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特表2022-525348ＤＮＡ結合リプレッサーを使用する原核細胞における転写制御
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-12
(54)【発明の名称】ＤＮＡ結合リプレッサーを使用する原核細胞における転写制御
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20220502BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220502BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220502BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220502BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20220502BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220502BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220502BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220502BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220502BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220502BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220502BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220502BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220502BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220502BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220502BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220502BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220502BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N7/01
C12N1/21
C12N15/11 Z
C12N15/70 Z
A61K48/00
A61P31/04
A61P3/04
A61P3/10
A61P3/00
A61P3/06
A61P1/16
A61P29/00
A61P37/06
A61P35/00
A61P31/00
A61P25/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555495
(86)(22)【出願日】2020-03-16
(85)【翻訳文提出日】2021-10-05
(86)【国際出願番号】 EP2020057112
(87)【国際公開番号】W WO2020187836
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】62/818,903
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519283484
【氏名又は名称】エリゴ・バイオサイエンス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヘスス・フェルナンデス－ロドリゲス
(72)【発明者】
【氏名】アントニーナ・クラヴジック
(72)【発明者】
【氏名】グザヴィエ・デュポルテ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA23
4C084MA28
4C084MA31
4C084MA32
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA41
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB311
4C084ZB312
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC331
4C084ZC332
4C084ZC351
4C084ZC352
(57)【要約】
本開示は、一般に、遺伝回路をある原核細胞(「ドナー細胞」)から別の原核細胞(本明細書において互換的に使用される「レシピエント細胞」又は「標的細胞」)に移入するための方法及び組成物に関する。より具体的には、本開示は、(i)目的の遺伝回路、及び(ii)1つ又は複数の発現された転写リプレッサータンパク質を含む原核ドナー細胞、並びに原核レシピエント細胞への遺伝回路の高効率の移入における前記ドナー細胞の使用に関する。遺伝回路は、目的のRNA分子又はタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝回路をドナー細胞から標的細胞に移入する方法であって、標的細胞への遺伝回路の移入を可能にするのに十分な時間、ドナー細胞を標的細胞と接触させる工程を含み、前記ドナー細胞が、遺伝回路によってコードされず標的細胞中に存在しないリプレッサータンパク質を発現し、遺伝回路が、リプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸配列を含む、方法。
【請求項2】
ドナー細胞が細菌ドナー細胞であり、標的細胞が細菌標的細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
遺伝回路が、移入前に細菌送達ビヒクル内にパッケージされる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
送達ビヒクルにパッケージされた遺伝回路が、パッケージファージミドである、請求項3に記載の方法。
【請求項5】
目的の核酸配列が、目的のタンパク質及び/又は目的のRNA分子をコードする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
目的の核酸配列が、目的のタンパク質をコードする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記目的のタンパク質が、毒素タンパク質である、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
前記毒素タンパク質が、細菌細胞、好ましくは標的細胞に対して毒性である、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記タンパク質が、ヌクレアーゼ、好ましくはCRISPRヌクレアーゼである、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記毒素タンパク質が、ホリン、エンドリシン、制限酵素、又は標的細胞の生存若しくは増殖に影響する毒素からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項11】
前記目的のタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項6から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
目的の核酸配列が、目的のRNA分子をコードする、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記目的のRNA分子が、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA、asRNA、リボザイムRNA、ガイドRNA、及びRNAアプタマーからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
前記目的のRNA分子が、asRNAである、請求項12に記載の方法。
【請求項15】
前記目的のRNA分子が、ガイドRNAである、請求項12に記載の方法。
【請求項16】
目的の核酸配列が、CRISPRヌクレアーゼをコードし、遺伝回路が、ガイドRNAをコードする核酸配列を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ガイドRNAをコードする核酸配列が、構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
目的の核酸配列が、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA(干渉RNA)、asRNA(アンチセンスRNA)、リボザイムRNA、RNAアプタマー若しくはガイドRNA等のRNAをコードする核酸、CRISPR遺伝子座、毒素遺伝子、ヌクレアーゼ若しくはキナーゼ等の酵素をコードする遺伝子、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、TALEN、ZFN及びメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする遺伝子、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質若しくは分泌タンパク質をコードする遺伝子、一般に抗生物質若しくは薬物に対する耐性をコードする遺伝子、毒素タンパク質若しくは毒素因子をコードする遺伝子、並びに病原性タンパク質若しくは病原性因子をコードする遺伝子、又は任意のこれらの組合せである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
目的の核酸配列が、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、CRISPR遺伝子座、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、キナーゼ、TALEN、ZFN、メガヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質、分泌タンパク質、抗生物質又は薬物に対する耐性を付与するタンパク質、毒素タンパク質又は毒素因子、病原性タンパク質及び病原性因子の1つ又は複数をコードする核酸からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
リプレッサータンパク質が、Table 1(表1)に列挙したリプレッサータンパク質からなる群から選択され、好ましくはPhlF、SrpR、LitR、PsrA、AmeR、McbR、QacR、TarA、ButR、Orf2、及びScbRからなる群から選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ドナー細胞によって発現されるが、遺伝回路によってコードされないリプレッサータンパク質によって制御された転写プロモーターを含む遺伝回路を含むドナー細胞。
【請求項22】
遺伝回路が、目的の核酸配列、特に、転写プロモーターの制御下に置かれた請求項5から19のいずれか一項に規定の目的の核酸配列を含む、請求項21に記載のドナー細胞。
【請求項23】
ドナー細胞が、バクテリオファージ粒子への遺伝回路のアセンブリーに必要なバクテリオファージ成分をトランスで提供するプロファージ配列を含む、請求項21又は22に記載のドナー細胞。
【請求項24】
遺伝回路が、キャプシドへの遺伝回路のキャプシド化を媒介するシス作用性パッケージングシグナルを含む、請求項23に記載のドナー細胞。
【請求項25】
前記遺伝回路が、ファージミドである、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法、又は請求項21から24のいずれか一項に記載のドナー細胞。
【請求項26】
前記ドナー細胞が、細菌細胞である、請求項1から20及び25のいずれか一項に記載の方法、又は請求項21から25のいずれか一項に記載のドナー細胞。
【請求項27】
前記ドナー細胞が、大腸菌種由来の細菌細胞である、請求項1から20、25及び26のいずれか一項に記載の方法、又は請求項21から26のいずれか一項に記載のドナー細胞。
【請求項28】
請求項3に記載の方法によって得られる遺伝回路を含む送達ビヒクル。
【請求項29】
前記送達ビヒクルが、細菌送達ビヒクル、好ましくはバクテリオファージである、請求項28に記載の送達ビヒクル。
【請求項30】
送達ビヒクルを産生する方法であって、(i)遺伝回路を、リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞に導入する工程であって、前記遺伝回路が、前記リプレッサータンパク質によって認識されるリプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸を含み、リプレッサータンパク質が、遺伝回路によってコードされない、工程;並びに
(ii)目的の遺伝回路の複製、及び送達ビヒクルへの遺伝回路のパッケージングに十分な時間を与える工程
を含む、方法。
【請求項31】
送達ビヒクルを収集する工程を更に含む、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
送達ビヒクルを精製する工程を更に含む、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項33】
ドナー細胞、好ましくは細菌ドナー細胞が、送達ビヒクルへの遺伝回路のアセンブリーにトランスで必要なタンパク質をコードするプロファージ配列を含む、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
遺伝回路が、ファージミドである、請求項30から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
送達ビヒクルが、細菌送達ビヒクル、好ましくはバクテリオファージである、請求項30から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
送達ビヒクルが、リプレッサータンパク質を発現しない標的細胞、好ましくは細菌標的細胞において使用される、請求項30から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
請求項30から36のいずれか一項に記載の方法によって得られる送達ビヒクル。
【請求項38】
リプレッサータンパク質によって制御される転写プロモーターと、前記転写プロモーターの制御下に置かれた目的の核酸配列とを含む遺伝回路であって、前記遺伝回路が、リプレッサータンパク質をコードせず、細菌送達ビヒクル内にパッケージされる、遺伝回路。
【請求項39】
前記遺伝回路が、ファージミドである、請求項38に記載の遺伝回路。
【請求項40】
遺伝回路をドナー細胞から標的細胞に移入するための、請求項37に記載の送達ビヒクル、又は請求項38若しくは39に記載の遺伝回路の使用であって、ドナー細胞がリプレッサータンパク質を発現し、標的細胞が前記リプレッサータンパク質を発現しない、使用。
【請求項41】
請求項28、29若しくは37に記載の送達ビヒクル、及び/又は請求項38若しくは39に記載の遺伝回路、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物又は獣医学用組成物。
【請求項42】
目的の送達ビヒクルを産生するためのキットであって、前記キットが、(i)リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞と;(ii)目的の核酸が挿入されている発現カセット、及びリプレッサータンパク質が結合し、目的の核酸の発現を抑制するリプレッサー結合配列を含む遺伝回路とを含むキット。
【請求項43】
リプレッサータンパク質を発現しない標的細胞を更に含み、それによって標的細胞への移入後に目的の核酸の発現を可能にする、請求項42に記載のキット。
【請求項44】
目的の核酸が挿入されている発現カセットと、リプレッサータンパク質が結合し、目的の核酸の発現を抑制するリプレッサー結合配列とを含む遺伝回路を、ドナー細胞から標的細胞に移入するための、請求項42又は43に記載のキットの使用であって、前記ドナー細胞がリプレッサータンパク質を発現し、前記標的細胞が前記リプレッサータンパク質を発現しない、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、遺伝回路をある原核細胞(「ドナー細胞」)から別の原核細胞(本明細書において互換的に使用される「レシピエント細胞」又は「標的細胞」)に移入するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
所与のプロモーターからの転写を制御する誘導システムは、分子生物学における有用なツールである[1]～[3]。一般に、これらのシステムは、その同種のDNAオペレーターへの結合が誘導因子の存在に依存するタンパク質リプレッサーで構成される。誘導因子の非存在下において、リプレッサーは、そのオペレーターを認識することができ、プロモーターからの転写を防ぎ;誘導因子が存在する場合、リプレッサーは、誘導因子がリプレッサーのドメインに結合することによって、又はその3D立体構造を変化させることによってのいずれかで、もはやそのオペレーターを認識することができず、したがって、転写を活性化する。誘導因子は、化学物質(IPTG、糖、小分子、タンパク質等)又は物理的(熱、光、圧力、pH等)であり得る。転写を防止するか、又は細胞で作られるタンパク質の量を減少させる多くの他の方法がある:タンパク質のコンディショナルな分解、産生株におけるプラスミドのコピー数の減少等。これらは、プロモーター自体を抑制しないが、遺伝回路の他の成分に作用する[22]。
【0003】
いくつかの場合では、宿主中で特定の遺伝子の転写/翻訳を制御しながら、誘導因子の非存在下、標的細菌中でそれを活性化することができることが望ましくあり得る。例えば、標的細菌に対して毒性のタンパク質及び/又は核酸のファージミド形質導入の場合、例えばCRISPR-Cas9含有回路[14]の場合において、粒子を産生するために使用される株が回路によってコードされる毒素タンパク質及び/又は核酸を発現しないことが必須であり、そうでなければ産生株は、死滅するか又は非常に損傷を受ける。しかしながら、毒素タンパク質及び/又は核酸が、標的株において発現/転写されて、標的株における配列特異的細胞死等の細胞死、又は任意の他のタイプの所望の機能のいずれかを誘導することが必要である。これは、標的株に注入される任意の他の毒素成分にも当てはまり、産生株に対しても毒性になり得る。更に、遺伝回路における成分の構成的発現は、特にそれらが負荷(毒素成分、又は産生株において望まない機能を有する任意の成分等)を課す場合、細胞に対して不利であり、それらが削除又は変異する傾向があり、設計及び成分の望まない破損を引き起こすことが示されている[15]。その意味で、産生株においてのみ作用するコンディショナルなリプレッサーを有することは、エンジニアリング/製造の観点から有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第2014124226号
【特許文献2】米国特許出願番号第62/771,761号
【特許文献3】米国特許出願番号第第62/802,777号
【特許文献4】米国特許出願番号第第62/783,258号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Chemical Reviews 2016年、116 (20) 12655～12687頁
【非特許文献2】Kues, U and Stahl, U 1989年、Microbiol Rev 53:491～516頁
【非特許文献3】Del Solarら、1998年、Microhio and Molec Biol. Rev 62:434～464頁
【非特許文献4】Cotterら、Nature Reviews Microbiology 11:95頁、2013年
【非特許文献5】Jinekら、Science 2012年
【非特許文献6】Fonfaraら、Nucleic Acids Res 42 (4)、2014年
【非特許文献7】Kooninら、Nat Rev Microbiol 15(3)、2017年
【非特許文献8】Henkelら、(Toxins from Bacteria in EXS. 2010年; 100: 1～29頁)
【非特許文献9】Krupovicら、Arch Virol、2015年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
遺伝回路の形質導入の特定の場合のために提案された解決手段が提示されており、正のレギュレーター(ファージポリメラーゼ及びその同種のプロモーター)を含む。標的細胞は、ファージミドによって形質導入される他の成分と共に、プロモーター又はポリメラーゼのいずれかのみを含有し得る[12][13]。しかしながら、これは、成分の1つを形質転換することが難しいので、野生型株と共に働く場合、又は回路の構成要素の1つを標的細胞に事前ロードすることができない環境において(例えば、腸の環境)、実質的な手法ではない。
【0007】
このための別の可能な解決手段は、トランスの毒素成分の発現を制御するリプレッサー、すなわち、パッケージされる回路中でコードされないリプレッサーを発現させることであろう。この場合において、リプレッサーは、産生株にのみ存在するが、標的株には存在しない。しかしながら、この手法に関する主な問題がある:ファージミドの産生に使用される株は、標的化することが必要な株と同じ種(又は、少なくとも非常に密接に関連する)であるので、使用されるリプレッサーは慎重に選択する必要がある。例えば、AraC又はLacIを使用することで、産生株における毒素成分の転写がトランスで効果的に抑制され、この方法で産生したファージミドは、「ネイキッド」構成的プロモーターを標的株に注入する。しかしながら、これらが野生型株である場合、それらはほぼおそらく、LacI又はAraCについてそれら自身の遺伝子を含有し、そのため、注入されたプロモーターは直ぐに抑制される。TetR等の抗生物質誘導システムでさえ、多くの野生型株において非常に一般的に見出される。同じことが、ファージマスター-リプレッサー-プロモーターの対を使用する場合に起こり得る:野生型株は、それらのゲノムに多くのプロファージを持ち、これらの多くは使用されるプロモーターを認識するリプレッサーをコードし得る。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書では、原核細胞(本明細書では、「ドナー細胞」と呼ばれる)から別の原核細胞(本明細書では「レシピエント細胞」又は「標的細胞」と呼ばれる)への目的の遺伝回路の移入における使用のための新規の方法及び組成物を記載する。特定の態様では、原核細胞は、細菌細胞である。更に、遺伝回路は、リプレッサー結合配列(本明細書では、プロモーター/オペレーターとも呼ばれる)の転写制御下の目的の核酸を含む。前記目的の核酸配列は、目的のタンパク質又はRNAをコードし得る。
【0009】
開示する方法及び組成物は、ドナー細胞における1つ又は複数のリプレッサータンパク質の発現、及びドナー細胞に存在する場合に目的の核酸配列の転写を抑制するように機能する遺伝回路内に位置するリプレッサー結合配列の存在に基づく。遺伝回路は、前記1つ又は複数のリプレッサータンパク質をコードしない。したがって、レシピエント細胞への遺伝回路の移入において、前記レシピエント細胞が、前記1つ又は複数のリプレッサータンパク質の発現の欠如のために選択され、その結果、目的の核酸配列が転写される。
【0010】
遺伝回路をドナー細胞からレシピエント細胞又は標的細胞に移入するための方法が提供される。前記移入は、様々な異なる方法によって達成され得る。そのような移入の非限定的な例としては、細菌の形質導入、コンジュゲーション及び形質転換が挙げられる。特定の一態様では、バクテリオファージ足場等の細菌送達ビヒクルは、遺伝回路をレシピエント細胞又は標的細胞に高効率で移入するための手段として、ドナー細胞においてアセンブルされる。そのような場合では、ドナー細胞は、バクテリオファージ粒子への遺伝回路のアセンブリーに必要なキャプシドタンパク質等のバクテリオファージ成分をトランスで提供するプロファージ配列を含む。更に、遺伝回路は、キャプシドへの遺伝回路のキャプシド化を媒介するシス作用性パッケージングシグナルを含有するように操作される。
【0011】
したがって、本発明は、遺伝回路をドナー細胞から標的細胞に移入する方法であって、標的細胞への遺伝回路の移入を可能にするのに十分な時間、ドナー細胞を標的細胞と接触させる工程を含み、前記ドナー細胞が、遺伝回路によってコードされず標的細胞中に存在しないリプレッサータンパク質を発現し、遺伝回路が、リプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸配列を含む、方法に関する。ドナー細胞は、細菌ドナー細胞であり得、標的細胞は、細菌標的細胞であり得る。遺伝回路は、移入前に細菌送達ビヒクル内にパッケージされ得る。好ましくは、送達ビヒクルにパッケージされた遺伝回路は、パッケージファージミドである。目的の核酸配列は、目的のタンパク質及び/又は目的のRNA分子をコードし得る。特に、目的の核酸配列は、(i)毒素タンパク質、好ましくは細菌細胞、特に標的細胞に対して毒性のタンパク質、より詳細にはホリン、エンドリシン、制限酵素、及び標的細胞の生存又は増殖に影響する毒素からなる群から選択される毒素タンパク質である、(ii)ヌクレアーゼ、好ましくはCRISPRヌクレアーゼであるか、及び/又は治療用タンパク質である、タンパク質をコードし得る。或いは、又は更に、目的の核酸配列は、目的のRNA分子、特にmRNA、crRNA、tRNA、iRNA、asRNA、リボザイムRNA、ガイドRNA、及びRNAアプタマーからなる群から選択される目的のRNA分子をコードし得る。特定の実施形態では、目的の核酸配列は、CRISPRヌクレアーゼをコードし、遺伝回路は、ガイドRNAをコードする核酸配列、好ましくは構成的プロモーターの転写制御下にあるガイドRNAをコードする前記核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸配列は、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA(干渉RNA)、asRNA(アンチセンスRNA)、リボザイムRNA、RNAアプタマー若しくはガイドRNA等のRNAをコードする核酸、CRISPR遺伝子座、毒素遺伝子、ヌクレアーゼ若しくはキナーゼ等の酵素をコードする遺伝子、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、TALEN、ZFN及びメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする遺伝子、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質若しくは分泌タンパク質をコードする遺伝子、一般に抗生物質若しくは薬物に対する耐性をコードする遺伝子、毒素タンパク質若しくは毒素因子をコードする遺伝子、並びに病原性タンパク質若しくは病原性因子をコードする遺伝子、又は任意のこれらの組合せである。より詳細には、目的の核酸配列は、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、ガイドRNA、CRISPR遺伝子座、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、キナーゼ、TALEN、ZFN、メガヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質、分泌タンパク質、抗生物質又は薬物に対する耐性を付与するタンパク質、毒素タンパク質又は毒素因子、病原性タンパク質、及び病原性因子の1つ又は複数をコードする核酸からなる群から選択され得る。好ましくは、リプレッサータンパク質は、Table 1(表1)に列挙したリプレッサータンパク質からなる群から選択され、好ましくはPhlF、SrpR、LitR、PsrA、AmeR、McbR、QacR、TarA、ButR、Orf2、及びScbRからなる群から選択される。
【0012】
方法はまた、例えば、所望の遺伝回路のレシピエント細胞又は標的細胞への高効率の移入における使用のための細菌送達ビヒクルであるパッケージファージミドの産生のために提供される。本開示は、目的の細菌送達ビヒクルの産生の間に、毒素若しくは望まないタンパク質及び/又はRNA分子をコードする核酸等の目的の核酸の制御された発現のために1つ又は複数のリプレッサータンパク質を発現する、本明細書に記載のドナー細胞の使用に関する。ドナー細胞における目的の核酸の抑制された転写は、目的の核酸に近接近したリプレッサー結合配列の機能的位置決めから生じ得る。或いは、ドナー細胞における目的の核酸の抑制された転写は、目的の核酸から離れたリプレッサー結合配列の機能的位置決めから生じ得る。対照的に、レシピエント細胞又は標的細胞に移入されると、目的の核酸は、前記細胞中の前記1つ又は複数のリプレッサータンパク質の非存在、及び遺伝回路内の前記リプレッサータンパク質をコードする核酸配列の非存在に起因して、転写される。
【0013】
一態様では、本発明のドナー細胞を使用する送達ビヒクルを産生する方法を提供する。特定の実施形態では、送達ビヒクルは、送達ビヒクルの形成を可能にする条件下で本明細書に記載の目的の遺伝回路をドナー細胞に導入することによって調製される。例えば、特定の実施形態では、方法は、(i)ドナー細胞に目的の遺伝回路を導入する工程;並びに(ii)目的の遺伝回路の複製、及び送達ビヒクルへの遺伝回路のパッケージングに十分な時間を与える工程を含む。一態様では、方法は、送達ビヒクルを収集する工程、及び場合により送達ビヒクルを精製する工程を更に含み得る。特に、本発明は、送達ビヒクルを産生する方法であって、i)遺伝回路を、リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞に導入する工程であって、前記遺伝回路が、前記リプレッサータンパク質によって認識されるリプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸を含み、リプレッサータンパク質が、遺伝回路によってコードされない、工程;並びに目的の遺伝回路の複製、及び送達ビヒクルへの遺伝回路のパッケージングに十分な時間を与える工程を含む、方法に関する。方法は、送達ビヒクルを収集する工程、及び場合により送達ビヒクルを精製する工程を更に含み得る。好ましくは、前記方法では、ドナー細胞、好ましくは細菌ドナー細胞は、送達ビヒクルへの遺伝回路のアセンブリーにトランスで必要なタンパク質をコードするプロファージ配列を含む。好ましくは、遺伝回路は、ファージミドであり、及び/又は送達ビヒクルは、細菌送達ビヒクル、より好ましくはバクテリオファージである。特に、送達ビヒクルは、リプレッサータンパク質を発現しない、標的細胞、好ましくは細菌標的細胞において使用され得る。本発明は、前記方法によって得られる送達ビヒクルにも関する。本発明は、リプレッサータンパク質によって制御される転写プロモーターと、前記転写プロモーターの制御下に置かれた目的の核酸配列とを含む遺伝回路であって、前記遺伝回路が、リプレッサータンパク質をコードせず、細菌送達ビヒクル内にパッケージされる、遺伝回路にも関する。好ましくは、前記遺伝回路は、ファージミドである。本発明は、遺伝回路をドナー細胞から標的細胞に移入するための本発明の送達ビヒクル又は遺伝回路の使用であって、ドナー細胞がリプレッサータンパク質を発現し、標的細胞が前記リプレッサータンパク質を発現しない、使用にも関する。
【0014】
更に別の態様では、本発明は、1つ又は複数の発現されたリプレッサータンパク質及び目的の遺伝回路を含むドナー細胞を提供する。好ましくは、目的の遺伝回路は、前記1つ又は複数の発現されたリプレッサータンパク質によって認識されるリプレッサー結合配列の転写制御下に置かれた目的の核酸配列を含む。更に、送達ビヒクルを産生する特定の実施形態では、ドナー細胞は、送達ビヒクルへの目的の遺伝回路のアセンブリーにトランスで必要なタンパク質をコードするプロファージ配列も含み得る。そのようなタンパク質は、例えば、構造バクテリオファージタンパク質、例えばキャプシドタンパク質を含む。いくつかの特定の態様では、本発明は、ドナー細胞によって発現されるが、遺伝回路によってコードされないリプレッサータンパク質によって制御された転写プロモーターを含む遺伝回路を含むドナー細胞に関する。好ましくは、遺伝回路は、転写プロモーターの制御下に置かれた目的の核酸配列を含む。ドナー細胞は、バクテリオファージ粒子への遺伝回路のアセンブリーに必要なバクテリオファージ成分をトランスで提供するプロファージ配列を更に含み得る。遺伝回路は、キャプシドへの遺伝回路のキャプシド化を媒介するシス作用性パッケージングシグナルを更に含み得る。
【0015】
本開示のドナー細胞は、目的の遺伝回路を含む。本発明の特定の実施形態では、遺伝回路は、リプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸を有する発現カセット又は転写カセットを含む。そのような目的の核酸は、例えば、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA(干渉RNA)、asRNA(アンチセンスRNA)、リボザイムRNA、RNAアプタマー若しくはガイドRNA等のRNAをコードする核酸、CRISPR遺伝子座、毒素遺伝子、ヌクレアーゼ若しくはキナーゼ等の酵素をコードする遺伝子、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、TALEN、ZFN及びメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする遺伝子、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質若しくは分泌タンパク質をコードする遺伝子、一般に抗生物質若しくは薬物に対する耐性をコードする遺伝子、毒素タンパク質若しくは毒素因子をコードする遺伝子、並びに病原性タンパク質若しくは病原性因子をコードする遺伝子、又は任意のこれらの組合せからなる群から選択される。本発明の一実施形態では、目的の核酸は、治療用タンパク質をコードする。別の実施形態では、核酸は、アンチセンス核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、2つ以上の目的の分子をコードする。特に、これらの分子の1つは、ヌクレアーゼ、例えばCasヌクレアーゼであり得、別のものは、ガイドRNA等の核酸分子であり得る。一態様では、目的の核酸は、レシピエント細胞若しくは標的細胞のゲノム、又はレシピエント細胞若しくは標的細胞のプラスミドの切断を行うヌクレアーゼをコードする。いくつかの態様では、切断は、抗生物質耐性遺伝子に起こる。本発明の別の実施形態では、目的の核酸は、レシピエント細胞又は標的細胞のゲノムの切断を標的化するヌクレアーゼをコードし、前記ヌクレアーゼは、細胞のゲノムへの目的の核酸の挿入のための相同組換え事象を刺激するように設計される。
【0016】
好ましくは、本発明の方法又は本発明のドナー細胞では、遺伝回路は、ファージミドであり、及び/又はドナー細胞は、細菌細胞、より好ましくは大腸菌種由来の細菌細胞である。
【0017】
本開示は、ドナー細胞、又は前記ドナー細胞においてアセンブルされる1つ若しくは複数の細菌送達ビヒクル、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物又は獣医学用組成物も提供する。本開示は、本発明の送達ビヒクル及び/又は遺伝回路、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物又は獣医学用組成物も提供する。細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症を処置するための方法であって、処置を必要とする前記疾患又は障害を有する対象に、提供した医薬組成物又は獣医学用組成物を投与する工程を含む、方法も提供する。更に、(i)医薬としての使用のため、特に、細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症の処置における使用のための本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物、及び(ii)細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症を処置するための医薬の製造のための本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物の使用を提供する。細菌集団を本明細書に開示する組成物と接触させる工程を含む、細菌集団、特に、細菌感染症を有する対象における病原性細菌及び/又は抗生物質耐性細菌の量を減少させるための方法を提供する。更に、細菌集団、特に、細菌感染症を有する対象における病原性細菌及び/又は抗生物質耐性細菌の量を減少させるための医薬の製造のための本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物の使用を提供する。
【0018】
本開示は、ドナー細胞からレシピエント細胞又は標的細胞への目的の遺伝回路の移入における使用のためのキットを更に提供する。一実施形態では、キットは、(i)リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞;及び(ii)目的の遺伝回路を含む。前記遺伝回路は、前記リプレッサータンパク質によって認識されるリプレッサー結合配列に機能的に近接して目的の核酸が挿入され得る発現カセットを含み得る。場合により、キットのドナー細胞は、送達ビヒクル、例えば目的の遺伝回路のパッケージングのためのバクテリオファージタンパク質のアセンブリーのためのプロファージ配列を含有し得る。キットは、レシピエント細胞又は標的細胞を更に含み得、前記レシピエント細胞又は標的細胞は、リプレッサータンパク質を発現せず、それによって前記細胞への移入後に目的の核酸の発現を可能にする。
【0019】
本明細書に開示する主題をより理解するため、及び実際にどのように実行され得るか例示するため、非限定的な例により、添付の図面を参照して、ここで実施形態を記載する。図面の特定の参照により、示した特色は、例による、及び本発明の実施形態の図解の目的のためであることを強調する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図1は、種間リプレッサーによるコンディショナルな転写制御を表す図である。左側、パッケージングプロファージ及びPhlFリプレッサーをトランスで含有するドナー株。遺伝回路は、PphlFプロモーターの制御下のパッケージングシグナル及び目的の核酸(アクチュエータータンパク質をコードする)を持つ。遺伝回路のパッケージングの際に、標的細胞又はレシピエント細胞は形質導入され得、PphlFプロモーターは、レシピエント細胞がPhlFリプレッサー(大腸菌に存在しない)を欠くので、活性である。PhlFリプレッサーが、プロモーター、RBS又はアクチュエーターの配列を標的化するdCas9+gRNAと置き換わり得ることに留意されたい。
【図2】図2は、Cas9含有遺伝回路の形質転換を表す図である。PphlFプロモーターの制御下のCas9、及びlacZを標的化する構成的sgRNAガイドを含有するプラスミドを、MG1655(左パネル)又はMG1656(右パネル)に形質転換した。空の細胞(任意の他のプラスミドを持たない)を上に示し、PhlFリプレッサーをコードする外部のプラスミドを含有する形質転換細胞を下に示す。
【図3】図3は、Cas9含有遺伝回路の形質導入を表す図である。PphlFプロモーターの制御下のCas9、及びlacZを標的化する構成的sgRNAガイドを含有するファージミドを、MG1655(左パネル)、プラスミド中にコードされるPhlFリプレッサーを有するMG1655(中央)又はMG1656(右パネル)に形質導入した。
【図4】図4は、Cpf1含有遺伝回路の形質転換を表す図である。PsrpRプロモーターの制御下のCpf1、及びlacZ(p455)を標的化する構成的crRNAガイドを含有するプラスミドを、MG1655(左パネル)又はMG1656(右パネル)に形質転換した。空の細胞(任意の他のプラスミドを持たない)を上の行に示し、SrpRリプレッサー(pRARE4-SrpR-1.0)をコードする外部のプラスミドを含有する形質転換細胞を下に示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
遺伝回路のレシピエント細胞又は標的細胞への送達のための新規の手法を本明細書に開示する。一態様では、新規の方法は、所望の遺伝回路の標的細胞への高効率の移入における使用のための細菌送達ビヒクルの産生のために提供される。本開示の方法及び組成物は、毒素タンパク質等のタンパク質、及び/又はRNA分子等の核酸の制御された発現のための1つ又は複数のリプレッサータンパク質を発現するドナー細胞の使用に基づく。これは、例えば遺伝回路が毒素タンパク質及び/又はRNA分子を発現するように設計される場合に特に重要である。
【0022】
1つ又は複数のリプレッサータンパク質を発現するドナー細胞を提供する。好ましい実施形態では、用語「ドナー細胞」は、ドナー細菌細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「リプレッサータンパク質」は、好ましくは、核酸上の特異的部位(本明細書では、「リプレッサー結合配列」)に結合し、近くの遺伝子の転写を防ぐタンパク質を指す。典型的には、リプレッサータンパク質は、リプレッサー結合配列(オペレーター)へのその結合によりRNAポリメラーゼのプロモーターへの結合をブロックし、そのようにして遺伝子の転写を防ぐ、DNA結合タンパク質である。前記ドナー細胞は、1つ又は複数のリプレッサータンパク質を天然で発現する細胞であり得る。或いは、ドナー細胞は、1つ又は複数のリプレッサータンパク質を発現するように組換え操作され得る。更に、提供するドナー細胞は、目的の遺伝回路を含み、前記遺伝回路は、リプレッサー結合配列の転写調節下の目的の核酸を含有し、前記リプレッサー結合配列に結合することができるリプレッサータンパク質をコードする核酸を含有しない。ドナー細胞によって発現される少なくとも1つのリプレッサータンパク質は、前記リプレッサー結合配列に結合することができ、それによって目的の核酸の転写を防ぐ。前記目的の核酸は、目的のタンパク質及び/又はRNAをコードし得る。
【0023】
ドナー細胞において用いられ得るリプレッサータンパク質は、例えば、Table 1(表1)に列挙するものを含む。一実施形態では、ドナー細胞は、Table 1(表1)に列挙するリプレッサータンパク質から選択されるリプレッサータンパク質を発現し、遺伝回路内に含有される目的の核酸は、前記リプレッサータンパク質によって結合するリプレッサー結合配列の転写調節下にある。
【0024】
【表1A】
【0025】
【表1B】
【0026】
そのようなリプレッサータンパク質に対応するリプレッサー結合配列は、当技術分野で周知であり、当業者は、リプレッサータンパク質/リプレッサー結合配列の機能的な対を容易に選択し得る。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は、遺伝回路内に含有される1つ又はいくつかのリプレッサー結合配列に対応する1つ又はいくつかのリプレッサータンパク質を発現する。ドナー細胞によって発現されるリプレッサータンパク質及び/又は遺伝回路に含まれるリプレッサー結合配列は、ドナー細胞と異種であり得、すなわち、前記ドナー細胞に天然に存在しない。特に、ドナー細胞によって発現されるリプレッサータンパク質及び/又は遺伝回路に含まれるリプレッサー結合配列は、ドナー細胞とは異なる細菌種、好ましくは異なる細菌属に由来し得る。好ましくは、ドナー細胞によって発現されるリプレッサータンパク質及び/又は遺伝回路に含まれるリプレッサー結合配列は、ドナー細胞に対して内在性であり、すなわち、前記ドナー細胞に天然に存在する。
【0027】
他の実施形態では、リプレッサータンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くCRISPRヌクレアーゼである。この実施形態では、リプレッサータンパク質は、目的の核酸の転写に必要な配列を標的化するガイドRNAと組み合わせて使用される。この実施形態では、ドナー細胞は、したがって、リプレッサータンパク質として作用するCRISPRヌクレアーゼに加えて、前記ガイドRNAも発現する。特に、ガイドRNAは、目的の核酸に作動可能に連結された、プロモーター、RBS又はリプレッサー結合配列等の制御配列を標的化し得る。或いは、ガイドRNAは、目的の核酸のコード領域等の非制御配列を標的化し得る。この場合では、前記非制御配列は、リプレッサー結合配列として考えられるべきである。このガイドRNAのおかげで、ヌクレアーゼ活性を欠くCRISPRヌクレアーゼは、任意の破壊を誘導することなく標的化配列に結合することができ、それによって遺伝回路の完全性を変えることなく目的の核酸の転写を防ぐ。死Cas9(dCas9)等のヌクレアーゼ活性を欠くCRISPRヌクレアーゼは、当業者に周知である。
【0028】
リプレッサータンパク質の発現に加えて、ドナー細胞は、細菌送達ビヒクル、例えばバクテリオファージ足場のアセンブリーのために必要な成分をトランスで提供するパッケージングプロファージを更に含み得る。産生すると、送達ビヒクルは、目的の遺伝回路をレシピエント細胞又は標的細胞に移入するために有利に使用され得る。レシピエント細胞又は標的細胞におけるリプレッサータンパク質の非存在は、移入された目的の遺伝回路の発現をもたらす。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝回路」は、好ましくは、核酸構築物、好ましくは、線状又は環状二本鎖DNA分子を指し、転写プロモーター(「プロモーター」)及びリプレッサー結合配列(ドナー細胞によって発現される少なくとも1つのリプレッサータンパク質によって認識される)を含む制御配列に作動可能に連結された1つ又は複数の目的の核酸を含む。遺伝回路は、転写プロモーターを含む1つ又はいくつかの制御配列に作動可能に連結された1つ又は複数の更なる核酸配列を更に含み得る。特に、遺伝回路は、プロモーター及びリプレッサー結合配列(ドナー細胞によって発現される少なくとも1つのリプレッサータンパク質によって認識される)を含む制御配列に作動可能に連結された1つ又は複数の目的の核酸、並びに構成的プロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数の核酸配列を含み得る。例えば、特定の実施形態では、遺伝回路は、プロモーター及びリプレッサー結合配列(ドナー細胞によって発現される少なくとも1つのリプレッサータンパク質によって認識される)を含む制御配列に作動可能に連結されたCRISPRヌクレアーゼをコードする目的の核酸、並びに構成的プロモーターに作動可能に連結されたガイドRNAをコードする核酸配列を含む。用語「作動可能に連結された」とは、制御配列が前記核酸の発現を指示するような方法で、目的の核酸に対して適切な位置に制御配列が置かれる配置を意味する。場合により、遺伝回路は、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、リボザイム、ヘアピン形成配列、リボソーム結合部位、シグナルペプチド配列及び/又は転写ターミネーター等の他の制御配列を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝回路は、プラスミド又はファージミドであり、すなわち、パッケージングのためにシグナル伝達する遺伝子配列を含む。より好ましくは、遺伝回路は、ファージミドである。
【0030】
一態様では、本発明のドナー細胞株を使用する送達ビヒクルを産生する方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「送達ビヒクル」は、好ましくは、遺伝回路の細胞への移入を可能にする任意の手段を指す。好ましくは、送達ビヒクルは、遺伝回路の細菌細胞への移入を可能にする(「細菌送達ビヒクル」)。特定の実施形態では、送達ビヒクルは、送達ビヒクルの形成を可能にする条件下で本明細書に記載の遺伝回路を好適なドナー細胞に導入することによって調製される。例えば、特定の実施形態では、方法は、(i)ドナー細胞に目的の遺伝回路を導入する工程;並びに(ii)遺伝回路の複製、及び送達ビヒクルへの遺伝回路のパッケージングに十分な時間を与える工程を含む。より詳細には、送達ビヒクルを産生する方法は、(i)上記に定義する目的の遺伝回路、及び送達ビヒクル(例えば、バクテリオファージ足場タンパク質)への遺伝回路のアセンブリーのためにトランスで必要なタンパク質をコードするプロファージ配列を、上記に定義するドナー細胞、好ましくは細菌ドナー細胞に導入する工程;並びに(ii)遺伝回路の複製、及び細菌送達ビヒクルへの遺伝回路のパッケージングに十分な時間を与える工程を含み得る。一態様では、方法は、送達ビヒクルの収集工程、及び場合により送達ビヒクルの精製工程を更に含み得る。
【0031】
更に別の態様では、本発明は、リプレッサータンパク質をコードする配列を含むリプレッサータンパク質発現カセットを含むドナー細胞を提供する。ドナー細胞は、リプレッサータンパク質をコードする配列、又はいくつかのリプレッサータンパク質をコードするいくつかの配列を含む、リプレッサータンパク質発現カセットを含み得る。更にこれらの実施形態のいずれかでは、ドナー細胞は、遺伝回路(又は遺伝回路全体)に含まれる目的の核酸ペイロードの送達ビヒクルへのパッケージングのためにトランスで必要なタンパク質をコードするプロファージ配列を含み得る。そのようなタンパク質は、例えば、構造バクテリオファージタンパク質、例えばキャプシドタンパク質を含む。
【0032】
目的のタンパク質又はRNA分子をコードする目的の核酸を含む遺伝回路の、ドナー細胞から所望のレシピエント細胞又は標的細胞への移入を可能にする方法を提供する。遺伝回路及びドナー細胞は、上記に定義の通りであり得る。標的細胞は、好ましくは細菌細胞であり、ドナー細胞において遺伝回路に含有される目的の核酸の転写を負に調節することが見出されたリプレッサータンパク質を発現しない。前記方法は、遺伝回路の移入のために十分な時間、前記ドナー細胞を前記レシピエント細胞又は標的細胞と接触させる工程を含み得る。或いは、細菌送達ビヒクルが産生する場合(例えば、バクテリオファージ足場を含むドナー細胞を使用する)、方法は、前記レシピエント細胞又は標的細胞を、ドナー細胞において産生する細菌送達ビヒクルと接触させる工程を含み得る。移入される遺伝回路は、リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞によって負に調節されるリプレッサー結合配列の制御下の目的の核酸を含む。そのような場合では、目的のタンパク質又はRNA分子をコードする目的の核酸の転写は、ドナー細胞におけるリプレッサータンパク質の発現により抑制される。本明細書で提供する方法は、1つ若しくは複数の目的のタンパク質又はRNA分子をコードする核酸を含む遺伝回路が、リプレッサータンパク質を発現しない、好ましくはリプレッサータンパク質を天然で欠き、それにより目的のペイロードの転写を可能にする所望の標的宿主細胞に移入されるのを可能にする。
【0033】
本発明の特定の実施形態では、目的の核酸は、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA(干渉RNA)、asRNA(アンチセンスRNA)、リボザイムRNA、RNAアプタマー若しくはガイドRNA等のRNAをコードする核酸、CRISPR遺伝子座、毒素遺伝子、ヌクレアーゼ若しくはキナーゼ等の酵素をコードする遺伝子、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、TALEN、ZFN及びメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする遺伝子、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質若しくは分泌タンパク質をコードする遺伝子、一般に抗生物質若しくは薬物に対する耐性をコードする遺伝子、毒素タンパク質若しくは毒素因子をコードする遺伝子、並びに病原性タンパク質若しくは病原性因子をコードする遺伝子、又は任意のこれらの組合せからなる群から選択される。目的の核酸はまた、細菌トランスポーター若しくは細菌孔、又は分泌システムをコードし得る。目的の核酸によってコードされるタンパク質は、機能の付加若しくは除去(例えば、dCas9)、通常分泌されないタンパク質への分泌シグナルの付加、又はループ中の外因性ペプチドの付加のような外部の特徴を含むように改変又は操作され得る。
【0034】
本発明の一実施形態では、目的の核酸は、治療用タンパク質をコードする。別の実施形態では、目的の核酸は、アンチセンス核酸分子をコードする。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、2つ以上の目的の分子をコードする。特に、これらの分子の1つは、ヌクレアーゼ、例えばCasヌクレアーゼであり得、別の分子は、ガイドRNA等の核酸分子であり得る。一態様では、本明細書で提供する方法及び組成物は、宿主細菌細胞ゲノム又は宿主細菌細胞プラスミドの切断を標的化するヌクレアーゼをコードする目的の核酸を含む遺伝回路の移入を可能にする。いくつかの実施形態では、切断を媒介するヌクレアーゼは、抗生物質耐性遺伝子に起こる。いくつかの他の実施形態では、宿主細菌細胞ゲノムの切断を媒介するヌクレアーゼは、細菌細胞のゲノムへの目的の核酸の挿入のための相同組換え事象を刺激するように設計される。
【0035】
目的のタンパク質又はRNA分子をコードする目的の核酸を含む遺伝回路を所望の標的細胞又はレシピエント細胞に移入するのを可能にする方法及び組成物を提供する。本明細書で使用する場合、用語「移入する」は、遺伝回路をレシピエント細胞又は標的細胞に移入するのを可能にする任意の手段を指す。そのような手段は、例えば、形質導入、コンジュゲーション及び形質転換を含む。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、遺伝回路をドナー細胞から標的細胞に移入するために使用され得る。本発明によって包含される送達ビヒクルは、限定はされないが、バクテリオファージ足場、ウイルス足場、化学ベースの送達ビヒクル(例えば、シクロデキストリン、リン酸カルシウム、カチオンポリマー、カチオンリポソーム)、タンパク質ベース又はペプチドベースの送達ビヒクル、脂質ベースの送達ビヒクル、ナノ粒子ベースの送達ビヒクル、非化学ベースの送達ビヒクル(例えば、形質転換、エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学トランスフェクション)、粒子ベースの送達ビヒクル(例えば、遺伝子銃、マグネトフェクション、インパレフェクション、微粒子銃、細胞透過性ペプチド)又はドナー細菌(コンジュゲーション)を含む。好ましい実施形態では、送達ビヒクルは、バクテリオファージ足場であり、すなわち、天然、進化した又は操作されたキャプシドから得られる。
【0036】
送達ビヒクルの任意の組合せも、本発明によって包含される。送達ビヒクルは、バクテリオファージ由来足場を指すこともでき、天然、進化した又は操作したキャプシドから得ることができる。いくつかの実施形態では、細菌が本来それ自身で環境からペイロード(例えば、遺伝回路)を吸収する能力があるため、送達ビヒクルはペイロードである。
【0037】
本明細書で使用する場合、用語「ペイロード」は、送達ビヒクルによってレシピエント細胞又は標的細胞に移入される、任意の1つ又は複数の核酸配列、例えば本明細書に開示する遺伝回路、及び/若しくはアミノ酸配列、又は両方の組合せ(例えば、限定はされないが、ペプチド核酸又はペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート)を指す。用語「ペイロード」は、プラスミド、ベクター又は積荷も指し得る。ペイロードは、天然、進化した又は操作したバクテリオファージゲノムから得られるファージミド又はファスミドであり得る。ペイロードは、天然、進化した又は操作したバクテリオファージゲノムから得られるファージミド又はファスミドの一部のみから構成されてもよい。
【0038】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、一本鎖若しくは二本鎖であり得る、又は一本鎖と二本鎖配列の両方の部分を含有する、共に共有結合した少なくとも2つのヌクレオチドの配列を指す。本発明の核酸は、自然発生、組換え又は合成であり得る。核酸は、環状配列若しくは線状配列の形態、又は両方の形態の組合せであり得る。核酸は、DNA、ゲノム若しくはcDNAの両方、若しくはRNA又は両方の組合せであり得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組合せ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン(xathanine)、ヒポキサンチン(hypoxathanine)、イソシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン及びイソグアニンを含む塩基の任意の組合せを含有し得る。本発明で使用され得る改変塩基の他の例は、Chemical Reviews 2016年、116 (20) 12655～12687頁に詳述される。用語「核酸」は、限定はされないが、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、O-メチルホスホロアミダイト結合及び/又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド核酸を含む、他の骨格を含有し得る任意の核酸類似体も包含する。核酸の上記の特徴の任意の組合せも、本発明により包含される。
【0039】
本発明で使用される遺伝回路は、複製起点も含み得る。開示する方法及び組成物における使用のための複製起点は、当技術分野で公知であり、種特異的プラスミドDNA(例えば、CoIE1、Rl、pT181、pSC101、pMB1、R6K、RK2、p15a等)から、細菌ウイルス(例えば、φX174、M13、F1及びP4)から、及び細菌染色体複製起点(例えば、oriC)から同定された。そのような配列は、例えば、細菌細胞、例えばドナー細胞及び/又は標的細胞における遺伝回路の複製を可能にする。一実施形態では、本開示によるファージミド(遺伝回路)は、ドナー細胞、標的細胞又はレシピエント細胞において機能性である細菌の複製起点を含む。
【0040】
或いは、本開示による遺伝回路は、任意の機能性な細菌の複製起点を含まず、又は標的細菌において不活性な複製起点を含有する。したがって、本開示の遺伝回路は、標的細胞又はレシピエント細胞に導入されると、それ自体では複製できない。
【0041】
一実施形態では、送達ビヒクルにパッケージされる遺伝回路又はプラスミド上の複製起点は、標的細菌において不活性であり、この複製起点が、標的細胞において機能性でなく、したがって望まないプラスミド複製を防ぐことを意味する。
【0042】
一実施形態では、遺伝回路又はプラスミドは、ドナー細菌細胞、例えば細菌ウイルス粒子の産生のために使用されるドナー細菌細胞において機能性である細菌の複製起点を含む。
【0043】
遺伝回路又はプラスミド複製は、宿主酵素、並びに遺伝回路又はプラスミド制御シス及びトランス決定因子に依存する。例えば、いくつかの遺伝回路又はプラスミドは、ほとんど全てのグラム陰性細菌において認識される決定因子を有し得、複製開始及び調節の間に各宿主において正確に作用し得る。他の遺伝回路又はプラスミドは、いくつかの細菌においてのみこの能力を保持し得る(Kues, U and Stahl, U 1989年、Microbiol Rev 53:491～516頁)。
【0044】
遺伝回路又はプラスミドは、3つの一般的なメカニズム、すなわちシータ型、鎖置換、及び複製起点で開始するローリングサークルによって複製され得る(Del Solarら、1998年、Microhio and Molec Biol. Rev 62:434～464頁によって概説される)。これらの複製起点は、遺伝回路若しくはプラスミド及び/又は宿主コードタンパク質の相互作用に必要な部位を含有する。
【0045】
本明細書で使用する複製起点は、中程度のコピー数のもの、例えばpBR322(細胞当たり15～20コピー)又はR6Kプラスミド(細胞当たり15～20コピー)からのcolE1 oriであってよく、又は高コピー数、例えばpUC ori(細胞当たり500～700コピー)、pGEM ori(細胞当たり300～400コピー)、pTZ ori(細胞当たり>1000コピー)又はpBluescript ori(細胞当たり300～500コピー)であってよい。
【0046】
一実施形態では、遺伝回路に含まれる細菌の複製起点は、ColE1、pMB1及びバリアント(pBR322、pET、pUC等)、p15a、ColA、ColE2、pOSAK、pSC101、R6K、IncW(pSa等)、IncFII、pT181、P1、F IncP、IncC、IncJ、IncN、IncP1、IncP4、IncQ、IncH11、RSF1010、CloDF13、NTP16、R1、f5、pPS10、pC194、pE194、BBR1、pBC1、pEP2、pWVO1、pLF1311、pAP1、pWKS1、pLS1、pLS11、pUB6060、pJD4、pIJ101、pSN22、pAMbeta1、pIP501、pIP407、ZM6100(Sa)、pCU1、RA3、pMOL98、RK2/RP4/RP1/R68、pB10、R300B、pRO1614、pRO1600、pECB2、pCM1、pFA3、RepFIA、RepFIB、RepFIC、pYVE439-80、R387、phasyl、RA1、TF-FC2、pMV158及びpUB113からなる群において選択される。
【0047】
より好ましくは、細菌の複製起点は、ColE1、pMB1及びバリアント(pBR322、pET、pUC等)、p15a、ColA、ColE2、pOSAK、pSC101、R6K、IncW(pSa等)、IncFII、pT181、P1、F IncP、IncC、IncJ、IncN、IncP1、IncP4、IncQ、IncH11、RSF1010、CloDF13、NTP16、R1、f5及びpPS10からなる群において選択される大腸菌の複製起点である。
【0048】
より好ましくは、細菌の複製起点は、pC194、pE194、BBR1、pBC1、pEP2、pWVO1、pLF1311、pAP1、pWKS1、pLS1、pLS11、pUB6060、pJD4、pIJ101、pSN22、pAMbeta1、pIP501、pIP407、ZM6100(Sa)、pCU1、RA3、pMOL98、RK2/RP4/RP1/R68、pB10、R300B、pRO1614、pRO1600、pECB2、pCM1、pFA3、RepFIA、RepFIB、RepFIC、pYVE439-80、R387、phasyl、RA1、TF-FC2、pMV158及びpUB113からなる群において選択される。
【0049】
更により好ましくは、細菌の複製起点は、ColE1及びp15Aである。
【0050】
遺伝回路は、ファージの複製起点を含み得る。特に、本開示による送達される核酸配列はまた、完全なファージゲノムの相補性により、異なるキャプシドへの後の被包化のための送達される核酸配列の複製を開始することができるファージの複製起点を含み得る。ファージの複製起点は、任意のファージ粒子をパッケージする必要なく、細菌の複製起点として作用するように操作され得る。
【0051】
本開示の遺伝回路又は送達される核酸配列に含まれるファージの複製起点は、ファージに見出される任意の複製起点であり得る。
【0052】
好ましくは、ファージの複製起点は、M13、f1、φX174、P4、ラムダ、P2、186、ラムダ様、HK022、mEP237、HK97、HK629、HK630、mEP043、mEP213、mEP234、mEP390、mEP460、mEPx1、mEPx2、phi80、mEP234、T2、T4、T5、T7、RB49、phiX174、R17、PRD1 Pl様、P2様、P22、P22様、N15及びN15様バクテリオファージの野生型又は非野生型配列であり得る。
【0053】
より好ましくは、ファージの複製起点は、M13、f1、φX174、P4、及びラムダのファージの複製起点からなる群において選択される。
【0054】
特定の実施形態では、ファージの複製起点は、ラムダ又はP4複製起点である。
【0055】
本明細書に開示する遺伝回路は、リプレッサー結合配列の転写制御下の目的の核酸配列を含む。開示する方法では、目的の核酸の転写は、ドナー細胞において抑制される一方、標的細胞において活性である。一実施形態では、目的の核酸は、標的細胞に送達されるプログラム可能なヌクレアーゼ回路であり、すなわち、目的の核酸は、標的細胞に送達されるプログラム可能なヌクレアーゼシステムをコードする。プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、プログラム可能なヌクレアーゼ、すなわち、標的細胞における目的の標的遺伝子の配列特異的除去を媒介することができるヌクレアーゼを含む。特に、このプログラム可能なヌクレアーゼシステムは、目的の標的遺伝子(例えば、ヒトに有害な遺伝子)を含有する細菌のin vivoでの配列特異的除去を媒介することができる場合がある。本発明の方法で使用され得るプログラム可能なヌクレアーゼは、例えば、CRISPRヌクレアーゼ(「CRISPR関連タンパク質」又は「Casヌクレアーゼ」ともいう)、好ましくはI型、II型CRISPRヌクレアーゼ、TALENヌクレアーゼ、ZFNヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びリコンビナーゼ、並びにそれらの任意のバリアント(進化した又は操作されたバリアント)を含む。これらのヌクレアーゼは、別々に又は組み合わせて使用され得、すなわち、プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、1つ又はいくつかのプログラム可能なヌクレアーゼを含み得る。特定の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)のII型CRISPR-Cas(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート-CRISPR関連)システムの操作したバリアントから選択される。使用され得る他のプログラム可能なヌクレアーゼは、他のCRISPR-Casシステム、操作したTALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)バリアント、操作したzincフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)バリアント、天然の、進化又は操作したメガヌクレアーゼ又はリコンビナーゼバリアント、及びプログラム可能なヌクレアーゼの任意の組合せ又はハイブリッドを含む。方法で使用されるヌクレアーゼのタイプに応じて、プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、1つ又はいくつかの更なる成分を更に含み得る。特に、CRISPRヌクレアーゼにおけるプログラム可能なヌクレアーゼの場合、プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、好ましくは、標的配列を見つけ、選択的に切断するガイドRNAを更に含む。したがって、本明細書で提供する操作した自律分散型ヌクレアーゼ回路を使用して、標的細胞における目的の遺伝子、例えば毒素遺伝子、病原性因子遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、リモデリング遺伝子又は調節遺伝子をコードするDNAを選択的に切断することができる(国際公開第2014124226号参照)。
【0056】
好ましくはプログラム可能な、目的の他の配列は、標的細胞に送達されるように送達される核酸配列に含まれ得る。一実施形態では、目的の核酸は、標的細胞、好ましくは標的細菌の生存又は増殖に影響する分子をコードする。標的細胞が細菌である実施形態では、そのような分子は、細胞死をもたらす(殺菌性効果)ため、又は前記細菌の増殖を防ぐ(静菌性効果)ために、選択され得る。例えば、目的の核酸配列は、ホリン、エンドリシン、制限酵素、又は標的細胞に影響する、好ましくは標的細胞の生存若しくは増殖に影響する毒素をコードし得る。
【0057】
特定の実施形態では、目的の核酸は、バクテリオシンをコードする。バクテリオシンは、他の細菌を死滅させる又は他の細菌の増殖を阻害する、細菌により産生されるタンパク質性の毒素であり得る。バクテリオシンは、産生する株、共通の耐性メカニズム、及び死滅のメカニズムを含むいくつかの方法でカテゴリー分類される。そのようなバクテリオシンは、グラム陰性細菌(例えば、ミクロシン、コリシン様バクテリオシン及びタイロシン)から、及びグラム陽性細菌(例えば、クラスI、クラスII、クラスIII又はクラスIVバクテリオシン)から記載されていた。目的の核酸はまた、毒素を細胞外の空間に分泌する必要があるトランスポーターをコードし得る。
【0058】
より特定の実施形態では、目的の核酸配列は、ミクロシン、コリシン様バクテリオシン、タイロシン、クラスI、クラスII、クラスIII及びクラスIVバクテリオシンからなる群において選択される毒素をコードする配列を含む。
【0059】
特定の実施形態では、相当する免疫性ポリペプチド(すなわち、抗毒素)は、送達する核酸配列産生及びカプシド化目的のための細菌細胞を保護するために使用され得る(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Cotterら、Nature Reviews Microbiology 11:95頁、2013年による概説を参照)が、医薬組成物中及び目的の核酸が送達される標的細菌内に存在しない。
【0060】
いくつかの他の実施形態では、標的細胞における移入された目的の核酸の発現は、細胞死をもたらさない。例えば、目的の核酸は、例えば発光又は蛍光シグナルをもたらすレポーター遺伝子をコードし得る。
【0061】
いくつかの他の実施形態では、目的の核酸は、タンパク質、特に酵素をコードし得、標的細胞の代謝、その環境、又は標的細胞を含む宿主に影響する組成を改変する等、標的細胞における有用な機能を達成する。
【0062】
特定の実施形態では、目的の核酸配列は、mRNA、crRNA、tRNA、iRNA(干渉RNA)、asRNA(アンチセンスRNA)、リボザイムRNA、RNAアプタマー又はガイドRNA(gRNA)等のRNAをコードする核酸、CRISPR遺伝子座、ヌクレアーゼ又はキナーゼ等の酵素をコードする遺伝子、Casヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、TALEN、ZFN又はメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする遺伝子、リコンビナーゼ、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質、分泌タンパク質、又は一般に抗生物質若しくは薬物に対する耐性をコードする遺伝子、毒素タンパク質若しくは毒素因子をコードする遺伝子、並びに病原性タンパク質、病原性因子、細菌トランスポーター又は細菌孔をコードする遺伝子、及び任意のこれらの組合せからなる群から選択される。目的の核酸によってコードされるタンパク質はまた、機能の付加若しくは除去(例えば、dCas9)、通常分泌されないタンパク質への分泌シグナルの付加、ループ中の外因性ペプチドの付加等のような外部の特徴を含むように改変又は操作され得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、CRISPRシステムをコードする。典型的には、CRISPRシステムは、2つの異なるエレメント、すなわちi)エンドヌクレアーゼ、この場合CRISPR関連ヌクレアーゼ(Cas又は「CRISPR関連タンパク質」)及びii)ガイドRNAを含有する。ガイドRNAの構造は、Casヌクレアーゼの性質に依存し得る。特に、ガイドRNA(gRNA又はsgRNA)は、CRISPR(RNAcr)細菌RNAとRNAtracr(トランス活性化RNA CRISPR)との組合せからなるキメラRNAの形態であり得る(Jinekら、Science 2012年)。gRNAは、Casタンパク質へのガイドとして寄与する「スペーシング配列」に相当するcRNAの標的化特異性と、単一転写物におけるRtracrの構造特性とを合わせる。そのようなガイドRNAは、例えばCasヌクレアーゼがCas9である場合に必要である。或いは、ガイドRNAは、RNAcrのみを含み得る。そのようなガイドRNAは、例えばCasヌクレアーゼがCpf1である場合に必要である。gRNA及びCasタンパク質が細胞において同時に発現される場合、標的ゲノム配列は、永続的に中断(並びに、場所に応じて、標的化配列及び周囲配列の消失、並びに/又は細胞死を引き起こす)又は改変され得る。改変は、修復マトリクスによってガイドされ得る。一般に、CRISPRシステムは、作用のヌクレアーゼメカニズムに依存する2つの主要なクラスを含む。クラス1は、多サブユニットエフェクター複合体からなり、I、III及びIV型を含む。クラス2は、Cas9ヌクレアーゼのように単一ユニットエフェクターモジュールからなり、II(II-A、II-B、II-C、II-Cバリアント)、V (V-A、V-B、V-C、V-D、V-E、V-U1、V-U2、V-U3、V-U4、V-U5)及びVI(VI-A、VI-B1、VI-B2、VI-C、VI-D)型を含む。
【0064】
本開示による目的の核酸は、Casタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。様々なCRISPR酵素は、プラスミドの目的の配列として使用するために利用可能である。いくつかの実施形態では、CRISPR酵素は、II型CRISPR酵素である。いくつかの実施形態では、CRISPR酵素は、DNA切断を触媒する。いくつかの他の実施形態では、CRISPR酵素はRNA切断を触媒する。一実施形態では、CRISPR酵素はsgRNAに結合され得る。特定の実施形態では、sgRNAは、抗生物質耐性遺伝子、病原性タンパク質又は病原性因子遺伝子、毒素タンパク質又は毒素因子遺伝子、細菌受容体遺伝子、膜タンパク質遺伝子、構造タンパク質遺伝子、分泌タンパク質遺伝子、一般に薬物に対する耐性を発現する遺伝子、又は宿主(標的細胞を含む宿主)に有害な効果を引き起こす遺伝子からなる群において選択される遺伝子を標的化する。
【0065】
多サブユニットエフェクターの一部として、又は単一ユニットエフェクターとしてのCasタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1及びCsx12としても公知)、Cas10、Cas11(SS)、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、Cas13a(C2c2)、Cas13b(C2c6)、Cas13c(C2c7)、Cas13d、Csa5、Csc1、Csc2、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csn2、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx13、Csx1、Csx15、SdCpf1、CmtCpf1、TsCpf1、CmaCpf1、PcCpf1、ErCpf1、FbCpf1、UbcCpf1、AsCpf1、LbCpf1、これらの相同体、これらの相同分子種、これらのバリアント、又はこれらの改変バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態では、CRISPR酵素は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位において標的核酸の両鎖を切断する。
【0066】
特定の実施形態では、CRISPR酵素は、任意のCas9タンパク質、例えば任意の自然発生の細菌性Cas9並びにこれらの任意のバリアント、相同体又は相同分子種である。
【0067】
「Cas9」により、タンパク質Cas9(Csn1又はCsx12とも呼ばれる)又は機能性タンパク質、ペプチド又はこれらのポリペプチド断片を意味し、すなわちガイドRNAと相互作用することができる及び標的ゲノムのDNAの二本鎖切断を行うことを可能にする酵素活性(ヌクレアーゼ)を発揮することができる。したがって、「Cas9」は、例えば、タンパク質の前定義された機能に必須ではないタンパク質のドメイン、特にgRNAとの相互作用に必要ではないドメインをトランケートして除去した改変タンパク質を示す。
【0068】
本開示の文脈で使用する場合、Cas9(全タンパク質又はこれらの断片)をコードする配列は、任意の公知のCas9タンパク質から得ることができる(Fonfaraら、Nucleic Acids Res 42 (4)、2014年; Kooninら、Nat Rev Microbiol 15(3)、2017年)。本開示で有用なCas9タンパク質の例としては、限定はされないが、化膿性連鎖球菌(SpCas9)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)(St1Cas9、St3Cas9)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、フランシセラ・ノビサイダ(Francisella novicida)(FnCas9)及び髄膜炎菌(Neisseria meningitides)(NmCas9)のCas9タンパク質が挙げられる。
【0069】
別の特定の実施形態では、CRISPR酵素は、任意のCas12a、Cas13a又はCas13dタンパク質、例えば任意の自然発生の細菌性Cas12a、Cas13a又はCas13d並びにこれらの任意のバリアント、相同体又は相同分子種である。
【0070】
本開示の文脈で使用する場合、Cpf1(Cas12a)(全タンパク質又はこれらの断片)をコードする配列は、任意の公知のCpf1(Cas12a)タンパク質から得ることができる(Kooninら、2017年)。本開示で有用なCpf1(Cas12a)タンパク質の例としては、限定はされないが、アシダミノコッカス菌(Acidaminococcus sp)、ラクノスピラ・バクテリウム(Lachnospiraceae bacteriu)及びフランシセラ・ノビサイダのCpf1(Cas12a)タンパク質が挙げられる。
【0071】
Cas13a(全タンパク質又はこれらの断片)をコードする配列は、任意の公知のCas13a(C2c2)タンパク質から得ることができる(Abudayyehら、2017年)。本開示で有用なCas13a(C2c2)タンパク質の例としては、限定はされないが、レプトトリキア・ウェイデイ(Leptotrichia wadei)(LwaCas13a)のCas13a(C2c2)タンパク質が挙げられる。
【0072】
Cas13d(全タンパク質又はこれらの断片)をコードする配列は、任意の公知のCas13dタンパク質から得ることができる(Yanら、2018年)。本開示で有用なCas13dタンパク質の例としては、限定はされないが、ユーバクテリウム・シラエウム(Eubacterium siraeum)及びルミノコッカス属(Ruminococcus sp)のCas13dタンパク質が挙げられる。
【0073】
特定の実施形態では、目的の核酸は、遺伝子発現の減少又は抗生物質耐性遺伝子、病原性因子若しくは病原性タンパク質遺伝子、毒素因子若しくは毒素タンパク質遺伝子、細菌受容体、膜タンパク質、構造タンパク質、分泌タンパク質を発現する遺伝子、一般に薬物に対する耐性を発現する遺伝子、又は宿主に有害な効果を引き起こす遺伝子からなる群から選択される遺伝子の不活性化のための、CRISPR/Casシステム、好ましくはCRISPR/Cas9システムをコードする。
【0074】
一実施形態では、CRISPRシステムは、病原性因子を標的化及び不活性化するために使用される。病原性因子は、宿主に与えられる損傷の程度を増加することにより宿主-病原体相互作用を変更する、病原体により産生される任意の物質であり得る。病原性因子は、例えば、細胞接着又は宿主におけるニッチのコロニー形成において、宿主の免疫応答を避けること、宿主細胞への侵入及び宿主細胞から放出を促進すること、宿主から栄養を得ること、又は宿主における他の生理学的プロセスを阻害すること、を含む多くの方法において病原体によって使用される。病原性因子は、酵素、エンドトキシン、接着因子、運動性因子、補体回避に関与する因子、及びバイオフィルム形成を促進する因子を含み得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、大腸菌病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、EHEC-HlyA、Stx1(VT1)、Stx2(VT2)、Stx2a(VT2a)、Stx2b(VT2b)、Stx2c(VT2c)、Stx2d(VT2d)、Stx2e(VT2e)及びStx2f(VT2f)、Stx2h(VT2h)、stx2k、fimA、fimF、fimH、neuC、kpsE、sfa、foc、iroN、aer、iha、papC、papGI、papGII、papGIII、hlyC、cnf1、hra、sat、ireA、usp ompT、ibeA、malX、fyuA、irp2、traT、afaD、ipaH、eltB、estA、bfpA、eaeA、espA、aaiC、aatA、TEM、CTX、SHV、csgA、csgB、csgC、csgD、csgE、csgF、csgG、csgH、T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS(分泌システム)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、stx1及びstx2であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、ペスト菌(Yersinia pestis)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、yscF(プラスミド保有(pCDl)T3SS外側ニードルサブユニット)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、野兎病菌(Francisella tularensis)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、fslAであり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、炭疽菌(Bacillus anthracis)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、pag(炭疽毒素、細胞結合防御抗原)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、コレラ菌(Vibrio cholera)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、ctxA及びctxB(コレラ毒素)、tcpA(毒素同時制御線毛)、及びtoxT(マスター病原性レギュレーター)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、ピオベルジン(例えば、シグマ因子pvdS、生合成支配遺伝子pvdL、pvdl、pvdJ、pvdH、pvdA、pvdF、pvdQ、pvdN、pvdM、pvdO、pvdP、トランスポーター遺伝子pvdE、pvdR、pvdT、opmQ)、シデロフォア・ピオケリン(例えば、pchD、pchC、pchB、pchA、pchE、pchF及びpchG)、並びに毒素(例えば、exoU、exoS及びexoT)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、fimA(粘着性、1型線毛主要サブユニット)、及びcps(莢膜多糖)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、ptk(莢膜重合)、及びepsA(アセンブリー)であり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、チフス菌(Salmonella enterica Typhi)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、MIA(侵入、SPI-1レギュレーター)、ssrB(SPI-2レギュレーター)、及び放出ポンプ遺伝子acrA、acrB及びtolCを含む、胆汁耐性と関連するものであり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、FadA及びTIGITであり得る。例えば、そのような標的化病原性因子遺伝子は、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)病原性因子遺伝子、例えば、限定はされないが、bftであり得る。
【0075】
別の実施形態では、CRISPRシステム、好ましくはCRISPR/Cas9システムは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、限定はされないが、GyrB、ParE、ParY、AAC(1)、AAC(2')、AAC(3)、AAC(6')、ANT(2")、ANT(3")、ANT(4')、ANT(6)、ANT(9)、APH(2")、APH(3")、APH(3')、APH(4)、APH(6)、APH(7")、APH(9)、ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、Sgm、AER、BLA1、CTX-M、KPC、SHV、TEM、BlaB、CcrA、IMP、NDM、VIM、ACT、AmpC、CMY、LAT、PDC、OXA β-ラクタマーゼ、mecA、Omp36、OmpF、PIB、bla(blaI、blaR1)及びmec(mecI、mecR1)オペロン、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、クロラムフェニコールホスホトランスフェラーゼ、エタンブトール耐性アラビノシルトランスフェラーゼ(EmbB)、MupA、MupB、膜内在性タンパク質MprF、Cfr 23S rRNAメチルトランスフェラーゼ、リファンピンADP-リボシルトランスフェラーゼ(Arr)、リファンピングリコシルトランスフェラーゼ、リファンピンモノオキシゲナーゼ、リファンピンホスホトランスフェラーゼ、DnaA、RbpA、RNAポリメラーゼのリファンピン耐性ベータ-サブユニット(RpoB)、Erm 23S rRNAメチルトランスフェラーゼ、Lsa、MsrA、Vga、VgaB、ストレプトグラミンVgbリアーゼ、Vatアセチルトランスフェラーゼ、フルオロキノロンアセチルトランスフェラーゼ、フルオロキノロン耐性DNAトポイソメラーゼ、フルオロキノロン耐性GyrA、GyrB、ParC、キノロン耐性タンパク質(Qnr)、FomA、FomB、FosC、FosA、FosB、FosX、VanA、VanB、VanD、VanR、VanS、リンコサミドヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Lin)、EreA、EreB、GimA、Mgt、Ole、マクロライドホスホトランスフェラーゼ(MPH)、MefA、MefE、Mel、ストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼ(sat)、Sul1、Sul2、Sul3、スルホンアミド耐性FolP、テトラサイクリン不活性化酵素TetX、TetA、TetB、TetC、Tet30、Tet31、TetM、TetO、TetQ、Tet32、Tet36、MacAB-TolC、MsbA、MsrA、VgaB、EmrD、EmrAB-TolC、NorB、GepA、MepA、AdeABC、AcrD、MexAB-OprM、mtrCDE、EmrE、adeR、acrR、baeSR、mexR、phoPQ、mtrR、又はComprehensive Antibiotic Resistance Database(CARD https://card.mcmaster.ca/)に記載の任意の抗生物質耐性遺伝子を標的化及び不活性化するために使用される。
【0076】
別の実施形態では、CRISPRシステム、好ましくはCRISPR/Cas9システムは、細菌性毒素遺伝子を標的化及び不活性化するために使用される。細菌毒素は、エキソトキシン又はエンドトキシンのいずれかとして分類され得る。エキソトキシンは、生成及び活発に分泌される;エンドトキシンは、細菌の一部のままである。細菌毒素への応答は、重度の炎症を含むことがあり、化膿症をもたらし得る。そのような毒素は、例えば、ボツリヌス神経毒素、破傷風毒素、ブドウ球菌毒素、ジフテリア毒素、炭疽毒素、アルファ毒素、百日咳毒素、志賀毒素、耐熱性エンテロトキシン(大腸菌ST)、コリバクチン、BFT(バクテロイデス・フラギリス毒素)又はHenkelら、(Toxins from Bacteria in EXS. 2010年; 100: 1～29頁)に記載の任意の毒素であり得る。
【0077】
用語「ドナー細胞」、「標的細胞」及び「レシピエント細胞」は、本明細書で使用される場合、好ましくは、原核細胞、より好ましくは細菌細胞を指す。特に、本明細書に開示する「ドナー」細胞、「標的」細胞又は「レシピエント」細胞は、哺乳動物の生物体に存在するか、又は存在し得る任意の細菌であり得る。それは、微生物叢又はマイクロビオームの任意の、共生生物、共生又は病原菌であり得る。
【0078】
マイクロビオームは、様々な内在性細菌種を含み、そのいずれかは本開示に従って標的化され得る。いくつかの実施形態では、細菌送達ビヒクルが使用される場合、標的化内在性細菌細胞の属及び/又は種は、細菌送達ビヒクルを調製するために使用されるバクテリオファージの型に依存し得る。例えば、いくつかのバクテリオファージは、細菌の特定の宿主種に向性を示す、又は優先的に標的化する。他のバクテリオファージは、そのような向性を示さず、内在性細菌細胞の多くの異なる属及び/又は種を標的化するために使用され得る。
【0079】
ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌細胞の例としては、限定はされないが、エルシニア属種(Yersinia spp.)、エシェリキア属種(Escherichia spp.)、クレブシエラ属種(Klebsiella spp.)、アシネトバクター属種(Acinetobacter spp.)、ボルデテラ種(Bordetella spp.)、ナイセリア属種(Neisseria spp.)、アエロモナス属種(Aeromonas spp.)、フランシセラ属種(Franciesella spp.)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp.)、シトロバクター属種(Citrobacter spp.)、クラミジア属種(Chlamydia spp.)、ヘモフィルス属種(Hemophilus spp.)、ブルセラ属種(Brucella spp.)、マイコバクテリウム属種(Mycobacterium spp.)、レジオネラ属種(Legionella spp.)、ロドコッカス属種(Rhodococcus spp.)、シュードモナス属種(Pseudomonas spp.)、ヘリコバクター属種(Helicobacter spp.)、ビブリオ属種(Vibrio spp.)、バチルス属種(Bacillus spp.)、エリシペロスリクス属種(Erysipelothrix spp.)、サルモネラ属種(Salmonella spp.)、ストレプトミセス属種(Streptomyces spp.)、ストレプトコッカス属種(Streptococcus spp.)、スタフィロコッカス属種(Staphylococcus spp.)、バクテロイデス属種(Bacteroides spp.)、プレボテラ属種(Prevotella spp.)、クロストリジウム属種(Clostridium spp.)、ビフィドバクテリウム属種(Bifidobacterium spp.)、クロストリジウム属種(Clostridium spp.)、ブレビバクテリウム属種(Brevibacterium spp.)、ラクトコッカス属種(Lactococcus spp.)、リューコノストック属種(Leuconostoc spp.)、アクチノバチルス属種(Actinobacillus spp.)、セレノモナス属種(Selnomonas spp.)、シゲラ属種(Shigella spp.)、ザイモナス属種(Zymonas spp.)、マイコプラズマ属種(Mycoplasma spp.)、トレポネーマ属種(Treponema spp.)、リューコノストック属種(Leuconostoc spp.)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp.)、エンテロコッカス属種(Enterococcus spp.)、エンテロバクター属種(Enterobacter spp.)、ピロコッカス属種(Pyrococcus spp.)、セルラチア属種(Serratia spp.)、モルガネラ属種(Morganella spp.)、パルビモナス属種(Parvimonas spp.)、フソバクテリウム属種(Fusobacterium spp.)、アクチノミセス属種(Actinomyces spp.)、ポルフィロモナス属種(Porphyromonas spp.)、ミクロコッカス属種(Micrococcus spp.)、バルトネラ属種(Bartonella spp.)、ボレリア属種(Borrelia spp.)、ブルセリア属種(Brucelia spp.)、カンピロバクター属種(Campylobacter spp.)、クラミドフィリア属種(Chlamydophilia spp.)、クチバクテリウム属種(Cutibacterium spp.)、プロピオニバクテリウム属種(Propionibacterium spp.)、ガードネレラ属種(Gardnerella spp.)、エーリキア属種(Ehrlichia spp.)、ヘモフィルス属種(Haemophilus spp.)、レプトスピラ属種(Leptospira spp.)、リステリア属種(Listeria spp.)、マイコプラズマ属種(Mycoplasma spp.)、ノカルジア属種(Nocardia spp.)、リケッチア属種(Rickettsia spp.)、ウレアプラズマ属種(Ureaplasma spp.)、及びラクトバチルス属種(Lactobacillus spp)、並びにこれらの混合物の細菌由来の細胞が挙げられる。
【0080】
好ましくは、細菌は、エルシニア属種、エシェリキア属種、クレブシエラ属種、アシネトバクター属種、シュードモナス属種、ヘリコバクター属種、ビブリオ属種、サルモネラ属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バクテロイデス属種、クロストリジウム属種、シゲラ属種、エンテロコッカス属種、エンテロバクター属種、リステリア属種、クチバクテリウム属種、プロピオニバクテリウム属種、フソバクテリウム属種、ポルフィロモナス属種及びガードネレラ属種からなる群から選択され得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る本開示の細菌細胞は、嫌気性細菌細胞(例えば、増殖のために酸素を必要としない細胞)である。嫌気性細菌細胞は、通性嫌気性細胞、例えば、限定はされないが、大腸菌、シェワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、ガードネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)及びリステリア(Listeria)を含む。嫌気性細菌細胞は、偏性嫌気性細胞、例えばバクテロイデス、クロストリジウム、クチバクテリウム、プロピオニバクテリウム、フソバクテリウム及びプルフィロモナ種も含む。ヒトでは、嫌気性細菌は、消化管において最も一般的に見出される。いくつかの特定の実施形態では、したがって、標的細菌(標的細胞)は、消化管において最も一般的に見出される細菌である。細菌ウイルス粒子を調製するために使用される細菌送達ビヒクル、好ましくはバクテリオファージ、次いで細菌ウイルス粒子は、当業者に公知のそれらの特定のスペクトルに従って嫌気性細菌細胞を標的化(例えば、特異的に標的化)し、プラスミドを特異的に送達することができる。
【0082】
いくつかの実施形態では、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌細胞は、限定はされないが、バクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・ジスタソニス(Bacteroides distasonis)、バクテロイデス・ブルガタス(Bacteroides vulgatus)、クロストリジウム・レプタム(Clostridium leptum)、クロストリジウム・コッコイデス(Clostridium coccoides)、黄色ブドウ球菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、B群溶結性連鎖球菌(Streptococcus agalactiae)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、リューコノストック・ラクチス(Leuconostoc lactis)、アクチノバチルス・アクチノビセテムコミタンス(Actinobacillus actinobycetemcomitans)、シアノバクテリア(cyanobacteria)、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、偏性嫌気性細菌(Selnomonas ruminatium)、D群赤痢菌(Shigella sonnei)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、マイコプラズマ・ミコイデス(Mycoplasma mycoides)、トレポネーマ・デンチコラ(Treponema denticola)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphilococcus lugdunensis)、リューコノストック・オエノス(Leuconostoc oenos)、コリネバクテリウム・ゼロシス(Corynebacterium xerosis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・ポピラエ(Bacillus popillae)、シネコシスティス株PCC6803(Synechocystis strain PCC6803)、バチルス・リクエファシエンス(Bacillus liquefaciens)、ピロコッカス・アビシイ(Pyrococcus abyssi)、セレノモナス・ノミナンチウム(Selenomonas nominantium)、ラクトバチルス・ヒルガルディー(Lactobacillus hilgardii)、ストレプトコッカス・フェルス(Streptococcus ferus)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、バクテロイデス・フラギリス、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトミセス・ファエクロモゲネス(Streptomyces phaechromogenes)、ストレプトミセス・ガナエニス(Streptomyces ghanaenis)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、セルラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、シトロバクター・フレウンディ(Citrobacter freundii)、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)、シュードモナス・アエリグノサ(Pseudomonas aerigunosa)、パルビノモナス・ミクラ(Parvimonas micra)、プレボテラ・インテルメディア(Prevotella intermedia)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、プレボテラ・ニグレッセンス(Prevotella nigrescens)、アクチノミセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)、ポルフィロモナス・エンドドンタリス(Porphyromonas endodontalis)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・キャビアエ(Aeromonas caviae)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バルトネラ・ヘンセラエ(Bartonella henselae)、バルトネラ・クインターナ(Bartonella Quintana)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボレリア・ガリニイ(Borrelia garinii)、ボレリア・アフゼリイ(Borrelia afzelii)、ボレリア・レクルレンチス(Borrelia recurrentis)、ブルセラ・アボルツス(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・フェタス(Campylobacter fetus)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミドフィラ・シッタシ(Chlamydophila psittaci)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria)、キューティバクテリウム・アクネス(Cutibacterium acnes)(以前のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes))、エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)、エーリキア・キャフェエンシス(Ehrlichia chaffeensis)、エンテロコッカス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、レプトスピラ・サンタロサイ(Leptospira santarosai)、レプトスピラ・ウェイリイ(Leptospira weilii)、レプトスピラ・ノグチイ(Leptospira noguchii)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、マイコプラズマ・ニューモニア(Mycoplasma pneumonia)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンギチデス(Neisseria meningitides)、ノカルジア・アステロイドス(Nocardia asteroids)、リケッチア・リケッチア(Rickettsia rickettsia)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、チフス菌(Salmonella typhi)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexnerii)、志賀赤痢菌、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、化膿性連鎖球菌、ガードネレラ・バギナリス、ストレプトコッカス・ビリダンス(Streptococcus viridans)、トレポネーマ・パリズム(Treponema pallidum)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス(Vibrio parahaemolyticus)、エルシニア・ぺスチス(Yersinia pestis)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)、アクチノバクター・バウマニイ(Actinobacter baumanii)、シュードモナス・アエリグノサ、及びこれらの混合物であり、好ましくは、ドナー細胞又は標的細胞として使用し得る細菌細胞は、大腸菌、エンテロコッカス・ファエシウム、黄色ブドウ球菌、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマニイ、緑膿菌、エンテロバクター・クロアカ、及びエンテロバクター・アエロゲネス、並びにこれらの混合物からなる群から選択される。
【0083】
一実施形態では、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌は、大腸菌である。
【0084】
一実施形態では、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌は、病原菌である。細菌は、病原性細菌であり得る。
【0085】
ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌は、抗菌耐性細菌であり得、好ましくは、広域スペクトルベータ-ラクタマーゼ産生(ESBL)大腸菌、ESBLクレブシエラ・ニューモニエ、バンコマイシン耐性エンテロコッカス(VRE)、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)、多剤耐性(MDR)アシネトバクター・バウマニイ、MDRエンテロバクター属種、及びこれらの組合せからなる群から選択され得る。好ましくは、細菌は、広域スペクトルベータ-ラクタマーゼ産生(ESBL)大腸菌株からなる群から選択され得る。
【0086】
いくつかの特定の実施形態では、ドナー細胞及び/又は標的細胞は、プロバイオティクスである。本明細書で使用される場合、用語「プロバイオティクス」は、好ましくは、限定はされないが、乳酸菌、ビフィズス菌、連鎖球菌、腸球菌、プロピオン酸菌、酵母、乳酸菌、ビフィズス菌、又はプロテオバクテリアを含む。
【0087】
或いは、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌は、所与の種のマイクロビオームの細菌、好ましくは、ヒト微生物叢の細菌であり得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、ドナー細胞及び標的細胞は、系統的に近い、好ましくは同じ門、綱、目、科、属又は種、より好ましくは同じ属又は種のものである。
【0089】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の遺伝回路を含有する細菌送達ビヒクルの産生による、遺伝回路をドナー細胞から標的細胞又はレピシエント細胞に移入するための方法に向けられる。細菌送達ビヒクルは、細菌ウイルスから調製され得る。細菌送達ビヒクルは、遺伝回路を標的細菌細胞に導入することができるように選択される。細菌送達ビヒクルは、特定の細菌を標的化するように操作され得る(例えば、そのそれぞれが、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号第62/771,761号;同第62/802,777号;及び同第62/783,258号を参照)。
【0090】
それにより細菌送達ビヒクルが由来し得る、細菌ウイルスは、好ましくはバクテリオファージである。場合により、バクテリオファージは、Krupovicら、Arch Virol、2015年の分類学に基づき、カウドウイルス目(Order Caudovirales)から選択される。
【0091】
バクテリオファージは、ミオウイルス(Myoviridae)科(例えば、限定はされないが、Cp220ウイルス属、Cp8ウイルス属、Ea214ウイルス属、Felixo1ウイルス属、Moogleウイルス属、Suspウイルス属、Hp1ウイルス属、P2ウイルス属、Kayウイルス属、P100ウイルス属、Silviaウイルス属、Spo1ウイルス属、Tsarbombaウイルス属、Twortウイルス属、Cc31ウイルス属、Jd18ウイルス属、Js98ウイルス属、Kp15ウイルス属、Moonウイルス属、Rb49ウイルス属、Rb69ウイルス属、S16ウイルス属、Schizot4ウイルス属、Sp18ウイルス属、T4ウイルス属、Cr3ウイルス属、Se1ウイルス属、V5ウイルス属、Abouoウイルス属、Agateウイルス属、Agrican357ウイルス属、Ap22ウイルス属、Arv1ウイルス属、B4ウイルス属、Bastilleウイルス属、Bc431ウイルス属、Bcep78ウイルス属、Bcepmuウイルス属、Biquartaウイルス属、Bxz1ウイルス属、Cd119ウイルス属、Cp51ウイルス属、Cvm10ウイルス属、Eah2ウイルス属、Elウイルス属、Hapunaウイルス属、Jimmerウイルス属、Kpp10ウイルス属、M12ウイルス属、Machinaウイルス属、Marthaウイルス属、Msw3ウイルス属、Muウイルス属、Myohaloウイルス属、Nit1ウイルス属、P1ウイルス属、Pakpunaウイルス属、Pbunaウイルス属、Phikzウイルス属、Rheph4ウイルス属、Rsl2ウイルス属、Rslunaウイルス属、Secunda5ウイルス属、Sep1ウイルス属、Spn3ウイルス属、Svunaウイルス属、Tg1ウイルス属、Vhmlウイルス属及びWphウイルス属)から選択され得る。
【0092】
バクテリオファージは、ポドウイルス(Podoviridae)科(例えば、限定はされないが、Fri1ウイルス属、Kp32ウイルス属、Kp34ウイルス属、Phikmvウイルス属、Pradoウイルス属、Sp6ウイルス属、T7ウイルス属、Cp1ウイルス属、P68ウイルス属、Phi29ウイルス属、Nona33ウイルス属、Pocjウイルス属、Tl2011ウイルス属、Bcep22ウイルス属、Bpp1ウイルス属、Cba41ウイルス属、Dfl12ウイルス属、Ea92ウイルス属、Epsilon15ウイルス属、F116ウイルス属、G7cウイルス属、Jwalphaウイルス属、Kf1ウイルス属、Kpp25ウイルス属、Lit1ウイルス属、Luz24ウイルス属、Luz7ウイルス属、N4ウイルス属、Nonanaウイルス属、P22ウイルス属、Pageウイルス属、Phieco32ウイルス属、Prtbウイルス属、Sp58ウイルス属、Una961ウイルス属及びVp5ウイルス属)から選択され得る。
【0093】
バクテリオファージは、サイフォウイルス(Siphoviridae)科(例えば、限定はされないが、Camウイルス属、Likaウイルス属、R4ウイルス属、Acadianウイルス属、Cooperウイルス属、Pg1ウイルス属、Pipefishウイルス属、Rosebushウイルス属、Brujitaウイルス属、Che9cウイルス属、Hawkeyeウイルス属、Plotウイルス属、Jerseyウイルス属、K1gウイルス属、Sp31ウイルス属、Lmd1ウイルス属、Una4ウイルス属、Bongoウイルス属、Reyウイルス属、Buttersウイルス属、Charlieウイルス属、Rediウイルス属、Baxterウイルス属、Nymphadoraウイルス属、Bignuzウイルス属、Fishburneウイルス属、Phayonceウイルス属、Kp36ウイルス属、Rogue1ウイルス属、Rtpウイルス属、T1ウイルス属、Tlsウイルス属、Ab18ウイルス属、Amigoウイルス属、Anatoleウイルス属、Andromedaウイルス属、Attisウイルス属、Barnyardウイルス属、Bernal13ウイルス属、Biseptimaウイルス属、Bronウイルス属、C2ウイルス属、C5ウイルス属、Cba181ウイルス属、Cbastウイルス属、Ceciウイルス属、Che8ウイルス属、Chiウイルス属、Cjw1ウイルス属、Corndogウイルス属、Cronusウイルス属、D3112ウイルス属、D3ウイルス属、Decurroウイルス属、Demosthenesウイルス属、Doucetteウイルス属、E125ウイルス属、Eiauウイルス属、Ff47ウイルス属、Gaiaウイルス属、Gilesウイルス属、Gordonウイルス属、Gordtnkウイルス属、Harrisonウイルス属、Hk578ウイルス属、Hk97ウイルス属、Jenstウイルス属、Jwxウイルス属、Kellezioウイルス属、Korraウイルス属、L5ウイルス属、lambdaウイルス属、Laroyeウイルス属、Liefieウイルス属、Marvinウイルス属、Mudcatウイルス属、N15ウイルス属、Nonagウイルス属、Np1ウイルス属、Omegaウイルス属、P12002ウイルス属、P12024ウイルス属、P23ウイルス属、P70ウイルス属、Pa6ウイルス属、Pamx74ウイルス属、Patienceウイルス属、Pbi1ウイルス属、Pepy6ウイルス属、Pfr1ウイルス属、Phic31ウイルス属、Phicbkウイルス属、Phietaウイルス属、Phifelウイルス属、Phijl1ウイルス属、Pis4aウイルス属、Psaウイルス属、Psimunaウイルス属、Rdjlウイルス属、Rer2ウイルス属、Sap6ウイルス属、Send513ウイルス属、Septima3ウイルス属、Seuratウイルス属、Sextaecウイルス属、Sfi11ウイルス属、Sfi21dt1ウイルス属、Sitaraウイルス属、Sk1ウイルス属、Slashウイルス属、Smoothieウイルス属、Soupsウイルス属、Spbetaウイルス属、Ssp2ウイルス属、T5ウイルス属、Tankウイルス属、Tin2ウイルス属、Titanウイルス属、Tm4ウイルス属、Tp21ウイルス属、Tp84ウイルス属、Triaウイルス属、Trigintaduoウイルス属、Vegasウイルス属、Vendettaウイルス属、Wbetaウイルス属、Wildcatウイルス属、Wizardウイルス属、Woesウイルス属、Xp10ウイルス属、Ydn12ウイルス属及びYuaウイルス属)から選択され得る。
【0094】
バクテリオファージは、アッカーマンウイルス(Ackermannviridae)科(例えば、限定はされないが、Ag3ウイルス属、Limestoneウイルス属、Cba120ウイルス属及びVi1ウイルス属)から選択され得る。
【0095】
場合により、バクテリオファージは、カウドウイルス目の一部ではないが、未分類の目を有する科、例えば、限定はされないが、テクチウイルス(Tectiviridae)科(例えば、アルファテクチウイルス(Alphatectiviridae)属、ベータテクチウイルス(Betatectiviridae)属)、コルチコウイルス(Corticoviridae)科(例えば、コルチコウイルス属)、イノウイルス(Inoviridae)科(例えば、Fibroウイルス属、Habeniウイルス属、イノウイルス属、Lineaウイルス属、Plectroウイルス属、Saetiウイルス属、Vespertilioウイルス属)、シストウイルス(Cystoviridae)科(例えば、シストウイルス属)、レビウイルス(Leviviridae)科(例えば、Alloレビウイルス属、レビウイルス属)、ミクロウイルス(Microviridae)科(例えば、Alpha3ミクロウイルス属、G4ミクロウイルス属、Phix174ミクロウイルス属、Bdelloミクロウイルス属、Chlamydiaミクロウイルス属、Spiroミクロウイルス属)及びプラズマウイルス(Plasmaviridae)科(例えば、プラズマウイルス属)由来である。
【0096】
場合により、バクテリオファージは、カウドウイルス目の一部ではないが、未分類の目を有する科、例えば限定はされないが、Ampullaウイルス科、フセロウイルス科、Globuloウイルス科、グッタウイルス科、リポスリクスウイルス科、Pleolipoウイルス科、ルディウイルス科、Salterproウイルス及びBicaudaウイルス科由来である標的化古細菌である。
【0097】
細菌属及びそれらの公知の宿主特異的細菌ウイルスの完全に網羅しているわけではないリストを以下の段落に提示する。本明細書に開示する細菌送達ビヒクルは、非限定的な例として、以下のファージから操作され得る。同意語及び表記揺れは、括弧に示す。同音異義語は、それらが生じる度に繰り返す(例えば、D、D、d)。名前の無いファージは、「NN」によって示し、横にそれらの属及びそれらの番号を括弧に示す。
【0098】
アクチノミセス属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:Av-I、Av-2、Av-3、BF307、CTl、CT2、CT3、CT4、CT6、CT7、CT8及び1281。
【0099】
アエロモナス属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:AA-I、Aeh2、N、PMl、TP446、3、4、11、13、29、31、32、37、43、43-10T、51、54、55R.1、56、56RR2、57、58、59.1、60、63、Aehl、F、PM2、1、25、31、40RR2.8t、(syn= 44R)、(syn= 44RR2.8t)、65、PM3、PM4、PM5及びPM6。
【0100】
バチルス属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:A、aizl、Al-K-I、B、BCJAl、BCl、BC2、BLLl、BLl、BP142、BSLl、BSL2、BSl、BS3、BS8、BS15、BS18、BS22、BS26、BS28、BS31、BS104、BS105、BS106、BTB、B1715V1、C、CK-I、Coll、Corl、CP-53、CS-I、Csi、D、D、D、D5、entl、FP8、FP9、Fsi、FS2、FS3、FS5、FS8、FS9、G、GH8、GT8、GV-I、GV-2、GT-4、g3、gl2、gl3、gl4、gl6、gl7、g21、g23、g24、g29、H2、kenl、KK-88、Kuml、Kyul、J7W-1、LP52、(syn= LP-52)、L7、Mexl、MJ-I、mor2、MP-7、MplO、MP12、MP14、MP15、Neol、N°2、N5、N6P、PBCl、PBLA、PBPl、P2、S-a、SF2、SF6、Shal、Sill、SP02、(syn= ΦSPP1)、SPβ、STI、Sti、SU-Il、t、TbI、Tb2、Tb5、TbIO、Tb26、Tb51、Tb53、Tb55、Tb77、Tb97、Tb99、Tb560、Tb595、Td8、Td6、Tdl5、TgI、Tg4、Tg6、Tg7、Tg9、TgIO、TgIl、Tgl3、Tgl5、Tg21、Tinl、Tin7、Tin8、Tinl3、Tm3、Tocl、Togl、toll、TP-I、TP-10vir、TP-15c、TP-16c、TP-17c、TP-19、TP35、TP51、TP-84、Tt4、Tt6、type A、type B、type C、type D、type E、Tφ3、VA-9、W、wx23、wx26、Yunl、α、γ、pl l、φmed-2、φT、φμ-4、φ3T、φ75、φlO5、(syn= φlO5)、IA、IB、1-97A、1-97B、2、2、3、3、3、5、12、14、20、30、35、36、37、38、41C、51、63、64、138D、I、II、IV、NN-バチルス(13)、alel、Arl、AR2、AR3、AR7、AR9、Bace-11、(syn= 11)、Bastille、BLl、BL2、BL3、BL4、BL5、BL6、BL8、BL9、BP12
4、BS28、BS80、Ch、CP-51、CP-54、D-5、darl、denl、DP-7、entl、FoSi、FoS2、FS4、FS6、FS7、G、gall、gamma、Gel、GF-2、Gsi、GT-I、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5、GT-6、GT-7、GV-6、gl5、19、110、Isi、K、MP9、MP13、MP21、MP23、MP24、MP28、MP29、MP30、MP32、MP34、MP36、MP37、MP39、MP40、MP41、MP43、MP44、MP45、MP47、MP50、NLP-I、No.l、N17、N19、PBSl、PKl、PMBl、PMB12、PMJl、S、SPOl、SP3、SP5、SP6、SP7、SP8、SP9、SplO、SP-15、SP50、(syn= SP-50)、SP82、SST、subl、SW、Tg8、Tgl2、Tgl3、Tgl4、thul、thuΛ、thuS、Tin4、Tin23、TP-13、TP33、TP50、TSP-I、type V、type VI、V、Vx、β22、φe、φNR2、φ25、φ63、1、1、2、2C、3NT、4、5、6、7、8、9、10、12、12、17、18、19、21、138、III、4(B.メガテリウン(B. megateriwn))、4(B.セファエリクス(B. sphaericus))、AR13、BPP-IO、BS32、BS107、Bl、B2、GA-I、GP-IO、GV-3、GV-5、g8、MP20、MP27、MP49、Nf、PP5、PP6、SF5、Tgl8、TP-I、Versailles、φl5、φ29、1-97、837/IV、mι-バチルス(1)、BatlO、BSLlO、BSLI l、BS6、BSI l、BS16、BS23、BslOl、BS102、gl8、morl、PBLl、SN45、thu2、thu3、TmI、Tm2、TP-20、TP21、TP52、type F、type G、type IV、HN-BacMus (3)、BLE、(syn= θc)、BS2、BS4、BS5、BS7、BlO、B12、BS20、BS21、F、MJ-4、PBA12、AP50、AP50-04、AP50-11、AP50-23、AP50-26、AP50-27及びBam35。以下のバチルス特異的ファージは欠失している:DLP10716、DLP-11946、DPB5、DPB12、DPB21、DPB22、DPB23、GA-2、M、No. IM、PBLB、PBSH、PBSV、PBSW、PBSX、PBSY、PBSZ、phi、Spa、type 1及びμ。
4、BS28、BS80、Ch、CP-51、CP-54、D-5、darl、denl、DP-7、entl、FoSi、FoS2、FS4、FS6、FS7、G、gall、gamma、Gel、GF-2、Gsi、GT-I、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5、GT-6、GT-7、GV-6、gl5、19、110、Isi、K、MP9、MP13、MP21、MP23、MP24、MP28、MP29、MP30、MP32、MP34、MP36、MP37、MP39、MP40、MP41、MP43、MP44、MP45、MP47、MP50、NLP-I、No.l、N17、N19、PBSl、PKl、PMBl、PMB12、PMJl、S、SPOl、SP3、SP5、SP6、SP7、SP8、SP9、SplO、SP-15、SP50、(syn= SP-50)、SP82、SST、subl、SW、Tg8、Tgl2、Tgl3、Tgl4、thul、thuΛ、thuS、Tin4、Tin23、TP-13、TP33、TP50、TSP-I、type V、type VI、V、Vx、β22、φe、φNR2、φ25、φ63、1、1、2、2C、3NT、4、5、6、7、8、9、10、12、12、17、18、19、21、138、III、4(B.メガテリウン(B. megateriwn))、4(B.セファエリクス(B. sphaericus))、AR13、BPP-IO、BS32、BS107、Bl、B2、GA-I、GP-IO、GV-3、GV-5、g8、MP20、MP27、MP49、Nf、PP5、PP6、SF5、Tgl8、TP-I、Versailles、φl5、φ29、1-97、837/IV、mι-バチルス(1)、BatlO、BSLlO、BSLI l、BS6、BSI l、BS16、BS23、BslOl、BS102、gl8、morl、PBLl、SN45、thu2、thu3、TmI、Tm2、TP-20、TP21、TP52、type F、type G、type IV、HN-BacMus (3)、BLE、(syn= θc)、BS2、BS4、BS5、BS7、BlO、B12、BS20、BS21、F、MJ-4、PBA12、AP50、AP50-04、AP50-11、AP50-23、AP50-26、AP50-27及びBam35。以下のバチルス特異的ファージは欠失している:DLP10716、DLP-11946、DPB5、DPB12、DPB21、DPB22、DPB23、GA-2、M、No. IM、PBLB、PBSH、PBSV、PBSW、PBSX、PBSY、PBSZ、phi、Spa、type 1及びμ。
【0101】
バクテロイデス(Bacteriodes)属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:crAss-ファージ、ad I2、Baf-44、Baf-48B、Baf-64、Bf-I、Bf-52、B40-8、Fl、βl、φAl、φBrOl、φBrO2、11、67.1、67.3、68.1、mt-バクテロイデス(3)、Bf42、Bf71、HN-ブデロビブリオ(1)及びBF-41。
【0102】
ボルデテラ属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:134及びNN-ボルデテラ(3)。
【0103】
ボレリア(Borrellia)属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:NN-ボレリア(1)及びNN-ボレリア(2)。
【0104】
ブルセラ属の細菌は、以下のファージによって感染され得る: A422、Bk、(syn= Berkeley)、BM29、Foi、(syn= Fol)、(syn= FQl)、D、FP2、(syn= FP2)、(syn= FD2)、Fz、(syn= Fz75/13)、(syn= Firenze 75/13)、(syn= Fi)、Fi、(syn= Fl)、Fim、(syn= Fim)、(syn= Fim)、FiU、(syn= FlU)、(syn= FiU)、F2、(syn= F2)、F3、(syn= F3)、F4、(syn= F4)、F5、(syn= F5)、F6、F7、(syn= F7)、F25、(syn= F25)、(syn= ￡25)、F25U、(syn= F25u)、(syn= F25U)、(syn= F25V)、F44、(syn- F44)、F45、(syn= F45)、F48、(syn= F48)、I、Im、M、MC/75、M51、(syn= M85)、P、(syn= D)、S708、R、Tb、(syn= TB)、(syn= Tbilisi)、W、(syn= Wb)、(syn= Weybridge)、X、3、6、7、10/1、(syn= 10)、(syn= F8)、(syn= F8)、12m、24/11、(syn= 24)、(syn= F9)、(syn= F9)、45/111、(syn= 45)、75、84、212/XV、(syn= 212)、(syn= Fi0)、(syn= FlO)、371/XXIX、(syn= 371)、(syn= Fn)、(syn= Fl l)及び513。
【0105】
バークホルデリア(Burkholderia)属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:CP75、NN-バークホルデリア(1)及び42。
【0106】
カンピロバクター属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:C type、NTCC12669、NTCC12670、NTCC12671、NTCC12672、NTCC12673、NTCC12674、NTCC12675、NTCC12676、NTCC12677、NTCC12678、NTCC12679、NTCC12680、NTCC12681、NTCC12682、NTCC12683、NTCC12684、32f、111c、191、NN-カンピロバクター(2)、Vfi-6、(syn= V19)、VfV-3、V2、V3、V8、V16、(syn= Vfi-1)、V19、V20(V45)、V45、(syn= V-45)及びNN-カンピロバクター(1)。
【0107】
クラミジア属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:Chpl。
【0108】
クロストリジウム属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:CAKl、CA5、Ca7、Ceβ、(syn= 1C)、Ceγ、Cldl、c-n71、c-203 Tox-、Deβ、(syn= ID)、(syn= lDt0X+)、HM3、KMl、KT、Ms、Nal、(syn= Naltox+)、PA135Oe、Pfo、PL73、PL78、PL81、Pl、P50、P5771、P19402、lCt0X+、2Ct0X＼ 2D3 (syn= 2Dt0X+)、3C、(syn= 3Ctox+)、4C、(syn= 4Ct0X+)、56、III-l、NN-Clostridium (61)、NBlt0X+、αl、Cal、HMT、HM2、PFl5 P-23、P-46、Q-05、Q-oe、Q-16、Q-21、Q-26、Q-40、Q-46、S111、SA02、WA01、WA03、Wm、W523、80、C、CA2、CA3、CPTl、CPT4、cl、c4、c5、HM7、H11/A1、H18/Ax、FWS23、Hi58ZA1、K2ZA1、K21ZS23、ML、NA2t0X; Pf2、Pf3、Pf4、S9ZS3、S41ZA1、S44ZS23、α2、41、112ZS23、214/S23、233/Ai、234/S23、235/S23、II-l、II-2、II-3、NN-クロストリジウム(12)、Cal、Fl、K、S2、1、5及びNN-クロストリジウム(8)。
【0109】
コリネバクテリウム属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:CGKl(欠失)、A、A2、A3、AlOl、A128、A133、A137、A139、A155、A182、B、BF、B17、B18、B51、B271、B275、B276、B277、B279、B282、C、capi、CCl、CGl、CG2、CG33、CL31、Cog、(syn= CG5)、D、E、F、H、H-I、hqi、hq2、11ZH33、Ii/31、J、K、K、(syn= Ktox")、L、L、(syn= Ltox+)、M、MC-I、MC-2、MC-3、MC-4、MLMa、N、O、ovi、ov2、ov3、P、P、R、RP6、RS29、S、T、U、UB1、ub2、UH1、UH3、uh3、uh5、uh6、β、(syn= βtox+)、βhv64、βvir、γ、(syn= γtoχ-)、γl9、δ、(syn= δ'ox+)、p、(syn= ptoχ-)、Φ9、φ984、ω、IA、1/1180、2、2/1180、5/1180、5ad/9717、7/4465、8/4465、8ad/10269、10/9253、13Z9253、15/3148、21/9253、28、29、55、2747、2893、4498及び5848。
【0110】
エンテロコッカス属の細菌は、以下のファージによって感染される:DF78、Fl、F2、1、2、4、14、41、867、Dl、SB24、2BV、182、225、C2、C2F、E3、E62、DS96、H24、M35、P3、P9、SblOl、S2、2BII、5、182a、705、873、881、940、1051、1057、21096C、NN-エンテロコッカス(1)、Pel、Fl、F3、F4、VD13、1、200、235及び341。
【0111】
エリシペロスリクス属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:NN-エリシペロスリクス(Eiysipelothrix)(1)。
【0112】
エシェリキア属の細菌は、以下のファージによって感染され得る:BW73、B278、D6、D108、E、El、E24、E41、FI-2、FI-4、FI-5、HI8A、Ffl8B、i、MM、Mu、(syn= mu)、(syn= MuI)、(syn= Mu-I)、(syn= MU-I)、(syn= MuI)、(syn= μ)、025、PhI-5、Pk、PSP3、Pl、PlD、P2、P4(欠失)、Sl、Wφ、φK13、φR73(欠失)、φl、φ2、φ7、φ92、ψ(欠失)、7 A、8φ、9φ、15(欠失)、18、28-1、186、299、HH-エシェリキア(2)、AB48、CM、C4、C16、DD-VI、(syn= Dd-Vi)、(syn= DDVI)、(syn= DDVi)、E4、E7、E28、fIl、FI3、H、Hl、H3、H8、K3、M、N、ND-2、ND-3、ND4、ND-5、ND6、ND-7、Ox-I (syn= oXl)、(syn= HF)、Ox-2 (syn= 0x2)、(syn= 0X2)、Ox-3、Ox-4、Ox-5、(syn= 0X5)、Ox-6、(syn= 66F)、(syn= φ66t)、(syn= φ66t-)5 0111、PhI-I、RB42、RB43、RB49、RB69、S、SaI-I、Sal-2、Sal-3、Sal-4、Sal-5、Sal-6、TC23、TC45、TuII*-6、(syn= TuII*)、TuIP-24、TuII*46、TuIP-60、T2、(syn= ganuTia)、(syn= γ)、(syn= PC)、(syn= P.C.)、(syn= T-2)、(syn= T2)、(syn= P4)、T4、(syn= T-4)、(syn= T4)、T6、T35、αl、1、IA、3、(syn= Ac3)、3A、3T+、(syn= 3)、(syn= Ml)、5φ、(syn= φ5)、9266Q、CFO103、HK620、J、K、KlF、m59、no. A、no. E、no. 3、no. 9、N4、sd、(syn= Sd)、(syn= SD)、(syn= Sa)3 (syn= sd)、(syn= SD)、(syn= CD)、T3、(syn= T-3)、(syn= T3)、T7、(syn= T-7)、(syn= T7)、WPK、W31、ΔH、φC3888、φK3、φK7、φK12、φV-1、Φ04-CF、Φ05、Φ06、Φ07、φl、φl.2、φ20、φ95、φ263、φlO92、φl、φll、(syn= φW)、Ω8、1、3、7、8、26、27、28-2、29、30、31、32、38、39、42、933W、NN-エシェリキア(1)、Esc-7-11、AC30、CVX-5、Cl、DDUP、eCl、EC2、E21、E29、Fl、F26S、F27S、Hi、HK022、HK97、(syn= ΦHK97)、HK139、HK253、HK256、K7、ND-I、no.D、PA-2、q、S2、Tl、(syn= α)、(syn= P28)、(syn= T-I)、(syn= Tx)、T3C、T5、(syn= T-5)、(syn= T5)、UC-I、w、β4、γ2、λ(syn= lambda)、(syn= Φλ)、ΦD326、φγ、Φ06、Φ7、Φ10、φ80、χ、(syn= χi)、(syn= φχ)、(syn= φχi)、2、4、4A、6、8A、102、150、168、174、3000、AC6、AC7、AC28、AC43、AC50、AC57、AC81、AC95、HK243、KlO、ZG/3A、5、5A、21EL、H19-J、933H、O157タイピングファージ1～16、JES-2013、121Q、172-1、1720a-02、ADB-2、AKVF33、av-05、bV_EcoS_AHP42、bV_EcoS_AHP24、bC_EcoS_AHS24、bV_EcoS_AKS96及びCBA120。
【0113】
フソバクテリウム属の細菌は、以下のファージによって感染される:NN-フソバクテリウム(2)、fv83-554/3、fv88-531/2、227、fv2377、fv2527及びfv8501。
【0114】
ヘモフィリス属の細菌は、以下のファージによって感染される:HPl、S2及びN3。
【0115】
ヘリコバクター属の細菌は、以下のファージによって感染される:HPl及び^^-ヘリコバクター(1)。
【0116】
クレブシエラ属の細菌は、以下のファージによって感染される:AIO-2、KI4B、Kl6B、Kl9、(syn= K19)、Kl14、Kl15、Kl21、Kl28、Kl29、KI32、Kl33、Kl35、Kl106B、Kl171B、Kl181B、Kl832B、AIO-I、AO-I、AO-2、AO-3、FC3-10、K、Kl1、(syn= kIl)、Kl2、(syn= K12)、Kl3、(syn= K13)、(syn= Kl 70/11)、Kl4、(syn= K14)、Kl5、(syn= K15)、Kl6、(syn= K16)、Kl7、(syn= K17)、Kl8、(syn= K18)、Kl19、(syn= K19)、Kl27、(syn= K127)、Kl31、(syn= K131)、Kl35、Kl171B、II、VI、IX、CI-I、Kl4B、Kl8、Kl11、Kl12、Kl13、Kl16、Kl17、Kl18、Kl20、Kl22、Kl23、Kl24、Kl26、Kl30、Kl34、Kl106B、kIi65B、Kl328B、KLXI、K328、P5046、11、380、III、IV、VII、VIII、FC3-11、Kl2B、(syn= K12B)、Kl25、(syn= K125)、Kl42B、(syn= K142)、(syn= K142B)、Kl181B、(syn= kIl 81)、(syn= K1181B)、Kl765/!、(syn= K1765/1)、Kl842B、(syn= K1832B)、Kl937B、(syn= K1937B)、Ll、φ28、7、231、483、490、632及び864/100。
【0117】
レプトスピラ(Lepitospira)属の細菌は、以下のファージによって感染される:lEl、LE3、LE4及び～NN-レプトスピラ(1)。
【0118】
リステリア属の細菌は、以下のファージによって感染される:A511、01761、4211、4286、(syn= BO54)、A005、A006、A020、A500、A502、A511、Al 18、A620、A640、B012、B021、B024、B025、B035、B051、B053、B054、B055、B056、BlOl、BI lO、B545、B604、B653、C707、D441、HSO47、HlOG、H8/73、H19、H21、H43、H46、H107、H108、HI lO、H163/84、H312、H340、H387、H391/73、H684/74、H924A、PSA、U153、φMLUP5、(syn= P35)、00241、00611、02971A、02971C、5/476、5/911、5/939、5/11302、5/11605、5/11704、184、575、633、699/694、744、900、1090、1317、1444、1652、1806、1807、1921/959、1921/11367、1921/11500、1921/11566、1921/12460、1921/12582、1967、2389、2425、2671、2685、3274、3550、3551、3552、4276、4277、4292、4477、5337、5348/11363、5348/11646、5348/12430、5348/12434、10072、11355C、11711A、12029、12981、13441、90666、90816、93253、907515、910716及びNN-リステリア(15)。
【0119】
モルガネラ属の細菌は、以下のファージによって感染される:47。
【0120】
マイコバクテリウム属の細菌は、以下のファージによって感染される:13、aGl、aLi、ATCC 11759、A2、B.C3、BG2、BKl、BK5、butyricum、B-I、B5、B7、B30、B35、Clark、Cl、C2、DNAIII、DSP1、D4、D29、GS4E、(syn= GS4E)、GS7、(syn= GS-7)、(syn= GS7)、iPa、lacticola、Legendre、Leo、L5、(syn= ΦL-5)、MC-I、MC-3、MC-4、minetti、MTPHI l、Mx4、MyF3P/59a、phlei、(syn= phlei 1)、phlei 4、Polonus II、rabinovitschi、smegmatis、TM4、TM9、tMlO、TM20、Y7、YlO、φ630、IB、IF、IH、1/1、67、106、1430、Bl、(syn= Bol)、B24、D、D29、F-K、F-S、HP、Polonus I、Roy、Rl、(syn= Rl-Myb)、(syn= Ri)、11、31、40、50、103a、103b、128、3111-D、3215-D及びNN-マイコバクテリウム(1)。
【0121】
ナイセリア属の細菌は、以下のファージによって感染される:Group I、group II及びNPl。
【0122】
ノカルジア属の細菌は、以下のファージによって感染される:MNP8、NJ-L、NS-8、N5及びTtiN-ノカルジア。
【0123】
プロテウス(Proteus)属の細菌は、以下のファージによって感染される:Pm5、13vir、2/44、4/545、6/1004、13/807、20/826、57、67b、78、107/69、121、9/0、22/608、30/680、PmI、Pm3、Pm4、Pm6、Pm7、Pm9、PmIO、PmI l、Pv2、πl、φm、7/549、9B/2、10A/31、12/55、14、15、16/789、17/971、19A/653、23/532、25/909、26/219、27/953、32A/909、33/971、34/13、65、5006M、7480b、VI、13/3a、Clichy 12、π2600、φχ7、1/1004、5/742、9、12、14、22、24/860、2600/D52、Pm8及び24/2514。
【0124】
プロビデンシア(Providencia)属の細菌は、以下のファージによって感染される:PL25、PL26、PL37、9211/9295、9213/921 Ib、9248、7/R49、7476/322、7478/325、7479、7480、9000/9402及び9213/921 Ia。
【0125】
シュードモナス属の細菌は、以下のファージによって感染される:PfI、(syn= Pf-I)、Pf2、Pf3、PP7、PRRl、7s、im-シュードモナス(1)、AI-I、AI-2、B 17、B89、CB3、Col 2、Col 11、Col 18、Col 21、C154、C163、C167、C2121、E79、F8、ga、gb、H22、K1、M4、N2、Nu、PB-I、(syn= PBl)、pfl6、PMN17、PPl、PP8、Psal、PsPl、PsP2、PsP3、PsP4、PsP5、PS3、PS17、PTB80、PX4、PX7、PYOl、PYO2、PYO5、PYO6、PYO9、PYOlO、PYO13、PYO14、PYO16、PYO18、PYO19、PYO20、PYO29、PYO32、PYO33、PYO35、PYO36、PYO37、PYO38、PYO39、PYO41、PYO42、PYO45、PYO47、PYO48、PYO64、PYO69、PYO103、PlK、SLPl、SL2、S2、UNL-I、wy、Yai、Ya4、Yan、φBE、φCTX、φC17、φKZ、(syn= ΦKZ)、φ-LT、Φmu78、φNZ、φPLS-1、φST-1、φW-14、φ-2、1/72、2/79、3、3/DO、4/237、5/406、6C、6/6660、7、7v、7/184、8/280、9/95、10/502、11/DE、12/100、12S、16、21、24、25F、27、31、44、68、71、95、109、188、337、352、1214、HN-シュードモナス(23)、A856、B26、CI-I、CI-2、C5、D、gh-1、Fl 16、HF、H90、K5、K6、Kl 04、K109、K166、K267、N4、N5、O6N-25P、PE69、Pf、PPN25、PPN35、PPN89、PPN91、PP2、PP3、PP4、PP6、PP7、PP8、PP56、PP87、PPl 14、PP206、PP207、PP306、PP651、Psp231a、Pssy401、Pssy9220、psi、PTB2、PTB20、PTB42、PXl、PX3、pXlO、PX12、PX14、PYO70、PYO71、R、SH6、SH133、tf、Ya5、Ya7、φBS、ΦKf77、φ-MC、ΦmnF82、φPLS2
7、φPLS743、φS-1、1、2、2、3、4、5、6、7、7、8、9、10、11、12、12B、13、14、15、14、15、16、17、18、19、20、20、21、21、22、23、23、24、25、31、53、73、119x、145、147、170、267、284、308、525、NN-シュードモナス(5)、af、A7、B3、B33、B39、BI-I、C22、D3、D37、D40、D62、D3112、F7、FlO、g、gd、ge、gξ Hwl2、Jb 19、KFl、L°、OXN-32P、O6N-52P、PCH-I、PC13-1、PC35-1、PH2、PH51、PH93、PH132、PMW、PM13、PM57、PM61、PM62、PM63、PM69、PM105、PMl 13、PM681、PM682、PO4、PPl、PP4、PP5、PP64、PP65、PP66、PP71、PP86、PP88、PP92、PP401、PP711、PP891、Pssy41、Pssy42、Pssy403、Pssy404、Pssy420、Pssy923、PS4、PS-IO、Pz、SDl、SLl、SL3、SL5、SM、φC5、φCl l、φCl l-1、φC13、φC15、φMO、φX、φO4、φl l、φ240、2、2F、5、7m、11、13、13/441、14、20、24、40、45、49、61、73、148、160、198、218、222、236、242、246、249、258、269、295、297、309、318、342、350、351、357-1、400-1、HN-シュードモナス(6)、GlOl、M6、M6a、Ll、PB2、Pssyl5、Pssy4210、Pssy4220、PYO12、PYO34、PYO49、PYO50、PYO51、PYO52、PYO53、PYO57、PYO59、PYO200、PX2、PX5、SL4、φO3、φO6及び1214。
7、φPLS743、φS-1、1、2、2、3、4、5、6、7、7、8、9、10、11、12、12B、13、14、15、14、15、16、17、18、19、20、20、21、21、22、23、23、24、25、31、53、73、119x、145、147、170、267、284、308、525、NN-シュードモナス(5)、af、A7、B3、B33、B39、BI-I、C22、D3、D37、D40、D62、D3112、F7、FlO、g、gd、ge、gξ Hwl2、Jb 19、KFl、L°、OXN-32P、O6N-52P、PCH-I、PC13-1、PC35-1、PH2、PH51、PH93、PH132、PMW、PM13、PM57、PM61、PM62、PM63、PM69、PM105、PMl 13、PM681、PM682、PO4、PPl、PP4、PP5、PP64、PP65、PP66、PP71、PP86、PP88、PP92、PP401、PP711、PP891、Pssy41、Pssy42、Pssy403、Pssy404、Pssy420、Pssy923、PS4、PS-IO、Pz、SDl、SLl、SL3、SL5、SM、φC5、φCl l、φCl l-1、φC13、φC15、φMO、φX、φO4、φl l、φ240、2、2F、5、7m、11、13、13/441、14、20、24、40、45、49、61、73、148、160、198、218、222、236、242、246、249、258、269、295、297、309、318、342、350、351、357-1、400-1、HN-シュードモナス(6)、GlOl、M6、M6a、Ll、PB2、Pssyl5、Pssy4210、Pssy4220、PYO12、PYO34、PYO49、PYO50、PYO51、PYO52、PYO53、PYO57、PYO59、PYO200、PX2、PX5、SL4、φO3、φO6及び1214。
【0126】
リケッチア属の細菌は、以下のファージによって感染される:NN-Rickettsia。
【0127】
サルモネラ属の細菌は、以下のファージによって感染される:b、Beccles、CT、d、Dundee、f、FeIs 2、GI、GUI、GVI、GVIII、k、K、i、j、L、01、(syn= 0-1)、(syn= O1)、(syn= O-I)、(syn= 7)、02、03、P3、P9a、PlO、Sab3、Sab5、SanlS、Sanl7、SI、Taunton、ViI、(syn= ViI)、9、imサルモネラ(1)、N-I、N-5、N-IO、N-17、N-22、11、12、16-19、20.2、36、449C/C178、966A/C259、a、B.A.O.R.、e、G4、GUI、L、LP7、M、MG40、N-18、PSA68、P4、P9c、P22、(syn= P22)、(syn= PLT22)、(syn= PLT22)、P22al、P22-4、P22-7、P22-11、SNT-I、SNT-2、SP6、Villi、ViIV、ViV、ViVI、ViVII、Worksop、Sj5、ε34、1,37、1(40)、(syn= φl[40])、1,422、2、2.5、3b、4、5、6,14(18)、8、14(6,7)、10、27、28B、30、31、32、33、34、36、37、39、1412、SNT-3、7-11、40.3、c、C236、C557、C625、C966N、g、GV、G5、Gl 73、h、IRA、Jersey、MB78、P22-1、P22-3、P22-12、Sabl、Sab2、Sab2、Sab4、Sanl、San2、San3、San4、San6、San7、San8、San9、Sanl3、Sanl4、Sanl6、Sanl8、Sanl9、San20、San21、San22、San23、San24、San25、San26、SasLl、SasL2、SasL3、SasL4、SasL5、SlBL、SII、ViII、φl、1、2、3a、3al、1010、Ym-サルモネラ(1)、N-4、SasL6及び27。
【0128】
セラチア属の細菌は、以下のファージによって感染される:A2P、PS20、SMB3、SMP、SMP5、SM2、V40、V56、ic、ΦCP-3、ΦCP-6、3M、10/la、20A、34CC、34H、38T、345G、345P、501B、SMB2、SMP2、BC、BT、CW2、CW3、CW4、CW5、Lt232、L2232、L34、L.228、SLP、SMPA、V.43、σ、φCWl、ΦCP6-1、ΦCP6-2、ΦCP6-5、3T、5、8、9F、10/1、2OE、32/6、34B、34CT、34P、37、41、56、56D、56P、6OP、61/6、74/6、76/4、101/8900、226、227、228、229F、286、289、290F、512、764a、2847/10、2847/1Oa、L.359及びSMBl。
【0129】
シゲラ属の細菌は、以下のファージによって感染される:Fsa、(syn= a)、FSD2d、(syn= D2d)、(syn= W2d)、FSD2E、(syn= W2e)、fv、F6、f7.8、H-Sh、PE5、P90、SfII、Sh、SHm、SHrv、(syn= HIV)、sHvi、(syn= HVI)、SHVvm、(syn= HVIII)、SKγ66、(syn= gamma 66)、(syn= yββ)、(syn= γ66b)、SKm、(syn= SIIIb)5 (syn= UI)、SKw、(syn= Siva)、(syn= IV)、SIC(商標)、(syn= SIVA.)、(syn= IVA)、sKvi、(syn= KVI)、(syn= Svi)、(syn= VI)、SKvm、(syn= Svm)、(syn= VIII)、SKVΠIA、(syn= SvmA)、(syn= VIIIA)、sTvi、STK、STx1、STxn、S66、W2、(syn= D2c)、(syn= D20)、φl、φIVb 3-SO-R、8368-SO-R、F7、(syn= FS7)、(syn= K29)、FlO、(syn= fSlO)、(syn= K31)、I1、(syn= alfa)、(syn= fSa)、(syn= Kl 8)、(syn= α)、I2、(syn= a)、(syn= K19)、SG33、(syn= G35)、(syn= SO-35/G)、SG35、(syn= SO-55/G)、SG3201、(syn= SO-3201/G)、SHn、(syn= HII)、SHv、(syn= SHV)、SHx、SHX、SKn、(syn= K2)、(syn= KII)、(syn= Sn)、(syn= SsII)、(syn= II)、SKrv、(syn= Sm)、(syn= SsIV)、(syn= IV)、SK1Va、(syn= Swab)、(syn= SsIVa)、(syn= iVa)、SKV、(syn= K4)、(syn= KV)、(syn= SV)、(syn= SsV)、(syn= V)、SKx、(syn= K9)、(syn= KX)、(syn= SX)、(syn= SsX)、(syn= X)、STV、(syn= T35)、(syn= 35-50-R)、STvm、(syn= T8345)、(syn= 8345-SO-S-R)、W1、(syn= D8)、(syn= FSD8)、W2a、(syn= D2A)、(syn= FS2a)、DD-2、Sf6、fSi、(syn= Fl)、SF6、(syn= F6)、SG42、(syn= SO-42/G)、SG3203、(syn= SO-3203/G)、SKF12、(syn= SsF12)、(syn= F12)、(syn= F12)、STn、(syn= 1881-SO-R)、γ66、(syn= gamma 66a)、(syn= Ssγ66)、φ2、bIl、DDVII、(syn= DD7)、FSD2b、(syn= W2B)、FS2、(syn= F2)、(syn= F2)、FS4、(syn= F4)、(syn= F4)、FS5、(syn= F5)、(syn= F5)、FS9、(syn= F9)、(syn= F9)、FI l、P2-S0-S、SG36、(syn= SO-36/G)、(syn= G36)、SG3204、(syn= SO-3204/G)、SG3244、(syn= SO-3244/G)、sHi、(syn= HI)、SHvπ、(syn= HVII)、SHK、(syn= HIX)、SHx1、SHxπ、(syn= HXn)、SKI、KI、(syn= S1)、(syn= SsI)、SKVII、(syn= KVII)、(syn= Svπ)、(syn= SsVII)、SKIX、(syn= KIX)、(syn= S1x)、(syn= SsIX)、SKXII、(syn= KXII)、(syn= Sxn)、(syn= SsXII)、sTi、STffl、STrv、STVi、STvπ、S70、S206、U2-S0-S、3210-SO-S、3859-SO-S、4020-SO-S、φ3、φ5、φ7、φ8、φ9、φlO、φl l、φl3、φl4、φl8、SHm、(syn= Hπi)、sHχi、(syn= HXt)及びsKxI、(syn= KXI)、(syn= Sχi)、(syn= SsXI)、(syn= XI)。
【0130】
スタフィロコッカス属の細菌は、以下のファージによって感染される:A、EW、K、Ph5、Ph9、PhIO、Phl3、Pl、P2、P3、P4、P8、P9、PlO、RG、SB-i、(syn= Sb-I)、S3K、Twort、ΦSK311、φ812、06、40、58、119、130、131、200、1623、STCl、(syn= stcl)、STC2、(syn= stc2)、44AHJD、68、aCl、AC2、A6"C"、A9"C"、b581、CA-I、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、DI l、L39x35、L54a、M42、Nl、N2、N3、N4、N5、N7、N8、NlO、Ni l、N12、N13、N14、N16、Ph6、Phl2、Phl4、UC-18、U4、U15、Sl、S2、S3、S4、S5、X2、Z1、φB5-2、φD、ω、11、(syn= φl l)、(syn= P11-M15)、15、28、28A、29、31、31B、37、42D、(syn= P42D)、44A、48、51、52、52A、(syn= P52A)、52B、53、55、69、71、(syn= P71)、71A、72、75、76、77、79、80、80α、82、82A、83 A、84、85、86、88、88A、89、90、92、95、96、102、107、108、111、129-26、130、130A、155、157、157A、165、187、275、275A、275B、356、456、459、471、471A、489、581、676、898、1139、1154A、1259、1314、1380、1405、1563、2148、2638A、2638B、2638C、2731、2792A、2792B、2818、2835、2848A、3619、5841、12100、AC3、A8、AlO、A13、b594n、D、HK2、N9、N15、P52、P87、Sl、S6、Z4、φRE、3A、3B、3C、6、7、16、21、42B、42C、42E、44、47、47A5 47C、51、54、54x1、70、73、75、78、81、82、88、93、94、101、105、110、115、129/16、174、594n、1363/14、2460 and mS-スタフィロコッカス(1)。
【0131】
ストレプトコッカス属の細菌は、以下のファージによって感染される:EJ-I、NN-ストレプトコッカス(Streptococais)(1)、a、Cl、FL0Ths、H39、Cp-I、Cρ-5、Cp-7、Cp-9、Cp-IO、AT298、A5、alO/Jl、alO/J2、alO/J5、alO/J9、A25、BTI l、b6、cAl、c20-l、c20-2、DP-I、Dp-4、DTl、ET42、elO、FA101、FEThs、Fκ、FKKIOI、FKLIO、FKP74、FKH、FLOThs、FyIOl、fl、F10、F20140/76、g、GT-234、HB3、(syn= HB-3)、HB-623、HB-746、M102、O1205、φO1205、PST、PO、Pl、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P9、P12、P13、P14、P49、P50、P51、P52、P53、P54、P55、P56、P57、P58、P59、P64、P67、P69、P71、P73、P75、P76、P77、P82、P83、P88、sc、sch、sf、SfIl 1、(syn= sFiI l)、(syn= φSFill)、(syn= ΦSfil l)、(syn= φSfil l)、sfil9、(syn= sFil9)、(syn= φSFil9)、(syn= φSfil9)、Sfi21、(syn= sFi21)、(syn= φSFi21)、(syn= φSfi21)、ST0、STX、st2、ST2、ST4、S3、(syn= φS3)、s265、Φ17、φ42、Φ57、φ80、φ81、φ82、φ83、φ84、φ85、φ86、φ87、φ88、φ89、φ90、φ91、φ92、φ93、φ94、φ95、φ96、φ97、φ98、φ99、φlOO、φlOl、φlO2、φ227、Φ7201、ωl、ω2、ω3、ω4、ω5、ω6、ω8、ωlO、1、6、9、1OF、12/12、14、17SR、19S、24、50/33、50/34、55/14、55/15、70/35、70/36、71/ST15、71/45、71/46、74F、79/37、79/38、80/J4、80/J9、80/ST16、80/15、80/47、80/48、101、103/39、103/40、121/41、121/42、123/43、123/44、124/44
、337/ST17及びmストレプトコッカス(34)。
、337/ST17及びmストレプトコッカス(34)。
【0132】
トレポネーマ属の細菌は、以下のファージによって感染される:NN-トレポネーマ(1)。
【0133】
ビブリオ属の細菌は、以下のファージによって感染される:CTXΦ、fs、(syn= si)、fs2、Ivpf5、Vfl2、Vf33、VPIΦ、VSK、v6、493、CP-Tl、ET25、kappa、K139、Labol、)XN-69P、OXN-86、O6N-21P、PB-I、P147、rp-1、SE3、VA-I、(syn= VcA-I)、VcA-2、VPl、VP2、VP4、VP7、VP8、VP9、vPlO、VP17、VP18、VP19、X29、(syn= 29 d'Herelle)、t、ΦHAWI-1、ΦHAWI-2、ΦHAWI-3、ΦHAWI-4、ΦHAWI-5、ΦHAWI-6、ΦHAWI-7、XHAWI-8、ΦHAWI-9、ΦHAWI-10、ΦHCl-1、ΦHC1-2、ΦHC1-3、ΦHC1-4、ΦHC2-1、>HC2-2、ΦHC2-3、ΦHC2-4、ΦHC3-1、ΦHC3-2、ΦHC3-3、ΦHD1S-1、ΦHD1S-2、ΦHD2S-1、ΦHD2S-2、ΦHD2S-3、ΦHD2S-4、ΦHD2S-5、ΦHDO-1、ΦHDO-2、ΦHDO-3、ΦHDO-4、ΦHDO-5、ΦHDO-6、ΦKL-33、ΦKL-34、ΦKL-35、ΦKL-36、ΦKWH-2、ΦKWH-3、ΦKWH-4、ΦMARQ-1、ΦMARQ-2、ΦMARQ-3、ΦMOAT-1、ΦO139、ΦPEL1A-1、ΦPEL1A-2、ΦPEL8A-1、ΦPEL8A-2、ΦPEL8A-3、ΦPEL8C-1、ΦPEL8C-2、ΦPEL13A-1、ΦPEL13B-1、ΦPEL13B-2、ΦPEL13B-3、ΦPEL13B-4、ΦPEL13B-5、ΦPEL13B-6、ΦPEL13B-7、ΦPEL13B-8、ΦPEL13B-9、ΦPEL13B-10、φVP143、φVP253、Φ16、φl38、1- II、5、13、14、16、24、32、493、6214、7050、7227、II、(syn= group II)、(syn= φ2)、V、VIII、～m-ビブリオ(13)、KVP20、KVP40、nt-1、O6N-22P、P68、el、e2、e3、e4、e5、FK、G、I、K、nt-6、Nl、N2、N3、N4、N5、O6N-34P、OXN-72P、OXN-85P、OXN-100P、P、Ph-I、PL163/10、Q、
S、T、φ92、1-9、37、51、57、70A-8、72A-4、72A-10、110A-4、333、4996、I (syn= group I)、III (syn= group III)、VI、(syn= A-Saratov)、VII、IX、X、HN-ビブリオ(6)、pAl、7、7-8、70A-2、71A-6、72A-5、72A-8、108A-10、109A-6、109A-8、l lOA-1、110A-5、110A-7、hv-1、OXN-52P、P13、P38、P53、P65、P108、Pill、TPl3 VP3、VP6、VP12、VP13、70A-3、70A-4、70A-10、72A-1、108A-3、109-B1、110A-2、149、(syn= φl49)、IV、(syn= group IV)、NN-ビブリオ(22)、VP5、VPIl、VP15、VP16、αl、α2、α3a、α3b、353B及びHN-ビブリオ(7)。
S、T、φ92、1-9、37、51、57、70A-8、72A-4、72A-10、110A-4、333、4996、I (syn= group I)、III (syn= group III)、VI、(syn= A-Saratov)、VII、IX、X、HN-ビブリオ(6)、pAl、7、7-8、70A-2、71A-6、72A-5、72A-8、108A-10、109A-6、109A-8、l lOA-1、110A-5、110A-7、hv-1、OXN-52P、P13、P38、P53、P65、P108、Pill、TPl3 VP3、VP6、VP12、VP13、70A-3、70A-4、70A-10、72A-1、108A-3、109-B1、110A-2、149、(syn= φl49)、IV、(syn= group IV)、NN-ビブリオ(22)、VP5、VPIl、VP15、VP16、αl、α2、α3a、α3b、353B及びHN-ビブリオ(7)。
【0134】
エルシニア属の細菌は、以下のファージによって感染される:H、H-I、H-2、H-3、H-4、Lucas 110、Lucas 303、Lucas 404、YerA3、YerA7、YerA20、YerA41、3/M64-76、5/G394-76、6/C753-76、8/C239-76、9/F18167、1701、1710、PST、1/F2852-76、D'Herelle、EV、H、Kotljarova、PTB、R、Y、YerA41、φYerO3-12、3、4/C1324-76、7/F783-76、903、1/M6176及びYer2AT。
【0135】
より好ましくは、細菌送達ビヒクルとして使用されるバクテリオファージは、サルモネラウイルスSKML39、シゲラウイルスAG3、ディッケヤウイルスLimestone、ディッケヤウイルスRC2014、エシェリキアウイルスCBA120、エシェリキアウイルスPhaxI、サルモネラウイルス38、サルモネラウイルスDet7、サルモネラウイルスGG32、サルモネラウイルスPM10、サルモネラウイルSFP10、サルモネラウイルスSH19、サルモネラウイルスSJ3、エシェリキアウイルスECML4、サルモネラウイルスMarshall、サルモネラウイルスMaynard、サルモネラウイルスSJ2、サルモネラウイルスSTML131、サルモネラウイルスViI、エルウィニアウイルスEa2809、クレブシエラウイルス0507KN21、セラチアウイルスIME250、セラチアウイルスMAM1、カンピロバクターウイルスCP21、カンピロバクターウイルスCP220、カンピロバクターウイルスCPt10、カンピロバクターウイルスIBB35、カンピロバクターウイルスCP81、カンピロバクターウイルスCP30A、カンピロバクターウイルスCPX、カンピロバクターウイルスNCTC12673、エルウィニアウイルスEa214、エルウィニアウイルスM7、エシェリキアウイルスAYO145A、エシェリキアウイルスEC6、エシェリキアウイルスHY02、エシェリキアウイルスJH2、エシェリキアウイルスTP1、エシェリキアウイルスVpaE1、エシェリキアウイルスwV8、サルモネラウイルスFelixO1、サルモネラウイルスHB2014、サルモネラウイルスMushroom、サルモネラウイルスUAB87、シトロバクターウイルスMoogle、シトロバクターウイルスMordin、エシェリキアウイルスSUSP1、エシェリキアウイルスSUSP2、アエロモナスウイルスphiO18P、ヘモフィルスウイルスHP1、ヘモフィルスウイルスHP2、パスツレラウイルスF108、ビブリオウイルスK139、ビブリオウイルスKappa、バークホルデリアウイルスphi52237、バークホルデリアウイルスphiE122、バークホルデリアウイルスphiE202、エシェリキアウイルス186、エシェリキアウイルスP4、エシェリキアウイルスP2、エシェリキアウイルスWphi、マンヘミアウイルスPHL101、シュードモナスウイルスphiCTX、ラルストニアウイルスRSA1、サルモネラウイルスFels2、サルモネラウイルスPsP3、サルモネラウイルスSopEphi、エルシニアウイルスL413C、スタフィロコッカスウイルスG1、スタフィロコッカスウイルスG15、スタフィロコッカスウイルスJD7、スタフィロコッカスウイルスK、スタフィロコッカスウイルスMCE2014、スタフィロコッカスウイルスP108、スタフィロコッカスウイルスRodi、スタフィロコッカスウイルスS253、スタフィロコッカスウイルスS25-4、スタフィロコッカスウイルスSA12、リステリアウイルスA511、リステリアウイルスP100、スタフィロコッカスウイルスRemus、スタフィロコッカスウイルスSA11、スタフィロコッカスウイルスStau2、バチルスウイルスCamphawk、バチルスウイルスSPO1、バチルスウイルスBCP78、バチルスウイルスTsarBomba、スタフィロコッカスウイルスTwort、エンテロコッカスウイルスphiEC24C、ラクトバチルスウイルスLb338-1、ラクトバチルスウイルスLP65、エンテロバクターウイルスPG7、エシェリキアウイルスCC31、クレブシエラウイルスJD18、クレブシエラウイルスPKO111、エシェリキアウイルスBp7、エシェリキアウイルスIME08、エシェリキアウイルスJS10、エシェリキアウイルスJS98、エシェリキアウイルスQL01、エシェリキアウイルスVR5、エンテロバクターウイルスEap3、クレブシエラウイルスKP15、クレブシエラウイルスKP27、クレブシエラウイルスMatisse、クレブシエラウイルスMiro、シトロバクターウイルスMerlin、シトロバクターウイルスMoon、エシェリキアウイルスJSE、エシェリキアウイルスphi1、エシェリキアウイルスRB49、エシェリキアウイルスHX01、エシェリキアウイルスJS09、エシェリキアウイルスRB69、シゲラウイルスUTAM、サルモネラウイルスS16、サルモネラウイルスSTML198、ビブリオウイルスKVP40、ビブリオウイルスnt1、ビブリオウイルスValKK3、エシェリキアウイルスVR7、エシェリキアウイルスVR20、エシェリキアウイルスVR25、エシェリキアウイルスVR26、シゲラウイルスSP18、エシェリキアウイルスAR1、エシェリキアウイルスC40、エシェリキアウイルスE112、エシェリキアウイルスECML134、エシェリキアウイルスHY01、エシェリキアウイルスIme09、エシェリキアウイルスRB3、エシェリキアウイルスRB14、エシェリキアウイルスT4、シゲラウイルスPss1、シゲラウイルスShfl2、エルシニアウイルスD1、エルシニアウイルスPST、アシネトバクターウイルス133、アエロモナスウイルス65、アエロモナスウイルスAeh1、エシェリキアウイルスRB16、エシェリキアウイルスRB32、エシェリキアウイルスRB43、シュードモナスウイルス42、クロノバクターウイルスCR3、クロノバクターウイルスCR8、クロノバクターウイルスCR9、クロノバクターウイルスPBES02、ペクトバクテリウムウイルスphiTE、クロノバクターウイルスGAP31、エシェリキアウイルス4MG、サルモネラウイルスSE1、サルモネラウイルスSSE121、エシェリキアウイルスFFH2、エシェリキアウイルスFV3、エシェリキアウイルスJES2013、エシェリキアウイルスV5、ブレビバチルスウイルスAbouo、ブレビバチルスウイルスDavies、バチルスウイルスAgate、バチルスウイルスBobb、バチルスウイルスBp8pC、エルウィニアウイルスDeimos、エルウィニアウイルスEa35-70、エルウィニアウイルスRAY、エルウィニアウイルスSimmy50、エルウィニアウイルスSpecialG、アシネトバクターウイルスAB1、アシネトバクターウイルスAB2、アシネトバクターウイルスAbC62、アシネトバクターウイルスAP22、アルスロバクターウイルスArV1、アルスロバクターウイルスTrina、バチルスウイルスAvesoBmore、バチルスウイルスB4、バチルスウイルスBigbertha、バチルスウイルスRiley、バチルスウイルスSpock、バチルスウイルスTroll、バチルスウイルスBastille、バチルスウイルスCAM003、バチルスウイルスBc431、バチルスウイルスBcp1、バチルスウイルスBCP82、バチルスウイルスBM15、バチルスウイルスDeepblue、バチルスウイルスJBP901、バークホルデリアウイルスBcep1、バークホルデリアウイルスBcep43、バークホルデリアウイルスBcep781、バークホルデリアウイルスBcepNY3、キサントモナスウイルスOP2、バークホルデリアウイルスBcepMu、バークホルデリアウイルスphiE255、アエロモナスウイルス44RR2、マイコバクテリウムウイルスAlice、マイコバクテリウムウイルスBxz1、マイコバクテリウムウイルスDandelion、マイコバクテリウムウイルスHyRo、マイコバクテリウムウイルスI3、マイコバクテリウムウイルスNappy、マイコバクテリウムウイルスSebata、クロストリジウムウイルスphiC2、クロストリジウムウイルスphiCD27、クロストリジウムウイルスphiCD119、バチルスウイルスCP51、バチルスウイルスJL、バチルスウイルスShanette、エシェリキアウイルスCVM10、エシェリキアウイルスep3、エルウィニアウイルスAsesino、エルウィニアウイルスEaH2、シュードモナスウイルスEL、ハロモナスウイルスHAP1、ビブリオウイルスVP882、ブレビバチルスウイルスJimmer、ブレビバチルスウイルスOsiris、シュードモナスウイルスAb03、シュードモナスウイルスKPP10、シュードモナスウイルスPAKP3、シノリゾビウムウイルスM7、シノリゾビウムウイルスM12、シノリゾビウムウイルスN3、エルウィニアウイルスMachina、アルスロバクターウイルスBrent、アルスロバクターウイルスJawnski、アルスロバクターウイルスMartha、アルスロバクターウイルスSonny、エドワージエラウイルスMSW3、エドワージエラウイルスPEi21、エシェリキアウイルスMu、シゲラウイルスSfMu、ハロバクテリウムウイルスphiH、バチルスウイルスGrass、バチルスウイルスNIT1、バチルスウイルスSPG24、アエロモナスウイルス43、エシェリキアウイルスP1、シュードモナスウイルスCAb1、シュードモナスウイルスCAb02、シュードモナスウイルスJG004、シュードモナスウイルスPAKP1、シュードモナスウイルスPAKP4、シュードモナスウイルスPaP1、バークホルデリアウイルスBcepF1、シュードモナスウイルス141、シュードモナスウイルスAb28、シュードモナスウイルスDL60、シュードモナスウイルスDL68、シュードモナスウイルスF8、シュードモナスウイルスJG024、シュードモナスウイルスKPP12、シュードモナスウイルスLBL3、シュードモナスウイルスLMA2、シュードモナスウイルスPB1、シュードモナスウイルスSN、シュードモナスウイルスPA7、シュードモナスウイルスphiKZ、リゾビウムウイルスRHEph4、ラルストニアウイルスRSF1、ラルストニアウイルスRSL2、ラルストニアウイルスRSL1、アエロモナスウイルス25、アエロモナスウイルス31、アエロモナスウイルスAes12、アエロモナスウイルスAes508、アエロモナスウイルスAS4、ステノトロホモナスウイルスIME13、スタフィロコッカスウイルスIPLAC1C、スタフィロコッカスウイルスSEP1、サルモネラウイルスSPN3US、バチルスウイルス1、ゲオバチルスウイルスGBSV1、エルシニアウイルスR1RT、エルシニアウイルスTG1、バチルスウイルスG、バチルスウイルスPBS1、ミクロシスティスウイルスMa-LMM01、ビブリオウイルスMAR、ビブリオウイルスVHML、ビブリオウイルスVP585、バチルスウイルスBPS13、バチルスウイルスHakuna、バチルスウイルスMegatron、バチルスウイルスWPh、アシネトバクターウイルスAB3、アシネトバクターウイルスAbp1、アシネトバクターウイルスFri1、アシネトバクターウイルスIME200、アシネトバクターウイルスPD6A3、アシネトバクターウイルスPDAB9、アシネトバクターウイルスphiAB1、エシェリキアウイルスK30、クレブシエラウイルスK5、クレブシエラウイルスK11、クレブシエラウイルスKp1、クレブシエラウイルスKP32、クレブシエラウイルスKpV289、クレブシエラウイルスF19、クレブシエラウイルスK244、クレブシエラウイルスKp2、クレブシエラウイルスKP34、クレブシエラウイルスKpV41、クレブシエラウイルスKpV71、クレブシエラウイルスKpV475、クレブシエラウイルスSU503、クレブシエラウイルスSU552A、パンテアウイルスLimelight、パンテアウイルスLimezero、シュードモナスウイルスLKA1、シュードモナスウイルスphiKMV、キサントモナスウイルスf20、キサントモナスウイルスf30、キシレラウイルスPrado、エルウィニアウイルスEra103、エシェリキアウイルスK5、エシェリキアウイルスK1-5、エシェリキアウイルスK1E、サルモネラウイルスSP6、エシェリキアウイルスT7、クライベラウイルスKvp1、シュードモナスウイルスgh1、プロクロロコッカスウイルスPSSP7、シネココッカスウイルスP60、シネココッカスウイルスSyn5、ストレプトコッカスウイルスCp1、ストレプトコッカスウイルスCp7、スタフィロコッカスウイルス44AHJD、ストレプトコッカスウイルスC1、バチルスウイルスB103、バチルスウイルスGA1、バチルスウイルスphi29、クルチアウイルス6、アクチノミセスウイルスAv1、マイコプラズマウイルスP1、エシェリキアウイルス24B、エシェリキアウイルス933W、エシェリキアウイルスMin27、エシェリキアウイルスPA28、エシェリキアウイルスStx2 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スM6、シュードモナスウイルスMP1412、シュードモナスウイルスPAE1、シュードモナスウイルスYua、シュードアルテロモナスウイルスPM2、シュードモナスウイルスphi6、シュードモナスウイルスphi8、シュードモナスウイルスphi12、シュードモナスウイルスphi13、シュードモナスウイルスphi2954、シュードモナスウイルスphiNN、シュードモナスウイルスphiYY、ビブリオウイルスfs1、ビブリオウイルスVGJ、ラルストニアウイルスRS603、ラルストニアウイルスRSM1、ラルストニアウイルスRSM3、エシェリキアウイルスM13、エシェリキアウイルスI22、サルモネラウイルスIKe、アコレプラズマウイルスL51、ビブリオウイルスfs2、ビブリオウイルスVFJ、エシェリキアウイルスIf1、プロピオニバクテリウムウイルスB5、シュードモナスウイルスPf1、シュードモナスウイルスPf3、ラルストニアウイルスPE226、ラルストニアウイルスRSS1、スピロプラズマウイルスSVTS2、ステノトロホモナスウイルスPSH1、ステノトロホモナスウイルスSMA6、ステノトロホモナスウイルスSMA7、ステノトロホモナスウイルスSMA9、ビブリオウイルスCTXphi、ビブリオウイルスKSF1、ビブリオウイルスVCY、ビブリオウイルスVf33、ビブリオウイルスVfO3K6、キサントモナスウイルスCf1c、スピロプラズマウイルスC74、スピロプラズマウイルスR8A2B、スピロプラズマウイルスSkV1CR23x、エシェリキアウイルスFI、エシェリキアウイルスQbeta、エシェリキアウイルスBZ13、エシェリキアウイルスMS2、エシェリキアウイルスalpha3、エシェリキアウイルスID21、エシェリキアウイルスID32、エシェリキアウイルスID62、エシェリキアウイルスNC28、エシェリキアウイルスNC29、エシェリキアウイルスNC35、エシェリキアウイルスphiK、エシェリキアウイルスSt1、エシェリキアウイルスWA45、エシェリキアウイルスG4、エシェリキアウイルスID52、エシェリキアウイルスTalmos、エシェリキアウイルスphiX174、ブデロビブリオウイルスMAC1、ブデロビブリオウイルスMH2K、クラミジアウイルスChp1、クラミジアウイルスChp2、クラミジアウイルスCPAR39、クラミジアウイルスCPG1、スピロプラズマウイルスSpV4、アコレプラズマウイルスL2、シュードモナスウイルスPR4、シュードモナスウイルスPRD1、バチルスウイルスAP50、バチルスウイルスBam35、バチルスウイルスGIL16、バチルスウイルスWip1、エシェリキアウイルスphi80、エシェリキアウイルスRB42、エシェリキアウイルスT2、エシェリキアウイルスT3、エシェリキアウイルスT6、エシェリキアウイルスVT2-Sa、エシェリキアウイルスVT1-Sakai、エシェリキアウイルスVT2-Sakai、エシェリキアウイルスCP-933V、エシェリキアウイルスP27、エシェリキアウイルスStx2phi-I、エシェリキアウイルスStx1phi、エシェリキアウイルスStx2phi-II、エシェリキアウイルスCP-1639からなる群において選択され、エシェリキアウイルスBP-4795、エシェリキアウイルス86、エシェリキアウイルスMin27、エシェリキアウイルス2851、エシェリキアウイルス1717、エシェリキアウイルスYYZ-2008、エシェリキアウイルスEC026_P06、エシェリキアウイルスECO103_P15、エシェリキアウイルスECO103_P12、エシェリキアウイルスECO111_P16、エシェリキアウイルスECO111_P11、エシェリキアウイルスVT2phi_272、エシェリキアウイルスTL-2011c、エシェリキアウイルスP13374、エシェリキアウイルスSp5に基づく。
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スM6、シュードモナスウイルスMP1412、シュードモナスウイルスPAE1、シュードモナスウイルスYua、シュードアルテロモナスウイルスPM2、シュードモナスウイルスphi6、シュードモナスウイルスphi8、シュードモナスウイルスphi12、シュードモナスウイルスphi13、シュードモナスウイルスphi2954、シュードモナスウイルスphiNN、シュードモナスウイルスphiYY、ビブリオウイルスfs1、ビブリオウイルスVGJ、ラルストニアウイルスRS603、ラルストニアウイルスRSM1、ラルストニアウイルスRSM3、エシェリキアウイルスM13、エシェリキアウイルスI22、サルモネラウイルスIKe、アコレプラズマウイルスL51、ビブリオウイルスfs2、ビブリオウイルスVFJ、エシェリキアウイルスIf1、プロピオニバクテリウムウイルスB5、シュードモナスウイルスPf1、シュードモナスウイルスPf3、ラルストニアウイルスPE226、ラルストニアウイルスRSS1、スピロプラズマウイルスSVTS2、ステノトロホモナスウイルスPSH1、ステノトロホモナスウイルスSMA6、ステノトロホモナスウイルスSMA7、ステノトロホモナスウイルスSMA9、ビブリオウイルスCTXphi、ビブリオウイルスKSF1、ビブリオウイルスVCY、ビブリオウイルスVf33、ビブリオウイルスVfO3K6、キサントモナスウイルスCf1c、スピロプラズマウイルスC74、スピロプラズマウイルスR8A2B、スピロプラズマウイルスSkV1CR23x、エシェリキアウイルスFI、エシェリキアウイルスQbeta、エシェリキアウイルスBZ13、エシェリキアウイルスMS2、エシェリキアウイルスalpha3、エシェリキアウイルスID21、エシェリキアウイルスID32、エシェリキアウイルスID62、エシェリキアウイルスNC28、エシェリキアウイルスNC29、エシェリキアウイルスNC35、エシェリキアウイルスphiK、エシェリキアウイルスSt1、エシェリキアウイルスWA45、エシェリキアウイルスG4、エシェリキアウイルスID52、エシェリキアウイルスTalmos、エシェリキアウイルスphiX174、ブデロビブリオウイルスMAC1、ブデロビブリオウイルスMH2K、クラミジアウイルスChp1、クラミジアウイルスChp2、クラミジアウイルスCPAR39、クラミジアウイルスCPG1、スピロプラズマウイルスSpV4、アコレプラズマウイルスL2、シュードモナスウイルスPR4、シュードモナスウイルスPRD1、バチルスウイルスAP50、バチルスウイルスBam35、バチルスウイルスGIL16、バチルスウイルスWip1、エシェリキアウイルスphi80、エシェリキアウイルスRB42、エシェリキアウイルスT2、エシェリキアウイルスT3、エシェリキアウイルスT6、エシェリキアウイルスVT2-Sa、エシェリキアウイルスVT1-Sakai、エシェリキアウイルスVT2-Sakai、エシェリキアウイルスCP-933V、エシェリキアウイルスP27、エシェリキアウイルスStx2phi-I、エシェリキアウイルスStx1phi、エシェリキアウイルスStx2phi-II、エシェリキアウイルスCP-1639からなる群において選択され、エシェリキアウイルスBP-4795、エシェリキアウイルス86、エシェリキアウイルスMin27、エシェリキアウイルス2851、エシェリキアウイルス1717、エシェリキアウイルスYYZ-2008、エシェリキアウイルスEC026_P06、エシェリキアウイルスECO103_P15、エシェリキアウイルスECO103_P12、エシェリキアウイルスECO111_P16、エシェリキアウイルスECO111_P11、エシェリキアウイルスVT2phi_272、エシェリキアウイルスTL-2011c、エシェリキアウイルスP13374、エシェリキアウイルスSp5に基づく。
【0136】
一実施形態では、細菌送達ビヒクルは、大腸菌を標的化し、BW73、B278、D6、D108、E、El、E24、E41、FI-2、FI-4、FI-5、HI8A、Ffl8B、i、MM、Mu、025、PhI-5、Pk、PSP3、Pl、PlD、P2、P4、Sl、Wφ、φK13、φl、φ2、φ7、φ92、7 A、8φ、9φ、18、28-1、186、299、HH-エシェリキア(2)、AB48、CM、C4、C16、Dd-VI、E4、E7、E28、FIl、FI3、H、Hl、H3、H8、K3、M、N、ND-2、ND-3、ND4、ND-5、ND6、ND-7、Ox-I、Ox-2、Ox-3、Ox-4、Ox-5、Ox-6、PhI-I、RB42、RB43、RB49、RB69、S、SaI-I、Sal-2、Sal-3、Sal-4、Sal-5、Sal-6、TC23、TC45、TuII*-6、TuIP-24、TuII*46、TuIP-60、T2、T4、T6、T35、αl、1、IA、3、3A、3T+、5φ、9266Q、CFO103、HK620、J、K、KlF、m59、no. A、no. E、no. 3、no. 9、N4、sd、T3、T7、WPK、W31、ΔH、φC3888、φK3、φK7、φK12、φV-1、Φ04-CF、Φ05、Φ06、Φ07、φl、φl.2、φ20、φ95、φ263、φlO92、φl、φll、Ω8、1、3、7、8、26、27、28-2、29、30、31、32、38、39、42、933W、NN-エシェリキア(1)、Esc-7-11、AC30、CVX-5、Cl、DDUP、ECl、EC2、E21、E29、Fl、F26S、F27S、Hi、HK022、HK97、HK139、HK253、HK256、K7、ND-I、PA-2、q、S2、Tl、)、T3C、T5、UC-I、w、β4、γ2、λ、ΦD326、φγ、Φ06、Φ7、Φ10、φ80、χ、2、4、4A、6、8A、102、150、168、174、3000、AC6、AC7、AC28、AC43、AC50、AC57、AC81、AC95、HK243、KlO、ZG/3A、5、5A、21EL、H19-J及び933Hからなる群において選択されるバクテリオファージのキャプシドを含む。
【0137】
遺伝回路が細菌送達ビヒクルにパッケージされる実施形態では、前記遺伝回路は、パッケージングのためにシグナル伝達する核酸配列を含み得、ドナー細胞は、バクテリオファージ足場タンパク質を発現し得る。パッケージングのためにシグナル伝達する前記配列、及び前記バクテリオファージ足場タンパク質は、細菌送達ビヒクルとして使用されるバクテリオファージの性質に応じて当業者によって選択される。
【0138】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌ドナー細胞及び/又は細菌レピシエント細胞は、それらの増殖又は細菌ドナー細胞及び/若しくは細菌レピシエント細胞の任意の他の所望の機能を増強するプレバイオティクスの存在下で使用され得る。プレバイオティクスは、限定はされないが、アミノ酸、ビオチン、フルクト-オリゴサッカライド、ガラクト-オリゴサッカライド、ヘミセルロース(例えば、アラビノキシラン、キシラン、キシログルカン、及びグルコマンナン)、イヌリン、キチン、ラクツロース、マンナンオリゴサッカライド、オリゴフルクトース強化イヌリン、ガム(例えば、グアーガム、アラビアガム及びカラゲナン)、オリゴフルクトース、オリゴデキストロース、タガトース、難消化性マルトデキストリン(例えば、難消化性デンプン)、トランス-ガラクトオリゴサッカライド、ペクチン(例えば、キシロガラクツロナン、シトラスペクチン、リンゴペクチン、及びラムノガラクツロナン-I)、食物繊維(例えば、大豆繊維、テンサイ繊維、エンドウ豆繊維、トウモロコシふすま及びオート麦繊維)及びキシロオリゴサッカライドを含む。
【0139】
更なる実施形態では、遺伝回路に含有され、リプレッサー結合配列の転写制御下に置かれる目的の核酸配列は、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。本明細書で使用される場合、用語「抗生物質」は、好ましくは、ペニシリン、例えば、ペニシリンG、ペニシリンK、ペニシリンN、ペニシリンO、ペニシリンV、メチシリン、ベンジルペニシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、エピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、テモシリン、メズロシリン、及びピペラシリン;セファロスポリン、例えば、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セフォニシド、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタン、セフォキシチン、ロラカルベフ、セフブペラゾン、セフミノクス、セフォテタン、セフォキシチン、セフォチアム、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフォベシン、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフタメレ、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、ラタモキセフ、セフクリジン、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、フロモキセフ、セフトビプロール、セフタロリン、セフトロザン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォキサゾール、セフロチル、セフスミド、セフチオキシド、セフラセチム、及びニトロセフィン;ポリミキシン、例えば、ポリスポリン、ネオスポリン、ポリミキシンB、及びポリミキシンE、リファンピシン、例えば、リファンピシン、リファペンチン、及びリファキシミン;フィダキソマイシン;キノロン、例えば、シノキサシン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミド酸、ピぺミド酸、ロソキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン、プルリフロキサシン、デラフロキサシン、ネモノキサシン、及びザボフロキサシン;スルホンアミド、例えば、スルファフラゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール、スルフィソミジン、スルファドキシン、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、及びテレフチル;マクロライド、例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン、及びロキシスロマイシン;ケトライド、例えば、テリスロマイシン、及びセトロマイシン;ルオロケトライド、例えば、ソリスロマイシン;リンコサミド、例えば、リンコマイシン、クリンダマイシン、及びピルリマイシン;テトラサイクリン、例えばデメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びテトラサイクリン;アミノグリコシド、例えば、アミカシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、シソマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、及びストレプトマイシン;アンサマイシン、例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、及びリファキシミン;カルバセフェム、例えば、ロラカルベフ;カルバペネム、例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム(又はシラスタチン)、及びメロペネム;グリコペプチド、例えば、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、及びオリタバンシン;リンコサミド、例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン;リポペプチド、例えば、ダプトマイシン;モノバクタム、例えば、アズトレオナム;ニトロフラン、例えば、フラゾリドン、及びニトロフラントイン;オキサゾリジノン、例えば、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、及びトレゾリド;テイクソバクチン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジンアミド、リファブチン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン(又はダルフォプリスチン)、チアムフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、トリメトプリム、アラトロフロキサシン、フィダキソマイシン、ナリジキシス酸、リファムピン、これらの誘導体及び組合せからなる群から選択される抗生物質を指す。特に、用語「抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質」は、これらの抗生物質のいずれかに対する耐性を付与するタンパク質を指し得る。
【0140】
本発明は、本明細書に開示するドナー細胞を使用して、好ましくは細菌送達ビヒクルを産生するための本発明の方法を使用して産生する1つ又は複数の細菌送達ビヒクル、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物又は獣医学用組成物を提供する。本発明は、遺伝回路が本明細書に開示する通り移入される、レピシエント細胞又は標的細胞、例えばプロバイオティクス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物又は獣医学用組成物も提供する。本発明は、本明細書に開示する、すなわち遺伝回路を含み、リプレッサータンパク質を発現する、ドナー細胞、例えばプロバイオティクス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物又は獣医学用組成物も提供する。一般に、医薬用途のため、細菌送達ビヒクルは、医薬品又は少なくとも1つの細菌送達ビヒクル及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤、並びに任意選択で1つ又は複数の更なる薬学的に活性な化合物を含む組成物として製剤化され得る。そのような製剤は、経口投与、非経口投与(例えば、静脈内、筋肉内若しくは皮下注射、又は静脈内注入による)、局所投与、吸入による、皮膚パッチによる、移植による、坐薬等による投与に好適な形態であり得る。そのような投与形態は、投与の方法及び経路に依存して、固体、半固体又は液体であり得る。例えば、経口投与のための製剤は、製剤中の合成の細菌送達ビヒクルが胃の環境に耐え、腸へと通過することが可能になるように腸溶コーティングをして提供され得る。より一般的には、経口投与のための合成の細菌送達ビヒクル製剤は、胃腸管の任意の所望の部分への送達に好適に製剤化され得る。更に、好適な坐薬は、胃腸管への送達に使用され得る。細菌送達ビヒクル組成物に有用な様々な薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤が、当業者に公知である。
【0141】
本開示による医薬組成物又は獣医学用組成物は、薬学的に許容されるビヒクルを更に含み得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、充填剤、滑剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、色素、コーティング剤、又は錠剤崩壊剤としても作用し得る1つ又は複数の物質を含み得る。好適な固体ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂を含む。
【0142】
医薬組成物又は獣医学用組成物は、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注射可能培地を使用して、投与時に懸濁し得る滅菌固体組成物として調製され得る。本開示の医薬組成物又は獣医学用組成物は、他の溶質又は懸濁剤(例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水又はグルコース)、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン(sorbitan monoleate)、ポリソルベート80(ソルビトールのオレイン酸エステル及びエチレンオキシドで共重合されたその無水物)等を含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で経口投与され得る。本開示による粒子はまた、液体又は固体組成物の形態のいずれかで経口投与され得る。経口投与に好適な組成物は、丸薬、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び粉末剤等の固体形態、並びに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液剤等の液体形態を含む。経腸投与に有用な形態は、滅菌溶剤、乳剤、及び懸濁液剤を含む。
【0143】
本開示の産生方法により産生する細菌送達ビヒクルは、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物、又は薬学的に許容される油若しくは脂質に溶解又は懸濁され得る。液体ビヒクルは、他の好適な薬学的添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤又は浸透圧調整剤を含有し得る。経口及び経腸投与のための液体ビヒクルの好適な例は、水(部分的に、上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含有する)、アルコール(一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む)及びこれらの誘導体、並びに油(例えば、ヤシ油及び落花生油)を含む。非経口投与の場合、ビヒクルは、油性エステル、例えば、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、経腸投与のための滅菌液体形態組成物に有用である。圧縮組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される噴霧剤であり得る。
【0144】
経皮投与の場合、医薬組成物又は獣医学用組成物は、軟膏、クリーム又はゲルの形態に製剤化することができ、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミド等の適切な浸透剤又は界面活性剤を使用して浸透を促進させることができる。
【0145】
経粘膜投与の場合、鼻腔用スプレー、直腸又は膣坐薬が使用され得る。活性化合物は、当技術分野で公知の方法によって、公知の坐薬基剤のいずれかに組み込まれ得る。このような基剤の例としては、カカオバター、ポリエチレングリコール(カーボワックス)、ポリエチレンモノステアリン酸ソルビタン、及びこれらの融点又は溶解速度を改変する他の適合性材料との混合物が挙げられる。
【0146】
本明細書に開示する組成物を使用する、細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症を処置するための方法も提供する。この態様では、目的の核酸を含む遺伝回路は、疾患又は障害を引き起こす1つ若しくは複数の細菌、すなわち、標的細胞に移入される。方法は、本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物、好ましくは治療有効量の本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物を、処置を必要とする、細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症を有する対象に投与する工程を含む。医薬として、特に、細菌によって引き起こされる疾患又は障害の処置における、好ましくは細菌感染症の処置における使用のための、本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物を更に提供する。細菌によって引き起こされる疾患又は障害、好ましくは細菌感染症を処置するための医薬の製造のための、本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物の使用も提供する。
【0147】
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの特定の実施形態では、対象はヒトである。
【0148】
細菌によって引き起こされる疾患又は障害は、腹部痙攣、尋常性座瘡、急性喉頭蓋炎、関節炎、菌血症、血性下痢、ボツリヌス中毒症、ブルセラ症、脳膿瘍、軟性下疳性病、クラミジア、クローン病、結膜炎、胆嚢炎、結腸直腸がん、ポリープ症、腸内菌共生バランス失調、ライム病、下痢、ジフテリア、十二指腸潰瘍、心内膜炎、エリシペロトリクス症(erysipelothricosis)、腸熱、発熱、糸球体腎炎、胃腸炎、胃潰瘍、ギランバレー症候群、破傷風、淋病、歯肉炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、レプトスピラ症、ハンセン病、リステリア症、結核、ウインダミア卿夫人症候群、レジオネラ症、髄膜炎、粘液膿性結膜炎、多剤耐性細菌感染症、多剤耐性細菌輸送、筋壊死性ガス壊疽、マイコバクテリウム・アビウム複合体、新生児壊死性腸炎、ノカルジア症、院内感染、耳炎、歯周炎、咽頭炎、肺炎、腹膜炎、紫斑熱、ロッキーマウンテン紅斑熱、赤痢、梅毒、副鼻腔炎、S状結腸炎、敗血症、皮下膿瘍、野兎病、気管気管支炎、扁桃炎、腸チフス、潰瘍性大腸炎、尿感染症、及び百日咳からなる群から選択され得る。
【0149】
細菌感染症は、皮膚感染症、例えば、ニキビ、腸感染症、例えば、食道炎、胃炎、腸炎、大腸炎、S状結腸炎、直腸炎、及び腹膜炎、尿路感染症、膣感染症、女性上部生殖管感染症、例えば、卵管炎、子宮内膜炎、卵巣炎、子宮筋炎、子宮傍組織炎、及び骨盤腹膜の感染症、気道感染症、例えば、肺炎、羊膜内感染症、歯原性感染症、歯内感染症、線維症、髄膜炎、血流感染症、院内感染症、例えば、カテーテル関連感染症、院内感染肺炎、分娩後感染、院内感染胃腸炎、院内感染尿路感染症、又はこれらの組合せからなる群から選択され得る。好ましくは、本開示による細菌感染症は、抗生物質耐性を示す細菌によって引き起こされる。特定の実施形態では、感染症は、上記に列挙した細菌、ドナー細胞又は標的細胞として使用され得る細菌によって引き起こされる。
【0150】
処置を必要とする細菌感染症を有する対象に、提供した医薬組成物又は獣医学用組成物、特に治療有効量の提供した医薬組成物又は獣医学用組成物を投与する工程を含む、細菌感染症を処置するための方法も提供する。「治療有効量」は、対象に投与される場合、標的の疾患若しくは障害を処置するため、又は所望の効果を生じるために必要な量、例えば、細菌によって引き起こされる疾患又は障害、特に細菌感染症を処置するために必要な量である。
【0151】
細菌集団を本明細書に開示する医薬組成物若しくは獣医学用組成物、又は本明細書に開示する細菌送達ビヒクルと接触させる工程を含む、細菌集団、特に、細菌感染症を有する対象における病原性細菌及び/又は抗生物質耐性細菌の量を減少させるための方法を提供する。更に、細菌集団、特に、細菌感染症を有する対象における病原性細菌及び/又は抗生物質耐性細菌の量を減少させるための医薬の製造のための本明細書に開示する医薬組成物若しくは獣医学用組成物、又は本明細書に開示する細菌送達ビヒクルの使用を提供する。
【0152】
本開示は、例えば、肥満、2型糖尿病、及び非アルコール性脂肪肝疾患を含む代謝障害の処置における使用のための本発明の医薬組成物又は獣医学用組成物にも関する。確かに、新たに出現した証拠は、これらの障害が、腸の微生物叢の組成及びその代謝産物における変化によって特徴付けられることを示す[31]。したがって、医薬組成物又は獣医学用組成物は、いくつかの腸の細菌において、腸の微生物叢の組成(例えば、いくつかの細菌の死を誘導することによって)及びその代謝産物(例えば、前記細菌によるいくつかの分子、例えば、代謝の炎症において有益な役割を有する分子の発現、過剰発現又は分泌を誘導することによって)を変化させることができる目的の核酸を送達するために使用され得る。本開示は、例えば、肥満、2型糖尿病、及び非アルコール性脂肪肝疾患を含む代謝障害の処置のための医薬の製造のための本発明の医薬組成物又は獣医学用組成物の使用にも関する。本開示は、処置を必要とする代謝障害を有する対象に、提供した医薬組成物又は獣医学用組成物、特に治療有効量の提供した医薬組成物又は獣医学用組成物を投与する工程を含む、例えば、肥満、2型糖尿病、及び非アルコール性脂肪肝疾患を含む代謝障害を処置するための方法にも関する。
【0153】
特定の実施形態では、本開示は、ヒトマイクロビオームの細菌が関与する病理学、例えば、炎症性疾患及び自己免疫疾患、がん、感染症、又は脳障害の処置における使用のための本発明の医薬組成物又は獣医学用組成物に関する。本開示は、病状を有し、処置を必要とする対象に、提供した医薬組成物又は獣医学用組成物、特に治療有効量の提供した医薬組成物又は獣医学用組成物を投与する工程を含む、ヒトマイクロビオームの細菌が関与する前記病状を処置するための方法にも関し、ヒトマイクロビオームの細菌が関与する病状を処置するための医薬の製造のための本明細書に開示する医薬組成物又は獣医学用組成物の使用にも関する。確かに、マイクロビオームのいくつかの細菌は、いずれの感染症を引き起こすこともなく、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患、又はがんの発生を誘発及び/又は増強する分子を分泌し得る。より具体的には、本開示は、例えばCAR-T(キメラ抗原受容体T)細胞、TIL(腫瘍浸潤リンパ球)及びサプレッサーT細胞としても公知のTreg(調節性T細胞)に基づく免疫療法の有効性を改善する、マイクロビオームの組成の改変にも関する。免疫療法の有効性を改善するためのマイクロビオームの組成の改変は、当技術分野で周知の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、限定はされないが、PD-1(プログラム細胞死タンパク質1)阻害剤、PD-L1(プログラム死リガンド1)阻害剤及びCTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)の使用も含み得る。
【0154】
マイクロビオームのいくつかの細菌は、脳に影響する分子も分泌し得る。
【0155】
したがって、本開示の更なる目的は、対象のマイクロビオームを制御するための方法であり、前記対象において本明細書に開示する有効量の医薬組成物を投与する工程を含む。
【0156】
特定の実施形態では、本開示は、細菌感染症の処置を必要とする個体のための個別処置方法にも関し:i)個体から生物学的試料を得て、試料から細菌DNA配列の群を決定する工程;ii)配列の決定に基づいて、試料にあった1つ又は複数の病原菌株又は種を同定する工程;及びiii)試料において同定された各病原菌株又は種を認識することができ、又はパッケージ遺伝回路を送達する、本開示による医薬組成物を個体に投与する工程を含む。
【0157】
好ましくは、生物学的試料は、病原菌及び非病原菌種を含み、個体に本開示による医薬組成物又は獣医学用組成物を投与した後、個体上又は個体内の病原菌の量が減少するが、非病原菌の量は減少しない。
【0158】
別の特定の実施形態では、本開示は、薬物の有効性を改善するために使用するための、本開示による医薬組成物又は獣医学用組成物に関する。確かに、マイクロビオームのいくつかの細菌は、それ自体では病原性ではなく、薬物を代謝し、それらを無効又は有害な分子に改変することができることが公知である。
【0159】
別の特定の実施形態では、本開示は、治療用化合物、例えば、哺乳動物の予防及び治療ワクチンを含む、目的の任意の化合物のin-situ細菌産生に関する。遺伝回路に含まれる目的の核酸によってコードされる目的の化合物は、標的細菌内で産生され得る、標的細菌から分泌され得る、又は標的細菌の表面に発現され得る。より特定の実施形態では、目的の化合物は、予防及び/又は治療ワクチン接種のために、標的細菌の表面に発現される抗原である。
【0160】
本開示は、本明細書に開示する組成物の非治療的使用にも関する。例えば、非治療的使用は、化粧使用、又は対象、特に疾患を患っていない対象の健康を改善するための使用であり得る。したがって、本開示は、本開示の組成物を含む、化粧品組成物又は非治療組成物にも関する。
【0161】
本開示は、ドナー細胞からレシピエント細胞又は標的細胞への目的の遺伝回路の移入における使用のためのキットを更に提供する。一実施形態では、キットは、(i)リプレッサータンパク質を発現するドナー細胞;及び(ii)目的の遺伝回路を含む。前記遺伝回路は、上記に定義される通りであり得、特に、リプレッサータンパク質によって認識されるリプレッサー結合配列に機能的に近接して目的の核酸が挿入され得る(作動可能に連結される)発現カセットを含み得る。本発明の別の実施形態では、又は更に、キットのドナー細胞は、送達ビヒクルの生成、例えば目的の遺伝回路パッケージングのためのプロファージ配列を含有し得る。キットは、レシピエント細胞又は標的細胞を更に含み得、前記レシピエント細胞又は標的細胞は、リプレッサータンパク質を発現せず、それによって前記細胞への移入後に目的の核酸の発現を可能にする。
【0162】
本明細書に開示する主題をより理解するため、及び実際にどのように実行され得るか例示するため、非限定的な例により、添付の図面を参照して、ここで実施形態を記載する。
【実施例1】
【0163】
実施例の特定の参照により、示した特色は、例による、及び本発明の実施形態の図解の目的のためであることを強調する。
【0164】
以下の実施例は、送達ビヒクルの産生のための新規のシステムにおける使用のための種間のプロモーター-リプレッサーの対の使用を実証する。この場合では、産生株においてトランスで発現しているリプレッサーは、異なる細菌種、理想的には系統的に異なる細菌種に由来する。種間リプレッサーの使用は、異種リプレッサーをトランスで含有する株においてのみ所与のタンパク質の発現又は遺伝回路成分の転写を制御する非常に有利なツールである。それにもかかわらず、この手法に従う場合には注意が必要であり、それらを他の種に移入する場合にそれらが直交性ではないことが示されているので[16]、トリプトファン合成リプレッサー等の遍在性が見られ得るリプレッサーは使用しない。しかし、細菌が異なる特徴を有する環境に存在するので、それらは、他の生物体全てに存在し得ない特定のシグナルを認識する特異的リプレッサーを進化させている。2つの最近の刊行物は、大腸菌における種間リプレッサーの使用が可能であり[10][17]、誘導因子が公知でない場合でさえ、可能性がある種間リプレッサー-オペレーターの対の起源となることを示す。最後に、別の解決手段は、不活性なCas9分子(dCas9)、及びプロモーター、RBS又は毒素成分のコード配列を標的化するgRNA/tracrRNAの発現を含む。dCas9は、ヌクレアーゼ活性を有さないが、結合し、gRNAによって標的化される領域からの転写をブロックすることができる[18][19]。
【0165】
図1は、種間リプレッサーによるコンディショナルな転写制御を表す。左側、パッケージングプロファージ及びPhlF(種間)リプレッサーをトランスで含有する産生株。ペイロードは、パッケージングシグナル、及びPphlFプロモーターの制御下の所望の配列(アクチュエーター)を持つ。ファージミド粒子のパッケージングの際に、標的株は形質導入され得、PphlFプロモーターは、それらがPhlFリプレッサー(大腸菌に存在しない)を欠くので、活性である。PhlFリプレッサーが、プロモーター、RBS又はアクチュエーターの配列を標的化するdCas9+gRNAと置き換わり得ることに留意されたい。
【0166】
概念の立証として、PphlFプロモーター(配列番号3)の制御下のCas9、LacZを標的化するsgRNA、及びラムダファージcosシグナルを含有するプラスミドを構築した。LacZを標的化するCas9は、異なる設定で以前に使用されている[20]。このプラスミドの大腸菌の2つの株:MG1655(wt株)及びMG1656(lacZに欠失を含有する)への形質転換を最初に試みた。予想通り、MG1655の形質転換は、Cas9回路がそのゲノムを標的化し、それが毒性であるので、コロニーを生じなかった。対照的に、MG1656への形質転換は、コロニーを与えた(図2)。更に、別のプラスミドにおいてトランスで発現するPhlFリプレッサー(配列番号1、コード配列:配列番号2)を含有する細胞への形質転換は、リプレッサーがCas9活性に対する保護を付与するので、両方の場合でコロニーを与えた。サイズの相違は、Cas9の構成的発現が毒性であることが示されているという事実に起因し得る[21]。
【0167】
図2は、Cas9含有回路の形質転換を表す。PphlFプロモーターの制御下のCas9、及びlacZ(配列番号4)を標的化する構成的sgRNAガイドを含有するプラスミドを、MG1655(左パネル)又はMG1656(右パネル)に形質転換した。空の細胞(任意の他のプラスミドを持たない)を上に示し、PhlFリプレッサー(配列番号5)をコードする外部のプラスミドを含有する形質転換細胞を下に示す。
【0168】
そのようなシステムも形質導入され得るかを試験するために、PhlFリプレッサーを、lacZ遺伝子も欠き、したがってCas9によって標的化されない産生株のゲノムに組み込んだ。このプラスミドを有する産生株は正常に増殖した(データは示さない)。ファージミドを、標準的な熱誘導プロトコール[23]に従って産生し、MG1655及びMG1656に対して滴定した(図3)。Cas9-LacZ回路のMG1655への形質導入はコロニーを与えなかった一方、形質導入の場合のように、MG1656の場合にコロニーは回復した。
【0169】
図3は、Cas9含有回路の形質導入を実証する。PphlFプロモーターの制御下のCas9、及びlacZ(配列番号4)を標的化する構成的sgRNAガイドを含有するファージミドを、MG1655(左パネル)、プラスミド中にコードされるPhlFリプレッサーを有するMG1655(中央)(配列番号5)又はMG1656(右パネル)に形質導入した。
【0170】
PhlFリプレッサーは大腸菌に天然で存在しないので、このシステムは、別の大腸菌株における発現を可能にしながら、産生株における毒素タンパク質(この場合では、Cas9)の発現を抑制するために使用することができる。この特定の場合では、産生株を標的化しないsgRNAガイドを使用したが、Cas9が抑制されるので、システムは、そのゲノムを標的化するsgRNAをコードするファージミド粒子の産生も可能にする。
【実施例2】
【0171】
PsrpRプロモーター(配列番号8)の制御下のCpf1ヌクレアーゼ、LacZを標的化するcrRNA、及びラムダファージcosシグナル(p455、配列番号9)を含有するプラスミドを構築した。これらのプラスミドの大腸菌の2つの株:MG1655(野生型株)及びMG1656(lacZ遺伝子に欠失を含有する)への形質転換を最初に行った。予想通り、MG1655の形質転換は、Cpf1回路がそのゲノムを標的にし、それが毒性であるので、コロニーを生じなかった。対照的に、MG1656への形質転換は、コロニーを与えた(図4)。更に、別のプラスミド(pRARE4-SrpR-1.0、配列番号10)においてトランスで発現するSrpRリプレッサーを含有する細胞への形質転換は、リプレッサーがCpf1活性に対する保護を付与するので、両方の場合でコロニーを与えた(図4)。
【0172】
そのようなシステムも形質導入され得るかを試験するために、SrpRリプレッサー(配列番号6、コード配列:配列番号7)を、lacZ遺伝子も欠き、したがってCpf1によって標的化されない産生株のゲノムに組み込んだ。パッケージファージミドを、PhlFリプレッサーのデータについて示された標準的な熱誘導プロトコールに従って産生し、トランスで供給されたSrpRリプレッサーを含有するMG1655、又はそれを含有しないMG1655、及びMG1656において量を決めた(図5)。Cpf1-LacZ回路のMG1655への形質導入は、回復したコロニーの数のほぼ4logの減少を与え、回路の高い毒性を反映した一方、SrpRリプレッサーで補充されたMG1655の場合に、コロニーはlacZ標的を含有しない細胞(MG1656)と同様の数に回復した。
【0173】
最後に、トランスでペイロードを抑制することができる産生株のゲノムへのリプレッサーの付加は、そうでなければ構成的に発現するであろう回路の負荷の減少を助け得る。プラスミドの負荷に起因して倍加時間が減少するので、細胞は小さくなり、これは、特定のODに達するために必要なより長いインキュベーション時間に起因して、アップスケーリングに有害であり得る。更に、おそらくより重要には、構成的に発現する成分を含有する回路は、細胞が代謝負荷を除去する方法を見出すので、不安定で、迅速に破壊されやすい[24]～[30]。これは、これらの発現レベルが、例えば、上記に示すCpf1回路の場合におけるように高い場合に特に当てはまり、回路が大スケールの発酵の間に破壊される場合、これは大きな経済的損失をもたらし得る。
【0174】
図6は、Cpf1の発現が図4及び図5(p841、配列番号11)よりも高いCpf1-LacZ回路をコードする産生株に利益を付与するSrpRリプレッサーの付加を示す(p841、配列番号11)。PsrpR-Cpf1-LacZ回路の、SrpRリプレッサーを含有するか又は含有しない産生株への形質転換後のコロニーのサイズを監視した。
細胞を、形質転換し、クロラムフェニコールLB寒天上、30℃で終夜インキュベートし、コロニーのサイズを、15時間後、17時間後、19時間後及び22時間後に追跡した。図6に示すことができるように、コロニーは、ゲノムSrpRリプレッサーを含有する産生株において17時間の時に明確に見られるが、なしのものでは見られない。22時間のインキュベーション後でさえ、リプレッサーなしの産生株のコロニーは、SrpRを含有するものよりも明白に小さく、これは、トランスでのリプレッサーの導入が、産生株における代謝負荷を減少させることを示す。
細胞を、形質転換し、クロラムフェニコールLB寒天上、30℃で終夜インキュベートし、コロニーのサイズを、15時間後、17時間後、19時間後及び22時間後に追跡した。図6に示すことができるように、コロニーは、ゲノムSrpRリプレッサーを含有する産生株において17時間の時に明確に見られるが、なしのものでは見られない。22時間のインキュベーション後でさえ、リプレッサーなしの産生株のコロニーは、SrpRを含有するものよりも明白に小さく、これは、トランスでのリプレッサーの導入が、産生株における代謝負荷を減少させることを示す。
【0175】
(参考文献)
本明細書で引用されている参考文献はいずれも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】