特表 2022-525937 ＢＴＮ２に対する特異性を有する抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-20

(54)【発明の名称】ＢＴＮ２に対する特異性を有する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220513BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220513BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220513BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220513BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220513BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220513BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220513BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220513BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220513BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220513BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220513BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P31/00

A61K39/395 N

A61P43/00 105

C07K16/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021556522

(86)(22)【出願日】2020-03-20

(85)【翻訳文提出日】2021-11-02

(86)【国際出願番号】 EP2020057794

(87)【国際公開番号】W WO2020188086

(87)【国際公開日】2020-09-24

(31)【優先権主張番号】19305345.1

(32)【優先日】2019-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19219691.3

(32)【優先日】2019-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520098187

【氏名又は名称】イムチェック セラピューティクス エスエーエス

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＣＨＥＣＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＳＡＳ

(71)【出願人】

【識別番号】511074305

【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）

(71)【出願人】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(71)【出願人】

【識別番号】520098202

【氏名又は名称】インスティテュート ジャン パオリ アンド イレーヌ カルメット

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＪＥＡＮ ＰＡＯＬＩ ＆ ＩＲＥＮＥ ＣＡＬＭＥＴＴＥＳ

(71)【出願人】

【識別番号】515267792

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ エクス－マルセイユ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ

【住所又は居所原語表記】５８ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｏｎ Ｆ－１３２８４ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ ０７ Ｆｒａｎｃｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】フーシェ， エティエンヌ

(72)【発明者】

【氏名】カノ， カルラ

(72)【発明者】

【氏名】ル， キュー スオン

(72)【発明者】

【氏名】パセロ， クリスティーヌ

(72)【発明者】

【氏名】オリーヴ， ダニエル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC15

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ＢＴＮ２Ａに対する特異性を有する抗体、及び特に、がんの処置のためのその使用に関する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の機能：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する機能、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する機能、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の活性化を、直接誘発する機能、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する機能
のうちの少なくとも１つを有することにおいて特徴づけられる抗ブチロフィリン２Ａ（ＢＴＮ２Ａ）抗体。

【請求項2】

ＢＴＮ２Ａ１への結合について、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３、又は
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５
と競合する、請求項１に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項3】

配列番号１７の６５、６８、６９、７２、７８、８４、８５、９５、９７、及び１００位に位置する残基を含むエピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項4】

配列番号１７の２１２、２１３、２１８、２２０、２２４、及び２２９位に位置する残基を含むエピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項5】

ヒトＢＴＮ３アイソフォームと交差反応しない、及び／又はカニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログと交差反応する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項6】

配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３、又は
配列番号２１を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２２を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号２３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号２４を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２５を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項7】

配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項8】

以下の機能：
ｉ．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子の分泌を活性化させる機能、
ｉｉ．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる機能、及び／又は
ｉｉｉ．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる機能
のうちの少なくとも１つをさらに有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項9】

ＢＴＮ２Ａ１への結合について、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照マウス抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と競合する、請求項８に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項10】

配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３、又は
配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項８又は９に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項11】

ヒトＢＴＮ２Ａ１アイソフォームに対する特異性をさらに有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項12】

ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項13】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項15】

治療における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項16】

がん又は感染性疾患の処置における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体。

【請求項17】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ２Ａ抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＢＴＮ２Ａ１に結合し、マクロファージ集団を、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへとシフトさせ、ＮＫ細胞を直接活性化させるほか、がん細胞に対する細胞傷害作用を有する抗ＢＴＮ２Ａ１活性化抗体に関する。代替的に、又は組合せにおいて、前記抗体は、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を活性化させうる。このような抗体は、がんの処置に、特に、有用である。

【背景技術】

【0002】

マクロファージは、古典的な活性化Ｍ１型から、代替的なＭ２型の範囲にわたる、可変的な表現型を呈する。ＬＰＳ（多糖）など、細菌性由来の生成物のほか、ＩＦＮγなど、感染症と関連するシグナルにより活性化されるＭ１マクロファージは、遊走の後、単球から急速に分化する。Ｍ１マクロファージは、高度に食作用性で殺菌性の潜在力を伴い、高度に炎症性である。Ｍ１マクロファージは、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、及びＩＬ－１２など、重要な炎症促進性サイトカインのほか、反応性の酸素分子種を分泌する。これに対し、Ｍ２マクロファージは、顆粒化組織形成を生じる、治癒過程の後期に存在し、炎症応答をアンタゴナイズするので、治癒の開始を可能とする。これらの抗炎症性細胞は、線維芽細胞を動員し、血管新生促進性因子を放出して、内皮前駆細胞を動員し、筋線維芽細胞へと分化するようにそれらを活性化させ、新たな血管形成を可能とする。これは、鍵となる抗炎症性サイトカインであるＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３の分泌を介して生じ、また、ＲＯＳ、一酸化窒素（ＮＯ）、及びＴＮＦαの産生の減少とも関連する過程である。

【0003】

腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、とりわけ、がん処置から復帰する腫瘍の場合、マクロファージをＭ２様表現型へと強く分極させる。この分極は、高度に血管新生促進性であるだけでなく、また、免疫抑制性でもある。したがって、大半の固形がんでは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）による浸潤の増大は、かなり前から、患者の予後不良と関連付けられており、がんにおける潜在的な診断的バイオマーカー及び予後診断的バイオマーカーとしての、それらの価値を強調する。

【0004】

したがって、Ｍ２マクロファージの再プログラム化及び選択的殺滅は、有望な治療戦略として示唆されている（Ｚｈｕ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１４）。

【0005】

さらに、自然免疫細胞として、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がんに対する免疫による監視において、枢要的機能を果たす。ＮＫ細胞は、様々な異常細胞又はストレス細胞を、事前の感作を伴わずに消失させ、さらに幹様細胞又はがん幹細胞を優先的に死滅させることが可能である。標的細胞との免疫学的シナプスを形成すると、ＮＫ細胞は、細胞溶解を誘導することが機能である、パーフォリン及びグランザイムを含む、あらかじめ形成された細胞溶解性顆粒を放出する。

【0006】

この仮定に基づき、いくつかの研究が、多様な腫瘍、とりわけ、血液悪性腫瘍に対する、ＮＫ細胞の養子移入を利用することに成功した。しかし、がんは、多様な戦術を用いて、抗腫瘍免疫を遅延させるか、変更するか、なお又は停止させ、腫瘍増殖に対するコントロールの失敗をもたらす。ＮＫ細胞の抗腫瘍応答はまた、多くの限界にも直面している。特に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、ＮＫ細胞の有効性にとって、大きな障壁であり続けており、とりわけ、養子移入ＮＫ細胞の有効性にとって、大きな障壁であり続けている。例えば、樹状細胞（ＤＣ）などの腫瘍浸潤免疫細胞、抑制性マクロファージ又は寛容原性マクロファージ、及び調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のほか、細胞外マトリックスに埋まっている、がん関連線維芽細胞は、免疫抑制性サイトカインの分泌を介して、又は受容体発現に干渉することにより、ＮＫ細胞の活性化に介入しうる。例えば、ＴＭＥでは、ＴＧＦ－β（とりわけ、Ｍ２分極マクロファージにより分泌される）は、ＮＫ細胞の数及び抗転移機能を制限する、ＮＫ細胞の主要な阻害性サイトカインとして認識される。

【0007】

したがって、ｉ）腫瘍環境の免疫抑制効果を阻害すること、及びｉｉ）ＮＫ細胞の活性化、及びＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を、直接誘発することの両方により、抗腫瘍性活性を刺激しうるツールを有することは、治療的観点から、極めて貴重であろう。

【0008】

ブチロフィリンは、ブチロフィリン（ＢＴＮ）、ＢＴＮ様（ＢＴＮＬ）タンパク質、及びＳＫＩＮＴ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｋｅｅｐ ｏｆ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌ）タンパク質を含む、膜貫通タンパク質のファミリーを構成する（Ａｒｎｅｔｔ及びＶｉｎｅｙ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１４）。ブチロフィリンの細胞外部分は、Ｂ７共刺激分子の対応するドメインに対する相同性を呈する、ＩｇＶ様ドメイン及びＩｇＣ様ドメインを含有する（Ａｒｎｅｔｔ及びＶｉｎｅｙ、２０１４）ので、ブチロフィリンは、拡張Ｂ７スーパーファミリー又はＩｇスーパーファミリーのメンバーであると考えられる。

【0009】

遺伝子のブチロフィリン（ＢＴＮ）ファミリーは、ヒトにおいて、１３の遺伝子から構成され、８つの別個の群を形成する（Ａｂｅｌｅｒ－Ｄｏｒｎｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１２；Ａｆｒａｃｈｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１２）。７つのヒトＢＴＮ遺伝子は、第６染色体の、ＭＨＣクラスＩ領域において、クラスター化され、系統発生関連群を形成する、３つのサブファミリー：ＢＴＮ１、ＢＴＮ２及びＢＴＮ３へと分けられる。ＢＴＮ１サブファミリーが、原型的な単一コピーのＢＴＮ１Ａ１遺伝子だけを含有するのに対し、ＢＴＮ２及びＢＴＮ３サブファミリーは各々、それぞれ、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、及びＢＴＮ２Ａ３（偽遺伝子である）、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、及びＢＴＮ３Ａ３という、３つずつの遺伝子を含有する。ＢＴＮ遺伝子ファミリーメンバーについて、高血圧症、慢性腎不全、封入体筋炎、１型糖尿病及び２型糖尿病、又はＨＣＶ感染を含む、異なる疾患と関連する、いくつかの遺伝子多型が記載されている（Ｃｈｅｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ、２０１５；Ｈｏｒｉｂｅら、Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、２０１１及び２０１４；Ｍｉｌｍａｎら、Ｃｌｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ、２０１１；Ｍｕｒａｋａｔａら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｐ、２０１４；Ｏｇｕｒｉら、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ、２０１３；Ｐａｃｈｅｃｏら、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ、２０１６）。ＢＴＮＬ２、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、及びＢＴＮ３Ａ３についての、一塩基多型バリアントのほか、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８が関与する有害なコピー数変動についても記載されている（Ａｉｇｎｅｒら、ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ、２０１３）。

【0010】

同定された、最初のブチロフィリンである、ＢＴＮ１Ａ１は、乳脂肪球の形成、分泌、及び安定化に要求される（Ｏｇｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、２００４）。次いで、Ｂ７遺伝子と、ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とは、共通の祖型遺伝子を有し、Ｔ細胞の活性化など、類似する機能に関与するタンパク質をコードしうることが提起されている（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００１；ＨａｒｌｙＣら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２）。ＢＴＮ２Ａ１タンパク質アイソフォーム及びＢＴＮ２Ａ２タンパク質アイソフォームは、ＩｇＶ及びＩｇＣの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに特徴的な細胞内Ｂ３０．２ドメインを呈し、ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３と類似するが、ＢＴＮ３Ａ２とは類似しない。マウスでは、ＢＴＮ２Ａ２は、単一コピー遺伝子であり、ヒトＢＴＮ２Ａ２遺伝子のオーソログである。組換えヒトＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１の特定の糖型が、樹状細胞（ＤＣ）において見出されるレクチン分子であるＤＣ－ＳＩＧＮに結合することを明らかにした。ＢＴＮ２Ａ１の、ＤＣ－ＳＩＧＮへの結合は、腫瘍細胞により発現される場合、タンパク質の、高マンノース型グリコシル化に依存する（Ｍａｌｃｈｅｒｅｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７）。

【0011】

増殖しつつある証拠は、その後、ブチロフィリンが、免疫系において、多様な役割を果たすことを示唆した。Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＧＴＥｘ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１３）に由来する５３例のヒト組織試料からのＲＮＡ－ｓｅｑは、正常組織における、ＢＴＮ２Ａ１転写物の、遍在的な発現を示す。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｔａｎｇ，Ｚ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０１７）を使用する、ＧＴＥｘからのＲＮＡ－Ｓｅｑデータと、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースに由来するデータとの比較は、子宮頸部扁平上皮がん及び子宮頸部腺癌、肺小細胞癌、卵巣癌、膵臓がん、並びに子宮内膜癌を含むいくつかのがんにおける、ＢＴＮ２Ａ１転写物発現のモジュレーションを指し示す。

【0012】

前出（国際公開第２０１９０５７９３３号）では、ＢＴＮ２Ａの両方のアイソフォームを認識する抗体が報告されているが、前記抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αの産生を阻害する、及び／又は活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害する、及び／又は活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を阻害する。

【0013】

Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、免疫的防御の、重要なエフェクターである。Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、病原体感染細胞又は異常細胞を、直接溶解させる。加えて、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟のほか、アイソタイプスイッチング、及び免疫グロブリンの産生を誘導することによっても、免疫応答を調節する。この免疫系の重要な細胞プラットフォームは、表面受容体、ケモカイン、及びサイトカインにより、厳密に調節される。Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、ｐＡｇ（ｐｈｏｓｐｈｏａｇｏｎｉｓｔ）と称される、非ペプチド性のリン酸化イソプレノイド経路代謝物により活性化される。

【0014】

ＢＴＮ２Ａ１をターゲティングし、免疫細胞、とりわけ、マクロファージ、ＮＫ細胞、及び／又はγδ Ｔ細胞、特に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞などの１つを超える免疫細胞コンパートメントを活性化させる抗体の開発は、とりわけ、がん治療において特に重要な場合があり、感染性疾患の処置のために、特に、重要でありうる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示は、初めて、ＢＴＮ２Ａ（とりわけ、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォーム（例えば、ヒトＢＴＮ２Ａ１ポリペプチド）に結合する）に結合する抗体であって、以下の特性：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の活性化を、直接誘発する特性、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性
のうちの少なくとも１つを呈する抗体を提示する。

【0016】

特に、本開示の抗体は、特性ｉ）及びｉｉ）のうちの少なくとも１つ、並びに特性ｉｉｉ）及びｉｖ）のうちの少なくとも１つを呈し、より特定すると、本開示の抗体は、特性ｉ）～ｉｖ）を呈する。

【0017】

したがって、本開示に従うこのような抗体は、
マクロファージの表現型及び機能性を、炎症促進性Ｍ１マクロファージへとシフトさせることにより、抗腫瘍性微小環境を優先的にもたらすことから、炎症促進性サイトカインの分泌をもたらすこと、及び／又は
ＮＫ細胞の活性化を、直接誘発し、これにより、それらの細胞溶解活性を、さらに強化すること
が可能である。

【0018】

したがって、本開示に従う、このような抗体は、がん治療のための多様な戦略において使用されうる、強力なツールを表す。

【0019】

詳細な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、ＢＴＮ２Ａへの結合について、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照マウス抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５、又は
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照マウス抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３
のうちのいずれか１つと競合する。

【0020】

一部の実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
配列番号１７の６５、６８、６９、７２、７８、８４、８５、９５、９７、１００位、又は
配列番号１７の２１２、２１３、２１８、２２０、２２４、２２９位
に位置するアミノ酸残基を含むエピトープ
に結合する。

【0021】

詳細な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３、又は
配列番号２１を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２２を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号２３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号２４を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２５を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３
を含む。

【0022】

詳細な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び２０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

【0023】

詳細な実施形態では、本開示の抗体は、以下の特性：
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞からの、細胞溶解性分子の分泌を活性化させる特性、
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる特性、及び／又は
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる特性
のうちの少なくとも１つをさらに呈する。

【0024】

最も特定すると、このような実施形態に従う抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、典型的に、ＢＴＮ２Ａへの結合について、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む参照マウス抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と競合しうる。

【0025】

より詳細には、このような抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３、又は
配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列との、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含みうる。

【0026】

本開示についての一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＢＴＮ２Ａ１に対する特異性を有する。

【0027】

詳細な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である。

【0028】

本開示はまた、上記で記載された抗ＢＴＮ２Ａ抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子も包含する。

【0029】

本開示はまた、特に、上記で記載された抗ＢＴＮ２Ａ抗体のうちのいずれか１つの製造における使用のための、このような核酸を含む宿主細胞にも関する。

【0030】

本開示の別の態様は、治療、とりわけ、がん又は感染性疾患の処置における使用のための、上記で記載した抗ＢＴＮ２Ａ抗体に関する。

【0031】

典型的に、本開示に従うがんは、扁平上皮がん及び子宮頸部腺癌などの子宮頸癌、卵巣癌、扁平上皮がん及び黒色腫を含む皮膚がん、肺小細胞癌を含む肺がん、前立腺癌、結腸がん、膵がん、及び子宮内膜癌であり、より詳細には、扁平上皮がんであり、子宮頸部腺癌、扁平上皮がん、卵巣癌、肺小細胞癌、前立腺癌、結腸がん、膵がん、及び子宮内膜癌を含む血液がん及び固形がんを含む。

【0032】

本開示はまた、上記で記載した抗ＢＴＮ２Ａ抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物にも関する。

【0033】

本開示は、対象における免疫応答を活性化させるための方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａを投与するステップを含む方法をさらに提示する。

【0034】

［発明の詳細な説明］
定義
本明細書で使用される、「ＢＴＮ２」という用語は、当技術分野における、その一般的な意味を有し、配列番号１７のＢＴＮ２Ａ１又は配列番号１８のＢＴＮ２Ａ２を含む、ヒトＢＴＮ２ポリペプチドを指す。

【0035】

配列番号１７：ＢＴＮ２Ａアイソフォーム１前駆体（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））：
MESAAALHFSRPASLLLLLLSLCALVSAQFIVVGPTDPILATVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALVIHNITAQENGTYRCYFQEGRSYDEAILHLVVAGLGSKPLISMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRDPYGGVAPALKEVSMPDADGLFMVTTAVIIRDKSVRNMSCSINNTLLGQKKESVIFIPESFMPSVSPCAVALPIIVVILMIPIAVCIYWINKLQKEKKILSGEKEFERETREIALKELEKERVQKEEELQVKEKLQEELRWRRTFLHAVDVVLDPDTAHPDLFLSEDRRSVRRCPFRHLGESVPDNPERFDSQPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKGEVLLIPQNGFWTLEMHKGQYRAVSSPDRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFSVPVRPFFRLGCEDSPIFICPALTGANGVTVPEEGLTLHRVGTHQSL

【0036】

配列番号１８：ＢＴＮ２Ａアイソフォーム２前駆体（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））：
MEPAAALHFSLPASLLLLLLLLLLSLCALVSAQFTVVGPANPILAMVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRITFVSKDINRGSVALVIHNVTAQENGIYRCYFQEGRSYDEAILRLVVAGLGSKPLIEIKAQEDGSIWLECISGGWYPEPLTVWRDPYGEVVPALKEVSIADADGLFMVTTAVIIRDKYVRNVSCSVNNTLLGQEKETVIFIPESFMPSASPWMVALAVILTASPWMVSMTVILAVFIIFMAVSICCIKKLQREKKILSGEKKVEQEEKEIAQQLQEELRWRRTFLHAADVVLDPDTAHPELFLSEDRRSVRRGPYRQRVPDNPERFDSQPCVLGWESFASGKHYWEVEVENVMVWTVGVCRHSVERKGEVLLIPQNGFWTLEMFGNQYRALSSPERILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFTVPVRPFFRLGSDDSPIFICPALTGASGVMVPEEGLKLHRVGTHQSL

【0037】

本明細書で使用される、「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、同じ意味を有し、本開示では、同義に使用されるであろう。

【0038】

本明細書で使用される、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合性部位を含有する分子を指す。このように、「抗体」という用語は、全抗体分子だけでなく、また、抗体断片のほか、抗体及び抗体断片のバリアント（誘導体を含む）も包含する。

【0039】

本明細書で使用される、「抗体」という用語はまた、二特異性分子又は多特異性分子も含む。抗体は、少なくとも２つの、異なる結合性部位又は標的分子に結合する二特異性分子を作出するように、誘導体化される場合もあり、別の機能的分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体、又は受容体に対するリガンド）へと連結される場合もある。実のところ、抗体は、２つを超える、異なる結合性部位及び／又は標的分子に結合する多特異性分子を作出するように、誘導体化される場合もあり、１つを超える他の機能的分子へと連結される場合もあり；このような多特異性分子もまた、本明細書で使用される、「二特異性分子」という用語により包含されることが意図される。二特異性分子を創出するために、本発明の抗体は、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、又は結合模倣体など、１つ又は複数の、他の結合性分子へと、機能的に連結されうる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、又は他の形で）。加えて、二特異性分子が、多特異性である実施形態では、分子は、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、本明細書で開示される二特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１種の抗体、又は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディー若しくは単鎖Ｆｖを含む、その抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖二量体若しくは重鎖二量体、又はＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているＦｖ構築物若しくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でもありうる。

【0040】

本明細書で開示される二特異性分子において用いられうる他の抗体は、マウスｍＡｂ、キメラｍＡｂ、及びヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

【0041】

本開示の二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、結合特異性の構成要素をコンジュゲートすることにより調製されうる。例えば、各構成要素は、互いとコンジュゲートされる。結合特異性が、タンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング剤又は架橋剤が、共有結合的コンジュゲーションのために使用されうる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボン酸（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、１９８４；Ｌｉｕら、１９８５）を含む。他の方法は、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５；Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７；Ｐａｕｌｕｓ、１９８５において記載されている方法を含む。代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において、発現され、アセンブルされる場合もある。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に、有用である。本開示の二特異性分子は、１つの単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子の、それらの特異的な標的への結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害及びアポトーシス）、又はウェスタンブロットアッセイにより確認されうる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に特異的な、標識付け試薬（例えば、抗体）を用いることにより、特に目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

【0042】

天然抗体では、２つの重鎖は、互いと、ジスルフィド結合により連結され、各重鎖は、軽鎖へと、ジスルフィド結合により連結される。ラムダ（λ）鎖及びカッパ（κ）鎖の、２種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能活性を決定する、５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥが存在する。各鎖は、顕著に異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）である、２つのドメインを含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、及び３つの定常ドメイン（ＣＨと総称される、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）である、４つのドメインを含む。軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び結合特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖及び重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体への結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの、重要な生物学的特性を付与する。

【0043】

Ｆｖ断片とは、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖の可変部分と、１つの重鎖の可変部分とからなる。抗体の特異性は、抗体の結合性部位と、抗原決定基との、構造的相補性に存する。抗体の結合性部位は、主に、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成される。場合によって、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が、抗体の結合性部位に参与するか、又は全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、これにより、結合性部位に影響を及ぼす場合がある。相補性決定領域又はＣＤＲとは、天然の免疫グロブリンの結合性部位のうちの、天然のＦｖ領域の、結合アフィニティー及び結合特異性を、併せて規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、それぞれが、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、及びＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と名指される、３つのＣＤＲを有する。したがって、抗原結合性部位は、典型的に、重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。「フレームワーク領域」（ＦＲ）とは、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖及び重鎖の可変領域は、典型的に、以下の順序：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の、４つのフレームワーク領域及び３つのＣＤＲを含む。

【0044】

抗体可変ドメインにおける残基は、従来、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムに従い番号付けされている。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（本明細書の後出では、「Ｋａｂａｔら」と称する）において明示されている。本明細書では、この番号付けシステムが使用される。Ｋａｂａｔによる残基呼称は、配列番号による配列におけるアミノ酸残基の直鎖状の番号付けと、常に直接対応するわけではない。実際の直鎖状のアミノ酸配列は、基礎的な可変ドメイン構造の、フレームワークであれ、相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、構造的構成要素の短縮、又はこれへの挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔによる番号付けより少ないアミノ酸を含有する場合もあり、より多くのアミノ酸を含有する場合もある。残基に対する、正しいＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、抗体配列において相同性を有する残基の、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアライメントにより決定されうる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う、残基３１～３５（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に配置されている。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う、残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に配置されている。

【0045】

詳細な実施形態では、本明細書で提示される抗体は、抗体断片であり、より特定すると、本明細書で開示される抗体の抗原結合性ドメインを含む、任意のタンパク質である。抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディーを含むがこれらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用される「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＢＴＮ２Ａ１に特異的に結合する単離抗体は、ＢＴＮ２Ａ以外の抗原に特異的に結合する抗体を、実質的に含まない）。しかし、ＢＴＮ２に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来する、類縁のＢＴＮ２分子など、他の抗原との交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞素材及び／又は化学物質を、実質的に含まない場合がある。

【0047】

抗体のアフィニティーとは、抗体が、その抗原結合性部位（パラトープ）を介して、本開示におけるＢＴＮ２Ａ１などの抗原に提示されたエピトープに結合する強度を指す。アフィニティーは、Ｋｄ値の評価に基づき評価されうる。

【0048】

本明細書で使用される、「Ｋ_Ｄ」という用語は、ｋ_ｏｆｆのｋ_ｏｎに対する比（すなわち、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）から得られ、モル濃度（Ｍ）と表される、平衡解離定数を指すことが意図される。Ｋ_Ｄ値は、抗体の濃度（特定の実験に必要とされる抗体の量）に関するので、低Ｋ_Ｄ値（低濃度）に関し、したがって、抗体の高アフィニティーに関する。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定されうる。ｍＡｂのＫ_Ｄ値を決定するために好ましい方法は、それらの参考文献が、参照により全体において本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８」、Ｃｏｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、１９９２、１９９３、及びＭｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９８３において見出されうる。抗体のＫ_Ｄを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる方法、又はビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）（アフィニティー評価に関する詳しい情報についてはまた、Ｒｉｃｈ ＲＬ、Ｄａｙ ＹＳ、Ｍｏｒｔｏｎ ＴＡ、Ｍｙｓｚｋａ ＤＧ、「Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｄｒｕｇ／ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）」、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００１も参照されたい）、又はオクテット（Ｏｃｔｅｔ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる方法である。オクテット（登録商標）プラットフォームは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術に基づく。ＢＬＩ技術の原理は、２つの表面（固定化タンパク質層及び内部参照層）から反射される白色光の、光学的干渉パターンに基づく。バイオセンサーチップ表面に固定化されたリガンドと、溶液における解析物との結合は、バイオセンサーチップにおける光学的厚さの増大をもたらし、これは、ナノメートル単位で測定される、干渉パターンのシフトを結果としてもたらす。波長のシフト（Δλ）は、生物学的層の光学的厚さの変化の直接的な測定値であり、このシフトが、時間経過にわたり測定され、その大きさが、時間の関数としてプロットされると、古典的な会合／解離曲線が得られる。この相互作用は、リアルタイムで測定され、結合特異性、会合速度、及び解離速度、並びに濃度のモニタリングを可能とする（Ａｂｄｉｃｈｅら、２００８を参照されたいが、また、「結果」における詳細も参照されたい）。アフィニティー測定は、典型的に、２５℃で実施される。

【0049】

本明細書で使用される、「ｋ_{ａｓｓｏｃ}」若しくは「ｋ_ａ」、又は「ｋ_ｏｎ」という用語は、特定の抗体－抗原間相互作用の会合速度を指すことが意図されるのに対し、「ｋ_ｄｉｓ」若しくは「ｋ_ｄ」、又は「ｋ_ｏｆｆ」という用語は、特定の抗体－抗原間相互作用の解離速度を指すことが意図される。

【0050】

本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、分子組成が単一である抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性、及び特定のエピトープに対するアフィニティーを呈する。

【0051】

本明細書で使用される、「特異性」という用語は、本開示におけるＢＴＮ２Ａアイソフォーム（ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２を含む）など、抗原に提示されたエピトープに、検出可能に結合する抗体の能力を指す。「特異性」という用語は典型的に、ヒトＢＴＮ２Ａ、とりわけ、ＢＴＮ２Ａ１に、１０ｎＭ若しくはこれ未満、５ｎＭ、１ｎＭ若しくはこれ未満、１００ｐＭ若しくはこれ未満、又は１０ｐＭ又はこれ未満のＫ_Ｄで結合する抗体又はタンパク質を指すことが意図される。典型的に、Ｋ_Ｄは、１０^－３ｐＭ～１０ｎＭの間、とりわけ、０．１ｐＭ～１０ｎＭの間、とりわけ、０．１ｐＭ～５ｎＭの間、又は１ｐＭ～１０ｎＭの間、とりわけ、１ｐＭ～５ｎＭ又は１０ｐＭ～５ｎＭの間から構成される。典型的に、本開示の抗体は、ＢＴＮ２Ａ１、又はＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２の両方に特異的であり、上記で規定されたＫ_Ｄを有する。一部の実施形態では、特異性はまた、ＢＴＮ２Ａ１を、細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞株）において発現させ、トランスフェクト細胞を、漸増濃度（例えば、５ｎｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬの範囲の）の、本明細書で開示される精製抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ、又はその対照アイソタイプなどの陰性対照で染色することによっても評価されうる。平均値蛍光強度データについての非線形回帰分析は、最大蛍光の５０％が観察されるｍＡｂ濃度としてのＥＣ_５０を決定することを可能とする。典型的に、本開示に従う、ＢＴＮ２Ａ１に特異的な抗体は、ＢＴＮ２Ａ１に、５０μｇ／ｍＬ未満、とりわけ、４０μｇ／ｍＬ未満（実施例節を参照されたい）、とりわけ、０．１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの間、又は０．５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬの間のＥＣ_５０で結合する。

【0052】

本明細書では、「抗原を認識する抗体」及び「抗原に対する特異性を有する抗体」は、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。

【0053】

「選択的に結合すること」とは、典型的に、抗体が、それが特異的であるエピトープなどの標的に、別の標的への結合と比較して、より強く結合することを意味する。抗体は、第１の標的に対する、そのアフィニティーが、第２の標的に対する、そのアフィニティーより大きい場合に、第１の標的に、第２の標的と比較して、より強く結合する。典型的に、抗体は、それが、第１の標的に、前述の通り、第２の標的に対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）又はＥＣ_５０より小さな平衡解離定数又はＥＣ_５０で結合する場合に、第１の標的に、第２の標的と比較して、より強く結合する。最も詳細には、薬剤は、第２の標的に適度に結合することは全くない。本出願の一部の実施形態では、抗体は、ＢＴＮ２Ａに選択的であり、最も特定すると、ＢＴＮ２Ａ１に選択的である。選択性はまた、他の関連しない分子への非特異的結合と対比した、特異的な抗原への結合における、例えば、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はこれを超えるアフィニティー比によってもさらに呈される（例えば、特異的抗原は、ＢＴＮ２Ａポリペプチド、とりわけ、ＢＴＮ２Ａ１であり、他の「関連しない分子」は、例えば、ＢＴＮ３アイソフォームでありうる）。

【0054】

本明細書で開示される抗体の選択性は、意図される標的タンパク質（ＢＴＮ２Ａアイソフォーム）と比較される近縁の他のタンパク質（例えば、ＢＴＮ３アイソフォーム）へと、交差反応アッセイを適用して調べられうる。このような交差反応性が検出されない一方で、これと同時に、且つ、同じ抗体希釈率で、意図される標的の、強いシグナルをもたらす場合、抗体は、典型的に、選択的であると考えられる（図３に対応する実施例において詳述された結果を参照されたい）。「抗原と交差反応する」抗体とは、この抗原に、１０ｎＭ若しくはこれ未満、１ｎＭ若しくはこれ未満、又は１００ｐＭ若しくはこれ未満のＫ_Ｄで結合する抗体を指すことが意図される。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、この抗原に、１００ｎＭ若しくはこれを超えるＫ_Ｄ、又は１μＭ若しくはこれを超えるＫ_Ｄ、又は１０μＭ若しくはこれを超えるＫ_Ｄで結合する抗体を指すことが意図される。ある特定の実施形態では、抗原と交差反応しない、このような抗体は、標準的な結合アッセイ（典型的に、表３又は図３Ａを参照されたい）において、これらのタンパク質に対して、本質的に検出不能な結合を呈する。

【0055】

詳細な実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、下記：
MQRQFSKASRPCLPWVLMEPAAALHFSLPASLILLLLLLRLCALVSAQFTVVGPTDPILAMVGENTTLRCHLSPEKNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALIIHNVTAQENGTYRCYFQEGRSYDEAILHLMVAGLGSKPLVEMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRDPYGRVVPALKEVFPPDTDGLFMVTTAVIIRDKSMRNMSCSISDTLLGQKKESVIFIPESFMPSVSPCVVALPIIVVFLMIIIAVCIYWINRLQKETKILSGEKESERKTREIAVKELKKERVQKEKELQVKEQLQEELRWRRTVLHAVDVVLDPDTAHPDLLLSEDRRSVRRCPLGHLGESVPDNPERFNSEPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKEEVLLRPRNGFWTLEMCKGQYRALSSPKRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRLAFSVPVRPFFRIGSDDSPIFICPALTGASGITVPEEGLILHRVGTNQSLMPVGTRCYGHGMRPTGFIRMREERGIHRTTREEREPDMQNFDLGAHWSNNLPSARSREFLNSDLVPDHSLESPVTPGLANKTGEPQAEVTCLCFSLPSSELRAFPSTATNHNHKATALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITDPFFRNAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATKQEISLRGGEKSLAYHGTHISYLAAPERWEMAVFPNSGLPRCLLTLILLQLPKLDSAPFDVIGPPEPILAVVGEDAELPCRLSPNASAEHLELRWFRKKVSPAVLVHRDGREQEAEQMPEYRGRATLVQDGIAEGRVALRIRGVRVSDDGEYTCFFREDGSYEEALVHLKVAALGSDPHISMQVQENGEIWLECTSVGWYPEPQVQWRTSKGEKFPSTSESRNPDEEGLFTVAASVIIRDTSVKNVSCYIQNLLLGQEKEVEIFIPG
で規定される、配列番号３５の配列を有する、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログ（ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１；ＮＣＢＩｒｅｆ．ＸＰ＿０１５３０４３９２．１）と交差反応する。

【0056】

これらの実施形態の一部では、本明細書で開示される抗体は、ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインに、ｈｕＢＴＮ２Ａ１において得られる対応するＥＣ_５０と同等（これを１０％超えるか又は下回る）であるＥＣ_５０で結合する。

【0057】

「同一性」という用語は、２つのポリペプチド分子の間、又は２つの核酸分子の間における、配列類似性を指す。比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又は同じアミノ酸残基により占有される場合、それぞれの分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性百分率は、２つの配列により共有される、マッチする位置の数を、比較される位置の数で除して、１００を乗じた数に対応する。一般に、比較は、２つの配列が、最大の同一性をもたらすようにアライメントされた場合になされる。同一性は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の累積プログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、若しくはＣＬＵＳＴＡＬＷなどの配列比較アルゴリズムのうちのいずれかを使用するアライメントにより計算されうる。

【0058】

本開示に従う参照分子の機能的バリアントは、参照分子（例えば、１０７Ｇ３ ｍＡｂ）の、対応する機能的特性と、実質的に同等であるか、又はこれより優れた機能的特性を呈する。本明細書では、「実質的に同等である」ことにより、前記機能的バリアントが、参照分子の、対応する機能的特性の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％を保持することが意図される。

【0059】

一態様では、本開示は、上記で規定された、ＢＴＮ２Ａ１に対する特異性を有する抗体に関する。典型的に、このような抗体は、上記で規定された通り、ヒトＢＴＮ２Ａ１に、１０ｎＭ又はこれ未満のＫ_Ｄで結合することにおいて特徴づけられる。

【0060】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＢＴＮ３アイソフォームと交差反応しない。

【0061】

ＢＴＮ２Ａに対する特異性を有する抗体であるが、とりわけ、本発明に従うＢＴＮ２Ａ１はまた、典型的に、以下の特性：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する特性、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性
のうちの少なくとも１つを有することにおいても、さらに特徴づけられる。

【0062】

好ましくは、本開示の抗体は、特性ｉ及びｉｉのうちの少なくとも１つ、並びに特性ｉｉｉ及びｉｖのうちの少なくとも１つを呈し、ほぼ確実に、特性ｉ～ｉｖを呈する。

【0063】

このような有利な特性を有する、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、例えば、実施例節で詳述されるアッセイを使用して、抗ＢＴＮ２Ａ抗体の間でスクリーニングされうる。前記アッセイ及びそれらの実施については、下記で略述される。

【0064】

マクロファージ分極アッセイでは、Ｍ２マクロファージは、当該分野で、従来なされてきた通り、抗ＢＴＮ２Ａ抗体、とりわけ、前出で規定された抗ＢＴＮ２Ａ１抗体の存在下で、又はその対照アイソタイプなどの陰性対照の存在下で、マクロファージから発生させられる。Ｍ２分化の阻害についての対照としての、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）誘導性Ｍ２分極時に、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及びＩＦＮ－γが、単球へと添加されうる。逆に、ＧＭ－ＣＳＦの存在下で分極させられたＭ１マクロファージもまた、典型的に、表現型対照として使用されうる。分極の後、細胞膜における、Ｍ１関連マーカー及びＭ２関連マーカーの発現が、結果として得られるマクロファージにおいて、フローサイトメトリーにより評価されうる。

【0065】

本開示に従い、簡便に検出されうるＭ１マーカーは、限定せずに述べると、ＰＤＬ１、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及び／又はＳＯＣＳ３を含む。典型的には、ＰＤＬ１及び／又はＣＤ８６が検出される。本開示に従い、簡便に検出されうるＭ２マーカーは、限定せずに述べると、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、及びＣＤ２０９を含み、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１６３が、典型的に検出される。

【0066】

典型的に、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極の阻害は、
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプと比較して、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で発生させられる場合に、少なくとも１つのＭ１マーカーの著明な増大が観察される場合；及び／又は
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプなど、その陰性対照と比較して、抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で発生させられる場合に、少なくとも１つのＭ２マーカーの著明な減少が観察される場合
に、本開示の抗ＢＴＮ２Ａにより誘導される。

【0067】

さらに、典型的に、適切な市販のキット（例えば、ＥＬＩＳＡ様キット）を使用することにより、Ｍ１マクロファージと、Ｍ２マクロファージとの間で特徴的な弁別機能である、サイトカイン分泌プロファイル（とりわけ、Ｍ２関連抗炎症性ＩＬ－１０サイトカインと、Ｍ１関連炎症促進性ＴＮＦαサイトカインとを含む）が、培養物上清中で定量されうる。Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージ表現型を特徴づけるように、これらもまた、容易に検出されうる、さらなるサイトカインは、Ｍ１関連サイトカインについての、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＩＬ－２３、並びにＭ２関連サイトカインについてのＴＧＦβ及びＩＬ－１０を含む。

【0068】

したがって、一部の実施形態では、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極の阻害もまた、
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプなどの陰性対照と比較して、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で培養される場合に、少なくとも１つのＭ２関連サイトカインの分泌の著明な減少が、観察される場合、及び／又は
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプなどの陰性対照と比較して、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で培養される場合に、少なくとも１つのＭ１関連サイトカインの分泌の著明な増大が、観察される場合
に、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体の作用から生じると考えられうる。

【0069】

典型的に、本開示に従う抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、Ｍ２関連マーカー（ＣＤ１４及び／又はＣＤ１６３など）の発現の減少、及び／又はＭ２関連サイトカイン（ＩＬ－１０など）の分泌の減少により評価される通り、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を、用量依存的に阻害しうる。前記少なくとも１つのＭ２関連サイトカインの分泌、又は前記少なくとも１つのＭ２関連マーカーの発現に関する、このような抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、実施例節で詳述される用量反応曲線において決定されうる。一部の詳細な実施形態では、本発明の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
Ｍ２関連マーカー（典型的に、ＣＤ１４及び／又はＣＤ１６３）の発現について、０．０５μｇ／ｍＬ、とりわけ、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、とりわけ、５０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ_５０、及び／又は
Ｍ２関連サイトカイン（典型的に、ＩＬ－１０）の分泌について、０．０１μｇ／ｍＬ、とりわけ、０．０５μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、とりわけ、５０μｇ／ｍＬ、最も特定すると、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ_５０
を呈する。

【0070】

加えて、又は代替的に、本開示に従う抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、Ｍ１関連マーカー（ＣＤ８６及び／又はＰＤＬ１など）の発現の増大、及び／又はＭ２関連サイトカイン（ＩＬ－１０など）の分泌の減少により評価される通り、Ｍ２促進刺激にもかかわらず、単球の分極を、Ｍ１マクロファージへと、用量依存的に偏らせうる。前記少なくとも１つのＭ１関連サイトカインの分泌、又は前記少なくとも１つのＭ１関連マーカーの発現に関する、このような抗体の５０％効果濃度（ＥＣ_５０）は、実施例節で詳述される、用量反応曲線において決定されうる。一部の詳細な実施形態では、本発明の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、
Ｍ１関連マーカー（典型的に、ＣＤ８６及び／又はＰＤＬ１）の発現について、０．０１μｇ／ｍＬ、とりわけ、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、とりわけ、５０μｇ／ｍＬ、最も特定すると、１～５０μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ_５０、及び／又は
Ｍ１関連サイトカイン（典型的に、ＴＮＦα）の分泌について、０．０１μｇ／ｍＬ、とりわけ、０．０５μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、とりわけ、５０μｇ／ｍＬ、最も特定すると、０．１～１０μｇ／ｍＬの範囲のＥＣ_５０
を呈する。

【0071】

Ｍ２マクロファージ復帰アッセイでは、典型的に、Ｍ－ＣＳＦの存在下で、単球から発生させられるＭ２マクロファージが、抗ＢＴＮ２Ａ抗体（最も特定すると、前出で規定された、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体）、又はその対照アイソタイプなどの陰性対照の存在下で、多糖（ＬＰＳ）を伴うか、又は伴わずに培養されうる。Ｍ２復帰についての陽性対照として、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及びＩＦＮ－γが、Ｍ２培養物へと添加されうる。ＧＭ－ＣＳＦの存在下で分極させられたＭ１マクロファージは、典型的に、表現型対照として使用されうる。復帰実験の後、ＬＰＳの非存在下で復帰させられたマクロファージが、上記で記載した通りに、フローサイトメトリーにより、Ｍ１関連マーカー又はＭ２関連マーカーの発現について解析されうる。サイトカインの分泌もまた、上記で記載した通りに定量されうる。

【0072】

典型的に、Ｍ２マクロファージの、Ｍ１マクロファージへの復帰は、
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプと比較して、前記抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で培養される場合に、Ｍ１マーカーの著明な増大が観察される場合、及び／又は
Ｍ２マクロファージが、その対照アイソタイプなどの陰性対照と比較して、前記抗ＢＴＮ２Ａ抗体の存在下で培養される場合に、Ｍ２マーカーの著明な減少が観察される場合
に、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体により誘導される。

【0073】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５の添加を伴うか、又は伴わずに、ＮＫ細胞（典型的に、健常ドナーに由来する）を、本明細書で規定される抗ＢＴＮ２Ａ抗体、又は陰性対照のための対照アイソタイプと共に培養することにより評価されうる。次いで、少なくとも４８時間後、とりわけ、少なくとも４日後、ＮＫ細胞は、ＣＤ６９及び／又はＣＤ２５など、それらの活性化マーカーについて、細胞外で表現型解析されうる。典型的に、ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ６９及び／又はＣＤ２５など、ＮＫ細胞の活性化マーカーの著明な増大が、前記抗ＢＴＮ２Ａの存在下で（ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５による、さらなる活性化を伴うか、又は伴わない）、そのアイソタイプ対照などの陰性対照と比較して観察される場合に、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体により誘導されたと考えられる。本明細書で提示される結果は、本発明の抗体が、ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発することを、明確に裏付ける。

【0074】

ＮＫ細胞による細胞傷害作用の増強は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＮＫ細胞の脱顆粒を評価することにより、さらに評価されうる。このような機能アッセイでは、白血病細胞株（骨髄性白血病）又は癌腫（例えば、結腸癌、乳腺癌、又は肺腺癌）細胞株などのがん細胞株が、上記で記載されたＮＫ細胞（上記で記載された通りに、抗ＢＴＮ２Ａ抗体又はその陰性対照で、あらかじめ活性化された）の存在下、並びにＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５の存在下又は非存在下で共培養される。ＮＫ細胞の脱顆粒は、典型的に、フローサイトメトリーにおける、ＣＤ１０７陽性ＮＫ細胞の百分率（ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５の存在下又は非存在下における）により評価されうる。

【0075】

典型的に、ＮＫ細胞による細胞傷害作用は、ＮＫ細胞の脱顆粒（例えば、ＣＤ１０７陽性ＮＫ細胞の百分率）が、前記抗ＢＴＮ２Ａ抗体による、ＮＫ細胞の活性化の後で、その対照アイソタイプなど、その陰性対照と比較して、著明に増大した場合に、抗ＢＴＮ２Ａ抗体により誘導されたと考えられる。典型的に、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体はまた、ＮＫ細胞の脱顆粒（とりわけ、前出で記載された、多様ながん細胞株に対する）も、用量依存的に誘導する。ＮＫ細胞の脱顆粒に関する、このような抗体の５０％効果濃度（ＥＣ_５０）は、実施例節で詳述される、用量反応曲線で決定されうる。

【0076】

参照抗体である、１０１Ｇ５及び／又は１０７Ｇ３は、上記で記載された機能アッセイにおいて、陽性対照として使用されうる。

【0077】

一部の実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、下記で十分に記載される通り、参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３と実質的に同等であるか、又はこれより優れたレベルへと、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する、Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する、ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する、及び／又はＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する。本明細書では、「参照抗体と実質的に同等であるか、又はこれより優れたレベルへと、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する、Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する、ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する、及び／又はＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する」により、被験抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による、被験機能活性の、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３又は１０１Ｇ５のうちのいずれか１つと比較した、２０％未満、とりわけ、１５％未満、とりわけ、１０％未満の変動であり、典型的に、５％未満の変動が観察されることが意図される。

【0078】

本開示はまた、
１）ＢＴＮ２Ａに対する特異性を有し、とりわけ、前出で規定された通り、ＢＴＮ２Ａ１に対する特異性を有する抗体、特に、以下の特性：
典型的に、細胞株、例えば、実施例で記載される通りに、ヒトＢＴＮ２Ａ１をコードするプラスミドをトランスフェクトされた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株で発現される、ヒトＢＴＮ２Ａ１に結合する、より詳細には、５０μｇ／ｍＬを下回り、より詳細には、４０μｇ／ｍＬを下回るＥＣ_５０で結合するか、又はＢＴＮ２Ａ１に、１０ｎＭ若しくはこれ未満のＫ_Ｄで結合する、及び／或いは約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はこれを超える、ＢＴＮ２Ａ１への結合アフィニティーの、非特異的結合と対比した比を有する特性；
ＢＴＮ３と交差反応しない特性
のうちの少なくとも１つを有する抗体；
並びに
２）さらに、又は代替的に、機能的特性：
Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子（とりわけ、ＩＦＮ－γ）の産生を活性化させる特性、及び／又は
Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる特性、及び／又は
Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる特性
のうちの１つ又は複数を呈する抗体も包含する。

【0079】

Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、増殖、細胞溶解機能、及び細胞溶解性分子（とりわけ、ＩＦＮ－γ）の産生は、典型的に、本明細書で開示される抗体により達成される、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞により達成されることが理解される。

【0080】

このような有利な特性を有する、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、実施例で記載される細胞アッセイを使用して、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体の中からスクリーニングされる場合があり、特に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌についての、ＥＬＩＳＡベースの評価によりスクリーニングされうる、及び／又はＤａｕｄｉ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｌ－ＩＰＣ細胞株、又はＭＤＡ－ＭＢ－１３４細胞株など、多様ながん細胞株におけるＣＤ１０７脱顆粒アッセイによりスクリーニングされうる。

【0081】

本開示に従う細胞傷害性分子は、典型的に、ＩＦＮγサイトカイン又はＴＮＦαサイトカインに存在する。

【0082】

本明細書で使用される、「細胞溶解性分子の産生を活性化させること」（典型的に、ＩＦＮγ／又はＴＮＦαの産生）とは、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、少なくとも、ＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生の著明な増大が、対照の活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞（対照としてのＩｇＧ１又はハイブリドーマ培養培地により活性化させた）と比較した場合に観察され、この場合、前記Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｌ－ＩＰＣ細胞株、又はＭＤＡ－ＭＢ－１３４細胞株）との共培養、又はｐＡｇ（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）により活性化されることを意味する。典型的に、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、ＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生の活性化は、フローサイトメトリーにおいて評価される、ＩＦＮγ又はＴＮＦαに対する抗体を伴う細胞内標識化による細胞アッセイにおいて、又はそれらの培養培地において、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞により分泌された、ＩＦＮγ又はＴＮＦαの、ＥＬＩＳＡベースの量により測定されうる。このようなアッセイについては、下記の実施例（「材料及び方法」節を参照されたい）において、より詳細に記載される。

【0083】

本明細書で使用される、「活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させること」とは、活性化ヒトＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の著明な増大が、対照の活性化ヒトＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞（対照としてのＩｇＧ１又はハイブリドーマ培養培地により活性化させた）と比較した場合に観察され、この場合、前記ヒトＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｌ－ＩＰＣ細胞株、又はＭＤＡ－ＭＢ－１３４細胞株）との共培養、又はｐＡｇ（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）により活性化されることを意味する。典型的に、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の活性化は、陽性の脱顆粒Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を検出するための脱顆粒マーカーとして、ＣＤ１０７ａと、ＣＤ１０７ｂとを、併せて使用して、標準的な細胞株に対する、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒の誘導の活性化の測定に従い測定されうる。イオノマイシンを伴う、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）による、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の処理は、典型的に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化についての陽性対照として使用されうる。このようなアッセイについては、下記の実施例において、より詳細に記載される。

【0084】

本明細書で使用される、「活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させること」とは、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖の著明な増大が、対照としてのＩｇＧ１により活性化させたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖と比較した場合に観察され、この場合、前記Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞は、標的細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｌ－ＩＰＣ細胞株、又はＭＤＡ－ＭＢ－１３４細胞株）との共培養、又はｐＡｇ（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）により活性化されることを意味する。典型的に、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖は、末梢血から精製されたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞に対する、ＣＦＳＥ染色又はＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ染色及びフローサイトメトリーによる細胞アッセイにおいて、又は刺激を伴うか、若しくは伴わない、末梢血単核細胞内の、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞コンパートメントの拡大をモニタリングすることにより測定されうる。

【0085】

一部の実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を、下記で記載される参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と実質的に同等であるか、又はこれより優れたレベルへと活性化させる。本明細書では、「参照抗体と実質的に同等なレベルへと、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させること」により、被験抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と比較した、１５％未満、とりわけ、１０％未満の変動であり、典型的に、５％未満の変動が観察されることが意図される。

【0086】

一部の実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子（すなわち、少なくとも、ＩＦＮγ又はＴＮＦα）の産生を、下記で記載される参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と実質的に同等であるか、又はこれより優れたレベルへと活性化させる。本明細書では、「参照抗体と実質的に同等なレベルへと、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、少なくとも、ＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生を活性化させること」により、被験抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子の産生の、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と比較した、１５％未満、とりわけ、１０％未満の変動であり、典型的に、５％未満の変動が観察されることが意図される。

【0087】

一部の実施形態では、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を、下記で記載される参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と実質的に同等であるか、又はこれより優れたレベルへと活性化させる。本明細書では、「参照抗体と実質的に同等なレベルへと、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させること」により、被験抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による、活性化Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と比較した、１５％未満、とりわけ、１０％未満の変動であり、典型的に、５％未満の変動が観察されることが意図される。

【0088】

参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５、ｍＡｂ １０７Ｇ３、及びこれらのバリアント
本明細書で開示される抗体は、参照モノクローナル抗体である、それぞれ、配列番号１９及び２０で規定される、それぞれのＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｍＡｂ １０１Ｇ５と、それぞれ、配列番号１及び２で規定される、それぞれのＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｍＡｂ １０７Ｇ３とを含む。

【0089】

本開示の他の抗体は、それぞれ、配列番号１及び２で規定されるＶＨ領域及びＶＬ領域、又はそれぞれ、配列番号１９及び２０で規定されるＶＨ領域及びＶＬ領域と、少なくとも９０％、とりわけ、少なくとも、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００パーセントの同一性を有する抗体を含む。

【0090】

特定の実施形態では、本開示に従う抗ＢＴＮ２Ａ抗体、典型的に、ヒト化抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３を含む。本明細書で開示される抗体についての、詳細な実施形態では、６つのＣＤＲ領域は、配列番号３～８で規定される、参照ｍＡｂである１０７Ｇ３の６つのＣＤＲ領域と１００％同一である。

【0091】

他の詳細な実施形態では、本開示に従う抗ＢＴＮ２Ａ１抗体、典型的に、ヒト化抗ＢＴＮ２Ａ１抗体は、配列番号２１を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２２を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号２３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号２４を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２５を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３を含む。

【0092】

本明細書で開示される抗体についての、詳細な実施形態では、６つのＣＤＲ領域は、配列番号２１～２６で規定される、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５の、６つのＣＤＲ領域と１００％同一である。本明細書で開示される他の抗体は、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換により変異させられているが、ＣＤＲ領域において、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５のＣＤＲ領域との、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００パーセントの同一性を、なおも有するアミノ酸を有する抗体を含む。典型的には、本開示に従い、抗体は、配列番号２１～２６で規定される、参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３のＣＤＲ配列と比較して、１つ又は複数のＣＤＲにおける、１つ、２つ、３つ、又は４つの間のアミノ酸の変動（欠失、挿入、又は置換を含む）を有しうる。

【0093】

本明細書で開示される抗体についての、他の詳細な実施形態では、６つのＣＤＲ領域は、配列番号３～８で規定される、参照ｍＡｂである１０７Ｇ３の６つのＣＤＲ領域と１００％同一である。本明細書で開示される他の抗体は、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換により変異させられているが、ＣＤＲ領域において、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３のＣＤＲ領域との、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００パーセントの同一性を、なおも有するアミノ酸を有する抗体を含む。典型的には、本開示に従い、抗体は、配列番号３～８で規定される、参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３のＣＤＲ配列と比較して、１つ又は複数のＣＤＲにおける、１つ、２つ、３つ、又は４つの間のアミノ酸の変動（欠失、挿入、又は置換を含む）を有しうる。

【0094】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３のそれぞれの、対応する６つのＣＤＲ領域と１００％同一である、６つのＣＤＲ領域を有するｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３の変異体バリアントであり、この場合、前記変異体バリアント抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸が、対応する参照抗体の、対応するフレームワーク領域と比較された場合に、ＦＲ１領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域、及びＦＲ４領域における、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換により変異させられた、変異体アミノ酸配列を含む。

【0095】

機能的バリアント抗体
実施例で提示される実験データにより示される通り、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３は、ヒトＢＴＮ２Ａ１の６５、６８、６９、７２、７８、８４、８５、９５、９７、１００位における残基に結合する。したがって、本開示は、配列番号１７の６０～１００位に位置するアミノ酸残基を含むコンフォメーションエピトープに結合し、最も特定すると、配列番号１７の６５、６８、６９、７２、７８、８４、８５、９５、９７、１００位におけるアミノ酸残基を含むコンフォメーションエピトープに結合し、前出で規定され、下記でさらに想起される機能的特性のうちの１つ又は複数を有する、特に、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の機能的特性のうちの１つ又は複数を有するｍＡｂを包含する。

【0096】

これもまた、実施例で提示される実験データにより示される通り、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５は、ＢＴＮ２Ａ１の２１２、２１３、２１８、２２０、２２４、２２９位における残基に結合する。したがって、本開示は、配列番号１７の２１０～２３０位に位置するアミノ酸残基を含むコンフォメーションエピトープに結合し、最も特定すると、配列番号１７の２１２、２１３、２１８、２２０、２２４、２２９位における残基を含むコンフォメーションエピトープに結合し、前出で規定され、下記でさらに想起される機能的特性のうちの１つ又は複数を有する、特に、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５の機能的特性のうちの１つ又は複数を有するｍＡｂを包含する。

【0097】

さらに他の実施形態では、本開示の機能的バリアント抗体は、上記で記載した参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３のうちのいずれか１つの、対応するアミノ酸配列と相同であるか、又は、より詳細には、同一である、全長の重鎖アミノ酸配列及び全長の軽鎖アミノ酸配列、又は可変領域の重鎖アミノ酸配列及び可変領域の軽鎖アミノ酸配列、若しくは６つのＣＤＲ領域全てのアミノ酸配列を有し、この場合、このような機能的バリアント抗体は、前記参照抗体の、所望の機能的特性を保持する。

【0098】

参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５抗体、又は参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３の機能的バリアント、とりわけ、本開示のモノクローナル抗体の文脈で使用される、ＶＬ、ＶＨ、又はＣＤＲの機能的バリアントは、抗体が、親抗体（例えば、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３）に対して、少なくともかなりの比率（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％）のアフィニティー（典型的に、典型的に、２５℃で実施される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、又はバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術に基づく、オクテット（登録商標）プラットフォームを使用することにより、測定されるＫ_Ｄにより評価される）、及び／又は選択性をやはり保持することを可能とし、場合によって、本開示の、このようなモノクローナル抗体は、親Ａｂ（例えば、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３）より大きなアフィニティー、選択性、及び／又は特異性と関連しうる。

【0099】

参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５若しくは１０７Ｇ３、又は本明細書で開示される、前記参照抗体のバリアントの、所望の機能的特性は、
ｉ．ＢＴＮ２Ａ１に対する特異性、特に、細胞株、例えば、実施例で記載される通りに、ヒトＢＴＮ２Ａ１をコードするプラスミドをトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ１への結合の特性、より詳細には、５０μｇ／ｍＬを下回り、より詳細には、４０μｇ／ｍＬを下回るＥＣ_５０、或いは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（典型的に、２５℃で）、又はＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（実施例で例示される）若しくはオクテット（登録商標）（Ａｂｄｉｃｈｅら、２００８）により測定される、１０ｎＭ又はこれ未満のＫ_Ｄを伴う特性、及び／或いは約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はこれを超えるＢＴＮ２Ａ１への結合アフィニティーの、非特異的結合と対比した比を有する特性；並びに／或いは
ｉｉ．典型的に、実施例節で例示される通りに評価される、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極の阻害、及び／又は
ｉｉｉ．典型的に、実施例節で例示される通りに評価される、Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰の誘導、及び／又は
ｉｖ．典型的に、実施例節で例示される通りに評価される、ＮＫ細胞活性化の直接的な誘発、及び／又は
ｖ．典型的に、実施例節で例示される通りに評価される、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用の増強
からなる群から選択されうる。

【0100】

一部の、より詳細な実施形態では、参照ｍＡｂである１０７Ｇ３、又は本明細書で開示される、前記参照抗体のバリアントの、所望の機能的特性は、
ｖｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞からの、細胞溶解性分子（例えば、ＩＦＮγ又はＴＮＦα）の産生の活性化、
ｖｉｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の活性化；及び／又は
ｖｉｉｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖の活性化
からなる群からさらに選択されうる。

【0101】

典型的に、参照ｍＡｂである１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の機能的バリアントの、上記の点（ｉｉ）～（ｖ）に従う機能的特性は、上記で記載した、対応する参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の、対応する機能的特性と、実質的に同等であるか、又はこれより優れている。本明細書では、「実質的に同等である」ことにより、機能的バリアントが、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の、対応する機能的特性の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を保持することが意図される。

【0102】

典型的に、参照ｍＡｂである１０７Ｇ３の機能的バリアントの、上記の点（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）に従う機能的特性は、上記で記載した参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３の、対応する機能的特性と、実質的に同等であるか、又はこれより優れている。本明細書では、「実質的に同等である」ことにより、機能的バリアントが、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の、対応する機能的特性の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を保持することが意図される。

【0103】

例えば、本開示は、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５の、機能的バリアント抗体であって、ＣＤＲ配列、すなわち、６つのＣＤＲ領域である、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号２１～２６で規定される、参照抗体であるｍＡｂ １０１Ｇ５の、対応するＣＤＲ配列に対する、少なくとも６０、７０、９０、９５、又は１００パーセントの配列同一性を共有する、可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を含み、ＢＴＮ２Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性ｉ）～ｉｖ）：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する特性、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性
のうちの少なくとも１つを呈する、機能的バリアント抗体に関する。

【0104】

好ましくは、抗体は、特性ｉ）及びｉｉ）のうちの少なくとも１つ、並びに特性ｉｉｉ）及びｉｖ）のうちの少なくとも１つを呈し、最も好ましくは、抗体は、特性ｉ）～ｉｖ）を呈する。

【0105】

本開示はまた、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の、機能的バリアント抗体であって、ＣＤＲ配列、すなわち、６つのＣＤＲ領域である、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号３～８で規定される、参照抗体であるｍＡｂ １０７Ｇ３の、対応するＣＤＲ配列に対する、少なくとも６０、７０、９０、９５、又は１００パーセントの配列同一性を共有する、可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を含み、ＢＴＮ２Ａ１に特異的に結合し、以下の機能的特性：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する特性、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性、
ｖ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、ＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生を活性化させる特性、
ｖｉ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる特性、
ｖｉｉ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる特性
のうちの少なくとも１つを呈する、機能的バリアント抗体にも関する。

【0106】

好ましくは、前記機能的バリアントは、機能活性ｉ）～ｉｖ）のうちの少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも活性ｉ）及び／又はｉｉ）、並びにｉｉｉ）及び／又はｉｖ））、及び機能活性ｖ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つを呈する。

【0107】

本開示は、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５の、機能的バリアント抗体であって、それぞれ、配列番号１９及び２０で規定される、前記参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５の、対応する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、少なくとも８０％、９０％、又は少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＢＴＮ２に特異的に結合し、以下の機能的特性：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する特性、
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性
のうちの少なくとも１つを呈する、機能的バリアント抗体にさらに関する。

【0108】

好ましくは、機能的バリアント抗体は、特性ｉ）及びｉｉ）のうちの少なくとも１つ、並びに特性ｉｉｉ）及びｉｖ）のうちの少なくとも１つを呈し、最も好ましくは、抗体は、特性ｉ）～ｉｖ）を呈する。

【0109】

本開示は、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の、抗体であって、それぞれ、配列番号１及び２で規定される、前記参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３の、対応する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、少なくとも８０％、９０％、又は少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＢＴＮ２Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性：
ｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する特性、
ｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する特性、
ｉｉｉ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する特性、及び／又は
ｉｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する特性、
ｖ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子（ＩＦＮγ又はＴＮＦα）の産生を活性化させる特性、
ｖｉ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる特性、及び／又は、
ｖｉｉ．Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる特性
のうちの少なくとも１つを呈する、機能的バリアント抗体にさらに関する。

【0110】

一部の実施形態では、前記機能的バリアントは、機能活性ｉ）～ｉｖ）のうちの少なくとも１つ（とりわけ、少なくとも活性ｉ）及び／又はｉｉ）、並びにｉｉｉ）及び／又はｉｖ））、及び機能活性ｖ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つを呈する。

【0111】

一部の実施形態では、前記機能的バリアントは、１つ又は複数の機能活性ｉ）～ｉｖ）、又は、１つ又は複数の機能活性ｖ）～ｖｉｉ）を呈する。

【0112】

典型的に、参照ｍＡｂである１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の機能的バリアントの、上記の点（ｉ）～（ｉｖ）に従う機能的特性は、上記で記載した、対応する参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の、対応する機能的特性と、実質的に同等であるか、又はこれより優れている。本明細書では、「実質的に同等である」ことにより、機能的バリアントが、参照ｍＡｂである１０７Ｇ３の、対応する機能的特性の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を保持することが意図される。

【0113】

多様な実施形態では、抗体は、上記で論じられた、所望の機能的特性のうちの１つ又は複数を呈しうる。

【0114】

抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体でありうる。典型的に、抗体又はタンパク質は、ヒト化抗体、より詳細には、ヒト化サイレント抗体である。

【0115】

本明細書で使用される、「サイレント」抗体という用語は、標的細胞の細胞溶解を測定する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性アッセイで測定される通り、ＡＤＣＣ活性を呈さないか、又は低ＡＤＣＣ活性を呈する抗体を指す。

【0116】

一実施形態では、「ＡＤＣＣ活性を伴わないか、又はＡＤＣＣ活性が低度である」という用語は、サイレント抗体が、対応する野生型（非サイレント）抗体、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１抗体により観察されるＡＤＣＣ活性の、５０％を下回る、例えば、１０％を下回るＡＤＣＣ活性を呈することを意味する。典型的に、サイレント抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性アッセイでは、対照Ｆａｂ抗体と比較して、検出可能なＡＤＣＣ活性が観察されない。

【0117】

エフェクター機能のサイレンシングは、抗体のＦｃ定常部分における変異により得られ、当技術分野：Ｓｔｒｏｈｌ、２００９（ＬＡＬＡ及びＮ２９７Ａ）；Ｂａｕｄｉｎｏ、２００８、Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８、Ｓｔｒｏｈｌ、ＣＯ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０、２００９）において記載されている。サイレントＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列の、２３４、２３５、及び／又は３３１位（ＥＵ番号付け）における、ＡＤＣＣを低減する変異を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、グリコシル化抗体又は非グリコシル化抗体を結果としてもたらす、Ｎ２９７Ａ変異を含む。

【0118】

ＣＤＲバリアントの配列は、保存的置換により、親抗体配列のＣＤＲの配列と異なる場合があり；例えば、バリアントにおける、少なくとも９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つなど、少なくとも１０の置換は、保存的なアミノ酸残基の置きかえである。本開示の文脈では、保存的置換は、以下：
脂肪族残基：Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニル会合残基：Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基：Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負帯電残基：Ｄ及びＥ
極性残基：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正帯電残基：Ｈ、Ｋ、及びＲ
小型残基：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
極小型残基：Ａ、Ｇ、及びＳ
ターンの形成に関与する残基：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及びＴ
可撓性の残基：Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ
の通りに反映されたアミノ酸クラス内の置換により規定されうる。さらなる保存的置換の群分けは、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンを含む。バリアントＣＤＲでは、疎水性／親水性特性及び残基の重量／サイズに関する保存もまた、ｍＡｂ１～ｍＡｂ６のうちのいずれか１つのＣＤＲと比較して、実質的に保持される。当技術分野では、タンパク質に対する、相互作用的生物学的機能の付与における、アミノ酸の疎水性指数の重要性が、一般に理解されている。アミノ酸の相対疎水性特徴は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが、タンパク質の、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが受容されている。各アミノ酸は、それらの疎水性及び電荷特徴に基づき、疎水性指数を割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）である。類似する残基の保持はまた、又は代替的に、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準設定：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｏｐｅｎ Ｇａｐ＝１１、及びＥｘｔｅｎｄｅｄ Ｇａｐ＝１を使用する、ＮＣＢＩから入手可能な、ＢＬＡＳＴ ２．２．８）の使用により決定される、類似性スコアによっても測定されうる。適切なバリアントは、典型的に、親ペプチドに対する、少なくとも約８０％の同一性を呈する。本開示に従い、第２のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％の同一性を有する、第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と、７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。本開示に従い、第２のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％の同一性を有する、第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と、５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。

【0119】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体、典型的に、マウス／ヒトキメラ抗体である。「キメラ抗体」という用語は、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインとを含む、モノクローナル抗体を指す。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、任意の動物が使用されうる。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３のうちのいずれか１つの、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含みうる。

【0120】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。詳細な実施形態では、本開示の抗体は、参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３のうちのいずれか１つの、６つのＣＤＲを含む、ヒト化抗体である。本明細書で使用される、「ヒト化抗体」という用語は、フレームワーク領域（ＦＲ）が、親免疫グロブリン（例えば、マウスＣＤＲ）のＦＲと比較して、異なる種（例えば、ヒト種）のドナー免疫グロブリンに由来するＦＲを含むように修飾された抗体を指す。

【0121】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。本明細書で使用される、「Ｆａｂ」という用語は、ＩｇＧを、プロテアーゼであるパパインで処置することにより得られる断片のうち、約５０，０００の分子量と、抗原結合活性とを有し、Ｈ鎖Ｎ末端側の約半分と、Ｌ鎖の全体とが、ジスルフィド結合を介して、一体に結合された抗体断片を表す。「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量と、抗原結合活性とを有し、ＩｇＧを、プロテアーゼであるペプシンで処置することにより得られる断片のうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂより、やや大型の抗体断片を指す。「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量と、抗原結合活性とを有し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる抗体断片を指す。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドとは、通例、ペプチドコードリンカーにより連結された、ＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む、遺伝子融合体により発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体である。本開示のヒトｓｃＦｖ断片は、典型的に、遺伝子組換え法を使用することにより、適切なコンフォメーションに保持されたＣＤＲを含む。

【0122】

変異体アミノ酸配列を伴う、機能的バリアント抗体は、コード核酸分子の変異誘発（例えば、部位指向変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発）に続く、本明細書で記載される機能アッセイを使用する、保持された機能（すなわち、上記で明示された機能）について変更された、コードされる抗体についての試験により得られうる。

【0123】

参照１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は参照１０７Ｇ３ ｍＡｂと交差競合する抗体
本明細書で開示される参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５、又は参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の、類似する有利な特性を伴う、さらなる抗体は、標準的なＢＴＮ２Ａ１結合アッセイにおいて、上記で記載した、前記参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と、統計学的に有意に交差競合する（例えば、この結合を、競合的に阻害する）それらの能力に基づき同定されうる。

【0124】

被験抗体はまず、ＢＴＮ２Ａ１に対する、それらの結合アフィニティーについて、典型的に、実施例（「材料及び方法」節を参照されたい）で評価される通りに、例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、例えば、ヒト組換え抗体ライブラリーから、又はＢＴＮ２Ａ１抗原で免疫化されたヒト可変領域抗体を発現するトランスジェニックマウスからスクリーニングされうる。

【0125】

別の実施形態では、本開示は、上記で記載した、少なくとも参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３、又は参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体を提示する。例節で例示される通り、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、ＢＴＮ２Ａ１における、同じエピトープに結合しない。

【0126】

本開示の抗体の、ヒトＢＴＮ２Ａ１への結合と交差競合するか、又はこれを阻害する、被験抗体の能力は、被験抗体が、ヒトＢＴＮ２Ａ１への結合について、この抗体と競合しうることを裏付け、非限定的な理論に従い、このような抗体は、ヒトＢＴＮ２Ａ１において、それが競合する抗体と同じであるか、又は類似の（例えば、構造的に類似するか、又は空間的に近位の）エピトープに結合する。

【0127】

例えば、以下の試験は、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を、参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３と交差競合する、その能力についてスクリーニングする、及び／又は抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を、前記参照抗体と同じエピトープに結合する、その能力についてスクリーニングするのに使用されうる：ヒトＢＴＮ２Ａ１をトランスフェクトされたＢＴＮ２ＫＯ細胞（典型的に、実施例で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ）を、飽和濃度（例えば、１０μｇ／ｍＬ）の参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３で染色することができる。次いで、異なる用量の被験抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂを、参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３との、それらの潜在的な競合可能性について調べることができる。このような参照抗体の存在下では、参照抗体と競合するｍＡｂは、ＢＴＮ２Ａ１を認識することが不可能であろう。データは、平均値蛍光強度として表すことができる。代替的に、競合アッセイは、実施例節で記載される、ビニングアッセイにおいて実施されうる。典型的に、ビニング実験は、組換えヒトＢＴＮ２Ａ１を、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒに固定し、参照抗体に続き、競合抗体を提示することにより実施されうる。

【0128】

選択された抗体は、特に、前出で詳述された、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３の有利な特性について、さらに調べられうる。

【0129】

したがって、一実施形態では、本開示は、ＢＴＮ２Ａ１への結合について、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５又は参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と競合する単離抗体であって、
ｉ．ＢＴＮ２Ａ１に対する特異性を有する、特に、細胞株、例えば、実施例で記載される通りに、ヒトＢＴＮ２Ａ１をトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞において発現されるヒトＢＴＮ２Ａ１に結合する、より詳細には、５０μｇ／ｍＬを下回り、より詳細には、４０μｇ／ｍＬを下回るＥＣ_５０、或いは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又はＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（実施例で例示される）若しくはオクテット（登録商標）アッセイにより測定される、１０ｎＭ又はこれ未満のＫ_Ｄで結合する、及び／或いは約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はこれを超える、ＢＴＮ２Ａ１への結合アフィニティーの、非特異的結合と対比した比を有する（さらなる詳細についてはまた、上記も参照されたい）；並びに／或いは
ｉｉ．単球の、Ｍ２マクロファージへの分極を阻害する、
ｉｉｉ．Ｍ２マクロファージの、抗腫瘍性Ｍ１マクロファージへの復帰を誘導する、
ｉｖ．ＮＫ細胞の直接的な活性化を誘発する、及び／又は
ｖ．ＮＫ細胞媒介性細胞傷害作用を増強する
単離抗体を提示する。

【0130】

代替的に、又はさらに、前記抗体は、
ｖｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞による、細胞溶解性分子（例えば、ＩＦＮγ又はＴＮＦα）の産生を活性化させる；及び／又は
ｖｉｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる；及び／又は
ｖｉｉｉ．典型的に、実施例で例示される通りに評価される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖を活性化させる。

【0131】

このような実施形態において、より詳細には、前記抗体は、ＢＴＮ３と交差反応しない。

【0132】

典型的に、ＢＴＮ２Ａ１への結合について、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３と競合する抗体の、上記の点（ｉｉｉ）～（ｖ）に従う機能的特性は、上記で記載した、参照抗体である、ｍＡｂ １０１Ｇ５又はｍＡｂ １０７Ｇ３の、対応する機能的特性と、実質的に同等であるか、又はこれより優れている。本明細書では、「実質的に同等である」ことにより、機能的バリアントが、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の、対応する機能的特性の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％を保持することが意図される。

【0133】

典型的に、本開示に従う、ＢＴＮ２Ａ１への結合について、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３と競合する抗体は、参照抗体（例えば、ｍＡｂ １０７Ｇ３）に対して、少なくともかなりの比率（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％）のアフィニティー及び／又は選択性を、やはり保持し、場合によって、参照抗体（例えば、ｍＡｂ １０７Ｇ３）より大きなアフィニティー、選択性、及び／又は特異性と関連しうる。

【0134】

ある特定の実施形態では、交差遮断抗体、又はＢＴＮ２Ａ１への結合について、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５若しくは１０７Ｇ３と競合する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト組換え抗体である。

【0135】

モノクローナル抗体を作製するトランスフェクトーマの作出
本開示の抗体は、限定せずに述べると、単独で、又は組合せによる、任意の化学法、生物学法、遺伝子法、又は酵素法など、当技術分野で公知の、任意の技法により作製される。典型的に、所望の配列のアミノ酸配列を知れば、当業者は、ポリペプチドを作製するための標準的な技法により、前記抗体を、たやすく作製することができる。例えば、本開示の抗体は、周知の固相法を使用して、典型的に、市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製のペプチド合成装置など）を使用し、製造元の指示書に従い合成されうる。代替的に、本開示の抗体は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ法により合成されうる。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列の、発現ベクターへの組込み、及び所望の抗体を発現させる、適切な真核宿主又は原核宿主への、このようなベクターの導入の後における、ＤＮＡ発現産物としてとして得られ、周知の技法を使用して、これらの宿主から単離されうる。

【0136】

したがって、本開示のさらなる目的は、本明細書で開示される抗体をコードする核酸分子に関する。より特定すると、核酸分子は、本開示の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。より特定すると、核酸分子は、参照抗体である、ｍＡｂ １０７Ｇ３の重鎖可変領域（ＶＨ領域）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする、対応する核酸に対する、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の同一性を有する領域をコードするＶＨ又はＶＬを含む。

【0137】

典型的に、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなど、任意の適切なベクターに組み入れられうる、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。本明細書で使用される、「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が、宿主細胞へと導入されうる媒体を意味する。したがって、本開示のさらなる目的は、本明細書で開示される核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、対象への投与において、前記抗体の発現を引き起こすか、又は方向付けるように、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含みうる。動物細胞のための発現ベクターにおいて使用されうる、プロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及び初期エンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びＬＴＲエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーなどを含む。ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子が、挿入され、発現されうる限りにおいて、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用されうる。適切なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１ベータｄ２－４などを含む。他のプラスミドの例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドを含む。他のウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターを含む。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞にトランスフェクトすること、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスの一過性トランスフェクションによるなど、当技術分野で公知の技法により作製されうる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などを含む。このような複製欠損組換えウイルスを作製するための、詳細なプロトコールは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開第９４／１９４７８号において見出されうる。

【0138】

本開示のさらなる目的は、上記で記載された核酸及び／又はベクターによりトランスフェクトされるか、感染させられるか、又は形質転換された宿主細胞に関する。本明細書で使用される、「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）の、遺伝子配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列の、宿主細胞への導入であって、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的に、導入された遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質又は酵素を産生するような導入を意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換され」ている。

【0139】

本明細書で開示される核酸は、適切な発現系において、本開示の抗体を作製するのに使用されうる。「発現系」という用語は、例えば、ベクターにより運ばれ、宿主細胞へと導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現に適切な条件下にある、宿主細胞及び適合性のベクターを意味する。一般的な発現系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例は、限定せずに述べると、原核細胞（細菌など）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含む。詳細な例は、大腸菌、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）のほか、初代哺乳動物細胞培養物又は確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから作製された培養物）を含む。例はまた、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（本明細書の後出では、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇら、１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２；本明細書の後出では、「ＹＢ２／０細胞」と称される）なども含む。

【0140】

本開示はまた、本明細書で開示される抗体を発現する組換え宿主細胞を作製する方法であって、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて、上記で記載した組換え核酸又はベクターを、コンピテント宿主細胞へと導入するステップと、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて得られた組換え宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉｉ）任意選択で、前記抗体を発現する、及び／又は分泌する細胞を選択するステップとを含む方法にも関する。このような組換え宿主細胞は、本開示の抗体を作製するのに使用されうる。

【0141】

本開示の抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から、適切に分離される。

【0142】

一部の実施形態では、本開示のヒトキメラ抗体は、前出で記載されたＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得、それらを、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターへと挿入することにより、ヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを、動物細胞へと導入することにより、コード配列を発現させることにより作製されうる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインについては、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でありうるが、ＩｇＧクラスのＣＨドメインが適し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４など、ＩｇＧクラスに属するサブクラスのうちのいずれか１つを使用してもよい。ヒトキメラ抗体のＣＬドメインについても、Ｉｇに属する任意の領域でありうるが、カッパクラス又はラムダクラスのＣＬドメインを使用してもよい。キメラ抗体を作製するための方法は、従来の組換えＤＮＡを伴い、当技術分野では、遺伝子トランスフェクション法が周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ．ら（１９８４）、並びに特許文書である、米国特許第５，２０２，２３８号及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照されたい）。

【0143】

本開示のヒト化抗体は、前出で記載されたＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、それらを、（ｉ）ヒト抗体と同一である、重鎖定常領域及び重鎖可変フレームワーク領域、並びに（ｉｉ）ヒト抗体と同一である、軽鎖定常領域及び軽鎖可変フレームワーク領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターへと挿入することにより、ヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを、適切な細胞株へと導入することにより、遺伝子を発現させることにより作製されうる。ヒト化抗体の発現ベクターは、抗体の重鎖をコードする遺伝子と、抗体の軽鎖をコードする遺伝子とが、別個のベクターに存在する型の場合もあり、両方の遺伝子が、同じベクターに存在する型（タンデム型）の場合もある。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、細胞株への導入の容易さ、及び細胞株における、抗体のＨ鎖とＬ鎖との間の、発現レベルの均衡の点において、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などを含む。

【0144】

当技術分野では、抗体をヒト化するための方法であって、従来の組換えＤＮＡ法及び遺伝子トランスフェクション法に基づく方法が周知である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ら、１９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ．ら、１９８５を参照されたい）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；及び同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ化又は再表面形成（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭら（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ．ら（１９９４））、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野で公知の様々な技法を使用してヒト化されうる。このような抗体を調製するための、一般的な組換えＤＮＡ技術もまた、公知である（欧州特許第１２５０２３号及び国際特許出願公開第９６／０２５７６号を参照されたい）。

【0145】

本開示のＦａｂは、抗ミュラー管ホルモンと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるパパインで処置することにより得られうる。Ｆａｂはまた、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核細胞発現系のためのベクター、又は真核細胞発現系のためのベクターへと挿入し、ベクターを、原核細胞又は真核細胞（必要に応じて）へと導入して、Ｆａｂを発現させることによっても作製されうる。

【0146】

本開示のＦ（ａｂ’）２は、抗ミュラー管ホルモンと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンで処置して得られうる。Ｆ（ａｂ’）２はまた、下記で記載される通り、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、Ｆａｂ’を結合させることによっても作製されうる。

【0147】

本開示のＦａｂ’は、抗ミュラー管ホルモンと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオトレイトールで処置して得られうる。Ｆａｂ’はまた、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核細胞のための発現ベクター、又は真核細胞のための発現ベクターへと挿入し、ベクターを、原核細胞又は真核細胞（必要に応じて）へと導入して、その発現を行うことによっても作製されうる。

【0148】

本開示のｓｃＦｖは、前出で記載された通りに、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、ＤＮＡを、原核細胞のための発現ベクター、又は真核細胞のための発現ベクターへと挿入し、次いで、発現ベクターを、原核細胞又は真核細胞（必要に応じて）へと導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより作製されうる。

【0149】

ヒト化ｓｃＦｖ断片を作出するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ドナーｓｃＦｖ断片から選択するステップと、それらを、ヒトｓｃＦｖ断片による、公知の三次元構造のフレームワークへとグラフティングするステップとを伴う、ＣＤＲグラフティングと呼ばれる、周知の技術が使用されうる（例えば、国際公開第９８／４５３２２号；同第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号を参照されたい）。

【0150】

本開示の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨ内及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基へと、修飾がなされた抗体をさらに含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるようになされる。例えば、１つの手法は、１つ又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異させる」ことである。より詳細には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体のフレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定されうる。フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと戻すために、体細胞変異は、例えば、部位指向変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発により、生殖細胞系列の配列へと「復帰変異させられ」うる。このような「復帰変異」抗体もまた、本開示により包含されることが意図される。フレームワーク修飾の別の種類は、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的免疫原性を低減するように、フレームワーク領域内の１つ若しくは複数の残基、なお又はＣＤＲ領域内の１つ若しくは複数の残基を変異させることを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号により、さらに詳細に記載されている。

【0151】

Ｆｃ操作
本明細書で開示される抗体は、上記で記載した態様の、機能的特徴又は構造的特徴のうちの１つ又は複数により特徴づけられる場合もあり、選択された機能的特徴及び構造的特徴の任意の組合せにより特徴づけられる場合もある。

【0152】

本明細書で開示される抗体は、任意のアイソタイプの抗体でありうる。アイソタイプの選出しは、典型的に、ＡＤＣＣのサイレンシングなど、所望のエフェクター機能により導かれるであろう。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域のうちのいずれかである、カッパ領域使用される場合もあり、ラムダ領域使用される場合もある。所望の場合、本開示の抗体のクラスは、公知の方法により切り替えられうる。典型的なクラススイッチング法は、１つのＩｇＧサブクラスを、別のＩｇＧサブクラスへと転換する、例えば、ＩｇＧ１を、ＩｇＧ２へと転換するのに使用されうる。したがって、本開示の抗体のエフェクター機能は、例えば、多様な治療的使用のために、アイソタイプスイッチングにより、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、又はＩｇＭ抗体へと変化させられうる。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、全長抗体である。一部の実施形態では、全長抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、全長抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ＢＴＮ２Ａ特異的ＩｇＧ４抗体は、安定化ＩｇＧ４抗体である。適切な安定化ＩｇＧ４抗体の例は、Ｋａｂａｔら、前出の、ＥＵインデックスにおいて指し示される、ヒトＩｇＧ４の、重鎖定常領域の４０９位におけるアルギニンが、リシン、スレオニン、メチオニン、若しくはロイシン、典型的に、リシンで置換された抗体（国際公開第２００６０３３３８６号において記載されている）、及び／又はヒンジ領域が、Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ配列を含む抗体である。他の適切な安定化ＩｇＧ４抗体については、国際公開第２００８１４５１４２号において開示されている。

【0153】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、及び「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣ末端断片、例えば、ヒトガンマ重鎖、又は他の種類の抗体重鎖（例えば、ヒト抗体について、α鎖、δ鎖、ε鎖、及びμ鎖）、若しくはその天然に存在するアロタイプにおけるその対応配列の、アミノ酸（ａａ）２３０近傍～ａａ ４５０近傍を指す。そうでないことが指定されない限りにおいて、本開示を通して、一般に受容されている、免疫グロブリンについての、Ｋａｂａｔによるアミノ酸の番号付けが使用される（Ｋａｂａｔら（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照されたい）。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに、実質的に結合することが可能なＦｃドメインを含まない。一部の実施形態では、本開示の抗体は、Ｆｃドメイン（例えば、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを欠く）を欠くか、又はＩｇＧ２アイソタイプ若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディー、単鎖抗体断片、又は複数の異なる抗体断片を含む多特異性抗体からなるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、本開示の抗体は、毒性部分へと連結されない。一部の実施形態では、抗体が、Ｃ２ｑへの結合を変更されている、及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減されるか、若しくは消失させられているように、アミノ酸残基から選択される、１つ又は複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置きかえられうる。この手法については、米国特許第６，１９４，５５１号において、さらに詳細に記載されている。

【0154】

本明細書で想定されている、本明細書における抗体の別の修飾は、ＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を延長するようにＰＥＧ化されうる。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はその断片は、典型的に、ＰＥＧの反応性のエステル又はアルデヒド誘導体など、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つ又は複数のＰＥＧ基が、抗体又は抗体断片と接合される条件下で反応させられる。ＰＥＧ化は、反応性のＰＥＧ分子（又は類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応により実行されうる。本明細書で使用される、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコール又はアリールオキシポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することが意図される。一部の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化するための方法が公知であり、本開示の抗体へも適用されうる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号、及びＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照されたい。

【0155】

本明細書で想定される抗体の別の修飾は、結果として得られる分子の半減期を延長するための、本開示の抗体の、少なくとも抗原結合性領域の、ヒト血清アルブミン又はその断片など、血清タンパク質へのコンジュゲート又はタンパク質融合である。

【0156】

一部の実施形態では、本開示はまた、多特異性抗体も提示する。本開示の多特異性抗体分子のための、例示的なフォーマットは、（ｉ）１つの抗体が、ＢＴＮ２Ａに対する特異性を伴い、別の抗体が、第２の抗原に対する特異性を伴う、化学的ヘテロコンジュゲーションにより架橋された、２つの抗体；（ｉｉ）２つ異なる抗原結合性領域を含む、単一の抗体；（ｉｉｉ）付加的ペプチドリンカーにより、インタンデムに連結された、２つの異なる抗原結合性領域、例えば、２つのｓｃＦｖを含む単鎖抗体；（ｉｖ）各軽鎖及び各重鎖が、２つずつの可変ドメインを、短いペプチド連結を介する、タンデムで含有する、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ（ＴＭ））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ」：「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２０１０）；（ｖ）化学連結された二特異性の（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）２つの単鎖ダイアボディーの融合体であることの結果として、標的抗原の各々に対して、２つずつの結合性部位を有する、四価の二特異性抗体もたらす、Ｔａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）ｓｃＦｖの、ダイアボディーとの組合せであることの結果として、多価分子もたらす、フレキシボディー；（ｖｉｉｉ）Ｆａｂへと適用されると、異なるＦａｂ断片へと連結された、２つの同一なＦａｂ断片からなる、三価の二特異性結合性タンパク質をもたらしうる、プロテインキナーゼＡにおける「二量体／ドッキングドメイン」に基づく、いわゆる、「ドックアンドロック」分子；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂアームの両末端へと融合された、２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子；並びに（ｘ）ダイアボディーを含むがこれらに限定されない。二特異性抗体のための、別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体を強いる、相補性のＣＨ３ドメインを伴う、ＩｇＧ様分子である。このような分子は、例えば、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ技術（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＫＩＨ（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）技術（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術（Ｒｏｃｈｅ）及び静電マッチ技術（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ技術（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ技術（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ技術（Ｍｅｒｕｓ）、及びＤｕｏＢｏｄｙ技術（ＧｅｎｍａｂＡ／Ｓ）として公知の技術など、公知の技術を使用して調製されうる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、典型的に、ＤｕｏＢｏｄｙ技術を使用する、制御型Ｆａｂアーム交換を介して得られるか、又は得ることが可能である。制御型Ｆａｂアーム交換により、二特異性抗体を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法については、国際公開第２００８１１９３５３号及び国際公開第２０１１１３１７４６号（いずれも、Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓによる）において記載されている。国際公開第２００８１１９３５３号において記載されている、１つの例示的な方法では、二特異性抗体は、還元条件下のインキュベーションにおける、両方が、ＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む、２つの単一特異性抗体の間の「Ｆａｂアーム」交換又は「半分子」交換（重鎖と、接合された軽鎖とのスワッピング）により形成される。結果として得られる生成物は、異なる配列を含みうる、２つのＦａｂアームを有する、二特異性抗体である。国際公開第２０１１１３１７４６号において記載されている、別の例示的な方法では、本開示の二特異性抗体は、以下のステップ：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含む、第１の抗体を用意するステップと；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含む、第２の抗体を用意するステップであって、前記第１のＣＨ３領域と、第２のＣＨ３領域とのヘテロ二量体相互作用が、前記第１のＣＨ３領域及び第２のＣＨ３領域の、ホモ二量体相互作用の各々より強くなるように、前記第１のＣＨ３領域の配列と、第２のＣＨ３領域の配列とが異なるステップと；ｃ）前記第１の抗体を、前記第２の抗体と併せて、還元条件下でインキュベートするステップと；ｄ）前記二特異性抗体を得るステップであって、第１の抗体が、本開示の抗体であり、第２の抗体が、異なる結合特異性を有するか、又はこの逆であるステップとを含み、第１の抗体及び第２の抗体のうちの少なくとも１つが、本開示の抗体である方法により調製される。還元条件は、例えば、２－メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンから選択される還元剤を、例えば、添加することによりもたらされうる。ステップｄ）は、例えば、脱塩による、例えば、還元剤の除去により、条件を、非還元条件又は低度の還元条件へと回復させることをさらに含みうる。典型的に、第１のＣＨ３領域の配列と、第２のＣＨ３領域の配列とは、前記第１のＣＨ３領域と、第２のＣＨ３領域とのヘテロ二量体相互作用が、前記第１のＣＨ３領域及び第２のＣＨ３領域の、ホモ二量体相互作用の各々より強くなるように、少数の、かなりの程度において保存的な、非対称的変異だけを含み、異なる。これらの相互作用についてのさらなる詳細、及びこれらの相互作用がどのようにして達成されうるのかについては、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１１３１７４６号において提示されている。以下は、任意選択で、Ｆｃ領域の一方又は両方が、ＩｇＧ１のアイソタイプである、対称的変異などの組合せについての、例示的な実施形態である。

【0157】

したがって、本開示は、本明細書で記載される抗ＢＴＮ２Ａ抗体を含む、二特異性抗体又は多特異性抗体（また、二特異性分子又は多特異性分子とも命名される）を提起する。したがって、本開示は、ＢＴＮ２Ａに対する、少なくとも１つの第１の結合特異性、例えば、本明細書で開示される抗体の、１つの抗原結合性部分と、第２の標的エピトープに対する、第２の結合特異性とを含む二特異性分子を含む。例えば、本開示に従う二特異性分子は、少なくとも、
配列番号３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号４を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号５を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号７を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号８を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３、又は
配列番号２１を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２２を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ２、配列番号２３を含む、重鎖可変領域であるＣＤＲ３、配列番号２４を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ１、配列番号２５を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む、軽鎖可変領域であるＣＤＲ３
を含む、１つの抗原結合性部分を含みうる。

【0158】

一実施形態では、二特異性分子は、ＢＴＮ３に対する、第２の結合特異性を含む。より詳細には、二特異性分子は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する、抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の抗原結合性部分をさらに含む場合があり、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させうる。

【0159】

加えて、二特異性分子が、多特異性である実施形態では、分子は、第１の標的エピトープ及び第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含みうる。

【0160】

一実施形態では、本明細書で開示される二特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１種の抗体、又は例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディー若しくは単鎖Ｆｖを含む、その抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖二量体若しくは重鎖二量体、又はＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているＦｖ構築物若しくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でもありうる。

【0161】

本明細書で開示される二特異性分子において用いうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及びヒト化モノクローナル抗体である。

【0162】

医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば、薬学的に許容できる担体と併せて製剤化される、本明細書で開示される、少なくとも１種の抗体を含有する医薬組成物を提示する。このような組成物は、上記で記載した抗体のうちの１つ又は組合せ（例えば、２つ又はこれを超える異なる抗体）を含みうる。本明細書で開示される医薬組成物はまた、組合せ療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせても投与されうる。

【0163】

例えば、本発明の抗体は、典型的に、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗炎症剤、又は別の抗増殖剤と組み合わされうる。組合せ療法で使用されうる治療剤の例については、下記の、本開示の抗体の使用についての節で、より詳細に記載される。

【0164】

本明細書で使用される、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性の担体など、任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤、並びにこれらの担体の全てを含む。担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄内投与、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適するものとする。一実施形態では、担体は、皮下経路に適するものとする。

【0165】

投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体は、化合物を、酸、及び化合物を不活化させる、他の天然の条件の作用から保護する材料でコーティングされうる。医薬組成物の形態、投与経路、投与量、及び投与レジメンは、当然ながら、処置される状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。

【0166】

本開示の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、又は眼内投与などのために製剤化されうる。

【0167】

本発明の使用及び方法
本開示の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける、診断的有用性及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、様々な障害を処置、防止、又は診断するように、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、培養物における細胞へと投与される場合もあり、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの対象において投与される場合もある。

【0168】

本開示の抗体は、単球の、表現型、サイトカイン分泌、及び／又はＴ細胞阻害特性との関係における、腫瘍促進性Ｍ２マクロファージへの分化を阻害する抗ＢＴＮ２Ａ１抗体である。

【0169】

代替的に、又は、好ましくは、加えて、本開示の抗体は、ＮＫ細胞の細胞膜におけるＢＴＮ２Ａ（とりわけ、ＢＴＮ２Ａ１）に直接結合し、それらの活性化、及びがん細胞に対する細胞傷害作用を誘発する。

【0170】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生、及び増殖をさらに活性化させうる。

【0171】

したがって、本開示の抗体は、がん患者において観察され、慢性感染症時にも観察される、免疫抑制機構を克服するのに使用されうる。

【0172】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、腫瘍環境の免疫抑制作用を低減するのに使用されうる。

【0173】

本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ抗体はまた、ＮＫ細胞及び／又はＴｈ１細胞の両方を、腫瘍微小環境に対して作用させ（Ｍ１への分極及び／又はＭ２の阻害を介して）、ＮＫ細胞コンパートメントにも直接作用させることにより、これらの両方の細胞傷害効果も強化しうる。

【0174】

一部の実施形態では、本開示の抗体（本明細書で記載される１０７Ｇ３抗体及びそのバリアントなど）は、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生、及び増殖をさらに活性化させる。したがって、このような抗体は、３つの免疫細胞コンパートメント：ＮＫ細胞、マクロファージ、及びγδ Ｔ細胞に対して、併せて作用する可能性を有し、したがって、がん処置のための、とりわけ、充実性腫瘍の処置のための強力なツールを表す。

【0175】

前臨床研究は、ＮＫ細胞が、骨髄系統白血病性細胞を死滅させうることを、堅固に裏付けている。しかし、ＣＭＬでは、例えば、ＮＫ細胞は、疾患の進行と共に数が減少し、刺激に対する応答が低下し、細胞溶解活性の低減を呈する。ＡＭＬでは、ＮＫ細胞の、高度の細胞溶解活性はまた、診断及び寛解の両方において、患者の良好な長期転帰も予測する（Ｃａｒｌｓｔｅｎ Ｍ、Ｊａｒａｓ Ｍ、「Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｔｏ Ｂｏｌｓｔｅｒ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ」、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１９）。したがって、一部の実施形態では、ＮＫ細胞活性化特性を呈する本発明の抗体は、ＮＫ細胞の機能を回復させる養子移入ＮＫ細胞療法、及び／又はそれらの細胞傷害作用を誘発若しくは改善する養子移入ＮＫ細胞療法などのＮＫ細胞療法と組み合わせて使用されうる。特に、本出願の抗体は、通例、ＮＫ細胞による殺滅に対して耐性である、充実性腫瘍の処置において使用されうる。本明細書で使用される、「がん」、「過剰増殖性」、及び「新生物性」という用語は、自己増殖に対する能力、すなわち、急速増殖性の細胞増殖により特徴づけられる、異常な段階又は状態を有する細胞を指す。過剰増殖性状態及び新生物性疾患状態は、病理学的状態、すなわち、疾患状態を特徴づけるか、又は構成する状態として類別される場合もあり、非病理学的状態、すなわち、正常状態からの逸脱ではあるが、疾患状態とは関連しない状態として類別される場合もある。用語は、浸潤性の組織病理学的種類又は組織病理学的段階に関わらず、がん性増殖若しくは発がん性過程、転移性組織、又は悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、若しくは悪性形質転換臓器の全ての種類を含むことが意図される。

【0176】

「がん」又は「新生物」という用語は、肺、乳腺、甲状腺、リンパ系、消化器、及び生殖泌尿器に影響を及ぼす悪性腫瘍など、多様な臓器系の悪性腫瘍のほか、大半の結腸がん、肺扁平上皮がん、皮膚がん又は膣がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺非小細胞がん、肺小細胞癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸部腺癌、膵がん、小腸がん、並びに食道がんなどの悪性腫瘍を含む腺癌、並びに、一般に、前記がんを患う対象における、γδ Ｔ細胞の、活性化及び／又は増殖に対する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける刺激により処置されうる、任意のがんを含む。

【0177】

がんの例は、Ｂ細胞リンパ系新生物、Ｔ細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ－ＮＨＬ、Ｔ－ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ－細胞リンパ系新生物、及び急性骨髄性白血病を含む骨髄細胞系統新生物などの血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない。

【0178】

非血液がんの例は、結腸がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、脳がん、前立腺癌、頭頸部がん、膵臓がん、膀胱がん、結腸直腸がん、骨がん、子宮頸がん、肝がん、口腔がん、食道がん、甲状腺癌、腎がん、胃がん、精巣がん、及び皮膚がんを含むがこれらに限定されない。

【0179】

慢性感染症の例は、慢性肝炎、肺感染症、下気道感染症、気管支炎、インフルエンザ、肺炎、及び性感染疾患など、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、又は真菌感染症を含むがこれらに限定されない。

【0180】

したがって、本開示は、それを必要とする対象における、上記で開示された障害のうちの１つを処置するための方法であって、治療有効量の、上記で開示された、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を含む方法に関する。

【0181】

上記で開示された使用のための抗体は、唯一の有効成分として投与される場合もあり、例えば、サイトカイン、抗ウイルス剤、抗炎症剤、又は細胞傷害剤、抗増殖剤、化学療法剤若しくは抗腫瘍剤、細胞療法生成物（例えば、γδ Ｔ細胞組成物又はＮＫ細胞組成物）、例えば、前述の疾患の処置又は防止のための、他の薬物と共に、例えば、これらへのアジュバントとして、又はこれらと組み合わせて投与される場合もある。

【0182】

例えば、上記で開示された使用のための抗体は、細胞療法、特に、γδ Ｔ細胞療法、ＮＫ細胞療法、化学療法、抗新生物剤、又は免疫療法剤と組み合わせて使用されうる。

【0183】

本明細書で使用される、「細胞療法」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、少なくとも治療有効量の細胞組成物の、それを必要とする対象への投与を含む治療を指す。患者へと投与される細胞は、同種細胞の場合もあり、自家細胞の場合もある。「γδ Ｔ細胞療法」という用語は、細胞組成物が、有効成分として、γδ Ｔ細胞、特に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞（養子γδ Ｔ細胞移入、又はキメラ抗原受容体発現γδ Ｔ細胞など）を含む細胞療法を指す。「ＮＫ細胞療法」という用語は、細胞組成物が、有効成分として、養子ＮＫ細胞移入又はキメラ抗原受容体発現ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）などのＮＫ細胞を含む細胞療法を指す。

【0184】

細胞療法生成物とは、前記患者へと、治療目的で投与される細胞組成物を指す。前記細胞療法生成物は、治療有効用量の細胞と、任意選択で、さらなる賦形剤、アジュバント、又は他の薬学的に許容できる担体とを含む。

【0185】

適切な抗新生物剤は、限定せずに述べると、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシル、メルファラン、ニトロソウレア、テモゾロミドなど）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、エポチロン、Ｉ型トポイソメラーゼの阻害剤（イリノテカン又はトポテカンなど）、ＩＩ型トポイソメラーゼの阻害剤（エトポシド、テニポシド、又はタフルポシドなど）、ヌクレオチド類似体及びヌクレオチド前駆体の類似体（アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、又はチオグアニンなど）、ペプチド抗生剤（カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなど）、レチノイド（トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテンなど）、ビンカアルカロイド及び誘導体（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなど）、キナーゼ阻害剤（イブルチニブ、イデラリシブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデジブなど）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブなど）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット又はロミデプシンなど）などのターゲティング療法を含みうる。

【0186】

免疫療法剤の例は、限定せずに述べると、ｐＡｇ（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）（例えば、ゾレドロン酸又は他のビスホスホネート）、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、及びサイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ－２など）（Ｃｈｏｕｄｈｒｙ Ｈら、２０１８、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）（Ｐａｔｉｄａｒ Ｍら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、２０１６）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）（Ｃａｃｃａｍｏ Ｎ．ら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．、２０１２）、又はインターロイキン３３（ＩＬ－３３）（Ｄｕａｕｌｔ Ｃら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１６））、又はリンパ球の活性（例えば、増殖又はサイトカイン産生又は代謝の変化）を誘導することが可能な、これらの組換え形態及びこれらの誘導体、又は任意のサイトカインを含む。「誘導体」という用語は、ＰＥＧ化（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖へのコンジュゲーション）、アミノ酸の欠失、置換、若しくは挿入などの変異、又は強化剤との会合（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃへと融合された、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体であって、加えて、ＩＬ－１５が、この複合体を、ＩＬ－２及びＩＬ－１５Ｒβγのスーパーアゴニストとする生物学的活性を、さらに増大させる変異（ａｓｎ７２ａｓｐ）がなされる複合体）（Ｒｈｏｄｅ ＰＲら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．、２０１６）（Ｂａｒｒｏｓｏ－Ｓｏｕｓａ Ｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．、２０１８）に依拠しうる、任意のサイトカイン修飾について使用される。

【0187】

「ＩＬ－２」という用語は、その一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン２を指す。ＩＬ－２は、ＩＬ－２受容体に結合することにより、主に、リンパ球活性を調節する。

【0188】

「ＩＬ－１５」という用語は、その一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン１５を指す。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）と、共通ガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）とから構成される複合体に結合し、これを介してシグナル伝達する。ＩＬ－１５は、Ｔ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖を調節する。

【0189】

「ＩＬ－２１」という用語は、その一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン２１を指す。ＩＬ－２１は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞による細胞傷害作用を増強すること、形質細胞分化をモジュレートすること、Ｔｒｅｇ細胞を阻害することを含むがこれらに限定されない、多面的な特性の一因とされている。

【0190】

「ＩＬ－３３」という用語は、その一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン３３を指す。組織ストレス又は組織損傷において放出されるアラーミンと考えられるＩＬ－３３は、ＩＬ－１ファミリーのメンバーであり、ＳＴ２受容体に結合する。ＩＬ－３３は、Ｔ_Ｈ１免疫細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びＣＤ８ Ｔリンパ球の有効な刺激因子として公知である。

【0191】

「ＰＤ－１」という用語は、当技術分野における、その一般的な意味を有し、プログラム死１受容体を指す。「ＰＤ－１」という用語はまた、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、ＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、及びＢＴＬＡ（Ｂ－ ａｎｄ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ＲＪら、２００５、Ｒｉｌｅｙ ＪＬら、２００５）を含む、受容体のＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達ファミリーに属する、Ｉ型膜貫通タンパク質も指す。

【0192】

「抗ＰＤ－１抗体」又は「抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、当技術分野における、その一般的な意味を有し、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１のそれぞれに対する結合アフィニティー、及び、ＰＤ－１に対するアンタゴニスト活性を伴い、すなわち、ＰＤ－１と関連するシグナル伝達カスケードを阻害し、ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２）への結合を阻害する抗体を指す。このような抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、それぞれ、受容体のＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達ファミリーの、他の亜型又はアイソフォーム（ＣＤ２８；ＣＴＬＡ－４；ＩＣＯＳ；ＢＴＬＡ）とのその相互作用より大きなアフィニティー及び効力で、ＰＤ－１を優先的に不活化させる。化合物が、ＰＤ－１アンタゴニストであるのかどうかを決定するための試験及びアッセイは、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５；Ｒｉｌｅｙら、２００５などにおいて記載されている通り、当業者により周知である。

【0193】

このような抗ＰＤ１抗体の例は、限定せずに述べると、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、又はアテゾリズマブを含む。

【0194】

前出に従い、なおさらなる態様では、本開示は、
治療有効量の、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体、及び少なくとも１つの第２の原薬の、例えば、共時的であるか、又は逐次的である共投与を含み、前記第２の原薬が、例えば、上記で指し示された、抗ウイルス剤若しくは抗増殖剤若しくは免疫療法剤、又はサイトカイン若しくは細胞療法生成物（γδ Ｔ細胞など）である、上記で規定された方法
を提示する。

【0195】

一実施形態では、本開示の抗体は、可溶性ＢＴＮ２Ａ１のレベル、又はＢＴＮ２Ａ１を発現する細胞のレベルを検出するのに使用されうる。これは、例えば、抗体と、ＢＴＮ２Ａ１（細胞の表面において発現されるＢＴＮ２Ａ１、又は例えば、血液試料中の可溶性ＢＴＮ２Ａ１）との複合体の形成を可能とする条件下で、試料（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料など）及び対照試料を、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体と接触させることにより達成されうる。試料及び対照において、抗体とＢＴＮ２Ａ１との間で形成される、任意の複合体が、検出及び比較される。本開示の組成物を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ及びフローサイトメトリーアッセイなど、当技術分野で周知の、標準的な検出法が実施されうる。

【0196】

したがって、一態様では、本開示は、試料における、ＢＴＮ２Ａ１（例えば、ヒトＢＴＮ２Ａ１抗原）の存在を検出するか、又はＢＴＮ２Ａ１の量を測定するための方法であって、抗体又はその部分と、ＢＴＮ２Ａ１との複合体の形成を可能とする条件下で、試料及び対照試料を、ＢＴＮ２Ａ１に特異的に結合する、本開示の抗体若しくはタンパク質、又はその抗原結合性領域と接触させるステップを含む方法をさらに提示する。次いで、複合体の形成が検出され、この場合、対照試料と比較した試料における、複合体形成の差違は、試料におけるＢＴＮ２Ａ１の存在を指し示す。

【0197】

また、本明細書で開示される組成物（例えば、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体、及び多特異性分子）と、使用のための指示書とからなるキットも、本開示の範囲内にある。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬、又は１つ若しくは複数の、さらなる抗体若しくはタンパク質をさらに含有しうる。キットは、典型的に、キットの内容物の、意図される使用を指し示す表示を含む。表示という用語は、キットにおいて、若しくはキットと共に供給されるか、又は他の形でキットに付随する、任意の書面又は記録素材を含む。キットは、患者が、上記で規定された、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体処置に応答する群に属するのかどうかについて診断するためのツールをさらに含みうる。

【0198】

別の治療戦略は、ヒト対象の試料から単離されたＮＫ細胞を選択的に活性化させる、本明細書で開示されるヒト化抗体の、薬剤としての使用に基づく。

【0199】

したがって、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）ＮＫ細胞を含む血液細胞、例えば、ＰＢＭＣを、対象の血液試料から単離するステップと、
（ｂ）ＮＫ細胞、任意選択で、他の腫瘍細胞又はアクセサリー細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ１の存在下で拡大するステップと、
（ｃ）拡大されたＮＫ細胞を回収するステップと、
（ｄ）任意選択で、拡大されたＮＫ細胞を製剤化し、治療有効量の、前記ＮＫ細胞を、対象へと投与するステップと
を含む方法に関する。

【0200】

本開示は、本明細書で開示されるヒト化抗体の、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ＮＫ細胞を、選択的に活性化させる、薬剤としての使用にさらに関する。ＣＡＲ ＮＫ細胞、及び養子ＮＫ細胞がん免疫療法におけるそれらの使用については、例えば、Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋら、「Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ」（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１９）において記載されている。

【0201】

本開示はまた、典型的に、がんを患う、それを必要とする対象の、ｉｎ ｖｉｖｏの、ＮＫ細胞療法における強化剤としての使用のための、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ１抗体にも関する。

【0202】

本明細書で使用された、ＮＫ細胞療法という用語は、それを必要とする対象への、少なくとも有効量のＮＫ細胞の投与を含む治療を指す。このようなＮＫ細胞は、同種の場合もあり、自家の場合もある。詳細な実施形態では、ＮＫ細胞は、特異的な遺伝子の、欠失又はノックアウトにより遺伝子操作される場合もあり、挿入又はノックインにより遺伝子操作される場合もある。詳細な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞を含む。ＮＫ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、拡大及び／又は精製されている場合がある。代替的に、ＮＫ細胞はまた、他の血液細胞を含み、例えば、免疫系の他の細胞を含む細胞組成物にも組み入れられうる。γδ Ｔ細胞療法に関する参考文献については、Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１９を参照されたい。

【0203】

したがって、本開示は、がん、例えば、血液悪性腫瘍、特に、急性骨髄性白血病などの白血病を患い、腫瘍細胞、例えば、血液腫瘍細胞を有する対象を処置する方法であって、
（ｉ）前記対象において、有効量の、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を投与するステップと、
（ｉｉ）前記対象において、有効量のＮＫ細胞組成物を投与するステップと、
を含み、前記有効量の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体が、前記ＮＫ細胞組成物により媒介される、前記腫瘍細胞に対する、抗腫瘍細胞溶解を強化する能力を有する方法に関する。本開示はまた、それを必要とする対象を処置するための方法であって、ＮＫ細胞、例えば、ＣＡＲ ＮＫ細胞と、本明細書で開示されるヒト化抗体との組合せ（共時的又は逐次的）投与を含む方法にも関する。

【0204】

代替的実施形態又はさらなる実施形態では、治療戦略はまた、ヒト対象の試料から単離されたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を、選択的に拡大及び／又は活性化させる、本明細書で開示されるヒト化抗体の、薬剤としての使用にも基づきうる。

【0205】

したがって、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を含む血液細胞、例えば、ＰＢＭＣを、対象の血液試料から単離するステップと、
（ｂ）Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞、任意選択で、他の腫瘍細胞又はアクセサリー細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ１の存在下で拡大するステップと、
（ｃ）拡大されたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を回収するステップと、
（ｄ）任意選択で、拡大されたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を製剤化し、治療有効量の、前記Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を、対象へと投与するステップと
を含む方法に関する。

【0206】

本開示は、本明細書で開示されるヒト化抗体の、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、選択的に拡大する、薬剤としての使用にさらに関する。ＣＡＲ γδ Ｔ細胞、及び養子Ｔ細胞がん免疫療法におけるそれらの使用については、例えば、Ｍｉｒｚａｅｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ、２０１６において記載されている。

【0207】

本開示の抗体はまた、人工Ｔ細胞受容体（また、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としても公知である）を調製するのにも使用されうる。例えば、抗体の可変領域は、スペーサーを介して、ＴＣＲの、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達細胞内ドメインへと連結され、Ｔ細胞の表面において産生される、Ｆａｂ又はｓｃＦｖを形成するのに使用されうる。このようなＣＡＲは、養子移入療法において、例えば、増殖性障害を処置するために使用されうる。

【0208】

本開示はまた、典型的に、がんを患う、それを必要とする対象の、ｉｎ ｖｉｖｏの、γδ Ｔ細胞療法における強化剤としての使用のための抗ＢＴＮ２Ａ１抗体にも関する。

【0209】

本明細書で使用される、γδ Ｔ細胞療法という用語は、それを必要とする対象への、少なくとも有効量のγδ Ｔ細胞の投与を含む治療を指す。このようなγδ Ｔ細胞は、同種の場合もあり、自家の場合もある。詳細な実施形態では、γδ Ｔ細胞は、特異的な遺伝子の、欠失又はノックアウトにより遺伝子操作される場合もあり、挿入又はノックインにより遺伝子操作される場合もある。詳細な実施形態では、前記γδ Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するγδ Ｔ細胞を含む。γδ Ｔ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、拡大及び／又は精製されている場合がある。代替的に、γδ Ｔ細胞はまた、他の血液細胞を含み、例えば、免疫系の他の細胞を含む細胞組成物にも組み入れられうる。γδ Ｔ細胞療法に関する参考文献については、Ｐａｕｚａ ＣＤ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１８；Ｊ Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ Ａ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１８を参照されたい。

【0210】

実際、いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、本開示の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体について提起される作用方式は、腫瘍細胞の表面において発現されるＢＴＮ２Ａ１へのその結合が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるそのカウンター受容体へのそのシグナル伝達を可能とするコンフォメーション変化を誘発することである。

【0211】

したがって、本開示は、がん、例えば、血液悪性腫瘍、特に、急性骨髄性白血病などの白血病を患い、腫瘍細胞、例えば、血液腫瘍細胞を有する対象を処置する方法であって、
（ｉ）前記対象において、有効量の、本明細書で開示される抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を投与するステップと、
（ｉｉ）前記対象において、有効量のγδ Ｔ細胞組成物を投与するステップと、
を含み、前記有効量の抗ＢＴＮ２Ａ１抗体が、前記γδ Ｔ細胞組成物により媒介される、前記腫瘍細胞に対する、抗腫瘍細胞溶解を強化する能力を有する方法に関する。本開示はまた、それを必要とする対象を処置するための方法であって、ＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ γδ Ｔ細胞と、本明細書で開示されるヒト化抗体との組合せ（共時的又は逐次的）投与を含む方法にも関する。

【0212】

本発明は、以下の図面及び例によりさらに例示される。しかし、これらの例及び図面は、いかなる形であれ、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0213】

【図1】抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂ同定を示す図である。Ａ．マウスの免疫化から、ｍＡｂのシーケンシングまでの、抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂのスクリーニングカスケードである。Ｂ．棒グラフは、一次ヒット選択時に、Ｌｕｍｉｎｅｘにおいて測定される、アフィニティー（Ｋ_Ｄ）範囲１つ当たりのクローンの数を示す。Ｃ．積上げ棒グラフは、一次ヒットスクリーニング（第１ラウンド）及び二次ヒットスクリーニング（第２ラウンド）時に、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生をモジュレートするそれらの能力に従い、中性（グレー）、アンタゴニスト（白）、又はアゴニスト（黒）と分類されたクローンの数を示す。

【図2】抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を増強することを示す図である。Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を、３例の健常ドナーのＰＢＭＣ（「材料及び方法」を参照されたい）から拡大し、表示の抗体を伴うか、又は伴わない、抗ＣＤ１０７ａ／ｂ抗体及びＧｏｌｇｉ ｓｔｏｐの存在下で、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を使用して、標的細胞と共に、３７℃で共培養した。４時間後、細胞を回収し、固定し、フローサイトメトリーにおいて解析した。Ａでは、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３上清、又は対照ハイブリドーマ培養培地を伴うか、又は伴わずに、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）、Ｌ－ＩＰＣ（膵腺癌）、及びＭＤＡ－ＭＢ－１３４（乳腺癌腫）を含む、異なる標的細胞株を使用した。棒グラフは、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒を描示する、ＣＤ１０７＋細胞の百分率を示す。Ｂでは、Ｄａｕｄｉ細胞を、表示濃度の、精製抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂ、又はアイソタイプ対照としての、関連しないマウスＩｇＧ１の存在下で、標的細胞として使用した。グラフは、ＥＣ_５０の計算を可能とする、用量反応曲線を示す。

【図3】抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、ＢＴＮ２Ａ１を認識するが、ＢＴＮ３を認識しないことを示す図である。ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞に、ＢＴＮ２Ａ１－ＣＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトした。Ａ．ヒストグラムは、精製抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（上、黒線）、精製抗ＢＴＮ３ １０３．２ｍＡｂ（下、黒線）、又はｍＩｇＧ１対照若しくはＩｇＧ２ａ対照（破線）で染色された、表示の細胞及びトランスフェクト細胞についての重合せ図を示す。トランスフェクト細胞については、ＣＦＰ＋細胞についてのゲーティングの後の染色を示す。Ｂ．グラフは、ＢＴＮ２Ａ１－ＣＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトされた、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞における、精製抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂの結合についての用量反応曲線を示す。全ての染色は、ＣＦＰ＋細胞についてのゲーティングの後で解析した。

【図4A】ＮＫ細胞及び単球におけるＢＴＮ２Ａの発現、並びに単球からＭ２マクロファージへの分極に対する、参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂの影響を示す図である。（Ａ）フローサイトメトリーにより評価される、非刺激ＨＤ－ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞及び単球における、対照アイソタイプ（グレー）と対比したＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２の発現（白）についての代表的ヒストグラムである。

【図4B】（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏの、Ｍ－ＣＳＦの存在下における、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ、又は１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３ ｍＡｂが誘導したマクロファージについての、代表的な、ＣＤ１４／ＣＤ１６３ドットプロットプロファイルである。分化の５日後、ＣＤ１４及びＣＤ１６３ドットプロットを、フローサイトメトリー解析により作成する。

【図5-1】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｍ２マクロファージ分極を、用量依存的に阻害することを示す図である。Ｍ１、Ｍ２、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮγによる復帰Ｍ２、及びＭ－ＣＳＦ誘導性マクロファージを、異なる濃度の１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で、５日間にわたり分極させ、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ１４（Ａ）及びＣＤ１６３（Ｂ）の発現を、フローサイトメトリーにより、非刺激細胞において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。

【図5-2】ＰＤＬ１（Ｃ）及びＣＤ８６（Ｄ）の発現を、フローサイトメトリーにより、非刺激細胞（Ｃ）又はＬＰＳ刺激細胞（Ｄ）において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。

【図5-3】ＩＬ－１０（Ｅ）及びＴＮＦα（Ｆ）を、ＬＰＳ刺激マクロファージ上清において、ＥＬＩＳＡにより定量した。結果を、ｐｇ／ｍＬ単位で表す。

【図6-1】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、単球からの「Ｍ２＋ＩＬ－４」誘導性分極を阻害することを示す図である。Ｍ１、Ｍ２、「Ｍ２＋ＩＬ４」、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮγによる復帰Ｍ２、及びＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４誘導性マクロファージを、１０μｇ／ｍＬの１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で、５日間にわたり発生させ、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ１４（Ａ）、ＣＤ１６３（Ｂ）、ＰＤＬ１（Ｃ）、ＤＣ－ＳＩＧＮ（Ｄ）の発現を、フローサイトメトリーにより、非刺激細胞（Ａ～Ｄ）において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。

【図6-2】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、単球からの「Ｍ２＋ＩＬ－４」誘導性分極を阻害することを示す図である。Ｍ１、Ｍ２、「Ｍ２＋ＩＬ４」、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮγによる復帰Ｍ２、及びＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４誘導性マクロファージを、１０μｇ／ｍＬの１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で、５日間にわたり発生させ、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ８６（Ｅ）の発現を、フローサイトメトリーにより、ＬＰＳ刺激細胞（Ｅ）において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。ＩＬ－１０（Ｆ）及びＴＮＦα（Ｇ）を、ＬＰＳ刺激マクロファージ上清において、ＥＬＩＳＡにより定量した。結果を、ｐｇ／ｍＬ単位で表す。

【図7】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、がん細胞誘導性Ｍ２分極を阻害することを示す図である。Ｍ１、Ｍ２、ＰＡＮＣ－１条件付け培地誘導性Ｍ２、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮγによる復帰Ｍ２、及びＰＡＮＣ－１条件付け培地誘導性マクロファージを、１０μｇ／ｍＬの１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で、５日間にわたり発生させ、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ１４（Ａ）、ＣＤ１６３（Ｂ）の発現を、フローサイトメトリーにより、非刺激細胞において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。ＩＬ－１０（Ｃ）及びＴＮＦα（Ｄ）を、ＬＰＳ刺激マクロファージ上清において、ＥＬＩＳＡにより定量した。結果を、ｐｇ／ｍＬ単位で表す。

【図8-1】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｍ２マクロファージを、炎症促進性Ｍ１マクロファージへと復帰させること：表現型及びサイトカイン分泌を示す図である。Ｍ１、Ｍ２を、単球から、５日間にわたり発生させた。５日後、１０μｇ／ｍＬの１０１Ｇ５ ｍＡｂ若しくは１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はアイソタイプ対照）、又はＩＦＮγを、Ｍ２マクロファージに、２日間にわたり添加し、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ１４（Ａ）、ＣＤ１６３（Ｂ）、ＰＤＬ１（Ｃ）の発現を、フローサイトメトリーにより、非刺激細胞（Ａ～Ｃ）において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。

【図8-2】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｍ２マクロファージを、炎症促進性Ｍ１マクロファージへと復帰させること：表現型及びサイトカイン分泌を示す図である。Ｍ１、Ｍ２を、単球から、５日間にわたり発生させた。５日後、１０μｇ／ｍＬの１０１Ｇ５ ｍＡｂ若しくは１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はアイソタイプ対照）、又はＩＦＮγを、Ｍ２マクロファージに、２日間にわたり添加し、ＬＰＳで、さらに２日間にわたり、刺激するか、又は刺激せずにおいた。ＣＤ８６（Ｄ）の発現を、フローサイトメトリーにより、ＬＰＳ刺激細胞（Ｄ）において解析した。結果を、それらの対応するアイソタイプ対照を差し引いた蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で表す。ＩＬ－１０（Ｅ）及びＴＮＦα（Ｆ）を、ＬＰＳ刺激マクロファージ上清において、ＥＬＩＳＡにより定量した。結果を、ｐｇ／ｍＬ単位で表す。

【図8-3】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｍ２マクロファージを、炎症促進性Ｍ１マクロファージへと復帰させること：表現型及びサイトカイン分泌を示す図である。

【図9-1】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｔ細胞増殖に対する、Ｍ２媒介性阻害及びＩＦＮγの分泌を解放することを示す図である。分化Ｍ１、分化Ｍ２、又は１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で誘導されたマクロファージを、同種ＯＫＴ３活性化ＣＴＶ標識付けＣＤ３＋ Ｔ細胞と共に、５日間にわたり共培養した。共培養の後、細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシン及びＧｏｌｇｉＳｔｏｐタンパク質阻害剤で、５時間にわたり刺激し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の数（Ａ及びＢ）、細胞内ＩＦＮγの産生（Ｃ及びＤ）を、フローサイトメトリーにより定量した。増殖を、ＣＴＶ色素（ベースラインとしての、０日目におけるＣＴＶシグナル）の希釈率により定量した。結果は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓにおいて較正された、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の絶対数（Ｂ）、又はＣＤ３＋ Ｔ細胞の百分率（Ｃ及びＤ）である。

【図9-2】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、Ｔ細胞増殖に対する、Ｍ２媒介性阻害及びＩＦＮγの分泌を解放することを示す図である。分化Ｍ１、分化Ｍ２、又は１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３ ｍＡｂ（又はこれらのアイソタイプ対照）の存在下で誘導されたマクロファージを、同種ＯＫＴ３活性化ＣＴＶ標識付けＣＤ３＋ Ｔ細胞と共に、５日間にわたり共培養した。共培養の後、細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシン及びＧｏｌｇｉＳｔｏｐタンパク質阻害剤で、５時間にわたり刺激し、細胞内ＩＦＮγの産生（Ｅ及びＦ）、及び増殖（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ ｄｉｍ）（Ｇ～Ｊ）を、フローサイトメトリーにより定量した。増殖を、ＣＴＶ色素（ベースラインとしての、０日目におけるＣＴＶシグナル）の希釈率により定量した。結果は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓにおいて較正された、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の絶対数（Ｅ、Ｆ、Ｉ、及びＪ）、又はＣＤ３＋ Ｔ細胞の百分率（Ｇ及びＨ）である。

【図10-1】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂの、精製ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害作用に対する効果を示す図である。（Ａ～Ｂ）精製ＮＫ細胞を、参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（又は対照アイソタイプ）と共に、ＩＬ－２又はＩＬ－２／ＩＬ－１５による刺激を伴い、５日間にわたり培養した。ＮＫ細胞の活性化は、非刺激ＮＫ細胞内、及びＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激ＮＫ細胞内の、ＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ２５（Ｂ）の発現（ＭＦＩ）を、表示のｍＡｂ又は対照アイソタイプの存在下で評価することにより査定した。

【図10-2】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂの、精製ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害作用に対する効果を示す図である。（Ｃ～Ｄ）精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激の存在下又は非存在下で、参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（又は対照アイソタイプ）と共に、一晩にわたりプレインキュベートし、次いで、ヒト腫瘍細胞株と共に、４時間にわたり共培養した。ＮＫ細胞の脱顆粒を、フローサイトメトリーにより、表示のｍＡｂ又は対照アイソタイプの存在下における、各腫瘍細胞株に対する、非刺激ＮＫ細胞内（Ｃ）、及びＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激ＮＫ細胞（Ｄ）内の、ＣＤ１０７αβの百分率として評価した。

【図10-3】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂの、精製ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害作用に対する効果を示す図である。（Ｅ）参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（又は対照アイソタイプ）を、共培養物の４時間前に、ＮＫ細胞又は標的細胞に加えて、あらかじめプレインキュベートした場合の、Ａ５４９細胞株に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒を、プレインキュベーションを伴わずに、共培養物へと添加されたｍＡｂと比較して示す。

【図11】参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂが、ＮＫ細胞の脱顆粒、及び腺癌細胞株に対する殺滅を増強することを示す図である。（Ａ）精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激の存在下又は非存在下で、参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（又は対照アイソタイプ）と共に、一晩にわたりプレインキュベートし、次いで、ＤＵ－１４５細胞株と共に、４時間にわたり共培養した。ＮＫ細胞の脱顆粒を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１０７αβ＋細胞の百分率として評価した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、４パラメータの用量反応曲線を使用して、ＮＫ細胞の脱顆粒の増強についてのＥＣ_５０を、表示のｍＡｂについて計算した。（Ｂ）精製ＮＫ細胞を、参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂ（又は対照アイソタイプ若しくはＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激）と共に、一晩にわたりプレインキュベートし、次いで、ＨＬ－６０及びＡ５４９細胞株と共に、４時間にわたり共培養した。ＮＫ細胞媒介性がん細胞死は、カスパーゼ３／７＋細胞の百分率を、表示のｍＡｂ又は対照アイソタイプの存在下で評価することにより査定した。

【図12-1】ＢＴＮ２Ａ１に対する参照ｍＡｂである、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０１Ｇ５ ｍＡｂ、及び抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂについてのビニング実験を示す図である。ビニング実験は、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）技術に基づくシステムである、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６プラットフォームにおいて実施した。１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５を、ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓタンパク質に対する、対応のあるコンビナトリアル方式で調べた。Ａ．１０７Ｇ３は、飽和ｍＡｂであり、１０１Ｇ５は、競合ｍＡｂである。

【図12-2】ＢＴＮ２Ａ１に対する参照ｍＡｂである、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０１Ｇ５ ｍＡｂ、及び抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂについてのビニング実験を示す図である。ビニング実験は、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）技術に基づくシステムである、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６プラットフォームにおいて実施した。１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５を、ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓタンパク質に対する、対応のあるコンビナトリアル方式で調べた。Ｂ：１０１Ｇ５は、飽和ｍＡｂであり、１０７Ｇ３は、競合ｍＡｂである。Ｃ：ｍＡｂの結合対及び自己遮断対についての、任意単位による測定である。

【図13-1】トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによる、ＢＴＮ２Ａ１ペプチドを示す図である。配列のうちの９６．３７％は、同定されたペプチドによりカバーされている。

【図13-2】トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによる、ＢＴＮ２Ａ１ペプチドを示す図である。配列のうちの９６．３７％は、同定されたペプチドによりカバーされている。

【図14】参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５の、ヒトＢＴＮ２Ａ１との相互作用を示す図である。Ａ．１０７Ｇ３／ＢＴＮ２Ａ１である。Ｂ．１０１Ｇ５／ＢＴＮ２Ａ１である。

【図15】ＢＴＮ２Ａ１／１０７Ｇ３間の相互作用を示す図である。ＢＴＮ２Ａ１のＰＤＢ構造である、４Ｆ９Ｐを、エピトープ部位において、グレーで着色した。青で着色された、ＢＴＮ２Ａ１のアミノ酸は、提示されたＢＴＮ２Ａ１配列の、６５～７８（ＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹ）、及び８４～１００（ＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳ）に対応している。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ：前面図（Ａ）；後面図（Ｂ）、側面図１（Ｃ）、側面図２（Ｄ）、及び上面図（Ｅ）についてのリボン／表面表示である。Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ：前面図（Ｆ）；後面図（Ｇ）、側面図１（Ｈ）、側面図２（Ｉ）、及び上面図（Ｊ）についてのリボン表示である。

【図16】ＢＴＮ２Ａ１／１０１Ｇ５間の相互作用を示す図である。ＢＴＮ２Ａ１のＰＤＢ構造である、４Ｆ９Ｐを、エピトープ部位において、グレーで着色した。青で着色された、ＢＴＮ２Ａ１のアミノ酸は、提示されたＢＴＮ２Ａ１配列の、２１２～２２９（ＫＳＶＲＮＭＳＣＳＩＮＮＴＬＬＧＱＫ）に対応している。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ：前面図（Ａ）；後面図（Ｂ）、側面図１（Ｃ）、側面図２（Ｄ）、及び上面図（Ｅ）についてのリボン／表面表示である。Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ：前面図（Ｆ）；後面図（Ｇ）、側面図１（Ｈ）、側面図２（Ｉ）、及び上面図（Ｊ）についてのリボン表示である。

【図17】カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログに対する参照ｍＡｂである、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０１Ｇ５ ｍＡｂ、及び抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂの交差反応性についての評価を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングする組換えヒトＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ融合タンパク質、又は組換えカニクイザルＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ融合タンパク質に結合する、１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５についての、ＥＬＩＳＡベースの測定である。グラフは、傾き可変モデルを使用する非線形回帰によるＥＣ５０の計算を可能とする、用量反応曲線を描示する。

【実施例】

【0214】

材料及び方法
細胞培養物、単球及びＮＫ細胞の分取：
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、地域の血液バンク（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）により提供される、健常ドナー（ＨＤ）に由来するＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）バフィーコートから得、密度勾配における遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ）により単離した。採取したてのＰＢＭＣを、３７℃で、５％ＣＯ_２、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充した、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ；Ｌｏｎｚａ）において培養した。

【0215】

製造元の指示書に従い、イージーセップ（ＥａｓｙＳｅｐ）（商標）Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する陰性選択により、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、採取したてのＰＢＭＣから分取した。製造元の指示書に従い、ＣＤ１４＋マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用することにより、ヒトＣＤ１４＋単球を分取した。１％Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１０％のＦＢＳ（全て、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）を補充したＲＰＭＩに、１ｍＬ当たりの細胞１０^６個の密度、３７℃で、５日間にわたり、単球を培養した。１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩにおいて、膵腺癌細胞株である、ＰＡＮＣ－１を培養した。９０％のコンフルエンシーまで増殖したら、培養培地を廃棄し、細胞を、１倍濃度のＰＢＳですすいだ。次いで、ＰＡＮＣ－１細胞を、５％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩにおいて、さらに２４時間にわたり培養した（上清を濃縮させるために、１７５ｃｍ^２のフラスコ１本当たり３０ｍＬ）。次いで、ＰＡＮＣ－１条件付け培地を回収し、濾過し（０．２μＭ）、使用まで、－２０℃で保管した。他のヒト細胞株、及びそれらの対応する培養培地を、下記の表１にまとめる。

【0216】

【表1】

【0217】

以下のヒト細胞株：Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）、ＭＤＡ－ＭＢ－１３４（乳管癌腫）、及びＨＥＫ－２９３Ｔ（胎児腎臓）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ヒト膵腺癌細胞株Ｌ－ＩＰＣ（ＰＤＡＣ０８７Ｔ）は、Ｊｕａｎ ＩＯＶＡＮＮＡ博士から恵与された。Ｄａｕｄｉ及びＪｕｒｋａｔ細胞のほか、ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％のピルビン酸Ｎａ、１％のＬ－グルタミン（全て、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充した、ＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。ＢＴＮ２の全てのアイソフォームの、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性不活化により、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞を発生させた（データは示さない）。ＭＤＡ－ＭＢ－１３４、Ｌ－ＩＰＣ、ＨＥＫ－２９３細胞、及びＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞を、１０％のＦＣＳを伴うＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。ハイブリドーマを、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ Ｉ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（１：２５０）、１％のグルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬのＰｅｎＳｔｒｅｐ（全て、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）において培養した。ハイブリドーマ上清を回収するために、ハイブリドーマを、Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅを伴わずに、４～５日間にわたり培養した。

【0218】

抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂの特異性を評価するために、製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞に、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２ ＣＦＰ（Ｎｔｅｒ）融合タンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３－Ｚｅｏ－ＢＴＮ２Ａ１－ＣＦＰプラスミドを、独立にトランスフェクトした。

【0219】

参照抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ １０７Ｇ３の同定
６種の異なるＭＨＣの組合せを保有する、４８匹のマウスを、組換えヒトＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ融合タンパク質で免疫化することにより、マウス抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体を作出した。２１日後に、マウスから採血し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを介して、ＢＴＮ２Ａ１特異的ポリクローナル抗体の血清力価を決定した。最高のＢＴＮ２Ａ１特異的抗体力価を呈するマウスを安楽死させた。陽性選択を介して、脾臓Ｂ細胞を単離し、ハイブリドーマを作出するために、骨髄腫細胞とのＰＥＧ誘導性融合を施した。

【0220】

ハイブリドーマを、限界希釈によりクローニングし、ハイブリドーマ上清に、標的特異性及びＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の脱顆粒を誘導するそれらの能力について、２ラウンドにわたるスクリーニングを施し（図１Ｃ及び図２）、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の同定をもたらした。これらのサブクローンのＶＨ領域及びＶＬ領域のシーケンシングを実施した（表１を参照されたい）。

【0221】

Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の拡大
エフェクターＶγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞は、０日目に始めて、ＨＶに由来するＰＢＭＣを、ソレドロネート（Ｓｉｇｍａ、１μＭ）、及び組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２（プロロイキン、２００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で培養することにより確立した。５日目から、ｒｈＩＬ－２を、隔日で補給し、合計１５日間にわたり、細胞密度を、１ｍＬ当たり１．１５×１０^６に保った。最終日に、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞の純度を、フローサイトメトリーにより査定した。８０％より高値の、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞純度に到達した細胞培養物だけを、機能試験において使用される細胞培養物として選択した。精製Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞は、使用まで凍結させた。

【0222】

Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
ＣＯＯＨ磁気ビーズ（Ｂｉｏｒａｄ）を、製造元の指示書に従い、ｒｈＢＴＮ２Ａ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ）へとコンジュゲートし、ビーズは、使用まで、保管緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）において、－２０℃で保管した。マウス血清の滴定のために、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液（Ｎａｎｏｔｏｏｌ）において、１：５０から始めて、希釈段階を１：４とする血清希釈系列を作り、１００μＬのビーズ懸濁液を、１００μＬの血清希釈液と混合し、ＲＴで、１時間にわたりインキュベートし、この後、ビーズを、洗浄緩衝液において、３回にわたり洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液に、１μｇ／ｍＬのビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃと共にインキュベートし、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液における、さらに３回にわたる洗浄を行った。最後に、ビーズを、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液に、１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンＰＥと共に、１時間にわたりインキュベートしてから、Ｌｕｍｉｎｅｘリード緩衝液（Ｎａｎｏｔｏｏｌ）における、３回にわたる最終的な洗浄を行った。ビーズを、Ｌｕｍｉｎｅｘリード緩衝液に再懸濁させ、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００／２００システムにおいて、データを収集した。ヒットの同定のために、３０μＬの上清を、９６ウェルプレートへと移し、９０μＬのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液を添加した。１００マイクロリットルのビーズ懸濁液を、１００μＬの上清希釈液と混合し、ＲＴで、１６時間にわたりインキュベートしてから、上記で記載したプロトコールへと進んだ。ヒットの同定のために、標的に対するアフィニティーが最高であり、関連しない対照タンパク質（Ｒａｎｋ－Ｆｃ）に対するアフィニティーが最低であるビーズ懸濁液を選択した。アフィニティー／Ｋｄの計算のために、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ緩衝液における、４０．０００ｐＭで始め、希釈段階を１：４とする系列希釈を、ハイブリドーマ上清に施し、上記で記載した通りに解析した。Ｋｄは、対応する結合曲線の中点に対応する。

【0223】

フローサイトメトリー
ＦｌｏｗＪｏ １０．５．３ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用する、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸ、又はＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）における解析の前に、精製Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞（Ｔ細胞又は細胞株）であるＰＢＭＣを、指定のｍＡｂと共にインキュベートした。Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞脱顆粒アッセイに使用された抗体は、抗ＣＤ１０７ａ－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１０７ｂ－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ３－ＰｅＶｉｏ７００（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＰａｎＴγδ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｎｅａｒ ＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）であった。全ての免疫染色は、ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ヤギ抗マウス－ＰＥ １：１００（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｎｅａｒ ＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の存在下で、１０μｇ／ｍＬの精製ｍＡｂを使用して実施した。マウス抗ヒトＣＤ２７７（また、ＢＴＮ３Ａとしても公知である；ＩｇＧ２ａアイソタイプを伴うクローン１０３．２）については、既に開示された（国際公開第２０１２／０８０３５１号）。抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂの特異性を評価するために、トランスフェクションの２４時間後、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞（試料１例当たり５×１０^４個）を回収し、上記で記載した通り、表示濃度（５ｎｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ）の抗ヒトＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂで染色した。マウスＩｇＧ１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、染色についてのアイソタイプ対照として使用した。

【0224】

Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞についての機能アッセイ
ＨＶから精製されたＶγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞を、ｒｈＩＬ－２（２００ＵＩ／ｍＬ）において、一晩にわたり培養した。次いで、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞を、３７℃で、以下のｍＡｂ（表示の通りの、５０μＬのハイブリドーマ上清又は１０μｇ／ｍｌの精製ｍＡｂ）：抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ、ｍＩｇＧ１（アイソタイプ対照抗体）又はハイブリドーマ培養培地を伴うか、又は伴わずに、表示の標的細胞株（エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：１とする）と共に共培養した。イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を伴う、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ、２０ｎｇ／ｍＬ）を、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞の活性化についての陽性対照として使用した。第１ラウンドのハイブリドーマ上清スクリーニングのために、培養物上清を、４時間後に回収し、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞の活性化の指標としての、それらのＩＦＮγ含量について調べた。第２ラウンドのハイブリドーマ上清の特徴づけのために、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞脱顆粒を、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び可溶性ＣＤ１０７（ａ＆ｂ）－ＦＩＴＣの存在下における、４時間にわたるインキュベーションにより評価した。４時間後、細胞を回収し、ＰＢＳに２％のパラホルムアルデヒドにおいて固定し、ＦｌｏｗＪｏ １０．５．３ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用する、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において解析した。

【0225】

Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞の増殖
抗ＴＣＲγδマイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞を、健常ドナーのＰＢＭＣから単離した。フローサイトメトリーにより評価された、γδ－Ｔ細胞の純度は、８０％より大きかった。γδ－Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔにより、３７℃で、２０分間にわたり標識付けした。次いで、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識付け細胞５×１０^５個を、ｐＡｇを伴うか、又は伴わず、精製抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）を伴うか、又は伴わない、ＩＬ－２（２００ＵＩ／ｍｌ）の存在下にある、９６ウェル丸底プレートにおいて培養した。培養の５日後、ＦｌｏｗＪｏ １０．５．３ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を使用する、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において、フローサイトメトリーにより、ＣｅｌｌＴｒａｃｅの希釈率を査定した。

【0226】

統計学的解析：
Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞脱顆粒について、結果は、平均値±ＳＥＭとして表す。精製抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂの、ＢＴＮ２Ａ１トランスフェクトＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞に対するＥＣ_５０は、傾き可変モデルに従う非線形回帰の後における、ｌｏｇ（用量）反応曲線に基づき決定した。全ての解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実施した。

【0227】

参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ １０１Ｇ５の同定
ＶＨ及びＶＬのシーケンシングの後、上記で記載した、マウスハイブリドーマの作出から得られた、２３種の抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂを、キメラＩｇＧ１フォーマット下で作製した。略述すると、マウス抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂのＶＨ配列及びＶＫ配列を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を使用するＰＣＲにより増幅した。Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＰＣＲ生成物を、重鎖及び軽鎖の発現ベクター（ＭＩ－ｍＡｂ）にクローニングし、プラスミドにより、Ｓｔｅｌｌａｒ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を形質転換した。抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂをバリデーションするために、ベクターシーケンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を実施してから、さらなるトランスフェクションのためのプラスミドの、大スケール（ｍａｘｉ）の調製を行った。各抗ＢＴＮ２Ａクローンについて、マッチさせた軽鎖及び重鎖をコードするベクターを、重鎖／軽鎖の比を１：１．２として、ＨＥＫ－２９３細胞に、一過性にトランスフェクトし（１ｍＬ当たりの細胞２．９×１０^６個）、１８時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの７日後、ｍＡｂの精製のために、培養物上清を採取した。抗体のアフィニティー精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、４４℃で、一晩にわたり実施した。結合緩衝液は、０．５Ｍのグリシン、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．９であった。溶出は、以下の緩衝液：０．１Ｍのクエン酸ｐＨ３により実施した。１Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９（１０％ ｖ／ｖ）による溶出の直後に、試料を中和した。最後に、キメラ抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂを、１倍濃度のＰＢＳへと透析し、０．２２μＭのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。キメラ抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ濃度は、抗体の減衰係数を考慮に入れて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において決定した。ｍＡｂ単量体の画分により規定される純度は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ－ＨＣｌａｓｓ Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ）を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＢＥＨ－２００Ａ、１．７μｍ、４．６×５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）と共に使用する、ＵＰＬＣ－ＳＥＣにより決定した。抗体の質量は、逆相カラム（ＰＬＲＰ－Ｓ ４０００ Ａ、５μｍ、５０×２．１ ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する、Ｘｅｖｏ Ｇ２－Ｓ Ｑ－Ｔｏｆ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）において決定した。全ての試料は、３７℃で、ＰＮＧａｓｅ Ｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による脱グリコシル化の後で解析した。予測外の質量が見出された場合は、バイオインフォマティックスツールを使用して、一次アミノ酸配列を解析して、Ｆａｂ領域内の、推定グリコシル化部位を同定した。精製抗体に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥは、無染色型のＭｉｎｉ ｐｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ ｇｅｌ ４－１５（Ｂｉｏｒａｄ）による、最終素材の断片化及び／又は凝集の検出を可能とした。内毒素レベルは、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ分光光度計（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用する、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｋｉｎｅｔｉｃアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｅｎｄｏｓａｆｅ）を使用して決定した。

【0228】

ｉｎ ｖｉｔｒｏマクロファージ分極アッセイ：
Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージを、健常ドナーから分取された単球から分極させた。この目的で、分取された単球を、ＧＭ－ＣＳＦ又はＭ－ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下で培養して、それぞれ、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージを発生させた。５日後、結果として得られるマクロファージを、表現型解析のために回収するか、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で、さらに２日間にわたり刺激した。一部の実験では、４日目に、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）を、Ｍ２マクロファージへと添加したところ、これは、「Ｍ２＋ＩＬ－４」マクロファージの発生を結果としてもたらした。一部の実験では、Ｍ－ＣＳＦの補充を伴わずに、ＰＡＮＣ－１がん細胞で条件付けされた培地（０日目及び３日目に、培養培地において、３０％ ｖ／ｖに希釈された）の存在下で、単球を培養することにより、Ｍ２マクロファージを発生させた。本出願では、結果として得られるＭ２マクロファージを、「Ｔｕｍ－ｉｎｄ－Ｍ２」と呼ぶ。抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂを、Ｍ２分化をモジュレートする、それらの能力についてスクリーニングするために、上記で記載した通り、表示の濃度で、キメラ抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ、又はそれらのアイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１；Ｓｉｇｍａ）を伴うか、又は伴わずに、単球から、Ｍ２マクロファージを発生させた。全てのｍＡｂをウェットコーティングした（１倍濃度のＰＢＳにおいて、ＲＴで一晩にわたり）。Ｍ２分化の阻害についての対照として、ＧＭ－ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ）を、Ｍ－ＣＳＦ誘導性Ｍ２分極時の、単球へと添加した。ＧＭ－ＣＳＦの存在下で分極させたＭ１マクロファージを、表現型対照として使用した。分極の後、結果として得られるマクロファージ、及びそれらの培養物上清を回収し、細胞膜における、Ｍ１関連マーカー及びＭ２関連マーカーの発現を、フローサイトメトリーにより評価した。加えて、製造元の指示書に従い、ＩＬ－１０ ａｎｄ ＴＮＦα ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、培養物上清におけるサイトカイン含量を定量した。

【0229】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍ２マクロファージ復帰アッセイ：
Ｍ２マクロファージを、上記で記載した通り、参照ｍＡｂの非存在下、Ｍ－ＣＳＦの存在下で、単球から発生させた。Ｍ２マクロファージを回収し、ＬＰＳを伴うか、又は伴わずに、１０μｇ／ｍＬの参照抗体、又はそれらの対照アイソタイプｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ製のヒトＩｇＧ１）で、一晩にわたり、あらかじめウェットコーティングされた培養ウェルにおいて、２日間にわたり培養した。Ｍ２復帰の対照として、ＧＭ－ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍＬ）を、Ｍ２マクロファージ培養物へと、２日間にわたり添加した。ＧＭ－ＣＳＦの存在下で分極させたＭ１マクロファージを、表現型対照として使用した。復帰実験の後、ＬＰＳの添加を伴わずに復帰させられたマクロファージを、フローサイトメトリーによる表現型解析のために回収した。ＬＰＳ刺激により復帰させられたマクロファージからの培養物上清を、ＥＬＩＳＡを使用するサイトカイン定量のために採取した。

【0230】

Ｔ細胞増殖及びＩＦＮγ産生に対する、Ｍ２マクロファージ媒介性阻害についてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
上記で記載した通り、参照抗体、又はそれらのアイソタイプ対照ｍＡｂの添加を伴うか、又は伴わずに、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを発生させた。製造元の指示書に従い、ＣＤ３＋マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用することにより、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、健常ドナーＰＢＭＣから分取し、共培養まで凍結させた。活性化ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、以下の通りに作出した：ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、次いで、このような細胞１０^５個を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であらかじめコーティングされた９６ウェル平底プレートにおいて、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）、及びＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓ（ウェル１つ当たり５×１０^３個、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充されたＸ－Ｖｉｖｏ １０培地において培養した。マクロファージとの共培養のために、同種の、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、又はＭ－ＣＳＦ及び参照ｍＡｂ若しくはそれらの対照アイソタイプの存在下で分極させられたマクロファージ２×１０^４個を、同種の活性化ＣＤ３＋細胞へと添加した。共培養の５日後、サイトカイン産生を増強するために、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐタンパク質輸送阻害剤の存在下で、５時間にわたり、２０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び０，５μｇ／ｍＬのイオノマイシンを、共培養物へと添加した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーによる表現型解析のために回収した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅの希釈率を、ＣＤ３＋ Ｔ細胞増殖の指標として使用した。表現型及び増殖の結果は、１ｍＬ当たりの百分率又は絶対細胞数で表した（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓによる較正の後で）。

【0231】

参照抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂによるナチュラルキラー（ＮＫ）チャレンジ：
健常ドナーから分取されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を標識付けし、次いで、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）刺激を伴うか、又は伴わずに、１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓ、ＩＬ－２（５０ＵＩ／ｍＬ）を補充されたＲＰＭＩにおいて、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。０日目に、参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ又は対照アイソタイプ（１０μｇ／ｍＬ）を、培養物へと添加した。５日後、ＮＫ細胞を、活性化マーカーの発現について、細胞外表現型解析にかけた。ＮＫの活性化を、ＣＤ６９発現及びＣＤ２５発現（百分率及び蛍光強度中央値ＭＦＩ）の誘導により評価した。ＮＫ細胞についてのゲーティング戦略を、図４に示す。ＮＫ細胞による細胞傷害作用の測定のために、３例の健常ドナーから分取されたＮＫ細胞を、ＩＬ－２（５０ＵＩ／ｍＬ）及びＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を伴うか、又は伴わずに、ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、及び１％のＰ／Ｓにおいて、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ又は対照アイソタイプ（１０μｇ／ｍＬ）を、非刺激ＮＫ細胞、又はＩＬ－２／ＩＬ－１５で刺激されたＮＫ細胞に、一晩にわたり添加した。翌日、ＮＫ細胞を、表示の血液又は癌腫細胞株と、１：１の比で共培養し、ＦＩＴＣで標識付けされた抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１０７ｂ ｍＡｂ（全て、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を、共培養物へと添加し、４時間にわたりインキュベートした。ＮＫ細胞の脱顆粒を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１０７αβ＋細胞非刺激ＮＫ細胞、又はＩＬ－２／ＩＬ－１５刺激ＮＫ細胞における百分率として評価した。ＮＫ細胞の脱顆粒増強についてのＥＣ_５０の計算のために、参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ、及びそれらのアイソタイプ対照ｍＡｂを、０．００５ｎＭ～３００ｎＭの範囲の濃度で使用した。がん細胞における、ＮＫ細胞媒介性殺滅を評価するために、精製ＮＫ細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓを補充したＲＰＭＩにおいて、５％ＣＯ_２、３７℃で、１０μｇ／ｍＬの、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂ、又は対応するＩｇＧ１対照と共に、一晩にわたりプレインキュベートした。ＩＬ－２（５０ＵＩ／ｍＬ）及びＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を、陽性対照として使用した。翌日、ＮＫ細胞を、表示の、ＣｅｌｌＴｒａｃｅで標識付けされたがん細胞株と共に、１：１の比で、４時間にわたり共培養した。がん細胞の死は、腫瘍細胞株において、セルイベント（ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ）（商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、カスパーゼ３／７＋細胞の百分率を評価することにより査定した。

【0232】

フローサイトメトリー：
染色の前に、ＰＢＭＣ／ＮＫ細胞及び単球／マクロファージを、Ｆｃ受容体を飽和させるために、ヒトＦｃブロック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）又はヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）と共に、１０分間にわたりインキュベートした。使用された標識付けｍＡｂは、以下：ＣＤ１４－ＦＩＴＣ及びＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ１６３－ＶｉｏＢｌｕｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＤＣ－ＳＩＧＮ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ８０－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤＬ１－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３－ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ３－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＣＤ５６－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６９－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の通りであった。細胞を、抗体カクテルと共に、４℃で、３０分間にわたりインキュベートした。「生」ゲートを規定するのに、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｎｅａｒ ＩＲ ｄｙｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、死細胞を除外した。細胞内ＩＦＮγ染色のために、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞外染色細胞を、固定及び透過化し、ＡＰＣ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｔｉ－ＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートした。収集は、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを使用する、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において実施した。ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２についての表現型解析のために、精製抗ＢＴＮ２Ａ１特異的抗体（ｍＡｂ５）及び抗ＢＴＮ２Ａ２特異的抗体（ｍＡｂ１７）を、１０μｇ／ｍＬで使用し、ＰＥ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ａｎｔｉ－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により表現型を明示した。ＮＫ細胞は、単一細胞の選択後における、「生」ゲート内の、ＣＤ４５＋ ＣＤ１４－ ＣＤ３－ ＣＤ５６＋細胞であった。単球は、単一細胞の選択後における、「生」ゲート内の、ＣＤ４５＋ ＣＤ１９－ ＣＤ３－ ＣＤ５６－ ＣＤ１４＋細胞であった。収集は、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において実施し、データは、ＦｌｏｗＪｏ １０ソフトウェアを使用して解析した。結果は、対応する染色対照により得られた値を差し引いた後の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として表す。

【0233】

Ｏｃｔｅｔベースの、ＢＴＮ２Ａ１エピトープに対するアフィニティーの測定、及びビニングアッセイ：
キメラＩｇＧ１フォーマットにおける、参照抗ＢＴＮ２Ａ抗体の作出の後、この標的の、２つの異なるアイソフォーム（ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２）に対するアフィニティーを、査定し、競合アッセイを実施して、これらのｍＡｂが、ＢＴＮ２Ａ１の、同じエピトープ領域を認識したのかどうかを決定した。アフィニティー実験及びビニング実験を、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）技術に基づくシステムである、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６プラットフォーム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ／ＰＡＬＬ）において実施した。アフィニティー実験のために、製造元の指示書に従い、ＥＺリンク（ＥＺ－Ｌｉｎｋ）（商標）ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチニル化キットを使用して、組換えヒト（ｒｈ）ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ（ＧＴＰ）をビオチニル化させ、ビオチニル化ｒｈＢＴＮ２Ａ２－Ｆｃを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＢＴＮ２Ａ１アフィニティーアッセイの場合、ビオチニル化ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃを、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）へとロードし、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ １Ｘ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において、約１ｎｍのローディング標的レベルへと希釈し、キメラ抗ＢＴＮ２Ａ抗体を、解析物として使用した。ＢＴＮ２Ａ２アフィニティーアッセイのためには、キメラ抗ＢＴＮ２Ａ抗体を、上記で記載した通りに、ＦＡＢ２Ｇセンサー（抗ヒトＣＨ１；Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）へとロードし、ビオチニル化ｒｈＢＴＮ２Ａ２－Ｆｃを、解析物として使用した。いずれの場合にも、解析物は、溶液において維持し、それらの作業濃度は、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ １０Ｘ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において希釈した。１回目の試行には、標準的な作業濃度は、２００～３．１２５ｎＭの範囲にわたった。２回目の試行に必要な場合は、作業濃度を、８０～１．２５ｎＭに調整した。全ての試行（ローディング、平衡化、センサーの、解析物への会合／浸漬、解離、及び再生を含む）は、１０００ｒｐｍの振盪を伴う、３０℃で実施した。解析は、良好な当てはめ計算を可能とする、Ｏｃｔｅｔソフトウェアにより計算される、１：１又は２：１のラングミュアモデル（ＢＴＮ２Ａ１又はＢＴＮ２Ａ２のそれぞれについて）を使用して実施した。ビニング実験のために、Ｈｉｓタグ付けＢＴＮ２Ａ１（ｒｈＢＴＮ２Ａ－Ｈｉｓ）を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。参照抗ＢＴＮ２Ａ抗体を、ＢＴＮ２Ａ１に対して、対応のある形で調べた。ビニング実験は、以下の「インタンデム」フォーマットにより実施したが、これは、ｒｈＢＴＮ２Ａ－Ｈｉｓを、バイオセンサー（抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ「ＨＩＳ１Ｋ」バイオセンサー；ＦｏｒｔｅＢｉｏ／ＰＡＬＬ）に固定化し、２種の競合抗体へと、連続ステップで提示したことを意味する。この反応速度スクリーニングでは、ｒｈＢＴＮ２Ａ－Ｈｉｓの、ＨＩＳ１Ｋ（シグナル強度：１ｎｍ）へのローディングに続き、１０μｇ／ｍＬの抗体との、３分間にわたる会合ステップ、次いで、３分間にわたる解離ステップを行った。ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ活性は、ビニングアッセイと同じフォーマット（センサーにおけるリガンド／捕捉物質としてのＢＴＮ２Ａ１、及び解析物としての抗体）で実施される、反応速度スクリーニングアッセイを介して確認した。全ての抗体（飽和ｍＡｂ又は競合ｍＡｂ）を、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ １Ｘにおいて希釈される、１０μｇ／ｍＬで使用した。この反応速度スクリーニングでは、ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓの、ＨＩＳ１Ｋ（シグナル強度：１ｎｍ）へのローディングに続き、抗体との、３分間にわたる会合ステップ、次いで、３分間にわたる解離ステップを行った。アッセイステップは、以下の通り：「インタンデム」スキームに従う、ベースライン→抗原の捕捉→ベースライン→飽和抗体→ベースライン→競合抗体→再生であった。ビニングデータは、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１を使用する、エピトープビン計算を使用して解析した。

【0234】

参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５についてのエピトープマッピング
ＢＴＮ２Ａ１と、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３及び１０１Ｇ５との相互作用を、ＢＴＮ２Ａ１単独、又は１０７Ｇ３若しくは１０１Ｇ５を伴うＢＴＮ２Ａ１のペプチドマスフィンガープリントについての示差的評価により評価した。エピトープマッピングを開始する前に、ＣｏｖａｌＸ製のＨＭ４相互作用モジュール（ＣｏｖａｌＸ）を装備したＡｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して、それらの完全性及び凝集レベルを検証するために、ｒｈＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質（ＧＴＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して、高質量ＭＡＬＤＩ解析を実施し、これにより、ＢＴＮ２Ａ１の非共有結合的凝集物又は多量体が、試料中に存在しないことを確認した。ＢＴＮ２Ａ１を特徴づけ、ＢＴＮ２Ａ１／１０７Ｇ３及びＢＴＮ２Ａ１／１０１Ｇ５のエピトープを決定するために、本発明者らは、試料を、トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるタンパク質分解に続く、ｎＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－ＲＳＬＣシステムを、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結して使用する、ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ解析にかけた。ＢＴＮ２Ａ１／１０７Ｇ３複合体及びＢＴＮ２Ａ１／１０１Ｇ５複合体については、タンパク質複合体を、重水素化架橋剤と共にインキュベートしてから、多酵素切断にかけた。架橋ペプチドのエンリッチメントの後で、試料をアッセイし、ＸＱｕｅｓｔ ２．０ソフトウェア及びＳｔａｖｒｏｘ ３．６ソフトウェアを使用して、生成されたデータを解析した。試料調製のために、還元アルキル化は、以下の通りに実施した：室温で、１８０分間にわたるインキュベーション時間の前に、ＢＴＮ２Ａ１（４．０４μＭ）を、ＤＳＳ ｄ０／ｄ１２（２ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＦ）と混合した。インキュベーション後、室温で、１時間にわたるインキュベーションの前に、１μＬの重炭酸アンモニウム（２０ｍＭの最終濃度）を添加することにより、反応を停止させた。次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して、溶液を乾燥させてから、Ｈ_２Ｏに８Ｍの尿素に懸濁させた（１０μＬ）。混合の後、１μＬのＤＴＴ（５００ｍＭ）を、溶液へと添加した。次いで、混合物を、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、暗所、室温で、１時間にわたるインキュベーション時間の前に、１μｌのヨードアセトアミド（１Ｍ）を添加した。インキュベーション後、１００μｌのタンパク質分解緩衝液を添加した。トリプシン緩衝液は、５０ｍＭのＡｍｂｉｃ ｐＨ ８．５、５％のアセトニトリルを含有し、キモトリプシン緩衝液は、１００ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２ ｐＨ７．８を含有し、ＡＳＰ－Ｎ緩衝液は、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．８を含有し、エラスターゼ緩衝液は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ ８．０を含有し、テルモリシン緩衝液は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．５ｍＭのＣａＣｌ_２ ｐＨ９．０を含有する。トリプシンによるタンパク質分解のために、１００μＬの還元／アルキル化ＢＴＮ２Ａ１を、１μＬのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と、１／１００の比で混合した。タンパク質分解混合物を、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。キモトリプシンによるタンパク質分解のために、１００μＬの還元／アルキル化ＢＴＮ２Ａ１を、０．５μＬのキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と、１／２００の比で混合した。タンパク質分解混合物を、２５℃で、一晩にわたりインキュベートした。ＡＳＰ－Ｎによるタンパク質分解のために、１００μＬの還元／アルキル化ＢＴＮ２Ａ１を、０．５μＬのＡＳＰ－Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と、１／２００の比で混合した。タンパク質分解混合物を、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。エラスターゼによるタンパク質分解のために、１００μＬの還元／アルキル化ＢＴＮ２Ａ１を、１μＬのエラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と、１／１００の比で混合した。タンパク質分解混合物を、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。テルモリシンによるタンパク質分解のために、１００μＬの還元／アルキル化ＢＴＮ２Ａ１を、２μＬのテルモリシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と、１／５０の比で混合した。タンパク質分解混合物を、７０℃で、一晩にわたりインキュベートした。消化の後、最終濃度を１％とするギ酸を、溶液へと添加した。タンパク質分解の後、タンパク質分解により作出された、１０μＬのペプチド溶液を、以下の設定：Ａ：９５／０５／０．１ Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ ｖ／ｖ／ｖ；Ｂ：２０／８０／０．１ Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ ｖ／ｖ／ｖ、勾配：３５分間で、注入容量１０μＬにおけるＢを、５～４０％とする、プレカラム内径：３００μｍ×５ｍｍＣ１８ペップマップ（ＰｅｐＭａｐ）（商標）、プレカラム流量：２０μＬ／分、カラム内径：７５μｍ×１５ｃｍＣ１８ ＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ、カラム流量：２００ｎＬ／分で、ナノ液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－ＲＳＬＣ）へとロードした。

【0235】

ヒトＢＴＮ２Ａ１と、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１との交差反応性についてのＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＬＡＳＴ検索の後、ヒトＢＴＮ２Ａ１アミノ酸配列を使用して、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログ配列（ＸＭ＿０１５４４８９０６．１）を同定し、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ制限部位を使用して、その細胞外ドメインを、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１ＦＣ２ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）へとクローニングした。製造元の指示書に従う、エクスパイフェクタミン（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２９３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による、エクスパイ２９３Ｆ（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）（商標）細胞への、結果として得られるｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１ＦＣ２－ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１プラスミドのトランスフェクションにより、組換えｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ融合タンパク質を作製した。６日目に回収した細胞培養物上清を、アフィニティー精製カラムを通した精製のために使用した。精製ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質を、分子量及び純度の測定のための、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法により解析した。ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質の濃度は、ＢＳＡを標準物質とするブラッドフォードアッセイにより決定した。ＥＬＩＳＡのために、プレートを、ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質、又は組換えヒトＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ（ｈｕＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ；ＧＴＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１倍濃度のＰＢＳに、５μｇ／ｍＬ）により、４℃で、一晩にわたりコーティングした。ＰＢＳにおける、３回にわたる洗浄の後、プレートを、ＰＢＳに２％ ｖ／ｖのＢＳＡにより、室温で、１時間にわたり飽和させ、次いで、飽和ｍＡｂ緩衝液を廃棄した。参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３、又は対照ヒトＩｇＧ１を、ＰＢＳに２％のＢＳＡにおいて、１μＭから始めて、１ｐＭまでの１０倍希釈カスケードで希釈し、ウェル１つ当たりの各希釈液１００μＬを添加し、プレートシェーカーにおいて、室温で９０分間にわたりインキュベートした。Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；ＰＢＳに２％のＢＳＡにおける、１：１００００の希釈率）の添加、及び室温で、１時間にわたるインキュベーションの前に、全てのウェルを、ＰＢＳにおいて、３回にわたり洗浄した。次いで、全てのウェルを、ＰＢＳにおいて、３回にわたり洗浄し、Ｓｐａｒｋ分光計（Ｔｅｃａｎ）において、４０５ｎｍの吸光度により評価される結合を明らかにするために、１－ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。全ての試料を、二連で評価した。

【0236】

結果：
参照抗体である、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３の同定
参照抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３抗体は、以下の通りに同定した：マウスを、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ抗原で免疫化し、ＢＴＮ２Ａ１特異的血清の最高力価を呈するマウスに由来する脾臓細胞を回収し、骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを得た。ＢＴＮ２Ａ１に対する、最高のアフィニティー提示する、ハイブリドーマ培養物上清を、Ｖγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌をモジュレートする、それらの能力に基づく、第１ラウンドのスクリーニングのために選択した。この第１ラウンドのスクリーニングから選択されたクローンを、サブクローニングし、ＩＦＮ－γ分泌及びＶγ９／Ｖδ２－Ｔ細胞脱顆粒を誘導する、それらの能力、とりわけ、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の脱顆粒を誘導するそれらの能力について調べ（図１Ｃ及び図２）、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３の同定をもたらした。これらのサブクローンのＶＨ領域及びＶＬ領域のシーケンシングを実施した（下記の表２を参照されたい）。

【0237】

抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３抗体は、異なるがん細胞株標的に対して、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞の脱顆粒を誘導する
精製Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞を、健常ドナーのＰＢＭＣから拡大し、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ハイブリドーマ培養物上清を伴うか、又は伴わずに、標的細胞としての、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）細胞、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）細胞、Ｌ－ＩＰＣ（膵腺癌）細胞、及びＭＤＡ－ＭＢ－１３４（乳腺癌腫）細胞を含む、異なるがん細胞株と共に共培養した。図２及び表３に示される通り、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ハイブリドーマ上清の添加は、ＣＤ１０７＋脱顆粒細胞の百分率により測定される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能の、標的細胞単独を伴う共培養物、又は対照ハイブリドーマ培養培地の存在下にある共培養物と比較した誘導をもたらす。Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の、ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理は、予測される通り、標的細胞に依存しない、それらの細胞溶解機能の、最大の誘導をもたらす。

【0238】

抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ハイブリドーマ上清により誘導されるＣＤ１０７＋細胞の百分率は、対照ハイブリドーマ培養培地を伴う共培養物における、それぞれ、２４．９±４．７％及び４．９±０．４％と対比した、Ｄａｕｄｉ細胞における７１．１±７．４％～ＭＤＡ－ＭＢ－１３４細胞における１７．１±２．９％の範囲にわたった。Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の、標的としての、被験がん細胞株の全てとの共培養物では、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３は、対照ハイブリドーマ培養培地の存在下にある、同じ共培養物と比較して、２倍～８倍の間の、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒を誘導した。

【0239】

精製抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ １０７Ｇ３は、標的としてのＤａｕｄｉ細胞と、漸増濃度（０～１８μｇ／ｍｌ）の抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂの存在下で共培養された、ＣＤ１０７＋細胞の百分率により描示される、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒の誘導について、０．７７μｇ／ｍＬ（９５％ＩＣ：０．３２～１３．２２μｇ／ｍＬ）のＥＣ_５０を呈した（図２Ｂ）。

【0240】

【表2】

【0241】

抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３抗体は、ＢＴＮ２Ａ１を認識するが、ＢＴＮ３を認識しない
抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ １０７Ｇ３の、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォームだけに対する特異性を確立するために、両方のＢＴＮ２アイソフォームに対する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性不活化を保有する、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞に、ＢＴＮ２Ａ１をＣＦＰ融合タンパク質としてコードするプラスミドを、一過性にトランスフェクトした。図３Ａに示される通り、精製抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ １０７Ｇ３による染色は、ＢＴＮ２Ａ１をコードするプラスミドをトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞だけで検出され、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞単独では検出されなかった。

【0242】

全てのＢＴＮ３アイソフォームを認識する、抗ＢＴＮ３ ｍＡｂ １０３．２は、ＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞におけるＢＴＮ３の発現を、たやすく検出した。よって、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３は、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォームに特異的であり、ＢＴＮ３と交差反応しない。

【0243】

細胞内における、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂの、ＢＴＮ２Ａ１に対するアフィニティー
抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂの、その標的に対するアフィニティーを測定するために、ＢＴＮ２Ａ１をコードするプラスミドをトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ ＢＴＮ２ ＫＯ細胞を、漸増濃度（５ｎｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ）の精製抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂ又は対照ｍＩｇＧ１で染色した（図３Ｂ）。平均値蛍光強度データについての非線形回帰分析は、抗ＢＴＮ２Ａ１ １０７Ｇ３ ｍＡｂについて、０．３２μｇ／ｍＬ（９５％ＩＣ：０．２１～０．４６μｇ／ｍＬ）のＥＣ_５０を見出した。

【0244】

キメラ抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂの作製、アフィニティーの測定、及びＢＴＮ２Ａアイソフォームに対する特異性：
２３種のモノクローナル抗体を、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞において、一過性に作製し、異なる範囲の生産性を達成した。大半の抗ＢＴＮ２Ａ抗体は、高レベル（＞１００ｍｇ／Ｌであり、且つ、最大で４３０ｍｇ／Ｌ）で産生された。１種の抗体である、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ３（表３）は、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞における、６～８ｍｇ／Ｌの範囲の、極めて低度の産生を呈した。アミノ酸配列解析は、そのＦａｂ部分内における、Ｎグリコシル化部位を、そのＶＨのＣＤＲ１において明らかにした。他の２種の抗体である、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ９及び抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ１１もまた、それらのＦａｂ領域内において（ｍＡｂ９についての、ＣＤＲ１＿ＶＨ、及びｍＡｂ１１についての、ＣＤＲ１＿ＶＬにおいて）、Ｎグリコシル化部位を呈した。６種の抗体は、低純度レベル（＜９５％が単量体である）を呈したが、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ１及び抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ３だけは、純度レベルが＜９０％（それぞれ、８６％及び７５％）であった。全ての最終精製抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂは、極めて低レベル（０．１ＥＵ／ｍｇの範囲）の細胞内毒素を呈した。ｍＡｂ３だけは、他の抗体より高度の細胞内毒素レベル（０．７３ＥＵ／ｍｇ）を有したが、なおも、許容基準（＜１ＥＵ／ｍｇ）内にあった。ビオチニル化組換えＦｃ融合可溶性タンパク質を使用する、Ｏｃｔｅｔ技術を使用することにより、２３種の抗ＢＴＮ２ＡキメラｍＡｂのアフィニティー定数（Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、及びｋ_ｏｆｆ）を、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォーム及びＢＴＮ２Ａ２アイソフォームについて決定した。表４は、各抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂについて、Ｋ_Ｄ定数を再掲する。ｍＡｂ６及びｍＡｂ９について、Ｋ_Ｄの計算は、測定時に観察される解離の非存在（ｋ_ｏｆｆ＜１０^－７／秒）のために、可能でなかったが、これは、それらの標的からの解離を緩徐化させる、これらの抗体のアビディビィー効果により説明されるであろう。８種の抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂは、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォーム（ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、及びｍＡｂ１０）に結合することが見出され、８種の抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂは、ＢＴＮ２Ａ２アイソフォーム（ｍＡｂ１６、ｍＡｂ１７、ｍＡｂ１８、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２０、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２２、及びｍＡｂ２３）に結合することが見出され、７種のｍＡｂは、両方のアイソフォーム（ｍＡｂ１、ｍＡｂ７、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、及びｍＡｂ１５）に結合することが見出された。

【0245】

【表3】

【0246】

ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ２Ａ２の、単球及びＮＫ細胞の細胞膜における発現：
本発明者らは、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂが、末梢血の非Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞コンパートメント、すなわち、単球及びＮＫ細胞を、治療目的でターゲティングしうるのかどうかを決定しようと試みた。このため、本発明者らは、本発明者らのオクテットアッセイにおいて、ＢＴＮ２Ａ１又はＢＴＮ２Ａ２だけに結合することが見出された、ｍＡｂ５及びｍＡｂ１７のそれぞれを、末梢血に由来する、単球及びＮＫ細胞の表現型解析に使用した。図４に示される通り、抗ＢＴＮ２Ａ１ ｍＡｂ５だけが、単球及びＮＫ細胞の両方の細胞膜を染色したが、単球において、より強いシグナルが観察された。よって、単球及びＮＫ細胞の細胞膜では、ＢＴＮ２Ａ１は検出されたが、ＢＴＮ２Ａ２は検出されなかったことから、ＢＴＮ２Ａ１を認識するｍＡｂを、これらの免疫細胞コンパートメントの免疫機能をモジュレートする、それらの能力についてスクリーニングすることに対する根拠が与えられる。

【0247】

単球から、マクロファージへの分極をモジュレートする、それらの能力についての、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂのスクリーニング
それらの微小環境からのシグナルに応答して、単球は、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージへと分極させられうる。Ｍ１マクロファージが、炎症促進性及び抗腫瘍性特性を伴って存在するのに対し、Ｍ２マクロファージは、抗炎症性特性を有し、腫瘍の発症と関連する。単球の細胞膜では、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォームだけが見出されることを踏まえ、ＢＴＮ２Ａ１アイソフォームだけ、又はＢＴＮ２Ａ１／ＢＴＮ２Ａ２アイソフォームの両方を認識する抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、Ｍ－ＣＳＦの存在下で、単球の、Ｍ２マクロファージへの分極に干渉する、それらの能力について査定した。いずれも、ｍＡｂを伴わずに、ＧＭ－ＣＳＦ（ＣＤ１４＋／－ ＣＤ１６３－）の存在下で発生するＭ１マクロファージ、及びＭ－ＣＳＦの存在下で発生するＭ２（ＣＤ１４＋ ＣＤ１６３＋）マクロファージを、マクロファージ分極についての対照として使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、５日間にわたる分極の後、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ又はそれらの対照ＩｇＧ１の存在下で分極させられた、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、及びＭ－ＣＳＦ誘導性マクロファージの細胞膜における、ＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現を、フローサイトメトリーにより評価した（表４）。予測される通り、Ｍ１細胞が、低ＣＤ１４発現及び検出不能なＣＤ１６３発現を呈した（表５及び図４）のに対し、Ｍ２マクロファージは、両方のマーカーの高発現を呈した。興味深いことに、後出では１０１Ｇ５と呼ばれる、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ１は、Ｍ－ＣＳＦの存在下で、ＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現の、最も強力な低減を誘導し、Ｍ－ＣＳＦ誘導性マクロファージ分極を、Ｍ１様表現型へと偏らせた（表４及び図４Ｂ）。Ｍ－ＣＳＦ誘導性Ｍ２マクロファージ分極の、第２の最良の阻害剤は、１０７Ｇ３である、ｍＡｂ２であった（表５及び図４Ｂ）。これは、Ｍ－ＣＳＦ及び対照ＩｇＧ１の存在下で得られるマクロファージの、非処理Ｍ２マクロファージと類似する表現型と対照的である。

【0248】

【表4】

【0249】

図５は、ＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現阻害との関係で、アイソタイプ対照と比較した、参照１０１Ｇ５ 抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ及び参照１０７Ｇ３抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂの、Ｍ２阻害効果の用量依存性（図５Ａ及び５Ｂ）のほか、Ｍ１表現型に特徴的な、ＰＤＬ１及びＣＤ８６の発現の増大（図５Ｃ及び５Ｄ）を示す。サイトカイン分泌プロファイルはまた、Ｍ２マクロファージとＭ１マクロファージとを弁別する特徴でもある。よって、ＩＬ－１０（抗炎症性、Ｍ２関連）及びＴＮＦα（炎症促進性、Ｍ１関連）の、参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂを伴うか、又は伴わない、Ｍ－ＣＳＦ誘導性マクロファージ培養物上清からの分泌を、ＬＰＳ刺激の後におけるＥＬＩＳＡにより評価した。図５Ｅ及び５Ｆに示される通り、参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂは、ＩＬ－１０の分泌を、用量依存的に阻害し、ＴＮＦαの分泌を、アイソタイプ対照とは対照的に、用量依存的に増大させた。これらの観察は、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３が、Ｍ１様表現型へと偏らせることにより、表現型及びサイトカイン分泌との関係で、Ｍ－ＣＳＦ誘導性の、単球のＭ２マクロファージへの分極を阻害することを確認する。さらに、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３のこれらの効果は、用量依存的である。各ｍＡｂのＩＣ_５０及びＥＣ_５０を、表６に示す。ＰＤ－Ｌ１以外の、全てのパラメータについて、１０７Ｇ３と比較した１０１Ｇ５により、最低のＩＣ_５０及びＥＣ_５０が得られたことが注目される。

【0250】

【表5】

【0251】

腫瘍微小環境からの他の刺激も、Ｍ２マクロファージ分極を誘導することが記載されている（Ｍｏｓｓｅｒ及びＥｄｗａｒｄｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８；Ｍａｎｔｏｖａｎｉ及びＡｌｌａｖｅｎａ、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０１５）。Ｍ－ＣＳＦに加えて、Ｍ２分極を誘導するのに最も一般的に使用される刺激のうちの１つは、ＩＬ－４である。本発明者らは、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の、Ｍ－ＣＳＦ及びＩＬ－４による刺激の後、単球から発生する、いわゆる、腫瘍促進性「Ｍ２＋ＩＬ－４」マクロファージの分化に対する影響を決定した。このような条件下で、５日間にわたる培養の後、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、「Ｍ２＋ＩＬ－４」関連マーカーの発現（ＣＤ１４、ＣＤ１６３、及びＤＣ－ＳＩＧＮ；図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｄ）、及びＩＬ－１０の分泌（図６Ｆ）を阻害する一方で、Ｍ１関連マーカー（ＣＤ８６、ＰＤＬ１）の発現、及びＴＮＦαの分泌を増大させた（図６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｇ）。したがって、腫瘍促進環境下（Ｍ－ＣＳＦ及びＩＬ－４）で、１０１Ｇ４及び１０７Ｇ３は、「Ｍ２＋ＩＬ－４」分化を阻害し、炎症促進性Ｍ１マクロファージ分化を増強する。

【0252】

加えて、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の、単球からの、がん細胞誘導性Ｍ２分極に対する効果を、分取された単球を、ＰＡＮＣ－１（膵腺癌細胞株）で条件付けされた培養物上清の存在下で培養することにより評価した。１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３を、この状況下で添加したところ、Ｍ２関連マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６３）の発現、及びＩＬ－１０の分泌の減少（図７Ａ～７Ｃ）、並びにＭ１関連炎症促進性ＴＮＦαの発現の増大（図７Ｄ）により示される通り、Ｍ２分極は阻害された。

【0253】

参照ｍＡｂである、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ １０１Ｇ５及び抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ １０７Ｇ３の、Ｍ２マクロファージの、Ｍ１への再プログラム化に対する効果
Ｍ２分極マクロファージを、Ｍ１表現型へと復帰させる、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂの潜在的可能性について評価した。この目的で、Ｍ－ＣＳＦの存在下で、５日間にわたり分極させられた、前出のＭ２マクロファージを、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂでコーティングされた、前出のウェルに播種し、２又は４日間にわたり、さらに培養した。Ｍ２マクロファージの、ＩＦＮγによる処理を、Ｍ２→Ｍ１復帰についての陽性対照として用いた。図８に示される通り、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の存在下で培養されたＭ２マクロファージは、ＩＦＮγ処理と同様の、Ｍ１様表現型を獲得した。実際、Ｍ２マクロファージの、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂによる処理は、ＣＤ１４発現（図８Ａ）及びＣＤ１６３発現（図８Ｂ）の減少、並びにＣＤ８６発現の増大（図８Ｃ）を結果としてもたらした。１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３のそれぞれによる処理の後、ＰＤＬ１の、微弱な上方調節～上方調節の非存在が観察された（図８Ｄ）。さらに、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３による、Ｍ２マクロファージの処理は、ＩＬ－１０の分泌を阻害し（図８Ｅ）、ＴＮＦαの分泌を増強した（図８Ｆ）ことから、Ｍ１の表現型を指し示す。

【0254】

図８Ｇ～８Ｉは、ＣＤ１６３発現阻害との関係で、アイソタイプ対照と比較した、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂｏｎＭ２マクロファージの、Ｍ１マクロファージへの再プログラム化に対する効果の用量依存性（図８Ｇ）、ＩＬ－１０の減少、及びＴＮＦαの分泌の増大（図８Ｈ及び８Ｉ）を示す。各ｍＡｂのＩＣ_５０及びＥＣ_５０を、適切な特異的Ｍ１／Ｍ２マーカーについて、表７に示すが、ここで、抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂは、Ｍ２マクロファージの、Ｍ１マクロファージへの再プログラム化に対して、最良の活性を示す。

【0255】

【表6】

【0256】

参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ １０１Ｇ５及びｍＡｂ １０７Ｇ３は、Ｔ細胞増殖に対する、Ｍ２媒介性阻害を解放する
Ｍ２マクロファージの機能、すなわち、Ｔ細胞増殖に対する、Ｍ２媒介性阻害に影響を及ぼす、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５ ｍＡｂ及び１０７Ｇ３ ｍＡｂの能力について、探索した。この目的で、あらかじめ活性化させた同種ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、Ｍ１、Ｍ２、又はｍＡｂの存在下で発生したＭ２と共に共培養した。予測される通り、従来のＭ２マクロファージとの共培養は、Ｍ１マクロファージと比較した、ＣＤ３＋ Ｔ細胞数の減少のほか、Ｔ細胞増殖の減少（ＣＴＶの希釈率により評価される）、及びＩＦＮγの産生を結果としてもたらした（図９Ａ、９Ｃ、９Ｇ、９Ｅ、及び９Ｉ）。これに対し、対照ＩｇＧ１の存在下で発生したＭ２マクロファージの培養物と比較した、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の高百分率及び高絶対数により示される通り、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の存在下で発生したＭ２マクロファージは、Ｔ細胞増殖を阻害しないと考えられた（図９Ｂ、９Ｈ、及び９Ｊ）。さらに、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の百分率及び数もまた、対照ＩｇＧ１と比較した、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の存在下で発生したマクロファージを含有する共培養物において高値であった（図９Ｄ及び９Ｆ）。

【0257】

よって、Ｍ－ＣＳＦ単独により誘導されるＭ２マクロファージと対照的に、Ｍ－ＣＳＦに加えて、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の存在下で発生するマクロファージは、Ｍ１マクロファージと同様の、同種ＣＤ３＋ Ｔ細胞の増殖及びＴｈ１機能（ＩＦＮγの産生）を可能とする。

【0258】

参照抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ １０１Ｇ５及びｍＡｂ １０７Ｇ３は、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害作用を誘発する
ＢＴＮ２Ａ１は、ＮＫ細胞の細胞膜において見出されたので、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３が、ＮＫ細胞の活性化をモジュレートする潜在的能力について探索した。健常ドナーに由来する精製ＮＫ細胞を、さらなる活性化（それぞれ、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、又はＩＬ－２だけ）を伴うか、又は伴わない、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の存在下で、５日間にわたり培養した。図１０に示される通り、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３のいずれも、全ての被験条件下のＮＫ細胞の細胞膜において、ＣＤ６９の発現を増強した（図１０Ａ）。加えて、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３はまた、ＮＫ細胞の、ＩＬ－２及びＩＬ－１５による処理により誘導される、ＣＤ２５の発現も増強した（図１０Ｂ）。１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、精製ＮＫ細胞を活性化させることが可能であったので、本発明者らは、これらのｍＡｂがまた、ＮＫ細胞による細胞傷害作用も増強しうるのかどうかについて探索した。よって、がん細胞株である、ＨＬ－６０（骨髄性白血病）、ＨＴ－２９（結腸癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳腺腺癌）、及びＡ５４９（肺腺癌）に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒（ＣＤ１０７＋細胞の％）を、ＩＬ－２及びＩＬ－１５による刺激を伴うか、又は伴わない、１０１Ｇ５又は１０７Ｇ３の存在下で評価した。予測される通り、対照ＩｇＧ１の存在下で、ＨＬ－６０細胞だけが、ＮＫ細胞の脱顆粒を誘発し（図１０Ｃ）、これは、ＩＬ－２及びＩＬ－１５を伴う刺激により増強された（図１０Ｄ）。充実性腫瘍細胞株である、ＨＴ－２９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、及びＡ５４９に対する、適度なＮＫ細胞の脱顆粒はまた、対照ＩｇＧ１及びＩＬ２＋ＩＬ－１５の存在下でも観察された。表８は、これらの被験がん細胞株及び他の被験がん細胞株（Ｒａｊｉ、ＨＣＴ１１６、ＤＵ－１４５）に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒についてまとめる。興味深いことに、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５による刺激を伴わずに、充実性腫瘍細胞株である、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒を増強し、ＨＴ－２９に対しては低度に増強した。ＩＬ－２及びＩＬ－１５の添加は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、Ａ５４９細胞、及びＤＵ１４５細胞における、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の効果を強調した（表８）。ＨＬ－６０血液がん細胞株及びＲａｊｉ血液がん細胞株について、参照１０１Ｇ５ ｍＡｂ又は参照１０７Ｇ３ ｍＡｂの添加により、このような増強が観察されることはなかった（表８及び図１０Ｃ及び１０Ｄ）。加えて、参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、ｍＡｂを、共培養物へと、さらに添加せずに、共培養の前に、ＮＫ細胞と共にプレインキュベートされた場合に、Ａ５４９細胞に対して、ＮＫ細胞の脱顆粒を誘発することが可能であった（図１０Ｅ）。これは、がん細胞に対する細胞傷害作用を誘発するＮＫ細胞への直接的な結合による、参照ｍＡｂである、１０７Ｇ３ ｍＡｂ及び１０１Ｇ５ ｍＡｂの直接的な効果を示唆する。さらに、前立腺腺癌ＤＵ－１４５細胞株に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒の増強における、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の用量依存性について評価した。実際、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、ＤＵ－１４５細胞に対する、ＮＫ細胞の脱顆粒を、用量依存的に増強した（１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３について、それぞれ、ＥＣ_{５０（ｎｏ ｓｔｉｍ）}＝０．１４及び０．５４ｎＭ；ＥＣ_{５０（ＩＬ－２＋ＩＬ－１５）}＝０．０８及び０．２ｎＭ）。

【0259】

【表7】

【0260】

最後に、本発明者らは、精製ＮＫ細胞の、白血病細胞株ＨＬ－６０又は肺腺癌細胞株Ａ４５９との共培養の後における、カスパーゼ３／７細胞の百分率を評価することにより、がん細胞に対するＮＫ細胞媒介性殺滅を増強する、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の能力について調べた。図１１に示される通り、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３は、腺癌Ａ５４９細胞に対するＮＫ細胞媒介性殺滅を増強した（約２倍）が、ＨＬ－６０白血病細胞に対するＮＫ細胞媒介性殺滅は増強しなかった。まとめると、これらの観察は、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３が、充実性腫瘍に由来するがん細胞に対する、ＮＫ細胞の細胞傷害作用を優先的に増強することを指し示す。

【0261】

参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂは、ＢＴＮ２Ａ１の、異なるエピトープを認識する
１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３のいずれも、ＢＴＮ２Ａ１に結合し、Ｍ２マクロファージ分極を阻害し、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害作用を増強する能力を共有する。よって、本発明者らは、これらのｍＡｂが、ＢＴＮ２Ａ１タンパク質における、同じエピトープ領域を認識したのかどうかについて探索した。そこで、「インダンテム」状況を使用して、１０１Ｇ５と１０７Ｇ３とが、ＢＴＮ２Ａ１への結合について競合する、オクテットベースのビニング実験を実施した。図１２に示される通り、１０１Ｇ５と、１０７Ｇ３とは、互いのＢＴＮ２Ａ１への結合を遮断しなかったことから、これらの２つのｍＡｂは、ＢＴＮ２Ａ１における、同じエピトープ領域に結合しないことを指し示す。

【0262】

参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３についてのエピトープマッピング
ＢＴＮ２Ａ１を特徴づけるために、本発明者らは、試料を、トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるタンパク質分解に続く、ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ解析にかけた。トリプシンによるタンパク質分解の後、ＢＴＮ２Ａ１の配列に、配列のうちの７９．８４％をカバーする、３２のペプチドを同定し；キモトリプシンによるタンパク質分解の後、ＢＴＮ２Ａ１配列のうちの９４．７６％をカバーする、２７のペプチドを同定し；ＡＳＰ－Ｎによるタンパク質分解の後、ＢＴＮ２Ａ１配列のうちの１２．５０％をカバーする、２つのペプチドを同定し；エラスターゼによるタンパク質分解の後、ＢＴＮ２Ａ１配列のうちの８９．１１％をカバーする、３３のペプチドを同定し；テルモリシンによるタンパク質分解の後、ＢＴＮ２Ａ１配列のうちの７８．２３％をカバーする、２９のペプチドを同定した。得られた結果に基づき、トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるペプチドについての重複マッピングをデザインした（図１３）。トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるタンパク質分解ペプチドを組み合わせて、ＢＴＮ２Ａ１配列のうちの９６．３７％をカバーした。ＢＴＮ２Ａ１／１０７Ｇ３複合体及びＢＴＮ２Ａ１／１０１Ｇ５複合体のエピトープを、高分解能で決定するために、タンパク質複合体を、重水素化架橋剤と共にインキュベートしてから、多酵素切断にかけた。タンパク質複合体である、ＢＴＮ２Ａ１／１０７Ｇ３に対する、トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるタンパク質分解の後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ解析は、ＢＴＮ２Ａ１と、抗体である１０７Ｇ３との間に、１７の架橋ペプチドを検出した。

【0263】

【表8】

【0264】

よって、本発明者らの解析は、ＢＴＮ２Ａ１と１０７Ｇ３ ｍＡｂとの相互作用が、ＢＴＮ２Ａ１における、以下のアミノ酸：６５、６８、６９、７２、７８、８４、８５、９５、９７、１００を含むことを指し示す。これらの結果を、図１４Ａ及び図１５に例示する。

【0265】

タンパク質複合体である、ＢＴＮ２Ａ１／１０１Ｇ５に対する、トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びテルモリシンによるタンパク質分解の後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ解析は、ＢＴＮ２Ａ１と、抗体である１０１Ｇ５との間に、１４の架橋ペプチドを検出した。

【0266】

【表9】

【0267】

よって、本発明者らの解析は、ＢＴＮ２Ａ１と１０１Ｇ５との相互作用が、ＢＴＮ２Ａ１における、以下のアミノ酸：２１２、２１３、２１８、２２０、２２４、２２９を含むことを指し示す。これらの結果を、図１４Ｂ及び図１６に例示する。

【0268】

参照抗ＢＴＮ２Ａ １０１Ｇ５ ｍＡｂ及び参照抗ＢＴＮ２Ａ １０７Ｇ３ ｍＡｂは、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログとの交差反応性を呈する
ＢＴＮ２Ａ１オーソログは、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を含む、大半の非ヒト霊長動物において存在する。参照ｍＡｂである、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３の、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログ（ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１；ＮＣＢＩ参照番号：ＸＭ＿０１５４４８９０６．１、ヒトＢＴＮ２Ａ１に対する、９３．３１％の同一性）との交差反応性を決定するために、本発明者らは、ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインを含有する組換えＦｃ融合タンパク質（ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ）を作出し、本発明者らは、参照ｍＡｂの、このタンパク質への結合について評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを実施した。本発明者らはまた、参照ｍＡｂのアフィニティーを、ヒトＢＴＮ２Ａ１オーソログと、カニクイザルＢＴＮ２Ａ１オーソログとの間で比較するために、組換えヒトＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質を使用するＥＬＩＳＡも実施した。図１３に示される通り、１０１Ｇ５及び１０７Ｇ３のいずれも、ｃｙｎｏＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインに、ｈｕＢＴＮ２Ａ１（それぞれ、０．８２及び０．５６ｎＭ）において得られる、対応するＥＣ_５０と同等である、それぞれ、０．６０及び０．５７ｎＭのＥＣ_５０で結合することが可能であった。

【0269】

【表10】

【0270】

参考文献：
本出願を通して、多様な参考文献は、本発明が関係する技術分野の最新技術について記載する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示へと組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図15J】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図16I】

【図16J】

【図17】

【配列表】

2022525937000001.app

【国際調査報告】