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特表2022-525228神経筋疾患の治療に使用するための植物エクジソン及びその誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】神経筋疾患の治療に使用するための植物エクジソン及びその誘導体
(51)【国際特許分類】
A61K 31/573 20060101AFI20220428BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20220428BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220428BHJP
A61K 31/58 20060101ALI20220428BHJP
A61K 36/88 20060101ALI20220428BHJP
A61K 36/28 20060101ALI20220428BHJP
A61K 31/575 20060101ALI20220428BHJP
【ＦＩ】
A61K31/573
A61P25/02
A61P43/00 111
A61P21/00
A61P9/00
A61K31/58
A61K36/88
A61K36/28
A61K31/575
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555793
(86)(22)【出願日】2020-03-12
(85)【翻訳文提出日】2021-11-02
(86)【国際出願番号】 EP2020056590
(87)【国際公開番号】W WO2020187678
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】1902726
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513285907
【氏名又は名称】ビオフィティス
(71)【出願人】
【識別番号】507416908
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
(74)【代理人】
【識別番号】100098394
【弁理士】
【氏名又は名称】山川 茂樹
(72)【発明者】
【氏名】ラティル，マチルド
(72)【発明者】
【氏名】ディルダ，ピエール
(72)【発明者】
【氏名】ラフォン，ルネ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェイエ，スタニスラス
【テーマコード（参考）】
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA10
4C086DA11
4C086DA12
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA22
4C086ZA36
4C086ZA94
4C086ZC41
4C088AB26
4C088AB71
4C088BA08
4C088NA14
4C088ZA22
4C088ZA36
4C088ZA94
4C088ZC41
(57)【要約】
本発明は、脊髄性筋萎縮症若しくは筋萎縮性側索硬化症といった神経筋疾患の治療における、又はより詳細には、これらの神経筋疾患の一部として発生する筋機能の変化を引き起こす運動ニューロンの特定の障害の治療における、使用を目的とした、２０‐ヒドロキシエクジソン及びその誘導体に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経筋疾患に罹患した哺乳類の運動ニューロンの特定の障害の治療におけるその使用のための、少なくとも２０‐ヒドロキシエクジソン及び／又は２０‐ヒドロキシエクジソンの少なくとも１つの半合成誘導体を含む組成物であって、前記障害は、運動ニューロンの前記特定の障害による筋機能の変化を含む、組成物。
【請求項2】
２０‐ヒドロキシエクジソンは、植物抽出物又は植物の一部分の抽出物の形態であり、前記植物は、前記植物の乾燥重量の少なくとも０．５％の２０‐ヒドロキシエクジソンを含有する植物から選択され、
前記抽出物は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の２０‐ヒドロキシエクジソンを含む、請求項１に記載の、その使用のための組成物。
【請求項3】
注目すべきことに、前記抽出物の医薬品としての応用の安全性、利用可能性、又は有効性に影響を及ぼし得る不純物を、前記抽出物の乾燥重量の０～０．０５％含む、請求項２に記載の、その使用のための組成物。
【請求項4】
前記植物は、Ｓｔｅｍｍａｃａｎｔｈａ ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ、Ｃｙａｎｏｔｉｓ ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ及びＣｙａｎｏｔｉｓ ｖａｇａから選択される、請求項２又は３に記載の、その使用のための組成物。
【請求項5】
前記筋機能の前記変化は、運動ニューロン機能の変化又はその変性によって生成される、請求項１～４のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項6】
運動ニューロンの前記障害は、神経筋疾患に罹患した哺乳類の遺伝的変化に起因する、請求項１～５のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項7】
変化する前記筋機能は、横紋筋又は心筋の機能である、請求項１～６のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項8】
前記筋機能の前記変化は、形成不全及び／又は萎縮に関連する、請求項１～７のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項9】
前記神経筋疾患は、哺乳類の乳児脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）及び／又は筋萎縮性側索硬化症（ＳＬＡ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項10】
２０‐ヒドロキシエクジソン及び／又は２０‐ヒドロキシエクジソンの前記少なくとも１つの半合成誘導体は、ＳＭＡ又はＳＬＡの原因となる少なくとも１つの遺伝的変化を治療するために使用される、請求項９に記載の、その使用のための組成物。
【請求項11】
前記神経筋疾患は、ＳＭＮ１、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＶＣＰ、ＦＵＳ／ＴＬＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２から選択される少なくとも１つの遺伝子の突然変異に起因する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項12】
運動ニューロンの前記特定の障害の治療は、運動ニューロンの生存率の改善、及び／又は神経筋接合部の成熟の加速を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項13】
２０‐ヒドロキシエクジソン及び／又は２０‐ヒドロキシエクジソンの前記少なくとも１つの半合成誘導体は、ヒトでは、３～１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項14】
２０‐ヒドロキシエクジソン及び／又は２０‐ヒドロキシエクジソンの前記少なくとも１つの半合成誘導体は、成年のヒトでは、２００～１０００ｍｇ／日の用量を１回以上に分けて投与され、ヒトの小児又は幼児では、５～３５０ｍｇ／日の用量を１回以上に分けて投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項15】
一般式（I）：【化1】
Ｖ‐Ｕは炭素‐炭素単結合であり、Ｙはヒドロキシル基又は水素であり、又はＶ‐Ｕはエチレン性Ｃ＝Ｃ結合であり；
Ｘは酸素であり；
Ｑはカルボニル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基、ただしＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す；ＣＨ２Ｂｒ基から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の、その使用のための組成物。
【請求項16】
前記一般式（I）において：Ｙはヒドロキシル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基、ただしＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す、から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである、請求項１５に記載の、その使用のための組成物。
【請求項17】
前記一般式（I）の前記少なくとも１つの化合物は：‐Ｎｏ．１：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐１７‐（２‐モルホリノアセチル）‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．２：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（３‐ヒドロキシピロリジン‐１‐イル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．３：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（４‐ヒドロキシ‐１‐ピペリジル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．４：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペリジル］アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．５：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐［２‐（３‐ジメチルアミノプロピル（メチル）アミノ）アセチル］‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．６：２‐［２‐オキソ‐２‐［（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐６‐オキソ‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐１７‐イル］エチル］エチルスルファニルアセテート；
‐Ｎｏ．７：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐（２‐エチルスルファニルアセチル）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
‐Ｎｏ．８：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（２‐ヒドロキシエチルスルファニル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン
から選択される、請求項１５又は１６に記載の、その使用のための組成物。
【請求項18】
一般式（II）：【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経筋疾患、特に乳児脊髄性筋萎縮症及び筋萎縮性側索硬化症の治療のための、植物エクジソン、及び植物エクジソンの半合成誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
神経筋疾患は、運動ニューロン、神経筋接合部、及び骨格筋で構成された運動単位の機能性の変化を特徴とする。疾患の原因が、乳児脊髄性筋萎縮症若しくは筋萎縮性側索硬化症におけるように神経性であるか、又は筋肉性であるかにかかわらず、これらの疾患は全て、患者の運動機能の変化を引き起こし、これはハンディキャップから、重要な筋肉が影響を受けた場合の早期の死亡にまで及ぶ可能性がある。これらの神経筋疾患のためのケアは、現在でも依然として対症療法的なものであり、患者のハンディキャップのレベル、これらの症状の進行度、並びにこれらの病状が必要とする人的及び物質的ニーズに関して、相当な経済的コストを呈する。運動に関する症状及び患者の依存度を緩和できる療法の研究及び開発は、一定の社会的及び経済的関心を集めている。
【0003】
これらの神経筋疾患のうちの２つを、運動ニューロンに特に影響を与えるものとして説明されているのは、小児期に症状が現れる乳児脊髄性筋萎縮症（即ちＳＭＡ）と、成人期に症状が現れる筋萎縮性側索硬化症（又はＳＬＡ）とである。原因及び臨床症状が異なるこれら２つの神経変性疾患では、進行性筋除神経が共通しており、これは筋委縮症の原因となる（非特許文献１、２）。
【0004】
乳児脊髄性筋萎縮症は、遺伝子由来の小児の死亡の最も一般的な原因であり、出生数の１／６，０００～１／１０，０００の発生率である（非特許文献２）。発症年齢及び臨床的症状の進行に応じて、最も重篤な１型から、寿命が４０年を超える可能性がある３型までの、３つの主要な重篤度のタイプが説明されている。ＳＭＡに罹患した患者は、分離した、又は繊維束へとグループ化した筋繊維の萎縮によって、骨格筋の対称的な損傷を示す。ほとんど全てのＳＭＡは近位筋優位であり、即ち体幹及び体幹付近の筋肉に影響を及ぼす。運動障害は漸進的に、第１段階において下肢の筋肉へと広がり、続いて第２段階において上肢の筋肉へと広がり、伸筋に優先的に影響を及ぼす。遺伝子解析により、ＳＭＡの全ての形態は、大きな臨床的異質性を有しているものの、染色体領域５ｑ１３に位置する運動ニューロンの生存のための遺伝子ＳＭＮ１の突然変異によって引き起こされていることを実証できた。
【0005】
ヒトゲノムには、この遺伝子ＳＭＮ２の逆セントロメアコピーが存在し、これは複数のコピーに見られる（非特許文献３）が、遺伝子ＳＭＮ１の機能の喪失を部分的にしか相殺できない。実際には、ＳＭＮ２はＳＭＮ１と５個のヌクレオチドの違いを有し、そのうちの１つはエクソン７に位置し、遺伝子ＳＭＮ２によって生成されるｍＲＮＡの９０％のスプライシングによって、その切断に有利に作用する。この選択的スプライシングは、切断された不安定なＳＭＮΔ７タンパク質の産生につながる。よって、遺伝子ＳＭＮ２によって産生されるタンパク質のうち、わずか１０％しか完全でなく、機能しない（非特許文献４、５）。従って、遺伝子ＳＭＮ２のコピーの数、その発現レベル、及び疾患の重篤度の間に関連が示されている。ＳＭＮタンパク質は、小さな偏在するタンパク質であり、「Ｇｅｍｉｎｉ ｏｆ Ｃｏｉｌｅｄ Ｂｏｄｉｅｓ」を略して「ＧＥＭｓ」と呼ばれる核の個々のドメイン内、及び細胞の細胞質中に存在する。ＳＭＮタンパク質は、軸索成長（非特許文献６）及び軸索輸送（非特許文献７、８）といった、特定のニューロンの役割を有するが、核内リボ核タンパク質の生体発生（非特許文献９～１１）又はｍＲＮＡの翻訳の制御（非特許文献１２）といった偏在的な機能にも関与する。よって、ＳＭＮタンパク質の発現も、その細胞機能も、運動ニューロンの特定の変性を直接説明することはできない。
【0006】
しかしながら、様々な動物モデルの開発、及び基礎研究の進歩により、ニューロンにおいてのみＳｍｎ遺伝子を条件付きで削除しても、ＳＭＡの完全な症状も、運動ニューロンの変性も再現されないことを実証できた（非特許文献１３）。他の研究は、星状細胞（非特許文献１４）、シュワン細胞（非特許文献１５）、心臓細胞（非特許文献１６～１９）、肝細胞（非特許文献２０）、及び血管（非特許文献２１）の適切な機能におけるＳＭＮタンパク質の役割を説明しており、疾患の進行及び重篤度においてエネルギ代謝が果たす役割を示唆している。他の更なる研究は、ＳＭＡにおける運動単位に焦点を合わせ、運動ニューロンの生存に不可欠な要素である神経筋接合部の特定の変化を明らかにしている（非特許文献２２～２５）。実際には、ＳＭＮタンパク質は、神経伝達物質小胞のプール、シナプスの活動（非特許文献２６）だけでなく、機能性の獲得及びその維持を可能とする重要なステップである、接合部の成熟（非特許文献２２、２５）に作用することによって、神経筋接合部の適切な機能化に関与する。一方、筋肉細胞のみにおけるＳｍｎ遺伝子の無効化は：重度のジストロフィー（非特許文献２７）；収縮を発生させ得る、筋節構造の不十分な組織化（非特許文献２８）；筋幹細胞の正しい融合の減少（非特許文献２９）；それに伴う筋幹細胞の分化の減少（非特許文献３０）といった、深刻な筋肉の変化を生成する（非特許文献２７、３１、３２）。更に、ＳＭＡに罹患した患者の筋原細胞は、神経筋接触の確立に不可欠な、ＣＡＮＰ（Ｃａｌｃｉｕｍ‐Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ：カルシウム活性化中性プロテアーゼ）等の特定の因子が不十分である（非特許文献３３、３４）。最後に、運動ニューロンがＳＭＡ筋細胞との共培養においてより迅速に変性することがインビトロで観察されている（非特許文献３４）。
【0007】
現在、ＳＭＡの治療法を開発するために、全く異なるアプローチが考えられている。現在の研究戦略は、大半が、ＳＭＮ２遺伝子の発現の増加、又はＳＭＮ２転写産物のスプライシングの変更、又は正しい遺伝子の再導入を目的とした遺伝子療法によって、ＳＭＮの発現を直接的又は間接的に変更することに焦点を合わせている。いくつかの研究は、細胞療法の開発によって、又は神経保護の活性化（オレソキシム）若しくは筋肉機能の改善（トロポニン活性化因子）に焦点を合わせることによる、ＳＭＮとは独立したアプローチに集中している。
【0008】
ＳＭＮの進行についての多数の臨床試験にもかかわらず、現在のところ、当局によって承認されたのはわずか２つの分子のみである。
【0009】
１つ目の、トロポニン活性化因子（ＣＫ‐２１２７１０７）は、筋肉機能の耐久性及びパフォーマンスの改善のために、カルシウムに対するサルコメアの感受性を上昇させることを目的としている（非特許文献３５）。この分子は、米国の規制当局によって、ＳＭＡの希少疾病用医薬品として指定された（２０１７年５月）。
【0010】
２つ目の、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉ‐ｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＡＳＯ）は、ＳＭＮ２遺伝子によって生成された転写産物の、エクソン７の包有を促進することによって、髄腔内注射後に脊髄の細胞に完全なＳＭＮタンパク質を過剰発現させることができるようにすることを目的としている（非特許文献３６、３７）。Ｂｉｏｇｅｎ社が開発したヌシネルセンという名称のこの分子は、米国及び欧州の当局によって承認されており、１型及び２型の重篤な乳児脊髄性筋萎縮症を治療するために市販された最初の治療用分子を構成する。重篤なＳＭＡ患者に対する第II及びIII相臨床試験（非特許文献３８）中においてであるかにかかわらず、イントロン７を標的とするＡＳＯによって得られる最初の結果は、非常に印象的なものであり、この致命的な疾患にとって有望なものである。しかしながら、中枢神経系への１回の及び／又は長期にわたるオリゴヌクレオチドのインビボ注射の使用に関して、グレーな領域がいくつか残っている。まず、科学界には、遺伝子発現を標的とするこのタイプの外因性分子に対する患者の長期耐性についての見通しが欠けている。そして、更なる疑問は、ＳＭＮタンパク質の有意で制御されていない過剰発現に固有のリスクに関連しており、上記タンパク質の機能は、細胞増殖に関連している（非特許文献３９）。更に、ヌシネルセンの有効性はますます重要であると思われる。というのは、治療の開始が、疾患の進行、診断時間及び家族の臨床的経過の関連から得るのが難しい臨床状況に関して早期に介入するためである。最後に、ＳＭＡにおいては、疾患の進行に対して多数の組織の変化が果たす役割の重要性に留意することが重要である。しかしながら、ヌシネルセンは血液脳関門を通過しない分子であり、髄腔内経路による治療を必要とし、これは、筋肉、肝臓、膵臓、及び血管系といった他の臓器を標的とすることなく、ニューロン及びグリア細胞のみを標的とすることができる。従ってこれらの変化は、ヌシネルセンの治療効果を制限する可能性がある。最後に、ＳＭＮタンパク質の発現レベルが極めて高く、生命予後にめったに関与しない、３型ＳＭＡに罹患した患者は、治療の認可がまだ承認されておらず、この重篤度は治療に関して孤立したままである。
【0011】
従って、その保護効果を強化し、患者の臨床的経過、患者の依存度、及び患者の臨床的管理を可能な限り制限するために、ヌシネルセンを補完する、生理学的及び／又は薬理学的アプローチを開発することが重要であると思われる。
【0012】
植物エクジソンは、ポリヒドロキシル化ステロールの重要なファミリーである。これらの分子は、様々な種類の植物（シダ植物、裸子植物、被子植物）によって産生され、害虫に対するこれらの植物の防御に関与する。植物界の大半の植物エクジソンは、２０‐ヒドロキシエクジソンである。
【0013】
特許文献１は、植物エクジソン、より詳細には２０‐ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）が、多数の薬学的研究の対象とされてきたことを開示している。これらの研究は、この分子の抗糖尿病及び同化特性を強調している。筋肉でのタンパク質合成に対するその刺激効果が、ラットにおいてインビボで観察されており（非特許文献４０～４２）、またマウス筋管Ｃ２Ｃ１２においてインビトロで観察されている（非特許文献４３）。動物モデルにおける上述の効果の一部は、臨床研究で発見されているものの、依然として数が少ない。例えば、２０‐ヒドロキシエクジソンは、若年のアスリートの筋肉量の増大を促進する（非特許文献４４）。最後に、特許文献１は更に、サルコペニア及びサルコペニア性肥満の治療及び予防のための、２０‐ヒドロキシエクジソン及び２０‐ヒドロキシエクジソン誘導体の使用を説明している（非特許文献４５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】仏国特許第３０２１３１８号
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Ａｌ－Ｃｈａｌａｂｉ ｅｔ Ｈａｒｄｉｍａｎ， ２０１３
【非特許文献2】Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ Ｐａｒｄｏ， １９９６
【非特許文献3】Ｌｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８
【非特許文献4】Ｖｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７
【非特許文献5】Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７
【非特許文献6】ＭｃＷｈｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３
【非特許文献7】Ａｋｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１
【非特許文献8】Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１１
【非特許文献9】Ｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９
【非特許文献10】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７
【非特許文献11】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献12】Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３
【非特許文献13】Ｆｒｕｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００
【非特許文献14】Ｒｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５
【非特許文献15】Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４
【非特許文献16】Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０
【非特許文献17】Ｈｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０
【非特許文献18】Ｓｈａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０
【非特許文献19】Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０
【非特許文献20】Ｖｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４
【非特許文献21】Ｓｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１６
【非特許文献22】Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献23】Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９
【非特許文献24】Ｍｕｒａｙ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献25】Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献26】Ｔｏｒｒｅｓ‐Ｂｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１１
【非特許文献27】Ｃｉｆｕｚｚ ｅｔ ａｌ．， ２００１
【非特許文献28】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献29】Ｎｉｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００３
【非特許文献30】Ｓｈａｆｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００５
【非特許文献31】Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００７
【非特許文献32】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１
【非特許文献33】Ｆｉｄｚｉａｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９８４
【非特許文献34】Ｖｒｂｏｖａ ｅｔ ａｌ．， １９８９
【非特許文献35】Ｈｗｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５
【非特許文献36】Ｈａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１６
【非特許文献37】Ｃｈｉｒｉｂｏｇａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６
【非特許文献38】Ｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６
【非特許文献39】Ｇｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１
【非特許文献40】Ｓｙｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０００
【非特許文献41】Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献42】Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２
【非特許文献43】Ｇｏｒｅｌｉｃｋ‐Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８
【非特許文献44】Ｓｉｍａｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８
【非特許文献45】Ｌａｆｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の目的は、神経筋疾患に関連する運動ニューロンの喪失、及びこの変性の結果を制限することである。
【0017】
植物エクジソンは、昆虫の脱皮ホルモンに構造的に関連する植物ポリヒドロキシル化ステロールの重要なファミリーである。これらの分子は、多数の植物種によって産生され、害虫に対するこれらの防御に関与する。大半の植物エクジソンは２０‐ヒドロキシエクジソンである。
【0018】
本発明者らは予想外にも、植物エクジソン及び植物エクジソンの半合成誘導体が、脊髄性筋萎縮症に罹患した哺乳類の生存率、及び体重の変化を、有意に改善することを発見した。更に、植物エクジソン及びその半合成誘導体は、筋委縮症及びこの病理に存在する形成不全を制限し、脊髄性筋萎縮症に罹患した哺乳類の運動ニューロンの喪失を有意に制限する。
【課題を解決するための手段】
【0019】
この目的のために、本発明は、神経筋疾患に罹患した哺乳類の運動ニューロンの特定の障害の治療に使用するための、２０‐ヒドロキシエクジソン及び／又は２０‐ヒドロキシエクジソンの少なくとも１つの半合成誘導体を含む組成物に関し、上記障害は、運動ニューロンの上記特定の障害による筋機能の変化を含む。
【0020】
特定の実施形態では、本発明は更に、別個に実装される、又は技術的に動作可能な各組み合わせで実装される、以下の特性を満たしている。
【0021】
２０‐ヒドロキシエクジソン及びその誘導体は、有利には、医薬品グレードまで精製される。
【0022】
使用される２０‐ヒドロキシエクジソンは、より好ましくは、２０‐ヒドロキシエクジソンに富む植物抽出物、又は２０‐ヒドロキシエクジソンを活性剤として含む組成物の形態である。２０‐ヒドロキシエクジソンに富む植物抽出物は例えば、Ｓｔｅｍｍａｃａｎｔｈａ ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ（Ｌｅｕｚｅａ ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓとも呼ばれる）、Ｃｙａｎｏｔｉｓ ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ及びＣｙａｎｏｔｉｓ ｖａｇａの抽出物である。
【0023】
得られた上記抽出物は、より好ましくは医薬品グレードまで精製される。
【0024】
ある実施形態では、２０‐ヒドロキシエクジソンは、植物抽出物又は植物の一部分の形態であり、上記植物は、上記植物の乾燥重量の少なくとも０．５％の２０‐ヒドロキシエクジソンを含有する植物から選択され、上記抽出物は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の２０‐ヒドロキシエクジソンを含む。上記抽出物は、より好ましくは医薬品グレードまで精製される。
【0025】
上記抽出物はこれ以降、ＢＩＯ１０１と呼ばれる。これは注目すべきことに、上記抽出物の医薬品としての応用の安全性、利用可能性、又は有効性に影響を及ぼし得る微量化合物等の不純物を、上記抽出物の乾燥重量の０～０．０５％含む。
【0026】
本発明のある実施形態によると、不純物は、ルブロステロン、ジヒドロルブロステロン、又はポストステロン等の、１９又は２１個の炭素原子を含む化合物である。
【0027】
ＢＩＯ１０１の生産の元となる上記植物は、より好ましくはＳｔｅｍｍａｃａｎｔｈａ ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ（Ｌｅｕｚｅａ ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓとも呼ばれる）、Ｃｙａｎｏｔｉｓ ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ及びＣｙａｎｏｔｉｓ ｖａｇａから選択される。
【0028】
２０‐ヒドロキシエクジソンの上記誘導体は、半合成によって得られ、特に欧州特許出願第１５７３２７８５．９号明細書に記載されている様式で得ることができる。
【0029】
ある好ましい実施形態によると、上記筋機能の上記変化は、運動ニューロン機能の変化又はその変性によるものである。
【0030】
ある実施形態では、変化する上記筋機能は、横紋筋又は心筋の機能である。
【0031】
ある実施形態では、上記筋機能の上記変化は、形成不全及び／又は萎縮に関連する。
【0032】
ある特定の実施形態では、運動ニューロンの障害は、神経筋疾患に罹患した哺乳類の遺伝的変化に起因する。
【0033】
用語「遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」は、１つ以上のヌクレオチドの置換若しくは挿入、又は１つ以上のヌクレオチドの欠失といった突然変異を意味する。
【0034】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳類の乳児脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＳＬＡ）の治療に使用するための組成物を目的とする。
【0035】
ある特定の実施形態では、本発明は、（原因遺伝子の、若しくは１つ以上の感受性遺伝子の、ランダムな突然変異に関連する）散発性神経筋疾患、又は：ＳＭＡのフレームワークに介入するＳＭＮ１；ＳＯＤ１；ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３をコードするＴＡＲＤＢＰ；ＶＣＰ（Ｖａｌｏｓｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＦＵＳ／ＴＬＳ（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）；及びＳＬＡのフレームワークに関与するＣ９ＯＲＦ７２（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ７２）から選択される少なくとも１つの遺伝子において突然変異が発見されるファミリーの形態の、治療に使用するための組成物を目的とする。
【0036】
ある特定の実施形態では、運動ニューロンの特定の障害の治療は、運動ニューロンの生存率の改善、及び／又は神経筋接合部の成熟の加速を含む。
【0037】
ある特定の実施形態では、植物エクジソンは、ヒトでは、３～１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。用語「植物エクジソン」はここでは、一般的な植物エクジソン及びその誘導体、（特に抽出物の形態の）２０‐ヒドロキシエクジソン及びその誘導体を意味する。
【0038】
好ましくは、植物エクジソンは、成年のヒトでは、２００～１，０００ｍｇ／日の用量を１回以上に分けて投与され、ヒトの小児又は幼児では、５～３５０ｍｇ／日の用量を１回以上に分けて投与される。用語「植物エクジソン」はここでは、一般的な植物エクジソン及びその誘導体、（特に抽出物の形態の）２０‐ヒドロキシエクジソン及びその誘導体を意味する。
【0039】
実施形態では、上記組成物は、植物エクジソンの誘導体と考えられる少なくとも１つの化合物を含み、上記少なくとも１つの化合物は、一般式（I）：
【0040】
【化1】
【0041】
のものであり、ここで、Ｖ‐Ｕは炭素‐炭素単結合であり、Ｙはヒドロキシル基又は水素であり、又はＶ‐Ｕはエチレン性Ｃ＝Ｃ結合であり；
Ｘは酸素であり；
Ｑはカルボニル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基（ここでＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す）；ＣＨ２Ｂｒ基から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである。
Ｘは酸素であり；
Ｑはカルボニル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基（ここでＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す）；ＣＨ２Ｂｒ基から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである。
【0042】
本発明の文脈において、「（Ｃ１‐Ｃ６）」は、炭素原子が１～６個の、直鎖又は分岐の、いずれのアルキル基、特にメチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｓｅｃ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｎ‐ペンチル、ｎ‐ヘキシル基を意味する。有利には、これはメチル、エチル、イソプロピル、又はｔ‐ブチル基、特にメチル又はエチル基、より詳細にはメチル基である。
【0043】
ある好ましい実施形態では、上記式（I）において：
Ｙはヒドロキシル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基、（ここでＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す）から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである。
Ｙはヒドロキシル基であり；
Ｒ１は：（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ｗ（Ｃ１‐Ｃ６）ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）基；（Ｃ１‐Ｃ６）Ａ基、（ここでＡは、ＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ１‐Ｃ６）、Ｎ（Ｃ１‐Ｃ６）、ＣＯ２（Ｃ１‐Ｃ６）タイプの基で任意に置換された複素環を表す）から選択され；
Ｗは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＯであり、より好ましくはＳである。
【0044】
実施形態では、上記組成物は、以下の化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む：
Ｎｏ．１：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐１７‐（２‐モルホリノアセチル）‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．２：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（３‐ヒドロキシピロリジン‐１‐イル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．３：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（４‐ヒドロキシ‐１‐ピペリジル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．４：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペリジル］アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．５：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐［２‐（３‐ジメチルアミノプロピル（メチル）アミノ）アセチル］‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．６：２‐［２‐オキソ‐２‐［（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐６‐オキソ‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐１７‐イル］エチル］エチルスルファニルアセテート；
Ｎｏ．７：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐（２‐エチルスルファニルアセチル）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．８：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（２‐ヒドロキシエチルスルファニル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン。
Ｎｏ．１：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐１７‐（２‐モルホリノアセチル）‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．２：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（３‐ヒドロキシピロリジン‐１‐イル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．３：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（４‐ヒドロキシ‐１‐ピペリジル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．４：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペリジル］アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．５：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐［２‐（３‐ジメチルアミノプロピル（メチル）アミノ）アセチル］‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．６：２‐［２‐オキソ‐２‐［（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐６‐オキソ‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐１７‐イル］エチル］エチルスルファニルアセテート；
Ｎｏ．７：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐１７‐（２‐エチルスルファニルアセチル）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン；
Ｎｏ．８：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）‐２，３，１４‐トリヒドロキシ‐１７‐［２‐（２‐ヒドロキシエチルスルファニル）アセチル］‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７‐デカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐６‐オン。
【0045】
実施形態では、上記組成物は、植物エクジソンの誘導体と考えられる少なくとも１つの化合物を含み、上記少なくとも１つの化合物は、一般式（II）：
【0046】
【化2】
【0047】
式（II）の化合物は、これ以降ではＢＩＯ１０３と呼ばれる。
【0048】
実施形態では、上記組成物は、経口投与可能な、薬学的に許容可能な処方に組み込まれる。
【0049】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、一般に安全であり、非毒性であり、獣医用及びヒト用医薬用途に許容される医薬組成物の調製に有用であることを意味している。
【0050】
図面を参照して非限定的な例として与えられる以下の説明を読むと、本発明はよりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図1A】図１Ａは、出生（Ｐ０）から出生後１１日（Ｐ１１）までビヒクルで又はＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスの体重の変化の曲線を示す。これ以降、Ｐは誕生後（出生後）の日数に対応し、ｎは試料のサイズに対応し、ｐは、結果の統計的有意性を定量化するために使用される「ｐ値」に対応する。
【図2】図２は、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、前脛骨筋（Ｔｉｂｉａｌｉｓ）の筋繊維の総数を示すヒストグラムである。
【図3D】図３Ｄは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の前脛骨筋（Ｔｉｂｉａｌｉｓ）の筋繊維の断面積を示すヒストグラムである。
【図3E】図３Ｅは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋の筋繊維の断面積を示すヒストグラムである。
【図3F】図３Ｆは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、ヒラメ筋の筋繊維の断面積を示すヒストグラムである。
【図4A】図４Ａは、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、前脛骨筋（Ｔｉｂｉａｌｉｓ）の断面積による筋繊維の分布を示すヒストグラムである。
【図4B】図４Ｂは、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋の断面積による筋繊維の分布を示すヒストグラムである。
【図4C】図４Ｃは、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、ヒラメ筋の断面積による筋繊維の分布を示すヒストグラムである。
【図5A】図５Ａは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋のＡＫＴのリン酸化を示すウエスタンブロットを示す。
【図5B】図５Ｂは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋のＡＫＴのリン酸化の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図5C】図５Ｃは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の足底筋のＥＲＫのリン酸化を示すウエスタンブロットを示す。
【図5D】図５Ｄは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋のＥＲＫのリン酸化の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図5E】図５Ｅは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、足底筋のＳＭＮタンパク質の発現のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図5F】図５Ｆは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の足底筋のＳＭＮタンパク質の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図6A】図６Ａは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄におけるＡＫＴのリン酸化を示すウエスタンブロットを示す。
【図6B】図６Ｂは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄におけるＡＫＴのリン酸化の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図6C】図６Ｃは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄におけるＥＲＫのリン酸化を示すウエスタンブロットを示す。
【図6D】図６Ｄは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄におけるＥＲＫのリン酸化の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図6E】図６Ｅは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄におけるＳＭＮタンパク質の発現のレベルを示すウエスタンブロットを示す。
【図6F】図６Ｆは、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＶＨ）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、脊髄の腰部の高さにおけるＳＭＮタンパク質の濃度測定による定量化を示すヒストグラムを示す。
【図7B】図７Ｂは、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）の脊髄の腰部領域の断面における、運動ニューロンの免疫蛍光標識（抗コリンアセチルトランスフェラーゼ）の代表的な画像である。
【図7C】図７Ｃは、Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の脊髄の腰部領域の断面における、運動ニューロンの免疫蛍光標識（抗コリンアセチルトランスフェラーゼ）の代表的な画像である。
【図7D】図７Ｄは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、腹側半脊髄を通る切片あたりの運動ニューロンの総数のヒストグラムを示す。
【図7E】図７Ｅは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、腹側半脊髄を通る切片あたりの側方及び遠位運動ニューロンの総数のヒストグラムを示す。
【図7F】図７Ｆは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１）の、腹側半脊髄を通る切片あたりの、その細胞体の面積による運動ニューロンの分布を示すヒストグラムである。
【図8】図８は、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ≧５）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝５）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ≧６）のグループにおける、異なるタイプの運動ニューロン（低速、中速、高速）の数の分布を示すヒストグラムである。低速運動ニューロンはＣｈＡＴ＋ＥＲＲβ＋マーカーの発現を特徴とし、高速運動ニューロンはＣｈＡＴ＋ＭＭＰ９＋マーカーの発現を特徴とし、中速運動ニューロンはＣｈＡＴ＋ＥＲＲβ－ＭＭＰ９－マーカーの発現を特徴とする。ｐ＜０．０５の場合に有意性に到達したとみなす。「＊」は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差を示す。「＃」は、ＳＭＡビヒクルマウスのグループと比較した場合の有意差を示す。
【図9A】図９Ａは、シナプス前面（ニューロフィラメント及びＳＮＡＰ２５）並びにシナプス後面（α‐ブンガロトキシン）の異なる複数のマーカーによる、神経筋接合部の免疫蛍光標識の写真を示す。ビスベンズイミドを用いた染色により、核の識別が可能となる。スケールバーは１０μｍを表す。
【図9B】図９Ｂは、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ＝４）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝４）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ＝４）のグループの足底筋における、その成熟状態（いわゆる「プレッツェル」状＝成熟；穿孔＝成熟の過程；又は均一＝未成熟）に応じた、異なるタイプの神経筋接合部のパーセンテージの分布を示すヒストグラムである。「＊」は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図9C】図９Ｃは、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ＝４）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝４）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ＝４）のグループのヒラメ筋における、その成熟状態（いわゆる「プレッツェル」状＝成熟；穿孔＝成熟の過程；又は均一＝未成熟）に応じた、異なるタイプの神経筋接合部のパーセンテージの分布を示すヒストグラムである。「＊」は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。「＃」は、ＳＭＡビヒクルマウスのグループと比較した場合の有意差を示す。
【図9D】図９Ｄは、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ＝４）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝４）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ＝４）のグループの前脛骨筋における、その成熟状態（いわゆる「プレッツェル」状＝成熟；穿孔＝成熟の過程；又は均一＝未成熟）に応じた、異なるタイプの神経筋接合部のパーセンテージの分布を示すヒストグラムである。「＊」は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。「＃」は、ＳＭＡビヒクルマウスのグループと比較した場合の有意差を示す。
【図10A】図１０Ａは、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ＝１３）、Ｐ０からＰ９までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝１１）、又はＰ０からＰ９までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ＝１２）の、Ｐ５、Ｐ７、及びＰ９の日にオープンフィールド試験によって評価された運動パフォーマンスを示す。「＊」の個数は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差を示す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。
【図10B】図１０Ｂは、健康な対照マウス（ビヒクル対照、ｎ＝１７）、Ｐ０からＰ９までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル、ｎ＝１１）、又はＰ０からＰ９までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０１、ｎ＝１０）の、Ｐ５、Ｐ７、及びＰ９の日に握力試験によって評価された運動パフォーマンスを示す。「＊」の個数は、ビヒクル対照マウスのグループと比較した場合の有意差を示す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図12A】図１２Ａは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０３）の、前脛骨筋（Ｔｉｂｉａｌｉｓ）の筋繊維の断面を示すヒストグラムである。
【図12B】図１２Ｂは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０３）の、足底筋の筋繊維の断面を示すヒストグラムである。
【図12C】図１２Ｃは、健康な対照マウス（ビヒクル対照）、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０３）の、ヒラメ筋の筋繊維の断面を示すヒストグラムである。
【図13A】図１３Ａは、Ｐ０からＰ１１までビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡビヒクル）、又はＰ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウス（ＳＭＡ ＢＩＯ１０３）の、断面による前脛骨筋（Ｔｉｂｉａｌｉｓ）の筋繊維の分布を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0052】
これより、本発明を、その好ましい非限定的な応用分野の一部の特定の文脈で説明する。
【0053】
１．ＢＩＯ１０１の精製方法
ＢＩＯ１０１は、純度９０％の２０‐ヒドロキシエクジソンから、以下のステップに従って調製される：
i）純度９０％の２０‐ヒドロキシエクジソンをメタノールに熱溶解し、ろ過及び部分濃縮するステップ；
ii）３倍量のアセトンを添加するステップ；
iii）０～５℃の温度まで撹拌しながら冷却するステップ；
iv）得られた沈殿物を濾過するステップ；
v）アセトン及び水で連続的にすすぐステップ；並びに
vi）乾燥させるステップ。
ＢＩＯ１０１は、純度９０％の２０‐ヒドロキシエクジソンから、以下のステップに従って調製される：
i）純度９０％の２０‐ヒドロキシエクジソンをメタノールに熱溶解し、ろ過及び部分濃縮するステップ；
ii）３倍量のアセトンを添加するステップ；
iii）０～５℃の温度まで撹拌しながら冷却するステップ；
iv）得られた沈殿物を濾過するステップ；
v）アセトン及び水で連続的にすすぐステップ；並びに
vi）乾燥させるステップ。
【0054】
この精製は、この分子に好適な、工業規模で実施できる再結晶化のプロセスを伴う。
【0055】
ステップi）のろ過は、０．２μｍ粒子フィルタを用いて実施される。
【0056】
ステップi）の部分濃縮は有利には、ＭｅＯＨの存在下における約５０℃の温度での真空蒸留によって実施される。
【0057】
乾燥させるステップvi）は、約５０℃の温度において真空下で実施される。
【0058】
２．ＢＩＯ１０３の合成方法
ＢＩＯ１０３は、以下の調製方法に従って、２０‐ヒドロキシエクジソンからの半合成と、それに続く医薬品グレードへの精製とによって得られる：
ＢＩＯ１０３は、以下の調製方法に従って、２０‐ヒドロキシエクジソンからの半合成と、それに続く医薬品グレードへの精製とによって得られる：
【0059】
【化3】
【0060】
ＢＩＯ１０３の３ステップでの合成ダイアグラム：
I）ポストステロンを得るための、炭素Ｃ２０とＣ２２との間での、２０‐ヒドロキシエクジソンの側鎖の酸化開裂（当業者には公知のプロトコル）；
II）Ｃ２１位への臭素原子の導入；
III）このようにして得られた臭素化合物とエタンジオールとの反応。
I）ポストステロンを得るための、炭素Ｃ２０とＣ２２との間での、２０‐ヒドロキシエクジソンの側鎖の酸化開裂（当業者には公知のプロトコル）；
II）Ｃ２１位への臭素原子の導入；
III）このようにして得られた臭素化合物とエタンジオールとの反応。
【0061】
３．ＢＩＯ１０１及びＢＩＯ１０３の生物活性
ａ．ＢＩＯ１０１の効果の表現型分析
重度のＳＭＡのマウスモデルをＦＶＢ／ＮＲｊ遺伝子プールに対して使用した。これは、マウス遺伝子Ｓｍｎのエクソン７の無効化、及びヒト導入遺伝子ＳＭＮ２の発現を特徴とする（ＳｍｎΔ７／Δ７；ｈｕＳＭＮ２＋／＋）（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐ＳｍｎΔ７／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」という遺伝子型を有するこれらの交配から生じたマウスは、「ＳＭＡ」として説明される。これらのマウスは、進行性成長障害を特徴とし、この進行性成長障害は、出生４日後に開始が観察され、寿命の終了時の脊髄の前角の運動ニューロンの約５０％の変性、及び約１２日の平均寿命を有する（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐Ｓｍｎ＋／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」遺伝子型を有するマウスは、いずれの特定の表現型を有さず、いわゆる「対照」マウスとして使用される。上記マウスを、ビヒクル（この場合はシクロデキストリン）と複合体を形成した分子ＢＩＯ１０１、又はビヒクル単独（ＶＨ）で、毎日５０ｍｇ／ｋｇの用量の強制経口投与によって治療した。体重及び生存率を毎日、Ｐ１１まで分析した。これ以降の記述では、ｎは試料のサイズに対応し、ｐは、結果の統計的有意性を定量化するために使用される「ｐ値」に対応する。
ａ．ＢＩＯ１０１の効果の表現型分析
重度のＳＭＡのマウスモデルをＦＶＢ／ＮＲｊ遺伝子プールに対して使用した。これは、マウス遺伝子Ｓｍｎのエクソン７の無効化、及びヒト導入遺伝子ＳＭＮ２の発現を特徴とする（ＳｍｎΔ７／Δ７；ｈｕＳＭＮ２＋／＋）（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐ＳｍｎΔ７／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」という遺伝子型を有するこれらの交配から生じたマウスは、「ＳＭＡ」として説明される。これらのマウスは、進行性成長障害を特徴とし、この進行性成長障害は、出生４日後に開始が観察され、寿命の終了時の脊髄の前角の運動ニューロンの約５０％の変性、及び約１２日の平均寿命を有する（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐Ｓｍｎ＋／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」遺伝子型を有するマウスは、いずれの特定の表現型を有さず、いわゆる「対照」マウスとして使用される。上記マウスを、ビヒクル（この場合はシクロデキストリン）と複合体を形成した分子ＢＩＯ１０１、又はビヒクル単独（ＶＨ）で、毎日５０ｍｇ／ｋｇの用量の強制経口投与によって治療した。体重及び生存率を毎日、Ｐ１１まで分析した。これ以降の記述では、ｎは試料のサイズに対応し、ｐは、結果の統計的有意性を定量化するために使用される「ｐ値」に対応する。
【0062】
結果は、マウスの誕生から毎日の経口治療において、ＢＩＯ１０１単独（ｎ＝１８（ｎは試料のサイズである））により、ビヒクルで治療された動物（ｎ＝２２）に比べて生後９日からの動物の体重の減少を大幅に制限でき（ｐ＜０．０５）（図１Ａ）、また治療された動物のＰ１１の前の死亡率を有意に低下させることができる（ｐ＜０．０５）（図１Ｂ）ことを実証している。
【0063】
ｂ．ＢＩＯ１０１の筋肉栄養効果の分析
Ｐ１１の、最後の強制経口投与の１時間後において、治療されているマウスを、６μＬ／ｇ（マウスの体重）の１％ペントバルビタールで麻酔した後、混合型の伸筋であるヒラメ筋、高速型の伸筋である足底筋、及び高速型の屈筋である前脛骨筋を採取して、組織学的又は分子的研究を実施した。
Ｐ１１の、最後の強制経口投与の１時間後において、治療されているマウスを、６μＬ／ｇ（マウスの体重）の１％ペントバルビタールで麻酔した後、混合型の伸筋であるヒラメ筋、高速型の伸筋である足底筋、及び高速型の屈筋である前脛骨筋を採取して、組織学的又は分子的研究を実施した。
【0064】
採取後、ヒラメ筋、足底筋、及び前脛骨筋を個別に保存用媒体に入れ、低温のイソペンタン中で冷凍した。各筋肉に関して、厚さ１０μｍの横方向内側の切片を作製した。これらの切片をヘマトキシリン‐エオシンで染色し、脱水して、封入培地中に入れた。これらの切片の画像を顕微鏡で撮影した（倍率２００倍）。レリーフのような画像を得るために、微分干渉コントラスト技法を使用した。これらの画像から、各筋肉の筋繊維の数、及びこれらの繊維の２０％の断面積を、画像処理ソフトウェアを用いて計数した（図２）。
【0065】
採取されてヘマトキシリン‐エオシンで染色された筋肉の断面の組織学的分析は、筋肉形成不全（筋繊維の数）に対するＢＩＯ１０１の有益な効果を示している。実際に、前脛骨筋では、ＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスの筋繊維の数が、ビヒクルで治療された動物の繊維の数に比べて大幅に増大していることが示された（繊維数はそれぞれ２，３５８及び２，０６９（＋１４％）、ｐ＜０．０５）。
【0066】
興味深いことに、ＳＭＡマウスに存在する筋委縮症は、筋肉の性質及びタイプにかかわらず、治療によって制限される。実際に、ＢＩＯ１０１による治療は、研究対照の３つの筋肉（屈筋又は伸筋）の萎縮を大幅に制限する。
【0067】
健康な対照マウス（図３Ｂ）に対する、ＳＭＡの文脈（図３Ａ）での筋繊維の萎縮は、実際に前脛骨筋の組織学的切片で観察でき、筋繊維の断面積の定量は、この萎縮が、対照マウス（ｎ＝４）に比べてＳＭＡマウス（ｎ＝４）の前脛骨筋において５６．１％であることを示している（図３Ｄ）。この萎縮は、ＢＩＯ１０１による治療（ｎ＝４）によって、Ｐ１１において３２．７％まで大幅に減少する（ｐ＜０．０５）（図３Ｃ、図３Ｄ）。これは、足底筋（健康な対照マウスに対して４６％の筋繊維の有意な萎縮がＳＭＡマウスで観察され（ｐ＜０．０５）、ＢＩＯ１０１での治療はこの萎縮を１７．９％まで大幅に制限する（ｐ＜０．０５）（図３Ｅ））、及びヒラメ筋（ＳＭＡマウスに関して、対照に比べて５０．２％（ｐ＜０．０１）、ＢＩＯ１０１での治療によって３７．８％（ｐ＜０．０５））（図３Ｆ）にも当てはまる。
【0068】
萎縮に対するＢＩＯ１０１の効果のより精密な分析を実施するために、筋繊維の分布を断面積のカテゴリ毎に評価した。筋繊維はそれらの性質に応じて、異なる断面積を有する。低速の収縮を特徴とするI型の繊維は、高速の収縮を特徴とするII型繊維よりも小さなサイズを有する。Ｐ０からＰ１１までのＳＭＡマウスの治療によって観察された、分子ＢＩＯ１０１による萎縮の大幅な減少は、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスと比較して、ＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスの、研究対象の３つの筋肉の断面積による繊維の分布に対するこの治療の有意な効果をもたらす（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスの前脛骨筋では、ＳＭＡビヒクルマウスのグループに対して、４００～８００μｍ２の断面積を有する繊維の比率の有意な上昇が観察され、一方で１００～２００μｍ２の断面積を有する繊維の比率が有意に低下する（ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスの足底筋及びヒラメ筋では、２００～４００μｍ２の断面積を有する繊維の比率の上昇が、足底筋については０～１００μｍ２の断面積を有する繊維（図４Ｂ）、ヒラメ筋については１００～２００μｍ２の断面積を有する繊維（図４Ｃ）の減少を伴って観察される。
【0069】
ｃ．分子分析
以前の研究により、ＡＫＴ／ＣＲＥＢ経路の活性化不足及びＥＲＫ／Ｅｌｋ‐１経路の過剰活性化が、重篤なII型脊髄性筋萎縮症のマウスモデルとして使用される「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐ＳｍｎΔ７／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」トランスジェニックマウスの脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の低発現に関連することが実証できており、これは、疾患におけるこれらの経路の役割を示唆している（Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。
以前の研究により、ＡＫＴ／ＣＲＥＢ経路の活性化不足及びＥＲＫ／Ｅｌｋ‐１経路の過剰活性化が、重篤なII型脊髄性筋萎縮症のマウスモデルとして使用される「ＦＶＢ／ＮＲｊ‐ＳｍｎΔ７／Δ７ ｈｕＳＭＮ２＋／＋ ２コピー」トランスジェニックマウスの脊髄の前角におけるＳＭＮタンパク質の低発現に関連することが実証できており、これは、疾患におけるこれらの経路の役割を示唆している（Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。
【0070】
冷凍した足底筋を機械的粉砕によって抽出緩衝液中で均質化した。タンパク質抽出物を含有する上清を採取し、続いて上記タンパク質抽出物を、ローリー法に従ってアッセイした。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上での電気泳動を実施し、その後、分離されたタンパク質を膜上に移した。使用した一次抗体は、以下のとおりであった：マウスモノクローナル抗ＳＭＮ（１：５，０００）、ウサギポリクローナル抗Ｓｅｒ ４７３リン酸化ＡＫＴ（１：１０００）、ウサギポリクローナル抗ＡＫＴ（１／１００）、ウサギモノクローナル抗リン酸化ＥＲＫ １／２（１：５００）、抗ＭＡＰキナーゼ１／２（ＥＲＫ １／２）（１：１０００）。これらの膜をすすいだ後、ペルオキシダーゼに結合した抗マウス（１：５，０００）又は抗ウサギ（１：５，０００）二次抗体と共にインキュベートした。一次抗体の使用後、抗体‐光源複合体を、解離溶液中でのインキュベーションによって破壊した後、膜を再びウサギ抗ＡＫＴ及び抗ＭＡＰキナーゼ１／２（ＥＲＫ １／２）抗体（１：１０００）と共にインキュベートした。抗体複合体は化学発光によって可視化され、ゲル、膜、又はフィルムの試料のデジタル画像取得デバイスによって撮像された。特定の帯域それぞれの光学密度は、バックグラウンドを差し引き、βアクチンの帯域の光学密度で正規化することによって、画像処理ソフトウェアで定量化された。ビヒクルで治療された対照に関して、得られた値を１と決定し、他のグループの値をこれらの対照に対して正規化して、相対量として表現する。独立した実験を実施し、各グループを対照と比較する際に異なる複数の膜を使用することによって、各グループからの動物を得た。足底筋におけるｐＡＫＴの定量値は、ビヒクルで治療されたグループ（対照又はＳＭＡ）あたり３匹のマウス、及びＢＩＯ１０１で治療された４匹のマウスを表している。足底筋におけるｐＥＲＫの定量値は、グループあたり少なくとも４匹のマウスを表している。ＳＭＮの定量値は、ｎ＝２を表している。脊髄におけるｐＡＫＴの定量値に関して、これらはｐＡＫＴ及びｐＥＲＫではグループあたりｎ＝２のマウスを表し、ＳＭＮのレベルではグループあたりｎ＝４を表す。
【0071】
足底筋の分子分析により、ビヒクル対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）に比べてＳＭＡマウスではＡＫＴ経路が実際に活性化不足となり（図５Ａ、５Ｂ）、ＥＲＫ経路に有益となる（図５Ｃ、５Ｄ）ことが確認される（Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。ＢＩＯ１０１での１１日間の治療は、Ｐ０からＰ１１まで治療されたマウスの筋肉において、ＥＲＫのリン酸化（ｐＥＲＫ）のレベルの大幅な低下（図５Ｄ）と同時にＡＫＴのリン酸化（ｐＡＫＴ）を極めて大きく増大させること（図５Ｂ）によって、この関係を逆転させることができる。この有益な状況は、ＳＭＮタンパク質の過剰発現に関与していることが既に実証されている（Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。予想通り、ＳＭＮタンパク質は、健康な対照動物と比較すると、ＳＭＡ動物ではほとんど発現されない。しかしながら、非常に驚くべきことに、ＢＩＯ１０１での治療後にＳＭＮの発現のレベルの変化は観察できず、これはオリジナルの分子調節を示唆している（図５Ｅ、５Ｆ）。
【0072】
ＥＲＫとＡＫＴとの間のシグナル伝達経路のこのようなバランスは、ＳＭＡマウスの脊髄でも見られる。実際に、健康な対照マウス（ＣＴＬ ＶＨ）と比較して、ＥＲＫのリン酸化（ｐＥＲＫ）が増大する（図６Ｃ、６Ｄ）のと同時に、ＳＭＡマウスにおけるＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のリン酸化の明らかな減少（図６Ａ、６Ｂ）が観察される。１１日間にわたるＢＩＯ１０１でのＳＭＡマウスの毎日の治療は、ｐＡＫＴのレベルを上昇させてｐＥＲＫのレベルを低下させることによって、動物の脊髄における上記バランスを部分的に回復する（図６Ｂ、６Ｄ）。このモデルに関して予想通り、ＳＭＮタンパク質はＳＭＡマウスで発現されない。足底筋で観察されたように、ＢＩＯ１０１での治療は、１１日間治療されたＳＭＡマウスのＳＭＮのレベルを回復できない（図６Ｅ、６Ｆ）。
【0073】
ｄ．運動ニューロンの分析
健康な対照マウス又はビヒクルで若しくはＢＩＯ１０１で１１日間治療されたＳＭＡマウスの脊髄の腰部領域（Ｌ１～Ｌ５）の厚い切片における、運動ニューロンの集団の定量的及び定性的研究を、上述のようなコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を用いた免疫蛍光標識によって実施した（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ． ， ２０１３）。次に、様々な運動ニューロン亜集団についての、その脊髄内での位置（外側又は内側位置）及びその細胞体のサイズの分布を特性決定することによる、様々な運動ニューロン亜集団の研究によって、分析を緻密化した。
健康な対照マウス又はビヒクルで若しくはＢＩＯ１０１で１１日間治療されたＳＭＡマウスの脊髄の腰部領域（Ｌ１～Ｌ５）の厚い切片における、運動ニューロンの集団の定量的及び定性的研究を、上述のようなコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を用いた免疫蛍光標識によって実施した（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ． ， ２０１３）。次に、様々な運動ニューロン亜集団についての、その脊髄内での位置（外側又は内側位置）及びその細胞体のサイズの分布を特性決定することによる、様々な運動ニューロン亜集団の研究によって、分析を緻密化した。
【0074】
麻酔したマウスにＰＢＳを心臓内注射した。マウスの脊髄を取り出し、固定してすすいだ。脊髄の腰部領域（Ｌ１～Ｌ５）を、４％アガロース溶液でコーティングした。試料の全長にわたってビブラトームを用いて、５０μｍの切片を作製した。次に、脊髄の５つの切片につき１つの切片を、免疫組織化学的分析に使用した。０．１Ｍグリシンで飽和させた後、組織を透過処理し、ブロックし、ヤギポリクローナル一次抗体である抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）（１／４００ｅ）でマーキングした。次に切片を洗浄し、シアニン３と結合した抗ヤギポリクローナル二次抗体（１：４００ｅ）と共にインキュベートした。ビスベンズイミド（１／１，０００ｅ）を用いて核をマーキングした後、切片を再び洗浄してから、蛍光染料の光退色阻害剤で処置した。マーキングの特異性は、一次抗体の不在下で実施される対照マーキングによって検証される。
【0075】
画像はカメラを用いて得られ、このカメラは、倍率２００倍の顕微鏡に設置され、特に好適な画像取得用ソフトウェアを備えたマイクロコンピュータタイプの中央処理装置に接続されている。全ての計数は、画像処理ソフトウェアを用いて実施された。
【0076】
免疫蛍光法では、抗ＣｈＡＴ抗体でマーキングされた運動ニューロンは、図面中において脊髄の前角の薄い灰色で識別できる（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）。腹側半脊髄を通る切片あたりの運動ニューロンの数を、マウスの３つのグループそれぞれについて決定した。予想通り、ＳＭＡマウスの運動ニューロンの数（ｎ＝５）は、健康な対照マウスのグループで見られる運動ニューロンの数（ｎ＝５）（図７Ａ）に比べて、大幅に減少している（図７Ｂ）。実際には、この運動ニューロン変性は、これら２つのグループの間で２５％（ｐ＜０．０５）である（図７Ｄ）。極めて興味深いことに、１１日間にわたるＢＩＯ１０１での毎日の治療の後、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（ｎ＝５）よりも、これらのＳＭＡマウスにおいて運動ニューロンの数が大幅に多い（ｐ＜０．０５）こと（図７Ｃ）が観察される。よって、ＢＩＯ１０１での治療が、病理による運動ニューロンの変性を有意に制限すること、及びこの治療が有意な神経保護効果を発揮し、運動ニューロンの喪失が分子ＢＩＯ１０１で治療されたグループにおいて１３％まで制限されること（図７Ｄ）が観察される
【0077】
次に、様々な運動ニューロン亜集団を、その脊髄内での位置（外側又は内側位置）の分析によって、及びその細胞体の面積の分布の研究によって研究することにより、上記定量的分析を緻密化した。
【0078】
ビヒクルを投与されたＳＭＡマウスに比べて、ＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスにおいて（遠位筋を神経支配する）外側運動ニューロンの数が多い一方で、内側運動ニューロンに対しては有意な影響がないことが観察される（図７Ｅ）。
【0079】
運動ニューロンの細胞体の面積の分析は、予想通り、健康な対照マウスと比較した場合の、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスの運動ニューロンの萎縮を示し、ここで、細胞体の面積が６００μｍ２未満（ｐ＜０．０５）である運動ニューロンの数が有意に増大している。これと並行して、ＳＭＡマウスにおいて、細胞体の面積が９００μｍ２超（ｐ＜０．０５）である運動ニューロンの喪失が観察される（図７Ｆ）。ＢＩＯ１０１での治療により、細胞体の面積が３００μｍ２未満（ｐ＜０．０５）である小さな運動ニューロンの数を有意に制限することによって、運動ニューロンのこのような萎縮を制限できる（図７Ｆ）。ＳＬＡの文脈において、複数の運動単位が病理的プロセスによって均質に影響されるわけではないことが説明されていることに留意することが重要である。実際には、この疾患の発症前マウスモデルにより、面積が大きな細胞体を伴う運動ニューロンが関与する、ＦＦ（Ｆａｓｔ Ｆａｔｉｇｕａｂｌｅ）タイプの運動単位の優先的な変性が明らかにされている（Ｐｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。同様の差分的変性が、患者でも報告されている（Ｄｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０；Ｔｈｅｙｓ， Ｐｅｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ， １９９９）。よって、細胞体の面積が大きな運動ニューロンを優先し、面積が小さな運動ニューロンの比率を減少させることは、ＳＬＡ等の病理の文脈における興味深いアプローチとなる可能性がある。
【0080】
運動ニューロンの数及びその細胞体のサイズの定量的分析、並びにその位置（腹側脊髄内の内側又は外側）に関する定性的研究を補うように、本発明者らは、運動ニューロンの亜集団（低速運動ニューロン、中速運動ニューロン、及び高速運動ニューロン）の保護に対する、ＢＩＯ１０１による治療の影響を研究した。この運動ニューロンの亜集団の定性的分析を、対照、又はＢＩＯ１０１で治療された若しくはされていないＳＭＡマウスの、脊髄の腰部領域（Ｌ１～Ｌ５）の厚い断面に対して：上述のようなコリンアセチルトランスフェラーゼを用いた免疫蛍光標識（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）；及び低速運動ニューロンの特異的マーカーであるエストロゲン関連受容体β（ＥＲＲβ）による、又は高速運動ニューロンの特異的マーカーであるマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）による、免疫蛍光同時標識による、運動ニューロンのタイプの分析によって、実施した。
【0081】
麻酔したマウスにＰＢＳを心臓内注射した。マウスの脊髄を取り出し、固定してすすいだ。脊髄の腰部領域（Ｌ１～Ｌ５）を、４％アガロース溶液でコーティングした。試料の全長にわたってビブラトームを用いて、５０μｍの断面を作製した。次に、脊髄の５つの切片につき１つの切片を、免疫組織化学的分析に使用した。０．１Ｍグリシンで飽和させた後、組織を透過処理し、ブロックし、以下の一次抗体でマーキングした：ヤギ抗ＣｈＡＴ抗体（１／４００ｅ）、マウス抗ＥＲＲβ抗体（１／４００ｅ）、ウサギ抗ＭＭＰ９抗体（１／６００ｅ）。３回すすいだ後、以下の抗体を切片と共にインキュベートした：ロバ抗ヤギＣｙ５抗体（１／４００ｅ）、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ ４８８抗体（１／４００ｅ）、ロバ抗ウサギＣｙ３抗体（１／４００ｅ）。ビスベンズイミド（１／１，０００ｅ）を用いて核をマーキングした後、切片を再び洗浄してから、蛍光染料の光退色阻害剤で処置した。マーキングの特異性は、一次抗体の不在下で実施される対照マーキングによって検証される。
【0082】
画像はカメラを用いて得られ、このカメラは、倍率２００倍の顕微鏡に設置され、特に好適な画像取得用ソフトウェアを備えたマイクロコンピュータタイプの中央処理装置に接続されている。全ての計数は、画像処理ソフトウェアを用いて実施された。
【0083】
低速運動ニューロン（ＣｈＡＴ＋ ＥＲＲβ＋）の数は、これらのグループにおいて有意に変化せず、ビヒクルで治療された健康なマウスであるか、ビヒクルで若しくはＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスであるかにかかわらない（図８）。ビヒクルで治療されたＳＭＡ動物のグループでは、健康な対照マウスのグループに比べて、高速運動ニューロン（ＣｈＡＴ＋ ＭＭＰ９＋）の平均数の有意な喪失が観察される（それぞれ１１及び１６；ｐ＜０．０５）。この喪失は、中速タイプの運動ニューロン（ＣｈＡＴ＋ ＥＲＲｂ－ ＭＭＰ９－）の利益になり、その数は、健康な対照マウス中に存在する数と比較して、ＳＭＡビヒクルマウスのグループにおいて有意に多い（４及び７；ｐ＜０．０５）。
【0084】
興味深いことに、ＢＩＯ１０１によるＳＭＡマウスの治療は好ましくは、高速タイプの運動ニューロン（ＣｈＡＴ＋ ＭＭＰ９＋）の生存を促進する。実際に、ＢＩＯ１０１で治療されたＳＭＡマウスのグループでは、高速運動ニューロンの数は、ビヒクルを投与されたＳＭＡマウスのグループにおいてよりも有意に多い（１４及び１１；ｐ＜０．０５）。
【0085】
その結果、ＢＩＯ１０１による治療は、特にマウスを高速運動ニューロンの喪失から保護することによって、この重篤なＳＭＡのモデルで観察される運動ニューロンの喪失を制限する。
【0086】
ｅ．神経筋接合部の分析
ＳＭＡは、ＳＭＮタンパク質の欠如によって誘発される神経筋接合部の特定の変化、及び運動ニューロンの特定の死によって誘発される除神経を特徴とする（Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｃｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。本発明者らは、いわゆる「プレッツェル」状の成熟構造の成熟及び断片化の度合いを決定するために、神経筋接合部の形態学的研究を実施した。そのために本発明者らは、分子ＢＩＯ１０１で治療された又はされていないＳＭＡマウスのヒラメ筋、足底筋、及び前脛骨筋の細分した筋繊維に対して、免疫蛍光法（Ｌｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）による、シナプス前面（シナプトフィジン及びニューロフィラメント）並びにシナプス後面（α‐ブンガロトキシン）の特定のマーキングを実施した。
ＳＭＡは、ＳＭＮタンパク質の欠如によって誘発される神経筋接合部の特定の変化、及び運動ニューロンの特定の死によって誘発される除神経を特徴とする（Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｃｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。本発明者らは、いわゆる「プレッツェル」状の成熟構造の成熟及び断片化の度合いを決定するために、神経筋接合部の形態学的研究を実施した。そのために本発明者らは、分子ＢＩＯ１０１で治療された又はされていないＳＭＡマウスのヒラメ筋、足底筋、及び前脛骨筋の細分した筋繊維に対して、免疫蛍光法（Ｌｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）による、シナプス前面（シナプトフィジン及びニューロフィラメント）並びにシナプス後面（α‐ブンガロトキシン）の特定のマーキングを実施した。
【0087】
厚さ７５μｍの縦切片をビブラトームで作製した。次に上記切片を、穏やかに撹拌しながら０．１Ｍグリシンで飽和させた後、ＰＢＳで洗浄した。続いて上記切片をブロックし、４％ＰＢＳ‐ＢＳＡ‐５％ヤギ血清‐０．５％トリトンの溶液で透過処理した。（神経筋接合部のシナプス前面を識別するための）抗ニューロフィラメント（１／８００ｅ）及び抗シナプトフィジン（ＳＮＡＰ２５；１／２００ｅ）一次抗体を、４８時間にわたってインキュベートし、二次抗体（抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７；１／４００ｅ）で可視化してから洗浄した。最後に切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５（１／５００ｅ）と直接結合した抗α‐ブンガロトキシンと共にインキュベートする。切片を洗浄し、核をビスベンズイミド（１／１，０００ｅ）でマーキングして、落射蛍光顕微鏡撮像での観察のために、蛍光染料の光退色阻害剤と共にカバーガラスとガラススライドとの間に配置した（図９Ａ）。
【0088】
神経筋接合部は、最も未成熟のものから最も成熟したものまで、均一なプレート、穿孔、又は「プレッツェル」状の３つのカテゴリに従って定義及び定量化される。
【0089】
研究対象の全ての筋肉（足底筋、ヒラメ筋、及び前脛骨筋）において、ＳＭＡ動物での均一な神経筋接合部のパーセンテージは、健康な対照マウスに比べて大幅に上昇する。このような神経筋接合部の成熟の遅延は予想されており、既に文献で記述されている（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。実際に、高速の伸筋である足底筋では、Ｐ１０における未成熟の神経筋接合部のパーセンテージは、健康な対照マウスの４９．７％に対して８９．７％（ｐ＜０．０５）であり（図９Ｂ）、低速の伸筋であるヒラメ筋では、未成熟の神経筋接合部のパーセンテージは、健康な対照マウスの４５．７％に対して８４．３％（ｐ＜０．０５）であり（図９Ｃ）、高速の屈筋である前脛骨筋では、未成熟の神経筋接合部のパーセンテージは、健康な対照マウスの２８．７％に対して６９．３％（ｐ＜０．０５）である（図９Ｄ）。ＳＭＡマウスを誕生からＰ１０まで毎日ＢＩＯ１０１で治療すると、試験した全ての筋肉の神経筋接合部において更に有意な成熟が観察され、未成熟なプレートのパーセンテージが減少して穿孔を有するプレートが優勢になり、これは成熟の加速の証拠となる。実際に、足底筋では、ビヒクルを投与されたＳＭＡ動物における１０．４％に比べて、接合部の１６．３％が穿孔タイプである（ｐ＝ｎｓ）（図９Ｂ）。この差は、ヒラメ筋（ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスのグループにおける１５．７％に比べて、ＳＭＡグループにおいて接合部の２６．５％が穿孔状である；ｐ＜０．０５、図９Ｃ）、前脛骨筋（ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスのグループにおける３０．７％に比べて、治療されたＳＭＡグループにおいて４５．７％が穿孔状接合部である；ｐ＜０．０５、図９Ｄ）において有意である。
【0090】
よって、これらの結果は、ＢＩＯ１０１による治療が神経筋接合部の成熟を加速させることを示している。
【0091】
ｆ．重篤なＳＭＡのマウスモデルの運動能力の分析
Ｐ０からＢＩＯ１０１で治療された又はされていない、重篤な２型ＳＭＡのマウスの表現型分析を実施した。Ｐ５からＰ９まで、マウスの運動能力に関する縦断試験を２日毎に実施した。本発明者らは、上述のように、オープンフィールド試験によって自発的移動能力を評価し、また握力試験によって筋肉の易疲労性を評価した（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３；Ｃｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）．
Ｐ０からＢＩＯ１０１で治療された又はされていない、重篤な２型ＳＭＡのマウスの表現型分析を実施した。Ｐ５からＰ９まで、マウスの運動能力に関する縦断試験を２日毎に実施した。本発明者らは、上述のように、オープンフィールド試験によって自発的移動能力を評価し、また握力試験によって筋肉の易疲労性を評価した（Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８；Ｂｒａｎｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３；Ｃｈａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）．
【0092】
オープンフィールド試験に使用されるデバイスは、マウスの年齢によって異なる。Ｐ０からＰ６までの動物については、上記デバイスは、１５×１５×５ｃｍのプラスチックの箱で形成され、２５個の３ｃｍ×３ｃｍの正方形に分割されたフィールドの格子パターンを有する。Ｐ７からＰ２１までの動物については、２８×２８×５ｃｍのプラスチックの箱で形成され、１６個の７ｃｍ×７ｃｍの正方形に分割されたフィールドの格子パターンを有する。マウスは個別に試験され、評価デバイスは各セッションの終了時に洗浄された。最初にフィールドに中央に置かれた各マウスは、５分間自由に移動できた。この５分の間に挙動の測定値が実験者によって記録され、また横断された正方形の総数が記録された。
【0093】
予想通り、試験した全ての時点（Ｐ５、Ｐ７、Ｐ９）において、ビヒクルで治療したＳＭＡマウスは、健康な対照マウスに比べて有意に低下した運動パフォーマンスを示す（図１０Ａ）。実際には、マウスが横断できる正方形の個数は、健康な対照マウスのグループではＰ５において１７、Ｐ７において１２、Ｐ９において２４であるのに対して、Ｐ５において１０、Ｐ７において６、Ｐ９において８である（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１）。Ｐ５では、ＢＩＯ１０１によるＳＭＡマウスの治療は、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（正方形１０個）に比べて、ＳＭＡマウスの運動パフォーマンスを改善しない（正方形１１個）。Ｐ７では、ＢＩＯ１０１で治療されたマウスの運動性（１０個の正方形を横断）は、ビヒクルを投与されたＳＭＡマウス（６個の正方形を横断；ｐ＜０．０５）に比べて有意に上昇する。Ｐ９では、この差は大きくないが、ＢＩＯ１０１での治療はマウスに対する有益な効果を有する傾向があり、ＳＭＡビヒクルグループが８個の正方形を横断できるのに対して、ＳＭＡ ＢＩＯ１０１グループは１１個の正方形を横断できる（ｐ＝ｎｓ）。
【0094】
筋肉の易疲労性を評価するために、Ｐ５からＰ９までのマウスの前肢の握力を試験した（握力試験）。マウスは、空中に水平に懸架した薄い金属製ロッドから、前肢で吊り下げられる。ぶら下がっている時間を記録する。各マウスは５回の連続した試行を受け、２つの試験の間には１分の休憩を入れた。最も良好な試験のみを、筋機能の評価のために保存した。
【0095】
上記握力試験によって試験された筋肉の易疲労性は、予想通り、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスが、健康な対照マウスに比べて有意に低減した筋機能を有することを示している（図１０Ｂ）。実際には、マウスが金属ロッドから吊り下がり続けることができる時間は、健康な対照マウスのグループではＰ５において３．３秒、Ｐ７において１１．４秒、Ｐ９において１６．１秒であるのに対して、Ｐ５において０．２秒、Ｐ７において６．２秒、Ｐ９において５．６秒となる（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。Ｐ５では、ＢＩＯ１０１によるＳＭＡマウスの治療は、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（０．２秒；ｐ＜０．０５）に比べて筋肉のパフォーマンスを有意に改善する（２．３秒）。Ｐ７では、ＢＩＯ１０１による治療は、ビヒクルを投与されたＳＭＡマウスに比べて、ＳＭＡマウスのぶら下がりの時間を、有意にではないものの増大させる傾向を有する（６．２秒に対して１２．２秒、ｐ＝ｎｓ）。最後にＰ９では、ＢＩＯ１０１はこのパラメータを、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウス（５．６秒、ｐ＜０．０１）に比べて、ＢＩＯ１０１で治療されたマウスにおいて極めて有意に改善する（２０．９秒）。
【0096】
結論として、ＢＩＯ１０１は、ＳＭＡ動物の自発的運動機能及び筋肉の易疲労性に対して有益な効果を有する。
【0097】
ｇ．ＢＩＯ１０３の効果の表現型分析
同じII型マウスモデルを用いて、重篤なＳＭＡのモデルにおける分子ＢＩＯ１０３の表現型の効果を特性決定した。マウスを、ビヒクル（この場合はシクロデキストリン）と複合体化した分子ＢＩＯ１０３で、又はビヒクル単独（ＶＨ）で、毎日５０ｍｇ／ｋｇの用量の強制経口投与によって治療した。体重及び生存率を、Ｐ１１まで毎日分析した。
同じII型マウスモデルを用いて、重篤なＳＭＡのモデルにおける分子ＢＩＯ１０３の表現型の効果を特性決定した。マウスを、ビヒクル（この場合はシクロデキストリン）と複合体化した分子ＢＩＯ１０３で、又はビヒクル単独（ＶＨ）で、毎日５０ｍｇ／ｋｇの用量の強制経口投与によって治療した。体重及び生存率を、Ｐ１１まで毎日分析した。
【0098】
結果は、マウスの誕生から毎日の経口治療において、ＢＩＯ１０３（ｎ＝１２）が、動物の体重の喪失を制限する傾向を有するものの、ビヒクルで治療された動物（ｎ＝２２）と比較した場合の差は有意性の閾値に届かないことを実証している（図１１Ａ）。一方、ＢＩＯ１０３は、ビヒクルを投与されたマウス（Ｐ１１において３６．３％の生存率）に比べて、治療された動物のＰ１１より前の生存率を有意に（ｐ＜０．０５）向上させる（Ｐ１１において６６．６％の生存率）（図１１Ｂ）。
【0099】
ｈ．ＢＩＯ１０３の筋肉栄養効果の分析
採取された筋肉のヘマトキシリン‐エオシン染色断面の組織学的分析は、筋委縮症（筋繊維の断面積）に対するＢＩＯ１０３の有益な効果を示す。
採取された筋肉のヘマトキシリン‐エオシン染色断面の組織学的分析は、筋委縮症（筋繊維の断面積）に対するＢＩＯ１０３の有益な効果を示す。
【0100】
分子ＢＩＯ１０１と同様に、ＳＭＡマウスの体内に存在する筋委縮症は、筋肉の性質及び種類にかかわらず、治療によって制限される。実際に、ＢＩＯ１０３による治療により、研究対象の３つの筋肉の萎縮を有意に制限できる。
【0101】
筋繊維の断面の定量は、予想通り、この萎縮が非常に顕著であり、対照マウス（ｎ＝４）に比べてＳＭＡマウス（ｎ＝４）の前脛骨筋において５６．１％であることを示している。この萎縮は、ＢＩＯ１０３による治療（ｎ＝４）によって、Ｐ１１において２２．１％まで大幅に減少する（ｐ＜０．０５）（図１２Ａ）。これは、足底筋（健康な対照マウスに対して４６％の筋繊維の有意な萎縮がＳＭＡマウスで観察され（ｐ＜０．０５）、ＢＩＯ１０３での治療はこの萎縮を１５．３％まで大幅に制限する（ｐ＜０．０５）（図１２Ｂ））、及びヒラメ筋（ＳＭＡマウスに関して、対照に比べて５０．２％（ｐ＜０．０１）、ＢＩＯ１０３での治療によって３７．１％（ｐ＜０．０５））（図１２Ｃ）にも当てはまる。
【0102】
萎縮に対するＢＩＯ１０３の効果のより精密な分析を実施するために、筋繊維の分布を断面積のカテゴリ毎に評価した。Ｐ０からＰ１１までのＳＭＡマウスの治療によって観察された、分子ＢＩＯ１０３による萎縮の大幅な減少は、ビヒクルで治療されたＳＭＡマウスと比較して、ＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウスの、研究対象の３つの筋肉の断面積による繊維の分布に対するこの治療の有意な効果をもたらす（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ）。Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウスの前脛骨筋では、ＳＭＡビヒクルマウスのグループに対して、４００μｍ２超の断面積を有する繊維の比率の有意な上昇が観察され、一方で２００μｍ２未満の断面積を有する小さな繊維の比率が有意に低下する（ｐ＜０．０５）（図１３Ａ）。Ｐ０からＰ１１までＢＩＯ１０３で治療されたＳＭＡマウスの足底筋（図１３Ｂ）及びヒラメ筋（図１３Ｃ）では、３００μｍ２超の断面積を有する筋繊維の比率の上昇が、２００μｍ２未満の断面積を有する筋繊維の減少を伴って観察される。
【0103】
４．結論
乳児脊髄性筋萎縮症に罹患した哺乳類の運動ニューロンの形成不全、筋委縮症、及び変性に対する、ＢＩＯ１０１及びＢＩＯ１０３の特性を考えると、植物エクジソン、特にＢＩＯ１０１及びＢＩＯ１０３の、単独での、又は遺伝的変化の影響の修正を目的とする治療への捕捉物としての、使用を提案でき、これによって、筋組織及び運動ニューロンを保護し、従って、筋機能の低下及び／又は運動ニューロンの喪失をもたらす神経筋疾患の進行を遅延させることができる。神経筋疾患は特に、筋萎縮性側索硬化症及び脊髄性筋萎縮症を含む。
乳児脊髄性筋萎縮症に罹患した哺乳類の運動ニューロンの形成不全、筋委縮症、及び変性に対する、ＢＩＯ１０１及びＢＩＯ１０３の特性を考えると、植物エクジソン、特にＢＩＯ１０１及びＢＩＯ１０３の、単独での、又は遺伝的変化の影響の修正を目的とする治療への捕捉物としての、使用を提案でき、これによって、筋組織及び運動ニューロンを保護し、従って、筋機能の低下及び／又は運動ニューロンの喪失をもたらす神経筋疾患の進行を遅延させることができる。神経筋疾患は特に、筋萎縮性側索硬化症及び脊髄性筋萎縮症を含む。
【0104】
より一般的には、以上で検討されている、本発明の実装及び実施のための態様は、非限定的な例として記載されたものであること、従って他の変形例も考えられることに留意されたい。
【0105】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【国際調査報告】