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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-20
(54)【発明の名称】超粒子製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 9/16 20060101AFI20220513BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220513BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220513BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20220513BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20220513BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220513BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220513BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20220513BHJP
【ＦＩ】
A61K9/16
A61K45/00
A61K47/42
A61K38/22
A61K47/36
A61K47/02
A61K47/10
A61P27/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021556581
(86)(22)【出願日】2020-03-19
(85)【翻訳文提出日】2021-10-18
(86)【国際出願番号】 AU2020050260
(87)【国際公開番号】W WO2020186304
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】2019900910
(32)【優先日】2019-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519044955
【氏名又は名称】ザ・バイオニクス・インスティテュート・オブ・オーストラリア
(71)【出願人】
【識別番号】504348389
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティー オブ メルボルン
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＥＬＢＯＵＲＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー・ワイズ
(72)【発明者】
【氏名】ユーティエン・マ
(72)【発明者】
【氏名】フランク・カルソ
(72)【発明者】
【氏名】マティアス・ビョルンマルム
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA31
4C076BB26
4C076CC10
4C076DD21P
4C076DD25P
4C076DD37
4C076DD37P
4C076EE30H
4C076EE36P
4C076EE41H
4C076FF31
4C084AA17
4C084AA19
4C084DB59
4C084MA41
4C084MA56
4C084NA12
4C084ZA34
4C084ZC75
(57)【要約】
本開示は、高レベルのペイロードを担持し、制御されたペイロード放出プロファイルを有する超粒子に関する。特に、メソポーラスシリカナノ粒子からなり、アルギン酸をエレクトロスプレーされ、その後、生分解性材料で被覆または製剤化される超粒子を開示する。かかる超粒子は、様々な治療用途に使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
超粒子を含む組成物であって、前記超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含み、生分解性コーティングで被覆される、前記組成物。
【請求項2】
生分解性製剤及び超粒子を含む組成物であって、前記超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含み、前記超粒子は、前記生分解性製剤に分散される、前記組成物。
【請求項3】
前記超粒子が、少なくとも２μｇのペイロードを含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記超粒子が、１．５μｇ～１０μｇのペイロードを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記超粒子が、少なくとも６０ｎｍの直径を有する細孔を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記超粒子が、少なくとも５０～１００ｎｍの直径を有する細孔を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記超粒子が、不規則な細孔構造を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記超粒子が、二峰性の細孔構造を有するナノ粒子からなる、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記ナノ粒子の二峰性の細孔構造が、３０ｎｍ超の大きな細孔径を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記生分解性製剤または前記生分解性コーティングが、ゲルまたはフォームである、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
前記生分解性製剤または前記生分解性コーティングが、タンパク液を含む。請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記タンパク液が、フィブリンまたはその前駆体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記その前駆体がフィブリノゲンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
トロンビンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記ペイロードが、神経栄養因子である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
前記神経栄養因子が、ニューロトロフィンである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記超粒子が、少なくとも２つのペイロードを含み、１つのペイロードが神経栄養因子である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項18】
少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個の超粒子を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項19】
異なるペイロードを備えた超粒子を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記超粒子が、持続放出プロファイルによって特徴づけられる、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
前記超粒子が、実質的に直線的な放出プロファイルによって特徴づけられる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記超粒子が、固体の出現として前記生分解性製剤に分散される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
前記超粒子が、フィブリンまたはキトサンで被覆される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項24】
前記超粒子が、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物を、ジカチオン性水溶液にエレクトロスプレーすることにより製造される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
アルギン酸［（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項26】
アルギン酸ナトリウム塩［Ｎａ（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
持続放出システムを含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項28】
前記持続放出システムが、ヒドロゲルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記持続放出システムが、アルギネートヒドロゲルを含む、請求項２７または請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記アルギネートヒドロゲルが、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
前記持続放出システムが、チタン－ポリフェノールゲルまたはフィブリン接着剤を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項32】
前記超粒子が、直接被覆される、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項33】
疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、請求項１～３２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項34】
前記障害が、聴力損失である、請求項３３に記載の使用。
【請求項35】
前記聴力損失が、感音性難聴（ＳＮＨＬ）、老人性難聴または騒音性難聴として特徴づけられる、請求項３４に記載の使用。
【請求項36】
疾患または障害の治療のために使用される際の、請求項１～３２のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項37】
前記障害が、聴力損失である、請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
さらに、蝸牛インプラントを含む、請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、高レベルのペイロードを担持し、制御されたペイロード放出プロファイルを有する超粒子に関する。かかる超粒子は、様々な治療用途に使用され得る。
【背景技術】
【0002】
メソポーラスシリカは、極めて大きな表面積を有する多孔質材料であり、様々な化合物を封入するため及び多様なナノ構造物質の鋳型合成に広く使用されている。このタイプの多孔質材料は、様々な用途、例えば、薬物送達において重要であるが、様々な問題が依然として未解決のままである。例えば、高い初期放出プロファイルまたはバースト放出挙動が課題である。場合によっては、治療薬物送達効率の向上、投与頻度の低減及び／または治療薬の高レベルの初期放出による潜在的副作用の低減等の結果を達成するために、放出の制御及び／または初期バースト放出の低減が必要であり得る。これらの結果を達成するため、ナノ担体の構造の修飾及び薬物とナノ担体を共有結合を介してコンジュゲートすること等、様々なアプローチが研究されてきた。
【0003】
極めて大きな表面積を有する新たな多孔質材料を提供することが望ましく、該新材料は、多くの興味深い特性を有し得ることが期待される。
【0004】
従って、改良された超粒子が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
超粒子からのペイロード放出の時間的制御における現在の課題は、ペイロードの初期の急速な放出（すなわち、「バースト」放出）であり、これが持続放出を制限し、投与頻度を高くし、薬物の長期有効性の低下をもたらす。バースト放出はまた、ペイロードのバイオアベイラビリティの急速な増加のため、対象に毒性の問題を引き起こす場合もある。毒性の問題は、超粒子が高レベルのペイロードを担持した場合に拡大される場合がある。本発明者らは、驚くべきことに、生分解性コーティングで超粒子を被覆することで、高レベルのペイロードを超粒子が担持している場合であっても、超粒子からのペイロードの初期のバースト放出を劇的に低減することができることを確認した。従って、第一の態様では、本開示は、超粒子を含む組成物に関し、該超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含み、生分解性コーティングで被覆される。ある例では、該超粒子は、直接被覆される。別の例では、本開示は、生分解性製剤及び超粒子を含む組成物に関し、該超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含み、ここで、該超粒子は、生分解性製剤に分散される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
ある例では、該超粒子は、少なくとも２μｇのペイロードを含む。別の例では、該超粒子は、１．５μｇ～１０μｇのペイロードを含む。別の例では、該超粒子は、少なくとも６０ｎｍの直径を有する細孔を含む。別の例では、該超粒子は、少なくとも５０～１００ｎｍの直径を有する細孔を含む。別の例では、該超粒子は、不規則な細孔構造を有する。別の例では、該超粒子は、二峰性の細孔構造を有するナノ粒子からなる。ある例では、該ナノ粒子の二峰性の細孔構造は、３０ｎｍ超の大きな細孔径を有する。
【0007】
ある例では、該生分解性製剤またはコーティングは、ゲルまたはフォームである。別の例では、該生分解性製剤またはコーティングは、タンパク液を含む。別の例では、該タンパク液は、フィブリンまたはその前駆体を含む。ある例では、その前駆体は、フィブリノゲンである。ある例では、前駆体を含む組成物は、さらに、生分解性コーティングまたはその一部への該前駆体の変換を触媒する酵素触媒を含み得る。従って、ある例では、本明細書に開示する組成物は、トロンビンを含み得る。ある例では、本開示によって包含される組成物は、フィブリノゲン及びトロンビンを包含する。
【0008】
ある例では、該ペイロードは、神経栄養因子である。例えば、該神経栄養因子は、ニューロトロフィンであり得る。ある例では、該ニューロトロフィンは、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３である。ある例では、該ニューロトロフィンは、ＢＤＮＦである。別の例では、該ニューロトロフィンは、ＮＴ－３である。別の例では、該超粒子は、少なくとも２つのペイロードを含み、１つのペイロードは、神経栄養因子である。
【0009】
別の例では、本明細書に開示する組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個の超粒子を含む。この例では、該超粒子は、異なるペイロードを担持し得る。
【0010】
別の例では、本開示によって包含される超粒子は、持続放出プロファイルを有する。別の例では、本開示によって包含される超粒子は、実質的に直線的な放出プロファイルを有する。別の例では、本開示によって包含される超粒子は、直線的な放出プロファイルを有する。
【0011】
別の例では、本開示によって包含される超粒子は、固体の出現として生分解性製剤に分散される。この例では、該生分解性製剤は、該超粒子を被覆する。
【0012】
別の例では、超粒子は、フィブリンまたはキトサンで被覆される。
【0013】
本発明者らは、本開示の被覆された超粒子をヒドロゲル系と組み合わせ、該超粒子の外科的送達のしやすさを改善すること及び／またはさらに薬物放出速度を制御することができることもまた確認した。従って、ある例では、本開示は、本明細書に開示する被覆された超粒子及びヒドロゲル系または持続放出システムを含む組成物を包含する。ある例では、該超粒子は、直接被覆される。ある例では、該持続放出システムは、アルギネートを含む。ある例では、該持続放出システムは、アルギネートヒドロゲルを含む。例えば、該アルギネートヒドロゲルは、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルであり得る。別の例では、該持続放出システムは、チタン－ポリフェノールゲルまたはフィブリン接着剤を含む。
【0014】
ある例では、超粒子は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物を、ジカチオン性水溶液にエレクトロスプレーすることにより製造される。ある例では、該アルギン酸は、［（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体である。別の例では、該アルギン酸のナトリウム塩は、［Ｎａ（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）ｎ］またはその多糖誘導体である。
【0015】
別の例では、本開示は、疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に開示する超粒子または組成物の使用に関する。ある例では、該障害は、聴力損失である。ある例では、該聴力損失は、感音性難聴（ＳＮＨＬ）、老人性難聴または騒音性難聴として特徴づけられる。
【0016】
別の例では、本開示は、本明細書に開示する疾患または障害の治療のために使用される際の、本明細書に開示する超粒子または組成物を含むキットに関する。ある例では、該障害は、聴力損失である。別の例では、該キットは、さらに、蝸牛インプラントを含む。
【0017】
本明細書における任意の例は、特に明記しない限り、任意の他の例に準用すると解釈されるものとする。
【0018】
本開示は、本明細書に記載の特定の例によって範囲を限定されない。このような特定の例は、例示のために意図されているに過ぎない。機能的に同等の製品、組成物及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本開示の範囲内である。
【0019】
本明細書全体を通じて、特に明記しない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、これらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
【0020】
本開示を、以下の非限定的な実施例により、及び添付の図面を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ＭＳ－ＳＰの作成手順の例。
【図2】異なるｐＨ値の関数としてのＭＳ－ＳＰのゼータ電位。ゼータ電位の測定は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）及び１０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）で行った。
【図3】ＦＩＴＣ－リゾチーム（緑）を担持したＭＳ－ＳＰの共焦点顕微鏡画像。ａ、ｂ）異なる倍率でのＭＳ－ＳＰ。ｃ）ＦＩＴＣ－リゾチームを担持した崩壊したＭＳ－ＳＰの内部。
【図4】異なるＦＩＴＣ－リゾチーム担持時濃度を使用した３日間（７２時間）のインキュベーション時間後の薬物担持。ａ）ＦＩＴＣ－リゾチーム担持時濃度に対する、非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒丸）、小孔ＭＳ－ＳＰａｌｇ（青四角）及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（赤三角）へのＦＩＴＣ－リゾチームの吸着量。ｂ）ＦＩＴＣ－リゾチーム担持時濃度に対する、非多孔性ＭＳ－ＳＰ（黒丸）、小孔ＭＳ－ＳＰ（青四角）及びＭＳ－ＳＰ（赤三角）へのＦＩＴＣ－リゾチームの吸着量。ｃ）ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びｄ）ＭＳ－ＳＰにおけるＦＩＴＣ－リゾチーム担持効率。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々５個のＳＰを使用し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図5】直径が異なるＭＳ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチーム担持及び放出挙動。ａ）ＦＩＴＣ－リゾチーム担持量、ｂ）インビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイル、ｃ）各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの値、ｄ）直径が２００、５５０、６５０、１０００μｍのＭＳ－ＳＰからのインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出の検量線。
【図6】異なる数のＭＳ－ＳＰとともに４８時間インキュベートしたヒト脳神経膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ細胞株）の細胞生存率。インサートでエタノールを加えた細胞は、陰性（細胞毒性）対照として調製し、未処理の細胞は、１００％の生存率を表す。示したデータは、４つのサンプルの平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【図7】インビトロ累積薬物放出プロファイル。ａ）．ＭＳ－ＳＰ（赤丸）、及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒三角）からインビトロで放出されたＦＩＴＣ－リゾチーム（０．２ｍｇ・ｍＬ－１、薬物担持３日間）。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々１０個のＳＰを使用し、エラーバーは標準偏差を表す。ｂ）ＭＳ－ＳＰからインビトロで放出されたＦＩＴＣ－リゾチーム（１．０ｍｇ・ｍＬ－１、薬物担持３日間）。ｂ）の挿入図は、６日目から始まるインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイルである。ｃ）ＭＳ－ＳＰからのインビトロＢＤＮＦ放出（１．０ｍｇ・ｍＬ－１、薬物担持３日間）。ＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）をＢＤＮＦ濃度の測定に使用した。
【図8】ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＭＳ－ＳＰ（担持条件：０．２ｍｇ・ｍＬ－１のＦＩＴＣ－リゾチーム１００μＬを担持、担持時間３日間）に関して各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの値。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々１０個の超粒子を使用し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図9】ＭＳ－ＳＰ（担持条件：１．０ｍｇ・ｍＬ－１のＦＩＴＣ－リゾチーム１００μＬを３日間にわたって担持）に関して各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの値。薬物担持は、超粒子あたり６．４９±０．４８μｇであった。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々１０個のＳＰを使用し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図10】インビトロＢＤＮＦ薬物試験（担持条件：１．０ｍｇ・ｍＬ－１のＢＤＮＦを３日間にわたって担持）に関する各時点での絶対値。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々１個のＭＳ－ＳＰを使用し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図11】ＭＳ－ＳＰからのＢＤＮＦの測定のためのＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ。ｂ）ＭＳ－ＳＰを使用した各時点で放出されたＢＤＮＦの値。薬物担持は、超粒子あたり６．８２μｇである。示したデータは、３回の反復の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【図12】ａ）ＰＦ１２７ヒドロゲル系でのＭＳ－ＳＰ（赤丸）、及びＭＳ－ＳＰａｌｇ（黒四角）のインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイル。ｂ）図（ａ）の各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの値（０．２ｍｇ・ｍＬ－１のＦＩＴＣ－リゾチーム１００μＬを担持）。薬物担持は、ＭＳ－ＳＰ及びＭＳ－ＳＰａｌｇにおいて、それぞれ、超粒子あたり１．８９±０．０８μｇ及び超粒子あたり１．９３±０．０３μｇである。示したデータは、３回の反復の平均であり、各々１０個の超粒子を使用し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図13】５０％担持（３．６５μｇ／ＳＰ）時のインビトロ放出プロファイル。
【図14】１５０日間のインビトロ薬物放出試験後のＭＳ－ＳＰの分解。ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃での１５０日間のインキュベーション後のＭＳ－ＳＰのＳＥＭ画像。ｂ、ｃ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃での１５０日間のインキュベーション後のＭＳ－ＳＰの表面構造のＳＥＭ画像。
【図15】ニューロトロフィン－３の量（担持量に対する％）及びμｇ単位での合計を示す。対象の内耳内への移植の１週間後、各ＳＰは、初期担持量のうち約２ｕｇのニューロトロフィン－３（約４０％）を含んでいた。
【図16】Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰの特徴。（ａ）Ｓｉ－ＳＰのＳＥＭ画像。（ｂ）Ｓｉ－ＳＰの表面を示す高解像度ＳＥＭ。（ｃ）ＦＳｉ－ＳＰのＳＥＭ画像。（ｄ）ＦＳｉ－ＳＰの表面を示す高解像度ＳＥＭ。（ｅ）ＦＳｉ－ＳＰの元素分布。（ｆ）Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰのＦＴＩＲスペクトル。
【図17】（ａ）低倍率及び（ｂ）高倍率でのＣａＣＯ３粒子のＳＥＭ画像。
【図19】ＢＤＮＦに関するインビトロ放出の検量線。
【図20】ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルにおけるＦＳｉ－ＳＰのインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイルに関するインビトロ薬物放出の検量線。
【図21】異なる濃度のフィブリノゲン及びトロンビンで被覆する前のＳｉ－ＳＰにおけるＦＩＴＣ－リゾチームの薬物担持量。
【図22】Ｓｉ－ＳＰならびに異なる濃度のフィブリノゲン（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１で１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）にてフィブリンで被覆したＦＳｉ－ＳＰからの所与の時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの割合。示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示し、各々１０個のＳＰを使用した。
【図23】Ｓｉ－ＳＰならびに異なる濃度のトロンビン（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１で２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン、それぞれ、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）にてフィブリンで被覆したＦＳｉ－ＳＰから放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの割合。示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示し、各々１０個のＳＰを使用した。
【図24】インビトロ累積放出プロファイル。（ａ）．Ｓｉ－ＳＰならびに異なる濃度のフィブリノゲン（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１で１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）にてフィブリンで被覆したＦＳｉ－ＳＰから放出されたＦＩＴＣ－リゾチーム。（ｂ）．Ｓｉ－ＳＰならびに異なる濃度のトロンビン（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１で２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン、それぞれ、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）にてフィブリンで被覆したＦＳｉ－ＳＰから放出されたＦＩＴＣ－リゾチーム。Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰからの（ｃ）ＢＤＮＦ及び（ｄ）ＮＴ－３の放出プロファイル。（ａ～ｄ）に示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示し、各々、（ａ）及び（ｂ）では１０個のＳＰから、（ｃ）及び（ｄ）では１個のＳＰからの放出を測定した。
【図25】ＥＬＩＳＡを使用して測定した、所与の時点でのＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから放出されたＢＤＮＦの割合。示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示し、各々１個のＳＰを使用した。
【図26】ＥＬＩＳＡを使用して測定した、所与の時点でのＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから放出されたＮＴ－３の割合。示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示し、各々１個のＳＰを使用した。
【図27】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃にて、（ａ）３日間、（ｂ）２週間、（ｃ）３週間、（ｄ）６週間、（ｅ）１０週間分解後のＳｉ－ＳＰのＳＥＭ画像。（ｆ）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で１０週間インキュベーション後のＳｉ－ＳＰの表面構造を示す。ここで、図１６ｂと（ｆ）を比較すると、劇的な変化が観察される。
【図28】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃にて、（ａ）３日間、（ｂ）２週間、（ｃ）３週間、（ｄ）６週間、及び（ｅ）１０週間インキュベーション後のＦＳｉ－ＳＰのＳＥＭ画像。（ｅ）の挿入図は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で１０週間インキュベーション後のＦＳｉ－ＳＰの表面構造を示す。インキュベーション前のＦＳｉ－ＳＰの代表的な画像を図１６に示し、分解されたＳｉ－ＳＰの画像を図２７に示す。（ｆ）１０週間にわたってＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから放出されたＳｉを定量化するためのＩＣＰ－ＯＥＳ分析。ＦＳｉ－ＳＰは、２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンを使用して調製した。
【図29】
ＦＳｉ－ＳＰ（２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び１．７２ｍｇ・ｍＬ－１をフィブリンコーティングに使用した）からのフィブリンのインビトロ累積分解割合。フィブリンの量は、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定した。
【図30】各時点でのＳｉの放出を、超粒子の最初のＳｉ量の割合として測定した。
【図31】無菌条件下、最大７７日間、細胞培地中でインキュベートした２個、５個、１０個または１５個のＦＳｉ－ＳＰからの分解産物を含む細胞培地に４８時間曝露した後のヒト脳神経膠芽腫細胞の細胞生存率。各点は、３連ウェルの平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示す。未処理細胞（すなわち、標準培地にのみ曝露した細胞）を使用して１００％の生存率を定義した。
【図32】（ａ）低倍率及び（ｂ）高倍率での凍結乾燥ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル（２重量％のアルギネート溶液及び１．５ｍｇのＣａＣＯ３粒子を使用して合成したもの）の断面のＳＥＭ画像。（ｃ）．凍結乾燥ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルの表面構造のＳＥＭ画像。（ｄ）．凍結乾燥ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル内のＦＳｉ－ＳＰの断片。（ｅ）．ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル内のＳｉ－ＳＰ、ＦＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰ（ＦＳｉ－ＳＰは、２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び２０ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンをフィブリンコーティングに使用して合成した）からのインビトロＦＩＴＣ－リゾチームの放出割合。（ｆ）．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃での４２日間にわたるａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルの分解。示したデータは、３連の平均であり、エラーバーは、標準偏差を示す。
【図33】（ａ）のインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイル。異なる量のＣａＣＯ３粒子、すなわち、１ｍｇ、４．５ｍｇまたは９ｍｇと、２重量％のアルギネート溶液で調製したａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル中でのＳｉ－ＳＰ、それぞれ、Ｓｉ－ＳＰ＠２ａｌｇ－１ＣａＣＯ３ヒドロゲル、Ｓｉ－ＳＰ＠２ａｌｇ－４．５ＣａＣＯ３ヒドロゲル及びＳｉ－ＳＰ＠２ａｌｇ－９ＣａＣＯ３ヒドロゲルとして示す。緑の線は、ヒドロゲルなしのインビトロＳｉ－ＳＰ放出プロファイルである。（ｂ）異なる濃度のアルギネート溶液、すなわち、１重量％、２重量％または３重量％と、１．５ｍｇのＣａＣＯ３粒子で調製したａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル中でのＳｉ－ＳＰ、それぞれ、Ｓｉ－ＳＰ＠１ａｌｇ－１．５ＣａＣＯ３ヒドロゲル、Ｓｉ－ＳＰ＠２ａｌｇ－１．５ＣａＣＯ３ヒドロゲル及びＳｉ－ＳＰ＠３ａｌｇ－１．５ＣａＣＯ３ヒドロゲルとして示す。緑の線は、ヒドロゲルなしのＳｉ－ＳＰ放出プロファイルである。（ｃ）最初の４２日間の（ａ）からのインビトロ薬物放出プロファイル、（ｄ）最初の４２日間の（ｂ）からのインビトロ薬物放出プロファイル。図ｃ及びｄは、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルが、Ｓｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームのバースト放出を２８日目まで遅らせることができることを示す。
【図34】
ＣｈｉＳｉ－ＳＰ（０．１重量％のキトサン及びアルギネート溶液でＳｉ－ＳＰを被覆する。Ｓｉ－ＳＰは、キトサン及びアルギネートの１層、２層または３層で被覆されている）からのインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイル。
【図35】Ｓｉ－ＳＰ及びＣｈｉＳｉ－ＳＰ（０．１重量％のキトサン及びアルギネート溶液での２サイクルでのＳｉ－ＳＰ被覆）からのインビトロＢＤＮＦ放出プロファイル。
【図36】Ｓｉ－ＳＰ及びＣｈｉＳｉ－ＳＰ（０．１重量％のキトサン及びアルギネート溶液での２サイクルでのＳｉ－ＳＰ被覆）からのインビトロＮＴ－３放出プロファイル。
【図37】
ＣｈｉＳｉ－ＳＰ（１重量％のキトサン及びアルギネート溶液でＳｉ－ＳＰを被覆、１サイクルでのキトサン及びアルギネート被覆）からのインビトロＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイル。
【発明を実施するための形態】
【0022】
一般的技術及び選択的定義
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当該分野（例えば、生理学、臨床研究、分子生物学、高表面積分子、エレクトロスプレー及び生化学）の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当該分野（例えば、生理学、臨床研究、分子生物学、高表面積分子、エレクトロスプレー及び生化学）の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【0023】
特に明記しない限り、本開示で使用される技術は、当業者に周知の標準的な手順である。かかる技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）等の資料の全体を通して記載及び説明されている。
【0024】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数での用語及び単数形の例えば、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他を指示しない限り、任意に複数の指示対象を含む。従って、例えば、「超粒子（ａ ｓｕｐｒａｐａｒｔｉｃｌｅ）」への言及は、任意に、複数の超粒子を含む。
【0025】
本明細書で使用される、「約」という用語は、反対の記載がない限り、指定値の＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％、より好ましくは＋／－１％を指す。
【0026】
「及び／または」という用語、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支持するものと解釈されるものとする。
【0027】
本明細書を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載される要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を包含することを意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくはステップ群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。
【0028】
本明細書で使用される、「治療」という用語は、臨床的病理の経過中に治療される個体または細胞の自然経過を改変するように設計された臨床的介入を指す。例示的な望ましい治療効果としては、治療される障害と関連する症状の軽減が挙げられる。聴力損失の治療との関連で、望ましい治療効果としては、聴力損失の速度の減少及び聴力損失の改善または緩和が挙げられる。例えば、障害と関連する１つ以上の症状が軽減または排除される場合に、ある個体は、良好に「治療」される。
【0029】
「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な少なくとも最小量を指す。治療有効量はまた、対象の障害に測定可能な改善をもたらすために必要な少なくとも最小量を含むこともできる。治療有効量は、１回以上の投与で提供され得る。該治療有効量は、治療される障害の重症度に応じて、また、治療される対象の体重、年齢、人種的背景、性別、健康及び／または身体状態に応じても変化し得る。通常、該有効量は、比較的広い範囲（例えば、「用量」範囲）に含まれ、これは、医師によって繰り返される試験及び実験を通して決定され得る。該治療有効量は、単回投与で施される場合もあれば、治療期間にわたって１回または数回繰り返される投与で施される場合もある。
【0030】
ペイロード
超粒子は、本開示によれば、様々なペイロードを含むことができる。「ペイロード」は、障害を治療するのに有用な任意の薬剤でよい。薬剤の例としては、生物学的製剤、例えば、ポリヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、抗体薬物複合体、タンパク質、生物活性タンパク質、融合タンパク質、組み換えタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、合成ポリペプチド、ワクチン、治療血清、ウイルス、ポリヌクレオチド、細胞、例えば、幹細胞またはその一部、及び小分子が挙げられる。
超粒子は、本開示によれば、様々なペイロードを含むことができる。「ペイロード」は、障害を治療するのに有用な任意の薬剤でよい。薬剤の例としては、生物学的製剤、例えば、ポリヌクレオチド、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、抗体薬物複合体、タンパク質、生物活性タンパク質、融合タンパク質、組み換えタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、合成ポリペプチド、ワクチン、治療血清、ウイルス、ポリヌクレオチド、細胞、例えば、幹細胞またはその一部、及び小分子が挙げられる。
【0031】
例示的なウイルスペイロードは、適切に改変されたレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または組み換え型、例えば、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ならびにその誘導体、例えば、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）及び非組み込み型ＡＶを含み得る。他の例示的なウイルス性の治療用ペイロードは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、ワクシニア及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み得る。例えば、該ウイルス性の治療用ペイロードは、ＡＡＶを含み得る。様々なＡＡＶ血清型が知られており、適切なウイルスペイロードであり得る。ある例では、該ＡＡＶは、血清型２である。別の例では、該ＡＡＶは、血清型１である。他の例では、該ＡＡＶは、血清型３、４、７、８、９、１０、１１、１２または１３である。
【0032】
ある例では、該小分子は、神経伝達物質である。「神経伝達物質」という用語は、本開示の文脈においては、シグナル（複数可）を、化学シナプスを越えて、ある細胞から別の細胞へ伝達する物質を指すために使用される。一般に、神経伝達物質は、シグナル（複数可）を、化学シナプスを越えて、あるニューロンから標的細胞、例えば、別のニューロン、筋細胞または腺細胞へ伝達する。別の例では、該小分子は、受容体アゴニストである。「アゴニスト」という用語は、本開示の文脈においては、受容体と組み合わされた際に生理反応を開始する物質を指すために使用される。別の例では、該小分子は、受容体アンタゴニストである。「アンタゴニスト」という用語は、本開示の文脈においては、受容体の生理作用を妨害または阻害する物質を指すために使用される。
【0033】
例示的なポリヌクレオチドとしては、アンチセンスポリヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が挙げられる。１つの例では、該ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡは、アプタマーである。別の例では、該ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。
【0034】
例示的な抗体及びその断片としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体または単一ドメイン抗体が挙げられる。ある例では、該抗体は、二重特異性でも、抗体薬物複合体でも、バイオシミラー抗体でもよい。他の例示的なポリペプチドとしては、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン及び血液凝固因子が挙げられる。ある例では、該ポリペプチドは、酵素である。例示的な酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、リプロタマーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、コラゲナーゼ、グルタミナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼまたはヌクレアーゼ、例えば、プログラマブルヌクレアーゼが挙げられる。ある例では、該酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり得る。ある例では、該酵素は、遺伝子改変を遺伝子またはその調節領域に導入することを目的としたプログラマブルヌクレアーゼであり得る。例えば、該プログラマブルヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導改変ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり得る。ある例では、ＲＧＥＮは、古細菌ゲノムに由来するか、またはその組み換え型であり得る。別の例では、ＲＧＥＮは、細菌ゲノムに由来し得るか、またはその組み換え型である。別の例では、ＲＧＥＮは、Ｉ型（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システムに由来する。別の例では、ＲＧＥＮは、ＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システムに由来する。別の例では、ＲＧＥＮは、ＩＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）－ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）システムに由来する。ある例では、該ヌクレアーゼは、クラスＩのＲＧＥＮまたはクラスＩＩのＲＧＥＮに由来する。
【0035】
別の例では、該治療用ペイロードは、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
【0036】
別の例では、該治療用ペイロードは、対象における免疫応答を刺激する抗原であり得る。例示的な抗原としては、タンパク質、ペプチド、多糖もしくはオリゴ糖（遊離またはタンパク質担体にコンジュゲートしたもの）またはそれらの混合物が挙げられる。他の例示的な抗原としては、細胞もしくはその一部またはウイルス粒子もしくはその一部が挙げられる。
【0037】
ある例では、該治療用ペイロードは、抗腫瘍薬である。
【0038】
他の例示的な治療用ペイロードとしては、内耳の膜受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストが挙げられる。かかる治療用ペイロードは、神経伝達を調節し得る。別の例では、該治療用ペイロードは、１つ以上の神経障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかんまたは多発性硬化症の治療に有用な神経学的薬剤である。
【0039】
ある例では、該ペイロードは、「神経栄養因子」である。神経栄養因子という用語は、本開示の文脈においては、聴覚系由来の細胞を含めた任意の細胞の増殖または生存可能性を高める分子を指すために使用される。例えば、本開示によって包含される神経栄養因子は、内耳、中耳もしくは前庭器官に位置する聴覚系由来の細胞またはそれらのシナプス結合の増殖または生存を高めることができる。例示的な細胞としては、蝸牛神経節ニューロン（ＳＧＮ）、内耳及び外耳の有毛細胞を含めた有毛細胞、蝸牛グリア細胞及びシュワン細胞が挙げられる。例示的なシナプス結合としては、有毛細胞、有毛細胞とＳＧＮまたは上記の他のニューロン間の結合が挙げられる。他の例としては、ローゼンタール管もしくはそれらのシナプス結合における神経細胞体、上部中蝸牛領域のニューロンまたはシナプス結合及び／または骨らせん板の神経線維が挙げられる。
【0040】
例示的な神経栄養因子としては、聴覚系由来の細胞及び／またはそれらのシナプス結合の生存を直接または間接的に向上させることが既知の治療効果がある上記の薬剤を挙げることができる。
【0041】
ある例では、該神経栄養因子は、神経栄養ペプチドである。例示的な神経栄養ペプチドとしては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）ファミリーのメンバー、例えば、ＣＮＴＦ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、グリア成熟因子（ＧＭＦ）、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ニューレグリン１、ニューレグリン２、ニューレグリン３及びニューレグリン４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバー、例えば、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、及びパーセフィン（ＰＳＰＮ）、エフリン、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）ならびにインターロイキン、例えば、ＩＬ－１１が挙げられる。
【0042】
ある例では、該神経栄養因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及びＩＬ－１１からなる群から選択される。
【0043】
蝸牛神経節ニューロン変性の１つの原因は、ニューロトロフィンの内因性供給の不足である。従って、ある例では、該神経栄養因子は、ニューロトロフィンである。「ニューロトロフィン」という用語は、本開示の文脈においては、ニューロン及び／またはそれらのシナプス結合の生存、発達及び／または機能を誘導するタンパク質を指すために使用される。例示的なニューロトロフィンは、上記で論じられており、ＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３及びニューロトロフィン－４を含む。従って、ある例では、該超粒子は、ＢＤＮＦを含む。別の例では、該超粒子は、神経成長因子を含む。別の例では、該超粒子は、ニューロトロフィン－３を含む。別の例では、該超粒子は、ニューロトロフィン－４を含む。ある例では、超粒子は、少なくとも２種の異なるニューロトロフィンを含み得る。他の例では、超粒子は、少なくとも３種または４種の異なるニューロトロフィンを含み得る。
【0044】
治療効果は、複数の異なる治療用ペイロードを含む超粒子を投与することによって改善され得る。従って、ある例では、超粒子は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の異なる治療用ペイロードを含み得る
【0045】
例えば、超粒子は、少なくとも２種の異なる神経栄養因子を含み得る。他の例では、超粒子は、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる神経栄養因子を含み得る。これらの例では、様々な神経栄養因子、例えば、ニューロトロフィンの組み合わせが企図される。例示的な神経栄養因子の組み合わせとしては、ＢＤＮＦと神経成長因子、ＢＤＮＦとニューロトロフィン－３、ＢＤＮＦとニューロトロフィン－４、ＢＤＮＦとＣＮＴＦ、ＢＤＮＦとＧＤＮＦ、ＢＤＮＦとＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３とニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－３とＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３とＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３とＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３とＩＬ－１１、ニューロトロフィン－４とＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－４とＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－４とＩＬ－１１、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ＣＮＴＦとＩＬ－１１、ＧＤＮＦとＩＬ－１１、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３とニューロトロフィン－４、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３とＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３とＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦとＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＣＮＴＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ＣＤＮＦとＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＩＬ－１１、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦとＩＬ－１１、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４とＩＬ－１１、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦとＧＤＮＦ、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＣＮＴＦとＩＬ－１１が挙げられる。
【0046】
様々な耳の治療介入、例えば、外科処置及び聴力装置の移植は、副作用、例えば、中耳及び内耳の組織の損傷、炎症及び／または感染を引き起こす場合がある。かかる副作用に対する生物反応（複数可）は、聴覚系由来の細胞及び／またはそれらのシナプス結合の増殖もしくは生存可能性に間接的に影響を与え得る。従って、ある例では、神経栄養因子は、組織の修復を助け、炎症を低減し、及び／または感染を低減する。従って、さらなる例示的な神経栄養因子としては、ステロイドまたは抗酸化剤が挙げられる。他の例示的な神経栄養因子としては、抗体または他の結合タンパク質、例えば、抗トロポミオシン受容体キナーゼ（ＴｒＫ）Ｂ、抗ＴｒＫ Ｃもしくはｐ７５ニューロトロフィン受容体と相互作用する結合タンパク質が挙げられる。例えば、ｐ７５ニューロトロフィン受容体アンタゴニスト。別の例では、神経栄養因子としては、核酸が挙げられる。例えば、神経栄養因子は、遺伝子療法、サイレンシングＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、発現構築物、例えば、目的の核酸を含むＤＮＡプラスミドを含み得る。ある例では、該神経栄養因子は、オプシン（複数可）をコードする核酸を含む発現構築物である。
【0047】
さらなる例示的な神経栄養因子の組み合わせとしては、ステロイド、抗酸化剤、抗体または核酸と、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる神経栄養因子が挙げられる。例えば、超粒子は、ステロイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾロンならびにＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４及びＧＤＮＦのうちのいずれか１つ以上を含み得る。別の例では、超粒子は、オプシンならびにＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４及びＧＤＮＦのうちのいずれか１つ以上を含む発現ベクターを含み得る。別の例では、超粒子は、抗体、例えば、抗トロポミオシン受容体キナーゼ（ＴｒＫ）Ｂまたは抗ＴｒＫ ＣならびにＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＧＤＮＦ及びＩＬ－１１のうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【0048】
ある例では、超粒子は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる治療用ペイロードを含むことができ、この場合、少なくとも１種の治療用ペイロードが神経栄養因子である。例えば、超粒子は、少なくとも３種の異なる治療用ペイロードを含むことができ、この場合、２種の治療用ペイロードが神経栄養因子である。別の例では、超粒子は、少なくとも４種の異なる治療用ペイロードを含むことができ、この場合、３種の治療用ペイロードが神経栄養因子である。これらの例では、該治療用ペイロードは、聴覚系由来の細胞の増殖または生存可能性を向上させる必要はなく、別の治療的有用性をもたらすことができる。例えば、該治療用ペイロードは、超粒子の投与後の対象の免疫系を抑制してもよい。別の例では、超粒子は、聴覚系由来の細胞またはそれらのシナプス結合の生存を低減するペイロード及び神経栄養因子（複数可）を含み得る。この例では、該神経栄養因子は、該治療用ペイロードによってもたらされる聴覚系由来の細胞またはそれらのシナプス結合の生存の低減を緩和し得る。ある例では、超粒子は、シスプラチンまたは関連化合物を含めた抗腫瘍薬、アミノグリコシド、例えば、トブラマイシンまたは関連化合物を含めた抗生物質、ループ利尿薬、例えば、フロセミド、代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート、サリシレート、例えば、アスピリンまたは放射性部分及び神経栄養因子（複数可）を含む。超粒子は、抗生物質ならびにＢＤＮＦ、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ＧＤＮＦ及びＩＬ－１１のうちのいずれか１つ以上を含むことができる。
【0049】
投与部位によっては、該ペイロードは、中耳から内耳または前庭器官に拡散することが必要な場合がある。これは、正円窓または卵円窓を越えた該ペイロードの拡散を介して生じ得る。従って、ある例では、超粒子は、正円窓及び卵円窓を越えた内耳及び／または前庭器官への該ペイロードの拡散を助ける分子（複数可）を含み得る。
【0050】
ある例では、該ペイロードは、７を超える等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、８を超える等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、９を超える等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、１０を超える等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、７～１０の等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、７～９の等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、８～１０の等電点を有する。別の例では、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。
【0051】
ペイロードを含む超粒子は、本開示の文脈においては、担持超粒子と呼ばれる場合がある。担持超粒子を生成する方法は、得られる超粒子が少なくとも１．５μｇのペイロードを担持し得る限り、特に限定されない。好ましくは、得られる超粒子は、対象の耳に該ペイロードを送達することができる。例示的な担持方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１９， ６４５１に概説されており、ペイロードの封入及び取り込みを含む。１つの非限定的な例では、超粒子は、該超粒子を、該ペイロードの水溶液と接触させ、その後一定期間インキュベーションを続けることにより担持し得る。該ペイロード溶液は、該超粒子に担持されるペイロードの量を超えて含むことができ、インキュベーションは、室温で行うことができる。該超粒子及び該ペイロードを含む溶液の攪拌を使用して、該ペイロードの担持を高めることができる。
【0052】
当業者には、必要なペイロードのレベルが、ペイロード自体及び本開示に従って治療される適応症によって影響を受ける可能性が高いことが理解されよう。
【0053】
超粒子
「超粒子」（「ＳＰ」）という用語は、本開示の文脈においては、細孔のネットワークを含む凝集粒子を指すために使用される。細孔のネットワークは、ペイロードを担持するための大きな細孔容積及び表面積を備えた超粒子を提供する。大きな細孔容積及び表面積は、超粒子によって担持され得るペイロードの量を高めることができるため、有利である。ある例では、本開示の超粒子は、凝集ナノ粒子である。
「超粒子」（「ＳＰ」）という用語は、本開示の文脈においては、細孔のネットワークを含む凝集粒子を指すために使用される。細孔のネットワークは、ペイロードを担持するための大きな細孔容積及び表面積を備えた超粒子を提供する。大きな細孔容積及び表面積は、超粒子によって担持され得るペイロードの量を高めることができるため、有利である。ある例では、本開示の超粒子は、凝集ナノ粒子である。
【0054】
ある例では、本開示の超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．０μｇのペイロードを含む。
【0055】
別の例では、本開示の超粒子は、少なくとも２．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．６μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．７μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．７μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．８μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．９μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．１μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．２μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．３μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．４μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．６μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．７μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．８μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．９μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも４．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも４．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも５．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも５．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも６．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも６．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも７．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも７．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも８．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも８．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも９．０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも９．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１．５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１２μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１５μｇのペイロードを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２０μｇのペイロードを含む。
【0056】
例えば、超粒子は、少なくとも６μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約２．５～１０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約３～１０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約４～１０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約６～１０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１５μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～２０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約８～２０μｇのペイロードを含み得る。別の例では、超粒子は、約８～１５μｇのペイロードを含み得る。
【0057】
例えば、超粒子は、約６～８μｇのペイロードを含み得る。
【0058】
ある例では、本開示の超粒子は、少なくとも１．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．０μｇの神経栄養因子を含む。
【0059】
別の例では、超粒子は、少なくとも２．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも４．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも５．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも６．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも７．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも８．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも９．０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１．５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１２μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１５μｇの神経栄養因子を含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２０μｇの神経栄養因子を含む。
【0060】
例えば、超粒子は、少なくとも６μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約２．５～１０μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１０μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約６～１０μｇの神経栄養因子を含み得る。例えば、超粒子は、約６～８μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１５μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約５～２０μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約８～２０μｇの神経栄養因子を含み得る。別の例では、超粒子は、約８～１５μｇの神経栄養因子を含み得る。
【0061】
ある例では、本開示の超粒子は、少なくとも１．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２．０μｇのニューロトロフィンを含む。
【0062】
別の例では、超粒子は、少なくとも２．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも３．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも４．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも５．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも６．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも７．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも８．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも９．０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１０．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１１．５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１２μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも１５μｇのニューロトロフィンを含む。別の例では、超粒子は、少なくとも２０μｇのニューロトロフィンを含む。
【0063】
例えば、超粒子は、少なくとも６μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約２．５～１０μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１０μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約６～１０μｇのニューロトロフィンを含み得る。例えば、超粒子は、約６～８μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～１５μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約５～２０μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約８～２０μｇのニューロトロフィンを含み得る。別の例では、超粒子は、約８～１５μｇのニューロトロフィンを含み得る。
【0064】
ある例では、本開示の超粒子は、少なくとも１．５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも２．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。
【0065】
別の例では、超粒子は、少なくとも２．５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも３．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも３．５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも４．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも５．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも６．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも７．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも８．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも９．０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１０．５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１１μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１１．５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１２μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも１５μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、少なくとも２０μｇのペイロードを含み、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。
【0066】
例えば、超粒子は、少なくとも６μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約２．５～１０μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約５～１０μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約６～１０μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。例えば、超粒子は、約６～８μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約５～２０μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約５～１５μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約８～２０μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。別の例では、超粒子は、約８～１５μｇのペイロードを含むことができ、この場合、該ペイロードは、９～１０の等電点を有する。例えば、該ペイロードは、９～１０の等電点を有するニューロトロフィンであり得る。
【0067】
ある例では、上記のペイロードを有する超粒子は、アルギネートヒドロゲル中で提供され得る。例えば、該アルギネートヒドロゲルは、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルであり得る。
【0068】
本開示の超粒子は、上記に例示されるペイロードを担持することができ、以下に論じる例から選択される細孔径を有することができる。ある例では、超粒子は、ミクロポーラスである。「ミクロポーラス」という用語は、本開示の文脈においては、約２ｎｍ未満の細孔径を有する粒子を指すために使用される。例えば、ミクロポーラス超粒子は、約０．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有し得る。他の例では、ミクロポーラス超粒子は、約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有する。別の例では、超粒子は、メソポーラスである。「メソポーラス」という用語は、本開示の文脈においては、直径約２ｎｍ～約５０ｎｍの細孔を有する粒子を指すために使用される。例えば、メソポーラス超粒子は、約２ｎｍ～約５０ｎｍの細孔径を有し得る。他の例では、メソポーラス超粒子は、約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍの細孔径を有する。別の例では、超粒子は、マクロポーラスである。「マクロポーラス」という用語は、本開示の文脈においては、約５０ｎｍ超の細孔径を有する粒子を指すために使用される。例えば、マクロポーラス超粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの細孔径を有し得る。他の例では、マクロポーラス超粒子は、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍの細孔径を有する。
【0069】
ある例では、超粒子は、ミクロポーラスナノ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約０．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、メソポーラスナノ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約２ｎｍ～約５０ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、マクロポーラスナノ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約５０ｎｍ～約９５ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約５０ｎｍ～約８５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約６５ｎｍの細孔径を有するナノ粒子からなる。
【0070】
別の例では、超粒子は、二峰性の細孔構造を有するナノ粒子からなる。「二峰性」という用語は、本開示の文脈においては、複数の細孔径、通常は、小さい方の細孔径及び大きい方の細孔径を含む粒子を指すために使用される。例えば、超粒子は、メソ孔及びマクロ孔を有するナノ粒子を含むことができる。ある例では、かかる超粒子は、２ｎｍ～９５ｎｍの細孔を有するナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、１０ｎｍ～９５ｎｍの細孔を有する二峰性のナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、１５ｎｍ～９５ｎｍの細孔を有する二峰性のナノ粒子からなる。
【0071】
他の例では、超粒子は、１ｎｍ～２００ｎｍの細孔径からなり得る。他の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１ｎｍ～約５ｎｍ及び大きい方の細孔径約１０ｎｍ～約５０ｎｍを有する二峰性のナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性のナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約３ｎｍ及び大きい方の細孔径約４ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性のナノ粒子からなる。他の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１０ｎｍ～約５０ｎｍ及び大きい方の細孔径約７０ｎｍ～約９５ｎｍを有する二峰性のナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍ及び大きい方の細孔径約８０ｎｍ～約９５ｎｍを有する二峰性のナノ粒子からなる。
【0072】
ある例では、超粒子は、ミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、ミクロポーラスミクロ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約０．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約１ｎｍ～約２ｎｍ、約１．５ｎｍ～約２ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、メソポーラスミクロ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約２ｎｍ～約５０ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約２ｎｍ～約４０ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、マクロポーラスミクロ粒子からなる。ある例では、超粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。他の例では、超粒子は、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍの細孔径を有するミクロ粒子からなる。
【0073】
別の例では、超粒子は、二峰性の細孔構造を有するミクロ粒子からなる。例えば、超粒子は、メソ孔及びマクロ孔を有するミクロ粒子を含むことができる。ある例では、かかる超粒子は、２ｎｍ～５００ｎｍの細孔を有するミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、１０ｎｍ～２５０ｎｍの細孔を有する二峰性のミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、１５ｎｍ～１５０ｎｍの細孔を有する二峰性のミクロ粒子からなる。
【0074】
他の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１ｎｍ～約５ｎｍ及び大きい方の細孔径約１０ｎｍ～約５０ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約７０ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約３ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約６５ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。他の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１０ｎｍ～約３０ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約２００ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約１５０ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、小さい方の細孔径約２０ｎｍ～約３０ｎｍ及び大きい方の細孔径約１００ｎｍ～約１２０ｎｍを有する二峰性のミクロ粒子からなる。
【0075】
別の例では、超粒子は、少なくとも３μｇの上記ペイロードを担持し、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性ナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、少なくとも５μｇの上記ペイロードを担持し、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性ナノ粒子からなる。
【0076】
別の例では、超粒子は、少なくとも８μｇの上記ペイロードを担持し、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性ナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、少なくとも１０μｇの上記ペイロードを担持し、小さい方の細孔径約２ｎｍ～約４ｎｍ及び大きい方の細孔径約１５ｎｍ～約４０ｎｍを有する二峰性ナノ粒子からなる。これらの例では、該超粒子は、アルギネートヒドロゲル中で提供され得る。例えば、該アルギネートヒドロゲルは、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルであり得る。
【0077】
別の例では、超粒子は、ミクロ粒子及びナノ粒子からなる。この例では、ミクロ粒子及びナノ粒子は、上記の細孔径（複数可）を有し得る。例えば、超粒子は、二峰性の細孔構造を有するミクロ粒子及びナノ粒子からなり得る。
【0078】
ある例では、超粒子は、実質的に均一な細孔径を有し得る。別の例では、超粒子は、様々な細孔径からなる。この例では、細孔径は様々でよいが、特定の径範囲に入り得る。例えば、超粒子は、大部分メソポーラスであり得る。別の例では、超粒子は、大部分マクロポーラスであり得る。別の例では、超粒子は、実質的に均一な細孔径を有するナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、実質的に均一な小孔径及び大孔径を有する二峰性のナノ粒子からなる。別の例では、超粒子は、実質的に均一な細孔径を有するミクロ粒子からなる。別の例では、超粒子は、実質的に均一な小孔径及び大孔径を有する二峰性のミクロ粒子からなる。
【0079】
ある例では、上記の超粒子は、規則的な細孔構造を有し得る。これらの超粒子は、規則的な３次元間隔の細孔を有する。別の例では、上記の超粒子は、不規則な細孔構造を有し得る。これらの超粒子は、不規則な３次元間隔の細孔を有する。別の例では、超粒子は、規則的な細孔構造と不規則な細孔構造の両方の組み合わせを有する。
【0080】
当業者には、超粒子の細孔径が、例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）及びＸ線コンピュータ断層撮影法によって測定され得ることが理解されよう。当業者には、上記に例示した細孔径を有する超粒子を、それらの３次元構造の最も広い点の幅を測定することによって特定することができる。ある例では、最も広い点または細孔は、当該超粒子の表面に存在し得る。
【0081】
本開示の超粒子は、それら粒子間の距離によって特徴づけられる場合がある。ある例では、粒子間の平均距離は、約８０ｎｍ～約４００ｎｍに及び得る。別の例では、コロイド粒子間の平均距離は、約９０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～に及ぶ。
【0082】
ある例では、超粒子の細孔は連結している。例えば、超粒子は、一連の相互連結した細孔を含み得る。別の例では、超粒子の細孔は連結していない。別の例では、超粒子は、連結した細孔及び連結していない細孔の両方の組み合わせを有する。
【0083】
本開示の超粒子は、それらの細孔の容積によって特徴づけられる場合がある。ある例では、超粒子の細孔容積は、約０．５ｍＬｇ－１～約１０ｍＬｇ－１に及ぶ。別の例では、超粒子は、約０．８ｍＬｇ－１～約５ｍＬｇ－１、約１ｍＬｇ－１～約２．５ｍＬｇ－１、約１．５ｍＬｇ－１～約２ｍＬｇ－１の細孔容積を有する。
【0084】
本開示の超粒子は、中空コアを有する場合もあれば、トロイダルコアを有する場合もある。ある例では、該超粒子のコアの内部容積は、該超粒子の全体積の少なくとも約４５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％である。中空コアの超粒子を生成する例示的な方法としては、酸コア法、例えば、ＵＳ４，４６８，４９８に記載のもの及びエステルコア法、例えば、ＵＳ５，１５７，０８４及び５，５２１，２５３に記載のものが挙げられる。
【0085】
本開示の超粒子は、それらの構造の表面積によって特徴づけられる場合がある。ある例では、超粒子の表面積は、約５００ｍ２ｇ－１～約１５００ｍ２ｇ－１に及ぶ。別の例では、超粒子は、約５５００ｍ２ｇ－１～約１２５０ｍ２ｇ－１、約６００ｍ２ｇ－１～１０００ｍ２ｇ－１、約６００ｍ２ｇ－１～７００ｍ２ｇ－１の表面積を有する。ある例では、超粒子の表面積は、約６００ｍ２ｇ－１である。ある例では、超粒子の表面積は、約６２０ｍ２ｇ－１である。
【0086】
本開示の超粒子は、特定のインビトロ放出プロファイルによって特徴づけられる場合がある。ある例では、超粒子は、ペイロードを少なくとも５０日間放出する。ある例では、超粒子は、ペイロードを少なくとも１００日間放出する。ある例では、超粒子は、ペイロードを少なくとも１５０日間放出する。ある例では、被覆された超粒子は、実質的に直線的な放出プロファイルを有する。当業者には、様々な方法を用いて超粒子のインビトロ放出プロファイルを測定することができる。かかる方法の例は、以下の実施例７に論じる。例えば、本明細書に開示する超粒子は、標識されたペイロード、例えば、ＦＩＴＣ－リゾチームを担持することができ、その後、ＰＢＳ等の溶液中でインキュベートされ得る。間欠蛍光測定を用いて、経時的に放出されるペイロードのレベル（例えば、μｇ）を測定することができる。当業者には、経時的にペイロードの放出を図にすること及び検量線を適合させることによって容易にバースト放出を識別すること及び／または放出プロファイルが実質的に直線的であるかどうかを特定することが可能であろう。ある例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９２の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９５の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９７の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９８の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２＞０．９９の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２が０．９～０．９９の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２が０．９２～０．９９の直線的な検量線を有する。別の例では、実質的に直線的な放出プロファイルは、Ｒ２が０．９５～０．９９の直線的な検量線を有する。
【0087】
ある例では、バースト放出は、ペイロード放出の顕著な増加と、その後のさらに持続する放出プロファイルによって識別される。バースト放出の例を、以下の図に示す。ある例では、バースト放出は、最初の７日間にわたる約３０～７５％のペイロードの放出を特徴とする。別の例では、バースト放出は、最初の７日間にわたる約３０～７０％のペイロードの放出を特徴とする。別の例では、バースト放出は、最初の７日間にわたる約３５～６５％のペイロードの放出を特徴とする。別の例では、バースト放出は、最初の７日間にわたる約４０～６０％のペイロードの放出を特徴とする。当然のことながら、バースト放出の割合は、ペイロードのタイプに左右される。例えば、リゾチームのバースト放出は、最初の７日間にわたる約５５～７５％のペイロードの放出を特徴とし得る。別の例では、ＢＤＮＦのバースト放出は、最初の７日間にわたる約３５～７０％のペイロードの放出を特徴とし得る。
【0088】
ある例では、本開示によって包含される持続放出プロファイルは、最初の７日間にわたる約３～２５％のペイロードの放出を特徴とする。別の例では、本開示によって包含される持続放出プロファイルは、最初の７日間にわたる約５～２５％のペイロードの放出を特徴とする。
【0089】
別の例では、本開示によって包含される持続放出プロファイルは、最初の７日間にわたる約５～１５％のペイロードの放出を特徴とする。別の例では、本開示によって包含される持続放出プロファイルは、最初の７日間にわたる約５～１０％のペイロードの放出を特徴とする。これらの例では、該ペイロードは、ニューロトロフィンであり得る。
【0090】
この場合もやはり、持続放出の割合は、ペイロードのタイプに左右される。例えば、リゾチームの持続放出は、最初の７日間にわたる約１５～４０％のペイロードの放出を特徴とし得る。別の例では、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３の持続放出は、最初の７日間にわたる約５～１０％のペイロードの放出を特徴とし得る。
【0091】
ある例では、上記の持続放出プロファイルもまた、実質的に直線的なペイロード放出の検量線と関連し得る。
【0092】
ある例では、ペイロードの遅延放出が、本開示によって包含される超粒子で認められる。例えば、ペイロードの放出は、当該超粒子のコーティングが十分に生分解するまで、実質的にまたは完全に阻害され得る。例えば、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、投与後の最初の数日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。ある例では、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、少なくとも２日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。別の例では、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、少なくとも３日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。別の例では、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、少なくとも４日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。別の例では、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、少なくとも５日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。別の例では、被覆された超粒子からのペイロードの放出は、３～５日間、実質的にまたは完全に阻害され得る。
【0093】
ある例では、本開示の超粒子は、約１ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するナノ粒子から生成される。別の例では、超粒子は、約０．１μｍ～１００μｍの直径を有するミクロ粒子から生成される。別の例では、超粒子は、ナノ粒子及びミクロ粒子から生成される。
【0094】
本開示の超粒子を形成する例示的な粒子としては、有機粒子、無機粒子、金属粒子またはそれらの組み合わせが挙げられる。例示的な有機粒子としては、ポリマー粒子、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（エタクリル酸）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド）、ポリアミド、ポリ－２－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ゼラチン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。例示的な無機粒子としては、鉱物充填剤、例えば、重充填剤または高密度充填剤、顔料、クレー及び他の合成粒子が挙げられる。他の例示的な無機粒子としては、高密度鉱物、例えば、バライト、ヘマタイト、酸化マグネシウム、無機酸化物、すなわち、二酸化チタン、酸化カルシウム、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化セリウム、二酸化ジルコニウム、及び二酸化ケイ素等が挙げられる。ある例では、該材料は、二酸化ケイ素（すなわち、シリカ）である。従って、ある例では、該超粒子は、シリカ超粒子と呼ばれ得る。例示的な金属粒子としては、金、銀、及び銅が挙げられる。１つの例では、超粒子は、同じ粒子を含み得る。例えば、超粒子は、実質的にシリカ粒子からなり得る。別の例では、超粒子は、異なる粒子、例えば、シリカ及びクレー粒子を含み得る。他の例では、超粒子は、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の異なる粒子を含むことができる。
【0095】
ある例では、超粒子は、高分子電解質または高分子電解質材料を含む。かかる超粒子の例は、ＷＯ２００６／０３７１６０に開示されている。この例では、該高分子電解質は、正荷電高分子電解質（または正荷電能力を有する）の場合もあれば、負荷電高分子電解質（または負荷電能力を有する）の場合も、正味荷電がゼロの場合もある。
【0096】
本開示の超粒子は、様々な形状を有し得る。例えば、超粒子は、球状の形状を有することができる。例示的な球状の形状としては、球及び卵形が挙げられる。別の例では、超粒子は、非球形の形状を有する。例示的な非球形の形状としては、ダンベル、半球、ディスク、四面体、繊維、球面円柱及び不規則形状が挙げられる。ある例では、超粒子は、規則的な構造を有し得る。例えば、超粒子は、秩序配列を含み得る。
【0097】
本開示の球状超粒子は、それらの直径によって特徴づけられる場合がある。例えば、本開示の超粒子は、１００μｍを超える直径を有する。例えば、本開示の超粒子は、少なくとも約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約５５０μｍ、約６００μｍ、約６５０μｍ、約７００μｍ、約７５０μｍ、約８００μｍ、約８５０μｍ、約９００μｍ、約９５０μｍ、約１０００μｍの直径を有し得る。例えば、超粒子は、約５５０μｍの直径を有し得る。この直径の超粒子は、高薬物担持を可能にしながら、カニューレを介して内耳への送達を容易にするために有利である。他の例では、超粒子は、約１５０μｍ～約１０００μｍ、約２００μｍ～約９００μｍ、約３００μｍ～約８００μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４００μｍ～約６００μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４５０μｍ～約５５０μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約５２０μｍ～約５８０μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４６０μｍ～約５４０μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４７０μｍ～約５３０μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４８０μｍ～約５２０μｍの直径を有し得る。別の例では、超粒子は、約４９０μｍ～約５１０μｍの直径を有し得る。他の例では、超粒子は、それらの３次元構造の最も広い点の幅によって特徴づけられる場合がある。例えば、超粒子は、上記に例示した直径と一致する幅を有し得る。
【0098】
別の例では、該超粒子の表面は、官能基の付加によってペイロードの担持を高めるように修飾される。任意の数の官能基を超粒子の表面に付加してもよく、官能基の選択は、担持されるペイロードを補足するように選択される。ある例では、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）等の部分が、シリカ超粒子の表面にグラフトされる。これにより、ペイロードに存在する任意のカルボキシル基と相互作用することができるアミン官能基が導入される。別の例では、該超粒子は、ペイロードの担持を高める全体としての正味荷電を有するように修飾される（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０１２）２４， ３３６２－３３６６）。例えば、該超粒子の表面は、全体としての正味の正電荷を有するように修飾される場合があり、その結果、全体としての正味の負電荷を有するペイロードの担持が高まる。別の例では、該超粒子の表面は、全体としての正味の負電荷を有するように修飾され、その結果、全体としての正味の正電荷を有するペイロードの担持が高まる。
【0099】
本開示の超粒子はまた、架橋された官能基を含んでもよい。例えば、官能基は、化学反応を介して架橋され得る。ある例では、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）分子は、ＰＧＡ分子とシスタミンの化学反応により架橋される（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０１２）２４， ３３６２－３３６６）。
【0100】
生分解性コーティング
ある特定の実施形態では、生分解性コーティングを使用して、本明細書に開示する超粒子からのペイロードの初期のバースト放出を低減または排除する場合がある。従って、ある例では、本開示は、生分解性コーティングで被覆された本明細書に記載のペイロードを含む超粒子を包含する。
ある特定の実施形態では、生分解性コーティングを使用して、本明細書に開示する超粒子からのペイロードの初期のバースト放出を低減または排除する場合がある。従って、ある例では、本開示は、生分解性コーティングで被覆された本明細書に記載のペイロードを含む超粒子を包含する。
【0101】
「生分解性」という用語は、本開示の文脈においては、経時的に、特に、対象への投与後に分解するコーティングを描写するために使用される。この例では、該コーティングの分解は、該超粒子からのペイロードの該対象への放出と同時に起こる。例えば、本開示によって包含される生分解性コーティングは、対象の内耳への投与後に分解し得る。別の例では、本開示によって包含される生分解性コーティングは、対象の蝸牛への投与後に分解し得る。
【0102】
「コーティング」という用語は、本開示の文脈においては、本明細書に開示する超粒子及びそのペイロードの表面に塗布されるまたはそれらを封入する組成物の少なくとも１層を指すために使用される。ある例では、該超粒子の少なくとも一部が被覆される。別の例では、超粒子は、実質的に被覆される。
【0103】
ある例では、コーティングは、本明細書に開示する超粒子の表面に塗布されるか、または形成される。「直接被覆」という用語は、該コーティングが、表面に直接塗布されるか、または形成される超粒子を描写するために使用され得る。例として、直接被覆超粒子は、当該超粒子の表面にコーティングを直接形成するため、前駆体物質で被覆された後、触媒で処理され得る。
【0104】
本開示によって包含される被覆された超粒子の他の例としては、ゲル製剤またはフォーム製剤等の製剤で提供される超粒子が挙げられる。これらの例では、該製剤は生分解性であるとともに、例えば、生分解性ゲルまたはフォームを含むことができる。例えば、固体の出現として製剤中に提供される超粒子は、本開示の文脈においては、被覆されていると見なされる。この例では、該超粒子は、生分解性製剤全体に分散され得る。
【0105】
本開示によって包含されるコーティングは、超粒子のペイロードと適合し（例えば、ペイロードを分解しない）、対象に生物学的に許容され、本明細書に開示する超粒子からのペイロードの放出を減速させる限り、特に限定されない。従って、例えば、米国特許第４，４３４，１５３号に記載されている様々な生分解性有機及び無機ポリマーを、本開示の文脈においてコーティングとして使用してもよい。該特許は、様々なセルロース系材料、ポリビニルポリマー等を開示しており、これらは、そのコーティングまたは封入材料及びその厚さに応じて最初の投与後数分からその後数時間まで変化し得る時点で、溶解または生分解し、それらの内容物を放出する。他の例示的なコーティング材料としては、天然及び合成の両材料、例えば、（ａ）動物由来の構造タンパク質及び親水コロイド、（ｂ）植物由来の多糖及び他の親水コロイド、ならびに（ｃ）合成ポリマーが挙げられる。これらのマトリックス材料の一部は、その天然型で適するが、他のもの、特に親水コロイドは、化学修飾、または物理的な修飾、例えば、配向、放射線架橋等のいずれかによる不溶化を必要とする。第一類の例は、天然及び修飾コラーゲン、筋タンパク質、エラスチン、ケラチン、レジリン及びフィブリンである。多糖及び植物親水コロイドの例は、アルギン、ペクチン、カラゲニン、キチン（またはキトサン）、ヘパリン、コンドロイチン硫酸塩、寒天、グアー、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、トラガカント、ガティガム、デンプン、オキシスターチ、リン酸デンプン、カルボキシメチルデンプン、スルファエチル（ｓｕｌｆａｅｔｈｙｌ）デンプン、アミノエチルデンプン、アミドエチルデンプン、デンプンエステル、例えば、デンプンマレエート、スクシネート、ベンゾエート及びアセテート、ならびにデンプンとゼラチンの混合物、セルロース及びその誘導体、例えば、修飾セルロース系、例えば、綿をエチレンオキシドで処理することによって得られる部分的にヒドロキシエチル化された綿、または綿を苛性及びクロロ酢酸で処理することによって得られる部分的にカルボキシメチル化された綿である。合成ポリマーの例としては、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリ（ホスフェート）、合成ポリペプチド、ポリビニルアルキルエーテル、ポリアルキルアルデヒド、非架橋ヒドロキシアルキルアクリレート及びメタクリレートの水溶性親水性ポリマー、ポリアルキレンカーボネート、ポリフェノールコーティング等が挙げられる。
【0106】
ある例では、該生分解性コーティングは、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、キトサン－グリセロリン酸ヒドロゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲル、ポリ酪酸（ＰＬＡ）ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ジブロックコポリペプチドヒドロゲル（ＤＣＨ）のうちの１つ以上を含む。
【0107】
ある例では、該生分解性コーティングは、フィブリンまたはその誘導体を含む。別の例では、該生分解性コーティングは、フィブリンまたはその誘導体である。ある例では、該フィブリンは、フィブリノゲンから生成される。フィブリンは、天然材料であり、いくつかの生物医学的応用に関して報告されている。フィブリンゲルは、多くの組織に結合するその能力及び創傷治癒におけるその天然の役割のため、シーラントとして使用されている。当業者には、フィブリンが、フィブリノゲンを重合させるプロテアーゼトロンビンを介して生成され得ることが理解されよう。ある例では、該トロンビンは、少なくとも８００単位／ｍｇの活性を有する。別の例では、該トロンビンは、少なくとも９００単位／ｍｇの活性を有する。別の例では、該トロンビンは、少なくとも１，０００単位／ｍｇの活性を有する。別の例では、該トロンビンは、８００～１２００単位／ｍｇの活性を有する。
【0108】
ある例では、該フィブリンコーティングは、第ＸＩＩＩ因子及びＣａ２＋を使用して安定化され得る。
【0109】
フィブリン誘導体の例としては、フィブリンモノマー、フィブリンダイマー、フィブリンポリマーまたは架橋フィブリンポリマーが挙げられる。別の例では、該生分解性コーティングは、フィブリンマトリックスまで架橋されたバイドメインペプチドを含む。
【0110】
別の例では、該生分解性コーティングは、キチンまたはキチンから生成される産物、例えば、キトサンを含む。ある例では、該コーティングは、キトサンである。ある例では、該キトサンは、キチンから生成される。例えば、当業者には、キトサンが、キチンの脱アセチル化によって生成され得ることが理解されよう。ある例では、キトサンは、キチンを、水酸化ナトリウム等のアルカリ性物質で処理することによって生成される。
【0111】
ある例では、該コーティングは、本明細書に開示する超粒子の表面に塗布される。ある例では、少なくとも１層のコーティング（または層）が、超粒子の表面に塗布される。別の例では、少なくとも２層、少なくとも３層、少なくとも４層または少なくとも５層のコーティング（または層）が、超粒子の表面に塗布される。従って、ある例では、本明細書に開示する超粒子は、少なくとも２層のコーティングを含むことができる。別の例では、本明細書に開示する超粒子は、少なくとも３層のコーティングを含むことができる。別の例では、本明細書に開示する超粒子は、２～５層のコーティングを含むことができる。別の例では、本明細書に開示する超粒子は、２層または３層のコーティングを含むことができる。他の例では、本開示によって包含される組成物は、様々な数のコーティングを有する超粒子を含む。例えば、該組成物中のいくつかの超粒子が１層のコーティングを含む場合があると同時に、他は２層のコーティングを含む。ある例では、組成物は、１層のコーティングを有する超粒子及び２層のコーティングを有する超粒子を含む。他の例では、該組成物中の超粒子の一部は被覆され、残りの超粒子は被覆されていない。これらの例では、該超粒子は、同じペイロードを担持し得る。例えば、ＢＤＮＦを担持し、２層のコーティングで被覆された超粒子は、ＢＤＮＦを担持し、３層のコーティングで被覆された超粒子とともに提供され得る。別の例では、異なる数のコーティングで被覆された超粒子は、異なるペイロードを担持する。例えば、ＢＤＮＦを担持し、２層のコーティングで被覆された超粒子は、ＮＴ－３を担持し、３層のコーティングで被覆された超粒子とともに提供され得る。
【0112】
ある例では、本明細書に開示する超粒子は、当該超粒子の直径の約５％のコーティング膜厚を有する。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の５％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の４％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の３％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の２％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の１％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．５％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．２％未満である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．２％～５％である。
【0113】
他の例では、本明細書に開示する超粒子は、当該超粒子の直径の約０．５％のコーティング膜厚を有する。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の約０．１５％である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の約０．１％である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．５％～０．１％である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．３％～０．１％である。別の例では、コーティング膜厚は、該超粒子の直径の０．２％～０．１％である。これらの例では、該超粒子の直径は、４５０～５５０μＭであり得る。別の例では、該超粒子の直径は、５００μＭであり得る。ある例では、直接被覆された超粒子は、それらのコーティング膜厚によって定義され得る。
【0114】
様々な方法が、超粒子の表面にコーティングを「塗布」するのに適しており、最適な方法は、通常、塗布されるコーティングによって決まる。ある例では、超粒子は、本明細書に開示するコーティング材料を含む製剤中でインキュベートされ得る。フィブリンで被覆された超粒子との関連では、本明細書に開示する超粒子は、フィブリノゲンとともにインキュベートされ、その後のトロンビンとの接触により、該超粒子表面のフィブリンコーティングへのフィブリノゲンの変換を促進することができる。ある例では、この過程を繰り返し、超粒子表面に複数のコーティングを塗布することができる。例えば、本明細書に開示する超粒子は、少なくとも２層、３層、４層、５層またはそれ以上のフィブリンコーティングで被覆することができ、各コーティングは、超粒子をフィブリノゲンとともにインキュベートし、その後のトロンビンとの接触により、該超粒子表面のフィブリンコーティングへのフィブリノゲンの変換を促進することによって塗布される。別の例では、本明細書に開示する超粒子は、少なくとも２層、３層、４層、５層またはそれ以上のキトサンコーティングで被覆され、各コーティングは、超粒子をキトサンとともにインキュベートし、その後の硬化期間の後、その過程を繰り返すことによって塗布される。
【0115】
他の例では、本明細書に開示する超粒子は、少なくとも２層、３層、４層、５層またはそれ以上の生分解性コーティングで被覆され得る。ある例では、すべてのコーティングは同じである。別の例では、異なる生分解性コーティングが使用される。例えば、超粒子は、１層以上のフィブリンで被覆された後、１層以上のキトサンで被覆される場合もあれば、逆の場合もある。
【0116】
固体の出現に関して上記で参照した通り、ある例では、超粒子は、本明細書に開示するコーティングとして作用する製剤中に提供される。例えば、超粒子は、上記のコーティングを含む製剤中に提供され得る。ある例では、超粒子は、上記の材料、例えば、フィブリンまたはキトサンを含む製剤中に提供され得る。
【0117】
別の例では、超粒子は、フィブリノゲン等のフィブリン前駆体及び重合触媒を含む製剤中に提供され得る。フィブリノゲンがフィブリンに重合される過程は、先に述べた。簡潔には、プロテアーゼが、ダイマーのフィブリノゲン分子を２つの対称部位で切断する。トロンビン、ペプチダーゼ、及びプロテアーゼＩＩＩを含め、フィブリノゲンを切断することができるプロテアーゼ触媒がいくつか考えられ、各々、異なる部位でこのタンパク質を切断する。フィブリノゲンが切断されると、自己重合ステップが生じ、ここでは、フィブリノゲンモノマーが集合し、非共有結合的に架橋されたポリマーゲルを形成する。この自己組織化は、プロテアーゼ切断が生じた後に、結合部位が露出するために生じる。それらが露出されると、分子の中心のこれら結合部位が、ペプチド鎖の末端に存在するフィブリノゲン鎖の他の部位に結合することができる。このようにして、ポリマーネットワークが形成される。
【0118】
従って、別の例では、超粒子は、フィブリノゲンを含む製剤中に提供され得る。この例では、該フィブリノゲンを、トロンビン（ＥＣ３．４．２１．５）等の適切なプロテアーゼと接触させ、対象への投与の前に、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を促進することができる。例えば、トロンビンは、対象への投与の前に当該製剤に加えてもよい。
【0119】
上記のように、上記材料中で超粒子を被覆することで、超粒子からのペイロードのバースト放出を減速させることができる。本発明者らはまた、ヒドロゲルの存在が、放出速度をさらに減じることも見出した。従って、本開示によって包含される被覆された超粒子は、ヒドロゲル中に提供され得る。ある例では、該ヒドロゲルは、アルギネートヒドロゲルである。例えば、該アルギネートヒドロゲルは、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルであり得る。他の例としては、フィブリン接着剤（例えば、ＴｉｓｓｅｅｌとしてＢａｘｔｅｒから市販されている）及びチタン－ポリフェノールゲル、例えば、Ｒａｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５５， １３８０３）に記載のものが挙げられる。
【0120】
ある例では、本開示に従ってヒドロゲル中に超粒子を提供することによって、それらの取り扱いを容易にすることもできる。例えば、該ヒドロゲルは、超粒子の容易な移植を助け、及び／または標的（例えば、鼓膜、卵円窓もしくは正円窓または蝸牛）での該超粒子の局在化を支援することができる。他の例では、ヒドロゲル中に超粒子を提供することによって、対象の耳内の膜、例えば、鼓膜、卵円窓または正円窓を越える拡散も高まる。
【0121】
別の例では、被覆された超粒子は、持続放出または標的化送達システムに組み込むことができる。かかる持続放出システムとしては、局所投与用のフォーム、ゲル、ドロップ及びスプレーまたは注射もしくは注射カニューレ用のデポーを挙げることができる。例示的な持続放出システムとしては、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びミクロスフェアが挙げられる。ポリマーマトリックスとしては、超粒子が多孔質ポリマーコーティングに囲まれるリザーバ系のシステム（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ（２０１２）ＪＡＬＡ．１７， ５０－５８）及び超粒子がポリマーマトリックスに埋め込まれるモノリシックマトリックスシステム（Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９， １５２７－１５３３）が挙げられる。リポソームは、生分解性及び両親媒性の薬物送達システムでよく、リン脂質及びコレステロールを使用して製剤化され得る。ミクロスフェアは、生分解性及び生体適合性ポリマーを使用して製剤化され得る。別の例では、該持続放出システムは、多糖に基づく場合がある。例えば、超粒子製剤は、アニオン性多糖を含むことができる。ある例では、該多糖は、アルギン酸またはその誘導体であり得る。例えば、該超粒子は、アルギネートヒドロゲルを含み得る。様々なアルギン酸誘導体が当技術分野で知られている。例としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム及びアルギン酸カルシウムが挙げられる。他の例としては、アルギン酸バリウム及びアルギン酸ストロンチウムが挙げられる。ある例では、該アルギン酸は、アルギン酸ナトリウムである。従って、ある例では、本開示は、上記の超粒子及びアルギン酸ナトリウムを含む製剤を包含する。アルギネートは、様々なソースから得ることができる（例えば、Ｓｉｇｍａ、ＦＭＣ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）。別の例では、該多糖は、非分岐多糖、例えば、グリコサミノグリカンである。例えば、該多糖は、ヒアルロン酸であり得る。
【0122】
製剤
超粒子は、対象への投与に適した医薬組成物として製剤化され得る。例示的な医薬組成物は、超粒子を単独で提供する場合もあれば、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて提供する場合もある。これらの組成物では、超粒子は、対象に対して治療有効量のペイロードを送達するのに十分な量で提供される。特定の投与経路に応じて、当技術分野で既知の様々な許容可能な担体を使用してもよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載の通りである。
超粒子は、対象への投与に適した医薬組成物として製剤化され得る。例示的な医薬組成物は、超粒子を単独で提供する場合もあれば、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて提供する場合もある。これらの組成物では、超粒子は、対象に対して治療有効量のペイロードを送達するのに十分な量で提供される。特定の投与経路に応じて、当技術分野で既知の様々な許容可能な担体を使用してもよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載の通りである。
【0123】
例示的な医薬組成物はまた、医薬的に許容される滅菌水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、またはエマルションを含んでもよく、また、滅菌注射剤または分散剤に使用の直前に再構成するための滅菌粉末を含んでもよい。適切な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒または媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物、植物油、ならびに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。かかる組成物はまた、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤または抗細菌剤及び抗真菌剤を含んでもよい。
【0124】
別の例では、超粒子は、持続放出または標的化送達システムに組み込むことができる。例えば、本発明者らは、本明細書に開示する超粒子を、アルギネートヒドロゲルとともに提供することによって、当該超粒子からのペイロードの放出が遅くなることを確認した。かかる持続放出システムとしては、局所投与用のフォーム、ゲル、ドロップ及びスプレーまたは注射もしくは注射カニューレ用のデポーを挙げることができる。ある例では、本明細書に開示する直接被覆された超粒子は、持続放出システムで提供される。
【0125】
例示的な持続放出システムとしては、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びミクロスフェアが挙げられる。ポリマーマトリックスとしては、超粒子が多孔質ポリマーコーティングに囲まれるリザーバ系のシステム（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ（２０１２）ＪＡＬＡ．１７， ５０－５８）及び超粒子がポリマーマトリックスに埋め込まれるモノリシックマトリックスシステム（Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９， １５２７－１５３３）が挙げられる。リポソームは、生分解性及び両親媒性の薬物送達システムでよく、リン脂質及びコレステロールを使用して製剤化され得る。ミクロスフェアは、生分解性及び生体適合性ポリマーを使用して製剤化され得る。別の例では、該持続放出システムは、多糖に基づく場合がある。例えば、超粒子製剤は、アニオン性多糖を含むことができる。ある例では、該多糖は、アルギン酸またはその誘導体であり得る。例えば、本明細書に開示する被覆された超粒子は、アルギネートヒドロゲル中に分散され得る。様々なアルギン酸誘導体が当技術分野で知られている。例としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム及びアルギン酸カルシウムが挙げられる。他の例としては、アルギン酸バリウム及びアルギン酸ストロンチウムが挙げられる。ある例では、該アルギン酸は、アルギン酸ナトリウムである。従って、ある例では、本開示は、上記の超粒子及びアルギン酸ナトリウムを含む製剤を包含する。アルギネートは、様々なソースから得ることができる（例えば、Ｓｉｇｍａ、ＦＭＣ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）。別の例では、該多糖は、非分岐多糖、例えば、グリコサミノグリカンである。例えば、該多糖は、ヒアルロン酸であり得る。
【0126】
ある例では、上記の持続放出システム（複数可）を含む製剤は、直接被覆された超粒子及び被覆されていない超粒子を含むことができる。この例では、超粒子は、同じペイロードを含む場合もあれば、異なるペイロードを含む場合もある。この例の利点は、個々の超粒子に関する放出プロファイルが、必要に応じて調整され得ることである。
【0127】
別の例では、超粒子は、対象の耳内の膜、例えば、鼓膜、卵円窓または正円窓を越える拡散を高める製剤中に提供される。例えば、超粒子製剤は、人工外リンパを含み得る。別の例では、超粒子製剤は、正円窓膜との接触時間を最大化する。例えば、接触時間は、被覆されていない超粒子と比較して延長され得る。
【0128】
別の例では、超粒子は、対象と適合し、対象に有害ではない産物に分解する足場内に組み込まれるか、または埋め込まれる。これらの足場は、対象に移植される超粒子を収容する。
【0129】
様々な異なる足場が、本開示の実施において良好に使用され得る。例示的な足場としては、生物学的な分解性足場が挙げられるが、これらに限定されない。天然の生分解性の足場としては、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンの足場が挙げられる。適切な足場としては、ポリグリコール酸の足場または合成ポリマー、例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が挙げられる。
【0130】
治療及び投与
本開示は、本明細書で定義される超粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療方法を包含する。従って、ある例では、本開示の超粒子を含む組成物は、対象に対して、該対象における疾患または障害を治療するのに有効な量で投与される。ある例では、該疾患または障害は、聴力損失である。「聴力損失」という用語は、本開示の文脈においては、音を検出または処理する対象の能力の任意の低下を指すために使用される。従って、聴力損失への言及は、部分的な聴覚欠損または完全に聞くことができないことを包含する。
本開示は、本明細書で定義される超粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療方法を包含する。従って、ある例では、本開示の超粒子を含む組成物は、対象に対して、該対象における疾患または障害を治療するのに有効な量で投与される。ある例では、該疾患または障害は、聴力損失である。「聴力損失」という用語は、本開示の文脈においては、音を検出または処理する対象の能力の任意の低下を指すために使用される。従って、聴力損失への言及は、部分的な聴覚欠損または完全に聞くことができないことを包含する。
【0131】
ある例では、該聴力損失は、感音性難聴（ＳＮＨＬ）として特徴づけられる。ＳＮＨＬは、本開示の文脈においては、蝸牛内の繊細な感覚有毛細胞の損傷、もしくはそれらの蝸牛神経節ニューロン（ＳＧＮ）とのシナプス結合の損失、または蝸牛シュワン細胞の機能不全に由来する聴力損失を指すために使用される。ある例では、該聴力損失は、老人性難聴として特徴づけられる。別の例では、該聴力損失は、騒音性難聴である。別の例では、該聴力損失は、疾患誘発性または遺伝性である。別の例では、該聴力損失は、オトトキシン（ｏｔｏｔｏｘｉｎ）、例えば、アミノグリコシドへの曝露によって誘発される。
【0132】
ある例では、該対象は、哺乳類である。１つの例では、該対象は、ヒトである。例えば、該ヒト対象は、成人であり得る。ある例では、該ヒト対象は、小児である。他の例示的な哺乳類対象としては、コンパニオンアニマル、例えば、イヌもしくはネコ、または家畜、例えば、ウマもしくはウシが挙げられる。「対象」、「患者」、または「個体」等の用語は、文脈上、本開示では同義で使用され得る用語である。
【0133】
ある例では、本開示の超粒子は、腹腔内に投与される。本開示はまた、対象の細胞、組織または器官に、耳を介してペイロードを送達する方法を包含し、該方法は、対象の耳に対して、本開示の超粒子を投与することを含む。この例では、該方法は、対象の内耳、中耳、及び／または前庭器官から細胞に対してペイロードを送達し得る。別の例では、該方法は、対象の神経細胞、神経組織または脳に対して治療用ペイロードを送達する。
【0134】
ある例では、組成物は、鼓膜に投与される。この例では、組成物は、局所投与用に製剤化され得る（例えば、ドロップ、ゲル、フォーム、スプレー）。
【0135】
別の例では、組成物は、「中耳」腔に投与される。「中耳」という用語は、本開示の文脈においては、鼓膜と内耳の間の空間を指すために使用される。従って、中耳は、すべての内耳組織の外側にある。例えば、組成物は、鼓膜を通した注射を介して中耳に投与され得る。この例では、超粒子は、デポー注射として投与され得る。別の例では、治療を行う医師によって鼓膜に開口が形成され、組成物の中耳へのアクセスを容易にすることができる。中耳に組成物を投与する際、組成物は、正円窓及び／または卵円窓に投与され得る。
【0136】
別の例では、超粒子は、内耳に投与される。例えば、超粒子は、蝸牛に投与され得る。ある例では、超粒子は、蝸牛の基底回転に投与され得る。蝸牛または内耳の他の構造にアクセスするための外科技術は、当技術分野では既知である。ヒト蝸牛に外科的にアクセスする例示的な技術は、例えば、Ｃｌａｒｋ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｇｅｒｙ ｆｏｒ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｃｈａｎｎｅｌ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｉｍｐｌａｎｔ”，Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－７， １９８４、及びＣｌａｒｋ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ”，Ｅａｒ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｕｐｐｌ．１２：１５Ｓ－２４Ｓ，１９９１に記載されている。
【0137】
超粒子と耳の治療介入の組み合わせは、上記で論じられている。これらの例では、耳の治療介入は、超粒子の投与と同時に行われ得る。例えば、蝸牛装置は、超粒子と同時に移植され得る。しかしながら、蝸牛神経節ニューロンの生存の増加により、蝸牛インプラントの効用が改善されることがある。従って、超粒子が投与された後に、蝸牛装置を移植することが望ましい場合がある。例えば、蝸牛装置は、超粒子が投与された後約１か月、約２か月、約３ヶ月、約６か月で移植され得る。これらの例では、さらなる超粒子を該蝸牛装置とともに投与することができる。
【0138】
ある例では、超粒子の最初の投与は、対象の蝸牛に施され、超粒子の少なくとも２回目の投与は、当該対象の正円窓及び／または卵円窓に施される。
【0139】
ある例では、治療有効量が、該対象の耳に投与される。ある例では、複数の超粒子が、該対象の耳に投与される。例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個の超粒子が、該対象の耳に投与され得る。別の例では、約１～１０個の超粒子が投与される。他の例では、約２～９個、約３～８個、約４～７個、約５～６個の超粒子が、該対象の耳に投与される。これらの例では、超粒子は、同じペイロードを含み得る。代替的に、別の例では、超粒子は、異なるペイロードを担持する。例えば、神経栄養因子を担持した超粒子及びステロイドを担持した超粒子が投与され得る。別の例では、神経栄養因子を担持した超粒子及び抗生物質を担持した超粒子が投与され得る。別の例では、神経栄養因子を担持した超粒子が、抗生物質とともに投与される場合がある。
【0140】
組成物／キット
本開示の超粒子は、キットまたはパックで提供され得る。例えば、本明細書に開示する組成物は、内耳の障害を治療するための取扱説明書とともに、適切な容器に包装され得る。ある例では、組成物は、単回投与容器、例えば、点耳器またはプレフィルドシリンジに提供され得る。
本開示の超粒子は、キットまたはパックで提供され得る。例えば、本明細書に開示する組成物は、内耳の障害を治療するための取扱説明書とともに、適切な容器に包装され得る。ある例では、組成物は、単回投与容器、例えば、点耳器またはプレフィルドシリンジに提供され得る。
【0141】
１つの例では、該キットは、内耳の障害の治療法に使用される本開示の超粒子を含む。別の例では、該キットは、聴力損失の治療法に使用される本開示の超粒子を含む。ある例では、該聴力損失は、ＳＮＨＬである。別の例では、該聴力損失は、騒音性難聴である。ある例では、本開示のキットは、さらに、補聴器またはインプラントを含む。従って、ある例では、該キットは、超粒子及び人口内耳を含み得る。
【0142】
製造
本開示の超粒子の製造の例は、以下の通りであり、以下の実施例の節にも提供されている。ある例では、該超粒子は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物から製造され得る。様々なナノ粒子の例は、上記に提供されている。ある例では、該ナノ粒子は、二峰性の細孔構造を有する。ナノ粒子は、様々な方法を使用して生成され得る。１つのかかる方法は、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，９， １５７１－１５８０に記載されている。
本開示の超粒子の製造の例は、以下の通りであり、以下の実施例の節にも提供されている。ある例では、該超粒子は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物から製造され得る。様々なナノ粒子の例は、上記に提供されている。ある例では、該ナノ粒子は、二峰性の細孔構造を有する。ナノ粒子は、様々な方法を使用して生成され得る。１つのかかる方法は、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，９， １５７１－１５８０に記載されている。
【0143】
別の例では、本開示の超粒子は、エレクトロスプレーによって生成される。エレクトロスプレーの例は、Ｊａｗｏｒｅｋ Ａ．，２００７ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １， １８－３５に概説されている。エレクトロスプレーの例は、以下にも例示されている。ある例では、本開示は、超粒子の製造方法を包含する。該方法は、ナノ粒子及びアルギン酸またはその多糖誘導体を含む組成物を、ジカチオン性水溶液にエレクトロスプレーすることを含む。
【0144】
当業者には、エレクトロスプレーのパラメータは、エレクトロスプレーに使用される溶液のタイプに基づいて最適化され得ることが理解されよう。例えば、電圧及び流量を最適化し、所望のサイズの超粒子を得ることができる。ある例では、該流量は、約６～１０ｍＬｈ－１である。別の例では、該流量は、約７～９ｍＬｈ－１である。別の例では、該流量は、約８ｍＬｈ－１である。ある例では、該電圧は、約１０～２５ＫＶである。別の例では、該電圧は、約１１～２０ＫＶである。別の例では、該電圧は、約１２～１４ＫＶである。別の例では、該電圧は、約１３ＫＶである。
【0145】
ある例では、超粒子は、ナノ粒子溶液をエレクトロスプレーすることにより生成される。ある例では、溶液中のナノ粒子の濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌである。ある例では、溶液中のナノ粒子の濃度は、約３０ｍｇ／ｍｌである。ある例では、溶液中のナノ粒子の濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである。ある例では、溶液中のナノ粒子の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌである。ある例では、溶液中のナノ粒子の濃度は、約６０ｍｇ／ｍｌである。
【0146】
別の例では、超粒子は、アルギン酸またはその誘導体を含むナノ粒子溶液を、エレクトロスプレーすることにより生成される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、５ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、１０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、２０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。
【0147】
ある例では、該ナノ粒子溶液は、５ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、１０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、２０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸溶液から調製される。ある例では、該ナノ粒子溶液は、３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。別の例では、該ナノ粒子溶液は、２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギン酸水溶液から調製される。
【0148】
別の例では、超粒子は、アルギン酸を含むナノ粒子溶液を、エレクトロスプレーすることにより生成される。
【0149】
アルギン酸誘導体は、規定の温度でゲルを形成する限り、特に限定されない。ある例では、該アルギン酸誘導体は、多糖誘導体である。アルギン酸誘導体としては、様々なアルギン酸塩の形態が挙げられる。例としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム及びアルギン酸カルシウムが挙げられる。他の例としては、アルギン酸バリウム及びアルギン酸ストロンチウムが挙げられる。ある例では、該アルギン酸は、アルギン酸ナトリウムである。別の例では、超粒子は、アルギン酸を含むナノ粒子溶液を、エレクトロスプレーすることにより生成される。
【0150】
様々な粘度のアルギネートを使用して、超粒子の所望のサイズ及び形状に応じた本開示の超粒子が生成され得る。例えば、約２０～３００ｍＰａ＊ｓの粘度を有するアルギネートが使用され得る。別の例では、該アルギネートは、約２０～２００ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。ある例では、該アルギネートは、２０ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。別の例では、該アルギネートは、１００ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。別の例では、該アルギネートは、２００ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。
【0151】
ある例では、超粒子は、ナノ粒子を含む組成物を、水溶液にエレクトロスプレーすることにより生成される。ある例では、これは、ジカチオン性水溶液である。例示的なジカチオン性成分としては、Ｃａ２＋及びＢａ２＋が挙げられる。例えば、該水溶液は、塩化カルシウムを含み得る。別の例では、該水溶液は、塩化バリウムを含む。
【0152】
ある例では、超粒子は、組成物をエレクトロスプレーすることにより生成され、ここで、該組成物中のアルギネートの濃度は、５ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は、２０ｍｇ・ｍＬ－１～５０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該電圧は、１０ｋＶ～２５ｋＶである。別の例では、超粒子は、組成物をエレクトロスプレーすることにより生成され、ここで、該組成物中のアルギネートの濃度は、１０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は、３０ｍｇ・ｍＬ－１～５０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該電圧は、１１ｋＶ～２１ｋＶである。別の例では、超粒子は、組成物をエレクトロスプレーすることにより生成され、ここで、該組成物中のアルギネートの濃度は、２０ｍｇ・ｍＬ－１～３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は、３５ｍｇ・ｍＬ－１～４５ｍｇ・ｍＬ－１であり、該電圧は、１２ｋＶ～１４ｋＶである。これらの例では、該流量は、８ｍＬｈ－１であり得る。
【0153】
別の例では、超粒子は、組成物をエレクトロスプレーすることにより生成され、ここで、該組成物中のアルギネートの濃度は、３０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該組成物中のナノ粒子の濃度は、４０ｍｇ・ｍＬ－１であり、該電圧は、１３ｋＶであり、該流量は、８ｍＬｈ－１である。
【0154】
ある例では、本明細書に定義する方法を使用して製造される超粒子を焼成に供して、アルギン酸またはその誘導体を除去する。ある例では、焼成は、約５００℃で行われる。別の例では、焼成は、約５５０℃で行われる。別の例では、焼成は、約６００℃で行われる。別の例では、焼成は、約６５０℃で行われる。別の例では、焼成は、約７００℃で行われる。ある例では、焼成は、約６～３０時間行われる。別の例では、焼成は、約１０時間行われる。別の例では、焼成は、約２０時間行われる。別の例では、焼成は、約３０時間行われる。
【実施例】
【0155】
実施例１－ナノ粒子の生成
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＮＰ）を、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，９， １５７１－１５８０に記載の方法に基づく方法を使用して生成した。１．１ｇのセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を、５０ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑに攪拌しながら完全に溶解した。４．３ｇのポリ（アクリル酸）溶液（ＰＡＡ、Ｍｗ＝２５０ｋＤａ、３５重量％水溶液）を続いて加え、透明な溶液が得られるまで室温（２５℃）にて２０分間激しく攪拌した。３．５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（２８～３０％）をその後その溶液に加えて激しく攪拌し、乳状懸濁液を得た。次いで、４．４６ｍｌのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を、２０分間攪拌した後に加えた。その溶液をさらに１５分間攪拌し、その後その混合物をテフロン（登録商標）でシールされたオートクレーブに移し、これを９０℃で４８時間放置した。
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＮＰ）を、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，９， １５７１－１５８０に記載の方法に基づく方法を使用して生成した。１．１ｇのセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を、５０ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑに攪拌しながら完全に溶解した。４．３ｇのポリ（アクリル酸）溶液（ＰＡＡ、Ｍｗ＝２５０ｋＤａ、３５重量％水溶液）を続いて加え、透明な溶液が得られるまで室温（２５℃）にて２０分間激しく攪拌した。３．５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（２８～３０％）をその後その溶液に加えて激しく攪拌し、乳状懸濁液を得た。次いで、４．４６ｍｌのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を、２０分間攪拌した後に加えた。その溶液をさらに１５分間攪拌し、その後その混合物をテフロン（登録商標）でシールされたオートクレーブに移し、これを９０℃で４８時間放置した。
【0156】
合成時のＭＳ－ＮＰをエタノールで１回、水で２回及びエタノールで２回洗浄し、最後に９０℃で乾燥した。有機鋳型を５５０℃で３０時間焼成して除去した。
【0157】
実施例２－超粒子製造プロセスの開始－プロセスＡ
メソポーラスシリカ（ＭＳ）ナノ粒子を、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ．２２， ３８２９－３８３１に従って調製した。ＭＳナノ粒子を、粒子濃度５重量％でＭｉｌｌｉ－Ｑ水に分散し、短時間超音波処理して安定したコロイド懸濁液を形成した。その後、０．５～２．０μＬのＭＳナノ粒子分散液のアリコートを、パラフィンフィルムで予め覆った平らな表面に塗布した。これらの液滴を気流下で乾燥し、ＭＳナノ粒子を、毛細管力の作用を介してメソポーラスシリカ超粒子（毛細管力ＭＳ－ＳＰ）へと組織化させた。毛細管力ＭＳ－ＳＰのサイズは、液滴に用いたナノ粒子分散液の体積によって制御した。
メソポーラスシリカ（ＭＳ）ナノ粒子を、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ．２２， ３８２９－３８３１に従って調製した。ＭＳナノ粒子を、粒子濃度５重量％でＭｉｌｌｉ－Ｑ水に分散し、短時間超音波処理して安定したコロイド懸濁液を形成した。その後、０．５～２．０μＬのＭＳナノ粒子分散液のアリコートを、パラフィンフィルムで予め覆った平らな表面に塗布した。これらの液滴を気流下で乾燥し、ＭＳナノ粒子を、毛細管力の作用を介してメソポーラスシリカ超粒子（毛細管力ＭＳ－ＳＰ）へと組織化させた。毛細管力ＭＳ－ＳＰのサイズは、液滴に用いたナノ粒子分散液の体積によって制御した。
【0158】
毛細管力下、ＭＳコロイドは自己組織化し、ＭＳ－ＳＰを形成する緻密な構造になった。毛細管力ＭＳ－ＳＰをその後パラフィンフィルムから外し、セラミック容器に移し、９２３Ｋでアニールして、毛細管力ＭＳ－ＳＰの機械的安定性を高めた。毛細管力ＭＳ－ＳＰにその後ペイロードを担持させた。粒子あたり約１．３３μｇのタンパク質を担持させた。この毛細管力ＭＳ－ＳＰは、二峰性の細孔構造（２～３ｎｍ及び１５～３０ｎｍ）及び毛細管力ＭＳ－ＳＰ内にマクロ孔を有することを示し、高密度に充填されたナノ粒子間の空間は、１００～２００ｎｍであった。
【0159】
実施例３－修正製造プロセス－プロセスＢ
８０ｍｇのＭＳ－ＮＰ粉末を、２ｍｌのアルギン酸ナトリウム塩溶液（３０ｍｇ・ｍＬ－１水溶液）に加えた。得られた溶液を、ＭＳ－ＮＰがアルギン酸ナトリウム塩溶液に均一に分布するまで１時間超音波処理した。
８０ｍｇのＭＳ－ＮＰ粉末を、２ｍｌのアルギン酸ナトリウム塩溶液（３０ｍｇ・ｍＬ－１水溶液）に加えた。得られた溶液を、ＭＳ－ＮＰがアルギン酸ナトリウム塩溶液に均一に分布するまで１時間超音波処理した。
【0160】
大孔径のＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰ）を形成するため、超音波処理した溶液を３ｍＬのプラスチックシリンジに加えてシリンジポンプに配置し、液体を塩化カルシウム溶液浴（１重量％で水中に調製）に、約８ｍＬｈ－１の流量を用いてエレクトロスプレーした（エレクトロスプレーの設定は図１に示す）。液滴のサイズは、チューブの端と塩化カルシウム溶液の間に電界を印加することによって制御した。アルギネートビーズＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）をこの塩化カルシウム浴から回収し、これにペイロードを担持させた。これらの粒子（ＬＭＳ－ＳＰ）では、プロセスＡで生成されたものと比較して、薬物担持性能の有意な向上、すなわち、粒子あたり約７．８μｇのタンパク質と、機械的安定性の改善が認められた。
【0161】
実施例４－修正製造プロセス－プロセスＣ
ＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）を、実施例３に記載の方法を使用して生成した。アルギン酸ナトリウム塩を６５０℃で３０時間焼成することにより除去した。このステップで、すべての有機成分が除去され、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＳＰ）ならびに微量のカルシウム及び塩化ナトリウムのみが残った。ＭＳ－ＳＰにその後ペイロードを担持させた。これらの粒子では、プロセスＡで生成されたものと比較して、薬物担持性能の有意な向上、すなわち、粒子あたり約７．８μｇのタンパク質が認められた。
ＭＳ－ＳＰ（ＬＭＳ－ＳＰａｌｇ）を、実施例３に記載の方法を使用して生成した。アルギン酸ナトリウム塩を６５０℃で３０時間焼成することにより除去した。このステップで、すべての有機成分が除去され、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳ－ＳＰ）ならびに微量のカルシウム及び塩化ナトリウムのみが残った。ＭＳ－ＳＰにその後ペイロードを担持させた。これらの粒子では、プロセスＡで生成されたものと比較して、薬物担持性能の有意な向上、すなわち、粒子あたり約７．８μｇのタンパク質が認められた。
【0162】
細孔を有さないナノ粒子（非多孔性ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ、ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ）及び細孔径＜２ｎｍのナノ粒子（小孔径ＭＳ－ＳＳＰａｌｇ、ＳＭＳ－ＳＰａｌｇ）からも超粒子を作製した。これらの超粒子からアルギネートを除去した場合、薬物担持性能は有意に低下した（表１）。
【0163】
プロセスＢ及びプロセスＣで生成したＭＳ－ＳＰの最大薬物担持量を表１に要約する。
【表1】
【0164】
実施例５－超粒子の放出特性
リゾチーム
滅菌したＳＰを１００μＬのＦＩＴＣ－リゾチーム溶液（０．２ｍｇ・ｍＬ－１のＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）とともにインキュベートすることにより、ＦＩＴＣ－リゾチームを担持したＳＰをインビトロ放出試験用に調製した。リゾチームは、同様の物理化学的特性を共有することから、ニューロトロフィンであるＢＤＮＦを模倣するのに良好なモデルタンパク質である（リゾチームは安価であり、入手が容易であるが、ＢＤＮＦは高価である）（リゾチーム、Ｍｗ＝１４．３±０．５ＫＤａ、ＲＨ＝１８．９±０．２５Å及びｐＩ＝１１、ＢＤＮＦ、Ｍｗ＝１３ＫＤａ、ＲＨ＝２４．０±３．２Å及びｐＩ＝１０）。
リゾチーム
滅菌したＳＰを１００μＬのＦＩＴＣ－リゾチーム溶液（０．２ｍｇ・ｍＬ－１のＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）とともにインキュベートすることにより、ＦＩＴＣ－リゾチームを担持したＳＰをインビトロ放出試験用に調製した。リゾチームは、同様の物理化学的特性を共有することから、ニューロトロフィンであるＢＤＮＦを模倣するのに良好なモデルタンパク質である（リゾチームは安価であり、入手が容易であるが、ＢＤＮＦは高価である）（リゾチーム、Ｍｗ＝１４．３±０．５ＫＤａ、ＲＨ＝１８．９±０．２５Å及びｐＩ＝１１、ＢＤＮＦ、Ｍｗ＝１３ＫＤａ、ＲＨ＝２４．０±３．２Å及びｐＩ＝１０）。
【0165】
リゾチームを担持したＭＳ－ＳＰのインビトロ放出プロファイルを図４のパートａ）及びｂ）ならびに図７のパートａ）に示す。プロセスＡ及びＣで生成したＭＳ－ＳＰの放出プロファイルは同様である。しかし、プロセスＣで生成したＭＳ－ＳＰは、有意に高レベルの標識リゾチームを担持する。ペイロードの放出は、プロセスＡ及びＣで生成したＭＳ－ＳＰと比較して、プロセスＢで生成したＭＳ－ＳＰで有意に減少した。
【0166】
ゼータ電位
ＭＳ－ＳＰに、その後フルオレセイン標識リゾチーム（ＦＩＴＣ－リゾチーム）を担持させた。図２に示すように、ＭＳ－ＳＰは、ｐＨ値が４から１０に増加するにつれて、約－７．６ｍＶ～約３３．９ｍＶの負のゼータ電位を示した。従って、静電的原動力の助けを借りて、正荷電リゾチーム及びＢＤＮＦをＭＳ－ＳＰに担持させることができる。共焦点顕微鏡画像（図３ａ、ｂ）は、ＭＳ－ＳＰの表面に担持されたＦＩＴＣ－リゾチームを示した。しかしながら、これらのＭＳ－ＳＰのサイズは極めて大きい（直径数百マイクロメートル）ため、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡法は、これらのＳＰの内部構造の画像化には適さない。しかしながら、外科用メスでこれらのＭＳ－ＳＰを破壊すると、その内部を画像化することができ、ＦＩＴＣ－リゾチームが、これらのＭＳ－ＳＰの多孔質内部構造でも認められることが分かった（図３ｃ）。
ＭＳ－ＳＰに、その後フルオレセイン標識リゾチーム（ＦＩＴＣ－リゾチーム）を担持させた。図２に示すように、ＭＳ－ＳＰは、ｐＨ値が４から１０に増加するにつれて、約－７．６ｍＶ～約３３．９ｍＶの負のゼータ電位を示した。従って、静電的原動力の助けを借りて、正荷電リゾチーム及びＢＤＮＦをＭＳ－ＳＰに担持させることができる。共焦点顕微鏡画像（図３ａ、ｂ）は、ＭＳ－ＳＰの表面に担持されたＦＩＴＣ－リゾチームを示した。しかしながら、これらのＭＳ－ＳＰのサイズは極めて大きい（直径数百マイクロメートル）ため、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡法は、これらのＳＰの内部構造の画像化には適さない。しかしながら、外科用メスでこれらのＭＳ－ＳＰを破壊すると、その内部を画像化することができ、ＦＩＴＣ－リゾチームが、これらのＭＳ－ＳＰの多孔質内部構造でも認められることが分かった（図３ｃ）。
【0167】
担持能力のさらなる評価
次に、異なるタイプのＳＰの担持能力を、ＦＩＴＣ－リゾチームを異なる担持時濃度で３日間のインキュベーション時間を用いて調べた（図４）。一般に、ＦＩＴＣ－リゾチームの濃度が増加するにつれ、薬物担持量が増加した。これらの結果は、アルギネートを含むＮＭＳ－ＳＰａｌｇ、ＳＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、アルギネートを除去したＮＭＳ－ＳＰ、ＳＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰ（同等の濃度）より高い担持能力を有したことを示す。これは、中性ｐＨ値付近での正荷電ＦＩＴＣ－リゾチームと負荷電アルギネート間の静電相互作用の増加に起因し得る。さらに、低ＦＩＴＣ－リゾチーム担持時濃度（＜０．４ｍｇ・ｍＬ－１）では、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと同様の薬物担持能力を有したが、その濃度が高い場合（＞０．４ｍｇ・ｍＬ－１）、ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと比較して、多くのＦＩＴＣ－リゾチームを、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇに担持させることができた。アルギネートを除去したＭＳ－ＳＰで同様の傾向が認められた。ＬＭＳ－ＳＰは、ＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰより多くのＦＩＴＣ－リゾチームを担持することができた。これらの結果は、大きな細孔構造（ＬＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇにおける）は、薬物担持を改善するための重要な要因であり、恐らくは、さらなる表面を提供すること及びそれにより、粒子の外表面及び粒子内の領域（ＳＰ構造の中）が、薬物で完全に飽和された場合の担持及び能力を与えることによることを示す。さらに、この担持能力はまた、ＭＳ－ＳＰの直径に依存し、大きいＭＳ－ＳＰ（１０００μｍ）は、小さいＭＳ－ＳＰ（２００μｍ）よりも大きな担持能力を有した（図５）。
次に、異なるタイプのＳＰの担持能力を、ＦＩＴＣ－リゾチームを異なる担持時濃度で３日間のインキュベーション時間を用いて調べた（図４）。一般に、ＦＩＴＣ－リゾチームの濃度が増加するにつれ、薬物担持量が増加した。これらの結果は、アルギネートを含むＮＭＳ－ＳＰａｌｇ、ＳＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、アルギネートを除去したＮＭＳ－ＳＰ、ＳＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰ（同等の濃度）より高い担持能力を有したことを示す。これは、中性ｐＨ値付近での正荷電ＦＩＴＣ－リゾチームと負荷電アルギネート間の静電相互作用の増加に起因し得る。さらに、低ＦＩＴＣ－リゾチーム担持時濃度（＜０．４ｍｇ・ｍＬ－１）では、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇは、非多孔性ＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと同様の薬物担持能力を有したが、その濃度が高い場合（＞０．４ｍｇ・ｍＬ－１）、ＮＭＳ－ＳＰａｌｇ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇと比較して、多くのＦＩＴＣ－リゾチームを、ＬＭＳ－ＳＰａｌｇに担持させることができた。アルギネートを除去したＭＳ－ＳＰで同様の傾向が認められた。ＬＭＳ－ＳＰは、ＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰより多くのＦＩＴＣ－リゾチームを担持することができた。これらの結果は、大きな細孔構造（ＬＭＳ－ＳＰ及びＬＭＳ－ＳＰａｌｇにおける）は、薬物担持を改善するための重要な要因であり、恐らくは、さらなる表面を提供すること及びそれにより、粒子の外表面及び粒子内の領域（ＳＰ構造の中）が、薬物で完全に飽和された場合の担持及び能力を与えることによることを示す。さらに、この担持能力はまた、ＭＳ－ＳＰの直径に依存し、大きいＭＳ－ＳＰ（１０００μｍ）は、小さいＭＳ－ＳＰ（２００μｍ）よりも大きな担持能力を有した（図５）。
【0168】
実験的に測定したＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰａｌｇへのＦＩＴＣ－リゾチームの最大担持量は、それぞれ、ＳＰあたり約３μｇ及びＳＰあたり２μｇであり、これらは、ＳＰあたり約１５μｇのＬＭＳ－ＳＰより有意に低かった（ＦＩＴＣ－リゾチーム濃度は１．５ｍｇ・ｍＬ－１であり、担持期間は３日間であった）。さらに、実験的に測定したＮＭＳ－ＳＰ及びＳＭＳ－ＳＰへのＦＩＴＣ－リゾチームの最大担持量は、それぞれ、ＳＰあたり約２μｇ及びＳＰあたり１μｇであり、これらもまた、ＳＰあたり約１０μｇのＬＭＳ－ＳＰより劇的に低かった（ＦＩＴＣ－リゾチーム濃度は５．０ｍｇ・ｍＬ－１であり、担持期間は３日間であった）。
【0169】
６種の異なるＳＰの薬物担持効率を図４ｃ及び４ｄに示す。ＦＩＴＣ－リゾチームの担持時濃度が増加するにつれ、より多くのＦＩＴＣ－リゾチームをＳＰに担持させることができた。
【0170】
ＢＤＮＦ
ＭＳ－ＳＰを、１００μｌのエタノール（８０ｖｏｌ／ｖｏｌ％）に４時間浸漬して滅菌した後、１００μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で６回すすいだ。ＭＳ－ＳＰを、１５μｌのＢＤＮＦ（Ｇｅｎｅｗａｙ，ＢＤＮＦ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，カタログ番号１０－６６３－４５０７８）溶液（１ｍｇ／ｍｌのＢＤＮＦ）を含むエッペンドルフチューブに入れ、それらを室温で３日間、不定期に手動で振盪してインキュベートすることにより担持させた。意外にも、約１０μｇのＢＤＮＦの担持が達成された。
ＭＳ－ＳＰを、１００μｌのエタノール（８０ｖｏｌ／ｖｏｌ％）に４時間浸漬して滅菌した後、１００μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で６回すすいだ。ＭＳ－ＳＰを、１５μｌのＢＤＮＦ（Ｇｅｎｅｗａｙ，ＢＤＮＦ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，カタログ番号１０－６６３－４５０７８）溶液（１ｍｇ／ｍｌのＢＤＮＦ）を含むエッペンドルフチューブに入れ、それらを室温で３日間、不定期に手動で振盪してインキュベートすることにより担持させた。意外にも、約１０μｇのＢＤＮＦの担持が達成された。
【0171】
実施例６－薬物動態
インビボ試験を行い、薬物ペイロード及び耳に移植された超粒子で送達されたニューロトロフィンのクリアランスを、移植の４時間、３日及び７日後に測定した。目的は、経時的に蝸牛に残るニューロトロフィン量を測定することであった。
インビボ試験を行い、薬物ペイロード及び耳に移植された超粒子で送達されたニューロトロフィンのクリアランスを、移植の４時間、３日及び７日後に測定した。目的は、経時的に蝸牛に残るニューロトロフィン量を測定することであった。
【0172】
放射性標識ニューロトロフィン－３を含む１個のＳＰを各蝸牛に移植した。４時間（ｎ＝５）、３日（ｎ＝７）または７日（ｎ＝４）後に、蝸牛を採取した。蝸牛全体のガンマカウントを測定し、経時的なニューロトロフィン－３のクリアランスを決定した。残ったニューロトロフィン－３の量（担持量に対する％）及びμｇ単位での合計を図１５に示す。移植の１週間後、各ＳＰは、初期担持量のうち約２ｕｇのニューロトロフィン－３（約４０％）を含んでいた。
【0173】
さらなる実験（ｎ＝２）を行い、正円窓への送達後のニューロトロフィン－３のクリアランスを調べた。移植の３日後、蝸牛全体の測定を再度用いて、正円窓膜からのニューロトロフィン－３のクリアランスを決定した。蝸牛内送達部位と比較すると、正円窓を用いて同様のレベルのクリアランスが認められた（正円窓への送達後、４７．４％のニューロトロフィン－３が残っていたのに対し、蝸牛内送達では５６％であった）。
【0174】
これらのデータは、ニューロトロフィン－３の持続放出が、１週間の治療後でも依然として利用可能な高ニューロトロフィン－３レベルで達成することができることを示す。
【0175】
実施例７－方法
超粒子の組織化
フィブリンで被覆されたシリカ超粒子（ＦＳｉ－ＳＰ）を、上記の通りに組織化させたＳｉ－ＳＰから調製した。Ｓｉ－ＳＰを、１００μＬの８０％（ｖ／ｖ）エタノールで室温（約２２℃）にて４時間滅菌した。これらのＳｉ－ＳＰを次に滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で６回洗浄した。その後、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に調整）に溶解した２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン５０μＬを、Ｓｉ－ＳＰに加え、４℃で終夜（約１６時間）インキュベートした。翌日、その上清を吸引し、Ｓｉ－ＳＰを、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭのＴＢＳの１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン溶液５０μＬとともに室温（約２２℃）で１時間インキュベートした。最後に、その上清を吸引し、Ｓｉ－ＳＰをＭｉｌｌｉ－Ｑ水で３回洗浄した。
超粒子の組織化
フィブリンで被覆されたシリカ超粒子（ＦＳｉ－ＳＰ）を、上記の通りに組織化させたＳｉ－ＳＰから調製した。Ｓｉ－ＳＰを、１００μＬの８０％（ｖ／ｖ）エタノールで室温（約２２℃）にて４時間滅菌した。これらのＳｉ－ＳＰを次に滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で６回洗浄した。その後、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に調整）に溶解した２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン５０μＬを、Ｓｉ－ＳＰに加え、４℃で終夜（約１６時間）インキュベートした。翌日、その上清を吸引し、Ｓｉ－ＳＰを、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭのＴＢＳの１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン溶液５０μＬとともに室温（約２２℃）で１時間インキュベートした。最後に、その上清を吸引し、Ｓｉ－ＳＰをＭｉｌｌｉ－Ｑ水で３回洗浄した。
【0176】
フィブリンの分解
ＦＳｉ－ＳＰからのフィブリンの分解を、ＦＳｉ－ＳＰを１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）とともに３７℃でインキュベートすることにより評価した（各サンプルに１０個のＦＳｉ－ＳＰ）。特定の時間間隔で（最大４２日）、９５μＬの上清を回収し、さらなる分析用に－２０℃で保存し、その後９５μＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。分解したフィブリンの上清中での濃度を、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイキットを製造業者のプロトコルに基づいて使用して定量化した。フィブリンの分解割合を以下により計算した：
ここで、ｍ０は、ＳＰ上のフィブリンの元の量（全量）であり、ｍｎは、時点ｎでの上清中のフィブリン量である。
ＦＳｉ－ＳＰからのフィブリンの分解を、ＦＳｉ－ＳＰを１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）とともに３７℃でインキュベートすることにより評価した（各サンプルに１０個のＦＳｉ－ＳＰ）。特定の時間間隔で（最大４２日）、９５μＬの上清を回収し、さらなる分析用に－２０℃で保存し、その後９５μＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。分解したフィブリンの上清中での濃度を、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイキットを製造業者のプロトコルに基づいて使用して定量化した。フィブリンの分解割合を以下により計算した：
【数1】
【0177】
ヒドロゲル系の合成方法
ＣａＣＯ３粒子を調製するため、最初に、５ｇのＰＳＳ（ＭＷ７０ｋＤａ）を、５００ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に完全に溶解し、１０ｍｇ・ｍＬ－１のＰＳＳ溶液を生成した。次に、１ｍＬの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、０．５ｍＬの１０ｍｇ・ｍＬ－１ＰＳＳ、及び３．５ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水からなる「前駆体溶液」を調製した。別のフラスコに、１０ｍｇ・ｍＬ－１のＰＳＳ溶液２０ｍＬを、１７５ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に加え、激しく攪拌した。１分間攪拌した後、５ｍＬの１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２溶液を加えて２分間激しく攪拌した。前駆体溶液（５ｍＬ）を次いで加え、得られた混合物を１分間激しく攪拌し、その後、攪拌機を止め、その混合物を３分間静置し、続いてさらに１分間激しく攪拌した。合成時のＣａＣＯ３粒子を８０℃のオーブン内で終夜乾燥し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕して、乾燥粉末中の大きな粒子を崩した。この微細なＣａＣＯ３粉末を次いで７２３Ｋの気流で２時間焼成し、すべての有機物を除去した。
ＣａＣＯ３粒子を調製するため、最初に、５ｇのＰＳＳ（ＭＷ７０ｋＤａ）を、５００ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に完全に溶解し、１０ｍｇ・ｍＬ－１のＰＳＳ溶液を生成した。次に、１ｍＬの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、０．５ｍＬの１０ｍｇ・ｍＬ－１ＰＳＳ、及び３．５ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水からなる「前駆体溶液」を調製した。別のフラスコに、１０ｍｇ・ｍＬ－１のＰＳＳ溶液２０ｍＬを、１７５ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に加え、激しく攪拌した。１分間攪拌した後、５ｍＬの１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２溶液を加えて２分間激しく攪拌した。前駆体溶液（５ｍＬ）を次いで加え、得られた混合物を１分間激しく攪拌し、その後、攪拌機を止め、その混合物を３分間静置し、続いてさらに１分間激しく攪拌した。合成時のＣａＣＯ３粒子を８０℃のオーブン内で終夜乾燥し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕して、乾燥粉末中の大きな粒子を崩した。この微細なＣａＣＯ３粉末を次いで７２３Ｋの気流で２時間焼成し、すべての有機物を除去した。
【0178】
ヒドロゲルを調製するため、２０ｍｇ・ｍＬ－１のアルギネートのＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液１ｍＬを、１００ｍｇ・ｍＬ－１のＣａＣＯ３粒子（粒径約１．８μｍ、図１７参照）１５μＬと混合した。これに、１００ｍｇ・ｍＬ－１のＤ－グルコノ－δ－ラクトン（ＧＤＬ）５３．４μＬを加えてＣａＣＯ３粒子とＧＤＬのモル比を１：２にし、中性ｐＨ値のヒドロゲルを生成した。このヒドロゲルのゲル化時間及び特性は、アルギネート溶液の濃度及びＣａＣＯ３粒子の使用量を調節することによって調整することができる。
【0179】
ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルの分解性を調べるため、ヒドロゲルの質量（乾燥重量）を経時的に観察した。ＰＢＳ（５００μＬ、ｐＨ７．４）をこのヒドロゲル（２０ｍｇ・ｍＬ－１のａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル５００μＬ）に加え、３７℃でインキュベートした。様々な時点（０日、３日、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間）で、このＰＢＳを除去し、残ったヒドロゲルサンプルをＭｉｌｌｉ－Ｑで洗浄し（５回）、その後、分析するまで－２０℃で凍結保存した。より長い時点用に、ＰＢＳを５００μＬの新鮮なＰＢＳで置き換え、次の時点まで３７℃のインキュベータに戻した。残りのすべてのサンプルを凍結乾燥し、そのヒドロゲルの乾燥重量を測定した。重量の減少率を以下により計算した：
ここで、ｍ０は、時点０でのヒドロゲルの全重量であり、ｍｎは、時点ｎでのヒドロゲルの重量である。
【数2】
【0180】
Ｓｉ－ＳＰ、ＦＳｉ－ＳＰ及びＣａＣＯ３粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像は、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０電界放射型走査型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、作動電圧５ｋＶで撮影した。これらＳＰのＳＥＭサンプルは、導電性カーボンテープにそれらを付着させ、スパッタコーティングによりそれらを２０ｎｍの金で被覆することによって作製した。ＦＳｉ－ＳＰのＳＥＭ－ＥＤＸマッピングは、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０電界放射型走査型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）で行った。ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルのＳＥＭサンプルの調製に関しては、上記の方法を用いて最初にヒドロゲルを合成し、その後終夜凍結乾燥した。その凍結乾燥サンプルを導電性カーボンテープに直接配置した後、画像化用に金コーティング（スパッタリングによる）した。Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルは、ＦＴＩＲ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて測定した。
【0181】
インビトロ放出試験
インビトロ放出試験をモデル薬物ＦＩＴＣ－リゾチームまたはニューロトロフィン（ＢＤＮＦもしくはＮＴ－３）のいずれかを使用して行った。滅菌後、１０個のＳｉ－ＳＰまたは１０個のＦＳｉ－ＳＰを１００μＬのＦＩＴＣ－リゾチーム溶液（１ｍｇ・ｍＬ－１のＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）とともにインキュベートした。３日間のインキュベーション後、その上清を吸引した。特定の時間間隔で（１５０日以上）、９５μＬの上清を回収し（分析するまで－２０℃で保存し）、９５μＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。回収したサンプルの蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定し、その上清中のＦＩＴＣ－リゾチームの濃度は、ＦＩＴＣ－リゾチームの検量線を使用して計算した（図１８）。担持ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出もまた、フィブリノゲン濃度（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲンで一定１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）の関数、ならびにトロンビン濃度（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンで一定２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）の関数として評価した。
インビトロ放出試験をモデル薬物ＦＩＴＣ－リゾチームまたはニューロトロフィン（ＢＤＮＦもしくはＮＴ－３）のいずれかを使用して行った。滅菌後、１０個のＳｉ－ＳＰまたは１０個のＦＳｉ－ＳＰを１００μＬのＦＩＴＣ－リゾチーム溶液（１ｍｇ・ｍＬ－１のＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）とともにインキュベートした。３日間のインキュベーション後、その上清を吸引した。特定の時間間隔で（１５０日以上）、９５μＬの上清を回収し（分析するまで－２０℃で保存し）、９５μＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。回収したサンプルの蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定し、その上清中のＦＩＴＣ－リゾチームの濃度は、ＦＩＴＣ－リゾチームの検量線を使用して計算した（図１８）。担持ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出もまた、フィブリノゲン濃度（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲンで一定１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビン、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）の関数、ならびにトロンビン濃度（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンで一定２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）の関数として評価した。
【0182】
ニューロトロフィン（ＢＤＮＦまたはＮＴ－３）の担持に関しては、４個の滅菌ＳＰ（Ｓｉ－ＳＰまたはＦＳｉ－ＳＰ）を、３０μＬのＢＤＮＦまたはＮＴ－３溶液（１．０ｍｇ・ｍＬ－１のＭｉｌｌｉ－Ｑ水溶液）とともにインキュベートした。３日間のインキュベーション後、その上清を取り出し、各ＳＰを新たな１．７ｍＬの微小遠心チューブに入れた（チューブあたり１個のＳＰ）。その後、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各チューブに加え、３７℃でインキュベートした。特定の時点で（４０日以上）９５μＬの上清を回収し（分析するまで－２０℃で保存し）、９５μＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。このサンプリング法を、放出試験の間、各時点で繰り返した。Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから放出されたＢＤＮＦまたはＮＴ－３の量を、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用し、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３の検量線を使用して、製造業者のプロトコルの通りに測定した（例えば、図１９）。
【0183】
ヒドロゲルに埋め込まれたＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出を、以下の通りに測定した。アルギネート溶液を、上記の通り、ＣａＣＯ３粒子と混合した。ゲル化前に、１０個のＦＳｉ－ＳＰ（ＦＩＴＣ－リゾチームを予め３日間担持させたもの）をこのａｌｇ－ＣａＣＯ３混合物に加えた。ゲル化を誘導するため、ＧＤＬを、上記と同じ濃度及び体積で加えた。約２分後、ヒドロゲルが生じた。ＰＢＳ中での放出を調べるため、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、そのサンプルを３７℃でインキュベートした。特定の時点で（１１０日以上）９５μＬの上清を回収し（分析するまで－２０℃で保存し）、新鮮なＰＢＳで置き換えた。回収したサンプルの蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートで測定し、対応するＦＩＴＣ－リゾチームの濃度を、検量線を使用して決定した（図２０）。
【0184】
インビトロ分解試験
Ｓｉ－ＳＰを、最初に室温（約２２℃）にて１００μＬのエタノール（８０％ｖ／ｖ）で４時間滅菌し、その後滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で４回洗浄した。その後、ＦＳｉ－ＳＰを上記のように調製した。超粒子の分解は、Ｓｉ－ＳＰまたはＦＳｉ－ＳＰ（各サンプル中に２０個のＳＰ）を、３７℃にて１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬに浸漬することにより調べた。特定の時点で（７０日以上）１ｍＬの上清を回収し、１ｍＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。この上清中でのシリカの分解産物の存在を、誘導結合プラズマ発光分析装置（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を使用して測定した。水酸化ナトリウム（８Ｍ、５００μＬ）を、回収した各上清５００μＬに加え、シリカの断片をすべて溶解した。これらのサンプルを９５℃で３０分間インキュベートした後、３０分間超音波処理した。それらサンプルをその後３７℃で終夜インキュベートした。溶解したサンプル１ｍＬを、４ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水と混合し、回収した元の上清から１０倍希釈のサンプルを得た。各サンプルのケイ素の量（ＳＰから放出されたケイ素に対応する）を、ケイ素の検量線を使用して、ＩＣＰ－ＯＥＳにより測定した。これらの測定に加えて、ＰＢＳ中での長期のインキュベーション後のＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰのモルフォロジーをＳＥＭ画像化により観察した。
Ｓｉ－ＳＰを、最初に室温（約２２℃）にて１００μＬのエタノール（８０％ｖ／ｖ）で４時間滅菌し、その後滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で４回洗浄した。その後、ＦＳｉ－ＳＰを上記のように調製した。超粒子の分解は、Ｓｉ－ＳＰまたはＦＳｉ－ＳＰ（各サンプル中に２０個のＳＰ）を、３７℃にて１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬに浸漬することにより調べた。特定の時点で（７０日以上）１ｍＬの上清を回収し、１ｍＬの新鮮なＰＢＳで置き換えた。この上清中でのシリカの分解産物の存在を、誘導結合プラズマ発光分析装置（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を使用して測定した。水酸化ナトリウム（８Ｍ、５００μＬ）を、回収した各上清５００μＬに加え、シリカの断片をすべて溶解した。これらのサンプルを９５℃で３０分間インキュベートした後、３０分間超音波処理した。それらサンプルをその後３７℃で終夜インキュベートした。溶解したサンプル１ｍＬを、４ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水と混合し、回収した元の上清から１０倍希釈のサンプルを得た。各サンプルのケイ素の量（ＳＰから放出されたケイ素に対応する）を、ケイ素の検量線を使用して、ＩＣＰ－ＯＥＳにより測定した。これらの測定に加えて、ＰＢＳ中での長期のインキュベーション後のＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰのモルフォロジーをＳＥＭ画像化により観察した。
【0185】
インビトロ細胞毒性試験
最初に、Ｓｉ－ＳＰを室温（約２２℃）にて１００μＬのエタノール（８０％ｖ／ｖ）で４時間滅菌し、続いて洗浄を滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（３回）、次に細胞培地（３回）で行った。ＳＰの分解産物の細胞毒性を特定するため、１ｍＬの細胞培地（１０％のウシ胎仔血清、１００単位ｍＬ－１のペニシリン、１００ｍｇ・ｍＬ－１のストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地）を、多数のＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰに加えた。特定の時間間隔で、すべての細胞培地を吸引し（後の細胞分析のために－２０℃で保存し）、新鮮な細胞培地で置き換えた。
最初に、Ｓｉ－ＳＰを室温（約２２℃）にて１００μＬのエタノール（８０％ｖ／ｖ）で４時間滅菌し、続いて洗浄を滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（３回）、次に細胞培地（３回）で行った。ＳＰの分解産物の細胞毒性を特定するため、１ｍＬの細胞培地（１０％のウシ胎仔血清、１００単位ｍＬ－１のペニシリン、１００ｍｇ・ｍＬ－１のストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地）を、多数のＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰに加えた。特定の時間間隔で、すべての細胞培地を吸引し（後の細胞分析のために－２０℃で保存し）、新鮮な細胞培地で置き換えた。
【0186】
脳由来のＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞を、加湿したインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）で、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。Ｕ８７ＭＧ細胞を９６ウェルのプレートに、ウェル当たり２×１０４細胞で１００μＬの培地中に播種し、終夜インキュベートした。続いて、１００μＬのサンプル（細胞培地でインキュベートし、上記の通り異なる時点で回収したＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰからの分解産物）を、各ウェルに加え、インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。４８時間のインキュベーション後、細胞培地を完全に吸引し、細胞生存率を測定するために１００μＬのＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を各ウェルに加えた。４時間のインキュベーション後、その溶液の吸光度をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダーを使用して、波長４７５ｎｍ及び参照波長６７５ｎｍで測定した。差吸光度は、６７５ｎｍでの吸光度を４７５ｎｍでの吸光度から差し引くことにより計算した。ＸＴＴ／ＰＭＳ溶液は、２ｍＭのＰＭＳのＤＰＢＳ溶液１３５μＬを、１０．８ｍｇのＸＴＴを含む、１０％のウシ胎児血清を添加した５４ｍＬのＤＭＥＭと混合することによって調製した。培地のみを含むサンプル（すなわち、細胞なし）のウェルを、吸光度測定のバックグラウンド対照として使用した。ＤＭＥＭ培地にのみ曝露した細胞を、未処理対照と呼び、細胞毒性の正規化に使用した。
【0187】
実施例８－フィブリン被覆シリカ超粒子の合成
ＦＩＴＣ－リゾチームを担持した、ゲル媒介エレクトロスプレー組織化により合成したＳｉ－ＳＰは、高い担持能力を有し、１１０日以上の持続薬物放出を達成することができる。しかしながら、これら超粒子からは、約６０％のＦＩＴＣ－リゾチームが、最初の３日間にわたって放出された。フィブリンで被覆されたシリカ超粒子（ＦＳｉ－ＳＰ）は、このバースト放出を減速させる。Ｓｉ－ＳＰをフィブリノゲンに続いて酵素トロンビンとともにインキュベートすることにより、そのＳｉ－ＳＰ表面で、フィブリノゲンのフィブリンのメッシュへの酵素的変換が生じる。フィブリンは、繊維状の非球状タンパク質であり、血液凝固の過程に関与する。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、フィブリンコーティング後の超粒子の表面超微細構造を調べた。低解像度では、Ｓｉ－ＳＰとＦＳｉ－ＳＰの間にはモルフォロジーの差がほとんどないが、高解像度では、Ｓｉ－ＳＰのもの（図１６ｂ）と比較したＦＳｉ－ＳＰの表面モルフォロジー（図１６ｄ）は、明らかに、フィブリンでの被覆により、超粒子及び細孔の表面構造が良好に覆われることを示している。ＳＥＭ－ＥＤＸ元素マッピングにより、ＦＳｉ－ＳＰが、予想通り、ケイ素（Ｓｉ）、酸素（Ｏ）、カルシウム（Ｃａ）及び窒素（Ｎ）元素を、ＦＳｉ－ＳＰ表面に均一に分布して含むことが示された（図１６）。Ｓｉ－ＳＰのＦＴＩＲ分光法により、Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉの１０７１ｃｍ－１での伸縮振動、Ｏ－Ｓｉ－Ｏの７９３ｃｍ－１での曲げ振動及びＳｉ－Ｏ－Ｓｉの４５５ｃｍ－１でのロッキング振動を伴うＳｉ－Ｏ－Ｓｉ結合の存在が確認され（図１６ｆ）、Ｓｉ－ＳＰが、主にシリカからなることが示された。９６２ｃｍ－１のピークは、さらに、Ｓｉ－Ｏ－Ｃａ振動モードに帰属する可能性があり、アルギン酸カルシウムを足場として、ゲル媒介エレクトロスプレー組織化を使用したＳｉ－ＳＰの合成手順に起因する可能性がある。これらのデータは、Ｓｉ－ＳＰの良好な調製及びフィブリンコーティングが形成されたことを示す。
ＦＩＴＣ－リゾチームを担持した、ゲル媒介エレクトロスプレー組織化により合成したＳｉ－ＳＰは、高い担持能力を有し、１１０日以上の持続薬物放出を達成することができる。しかしながら、これら超粒子からは、約６０％のＦＩＴＣ－リゾチームが、最初の３日間にわたって放出された。フィブリンで被覆されたシリカ超粒子（ＦＳｉ－ＳＰ）は、このバースト放出を減速させる。Ｓｉ－ＳＰをフィブリノゲンに続いて酵素トロンビンとともにインキュベートすることにより、そのＳｉ－ＳＰ表面で、フィブリノゲンのフィブリンのメッシュへの酵素的変換が生じる。フィブリンは、繊維状の非球状タンパク質であり、血液凝固の過程に関与する。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、フィブリンコーティング後の超粒子の表面超微細構造を調べた。低解像度では、Ｓｉ－ＳＰとＦＳｉ－ＳＰの間にはモルフォロジーの差がほとんどないが、高解像度では、Ｓｉ－ＳＰのもの（図１６ｂ）と比較したＦＳｉ－ＳＰの表面モルフォロジー（図１６ｄ）は、明らかに、フィブリンでの被覆により、超粒子及び細孔の表面構造が良好に覆われることを示している。ＳＥＭ－ＥＤＸ元素マッピングにより、ＦＳｉ－ＳＰが、予想通り、ケイ素（Ｓｉ）、酸素（Ｏ）、カルシウム（Ｃａ）及び窒素（Ｎ）元素を、ＦＳｉ－ＳＰ表面に均一に分布して含むことが示された（図１６）。Ｓｉ－ＳＰのＦＴＩＲ分光法により、Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉの１０７１ｃｍ－１での伸縮振動、Ｏ－Ｓｉ－Ｏの７９３ｃｍ－１での曲げ振動及びＳｉ－Ｏ－Ｓｉの４５５ｃｍ－１でのロッキング振動を伴うＳｉ－Ｏ－Ｓｉ結合の存在が確認され（図１６ｆ）、Ｓｉ－ＳＰが、主にシリカからなることが示された。９６２ｃｍ－１のピークは、さらに、Ｓｉ－Ｏ－Ｃａ振動モードに帰属する可能性があり、アルギン酸カルシウムを足場として、ゲル媒介エレクトロスプレー組織化を使用したＳｉ－ＳＰの合成手順に起因する可能性がある。これらのデータは、Ｓｉ－ＳＰの良好な調製及びフィブリンコーティングが形成されたことを示す。
【0188】
実施例９－インビトロ薬物放出
モデルタンパク質治療薬（ＦＩＴＣ－リゾチーム）をＳｉ－ＳＰに予め担持させ、その後、緻密なフィブリン層で被覆することが、ＦＳｉ－ＳＰからの薬物放出を減速させると仮定した。ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイルを特定するため、ＦＩＴＣ－リゾチームを担持したＦＳｉ－ＳＰを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートし、タンパク質含量の分析のため、その上清を様々な時点で回収した。以下を含むＦＳｉ－ＳＰ合成のパラメータの範囲を調べた。すなわち、異なる濃度のフィブリノゲンを使用して調製した（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲンで一定濃度のトロンビン（１．７２ｍｇ・ｍＬ－１）、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）ＦＳｉ－ＳＰ及び異なる濃度のトロンビンを使用して調製したもの（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンで一定濃度のフィブリノゲン（２０ｍｇ・ｍＬ－１）、それぞれ、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）。ＦＩＴＣ－リゾチームを、Ｓｉ－ＳＰに担持させたところ（室温で３日間インキュベーション）、ＳＰあたり約７μｇの平均担持量となった。異なるフィブリノゲン及びトロンビン濃度下でのフィブリンコーティング前のＳｉ－ＳＰの個々のチューブすべてに関するＦＩＴＣ－リゾチームの担持量を図２１に示す。これらのＳＰから各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの割合を図２２及び２３に示す。図２４ａ及び図２４ｂに示すように、持続したＦＩＴＣ－リゾチームの放出が、１１０日間にわたってＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから検出された。しかしながら、ＦＳｉ－ＳＰに使用したフィブリンコーティングは、初期の放出を遅らせた。未被覆の超粒子では、３日以内に＞６０％のタンパク質放出が観察された。比較すると、２ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンを使用して被覆した超粒子では、放出速度は遅く、同じ放出量に至るまで＞２０日を要した。より高濃度のフィブリノゲン（２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１）を使用して被覆したＳｉ－ＳＰでは、＞６０％のタンパク質放出に至るまでの時間は、さらに２８日まで延長された（図２４ａ）。異なる濃度のトロンビンを加えることで、ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出を同様に減速させることができる。すなわち、未被覆粒子では、６０％のタンパク質放出が３日後に観察されたが、被覆粒子では、これには約２８日を要し、異なる濃度内で大きな差はなかった（図２４ｂ）。
モデルタンパク質治療薬（ＦＩＴＣ－リゾチーム）をＳｉ－ＳＰに予め担持させ、その後、緻密なフィブリン層で被覆することが、ＦＳｉ－ＳＰからの薬物放出を減速させると仮定した。ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチーム放出プロファイルを特定するため、ＦＩＴＣ－リゾチームを担持したＦＳｉ－ＳＰを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートし、タンパク質含量の分析のため、その上清を様々な時点で回収した。以下を含むＦＳｉ－ＳＰ合成のパラメータの範囲を調べた。すなわち、異なる濃度のフィブリノゲンを使用して調製した（２ｍｇ・ｍＬ－１、２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲンで一定濃度のトロンビン（１．７２ｍｇ・ｍＬ－１）、それぞれ、２Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び４０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰと示す）ＦＳｉ－ＳＰ及び異なる濃度のトロンビンを使用して調製したもの（０．１ｍｇ・ｍＬ－１、０．５ｍｇ・ｍＬ－１、１．７２ｍｇ・ｍＬ－１及び５ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンで一定濃度のフィブリノゲン（２０ｍｇ・ｍＬ－１）、それぞれ、２０Ｆ０．１Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ０．５Ｓｉ－ＳＰ、２０Ｆ１．７２Ｓｉ－ＳＰ及び２０Ｆ５Ｓｉ－ＳＰと示す）。ＦＩＴＣ－リゾチームを、Ｓｉ－ＳＰに担持させたところ（室温で３日間インキュベーション）、ＳＰあたり約７μｇの平均担持量となった。異なるフィブリノゲン及びトロンビン濃度下でのフィブリンコーティング前のＳｉ－ＳＰの個々のチューブすべてに関するＦＩＴＣ－リゾチームの担持量を図２１に示す。これらのＳＰから各時点で放出されたＦＩＴＣ－リゾチームの割合を図２２及び２３に示す。図２４ａ及び図２４ｂに示すように、持続したＦＩＴＣ－リゾチームの放出が、１１０日間にわたってＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから検出された。しかしながら、ＦＳｉ－ＳＰに使用したフィブリンコーティングは、初期の放出を遅らせた。未被覆の超粒子では、３日以内に＞６０％のタンパク質放出が観察された。比較すると、２ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンを使用して被覆した超粒子では、放出速度は遅く、同じ放出量に至るまで＞２０日を要した。より高濃度のフィブリノゲン（２０ｍｇ・ｍＬ－１及び４０ｍｇ・ｍＬ－１）を使用して被覆したＳｉ－ＳＰでは、＞６０％のタンパク質放出に至るまでの時間は、さらに２８日まで延長された（図２４ａ）。異なる濃度のトロンビンを加えることで、ＦＳｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出を同様に減速させることができる。すなわち、未被覆粒子では、６０％のタンパク質放出が３日後に観察されたが、被覆粒子では、これには約２８日を要し、異なる濃度内で大きな差はなかった（図２４ｂ）。
【0189】
図２４ａ及び２４ｂでは、累積薬物放出量は、恐らくは長期間にわたるＦＩＴＣの光退色のために１００％未満であるが、Ｓｉ－ＳＰに堅く吸着したタンパク質の存在を除外することはできない。それでもなお、フィブリンコーティングは、Ｓｉ－ＳＰからのモデルカーゴであるＦＩＴＣ－リゾチームの初期のバースト放出を実質的に低下させ、より均一に分布した放出プロファイルを与えることができるという明らかな証拠がある。
【0190】
この試験を、臨床的に意義のあるニューロトロフィンであるＢＤＮＦ及びＮＴ－３に拡張し、内耳へのニューロトロフィン送達へのＳｉ－ＳＰの潜在用途を評価した。ＢＤＮＦまたはＮＴ－３をＳｉ－ＳＰに担持させたところ（室温で３日間インキュベーション）、平均担持量７．３μｇ・ＳＰ－１となった。２０ｍｇ・ｍＬ－１のフィブリノゲン及び１．７２ｍｇ・ｍＬ－１のトロンビンを使用して、これらＢＤＮＦ及びＮＴ－３を担持したＳｉ－ＳＰのフィブリンでの被覆を行った。これらのパラメータは、それらが、ＦＩＴＣ－リゾチーム試験でバースト放出を最適に減速したことから選択された。図２４ｃ及びｄは、Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰからの、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でのＢＤＮＦ及びＮＴ－３の放出プロファイルを示している。ＦＳｉ－ＳＰからのＢＤＮＦ及びＮＴ－３の放出は、未被覆のＳｉ－ＳＰからの放出と比較して、ほぼ直線的な放出プロファイルをたどるように見える。２１日目には、未被覆のＳｉ－ＳＰからは担持したＢＤＮＦまたはＮＴ－３の約６０％が放出されているのに対し、ＦＳｉ－ＳＰからは約１０％であり、このフィブリンコーティングの戦略もまた、ニューロトロフィンの放出を減速させることを示している。各時点でＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから放出されたＢＤＮＦ及びＮＴ－３の割合を図２５及び２６に示す。フィブリンのゲル化時間の増加もまた、経時的な薬物放出の減少と関連していた（ゲル化時間１０分［軟］に対してゲル化時間２時間［硬］）。
【0191】
実施例１０－フィブリン被覆シリカ超粒子の分解
インビトロ分解試験を、Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４、３７℃）中でインキュベートすることによって行った。ＳＥＭ分析から、Ｓｉ－ＳＰ（図２７）及びＦＳｉ－ＳＰ（図２８ａ～ｅ）のサイズは、時間とともに段階的に減少し、これら超粒子のモルフォロジーから、６週間のインキュベーション後、亀裂が入り崩壊したように見える明らかな分解の証拠があった。ＰＢＳ中、３７℃での１０週間のインキュベーション後、ＦＳｉ－ＳＰの直径は約４０％減少し、３日目のＦＳｉ－ＳＰと１０週でのＦＳｉ－ＳＰを比較すると、超粒子のモルフォロジーにおける実質的な変化は明らかである。１０週間後のＦＳｉ－ＳＰ表面のより高倍率での画像化で、同様に崩壊したように見える下層のシリカミクロ粒子の外観が分かり、フィブリンコーティングの分解性を確認した。これは、ＦＳｉ－ＳＰに残るフィブリン量を測定することによって確認した（図２９）。この測定で、６週間のインキュベーション後のほぼ完全なフィブリンの分解が示された。担持したＦＩＴＣ－リゾチームの６０％を放出するのに必要な時間であった２８日目に、ＦＳｉ－ＳＰには約５％のフィブリンが残っているのみであり、その後は、Ｓｉ－ＳＰとＦＳｉ－ＳＰの間の放出プロファイルは同様になった。
インビトロ分解試験を、Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４、３７℃）中でインキュベートすることによって行った。ＳＥＭ分析から、Ｓｉ－ＳＰ（図２７）及びＦＳｉ－ＳＰ（図２８ａ～ｅ）のサイズは、時間とともに段階的に減少し、これら超粒子のモルフォロジーから、６週間のインキュベーション後、亀裂が入り崩壊したように見える明らかな分解の証拠があった。ＰＢＳ中、３７℃での１０週間のインキュベーション後、ＦＳｉ－ＳＰの直径は約４０％減少し、３日目のＦＳｉ－ＳＰと１０週でのＦＳｉ－ＳＰを比較すると、超粒子のモルフォロジーにおける実質的な変化は明らかである。１０週間後のＦＳｉ－ＳＰ表面のより高倍率での画像化で、同様に崩壊したように見える下層のシリカミクロ粒子の外観が分かり、フィブリンコーティングの分解性を確認した。これは、ＦＳｉ－ＳＰに残るフィブリン量を測定することによって確認した（図２９）。この測定で、６週間のインキュベーション後のほぼ完全なフィブリンの分解が示された。担持したＦＩＴＣ－リゾチームの６０％を放出するのに必要な時間であった２８日目に、ＦＳｉ－ＳＰには約５％のフィブリンが残っているのみであり、その後は、Ｓｉ－ＳＰとＦＳｉ－ＳＰの間の放出プロファイルは同様になった。
【0192】
超粒子からのＳｉの放出を定量化するため、これら放出試験（図２８ｆ）の異なる時点（３日、７日、１４日、２１日、２８日、４２日及び７０日）で回収したサンプルを使用してＩＣＰ－ＯＥＳを行い、Ｓｉ濃度を測定した。ＰＢＳ中、３７℃での７０日間のインキュベーション後、約３０％のＳｉがＳｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰの両方から放出された。最初の１週間のＳｉの分解は、Ｓｉ－ＳＰよりＦＳｉ－ＳＰで緩やかであった（図３０）。１４日後、ＦＳｉ－ＳＰ及びＳｉ－ＳＰの分解速度は、同じプロファイルをたどる。これは、１４日後には、ＦＳｉ－ＳＰ上に約２５％のフィブリンが残っているのみであり、それ故、シリカミクロ粒子のほとんどがＰＢＳに直接曝露される（すなわち、未被覆である）ためであると予想される。
【0193】
これらのデータは、フィブリン等の生分解性コーティングを用いて、Ｓｉ－ＳＰからの治療薬の持続放出を容易にすることができることを示す。
【0194】
実施例１１－インビトロ細胞毒性
細胞毒性実験を、Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから長時間スケールで放出された任意の毒性成分を測定するために行った。ＦＳｉ－ＳＰの分解産物のインビトロ細胞毒性は、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用して調べた。２個、５個、１０個または１５個のＦＳｉ－ＳＰから、１１週間にわたって回収した、崩壊したＳｉ及びフィブリンコーティングを含む上清を、細胞に直接加え、これらの細胞の生存率を２日間のインキュベーション後に測定した（図３１）。これらの結果は、ＦＳｉ－ＳＰの数が２個から最大１５個まで増えた場合でも、ＦＳｉ－ＳＰの分解産物に起因する細胞毒性がないことを示している。Ｓｉ－ＳＰでも同様の結果が認められた。これは、Ｓｉ及びフィブリン、ならびにそれらの対応する分解産物の生体適合性を支持する。
細胞毒性実験を、Ｓｉ－ＳＰ及びＦＳｉ－ＳＰから長時間スケールで放出された任意の毒性成分を測定するために行った。ＦＳｉ－ＳＰの分解産物のインビトロ細胞毒性は、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用して調べた。２個、５個、１０個または１５個のＦＳｉ－ＳＰから、１１週間にわたって回収した、崩壊したＳｉ及びフィブリンコーティングを含む上清を、細胞に直接加え、これらの細胞の生存率を２日間のインキュベーション後に測定した（図３１）。これらの結果は、ＦＳｉ－ＳＰの数が２個から最大１５個まで増えた場合でも、ＦＳｉ－ＳＰの分解産物に起因する細胞毒性がないことを示している。Ｓｉ－ＳＰでも同様の結果が認められた。これは、Ｓｉ及びフィブリン、ならびにそれらの対応する分解産物の生体適合性を支持する。
【0195】
実施例１２－Ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルに封入されたＦＳｉ－ＳＰのインビトロ薬物放出
アルギネートとＣａ２＋イオンの架橋により生じたヒドロゲルを、Ｓｉ－ＳＰからのタンパク質治療薬の放出のさらなる制御を達成するアプローチとして調べた。アルギネートは、生体適合性の高い天然多糖であり、様々な生物医学的応用に広く研究されており、長期間の移植で内耳に生体適合性があることが示されている。Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン（ＧＤＬ、一般的な食品添加物）の添加時にカルシウムイオンを放出するＣａＣＯ３粒子（約１．６μｍ径）を使用して、アルギネートをヒドロゲルまで架橋するためのＣａ２＋イオンを提供した。これらの成分が組み合わさって、遅延／誘発ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルプラットフォームが生じ、それにより、薬物を担持したＳｉ－ＳＰを、アルギネート及びＣａＣＯ３粒子との混合物にて液状で投与することができ、続いてすぐにＧＤＬを添加し、そのヒドロゲルを所定の位置で凝固させる。多孔質ＣａＣＯ３粒子の表面積が大きいこと及びＧＤＬに関連する穏やかな加水分解条件により、ゲル化は、ＧＤＬの添加後約２分以内に生じる。
アルギネートとＣａ２＋イオンの架橋により生じたヒドロゲルを、Ｓｉ－ＳＰからのタンパク質治療薬の放出のさらなる制御を達成するアプローチとして調べた。アルギネートは、生体適合性の高い天然多糖であり、様々な生物医学的応用に広く研究されており、長期間の移植で内耳に生体適合性があることが示されている。Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン（ＧＤＬ、一般的な食品添加物）の添加時にカルシウムイオンを放出するＣａＣＯ３粒子（約１．６μｍ径）を使用して、アルギネートをヒドロゲルまで架橋するためのＣａ２＋イオンを提供した。これらの成分が組み合わさって、遅延／誘発ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲルプラットフォームが生じ、それにより、薬物を担持したＳｉ－ＳＰを、アルギネート及びＣａＣＯ３粒子との混合物にて液状で投与することができ、続いてすぐにＧＤＬを添加し、そのヒドロゲルを所定の位置で凝固させる。多孔質ＣａＣＯ３粒子の表面積が大きいこと及びＧＤＬに関連する穏やかな加水分解条件により、ゲル化は、ＧＤＬの添加後約２分以内に生じる。
【0196】
ＦＩＴＣ－リゾチームを担持したＦＳｉ－ＳＰを、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル内に封入し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートした際のＦＩＴＣ－リゾチームの放出を測定した（図３２ｅ）。生分解性フィブリンコーティングは、すでに上記でバースト放出を減速させることが示されたが、図３２ｅは、ヒドロゲルの存在が、放出速度をさらに低下させ、４０日間で６０％のＦＩＴＣ－リゾチームが放出されることを示す。ＦＳｉ－ＳＰを使用したこれらの結果に加えて、ａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル中でのＳｉ－ＳＰのインビトロ放出プロファイルも同様に、異なる量のＣａＣＯ３粒子及び異なる濃度のアルギネート溶液を使用して調べた（図３３）。調べた様々なＣａＣＯ３粒子量及びアルギネート濃度では、Ｓｉ－ＳＰからのＦＩＴＣ－リゾチームの放出プロファイルに大きな差は認められなかった。総合すれば、これらの結果は、堅牢な放出プロファイルを有する、薬物を担持した超粒子を封入することができるａｌｇ－ＣａＣＯ３ヒドロゲル系の誘発ゲル化（ＧＤＬ添加時）を示す。使用例は、臨床医または外科医が、その薬物送達システムを目的の場所、例えば、中耳または内耳に配置することができる単純な２成分の「ミックスアンドインジェクト」システムとしての使用である。
【0197】
実施例１３－キトサン被覆超粒子
Ｓｉ－ＳＰを、上記の通りゲル媒介エレクトロスプレー組織化により合成し、これに、リゾチーム、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３を担持させた。担持させたＳｉ－ＳＰを次いで１層、２層、または３層のキトサン及びアルギネート（０．１重量％のキトサン及びアルギネート溶液）で被覆した。インビトロ薬物放出を、その後経時的に追跡した（図３４、３５及び３６）。リゾチームを担持したＳｉ－ＳＰを、次に１層の１重量％のキトサン及びアルギネート溶液で被覆し、その後リゾチームを経時的に追跡した（図３７）。
Ｓｉ－ＳＰを、上記の通りゲル媒介エレクトロスプレー組織化により合成し、これに、リゾチーム、ＢＤＮＦまたはＮＴ－３を担持させた。担持させたＳｉ－ＳＰを次いで１層、２層、または３層のキトサン及びアルギネート（０．１重量％のキトサン及びアルギネート溶液）で被覆した。インビトロ薬物放出を、その後経時的に追跡した（図３４、３５及び３６）。リゾチームを担持したＳｉ－ＳＰを、次に１層の１重量％のキトサン及びアルギネート溶液で被覆し、その後リゾチームを経時的に追跡した（図３７）。
【0198】
当業者には、広く記載される本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、多くの変更及び／または修正が、特定の実施形態に示される本開示になされ得ることが理解されよう。従って、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【0199】
本出願は、２０１９年３月１９日に出願されたＡＵ２０１９９００９１０の優先権を主張するものであり、その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【0200】
上記のすべての刊行物は、全体として本明細書に組み込まれる。
【0201】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等のいかなる説明も、本開示の文脈を提供することのみを目的としている。これらの事項のいずれかまたはすべては、先行技術の基礎の一部を形成すると認めると見なされるべきではなく、本出願の各請求項の優先日前に存在していたために、本開示に関連する分野共通の一般知識であったと認めると見なされるべきでもない。
【0202】
参考文献
Ｃｌａｒｋ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－２０７
Ｃｌａｒｋ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅａｒ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｓｕｐｐｌ．１２：１５Ｓ－２４Ｓ
Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１５７１－１５８０
Ｊａｗｏｒｅｋ（２００７）Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７６（１），１８－３５
Ｌａｎｇｅｒ Ｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９，１５２７－１５３３
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）
Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２４：３３６２－３３６６
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１９：６４５１－６４６４
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ．２２：３８２９－３８３１
Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ（２０１２）ＪＡＬＡ．１７， ５０－５８
Ｃｌａｒｋ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ Ｏｔｏｌ Ｒｈｉｎｏｌ Ｌａｒｙｎｇｏｌ ９３：２０４－２０７
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Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ．２２：３８２９－３８３１
Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｔｏｒｆｆ（２０１２）ＪＡＬＡ．１７， ５０－５８
【図1】
【図2】
【図3a)】
【図3b)】
【図3c)】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a)】
【図14b)】
【図14c)】
【図15】
【図16】
【図17a)】
【図17b)】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27a)】
【図27b)】
【図27c)】
【図27d)】
【図27e)】
【図27f)】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【国際調査報告】