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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-18
(54)【発明の名称】細胞死を検出するための超高感度方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20220511BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220511BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220511BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220511BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220511BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/06
C12Q1/6888 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021556536
(86)(22)【出願日】2020-03-16
(85)【翻訳文提出日】2021-09-17
(86)【国際出願番号】 FR2020050571
(87)【国際公開番号】W WO2020188216
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】1902755
(32)【優先日】2019-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．Ｉｇｅｐａｌ
４．Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】514282002
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】511307616
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ ポール サバティエ トゥールーズ トロワジェーム
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＵＬ ＳＡＢＡＴＩＥＲ ＴＯＵＬＯＵＳＥ ＩＩＩ
【住所又は居所原語表記】１１８，ＲＯＵＴＥ ＤＥ ＮＡＲＢＯＮＮＥ，Ｆ‐３１４００ ＴＯＵＬＯＵＳＥ，ＦＲＡＮＣＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ロレル，アンリク
(72)【発明者】
【氏名】ラカゼットゥ，エリク
(72)【発明者】
【氏名】トゥリオル，クリスチアン
(72)【発明者】
【氏名】イアコヴォニ，ジャソン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、ｑＰＣＲ／定量的ＰＣＲ、もしくはｄｄＰＣＲ／デジタル液滴ＰＣＲを含むＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術、または少量のＤＮＡを検出するための任意の他の技術（ナノストリングなど）を使用して、細胞死を検出するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞サンプル中の細胞死を定量化するための方法であって、核由来のゲノムＤＮＡ断片上に存在する少なくとも１つの配列が、前記サンプルの細胞質抽出物から増幅されることを特徴とする、方法。
【請求項2】
以下を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法：－前記細胞サンプルからの細胞質抽出物の入手；
－前記細胞質抽出物中の少なくとも１つの配列の増幅；
－前記細胞質抽出物中に検出されたゲノムＤＮＡの定量化。
【請求項3】
前記細胞質抽出物は、前記細胞サンプルを溶解緩衝液または低張緩衝液とインキュベートすることによって得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの配列は、ゲノム当たり１コピー中に存在するＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの配列は、ゲノム当たり少なくとも２回存在するＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの配列は、反復ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記反復ＤＮＡ配列の少なくとも１つは、ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥから選択されることを特徴とする、請求項６に線の方法。
【請求項8】
定量的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、ナノストリング技術、および多重化ＰＣＲから選択される、ＰＣＲ技術または少量のＤＮＡを検出するための技術によって、増幅が実施されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
定量的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、または多重化ＰＣＲによって、前記増幅が実施されることを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９に記載の方法により、前記細胞サンプル中の細胞死を検出することを含む、細胞死に対する処理の有効性をモニターするための方法。
【請求項11】
請求項１～９に記載の方法により、前記細胞サンプル中の細胞死を検出することを含む、細胞死の過程を含む病状を診断する方法。
【請求項12】
以下を含む、化合物をスクリーニングする方法：－少なくとも１つの化合物を用いた、細胞サンプルの処理；
－請求項１～９に記載の方法による、前記サンプル中の細胞死の検出。
【請求項13】
以下を含む、細胞サンプル中の細胞死を検出するためのキット：－原形質膜を特異的に溶解または透過することが可能な、溶解緩衝液または低張緩衝液；
－ゲノムＤＮＡを増幅する少なくとも１対のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術：ｑＰＣＲ、すなわち定量的ＰＣＲ；ｄｄＰＣＲ、すなわち液滴デジタルＰＣＲなど、または少量のＤＮＡを検出するための任意の他の技術（ナノストリングなど）の使用によって細胞死を検出するための方法に関する。
本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術：ｑＰＣＲ、すなわち定量的ＰＣＲ；ｄｄＰＣＲ、すなわち液滴デジタルＰＣＲなど、または少量のＤＮＡを検出するための任意の他の技術（ナノストリングなど）の使用によって細胞死を検出するための方法に関する。
【0002】
〔従来技術〕
細胞死は、細胞レベルおよび分子レベルでの構造の修飾を伴う、生命機能の不可逆的な停止である。この細胞死の過程は、多くの相対的に異なる方法で起こり得る（Ｇａｌｌｏｕｚｚｉらの、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２０１８）。
細胞死は、細胞レベルおよび分子レベルでの構造の修飾を伴う、生命機能の不可逆的な停止である。この細胞死の過程は、多くの相対的に異なる方法で起こり得る（Ｇａｌｌｏｕｚｚｉらの、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２０１８）。
【0003】
主に、アポトーシスを介した細胞死、すなわち細かく調節された一連の事象に従って起こる調節された細胞死と、死のシグナル（酸化ストレス、外因性ストレス、ＤＮＡ損傷、ウイルス感染など）に応答して開始される細胞死、または各細胞が多かれ少なかれ決定された寿命を有する、組織恒常性の維持に関与するプログラムされた細胞死との区別がなされるであろう。
【0004】
その部分の壊死による死は、例えば凍結、高温、機械的損傷などのような、一般に「偶発的に」引き起こされる細胞プロセスの結果生じる。アポトーシスまたは壊死による応答の選択はまた、攻撃の強さに依存し得る。
【0005】
機構的には、アポトーシスによる死の間、以下が観察される：膜の変質、酵素シグナル（カスパーゼタンパク質の活性化など）、核および細胞質の濃縮、クロマチンの縮合、ミトコンドリア損傷、ならびに核ＤＮＡのヌクレオソーム間断片への断片化。興味深いことに、ほとんどの抗腫瘍薬は、アポトーシス現象を誘導し得る。
【0006】
対照的に、壊死細胞の形態学的基準は異なる。細胞膜が破壊されると、細胞に大量の水分が流入し、細胞内小器官が破壊される。その結果、リソソームおよびペルオキシソームから溶菌酵素が放出され、細胞の消化、ＤＮＡの分解、および細胞死に至る。
【0007】
アポトーシスまたは壊死によって細胞死に至る経路は、それぞれの機構の点で非常に異なっているが、これらの経路のそれぞれにおいて以下が観察されている：一本鎖や二本鎖の切断によるＤＮＡの分解、およびヌクレオソーム間断片に徐々に分解されるか（アポトーシス）、またはランダムに徐々に分解される（壊死）高分子量ＤＮＡ断片の生成。
【0008】
アポトーシスを検出するための方法は、それらがｉ）原形質膜の変質、ｉｉ）カスパーゼの活性化、ｉｉｉ）ミトコンドリア損傷、またはｉｖ）ＤＮＡの断片化、を検出するかどうかに依存して、４つの主要な原理に分類され得る。
【0009】
カスパーゼの活性化に関して、カスパーゼによる切断のテトラペプチド部位の、蛍光レポーターまたは発光レポーターへの融合によって、カスパーゼ活性を測定することが可能である（Ｐｒｏｍｅｇａ製のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）キットを挙げることができる）。この方法は迅速であり、使用が簡単であり、多数の供給者によって提供されるという利点を有する。しかしながら、この方法は高価であり、分光蛍光光度計またはルミノメーターを必要とし、カスパーゼ依存性アポトーシスの検出のみを可能にする。
【0010】
原形質膜の変質の検出のために、原形質膜の外層に露出したホスファチジルセリンの検出も、多数の供給者によって提案されている（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）製のＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを挙げることができる）。原理は、アネキシンＶ（カルシウム依存的にホスファチジルセリンに特異的に結合するタンパク質）を、前記タンパク質の検出を可能にする、異なる（主に蛍光性の）レポーターと組み合わせて使用することである。分析は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）または顕微鏡によって行う。この広く提案されている方法は、蛍光色素の幅広い選択を提供し、アポトーシス細胞および壊死細胞を検出することを可能にする。しかしながら、この方法はフローサイトメーターを必要とし、フローサイトメトリーにおける接着細胞のアポトーシスの定量化は、非常にデリケートである。顕微鏡の使用は、この問題を克服することができる。しかしながら、定量化はより困難である。したがって、この方法は、接着細胞にはあまり適していない。
【0011】
ＤＮＡの断片化を検出する方法の中で、まず、ゲル電気泳動後に挿入剤により可視化して、断片化ＤＮＡを可視化する方法を挙げることができる。原理は、ゲノムＤＮＡの抽出、次いでアガロースゲル電気泳動（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｋｉｔ）による断片の分離にある。この方法は低コストであり、特定の高価な装置を必要としないという利点を有するが、この方法は極めて感度が低い。
【0012】
ＥＬＩＳＡによってヒストンに結合した細胞質ＤＮＡを定量化するための方法、ならびにＤＮＡおよびヒストンに対する抗体の使用についても言及する（Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡキット）。この方法は、例えば、米国特許第５６３７４６５号に記載されている。実施するのは非常に簡単であるが、この方法は比較的手間がかかる。この方法は高コストにもかかわらず、その感度および検出範囲は制限される。
【0013】
Hooker et al., 2012 (Nucl Acids Res, 40(15)e113)、Hooker et al., 2009 (J Cell Mol Med, 13(5):948-958)およびStaley et al., 1997 (Cell Death Differ, 4:66-75)には、ヌクレアーゼの活性化後に形成される、平滑末端を有する断片を増幅することを可能にする「定量的ライゲーション媒介ＰＣＲ」を用いて断片化ＤＮＡを検出する方法が記載されている。この手間がかかる方法は、複数のステップを必要とする。
【0014】
最後に、Botezatu et al., 2000 (Clin Chem 46(8):1078-1084)、Umetani et al., 2006 (Clin Chem 52(6):1062-1069)、Lou et al., Int J Mol Med 35: 72-80)、Fawzy et al., 2016 (J Egypt Natl Canc Inst, 28: 235-242)には、循環（すなわち遊離の）ゲノムＤＮＡを検出／定量化するための方法、具体的には細胞死から生じるゲノムＤＮＡを検出するための方法が記載されている。これらの方法は、定量的ＰＣＲによる反復「Ａｌｕ」配列の増幅を含む。この方法において、ＤＮＡサンプルは、血清および血漿サンプルである。
【0015】
したがって、感度が高く、簡単かつ迅速であり、適度なコストを有し、接着細胞または懸濁液中の細胞、さらには組織に対しても作用する、細胞死を検出するための方法を開発する必要性が依然として存在する。
【0016】
〔発明の開示〕
本発明は、細胞質に存在する核由来のゲノムＤＮＡ断片の検出に基づく、細胞死を検出するための方法に関する。具体的には、本発明者らは、細胞質中の核由来のゲノムＤＮＡ断片の検出を可能にする、非常に感度の高い方法を開発した。
本発明は、細胞質に存在する核由来のゲノムＤＮＡ断片の検出に基づく、細胞死を検出するための方法に関する。具体的には、本発明者らは、細胞質中の核由来のゲノムＤＮＡ断片の検出を可能にする、非常に感度の高い方法を開発した。
【0017】
ＰＣＲによってＤＮＡ断片を検出するための従来技術の方法とは異なり、ＤＮＡ断片は全細胞抽出物（核＋細胞質）中で、または血漿などの生物学的流体中で検出および定量化され、検出は細胞質抽出物において行われる。この細胞質抽出物は、核膜を透過性にすることなく細胞膜を溶解または透過性にするために、細胞サンプルを溶解緩衝液または低張緩衝液とインキュベートすることによって得られる。
【0018】
細胞質抽出物からの検出は、先行技術の方法と比較して、より迅速で、実施がより簡単で、より安価な方法を得ることを可能にする。
【0019】
細胞質抽出物は、細胞質含有物のすべてまたは一部に相当する。細胞死の過程が引き起こされると、細胞質抽出物は、死の過程が開始されなかった細胞と比較して、核由来のゲノムＤＮＡに富む。
【0020】
細胞質中に存在する核由来のゲノムＤＮＡ断片の検出は、ゲノム中の少なくとも１つのコピーに存在する区域の増幅／検出によって測定される。したがって、これらのゲノムＤＮＡ断片は、有利にサンプル中で検出および定量化され得る。回収されたＤＮＡ断片の量は、サンプル中で死の過程が開始された細胞の量に比例し、したがって、この過程を検出および定量化することを可能にする。
【0021】
ゲノム中に存在する反復配列を標的とする特異的プライマーを用いた、細胞質中のゲノムＤＮＡ断片の検出は、本発明に係る方法の感度を増大させる。得られた比較結果は、当該感度が、既に市販されている既存の従来の方法で得られた感度よりも高いことを確かにする。
【0022】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の他の特徴、詳細、および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を分析することによって明らかになるであろう。
本発明の他の特徴、詳細、および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を分析することによって明らかになるであろう。
【0023】
図１は、本発明に係る方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＨｅｐＧ２細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0024】
図２は、本発明に係る方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0025】
図３は、本発明に係る方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0026】
図４は、本発明に係る方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0027】
図５は、従来技術のＣａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ３／７法に対する、本発明に係るｑＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0028】
図６は、従来技術のフローサイトメトリー法（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0029】
図７は、フローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲ（直接溶解）によって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0030】
図８は、フローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0031】
図９は、フローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲ（直接溶解）によって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0032】
図１０は、フローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度および飽和閾値の比較を表す。
【0033】
図１１は、フローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）に対する、本発明に係るｑＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0034】
図１２は、単離された細胞に対する、本発明に係るｄｄＰＣＲによって細胞死を検出するための方法の感度の比較を表す。
【0035】
図１３は、ゲノム当たり１コピー中に存在する配列を標的とする１対のプライマーを用いて、異なる細胞株の細胞質抽出物において実現される細胞死の活性化のレベルを表す。
【0036】
図１４は、ゲノム当たり２コピー中に存在する配列を標的とする１対のプライマーを用いて、異なる細胞株の細胞質抽出物において実現される細胞死の活性化のレベルを表す。
【0037】
図１５は、ゲノム当たり１コピー中に存在する配列をそれぞれ標的とする２対のプライマーを用いて、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株に由来する細胞質抽出物において実現される細胞死の活性化のレベルを表す。
【0038】
図１６は、細胞質画分中のＤＮＡ断片の量の増加を示し、前記ＤＮＡ断片は、本発明に係る方法において記載される溶解緩衝液で抽出した後に得られ、キャピラリー電気泳動によって検出され、このＤＮＡ断片の量の増加は、細胞死を誘導する薬物（スタウロスポリン）で処理されていない細胞（ＭＤＡ ＮＴ）と比較すると、スタウロスポリンによって処理された細胞（ＭＤＡ ５０およびＭＤＡ １００）においてのみ見られる。
【0039】
〔詳細な説明〕
図面および以下の説明は、主に、特定の性質の要素を含む。したがって、それらは、本発明をより良く理解するために役立つだけでなく、必要に応じて、その定義にも寄与することができる。
図面および以下の説明は、主に、特定の性質の要素を含む。したがって、それらは、本発明をより良く理解するために役立つだけでなく、必要に応じて、その定義にも寄与することができる。
【0040】
したがって、本発明は、核由来のゲノムＤＮＡ断片上に存在する少なくとも１つの配列が、細胞サンプル中の細胞質抽出物から増幅されることを特徴とする、前記サンプル中の細胞死を定量化するための方法に関する。
【0041】
具体的には、本発明者らは、核由来のゲノムＤＮＡ断片が細胞死の過程で細胞の細胞質中に位置するという、核由来のゲノムＤＮＡ断片の異常な存在を有利に利用した。したがって、核由来の断片化ゲノムＤＮＡは、細胞の細胞質抽出物から検出され得る。
【0042】
本発明の目的に関する用語「細胞死」は、アポトーシスによる細胞死および／または壊死による細胞死を意味すると理解される。
【0043】
用語「ゲノムＤＮＡ断片」または「断片化ゲノムＤＮＡ」は、細胞死の過程で生成される、核由来のＤＮＡの断片を意味すると理解される。
【0044】
細胞サンプルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における細胞のサンプル（例えば、接着細胞もしくは懸濁液中の細胞）、循環腫瘍細胞を含むサンプル、精製された循環腫瘍細胞を含むサンプル、循環細胞を含む血液サンプル、または任意の他のサンプル（例えば、血漿サンプル、尿サンプル、もしくは唾液サンプル）であってもよい。
【0045】
一実施形態によれば、細胞サンプル中の細胞死を定量化するための方法は以下を含む：
－細胞サンプルからの細胞質抽出物の入手；
－前記細胞質抽出物中の少なくとも１つの配列の増幅；
－前記細胞質抽出物中において検出された、ゲノムＤＮＡの定量化。
－細胞サンプルからの細胞質抽出物の入手；
－前記細胞質抽出物中の少なくとも１つの配列の増幅；
－前記細胞質抽出物中において検出された、ゲノムＤＮＡの定量化。
【0046】
用語「細胞質抽出物」は、核膜を変質させずに原形質膜を特異的に透過させた後、遠心分離することにより回収される、シトソールとも呼ばれる細胞の細胞質の可溶部分を意味するものと理解される。細胞質抽出物およびそれを得るための方法は、当業者に公知であり、先行技術、例えば、Suzuki, Keiko et al. "REAP: A two minute cell fractionation method." BMC research notes vol. 3 294. 10 Nov. 2010, doi:10.1186/1756-0500-3-294 or in Gary Zieve and Sheldon Penman, Small RNA species of the HeLa cell: Metabolism and subcellular localization Cell, May 1976, Pages 19-31に記載されている。
【0047】
典型的には、細胞質抽出物は、細胞サンプルを溶解緩衝液または低張緩衝液とインキュベートすることによって得られる。
【0048】
サンプルを溶解緩衝液とインキュベートすることにより、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることが可能になるので有利である。
【0049】
したがって、本発明の目的に関する、用語「溶解緩衝液」は、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることを可能にする任意の緩衝液を意味すると理解される。
【0050】
当業者は、適切な溶解緩衝液を選択することができる。典型的には、米国特許第５６３７４６５号に記載されているような、非イオン性界面活性剤を使用することができる。
【0051】
当業者はまた、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることを可能にするのに適した緩衝液の濃度をどのように選択するかを知っている。
【0052】
典型的には、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることを可能にするのに適した緩衝液の濃度を決定するために、当業者によって抗ＤＮＡ抗体が使用され得る。
【0053】
死の過程が開始されなかった細胞を、界面活性剤の濃度を増加させて処理した後、これらの細胞を抗ＤＮＡ抗体の存在下に置く。この抗体の核排除によって、核膜の完全性を確認し、さらに界面活性剤の最適濃度を決定することが可能となる。高すぎる濃度の界面活性剤は、核膜を透過性にし、抗体が核に浸透することを可能にし、したがって核ＤＮＡを検出することを可能にする。この方法は、核に位置するタンパク質を検出するための方法に基づいてモデル化される（Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Goldenthal KL, Hedman K, Chen JW, August JT, Willingham MC. J Histochem Cytochem. 1985 Aug; 33(8):813-20）。
【0054】
例として、溶解緩衝液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、エチレンジアミン四酢酸、塩化ナトリウム、ジギトニンもしくはサポニンのようなサポニン、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＮＰ４０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ６３０、Ｅｍｐｉｇｅｎ、または組み合わせから選択してもよい。
【0055】
一実施形態によれば、溶解緩衝液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、エチレンジアミン四酢酸、塩化ナトリウム、およびジギトニンの混合物である。
【0056】
これらの緩衝液は、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることを可能にする。
【0057】
一実施形態では、溶解緩衝液は、５０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのジギトニンの混合物である。
【0058】
一実施形態によれば、細胞質抽出物は、以下の工程によって得ることができる：
－溶解緩衝液または低張緩衝液との、細胞サンプルのインキュベーション。
－溶解緩衝液または低張緩衝液との、細胞サンプルのインキュベーション。
【0059】
－溶解した細胞サンプルの遠心分離または濾過。
【0060】
遠心分離または濾過の工程は、上清と細胞片の残部とに分離することを可能にする。
【0061】
「細胞質抽出物の画分」は、細胞質抽出物のアリコート画分に相当する。
【0062】
一実施形態によれば、細胞質抽出物の画分は、以下の工程によって得ることができる：
－溶解緩衝液または低張緩衝液との、細胞サンプルのインキュベーション；
－溶解した細胞サンプルの遠心分離または濾過；
－遠心分離または濾過の工程の後に得られる上清中の細胞質抽出物のアリコート画分の回収。
－溶解緩衝液または低張緩衝液との、細胞サンプルのインキュベーション；
－溶解した細胞サンプルの遠心分離または濾過；
－遠心分離または濾過の工程の後に得られる上清中の細胞質抽出物のアリコート画分の回収。
【0063】
一実施形態によれば、細胞質抽出物画分を得るための方法は、さらに、前記回収されたアリコート画分を少なくとも水で５倍、好ましくは水で１０倍に、希釈する工程を含んでいてもよい。
【0064】
典型的には、希釈工程は、定量化方法がＰＣＲによる定量化のための方法である場合に適用され得る。
【0065】
有利なことに、本発明者らは、核ゲノム上の１コピー中に存在する配列を標的とするプライマーを用いて、細胞質抽出物上の細胞死を検出することが可能であることを実証した。
【0066】
したがって、一実施形態によれば、本発明による細胞死を定量化するための方法は、前記少なくとも１つの配列が前記ゲノムＤＮＡ断片上の１コピー中に存在するＤＮＡ配列であることを特徴とする。
【0067】
本発明に係る細胞死を定量化するための方法は、また、核ゲノム中、２コピー以上中に存在する配列を標的とするプライマーを用いて、細胞質抽出物において細胞死を検出することを可能にする。
【0068】
例として、本発明に係る方法は、核ゲノム中、２コピー中に存在する配列を標的とするプライマーを用いて、細胞質抽出物において細胞死を検出することを可能にする。
【0069】
したがって、一実施形態によれば、本発明に係る細胞死の定量化するための方法は、前記少なくとも１つの配列が前記ゲノムＤＮＡ断片上の少なくとも２コピー中に存在するＤＮＡ配列であることを特徴とする。
【0070】
本発明に係る方法の感度は、反復ＤＮＡ配列を細胞質ゲノムＤＮＡの量を検出および定量化するためのマーカーとして使用する場合、前記反復ＤＮＡ配列の数に比例して増加する。
【0071】
一実施形態によれば、本発明に係る細胞死を定量化するための方法は、前記少なくとも１つの配列が反復ＤＮＡ配列であることを特徴とする。
【0072】
ゲノムＤＮＡは、典型的には短鎖散在反復配列（small interspersed nuclear element、ＳＩＮＥ）または長鎖散在反復配列（long interspersed nuclear element、ＬＩＮＥ）であり得る反復配列を含む。
【0073】
ＳＩＮＥの中から、Ａｌｕ、ＭＩＲ、およびＭＩＲ３配列を選択し得る。
【0074】
ＬＩＮＥの中から、ＬＩＮＥ１配列を選択し得る。
【0075】
したがって、一実施形態によれば、本発明に係る細胞死を定量化するための方法は、前記少なくとも１つの反復ＤＮＡ配列がＡｌｕ、ＭＩＲ、およびＭＩＲ３などのＳＩＮＥ、ならびにＬＩＮＥ１などのＬＩＮＥから選択されることを特徴とする。
【0076】
本発明者らは、また、各対のプライマーが核ゲノム中に存在するＤＮＡ配列を標的とするプライマーのいくつかの対を用いて、細胞質抽出物において細胞死を検出することが可能であることを実証した。
【0077】
したがって、一実施形態によれば、本発明に係る細胞死を定量化するための方法は、いくつかの異なる配列が同時に増幅されることを特徴とする。
【0078】
当業者は、ゲノムＤＮＡ配列の検出および定量化を可能にする、任意のタイプの技術を使用することができる。
【0079】
ゲノムＤＮＡ断片の検出／定量化は、定量的ＰＣＲ技術、または当業者に公知の少量のＤＮＡを検出するための任意の他の技術によって実施され得る。
【0080】
一実施形態によれば、断片化ゲノムＤＮＡの定量化および検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる。ｑＰＣＲの原理は、挿入剤またはプローブ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を使用して、サンプル中に存在するＤＮＡ鋳型の量をリアルタイムで決定する可能性に基づく。放出される蛍光は、ＰＣＲ反応の間に生成されるアンプリコンの量に正比例する。
【0081】
当業者は、ｑＰＣＲ技術を実施するための任意の装置を使用することができるであろう。例として、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）社のＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲリーダーシステムを使用し得る。
【0082】
したがって、本発明に係る細胞死の定量化方法は、検出／定量化がｑＰＣＲによって行われることを特徴とする。
【0083】
一実施形態によれば、ゲノムＤＮＡ断片の定量化は、水滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって行われる。ｄｄＰＣＲは、各サンプルを２０，０００の１ｎｌ液滴へ分割することに基づく、マイクロ流体ＰＣＲである。
【0084】
一実施形態によれば、ゲノムＤＮＡ断片の定量化は、ナノストリング技術によって行われる。ナノストリングの原理は、２つの鍵となる工程に基づいている。上流では、２つのプローブが目的の各標的に対して特異的に設計される。キャプチャプローブと呼ばれるプローブの１つは、計数用の支持体上に目的の分子を固定化するために使用される、ビオチンに結合される。「レポーター」と呼ばれる２つ目のプローブは、目的の分子に特異的である。それは、４つの異なる色からなる一連の６つの蛍光色素を含み、その配列は、目的の各分子に特異的であるバーコードを規定する。前記バーコードは、この技術の超高感度を可能にし、したがって、少量の生物学的物質を分析する可能性を可能にする（ＬＡＢＥＸ ＤＥＥＰ Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）。
【0085】
一実施形態によれば、ゲノムＤＮＡ断片の定量化は、多重ＰＣＲまたは多重化によって行われる。多重ＰＣＲの実施に関して、ゲノム中に存在するいくつかの配列を同時に増幅するために、いくつかの対のプライマーのセットが使用される。
【0086】
一実施形態によれば、単一の配列は、例えば、センスプライマー５’ＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡ３’（配列番号１）およびアンチセンスプライマー５’ＡＧＧＣＴＡＡＧＴＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ’（配列番号２）、またはセンスプライマー５’ＡＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号３）およびアンチセンスプライマー５’ＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣ３’（配列番号４）を使用して、検出および定量化される。
【0087】
一実施形態によれば、２コピー中に存在する配列は、センスプライマー５’ＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴ３’（配列番号５）およびアンチセンスプライマー５’ＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡ３’（配列番号６）を使用して、検出および定量化される。
【0088】
一実施形態によれば、多重化は、例えば、配列番号１および配列番号２のプライマー対と、配列番号３および配列番号４のプライマー対を同時に使用して行うことができる。
【0089】
一実施形態によれば、Ａｌｕ配列は、センスプライマー５’ＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ３’（配列番号７）およびアンチセンスプライマー５’ＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号８）を使用して、検出および定量化される。
【0090】
一実施形態によれば、ＬＩＮＥ１配列は、センスプライマー５’ＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧ３’（配列番号９）およびアンチセンスプライマー５’ＡＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡ３’（配列番号１０）を使用して、またはセンスプライマー５’ＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡ３’（配列番号１１）およびアンチセンスプライマー５’ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡ３’（配列番号１２）を使用して、検出および定量化される。
【0091】
一実施形態によれば、核酸の前記サンプルにおいて増幅された核酸の量は、対照サンプルの増幅された核酸の量と比較される。
【0092】
用語「対照サンプル」は、細胞死の過程が開始されていない細胞サンプルを意味すると理解される。
【0093】
典型的には、「対照サンプル」の増幅された核酸の量と比較した、前記「サンプル」中の増幅された核酸の量の増加は、細胞死を示す。
【0094】
本発明に係る細胞の細胞質中のＤＮＡ断片の検出による細胞死の定量化は、病状の診断、細胞死に対する処理の効果のモニタリング、病状の予後の取得、化合物のスクリーニングの実施、および細胞培養の条件の最適化を可能にする。
【0095】
したがって、本発明は、また、本発明に係る方法による細胞サンプル中の細胞死の検出を含む、細胞死に対する処理の有効性および／または効果をモニターするための方法に関する。
【0096】
この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏ条件に適用される。
【0097】
典型的には、本発明は、処理に対する患者の反応をモニターすることを可能にする。細胞死の検出および定量化は、処理の有効性またはその欠如を示す。患者に由来するサンプルの増幅された核酸の量は、対照サンプルの増幅された核酸の量と比較され得、前記対照サンプルは、処理の実施前に得た患者に由来するサンプル、または病状を患っていない被験者に由来するサンプルであり得る。一般に、増幅された核酸の量の増加は、処理の有効性と同義であり、一方、有意な変動の欠如は、処理の失敗と同義であり得る。
【0098】
本発明は、また、本発明に係る方法による細胞サンプル中の細胞死の検出を含む、細胞死の過程を伴う病状を診断するための方法に関する。
【0099】
典型的には、細胞サンプル中の細胞死の活性化のレベルは、細胞死の過程を伴う病状を示す。患者に由来するサンプルの増幅された核酸の量は、対照サンプルの増幅された核酸の量と比較され得、前記対照サンプルは、病状を患っていない被験者に由来するサンプルであり得る。
【0100】
本発明は、また、本発明に係る方法による細胞サンプル中の細胞死の検出を含む、細胞死の過程を伴う病状の予後診断のための方法に関する。
【0101】
本発明は、また、以下を含む、化合物をスクリーニングするための方法に関する：
－１つ以上の化合物による細胞サンプルの処理；
－本発明に係る方法による前記サンプル中の細胞死の検出。
－１つ以上の化合物による細胞サンプルの処理；
－本発明に係る方法による前記サンプル中の細胞死の検出。
【0102】
本発明に係る方法は、細胞死を誘発する化合物を決定することを可能にする。
【0103】
本発明の対象はまた、以下を含む、細胞サンプル中の細胞死の検出のためのキットである：
－原形質膜を特異的に溶解または透過性にすることができる、溶解緩衝液または低張緩衝液；
－ゲノムＤＮＡを増幅する少なくとも１対のプライマー。
－原形質膜を特異的に溶解または透過性にすることができる、溶解緩衝液または低張緩衝液；
－ゲノムＤＮＡを増幅する少なくとも１対のプライマー。
【0104】
有利なことに、溶解緩衝液は、核膜を透過性にすることなく、原形質膜を溶解または透過性にすることを可能にする。
【0105】
溶解緩衝液およびプライマーは、上記の通りである。
【0106】
細胞サンプルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の細胞のサンプル（例えば、接着細胞または懸濁液中の細胞）、循環腫瘍細胞を含むサンプル、精製された循環腫瘍細胞を含むサンプル、循環細胞を含む血液サンプル、または細胞死の過程が開始された細胞を含む任意のサンプル（例えば、血漿サンプル、尿サンプル、もしくは唾液サンプル）から選択され得る。
【0107】
同様に有利なことに、プライマーは、研究される種に特異的である。
【0108】
〔実施例〕
以下の実施例では、以下に詳述する材料および方法を使用した：
＜方法＞
所与のサンプル中の細胞死を測定するためのプロトコルを開発した。
以下の実施例では、以下に詳述する材料および方法を使用した：
＜方法＞
所与のサンプル中の細胞死を測定するためのプロトコルを開発した。
【0109】
細胞死を引き起こす薬物によって処理されていない、または処理された細胞を起点とし、該細胞を、その分解の結果生じるＤＮＡの小断片を培地中に放出するために、緩衝液を使用して溶解する。
【0110】
遠心分離または濾過の工程は、その分解の結果生じるＤＮＡの断片を含む上清と、細胞片の残部とに分離することを可能にする。上清のアリコート画分、すなわち、細胞死を定量化するために使用される方法に応じて希釈され得る、細胞質抽出物の画分を、回収する。次いで、ゲノム全体に分散した反復配列を特異的に増幅するプライマーを使用して、またはゲノム上の１コピーもしくは２コピー中の配列を標的とするプライマーを使用して、サンプルに対してＰＣＲを実施する。
【0111】
あるいは、細胞死を定量化するための該方法は、培養培地中で直接的に溶解された細胞から得られた、細胞質抽出物に対して実施され得る。
【0112】
細胞死を定量化するための方法が完了した後すぐに、結果を所定の対照条件と比較して分析する。最終結果は、２～３時間で得ることができる。
【0113】
＜プライマー＞
単一配列の検出および定量化を可能にするプライマー：
５’ＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡ３’（配列番号１）および
５’ＡＧＧＣＴＡＡＧＴＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ３’（配列番号２）、
または
５’ＡＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号３）および
５’ＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣ３’（配列番号４）。
単一配列の検出および定量化を可能にするプライマー：
５’ＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡ３’（配列番号１）および
５’ＡＧＧＣＴＡＡＧＴＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ３’（配列番号２）、
または
５’ＡＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号３）および
５’ＧＴＧＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣ３’（配列番号４）。
【0114】
ゲノム当たり２コピー存在する配列の検出および定量化を可能にするプライマー：
５’ＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴ３’（配列番号５）および
５’ＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡ３’（配列番号６）。
５’ＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴ３’（配列番号５）および
５’ＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡ３’（配列番号６）。
【0115】
Ａｌｕ反復配列の検出および定量化を可能にするプライマー：
５’ＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ３’（配列番号７）
５’ＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号８）。
５’ＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ３’（配列番号７）
５’ＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴ３’（配列番号８）。
【0116】
ＬＩＮＥ１反復配列の検出および定量化を可能にするプライマー：
５’ＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧ３’（配列番号９）および
５’ＡＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡ３’（配列番号１０）
または
５’ＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡ３’（配列番号１１）および
５’ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡ３’（配列番号１２）。
５’ＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧ３’（配列番号９）および
５’ＡＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡ３’（配列番号１０）
または
５’ＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡ３’（配列番号１１）および
５’ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡ３’（配列番号１２）。
【0117】
＜セル培養＞
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（懸濁液中）は、急性骨髄性白血病から得られる。それらを、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（懸濁液中）は、急性骨髄性白血病から得られる。それらを、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0118】
ＨｅｐＧ２（接着）細胞は、ヒト肝癌から得られる。それらを、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース培地（ＤＭＥＭ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0119】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（接着）細胞は、上皮性乳腺腫瘍細胞である。それらを、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース培地（ＤＭＥＭ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0120】
ＭＯＬＭ１４細胞（懸濁液中）は、急性骨髄性白血病から得られる。それらを、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0121】
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ－Ｇｉｂｃｏ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース培地（ＤＭＥＭ－Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0122】
＜接種および処理＞
懸濁液中の細胞（例えば、ＯＣＩ－ＡＭＬ３）を、２００，０００細胞／ｍｌで６ウェルプレートに接種する。次いで、細胞を、未処理のままにするか、または異なる濃度の異なる薬物で処理し、そして１６時間インキュベートする。
懸濁液中の細胞（例えば、ＯＣＩ－ＡＭＬ３）を、２００，０００細胞／ｍｌで６ウェルプレートに接種する。次いで、細胞を、未処理のままにするか、または異なる濃度の異なる薬物で処理し、そして１６時間インキュベートする。
【0123】
接着細胞（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨｅｐＧ２）を、４８ウェルプレート中の２５０μｌの培地に、２０，０００～３０，０００細胞／ウェルで接種する。次いで、細胞を、未処理のままにするか、または異なる濃度の異なる薬物で処理し、そして２４時間インキュベートする。
【0124】
＜ｑＰＣＲ＞
ｑＰＣＲの実施のために、得られた細胞質画分を水で１０倍希釈する。
使用したキットは、ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）である。サンプルを予め水で１／１０に希釈した。一度、マスターミックスを調製し（以下の表に記載するように）、６μｌをＰＣＲプレートの各ウェルに分配する。次いで、４μｌのサンプルを添加する。ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲリーダーシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行う。増幅プログラムは、以下の通りである：９５℃で３０秒間、続いて９５℃で５秒間および６０℃で２０秒間の２ステップからなるサイクルを４０サイクル。
ｑＰＣＲの実施のために、得られた細胞質画分を水で１０倍希釈する。
使用したキットは、ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）である。サンプルを予め水で１／１０に希釈した。一度、マスターミックスを調製し（以下の表に記載するように）、６μｌをＰＣＲプレートの各ウェルに分配する。次いで、４μｌのサンプルを添加する。ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲリーダーシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行う。増幅プログラムは、以下の通りである：９５℃で３０秒間、続いて９５℃で５秒間および６０℃で２０秒間の２ステップからなるサイクルを４０サイクル。
【0125】
【表1】
【0126】
＜Ｃａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ＞
未処理細胞（ＮＴ）、および細胞死を誘導するために処理した細胞（ＴＴＴ）を、これらのアッセイに使用した。ＮＴおよびＴＴＴ条件のそれぞれにおいて、１００，０００－１０，０００－１０００－１００または１０個の細胞を、９６ウェルプレートの５０μｌの培地中に移す（トリプリケートで）。次に、５０μｌのＣａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ３／７試薬を添加する。１時間インキュベートした後、カスパーゼ３および７による基質の切断の結果生じる発光を、ルミノメーターを用いて決定する。
未処理細胞（ＮＴ）、および細胞死を誘導するために処理した細胞（ＴＴＴ）を、これらのアッセイに使用した。ＮＴおよびＴＴＴ条件のそれぞれにおいて、１００，０００－１０，０００－１０００－１００または１０個の細胞を、９６ウェルプレートの５０μｌの培地中に移す（トリプリケートで）。次に、５０μｌのＣａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ３／７試薬を添加する。１時間インキュベートした後、カスパーゼ３および７による基質の切断の結果生じる発光を、ルミノメーターを用いて決定する。
【0127】
＜アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）標識－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＞
未処理細胞（ＮＴ）、および細胞死を誘導するために処理した細胞（ＴＴＴ）細胞を、これらのアッセイに使用した。
未処理細胞（ＮＴ）、および細胞死を誘導するために処理した細胞（ＴＴＴ）細胞を、これらのアッセイに使用した。
【0128】
細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１×１０６細胞／ｍｌの１×結合緩衝液に再懸濁する。２００μｌのこの細胞懸濁液に、１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅおよび１０μｌのヨウ化プロピジウム（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄキット）を添加し、次いでこれを暗所および周囲温度で１５分間インキュベートする。３００ｇで５分間遠心分離した後、上清を穏やかに吸引し、５００μｌの１×結合緩衝液を添加する。
【0129】
次いで、これらの細胞を、処理の効果、およびアポトーシス状態の細胞数を決定するために、フローサイトメトリーにおいて使用した。これらの細胞は、次にＰＣＲを実施するために、それらのアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムの状態に依存して選別される。
【0130】
＜ｄｄＰＣＲ（液滴デジタルＰＣＲ）＞
各ｄｄＰＣＲ反応は、約２０，０００の１ｎｌ量の液滴で、最適に行われる。
各ｄｄＰＣＲ反応は、約２０，０００の１ｎｌ量の液滴で、最適に行われる。
【0131】
サンプル、およびｄｄＰＣＲ混合物の調製
未処理細胞および細胞死を誘導するために処理した細胞から得た細胞質抽出物をサンプルとして使用した。
未処理細胞および細胞死を誘導するために処理した細胞から得た細胞質抽出物をサンプルとして使用した。
【0132】
ｄｄＰＣＲ反応混合物（２４μｌ）は、１１μｌの２×「ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、０．２２μｌのプライマー（センスおよびアンチセンス、それぞれ最終２００ｎＭ）、４μｌのサンプル、および６．７８μｌの水を必要とする。
【0133】
液滴の生成
液滴は、ＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のウェルにおいて、２０μｌのｄｄＰＣＲ混合物および２０μｌの油を乳化することによって、ＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＧｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により生成される。次いで、液滴／油混合物を９６ウェルプレートに移し、「ＰＸ１ ＰＣＲプレートシーラー」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて密封する。
液滴は、ＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のウェルにおいて、２０μｌのｄｄＰＣＲ混合物および２０μｌの油を乳化することによって、ＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＧｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により生成される。次いで、液滴／油混合物を９６ウェルプレートに移し、「ＰＸ１ ＰＣＲプレートシーラー」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて密封する。
【0134】
増幅
増幅は、プログラムに従ってＴ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において実施される：酵素活性化：９５℃で５分間；４０サイクル：９５℃で３０秒間の変性、次いで６０℃で１分間の伸長。シグナル安定化：４℃で５分間、次いで９０℃で５分間。
増幅は、プログラムに従ってＴ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において実施される：酵素活性化：９５℃で５分間；４０サイクル：９５℃で３０秒間の変性、次いで６０℃で１分間の伸長。シグナル安定化：４℃で５分間、次いで９０℃で５分間。
【0135】
液滴読み取り
次いで、プレートをＱＸ２００液滴リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって読み取る。次いで、結果をエクスポートし、データを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて分析する。
次いで、プレートをＱＸ２００液滴リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって読み取る。次いで、結果をエクスポートし、データを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて分析する。
【0136】
〔実施例１：培養中の接着細胞（ＨｅｐＧ２およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１）または懸濁液中の細胞（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）における細胞死の検出〕
＜培養中のＨｅｐＧ２接着細胞＞
図１は、本発明による方法において、種々の溶解緩衝液を用いて得られたＨｅｐＧ２細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
＜培養中のＨｅｐＧ２接着細胞＞
図１は、本発明による方法において、種々の溶解緩衝液を用いて得られたＨｅｐＧ２細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
【0137】
３０，０００個の細胞を接種し、次いで、未処理のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１８時間処理する。次いで、細胞を、異なる界面活性剤：０．０７５％のＴｗｅｅｎ－２０、０．００７５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．０３７％のＥｍｐｉｇｅｎ、および０．３３％のＴｅｒｇｉｔｏｌを含む緩衝液中で溶解する。細胞質抽出物を遠心分離し、次いで、上清の画分を回収し、水で希釈する（１０×）。次いで、ｑＰＣＲを前記画分に対して実施する。
【0138】
配列番号９および配列番号１０のプライマー対を、０．３３％のＴｅｒｇｉｔｏｌを用いて細胞を溶解した後に得られた細胞質抽出物の画分に対して使用した。配列番号７および配列番号８のプライマー対を、０．０７５％のＴｗｅｅｎ－２０、０．００７５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．０３７％のＥｍｐｉｇｅｎを用いて細胞を溶解した後に得られた細胞質抽出物の画分に対して使用した。
【0139】
＜懸濁液中のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞＞
図２は、本発明による方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
図２は、本発明による方法において、種々の界面活性剤を用いて得られたＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
【0140】
細胞を、未処理のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１８時間処理する。５０００個の細胞の遠心分離後、後者を、異なる界面活性剤：０．１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．１％のＥｍｐｉｇｅｎ、１５０μｇ／ｍｌのジギトニン、０．１％のＮＰ４０を含む緩衝液中で溶解し、次いで、配列番号９および配列番号１０のプライマー対を使用して、細胞質抽出物の画分上に対してｑＰＣＲを実施する。
【0141】
図３は、本発明による方法において、異なる界面活性剤を用いて生成された溶解緩衝液を用いて得られた、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
【0142】
５０００個の細胞を、未処理のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１８時間処理し、次いで、異なる界面活性剤：０．１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．５％のＮＰ４０、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５０μｇ／ｍｌのジギトニンを含む緩衝液中で直接的に溶解する。次いで、配列番号７および配列番号８のプライマー対を使用して、細胞質抽出物の画分上に対してｑＰＣＲを実施する。提供される実施例の結果は、３つの独立した実施例の手段である。
【0143】
＜培養中のＭＤＡ－ＭＢ－２３１接着細胞＞
図４は、本発明に係る方法における、異なる界面活性剤を用いて生成された溶解緩衝液を使用して得られたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
図４は、本発明に係る方法における、異なる界面活性剤を用いて生成された溶解緩衝液を使用して得られたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを示す。
【0144】
２０，０００個の細胞を、未処理のままにするかまたは１μＭのドキソルビシンで１８時間処理し、次いで、異なる界面活性剤：０．１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ６３０、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含む緩衝液中で直接的に溶解する。次いで、配列番号７および配列番号８のプライマー対を使用して、細胞質抽出物の画分に対してｑＰＣＲを実施する。
【0145】
本発明に係る方法は、細胞死を検出することを有利に可能にし、したがって、接着細胞および懸濁液中の細胞のサンプルにおける、細胞死の活性化のレベルを測定することを可能にする。
【0146】
〔実施例２：従来技術のＣａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ３／７法と比較した、本発明に係るＰＣＲにより細胞死を検出するための方法の感度の決定〕
ＭＯＬＭ１４細胞を、１μＭのエトポシドで１６時間処理する。細胞死は、Ｃａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ技術を用いて、１０～１０，０００細胞の範囲の細胞のサンプルにおいて決定される。並行して、ｑＰＣＲを、配列番号７および配列番号８のプライマー対を用いて、同一数の細胞（１０～１０，０００個の細胞）に由来する細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。図５に示される実施例の結果は、３つの独立した実施例の手段である。
ＭＯＬＭ１４細胞を、１μＭのエトポシドで１６時間処理する。細胞死は、Ｃａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ技術を用いて、１０～１０，０００細胞の範囲の細胞のサンプルにおいて決定される。並行して、ｑＰＣＲを、配列番号７および配列番号８のプライマー対を用いて、同一数の細胞（１０～１０，０００個の細胞）に由来する細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。図５に示される実施例の結果は、３つの独立した実施例の手段である。
【0147】
本発明に係る方法を、従来技術の方法（Ｃａｓｐａｓｅ・Ｇｌｏ）と比較することにより、本発明に係る方法の、改善された感度およびより低い検出閾値を有利に実証することが可能になる。
【0148】
〔実施例３：従来技術のフローサイトメトリー（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）と比較した、本発明に係る細胞死を検出するための方法の感度の決定〕
＜未処理、または漸増濃度のエトポシドで処理された、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞＞
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
＜未処理、または漸増濃度のエトポシドで処理された、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞＞
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
【0149】
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のエトポシド（０～７．５～１５もしくは３０μＭ）で１６時間処理する。
【0150】
細胞を、供給者の推奨に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識し、次いで、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析する。陽性アポトーシス細胞（アネキシンＶ）の割合を測定する。
【0151】
並行して、配列番号９および配列番号１０の１対のプライマーを用いて、遠心分離後に溶解した１０，０００個の細胞から得られた細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。結果を図６に示している。
【0152】
培養培地中で直接的に溶解した細胞から得られた、細胞質抽出物に対して実施されるｑＰＣＲ。
【0153】
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のエトポシド（０～７．５～１５または３０μＭ）で１６時間処理する。
【0154】
細胞を、供給者の推奨に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識し、次いで、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析する。陽性アポトーシス細胞（アネキシンＶ）の割合を測定する。
【0155】
並行して、配列番号９および配列番号１０の１対のプライマーを用いて、遠心分離後に培養培地中で直接的に溶解した１０，０００個の細胞から得られた細胞質抽出物に対してＰＣＲを実施する。結果を図７に示している。
【0156】
＜未処理のまま、または漸増濃度のボルテゾミブを用いて処理したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞＞
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
【0157】
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のボルテゾミブ（０～０．１２５または０．２５μＭ）で１６時間処理する。
【0158】
細胞を、供給者の推奨に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識し、次いで、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析する。陽性アポトーシス細胞（アネキシンＶ）の割合を測定する。
【0159】
並行して、配列番号９および配列番号１０の１対のプライマーを用いて、遠心分離後に溶解した１０，０００個の細胞から得られた細胞質抽出物に対してＰＣＲを実施する。結果を図８に示している。
【0160】
培養培地中で直接的に溶解した細胞から得られた、細胞質抽出物に対して実施されるｑＰＣＲ
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のボルテゾミブ（０～０．１２５または０．２５μＭ）で１６時間処理する。
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のボルテゾミブ（０～０．１２５または０．２５μＭ）で１６時間処理する。
【0161】
細胞を、供給者の推奨に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識し、次いで、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析する。陽性アポトーシス細胞（アネキシンＶ）の割合を測定する。
【0162】
並行して、配列番号９および配列番号１０の１対のプライマーを用いて、遠心分離後に培養培地中で直接的に溶解した１０，０００個の細胞から得られた細胞質抽出物に対してＰＣＲを実施する。結果を図９に示している。
【0163】
＜未処理のまま、または漸増濃度のエトポシドを用いて処理したＭＯＬＭ１４細胞＞
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
遠心分離後に溶解した細胞から得られた細胞質抽出物に対するｑＰＣＲ。
【0164】
ＭＯＬＭ１４細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または漸増濃度のエトポシド（０～０．６２～１．２５～２．５～５または１０μＭ）で１６時間処理する。
【0165】
［１８２］細胞を、供給者の推奨に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識し、次いで、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析する。陽性アポトーシス細胞（アネキシンＶ）の割合を測定する。
【0166】
並行して、配列番号７および配列番号８の１対のプライマーを用いて、遠心分離し後に溶解した１０，０００細胞から得られた細胞質抽出物に対してＰＣＲを実施する。
【0167】
本発明によるＰＣＲを使用する方法の感度は、フローサイトメトリーの感度よりもはるかに高い。さらに、フローサイトメトリーを使用する方法は、２．５μＭのエトポシドの濃度から開始して検出プラトーに達するが、ＰＣＲ法においてはそうではない。結果を図１０に示している。
【0168】
本発明に係る方法と従来技術の方法（アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム標識）との比較は、本発明に係る方法の改善された感度およびより低い飽和性を有利に実証することを可能にする。
【0169】
該方法は、また、培養培地中での溶解の直後に、細胞死を検出することを可能にし、これは、従来技術よりもはるかに高い感度で行われる。
【0170】
＜１μＭのドキソルビシンで処理したＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞＞
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１６時間処理する。
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１６時間処理する。
【0171】
細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識する。１０００個の、処理または未処理の二重陰性細胞（ｄｎ集団－アネキシンＶ陰性－ヨウ化プロピジウム陰性）を選別する。これらの結果を図１１Ａに示す。
【0172】
配列番号９および配列番号１０のプライマー対を使用して、これらの１０００個の、処理（ＴＴＴ）または未処理（ＮＴ）の（ＡＶ－／ＰＩ－）細胞に由来する細胞質抽出物に対してＰＣＲを実施する。提示された実施例の結果は、３つの独立した実施例の手段である。結果を図１１Ｂに示している。
【0173】
本発明に係る方法は、細胞における細胞死の出現を検出することを可能にし、前記細胞は、本発明に有利に働く感度閾値の観点において、従来技術の試験によって、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム標識について二重陰性であると考えられる。
【0174】
＜単離細胞＞
ＭＯＬＭ１４細胞を、未処理のままにするか、または２．５μＭのエトポシドで１６時間処理する。
ＭＯＬＭ１４細胞を、未処理のままにするか、または２．５μＭのエトポシドで１６時間処理する。
【0175】
細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して標識する。各サブ集団について、１つの細胞を選別し、そして、配列番号９および配列番号１０のプライマー対を使用して、細胞質抽出物に対してｄｄＰＣＲ（液滴デジタル）を実施する。細胞死の活性化のレベルを決定し、ヨウ化プロピジウム／アネキシンＶ標識について陰性の未処理細胞の細胞質抽出物から得られた、シグナルと比較する。
【0176】
図１２に示す結果は、５～６個の細胞で得られた結果の平均を示す。
【0177】
本発明に係る方法は、細胞サンプル上の細胞死を検出することを可能にし、したがって、先行技術の方法と比較して最適化された感度を提供する。
【0178】
〔実施例４：ゲノム上の１コピーまたは２コピー中に存在する配列を標的とするプライマーを使用して、異なる細胞株からの細胞質抽出物において実現される細胞死の検出〕
図１３は、横軸（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｍｏｌｍ１４、ＨｅＬａ、ＯＣＩ－ＡＭＬ３）に示した細胞株からの、細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
図１３は、横軸（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｍｏｌｍ１４、ＨｅＬａ、ＯＣＩ－ＡＭＬ３）に示した細胞株からの、細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0179】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または２００ｎＭのスタウロスポリンで２４時間処理（ＴＴＴ）する。Ｍｏｌｍ１４細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または０．５μＭのドキソルビシンで１６時間処理（ＴＴＴ）する。ＨｅＬａ細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または４００ｎＭのスタウロスポリンで２４時間処理（ＴＴＴ）する。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１６時間処理（ＴＴＴ）する。溶解緩衝液の作用後、配列番号１および配列番号２のプライマー対を使用して、１０倍希釈した細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。
【0180】
図１４は、横軸（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｍｏｌｍ１４、ＨｅＬａ、ＯＣＩ－ＡＭＬ３）に示した細胞株からの、細胞質抽出物において実現された細胞死の活性化のレベルを表す。
【0181】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または２００ｎＭのスタウロスポリンで２４時間処理（ＴＴＴ）する。Ｍｏｌｍ１４細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または０．５μＭのドキソルビシンで１６時間処理（ＴＴＴ）する。ＨｅＬａ細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または４００ｎＭのスタウロスポリンで２４時間処理（ＴＴＴ）する。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または１μＭのドキソルビシンで１６時間処理（ＴＴＴ）する。溶解緩衝液の作用および遠心分離後、配列番号５および配列番号６のプライマー対を使用して、１０倍希釈した細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。
【0182】
有利なことに、本発明に係る方法は、ゲノム上の１コピー中に存在するＤＮＡ配列の検出および増幅によって、細胞死を検出することを可能にする。
【0183】
〔実施例５：多重化によって、細胞質抽出物において実現される細胞死の検出〕
図１５は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株の細胞質抽出物において実現される、細胞死の活性化のレベルを表す。
図１５は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株の細胞質抽出物において実現される、細胞死の活性化のレベルを表す。
【0184】
細胞を、未処理（ＮＴ）のままにするか、または１０μＭのアラキチン［シタラビン］で２４時間処理（ＴＴＴ）する。遠心分離後、細胞を溶解する。次いで、配列番号１および配列番号２のプライマー対と、配列番号３および配列番号４のプライマー対とを同時に使用して、１０倍希釈した細胞質抽出物に対してｑＰＣＲを実施する。
【0185】
本発明に係る細胞死を検出する方法は、多重化技術によって有利に実施することができる。
【0186】
したがって、有利なことに、本発明者らは、感度が高く、簡単かつ迅速であり、適度なコストを有し、接着細胞または懸濁中の細胞に作用する、細胞死を検出するための方法を開発した。この方法は、従来技術の方法と比較して、感度が増し、検出閾値がはるかに低く、飽和性がより低い。
【0187】
〔実施例６：細胞質画分中のＤＮＡフラグメントの存在の検出（前記ＤＮＡフラグメントは、細胞死を誘導する薬物（スタウロスポリン）によって処理された細胞または未処理のままの細胞（ＮＴ）において、本発明に係る方法において記載される溶解緩衝液での抽出後に得られ、キャピラリー電気泳動によって検出される。）〕
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＤＭＥＭ高グルコース培地（１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ）３５ｍｌ当たり３００万細胞の量で、６個のＴ１７５ｓに接種した。翌日、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、５０ｎＭおよび１００ｎＭのスタウロスポリンで処理した。２個の未処理Ｔ１７５ｓの培地を交換した。処理の２４時間後、Ｔ１７５ｓに添加した２ｍｌの溶解緩衝液を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、周囲温度で１５分間溶解し、次いで、２ｍｌをチューブに移して、２０００ｇで５分間遠心した。次いで、上清をＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）、次いでプロテイナーゼＫ（１００ｕｇ／ｍｌで使用）で処理し、７０℃で１５分間置いた。溶解緩衝液は、５０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのジギトニンの混合物である。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＤＭＥＭ高グルコース培地（１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ）３５ｍｌ当たり３００万細胞の量で、６個のＴ１７５ｓに接種した。翌日、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、５０ｎＭおよび１００ｎＭのスタウロスポリンで処理した。２個の未処理Ｔ１７５ｓの培地を交換した。処理の２４時間後、Ｔ１７５ｓに添加した２ｍｌの溶解緩衝液を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、周囲温度で１５分間溶解し、次いで、２ｍｌをチューブに移して、２０００ｇで５分間遠心した。次いで、上清をＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）、次いでプロテイナーゼＫ（１００ｕｇ／ｍｌで使用）で処理し、７０℃で１５分間置いた。溶解緩衝液は、５０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのジギトニンの混合物である。
【0188】
次いで、１／１０容量の酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）（３Ｍ、ｐＨ５．２）を添加した。ＤＮＡを１容量のイソプロパノールで沈殿させた。サンプルを周囲温度で１５分間放置した後、＋４℃で、２０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを７５％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させ、次いでｐＨ８の３０μｌのＴＥに再懸濁し、断片分析器で分析した。
【0189】
未処理、または５０もしくは１００ｎＭのスタウロスポリンで２４時間処理した、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞の細胞質画分中のＤＮＡの存在を分析したところ、図１６に示されているとおりであった。
【0190】
細胞死のマーカーであるＤＮＡ断片は、前記細胞の死を誘導する薬物（スタウロスポリン）で処理した細胞サンプルの細胞質画分中に検出される。細胞死を誘導する処理を受けていない細胞サンプルの細胞質画分には、断片化ＤＮＡがあったとしても、ほとんど存在しない。
【図面の簡単な説明】
【0191】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】