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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-18
(54)【発明の名称】細胞サンプルの評価のための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20220511BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20220511BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20220511BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N5/078
C12N5/09
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555585
(86)(22)【出願日】2020-03-18
(85)【翻訳文提出日】2021-11-15
(86)【国際出願番号】 US2020023445
(87)【国際公開番号】W WO2020191105
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】62/820,719
(32)【優先日】2019-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521420152
【氏名又は名称】ユン，キュソン
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ユン，キュソン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA06
4B063QA18
4B063QQ21
4B063QQ79
4B063QQ91
4B063QR77
4B063QS40
4B063QX10
4B065AA90X
4B065BD21
4B065CA46
(57)【要約】
【解決手段】
本明細書で、癌組織などの組織サンプルを含む、細胞サンプルを評価するための方法およびシステムが開示される。場合によっては、細胞サンプルを評価することは、１以上の候補分子の長期的評価を含む。細胞生存率を評価する方法およびシステムが提供される。
【選択図】図６
本明細書で、癌組織などの組織サンプルを含む、細胞サンプルを評価するための方法およびシステムが開示される。場合によっては、細胞サンプルを評価することは、１以上の候補分子の長期的評価を含む。細胞生存率を評価する方法およびシステムが提供される。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを前記候補分子の存在下で少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項2】
工程（ｂ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程（ｂ）において、前記細胞サンプルは１２日間培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
（ｄ）追加的候補分子を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは１２日間培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（ｅ）前記追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
（ｄ）前記追加的候補分子の第２の用量を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは１２日間培養される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
（ｅ）前記追加的候補分子の第２の用量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞サンプルは液体－空気界面で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
生存率反応を評価する工程は、前記細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物を計測することは、細胞培養培地から前記代謝産物を単離し、そして前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項32】
前記テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項36】
前記原発性腫瘍サンプルは被験体からの外科サンプルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項40】
前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項41】
前記候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項42】
前記生物分子は、組み換えタンパク質、酵素、抗体、成長因子、受容体、およびそれらの任意の一部、から成る群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
工程（ａ）は１以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、工程（ｃ）は前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの前記反応を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項44】
前記１以上の追加的候補分子は前記候補分子と同時に提供される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子は連続して提供される、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
（ｄ）前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、（ｅ）少なくとも５日間、前記候補分子の存在下で前記追加的細胞サンプルを培養する工程と、
（ｆ）前記候補分子に対する前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｇ）前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項47】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第２の位置に由来する、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、または２０日離れている、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項４６に記載の方法。
【請求項51】
前記細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項52】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを固定することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを透過処理することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項54】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを溶解させることを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項55】
前記生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項56】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を 被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項57】
工程（ｂ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
工程（ｂ）において、前記細胞サンプルは４日間培養される、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
工程（ｄ）は、（ａ）－（ｃ）を少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回繰り返すことを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項60】
工程（ｄ）は、（ａ）－（ｄ）を３回繰り返すことを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項５９に記載の方法。
【請求項63】
前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項64】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織から単離される、請求項５９に記載の方法。
【請求項65】
前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項66】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項67】
前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項５６に記載の方法。
【請求項72】
前記細胞サンプルは液体－空気界面で培養される、請求項５６に記載の方法。
【請求項73】
前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項74】
前記反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である、請求項５６に記載の方法。
【請求項75】
前記反応を評価する工程は、前記細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項76】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物を計測することは、細胞培養培地から前記代謝産物を単離し、そして前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項７５に記載の方法。
【請求項78】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項７５に記載の方法。
【請求項79】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項７７に記載の方法。
【請求項81】
前記テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項８０に記載の方法。
【請求項83】
前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項84】
前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項85】
前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された外科サンプルである、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項89】
前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項90】
前記候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項91】
工程（ａ）は１以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、工程（ｃ）は前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの前記反応を評価することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項92】
前記１以上の追加的候補分子は前記候補分子と同時に提供される、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子は連続して提供される、請求項９１に記載の方法。
【請求項94】
（ｅ）前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、（ｆ）前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｇ）前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｈ）工程（ｅ）－（ｇ）を繰り返す工程と、
（ｉ）前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項95】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第２の位置に由来する、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項９４に記載の方法。
【請求項97】
前記異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、または５日離れている、請求項９６に記載の方法。
【請求項98】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項９５に記載の方法。
【請求項99】
前記細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項100】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを固定することを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを透過処理することを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項102】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを溶解させることを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項103】
前記生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項104】
細胞生存率を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを培養する工程と、
（ｂ）前記細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
（ｃ）前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測する工程であって、それによって前記細胞サンプルの前記細胞生存率を評価する、工程と、
を含む、方法。
【請求項105】
前記細胞サンプルは細胞株からのものである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項107】
前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項108】
前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項109】
前記細胞サンプルは腫瘍から単離される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項110】
前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項111】
前記細胞サンプルは腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項112】
前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項115】
前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項116】
前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項117】
前記細胞サンプルは液体－空気界面で培養される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項118】
前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項１０４に記載の方法。
【請求項119】
前記代謝産物を計測する工程は、蛍光計測または化学発光計測を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項120】
前記細胞サンプルは、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項121】
前記細胞サンプルは１２日間培養される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項122】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項123】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項124】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項125】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項126】
前記テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項127】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項128】
候補分子を前記細胞サンプルに投与する工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項129】
前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項130】
前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項131】
前記原発性腫瘍サンプルは外科サンプルである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項132】
前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項133】
前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項134】
前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項135】
前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項136】
（ｄ）追加的細胞培養培地で追加的細胞サンプルを培養する工程と、（ｅ）前記追加的細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
（ｆ）前記追加的細胞サンプルが存在しない状態で前記追加的細胞培養培地からの前記代謝産物を計測する工程であって、それによって、前記追加的細胞サンプルの細胞生存率を評価する、工程と、
（ｇ）前記追加的細胞サンプルの前記細胞生存率を前記細胞サンプルの前記細胞生存率と比較する工程と、
をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項137】
前記細胞サンプルは腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第２の位置に由来する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項138】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項139】
前記異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、または２０日離れている、請求項１３８に記載の方法。
【請求項140】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項141】
前記腫瘍組織は被験体に由来する組織サンプルである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項142】
放射線量を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記放射線量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項143】
腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記腫瘍処置照射野に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項144】
放射線量を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記放射線量に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項145】
腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記腫瘍処置照射野に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項146】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを前記候補分子の存在下で少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項147】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項148】
細胞生存率を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを少なくとも４日間培養する工程と、
（ｂ）前記細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
（ｃ）前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測する工程であって、それによって前記細胞サンプルの前記細胞生存率を評価する、工程と、
を含む、方法。
【請求項149】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも４日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を少なくとも３回繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項150】
放射線量を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記放射線量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項151】
腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記腫瘍処置照射野に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項152】
放射線量を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記放射線量に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項153】
腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
（ｂ）前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、
（ｃ）前記腫瘍処置照射野に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１９年３月１９日に出願された米国仮特許出願６２／８２０，７１９号の利益を主張するものであり、それは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１９日に出願された米国仮特許出願６２／８２０，７１９号の利益を主張するものであり、それは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【0002】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、候補分子を評価する方法であって、該方法は、（ａ）候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）細胞サンプルを候補分子の存在下で少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１２日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１６日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは２０日間培養される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）追加的候補分子を細胞サンプルに投与し、そして細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは４日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは８日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは１２日間培養される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）追加的候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）追加的候補分子の第２の用量を細胞サンプルに投与し、そして細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程を、さらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）候補分子の第２の用量に対する細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは４日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは８日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、細胞サンプルは１２日間培養される。
【0003】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルはオルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍組織の微小環境からの細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ（例えば組織常在性および末梢由来マクロファージ）、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無血清条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルはサイトカインまたは成長因子で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている。いくつかの実施形態では、反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、免疫表現型反応、または代謝反応である。
【0004】
いくつかの実施形態では、生存率反応を評価する工程は、細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物を計測することは、細胞培養培地から代謝産物を単離し、そして細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物の計測することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は還元反応の産物である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレサズリンに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレゾルフィンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はテトラゾールに由来する。いくつかの実施形態では、テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はホルマザンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された外科サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである。いくつかの実施形態では、生検サンプルはコア針生検によって取得される。
【0005】
いくつかの実施形態では、方法は、候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、前期候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、生物分子は、組み換えタンパク質、酵素、抗体、成長因子、受容体、およびそれらの任意の一部、から成る群から選択される。
【0006】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）は１以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、ここで、工程（ｃ）は候補分子と１以上の追加的候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価することを含む。いくつかの実施形態では、１以上の追加的候補分子は候補分子と同時に提供される。いくつかの実施形態では、候補分子と１以上の追加的候補分子は連続して提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、（ｅ）少なくとも５日、候補分子の存在下で追加的細胞サンプルを培養する工程と、（ｆ）候補分子に対する追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｇ）追加的細胞サンプルの反応を細胞サンプルの反応と比較する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、追加的細胞サンプルは腫瘍組織の第２の位置に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは異なる時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、または２０日離れている。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは実質的に同時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを透過処理することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを溶解させることを含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される。
【0007】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、候補分子を評価する方法であって、該方法は、（ａ）候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）候補分子に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは４日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｄ）を少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｄ）を３回繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルはオルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍組織の微小環境からの細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、マクロファージ（例えば組織常在性および末梢由来マクロファージ）、骨髄性抑制性細胞、赤血球、または樹状細胞である。
【0008】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無血清条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている。いくつかの実施形態では、反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である。いくつかの実施形態では、反応を評価する工程は、細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物を計測することは、細胞培養培地から代謝産物を単離し、そして細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物の計測することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は還元反応の産物である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレサズリンに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレゾルフィンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はテトラゾールに由来する。いくつかの実施形態では、テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はホルマザンである。
【0009】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された外科サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである。いくつかの実施形態では、生検サンプルはコア針生検によって取得される。いくつかの実施形態では、方法は、候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、前期候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）は１以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、ここで、工程（ｃ）は候補分子と１以上の追加的候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価することを含む。いくつかの実施形態では、１以上の追加的候補分子は候補分子と同時に提供される。いくつかの実施形態では、候補分子と１以上の追加的候補分子は連続して提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）候補分子を 被験体に由来する腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、（ｆ）腫瘍組織の追加的細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｆ）候補分子に対する腫瘍組織の追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｈ）工程（ｅ）－（ｇ）を繰り返す工程と、（ｉ）追加的細胞サンプルの反応を細胞サンプルの反応と比較する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、追加的細胞サンプルは腫瘍組織の第２の位置に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは異なる時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、または５日離れている、いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは実質的に同時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを固定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを透過処理することを含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを溶解させることを含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される。
【0010】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、細胞生存率を評価する方法であって、該方法は、（ａ）細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを培養する工程と、（ｂ）細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、（ｃ）細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程であって、それによって細胞サンプルの細胞生存率を評価する、工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞株からのものである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルはオルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍組織の微小環境からの細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ（例えば組織常在性および末梢由来マクロファージ）、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは無血清条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている。いくつかの実施形態では、代謝産物を計測する工程は、蛍光計測または化学発光計測を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは２０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は還元反応の産物である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレサズリンに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はレゾルフィンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はテトラゾールに由来する。いくつかの実施形態では、テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はホルマザンである。いくつかの実施形態では、方法は、細胞サンプルに候補分子を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された外科サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである。いくつかの実施形態では、生検サンプルはコア針生検によって取得される。いくつかの実施形態では、方法は、候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）追加的細胞培養培地で追加的細胞サンプルを培養する工程と、（ｅ）追加的細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、（ｆ）追加的細胞サンプルが存在しない状態で追加的細胞培養培地からの代謝産物を計測する工程であって、それによって、追加的細胞サンプルの細胞生存率を評価する、工程と、（ｇ）追加的細胞サンプルの細胞生存率を細胞サンプルの細胞生存率と比較する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、追加的細胞サンプルは腫瘍組織の第２の位置に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは異なる時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、または２０日離れている。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは実質的に同時に腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍組織は被験体に由来する組織サンプルである。
【0013】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、放射線量を評価する方法であって、該方法は、（ａ）放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）放射線量に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、または少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１２日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１６日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは２０日間培養される。
【0014】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、腫瘍処置照射野を評価する方法であって、該方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、（ｂ）細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）腫瘍処置照射野に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１２日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは１６日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは２０日間培養される。
【0015】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、放射線量を評価する方法であって、該方法は、（ａ）放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）放射線量に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは４日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｄ）を少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｃ）を３回繰り返すことを含む。
【0016】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、腫瘍処置照射野を評価する方法であって、該方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）腫瘍処置照射野に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、細胞サンプルは４日間培養される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｄ）を少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）－（ｃ）を３回繰り返すことを含む。
【0017】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、腫瘍処置照射野を評価する方法であって、該方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、（ｃ）腫瘍処置照射野に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。
【0018】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、候補分子を評価する方法であって、該方法は、（ａ）候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）細胞サンプルを候補分子の存在下で少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。
【0019】
本明細書に開示されるのは、候補分子を評価する方法であって、該方法は、（ａ）候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）候補分子に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。
【0020】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、細胞生存率を評価する方法であって、該方法は、（ａ）細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを少なくとも４日間培養する工程と、（ｂ）細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、（ｄ）細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程であって、それによって細胞サンプルの細胞生存率を評価する、工程と、を含む。
【0021】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、候補分子を評価する方法であって、該方法は、（ａ）候補分子を 被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも４日間培養する工程と、（ｃ）候補分子に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を少なくとも３回繰り返す工程と、を含む。
【0022】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、放射線量を評価する方法であって、該方法は、（ａ）放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）放射線量に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。
【0023】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、腫瘍処置照射野を評価する方法であって、該方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、（ｂ）細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）腫瘍処置照射野に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。
【0024】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、放射線量を評価する方法であって、該方法は、（ａ）放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）放射線量に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。
【0025】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態における、腫瘍処置照射野を評価する方法であって、該方法は、（ａ）被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、（ｂ）腫瘍組織の細胞サンプルを少なくとも１２日間培養する工程と、（ｃ）腫瘍処置照射野に対する腫瘍組織の細胞サンプルの反応を評価する工程と、（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0026】
特許又は特許出願のファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーが、必要な料金の請求および支払い後に当該事務局によって提供される。本開示の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載とを参照することによって得られる。
【図1D】インビトロの、０日、１日、３日、５日、および１３日後の、ＰＡ０１７０の膵臓の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）組織の組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。
【図1J】示されるように、培地で、または空気－培地界面で、浸されて培養されたＧＢＭ組織からの、生存率の読み取り値を示す。
【図2A】シスプラチンまたはドキソルビシンで処置された時の、ＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸ腫瘍細胞の生存率の読み取り値を示す。
【図2B】シスプラチンまたはパクリタキセルで処置された時の、ＢＲ１１２６ ＴＮＢＣ ＰＤＸ腫瘍細胞の生存率の読み取り値を示す。
【図2C】インビトロで６日間シスプラチンまたはあるいはドキソサイクリン（ｄｏｘｏｃｙｃｌｉｎ）で処置された、ＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸスライスの免疫組織化学分析を示す。
【図2D】放射線のみ、テモゾロミド（ＴＭＺ）プラス放射線、あるいはプロカルバジン、ロムスチン、およびビンクリスチン（ＰＣＶ）プラス放射線で処置された、ＳＮ２８９ ＧＢＭ ＰＤＸ組織の、培養０日目、４日目、８日目、および１２日目の、生存率分析を示す。
【図2E】オキサリプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、あるいはその組み合わせ（Ｏｘ＋５ＦＵ）で処置された、大腸癌ＰＤＸモデルの、培養０日目、４日目、および８日目の、生存率分析を示す。
【図3A】ビヒクル、オキサリプラチン（ＯＸＰ）、または５－フルオロウラシル（５ＦＵ）で、示された濃度で示された時間処置された、ＣＮ０４５８大腸ＰＤＸ組織（図３Ａ）とＣＮＳＴＧ大腸ＰＤＸ（図３Ｂ）組織の、生存率分析を示す。
【図3B】ビヒクル、オキサリプラチン（ＯＸＰ）、または５－フルオロウラシル（５ＦＵ）で、示された濃度で示された時間処置された、ＣＮ０４５８大腸ＰＤＸ組織（図３Ａ）とＣＮＳＴＧ大腸ＰＤＸ（図３Ｂ）組織の、生存率分析を示す。
【図3C】ビヒクルまたはシスプラチン（Ｃｉｓ）で、示された濃度で示された時間処置された、ＢＲ１１２６７ ＴＮＢＣ ＰＤＸ（図３Ａ）細胞とＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸ（図３Ｂ）細胞の、生存率分析を示す。
【図3D】ビヒクルまたはシスプラチン（Ｃｉｓ）で、示された濃度で示された時間処置された、ＢＲ１１２６７ ＴＮＢＣ ＰＤＸ（図３Ａ）細胞とＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸ（図３Ｂ）細胞の、生存率分析を示す。
【図4A】示される通りの１１９の薬物の１つで処置された、ＣＮ０４５８結腸ＰＤＸ腫瘍の生存率計測値を示す。
【図5A】ダブラフェニブ（ｄａｂｒａｆｅｎｉｎｂ）、プラス、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）処置に対する、４人の異なる患者（ＣＮ１５７１、ＣＮ１５７２、ＣＮ１４７３、およびＣＮ１５７４）からのＰＤＸ腫瘍スライスの生存率反応を示す。
【図5B】トラメチニブ、プラス、ダブラフェニブ処置に対する、対応する患者、ＰＤＸマウスモデル、およびＰＤＸ腫瘍スライスにおける、処置反応の相関を示す。
【図6】腫瘍組織から生存率を計測するための、例示的実験パラダイムを示す。
【図7】ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ乳腺腫瘍とＣＴ２６大腸腫瘍からの１８ゲージの生検針コアを使用した、例示的成長曲線と処置反応とを示す。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴの生検コアスライスを、溶媒対照（ＤＭＳＯ）、シクロホスファミド（ＣＰＰ、２０μＭ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ、１００ｎＭ）、または組み合わせ（ＣＰＰ（２０μＭ）＋ＤＯＸ（１００ｎＭ）＋ＴＡＸＯＬ（１ｎＭ））で処置した。ＣＴ２６大腸腫瘍の生検コアスライスを、対照（ＩｇＧ＋ＤＭＳＯ）、ＩｇＧ＋５－フルオロウラシル（５ＦＵ、１μＭ）、抗－ＰＤ１＋ＤＭＳＯ、または抗－ＰＤ１＋５ＦＵ＋オキサリプラチン（抗－ＰＤ１＋５ＦＵ（１μＭ）＋ＯＸ（１μＭ））で処置した。
【図8】いくつかの腫瘍組織における長期間培養による、治療耐性の出現を示す。エンコラフェニブ（Ｅ、１００ｎＭ、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤）、セツキシマブ（Ｃ、１０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦＲ阻害剤）、ビニメチニブ（Ｂ、１００ｎＭ、ＭＥＫ阻害剤）および組み合わせ、で処置されたヒトｍＣＲＣ生検コアは、１６日間の培養後に、エンコラフェニブ耐性の出現を示し、当該耐性は、ＭＥＫ阻害剤ビニメチニブでの処置によって抑制される（１６日目と２０日目のＥ ｖｓ Ｂと、Ｅ＋Ｃ ｖｓ Ｅ＋Ｃ＋Ｂとを比較のこと）。
【図9】培養４日目の、腫瘍スライスにおける免疫細胞の維持を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
多くの細胞毒性療法と標的療法が培養細胞で有望な活性を示すが、ほとんどは、患者で同等の有効性を示すことがなく、既存の細胞培養モデルの予測力が最適とは言えないことを示唆している。単離で培養された細胞株（例えば癌細胞株）は、複数のレベルで、ヒト組織（例えば腫瘍組織）の複雑性を十分に再現できないことがある。例えば、癌の開始と進行は、（例えば炎症性サイトカインを介した）免疫細胞、間質細胞などの非癌細胞を含む、腫瘍微小環境によって調節することができる。患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）や他の動物モデルなどの複合体モデルシステムは、度々、高価で時間がかかる。樹立細胞株、新たに解離された初代細胞、またはオルガノイドは、ネイティブ細胞（ｎａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）：つまり細胞間情報伝達と細胞外基質、を破壊し、そしてまた、免疫細胞を含む重要な間質細胞を欠いている。
【0028】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞の異質性を再現し、細胞：つまり細胞相互作用、を保持し、そして、費用対効果が高く、かつタイムリーな実験操作に適している、細胞サンプル（例えば無傷の癌組織）を評価するための方法とシステムである。本明細書に開示されるのは、ある実施形態で、無傷の系として細胞サンプルを評価するための方法とシステムである。本明細書に開示されるのは、ある実施形態で、被験体からの細胞サンプルを評価するための方法とシステムである。
【0029】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルを評価することは、所与の持続時間、細胞サンプルに供給される候補分子（例えば化学分子、生物分子等）を評価する工程を含み、それによって、候補分子に対するサンプルの反応を評価する。いくつかの実施形態では、候補分子は細胞サンプル（例えば腫瘍組織）に投与され、当該細胞サンプルは少なくとも５日間候補分子の存在下で培養され、そして候補分子に対する反応（例えば細胞の生存率）が評価される。いくつかの実施形態では、候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する、開示された方法は、例えば、被験体からの腫瘍細胞を処置する際に、１以上の化合物の長期間の有効性を確認するのに有用である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、同じ腫瘍サンプルからの細胞を処置する際に、複数の化合物の長期間の有効性を比較するのに有用である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍サンプルからの細胞サンプルの細胞状態（例えば癌幹細胞の成熟、免疫細胞の再分極等）の変化を判定するのに有用である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、候補分子または候補分子の組み合わせに対する、患者に特異的な反応を検出するのに有用である。
【0030】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルを評価することは、長期的な方法で候補分子を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、候補分子は細胞サンプル（例えば腫瘍組織）に投与され、当該細胞サンプルは、少なくとも１日間候補分子の存在下で培養され、候補分子に対する反応（例えば細胞の生存率）が評価され、そして当該プロセスは少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態では、候補分子に対する細胞サンプルの反応は、細胞サンプルを破壊することなく遂行され、これによって、細胞サンプルの継続的な培養と評価とが可能になる。いくつかの実施形態では、候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する、開示された方法は、例えば、被験体からの腫瘍細胞を経時的に処置する際に、１以上の化合物の有効性を判定するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍サンプルに対して処置の初期には最小限の有効性を有し、そして処置の後期には高い有効性を有するものであると確認するのに有用である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、同じ腫瘍サンプルからの細胞サンプルを経時的に処置する際に、複数の化合物の有効性を比較するのに有用である。
【0031】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルを評価することは、細胞生存率を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、細胞の生存率を評価する方法である。いくつかの実施形態では、細胞の生存率を評価することは、細胞サンプルを細胞培養培地内で培養する工程と、細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞の生存率を評価するための開示された方法は、例えば、候補化合物に対する細胞サンプル（例えば腫瘍細胞）の反応を評価するのに有用である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルが存在しない状態で細胞サンプルからの代謝産物を計測することは、細胞サンプル内で代謝産物を計測するのと比較して、ばらつきの少ない計測を取得するのに有用である。
【0032】
定義
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、動物、好ましくは、ヒトまたは非ヒトを含む哺乳動物を意味するために使用される。患者、被験体、個体という用語は、交換可能に使用される。これらの用語のいずれも、医療専門家（例えば、医者、看護師、医師助手、看護助手、ホスピスワーカー）の監督を必要とするものであるとは解釈されない。
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、動物、好ましくは、ヒトまたは非ヒトを含む哺乳動物を意味するために使用される。患者、被験体、個体という用語は、交換可能に使用される。これらの用語のいずれも、医療専門家（例えば、医者、看護師、医師助手、看護助手、ホスピスワーカー）の監督を必要とするものであるとは解釈されない。
【0033】
「約」の用語は、量、時間的な持続期間などの計測可能な値を指す場合、指定値から、±２０％、または場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては±１％、または場合によっては±０．１％の変動を包含することが意図されており、その理由は、そのような変動が、開示された方法を実行するのに適切であるからである。さらに、「約」は、プラスまたはマイナス１パーセント未満、あるいはプラスまたはマイナス１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０パーセント、あるいは３０パーセントを上回り、これは状況によって変わり、そして当業者にとっては既知、または知り得ることである。「約」は正確な量も含む。従って、「約１０ｋＤａ」は、「約１０ｋＤａ」と、さらに「１０ｋＤａ」とを意味する。
【0034】
候補分子の長期間評価
本明細書に開示されるのは、ある実施形態で、細胞サンプル上での１以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補化合物を細胞サンプルに投与する工程と、１以上の候補分子の存在下で、細胞サンプルを少なくとも５日間培養する工程と、複数の候補分子の１つに対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも７日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２０日間培養される。
本明細書に開示されるのは、ある実施形態で、細胞サンプル上での１以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補化合物を細胞サンプルに投与する工程と、１以上の候補分子の存在下で、細胞サンプルを少なくとも５日間培養する工程と、複数の候補分子の１つに対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも７日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２０日間培養される。
【0035】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球（例えばミクログリア細胞）、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ（例えば組織常在性マクロファージおよび末梢由来マクロファージ）、骨髄性抑制性細胞、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織サンプル（例えば原発性腫瘍サンプル）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膠芽腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、結腸癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膵臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、乳癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、前立腺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腎臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、頭頚部癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、皮膚癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、卵巣癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、子宮癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肉腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肝臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、胃癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、異なる臓器部位に転移した癌細胞（例えば肺に転移した乳癌細胞）を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも５日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも６日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも８日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１０日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１２日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１５日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、無血清培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞培養培地に浸されて培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、低酸素環境（例えば低酸素チャンバ中）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、標準培養条件に対して低いｐＨ（例えば酸性条件）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、標準培養条件に対して高いｐＨ（例えばアルカリ条件）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、標準培養条件に対して、アミノ酸、代謝物質、および／または炭素源の濃度が高い状態で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、標準培養条件に対して、アミノ酸、代謝物質、および／または炭素源の濃度が低い状態で培養される。いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子の第２の用量を細胞サンプルに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも１日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも３日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも１０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子の第２の用量を投与した後、少なくとも１５日間培養される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子の第２の用量に対する細胞サンプルの反応が評価される。
【0037】
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の追加的候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも１日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも３日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも１０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の追加的候補分子を投与した後、少なくとも１５日間培養される。いくつかの実施形態では、１以上の追加的候補分子に対する細胞サンプルの反応が評価される。
【0038】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応が（例えば生存率分析を介して）評価され、その後、生物アッセイ（例えば核酸配列決定、組織学的分析等）が細胞サンプル上で実行される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）を含まない。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応は、１以上の候補分子に対する追加的な細胞サンプルの反応と比較される。例えば、いくつかの実施形態では、候補分子が２つの細胞サンプルの各々に提供され、各細胞サンプルは少なくとも５日間培養され、候補分子に対する各細胞サンプルの反応が評価され、そして、各細胞サンプルの反応が比較される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、異なる腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、異なる時に同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、実質的に同時に同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍組織から取得された２つの細胞サンプルに対する候補分子の反応を評価することは、腫瘍組織内の異質性を評価する際に有用である。例えば、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、実質的に同時に同じ腫瘍組織の異なる位置から取得されてもよく、そして、候補分子に対する各細胞サンプルからの反応が比較されてもよく、それによって、腫瘍組織内の候補分子に対する反応における特別な異質性を評価してもよい。別の例では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、異なる時に同じ腫瘍組織から取得されてもよく、そして、候補分子に対する各細胞サンプルからの反応が比較されてもよく、それによって、腫瘍組織内の候補分子に対する反応における特別な異質性を経時的に評価してもよい。別の例では、腫瘍組織からの細胞サンプルと健康な組織からの細胞サンプルが、同じ被験体から取得されてもよく、そして候補分子に対する各細胞サンプルからの反応が評価されてもよい。
【0040】
いくつかの実施形態では、開示された方法は、複数の放射線量の１つと組み合わせて、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍処置照射野への曝露と組み合わせて、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、免疫療法と組み合わせて、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の放射線量を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを少なくとも５日間培養する工程と、１以上の放射線量に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、１以上の放射線量に、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、またはそれ以上、曝露される。いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍処置照射野に細胞サンプルを暴露する工程と、細胞サンプルを少なくとも５日間培養する工程と、腫瘍処置照射野に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。
【0042】
候補分子の長期的評価
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞サンプル上での１以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、投与する工程、培養する工程、および評価する工程を、同じ１以上の候補分子または１以上の追加的候補分子の第２の用量で繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１２時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２４時間培養される。
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞サンプル上での１以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、投与する工程、培養する工程、および評価する工程を、同じ１以上の候補分子または１以上の追加的候補分子の第２の用量で繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１２時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２４時間培養される。
【0043】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも３日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも４日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１２日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも２０日間培養される。
【0044】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程とは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、またはそれ以上、繰り返される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、反応を評価する工程とは、少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、反応を評価する工程とは、少なくとも２回繰り返される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、反応を評価する工程とは、少なくとも３回繰り返される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、反応を評価する工程とは、少なくとも４回繰り返される。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、反応を評価する工程とは、少なくとも５回繰り返される。いくつかの実施形態では、投与する工程と、培養する工程と、評価する工程とは、同じ１以上の候補分子の追加的用量で繰り返され、例えば、細胞サンプル（例えば腫瘍組織サンプル）に対する１以上の候補分子の長期的な影響が評価される。いくつかの実施形態では、投与する工程と、培養する工程と、評価する工程とは、１以上の異なる候補分子で繰り返され、例えば、複数の異なる候補分子の影響が評価される。
【0045】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球（例えばミクログリア細胞）、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織サンプル（例えば原発性腫瘍サンプル）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膠芽腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、結腸癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膵臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、乳癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、前立腺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腎臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、頭頚部癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、皮膚癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、卵巣癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、子宮癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肉腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肝臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、胃癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、異なる臓器部位に転移した癌細胞（例えば肺に転移した乳癌細胞）を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも５日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも６日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも８日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１０日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１２日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも２０日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、無血清培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、サイトカインまたは成長因子の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプル培養培地に浸されて培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、低酸素環境（例えば低酸素チャンバ中）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、標準培養条件に対して低いｐＨ（例えば酸性条件）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、標準培養条件に対して高いｐＨ（例えばアルカリ条件）で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、標準培養条件に対して、アミノ酸、代謝物質、および／または炭素源の濃度が高い状態で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、標準培養条件に対して、アミノ酸、代謝物質、および／または炭素源の濃度が低い状態で培養される。
【0047】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応が（生存率分析を介して）評価され、その後、生物アッセイ（例えば核酸配列決定、組織学的分析等）が細胞サンプル上で実行される。いくつかの実施形態では、１以上の細胞特性を評価するために生物アッセイが実行され、例えば、細胞形態、遺伝子異常、遺伝子発現、タンパク質発現、エピジェネティック特性、タンパク質修飾、免疫表現型、代謝産物発現、および／または組織学的特性が評価される。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、細胞形態を評価するためのアッセイ（例えば光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、遺伝子異常を評価するためのアッセイ（例えば核型分析、ＤＮＡ配列決定、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、遺伝子発現を評価するためのアッセイ（例えばＲＮＡ－配列決定、マイクロアレイ分析、ノーザンブロット法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、タンパク質発現を評価するためのアッセイ（例えば免疫ブロット法、質量分析法、フローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降法、免疫蛍光検査法、免疫組織化学等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、タンパク質の翻訳後修飾を評価するためのアッセイ（例えば免疫ブロット法、質量分析法、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、エピジェネティック特性を評価するためのアッセイ（例えばＡＴＡＣ－配列決定、ＤＮａｓｅ－配列決定、ＭＮａｓｅ－配列決定、バイサルファイト配列決定、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、タンパク質修飾を評価するためのアッセイ（例えば免疫ブロット法、質量分析法等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、代謝産物発現を評価するためのアッセイ（例えば質量分析法、ＨＰＬＣ，、ＮＭＲ等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、分泌タンパク質を評価するためのアッセイ（例えば質量分析法、サイトカイン配列、成長因子配列、ＥＬＩＳＡ、ビーズベースアッセイ（ｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、組織学的特性を評価するためのアッセイである。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）を含まない。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、免疫細胞の組成、活性状態、または機能における変化を評価するためのアッセイである。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応は、１以上の候補分子に対する追加的な細胞サンプルの反応と比較される。例えば、いくつかの実施形態では、候補分子が２つの細胞サンプルの各々に提供され、各細胞サンプルは候補分子の存在下で培養され、候補分子に対する各細胞サンプルの反応が評価され、当該プロセスが少なくとも１回繰り返され、そして、候補サンプルに対する各細胞サンプルの長期的な反応が比較される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、異なる腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、異なる時に同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルと追加的細胞サンプルは、実質的に同時に同じ腫瘍組織から取得される。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍組織から取得された２つの細胞サンプルに対する候補分子の反応を評価することは、腫瘍組織内の異質性を評価する際に有用である。例えば、細胞サンプルと追加的な細胞サンプルは、実質的に同時に同じ腫瘍組織の異なる位置から取得されてもよく、そして、候補分子に対する反応が各細胞サンプルで比較されてもよく、それによって、腫瘍組織内の候補分子に対する反応における特別の異質性を評価してもよい。別の例では、細胞サンプルと追加的な細胞サンプルは、異なる時に同じ腫瘍組織から取得されてもよく、そして、候補分子に対する反応が各細胞サンプルで比較されてもよく、それによって、腫瘍組織内の候補分子に対する反応における特別の異質性を経時的に評価してもよい。別の例では、腫瘍組織からの細胞サンプルと健康な組織からの細胞サンプルが、同じ被験体から取得されてもよく、そして候補分子に対する各細胞サンプルからの反応が評価されてもよい。
【0049】
いくつかの実施形態では、開示された方法は、複数の放射線量の１つと組み合わせて、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍処置照射野への曝露と組み合わせて、１以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、開示された方法は、放射線量を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、複数の放射線量の１つに対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、投与する工程、培養する工程、および評価する工程を、例えば第２の放射線量で繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、１以上の放射線量に、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、またはそれ以上、曝露される。いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍処置照射野に細胞サンプルを曝露する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、腫瘍処置照射野に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、投与する工程、培養する工程、および評価する工程を、例えば同じ腫瘍処置照射野または異なる腫瘍処置照射野で繰り返す工程と、を含む。
【0051】
反応の評価
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子に対する細胞サンプル（例えば細胞）の反応を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）を含まない。いくつかの実施形態では、反応は、１以上の候補分子への曝露に対する反応である、１以上の細胞条件の変化である。いくつかの実施形態では、反応は、例えば、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である。いくつかの実施形態では、反応は生存率反応である。いくつかの実施形態では、反応は、１以上の候補分子への曝露に対する反応である、細胞の生存率の変化である。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子に対する細胞サンプル（例えば細胞）の反応を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、細胞サンプルを破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）を含まない。いくつかの実施形態では、反応は、１以上の候補分子への曝露に対する反応である、１以上の細胞条件の変化である。いくつかの実施形態では、反応は、例えば、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である。いくつかの実施形態では、反応は生存率反応である。いくつかの実施形態では、反応は、１以上の候補分子への曝露に対する反応である、細胞の生存率の変化である。
【0052】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルの遺伝子発現を計測することを含む。遺伝子発現を計測する方法は、核酸配列決定とマイクロアレイ分析を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルのタンパク質発現を計測することを含む。タンパク質発現を計測する方法は、質量分析法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学、免疫蛍光検査法、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルのタンパク質修飾を計測することを含む。タンパク質修飾を計測する方法は、質量分析法、ウエスタンブロット法、およびＥＬＩＳＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルの細胞のシグナル伝達を計測することを含む。細胞のシグナル伝達を計測する方法は、質量分析法、ウエスタンブロット法、核酸配列決定、およびマイクロアレイ分析を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルの形態的変化を計測することを含む。形態的変化を計測する方法は、光学顕微鏡法および電子顕微鏡法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルの代謝産物発現を計測することを含む。タンパク質修飾を計測する方法は、ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を含むが、これらに限定されない。
【0053】
いくつかの実施形態では、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子に曝露された細胞サンプルの細胞の生存率を計測することを含む。例えば、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、１以上の候補分子の存在下で、細胞サンプルを所与の期間培養した後に細胞サンプルの細胞の生存率を計測することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞サンプルの細胞の生存率を計測することは、細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む。いくつかの実施形態では、代謝産物を計測することは、代謝産物を励起させること、および結果として生じた螢光を計測すること（例えば蛍光強度および波長を計測すること）とを含む。いくつかの実施形態では、代謝産物は、細胞サンプルの内部にある間に計測される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、細胞培養培地から単離され、そして細胞サンプルがない状態で計測される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、還元反応の結果である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、細胞サンプルに提供された分子に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、レサズリンに由来する。いくつかの実施形態では、代謝産物は、レゾルフィンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、テトラゾールに由来する。テトラゾールの例としては、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はホルマザンである。
【0054】
細胞の生存率の計測
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞の生存率を計測する方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞サンプルが存在しない状態で、細胞の生存率を計測する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞培養培地で細胞サンプル（例えば細胞）を培養する工程と、細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、代謝産物を計測する工程は、代謝産物を励起させること、および結果として生じた螢光を計測すること（例えば蛍光強度および波長を計測すること）とを含む。
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞の生存率を計測する方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞サンプルが存在しない状態で、細胞の生存率を計測する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞培養培地で細胞サンプル（例えば細胞）を培養する工程と、細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、代謝産物を計測する工程は、代謝産物を励起させること、および結果として生じた螢光を計測すること（例えば蛍光強度および波長を計測すること）とを含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞株からのものである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、無傷組織である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球（例えばミクログリア細胞）、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織サンプル（例えば原発性腫瘍サンプル）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膠芽腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、結腸癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、膵臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、乳癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、前立腺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腎臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肺癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、頭頚部癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、皮膚癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、卵巣癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、子宮癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肉腫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、肝臓癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、胃癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、異なる臓器部位に転移した癌細胞（例えば肺に転移した乳癌細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも５日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも６日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも８日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１０日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１２日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞サンプルの継続的な生存を可能にするのに十分な条件で、少なくとも１５日間、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、無血清培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、液体－空気界面で培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞培養培地に浸されて培養される。
【0056】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、細胞サンプルに提供された分子に由来する。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、またはそれ以上、細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約２４時間、細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１２時間細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１３時間細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１４時間細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１５時間細胞サンプルに提供される。いくつかの実施形態では、分子は、細胞サンプルからの代謝産物を計測する前に、約１６時間細胞サンプルに提供される。
【0057】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、還元反応の結果である。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、レサズリンに由来する。いくつかの実施形態では、代謝産物は、レゾルフィンである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物は、テトラゾールに由来する。テトラゾールの例としては、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからの代謝産物はホルマザンである。
【0058】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測することは、細胞サンプルの存在下で（細胞サンプル内部にある間に）代謝産物を計測するのと比較して、計測ばらつきの低下をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、同じ細胞サンプルからの複数の細胞からの複数の代謝産物からの計測は、細胞サンプルが存在しない状態で（例えば細胞培養培地から単離された状態で）計測された時に、細胞サンプルの存在下で（細胞内で）計測された時よりも、ばらつきが小さくなる。
【0059】
細胞サンプル
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の細胞サンプルの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球（例えばミクログリア細胞）、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、組織サンプルである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、被験体（例えば被験体からの組織）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織（例えば原発性腫瘍組織）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に由来する。いくつかの実施形態では、患者由来（例えば原発性腫瘍組織または患者由来の異種移植片から）の細胞サンプルの使用は、候補分子に対する患者に特異的な反応の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、単一タイプの細胞（例えば癌細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数タイプの細胞（例えば癌細胞、および腫瘍の微小環境からの細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、原発性腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、請求項１に記載で、ここで、細胞サンプルは転移性腫瘍サンプルからのものである。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の細胞サンプルの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、１以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球（例えばミクログリア細胞）、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、組織サンプルである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、被験体（例えば被験体からの組織）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織（例えば原発性腫瘍組織）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に由来する。いくつかの実施形態では、患者由来（例えば原発性腫瘍組織または患者由来の異種移植片から）の細胞サンプルの使用は、候補分子に対する患者に特異的な反応の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、単一タイプの細胞（例えば癌細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数タイプの細胞（例えば癌細胞、および腫瘍の微小環境からの細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、原発性腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、請求項１に記載で、ここで、細胞サンプルは転移性腫瘍サンプルからのものである。
【0060】
いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは、被験体からの外科サンプルである。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍サンプルは、患者生検（例えばコア生検、切除生検、切開生検、またはパンチ生検などの、患者の体の任意の一部からの組織の取り出し）に由来する。いくつかの実施形態では、生検は、コア針生検（例えば中空針を腫瘍の中に挿入して、腫瘍から組織サンプルを取り出す生検）である。いくつかの実施形態では、コア生検を取得するための針は、１４ゲージ、１５ゲージ、１６ゲージ、１７ゲージ、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、または２２ゲージの針である。いくつかの実施形態では、針は、１８ゲージの針である。
【0061】
いくつかの実施形態では、複数の細胞サンプルは、同じ腫瘍上の異なる解剖学的位置からのコア針生検を介して取得される。いくつかの実施形態では、複数のサンプルは、同じ時点で取得される。いくつかの実施形態では、当該サンプルは、異なる時点で取得される。例えば、いくつかの実施形態では、開示された方法は、腫瘍サンプルに対して処置の初期には最小限の有効性を有し、そして処置の後期には高い有効性を有するものであると確認するのに有用である。
【0062】
候補分子
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、癌治療薬である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬であるとされる化合物である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬ではない。いくつかの実施形態では、候補分子は、細胞サンプルからの反応を引き出すことができるとされる分子である。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の候補分子を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、癌治療薬である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬であるとされる化合物である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬ではない。いくつかの実施形態では、候補分子は、細胞サンプルからの反応を引き出すことができるとされる分子である。
【0063】
いくつかの実施形態では、候補分子は、化学分子である。いくつかの実施形態では、候補分子は、小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、最大で９００ダルトン、最大で８００ダルトン、最大で７００ダルトン、最大で６００ダルトン、最大で５００ダルトン、最大で４００ダルトン、最大で３００ダルトン、最大で２００ダルトン、最大で１００ダルトン、またはそれ以下のサイズである。いくつかの実施形態では、候補分子は、生物分子である。生体分子の例は、組み換えタンパク質、酵素、抗体、操作された抗体、操作された抗体薬物キメラ、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、受容体、およびその任意の一部を含むが、これらに限定されない。
【0064】
生物学的アッセイ
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の生物アッセイを細胞サンプル上で実行する工程を含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価した後に、細胞サンプル上で実行される。例えば、候補分子が細胞サンプルに提供され、細胞サンプルは候補分子の存在下で少なくとも５日間培養され、細胞サンプルの生存率反応が評価され、そして、生物アッセイが続いて実行される。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルの細胞を破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期間の評価の後に、細胞サンプル上で実行される。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期的な評価の後に、細胞サンプル上で実行される。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、１以上の生物アッセイを細胞サンプル上で実行する工程を含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、１以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価した後に、細胞サンプル上で実行される。例えば、候補分子が細胞サンプルに提供され、細胞サンプルは候補分子の存在下で少なくとも５日間培養され、細胞サンプルの生存率反応が評価され、そして、生物アッセイが続いて実行される。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルの細胞を破壊すること（例えば、溶解、透過処理、固定等）含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期間の評価の後に、細胞サンプル上で実行される。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期的な評価の後に、細胞サンプル上で実行される。
【0065】
いくつかの実施形態では、生物アッセイは、細胞を固定すること含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、細胞を透過処理すること含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、細胞を溶解させること含む。いくつかの実施形態では、１以上の細胞特性を評価するために生物アッセイが実行され、例えば、細胞形態、遺伝子異常、遺伝子発現、タンパク質発現、エピジェネティック特性、タンパク質修飾、代謝産物発現、および／または組織学的特性が評価される。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、細胞形態を評価するためのアッセイ（例えば光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、遺伝子異常を評価するためのアッセイ（例えば核型分析、ＤＮＡ塩基配列決定、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、遺伝子発現を評価するためのアッセイ（例えばＲＮＡ－配列決定、マイクロアレイ分析、ノーザンブロット法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＲ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、タンパク質発現を評価するためのアッセイ（例えば免疫ブロット法、質量分析法、フローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降法、免疫蛍光検査法、免疫組織化学等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、エピジェネティック特性を評価するためのアッセイ（例えばＡＴＡＣ－配列決定、ＤＮａｓｅ－配列決定、ＭＮａｓｅ－配列決定、バイサルファイト配列決定、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、タンパク質修飾を評価するためのアッセイ（例えば免疫ブロット法、質量分析法等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、代謝産物発現を評価するためのアッセイ（例えば質量分析法、ＨＰＬＣ等）である。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、組織学的特徴を評価するためのアッセイである。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、分泌分子を評価するためのアッセイである。
【実施例】
【0066】
実施例１：ＰＤＸ腫瘍スライスの長期間培養と長期的モニタリング
エクスビボで２０日を超えて、無傷の腫瘍組織の継続的成長を可能にするスライス培養システムを開発した。最適培養条件の開発において４つのパラメータをテストし、そこには、５つの培養培地条件、４つの異なる生存率アッセイ、３つの異なる培養条件、および５つの異なる腫瘍サイズが含まれる。これらのパラメータと最終培養条件が、表１に示される。
エクスビボで２０日を超えて、無傷の腫瘍組織の継続的成長を可能にするスライス培養システムを開発した。最適培養条件の開発において４つのパラメータをテストし、そこには、５つの培養培地条件、４つの異なる生存率アッセイ、３つの異なる培養条件、および５つの異なる腫瘍サイズが含まれる。これらのパラメータと最終培養条件が、表１に示される。
【0067】
【表1】
【0068】
培養条件は、無血清培養培地内の液体－空気界面で培養された、定義されたサイズの腫瘍スライス（直径３ｍｍ、厚み２５０－３５０μＭ）を生成することで構成されていた。
【0069】
これらの条件で、複数の器官部位（例えば脳、乳房、結腸、膵臓）を起源とする腫瘍組織を、エクスビボで最大１６日間継続的に成長させながら維持した。
【0070】
各サンプルの成長を蛍光代謝生存率アッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）を使用して長期的に計測し、異なる摂動前後の、同じ組織からの複数のリアルタイム計測が可能になった。図１Ａ－図１Ｃは、乳房（図１Ａ）、膵臓（図１Ｂ）、膠芽腫（図１Ｃ）の腫瘍サンプルに対する、インビトロの、０日目、４日目、８日目、および１２日目（ｄｉｖ）における、生存率計測値を示す。これらの結果は、これらの条件下での培養組織の生存率と継続的増殖とを実証する。図１Ｄは、インビトロの、０日、１日、３日、５日、および１３日後の、ＰＡ０１７０膵臓細胞の組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。図１Ｅ－図１Ｇは、インビトロの、示された日数後の、乳癌（図１Ｅ）、肺癌（図１Ｆ）、および腎臓癌（図１Ｇ）からの、ヒト患者腫瘍のＨ＆Ｅ染色を示す。これらの結果は、異なる器官部位からの腫瘍組織が１３日間の培養後でさえも、元の組織学的特徴を維持することを示す。
【0071】
生存率計測値が腫瘍細胞数の変化を正確に反映していることを検証するために、生存率読み取り値を、同じ組織からの実際の細胞の個数と比較した。複数の異なるＰＤＸモデルを使用して、生存率を計測した。生存率読み取りを行った直後に、同じ組織上で、生細胞を手動でカウントした。組織を分離し、そして、生細胞を、トリパンブルー排除法（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）によって血球計を使用して、各ウェルからカウントした。図１Ｈと図１Ｉは、ＳＮ２１１ ＧＢＭ ＰＤＸ組織における、細胞のカウント数と生存率の読み取り値との間の相関を示す。図１Ｊは、浸された状態（左）、または空気－培地界面（右）において、培養されたＧＢＭ組織からの生存率計測値を示す。示されるように、計測を、１日目、７日目、または１４日目に行った。これらのデータは、浸された状態で培養された組織と比較して、空気－培地界面で培養された組織に対して、生存率と増殖との著しい改善を示す。
【0072】
材料と方法
患者由来の異種移植片
初期継代（Ｐ０－Ｐ１）の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）をＪａｘ－Ｗｅｓｔから取得し、そして月齢２－３ヵ月のメスのＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；株：００５５５７）、ＮＳＧ－Ｈｐｒｔマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｈｐｒｔｅｍ１Ｍｖｗ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＭｖｗＪ；株：０２６２２２）、またはＮＧＳ－ＥＧＦＰマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／ＳｚＪ；株：０２１９３７）で増やした。２つの三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）サンプル、５つの多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）サンプル、３つの膵臓癌サンプル、および３つの結腸癌サンプルをテストした。ＧＢＭとＴＮＢＣのモデルを、脳または４番目の乳房の脂肪パッドにそれぞれ注入することによって、同所的にそれらを増やした。膵臓腫瘍モデルと結腸腫瘍モデルを、皮下に注射して増殖させた。
患者由来の異種移植片
初期継代（Ｐ０－Ｐ１）の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）をＪａｘ－Ｗｅｓｔから取得し、そして月齢２－３ヵ月のメスのＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；株：００５５５７）、ＮＳＧ－Ｈｐｒｔマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｈｐｒｔｅｍ１Ｍｖｗ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＭｖｗＪ；株：０２６２２２）、またはＮＧＳ－ＥＧＦＰマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／ＳｚＪ；株：０２１９３７）で増やした。２つの三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）サンプル、５つの多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）サンプル、３つの膵臓癌サンプル、および３つの結腸癌サンプルをテストした。ＧＢＭとＴＮＢＣのモデルを、脳または４番目の乳房の脂肪パッドにそれぞれ注入することによって、同所的にそれらを増やした。膵臓腫瘍モデルと結腸腫瘍モデルを、皮下に注射して増殖させた。
【0073】
腫瘍組織回収と器官型スライス培養
腫瘍が５００－１０００ｍｍ３に達した時に、腫瘍組織を回収した。サンプルを、ＫＲＥＢ緩衝液またはリン酸緩理食塩水（ＰＢＳ）中で、４％の低融点アガロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））に埋め込み、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ ＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して２５０－３５０μＭの厚さのスライスに精密にカットした。スライス速度と大きさは、腫瘍組織の密度と完全性によって調節した。１ｍｍ、２ｍｍ、または３ｍｍの直径の組織を、生検針を使用して、壊死領域を回避して、腫瘍含有領域から生成した。各スライスパンチを、１ｍｌまたは０．２ｍｌの無血清スライス培養培地（スライス培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して、１２ウェルまたは４８ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈｅｄ－Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））上で培養した。
腫瘍が５００－１０００ｍｍ３に達した時に、腫瘍組織を回収した。サンプルを、ＫＲＥＢ緩衝液またはリン酸緩理食塩水（ＰＢＳ）中で、４％の低融点アガロース（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））に埋め込み、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ ＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して２５０－３５０μＭの厚さのスライスに精密にカットした。スライス速度と大きさは、腫瘍組織の密度と完全性によって調節した。１ｍｍ、２ｍｍ、または３ｍｍの直径の組織を、生検針を使用して、壊死領域を回避して、腫瘍含有領域から生成した。各スライスパンチを、１ｍｌまたは０．２ｍｌの無血清スライス培養培地（スライス培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して、１２ウェルまたは４８ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈｅｄ－Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））上で培養した。
【0074】
生存率アッセイと組織学的分析
５μｌのＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））基質を、１ｍｌの培養培地に添加し、そして３７°Ｃで１５時間または２４時間インキュベートした。１００μｌの培地を、各サンプル培養物から取り出し、そしてＥｎｓｐｉｒｅ（登録商標） ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標））を使用して、蛍光を計測した（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）。培養培地の背景蛍光は、毎日、各サンプルの読み取り値から差し引いた。ＣＴＢ読み取り直後に培地を変更し、そして、新規培地に薬物を添加して、培養を継続した。望ましい時点で、追加的な生存率計測を行って長期的データを収集し、そして、馴化培地を収集して分析した。最終時点後、組織を、ホルマリン中に固定して、組織学的分析用にパラフィンまたはＯＣＴに埋め込むか、あるいは、ＲＩＰＡ緩衝液またはトリゾール中に溶解させ、そして、馴化培地を冷凍する。各スライスパンチの組織組成におけるばらつきを考慮して、各サンプルの生存率読み取り値を、スライス直後のＣＴＢ読み取り値（０日目エクスビボ：１ ｄｅｘ ＣＴＢ読み取り値）にそれぞれ正規化し、そして、各時点におけるＣＴＢ計測値の相対的な倍率変化を分析した。
５μｌのＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））基質を、１ｍｌの培養培地に添加し、そして３７°Ｃで１５時間または２４時間インキュベートした。１００μｌの培地を、各サンプル培養物から取り出し、そしてＥｎｓｐｉｒｅ（登録商標） ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標））を使用して、蛍光を計測した（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）。培養培地の背景蛍光は、毎日、各サンプルの読み取り値から差し引いた。ＣＴＢ読み取り直後に培地を変更し、そして、新規培地に薬物を添加して、培養を継続した。望ましい時点で、追加的な生存率計測を行って長期的データを収集し、そして、馴化培地を収集して分析した。最終時点後、組織を、ホルマリン中に固定して、組織学的分析用にパラフィンまたはＯＣＴに埋め込むか、あるいは、ＲＩＰＡ緩衝液またはトリゾール中に溶解させ、そして、馴化培地を冷凍する。各スライスパンチの組織組成におけるばらつきを考慮して、各サンプルの生存率読み取り値を、スライス直後のＣＴＢ読み取り値（０日目エクスビボ：１ ｄｅｘ ＣＴＢ読み取り値）にそれぞれ正規化し、そして、各時点におけるＣＴＢ計測値の相対的な倍率変化を分析した。
【0075】
実施例２：ＰＤＸスライスの長期間培養物を使用して、薬物反応をテストする
脳、乳房、結腸、および膵臓からの１２の異なるＰＤＸモデルにおいて、１３の薬物を、単独でまたは放射線との組み合わせでテストした（表２）。テストした組み合わせとしては、プロカルバジン、ロムスチン、およびビンクリスチン（「ＰＣＶ」）と５ＦＵ、ロイコボリン、イリノテカン、およびＯＸＰ（「ＦＬＣＯ」）が挙げられた。
脳、乳房、結腸、および膵臓からの１２の異なるＰＤＸモデルにおいて、１３の薬物を、単独でまたは放射線との組み合わせでテストした（表２）。テストした組み合わせとしては、プロカルバジン、ロムスチン、およびビンクリスチン（「ＰＣＶ」）と５ＦＵ、ロイコボリン、イリノテカン、およびＯＸＰ（「ＦＬＣＯ」）が挙げられた。
【0076】
【表2】
【0077】
図２Ａと図２Ｂは、観察された反応を表わす、２つの三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸからの例を示す。２つの別個のＴＮＢＣ ＰＤＸスライスを、標準ケア化学療法（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃａｒｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、シスプラチン（Ｃｉｓ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、またはパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）で処置した。実施例１に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。生存率アッセイの読み取り値は、ＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸ腫瘍は、シスプラチン処置に対して感受性が無いが、Ｄｏｘ処置に感受性が高いことを示しており、このことは、１２日目のエクスビボ（「ｄｉｖ」）を０ｄｉｖと比較して、１２ｄｉｖで、ビヒクルとシスプラチン処置スライスで生存率読み取り値が上がっていること、および、Ｄｏｘ処置スライスで生存率読み取り値が下がっていることよって実証されている（図２Ａ）。他方、ＢＲ１１２６ ＴＮＢＣ ＰＤＸ腫瘍は、Ｃｉｓ処置とＴａｘｏｌ処置の両方に対して感受性が高い（図２Ｂ）。
【0078】
１３ｄｉｖでのＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸスライスの免疫組織化学法は、全組織数は、ビヒクルとＣｉｓ処置組織とにおいては同様であるが、ビヒクルとシスプラチン処置組織と比較してＤｏｘ処置組織では、細胞数が全体的に減少し、核濃縮と核異常が増加し、そして壊死領域が増加していることを示している（図２Ｃ）。従って、免疫化学分析はＣＴＢ読み取り値と一致しており、つまり、Ｄｏｘ処置は、結果として、１３ｄｉｖまでに完全寛解をもたらす。対照的に、薬物への長期間曝露後ですら、シスプラチン処置組織は成長し続け、そして疾患プロファイルの進行を呈し続けた。
【0079】
ＰＤＸ ＧＢＭモデル（ＳＮ２８９）を使用して、２つの処置レジメンを同じ腫瘍上で並びで比較した。単一のＰＤＸ腫瘍から複数のスライスパンチを生成し、そして複数の複製で異なる処置にさらした。放射線治療（ＩＲ）自体は、最初は成長を抑制したが、長期間培養では抑制せず、一方で、ＴＭＺを放射線と組み合わせると、生存率は結果的に、４ｄｉｖから１３ｄｉｖで低下した（図２Ｄ）。ＰＣＶも、放射線と組み合わせると同様の反応を示し、結果として、１３ｄｉｖまで安定的な疾患プロファイルであった（図２Ｄ）。
【0080】
転移性大腸癌（ｍＣＲＣ）用の現在の標準ケアは、オキサリプラチンと５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）処置とを含む。図２Ｅは、実施例１に記載されるように、オキサリプラチン（左から右に示される通り、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）で、５－ＦＵ（左から右に示される通り、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭ）で、または組み合わせで、示された日数インビトロ（ｄｉｖ）で処置された細胞から観察された、生存率計測値を示す。このデータは、ｍＣＲＣのオキサリプラチンに対する反応が、用量と時間とに依存することを実証する。対照的に、５－ＦＵ処置は、最高用量であっても細胞生存率の低下を示すことはない。これらの結果は、そのような組織培養と反応計測を使用して、個別の患者の併用処置から、効果の無い化学療法を排除することができることを示している。
【0081】
材料と方法
組織学分析と免疫組織化学法
ホルマリン固定組織部分、パラフィン－またはＯＣＴ－包埋の組織部分を、組織学的評価用に、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。増殖に関する特定のマーカー（ＫＩ６７：Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ１５５８０、１：３００）と、アポトーシスに関する特定のマーカー（切断型カスパーゼ３：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）、＃９６６１、１：３００）とを、標準免疫組織化学法分析プロトコルを使用して分析した。加えて、ヒトに特異的な抗体（ＨｕＮｕ：ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、ＭＡＢ１２８１、（クローン２３５－１）、１：３００）を使用することによって、ＰＤＸ腫瘍がヒト起源のものであることをも確認した。
組織学分析と免疫組織化学法
ホルマリン固定組織部分、パラフィン－またはＯＣＴ－包埋の組織部分を、組織学的評価用に、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。増殖に関する特定のマーカー（ＫＩ６７：Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ１５５８０、１：３００）と、アポトーシスに関する特定のマーカー（切断型カスパーゼ３：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）、＃９６６１、１：３００）とを、標準免疫組織化学法分析プロトコルを使用して分析した。加えて、ヒトに特異的な抗体（ＨｕＮｕ：ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、ＭＡＢ１２８１、（クローン２３５－１）、１：３００）を使用することによって、ＰＤＸ腫瘍がヒト起源のものであることをも確認した。
【0082】
実施例３：薬物感受性におけるモデル間および患者間の差異を予測するためのエクスビボスライス培養
腫瘍間および腫瘍内の異質性は、薬物反応と薬物耐性の出現に重大な役割を果たす。ちょうど、異なる患者が同じ薬物に対して異なる反応を呈するように、異なるＰＤＸモデルは、同じ薬物に対して示差的感受性を示すことが見込まれる。スライス培養システムが異なるＰＤＸモデルの示差的な薬物感受性を報告できるか否かをテストするために、同じ臨床タイプの別個の腫瘍の処置反応を比較した。例えば、２つの異なる結腸ＰＤＸ腫瘍を、標準ケア剤オキサリプラチン（ＯＸＰ）と５－フルオロウラシル（５ＦＵ）で処置し、そして、両方の結腸腫瘍モデルは、ＯＸＰと５ＦＵに対して異なる反応を呈した（図３Ａと図３Ｂ）。生存率読み取り値に基づいて、１００ｕＭのＯＸＰは、ＣＮ０４５８結腸腫瘍スライスと比較して、ＣＮＳＴＧ結腸腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的であり、一方で、１００ｕＭの５ＦＵは、ＣＮＳＴＧ結腸腫瘍スライスと比較して、ＣＮ０４５８腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的である（図３Ａと図３Ｂ）。
腫瘍間および腫瘍内の異質性は、薬物反応と薬物耐性の出現に重大な役割を果たす。ちょうど、異なる患者が同じ薬物に対して異なる反応を呈するように、異なるＰＤＸモデルは、同じ薬物に対して示差的感受性を示すことが見込まれる。スライス培養システムが異なるＰＤＸモデルの示差的な薬物感受性を報告できるか否かをテストするために、同じ臨床タイプの別個の腫瘍の処置反応を比較した。例えば、２つの異なる結腸ＰＤＸ腫瘍を、標準ケア剤オキサリプラチン（ＯＸＰ）と５－フルオロウラシル（５ＦＵ）で処置し、そして、両方の結腸腫瘍モデルは、ＯＸＰと５ＦＵに対して異なる反応を呈した（図３Ａと図３Ｂ）。生存率読み取り値に基づいて、１００ｕＭのＯＸＰは、ＣＮ０４５８結腸腫瘍スライスと比較して、ＣＮＳＴＧ結腸腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的であり、一方で、１００ｕＭの５ＦＵは、ＣＮＳＴＧ結腸腫瘍スライスと比較して、ＣＮ０４５８腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的である（図３Ａと図３Ｂ）。
【0083】
エクスビボにおける薬物反応における差異が、インビボにおける薬物感受性と一致するか否かを判定するために、インビボ薬物反応データが存在する２つの異なるＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（ＢＲ１１２６とＢＲ０８５１、ＪＡＸ ＰＤＸ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）の反応を比較した。エクスビボのシスプラチン処置は、結果的に、ＢＲ１１２６ ＴＮＢＣ ＰＤＸスライスで部分的反応をもたらしたが、ＢＲ０８５１ ＴＮＢＣ ＰＤＸスライスではそうならなかった（図３Ｃと図３Ｄ）。このパターンはインビボ処置においても同様であり、ＢＲ０８５１が反応を示さなかった一方で、ＢＲ１１２６は部分的反応を示した（図３Ａと図３Ｂ）。処置の用量およびスケジューリングはインビボ研究とエクスビボ研究との間で大きく異なっていたが、この相関は明白だった。これらの結果は、エクスビボスライスシステムが、費用的かつ時間的に効率的な方法で相対的なインビボ感受性を予測するのに使用できることを示唆する。
【0084】
実施例４：腫瘍スライスを使用する、ゲノミクス情報に左右されない、偏り無い薬理学的スクリーニング
ＦＤＡ認可の腫瘍薬物は１００を超えるが、臨床の場における特定の腫瘍タイプの処置のための標準ケアとして使用される薬物の数は、全ての入手可能な薬物の内のほんの一部である。個々の患者の限られた量の腫瘍組織で、偏り無い薬物有効性スクリーンを実施するために、本明細書に記載されたエクスビボスライス培養システムに変更を加えて、高含有量薬物スクリーニングを実施した。１１９のＦＤＡ認可の腫瘍薬物を含む認可腫瘍薬物セットＶＩを、国立癌研究所（ＮＣＩ）から取得した。ＰＤＸ腫瘍スライスを、実施例１に記載されるように取得し、そして直径２ｍｍの腫瘍スライスパンチを９６のウェルプレートに播種し、そして２００ｕｌのＴＳＣ培地に浸した。１日目と３日目に、生存率を、実施例１に記載されるように長期的なＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ （ＣＴＢ）生存率アッセイを使用して計測し、そして、１日目に、培地を、ＣＴＢ計測後に交換した。薬物を、１日目に、１００μＭの最終濃度で添加した。３日目（つまり２日の薬物曝露）のサンプルの生存率読み取り値を、各ウェルの１日目の生存率読み取り値に正規化し、そして、１日目の読み取り値と比較した３日目の倍数変化として表した。
ＦＤＡ認可の腫瘍薬物は１００を超えるが、臨床の場における特定の腫瘍タイプの処置のための標準ケアとして使用される薬物の数は、全ての入手可能な薬物の内のほんの一部である。個々の患者の限られた量の腫瘍組織で、偏り無い薬物有効性スクリーンを実施するために、本明細書に記載されたエクスビボスライス培養システムに変更を加えて、高含有量薬物スクリーニングを実施した。１１９のＦＤＡ認可の腫瘍薬物を含む認可腫瘍薬物セットＶＩを、国立癌研究所（ＮＣＩ）から取得した。ＰＤＸ腫瘍スライスを、実施例１に記載されるように取得し、そして直径２ｍｍの腫瘍スライスパンチを９６のウェルプレートに播種し、そして２００ｕｌのＴＳＣ培地に浸した。１日目と３日目に、生存率を、実施例１に記載されるように長期的なＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ （ＣＴＢ）生存率アッセイを使用して計測し、そして、１日目に、培地を、ＣＴＢ計測後に交換した。薬物を、１日目に、１００μＭの最終濃度で添加した。３日目（つまり２日の薬物曝露）のサンプルの生存率読み取り値を、各ウェルの１日目の生存率読み取り値に正規化し、そして、１日目の読み取り値と比較した３日目の倍数変化として表した。
【0085】
ＮＣＩ薬物パネルの１１９のＦＤＡ認可薬物の各々を、それぞれ３回テストすることができるように、２ｍｍのパンチを、２つのＣＮ０４５８結腸ＰＤＸ腫瘍から生成した。細胞を３日間培養した。各スライスのベースラインの生存率を、培養物をセットアップした直後（０ｄｉｖ）に、ＣＴＢ読み取りを実施することによって評価した。１１９の薬物の各々を、ベースラインのＣＴＢ読み取り後に、複製ウェルに添加した。ＣＴＢ読み取りを、初期の反応を判定するために、１日目の薬物処置後（１ｄｉｖ）と、再び３日目の薬物処置後（３ｄｉｖ）とに実施した。手順の再現性をテストするために同じ実験を２回実施し、高度に一貫した結果を観察した。図４Ａは、３ｄｉｖでの、各薬物に対するこれらの２つの実験からのＣＴＢ計測値の平均（合計ｎ＝６）で、ベースライン読み取り値に正規化されたものを示す。７つの薬物が、開始時の組織の５０％を上回る生存率を、再現性良く抑制した。これらの７つの薬物の２つは、同じタンパク質、ＡＬＫに対する阻害活性を有する。７つの薬物のどれも、現在はｍＣＲＣ患者のための標準ケアではなく、ＦＤＡ認可腫瘍薬物を別の目的で使用するためにこの方法を使用しても良いことを示唆する。図４Ｂは、ベースライン読み取り値に正規化された、より高い倍率における、これらの７つの薬物の平均ＣＴＢ計測値を示す。
【0086】
実施例５：腫瘍スライスは患者の反応を正確に予測する
腫瘍スライスシステムの臨床的有用性を検証するために、臨床試験に登録された４人の患者（ＣＮ１５７１、ＣＮ１５７２、ＣＮ１５７３、およびＣＮ１５７４）から生成されたｍＣＲＣ ＰＤＸモデルからの組織サンプルを取得し、培養し、実施例１に記載される方法を使用して評価した。図５Ａは、示された日のエクスビボ（ｄｅｖ）における、ダブラフェニブ（Ｄａｂ）、プラス、トラメチニブ（Ｔｒａ）の併用療法またはＤＭＳＯ対照に反応する、組織サンプルの生存率分析を示す。腫瘍スライス反応を、表３に概説されている修正を加えたＲＥＣＩＳＴ基準を使用して、患者の反応に関して以前に公表されているデータ、および同じ４人の患者からのインビボＰＤＸモデルの反応と比較し、腫瘍スライス反応の相互関係を示した。この比較の結果を図５Ｂに示す。腫瘍スライス反応は、対応するＰＤＸと患者の反応に一致した。
腫瘍スライスシステムの臨床的有用性を検証するために、臨床試験に登録された４人の患者（ＣＮ１５７１、ＣＮ１５７２、ＣＮ１５７３、およびＣＮ１５７４）から生成されたｍＣＲＣ ＰＤＸモデルからの組織サンプルを取得し、培養し、実施例１に記載される方法を使用して評価した。図５Ａは、示された日のエクスビボ（ｄｅｖ）における、ダブラフェニブ（Ｄａｂ）、プラス、トラメチニブ（Ｔｒａ）の併用療法またはＤＭＳＯ対照に反応する、組織サンプルの生存率分析を示す。腫瘍スライス反応を、表３に概説されている修正を加えたＲＥＣＩＳＴ基準を使用して、患者の反応に関して以前に公表されているデータ、および同じ４人の患者からのインビボＰＤＸモデルの反応と比較し、腫瘍スライス反応の相互関係を示した。この比較の結果を図５Ｂに示す。腫瘍スライス反応は、対応するＰＤＸと患者の反応に一致した。
【0087】
【表3】
【0088】
実施例６：腫瘍サンプルの異なる位置からの細胞における、反応のばらつき
同じ患者の腫瘍の２つの位置からの腫瘍組織サンプルを、実施例１に記載されるように、取得し培養した。各サンプルを、シスプラチン（Ｃｉｓ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、またはパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）で処置する。生存率計測を、インビトロで０日目、３日目、５日目、９日目、および１２日目に取得する。２つのサンプルの各々の生存率計測値間の有意差を観察し、これは腫瘍組織内の薬物反応における異質性を実証している。
同じ患者の腫瘍の２つの位置からの腫瘍組織サンプルを、実施例１に記載されるように、取得し培養した。各サンプルを、シスプラチン（Ｃｉｓ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、またはパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）で処置する。生存率計測を、インビトロで０日目、３日目、５日目、９日目、および１２日目に取得する。２つのサンプルの各々の生存率計測値間の有意差を観察し、これは腫瘍組織内の薬物反応における異質性を実証している。
【0089】
実施例７：腫瘍スライスを、生検針コアから確立し調査することができる。
自然発症のＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍とＣＴ２６マウスの大腸腫瘍からの、腫瘍組織標本を、１８ゲージコアの生検針を使用して抽出した。サンプルは、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ ＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２５０－３５０μＭの厚さのスライスに精密にカットした。各スライスを、２００μｌの無血清腫瘍様塊培養培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ＴＳＣ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して、４８ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈｅｄ－Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））上で培養した。
自然発症のＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍とＣＴ２６マウスの大腸腫瘍からの、腫瘍組織標本を、１８ゲージコアの生検針を使用して抽出した。サンプルは、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ ＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２５０－３５０μＭの厚さのスライスに精密にカットした。各スライスを、２００μｌの無血清腫瘍様塊培養培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ＴＳＣ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して、４８ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈｅｄ－Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））上で培養した。
【0090】
ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴスライスを、対照（ＤＭＳＯ）と化学療法：つまり、シクロホスファミド（ＣＰＰ）と、ドキソルビシン（ＤＯＸ）と、シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびパクリタキセル（ＣＰＰ＋ＤＯＸ＋ＴＡＸＯＬ）の組み合わせと、で処置した。薬物を、１日目に、以下の最終濃度で、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴコアスライス培養物に添加した；２０μＭのＣＰＰ、１００ｎＭのＤＯＸ、および１ｎＭのＴＡＸＯＬ、そして、各培地変更を－１日目、４日目、および８日目に行った。
【0091】
その後、ＣＴ２６コアスライスは、対照、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）とＤＭＳＯ（ＩｇＧ＋ＤＭＳＯ）、および化学療法と免疫療法との組み合わせで処置し、当該組み合わせとしては、ＩｇＧ、フルオロウラシル（５ＦＵ）、およびオキサリプラチン（Ｏｘ）の組み合わせ（ＩｇＧ＋Ｏｘ＋５ＦＵ）；抗－ＰＤ１とＤＭＳＯ（抗－ＰＤ１＋ＤＭＳＯ）の組み合わせ；そして、抗－ＰＤ１、５ＦＵ、およびオキサリプラチンの組み合わせ（抗－ＰＤ１＋５ＦＵ＋Ｏｘ）、が挙げられる。薬物を、１日目に、以下の最終濃度で、ＣＴ２６コアスライス培養物に添加した；１μＭの５ＦＵ、１μＭのＯＸ、および１０μｇ／ｍｌの抗－ＰＤ１。
実施例１に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。代表的な結果を図７に示す。生存率アッセイによる読み取り値は、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍が、Ｄｏｘ処置とＣＣＰ＋Ｄｏｘ＋Ｔａｘｏｌ処置に感受性が高く、そしてＣＰＰ処置に感受性が無いことを示し、このことは、１２日目を０日目と比較して、ＣＣＰ処置スライスで生存率読み取り値が上がっていること、および、Ｄｏｘ処置スライスと、ＣＣＰ＋Ｄｏｘ＋Ｔａｘｏｌ処置スライスとで生存率読み取り値が下がっていることよって実証されている。追加的に、生存率アッセイによる読み取り値は、ＣＴ２６腫瘍が、ＩｇＧ＋ＯＸ＋５ＦＵ処置と抗－ＰＤ１＋ＯＸ＋５ＦＵ処置とに感受性がより高く、そして抗－ＰＤ１＋ＤＭＳＯ処置に感受性が低いことを示す。
実施例１に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。代表的な結果を図７に示す。生存率アッセイによる読み取り値は、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍が、Ｄｏｘ処置とＣＣＰ＋Ｄｏｘ＋Ｔａｘｏｌ処置に感受性が高く、そしてＣＰＰ処置に感受性が無いことを示し、このことは、１２日目を０日目と比較して、ＣＣＰ処置スライスで生存率読み取り値が上がっていること、および、Ｄｏｘ処置スライスと、ＣＣＰ＋Ｄｏｘ＋Ｔａｘｏｌ処置スライスとで生存率読み取り値が下がっていることよって実証されている。追加的に、生存率アッセイによる読み取り値は、ＣＴ２６腫瘍が、ＩｇＧ＋ＯＸ＋５ＦＵ処置と抗－ＰＤ１＋ＯＸ＋５ＦＵ処置とに感受性がより高く、そして抗－ＰＤ１＋ＤＭＳＯ処置に感受性が低いことを示す。
【0092】
実施例８：長期間の腫瘍スライス培養物を使用する、治療耐性の出現の検出
臨床試験中の患者から、ヒトの転移性の大腸癌（ｍＣＲＣ）のコア針生検のサンプルを取得した。サンプルを、実施例７に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。サンプルを、標的療法－エンコラフェニブ（ｅｎｃｏ）、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤；セツキシマブ（ｃｅｔｕｘ）（ＥＧＦＲ阻害剤）；ビニメチニブ（ｂｉｎｉ）（ＭＥＫ阻害剤）；およびそれらの組み合わせで処置し、当該組み合わせとしては、エンコラフェニブとセツキシマブの組み合わせ（ｅｎｃｏ＋ｃｅｔｕｘ）、およびエンコラフェニブ、セツキシマブ、およびビニメチニブ（ｅｎｃｏ＋ｃｅｔｕｘ＋ｂｉｎｉ）の組み合わせが挙げられる。薬物を腫瘍スライス培養物に、１日目に、以下の最終濃度で添加し、各培地変更を－４日目、８日目、１２日目、および１６日目に行った：１００ｎＭのエンコラフェニブ、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブ、および１００ｎＭのビニメチニブ（ｂｉｎｉｔｅｔｉｎｉｂ）。
臨床試験中の患者から、ヒトの転移性の大腸癌（ｍＣＲＣ）のコア針生検のサンプルを取得した。サンプルを、実施例７に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。サンプルを、標的療法－エンコラフェニブ（ｅｎｃｏ）、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤；セツキシマブ（ｃｅｔｕｘ）（ＥＧＦＲ阻害剤）；ビニメチニブ（ｂｉｎｉ）（ＭＥＫ阻害剤）；およびそれらの組み合わせで処置し、当該組み合わせとしては、エンコラフェニブとセツキシマブの組み合わせ（ｅｎｃｏ＋ｃｅｔｕｘ）、およびエンコラフェニブ、セツキシマブ、およびビニメチニブ（ｅｎｃｏ＋ｃｅｔｕｘ＋ｂｉｎｉ）の組み合わせが挙げられる。薬物を腫瘍スライス培養物に、１日目に、以下の最終濃度で添加し、各培地変更を－４日目、８日目、１２日目、および１６日目に行った：１００ｎＭのエンコラフェニブ、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブ、および１００ｎＭのビニメチニブ（ｂｉｎｉｔｅｔｉｎｉｂ）。
【0093】
実施例１に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。代表的な結果を図８に示す。図８は、培養１６日目での、エンコラフェニブ耐性の出現を示し、これは、下流のＭＥＫ阻害剤ビニメチニブでの処置によって抑制される（１６日目と２０日目の、ｅｎｃｏ ｖｓ ｂｉｎｉ、およびｅｎｃｏ＿ｃｅｔｕｘ ｖｓ ｅｎｃｏ＋ｃｅｔｕｘ＋ｂｉｎｉとを比較のこと）。
【0094】
実施例９：常在性免疫細胞の長期間の維持
抗－ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４抗体で分析された自然発症のＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍スライス培養物のフローサイトメトリー分析を実施し、本明細書に記載される培養条件にさらされた腫瘍スライス中の常在性免疫細胞の長期的な維持を評価した。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍からの組織標本を、エクスビボで４日間、ＩＬ２有りと無しとで、培養した。エクスビボの４日目に、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍スライスを、９：１の比のアキュターゼ：コラゲナーゼ＋ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｏｒｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含むカクテルを使用して、分離した。分離された単一の細胞を洗浄し、遮断抗体（抗ＣＤ１６／３２）に再懸濁し、そして、氷の上で３０分間、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した。その後、細胞を洗浄し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ染色緩衝液中で、抗－ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４抗体（ＰＥ－ＣＹ７、ＰＥ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ＢＶ６５０、およびＢＶ７１１）を含む、４５μｌの抗体カクテルに再懸濁し、そして、氷の上で３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、室温で３０分間固定可能な生存率染料で染色した。染色後、細胞を洗浄し、ＩＣｆｉｘ溶液で固定し、そしてその後、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
抗－ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４抗体で分析された自然発症のＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍スライス培養物のフローサイトメトリー分析を実施し、本明細書に記載される培養条件にさらされた腫瘍スライス中の常在性免疫細胞の長期的な維持を評価した。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスの乳腺腫瘍からの組織標本を、エクスビボで４日間、ＩＬ２有りと無しとで、培養した。エクスビボの４日目に、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍スライスを、９：１の比のアキュターゼ：コラゲナーゼ＋ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｏｒｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含むカクテルを使用して、分離した。分離された単一の細胞を洗浄し、遮断抗体（抗ＣＤ１６／３２）に再懸濁し、そして、氷の上で３０分間、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した。その後、細胞を洗浄し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ染色緩衝液中で、抗－ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４抗体（ＰＥ－ＣＹ７、ＰＥ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ＢＶ６５０、およびＢＶ７１１）を含む、４５μｌの抗体カクテルに再懸濁し、そして、氷の上で３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、室温で３０分間固定可能な生存率染料で染色した。染色後、細胞を洗浄し、ＩＣｆｉｘ溶液で固定し、そしてその後、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【0095】
結果を図９Ａに示す。スライス培養物におけるＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋細胞は、（ＩＬ２の添加無しで）親の腫瘍周波数に近い周波数で維持され、腫瘍スライスが免疫細胞微小環境に対する原発性腫瘍組織を表わすことを裏付ける。ＩＬ２の添加によって、免疫細胞周波数は親の腫瘍周波数に対して増加した。
【0096】
実施例１０：免疫療法に対する患者に特異的な反応の計測
コア針生検を使用して、臨床試験中の２人の患者から、ヒトの転移性の大腸癌（ｍＣＲＣ）生検コアのサンプルを取得した。サンプルを、実施例７に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。その後、各患者からのサンプルは、対照（ＤＭＳＯ）と、エンコラフェニブおよびセツキシマブ（Ｅ＋Ｃ）と、免疫チェックポイント阻害剤ニボルマブ（Ｎ）と、エンコラフェニブ、セツキシマブ、およびニボルマブの組み合わせ（Ｅ＋Ｃ＋Ｎ）と、で処置された。薬物を腫瘍スライス培養物に、１日目、４日目、８日目、１２日目、および１６日目に、以下の最終濃度で添加した：１００ｎＭのエンコラフェニブ、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブ、１００ｎＭのビニメチニブ、および１０μｇ／ｍＬのニボルマブ。サンプルを１４日間培養した。
コア針生検を使用して、臨床試験中の２人の患者から、ヒトの転移性の大腸癌（ｍＣＲＣ）生検コアのサンプルを取得した。サンプルを、実施例７に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。その後、各患者からのサンプルは、対照（ＤＭＳＯ）と、エンコラフェニブおよびセツキシマブ（Ｅ＋Ｃ）と、免疫チェックポイント阻害剤ニボルマブ（Ｎ）と、エンコラフェニブ、セツキシマブ、およびニボルマブの組み合わせ（Ｅ＋Ｃ＋Ｎ）と、で処置された。薬物を腫瘍スライス培養物に、１日目、４日目、８日目、１２日目、および１６日目に、以下の最終濃度で添加した：１００ｎＭのエンコラフェニブ、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブ、１００ｎＭのビニメチニブ、および１０μｇ／ｍＬのニボルマブ。サンプルを１４日間培養した。
【0097】
実施例１に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。結果を図１０に示す。２つのｍＣＲＣサンプルは、早期の時点と後期の時点において、チェックポイント阻害剤ニボルマブのみ、およびエンコラフェニブとセツキシマブとの組み合わせ（Ｅ＋Ｃ＋Ｎ）に対して、示差的な感受性を示した。
【0098】
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されるものである。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施に際して利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、ならびに、それによって、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は包含されることが、意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A-1】
【図4A-2】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2021-12-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
候補分子を評価する方法であって、前記方法は、（ａ）前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
（ｂ）前記細胞サンプルを前記候補分子の存在下で少なくとも１日間培養する工程と、
（ｃ）前記候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。
【請求項2】
工程（ｂ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｄ）追加的候補分子を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
（ｅ）前記追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
（ｄ）前記追加的候補分子の第２の用量を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも２４時間培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｄ）において、前記細胞サンプルは、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、培養される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
（ｅ）前記追加的候補分子の第２の用量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞サンプルは複数の細胞、無傷組織、オルガノイド、癌細胞、および腫瘍組織の微小環境からの細胞の１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記リンパ球細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞であるか、あるいは、骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞サンプルは無血清条件で、液体－空気界面で、または細胞培養培地に浸されて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
生存率反応を評価する工程は、前記細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞サンプルからの前記代謝産物を計測することは、細胞培養培地から前記代謝産物を単離し、そして前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測することを含み、前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物であり、前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来し、前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンであり、前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来し、前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記テトラゾールは、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）またはその塩、２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキサニリド（ＸＴＴ）またはその塩、および３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）またはその塩、から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものであるか、あるいは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記原発性腫瘍サンプルは被験体からの外科サンプルであるか、あるいは患者から取得された生検サンプルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程か、あるいは被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記生物分子は、組み換えタンパク質、酵素、抗体、成長因子、受容体、およびそれらの任意の一部、から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
工程（ａ）は１以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、工程（ｃ）は前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの前記反応を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記１以上の追加的候補分子は前記候補分子と同時に提供されるか、あるいは前記候補分子と前記１以上の追加的候補分子は連続して提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
（ｄ）前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、
（ｅ）少なくとも５日間、前記候補分子の存在下で前記追加的細胞サンプルを培養する工程と、
（ｆ）前記候補分子に対する前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｇ）前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の第１の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第２の位置に由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記異なる時は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、または２０日離れている、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項33】
前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを固定することを含み、前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを透過処理することを含み、前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを溶解させることを含み、あるいは前記生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
（ｄ）工程（ａ）－（ｃ）を繰り返す工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項35】
工程（ｄ）は、（ａ）－（ｃ）を少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも６回繰り返すことを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
（ｅ）前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、
（ｆ）前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルを少なくとも１日間培養する工程と、
（ｇ）前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
（ｈ）工程（ｅ）－（ｇ）を繰り返す工程と、
（ｉ）前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【国際調査報告】