特表2022-525700細胞組成物、その製造方法及びそれを含むアトピーの予防または治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-18
(54)【発明の名称】細胞組成物、その製造方法及びそれを含むアトピーの予防または治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0786 20100101AFI20220511BHJP
A61K 35/16 20150101ALI20220511BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220511BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220511BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0786
A61K35/16 Z
A61P17/00
A61P37/08
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503396
(86)(22)【出願日】2020-03-16
(85)【翻訳文提出日】2021-09-15
(86)【国際出願番号】 KR2020003577
(87)【国際公開番号】W WO2020189990
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】10-2019-0029795
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521425331
【氏名又は名称】テラベスト カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＲＡＢＥＳＴ ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】（Ｐａｎｇｙｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｏｗｅｒ， Ｕｎｊｕｎｇ－ｄｏｎｇ） ４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， １４２， Ｕｎｊｕｎｇ－ｒｏ， Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １３４６６ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】キ， ユン ウーク
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ド ウォン
(72)【発明者】
【氏名】パク， ダン ベ
(72)【発明者】
【氏名】キム， スー ミン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ヘ キュン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC14
4B065BB19
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB34
4C087BB37
4C087BB64
4C087DA19
4C087NA14
4C087ZA89
4C087ZB13
(57)【要約】
本発明は、細胞組成物、その製造方法及びそれを含むアトピーの予防または治療用薬学組成物に関するものであり、本発明に係る細胞組成物は、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上に増加されたものであり、インターフェロン－ガンマを持続的に生産する細胞の割合が増加することにより、アトピー性皮膚炎を顕著に改善させることができる。また、副作用がなく、安全に長期間使用が可能であるので、アトピー性皮膚炎の免疫学的異常を根本的に治療できると期待される。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの末梢血から単核球および自己血漿をそれぞれ分離して得るステップと、抗ＣＤ３抗体で細胞培養容器をコーティングするステップと、
前記単核球を前記細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養するステップとを含む、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である細胞組成物の製造方法。
【請求項2】
前記組成物中のＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記組成物は、ＫＳＰ３７（Killer－specific secretory protein of 37 kDa）、ＧＮＬＹ（Granulysin）、ＣＤ７４（Cluster of Differentiation 74）、ＺＢＰ１（Z－DNA－binding protein 1）、ＣＣＬ５（C－C chemokine receptor type 5）およびＨＣＳＴ（Hematopoietic Cell Signal Transducer）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に比べて５倍以上発現されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記培養は、３ステップ以上で行われ、１ステップの培養は、前記単核球を前記抗ＣＤ３抗体がコーティングされた前記細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地を添加して培養し、
２ステップの培養は、前記１ステップの培養物を前記抗ＣＤ３抗体がコーティングされていない前記細胞培養容器に移し、ＩＬ－２を含む培地を添加して培養し、
３ステップの培養は、前記２ステップの培養物をＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地で培養するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、１～１０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ－２は８００～１２００ＩＵ／ｍｇ、ＩＬ－１２は２～６ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１８は２０～６０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ヒト末梢血単核球の培養物である異種細胞混合物であり、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である、細胞組成物。
【請求項7】
前記細胞組成物は、前記全細胞中の前記インターフェロン－ガンマ発現細胞の前記割合が８０％以上である、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項8】
前記細胞組成物は、前記全細胞中のＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上である、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項9】
前記組成物は、ＫＳＰ３７（Killer－specific secretory protein of 37 kDa）、ＧＮＬＹ（Granulysin）、ＣＤ７４（Cluster of Differentiation 74）、ＺＢＰ１（Z－DNA－binding protein 1）、ＣＣＬ５（C－C chemokine receptor type 5）およびＨＣＳＴ（Hematopoietic Cell Signal Transducer）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に比べて５倍以上発現されるものである、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項10】
前記細胞組成物は、総細胞数が１×１０８～１×１０１０個である、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項11】
前記細胞組成物は、ヒトの末梢血から分離した単核球を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養して得られたものである、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項12】
前記培養は、３ステップ以上で行われ、１ステップの培養は、前記単核球を前記抗ＣＤ３抗体がコーティングされた細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地を添加して培養し、
２ステップの培養は、前記１ステップの培養物を前記抗ＣＤ３抗体がコーティングされていない細胞培養容器に移し、ＩＬ－２を含む培地を添加して培養し、
３ステップの培養は、前記２ステップの培養物をＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地で培養するものである、請求項１１に記載の細胞組成物。
【請求項13】
前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、１～１０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ－２は８００～１２００ＩＵ／ｍｇ、ＩＬ－１２は２～６ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１８は２０～６０ｎｇ／ｍｌである、請求項１１に記載の細胞組成物。
【請求項14】
請求項６～１３のいずれか一項に記載の細胞組成物を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞組成物、その製造方法及びそれを含むアトピーの予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）は、乳幼児期に発生し、多い場合に成人期まで持続する、激しい掻痒症と特徴的な皮膚所見を示す慢性炎症性疾患である。アトピー性皮膚炎の原因は、遺伝的背景、免疫学的機序、環境的要因などの様々な因子が複合されていることが知られており、発症機序が非常に複雑で、様々な仮説が存在する。最も有力な仮説の一つは、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の恒常性が破綻してＴｈ２細胞が過剰活性化するというものである。特定のアレルゲン（allergen）によって過剰活性化されたＴｈ２細胞は、ＩＬ－４及びＩＬ－３１のようなＴｈ２サイトカインを分泌し、分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌と肥満細胞（Mast cell）の脱顆粒を誘導して様々な炎症物質を放出させる。
【0003】
現在までは、アトピー性皮膚炎の治療において、抗炎症剤であるコルチコステロイド（Corticosteroid）のような物質を用いて、免疫細胞の全体的な活性を抑制する方法を用いているだけである。この方法は、持続期間が非常に短いだけでなく、激しい副作用を伴っているため、適切な治療方法としては推奨されていない。また、近年開発された低分子及び抗体治療剤の場合は、一つの炎症物質に結合する受容体を遮断する程度であるため、アトピーのように複雑な炎症シグナルシステムを媒介とした慢性皮膚炎を治療するのには限界があり、別の経路によるアトピーの再発危険を避けることが容易ではない。最近では、Ｔｈ１サイトカインの一種であるＩＦＮ－γタンパク質を用いてＴｈ２細胞の活性を抑制することにより、アトピー性皮膚炎を改善しようとする試みがあったが、ＩＦＮ－γタンパク質は、体内半減期が極めて短いので治療効果に限界がある。
【0004】
そこで、アトピーの病因に基づいてＴｈ１／Ｔｈ２免疫システムの均衡化による根本的な治療アプローチによって治療効果を極大化することが非常に重要であり、副作用を誘発しないアトピー性皮膚炎治療薬の開発が切実に求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である細胞組成物を提供することを目的とする。
【0006】
本発明は、前記細胞組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【0007】
本発明は、前記細胞組成物を含むアトピーの予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
１．ヒトの末梢血から単核球及び自己血漿をそれぞれ分離して得るステップと、抗ＣＤ３抗体で細胞培養容器をコーティングするステップと、前記単核球を前記細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養するステップとを含む、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である細胞組成物の製造方法。
【0009】
２．前記項目１において、前記組成物中のＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上である、方法。
【0010】
３．前記項目１において、前記組成物は、ＫＳＰ３７（Killer－specific secretory protein of 37 kDa）、ＧＮＬＹ（Granulysin）、ＣＤ７４（Cluster of Differentiation 74）、ＺＢＰ１（Z－DNA－binding protein 1）、ＣＣＬ５（C－C chemokine receptor type 5）およびＨＣＳＴ（Hematopoietic Cell Signal Transducer）からなる群より選択される一つ以上の遺伝子が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に比べて５倍以上発現されるものである、方法。
【0011】
４．前記項目１において、前記培養は３ステップ以上で行われ、１ステップの培養は、前記単核球を抗ＣＤ３抗体がコーティングされた細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地を添加して培養し、２ステップの培養は、前記１ステップの培養物を抗ＣＤ３抗体がコーティングされていない細胞培養容器に移し、ＩＬ－２を含む培地を添加して培養し、３ステップの培養は、前記２ステップの培養物をＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地で培養するものである、方法。
【0012】
５．前記項目１において、前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、１～１０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ－２は８００～１２００ＩＵ／ｍｇ、ＩＬ－１２は２～６ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１８は２０～６０ｎｇ／ｍｌである、方法。
【0013】
６．ヒト末梢血単核球の培養物である異種細胞混合物であり、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である、細胞組成物。
【0014】
７．前記項目６において、前記細胞組成物は、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が８０％以上である、細胞組成物。
【0015】
８．前記項目６において、前記細胞組成物は、全細胞中のＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上である、細胞組成物。
【0016】
９．前記項目６において、前記組成物は、ＫＳＰ３７（Killer－specific secretory protein of 37 kDa）、ＧＮＬＹ（Granulysin）、ＣＤ７４（Cluster of Differentiation 74）、ＺＢＰ１（Z－DNA－binding protein 1）、ＣＣＬ５（C－C chemokine receptor type 5）およびＨＣＳＴ（Hematopoietic Cell Signal Transducer）からなる群より選択される一つ以上の遺伝子が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に比べて５倍以上発現されるものである、細胞組成物。
【0017】
１０．前記項目６において、前記細胞組成物は、全細胞数が１×１０８～１×１０１０個である、細胞組成物。
【0018】
１１．前記項目６において、前記細胞組成物は、ヒトの末梢血から分離した単核球を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養して得られたものである、細胞組成物。
【0019】
１２．前記項目１１において、前記培養は３ステップ以上で行われ、１ステップの培養は、前記単核球を抗ＣＤ３抗体がコーティングされた細胞培養容器に接種し、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地を添加して培養し、２ステップの培養は、前記１ステップの培養物を抗ＣＤ３抗体がコーティングされていない細胞培養容器に移し、ＩＬ－２を含む培地を添加して培養し、３ステップの培養は、前記２ステップの培養物をＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含む培地で培養するものである、細胞組成物。
【0020】
１３．前記項目１１において、前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、１～１０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ－２は８００～１２００ＩＵ／ｍｇ、ＩＬ－１２は２～６ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１８は２０～６０ｎｇ／ｍｌである、細胞組成物。
【0021】
１４．前記項目６～１３のいずれかに記載の細胞組成物を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学組成物。
【発明の効果】
【0022】
本発明に係る細胞組成物は、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上に増加したものであり、インターフェロン－ガンマを持続的に生産する細胞の割合が増加することにより、アトピー性皮膚炎を顕著に改善させることができる。また、副作用がなく、安全に長期間使用が可能であり、アトピー性皮膚炎の免疫学的異常を根本的に治療できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0025】
本発明は、細胞組成物の製造方法に関するものである。
【0026】
本発明の細胞組成物の製造方法は、ヒトの末梢血から単核球及び自己血漿をそれぞれ分離して得るステップを含む。
【0027】
末梢血から単核球を分離する方法としては、公知の方法を用いることができる。通常、フィコール（Ficoll）方法を用いるが、フィコールは、砂糖とエピクロロヒドリンを互いに重合させた化合物であり、一般的に約４０万分子量のものを用いる。フィコールは水に溶かすと、低粘度で高密度に至る溶液に変化するため、細胞、ウイルスおよび細胞小器官などを分離するための密度勾配を形成させる物質として使用する。末梢血単核球は、血液中に含まれている赤血球、顆粒性白血球（granulocytes）および死んだ細胞に比べて軽く、血漿（plasma）よりは重いので分離が可能である。
【0028】
前記単核球は、前記細胞組成物の適用対象である個体の自己血液から分離されて培養されたものであってもよい。自己血液から分離された単核球を用いると、不要な自己免疫反応が排除され、炎症などの副作用なしに効率的にアトピー性皮膚炎を治療できる。
【0029】
本発明の細胞組成物の製造方法は、前記単核球を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養するステップを含む。
【0030】
前記培地が抗ＣＤ３抗体を含む場合、抗ＣＤ３抗体は培地にコーティングされたものであってもよい。抗ＣＤ３抗体が培地にコーティングされた場合、前記培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上をさらに含むことができる。
【0031】
前記培地は、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含むことができる。より具体的には、抗ＣＤ３抗体は培地にコーティングされ、前記細胞培養用培地にＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８をさらに含むことができる。
【0032】
抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する特性を有する抗体であれば制限なく用いることができる。抗ＣＤ３抗体は、０．１～１００μｇ／ｍｌの範囲で含むことができ、好ましくは０．５～５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１～１０μｇ／ｍｌの範囲で含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【0033】
インターロイキンは、リンパ球や単球及びマクロファージなどの免疫担当細胞が生産するタンパク質性の生物活性物質の総称である。本発明では、インターロイキン類のサイトカインとして、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含むことができる。ＩＬ－２は、１００～２０００ＩＵ／ｍｌの範囲で含むことができ、好ましくは５００～１５００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは８００～１２００ＩＵ／ｍｌ含むことができるが、これらに限定されるものではない。ＩＬ－１２は、０．５～１０ｎｇ／ｍｌの範囲で含むことができ、好ましくは１～８ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２～６ｎｇ／ｍｌ含むことができるが、これらに限定されるものではない。ＩＬ－１８は、１～１００ｎｇ／ｍｌの範囲で含むことができ、好ましくは１０～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０～６０ｎｇ／ｍｌの範囲で含むことができるが、これらに限定されるものではない。インターロイキン類は、これらに限定されず、通常の技術者に公知の他のインターロイキン類もまた、本発明の目的に合致する限り、制限なく用いることができる。
【0034】
前記培地は、Ｌ－グルタミン（glutamine）をさらに含むことができる。前記Ｌ－グルタミンの濃度は特に限定されず、例えば０．５～５ｍＭであってもよく、好ましくは１～３ｍＭであってもよい。
【0035】
前記培地は、その他に単核球の培養のために通常使用される成分をさらに含むことができる。例えば、グリシン（Glycine）、Ｌ－アルギニン（L－Arginine）、Ｌ－アスパラギン（L－Asparagine）、Ｌ－アスパラギン酸（L－Aspartic acid）、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ（LCystine 2HCl）、Ｌ－グルタミン酸（L－Glutamic Acid）、Ｌ－ヒスチジン（L－Histidine）、Ｌ－ヒドロキシプロリン（L－Hydroxyproline）、Ｌ－イソロイシン（LIsoleucine）、Ｌ－ロイシン（L－Leucine）、Ｌ－リジン塩酸塩（L－Lysine hydrochloride）、Ｌ－メチオニン（L－Methionine）、Ｌ－フェニルアラニン（L－Phenylalanine）、Ｌ－プロリン（L－Proline）、Ｌ－セリン（L－Serine）、Ｌ－スレオニン（L－Threonine）、Ｌ－トリプトファン（LTryptophan）、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物（L－Tyrosine disodium salt dihydrate）、Ｌ－バリン（L－Valine）、ビオチン（Biotin）、塩化コリン（Choline chloride）、Ｄ－パントテン酸カルシウム（D－Calcium pantothenate）、葉酸（Folic Acid）、ナイアシンアミド（Niacinamide）、パラ－アミノベンゾ酸（Para－Aminobenzoic Acid）、ピリドキシン塩酸塩（Pyridoxine hydrochloride）、リボフラビン（Riboflavin）、チアミン塩酸塩（Thiamine hydrochloride）、ビタミンＢ１２（Vitamin B12）、ｉ－イノシトール（i－Inositol）、硝酸カルシウム（Calcium nitrate）、硫酸マグネシウム（Magnesium Sulfate）、塩化カリウム（Potassium Chloride）、重炭酸ナトリウム（Sodium Bicarbonate）、塩化ナトリウム（Sodium Chloride）、第一リン酸ナトリウム水和物（Sodium Phosphate dibasic anhydrous）、Ｄ－グルコース（DGlucose）、グルタチオン（Glutathione）、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド（Phenol Red）などを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【0036】
また、前記培地は、血清または血漿と単核球の増殖を支持する追加の増殖因子を添加して培養したものであってもよい。培地に添加する血清または血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物由来のものを使用できるが、ヒト由来として自身由来のものがより好ましい。例えば、サイトカインの組み合わせや、単核球の増殖を刺激するレクチン類などを添加するなど、通常の技術者に知られている方法を用いることができる。
【0037】
また、培地は、血清または血漿と単核球の増殖を支持する追加の増殖因子をさらに含むものであってもよく、血清または血漿自体を含むものであってもよい。培地に添加する血清または血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物由来のものを使用できるが、ヒト由来として自身由来（自己）のものが好ましく、例えばヒトＡＢ血清（human AB serum）または自己血漿（auto plasma）であってもよい。
【0038】
前記培養は、複数のステップで行うことができる。例えば、２ステップまたは３ステップ以上で行うことができる。
【0039】
２ステップ以上で行う場合には、例えば、１ステップで培養された単核球を２ステップで新たな培地に移して培養することができる。２ステップ以上で行う場合には、１ステップの培地は、血漿（自己）、抗ＣＤ３抗体、Ｌ－グルタミン（glutamine）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含み、２ステップの培地は、血漿（自己）、Ｌ－グルタミン（glutamine）、ＩＬ－２を含むことができる。より具体的には、１ステップの培地は、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を含み、２ステップの培地はＩＬ－２を含み、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を含まなくてもよい。
【0040】
３ステップ以上で行う場合には、例えば前記２ステップの培養後、培養物を新たな培地に移して培養することができる。１ステップの培地は、血漿（自己）、抗ＣＤ３抗体、Ｌ－グルタミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含み、２ステップの培地は、血漿（自己）、Ｌ－グルタミン、ＩＬ－２を含み、３ステップの培地は、血漿（自己）、Ｌ－グルタミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含むことができる。より具体的には、１ステップの培地は、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を含み、２ステップの培地は、ＩＬ－２を含み、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を含まなくてもよく、３ステップの培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を含み、抗ＣＤ３抗体を含まなくてもよい。
【0041】
抗ＣＤ３抗体、Ｌ－グルタミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８は、前述した範囲内の濃度で含むことができ、先に例示した培地を用いることができる。
【0042】
培養は、一般的な細胞培養方法、例えばＣＯ２インキュベーター中で行うことができる。ＣＯ２の濃度は、例えば１～１０％、具体的には３～７％であってもよく、温度は３０～４０℃、具体的には３５～３８℃であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0043】
培養は、単核球が十分に活性、増殖するまで行うことができ、例えば３日～２０日、具体的には８日～１６日間行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
培養効率の改善のために、培養中に細胞数の増加に合わせて培地を追加することが好ましい。培地追加の周期は、培養液の劣化を防止するために、例えば１～１０日、具体的には１～７日に１回ずつ追加できるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
本発明の方法により得られる細胞組成物は、末梢血由来の単核球を培養して得られた異種細胞混合物であり、いくつかの表現型の細胞を含むことができる。
【0046】
その表現型は、例えば、ＣＤ３（＋）ＣＤ５６（－）細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３（＋）ＣＤ５６（＋）細胞（ＮＫＴ細胞）、ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）細胞（ＮＫ細胞）などであってもよい。
【0047】
本発明の方法により得られる細胞組成物は、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上である。
【0048】
インターフェロン－ガンマ発現細胞は、その細胞中でインターフェロンガンマを発現する細胞（ＩＦＮ－γ（＋）細胞またはＩＦＮ－γreleasing cell）である。前記細胞組成物は、全細胞中のインターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が非常に高いので、アトピー性皮膚炎の個体に投与した場合、アトピー性皮膚炎の症状を改善させることができる。
【0049】
前記細胞組成物は、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上であり、具体的には６０％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。その上限は特に限定されず、１００％未満であってもよく、具体的には９０％以下であってもよい。
【0050】
前記細胞組成物は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上であってもよい。
【0051】
ＮＫＧ２Ｄ発現細胞は、その細胞中でＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（ＮＫＧ２Ｄ（＋）またはＮＫＧ２Ｄ releasing cell）である。前記細胞組成物は、全細胞中のＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が高いので、重要な免疫バランス調節の役割を果たすＴｈ１細胞で主に発現する高いＮＫＧ２Ｄ数値から、アトピー性皮膚炎に対して高い治療効果を示す。
【0052】
前記細胞組成物は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上であり、具体的には６０％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。その上限は特に限定されず、１００％未満であってもよく、具体的には９０％以下であってもよい。
【0053】
前記細胞組成物は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３発現細胞の割合がそれぞれ１０％未満であってもよい。具体的には、８％未満、７％未満であってもよい。前記細胞組成物は、全細胞中のＩＬ－４およびＩＬ－１３発現細胞の割合が低く、アトピーを誘発するサイトカインであるＩＬ－４およびＩＬ－１３の分泌量が低いので、アトピーの予防及び治療に有効である。
【0054】
前記細胞組成物は、全細胞数が例えば１×１０６～１×１０１０個、具体的には１×１０８～１×１０１０個であってもよい。
【0055】
本発明の方法により得られる細胞組成物は、免疫活性に関与する遺伝子発現を増加させることができる。前記免疫活性に関与する遺伝子は、ＫＳＰ３７（Killer－specific secretory protein of 37 kDa）、ＧＮＬＹ（Granulysin）、ＣＤ７４（Cluster of Differentiation 74）、ＺＢＰ１（Z－DNA－binding protein 1）、ＣＣＬ５（C－C chemokine receptor type 5）およびＨＣＳＴ（Hematopoietic Cell Signal Transducer）からなる群より選択される１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない。
【0056】
細胞組成物は、前記遺伝子の発現がＰＢＭＣに比べて５倍以上、１０倍以上増加したものであってもよい。例えば、ＧＮＬＹの発現が６０倍以上増加したものであってもよい。
【0057】
ＫＳＰ３７は、ＦＧＦＢＰ２（Fibroblast Growth Factor Binding Protein 2）としても知られており、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞特異的な分泌タンパク質である。ＮＫ細胞、γ／δＴ細胞、エフェクター（effector）ＣＤ８ Ｔ細胞およびＴｈ１細胞のサブセット（subset）によって生成され、血清に分泌される。ほとんどのＫｓｐ３７発現細胞は、パーフォリン（perforin）を発現しているが、これはＫｓｐ３７が細胞毒性リンパ球－媒介免疫の主要な過程に関与していることを示唆する。
【0058】
ＧＮＬＹは、Ｔ細胞活性化タンパク質（Ｔ－Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）５１９としても知られており、パーフォリンおよびグランザイム（granzymes）と共に細胞毒性細胞（ＣＴＬ）とＮＫ細胞の細胞分解顆粒に存在する細胞溶解性および炎症性のタンパク質である。ＧＮＬＹは、サポシン（saposin）－類似タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）ファミリーの構成員であり、幅広い抗菌活性と腫瘍細胞に対する強力な細胞毒性作用を示し、抗原提示細胞を活性化させ、免疫アラーミン（immune alarmin）の役割を果たす。ＧＮＬＹは、細胞毒性Ｔ細胞とＮＫ細胞が感染した細胞に付着するときに放出され、Ｔ細胞、単核球、および他の炎症細胞の化学誘引物質として作用する。また、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－γを含む様々なサイトカインの発現を刺激するので、免疫バランスを誘導することができ、標的細胞を殺傷する生物学的機能により、アトピー性皮膚内で破損を受けて変形した炎症細胞を除去し、アトピー性皮膚炎の症状を改善することができる。
【0059】
ＣＤ７４は、コーディングされたタンパク質に結合されるとき、生存経路および細胞増殖を開始するサイトカインマクロファージ移動抑制因子（cytokine macrophage migration inhibitory factor、MIF）に対する細胞表面受容体として作用する。ＭＩＦは、皮膚の炎症を誘導する前炎症性サイトカインであり、損傷した細胞から分泌され得、高移動性グループタンパク質Ｂ１（high－mobility group protein B1）のような損傷関連の分子を放出させる。さらに、ＭＩＦはＴ細胞活性化および浸潤を増加させることができる。
【0060】
ＨＣＳＴ（＝ＤＡＰ１０）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞で発現するＮＫＧ２Ｄシグナルの伝達に関与するアダプター分子であり、ＮＫＧ２ＤとＨＣＳＴの結合は、ＩＴＡＭ（Immunoreceptor Tyrosine－based Activation Motif）のリン酸化を誘導し、Ｓｙｋ（spleen tyrosine kinase）とＺａｐ７０（Zeta－chain－associated protein kinase 70）の信号カスケード（cascade）を誘導して、インターフェロン－ガンマのようなＴｈ１サイトカインを分泌する免疫活性に関与するタンパク質である。
【0061】
ＺＢＰ１は、活性化されると、インターフェロン－ベータを調節することにより、細胞質パターン－認識システム（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）に影響を及ぼして免疫反応を活性化させる。ＺＢＰ１の遺伝子の活性および発現の増加は、細胞壊死（Necroptosis）の活性化と関連がある。細胞壊死はウイルスに感染した細胞を除去したり、ウイルスが広がるのを抑制するものであり、細胞壊死のとき、細胞内のＤＡＭＰｓ（ＤＮＡ、ＨＳＰｓ、ＭＳＵなど）が細胞外に放出される。このとき、一部のＤＡＭＰｓは樹状細胞（dendritic cells、ＤＣｓ）を刺激する。この刺激によって成熟されたＤＣｓは、Ｔ細胞を活性化させる。これにより、ＺＢＰ１が関与する細胞壊死によってウイルス感染した細胞を除去するだけでなく、ＤＣｓを成熟させ、Ｔ細胞を活性化させて免疫活性を誘導することができる。
【0062】
ＣＣＬ５は、Ｔｈ１細胞活性を誘導し、インターフェロン－ガンマと共に作用する場合には、ＮＫ細胞の増殖と活性を誘導することができる。
【0063】
このように、アトピーは免疫機能障害によって引き起こされた免疫不均衡によるものであって、Ｔｈ２が過度に活性化されて発生するものであるが、本発明の方法で得られた細胞組成物は、Ｔｈ２増殖を抑制し、Ｔｈ１細胞を活性化して免疫システムを均衡化させ、アトピーを改善することができる。
【0064】
また、本発明は、細胞組成物に関するものである。
【0065】
本発明の細胞組成物は、末梢血由来の単核球を培養して得られた異種細胞混合物であり、いくつかの表現型の細胞を含むことができる。
【0066】
その表現型は、例えば、ＣＤ３（＋）ＣＤ５６（－）細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ３（＋）ＣＤ５６（＋）細胞（ＮＫＴ細胞）、ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）細胞（ＮＫ細胞）などであってもよい。
【0067】
本発明の細胞組成物は、ヒト末梢血単核球の培養物である異種細胞混合物であり、全細胞中のインターフェロン－ガンマ細胞の割合が６０％以上である。
【0068】
前記細胞組成物は、インターフェロン－ガンマ発現細胞の割合が６０％以上であり、具体的には、６０％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。その上限は特に限定されず、１００％未満であってもよく、具体的には９０％以下であってもよい。
【0069】
前記細胞組成物は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の割合が６０％以上であり、具体的には、６０％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。その上限は特に限定されず、１００％未満であってもよく、具体的には９０％以下であってもよい。
【0070】
前記細胞組成物は、インターフェロン－ガンマの分泌量が増加するので、アトピー性皮膚炎の治療に有効である。
【0071】
前記細胞組成物は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３発現細胞の割合がそれぞれ１０％未満であってもよい。具体的には、８％未満、７％未満であってもよい。前記細胞組成物は、全細胞中のＩＬ－４およびＩＬ－１３発現細胞の割合が低く、アトピーを誘発するサイトカインであるＩＬ－４およびＩＬ－１３の分泌量が低いので、アトピーの予防および治療に有効である。
【0072】
前記細胞組成物は、全細胞数が例えば１×１０６～１×１０１０個、具体的には１×１０８～１×１０１０個であってもよい。
【0073】
前記細胞組成物は、ヒトの末梢血から分離した単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８からなる群より選択される１つ以上を含む培地で培養して得られたものであってもよい。
【0074】
そのほかの培地の組成及び培養方法などは、前述の通りである。
【0075】
また、本発明はアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【0076】
本発明は、前記細胞組成物を含んでインターフェロン－ガンマの分泌量が多いので、アトピー性皮膚炎の予防または治療に有効である。
【0077】
細胞組成物に関する事項は、前述の通りである。
【0078】
本発明の薬学組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるではない。本発明の薬学組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬学的に許容される担体及び製剤として好適なものは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ.，１９９５）に詳細に記載されている。本発明の薬学組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、健康状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性などの要因によって様々であり、普通の熟練した医師は目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。なお、本発明の薬学組成物の投与量はこれに限定されず、１日当たり０．０１－２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよい。
【0079】
本発明の薬学組成物は経口または非経口で投与でき、非経口で投与される場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与できる。本発明の薬学組成物は、適用される疾患の種類によって投与経路が決定されることが好ましい。例えば、本発明の薬学組成物は、発毛の促進または脱毛の予防および治療に使用されるので、皮膚に局所的に適用される方法で投与されることが好ましい。
【0080】
本発明の薬学組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造したり、又は多容量容器内に内入して製造することができる。このとき、製形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【0081】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
【0082】
実験材料
実験動物としては、雄６週齢のＢａｌｂ／Ｃをラオンバイオ（yongin、Korea）から供給を受けて、実験当日まで固形飼料（抗生剤無添加）と水を十分に供給し、温度２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間－１２時間（light－dark cycle）の環境で１週間適応させた後に実験に使用した。動物実験の全過程は、ＮＩＨ（National Institutes of Health）の実験動物管理規定（Principle of Laboratory Animal Care）と中央大学の動物実験倫理委員会の承認を受けて行われた。
実験動物としては、雄６週齢のＢａｌｂ／Ｃをラオンバイオ（yongin、Korea）から供給を受けて、実験当日まで固形飼料（抗生剤無添加）と水を十分に供給し、温度２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間－１２時間（light－dark cycle）の環境で１週間適応させた後に実験に使用した。動物実験の全過程は、ＮＩＨ（National Institutes of Health）の実験動物管理規定（Principle of Laboratory Animal Care）と中央大学の動物実験倫理委員会の承認を受けて行われた。
【0083】
実施例
実験方法
１．体外増強免疫細胞（Ex－vivo Boosted Imuune cell、ＥＢＩ）の培養
血液を常温で保温した後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）２回遠心分離した。上澄み液の血漿を新しい５０ｍｌチューブに収集し、血球層も新しい５０ｍｌチューブに集める。血漿を５６℃の水槽で３０分間不活性化処理した後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液を新しい５０ｍｌチューブに集めて血漿として使用した。５０ｍｌチューブに集めておいた血球層は１：１の割合でＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地を加えて希釈した。１５ｍｌチューブにフィコール４ｍｌを入れて、その上に血液－培地混合物（Blood－media mix）を８ｍｌ載せた後、４００ＲＣＦで３０分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：０）遠心分離した。上位層の血漿（約３ｍｌ）を捨てて、血漿とフィコール層との間のＰＢＭＣ層を最大限に分離して、５０ｍｌチューブに移し、総体積５０ｍｌに合わせて滅菌生理食塩水を入れた後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液を除去した後、１０ｍｌのＲＢＣ溶解バッファ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてセルを溶解した後、振りながら３分間反応させた。反応が終わると、滅菌生理食塩水を用いて総体積を５０ｍｌにした後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。その後、上澄み液を除去し、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地１ｍｌに細胞を溶解した後、セルカウントして総細胞数を計算した。
実験方法
１．体外増強免疫細胞（Ex－vivo Boosted Imuune cell、ＥＢＩ）の培養
血液を常温で保温した後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）２回遠心分離した。上澄み液の血漿を新しい５０ｍｌチューブに収集し、血球層も新しい５０ｍｌチューブに集める。血漿を５６℃の水槽で３０分間不活性化処理した後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液を新しい５０ｍｌチューブに集めて血漿として使用した。５０ｍｌチューブに集めておいた血球層は１：１の割合でＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地を加えて希釈した。１５ｍｌチューブにフィコール４ｍｌを入れて、その上に血液－培地混合物（Blood－media mix）を８ｍｌ載せた後、４００ＲＣＦで３０分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：０）遠心分離した。上位層の血漿（約３ｍｌ）を捨てて、血漿とフィコール層との間のＰＢＭＣ層を最大限に分離して、５０ｍｌチューブに移し、総体積５０ｍｌに合わせて滅菌生理食塩水を入れた後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液を除去した後、１０ｍｌのＲＢＣ溶解バッファ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてセルを溶解した後、振りながら３分間反応させた。反応が終わると、滅菌生理食塩水を用いて総体積を５０ｍｌにした後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。その後、上澄み液を除去し、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地１ｍｌに細胞を溶解した後、セルカウントして総細胞数を計算した。
【0084】
Ｔ２５フラスコに抗ＣＤ３抗体（BD、Mouse anti－human、＃555329）５μｌ、１０ｘＨＢＳＳ ５００μｌ、滅菌生理食塩水４．５ｍｌを入れてフラスコをコーティングした（３７℃、４時間）。ＣＤ３コーティングされたＴ２５フラスコにコーティング溶液を除去し、滅菌生理食塩水を用いて二回洗浄した。洗浄したＴ２５フラスコにＰＢＭＣ １ｘ１０７細胞／５ｍｌをシーディングした後、血漿（自己）５００μｌ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）５０μｌ、ＩＬ－２（１０００ＩＵ／ｍｌ）２．８μｌ、ＩＬ－１２（３ｎｇ／ｍｌ）１．５μｌ、ＩＬ－１８（３０ｎｇ／ｍｌ）１．５μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地４．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【0085】
ＥＢＩの培養には、フラスコおよびバックを用いた。フラスコを用いた培養時、前記方法で製造されたＴ２５フラスコでＰＢＭＣシーディング３日目に血漿（自己）５００μｌ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）５０μｌ、ＩＬ－２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）２．８μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地４．５ｍｌを添加した。シーディング４日目にＴ７５フラスコに移し、血漿（自己）１ｍｌ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）１００μｌ、ＩＬ－２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）５．６μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地９ｍｌを添加した。シーディング５日目に血漿（自己）２ｍｌ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）２００μｌ、ＩＬ－２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）１１．２μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地１８ｍｌを添加した。シーディング６日目にＴ１５０フラスコに移し、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）４００μｌ、ＩＬ－２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）２２．４μｌ、ＩＬ－１２（３ｎｇ／ｍｌ）１２μｌ、ＩＬ－１８（３０ｎｇ／ｍｌ）１２μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地４０ｍｌを添加した。シーディング７日目にＬ－グルタミン（２ｍＭ）５００μｌ、ＩＬ－２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）２８μｌ、ＩＬ－１２（３ｎｇ／ｍｌ）１５μｌ、ＩＬ－１８（３０ｎｇ／ｍｌ）１５μｌ、ＡＬｙＳ５０５Ｎ－０培地５０ｍｌを添加した。
【0086】
シーディング８日目に培養バックにＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍｌ）を５ｍｌ入れ、バックをマッサージした。培養バッグの１／３ポイントをクランプで固定した後、約３０ｍｌの培地を取っておいた。Ｔ１５０フラスコの細胞をスクレーパを用いて剥がした後、バックに移した。取っておいた培地を用いてフラスコを洗浄し、バックに入れた。１つの培養器チャンバーに１つのバックのみを入れて平らにした（３７℃、５％ＣＯ２）。シーディング１０日目にバックマッサージした後、バックの２／３ポイントをクランプで固定し、１／３ポイントのクランプを除去した。シーディング１２日目にバックマッサージした後、バックの２／３ポイントのクランプを除去した。シーディング１４日目にバックマッサージした後、ラッチに固定させた。細胞を収穫するチューブライン（tube line）を７０％ＥｔＯＨで拭いて、２５０ｍｌ、５０ｍｌチューブを用いて細胞を収穫した後、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液の一部を５０ｍｌチューブに入れておき、培養培地を用いて５０ｍｌチューブに細胞を集めて総体積５０ｍｌとし、２０００ＲＰＭで３分間（Ａｃｅ：４、Ｄｅｃ：３）遠心分離した。上澄み液を除去した後、培養培地１ｍｌに細胞ペレットを溶解し、セルカウントを行った。
【0087】
２．培養期間による細胞表現型の測定
（１）細胞の活性化
検体（培養期間別ＥＢＩ）を常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、細胞数を２Ｘ１０６個／ｍｌにした後、培養液５００μｌで細胞を浮遊させた。マイクロチューブ（Microtube）に培養液５００μｌを入れ、下記のように試薬を添加して活性化溶液を調製した。２４－ウェルプレートの１つのウェルに細胞浮遊液５００μｌを入れ、製造された活性化溶液５００μｌを入れた。５％ＣＯ２、３７℃の条件のＣＯ２培養器で４時間反応させた。ウェルの細胞浮遊液を１５ｍｌチューブに移して、１ＸＰＢＳ ４ｍｌを添加して洗浄した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＦＣＭ染色バッファ５ｍｌを添加して洗浄した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＦＣＭ染色バッファ２００μｌを添加して細胞を懸濁した。
（１）細胞の活性化
検体（培養期間別ＥＢＩ）を常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、細胞数を２Ｘ１０６個／ｍｌにした後、培養液５００μｌで細胞を浮遊させた。マイクロチューブ（Microtube）に培養液５００μｌを入れ、下記のように試薬を添加して活性化溶液を調製した。２４－ウェルプレートの１つのウェルに細胞浮遊液５００μｌを入れ、製造された活性化溶液５００μｌを入れた。５％ＣＯ２、３７℃の条件のＣＯ２培養器で４時間反応させた。ウェルの細胞浮遊液を１５ｍｌチューブに移して、１ＸＰＢＳ ４ｍｌを添加して洗浄した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＦＣＭ染色バッファ５ｍｌを添加して洗浄した後、４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、ＦＣＭ染色バッファ２００μｌを添加して細胞を懸濁した。
【0088】
（２）表面抗原染色
ＦＣＭチューブを検体（培養期間別ＥＢＩ）当たりに２つずつ用意し、それぞれのチューブをｉｓｏチューブ、サンプル（ｓａｍｐｌｅ）チューブという。各チューブにＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体を２μｌ入れた。各チューブに（１）の細胞懸濁液を１００μｌずつ分注した後、マイクロピペットでよく混ぜた。常温の暗所に３０分間放置して染色した。放置が終わると、各チューブにＦＣＭ染色バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブにＦＣＭ染色バッファ１００μｌを添加してペレットを懸濁させた。各チューブにＩＣ固定バッファ１００μｌを添加した後、常温の暗所で２０分以上反応させた（このとき、１時間を超えないようにする。）。
ＦＣＭチューブを検体（培養期間別ＥＢＩ）当たりに２つずつ用意し、それぞれのチューブをｉｓｏチューブ、サンプル（ｓａｍｐｌｅ）チューブという。各チューブにＣＤ４５－ＦＩＴＣ抗体を２μｌ入れた。各チューブに（１）の細胞懸濁液を１００μｌずつ分注した後、マイクロピペットでよく混ぜた。常温の暗所に３０分間放置して染色した。放置が終わると、各チューブにＦＣＭ染色バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブにＦＣＭ染色バッファ１００μｌを添加してペレットを懸濁させた。各チューブにＩＣ固定バッファ１００μｌを添加した後、常温の暗所で２０分以上反応させた（このとき、１時間を超えないようにする。）。
【0089】
（３）細胞内染色（Intracelluar straining）
１０Ｘ透過化バッファー（Permeabilization buffer）を蒸留水で１０倍希釈して１Ｘ透過化バッファーを製造した。各チューブに１Ｘ透過化バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブに１Ｘ透過化バッファー１００μｌを添加してペレットを懸濁させた。ＩｓｏチューブにはＩｓｏｔｙｐｅ抗体を、ｓａｍｐｌｅチューブにはＦＣＭ抗体を添加した。各チューブを弱く混ぜて（vortexing）、常温の暗所に３０分間放置して染色した。放置が終わると、各チューブに１Ｘ透過化バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブにＦＣＭ染色バッファ３００～４００μｌを添加してペレットを懸濁させた。測定時にはｉｓｏチューブ、ｓａｍｐｌｅチューブの順に測定した。
１０Ｘ透過化バッファー（Permeabilization buffer）を蒸留水で１０倍希釈して１Ｘ透過化バッファーを製造した。各チューブに１Ｘ透過化バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブに１Ｘ透過化バッファー１００μｌを添加してペレットを懸濁させた。ＩｓｏチューブにはＩｓｏｔｙｐｅ抗体を、ｓａｍｐｌｅチューブにはＦＣＭ抗体を添加した。各チューブを弱く混ぜて（vortexing）、常温の暗所に３０分間放置して染色した。放置が終わると、各チューブに１Ｘ透過化バッファー１ｍｌを添加した後、常温で４００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、各チューブにＦＣＭ染色バッファ３００～４００μｌを添加してペレットを懸濁させた。測定時にはｉｓｏチューブ、ｓａｍｐｌｅチューブの順に測定した。
【0090】
３．サイトカインの分析
サイトカインの分析は、ヒト・サイトカイン・アレイ（human cytokine array）（ｃａ．ＡＲＹ００５Ｂ）を用いて、１０個以上のサイトカインの量を同時に測定した。分析バッファ２ｍｌを準備した４ウェルマルチディッシュに処理し、ロッキングシェーカー（Rocking shaker）で１時間反応させた。１ｍｌのサンプルを準備した分析バッファに処理し、最終の体積を１．５ｍｌとした。１５μｌのヒトサイトカインアレイ検出抗体カクテル（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を処理して混合した後、常温で１時間反応させた。メンブレン（Membrane）を注意しながら除去し、１ｘ洗浄バッファー１ｍｌで洗浄（rinsing）した。ストレプトアビジン（Streptoavidin）－ＨＲＰを分析バッファ５ｍｌで希釈し、２ｍｌの希釈されたストレプトアビジン（streptavidin）－ＨＲＰを各ウェルに処理した。Ｘ－ｒａｙフィルムで１０分間メンブレン（membrane）を露出させ、各サイトカインの量を測定した。
サイトカインの分析は、ヒト・サイトカイン・アレイ（human cytokine array）（ｃａ．ＡＲＹ００５Ｂ）を用いて、１０個以上のサイトカインの量を同時に測定した。分析バッファ２ｍｌを準備した４ウェルマルチディッシュに処理し、ロッキングシェーカー（Rocking shaker）で１時間反応させた。１ｍｌのサンプルを準備した分析バッファに処理し、最終の体積を１．５ｍｌとした。１５μｌのヒトサイトカインアレイ検出抗体カクテル（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を処理して混合した後、常温で１時間反応させた。メンブレン（Membrane）を注意しながら除去し、１ｘ洗浄バッファー１ｍｌで洗浄（rinsing）した。ストレプトアビジン（Streptoavidin）－ＨＲＰを分析バッファ５ｍｌで希釈し、２ｍｌの希釈されたストレプトアビジン（streptavidin）－ＨＲＰを各ウェルに処理した。Ｘ－ｒａｙフィルムで１０分間メンブレン（membrane）を露出させ、各サイトカインの量を測定した。
【0091】
４．アトピー性皮膚炎オボアルブミン（ＯＶＡ）感作アトピーモデル
７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにオボアルブミン（OVA、grade V、Sigma、St．Louis、MO、USA）２０μｇと、免疫アジュバント（immunologic adjuvant）である水酸化アルミニウム（aluminum hydroxide）（Alum、Sigma）１ｍｇを生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に希釈し、週に一度２週間腹腔投与して、アトピー性皮膚炎感作を誘導した。ＯＶＡ腹腔投与から２週間後、ＯＶＡの１００μｇを除毛した背中の皮膚に１×１ｃｍのパッチ（patch）で１週間感作後２週間休息を３回繰り返して局所部位に皮膚炎を誘導した。ＯＶＡ感作２週間後からＥＢＩ（１×１０６cells／animal）と陽性対照群シクロスポリンＡ（Cyclosporin A）（ＣｓＡ、２ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射法（tail i.v. injection）で６週間注射した。
７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにオボアルブミン（OVA、grade V、Sigma、St．Louis、MO、USA）２０μｇと、免疫アジュバント（immunologic adjuvant）である水酸化アルミニウム（aluminum hydroxide）（Alum、Sigma）１ｍｇを生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に希釈し、週に一度２週間腹腔投与して、アトピー性皮膚炎感作を誘導した。ＯＶＡ腹腔投与から２週間後、ＯＶＡの１００μｇを除毛した背中の皮膚に１×１ｃｍのパッチ（patch）で１週間感作後２週間休息を３回繰り返して局所部位に皮膚炎を誘導した。ＯＶＡ感作２週間後からＥＢＩ（１×１０６cells／animal）と陽性対照群シクロスポリンＡ（Cyclosporin A）（ＣｓＡ、２ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射法（tail i.v. injection）で６週間注射した。
【0092】
ノーマル（ＮＯＲ）群とＯＶＡ群では生理食塩水（１００μｌ）を注射した。実験が終わった後、血液を採血し、背中の皮膚を摘出した（図１）。
【0093】
５．官能評価試験（皮膚病変の評価）
アトピー性皮膚炎で一般的に用いられる臨床的肉眼評価法として、アトピー性皮膚炎の重症度の程度を、下記５つの項目によってそれぞれ評価した点数の合計で表す。評価項目は、紅斑（erythema）、かゆみと皮膚乾燥（pruritus＆dry skin）、浮腫と血腫（edema＆excoriation）、ただれ（erosion）、および苔癬化（lichenification）などである。それぞれの項目について、症状がない（０点）、症状が弱い（１点）、普通（２点）、症状が激しい（３点）で採点した後、５項目の点数を合算することにより、最低０点（何の症状もない状態）から最高１５点（すべての項目の症状が激しい状態）の間で評価点数を付与する。
アトピー性皮膚炎で一般的に用いられる臨床的肉眼評価法として、アトピー性皮膚炎の重症度の程度を、下記５つの項目によってそれぞれ評価した点数の合計で表す。評価項目は、紅斑（erythema）、かゆみと皮膚乾燥（pruritus＆dry skin）、浮腫と血腫（edema＆excoriation）、ただれ（erosion）、および苔癬化（lichenification）などである。それぞれの項目について、症状がない（０点）、症状が弱い（１点）、普通（２点）、症状が激しい（３点）で採点した後、５項目の点数を合算することにより、最低０点（何の症状もない状態）から最高１５点（すべての項目の症状が激しい状態）の間で評価点数を付与する。
【0094】
皮膚の状態は、実験終了直後、デジタルカメラ（Canon、Tokyo、Japan）を用いて写真を撮って調査した。
【0095】
６．かゆみ抑制力の評価
ＥＢＩの投与がアトピー性皮膚炎による痒み抑制力に与える影響を評価するために、実験終了前日に引っ掻き傷のパターン（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ）を測定した。マウスは、個体ごとに隔離して観察し、マウスの後ろ足が背中に上がって床につけるまでの行動を１回とカウントした。また、連続動作は１回とみなし、少しでも中断後に再び掻く場合は、それぞれを回数に含めた。
ＥＢＩの投与がアトピー性皮膚炎による痒み抑制力に与える影響を評価するために、実験終了前日に引っ掻き傷のパターン（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ）を測定した。マウスは、個体ごとに隔離して観察し、マウスの後ろ足が背中に上がって床につけるまでの行動を１回とカウントした。また、連続動作は１回とみなし、少しでも中断後に再び掻く場合は、それぞれを回数に含めた。
【0096】
７．組織学的検査
１）ヘマトキシリン・エオシン染色
アレルゲンの皮膚露出によって誘導される炎症反応を確認するために、ヘマトキシリン・エオシン染色で形態学的分析を行った。実験終了後、実験動物の背中の組織を１０％中性バッファホルマリン（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｆｏｒｍａｌｉｎ（ＮＢＦ））に固定し、低濃度から高濃度のエタノール溶液で段階的な脱水過程を経た後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックを５μｍの厚さで薄切してスライドに組織切片を付けた後、各組織スライドをキシレン（xylene）で脱パラフィンを行った後、アルコールに含水させた。ヘマトキシリン試薬をスライドに１分、エオシン試薬は３分間処理して染色した。染色が終わってから脱水させて封入し、光学顕微鏡（DＭ750、Leica、Wetzlar、Germany）を用いて観察した。
１）ヘマトキシリン・エオシン染色
アレルゲンの皮膚露出によって誘導される炎症反応を確認するために、ヘマトキシリン・エオシン染色で形態学的分析を行った。実験終了後、実験動物の背中の組織を１０％中性バッファホルマリン（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｆｏｒｍａｌｉｎ（ＮＢＦ））に固定し、低濃度から高濃度のエタノール溶液で段階的な脱水過程を経た後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックを５μｍの厚さで薄切してスライドに組織切片を付けた後、各組織スライドをキシレン（xylene）で脱パラフィンを行った後、アルコールに含水させた。ヘマトキシリン試薬をスライドに１分、エオシン試薬は３分間処理して染色した。染色が終わってから脱水させて封入し、光学顕微鏡（DＭ750、Leica、Wetzlar、Germany）を用いて観察した。
【0097】
２）トルイジンブルー（Toluidine blue）染色
トルイジンブルー（Toluidine blue）染色によって採取したマウスの耳組織に脱顆粒された肥満細胞の数を測定するために、１０％ＮＢＦに組織を固定した後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックは、５μｍの厚さで切片を作り、脱パラフィン過程とアルコールへの含水過程を経て蒸留水で洗浄した。洗浄が完了した切片は、トルイジンブルー（ｐＨ０．５）で１時間染色した後、３～４回蒸留水で洗浄した。その後、脱水と透明過程を経て封入した後、光学顕微鏡（DＭ750、Leica、Wetzlar、Germany）で脱顆粒された肥満細胞の数を測定した。
トルイジンブルー（Toluidine blue）染色によって採取したマウスの耳組織に脱顆粒された肥満細胞の数を測定するために、１０％ＮＢＦに組織を固定した後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックは、５μｍの厚さで切片を作り、脱パラフィン過程とアルコールへの含水過程を経て蒸留水で洗浄した。洗浄が完了した切片は、トルイジンブルー（ｐＨ０．５）で１時間染色した後、３～４回蒸留水で洗浄した。その後、脱水と透明過程を経て封入した後、光学顕微鏡（DＭ750、Leica、Wetzlar、Germany）で脱顆粒された肥満細胞の数を測定した。
【0098】
３）免疫組織化学染色法
マウスの皮膚組織を１０％ＮＢＦに固定した後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックを５μｍの厚さで薄切してスライドに組織切片を付けた後、各組織スライドをキシレン（xylene）で脱パラフィンを行った後、アルコールに含水させた。その後、５％正常血清（normal serum）に１時間ブロッキング（blocking）した。その後、スライドを皮膚バリア改善フィラグリン（filaggrin）、ロリクリン（loricrin）、インボルクリン（involucrin）、オクルディン（occludin）、ＴＲＰＡ１、およびＰＧＰ９．５抗体でそれぞれ４℃でオーバーナイト（overnight）処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体であるビオチンラビット抗－ヤギ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ）ＩｇＧ（1：100、Santa Cruz Biotec）に室温で２４時間反応させ、アビジン－ビオチン複合キット（ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｔ（Vector Lab、USA））に室温で１時間反応させた。０．０５％３，３'－ジアミノベンジジン（3,3'- diaminobenzidine）と０．０１％ＨＣｌを含む０．０５Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）で発色させた後、ヘマトキシリンで対照染色した。Ａｎｔｉ－ＴＲＰＡ１とａｎｔｉ－ＰＧＰ９．５は、ＦＩＴＣが結合された２次抗体と共に１時間処理した。蛍光画像は、共焦点顕微鏡（Confocal microscopy）（LSM700、ZEISS、Jena、Germany）を用いて得た。
マウスの皮膚組織を１０％ＮＢＦに固定した後、パラフィンブロックを作成した。各組織ブロックを５μｍの厚さで薄切してスライドに組織切片を付けた後、各組織スライドをキシレン（xylene）で脱パラフィンを行った後、アルコールに含水させた。その後、５％正常血清（normal serum）に１時間ブロッキング（blocking）した。その後、スライドを皮膚バリア改善フィラグリン（filaggrin）、ロリクリン（loricrin）、インボルクリン（involucrin）、オクルディン（occludin）、ＴＲＰＡ１、およびＰＧＰ９．５抗体でそれぞれ４℃でオーバーナイト（overnight）処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体であるビオチンラビット抗－ヤギ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ）ＩｇＧ（1：100、Santa Cruz Biotec）に室温で２４時間反応させ、アビジン－ビオチン複合キット（ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｔ（Vector Lab、USA））に室温で１時間反応させた。０．０５％３，３'－ジアミノベンジジン（3,3'- diaminobenzidine）と０．０１％ＨＣｌを含む０．０５Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）で発色させた後、ヘマトキシリンで対照染色した。Ａｎｔｉ－ＴＲＰＡ１とａｎｔｉ－ＰＧＰ９．５は、ＦＩＴＣが結合された２次抗体と共に１時間処理した。蛍光画像は、共焦点顕微鏡（Confocal microscopy）（LSM700、ZEISS、Jena、Germany）を用いて得た。
【0099】
８．血中の総ＩｇＥの測定
採血したマウスの血液１．５ｍＬをチューブに入れて４℃、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液は、測定前まで－７０℃で保管した。血中ＩｇＥは、酵素結合免疫吸着法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay、ELISA）を用いて測定した。マウスＩｇＥイライザセット（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（BD Biosciences、San Jose、CA、USA））を用いて、各試料を１次抗体が処理された９６ウェルプレートに入れた後、使用液（working solution）で４回洗浄した。洗浄後、２次抗体であるＨＲＰ－共役ヤギ抗マウスＩｇＥ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ）（１：１０，０００）に１時間処理した後、発色試薬（color development reagent）で発色した。発色完了後、停止液（stop solution）で反応を停止させた後、ＥＬＩＳＡを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
採血したマウスの血液１．５ｍＬをチューブに入れて４℃、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液は、測定前まで－７０℃で保管した。血中ＩｇＥは、酵素結合免疫吸着法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay、ELISA）を用いて測定した。マウスＩｇＥイライザセット（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（BD Biosciences、San Jose、CA、USA））を用いて、各試料を１次抗体が処理された９６ウェルプレートに入れた後、使用液（working solution）で４回洗浄した。洗浄後、２次抗体であるＨＲＰ－共役ヤギ抗マウスＩｇＥ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ）（１：１０，０００）に１時間処理した後、発色試薬（color development reagent）で発色した。発色完了後、停止液（stop solution）で反応を停止させた後、ＥＬＩＳＡを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【0100】
９．ＥＬＩＳＡ
血清およびリンパ内サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ２）の分析のために、分離された血清及びリンパにおいて、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｑ－Ｐｌｅｘ（商標） マウス・サイトカイン・アレイ（DonginBio、Seoul、Korea）を用いて、各サイトカインの含有量を分析した。プレート（plate）にキャプチャー（capture）抗体をコーティングバッファー（0.1M sodium Carbonate、PH9.5）に希釈させ、シールテープで密封し、４℃で一晩付着させた。２００μｌの検体希釈液（assay diluent）を各ウェルに分注し、プレートシェーカー（plate shaker）で１時間ブロッキングし、濃度別のサイトカイン標準液と血清を各ウェルに１００μｌずつ分注し、さらに室温で２時間反応させた。反応が終わってから、検出抗体溶液を１００μｌずつ分注して１時間、その後、アビジン－ＨＲＰ溶液（Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を３０分間反応させた。最後の洗浄過程を除く各ステップ間のすべてのプレートの洗浄は、洗浄緩衝液（wash buffer）（0.05%PBS－Tween 20）を用いて４回行った。最後の洗浄は、洗浄緩衝液（wash buffer）を用いて５回行い、洗浄が終わってから発色のために１００μｌのＴＭＢ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を各ウェルに分注し、２０分間反応させた。停止液（stop solution）（2NH2SO4）を１００μｌ分注して反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（microplate reader）を用いて、４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した値から、各サイトカインの含有量を分析した。
血清およびリンパ内サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ２）の分析のために、分離された血清及びリンパにおいて、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｑ－Ｐｌｅｘ（商標） マウス・サイトカイン・アレイ（DonginBio、Seoul、Korea）を用いて、各サイトカインの含有量を分析した。プレート（plate）にキャプチャー（capture）抗体をコーティングバッファー（0.1M sodium Carbonate、PH9.5）に希釈させ、シールテープで密封し、４℃で一晩付着させた。２００μｌの検体希釈液（assay diluent）を各ウェルに分注し、プレートシェーカー（plate shaker）で１時間ブロッキングし、濃度別のサイトカイン標準液と血清を各ウェルに１００μｌずつ分注し、さらに室温で２時間反応させた。反応が終わってから、検出抗体溶液を１００μｌずつ分注して１時間、その後、アビジン－ＨＲＰ溶液（Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を３０分間反応させた。最後の洗浄過程を除く各ステップ間のすべてのプレートの洗浄は、洗浄緩衝液（wash buffer）（0.05%PBS－Tween 20）を用いて４回行った。最後の洗浄は、洗浄緩衝液（wash buffer）を用いて５回行い、洗浄が終わってから発色のために１００μｌのＴＭＢ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を各ウェルに分注し、２０分間反応させた。停止液（stop solution）（2NH2SO4）を１００μｌ分注して反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（microplate reader）を用いて、４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した値から、各サイトカインの含有量を分析した。
【0101】
血清は１／２に希釈させた。リンパは上澄み液を収集し、マルチプレックス・アレイ（multiplex array）を製造業者の指示に従って行った。５０μｌの抗原標準またはサンプルを二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で各ウェルに分注した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液（wash buffer）で洗浄し、検出混合物（detection mix）と共に１時間培養し、ストレプトアビジン（straptavidin）－ＨＲＰ １Ｘで１５分間室温で反応させた。ウェルを洗浄した後に基質ＡとＢを添加し、プレートの画像をＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（Bio－Rad Laboratories）で測定し、Ｑｕａｎｓｙｓ画像解析ソフトウェアで分析した。サイトカインデータを標準化するために、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光測定器（LifeTechnologies）上のＱｕｂｉｔ（登録商標）タンパク質分析キットを用いてタンパク質濃度を決定し、サイトカインのレベルを総タンパク質のｐｇ／ｍｌで示した。
【0102】
１０．ＲＮＡ抽出及びリアルタイム（Real－time）ＰＣＲ
アトピー性皮膚炎に関与するサイトカインの遺伝子発現の変化をリアルタイム（real－time）ＰＣＲを用いて比較分析した。総ＲＮＡは、Ｔｒｉ－ＲＮＡ試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）（Favorgen biotech、Taiwan）を用いて、分離された皮膚組織および培養された細胞から抽出した。全ＲＮＡ鋳型から一本鎖ｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Takara、Tokyo、Japan）で行った。生成されたｃＤＮＡをＣＦＸ－９６（Bio－Rad、Hercules、CA、USA）と共にｑＰＣＲ ２ｘ ＰｒｅＭＩＸ ＳＹＢＲ（Enzynomics、Seoul、Korea）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すべての遺伝子を増幅するのに使用されたＰＣＲは、９５℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程を経た後、４０サイクル（９５℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒）の条件下で行った。合計４０回行った。発現データは、ΔＣｔ定量化方法を用いてサイクル臨界値（Ｃｔ）で計算した。ＧＡＰＤＨを用いて定量化した。
アトピー性皮膚炎に関与するサイトカインの遺伝子発現の変化をリアルタイム（real－time）ＰＣＲを用いて比較分析した。総ＲＮＡは、Ｔｒｉ－ＲＮＡ試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）（Favorgen biotech、Taiwan）を用いて、分離された皮膚組織および培養された細胞から抽出した。全ＲＮＡ鋳型から一本鎖ｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Takara、Tokyo、Japan）で行った。生成されたｃＤＮＡをＣＦＸ－９６（Bio－Rad、Hercules、CA、USA）と共にｑＰＣＲ ２ｘ ＰｒｅＭＩＸ ＳＹＢＲ（Enzynomics、Seoul、Korea）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すべての遺伝子を増幅するのに使用されたＰＣＲは、９５℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程を経た後、４０サイクル（９５℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒）の条件下で行った。合計４０回行った。発現データは、ΔＣｔ定量化方法を用いてサイクル臨界値（Ｃｔ）で計算した。ＧＡＰＤＨを用いて定量化した。
【0103】
１１．免疫ブロット分析（Immunoblot assay）
分離された皮膚組織をＰＲＯ－ＰＲＥＰ（iNtRON、Seongnam、Korea）に溶解させた後、１４,０００ｇで２０分間遠心分離して得られた上澄み液を実験に使用した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡキット（Fisher Scientific、hampton、NH、USA）を用いて定量した。分離された上澄み液（総タンパク質量３０μｇ）を８～１２％ｇｅｌ ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて電気泳動で分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレイン（Millipore、Danvers、MA、USA）にトランスファー（transfer）した。トランスファーしたＰＶＤＦメンブレイン（membrane）を５％脱脂粉乳に１時間ブロッキング（blocking）した後、１次抗体（filaggrin、loricrin、involucrin、PAR2、TSLP、TSLPR、TRPA1、β－actin）をメンブレインと４℃で１２時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄した後、１次抗体に対する特異的な２次抗体を室温で１時間反応させた。メンブレインを洗浄した後、ＥＣＬ溶液（Millipore）で発色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標） ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Bio－RAD、Hercules、CA、USA）を用いて測定した。
分離された皮膚組織をＰＲＯ－ＰＲＥＰ（iNtRON、Seongnam、Korea）に溶解させた後、１４,０００ｇで２０分間遠心分離して得られた上澄み液を実験に使用した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡキット（Fisher Scientific、hampton、NH、USA）を用いて定量した。分離された上澄み液（総タンパク質量３０μｇ）を８～１２％ｇｅｌ ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて電気泳動で分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレイン（Millipore、Danvers、MA、USA）にトランスファー（transfer）した。トランスファーしたＰＶＤＦメンブレイン（membrane）を５％脱脂粉乳に１時間ブロッキング（blocking）した後、１次抗体（filaggrin、loricrin、involucrin、PAR2、TSLP、TSLPR、TRPA1、β－actin）をメンブレインと４℃で１２時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄した後、１次抗体に対する特異的な２次抗体を室温で１時間反応させた。メンブレインを洗浄した後、ＥＣＬ溶液（Millipore）で発色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標） ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Bio－RAD、Hercules、CA、USA）を用いて測定した。
【0104】
１２．統計解析
実験の結果は、ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｍｅａｎ（ＳＥＭ）で示した。有意性の検定は、一元配置分散分析（One way analysis of variance、ANOVA）で行い、集団間の事後検定は、Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ ＨＤＳ法を用い、Ｐの値が０．０５以下であるものを統計学的に有意なものとみなした。
実験の結果は、ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｍｅａｎ（ＳＥＭ）で示した。有意性の検定は、一元配置分散分析（One way analysis of variance、ANOVA）で行い、集団間の事後検定は、Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ ＨＤＳ法を用い、Ｐの値が０．０５以下であるものを統計学的に有意なものとみなした。
【0105】
実験の結果
１．培養期間による細胞表現型の評価
実施例による細胞組成物の細胞表現型を確認するために、各培養期間別の細胞のサンプルを一部採取して表現型を分析し、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用した。
その結果を図２及び図３に示す。
１．培養期間による細胞表現型の評価
実施例による細胞組成物の細胞表現型を確認するために、各培養期間別の細胞のサンプルを一部採取して表現型を分析し、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ抗体を使用した。
その結果を図２及び図３に示す。
【0106】
インターフェロン－ガンマを発現する細胞（IFN－γ（+）cell、IFN－γreleasing cell）の割合は、下記表１に示す。
【0107】
【表1】
【0108】
ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（ＮＫＧ２Ｄ（+）cell）の割合は、下記表２に示す。
【0109】
【表2】
【0110】
ＮＫＧ２Ａを発現する細胞（ＮＫＧ２Ａ（+）cell）の割合は、下記表３に示す。
【0111】
【表3】
【0112】
ＩＬ－４を発現する細胞（ＩＬ－４（+）cell）の割合は、下記表４に示す。
【0113】
【表4】
【0114】
ＩＬ－１３を発現する細胞（ＩＬ－１３（+）cell）の割合は、下記表５に示す。
【0115】
【表5】
【0116】
表１～表５を参照すると、ＥＢＩはインターフェロン－ガンマ及びＮＫＧ２Ｄを発現する細胞の割合が非常に高く、ＩＬ－４およびＩＬ－１３を発現する細胞の割合が低いので、アトピー性皮膚炎の予防および治療に効果的であることが分かる。
【0117】
２．インターフェロン－ガンマ生産量の測定
図４及び下記表６は、培養期間による細胞外インターフェロン－ガンマ分泌蓄積量を測定したものである。培養期間によって分泌量が増加することが分かる。
図４及び下記表６は、培養期間による細胞外インターフェロン－ガンマ分泌蓄積量を測定したものである。培養期間によって分泌量が増加することが分かる。
【0118】
【表6】
【0119】
３．サイトカインの分析
本発明の細胞組成物の培養期間別に分泌する特定の活性因子の分泌量の変化を測定した（図５）。
本発明の細胞組成物の培養期間別に分泌する特定の活性因子の分泌量の変化を測定した（図５）。
【0120】
免疫細胞の移動および活性に関与する様々な免疫因子の数値が１０００倍以上増加し、７日以後にＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ１８の分泌が急激に増加することが確認できた。これは、本発明の細胞組成物は、免疫活性細胞分泌因子の分泌の増加によって、アトピー性皮膚炎で一般的に知られている過剰活性化されたＴｈ２細胞（免疫抑制を担当）を抑制できる環境を誘導することができ、アトピー性皮膚炎に薬効があるものと判断された。
【0121】
４．ＲＮＡシークエンシング（sequencing）
アトピー免疫細胞活性の３日目、７日目、１４日目に６つの遺伝子（Ｋｓｐ３７、ＧＬＮＹ、ＣＤ７４、ＨＣＳＴ、ＺＢＰ１、ＣＣＬ５）に対して日付別の発現量を確認した（図６及び７）。
アトピー免疫細胞活性の３日目、７日目、１４日目に６つの遺伝子（Ｋｓｐ３７、ＧＬＮＹ、ＣＤ７４、ＨＣＳＴ、ＺＢＰ１、ＣＣＬ５）に対して日付別の発現量を確認した（図６及び７）。
【0122】
特に、ＧＬＮＹはＥＢＩで１４日目に６０倍以上増加したことが分かった。ＥＢＩは、前記遺伝子を過剰発現することで免疫活性を誘導し、アトピー性皮膚炎を改善することができる。
【0123】
表７及び表８は、それぞれＫｓｐ３７、ＧＬＮＹ、ＣＤ７４の日付別の発現量に対するＲＮＡシークエンシング及びリアルタイムＰＣＲの結果である。
【0124】
表９及び表１０は、それぞれＨＣＳＴ、ＺＢＰ１、ＣＣＬ５の日付別の発現量に対するＲＮＡシークエンシング及びｑＰＣＲの結果である。
【0125】
【表7】
【0126】
【表8】
【0127】
【表9】
【0128】
【表10】
【0129】
５．オボアルブミン（ＯＶＡ）で誘導されたアトピー性皮膚炎の改善に対するＥＢＩの効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスを対象とし、ＯＶＡ皮膚感作でアトピー性皮膚炎の類似病変が誘発されたマウスにＥＢＩ（１ｘ１０６cells／head）を６週間静脈注射し、アトピー性皮膚炎の改善に対する効果を確認した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを対象とし、ＯＶＡ皮膚感作でアトピー性皮膚炎の類似病変が誘発されたマウスにＥＢＩ（１ｘ１０６cells／head）を６週間静脈注射し、アトピー性皮膚炎の改善に対する効果を確認した。
【0130】
図８に示すように、ＥＢＩ投与群では、皮膚病変の形態、皮膚の厚さなど、アトピー性皮膚炎の臨床的特徴が改善される優れた効果を示した。
【0131】
正常マウスに比べてＯＶＡで誘発された対照群の場合には、皮膚バリアの崩壊および炎症を伴う皮膚学的症状（乾燥、紅斑、ただれ、浮腫／血腫、苔癬）と表皮の厚さが深刻化したのに対し、ＥＢＩを投与した実験群では、症状が改善される効果を示した（図８Ａ～８Ｄ）。この評価後、皮膚組織学的な改善効果を調べるために、Ｈ＆Ｅで皮膚組織を染色して顕微鏡で検鏡した結果、ＯＶＡで誘発された対照群は正常群に比べて表皮の厚さと皮膚バリアの崩壊が非常に増加した。表皮（epidermis）と真皮（dermis）が浮腫で顕著に拡張し、表皮の脱落と厚さの増加を確認することができた。これに対して、ＥＢＩ投与群では、対照群に比べて皮膚組織学的な特徴が改善される効果を示した。過角化症（hyperkeratosis）、異常角化症（parakeratosis）は全体的に減少し、表皮（epidermis）の厚さも減少したことにより、表皮過剰形成（hyperplasia）および表皮海綿化（spongiosis）も減少した。また、炎症性反応によって厚くなった真皮（dermis）の厚さも薄くなり、退化した毛包も新たに形成されていることが分かった（図８Ａ、８Ｂ）。
【0132】
また、ＥＢＩ投与群では、対照群に比べてアトピー性皮膚炎の重症度の程度（AD severity score）が改善され（図８Ｃ）、掻く行動が相対的に減少してそう痒感が顕著に減少した（図８Ｄ）。体重の変化を測定して動物への影響を観察した結果、ＥＢＩの投与はマウスの体重に影響を与えなかった（図８Ｅ）。
【0133】
６．オボアルブミン（ＯＶＡ）で誘導されたアトピー性皮膚炎の皮膚バリアの改善に対するＥＢＩの効果
表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）がＥＢＩの投与によって非常に改善されることを確認した（図９Ａ）。また、表皮細胞の過剰増殖の変化を調べるために、ケラチン１（Ｋ１）遺伝子の発現の変化を測定した結果、ＥＢＩが投与されたマウスで明らかな減少を示した（図９Ｂ）。つまり、ＥＢＩがＯＶＡ誘導によるアトピー類似病変において、表皮細胞の増殖能を抑制させる効果を持っていることを示す。そして、皮膚バリアの改善効果を測定するために、皮膚バリアを構成しているタンパク質の変化を観察した。アトピー性皮膚炎が発生すると、皮膚バリアを構成するタンパク質の発現が減少し、最終的にはバリアの損傷が発生し、水分損失と抗原（allergen）による浸透、感染のリスクが増加することになる。フィラグリン（Filaggrin）、インボルクリン（involucrin）、ロリクリン（loricrin）は皮膚表皮層を構成している主要なタンパク質であり、皮膚バリアの改善において重要なものである。また、オクルディン（occludin）は、タイトジャンクション（tight junction）タンパク質の一つであり、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患で減少することになる。ＥＢＩの投与により、ＯＶＡで誘発されたアトピー性皮膚炎の類似病変が改善され、これらのタンパク質の発現が増加したことを確認した（図９Ｂ～９Ｄ）。ＥＢＩの投与は、ＣｓＡの投与とともに乾燥症状を改善させ、皮膚バリアを保護することにより、効果的にアトピー性皮膚炎の症状を緩和させるものと考えられる。
表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）がＥＢＩの投与によって非常に改善されることを確認した（図９Ａ）。また、表皮細胞の過剰増殖の変化を調べるために、ケラチン１（Ｋ１）遺伝子の発現の変化を測定した結果、ＥＢＩが投与されたマウスで明らかな減少を示した（図９Ｂ）。つまり、ＥＢＩがＯＶＡ誘導によるアトピー類似病変において、表皮細胞の増殖能を抑制させる効果を持っていることを示す。そして、皮膚バリアの改善効果を測定するために、皮膚バリアを構成しているタンパク質の変化を観察した。アトピー性皮膚炎が発生すると、皮膚バリアを構成するタンパク質の発現が減少し、最終的にはバリアの損傷が発生し、水分損失と抗原（allergen）による浸透、感染のリスクが増加することになる。フィラグリン（Filaggrin）、インボルクリン（involucrin）、ロリクリン（loricrin）は皮膚表皮層を構成している主要なタンパク質であり、皮膚バリアの改善において重要なものである。また、オクルディン（occludin）は、タイトジャンクション（tight junction）タンパク質の一つであり、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患で減少することになる。ＥＢＩの投与により、ＯＶＡで誘発されたアトピー性皮膚炎の類似病変が改善され、これらのタンパク質の発現が増加したことを確認した（図９Ｂ～９Ｄ）。ＥＢＩの投与は、ＣｓＡの投与とともに乾燥症状を改善させ、皮膚バリアを保護することにより、効果的にアトピー性皮膚炎の症状を緩和させるものと考えられる。
【0134】
７．オボアルブミン（ＯＶＡ）で誘導された炎症反応の抑制に対するＥＢＩの効果
トルイジンブルー（Toluidine blue）染色により、肥満細胞（mast cell）などの炎症反応に関わる現象を、組織の青黒い部分から確認することができた（図１０Ａ）。ＯＶＡ誘導後、７週目（４９日）の組織を確認した結果、ＯＶＡ群で真皮（dermis）周辺に肥満細胞が多く浸潤しており、表皮（epidermis）の厚さも厚くなっているのに対して、ＥＢＩ投与群では、対照群に比べて肥満細胞の浸潤が減少していることが観察された（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
トルイジンブルー（Toluidine blue）染色により、肥満細胞（mast cell）などの炎症反応に関わる現象を、組織の青黒い部分から確認することができた（図１０Ａ）。ＯＶＡ誘導後、７週目（４９日）の組織を確認した結果、ＯＶＡ群で真皮（dermis）周辺に肥満細胞が多く浸潤しており、表皮（epidermis）の厚さも厚くなっているのに対して、ＥＢＩ投与群では、対照群に比べて肥満細胞の浸潤が減少していることが観察された（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
【0135】
また、ＯＶＡ誘導アトピー性皮膚炎モデルにおけるＯＶＡ感作群の血清総ＩｇＥ濃度（６４７．５ｎｇ／ｍＬ）は、正常対照群（ＮＯＲ、２２０．０ｎｇ／ｍＬ）に比べて大幅に増加した。このＩｇＥの増加は、ＣｓＡとＥＢＩの投与により、それぞれ３２８．０ｎｇ／ｍＬと３２０．５ｎｇ／ｍＬのレベルに有意に減少し、有意な効果を示した（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。
【0136】
８．オボアルブミン（ＯＶＡ）で誘導されたサイトカイン発現抑制に対するＥＢＩの効果
ＥＢＩ－Ｍのアレルギー皮膚反応及びＩｇＥ抑制効果がＴｈ２免疫反応と関連があるかを確認するために、ＯＶＡに感作されたマウスから皮膚組織を分離し、Ｔｈ２サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを確認した。実験の結果、ＮＯＲ群に比べてＯＶＡ処理群では、Ｔｈ２分化誘導サイトカインＴＳＬＰ、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、Ｔｈ２及びＴｈ１７関連のサイトカインの発現が顕著に増加した。これに対して、ＣｓＡ及びＥＢＩ投与マウスでは、ＩＬ－４が４６．８％、ＩＬ－１３が４７．３％、ＴＳＬＰが５３．１％、ＩＬ－３３が４９．２％減少するなど、有意に抑制された。陽性対照群であるＣｓＡ処理群もそれぞれ３３．６、３５．４、４５．８、５７．９％減少し、Ｔｈ２サイトカインを抑制することを示した（図１１Ａ）。また、血清およびリンパに存在する炎症性サイトカインの分析の結果、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＩＬ－６、およびＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）がＥＢＩ投与によって非常に減少した（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。したがって、ＥＢＩはＴｈ２細胞に関連するサイトカインの発現を抑制させ、肥満細胞の浸潤およびＩｇＥの生成抑制などによってアトピー性皮膚炎の症状を緩和させるものと考えられる。
ＥＢＩ－Ｍのアレルギー皮膚反応及びＩｇＥ抑制効果がＴｈ２免疫反応と関連があるかを確認するために、ＯＶＡに感作されたマウスから皮膚組織を分離し、Ｔｈ２サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを確認した。実験の結果、ＮＯＲ群に比べてＯＶＡ処理群では、Ｔｈ２分化誘導サイトカインＴＳＬＰ、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、Ｔｈ２及びＴｈ１７関連のサイトカインの発現が顕著に増加した。これに対して、ＣｓＡ及びＥＢＩ投与マウスでは、ＩＬ－４が４６．８％、ＩＬ－１３が４７．３％、ＴＳＬＰが５３．１％、ＩＬ－３３が４９．２％減少するなど、有意に抑制された。陽性対照群であるＣｓＡ処理群もそれぞれ３３．６、３５．４、４５．８、５７．９％減少し、Ｔｈ２サイトカインを抑制することを示した（図１１Ａ）。また、血清およびリンパに存在する炎症性サイトカインの分析の結果、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＩＬ－６、およびＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）がＥＢＩ投与によって非常に減少した（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。したがって、ＥＢＩはＴｈ２細胞に関連するサイトカインの発現を抑制させ、肥満細胞の浸潤およびＩｇＥの生成抑制などによってアトピー性皮膚炎の症状を緩和させるものと考えられる。
【0137】
９．オボアルブミン（ＯＶＡ）による掻痒症の改善に対するＥＢＩの効果
ＯＶＡで誘発させたアトピー性皮膚炎の類似病変皮膚において、掻痒症の改善に与えるＥＢＩの効果を観察するために、掻痒症に関与すると知られている様々なサイトカインおよび因子の発現を調べた。ＥＢＩを投与したマウスでは、ＩＬ－３１シグナリング（signaling）に関連する遺伝子の発現が減少することを確認できる（図１２Ａ）。また、かゆみの刺激は、ヒスタミン－依存性経路とヒスタミン－非依存性経路の２つに分けられるが、ＥＢＩ投与の結果として、Ｈ１Ｒ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＴＧＦ５、ＮＫ１Ｒ、ＭｒｇｐＡ３、およびＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲなどのかゆみ刺激シグナリングに関連する遺伝子の発現が顕著に減少することを確認した（図１２Ａ）。この結果は、タンパク質の発現レベルからも確認された（図１２Ｂ）。
ＯＶＡで誘発させたアトピー性皮膚炎の類似病変皮膚において、掻痒症の改善に与えるＥＢＩの効果を観察するために、掻痒症に関与すると知られている様々なサイトカインおよび因子の発現を調べた。ＥＢＩを投与したマウスでは、ＩＬ－３１シグナリング（signaling）に関連する遺伝子の発現が減少することを確認できる（図１２Ａ）。また、かゆみの刺激は、ヒスタミン－依存性経路とヒスタミン－非依存性経路の２つに分けられるが、ＥＢＩ投与の結果として、Ｈ１Ｒ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＴＧＦ５、ＮＫ１Ｒ、ＭｒｇｐＡ３、およびＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲなどのかゆみ刺激シグナリングに関連する遺伝子の発現が顕著に減少することを確認した（図１２Ａ）。この結果は、タンパク質の発現レベルからも確認された（図１２Ｂ）。
【0138】
ＴＳＬＰもまた、アトピー性皮膚炎に関連するかゆみ媒介体であり、ヒスタミン－非依存性経路によってかゆみが誘発される。ＴＳＬＰは、ｃ神経線維にカルシウムを蓄積するが、このとき、ＴＲＰＡ１の活性化が求められ、神経の活性化はかゆみを誘発する。ＥＢＩの投与は、このような皮膚表皮内の神経線維にＴＲＰＡ１の発現を減少させることにより、そう痒感を減少させていることを確認した（図１２Ｃ）。また、ＴＲＰＡ１免疫反応神経細胞数の減少と一致するように、皮膚でＰＧＰ９．５に免疫反応を示す神経線維の分布が対照群に比べてＥＢＩ投与群で顕著に減少した（図１２Ｃ）。
【0139】
１０．ＰＢＭＣ投与群とＥＢＩ投与群との比較
ＯＶＡ誘導アトピー性皮膚炎モデルを対象とし、ＥＢＩの場合には、細胞数１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回静脈投与した。Ｓ．Ｃグループの場合には、１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回皮下投与した。ＰＢＭＣの場合には、１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回静脈投与した。
ＯＶＡ誘導アトピー性皮膚炎モデルを対象とし、ＥＢＩの場合には、細胞数１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回静脈投与した。Ｓ．Ｃグループの場合には、１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回皮下投与した。ＰＢＭＣの場合には、１ｘ１０６／ｈｅａｄを週１回、合計６回静脈投与した。
【0140】
（１）アトピー性皮膚炎の改善効果の確認
その結果は図１３に示す。
インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ群では、皮膚改善の効果が優れることが分かる。
その結果は図１３に示す。
インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ群では、皮膚改善の効果が優れることが分かる。
【0141】
（２）細胞組成物の投与による体重変化の確認
その結果は図１４に示す。すべての実験群において、目につく体重変化はなかった。
その結果は図１４に示す。すべての実験群において、目につく体重変化はなかった。
【0142】
（３）細胞組成物の投与による経皮厚さの減少効果の確認
その結果は図１５及び１６に示す。ＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ群では、すべての投与経路において経皮の厚さが減少した。
その結果は図１５及び１６に示す。ＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ群では、すべての投与経路において経皮の厚さが減少した。
【0143】
（４）炎症反応の減少効果の確認
その結果は図１７及び１８に示す。インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄ発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路において肥満細胞が減少し、炎症反応が減少した。
その結果は図１７及び１８に示す。インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄ発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路において肥満細胞が減少し、炎症反応が減少した。
【0144】
（５）血液中のＩｇＥの減少の確認
その結果は図１９に示す通りである。インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ投与群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路においてＩｇＥが減少した。
その結果は図１９に示す通りである。インターフェロン－ガンマを分泌しないＰＢＭＣ投与群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄの発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路においてＩｇＥが減少した。
【0145】
（６）皮膚組織内アトピー性皮膚炎に関連するサイトカイン及びかゆみ（itching）に関連する遺伝子の発現の分析
ＰＢＭＣ投与群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄ発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路において炎症性サイトカイン及びかゆみに関連する遺伝子の発現が減少し、１ｘ１０６個の細胞を含むＥＢＩ投与群で最も効果的であることが分かる（図２０）。また、インターフェロン－ガンマは、リンパ節内で高い分泌量を示した（図２１）。
ＰＢＭＣ投与群と比較して、インターフェロン－ガンマおよびＮＫＧ２Ｄ発現率が高いＥＢＩ投与群では、すべての投与経路において炎症性サイトカイン及びかゆみに関連する遺伝子の発現が減少し、１ｘ１０６個の細胞を含むＥＢＩ投与群で最も効果的であることが分かる（図２０）。また、インターフェロン－ガンマは、リンパ節内で高い分泌量を示した（図２１）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【国際調査報告】