▶ ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-24
(54)【発明の名称】ＡＭＤの処置のためのＨＴＲＡ１調節
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220517BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220517BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220517BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20220517BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220517BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220517BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220517BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220517BHJP
A61K 31/7052 20060101ALI20220517BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220517BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20220517BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220517BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/867 Z
C12N15/869 Z
C12N15/864 100Z
C12N5/10
A61P27/02
A61K35/76
A61K31/7052
A61P43/00 121
A61K35/763
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559892
(86)(22)【出願日】2020-04-10
(85)【翻訳文提出日】2021-11-30
(86)【国際出願番号】 US2020027802
(87)【国際公開番号】W WO2020210724
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/832,182
(32)【優先日】2019-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504260058
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ，ブランディ
(72)【発明者】
【氏名】ハーグマン，グレゴリー
(72)【発明者】
【氏名】リチャーズ，バート ティモシー
(72)【発明者】
【氏名】ユセフ，オサマ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA31
4B065CA44
4C084AA24
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZA33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、眼の網膜色素上皮細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させるための遺伝子治療を含む、第１０染色体誘発加齢性黄斑変性症の処置のための組成物および方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＴＲＡ１プロモーター中またはＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項2】
ＨＴＲＡ１プロモーターが配列番号５、７、８または１３に記載される配列を有し、２ｋｂ制御領域が配列番号１４に記載される配列を有する、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
【請求項3】
ａ）ＨＴＲＡ１プロモーター中またはＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびｂ）転写活性化因子ドメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ドメインを含む融合タンパク質、
を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体であって、
Ｃａｓタンパク質ドメインがヌクレアーゼ活性を欠いており、
ＨＴＲＡ１プロモーターが配列番号５、７、８または１３に記載される配列を有し、２ｋｂ制御領域が配列番号１３に記載される配列を有する、
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
【請求項4】
ａ）ＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、
を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体であって、
２ｋｂ制御領域が配列番号１３に記載される配列を有する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
【請求項5】
ガイド配列が、標的配列に対応する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｇＲＮＡまたは請求項３もしくは請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項6】
ガイド配列が、標的配列に対応する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｇＲＮＡまたは請求項３もしくは請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項7】
ガイド配列が、標的配列に対応する１５～２５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｇＲＮＡまたは請求項３もしくは請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項8】
標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧに連続している、請求項１に記載のｇＲＮＡまたは請求項３もしくは請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項9】
ＣａｓがｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａである、請求項３に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項10】
ＣａｓがＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ３である、請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項11】
標的配列がプロモーター中にあり、転写活性化因子がＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＭＬＬ、Ｅ２Ａ、ＨＳＦ１、ＮＦ－ＩＬ６、ＮＦＡＴ１およびＮＦ－ｋＢから選択される、請求項３に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項12】
標的配列が２ｋｂ制御領域中にあり、転写活性化因子がＬＨＸ２である、請求項３に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項13】
ガイド配列が配列番号１５～３３のいずれか、または配列番号１５～３３のいずれかの少なくとも１５個の連続する塩基を含むサブ配列を含む、請求項１から２もしくは４から７に記載のｇＲＮＡまたは請求項３に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項14】
ｉ）ガイド配列が配列番号３６～４９のいずれか１つを含み、ｉｉ）標的配列が、ｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３、ｒｓ３７５０８４８、ｒｓ３７５０８４７およびｒｓ３７５０８４６のいずれか１つでのリスクから選択されるリスク対立遺伝子を含み、
ｉｉｉ）標的配列がｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３、ｒｓ３７５０８４８、ｒｓ３７５０８４７およびｒｓ３７５０８４６のいずれか１つに隣接している、
請求項１から２もしくは４から７に記載のｇＲＮＡまたは請求項４に記載のＲＮＰ複合体。
【請求項15】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１から２、５から８または１３から１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
【請求項16】
ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター。
【請求項18】
ＨＴＲＡ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターであって、ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されたＨＴＲＡ１をコードするヒトコドン最適化配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項19】
レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１７または請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項20】
プロモーターがＲＰＥ特異的プロモーターである、請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８から１９に記載のウイルスベクター。
【請求項21】
ａ）請求項１、２、５から８または１３から１４のいずれかに記載のｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター、およびｂ）転写活性化因子ドメインに融合されたＣａｓタンパク質ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターであって、Ｃａｓタンパク質ドメインがヌクレアーゼ活性を欠いている、ベクター、
を含むＨＴＲＡ１活性化システム。
【請求項22】
（ａ）におけるベクターと（ｂ）におけるベクターが異なるベクターである、請求項２１に記載のＨＴＲＡ１活性化システム。
【請求項23】
（ａ）請求項１、２、５から８または１３から１４のいずれかのｇＲＮＡをコードする核酸を含むベクター、および（ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクター
を含むＨＴＲＡ１標的化システム。
【請求項24】
（ｃ）鋳型修復配列をコードする核酸を含むベクターであって、前記鋳型修復配列が配列番号８７～９４の少なくとも１つまたは配列番号８７～９４の少なくとも１つの相補体を適宜含む、ベクターをさらに含む、請求項２３に記載のＨＴＲＡ１標的化システム。
【請求項25】
（ａ）および（ｂ）が同じベクターである、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が同じベクターである、請求項２４に記載のＨＴＲＡ１標的化システム。
【請求項26】
請求項１または２に記載のｇＲＮＡ、請求項３または４に記載のＲＮＰ複合体、請求項１５、１６もしくは２０に記載のポリヌクレオチド、請求項１７から１９に記載のウイルスベクター、請求項２１から２２に記載の活性化システムまたは請求項２３から２５に記載の標的化システムを含む、単離された細胞。
【請求項27】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための医薬の調製のための、請求項１から２、４から７もしくは１３から１４のいずれかに記載のｇＲＮＡ、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１７から１９に記載のベクター、請求項２１から２２に記載の活性化システム、請求項２３から２５に記載の標的化システムまたは請求項２６に記載の単離された細胞の使用。
【請求項28】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための医薬の調製のための、請求項１から２、４から７もしくは１３から１４のいずれかに記載のガイドＲＮＡ、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１７から１９に記載のベクター、請求項２１から２２に記載の活性化システム、請求項２３から２５に記載の標的化システムまたは請求項２６に記載の単離された細胞。
【請求項29】
処置される対象が、ａ）Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す；
ｂ）第１０染色体リスク対立遺伝子を有する；
ｃ）第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性である；または
ｄ）第１染色体リスク対立遺伝子を有さない、
請求項２７に記載の使用または請求項２８に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項30】
細胞において、請求項２１から２２に記載の活性化システムまたは請求項２３から２５に記載の標的化システムを発現させることを含む、細胞においてＨＴＲＡ１発現を増加させるための方法。
【請求項31】
対象のＲＰＥ細胞または水平細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させる薬剤（複数可）を投与することを含む、対象においてＣｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法。
【請求項32】
対象がＣｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
対象が第１０染色体リスク対立遺伝子を有する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
対象が第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
対象が第１染色体リスク対立遺伝子を有さない、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項36】
内在性ＨＴＲＡ１遺伝子配列の転写が増加する、請求項３１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項37】
薬剤が、（ａ）酵素的に不活性なＣａｓタンパク質ドメインおよび転写活性化因子ドメインの融合タンパク質、ならびに（ｂ）ガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
酵素的に不活性なＣａｓタンパク質がｄＣａｓ９である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
リボ核タンパク質複合体がＨＴＲＡ１プロモーター領域に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
リボ核タンパク質複合体がＨＴＲＡ１エンハンサー領域に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
転写活性化因子ドメインが、ＬＨＸ２結合モチーフに結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項42】
薬剤が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含むリボ核酸複合体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項43】
対象がＨＴＲＡ１遺伝子エンハンサーにリスク対立遺伝子を保有し、薬剤が、（ａ）ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含むリボ核酸複合体、ならびに（ｉｉ）リスク対立遺伝子に対応する非リスク対立遺伝子の配列を含む鋳型修復ポリヌクレオチドを含む合剤である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、加齢性黄斑変性症の処置のための方法および組成物に関し、生物学および医学の分野における応用を見出す。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年４月９日に作成され、０９８８４６－１１８５５２９－０００８１０ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズ４６，６４２バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年４月９日に作成され、０９８８４６－１１８５５２９－０００８１０ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズ４６，６４２バイトである。
【0003】
関連特許の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／８３２，１８２号、２０１９年４月１０日出願の優先権を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／８３２，１８２号、２０１９年４月１０日出願の優先権を主張する。
【背景技術】
【0004】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、先進国世界における不可逆的な視力喪失の主因であり［概説について、Zarbin, Eur. Ophthalmol. 8:199-206, (1998)を参照されたい、６０歳以上の人のおよそ１５％が発症する。人口動態で推定６億人がこの年齢にある。ＡＭＤの有病率は、年齢と共に増加し；軽度または初期の形態は、７５歳以上である人口の３０％近くに、進行した形態は約７％において生じる［Vingerling et al., Epidemiol. Rev. 17(2):347-360, 1995］。
【0005】
伝統的治療は、隔月または必要に応じた治療剤、例えば抗ＶＥＧＦ薬剤の硝子体内注射を一般に含む。これらの治療は、患者に著しい不快感および不自由を生じる度重なる侵襲性手術を必要とする。これらの治療に含まれる手順は、副作用のリスクを増加させる場合もある。さらに、多くの場合、治療剤は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が発生した後、および黄斑に著しい損傷がある場合だけ投与される。初期ＡＭＤのためにまたはＡＭＤの発症を予防するために現在承認されている治療はない。
【0006】
ＡＭＤ患者の詳細な遺伝子型判定研究に基づいて、ＡＭＤが以下の２つの異なる生物学的疾患を含むことが現在理解されている：補体Ｈ因子調節不全を含む補体系の調節不全から生じる第１染色体依存性ＡＭＤ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＡＭＤ）（または「Ｃｈｒ１ ＡＭＤ」）、およびＡＲＭＳ２およびＨＴＲＡ１遺伝子を保有する染色体領域１０ｑ２６中の遺伝的変異体と関連する第１０染色体依存性ＡＭＤ（または「Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ」）。参照により本明細書に組み込まれる、Keenan et al, 2015, "ASSESSMENT OF PROTEINS ASSOCIATED WITH COMPLEMENT ACTIVATION AND INFLAMMATION IN MACULAE OF HUMAN DONORS HOMOZYGOUS RISK AT CHROMOSOME 1 CFH-TO-F13B" Invest Ophthalmol Vis Sci. 56:487-79；Ｈａｇｅｍａｎ，２０１５，“ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ ＴＨＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＯＦ ＡＭＤ ＢＡＳＥＤ ＯＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １ ＡＮＤ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １０” 米国特許公開第２０１５／０２１１０６５号を参照されたい。第１および第１０染色体上のこれらの遺伝子座は、合わせてコーカサス人種におけるすべてのＡＭＤリスクの９５％を構成しており、染色体領域１０ｑ２６がＡＭＤのリスクの増加と強く関連することが報告されている（Fisher et al., 2005；Rivera et.al. 2005）。リスク領域は、広範な連鎖不平衡（ＬＤ）（Ｄ’＝０．９９）を共有する遺伝子（ＡＲＭＳ２およびＨＴＲＡ１を含む）を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本開示では、第１０染色体誘発（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０－ｄｒｉｖｅｎ）加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法および組成物が提供される。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一部の態様では、本開示は、対象の細胞（例えば、ＲＰＥ細胞、水平細胞または光受容細胞）におけるＨＴＲＡ１発現を増加させる薬剤を投与することによって、対象においてＣｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法を提供する。一部の場合では、対象は、単一の第１０染色体リスク対立遺伝子を有する。一部の場合では、対象は、第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性である。一部の場合では、対象は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す。一部の場合では、対象は、第１染色体リスク対立遺伝子（複数可）を保有していない。
【0009】
一部のアプローチでは、薬剤は、内在性ＨＴＲＡ１遺伝子配列の転写の上方制御を生じる。例えば薬剤は、ＨＴＲＡ１転写制御領域またはＨＴＲＡ１プロモーター内の標的配列に結合する転写活性化因子である場合がある。一部の場合では、薬剤は、ｉ）ＨＴＲＡ１転写制御領域内の標的配列を認識できるＤＮＡ標的化タンパク質と、ｉｉ）転写活性化因子との融合タンパク質である。一部の場合では、ＤＮＡ標的化タンパク質は、ＨＴＲＡ１転写制御領域またはＨＴＲＡ１プロモーター領域内の配列に相補的であるガイドＲＮＡを通して標的配列を認識する。一部の場合では、ＤＮＡ標的化タンパク質は、酵素的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）である。一部の場合では、転写活性化因子はＶＰ１６である。一部の場合では、方法は、ＨＴＲＡ１転写制御領域内の配列に相補的であるｓｇＲＮＡを投与することをさらに含む。
【0010】
一部の場合では、薬剤の投与は、対象の細胞（例えば、ＲＰＥ細胞、水平細胞または光受容細胞が挙げられる）において外来性ＨＴＲＡ１タンパク質の発現を生じる。遺伝子治療アプローチでは、薬剤は、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質、またはＨＴＲＡ１タンパク質をコードする、好ましくはプロモーターに作動可能に連結した核酸配列をデリバリーするウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス）などのベクターであり得る。一部の場合では、プロモーターは、ＲＰＥ特異的プロモーターである。
【0011】
一部の場合では、薬剤を使用して対象を処置することは、対象のＲＰＥ細胞においてゲノムＤＮＡの改変を生じる。例えば、ゲノム編集法は、ＨＴＲＡ１遺伝子または転写制御領域中の配列を変化させ、１つまたは複数のリスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子（複数可）に変換するために使用され得る。一部の場合では、薬剤は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼベースシステムである。一部の場合では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼである。一部の場合では、薬剤は、ゲノムＤＮＡを改変し、配列番号３４を含むゲノムＤＮＡ配列を生じる。一部の場合では、薬剤は、ゲノムＤＮＡを改変し、配列番号１４を含むゲノムＤＮＡ配列を生じる。一部の場合では、ｒｓ３６２１２７３３でのリスク対立遺伝子配列（ｃ）は、非リスク対立遺伝子配列（ｔ）に変更される。一部の場合では、薬剤は、網膜下注射によって投与される。一部の場合では、薬剤は、上脈絡膜注射によってデリバリーされる。一部の場合では、薬剤は、硝子体内注射によってデリバリーされる。一部の場合では、薬剤は、他の経路によってデリバリーされる。一部の場合では、１つまたは複数の薬剤は、Ｃａｓ９および１つまたは複数のｓｇＲＮＡを含み、ここで１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、ｃａｓ９を１つまたは複数のリスク対立遺伝子を含むゲノム領域に方向付け、それによりゲノム領域を改変し、１つまたは複数のリスク対立遺伝子が対応する非リスク対立遺伝子を用いて置き換えられるようにする。
【0012】
一部の場合では、薬剤は、ＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現または活性を増加させる小分子化合物、ペプチドまたは核酸である。
【0013】
一部の態様では、本開示は、（ｉ）対象のＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現を増加させる薬剤、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置するための医薬組成物を提供する。
【0014】
一形態での本発明の組成物は、ＨＴＲＡ１プロモーター中またはＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一態様では、ＨＴＲＡ１プロモーターは配列番号５、７、８または１３に記載される配列を有し、２ｋｂ制御領域は、配列番号１４に記載される配列を有する。
【0015】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＨＴＲＡ１プロモーター中またはＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および（ｂ）転写活性化因子ドメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ドメインを含む融合タンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体であって、Ｃａｓタンパク質ドメインがヌクレアーゼ活性を欠いており、ＨＴＲＡ１プロモーターが配列番号５、７、８または１３に記載される配列を有し、２ｋｂ制御領域が配列番号１４に記載される配列を有する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一実施形態では、ＲＮＰ複合体のＣａｓは、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａである。一態様では、ＲＮＰ複合体の標的配列はプロモーター中にあり、転写活性化因子は、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＭＬＬ、Ｅ２Ａ、ＨＳＦ１、ＮＦ－ＩＬ６、ＮＦＡＴ１およびＮＦ－ｋＢから選択される。別の態様では、ＲＮＰ複合体の標的配列は、２ｋｂ制御領域中にあり、転写活性化因子はＬＨＸ２である。
【0016】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ＨＴＲＡ１ ２ｋｂ制御領域中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体であって、２ｋｂ制御領域が配列番号１４に記載される配列を有する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一実施形態では、ＲＮＰ複合体のＣａｓは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ３である。
【0017】
一態様では、ｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体のガイド配列は、標的配列に対応する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。別の態様では、ｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体のガイド配列は、標的配列に対応する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む。さらに別の態様では、ｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体のガイド配列は、標的配列に対応する１５～２５個の連続するヌクレオチドを含む。一実施形態では、ｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体の標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧと連続している。
【0018】
一態様では、ｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体のガイド配列は、配列番号１５～３３のいずれか、または配列番号１５～３３のいずれかの少なくとも１５個の連続する塩基を含むサブ配列を含む。
【0019】
別の態様では、本発明は（ｉ）ガイド配列が配列番号３６～４９のいずれかを含む；ならびに／または（ｉｉ）標的配列がｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３、ｒｓ３７５０８４８、ｒｓ３７５０８４７およびｒｓ３７５０８４６でのリスクから選択されるリスク対立遺伝子を含むかもしくは隣接するｇＲＮＡまたはＲＮＰ複合体を含む。
【0020】
別の態様では、本発明は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、ＤＮＡであるポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【0021】
さらに別の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。
【0022】
さらなる態様では、本発明は、ＨＴＲＡ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターであって、ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結したＨＴＲＡ１をコードするヒトコドン最適化配列を含む、ウイルスベクターを提供する。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【0023】
一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのプロモーターは、ＲＰＥ特異的プロモーターである。
【0024】
別の態様では、本発明は、（ａ）ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター；および（ｂ）転写活性化因子ドメインに融合されたＣａｓタンパク質ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクター、を含むＨＴＲＡ１活性化システムであって、Ｃａｓタンパク質ドメインがヌクレアーゼ活性を欠いているＨＴＲＡ１活性化システムである。一実施形態では、（ａ）中のベクターおよび（ｂ）中のベクターは、異なるベクターである。
【0025】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書において開示されるｇＲＮＡをコードする核酸を含むベクター；および（ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクター、を含むＨＴＲＡ１標的化システムを含む。一態様では、ＨＴＲＡ１標的化システムは、（ｃ）鋳型修復配列をコードする核酸を含むベクターをさらに含み、前記鋳型修復配列は、配列番号８７～９４の少なくとも１つまたは配列番号８７～９４の少なくとも１つの相補体を適宜含む。一実施形態では、（ａ）および（ｂ）は同じベクターである、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は同じベクターである。
【0026】
さらに別の態様では、本発明は、ｇＲＮＡ、ＲＮＰ、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、活性化システムまたは標的化システムを含む単離された細胞を含む。
【0027】
一態様では、本発明は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための薬物の調製物のためのｇＲＮＡ、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、活性化システム、標的化システムまたは単離された細胞の使用を提供する。別の態様では、ガイドＲＮＡ、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、活性化システム、標的化システムまたは単離された細胞は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための薬物の調製物のために使用される。一実施形態では、処置される対象は、（ａ）Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す；（ｂ）第１０染色体リスク対立遺伝子を有する；（ｃ）第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性である；または（ｄ）第１染色体リスク対立遺伝子を有さない。
【0028】
本発明は、細胞において活性化システムまたは標的化システムを発現させることを含む、細胞においてＨＴＲＡ１発現を増加させるための方法をさらに含む。
【0029】
さらに別の態様では、本発明は、対象のＲＰＥ細胞または水平細胞または光受容細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させる薬剤（複数可）を投与することを含む、対象におけるＣｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法を含む。一実施形態では、対象は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す。別の実施形態では、対象は、第１０染色体リスク対立遺伝子を有する。さらに別の実施形態では、対象は、第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性である。さらに別の実施形態では、対象は、第１染色体リスク対立遺伝子を有さない。一態様では、内在性ＨＴＲＡ１遺伝子配列の転写は、増加する。一実施形態では、薬剤は、（ａ）酵素的に不活性なＣａｓタンパク質ドメインと転写活性化因子ドメインとの融合タンパク質および（ｂ）ガイドＲＮＡ、を含むリボ核タンパク質複合体である。本態様の一実施形態では、酵素的に不活性なＣａｓタンパク質はｄＣａｓ９である。一実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、ＨＴＲＡ１プロモーター領域中に結合する。別の実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、ＨＴＲＡ１エンハンサー領域中に結合する。一実施形態では、転写活性化因子ドメインは、ＬＨＸ２結合モチーフに結合する。さらに別の実施形態では、薬剤は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含むリボ核酸複合体である。別の態様では、対象は、ＨＴＲＡ１遺伝子エンハンサー中にリスク対立遺伝子を保有し、薬剤は、（ａ）ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含むリボ核酸複合体、ならびに（ｉｉ）リスク対立遺伝子に対応する非リスク対立遺伝子の配列を含む鋳型修復ポリヌクレオチド、を含む合剤である。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図4】図４Ａおよび４Ｂは、ヒト眼球組織（ＲＰＥ脈絡膜および神経網膜）ならびにＲＰＥ掻爬におけるＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現をそれぞれ示す。ｒｓ１０４９３３１にリスク対立遺伝子を含むＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの量は、非リスク対立遺伝子を有するＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの量と比べて決定された。
【図14-2】同上
【図16】図１６は、７２時間、モックトランスフェクトされたまたはＬｅｎｔｉＭＰＨプラスミド（ＭＰＨ）、ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（ＳＡＭ）もしくは両方（ＭＰＨ＋ＳＡＭ）をトランスフェクトされたｈ１ＲＰＥ７細胞の総ＲＮＡ中のＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベル（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）を示す。
【図17】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＨＴＲＡ１（図１７Ａ）およびＩＬ１Ｂ（図１７Ｂ）のレベルを示す。ＬｅｎｔｉＭＰＨプラスミド（ＭＰＨ）を伴ってまたは伴わずに７２時間、ＨＴＲＡ１標的化Ｐ７ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭ（Ｐ７）またはＰ１８ ｓｇＲＮＡ（Ｐ１８）またはＩＬ１Ｂ標的化Ｐ２ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭをトランスフェクトされたｈ１ＲＰＥ７細胞の総ＲＮＡ中のｍＲＮＡ（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）。
【図18】図１８Ａおよび１８Ｂは、異なる量のＰ７ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（ＳＡＭ）を７２時間トランスフェクトされたｈ１ＲＰＥ７細胞中の総ＲＮＡのＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）のレベルを示す。
【図19】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＨＴＲＡ１ ＥＬＩＳＡの結果を示す、（Ａ）ＨＴＲＡ１タンパク質の標準曲線；（Ｂ）異なる量（２．５、５．０および７．５μｇ）のＣｔｒｌ ｓｇＲＮＡ－またはＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭを３、４および５日間トランスフェクトされたｈ１ＲＰＥ７の細胞培養上清におけるＨＴＲＡ１タンパク質レベル。
【図20】図２０Ａおよび２０Ｂは、異なる量（２．５、５．０および７．５μｇ）のＣｔｒｌ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭまたはＰ１８ ｓｇＲＮＡを３、４および５日間トランスフェクトされたｈ１ＲＰＥ７細胞における標準化ＨＴＲＡ１タンパク質レベル（Ａ）およびＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベル（Ｂ）の結果を示す。
【図21】図２１は、Ｃｔｒｌ－またはＰ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭウイルス粒子をＭＯＩ＝２０で用いて３、６および９日間形質導入されたｈ１ＲＰＥ７の細胞培養上清におけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルを示す。データは、Ｃｔｒｌ－ＬｅｎｔｉＳＡＭと比べた倍数増加としてプロットされている。
【図22】図２２は、Ｃｔｒｌ－またはＰ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭレンチウイルス粒子をＭＯＩ＝２０で用いて３、６および９日間形質導入されたｈ１ＲＰＥ７の細胞培養上清におけるＥＮＰＰ－２タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図23-1】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＭＯＩ ２０のＣｔｒｌ ｓｇＲＮＡ－またはＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭを用いて３、６および９日間形質導入されたｈ１ＲＰＥ７細胞における標準化ＨＴＲＡ１タンパク質レベル（Ａ）およびＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベル（Ｂ）の結果を示す。
【図23-2】同上
【図24】図２４は、対照ｐＣＴＭ２５９ベクターと比べて、リポフェクタミン３０００、７２時間を使用して、プロモーターを有さない（無）、ＢＥＳＴ１、ＲＰＥ６５またはＣＭＶ－ＨＴＲＡ１プラスミドをトランスフェクトされたＨＴＲＡ１ノックダウンＲＰＥ１細胞におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルを示す。
【図25】図２５は、対照ｐＣＴＭ２５９ベクターと比べて、リポフェクタミン３０００、７２時間を使用して、プロモーターを有さない（無）、ＢＥＳＴ１、ＲＰＥ６５またはＣＭＶ－ＨＴＲＡ１プラスミドをトランスフェクトされたＲＰＥ１細胞におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルを示す。
【図26】図２６は、ＢＥＳＴ１－、ＲＰＥ６５－またはＣＭＶ－由来プロモーターによって駆動されるＡＡＶ２－ＨＴＲＡ１プラスミドをトランスフェクトされたＲＰＥ１細胞（ＨＴＲＡ１ ＫＤ）におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現の経時変化動態を示す。
【図27】図２７Ａ～２７Ｃは、ＢＥＳＴ１－、ＲＰＥ６５－またはＣＭＶ－由来プロモーターによって駆動されるＡＡＶ２－ＨＴＲＡ１プラスミドをトランスフェクトされたＲＰＥ１細胞（ＨＴＲＡ１ ＫＤ）におけるＨｔｒＡ１タンパク質発現の経時変化動態を示す。
【図29】図２９は、ＡＭＤ第１０染色体遺伝子座上の「原因」（制御）領域およびｌｎｃＳＣＴＭ１を示す。Ｃｈｒ１０制御領域は、およそ２～４ｋｂである。新規ｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃＳＣＴＭ１と称する）は、この制御領域と重複して同定された。新規ｌｎｃＲＮＡは、ＡＲＭＳ２ ｒｓ１０４９０９２４を含有する。矢印は、ｌｎｃＳＣＴＭ１がＨＴＲＡ１プロモーターからアンチセンス方向で転写され、ＨＴＲＡ１と分岐プロモーター（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を共有し得ることを示す。
【図30-1】図３０は、Ｃｈｒ１０非リスク（ＧＧ）ドナーをヘテロ接合性（ＧＴ）およびホモ接合性リスク（ＴＴ）ドナーと比較する、ヒト黄斑外ＲＰＥ脈絡膜（図３０Ａ）、黄斑外網膜（図３０Ｂ）、黄斑ＲＰＥ脈絡膜（図３０Ｃ）および黄斑網膜（図３０Ｄ）におけるエクソン標的化プローブを用いたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析を示す。
【図30-2】同上
【発明を実施するための形態】
【0031】
１．序論
本発明者らは、眼（例えば、網膜色素上皮）におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させることが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を有するまたはその発症リスクがある対象に利益を提供することを発見した。特に、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させることは、第１０染色体依存性ＡＭＤ（または「Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ」）の所見を有する、または第１０染色体依存性ＡＭＤを発症する遺伝的素因を有する患者に利益を提供する。
本発明者らは、眼（例えば、網膜色素上皮）におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させることが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を有するまたはその発症リスクがある対象に利益を提供することを発見した。特に、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させることは、第１０染色体依存性ＡＭＤ（または「Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ」）の所見を有する、または第１０染色体依存性ＡＭＤを発症する遺伝的素因を有する患者に利益を提供する。
【0032】
本開示は、処置を必要とする対象の眼において、ＨＴＲＡ１発現またはレベルを増加させることによって、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法および試薬を提供する。
【0033】
Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる例示的方法が記載される。方法は、対象に薬剤を投与することを含み、ここで薬剤は、対象のＲＰＥ細胞、または代替的に水平細胞もしくは光受容細胞においてＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させる。細胞においてＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを増加させるための例示的方法が下に記載される。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１発現は、対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において増加する。眼においてＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの量および／またはタンパク質レベルを増加させるアプローチは、ＣＲＩＳＰＲａを使用する内在性ＨＴＲＡ１の発現の上方制御、リスク領域でのＣＲＩＳＰＲ媒介修復、ＨＴＲＡ１タンパク質コード配列を細胞に導入する遺伝子治療、細胞内でのＨＴＲＡ１の分解の低減および細胞療法が挙げられる、ＨＴＲＡ１の転写制御を含む。しかし、本発明は、具体的な方法に限定されず、任意の治療に有効なアプローチが使用され得る。本明細書において使用される場合、「ＨＴＲＡ１の発現を増加させる」は、内在性または外来性遺伝子からの転写、および遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させることによってＨＴＲＡ１タンパク質のレベルを増加させることを指す。したがって、文脈に応じて、ＨＴＲＡ１「発現」は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡまたはＨＴＲＡ１タンパク質の産生を指し得る。「発現を増加させる」は、細胞におけるＨＴＲＡ１タンパク質またはｍＲＮＡの安定性を増加させる、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの翻訳速度を増加させる、ｍＲＮＡリクルートメントおよび細胞への外来性ＨＴＲＡ１タンパク質の直接導入などの転写以外の機構を通じてＨＴＲＡ１タンパク質の量を増加させる方法も指し得る。「ＨＴＲＡ１発現を増加させる」が、ＨＴＲＡ１タンパク質の望ましい分子種の量を増加させることを指し得ることは読者によって認識される。例えば、リスク遺伝子型と関連する内在性ＨＴＲＡ１タンパク質を発現する細胞において、「ＨＴＲＡ１発現を増加させる」は、リスク遺伝子型と関連しない配列を有するＨＴＲＡ１タンパク質の量を増加させることを指し得る。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１セリンプロテアーゼ活性は、増加する。用語「上方制御」は、薬剤を用いて処置されていない対象細胞と比べて、転写（例えば、ｍＲＮＡ産生の量）における少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも５０％の増加を指して使用され得る。
【0034】
ＨＴＲＡ１レベルの増加が、患者に利益を与えるという発見は予想外であった。ＡＭＤ分野におけるコンセンサスは、ＨＴＲＡ１の過小発現ではなく過剰発現がＡＭＤを発症するリスクの増加と関連しており、ＨＴＲＡ１レベルまたは活性はＡＭＤを処置するために低減または抑制されるべきであるとのことであった。例えば、Dewan et al (2006)は、ｒｓ１１２００６３８でのＨＴＲＡ１プロモーターＳＮＰのリスク対立遺伝子（Ａ）が培養ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１転写の増強と関連すると報告した。Yang et al (2006)もリスク対立遺伝子についてホモ接合性（ＡＡ）の個体由来の循環リンパ球が、非リスク対立遺伝子についてホモ接合性（ＧＧ）の個体由来のリンパ球と比較して、高レベルのＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡを発現することを報告した。Chan et al. (2007)は、ＡＭＤを有する患者の保存された眼においてｍＲＮＡレベルでＨＴＲＡ１発現が上方制御されていることを報告し、ＨＴＲＡ１の発現の増強が滲出型ＡＭＤの黄斑病変における活発な血管新生の原因であると結論付けた。同様に、Vierkotten et al. (2011)は、ＨＴＲＡ１の過剰発現が、ブルッフ膜の弾性層における超微細構造変化と相関することを報告し、ＨＴＲＡ１がＡＭＤの病態生理の一因となることを示唆した。Jones et al. (2011)は、マウス網膜色素上皮においてヒトＨＴＲＡ１を過発現することが、脈絡膜の分枝血管網、ポリープ状病変、弾性板の重度の変性および脈絡膜血管の中膜を含む、ポリープ状脈絡膜血管症（「ＰＣＶ」）の誘発される主要な特性と関連したことを報告した。ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ（米国特許公開第２０１３／０１２２０１６号）は、ＨＴＲＡ１遺伝子の発現を低減すること、またはＨＴＲＡ１遺伝子産物の生物学的活性を低減することによる、対象における加齢性黄斑変性症の進行の遅延を提唱した。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（米国特許公開第２０１３／０１２９７４３号）は、ＡＭＤの処置のために、ＨＴＲＡ１に結合し、ＨＴＲＡ１酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を使用することを提唱した。
【0035】
２．ＡＭＤに関連するＨＴＲＡ１制御エレメント
本発明者らは、ＨＴＲＡ１のレベルを増加させることによってＡＭＤを処置するための標的および方法を特定した。本発明者らの発見は、一部、実施例に記載される研究に基づいている。
本発明者らは、ＨＴＲＡ１のレベルを増加させることによってＡＭＤを処置するための標的および方法を特定した。本発明者らの発見は、一部、実施例に記載される研究に基づいている。
【0036】
ｒｓ１０４９０９２４でのＡＭＤリスク対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性（ＧＴ、ＴＴ）のヒト対象および非リスクについてホモ接合性（ＧＧ）の対照対象由来のドナー眼を使用して、本発明者らは、ＡＭＤリスク対立遺伝子を有するドナーが、対照と比較して低いＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現を有することを観察した。重要なことに、データは、リスク患者におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルの低減が組織特異的であることを実証した。低減は、ＲＰＥにおいて検出されたが、神経網膜および脈絡膜では検出されなかった。さらに、Ｃｈｒ１０遺伝子座にリスクを有するまたは有さないドナーにおいて年齢に応じたヒト黄斑外網膜およびＲＰＥ脈絡膜におけるＨＴＲＡ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルの比較は、網膜では、ＨｔｒＡ１レベルが、年齢では比較的変化せず、対象のＣｈｒ１０リスク状態と無関係だが、ＲＰＥ脈絡膜では、Ｃｈｒ１０リスクを有さないドナーのＨｔｒＡ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに、リスク対立遺伝子を有するドナーと比較して、年齢に伴う顕著な増加があることを実証した。
【0037】
４ｋｂ ＡＭＤリスク領域
ＨＴＲＡ１対立遺伝子特異的発現アッセイは、ＡＭＤの原因である第１０染色体の領域を狭めるために使用された。アッセイは、ＡＭＤ関連ＡＲＭＳ２／ＨＴＲＡ１ ＬＤブロック内に稀な組換え事象を有するヒトドナー眼由来のｍＲＮＡを使用した。本発明者らは、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの減少に関連する領域を、ＨＴＲＡ１コード配列の上流のおよそ４ｋｂ制御領域（ｒｓ１１２００６３２とｒｓ３７５０８４６とを含めてそれらの間にある）にマッピングした。４ｋｂ領域は、ｒｓ１０４９０９２４（ＡＲＭＳ２ Ａ６９Ｓ）を含む。同じ遺伝的領域は、Grassmann et al. (Genetics 2017)による、事例／対照研究における組換えハプロタイプの彼らの分析においてＡＭＤ疾患のリスクの上昇と関連することが見出された。本発明者らがＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現と関連するとして特定した４ｋｂ領域が、ＡＭＤリスクと関連する領域と合致するという発見は、ＨＴＲＡ１発現におけるリスク関連低減がＡＭＤ発生率の増加をもたらすことを意味する。この領域を、「４ｋｂ ＡＭＤリスク領域」、または同義であるが「４ｋｂリスク領域」、「４ｋｂ制御領域」、「４ｋｂ原因領域」もしくは「４ｋｂ領域」と称する。
ＨＴＲＡ１対立遺伝子特異的発現アッセイは、ＡＭＤの原因である第１０染色体の領域を狭めるために使用された。アッセイは、ＡＭＤ関連ＡＲＭＳ２／ＨＴＲＡ１ ＬＤブロック内に稀な組換え事象を有するヒトドナー眼由来のｍＲＮＡを使用した。本発明者らは、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの減少に関連する領域を、ＨＴＲＡ１コード配列の上流のおよそ４ｋｂ制御領域（ｒｓ１１２００６３２とｒｓ３７５０８４６とを含めてそれらの間にある）にマッピングした。４ｋｂ領域は、ｒｓ１０４９０９２４（ＡＲＭＳ２ Ａ６９Ｓ）を含む。同じ遺伝的領域は、Grassmann et al. (Genetics 2017)による、事例／対照研究における組換えハプロタイプの彼らの分析においてＡＭＤ疾患のリスクの上昇と関連することが見出された。本発明者らがＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現と関連するとして特定した４ｋｂ領域が、ＡＭＤリスクと関連する領域と合致するという発見は、ＨＴＲＡ１発現におけるリスク関連低減がＡＭＤ発生率の増加をもたらすことを意味する。この領域を、「４ｋｂ ＡＭＤリスク領域」、または同義であるが「４ｋｂリスク領域」、「４ｋｂ制御領域」、「４ｋｂ原因領域」もしくは「４ｋｂ領域」と称する。
【0038】
２ｋｂ ＡＭＤリスク領域
転写活性化のエピジェネティックマーカーを記載するデータを使用して、本発明者らは、４ｋｂ領域と重複し、ＨＴＲＡ１転写を制御するおよそ２ｋｂゲノム領域［Ｃｈｒ１０：１２２４５４５０８－１２２４５６５６４（ｈｇ３８）に対応する］を特定した。ＲＰＥ細胞では、この領域は、Ｈ３Ｋ２７アセチル化を含む転写活性化のマーカーによって特徴付けられるが、この領域は網膜組織においてまたは種々の非ＲＰＥ細胞株を使用するＥＮＣＯＤＥからのデータにおいてはＨ３Ｋ２７アセチル化を示さず、この領域におけるクロマチンがＲＰＥ組織では活性だが、他の細胞型ではそうでないことを示唆している。「２ｋｂ ＡＭＤリスク領域」（配列番号１４）は、「２ｋｂリスク領域」、「２ｋｂ制御領域」、「２ｋｂ原因領域」または「２ｋｂ領域」と同等に称される。２ｋｂ ＡＭＤリスク領域は、「ＨＴＲＡ１エンハンサー領域」とも称される。
転写活性化のエピジェネティックマーカーを記載するデータを使用して、本発明者らは、４ｋｂ領域と重複し、ＨＴＲＡ１転写を制御するおよそ２ｋｂゲノム領域［Ｃｈｒ１０：１２２４５４５０８－１２２４５６５６４（ｈｇ３８）に対応する］を特定した。ＲＰＥ細胞では、この領域は、Ｈ３Ｋ２７アセチル化を含む転写活性化のマーカーによって特徴付けられるが、この領域は網膜組織においてまたは種々の非ＲＰＥ細胞株を使用するＥＮＣＯＤＥからのデータにおいてはＨ３Ｋ２７アセチル化を示さず、この領域におけるクロマチンがＲＰＥ組織では活性だが、他の細胞型ではそうでないことを示唆している。「２ｋｂ ＡＭＤリスク領域」（配列番号１４）は、「２ｋｂリスク領域」、「２ｋｂ制御領域」、「２ｋｂ原因領域」または「２ｋｂ領域」と同等に称される。２ｋｂ ＡＭＤリスク領域は、「ＨＴＲＡ１エンハンサー領域」とも称される。
【0039】
ＨＴＲＡ１プロモーター
ＨＴＲＡ１「プロモーター配列」は、ＣＲＩＳＰＲａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）標的配列および他の特性を含む。プロモーター領域配列は、次の配列中に提供される。他に示されるまたは文脈から明らかである場合を除いて、本明細書における「プロモーター」への言及は、配列のこれらの範囲それぞれを指すことが意図される。配列番号８（３００ｂｐ）は、推定転写開始部位から５’３００ｂｐを含むＨＴＲＡ１主要プロモーター配列を示している。配列番号５（４６９ｂｐ）は、追加的上流配列を含む伸長されたプロモーター配列を示す。配列番号７（４００ｂｐ）は、主要プロモーター配列に加えて１００ｂｐの５’ＵＴＲ配列を示す。「天然プロモーター領域」は、プロモーターおよびＵＴＲ配列の両方を含む配列番号１３（８５３ｂｐ）である。
ＨＴＲＡ１「プロモーター配列」は、ＣＲＩＳＰＲａ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）標的配列および他の特性を含む。プロモーター領域配列は、次の配列中に提供される。他に示されるまたは文脈から明らかである場合を除いて、本明細書における「プロモーター」への言及は、配列のこれらの範囲それぞれを指すことが意図される。配列番号８（３００ｂｐ）は、推定転写開始部位から５’３００ｂｐを含むＨＴＲＡ１主要プロモーター配列を示している。配列番号５（４６９ｂｐ）は、追加的上流配列を含む伸長されたプロモーター配列を示す。配列番号７（４００ｂｐ）は、主要プロモーター配列に加えて１００ｂｐの５’ＵＴＲ配列を示す。「天然プロモーター領域」は、プロモーターおよびＵＴＲ配列の両方を含む配列番号１３（８５３ｂｐ）である。
【0040】
３．転写活性化によるＨＴＲＡ１発現の増加
一部のアプローチでは、遺伝子治療は、ＲＰＥ細胞において内在性ＨＴＲＡ１の発現を増強するために使用される。一部のアプローチでは、遺伝子治療は、ＨＴＲＡ１の転写制御領域に結合し、ＨＴＲＡ１の転写を促進できる転写活性化因子をデリバリーすることを含む。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター領域に結合し、転写活性化因子をＨＴＲＡ１プロモーター領域の近くに位置させる標的化成分（例えば、Ｃａｓタンパク質ガイドＲＮＡ複合体）が使用される。関連アプローチでは、標的化成分はＨＴＲＡ１エンハンサー領域に結合し、転写活性化因子を転写活性化因子結合モチーフ近くに位置させる。
一部のアプローチでは、遺伝子治療は、ＲＰＥ細胞において内在性ＨＴＲＡ１の発現を増強するために使用される。一部のアプローチでは、遺伝子治療は、ＨＴＲＡ１の転写制御領域に結合し、ＨＴＲＡ１の転写を促進できる転写活性化因子をデリバリーすることを含む。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター領域に結合し、転写活性化因子をＨＴＲＡ１プロモーター領域の近くに位置させる標的化成分（例えば、Ｃａｓタンパク質ガイドＲＮＡ複合体）が使用される。関連アプローチでは、標的化成分はＨＴＲＡ１エンハンサー領域に結合し、転写活性化因子を転写活性化因子結合モチーフ近くに位置させる。
【0041】
一部のアプローチでは、転写活性化因子活性は、転写活性化因子およびＤＮＡ標的化タンパク質の融合タンパク質によって提供される。本明細書において開示されるＤＮＡ標的化タンパク質は、ＨＴＲＡ１転写制御領域に結合するＤＮＡ標的化タンパク質であり得る。ＤＮＡ標的化タンパク質を使用する種々のプラットホームは、下に考察されるとおり使用され得る。ある特定の実施形態では、「ＣＲＩＳＰＲａ」（ＣＲＩＳＰＲ活性化）法が使用される。一部の場合では、転写活性化因子は、ヌクレアーゼ欠損ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）がＤＮＡ標的化タンパク質である融合タンパク質として提供される。一般に、Ｃａｓは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変される（すなわち、「ヌクレアーゼデッドＣａｓ」または「ｄＣａｓ」）。一部のアプローチでは、ＣａｓはｄＣａｓ９である。一部のアプローチでは、ＣａｓはｄＣａｓ１２ａである。一部のアプローチでは、Ｃａｓはそれをヌクレアーゼ欠損にする改変を有する任意のＣａｓタンパク質である。上および本明細書他所に記載されるとおり発明は、この活性化方法に限定されず、転写活性化因子をプロモーターまたはエンハンサー領域に方向付ける非Ｃａｓタンパク質または成分は使用され得る。
【0042】
これにより、本発明の一部の態様では、ｄＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ活性化（「ＣＲＩＳＰＲａ」）システムにおいてＨＴＲＡ１発現の上方制御を媒介するために使用される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて広く使用され、標的配列に方向付けられた場合にゲノムＤＮＡ中に２本鎖切断を生成するＣａｓ９とは対照的に、ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を欠いており、ＤＮＡ中に２本鎖切断を生成しない。代わりに、ｄＣａｓ９は、転写活性化因子に連結され、正確でロバストなＲＮＡガイド転写制御を達成するようにＨＴＲＡ１プロモーター領域中の配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と複合体形成できる。ｄＣａｓ９媒介遺伝子活性化システムの使用は、十分周知であり、例えば、Dominquez et al., 2016, "Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation," Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 17: 5-15に記載されている。
【0043】
他のヌクレアーゼ欠乏Ｃａｓタンパク質は、プロモーターまたはエンハンサー部位に転写活性化因子をリクルートするためにも使用され得る。例えば、ｄＣａｓ１２ａドメインは、本発明の方法における使用のために転写活性化因子ドメインに融合され得る（Sarstedt, "Spotlight on Cas12 A search for more type V Cas12 family members turns up unexpected functionality", Nature Methods, 2019, 16:213-219；Pickar-Oliver et al., "The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications", Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2019, 20:490-507；Kleinstiver et al., "Engineered CRISPR-Cas12a Variants with Increased Activities and Improved Targeting Ranges for Gene, Epigenetic And Base Editing", Nature Biotechnology, 2019, 37:276-282；Xu et al., 2018, "A CRISPR-dCas Toolbox for Genetic Engineering and Synthetic Biology", J. Mol. Biol. doi.org/10.1016/j.jmb.2018.06.037を参照されたい）。１つのアプローチでは、Ｃａｓ１２ａは、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣａｓ１２ａ）である。
【0044】
したがって、一実施形態では、本明細書において開示される方法は、薬剤を患者に投与することを含み、ここで投与は、処置を必要とする患者の眼（例えば、ＲＰＥ）へのｄＣａｓ転写活性化因子融合タンパク質および１つまたは複数のｓｇＲＮＡのデリバリーを生じる。融合タンパク質は、１つまたは複数の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のガイダンス下でＨＴＲＡ１制御領域に結合し、それによりＨＴＲＡ１転写を上方制御する。１つのアプローチではｄＣａｓ９は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来である（「Ｓａ－ｄＣａｓ９」）。１つのアプローチではｄＣａｓ９は、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来である（「Ｓｐ－ｄＣａｓ９」）。ｄＣａｓ９転写活性化因子融合タンパク質は、Dominguez et al., Nat Rev Mol Cell Biol. Jan; 17(1): 5-15 (2016)において開示されるものなどの異なる立体配置を取り得る。一例では、融合タンパク質は、複数コピーの転写活性化因子および１コピーのｄＣａｓ９からなり得る。
【0045】
３．１ 転写活性化のための融合タンパク質
ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を増加させるために有用な転写因子は、ＨＴＲＡ１プロモーターまたはエンハンサー領域に結合し、結合は対象の細胞、例えばＲＰＥ細胞、水平細胞または光受容細胞における転写の増加を生じる。用語「転写因子」は、トランス活性化ドメイン（「ＴＡＤ」）を介して転写を活性化する因子を含むプロモーター領域に結合する因子、およびＬＩＭエレメントなどスキャホールドを介して転写を活性化し、転写を開始するようにまたは他の機構を通じて追加的転写因子およびクロマチンリモデリングタンパク質をリクルートおよびアセンブルできる因子を含むエンハンサー領域に結合する因子を包含する。例えば、Hirai et al., Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA Int. J. Dev. Biol. 2010; 54(11-12):1589-1596を参照されたい。転写因子の両方のクラスのメンバーは、転写因子を標的プロモーターまたはエンハンサーエレメント、およびエフェクタードメイン（例えば、ＴＡＤもしくはスキャホールドなど）に方向付けるＤＮＡ結合ドメインを含む。
ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を増加させるために有用な転写因子は、ＨＴＲＡ１プロモーターまたはエンハンサー領域に結合し、結合は対象の細胞、例えばＲＰＥ細胞、水平細胞または光受容細胞における転写の増加を生じる。用語「転写因子」は、トランス活性化ドメイン（「ＴＡＤ」）を介して転写を活性化する因子を含むプロモーター領域に結合する因子、およびＬＩＭエレメントなどスキャホールドを介して転写を活性化し、転写を開始するようにまたは他の機構を通じて追加的転写因子およびクロマチンリモデリングタンパク質をリクルートおよびアセンブルできる因子を含むエンハンサー領域に結合する因子を包含する。例えば、Hirai et al., Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA Int. J. Dev. Biol. 2010; 54(11-12):1589-1596を参照されたい。転写因子の両方のクラスのメンバーは、転写因子を標的プロモーターまたはエンハンサーエレメント、およびエフェクタードメイン（例えば、ＴＡＤもしくはスキャホールドなど）に方向付けるＤＮＡ結合ドメインを含む。
【0046】
一態様では、本発明は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ／ガイドＲＮＡシステムのＤＮＡ結合および認識特性を転写因子の転写エフェクター特性と組み合わせる融合タンパク質を利用する。本発明において使用される転写因子エフェクタードメインは、任意の供給源由来であってよいが、一般に、ヒトもしくはウイルス転写因子またはそれらの操作された誘導体由来である。ＨＴＲＡ１転写の上方制御のために有用な例示的転写因子として、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０（ＶＰ１６の２つ以上のコピーからなるＶＰ６４、およびＶＰ１６の１０個のタンデムコピーからなるＶＰ１６０）；ＭＬＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ００６１３）、Ｅ２Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５９２３）、ＨＳＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ００６１３）、ＮＦ－ＩＬ６（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１７６７６）、ＮＦＡＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ１３４６９）、ＮＦＩＸ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ１４９３８）、ＮＦ－ｋＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ０４２０６）；ＭＥＦ２Ａ［Potthoff & Olson (2007), "MEF2: a central regulator of diverse developmental programs," Development 2007; 134(23):4131-4140；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ０２０７８］；およびＹＹ１［Weintraub et al. (2017), "YY1 Is a Structural Regulator of Enhancer-Promoter Loops", Cell 2017;171:1573-88；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２５４９０］、ＬＨＸ２（ZIBETTI et al., "Epigenomic profiling of retinal progenitors reveals LHX2 is required for developmental regulation of open chromatin", Communications Biology, April 25, 2019, Pages 1-13, 2、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ５０４５８）が挙げられる。
【0047】
ヒト転写因子（ＴＦ）または転写活性化因子は、十分周知であり、十分特徴付けられている。例えば、Ｌａｍｂｅｒｔらは、ヒト転写因子の可能性があるものを１，６００を超えて記載している（Lambert et al., 2018, "The Human Transcription Factors" Cell 172: 650-665）。同様に、Fulton et al. (2009), "TFCat: the curated catalog of mouse and human transcription factors", Genome Biol 2009; 10: R29、Vaquerizas et al. (2009), "A census of human transcription factors: function, expression and evolution", Nat. Rev. Genet. 2009; 10: 252-263、Wingender et al. (2015), "TFClass: a classification of human transcription factors and their rodent orthologs", Nucleic Acids Res. 2015; 43: D97-D102も参照されたい。転写因子結合モチーフは、周知であり、ＴＲＡＮＳＦＡＣ［（Matys et al. (2006), "TRANSFAC and its module TRANSCompel: transcriptional gene regulation in eukaryotes", Nucleic Acids Res. 2006; 34: D108-D110］、ＪＡＳＰＡＲ［Mathelier et al. (2016), "JASPAR 2016: a major expansion and update of the open-access database of transcription factor binding profiles", Nucleic Acids Res. 2016; 44: D110-D115］、ＨＴ－ＳＥＬＥＸ［Jolma et al. (2013), "DNA-binding specificities of human transcription factors", Cell 2013; 152: 327-339；Jolma et al. (2015), "DNA-dependent formation of transcription factor pairs alters their binding specificity", Nature 2015; 527: 384-388；Yin et al. (2017), "Impact of cytosine methylation on DNA binding specificities of human transcription factors", Science 2017; 356: eaaj2239］、ＵｎｉＰＲＯＢＥ［Hume et al.(2015), "UniPROBE,update 2015:new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions". Nucleic Acids Re. 2015; 43: D117-D122］およびＣｉｓＢＰ［Weirauch et al. (2014), "Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity", Cell 2014; 158: 1431-1443］などの集合で記載されている。
【0048】
転写因子エフェクタードメインがヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合ドメインと組み合わされている融合タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮを含む、Ｃａｓタンパク質以外のプログラム可能なヌクレアーゼを使用して作製され得る。
【0049】
３．２ ガイドＲＮＡ
一部のアプローチでは、標的化成分は、ＤＮＡ標的に相補的な領域を有するＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称され、相補性の領域は、ガイド配列と称され得る。ｇＲＮＡの「ガイド配列」は、標的特異性を付与する配列である。それは、標的配列の反対鎖（すなわち、その逆相補体である）にハイブリダイズする。天然では、多くのＣＲＩＳＰＲシステムは、２つのＲＮＡ分子：Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＤＮＡ標的配列に結合するｃｒＲＮＡを含む。一部のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１）は、ｃｒＲＮＡだけを必要とする。研究および生物医学的適用では、一般にＲＮａｓｅＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングに対する必要性を除き、Ｃａｓおよび標的の両方に結合するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である、キメラ単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）を使用することがより典型的である。文脈から明らかである場合を除いて、「ｓｇＲＮＡ」への言及は、適切な結合特異性を有する任意の好適なガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列を含む他のＲＮＡ）を使用する任意の標的化法を包含することは理解される。
一部のアプローチでは、標的化成分は、ＤＮＡ標的に相補的な領域を有するＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称され、相補性の領域は、ガイド配列と称され得る。ｇＲＮＡの「ガイド配列」は、標的特異性を付与する配列である。それは、標的配列の反対鎖（すなわち、その逆相補体である）にハイブリダイズする。天然では、多くのＣＲＩＳＰＲシステムは、２つのＲＮＡ分子：Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＤＮＡ標的配列に結合するｃｒＲＮＡを含む。一部のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１）は、ｃｒＲＮＡだけを必要とする。研究および生物医学的適用では、一般にＲＮａｓｅＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングに対する必要性を除き、Ｃａｓおよび標的の両方に結合するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である、キメラ単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）を使用することがより典型的である。文脈から明らかである場合を除いて、「ｓｇＲＮＡ」への言及は、適切な結合特異性を有する任意の好適なガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列を含む他のＲＮＡ）を使用する任意の標的化法を包含することは理解される。
【0050】
最も一般的に使用されるｓｇＲＮＡは、長さおよそ１００塩基対である。プログラム可能な標的化配列は、ｓｇＲＮＡの５’末端のまたはその近くのおよそ２０塩基を含む。この配列をプログラムすることによって、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムまたは他のＣａｓシステムは、その配列に相補的な任意のゲノム領域に向けて標的化され得る。
【0051】
特定のゲノム領域を標的化するｓｇＲＮＡを設計するための方法は、当技術分野において十分周知である。Doench et al. Nature Biotechnology 34: 184-191, 2016；Horlbeck et al. eLife. 5e19760 (2016)；Doench et al. , Nt.Biotechnol 34 (2): 184-191 (2016)；Cui et al., "Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools.Interdiscip.Sci. 2018, 10: 455-465；Jensen, 2018, Design principles for nuclease-deficient CRISPR-based transcriptional regulators" FEMS Yeast Research, 18: 4およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８１０７０２８号を参照されたい。かかるｓｇＲＮＡを設計するための方法およびツールは、例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ．から商業的に入手可能であり、dharmacon. horizondiscovery.com/ applications/ crispra-transcriptional -activation-for-gene-overexpressionまたはbenchling.com/academic;およびBroad institute .org/gpp/public/ analysis-tools/sgrna-design-help-crisprai.などのウエブサイトにおいて公開されている。
【0052】
一態様では本発明は、ＨＴＲＡ１プロモーター中の標的配列に対応する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。一部の場合ではガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。一部のアプローチではガイド配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０または少なくとも２５ヌクレオチドを含む。一部の場合ではガイド配列は、長さ２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では本発明は、ガイド配列を含むガイドＲＮＡを提供し、ここでガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性を欠いているＣａｓ（Ｃａｓ９など）（例えば、ｄＣａｓ９）と複合体化される。一部の場合では本発明は、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化因子を含むＣａｓ融合タンパク質と複合体化されるｓｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡを提供する。典型的にはＣａｓは、ヌクレアーゼ欠損ｄＣａｓ（ｄＣａｓ９など）である。
【0053】
一部の場合ではＤＮＡ標的配列（例えば、ＨＴＲＡ１プロモーターまたはエンハンサー中）は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に連続している。例えば、Ｃａｓ９は、活性のために一般にＰＡＭモチーフＮＧＧを必要とする。したがって一部のシステムでは、ある特定の標的配列は（したがってある特定のガイド配列も）、ＰＡＭへの標的配列の近くにあることに基づいて好ましい。しかし、Ｃａｓ９の変異体を含む一部のＣａｓタンパク質は、弾力的なＰＡＭ要求性を有し（Karvekis et al., 2019, "PAM recognition by miniature CRISPR-Cas14 triggers programmable double-stranded DNA cleavage." bioRxiv. https://doi.org/10.1101/654897；Legut et al. ,2020, "High-Throughput Screens of PAM-Flexible Cas9" , Cell Reports 30:2859-2868；Jakimo et al., 2018 Cas9 with Complete PAM Recognition for Adenine Dinucleotides bioRxiv doi.org/10.1101/429654；Esvelt KM,Mali Pet al. (2013) Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.Nature Methods, 10(11):1116-1121；Gleditzsch et al., 2019, PAM identification by CRISPR-Cas effector complexes: diversified mechanisms and structures. RNA Biol. 2019 Apr; 16(4): 504-517；Tang et al., 2019, Efficient cleavage resolves PAM preferences of CRISPR-Cas in human cells Cell Regeneration 8:44-50を参照されたい）、他のＣａｓタンパク質はＰＡＭ非依存性である（例えば、Ｃａｓ１４ａ１）。例示的ＰＡＭとして、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＳｐＣａｓ９ ＮＧＧ；化膿性連鎖球菌由来のＳｐＣａｓ９ ＮＲＧ；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＳｔＣａｓ９ ＮＮＡＧＡＡＷ；髄炎球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＮｍＣａｓ９ ＮＮＮＮＧＡＴＴ；黄色ブドウ球菌由来のＳａＣａｓ９ ＮＮＧＲＲＴ；ＳａＣａｓ９変異体（ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）ＮＮＮＲＲＴ；ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅ変異体ＮＧＧ；ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体ＮＧＣＧ；ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ変異体ＮＧＡＧ；ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体ＮＧＡＮもしくはＮＧＮＧ３’；アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＡｓＣｐｆ１、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）由来のＬｂＣｐｆ１ ＴＴＴＮ；フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２株由来のＦｎＣｐｆ１ ＴＴＮならびに／またはＣＴＡ；４つの主な分類群：桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、ベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびｄ－プロテオバクテリア（ｄ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来のＣ２ｃ１ ＴＴＮ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＴ）が挙げられ、Zhao et al., 2017, CRISPR-offinder: a CRISPR guide RNA design and off-target searching tool for user-defined protospacer adjacent motif. Int J Biol Sci 2017; 13 (12): 1470-1478に記載されている。したがって、一般に使用されるＣａｓ９タンパク質は、標的配列および連続するＮＧＧ ＰＡＭを必要とするが、他の天然に存在するまたは操作されたＣａｓタンパク質は、緩やかなＰＡＭ要求性を有するまたは要求性を有さない。結果として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの賢明な選択を通じて、開業医は、転写活性化因子をリクルートするための標的として、ＨＴＲＡ１転写制御領域中のほとんどいずれのサブ配列も選択することができる。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター標的は、配列番号１３に見出される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター標的は、配列番号５に見出される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター標的は、配列番号８に見出される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター標的は、配列番号１３に見出される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１プロモーター標的は、配列番号７に見出される。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１エンハンサー標的は、配列番号１４（２ｋｂ領域）に見出される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１標的は、配列番号１４（２ｋｂ領域）または配列番号３４（４ｋｂ領域）に見出される。
【0054】
本発明により、ガイド配列は、ＨＴＲＡ１プロモーター配列（配列番号５、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号１３）の、または配列番号５、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号１３の逆相補体の、またはＨＴＲＡ１エンハンサー配列（配列番号１４もしくは３４）または配列番号１４もしくは３４の逆相補体の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個または約２０個の連続するヌクレオチドを含む標的配列にハイブリダイズする。
【0055】
一部の場合ではガイド配列は、上に示されるプロモーター配列の１０個以上の連続する塩基を含む。配列番号１３の１０個の連続する塩基を含む配列の例として、ＧＴＣＣＣＡＡＣＧＧ；ＴＣＣＣＡＡＣＧＧＡ；ＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴ；ＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧ；ＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣなどまたはこれらの逆相補体が挙げられる。配列番号１３の１０個以上の連続する塩基を含む配列は、配列番号１３の塩基１から１０をコードする、配列番号１３の塩基２～１１をコードする、配列番号１３の塩基３～１２をコードするなどの配列を含む。配列番号１３の１０以上の連続する塩基を含む配列は、ヌクレオチドが配列番号１３の塩基Ｘである配列を含み、ここでＸは１から３００であり、１０個の連続する塩基は配列番号１３のＸ＋Ｙに延長され、ここでＹは、ガイド配列がしばしば長さ５０塩基未満であるという条件で９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上である。１５個または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの配列は、同じ方法で記載され得る。例えば、一部の場合ではガイド配列は、配列番号１３（ＧＴＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣＡ；ＴＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣ；ＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣ；ＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡ；ＣＡＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＡ）またはこれらの逆相補体の１５個以上の連続する塩基を含む。
【0056】
１０、１５または２０ヌクレオチド配列のそれぞれおよびその相補体は表に列挙され、個々の配列または配列の組合せが、セットに含めるためまたはセットから除外するためにかかる表から個々に選択され得ることは認識される。すなわちかかる表は、個々の配列および組合せを選択または除外するための根拠を記載および提供する。上の記載がかかる表の代わりを目的とし、同じ内容を有することは理解される。
【0057】
実施例９（１４．９節）に記載されるとおり、本発明者らは、配列番号１５～３３と称する、配列番号１３中の標的領域に対応するガイド配列を有するｓｇＲＮＡを設計し、ＨＴＲＡ１プロモーターからの転写を活性化するそれらの能力を検査した。一部のアプローチでは、本方法において使用されるｇＲＮＡは、配列番号１５～３３の１つを含む配列を標的化する。
【0058】
一部の実施形態では、目的の遺伝子中の標的配列は、ｓｇＲＮＡのガイド領域に相補的であり得る。一般に、ｇＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間に正確な相補性または同一性があり、１００％未満である場合がある。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、１００％同一性がオフターゲット効果を回避するために望ましいが、１００％未満である場合がある。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド領域と目的の遺伝子の標的領域とは、少なくとも９５％同一（例えば、２０個の内１つミスマッチ）、少なくとも９０％同一または少なくとも８５％同一である場合がある。
【0059】
３．３ デリバリー
転写活性化因子タンパク質およびｇＲＮＡに融合されたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９）の細胞へのデリバリー方法は、周知である。融合タンパク質は、タンパク質形態で（例えば、微量注入を介して） デリバリーされ得る。さらに頻繁には、融合タンパク質は、ＤＮＡ形態で、例えばＲＰＥまたは脈絡膜細胞中に導入され得る好適なベクター中でデリバリーされる。一般に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現のためのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）の下流でベクターにクローニングされる。一部のアプローチでは、デリバリーは、Byrne et al., Methods Enzymol. 546, 119-38 (2014)；Cong et al., Science (80). 339, 819-823；Hirsch et al., Mol. Ther. 18, 6-8 (2010)に記載されるとおり、ウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による。一部のアプローチでは、デリバリーは、細胞由来ナノベシクルまたは他の方法による。下の７節も参照されたい。
転写活性化因子タンパク質およびｇＲＮＡに融合されたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９）の細胞へのデリバリー方法は、周知である。融合タンパク質は、タンパク質形態で（例えば、微量注入を介して） デリバリーされ得る。さらに頻繁には、融合タンパク質は、ＤＮＡ形態で、例えばＲＰＥまたは脈絡膜細胞中に導入され得る好適なベクター中でデリバリーされる。一般に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現のためのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）の下流でベクターにクローニングされる。一部のアプローチでは、デリバリーは、Byrne et al., Methods Enzymol. 546, 119-38 (2014)；Cong et al., Science (80). 339, 819-823；Hirsch et al., Mol. Ther. 18, 6-8 (2010)に記載されるとおり、ウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による。一部のアプローチでは、デリバリーは、細胞由来ナノベシクルまたは他の方法による。下の７節も参照されたい。
【0060】
３．４ 相乗的活性化メディエーター
一部のアプローチでは、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）として周知のＣＲＩＳＰＲａシステムはＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者においてＨＴＲＡ１の発現を増加させるために使用される。ＳＡＭシステムは、複数の転写因子を使用し、Ｃａｓ９媒介遺伝子活性化の強度をさらに改善できる。Konermann et al., Nature, January 29; 517(7536) 2015］を参照されたい、関連する開示は、本明細書に参照により組み込まれる。一部の場合では、このシステムは、２つのプラスミドを使用し、一方はｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－転写活性化因子、例えばｄＣａｓ９ＶＰ６４分子の両方をコードし、他方はＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質をコードする。ＭＳ２－ＴＡＤは、ＭＳ２ポリペプチドおよび少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む。一部のアプローチではＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチド（配列番号５６）ならびにｐ６５およびＨＳＦ１のトランス活性化ドメインを含む（ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）。ＳＡＭシステムにおいて使用されるｓｇＲＮＡは、ＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質に結合できる１つまたは複数のＭＳ２結合配列（例えば、配列番号５５）を含む。一部の実施形態では、２つのＭＳ２結合配列がｇＲＮＡに含まれている：１つはテトラループに、１つはｇＲＮＡのステムループに。ＭＳ２－ＴＡＤ（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）をコードするプラスミドは、商業的に入手できる、例えば、ＬｅｎｔｉＭＰＨ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質をコードするプラスミドは、好適なｓｇＲＮＡコード配列を、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４コード配列を保有するプラスミドにクローニングすることによってコンストラクトされ得る。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４コード配列を保有するプラスミドも商業的に入手できる、例えばＡｄｄｇｅｎｅ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのＬｅｎｔｉＳＡＭ ｐｌａｓｍｉｄ。ｓｇＲＮＡコード配列は、ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドにクローニングされたクローンであってよい。
一部のアプローチでは、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）として周知のＣＲＩＳＰＲａシステムはＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者においてＨＴＲＡ１の発現を増加させるために使用される。ＳＡＭシステムは、複数の転写因子を使用し、Ｃａｓ９媒介遺伝子活性化の強度をさらに改善できる。Konermann et al., Nature, January 29; 517(7536) 2015］を参照されたい、関連する開示は、本明細書に参照により組み込まれる。一部の場合では、このシステムは、２つのプラスミドを使用し、一方はｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－転写活性化因子、例えばｄＣａｓ９ＶＰ６４分子の両方をコードし、他方はＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質をコードする。ＭＳ２－ＴＡＤは、ＭＳ２ポリペプチドおよび少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む。一部のアプローチではＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチド（配列番号５６）ならびにｐ６５およびＨＳＦ１のトランス活性化ドメインを含む（ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）。ＳＡＭシステムにおいて使用されるｓｇＲＮＡは、ＭＳ２－ＴＡＤ融合タンパク質に結合できる１つまたは複数のＭＳ２結合配列（例えば、配列番号５５）を含む。一部の実施形態では、２つのＭＳ２結合配列がｇＲＮＡに含まれている：１つはテトラループに、１つはｇＲＮＡのステムループに。ＭＳ２－ＴＡＤ（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）をコードするプラスミドは、商業的に入手できる、例えば、ＬｅｎｔｉＭＰＨ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質をコードするプラスミドは、好適なｓｇＲＮＡコード配列を、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４コード配列を保有するプラスミドにクローニングすることによってコンストラクトされ得る。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４コード配列を保有するプラスミドも商業的に入手できる、例えばＡｄｄｇｅｎｅ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのＬｅｎｔｉＳＡＭ ｐｌａｓｍｉｄ。ｓｇＲＮＡコード配列は、ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドにクローニングされたクローンであってよい。
【0061】
３．５ エンハンサー結合部位
一部のアプローチでは、内在性ＨＴＲＡ１遺伝子からの転写は、転写活性化因子のＨＴＲＡ１ ２ｋｂ（エンハンサー）領域中の部位への結合によって増加する。下に詳細に考察されるとおり、本発明者らは、ｒｓ３６２１２７３３のリスク対立遺伝子に重複する転写活性化因子ＬＨＸ２に対する結合モチーフを同定した。遺伝的および実験的証拠についてのいくつかのラインは、リスク対立遺伝子へのＬＨＸ２結合がない、または非リスク対立遺伝子への結合と比較して減少しており、これがＨＴＲＡ１の発現の低減を生じさせていることを示唆している。１つのアプローチでは、Ｃａｓタンパク質に融合されたＬＨＸ２ ＬＩＭドメインは、適切なガイドＲＮＡと組み合わされ、リスク対立遺伝子を保有する患者においてＬＨＸ２リスク結合部位にリクルートされる。リスク対立遺伝子結合部位付近へのＬＨＸ２のデリバリーは、転写活性化因子のテザリングがＬＨＸ２の局所濃度を効果的に増加させ、結合でのリスク変動の負の影響を除外または軽減し、ＨＴＲＡ１の発現の増加を生じることから、遺伝子発現の増加を生じると考えられている。別のアプローチでは、ＬＨＸ２転写活性化因子は、リスク対立遺伝子配列に効率的に結合するように改変され、それにより転写の増加を生じる。
一部のアプローチでは、内在性ＨＴＲＡ１遺伝子からの転写は、転写活性化因子のＨＴＲＡ１ ２ｋｂ（エンハンサー）領域中の部位への結合によって増加する。下に詳細に考察されるとおり、本発明者らは、ｒｓ３６２１２７３３のリスク対立遺伝子に重複する転写活性化因子ＬＨＸ２に対する結合モチーフを同定した。遺伝的および実験的証拠についてのいくつかのラインは、リスク対立遺伝子へのＬＨＸ２結合がない、または非リスク対立遺伝子への結合と比較して減少しており、これがＨＴＲＡ１の発現の低減を生じさせていることを示唆している。１つのアプローチでは、Ｃａｓタンパク質に融合されたＬＨＸ２ ＬＩＭドメインは、適切なガイドＲＮＡと組み合わされ、リスク対立遺伝子を保有する患者においてＬＨＸ２リスク結合部位にリクルートされる。リスク対立遺伝子結合部位付近へのＬＨＸ２のデリバリーは、転写活性化因子のテザリングがＬＨＸ２の局所濃度を効果的に増加させ、結合でのリスク変動の負の影響を除外または軽減し、ＨＴＲＡ１の発現の増加を生じることから、遺伝子発現の増加を生じると考えられている。別のアプローチでは、ＬＨＸ２転写活性化因子は、リスク対立遺伝子配列に効率的に結合するように改変され、それにより転写の増加を生じる。
【0062】
転写活性化因子結合部位と一致したリスク対立遺伝子が、転写活性化因子の結合を低減し得るまたは他に影響を与え得る、および低いＨＴＲＡ１発現を生じる、ならびに対応する転写活性化因子を部位にリクルートすることがＨＴＲＡ１発現を増加させることができるという発見に一部基づいて、２ｋｂ領域の考察が転写活性化因子結合モチーフと一致する他のリスク関連配列多様性を同定するために実施された。ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ３７５０８４８およびｒｓ６２１２７３３でのリスク対立遺伝子［すなわち、リスク関連変異体（ｖａｒｉａｎｔｅ）］の分析は、リスク関連ＳＮＰと一致するいくつかの結合モチーフを（ＬＸＨ２モチーフに加えて）同定した。
ｒｓ１４４２２４５５０（１０：１２２４５５０８４－１２２４５５０８５）；Ｎｋｘ２－５（ｖａｒ２）；ＮＦＩＸ；
ｒｓ３６２１２７３３（１０：１２２４５５６９５）；ＭＥＦ２Ａ；ＨＯＸＢ４；ＡＬＸ３；ＨＯＸＤ３；ＬＢＸ１；ＨＯＸＤ４；ＶＡＸ１；ＬＢＸ１；ＶＳＸ１；ＶＳＸ２、ＬＨＸ９；ＭＮＸ１；ＰＤＸ１；ＥＭＸ１；ＰＲＲＸ２；ＢＡＲＸ２；
ｒｓ１０４９０９２４（１０：１２２４５４９３２）ＲＨＯＸＦ；Ｍｙｏｇ；ＴＣＦ１２；ＡＳＣＬ１；Ａｓｃｌ２；ＮＨＬＨ１；ＢＨＬＨＡ１５ ｖａｒ２
ｒｓ３７５０８４８（１０：１２２４５５７９９）；ＹＹ１；ＢＡＲＸ２；
ｒｓ１４４２２４５５０（１０：１２２４５５０８４－１２２４５５０８５）；Ｎｋｘ２－５（ｖａｒ２）；ＮＦＩＸ；
ｒｓ３６２１２７３３（１０：１２２４５５６９５）；ＭＥＦ２Ａ；ＨＯＸＢ４；ＡＬＸ３；ＨＯＸＤ３；ＬＢＸ１；ＨＯＸＤ４；ＶＡＸ１；ＬＢＸ１；ＶＳＸ１；ＶＳＸ２、ＬＨＸ９；ＭＮＸ１；ＰＤＸ１；ＥＭＸ１；ＰＲＲＸ２；ＢＡＲＸ２；
ｒｓ１０４９０９２４（１０：１２２４５４９３２）ＲＨＯＸＦ；Ｍｙｏｇ；ＴＣＦ１２；ＡＳＣＬ１；Ａｓｃｌ２；ＮＨＬＨ１；ＢＨＬＨＡ１５ ｖａｒ２
ｒｓ３７５０８４８（１０：１２２４５５７９９）；ＹＹ１；ＢＡＲＸ２；
【0063】
本発明の態様により、上に列挙される転写活性化因子由来のエフェクタードメイン、例えばＬＸＨ２由来のＬＩＭドメインを、ＨＴＲＡ１発現を増加させるように対応する結合モチーフに位置させる（例えば、ＣＲＩＳＰＲａを使用する）。注目すべきことに、ＮＦＩＸ、ＭＥＦ２ＡおよびＹＹ１は、ＲＮＡ配列データに基づいて１より大きなＦＰＫＭでＲＰＥにおいて発現される。本発明の種々の態様では、ＨＴＲＡ１発現は、ＮＦＩＸ、ＭＥＦ２ＡおよびＹＹ１のいずれか１つのその対応する結合モチーフへの結合によって増加する。
【0064】
一般に、適切なガイドＲＮＡのためのガイド配列は、リスク関連ヌクレオチドの末端２０塩基以内、時に５０塩基以内および時に１００塩基以内の標的配列に結合する。
【0065】
３．６ 他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの文脈内で一般に記載される。（ａ）核酸の配列特異的な（「プログラム可能な」）改変および（ｂ）転写活性化因子のプロモーターおよびエンハンサー領域への配列特異的なリクルートメントのための他のシステムも使用され得る。そのようなシステムの例として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ホーミングエンドヌクレアーゼシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはＣｒｅリコンビナーゼシステム（例えば、潜在性ｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ誘導組換え）が挙げられる。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび配列または眼細胞における発現を改変するためのナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡガイドポリペプチドの使用は、Yanik et al., 2017, In vivo genome editing as a potential treatment strategy for inherited retinal dystrophies Progress in Retinal and Eye Research 56: 1-18に記載されている。同様にそれぞれ本明細書に参照により組み込まれる、Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221) , 1-7(2013)；Urnov et al., 2010, "Genome editing with engineered zinc finger nucleases," Nat Rev Genet. 11(9): 636-46；Sun et al., 2013, "Transcription activator-like effector nucleases (TALENs): a highly efficient and versatile tool for genome editing," Biotechnol Bioeng. 110(7):1811-21；Sengupta et al., 2017, "Viral Cre-LoxP tools aid genome modification in mammalian cells" J. Biological Engineering 11:45、（Ｃｒｅ－Ｌｏｘのためのレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスデリバリーシステムを記載している）およびNagy 2, "Cre recombinase:the universal reagent for genome tailoring," Genesis, 26(2):99-109、も参照されたい。各ゲノム改変法では、特異的核酸配列は標的化され、続く改変が作製される。これらの改変は、相同組換え、非相同性末端連結、相同性指向修復、ヒストン改変、転写活性化、ＲＮＡ編集、転写抑制によって編集される標的配列を含む。加えて、切断を伴わない操作の例は、Thakore et al. 2018によって"RNA-guided transcriptional silencing in vivo with S. aureus CRISPR-Cas9 repressors" Nat Commun .9(1):1674において、およびAmabile et al. 2016によって"Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing" Cell 167(1): 219-232.e14.において記載されている。［００６０］一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、１つまたは複数の亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、または配列特異的様式でＤＮＡに結合し、ヌクレアーゼに融合されているそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、その構造が亜鉛イオンの配位を通じて安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つもしくは複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしば亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの文脈内で一般に記載される。（ａ）核酸の配列特異的な（「プログラム可能な」）改変および（ｂ）転写活性化因子のプロモーターおよびエンハンサー領域への配列特異的なリクルートメントのための他のシステムも使用され得る。そのようなシステムの例として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ホーミングエンドヌクレアーゼシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはＣｒｅリコンビナーゼシステム（例えば、潜在性ｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ誘導組換え）が挙げられる。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび配列または眼細胞における発現を改変するためのナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡガイドポリペプチドの使用は、Yanik et al., 2017, In vivo genome editing as a potential treatment strategy for inherited retinal dystrophies Progress in Retinal and Eye Research 56: 1-18に記載されている。同様にそれぞれ本明細書に参照により組み込まれる、Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221) , 1-7(2013)；Urnov et al., 2010, "Genome editing with engineered zinc finger nucleases," Nat Rev Genet. 11(9): 636-46；Sun et al., 2013, "Transcription activator-like effector nucleases (TALENs): a highly efficient and versatile tool for genome editing," Biotechnol Bioeng. 110(7):1811-21；Sengupta et al., 2017, "Viral Cre-LoxP tools aid genome modification in mammalian cells" J. Biological Engineering 11:45、（Ｃｒｅ－Ｌｏｘのためのレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスデリバリーシステムを記載している）およびNagy 2, "Cre recombinase:the universal reagent for genome tailoring," Genesis, 26(2):99-109、も参照されたい。各ゲノム改変法では、特異的核酸配列は標的化され、続く改変が作製される。これらの改変は、相同組換え、非相同性末端連結、相同性指向修復、ヒストン改変、転写活性化、ＲＮＡ編集、転写抑制によって編集される標的配列を含む。加えて、切断を伴わない操作の例は、Thakore et al. 2018によって"RNA-guided transcriptional silencing in vivo with S. aureus CRISPR-Cas9 repressors" Nat Commun .9(1):1674において、およびAmabile et al. 2016によって"Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing" Cell 167(1): 219-232.e14.において記載されている。［００６０］一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、１つまたは複数の亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、または配列特異的様式でＤＮＡに結合し、ヌクレアーゼに融合されているそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、その構造が亜鉛イオンの配位を通じて安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つもしくは複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしば亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
【0066】
ＺＦＰの内で優れているのは、特異的ＤＮＡ配列、典型的には９～１８ヌクレオチド長を標的化し、個々のフィンガーのアセンブリによって生成される人工ＺＦＰドメインである。ＺＦＰは、単一のフィンガードメインが長さおよそ３０アミノ酸であり、亜鉛を介して単一のベータターンの２つのシステインと配位された２つの不変異体インバリアントヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスを含有し、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのフィンガーを有するものを含む。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、亜鉛フィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３および６）にアミノ酸置換を作製することによって変更され得る。したがって一部の実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在しない、例えば、選択された標的部位に結合するように操作されている。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；第２００７／０２１８５２８号；第２００５／０２６７０６１号を参照されたい、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0067】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥＮ、または標的化ヌクレアーゼを形成するようにＤＮＡ切断ドメインに融合された他のＤＮＡ標的化タンパク質であるかまたは含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１つまたは複数のＤＮＡ標的化タンパク質由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）を含む。一部の実施形態では切断ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉ由来である。一般にＦｏｋ Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドで、および他方の認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照されたい。
【0068】
用語「プログラム可能なヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲファミリーＣａｓヌクレアーゼまたはその誘導体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはその誘導体およびホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはその誘導体を指し得る。
【0069】
４．リスク形態を非リスク形態を用いて置き換えるための遺伝子編集
一部のアプローチでは、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法は、１つまたは複数のリスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子を用いて変換または置換することによって患者のＲＰＥ細胞のゲノムＤＮＡを改変するための薬剤を投与することを含む。ある特定の実施形態では、対立遺伝子は、２．０ｋｂリスク領域中にある（例えば、実施例５および図１３を参照されたい）。
一部のアプローチでは、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法は、１つまたは複数のリスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子を用いて変換または置換することによって患者のＲＰＥ細胞のゲノムＤＮＡを改変するための薬剤を投与することを含む。ある特定の実施形態では、対立遺伝子は、２．０ｋｂリスク領域中にある（例えば、実施例５および図１３を参照されたい）。
【0070】
４．１ リスク対立遺伝子の修復
一部のアプローチでは、２ｋｂ領域中の１つまたは複数のリスク対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡが使用される。これらのリスク対立遺伝子として、これだけに限らないが、ｒｓ１０４９０９２４（リスク対立遺伝子はＴである）、ｒｓ１４４２２４５５０（リスク対立遺伝子はＧＴ挿入である）、ｒｓ３６２１２７３１（リスク対立遺伝子はＴである）、ｒｓ３６２１２７３３（リスク対立遺伝子はＣである）、ｒｓ３７５０８４８（リスク対立遺伝子はＧである）、ｒｓ３７５０８４７（リスク対立遺伝子はＴである）およびｒｓ３７５０８４６（リスク対立遺伝子はＣである）が挙げられる。これらのリスク対立遺伝子を標的化するために使用され得る例示的なｓｇＲＮＡｓ／ガイド配列は、下の表１に示されている。太字のヌクレオチドは、リスク対立遺伝子中に見出される。
一部のアプローチでは、２ｋｂ領域中の１つまたは複数のリスク対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡが使用される。これらのリスク対立遺伝子として、これだけに限らないが、ｒｓ１０４９０９２４（リスク対立遺伝子はＴである）、ｒｓ１４４２２４５５０（リスク対立遺伝子はＧＴ挿入である）、ｒｓ３６２１２７３１（リスク対立遺伝子はＴである）、ｒｓ３６２１２７３３（リスク対立遺伝子はＣである）、ｒｓ３７５０８４８（リスク対立遺伝子はＧである）、ｒｓ３７５０８４７（リスク対立遺伝子はＴである）およびｒｓ３７５０８４６（リスク対立遺伝子はＣである）が挙げられる。これらのリスク対立遺伝子を標的化するために使用され得る例示的なｓｇＲＮＡｓ／ガイド配列は、下の表１に示されている。太字のヌクレオチドは、リスク対立遺伝子中に見出される。
【0071】
【表1】
【0072】
ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質および非リスク対立遺伝子の配列を含む鋳型修復ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のウイルスベクター中でＲＰＥ細胞に導入され得る。鋳型修復配列は、切断部位の各側に一定量の重複（相同）を一般に必要とする。単一ヌクレオチドの修復のために、ドナー鋳型の「相同アーム」は、およそ２００～５００ヌクレオチドであるべきである。より長い修復（例えば、２ｋｂ領域全体）のために、各相同アームは、およそ５００～８００ヌクレオチドであるべきである。これは、リスク対立遺伝子が野生型対立遺伝子を用いて置き換えられることを生じ、それによりＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者におけるＲＰＥ細胞中のＨＴＲＡ１発現は、正常レベルに回復される。例示的な修復配列は、表２に示される。
【0073】
【表2】
【0074】
ガイド配列が標的ＳＮＰと直接重複する必要がないことは理解される。ｓｇＲＮＡがＳＮＰに近いまたは隣接している場合、欠損ＳＮＰの相同性指向修復を可能にするために十分である。この文脈では、「に隣接する」は、ガイド配列ヌクレオチドにハイブリダイズする最も近いヌクレオチドが、ＳＮＰまたは他の修復部位から２５ヌクレオチド以内、好ましくは２０ヌクレオチド以内、および時に１５または１０ヌクレオチド以内であることを意味する。
【0075】
４．２ ＨＴＲＡ１転写制御領域中の広い領域の置換
一部のアプローチでは、ｇＲＮＡの対は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者由来のＲＰＥ細胞中の２ｋｂリスク領域全体を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用される。ｓｇＲＮＡの対は、２つのヌクレオチド位置、２ｋｂリスク領域を包含する２つの位置によって定義される領域を標的化するように設計される。一部のアプローチでは、ｓｇＲＮＡは、配列番号５０および列番号５２である。一部のアプローチでは、ｓｇＲＮＡ対は、配列番号５１および配列番号５２である。ｓｇＲＮＡの対およびＣａｓ９のＲＰＥ細胞への導入は、２ｋｂ領域を包含する領域の除去を生じる。欠失領域に対応する非リスク配列をコードし、５’切断部位の上流および３’切断部位の下流の５００～８００ｎｔの追加的ゲノム配列を含有するプラスミドは、非リスク配列が相同性指向修復によって欠失領域に挿入され、２ｋｂリスク領域が非リスク配列で置き換えられるように、ＲＰＥ細胞に導入される。ｓｇＲＮＡ対、Ｃａｓ９および非リスク鋳型配列をコードするプラスミドは、同じまたは異なるウイルスベクターに導入されてよく、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者のＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させるように同時にまたは逐次的に導入され得る。
一部のアプローチでは、ｇＲＮＡの対は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者由来のＲＰＥ細胞中の２ｋｂリスク領域全体を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用される。ｓｇＲＮＡの対は、２つのヌクレオチド位置、２ｋｂリスク領域を包含する２つの位置によって定義される領域を標的化するように設計される。一部のアプローチでは、ｓｇＲＮＡは、配列番号５０および列番号５２である。一部のアプローチでは、ｓｇＲＮＡ対は、配列番号５１および配列番号５２である。ｓｇＲＮＡの対およびＣａｓ９のＲＰＥ細胞への導入は、２ｋｂ領域を包含する領域の除去を生じる。欠失領域に対応する非リスク配列をコードし、５’切断部位の上流および３’切断部位の下流の５００～８００ｎｔの追加的ゲノム配列を含有するプラスミドは、非リスク配列が相同性指向修復によって欠失領域に挿入され、２ｋｂリスク領域が非リスク配列で置き換えられるように、ＲＰＥ細胞に導入される。ｓｇＲＮＡ対、Ｃａｓ９および非リスク鋳型配列をコードするプラスミドは、同じまたは異なるウイルスベクターに導入されてよく、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者のＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させるように同時にまたは逐次的に導入され得る。
【0076】
【表3】
【0077】
５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
一部のアプローチでは、ＣＲＩＳＰＲ技術は、Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子を保有する個体において１つまたは複数のヌクレオチド置換をＲＰＥまたは脈絡膜細胞のゲノムＤＮＡに導入するために使用され、それにより１つまたは複数のリスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子を用いて置換する。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来性核酸に対する防御のための細菌のシステムの広範なクラスを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、亜型、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型を含む。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ媒介ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を、外来性核酸を認識および切断するためにガイドおよび活性化ＲＮＡとの複合体で使用する。Ｃａｓタンパク質の非限定的例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても周知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログまたはこれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は、周知である。例えば化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受入番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて見出すことができる。Ｃａｓ９タンパク質中の突然変異の非限定的例は、当技術分野において周知であり（例えば、ＷＯ２０１５／１６１２７６を参照されたい）、そのいずれも、提供される方法と合致してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに含まれ得る。Ｃａｓ９ホモログは、これだけに限らないが、次の分類学的群の細菌を含む多種多様な真正細菌において見出される：アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、バクテロイデス・クロロビ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、クラミジア・ベルコミクロビア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、クロロフレキシ（Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）およびテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）。例示的なＣａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。追加的なＣａｓ９タンパク質およびそのホモログは、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10 (5):726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477；Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7;およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記載されている。Ｃａｓ９およびそのホモログは、目的のゲノム領域、例えば１つまたは複数のＣｈｒ１０リスク対立遺伝子を含むゲノム領域に特異的改変を導入するためにｓｇＲＮＡと共に使用され得る。
一部のアプローチでは、ＣＲＩＳＰＲ技術は、Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子を保有する個体において１つまたは複数のヌクレオチド置換をＲＰＥまたは脈絡膜細胞のゲノムＤＮＡに導入するために使用され、それにより１つまたは複数のリスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子を用いて置換する。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来性核酸に対する防御のための細菌のシステムの広範なクラスを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、亜型、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型を含む。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ媒介ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を、外来性核酸を認識および切断するためにガイドおよび活性化ＲＮＡとの複合体で使用する。Ｃａｓタンパク質の非限定的例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても周知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログまたはこれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は、周知である。例えば化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受入番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて見出すことができる。Ｃａｓ９タンパク質中の突然変異の非限定的例は、当技術分野において周知であり（例えば、ＷＯ２０１５／１６１２７６を参照されたい）、そのいずれも、提供される方法と合致してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに含まれ得る。Ｃａｓ９ホモログは、これだけに限らないが、次の分類学的群の細菌を含む多種多様な真正細菌において見出される：アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、バクテロイデス・クロロビ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、クラミジア・ベルコミクロビア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、クロロフレキシ（Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）およびテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）。例示的なＣａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。追加的なＣａｓ９タンパク質およびそのホモログは、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10 (5):726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477；Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7;およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記載されている。Ｃａｓ９およびそのホモログは、目的のゲノム領域、例えば１つまたは複数のＣｈｒ１０リスク対立遺伝子を含むゲノム領域に特異的改変を導入するためにｓｇＲＮＡと共に使用され得る。
【0078】
２ｋｂリスク領域中のリスク対立遺伝子を変換するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいても使用され得る他のＲＮＡ媒介ヌクレアーゼとして、例えば、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓｃａｄｅ／Ｃａｓ３が挙げられる。その関連部分が本明細書に参照により組み込まれる、Pickar-Oliver and Gersbach, Nature, vol. 20, August 2019を参照されたい。Ｃａｓ１２ａは、３’ＰＡＭの隣に位置するｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）中のスペーサーに相補性を有する標的配列を認識する。標的認識は、ねじれ型ＤＮＡ二重鎖切断の生成を生じる。Ｃａｓｃａｄｅ／Ｃａｓ３は、ｃｒＲＮＡのスペーサー部分に相補性を有し、３’ＰＡＭの隣に位置しており、一鎖ニックを生成するＤＮＡを標的化する多量体複合体である。
【0079】
したがって一部のアプローチでは、方法は、個々のＣＲＩＳＰＲシステムをＲＰＥ細胞に導入することを含み、ここでシステムは、Ｃａｓ９タンパク質、および標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９は、システムの同じまたは異なるベクターから発現され得る。加えて、切断部位に重複する非リスクヌクレオチド配列をコードするドナーベクターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラスミドと共にデリバリーされる。ガイドＲＮＡは、リスク対立遺伝子を含むかまたはその近くの配列を標的化し、Ｃａｓ９タンパク質はゲノムＤＮＡ分子を切断する。切断されたゲノムＤＮＡは、ドナー配列プラスミドを使用して相同組換えによって修復され、リスク対立遺伝子から非リスク対立遺伝子へのゲノム配列における変化を生じる。上に記載されるいずれのリスク対立遺伝子も非リスク対立遺伝子に変換され得る。一部のアプローチでは、２．０ｋｂ領域全体（実施例５を参照されたい）または４ｋｂ ＡＭＤリスク領域全体（実施例３を参照されたい）は、Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子を含まず、ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を回復するように変換される。
【0080】
５．１ Ｃａｓ９ニッカーゼ
一部のアプローチでは、Ｃａｓ９ニッカーゼベースＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、個々のリスク対立遺伝子を補正するために使用され得る。未改変Ｃａｓ９タンパク質と比較して、ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、そのヌクレアーゼドメインの１つに突然変異を含有する。そのため、Ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、標的ＤＮＡに「ニックを入れる」、すなわち標的部位に、未改変Ｃａｓ９を用いた二重鎖切断よりも単一鎖ＤＮＡ切断を生じる。一例では、ｄＣａｓ９は、その２つのヌクレアーゼドメインのそれぞれに突然変異を含有する一方で、Ｃａｓ９ニッカーゼは、そのヌクレアーゼドメインの１つにだけ突然変異を含有する。本明細書に記載される他のＣＲＩＳＰＲアプローチにおいてと同様に、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ニッカーゼを特定のゲノム位置に標的化できる。ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、シトシン塩基をウラシル塩基（チミン塩基の塩基対合特性を有する）に変換するシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはＣＤＡ１）、およびアデノシン塩基をイノシン塩基（グアノシンの塩基対合特性を有する）に変換するアデニンデアミナーゼなどの塩基編集タンパク質と共に導入される。これらの変換は、Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対に（シチジンデアミナーゼ）またはＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対（アデニンデアミナーゼ）に変更する効果を有する。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくＣａｓ９ニッカーゼは、塩基編集効率を促進するために細胞性ＤＮＡ修復応答の阻害物質も含む。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡからウラシル塩基の除去を触媒することについて、細胞中のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素を妨げるために使用され得る。ウラシルの除去は、編集されたウラシルをシトシンに戻す復帰突然変異をもたらし得る。Ｃａｓ９ニッカーゼベース遺伝子編集システムは、十分周知であり、例えば、Komor et al., Nature, 533 (7603): 420-424 (2016)に記載されている。一例ではシステムは１６アミノ酸残基ＸＴＥＮリンカーを用いてＣａｓ９ニッカーゼのＮ末端に融合されたシチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ１）、およびＣａｓ９ニッカーゼのＣ末端に融合されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）を含む［例えば、Komor Et al., Nature, 533 (7603): 420-424 (2016)でのエディタＢＥ３］。かかるシステムは、低率のインデル（すなわち、わずかな欠失または挿入）形成およびオフターゲット活性（すなわち、ガイドＲＮＡによって標的化される遺伝子座以外のゲノム位置での編集またはインデル形成）を有して、Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対にインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で効率的に編集できる。一部の場合では、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結された編集タンパク質は、リンカー配列の長さに応じて複数の塩基を標的化できる。例えば、１６残基ＸＴＥＮリンカーを用いてｄＣａｓ９に融合されたＡＰＯＢＥＣ１は、およそ５ヌクレオチドのウインドウ内の、典型的には、プロトスペーサー隣接モチーフに対して遠位末端側を１位として数えてプロトスペーサー配列内の４から８位のシトシン塩基を脱アミノ化できる［例えば、Komor et al., Nature, 533(7603): 420-424 (2016)を参照されたい］。一部のアプローチでは、ガイドＲＮＡ配列は、かかるウインドウ内の１つまたは複数の塩基を標的化するように設計され得る。
一部のアプローチでは、Ｃａｓ９ニッカーゼベースＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、個々のリスク対立遺伝子を補正するために使用され得る。未改変Ｃａｓ９タンパク質と比較して、ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、そのヌクレアーゼドメインの１つに突然変異を含有する。そのため、Ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、標的ＤＮＡに「ニックを入れる」、すなわち標的部位に、未改変Ｃａｓ９を用いた二重鎖切断よりも単一鎖ＤＮＡ切断を生じる。一例では、ｄＣａｓ９は、その２つのヌクレアーゼドメインのそれぞれに突然変異を含有する一方で、Ｃａｓ９ニッカーゼは、そのヌクレアーゼドメインの１つにだけ突然変異を含有する。本明細書に記載される他のＣＲＩＳＰＲアプローチにおいてと同様に、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ニッカーゼを特定のゲノム位置に標的化できる。ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、シトシン塩基をウラシル塩基（チミン塩基の塩基対合特性を有する）に変換するシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはＣＤＡ１）、およびアデノシン塩基をイノシン塩基（グアノシンの塩基対合特性を有する）に変換するアデニンデアミナーゼなどの塩基編集タンパク質と共に導入される。これらの変換は、Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対に（シチジンデアミナーゼ）またはＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対（アデニンデアミナーゼ）に変更する効果を有する。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づくＣａｓ９ニッカーゼは、塩基編集効率を促進するために細胞性ＤＮＡ修復応答の阻害物質も含む。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡからウラシル塩基の除去を触媒することについて、細胞中のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素を妨げるために使用され得る。ウラシルの除去は、編集されたウラシルをシトシンに戻す復帰突然変異をもたらし得る。Ｃａｓ９ニッカーゼベース遺伝子編集システムは、十分周知であり、例えば、Komor et al., Nature, 533 (7603): 420-424 (2016)に記載されている。一例ではシステムは１６アミノ酸残基ＸＴＥＮリンカーを用いてＣａｓ９ニッカーゼのＮ末端に融合されたシチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ１）、およびＣａｓ９ニッカーゼのＣ末端に融合されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）を含む［例えば、Komor Et al., Nature, 533 (7603): 420-424 (2016)でのエディタＢＥ３］。かかるシステムは、低率のインデル（すなわち、わずかな欠失または挿入）形成およびオフターゲット活性（すなわち、ガイドＲＮＡによって標的化される遺伝子座以外のゲノム位置での編集またはインデル形成）を有して、Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対にインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で効率的に編集できる。一部の場合では、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結された編集タンパク質は、リンカー配列の長さに応じて複数の塩基を標的化できる。例えば、１６残基ＸＴＥＮリンカーを用いてｄＣａｓ９に融合されたＡＰＯＢＥＣ１は、およそ５ヌクレオチドのウインドウ内の、典型的には、プロトスペーサー隣接モチーフに対して遠位末端側を１位として数えてプロトスペーサー配列内の４から８位のシトシン塩基を脱アミノ化できる［例えば、Komor et al., Nature, 533(7603): 420-424 (2016)を参照されたい］。一部のアプローチでは、ガイドＲＮＡ配列は、かかるウインドウ内の１つまたは複数の塩基を標的化するように設計され得る。
【0081】
一部のアプローチでは、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびガイドＲＮＡを発現するベクター配列は、導入遺伝子として宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。例えば、上に記載されるＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＵＧＩ融合物をコードする遺伝子配列はガイドＲＮＡと共に、プラスミドに組み込まれ、集団中の細胞にトランスフェクトされ得る。一部のアプローチでは、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集システム構成成分のデリバリーはウイルス、例えば、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集システム構成成分をコードするＤＮＡ配列は、５キロ塩基未満のゲノムパッケージングサイズ制限を有するＡＡＶでのパッケージングのためには大きすぎる。１つのアプローチでは、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集システム構成成分は、インテイン配列を使用する二重－ＡＡＶ戦略（ｄｕａｌ－ＡＡＶ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用してデリバリーされ得る。インテインは、それ自身を切り取ることができ、残りのタンパク質部分を合わせてスプライスできるタンパク質のセグメントである。前駆体タンパク質のインテインは、２つの遺伝子に由来する場合があり、その場合それらはスプリットインテインと称される。Levy et al., Nat. Biomed. Eng., 4(1): 97-110 (2020)に記載されるかかる二重－ＡＡＶ戦略の一例では、上に記載されるＢＥ３などのシトシン塩基エディターは、半分に分割されてよく、各半分はファスト－スプライシングスプリットインテイン（ｆａｓｔ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎ）の半分に融合される。これらの産物をコードする配列は、２つの別々のＡＡＶゲノムに、ガイドＲＮＡをコードする配列と共に組み込まれ、細胞に同時形質導入され得る。両方の産物が細胞で発現される場合、それらは一緒にスプライスされ、ＢＥ３などの全長塩基エディターの再構成をもたらす。
【0082】
６．ポリヌクレオチドをコードする外来性ＨＴＲＡ１タンパク質を導入することによる遺伝子治療を使用するＨＴＲＡ１発現の増加
一実施形態では、ＡＭＤを処置することは、ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増強するための遺伝子治療を含む。遺伝子治療は、十分周知の技術であり、例えば、すべての目的についてそれぞれ参照により組み込まれる、Moore et al., 2017, "GENE THERAPY FOR AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION" Expert Opinion on Biological Therapy 17:10: 1235-1244；Aponte-Ubillus et al., 2018, "MOLECULAR DESIGN FOR RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS (RAAV) VECTOR PRODUCTION" Applied microbiology and biotechnology 102.3:1045-1054；Ochakovski et al., 2017, "RETINAL GENE THERAPY: SURGICAL VECTOR DELIVERY IN THE TRANSLATION TO CLINICAL TRIALS" Frontiers in Neuroscience 11；Schoen et al., 2015, "RETINAL GENE DELIVERY BY ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) VECTORS: STRATEGIES AND APPLICATIONS" European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 95:343-352；Naso et al., 2017, "ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) AS A VECTOR FOR GENE THERAPY" BioDrugs 31:317；Dunbar et al., 2018, "GENE THERAPY COMES OF AGE" Science 359:6372；Penaud-Budloo et al., 2018., "PHARMACOLOGY OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS PRODUCTION" Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 8:166-180；に記載されている。
一実施形態では、ＡＭＤを処置することは、ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増強するための遺伝子治療を含む。遺伝子治療は、十分周知の技術であり、例えば、すべての目的についてそれぞれ参照により組み込まれる、Moore et al., 2017, "GENE THERAPY FOR AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION" Expert Opinion on Biological Therapy 17:10: 1235-1244；Aponte-Ubillus et al., 2018, "MOLECULAR DESIGN FOR RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS (RAAV) VECTOR PRODUCTION" Applied microbiology and biotechnology 102.3:1045-1054；Ochakovski et al., 2017, "RETINAL GENE THERAPY: SURGICAL VECTOR DELIVERY IN THE TRANSLATION TO CLINICAL TRIALS" Frontiers in Neuroscience 11；Schoen et al., 2015, "RETINAL GENE DELIVERY BY ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) VECTORS: STRATEGIES AND APPLICATIONS" European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 95:343-352；Naso et al., 2017, "ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) AS A VECTOR FOR GENE THERAPY" BioDrugs 31:317；Dunbar et al., 2018, "GENE THERAPY COMES OF AGE" Science 359:6372；Penaud-Budloo et al., 2018., "PHARMACOLOGY OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS PRODUCTION" Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 8:166-180；に記載されている。
【0083】
６．１ 外来性ＨＴＲＡ１タンパク質の発現
一部のアプローチでは、遺伝子治療は、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質をＲＰＥ細胞に導入するために実施される。一部のアプローチでは、導入される外来性ＨＴＲＡ１は、天然ＨＴＲＡ１タンパク質（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。一部のアプローチでは、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質は、配列番号２と異なるが、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を配列番号２のアミノ酸配列と共有するアミノ酸配列を有する。一部のアプローチでは、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質は、配列番号２とは異なる（すなわち、ＨＴＲＡ１変異体）が、ＨＴＲＡ１のセリンプロテアーゼ活性を維持している。ＨＴＲＡ１のセリンプロテアーゼ活性は、例えば、Grau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. April 26, 102 (17) 6021-6026 (2005)に記載されるとおり、当技術分野において十分周知の方法を使用して測定され得る。本開示の目的のために、セリンプロテアーゼ活性を維持することは、天然ＨＴＲＡ１タンパク質（配列番号２）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のセリンプロテアーゼ活性を有する外来性ＨＴＲＡ１タンパク質を指す。
一部のアプローチでは、遺伝子治療は、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質をＲＰＥ細胞に導入するために実施される。一部のアプローチでは、導入される外来性ＨＴＲＡ１は、天然ＨＴＲＡ１タンパク質（配列番号２）と同一のアミノ酸配列を有する。一部のアプローチでは、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質は、配列番号２と異なるが、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を配列番号２のアミノ酸配列と共有するアミノ酸配列を有する。一部のアプローチでは、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質は、配列番号２とは異なる（すなわち、ＨＴＲＡ１変異体）が、ＨＴＲＡ１のセリンプロテアーゼ活性を維持している。ＨＴＲＡ１のセリンプロテアーゼ活性は、例えば、Grau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. April 26, 102 (17) 6021-6026 (2005)に記載されるとおり、当技術分野において十分周知の方法を使用して測定され得る。本開示の目的のために、セリンプロテアーゼ活性を維持することは、天然ＨＴＲＡ１タンパク質（配列番号２）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のセリンプロテアーゼ活性を有する外来性ＨＴＲＡ１タンパク質を指す。
【0084】
一部のアプローチでは、遺伝子治療は、配列番号２の外来性ＨＴＲＡ１タンパク質、またはＨＴＲＡ１のセリンプロテアーゼ活性を有する変異体などの上に記載される変異体をコードする核酸配列（「カーゴ」）を含むベクターを投与することを含む。一部のアプローチでは、核酸配列は配列番号１を含む。一部のアプローチでは、核酸配列は、顕著な配列同一性、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％核酸配列同一性を配列番号１と共有する。一部のアプローチでは、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２に顕著な、例えば、配列番号２に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する。一部の場合では、ＨＴＲＡ１タンパク質をコードする核酸は、天然ＨＴＲＡ１核酸配列と比べて欠失、挿入または置換を含む配列を含み、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいまだ生じる。
【0085】
ＨＴＲＡ１核酸およびポリペプチドは、当業者に十分周知の方法を使用する化学的または酵素的変更を通じても修飾される場合がある。例えば配列は、脂質、糖、ペプチド、有機もしくは無機化合物の付加によって、修飾ヌクレオチドまたはアミノ酸などの含有によって修飾される場合がある。したがってＨＴＲＡ１核酸およびタンパク質は、別の成分（例えば、レポータータンパク質）にコンジュゲートされる場合があり、その存在は検出を促進する、または他の目的に役立ち得る。
【0086】
６．２ 遺伝子治療のためのベクター
ＨＴＲＡ１コード配列を導入するために好適なウイルスベクターとして、例示のために、限定ではなく、アデノウイルス、ＡＡＶ２ウイルス、レンチウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－Ｉ）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）が挙げられる。微小粒子として製剤化されたネイキッドＤＮＡなどの非ウイルスシステムも使用され得る。下の７節を参照されたい。
ＨＴＲＡ１コード配列を導入するために好適なウイルスベクターとして、例示のために、限定ではなく、アデノウイルス、ＡＡＶ２ウイルス、レンチウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－Ｉ）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）が挙げられる。微小粒子として製剤化されたネイキッドＤＮＡなどの非ウイルスシステムも使用され得る。下の７節を参照されたい。
【0087】
６．３ 遺伝子治療ベクターのためのプロモーター
一部のアプローチでは、デリバリーされる導入遺伝子（例えば、外来性ＨＴＲＡ１遺伝子、またはＲＰＥ細胞におけるその発現が内在性ＨＴＲＡ１遺伝子の発現を増加させ得る組換え核酸）は、プロモーター配列に作動可能に連結されたタンパク質コード配列を含む。一部のアプローチでは、プロモーターは、ＨＴＲＡ１ポリヌクレオチドに異種性である。一部のアプローチでは、プロモーターは、天然ＨＴＲＡ１プロモーターである（例えば、配列番号１３）。一部のアプローチでは、プロモーターは誘導性プロモーターである。一部のアプローチでは、プロモーターは、構成的プロモーターである。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１つより多いプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターである場合がある。一部のアプローチでは、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一般にプロモーターは、ヒト内在性ＲＰＥ特異的プロモーター配列の短縮バージョンである（例えば、ＲＰＥ６５－５０２２ヌクレオチドおよびＢＥＳＴ１－５４７９ヌクレオチド）。ＲＰＥ特異的プロモーターの非限定的例として、国際特許公開第ＷＯ２０２００１９００２号に記載される、ＢＥＳＴ１－ＥＰ－４５４；ＲＰＥ６５－ＥＰ－４１５；ｓｍＣＢＡ；ＣＢＡ；ＲＰＥ６５－ＥＰ－４１９；ｓｃｔｍＣＢＡ；またはＶＭＤ２が挙げられる。他のプロモーターまたは改変プロモーター（天然および合成を含む）は、これだけに限らないがＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、ＧＦＡＰ、ＰＡＩ１、ＩＣＡＭ、ｆｌｔ－１およびＣＦＴＲを含む本明細書において開示される治療用産生物の発現を調節するためにも使用され得る［それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Papadakis et al 2004; PROMOTERS AND CONTROL ELEMENTS: DESIGNING EXPRESSION CASSETTES FOR GENE THERAPY in Current Gene Therapy, 2004, 4, 89-113；Gray & Samulski 2011; VECTOR DESIGN AND CONSIDERATIONS FOR CNS APPLICATIONS in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders, ed. J. Glorioso (Washington, DC: Society for Neuroscience), 1-9. ；Trapani et al 2014; VECTOR PLATFORMS FOR GENE THERAPY OF INHERITED RETINOPATHIES Progress in Retinal and Eye Research 43 (2014) 108e128; Powell and Gray 2015). VIRAL EXPRESSION CASSETTE ELEMENTS TO ENHANCE TRANSGENE TARGET SPECIFICITY AND EXPRESSION IN GENE THERAPY Discov. Med. 2015 January ; 19(102): 49-57、を参照されたい。使用され得る追加的プロモーターとして、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって方向付けられるＴ７プロモーター、ファージラムダのメジャーオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーターおよび原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが周知である他の配列、およびこれらの種々の組合せが挙げられる。
一部のアプローチでは、デリバリーされる導入遺伝子（例えば、外来性ＨＴＲＡ１遺伝子、またはＲＰＥ細胞におけるその発現が内在性ＨＴＲＡ１遺伝子の発現を増加させ得る組換え核酸）は、プロモーター配列に作動可能に連結されたタンパク質コード配列を含む。一部のアプローチでは、プロモーターは、ＨＴＲＡ１ポリヌクレオチドに異種性である。一部のアプローチでは、プロモーターは、天然ＨＴＲＡ１プロモーターである（例えば、配列番号１３）。一部のアプローチでは、プロモーターは誘導性プロモーターである。一部のアプローチでは、プロモーターは、構成的プロモーターである。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１つより多いプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターである場合がある。一部のアプローチでは、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一般にプロモーターは、ヒト内在性ＲＰＥ特異的プロモーター配列の短縮バージョンである（例えば、ＲＰＥ６５－５０２２ヌクレオチドおよびＢＥＳＴ１－５４７９ヌクレオチド）。ＲＰＥ特異的プロモーターの非限定的例として、国際特許公開第ＷＯ２０２００１９００２号に記載される、ＢＥＳＴ１－ＥＰ－４５４；ＲＰＥ６５－ＥＰ－４１５；ｓｍＣＢＡ；ＣＢＡ；ＲＰＥ６５－ＥＰ－４１９；ｓｃｔｍＣＢＡ；またはＶＭＤ２が挙げられる。他のプロモーターまたは改変プロモーター（天然および合成を含む）は、これだけに限らないがＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、ＧＦＡＰ、ＰＡＩ１、ＩＣＡＭ、ｆｌｔ－１およびＣＦＴＲを含む本明細書において開示される治療用産生物の発現を調節するためにも使用され得る［それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Papadakis et al 2004; PROMOTERS AND CONTROL ELEMENTS: DESIGNING EXPRESSION CASSETTES FOR GENE THERAPY in Current Gene Therapy, 2004, 4, 89-113；Gray & Samulski 2011; VECTOR DESIGN AND CONSIDERATIONS FOR CNS APPLICATIONS in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders, ed. J. Glorioso (Washington, DC: Society for Neuroscience), 1-9. ；Trapani et al 2014; VECTOR PLATFORMS FOR GENE THERAPY OF INHERITED RETINOPATHIES Progress in Retinal and Eye Research 43 (2014) 108e128; Powell and Gray 2015). VIRAL EXPRESSION CASSETTE ELEMENTS TO ENHANCE TRANSGENE TARGET SPECIFICITY AND EXPRESSION IN GENE THERAPY Discov. Med. 2015 January ; 19(102): 49-57、を参照されたい。使用され得る追加的プロモーターとして、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって方向付けられるＴ７プロモーター、ファージラムダのメジャーオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーターおよび原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが周知である他の配列、およびこれらの種々の組合せが挙げられる。
【0088】
外来性ＨＴＲＡ１遺伝子または導入遺伝子は、エンハンサーまたは活性化因子配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、ならびにポリアデニル化配列などの他の制御配列の調節下にある場合もある。本発明のアプローチにおいて使用され得るエンハンサーとして、これだけに限らないが：ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが挙げられる。終結調節領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルス終結配列などを含むかまたはこれら由来であり得る。
【0089】
例示的なプロモーターおよびエンハンサーヌクレオチド配列は、配列番号６、１１、１２および１３（「プロモーター配列」）として提供される。制御（プロモーター／エンハンサー）配列が、制御特性を保持したままある程度の変動を許容できることは、当業者によって理解される。プロモーター／エンハンサーがコールアウトされる本明細書に記載のある特定のアプローチでは、実質的に同一の配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列全体にわたって少なくとも約９０％同一性、好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ヌクレオチド同一性を有する配列）は、コールアウトされた配列についての好適な置換物として企図される。
【0090】
７．ＣＲＩＳＰＲ、ＣＲＩＳＰＲａ、エンドヌクレアーゼ、修復鋳型および他の構成成分のデリバリー
ＣＲＩＳＰＲエレメントを含むタンパク質および核酸をデリバリーするためのシステム（「デリバリーシステム」）は、当技術分野において十分周知である。これらのシステムは、Ｃａｓタンパク質（ヌクレアーゼ活性を有するまたは有さない）、Ｃａｓニッカーゼ、ｓｇＲＮＡまたは他のガイドＲＮＡ、Ｃａｓ転写活性化因子融合タンパク質、ＨＴＲＡ１タンパク質コード配列、鋳型修復配列などを、細胞（例えば、ＲＰＥ、光受容細胞および水平細胞）にデリバリーするために使用され得る。細胞にデリバリーされる物質は、時に「導入遺伝子」または「カーゴ」と本明細書において称される。Ｈａｇｅｍａｎ、ＧおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｂ．、国際特許公開第ＷＯ２０２００１９００２号、およびYanik et al., 2017, In vivo genome editing as a potential treatment strategy for inherited retinal dystrophies Progress in Retinal and Eye Research 56: 1-18は、本発明に適合され得る導入遺伝子発現、遺伝子修復、遺伝子活性化などのために目の細胞に構成成分をデリバリーするための方法を記載している。一部のアプローチでは、デリバリーは、Byrne et al., Methods Enzymol. 546, 119-38 (2014)；Cong et al., Science (80). 339, 819-823；Hirsch et al., Mol. Ther. 18, 6-8 (2010)に記載されるとおり、ウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による。
ＣＲＩＳＰＲエレメントを含むタンパク質および核酸をデリバリーするためのシステム（「デリバリーシステム」）は、当技術分野において十分周知である。これらのシステムは、Ｃａｓタンパク質（ヌクレアーゼ活性を有するまたは有さない）、Ｃａｓニッカーゼ、ｓｇＲＮＡまたは他のガイドＲＮＡ、Ｃａｓ転写活性化因子融合タンパク質、ＨＴＲＡ１タンパク質コード配列、鋳型修復配列などを、細胞（例えば、ＲＰＥ、光受容細胞および水平細胞）にデリバリーするために使用され得る。細胞にデリバリーされる物質は、時に「導入遺伝子」または「カーゴ」と本明細書において称される。Ｈａｇｅｍａｎ、ＧおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｂ．、国際特許公開第ＷＯ２０２００１９００２号、およびYanik et al., 2017, In vivo genome editing as a potential treatment strategy for inherited retinal dystrophies Progress in Retinal and Eye Research 56: 1-18は、本発明に適合され得る導入遺伝子発現、遺伝子修復、遺伝子活性化などのために目の細胞に構成成分をデリバリーするための方法を記載している。一部のアプローチでは、デリバリーは、Byrne et al., Methods Enzymol. 546, 119-38 (2014)；Cong et al., Science (80). 339, 819-823；Hirsch et al., Mol. Ther. 18, 6-8 (2010)に記載されるとおり、ウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による。
【0091】
一部のアプローチでは、カーゴ（例えば、ＨＴＲＡ１導入遺伝子）は、ｒＡＡＶ２発現ベクターを使用してデリバリーされる。１つのアプローチでは、導入遺伝子または他の構成成分（例えば、外来性ＨＴＲＡ１遺伝子、またはＲＰＥ細胞におけるその発現が内在性ＨＴＲＡ１の発現を増加させることができる組換え核酸）は、高効率でＲＰＥ細胞に形質導入できるｒＡＡＶ２システムを使用してＲＰＥにデリバリーされる。ＡＡＶ２に加えて、他のアデノ随伴ウイルスベースベクターとして、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびシュードタイプＡＡＶが挙げられる。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび他もその関連する開示は本明細書に参照により組み込まれる、Lau and Suh (2017) doi: 10.12688/f1research.11243.1に開示されるとおり、使用することができる。
【0092】
導入遺伝子をＡＡＶベクターにパッケージングするために、ＩＴＲは、導入遺伝子として同じコンストラクト中にシスで必要な唯一のＡＡＶ構成成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給されてよい。したがって、ＤＮＡコンストラクトは、ＡＡＶ ＩＴＲが抗病原体コンストラクト（またはそのサブユニット、または制御可能なプロモーターの一部である二量体化可能な（ｄｉｍｅｒｉｚａｂｌｅ）ドメインに融合されたそのサブユニット）についてのコード配列に隣接し、それにより増幅され、パッケージングされる領域を明らかにするように設計され得る－唯一の設計制約はパッケージングされるＤＮＡのサイズの上限（およそ４．５ｋｂ）である。
【0093】
ＡＡＶベクターに加えて、使用され得る他のウイルスベクターとして、これだけに限らないが、レトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられる。
【0094】
ＨＴＲＡ１導入遺伝子または他のカーゴを含む発現カセットを保有するウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ２、レンチウイルスベクター）は、当技術分野において周知の方法（本明細書に引用する刊行物に記載されている方法を含む）を使用して、産生、回収および精製され得る。ＡＡＶ方法について、参照により組み込まれる、Zolotukin et al., 2002, Production And Purification Of Serotype 1, 2, And 5 Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors" Methods 28: 158-167、およびすべて参照により組み込まれ、上に引用される、Aponte-Ubillus et al., 2018；Naso et al., 2017；およびPenaud-Budloo et al., 2018を参照されたい。同様に、発現およびデリバリーシステムの記載を含む、遺伝子治療に関する一般的な概説について、すべての目的のために、それぞれ参照により組み込まれる、Moore et al., 2017, "Gene Therapy For Age-Related Macular Degeneration" Expert Opinion on Biological Therapy 17: 10: 1235-1244；Aponte-Ubillus et al., 2018, "Molecular Design For Recombinant Adeno-Associated Virus(Raav)Vector Production" Applied microbiology and biotechnology 102. 3: 1045-1054；Ochakovski et al., 2017, "Retinal Gene Therapy: Surgical Vector Delivery In The Translation To Clinical Trials" Frontiers in Neuroscience 11；Schon et al., 2015, "Retinal Gene Delivery By Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors: Strategies And Appucations" European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 95: 343-352；Naso et al., 2017, "Adeno-Associated Virus (Aav) As A Vector For Gene Therapy" BioDrugs 31: 317；Dunbar et al., 2018, "Gene Therapy Comes Of Age" Science 359: 6372；Penaud-Budloo et al., 2018., "Pharmacology of Recombinant Adeno- Associated Virus Production" Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 8: 166-180；を参照されたい。
【0095】
非ウイルスベクターまたは方法もカーゴをデリバリーするために使用され得る。これらとして、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用するデリバリー、カチオン性リポソームを使用する投与、細胞由来ナノベシクル、直接核酸注入、水圧注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ペプチドおよび非ペプチドを凝集する核酸の使用、カチオン性リポソームおよびリポソームへの封入が挙げられる。１つのアプローチでは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、カーゴをデリバリーするために使用される。ＶＬＰは、ウイルスベクターの操作されたバージョンを含み、ここで核酸または非核酸カーゴは、代替機構（例えば、ｍＲＮＡリクルートメント、タンパク質融合、タンパク質－タンパク質結合）を通じてＶＬＰにパッケージングされる。参照により組み込まれるItaka and Kataoka, 2009, "Recent development of nonviral gene delivery systems with virus-like structures and mechanisms," Eur J Pharma and Biopharma 71: 475-483およびKeeler et al., 2017, "Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions" Clin. Transl. Sci. (2017) 10, 242-248を参照されたい。
【0096】
８．ＨＴＲＡ１発現または活性を増加させるための他の治療
８．１ 細胞療法
１つのアプローチでは、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、ＲＰＥへの移植のためにインビボおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で改変される（Peddle et al., "CRISPR Interference-Potential Application in Retinal Disease" , Int. J. Mol. Sci., 2020 21: 1-14を参照されたい。
８．１ 細胞療法
１つのアプローチでは、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、ＲＰＥへの移植のためにインビボおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で改変される（Peddle et al., "CRISPR Interference-Potential Application in Retinal Disease" , Int. J. Mol. Sci., 2020 21: 1-14を参照されたい。
【0097】
８．２ 他の薬剤
一部のアプローチでは、方法は、ＨＴＲＡ１の発現を増加させることができる小分子化合物を用いて患者を処置することを含む。本明細書において開示される小分子化合物は、有機化合物、典型的には５，０００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、９００ダルトン未満または８００ダルトン未満の分子量を有するものを指す。Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法は、患者に小分子化合物を投与することを含み、ここで薬剤はＨＴＲＡ１の発現を増加させる。例示的化合物として、ＨＴＲＡ１のｍＲＮＡ発現を約２倍増加させることが示されたトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、クラスＩおよびクラスＩＩヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、が挙げられる。Wang et al., Plos|One 2012, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039446
一部のアプローチでは、方法は、ＨＴＲＡ１の発現を増加させることができる小分子化合物を用いて患者を処置することを含む。本明細書において開示される小分子化合物は、有機化合物、典型的には５，０００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、９００ダルトン未満または８００ダルトン未満の分子量を有するものを指す。Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる方法は、患者に小分子化合物を投与することを含み、ここで薬剤はＨＴＲＡ１の発現を増加させる。例示的化合物として、ＨＴＲＡ１のｍＲＮＡ発現を約２倍増加させることが示されたトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、クラスＩおよびクラスＩＩヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、が挙げられる。Wang et al., Plos|One 2012, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039446
【0098】
一部の場合では、好適な化合物は、定量的インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写アッセイを使用して化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。インビトロ転写アッセイは、ＨＴＲＡ１および制御エレメントを含むプラスミドを含む細胞不含有システム中であってよい。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１の発現を増加させることができる薬剤を同定することは、薬剤のライブラリーをＨＴＲＡ１を発現する細胞と接触させること、およびＨＴＲＡ１の発現レベルまたは活性を測定すること、およびＨＴＲＡ１発現または活性を増加させる薬剤を選択することを含む。化合物のライブラリーは、スクリーニングされ、ＨＴＲＡ１の転写は当技術分野において十分周知の手段を使用して測定され得る。例えば、転写は、放射標識または蛍光標識されたヌクレオチドの存在下で実行されてよく、標識された転写物は、ゲルに沈殿され、電気泳動によって分離され、次に定量され得る。代替的に、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡは、定量的ＲＴ－ＰＣＲまたはデジタルＰＣＲによって測定され得る。次に、ＨＴＲＡ１の転写を増加させる薬剤は、選択され、検査される。転写を活性化できる薬剤（化合物またはペプチドが挙げられる）を選択するための方法は、当技術分野において十分周知であり、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７４，７２２号に記載されている。
【0099】
ＨＴＲＡ１転写を活性化できる薬剤をスクリーニングするために使用され得るライブラリーをコンストラクトするための方法も十分周知である。例えば、コンビナトリアルライブラリーは、ステップバイステップ様式で合成され得る多くの種類の化合物について作製され得る。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９４／０８０５１、ＷＯ９５／３５５０３およびＷＯ９５／３０６４２に記載されているコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によってコンストラクトされ得る。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ法（例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ９１／１８９８０を参照されたい）によっても生成され得る。細菌性、真菌性、植物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーは、商業的供給源から得ることができる、またはフィールドで回収することができる。周知の薬理学的薬剤は、構造類似体を産生するようにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの方向付けられたまたは無作為の化学修飾に供され得る。
【0100】
一部のアプローチでは、検査剤は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片であり得る。検査剤は、ペプチド、例えば約５から約３０アミノ酸のペプチドであってもよく、約５から約２０アミノ酸が好ましく、約７から約１５が特に好ましい。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムペプチドであってよい。検査剤は、種々の長さおよび配列の核酸でもあってもよい。
【0101】
一部のアプローチでは、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、その発症を予防する、その進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させるために使用され得る薬剤は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたＨＴＲＡ１プロモーターに薬剤を接触させること、およびレポーター遺伝子の発現を促進するその能力に基づいて薬剤を選択することによって同定され得る。
【0102】
９．患者集団
９．１ 患者集団
本発明の組成物および方法は、第１０染色体ＡＭＤを有するまたは発症するリスクがある対象の処置のための特定の使用を見出す。上に述べたとおり、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤは、ＡＲＭＳ２およびＨＴＲＡ１遺伝子を保有する染色体領域１０ｑ２６中の遺伝的病変に関連することが周知である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０１５，“ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ ＴＨＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＯＦ ＡＭＤ ＢＡＳＥＤ ＯＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １ ＡＮＤ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １０”米国特許公開第２０１５／０２１１０６５号を参照されたい。Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを有する患者は、疾患所見に基づいて、および／または遺伝子型に基づいて同定され得る。１つのアプローチでは、処置についての候補は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す。それにより１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、Ｃｈｒ１０臨床表現型を示す。１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、１つまたは２つの第１０染色体リスク対立遺伝子を保有する。１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、第１０染色体リスク対立遺伝子の１つまたは２つのコピーに１つのリスク対立遺伝子を保有する。１つのアプローチでは、対象は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型または遺伝子型を有し、いかなる第１染色体リスク対立遺伝子も有さない。ＡＭＤについての第１染色体リスク対立遺伝子として、ｒｓ５２９８２５、ｒｓ８００２９２、ｒｓ３７６６４０４、ｒｓ１０６１１４７、ｒｓ２０３６７４、ｒｓ０１６１１７０、ｒｓ２２７４７００、ｒｓ３７５０４６、ｒｓ９４２７６６１、ｒｓ９４２７６６２およびｒｓ１２０９７５５０が挙げられる。
９．１ 患者集団
本発明の組成物および方法は、第１０染色体ＡＭＤを有するまたは発症するリスクがある対象の処置のための特定の使用を見出す。上に述べたとおり、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤは、ＡＲＭＳ２およびＨＴＲＡ１遺伝子を保有する染色体領域１０ｑ２６中の遺伝的病変に関連することが周知である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０１５，“ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ ＴＨＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＯＦ ＡＭＤ ＢＡＳＥＤ ＯＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １ ＡＮＤ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ １０”米国特許公開第２０１５／０２１１０６５号を参照されたい。Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを有する患者は、疾患所見に基づいて、および／または遺伝子型に基づいて同定され得る。１つのアプローチでは、処置についての候補は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を示す。それにより１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、Ｃｈｒ１０臨床表現型を示す。１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、１つまたは２つの第１０染色体リスク対立遺伝子を保有する。１つのアプローチでは、処置を受ける対象は、第１０染色体リスク対立遺伝子の１つまたは２つのコピーに１つのリスク対立遺伝子を保有する。１つのアプローチでは、対象は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型または遺伝子型を有し、いかなる第１染色体リスク対立遺伝子も有さない。ＡＭＤについての第１染色体リスク対立遺伝子として、ｒｓ５２９８２５、ｒｓ８００２９２、ｒｓ３７６６４０４、ｒｓ１０６１１４７、ｒｓ２０３６７４、ｒｓ０１６１１７０、ｒｓ２２７４７００、ｒｓ３７５０４６、ｒｓ９４２７６６１、ｒｓ９４２７６６２およびｒｓ１２０９７５５０が挙げられる。
【0103】
Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者は、主に古典的な脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、稀に潜在的なＣＮＶおよび網膜の血管腫増殖（ＲＡＰ）を示し、しばしば重度で急速な失明を生じる。典型的にはＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者は、Ｃｈｒ１ ＡＭＤ患者よりもドルーゼン、網膜内液（シスト）、速い地図状萎縮（ＧＡ）成長速度および網膜／脈絡膜の菲薄化が少ない。Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ患者は、網膜および脈絡膜（脈絡毛細管を含む）の血管密度も低減していた。
【0104】
一部の態様では、ＨＴＲＡ１発現を増強することは、遺伝子治療によって達成される。一部のアプローチでは、ＨＴＲＡ１を増強することは、内在性ＨＴＲＡ１遺伝子の転写を上方制御する薬剤、例えば、小分子化合物、ペプチドまたは核酸を投与することによって達成される。ＨＴＲＡ１の転写を上方制御するための遺伝子治療は、さまざまな方法で実施され得る。一部のアプローチでは、遺伝子治療は、内在性ＨＴＲＡ１発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）を上方制御する。一部のアプローチでは、遺伝子治療は、ＲＰＥ細胞において発現される外来性ＨＴＲＡ１遺伝子を導入する。一部のアプローチでは、遺伝子治療法は、下に記載されるとおり、細胞ゲノム中のＣｈ１０リスク対立遺伝子を対応する非リスク対立遺伝子に変換するために使用される。
【0105】
下に記載されるとおり、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを有する個体は、疾患の発症に関連する１つまたは複数のリスク対立遺伝子（「Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子」）をしばしば保有する。実施例１および３を参照されたい。本発明者らは、健康なまたは低いリスクの対照と比較してＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者は、ＲＰＥにおいて特異的にＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現が減少していることを驚くべきことに発見した（図２）。さらに、本発明者らは、ＡＭＤリスクの増加と関連する領域に対応する、ＨＴＲＡ１の減少の原因となるゲノム領域を同定した。
【0106】
リスク対立遺伝子についてホモ接合性の患者は、ＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１タンパク質の減少を有すると示されており、ＲＰＥとブルッフ膜との間の（「ＲＰＥ下腔」）境界面におけるＨＴＲＡ１レベルにも影響を与える場合がある。ＨＴＲＡ１発現の減少、例えばＲＰＥ下腔中のＨＴＲＡ１発現の減少は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの発症の一因となると考えられている。ＨＴＲＡ１はセリンプロテアーゼであり、ＲＰＥ下腔において大きく富化されている細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を分解できる。特定の理論または機構に束縛されることを意図せず、ＨＴＲＡ１発現における低減は、ＥＣＭタンパク質のプロセシング、維持および代謝回転を損ない、損傷した、ミスフォールドしたおよび／または凝集したタンパク質の蓄積を生じる。これらのタンパク質の蓄積は、次に、その基底膜への、および／またはブルッフ膜へのＲＰＥ組織の付着を破壊する場合があり、血液網膜関門の喪失をもたらし、ＡＭＤの発症の一因となる。表４は、Ｃｈｒ１０リスクを有するある特定の表現型の関連についてのオッズ比およびＰ値を示している。脈絡膜（ｃｈｒｏｉｄａｌ）線維症および基底膜沈着物（ｂａｓａｌ ｌａｍｉｎａｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）（ＢＬＤ）の両方が、第１０染色体リスク対立遺伝子についてホモ接合性のドナー由来の眼において観察された。ＢＬＤは、ＲＰＥ細胞膜と基底膜との間にある異常な細胞外物質であり、後期ＡＭＤと強く関連するとして以前示された。さらにＥＣＭ構造タンパク質中の突然変異は、それらの誤制御を生じ、Ｌ－ＯＲＤ（Ｃ１ｑＴＮＦ５）、ソースビー眼底変性症（ＴＩＭＰ３）、エーラス・ダンロス症候群ＶＩ型（ＰＬＯＤ１）またはドインの蜂巣状網膜ジストロフィー（ＥＦＥＭＰ１）を含むＡＭＤ様疾患をもたらす。Hayward et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2657-67 (2003)；Weber et al., Nat. Genet 8 (4): 352-6およびMarmorstein et al., PNAS. 99 (20): 13067-72を参照されたい。これらのエビデンスは、ＥＣＭの変更および基底膜沈着物の形成が共通の原因を共有し、ＨＴＲＡ１の発現の減少が、損傷した、ミスフォールドした、凝集したタンパク質の蓄積およびＡＭＤの発症をもたらすことを示唆している。
【0107】
【表4】
【0108】
したがって、一部の態様では本開示は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ発症を予防するまたは遅らせるためにＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させる方法を提供する。ＨＴＲＡ１治療は、患者が遺伝的プロファイルに基づいてＣｈｒ１０ ＡＭＤを発症するリスクを有すると同定された後に、および一部の場合ではＡＭＤのいずれかの臨床症状の出現前に、投与され得る。この早期介入は、ＡＭＤに伴う広範な組織損傷を回避できる。本明細書において開示される方法は、最小限、典型的には患者の生涯で１回または２回だけ、手術を必要とし、それにより従来の治療では必要とされる頻回の手術に伴う不快感および有害事象を最小化する。
【0109】
９．１．１ 処置のための対象の選択
一部のアプローチでは、患者は、臨床表現型または処置についての遺伝的要因に基づいて処置のために選択される。一部のアプローチでは、彼らは、疾患の個々の遺伝的（例えば、上に開示されるＣｈｒ１０リスク対立遺伝子の存在を評価することによって）および関連するリスクを決定するために遺伝子型判定によって評価される。付加的に、彼らは、これだけに限らないが次が挙げられる臨床検査を介して評価され得る：画像および形態学的評価（例えば、これだけに限らないが、カラー眼底写真、ＳＤ－ＯＣＴ、ＯＣＴ－Ａ、インドシアニングリーン血管造影、フルオレセイン血管造影、および近赤外リフレクタンス（ＮＩＲ）、青色光自己蛍光、緑色光自己蛍光を含む共焦点走査レーザー眼底検査（例えば、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられる；ならびに機能検査（例えば、これだけに限らないが視力、最高矯正視力（ＥＴＤＲＳチャートを使用するＢＣＶＡ）、低輝度ＢＣＶＡ（ＬＬＶＡ、ＥＴＤＲＳチャートと共にニュートラルデンシティーフィルムを使用）、読取り速度（単眼／両眼）、固視安定性、暗順応した微小視野測定（Ｓ－ＭＡＩＡ）、暗順応および薄明視微小視野測定感度を含む微小視野測定（ＭＡＩＡ）、視覚誘発電位（ＶＥＰ）評価ならびに多焦点ＥＲＧが挙げられる。
一部のアプローチでは、患者は、臨床表現型または処置についての遺伝的要因に基づいて処置のために選択される。一部のアプローチでは、彼らは、疾患の個々の遺伝的（例えば、上に開示されるＣｈｒ１０リスク対立遺伝子の存在を評価することによって）および関連するリスクを決定するために遺伝子型判定によって評価される。付加的に、彼らは、これだけに限らないが次が挙げられる臨床検査を介して評価され得る：画像および形態学的評価（例えば、これだけに限らないが、カラー眼底写真、ＳＤ－ＯＣＴ、ＯＣＴ－Ａ、インドシアニングリーン血管造影、フルオレセイン血管造影、および近赤外リフレクタンス（ＮＩＲ）、青色光自己蛍光、緑色光自己蛍光を含む共焦点走査レーザー眼底検査（例えば、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられる；ならびに機能検査（例えば、これだけに限らないが視力、最高矯正視力（ＥＴＤＲＳチャートを使用するＢＣＶＡ）、低輝度ＢＣＶＡ（ＬＬＶＡ、ＥＴＤＲＳチャートと共にニュートラルデンシティーフィルムを使用）、読取り速度（単眼／両眼）、固視安定性、暗順応した微小視野測定（Ｓ－ＭＡＩＡ）、暗順応および薄明視微小視野測定感度を含む微小視野測定（ＭＡＩＡ）、視覚誘発電位（ＶＥＰ）評価ならびに多焦点ＥＲＧが挙げられる。
【0110】
追加的指標として、形態学的および機能的情報（視力、読取り速度、弱光視力（ｌｏｗ ｌｉｇｈｔ ｖｉｓｉｏｎ）、固視、網膜電図など）の組合せが挙げられる。
【0111】
追加的に患者は、多数の表現型およびバイオマーカーに基づいて評価され得る。本明細書に開示される治療を投与することは、ＨＴＲＡ１発現を増加させ、眼の解剖所見および外観における変化、または非限定的に：ドルーゼンがほとんどない（ドルーゼンが小さく硬い）、網膜内液（シスト）、速いＧＡ成長速度および網膜／脈絡膜の菲薄化を含むある種のバイオマーカーのレベルにおける変化によって定義される特定の表現型ウインドウ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）に投与される場合に、患者に利益も提供する。
【0112】
一態様では、本明細書において開示される治療剤のＣｈｒ１０ ＡＭＤの進行の超早期での投与は、優れた治療利益を提供できる。例えば、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの徴候または症状の出現に先立つ（例えば、次の症状のいずれも存在しない：ドルーゼン、網膜内液（シスト）、速いＧＡ成長速度および網膜／脈絡膜の菲薄化）患者、特に１つまたは複数のＣｈｒ１０リスク対立遺伝子を有することによる高い遺伝的リスクにある患者の処置。したがって、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの発症を予防する、およびＣｈｒ１０ ＡＭＤの進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させるための方法および組成物が本明細書において提供される。一部のアプローチでは、患者は、ＡＭＤの症状を有さない（すなわち、無症候性）。一部のアプローチでは、治療剤の最初の投与時に患者は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤのいかなる臨床表現型も示さない。
【0113】
一部のアプローチでは、患者は、Ｃｈｒ１およびＣｈｒ１０の両方の組合せ、Ｃｈｒ１および他のマイナーなＡＭＤ関連遺伝子（Ｃ３、ＣＦＢ、Ｃ２など）、またはすべての組合せを有し、患者は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの症状および徴候を処置する、予防する、その進行を遅らせるために本発明の治療を用いて、およびＣｈｒ１ ＡＭＤを処置する、予防するまたは進行を遅らせるために第２の薬剤を用いて処置される。
【0114】
９．２ ＨＴＲＡ１発現の低減およびＣｈｒ１０ ＡＭＤに関連する遺伝的因子
９．２．１ Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子
臨床表現型に加えて、個体は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを発症することのリスクが上昇することから、遺伝的要因だけに基づいても同定され得る
９．２．１ Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子
臨床表現型に加えて、個体は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤを発症することのリスクが上昇することから、遺伝的要因だけに基づいても同定され得る
【0115】
したがって、本明細書において開示される方法および組成物は、これらのリスク対立遺伝子を有する患者を対象のＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させ、それによりＣｈｒ１０ ＡＭＤを処置する、発症を予防する、進行を遅らせる、元に戻すまたはその症状および徴候を軽快させる薬剤を用いて処置するため使用されてよい。
【0116】
実施例において記載されるとおり、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの減少に関連する領域は、ｒｓ１１２００６３２とｒｓ３７５０８４６とを含めてそれらの間にある、ＨＴＲＡ１の上流制御領域に位置し得る（「４ｋｂ ＡＭＤリスク領域」）。例示的なＣｈｒ１０リスク対立遺伝子は、ｒｓ１１２００６３２（リスク対立遺伝子はＧ）、ｒｓ１１２００６３３（リスク対立遺伝子はＴ）、ｒｓ６１８７１７４６（リスク対立遺伝子はＣ）、ｒｓ６１８７１７４７（リスク対立遺伝子はＴ）、ｒｓ１０４９０９２４（リスク対立遺伝子はＴ）、ｒｓ３６２１２７３１（リスク対立遺伝子はＴ）、ｒｓ３６２１２７３２（リスク対立遺伝子はＧ）、ｒｓ３６２１２７３３（リスク対立遺伝子はＣ）、ｒｓ３７５０８４８（リスク対立遺伝子はＧ）、ｒｓ３７５０８４７（リスク対立遺伝子はＴ）およびｒｓ３７５０８４６（リスク対立遺伝子はＣ）に位置する。表５は、これらの多型部位でのリスク対立遺伝子（上）および非リスク対立遺伝子（下）を示す。４ｋｂリスク領域内にあるｒｓ１０４９０９２４を含む完全なＬＤ（ｒ２＝１）または非常に高いＬＤでのＳＮＰの完全なリストは、表５に示されている。本明細書において開示される方法および組成物は、これらのリスク対立遺伝子の１つまたは複数を有する患者を処置するために使用され得る。
【0117】
【表5】
【0118】
一部のアプローチでは、本明細書において開示される治療から利益を得ることができる個体は、１つまたは複数の転写活性化因子への結合を減少させ、ＨＴＲＡ１遺伝子の転写を減少させる１つまたは複数のリスク対立遺伝子を保有している可能性がある。実施例において示されるとおり、本発明者らは、Ｃｈｒ１０：１２２４５４５０８－Ｃｈｒ１０：１２２４５６５６４（「２ｋｂリスク領域」）に位置する２ｋｂ領域を発見し、これは、ＲＰＥ細胞において転写的に活性であり、ＨＴＲＡ１転写を活性化できる転写活性化因子への結合の原因であると考えられている。この２ｋｂ領域は、Ｈ３Ｋ４モノメチル化およびＨ３Ｋ２７アセチル化を含む、活性転写エンハンサーエレメントのエピジェネティックマーカーを含む。例えば、ＬＨＸ２は、ヌクレオチド配列ＴＴＧＣＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡＴ（ｒｓ３６２１２７３３に非リスク対立遺伝子Ｔ、下線付きを含む）を有するこの領域内の配列モチーフに結合する。ＬＨＸ２は、ＴＴＧＣＣＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴ（ｒｓ３６２１２７３３にリスク対立遺伝子Ｃ、下線付きを含む）にあまり結合しない。図９（図１０および１１）を参照されたい。したがって、一部のアプローチでは、本明細書において開示される方法は、この２．０ｋｂ領域におけるそのゲノムＤＮＡがＨＴＲＡ１に対する転写活性化因子への結合親和性が低減している患者に薬剤を投与することを含み、薬剤の投与は、ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１発現を増加させる。一部のアプローチでは、患者は、ＬＨＸ２への結合の低減または完全な喪失を示した。一部のアプローチでは、患者は、ｒｓ３６２１２７３３、（すなわち、ＴＴＧＣＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴ）にＬＨＸ２への結合の喪失を生じるＣのリスク対立遺伝子を有する場合がある。一部のアプローチでは、処置方法は、薬剤を患者に投与することを含み、ここで薬剤は、ＨＴＲＡ１の転写制御領域への転写活性化因子（例えば、ＬＨＸ２）の結合を促進することによって、患者のＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現を増加させる。
【0119】
９．２．２ ｌｎｃＳＣＴＭ１発現は、ＨＴＲＡ１発現に逆に関連する。
一部のアプローチでは、本明細書において開示される治療から利益を得ることができる個体は、対照と比較して、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＳＣＴＭ１（ＬＯＣ１０５３７８５２５とも称される）またはそのアイソフォームの対立遺伝子特異的発現の増加を示した。ｌｎｃＳＣＴＭ１は、ＨＴＲＡ１と同じＬＤブロックを共有するＤＮＡ配列から転写される。図７および実施例に示されるとおり、ｌｎｃＳＣＴＭ１は、ＨＴＲＡ１と分岐プロモーターを共有し、ＨＴＲＡ１プロモーターからアンチセンス方向で転写される。ｌｎｃＳＣＴＭ１の対立遺伝子特異的発現は、ＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現と逆に関連している。ヘテロ接合性患者では、ｌｎｃＳＣＴＭ１のリスク対立遺伝子（例えば、ｒｓ１１２００６３８）のｍＲＮＡレベルは、ｌｎｃＳＣＴＭ１の非リスク対立遺伝子のｍＲＮＡより高いレベルである。対照的に、ＨＴＲＡ１のリスク対立遺伝子のｍＲＮＡレベルは、非リスク対立遺伝子のｍＲＮＡレベルより低い（図８）。
一部のアプローチでは、本明細書において開示される治療から利益を得ることができる個体は、対照と比較して、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＳＣＴＭ１（ＬＯＣ１０５３７８５２５とも称される）またはそのアイソフォームの対立遺伝子特異的発現の増加を示した。ｌｎｃＳＣＴＭ１は、ＨＴＲＡ１と同じＬＤブロックを共有するＤＮＡ配列から転写される。図７および実施例に示されるとおり、ｌｎｃＳＣＴＭ１は、ＨＴＲＡ１と分岐プロモーターを共有し、ＨＴＲＡ１プロモーターからアンチセンス方向で転写される。ｌｎｃＳＣＴＭ１の対立遺伝子特異的発現は、ＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現と逆に関連している。ヘテロ接合性患者では、ｌｎｃＳＣＴＭ１のリスク対立遺伝子（例えば、ｒｓ１１２００６３８）のｍＲＮＡレベルは、ｌｎｃＳＣＴＭ１の非リスク対立遺伝子のｍＲＮＡより高いレベルである。対照的に、ＨＴＲＡ１のリスク対立遺伝子のｍＲＮＡレベルは、非リスク対立遺伝子のｍＲＮＡレベルより低い（図８）。
【0120】
一部のアプローチでは、本明細書において開示される治療から利益を得ることができる患者は、ＨＴＲＡ１の発現の減少に相関する１つまたは複数のスプライス形態のｌｎｃＳＣＴＭ１を保有している。実施例に示されるとおり、ｌｎｃＳＣＴＭ１は、さまざまなスプライス変異体として存在し（図７）、さまざまな眼組織において発現される（図１４）。
【0121】
一部のアプローチでは、本明細書において開示される方法および組成物は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの１つまたは複数の臨床表現型を有する、例えばわずかなドルーゼン、網膜内液（シスト）有する、速いＧＡ成長速度、網膜／脈絡膜菲薄化を示す、個体においてＣｈｒ１０ ＡＭＤを処置するために使用され得る。一部のアプローチでは、患者は、上に開示される１つまたは複数のＣｈｒ１０リスク対立遺伝子を有する。一部のアプローチでは、患者は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの１つまたは複数の臨床表現型および１つまたは複数のＣｈｒ１０リスク対立遺伝子の両方を有する。
【0122】
一部の場合では、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤ臨床表現型を有する、および／またはＣｈｒ１０リスク対立遺伝子を有することに加えて、患者は、Ｃｈｒ１リスク対立遺伝子および／またはＣｈｒ１誘発ＡＭＤ臨床表現型も有する。Ｃｈｒ１リスク対立遺伝子／ハプロタイプ。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８６７，７２７号を参照されたい。一部の場合では、患者は、ＡＭＤについてＣｈｒ１リスク対立遺伝子／ハプロタイプを有さない。
【0123】
１０．投与方法および用量
上に記載のとおり、本発明の態様は、処置を必要とする対象においてリスク対立遺伝子を非リスク対立遺伝子に変換するために、ＨＴＲＡ１発現を増加させる、またはゲノム領域を編集する、のいずれかのための薬剤を投与する方法を含む。このため本発明の態様は、１つまたは複数の治療剤、例えば、ウイルスベクター、化合物、ペプチドまたはこれらの組合せに対象を、上に記載のとおり、対象への薬剤のデリバリーが対象の健康の１つまたは複数の態様において有益な効果をもたらすような条件下で、接触させることを含む。本発明は、投与の具体的な部位または方法に限定されない。例えば、例示のために限定ではなく、薬剤は、全身投与（例えば、静脈内注射もしくは注入）、局所注射または注入（例えば、網膜下、上脈絡膜、硝子体内、経強膜もしくは他に眼球に）によって、浸透圧ポンプの使用によって、電気穿孔法によって、適用によって（例えば、点眼剤）および他の手段によって投与され得る。本発明の導入遺伝子が、桿体、錐状体、ＲＰＥ、および神経節細胞、毛様体上皮、強膜、脈絡膜および他の眼球の細胞などの神経網膜細胞型を含む種々の細胞型に導入されてよく、発現され得ることは企図される。
上に記載のとおり、本発明の態様は、処置を必要とする対象においてリスク対立遺伝子を非リスク対立遺伝子に変換するために、ＨＴＲＡ１発現を増加させる、またはゲノム領域を編集する、のいずれかのための薬剤を投与する方法を含む。このため本発明の態様は、１つまたは複数の治療剤、例えば、ウイルスベクター、化合物、ペプチドまたはこれらの組合せに対象を、上に記載のとおり、対象への薬剤のデリバリーが対象の健康の１つまたは複数の態様において有益な効果をもたらすような条件下で、接触させることを含む。本発明は、投与の具体的な部位または方法に限定されない。例えば、例示のために限定ではなく、薬剤は、全身投与（例えば、静脈内注射もしくは注入）、局所注射または注入（例えば、網膜下、上脈絡膜、硝子体内、経強膜もしくは他に眼球に）によって、浸透圧ポンプの使用によって、電気穿孔法によって、適用によって（例えば、点眼剤）および他の手段によって投与され得る。本発明の導入遺伝子が、桿体、錐状体、ＲＰＥ、および神経節細胞、毛様体上皮、強膜、脈絡膜および他の眼球の細胞などの神経網膜細胞型を含む種々の細胞型に導入されてよく、発現され得ることは企図される。
【0124】
本明細書において開示される治療剤は、ヒトへの投与のために生理学的に適合性の担体中に懸濁されてよい。投与は、眼球または眼球ではない（例えば、硝子体内、血管内、眼球外への投与）経路によってであってよい。好適な担体は、デリバリーの経路を考慮して当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体として、種々の緩衝液と製剤化され得る生理食塩水が挙げられる（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）。
【0125】
１０．１ 眼球投与
１０．１．１ 網膜下および他の注射
ＲＰＥ脈絡膜境界面のレベル近くへの治療剤の導入は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの初期段階でのＨＴＲＡ１制御のより良い調節をもたらし、後期地図状萎縮および脈絡膜新生血管に伴う失明を予防する。１つのアプローチでは、薬剤は、疾患による影響を受けた網膜の領域に直接ウイルスベクターをデリバリーするために、網膜下にブレブまたは水疱を作ることによる網膜下注射を介して投与される。１つまたは複数のブレブは、治療剤の十分な分布を確実にするために眼の四分円の１つにまたは複数の四分円に作られてよい。Xue et al., "TECHNIQUE OF RETINAL GENE THERAPY: DELIVERY OF VIRAL VECTOR INTO THE SUBRETINAL SPACE" Eye 31:1308-1316, 2017を参照されたい。同様に、Moore et al. 2017、Ochakovski et al. 2017、Schoen et al. 2015、上記、も参照されたい。
１０．１．１ 網膜下および他の注射
ＲＰＥ脈絡膜境界面のレベル近くへの治療剤の導入は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの初期段階でのＨＴＲＡ１制御のより良い調節をもたらし、後期地図状萎縮および脈絡膜新生血管に伴う失明を予防する。１つのアプローチでは、薬剤は、疾患による影響を受けた網膜の領域に直接ウイルスベクターをデリバリーするために、網膜下にブレブまたは水疱を作ることによる網膜下注射を介して投与される。１つまたは複数のブレブは、治療剤の十分な分布を確実にするために眼の四分円の１つにまたは複数の四分円に作られてよい。Xue et al., "TECHNIQUE OF RETINAL GENE THERAPY: DELIVERY OF VIRAL VECTOR INTO THE SUBRETINAL SPACE" Eye 31:1308-1316, 2017を参照されたい。同様に、Moore et al. 2017、Ochakovski et al. 2017、Schoen et al. 2015、上記、も参照されたい。
【0126】
別のアプローチでは、薬剤は、上脈絡膜注射を介して投与され、それによりＲＰＥの基底面に到達する。Ding et al., "AAV8-vectored suprachoroidal gene transfer produces widespread ocular transgene expression", J Clin Invest 129(11): 4901-4911, 2019を参照されたい。同様に、Emami-and Yiu, Medical and Sugical Applications for the Suprachoroidal Space, Int Ophthalmol Clin 59(1): 195-207, 2019も参照されたい。別のアプローチでは、薬剤は、硝子体に注射され得る。このアプローチは、地図状萎縮またはＣＮＶを有するＣｈｒ１０ ＡＭＤ患者のＲＰＥに薬剤を入れるために特に有用であり得る。この技術は、当業者に十分周知である。Kansar et al., "Suprachoroidal Delivery of Viral and Nonviral Gene Therapy for Retinal Disease", J Ocular Pharmacol Ther DOI: 10. 1089/jop. 2019. 0126.2020を参照されたい。
【0127】
用量
投与量の値が、産生物の性質および状態の重症度により変動する場合があることは、記載される。任意の具体的な対象について、特定の投与レジメンが個体の必要性および組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門家としての判断により経時的に調整されてよく、本明細書に記載される投与範囲が例示的なだけであり、特許請求される組成物の範囲および実行を制限する意図ではないことはさらに理解される。
投与量の値が、産生物の性質および状態の重症度により変動する場合があることは、記載される。任意の具体的な対象について、特定の投与レジメンが個体の必要性および組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門家としての判断により経時的に調整されてよく、本明細書に記載される投与範囲が例示的なだけであり、特許請求される組成物の範囲および実行を制限する意図ではないことはさらに理解される。
【0128】
投与される薬剤の量は、望ましい結果を達成するために、必要な投与量および期間について「有効量」または「治療有効量」、すなわち有効である量である。望ましい結果は、標的細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）におけるＨＴＲＡ１発現もしくは活性の改善、または非限定的に、ＡＭＤ症状もしくは徴候における改善、好ましくは統計的に有意な改善が挙げられるＨＴＲＡ１発現の低減に関連する症状における検出可能な改善を含む。代替的に医薬組成物が予防的に使用される場合、望ましい結果は、非限定的に、ＡＭＤの症状もしくは徴候を含む、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤの１つまたは複数の症状の実証可能な予防、好ましくは統計的に有意な予防を含む。かかる組成物の治療有効量は、個体の疾患段階、年齢、性別および体重または個体において望ましい応答を誘発するウイルスベクターの能力などの要因に応じて変動する場合がある。投与レジメンは、最適な応答を提供するように調整され得る。治療有効量は、治療的に有益な作用が、薬剤、例えばウイルスベクターのいかなる毒性または有害な影響も上回るものでもある。組成物中のウイルスベクターの量は、個体の疾患段階、年齢、性別および体重などの要因に応じて変動する場合がある。
【0129】
投与レジメンは、最適な治療反応を提供するために調整され得る。例えば、単一ボーラスが投与されてよく、いくつかに分割された用量が経時的に投与されてもよく、または用量は治療状況が緊迫しているために必要とされる場合、比例的に低減または増加されることがある。治療剤がＡＡＶ粒子である場合、好ましいヒト投与量は、網膜下ブレブあたり１００～３００μｌの容量で、注射１回あたりＡＡＶゲノム１０８から１０１２個であってよい。１つより多いブレブが１つの眼に作られてもよい。任意の所与の個体において生涯に複数回の処置が必要である場合がある。
【0130】
１１．処置結果
ＡＭＤを発症するリスクがある、または疾患の初期段階にある個体の処置を含む、好適な患者におけるＨＴＲＡ１遺伝子治療は、患者におけるＡＭＤの症状または徴候を安定化する、軽快させるまたは元に戻すことができる。例えば、非限定的に、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質を提供すること、Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である患者に転写活性化因子を導入することは、種々の眼球のバイオマーカーによって実証されるとおり、疾患を安定化させる、および／またはその進行を遅らせるもしくは元に戻すことができる。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１関連治療を用いて処置された患者における主な望ましい処置結果は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤに伴う症状すなわち、ドルーゼンを有する、網膜内液（シスト）、速いＧＡ成長速度および網膜／脈絡膜菲薄化、網膜および脈絡膜血管密度の低減、黄斑領域における脈絡膜毛細管ゴースト（ＯＣＴ－Ａで流れがない）、黄斑領域での脈絡膜線維症、黄斑外領域での脈絡膜線維症、黄斑領域でのブルッフの基底膜沈着物（ＢＬＤ）、黄斑領域でのＢＬＤ、黄斑領域でのブルッフ膜の肥厚、黄斑外領域でのＢＬＤ、の１つまたは複数における検出可能な改善である。
ＡＭＤを発症するリスクがある、または疾患の初期段階にある個体の処置を含む、好適な患者におけるＨＴＲＡ１遺伝子治療は、患者におけるＡＭＤの症状または徴候を安定化する、軽快させるまたは元に戻すことができる。例えば、非限定的に、外来性ＨＴＲＡ１タンパク質を提供すること、Ｃｈｒ１０リスク対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である患者に転写活性化因子を導入することは、種々の眼球のバイオマーカーによって実証されるとおり、疾患を安定化させる、および／またはその進行を遅らせるもしくは元に戻すことができる。１つのアプローチでは、ＨＴＲＡ１関連治療を用いて処置された患者における主な望ましい処置結果は、Ｃｈｒ１０ ＡＭＤに伴う症状すなわち、ドルーゼンを有する、網膜内液（シスト）、速いＧＡ成長速度および網膜／脈絡膜菲薄化、網膜および脈絡膜血管密度の低減、黄斑領域における脈絡膜毛細管ゴースト（ＯＣＴ－Ａで流れがない）、黄斑領域での脈絡膜線維症、黄斑外領域での脈絡膜線維症、黄斑領域でのブルッフの基底膜沈着物（ＢＬＤ）、黄斑領域でのＢＬＤ、黄斑領域でのブルッフ膜の肥厚、黄斑外領域でのＢＬＤ、の１つまたは複数における検出可能な改善である。
【0131】
ＨＴＲＡ１関連治療を用いて処置される患者における望ましい処置結果も、非限定的に：視力（早期処置糖尿病性網膜症研究、またはＥＴＤＲＳ）；最高矯正視力（またはＢＣＶＡ）；微小視野測定（黄斑完全性評価、またはＭＡＩＡ）；暗順応；読取り速度；視覚誘発電位（ＶＥＰ）；および多局所網膜電図（ｍｆＥＲＧ）が挙げられる機能的測定の１つまたは複数における検出可能な改善であり得ることが企図される。ＡＭＤ進行の安定化、遅延または元に戻すこと示す他のバイオマーカーとして、非限定的に：ＢＣＶＡ変化；ＧＡ変化の面積（平方根変換または別法）；固視；読取り速度；ＧＡの新規面積の％；光受容細胞長；個々のドルーゼ特徴が挙げられる。
【0132】
１２．医薬組成物
本発明の別の態様は、本発明のベクターの医薬組成物に関する。一実施形態では、組成物は、薬剤の有効量および薬学的に許容される担体を含む。一部のアプローチでは、滅菌注射可能な溶液は、ベクター、例えば、ウイルスベクターを必要な量で、適宜ヒト患者への注射のために好適な希釈剤または賦形剤と共に組み込むことによって調製され得る。例えば患者への単一投与のために十分なＡＡＶ粒子または化合物を有する、単一使用、予め充填されたシリンジまたは他の注射用またはデバイスなどの単位投与形態が提供される。本発明のいずれの医薬調製物も調製物およびＡＭＤを処置するためのその使用についての情報を含むかたちで、または伴って包装され得る。
本発明の別の態様は、本発明のベクターの医薬組成物に関する。一実施形態では、組成物は、薬剤の有効量および薬学的に許容される担体を含む。一部のアプローチでは、滅菌注射可能な溶液は、ベクター、例えば、ウイルスベクターを必要な量で、適宜ヒト患者への注射のために好適な希釈剤または賦形剤と共に組み込むことによって調製され得る。例えば患者への単一投与のために十分なＡＡＶ粒子または化合物を有する、単一使用、予め充填されたシリンジまたは他の注射用またはデバイスなどの単位投与形態が提供される。本発明のいずれの医薬調製物も調製物およびＡＭＤを処置するためのその使用についての情報を含むかたちで、または伴って包装され得る。
【0133】
１３．定義および慣習
本発明が詳細に記載される前に、記載される具体的なアプローチに、当然のことながら変動することから、本発明が限定されないことは理解される。本明細書において使用される用語は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、具体的なアプローチを記載するためだけであって、限定することを意図しないことも理解される。
本発明が詳細に記載される前に、記載される具体的なアプローチに、当然のことながら変動することから、本発明が限定されないことは理解される。本明細書において使用される用語は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、具体的なアプローチを記載するためだけであって、限定することを意図しないことも理解される。
【0134】
本明細書において使用される場合、用語「導入遺伝子」は、「外来性遺伝子」と互換的に使用され、遺伝子治療ベクターを使用して発現を生じるように細胞に導入される組換えポリヌクレオチドコンストラクトを指す。
【0135】
本明細書において使用される場合、用語「天然のプロモーター」は、天然でおよび／または本来は細胞に存在し、典型的には特定の遺伝子の発現のために指定されるプロモーターを指す。例えば、配列番号１３は、天然ＨＴＲＡ１プロモーターである。遺伝子の非天然プロモーターは、天然では遺伝子と関連しないものである。例えば、ＶＭＤ２プロモーター（配列番号６）は、天然ＨＴＲＡ１プロモーターではない。
【0136】
本明細書において使用される場合、用語「天然の転写活性化因子」は、天然でおよび／または本来は細胞に存在し、典型的には特定の遺伝子の転写を制御するために指定される転写活性化因子を指す。例えば、ＬＨＸ２はＨＴＲＡ１プロモーターのための天然の転写活性化因子である一方で、ＶＰ１６はＨＴＲＡ１のための天然の転写活性化因子ではない。
【0137】
本明細書において使用される場合、「遺伝子治療ベクター」は、細胞に導入遺伝子を導入するために使用されるウイルス由来配列エレメントを指す。
【0138】
本明細書において使用される場合、「ウイルスベクター」は、細胞に導入遺伝子をデリバリーするために使用される、カプシドタンパク質を含む遺伝子治療ベクターを指す。
【0139】
本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節（例えば、増加）できるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ミニマルプロモーター（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始の部位を特定するために働く他の配列からなる短いＤＮＡ配列）を含み得る。エンハンサー配列（例えば、上流エンハンサー配列）は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節（例えば、増加）するためにプロモーターと相互作用できる制御エレメントである。本明細書において使用される場合、「プロモーター」への言及は、エンハンサー配列を含み得る。
【0140】
プロモーターおよび他の制御配列は、それらが導入遺伝子または導入遺伝子産生物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）の発現または安定性に影響を与える場合に、導入遺伝子に「作動可能に連結」されている。
【0141】
本明細書において使用される場合、用語「導入する」または「導入した」は、遺伝子治療の文脈では、例えば、ＨＴＲＡ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、ＨＴＲＡ１の発現を増加させることができる転写活性化因子またはＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む組成物を、ポリヌクレオチドが細胞に進入し、タンパク質を産生するように細胞において発現される条件下で投与することを指す。ポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ２）ベクターを使用して、非ウイルスベクターシステムを使用して、または他の方法によってネイキッドＤＮＡとして導入され得る。
【0142】
用語「に対応する」および文法的等価物は、正確な位置が類似性または相同が測定される分子と同一または異なっているかにかかわらず、同様のまたは相同性のタンパク質またはヌクレオチド配列中の位置を指して本明細書において使用される。例えば、長さ１００残基の第１のタンパク質、およびアミノ末端での５アミノ酸の欠失を除いて第１のタンパク質と同一である第２のタンパク質の場合に、第１のタンパク質の１２位は、第２のタンパク質の７位「に対応する」。
【0143】
「アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）」および「組換えアデノ随伴ウイルス２（ｒＡＡＶ２）は、同等に使用される。例示的ＡＡＶ２ベクターは、アデノ随伴ウイルス２ゲノム由来であり、科学文献に広範に記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるSrivastava, et al, 1983, J. Virol. 45: 555-564および本明細書以下で引用される他の参考文献を参照されたい。
【0144】
本明細書において使用される場合「レンチウイルス」は、細胞に導入遺伝子を導入するために使用され得る遺伝子治療ベクター（レンチウイルスベクター）を指す。例えば、参照により本明細書に組み込まれるKeeker et al., 2017, Clin Transl Sci. 10: 242-248および本明細書以下で引用される他の参考文献を参照されたい。
【0145】
用語「同一」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈では、同じ（「同一」）である、または同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率［すなわち、比較ウインドウまたは指定の領域にわたって最大の一致について比較およびアラインされた場合に、手作業でのアライメントおよび目視検査またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下に記載される初期設定パラメーターで（例えば、ＮＣＢＩウエブサイト、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照されたい）使用することによって測定して、特定の領域の全配列にわたって少なくとも約７０％同一性、少なくとも約７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性］を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、その結果「実質的に同一である」と呼ばれる。
【0146】
用語「対象」または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは動物（特に、哺乳動物）および他の生物を指す。例えば、対象は、非ヒト霊長類であってよい。
【0147】
下に記載されるとおり、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮に入れることができる。好ましくは、同一性は、長さ少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さ５０～１００以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。配列比較のために、典型的には１つの配列は、参照配列として機能し、それに検査配列が比較される。一部のアプローチでは、同一性百分率は、配列番号１（ＨＴＲＡ１のヌクレオチド配列）または配列番号２（ＨＴＲＡ１のアミノ酸配列）から選択される参照配列の全長への関係で決定される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査および参照配列は、コンピューターに入力され、サブ配列座標が指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、初期設定プログラムパラメーターは使用され得る、または代替パラメーターが指定され得る。これにより、配列比較アルゴリズムは、参照配列と比べた検査配列のパーセント配列同一性を、プログラムパラメーターに基づいて算出する。本明細書において使用される場合、「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適にアラインされた後に配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、２０から６００、通常約５０から約２００、さらに通常では約１００から約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において十分周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所相同アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同アライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性についての検索の法によって、これらのアルゴリズム（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、または手作業でのアライメントおよび目視検査［例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement）を参照されたい］によって、実行され得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、Altschul et al., Nuc. Acids Res.25: 3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載されるパラメーターを用いて使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合に、一定の正値の閾値スコアＴに合致するまたは満たす、クエリー配列中の長さの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Altschul et al.、上記）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含む長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードの役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加できる限り、各配列の両方に沿って延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（合致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列について、スコア化マトリクスは、累積スコアを算出するために使用される。各方向へのワードヒットの延長は、累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘより下がる場合；１つもしくは複数の負スコアの残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる場合；または配列のいずれかの端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、予測（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、ワード長３および予測（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリクス［Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. SciUSA 89: 10915 (1989)を参照されたい］アライメント（Ｂ）５０、予測（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。
【0148】
「ドルーゼン」は、脂質、液体、補体経路関連タンパク質を含む種々のタンパク質を含み、ＲＰＥ基底膜とブルッフ膜との間に位置する限局性細胞外沈着物である。ドルーゼンは、白色／黄色ドットとして検眼鏡で見ることができ、Wu et al., 2015, "FUNDUS AUTOFLUORESCENCE CHARACTERISTICS OF NASCENT GEOGRAPHIC ATROPHY IN AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION" Invest Ophthalmol Vis Sci. 56:1546-52および参考文献の参考文献１～８に記載されているものを含む、当技術分野において周知の種々の方法を使用して検出され得る。本明細書において使用される場合、用語「小さなドルーゼン」および「小さな硬いドルーゼン」は、約６３μｍ未満の直径を有する別個のドルーゼンを指す。用語「大きなドルーゼン」、「柔らかいドルーゼン」および「大きくて柔らかいドルーゼン」は、約１２５μｍより大きい直径を有し、しばしばクラスター化されるドルーゼンを指す。６３から１２５μｍの間の直径を有するドルーゼンは、「中間ドルーゼン」と称され得る。典型的には色素上皮剥離（ＰＥＤ）と称されるＲＰＥの局所的剥離は、しばしばドルーゼンと呼ばれる。
【0149】
本明細書において使用される場合「ハプロタイプ」は、一緒に伝達される染色体上の種々の遺伝子座に存在するＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列の組合せを指す；ハプロタイプは、所与のセットの遺伝子座間に生じた組換え事象の数に応じて、１つの遺伝子座、数個の遺伝子座、または染色体全体である場合がある。
【0150】
用語「多型」は、集団において１つまたは複数の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の出現を指す。「多型部位」は、配列の相違が生じた遺伝子座である。多型部位は、少なくとも１つの対立遺伝子を有する。二対立遺伝子（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は、２つの対立遺伝子を有する。三対立遺伝子（ｔｒｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は、３つの対立遺伝子を有する。二倍体生物は、対立遺伝子の形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性である場合がある。多型部位は、１つの塩基対ほどに小さい場合がある。多型部位の例として：制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、縦列反復配列多型（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＶＮＴＲ）、高頻度可変性領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復および単純反復配列が挙げられる。本明細書において使用される場合、「多型」への言及は、多型のセット（すなわち、ハプロタイプ）を包含する場合がある。
【0151】
「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」は、対立遺伝子の配列間の変動部位である、単一ヌクレオチドによって占められる多型部位で生じ得る。部位は、対立遺伝子の高度の保存された配列によって先行され、およびそれが続く場合がある。ＳＮＰは、多型部位での１つのヌクレオチドの別のものでの置換のために生じ得る。１つのプリンの別のプリンによる、または１つのピリミジンの別のピリミジンによる置換は、トランジションと呼ばれる。プリンのピリミジンによる、またはその逆は、トランスバージョンと呼ばれる。同義ＳＮＰは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない、コード領域における１つのヌクレオチドの別のものでの置換を指す。非同義ＳＮＰは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する、コード領域における１つのヌクレオチドの別のものでの置換を指す。ＳＮＰは、参照対立遺伝子と比べて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入から生じる場合もある。
【0152】
本明細書において使用される場合、「連鎖不平衡」または「ＬＤ」は、必ずしも同じ染色体上ではない２つ以上の遺伝子座での対立遺伝子の非無作為関連である。それは、それらの間の限定的組換えを有する染色体上の２つ以上の遺伝子座の関連を述べる連鎖と同じではない。連鎖不平衡は、対立遺伝子または遺伝的マーカーの一部の組み合わせが、対立遺伝子からのハプロタイプの無作為形成からそれらの頻度に基づいて予測されるものよりも、集団においてより高い頻度でまたは少ない頻度で生じる状況を述べている。さまざまな遺伝子座での多型間の非無作為関連は、連鎖不平衡（ＬＤ）の程度によって測定される。連鎖不平衡のレベルは、遺伝連鎖、組換え比率、突然変異の比率、無作為ドリフト、非任意交配および集団構造が挙げられる多数の要因によって影響を受ける場合がある。したがって「連鎖不平衡」または「対立遺伝子の関連」は、集団中の任意の具体的な対立遺伝子の頻度について偶然から予測されるよりも高い頻度を有する、特定の対立遺伝子または遺伝的マーカーと別の特異的対立遺伝子または遺伝的マーカーとの、非無作為関連を意味する。情報価値のあるマーカーを含む連鎖不平衡におけるマーカー、本明細書に記載されるＳＮＰ、ハプロタイプまたはディプロタイプの１つなどは、Ｃｈｒ１０誘発ＡＭＤへの易罹患性を検出するために有用であり得る。
【0153】
「ＡＲＭＳ２」は、ＡＭＤ易罹患性２遺伝子を指す。ＡＲＭＳ２遺伝子は、２つのエクソンからなり、周知のタンパク質モチーフに相同を有さず、機能が不明である１０７アミノ酸タンパク質を理論上にはコードする。細胞内のＡＲＭＳ２タンパク質の発現および局在は、理解しにくいままであり、不十分に特徴付けられた抗体の使用は矛盾する報告を生じている（Fritsche et al., 2008；Kanda et al. , 2007；Kortvely et al, 2010；Wang et al., 2012）。さらに、ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析は、ＡＲＭＳ２ ｍＲＮＡの発現が、精巣（ＴＰＭはおよそ６．９）および胎盤（ｑＲＴ－ＰＣＲ、データ未記載）を除く大部分の組織において例外的に低い（ＴＰＭ＜１．０）ことを示している（Lonsdale et al., 2013; The GTEx Consortium, 2015）。
【0154】
「ＨＴＲＡ１」は、ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１を指し、そのｍＲＮＡおよびタンパク質は、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７７５およびＮＰ＿００２７６６によってそれぞれ表される。ＨＴＲＡ１は、検討されたほとんどすべての細胞および組織において遍在性に発現されており、網膜の光受容細胞および水平細胞、脈絡膜における網膜色素上皮（ＲＰＥ）および種々の細胞型において豊富に発現されている（図１）。ＨＴＲＡ１は、網膜およびＲＰＥと比較して、ブルッフ膜および脈絡膜由来の抽出物において富化されている（図６）。ＨＴＲＡ１は、分泌セリンプロテアーゼとして作用し、溶液中で主におよそ１５０ｋＤａ三量体として存在する。ＨＴＲＡ１は、アロステリック機構によって活性化され（Cabrera et al., 2017）、種々の細胞外マトリクスタンパク質、プロテオグリカン、ならびにＴＧＦｂ、ＦＧＦおよびＩＧＦＢＰなどの多数の増殖因子を切断する。ＨＴＲＡ１ノックアウトマウスモデルでは、ＨＴＲＡ１の喪失は、脳血管プロテオームにおいてＴＩＭＰ３、クラスタリン、エラスチン、ビトロネクチンおよびフィビュリン３を含む多数のＥＣＭタンパク質の増加を生じる（Zellner et al., 2018）。ＨｔｒＡ１プロテアーゼ活性を損なう、またはｍＲＮＡ発現を低減する機能喪失突然変異は、脳における加齢性の脈管構造欠損のためにＣＡＲＡＳＩＬ（皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体劣性脳動脈症）も生じる場合がある（Hara et al., 2009；Fukutake, 2011）。
【0155】
用語「処置」またはその任意の文法的変化形（例えば、処置する、処置すること、処置など）は、本明細書において使用される場合これだけに限らないが、疾患もしくは状態の症状を軽減する；ならびに／または疾患または状態の進行、重症度、および／もしくは範囲を低減する、抑制する、阻害する、和らげる、軽快させるもしくは影響を与えることを含む。
【0156】
本明細書において使用される場合、用語「転写制御領域」は、ＨＴＲＡ１プロモーターおよびＨＴＲＡ１エンハンサーを指す。
【0157】
本明細書において使用される場合、用語「エンハンサー」は、ＨＴＲＡ１ ２ｋｂ領域を指す。
【0158】
本明細書において使用される場合、用語「に対応する」は、配列の文脈では相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）、ＵがＴになど文脈から明らかである置換を除いてＤＮＡ配列と等価であるＲＮＡ配列を指す。
【0159】
本明細書において使用される場合「コドン最適化」は、当技術分野におけるその通常の意味を有する。コドン最適化は、最適化されていない配列を使用して産生された転写物と比較して、翻訳の速度を増加させる、または長い半減期またはより大きな発現効率などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために使用され得る。一部の実施形態では、本開示は、発現効率を最大化するように操作されたＨＴＲＡ１コード配列を提供する。コドン最適化のための方法は、容易に利用可能である、例えば、ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、http://genomes.urv.es/OPTIMIZERおよびＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において無料でアクセス可能である。具体的な実施形態では、コード配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）からのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭアルゴリズムを使用してヒトでの発現のためにコドン最適化される。
【0160】
本明細書において使用される場合、「ヌクレアーゼ活性を欠いている」Ｃａｓタンパク質は、野生型等価物と比べて活性が少なくとも５０％低減、時に少なくとも８０％低減、時に少なくとも９５％低減および時に少なくとも９９％低減している。
【0161】
本明細書において使用される場合、用語「水平細胞」は、当技術分野における通常の意味を有する。例えば、Poche et al., "Retinal horizontal cells: challenging paradigms of neural development and cancer biology", Development, 2009, 136, Pages 2141-2151、を参照されたい。「水平細胞」は、脊椎動物の眼の網膜の内顆粒層にその細胞体を有する、側方に相互接続しているニューロンである。それらは、複数の光受容細胞からの入力を統合し、制御している。
【0162】
本明細書において使用される場合、用語「光受容細胞」は、神経網膜の最外側層において見出される特定化された神経上皮細胞である。それらは、視覚の光伝達（ｖｉｓｕａｌ ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を可能にし、２つの主な種類、暗所視を媒介する桿体および明所視を媒介する錐体がある。
【0163】
本明細書において使用される場合、「プログラム可能な」エンドヌクレアーゼは、関連分子（例えば、Ｃａｓタンパク質についてのｇＲＮＡ）の選択、融合したタンパク質配列、または他の手段によって特定のＤＮＡ配列に特異的に標的化され得るヌクレアーゼである。
【0164】
次の慣習が本明細書において使用される。ＤＮＡ「標的配列」［Ａ］は、第１のＤＮＡ鎖上のＰＡＭ［Ｐ］と連続している。標的配列の相補体［Ｃ］は、相補的ＤＮＡ鎖に見出される。ｇＲＮＡのガイド配列［Ｇ］は、標的の相補体にハイブリダイズし、相補的であり、ＤＮＡにおけるチミジンがＲＮＡにおいてウラシルによって置き換えられていることを除いて標的［Ａ］の配列を有する。ｇＲＮＡのガイド配列は、［Ｃ］から転写によって産生され得る。
【0165】
他に示されない限り、ヌクレオチド配列は５’から３’に示される。
【0166】
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の実行または検査において使用され得るが、代表的で例示的な方法および材料がここに記載される。
【実施例】
【0167】
１４．１ 第１０染色体リスク対立遺伝子を有するヒトドナーのＲＰＥにおいてＨＴＲＡ１の発現は、低減されている。
本実施例は、ＡＭＤリスク対立遺伝子を有する個体由来のヒトドナー眼が、対照と比較してｍＲＮＡ ＨＴＲＡ１発現が低いことを示す。
本実施例は、ＡＭＤリスク対立遺伝子を有する個体由来のヒトドナー眼が、対照と比較してｍＲＮＡ ＨＴＲＡ１発現が低いことを示す。
【0168】
マイクロアレイベース遺伝子発現分析は、ヒトドナー眼組織の２つの独立したセット（それぞれ８０個および２００個のドナー試料を含む）を使用して実行した。結果は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルが、非リスク対立遺伝子についてホモ接合性の非リスクドナーと比較して、ｒｓ１０４９０９２４でのリスク対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性のヒトドナーのＲＰＥ脈絡膜組織において減少していたことを示している（図２および図３０）。ＲＰＥ脈絡膜（ｃｈｏｒｉｏｄ）組織におけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルの低減の結果は、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した（図３Ａおよび３Ｂ）。ヘテロ接合性ドナーＲＰＥ組織試料由来のｍＲＮＡを使用する対立遺伝子特異的発現分析も野生型対立遺伝子ｍＲＮＡと比較してリスク対立遺伝子ｍＲＮＡの顕著で再現性のある減少を示した。非リスク対立遺伝子対リスク対立遺伝子でのｍＲＮＡのコピー数をデジタルＰＣＲおよびＴａｑｍａｎ ＳＮＰアッセイを使用して決定した。対立遺伝子特異的ｍＲＮＡ変化は、同じドナー試料由来の脈絡膜または網膜において検出されなかった（図４）。対立遺伝子特異的ＨＴＲＡ１発現アッセイから得られたこれらの結果は、ＡＭＤ関連リスク対立遺伝子がＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現の低減をもたらしていることを強く支持している。
【0169】
結果は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの低減が組織特異的であり、ＲＰＥにおいてだけ検出され、網膜ではされなかったことも示している。図２、図３Ａ、図３Ｂおよび図３０は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルは、２つの野生型非リスク対立遺伝子を有する非リスクドナーと比較して、１つまたは２つのリスク対立遺伝子をｒｓ１０４９０９２４に有する患者のＲＰＥ脈絡膜組織において減少していたが、網膜でのＨＴＲＡ１発現は変化しないままであったことを示している。
【0170】
１４．２ ヒト非ＡＭＤ試料由来の眼組織においてＨＴＲＡ１発現は、ブルッフ膜および脈絡膜で富化されている。
本実施例は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡが極性様式で分泌され、非ＡＭＤ試料由来のヒト眼組織においてブルッフ膜および脈絡膜で富化されていることを示している。
本実施例は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡが極性様式で分泌され、非ＡＭＤ試料由来のヒト眼組織においてブルッフ膜および脈絡膜で富化されていることを示している。
【0171】
極性ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ１細胞（ヒトＲＰＥ細胞株、Bodnar et al., 1998, Science 279: 349-52を参照されたい）およびヒト胎児ＲＰＥ細胞の両方において、ＨＴＲＡ１タンパク質は、７０％のＨｔｒＡ１は頂端で分泌され、３０％は基底で分泌されて極性様式で分泌された（図５Ａおよび５Ｂ）。ＨＴＲＡ１の基底分泌は、ＨＴＲＡ１三量体が、ブルッフ膜およびＲＰＥ基底膜の選択的透過性のために、脈絡毛細管からＲＰＥ下腔へ侵入することは期待されないことから、高齢者においてＲＰＥ下のＨＴＲＡ１の排他的供給源である可能性がある（Moore, DJ et. al., 2001）。ＲＰＥとブルッフ膜との間の境界面は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質が大きく富化されており、ＨＴＲＡ１、種々のＥＣＭタンパク質を分解する能力が実証された分泌セリンプロテアーゼが、この腔において加齢に関連する必須の機能を有すると考えられる。網膜、ＲＰＥおよび脈絡膜と比べて、データは、ＨＴＲＡ１タンパク質が、ＡＭＤを有さない患者由来の試料中のブルッフ膜由来の抽出物において富化されていたことを示している（図６）。特定の理論または機構に束縛されることを意図せず、これらの結果は、ＲＰＥ下腔においてＨＴＲＡ１タンパク質が減少しているホモ接合性リスク患者が、損傷した、ミスフォールドした、および／または凝集したタンパク質の蓄積を生じるＥＣＭタンパク質のプロセシング、維持または代謝回転の変化を有するとするモデルと一致している。これは、ＲＰＥ組織のその基底膜への、および／またはブルッフ膜への付着を破壊でき、血液網膜関門の喪失を生じる。これを支持することには、本発明者らは、脈絡膜（ｃｈｒｏｉｄａｌ）線維症および基底膜沈着物（ＢＬＤ）（ＲＰＥ細胞膜と基底膜との間にあり、後期ＡＭＤと強く関連するとして以前示された異常な細胞外材料）の両方が、第１０染色体リスクについてホモ接合性のドナーにおいて生じることを実証した（表１、上記）。誤制御を生じるいくつかのＥＣＭ構造タンパク質における突然変異は、Ｌ－ＯＲＤ（Ｃ１ｑＴＮＦ５）、ソースビー眼底変性症（ＴＩＭＰ３）、エーラース・ダンロス症候群ＶＩ型（ＰＬＯＤ１）またはドインの蜂巣状網膜ジストロフィー（ＥＦＥＭＰ１）を含むＡＭＤ様疾患をもたらす。Hayward et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2657-67 (2003)；Weber et al., Nat.Genet 8 (4): 352-6;およびMarmorstein et al., PNAS. 99 (20): 13067-72を参照されたい。これは、ＥＣＭおよびＢＬＤの形成の変化が共通の原因を共有していると考えられると示唆している。
【0172】
１４．３ ヒト眼球組織中のＨｔｒＡ１タンパク質
ＡＡＶ－ＨＴＲＡ１治療の目標は、機能を回復させるために治療量のＨｔｒＡ１を眼にデリバリーすることである。この目標に向けて、ヒトおよびＡＧＭ眼球組織中のＨｔｒＡ１濃度の理解が必要である。本発明者らは、種々の眼球組織の抽出物からＥＬＩＳＡアッセイによってＨｔｒＡ１の濃度を測定した。ヒト眼球組織における濃度を表６にまとめる。
ＡＡＶ－ＨＴＲＡ１治療の目標は、機能を回復させるために治療量のＨｔｒＡ１を眼にデリバリーすることである。この目標に向けて、ヒトおよびＡＧＭ眼球組織中のＨｔｒＡ１濃度の理解が必要である。本発明者らは、種々の眼球組織の抽出物からＥＬＩＳＡアッセイによってＨｔｒＡ１の濃度を測定した。ヒト眼球組織における濃度を表６にまとめる。
【0173】
【表6】
【0174】
Ｃｈｒ１０遺伝子座でのリスクを有するまたは有さないドナーにおける年齢に応じた黄斑外網膜およびＲＰＥ脈絡膜におけるＨｔｒＡ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルの比較は、ＨｔｒＡ１レベルがＣｈｒ１０リスク状況と無関係に加齢で網膜において比較的変化しないが（図１２）、Ｃｈｒ１０リスクを有さないドナーのＲＰＥ脈絡膜において加齢で顕著に増加することを実証した（図１３Ａ）。対照的にＣｈｒ１０リスクを有するドナーは、非リスクドナーのＲＰＥ脈絡膜におけるＨｔｒＡ１の年齢依存的増加に顕著な機能障害を示す。これは、非リスクドナーにおけるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの同様の年齢依存的増加と一致するが、リスクを有するドナーでは一致しない（図１３Ｂ）。特定の理論または機構に束縛されることを意図せず、これらの結果は、年齢と共にＨｔｒＡ１に対する要求の増加があり、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの転写上方制御によって対処され、より多いＨｔｒＡ１タンパク質の翻訳をもたらすが、リスクについてホモ接合性のドナーでは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルのいずれでもＨＴＲＡ１を上方制御できないとするモデルと一致する。
【0175】
１４．４ ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現の減少を生じる制御エレメントを含有する４Ｋｂ領域は、ＡＭＤリスクとも関連する。
本実施例は、ＨＴＲＡ１の減少を生じる原因となるゲノム領域が、ＡＭＤを発症するリスクと関連する領域と合致することを示す。
本実施例は、ＨＴＲＡ１の減少を生じる原因となるゲノム領域が、ＡＭＤを発症するリスクと関連する領域と合致することを示す。
【0176】
ＡＭＤの原因である第１０染色体上の領域（リスク領域）を狭めるために、ＨＴＲＡ１対立遺伝子特異的発現アッセイを、ＡＭＤ関連ＡＲＭＳ２／ＨＴＲＡ１ ＬＤブロック内に稀な組換え事象を有するドナー由来のｍＲＮＡを使用して実施した。ドナーは、ＨＴＲＡ１エクソン１においてｒｓ１０４９３３１ ＳＮＰでヘテロ接合性であったが、ＬＤブロック内の上流ＳＮＰの一部においてリスクまたは非リスク対立遺伝子のいずれかについてホモ接合性であった。これらのドナーを、対立遺伝子特異的発現アッセイにおいて使用し、ＤＮＡ配列決定を介して各ドナー中の組換え部位をマッピングし、ＨＴＲＡ１プロモーターＳＮＰおよびＡＲＭＳ２挿入欠失（インデル）領域をＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現の減少の原因となるドライバーとして除外した。代わりに、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの減少に関連する領域をｒｓ１０４９０９２４（ＡＲＭＳ２ Ａ６９Ｓ）を含み、ｒｓ１１２００６３２とｒｓ３７５０８４６ ＳＮＰとを含めてそれらの間にある上流制御領域にマッピングした（表８）。同じ遺伝的領域が、症例／対照研究における組換えハプロタイプの分析でGrassmann et al (Genetics 2017)によって、ＡＭＤ疾患のリスクの上昇と関連することが見出された。ＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現と関連する領域が、ＡＭＤリスクと関連する同じ領域と合致するという発見は、ＨＴＲＡ１発現におけるリスク関連低減がＡＭＤ発生率の上昇をもたらすことを強く意味する。この領域を、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域と称する。
【0177】
下の表７は、ＡＲＭＳ２領域の９個のハプロタイプを示し、それぞれ集団の２％より多くを構成する。ハプロタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ６は、すべてＣｈｒ１０ ＡＭＤリスクの増加を示し、すべてＳＮＰ ｒｓ１０４９０９２４にＴ対立遺伝子を含む。これは、ｒｓ１０４９０９２４（Ａ６９Ｓ）でのリスク対立遺伝子の存在がＣｈｒ１０ ＡＭＤの発症と関連していることを示している。
【0178】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【0179】
【表8】
【0180】
１４．５ ＨＴＲＡ１とｌｎｃＳＣＴＭ１ ｍＲＮＡ発現との間の逆相関
本実施例は、ＨＴＲＡ１とｉｎｃＳＣＴＭ１対立遺伝子特異的ｍＲＮＡ発現との間の逆相関を実証する。長い非コードＲＮＡ（ＬＯＣ１０５３７８５２５）が、同定され、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域と重複する領域にマッピングされた。本発明者らの分析は、ＸＲ＿９４６３８２、ＸＲ＿９４６３８３、ＸＲ＿９４６３８４およびＸＲ＿９４６３を含むｌｎｃＲＮＡの４つの予測される変異体があることを示した（図７）。ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ１細胞、網膜およびＲＰＥ組織において検出されたｌｎｃＳＣＴＭ１の種々のアイソフォームを表９に示す。このｌｎｃＲＮＡはＨＴＲＡ１プロモーターからアンチセンス方向に転写され、ＨＴＲＡ１およびＬＯＣ１０５３７８５２５が重複する分岐プロモーターを共有する可能性があると考えられる。本発明者らは、このｌｎｃＲＮＡをｌｎｃＳＣＴＭ１と称した。網膜およびＲＰＥ由来のＲＮＡのＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）ＰＣＲ分析は、ＸＲ＿９４６３８２変異体１にマッピングされるエクソン３が報告されたよりもおよそ１ｋｂ伸長していることを示している。これは、リードが種々の組織でこの伸長された領域にマッピングされる、ＧＴＥｘコンソーシアムからのＲＮＡ－ｓｅｑデータによって支持される。ＲＡＣＥ ＰＣＲも、変異体４（ＸＲ＿９４６３８５）にマッピングされる代替エクソン３が、ｈｇ３８ Ｃｈｒ１０：１２２，４５５，０２１（ａｌｔ ｅｘ３ａ）またはＣｈｒ１０：１２２，４５４，８５７（Ａｌｔ ｅｘ３ｂ）のいずれかで開始し、Ｃｈｒ１０：１２２，４５４，４５７にアンチセンス方向で伸長することを示している。配列分析は、ａｌｔ ｅｘ３ａ変異体がｒｓ１０４９０９２４ ＳＮＰを含有し、そのリスク形態がＡＭＤリスクの上昇と関連する一方で、ａｌｔ ｅｘ３ｂは関連しないことを示している。さらに、代替的エクソン３の代わりにエクソン３を含む変異体は、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域中にｒｓ１０４９０９２４および任意の他のＳＮＰを含有しない。ｌｎｃＳＣＴＭ１代替的エクソン３は、ＡＲＭＳ２エクソン１とほとんど完全に重複している。
本実施例は、ＨＴＲＡ１とｉｎｃＳＣＴＭ１対立遺伝子特異的ｍＲＮＡ発現との間の逆相関を実証する。長い非コードＲＮＡ（ＬＯＣ１０５３７８５２５）が、同定され、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域と重複する領域にマッピングされた。本発明者らの分析は、ＸＲ＿９４６３８２、ＸＲ＿９４６３８３、ＸＲ＿９４６３８４およびＸＲ＿９４６３を含むｌｎｃＲＮＡの４つの予測される変異体があることを示した（図７）。ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ１細胞、網膜およびＲＰＥ組織において検出されたｌｎｃＳＣＴＭ１の種々のアイソフォームを表９に示す。このｌｎｃＲＮＡはＨＴＲＡ１プロモーターからアンチセンス方向に転写され、ＨＴＲＡ１およびＬＯＣ１０５３７８５２５が重複する分岐プロモーターを共有する可能性があると考えられる。本発明者らは、このｌｎｃＲＮＡをｌｎｃＳＣＴＭ１と称した。網膜およびＲＰＥ由来のＲＮＡのＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）ＰＣＲ分析は、ＸＲ＿９４６３８２変異体１にマッピングされるエクソン３が報告されたよりもおよそ１ｋｂ伸長していることを示している。これは、リードが種々の組織でこの伸長された領域にマッピングされる、ＧＴＥｘコンソーシアムからのＲＮＡ－ｓｅｑデータによって支持される。ＲＡＣＥ ＰＣＲも、変異体４（ＸＲ＿９４６３８５）にマッピングされる代替エクソン３が、ｈｇ３８ Ｃｈｒ１０：１２２，４５５，０２１（ａｌｔ ｅｘ３ａ）またはＣｈｒ１０：１２２，４５４，８５７（Ａｌｔ ｅｘ３ｂ）のいずれかで開始し、Ｃｈｒ１０：１２２，４５４，４５７にアンチセンス方向で伸長することを示している。配列分析は、ａｌｔ ｅｘ３ａ変異体がｒｓ１０４９０９２４ ＳＮＰを含有し、そのリスク形態がＡＭＤリスクの上昇と関連する一方で、ａｌｔ ｅｘ３ｂは関連しないことを示している。さらに、代替的エクソン３の代わりにエクソン３を含む変異体は、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域中にｒｓ１０４９０９２４および任意の他のＳＮＰを含有しない。ｌｎｃＳＣＴＭ１代替的エクソン３は、ＡＲＭＳ２エクソン１とほとんど完全に重複している。
【0181】
【表9】
【0182】
時にｌｎｃＲＮＡが近くの遺伝子の発現を制御することから、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよびｌｎｃＳＣＴＭ１ ｎｃＲＮＡのレベル間の関連を、ＨＴＲＡ１（ｒｓ１０４９３３１、エクソン１）およびｌｎｃＳＣＴＭ１（ｒｓ１１２００６３８、エクソン１）についての対立遺伝子特異的発現アッセイを使用して検討した。ヘテロ接合性ドナー由来のｍＲＮＡをアッセイにおいて使用し、予測される５０：５０比からのいかなる偏差も、対立遺伝子特異的発現の指標であった。転写物が予測される鎖由来であることを確実にするための遺伝子特異的プライマーをｃＤＮＡ合成のために使用した。ＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現が、ｌｎｃＳＣＴＭ１の対立遺伝子特異的発現と逆相関したことが観察された。結果は、ｌｎｃＳＣＴＭ１のリスク対立遺伝子由来のｍＲＮＡが非リスク対立遺伝子由来のものより高いレベルで発現された一方で、ＨＴＲＡ１のリスク対立遺伝子由来のｍＲＮＡが非リスク対立遺伝子のものと比較して減少していたことも示した（図８）。図８で分析されたリスク対立遺伝子は、ｒｓ１０４９０９２４を含むＡＭＤと関連するＬＤブロック中にあるｒｓ１１２００６３８であった。ｒｓ１１２００６３８も、ｌｎｃＳＣＴＭ１のエクソン１にあり、ｌｎｃＳＣＴＭ１のすべてのアイソフォームに存在する。網膜およびＲＰＥのＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡが、ｌｎｃＳＣＴＭ１ ｍＲＮＡよりも＞４００倍高いレベルで発現されたことを示している（データ未記載）。ｌｎｃＳＣＴＭ１がＨＴＲＡ１発現を制御する場合、ＨＴＲＡ１をトランスで制御できるとは考えにくく、それよりもｌｎｃＳＣＴＭ１がＨＴＲＡ１転写へのシス効果を介してＨＴＲＡ１の発現を制御すると考えられる。
【0183】
１４．６ ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現の減少をもたらす調節エレメントを含有する２ｋｂ ＡＭＤリスク領域
エピジェネティックマーカー
本実施例は、ＨＴＲＡ１転写およびそれに関連する転写活性化因子の制御を担う新たに同定された２ｋｂ領域を記載する。ヒト胎児ＲＰＥ組織由来またはＲＰＥに分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）由来の公的に入手可能なエピジェネティックデータ（ＡＴＡＣ－ＳｅｑおよびＤＮａｓｅ－Ｓｅｑ）の検討は、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域と重複するオープンクロマチンのおよそ２．０ｋｂ領域を示している。さらにこの同じ２ｋｂ領域は、Ｈ３Ｋ２７アセチル化を含む活性転写のエピジェネティックマーカーを含む。この２ｋｂ領域は、ｌｎｃＳＣＴＭ１のＡＲＭＳ２エクソン１－イントロン１および代替エクソン３の両方（図１０）、ならびにｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３およびｒｓ３７５０８４８を含む４ｋｂ ＡＭＤリスク領域中の他のＳＮＰと重複する。
エピジェネティックマーカー
本実施例は、ＨＴＲＡ１転写およびそれに関連する転写活性化因子の制御を担う新たに同定された２ｋｂ領域を記載する。ヒト胎児ＲＰＥ組織由来またはＲＰＥに分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）由来の公的に入手可能なエピジェネティックデータ（ＡＴＡＣ－ＳｅｑおよびＤＮａｓｅ－Ｓｅｑ）の検討は、４ｋｂ ＡＭＤリスク領域と重複するオープンクロマチンのおよそ２．０ｋｂ領域を示している。さらにこの同じ２ｋｂ領域は、Ｈ３Ｋ２７アセチル化を含む活性転写のエピジェネティックマーカーを含む。この２ｋｂ領域は、ｌｎｃＳＣＴＭ１のＡＲＭＳ２エクソン１－イントロン１および代替エクソン３の両方（図１０）、ならびにｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３およびｒｓ３７５０８４８を含む４ｋｂ ＡＭＤリスク領域中の他のＳＮＰと重複する。
【0184】
網膜およびＲＰＥ抽出物のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ分析をモノメチル化ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）およびアセチル化ヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）を含む、エンハンサーエレメントと関連するヒストンマークを標的化する抗体を用いて実施した。ＲＰＥ抽出物では、両マークは、オープンクロマチン領域と重複するピークに存在した一方で、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１マークだけは網膜に存在した。これらの結果は、ＡＲＭＳ２イントロン内のこのおよそ２ｋｂ領域が、組織特異的エンハンサーエレメントとして機能するという仮説を支持する。
【0185】
２ｋｂ領域に位置するＳＮＰ。
ＳＮＰ ８個（ｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３、ｒｓ３７５０８４８、ｒｓ３７５０８４７、ｒｓ３７５０８４６）は、Ｃｈｒ１０ ＬＤブロック内にある。
ＳＮＰ ８個（ｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４４２２４５５０、ｒｓ３６２１２７３１、ｒｓ３６２１２７３２、ｒｓ３６２１２７３３、ｒｓ３７５０８４８、ｒｓ３７５０８４７、ｒｓ３７５０８４６）は、Ｃｈｒ１０ ＬＤブロック内にある。
【0186】
１４．７ ２Ｋｂ領域は、野生型には存在するがリスク対立遺伝子には存在しないＬＨＸ２コンセンサス結合モチーフを含む。
本発明者らは、周知の転写因子結合モチーフについて、ＨＯＭＥＲ、ＪＡＳＰＥＲおよびＴＲＡＮＳＦＡＣツールを使用して配列をスキャンし、各ＡＭＤ関連ＳＮＰについて非リスクとリスク遺伝子型とを比較した。この分析は、ＡＲＭＳ２のイントロン中のｒｓ３６２１２７３３変異体をＬＨＸ２、ＰＯＵ６Ｆ１および／またはＺＮＦ３３の予測された遺伝子型依存性差次的結合を有する転写因子結合部位として同定した。これらの内、ＬＨＸ２ｍＲＮＡ発現は、ＲＰＥにおいて中程度（ＦＰＫＭ＞２０）である一方で、ＰＯＵ６Ｆ１およびＺＮＦ３３３発現は低い（ＦＰＫＭ＜２）。スクリーニングしたこれらの内、ＬＨＸ２だけが野生型内に位置するがリスク配列にはないコンセンサス結合モチーフを有し、ＡＲＭＳ２およびｌｎｃＳＣＴＭ１のイントロン中にこの配列モチーフ（図９）に対するほとんど完全なマッチがあった。ＬＨＸ２も網膜および脈絡膜中の一部の細胞型において発現されることから、ＲＰＥ特異的転写因子ではない。ＡＭＤのリスクに関連するｒｓ３６２１２７３３ ＳＮＰは、６位の「Ｔ」を「Ｃ」に変換することによって、このモチーフ内の重要な残基の１つを破壊する。ＬＨＸ２部位は、転写因子のＳｏｘＥファミリーのメンバーのための２つの潜在的な結合部位によって囲まれているが、これらはＣｈｒ１０関連ＳＮＰと重複しない。
本発明者らは、周知の転写因子結合モチーフについて、ＨＯＭＥＲ、ＪＡＳＰＥＲおよびＴＲＡＮＳＦＡＣツールを使用して配列をスキャンし、各ＡＭＤ関連ＳＮＰについて非リスクとリスク遺伝子型とを比較した。この分析は、ＡＲＭＳ２のイントロン中のｒｓ３６２１２７３３変異体をＬＨＸ２、ＰＯＵ６Ｆ１および／またはＺＮＦ３３の予測された遺伝子型依存性差次的結合を有する転写因子結合部位として同定した。これらの内、ＬＨＸ２ｍＲＮＡ発現は、ＲＰＥにおいて中程度（ＦＰＫＭ＞２０）である一方で、ＰＯＵ６Ｆ１およびＺＮＦ３３３発現は低い（ＦＰＫＭ＜２）。スクリーニングしたこれらの内、ＬＨＸ２だけが野生型内に位置するがリスク配列にはないコンセンサス結合モチーフを有し、ＡＲＭＳ２およびｌｎｃＳＣＴＭ１のイントロン中にこの配列モチーフ（図９）に対するほとんど完全なマッチがあった。ＬＨＸ２も網膜および脈絡膜中の一部の細胞型において発現されることから、ＲＰＥ特異的転写因子ではない。ＡＭＤのリスクに関連するｒｓ３６２１２７３３ ＳＮＰは、６位の「Ｔ」を「Ｃ」に変換することによって、このモチーフ内の重要な残基の１つを破壊する。ＬＨＸ２部位は、転写因子のＳｏｘＥファミリーのメンバーのための２つの潜在的な結合部位によって囲まれているが、これらはＣｈｒ１０関連ＳＮＰと重複しない。
【0187】
特定の理論または機構に束縛されることを意図せず、これらのデータは、ＬＨＸ２が、ＨＴＲＡ１の上流に位置する４ｋｂ ＡＭＤリスク領域でｒｓ３６２１２７３３と重複し、ＡＲＭＳ２およびｌｎｃＳＣＴＭ１遺伝子の両方と重複するモチーフに結合するとするモデルと一致する。非リスクＲＰＥ細胞では、ＬＨＸ２は、このモチーフにＲＰＥ特異的補助因子と共に結合し、ＨＴＲＡ１転写のエンハンサーとして作用し、それによりＲＰＥ特異的様式で基底レベルより上にＨＴＲＡ１の発現を増加させる。ＲＰＥ特異的補助因子がこの時点で何であるか、およびその発現が加齢性因子または他の外部シグナルによって影響を受けるかどうかは不明である。ＬＨＸ２のこのエンハンサーへの結合が、ｌｎｃＳＣＴＭ１の転写を進めるＲＮＡポリメラーゼの能力を妨害する場合、これはｌｎｃＳＣＴＭ１遺伝子の発現の減少をもたらす。ＬＨＸ２が非リスク対立遺伝子だけに結合すると予測されていることから、これは、ヘテロ接合性ドナーでのリスク対立遺伝子と比べた非リスク対立遺伝子のレベルの低減を含む対立遺伝子の不均衡をもたらす。この仮説は、ＲＰＥ細胞におけるＨＴＲＡ１およびｌｎｃＳＣＴＭ１の対立遺伝子特異的発現の間に逆相関があるとの本発明者らの発見によって支持される（図８）。最後に、非ＲＰＥ細胞では、ＬＨＸ２の非リスク配列への結合は、ＲＰＥ特異的補助因子が存在しないためにＨＴＲＡ１発現を増強しない。しかしそれでも、それは、ｌｎｃＳＣＴＭ１転写に干渉し、非リスク対立遺伝子の低いレベルの発現を生じる。それにより、非ＲＰＥ組織では、ＨＴＲＡ１の対立遺伝子特異的発現はないが、細胞がＬＨＸ２を発現する限りｌｎｃＳＣＴＭ１の対立遺伝子特異的発現は残る。
【0188】
１４．８ ＬＨＸ２は、リスク配列を含むプローブへよりも野生型プローブにさらに強く結合する。
ＬＨＸ２がこのＤＮＡ配列に結合できるかどうかを検査するために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、ＬＨＸ２をコードするプラスミドまたは空ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞由来の核抽出物、ならびに非リスク（ＷＴ）配列、またはｒｓ３６２１２７３２およびｒｓ３６２１２７３３を包含するＣｈｒ１０領域のリスク配列（ＲＩＳＫ）を含有するビオチン化オリゴプローブを使用して実施した。この領域のスクランブル配列（ＳＣＲ、陰性対照）または以前報告されたＬＨＸ２結合部位（ＰＯＳ、陽性対照）を含有するプローブ（Muralidharan et al. (2017) J. Neurosci 37 (46): 11245-54）も使用した。結果は、ＬＨＸ２は、野生型およびリスクプローブの両方ならびに陽性対照プローブに結合したが、スクランブルプローブに結合しなかったことを示している（図１０Ａ）。抗ＬＨＸ２抗体の反応への添加は、ＬＨＸ２バンドのスーパーシフトを生じ、ＬＨＸ２の同一性を確認し、未標識プローブの添加は、バンドの喪失を生じた（図１０Ｂ）。最終的に本発明者らは、反応に添加するプローブの量を増加させることによって、野生型対リスクプローブに対するＬＨＸ２の結合親和性を比較した。ＬＨＸ２は、リスク配列を含有するプローブへよりも野生型プローブにさらに強く結合した（図１１）。総合的に、これらの結果は、ＬＨＸ２がｒｓ３６２１２７３３を包含する配列に結合でき、リスク対立遺伝子の存在がＬＨＸ２のこの配列への結合を顕著に減少させることを示している。上に記載したエピジェネティックデータおよびｒｓ３６２１２７３３とＨＴＲＡ１発現とのｅＱＴＬ関連を組み合せて、本発明者らの結果は、この領域がＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現のためのエンハンサーとして機能し、ＬＨＸ２がＨＴＲＡ１発現に寄与し得るとの仮説を支持している。
ＬＨＸ２がこのＤＮＡ配列に結合できるかどうかを検査するために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、ＬＨＸ２をコードするプラスミドまたは空ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞由来の核抽出物、ならびに非リスク（ＷＴ）配列、またはｒｓ３６２１２７３２およびｒｓ３６２１２７３３を包含するＣｈｒ１０領域のリスク配列（ＲＩＳＫ）を含有するビオチン化オリゴプローブを使用して実施した。この領域のスクランブル配列（ＳＣＲ、陰性対照）または以前報告されたＬＨＸ２結合部位（ＰＯＳ、陽性対照）を含有するプローブ（Muralidharan et al. (2017) J. Neurosci 37 (46): 11245-54）も使用した。結果は、ＬＨＸ２は、野生型およびリスクプローブの両方ならびに陽性対照プローブに結合したが、スクランブルプローブに結合しなかったことを示している（図１０Ａ）。抗ＬＨＸ２抗体の反応への添加は、ＬＨＸ２バンドのスーパーシフトを生じ、ＬＨＸ２の同一性を確認し、未標識プローブの添加は、バンドの喪失を生じた（図１０Ｂ）。最終的に本発明者らは、反応に添加するプローブの量を増加させることによって、野生型対リスクプローブに対するＬＨＸ２の結合親和性を比較した。ＬＨＸ２は、リスク配列を含有するプローブへよりも野生型プローブにさらに強く結合した（図１１）。総合的に、これらの結果は、ＬＨＸ２がｒｓ３６２１２７３３を包含する配列に結合でき、リスク対立遺伝子の存在がＬＨＸ２のこの配列への結合を顕著に減少させることを示している。上に記載したエピジェネティックデータおよびｒｓ３６２１２７３３とＨＴＲＡ１発現とのｅＱＴＬ関連を組み合せて、本発明者らの結果は、この領域がＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現のためのエンハンサーとして機能し、ＬＨＸ２がＨＴＲＡ１発現に寄与し得るとの仮説を支持している。
【0189】
１４．９ ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現を上方制御するためのＣＲＩＳＰＲａシステムの使用（レンチウイルスプラスミド）
ドナーＲＰＥ組織のマイクロアレイおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡのレベルが、リスクを有さないドナーと比較してＣｈｒ１０にホモ接合性リスクを有するドナーにおいておよそ３０％下方制御されたことを実証した。遺伝子発現へのいかなるオフターゲット作用も最小化する一方で、ＲＰＥ組織におけるＨＴＲＡ１の発現を非リスクドナーと同様のレベルに回復させるためにＳＡＭ ＣＲＩＳＰＲａシステムを選択した。ＳＡＭシステムは、２つのプラスミドからなる：ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質の両方をコードするＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（ＳＡＭ；Ａｄｄｇｅｎｅ＃９２０６２）、ならびにＭＳ２親和性タグならびにｐ６５およびＨＳＦ１転写因子からなる融合タンパク質をコードするＬｅｎｔｉＭＰＨ（ＭＰＨ；Ａｄｄｇｅｎｅ＃９２０６５）プラスミド。
ドナーＲＰＥ組織のマイクロアレイおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡのレベルが、リスクを有さないドナーと比較してＣｈｒ１０にホモ接合性リスクを有するドナーにおいておよそ３０％下方制御されたことを実証した。遺伝子発現へのいかなるオフターゲット作用も最小化する一方で、ＲＰＥ組織におけるＨＴＲＡ１の発現を非リスクドナーと同様のレベルに回復させるためにＳＡＭ ＣＲＩＳＰＲａシステムを選択した。ＳＡＭシステムは、２つのプラスミドからなる：ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質の両方をコードするＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（ＳＡＭ；Ａｄｄｇｅｎｅ＃９２０６２）、ならびにＭＳ２親和性タグならびにｐ６５およびＨＳＦ１転写因子からなる融合タンパク質をコードするＬｅｎｔｉＭＰＨ（ＭＰＨ；Ａｄｄｇｅｎｅ＃９２０６５）プラスミド。
【0190】
Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇソフトウェアを使用して、ｓｇＲＮＡをＨＴＲＡ１のプロモーター領域を網羅するように設計した（図１４）。これらの配列を、公開されているｓｇＲＮＡ配列標的化ＩＬ１Ｂと共に、ｌｅｎｔｉＳＡＭ ｖ２（Ｐｕｒｏ）プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）内のＵ６プロモーターに隣接するＢｓｍＢＩ部位にクローニングした。細胞にｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭｖ２（Ｐｕｒｏ）プラスミドを、当モル量のＡｄｄｇｅｎｅ（Ｎｅｏ）プラスミド（合計５μｇ）を伴ってまたはこれを伴わずに電気穿孔法によってトランスフェクトした。２４～９６時間後、総ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）を使用して精製した。相補的ＤＮＡを１μｇの総ＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５６０５０）を使用して生成した。定量的ＰＣＲを５０ｎｇのｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＨＴＲＡ１（Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１）、ＩＬ１Ｂ（Ｈｓ０１５５５４１０＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）について標準的プロトコールに従って実施した。
【0191】
本発明者らは、表１０に列挙するｓｇＲＮＡのＨＴＲＡ１発現を上方制御する能力をＳＡＭ ＣＲＩＳＰＲａシステムを使用して検査した［Konerman et al., Nature, 517 (7536) 015］。
【0192】
【表10】
【0193】
図１５は、大部分のｓｇＲＮＡがＨＴＲＡ１をある程度のレベル上方制御することを示している。Ｐ７およびＰ１８ ｓｇＲＮＡは、ＨＴＲＡ１レベルの最も高い増加を示した（Ｐ７およびＰ１８ ｓｇＲＮＡについてそれぞれおよそ３．６および３．２倍）。
【0194】
いずれかのプラスミドがｍＲＮＡレベルにオフターゲット効果を有したかどうかを評価するために、本発明者らは、ＳＡＭ構成成分を、個々に（ＭＰＨもしくはＳＡＭ）または合わせて（ＭＰＨ＋ＳＡＭ）ｈ１ＲＰＥ７細胞にトランスフェクトした。これらの実験では、ＳＡＭプラスミド中のｓｇＲＮＡは、いかなる周知のヒト遺伝子も標的化しない（Ｃｔｒｌ ｓｇＲＮＡ）。図１６に示すとおり、モックトランスフェクト細胞と比較して、ＭＰＨプラスミドは、ＨＴＲＡ１標的化ｓｇＲＮＡの非存在下でＨＴＲＡ１のレベルをおよそ１．８倍増加させた。同様に、ＳＡＭプラスミド単独でトランスフェクトした細胞ではＨＴＲＡ１においておよそ１．６倍の増加があり、これはＭＰＨ転写因子の存在によってさらには増加しなかった。これらのデータは、ＳＡＭシステム構成成分が転写における全般的な増加を促進できることを示している。
【0195】
次に、本発明者らは、ＭＰＨプラスミドがＨＴＲＡ１の上方制御のために必要であったかどうかを決定するために実験を実施した。本発明者らは、本発明者らの最も強いＨＴＲＡ１標的化ｓｇＲＮＡ（Ｐ７およびＰ１８、図１７）をＭＰＨプラスミドの非存在および存在下で、ｈ１ＲＰＥ７細胞におけるＨＴＲＡ１ 発現へのそれらの効果を検査した。本発明者らは、ＭＰＨが含まれる場合のレベル（Ｐ７ｄについて７倍、Ｐ１８について５倍）と比較して低減したレベルだが、ＭＰＨプラスミドの非存在下でさえも、ＨＴＲＡ１レベルがＳＡＭプラスミドによって増加する（Ｐ７について５倍、およびＰ１８について２．５倍）ことを見出した。それにより、ＨＴＲＡ１標的化ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４トランス活性化因子をコードする単一のプラスミドは、ＨＴＲＡ１発現を上方制御するために十分であると考えらえる。追加的に、ＳＡＭシステムがＨＴＲＡ１レベルに濃度依存性である場合、効果は、ＳＡＭプラスミドの量の減少と共に減少した（図１８）。
【0196】
１４．１０ ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの増加はＨＴＲＡ１タンパク質レベルの増加と相関する。
予備実験を、上に記載されるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡにおける増加がＨｔｒＡ１タンパク質レベルにおける増加と相関するかどうかを検査するために実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドをトランスフェクトしたｈ１ＲＰＥ７細胞の細胞培養上清におけるＨｔｒＡ１タンパク質濃度を測定した。本発明者らは、ｈ１ＲＰＥ７細胞にさまざまな量のＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（２．５、５．０および７．５μｇ）を、さまざまな時点（３、４および５日間）でトランスフェクトした。本発明者らはまた、対照として用いるために非標的化ｓｇＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）を細胞にトランスフェクトした。図１９は、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭトランスフェクト細胞において、トランスフェクション３および４日後に特異的に増加したことを示している。タンパク質レベルは、５μｇのＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドを用いてその最大に達した。図２０は、ＥＮＰＰ－２タンパク質への標準化後のＨＴＲＡ１タンパク質レベルを示す。これらの初期結果データは、対照と比較して、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドをトランスフェクトした細胞においてトランスフェクション３および４日後に特異的に増加したことを示している。
予備実験を、上に記載されるＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡにおける増加がＨｔｒＡ１タンパク質レベルにおける増加と相関するかどうかを検査するために実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、本発明者らは、ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドをトランスフェクトしたｈ１ＲＰＥ７細胞の細胞培養上清におけるＨｔｒＡ１タンパク質濃度を測定した。本発明者らは、ｈ１ＲＰＥ７細胞にさまざまな量のＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミド（２．５、５．０および７．５μｇ）を、さまざまな時点（３、４および５日間）でトランスフェクトした。本発明者らはまた、対照として用いるために非標的化ｓｇＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）を細胞にトランスフェクトした。図１９は、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭトランスフェクト細胞において、トランスフェクション３および４日後に特異的に増加したことを示している。タンパク質レベルは、５μｇのＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドを用いてその最大に達した。図２０は、ＥＮＰＰ－２タンパク質への標準化後のＨＴＲＡ１タンパク質レベルを示す。これらの初期結果データは、対照と比較して、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＰ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドをトランスフェクトした細胞においてトランスフェクション３および４日後に特異的に増加したことを示している。
【0197】
上のデータは、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルが、Ｐ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドを一過的にトランスフェクトしたｈ１ＲＰＥ７細胞において用量依存的様式で上方制御されることを実証している。
【0198】
１４．１１ レンチウイルスデリバリー
表１１に示すレンチウイルス粒子をコンストラクトした。これらの粒子は、Ｐ１８－ｌｅｎｔｉＳＡＭプラスミドを含む。
表１１に示すレンチウイルス粒子をコンストラクトした。これらの粒子は、Ｐ１８－ｌｅｎｔｉＳＡＭプラスミドを含む。
【0199】
【表11】
【0200】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲベースＳＡＭシステムのレンチウイルスデリバリーがＲＰＥ細胞においてＨＴＲＡ１発現を誘導できるかどうかを検査した。ｈ１ＲＰＥ７細胞をＰ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭプラスミドをコードするレンチウイルス粒子を用いてＭＯＩ、２０で形質導入し、細胞培養上清を形質導入後３日ごとに回収した。対照として、細胞を非標的化ｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルス粒子を用いて形質導入した（Ｃｔｒｌ－ＬｅｎｔｉＳＡＭ）。細胞をウイルスを含まないポリブレン含有培地を用いても処置した（モック）。形質導入３、６および９日後に回収した細胞培養上清におけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルをＨＴＲＡ１ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図２１に示すとおり、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルは、Ｃｔｒｌ－ＬｅｎｔｉＳＡＭウイルス粒子を用いて形質導入した細胞と比較して、Ｐ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭを用いて形質導入した細胞において形質導入６および９日後におよそ４０％（Ｃｔｒｌ－ＬｅｎｔｉＳＡＭと比べて１．４倍増加）増加した。
【0201】
それぞれ個々の試料の形質導入後の細胞数のあり得る差異を補償するために、ＨｔｒＡ１タンパク質レベルを、経時的にすべての試料において増加したが対照とＰ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭ処置細胞との間に差異はなかった（データ未記載）ＥＮＰＰ２タンパク質のレベルに対して標準化した。図２３は、ＥＮＰＰ－２タンパク質への標準化後のＨＴＲＡ１タンパク質レベルを示している。ＨｔｒＡ１のレベルは、Ｐ１８ ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＳＡＭを用いた形質導入後、形質導入６および９日後に約３０～４０％増加を示している。ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ発現とＨＴＲＡ１分泌タンパク質レベルとの間の相関を検査するために、ＨＴＲＡ１のｍＲＮＡレベルを形質導入９日後に抽出した総ＲＮＡ抽出物から測定した（図２３）。ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルは、Ｃｔｒｌ－ＬｅｎｔｉＳＡＭを用いて処置した細胞と比べて、Ｐ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭを用いて処置した細胞においておよそ２倍増加していた。したがって、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方は、Ｐ１８－ＬｅｎｔｉＳＡＭ処置に応答して増加した。これは、ＣＲＩＳＰＲベースＳＡＭシステムのウイルスデリバリーは、ＨＴＲＡ１を良好に誘導できることを示している。ＨＴＲＡ１を上方制御するＡＡＶ２－ＨＴＲＡ１プラスミド
【0202】
本実施例における実験を、ＡＭＤ患者のＲＰＥにおいてＨＴＲＡ１の野生型発現レベルを回復させるようにＨＴＲＡ１遺伝子を好適なＲＰＥ特異的プロモーターの調節下に保有するＡＡＶ２ベースベクターを開発するために実行した。ＨＴＲＡ１遺伝子をｐＴＲ－ＨＴＲＡ１を生成するためにＫｐｎＩおよびＳｐｈＩ制限部位を使用して、ｐＣＴＭ１６プラスミドからｐＣＴＭ２９５にサブクローニングした（ｐＣＴＭ２８９）。ＢＥＳＴ１およびＲＰＥ６５プロモーターの断片を、Ａｃｃ６５Ｉ（フォワード）およびＢａｍＨＩ制限部位（リバース）を有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産生物をＡｃｃ６５ＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ＢＥＳＴ１およびＲＰＥ６５由来プロモーター断片の調節下でＨＴＲＡ１発現プラスミドを生成するようにこれらの部位でｐＣＴＭ２８９にサブクローニングした。
【0203】
表１２は、ＢＥＳＴ１プロモーター（配列番号１１）およびＲＰＥ６５プロモーター断片（配列番号１２）からそれぞれのプロモーター断片を調製するために使用したプライマーを示す。ＨＴＲＡ１ ３－ＵＴＲ－標的化ｓｈＲＮＡプラスミドを安定に発現する（したがって、内在性ＨＴＲＡ１を低レベルで発現する）ＲＰＥ１細胞に５μｇの表示のプラスミドを、１ウエルあたり細胞１０，０００個を含む９６ウエルプレートで１００μｌ Ｎｅｏｎチップを使用する電気穿孔法によって、または脂質トランスフェクションによってトランスフェクトした。０．１５μｌのリポフェクタミン３０００、０．２μｌ Ｐ３０００および１００ｎｇ ＤＮＡを合わせて使用した。細胞培養上清およびＲＮＡをトランスフェクション２４～９６時間後に回収した。本発明者らの標準的ＨＴＲＡ１ ＥＬＩＳＡをタンパク質のレベルを測定するために実施した。総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）を使用して細胞から抽出した。相補的ＤＮＡを５００ｎｇの総ＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５６０５０）を使用して生成した。定量的ＰＣＲを５０ｎｇのｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＨＴＲＡ１ （Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）について実施した。
【0204】
【表12】
【0205】
本発明者らは、これらのＡＡＶ－ＨＴＲＡ１プラスミドを、電気穿孔法を使用してＨＴＲＡ１の安定なノックダウン（＞９０％）を有するＲＰＥ１クローン（７－６および７－７）のプールした集団におけるＨＴＲＡ１過剰発現について検査した。ＨＴＲＡ１レベルがこれらの細胞において低いことから、信号対雑音比は改善し、アッセイの感度は上昇する。陰性対照として本発明者らは、本発明者らのプラスミドと同じＡＡＶベクター骨格中にｓｍＣＢＡ駆動ＣＦＨ遺伝子をコードするｐＣＴＭ２５９を使用した。ＣＦＨ過剰発現は、ＨＴＲＡ１発現に影響を与えなかった（データ未記載）。図２４は、ＢＥＳＴ１－およびＲＰＥ６５駆動ＨＴＲＡ１コンストラクトのすべてが、ｐＣＴＭ２５９をトランスフェクトした細胞と比較して、種々の程度にＨＴＲＡ１を増加させたことを示している。
【0206】
本発明者らは、これらのプラスミドを親ＲＰＥ１細胞においても検査した。図２５に示すとおり、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡは、陰性対照プラスミド（ｐＣＴＭ２５９）と比較して、ＢＥＳＴ１－およびＲＰＥ６５－ＨＴＲＡ１プラスミドをトランスフェクトした細胞において増加した。互いに比べたＨＴＲＡ１発現のパターンは、両細胞株において同様である。
【0207】
ＢＥＳＴ１＿７２３、ＢＥＳＴ＿６９９、ＢＥＳＴ１＿４１８、ＢＥＳＴ１＿３４０、ＲＰＥ６５＿３１６およびＲＰＥ６５＿１４６を含む６個のコンストラクトを、さらなる検査のために選択した。経時的分析を、本発明者らの最も強い候補プラスミドをトランスフェクトした細胞におけるＨＴＲＡ１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方を測定するために実施した。トランスフェクションを、毒性を低減する一方でトランスフェクション効率を最大化するためにエンドトキシン不含有ｍａｘｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて調製したプラスミドＤＮＡを使用して電気穿孔法によって実施した。対照プラスミド（ｐＣＴＭ２５９）と比べて、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡのレベルは、ＢＥＳＴ１＿７２３、ＢＥＳＴ１＿３４０およびＲＰＥ６５＿１４６プロモーターによって駆動される数個のＡＡＶ－ＨＴＲＡ１プラスミドによって強く増加した（図２６）。これらの各プラスミドでは、ｍＲＮＡレベルは、２４時間でピークになり、４８および７２時間時点で徐々に減少する。陽性対照ＣＭＶ駆動プロモーターでもＨＴＲＡ１レベルは２４時間でピークになるが、４８および７２時間時点までに鋭く減少する。
【0208】
本発明者らは、ＨＴＲＡ１タンパク質発現の動態を検討し、ＨＴＲＡ１の過剰発現によって影響を受けないＶＥＧＦのレベルにそれを標準化した（ｐＣＴＭ２５９対照を他の試料それぞれと比較する、図２７Ｂ）。ＨＴＲＡ１のレベルは、ｐＣＴＭ２５９対照試料においてさえ経時的に増加する。しかし、ＨＴＲＡ１タンパク質における相対的増加は、ＢＥＳＴ１＿７２３、ＢＥＳＴ１＿３４０およびＲＰＥ６５＿１４６プロモーターによって駆動されるＡＡＶ－ＨＴＲＡ１プラスミドを用いて処置した細胞におけるバックグラウンドより顕著に大きい（図２７Ａ）。ＶＥＧＦへの標準化後、２４時間でピークになり、徐々に減少する対照プラスミドと比べてＨｔｒＡ１タンパク質発現において４から６倍増加した（図２７Ｃ）。
【0209】
合わせて、これらのデータは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方でのＨＴＲＡ１発現がＢＥＳＴ１－またはＲＰＥ６５－ベースプロモーターによって駆動されるＡＡＶ２－ＨＴＲＡ１プラスミドの一過性形質移入によって上方制御できることを実証している。
【0210】
１４．１２ ＣＲＩＳＰＲ媒介編集
本実施例は、ＨＴＲＡ１制御領域を包含するＣｈｒ１０上のＤＮＡの領域を対立遺伝子特異的様式で選択的に欠失させるために実行された実験を示す。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、およびＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ対の組み合わせを、ＲＰＥ１細胞におけるリスクまたは野生型対立遺伝子のいずれかから、ｒｓ１０４９０９２４ ＳＮＰ周辺のＤＮＡの大きなセクションを特異的に除去するために使用した。
本実施例は、ＨＴＲＡ１制御領域を包含するＣｈｒ１０上のＤＮＡの領域を対立遺伝子特異的様式で選択的に欠失させるために実行された実験を示す。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、およびＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ対の組み合わせを、ＲＰＥ１細胞におけるリスクまたは野生型対立遺伝子のいずれかから、ｒｓ１０４９０９２４ ＳＮＰ周辺のＤＮＡの大きなセクションを特異的に除去するために使用した。
【0211】
トランスフェクションをＩＤＴ Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して実施した。個々のガイドＲＮＡの配列を下の表１３に列挙する。ｃｒＲＮＡをＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ溶液中に最終濃度２００μＭで再懸濁した。各ｃｒＲＮＡをｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｄｕｐｌｅｘ ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴ カタログ番号１１－０１－０３－０１）中でｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ カタログ番号１０７２５３２）と１：１の比で合わせ、２分間、９５℃で加熱し徐々に冷却することによってアニールした。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体をｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｄｕｐｌｅｘ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、ｓｐＣａｓ９－３ＮＬＳ（ＩＤＴ カタログ番号１０７４１８１）を複合体に加えた。ＲＮＰ形成を可能にするように試料を２０分間、室温でインキュベートした。インキュベーション中に、ＲＰＥ１細胞を採取し、電気穿孔法緩衝液「Ｒ」緩衝液に５ｘ１０７個／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を１．８μＭの３’および５’ＲＮＰ複合体と１．８μＭの担体ｓｓＤＮＡと共に混合した。各反応物について、最終溶液は、２μＭ ｓｐＣａｓ９－３ＮＬＳ、１．８μＭ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡおよび１．８μＭ担体ｓｓＤＮＡを含有した。細胞ＲＮＰ混合物を１０μｌ Ｎｅｏｎピペットチップを１３００ボルト、パルス幅２０および２パルスで使用して電気穿孔し、６ウエルプレート中の培地３ｍｌに移した。２４時間後、トランスフェクトした細胞を細胞１５個／ｍｌの濃度まで系列希釈した。細胞およそ１．５個／ウエル）１００μｌを９６ウエルプレート３枚に蒔いた。
【0212】
【表13】
【0213】
ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号６９５０４）を使用してクローン培養物から精製した。ＰＣＲを、２００ｎＭのＴ７Ｅ１－Ｒｅｇ８－Ｆ（５’ＣＴＴ ＡＣＣＡＣＣＣＴＣＧＣＴＡＣＡＴＣ３’）およびＩＮＤＥＬ－ＤＥＬ－Ｒ１（５’ＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＡＡＴＣＣ ＡＴＣ３’）プライマーを使用して、５０ｎｇゲノムＤＮＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８４２７）およびＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０４９３）を含有するＱ５ ＰＣＲ緩衝液（ＮＥＢ、カタログ番号Ｂ９０２７）中で実施した。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル電気泳動によって可視化した。
【0214】
ＲＰＥ１細胞は、２コピーのｒｓ１０４９０９２４野生型対立遺伝子および単一コピーのリスク対立遺伝子を含有して染色体１０ｑ２６について三倍体である。未処置ＲＰＥ１細胞を使用するこの領域のＰＣＲ増幅は、野生型対立遺伝子についての３．５ｋｂバンドおよびリスク対立遺伝子についての３．２ｋｂバンドに対応する２つのＰＣＲ産生物を生じる。アガロースゲル電気泳動は、野生型対突然変異体対立遺伝子の密度において２：１バイアスを示す。細胞を野生型対立遺伝子に対して特異的なＣＲＩＳＰＲガイド対を用いて処置する場合、生じ得る結果は３つある。単一野生型対立遺伝子は、１：１比の３．５ｋｂ／３．２ｋｂバンド、および断片が除去された切断対立遺伝子から生成された６００～８００ｂｐバンドによって示されるとおり欠失され得る。両方の野生型対立遺伝子が切断される場合、ＰＣＲは、突然変異体対立遺伝子由来の３．２ｋｂバンドおよび切断野生型対立遺伝子由来の６００～８００バンドだけをもたらす。対照的に、突然変異体対立遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲガイド対を用いて処置した細胞は、密な３．５ｋｂ野生型バンドおよび切断突然変異体対立遺伝子に対応する６００～８００ｂｐバンドだけを示すはずである。
【0215】
本発明者らは、ｃｒＲＮＡガイドの標的化対が対立遺伝子依存性様式でｒｓ１０４９０９２４領域の大きなセクションを効果的に除去できることを決定した（表１４および図２８）。この効果を、各ＣＲＩＳＰＲガイド対についてトランスフェクトしたＲＰＥ１細胞のバルク集団において実証した（データ未記載）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、２ｋｂ領域を欠失させる本発明者らの能力を正確に評価するためにバルク集団の限定希釈によって、モノクローナル培養物を単離および確立した。モノクローナル培養物由来のゲノムＤＮＡを、切断部位周辺のｒｓ１０４９０９２４領域のＰＣＲ増幅によってスクリーニングし、アガロースゲル電気泳動によって分析した。図２８は、Ａ２－ＷＴ２ ｃｒＲＮＡの組み合わせがＣｈｒ１０非リスク対立遺伝子（対立遺伝子Ａ）の欠失を生じる一方で、Ａ２－ＩＮＤＥＬ１ ｃｒＲＮＡの組み合わせはＣｈｒ１０リスク対立遺伝子（対立遺伝子Ｂ）の欠失を生じる例を示している。ｃｒＲＮＡの他の組み合わせは、予測される対立遺伝子特異的欠失を生成した（データ未記載）。これは、対立遺伝子特異的様式で染色体領域の除去を具体的に標的化できることを実証している。
【0216】
【表14】
【0217】
【表15】
【0218】
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29. Zellner A, Scharrer E, Arzberger T et al. (2018) CADASIL brain vessels show a HTRA1 loss-of-function profile. Acta Neuropathol 136: 111-125.
【0219】
１６．
【0220】
【表16】
【0221】
前述の本発明は、明瞭な理解の目的のために例示および例の方法によってある程度詳細に記載されているが、当業者は、ある種の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実行され得ることを理解する。
【0222】
本発明は、本明細書に広範に記載され、本明細書下に特許請求される、その構造、方法または他の本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態に具体化され得る。記載されるアプローチは、あらゆる点で限定ではなく例示としてだけ見なされる。したがって本発明の範囲は、前述の記載よりも、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にあるすべての変更は、その範囲内に受け入れられる。
【0223】
本明細書において引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物および特許が具体的および個別に参照により組み込まれるとして示され、引用される刊行物と関連する方法および／または材料を開示および記載するように参照により本明細書に組み込まれるのと同様に、本明細書に参照により組み込まれる。すべての刊行物の引用は、出願日に先行するその開示についてであり、先行する発明のために先行するそのような刊行物に本発明が、先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。さらに、示される公開日は、別々に確認される必要がある実際の公開日と異なる場合がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30-1】
【図30-2】
【配列表】
【国際調査報告】