知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッドの特許一覧 ▶ シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
特表2022-526487ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-25
(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220518BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220518BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20220518BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220518BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220518BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220518BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220518BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220518BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20220518BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C07K16/22
C07K16/46
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P27/02
A61P27/06
G01N33/53 V
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021556346
(86)(22)【出願日】2020-03-17
(85)【翻訳文提出日】2021-11-12
(86)【国際出願番号】 CN2020079690
(87)【国際公開番号】W WO2020187202
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】201910204246.3
(32)【優先日】2019-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510166892
【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(71)【出願人】
【識別番号】508209602
【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】イン ファ
(72)【発明者】
【氏名】シ チンピン
(72)【発明者】
【氏名】マオ ランヨン
(72)【発明者】
【氏名】グォ フー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン シャオイン
(72)【発明者】
【氏名】タオ ウェイカン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB12
4C085CC23
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA15
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントと、ＡＮＧ２に特異的に結合する抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体とを含むＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、直接的に若しくは間接的に抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに接続されている二重特異性抗体を提供する。本開示はさらに、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに前記抗体の調製及び投与を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＶＥＧＦに特異的に結合する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントと、ＡＮＧ２に特異的に結合する抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体とを含むＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、ペプチド結合を介して直接的に若しくはリンカーを介して間接的に前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントに共有結合で接続されている、二重特異性抗体。
【請求項2】
請求項１に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、ペプチド結合を介して直接的に若しくはリンカーを介して間接的に前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖のカルボキシル末端に接続されており、好ましくは、前記リンカーが（Ｇ）ｎ（ｎ＞＝１）である、二重特異性抗体。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、配列番号５に示されるＣＤＲ１又はそれと比較して多くて３個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２又はそれと比較して多くて６個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３領域又はそれと比較して多くて３個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ３領域とを含む、二重特異性抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、配列番号１４に示されるＣＤＲ１と、配列番号１５に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを含む、二重特異性抗体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、以下のいずれか１つに示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む、二重特異性抗体：ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体がラマ抗体又はヒト化抗体である、二重特異性抗体。
【請求項7】
請求項６に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記ヒト化抗体が、ヒト抗体に由来する重鎖フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントを含み、前記フレームワーク領域バリアントが、前記ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に多くて１０個のアミノ酸復帰突然変異を有し；好ましくは、前記復帰突然変異（単数又は複数）が、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数である、二重特異性抗体。
【請求項8】
請求項６に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体が、以下のいずれか１つに示される配列を含む、二重特異性抗体：ｖ）配列番号１６に示される配列、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２若しくは配列番号１３に示される配列、又は
ｖｉ）配列番号２７に示される配列、好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５若しくは２６に示される配列。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが以下を含む、二重特異性抗体：配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；並びに配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３。
【請求項10】
請求項９に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２８に示される軽鎖可変領域と、配列番号３０に示される重鎖可変領域とを含む、二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１０に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２９に示される軽鎖と、配列番号３１若しくは５４に示される重鎖とを含む、二重特異性抗体。
【請求項12】
配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５５若しくは５６からなる群のいずれか１つから選択される第１ポリペプチド鎖、及び／又は配列番号２９に示される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体。
【請求項13】
配列番号５に示されるＣＤＲ１又はそれと比較して多くて３個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２又はそれと比較して多くて６個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３領域又はそれと比較して多くて３個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ３領域とを含む、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項14】
配列番号１４に示されるＣＤＲ１と、配列番号１５に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを含む、請求項１３に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項15】
以下に示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む、請求項１４に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体：ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
【請求項16】
ラマ抗体及びヒト化抗体から選択される、請求項１５に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項17】
請求項１６に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体であって、前記ヒト化抗体が、ヒト抗体に由来する重鎖フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントを含み、前記フレームワーク領域バリアントが、前記ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に多くて１０個のアミノ酸復帰突然変異を有し；好ましくは、前記復帰突然変異（単数又は複数）が、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数である、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項18】
以下に示される配列を含む、請求項１６に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体：ｖ）配列番号１６に示される配列、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、若しくは配列番号１３に示される配列を含む配列、又は
ｖｉ）配列番号２７に示される配列、好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５若しくは２６に示される配列を含む配列。
【請求項19】
請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントと競合してヒトＡＮＧ２に結合する、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項20】
配列番号３、配列番号４、配列番号１２又は配列番号１３に示される前記単一ドメイン抗体と同じＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３領域配列とを含む、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体。
【請求項21】
請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体。
【請求項22】
請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含む二重特異性抗体。
【請求項23】
治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、又は請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は請求項２１に記載のモノクローナル抗体、又は請求項２２に記載の二重特異性抗体に加えて、１つ若しくは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤若しくは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項24】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、又は請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は請求項２１に記載のモノクローナル抗体、又は請求項２２に記載の二重特異性抗体をコードする核酸分子。
【請求項25】
請求項２４に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞であって、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択される、宿主細胞。
【請求項26】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、若しくは請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、若しくは請求項２１に記載のモノクローナル抗体、若しくは請求項２２に記載の二重特異性抗体を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトＡＮＧ２の検出又は測定方法。
【請求項27】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、又は請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は請求項２１に記載のモノクローナル抗体、又は請求項２２に記載の二重特異性抗体を含むキット。
【請求項28】
治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、若しくは請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、若しくは請求項２１に記載のモノクローナル抗体、若しくは請求項２２に記載の二重特異性抗体、若しくは請求項２３に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、ＶＥＧＦ媒介性及び／又はＡＮＧ２媒介性血管新生に関連する疾患の治療方法。
【請求項29】
治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に特異的に結合する二重特異性抗体、若しくは請求項１３～２０のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、若しくは請求項２１に記載のモノクローナル抗体、若しくは請求項２２に記載の二重特異性抗体、若しくは請求項２３に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、がん又は血管新生眼疾患の治療方法であって；好ましくは、前記がんが、乳がん、副腎腫瘍、卵管がん、扁平上皮がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、非小細胞肺がん、胆管がん、膀胱がん、膵臓がん、皮膚がん及び肝臓がんからなる群より選択され；前記血管新生眼疾患が、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩角膜血管新生（ルベオーシス）、眼内新生血管疾患、血管再狭窄及び動静脈奇形（ＡＶＭ）からなる群より選択される、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、バイオ医薬品の分野に属するものである。具体的には、本開示は、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又はそれらの抗原結合フラグメント、抗ＶＥＧＦ抗体又はそれらの抗原結合フラグメント、並びに抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体との融合によって形成される二重特異性抗体の調製及び投与に関する。
【背景技術】
【0002】
本明細書の記述は、本開示に関連する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。
【0003】
血管新生は、腫瘍細胞に酸素と栄養を供給し、腫瘍細胞が増殖優位性を得て、血管のない状態の遅い増殖期から、血管のある状態の急速な増殖期に入ることを可能にする。そのため、血管新生を抑制することで腫瘍の増殖を抑制することは、比較的有望で効果的な戦略である。血管新生を促進する数多くの因子の中でも、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦは、血管新生を促進する非常に重要な因子である。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体に結合して細胞の増殖、遊走を促進し、血管透過性を高めることにより、腫瘍細胞の血管新生を促進することができる。したがって、ＶＥＧＦを遮断することで、腫瘍の血管新生を抑制し、腫瘍の増殖及び転移を抑制するという目的を達成することができる。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体「アバスチン」、ＶＥＧＦを中和する可溶性ＶＥＧＦ受容体、及びＶＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体など、様々な戦略でＶＥＧＦを遮断する臨床生物学的因子が多数存在し、いずれも比較的良好な活性を示している。しかし、腫瘍の血管新生は、多くの分子と複数のシグナル伝達経路が関与する複雑なプロセスである。１つの経路を遮断しても、腫瘍を完全に抑制するという目的を達成することはできず、他の血管新生関連因子を同時に遮断する必要がある。
【0004】
Ｔｉｅ２は、血管内皮細胞に特異的なチロシンキナーゼ受容体として２番目に同定されたもので、リガンドであるアンジオポエチン－１（ＡＮＧ１）及びアンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）との結合も血管新生に重要な役割を果たしている。ＡＮＧ１とＡＮＧ２はともにＴｉｅ２に結合するが、そのうちＡＮＧ１は内皮細胞（ＥＣ）の生存をサポートし、血管の完全性と安定性を促進する一方、ＡＮＧ２は内皮細胞から末梢細胞を剥離させるという逆の効果があり、内皮細胞の透過性を高め、ＶＥＧＦが新生血管を促進する効果を発揮できるようにする。ＡＮＧ２とＶＥＧＦとは互いに補完・協調し、腫瘍の血管新生の過程で一緒に作用する。したがって、ＶＥＧＦとＡＮＧ２とを同時に遮断することでより効果的に血管新生を抑制し、血管の正常化を促進し、腫瘍の増殖及び転移を抑制するという目的を達成することができる。
【0005】
現在、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２のシグナル伝達経路を同時に遮断する二重特異性抗体が４つ報告されている。その中でも、ＶＥＧＦとＡＮＧ２とを標的とするＲｏｃｈｅ社のクロスマブ「バヌシズマブ」は最も進捗が早く、臨床第２相に入っている。
【0006】
現在、ＡＮＧ２－ＶＥＧＦ二重特異性抗体又はＶＥＧＦ抗体は、特許出願ＷＯ１９９８０４５３３２、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２、ＷＯ２０１００４０５８、ＣＮ１０２２５０２４７Ａ、ＷＯ２０１１１１７３２９などに開示されているが、新規で効果の高い腫瘍治療用ＡＮＧ２－ＶＥＧＦ二重特異性抗体及び腫瘍治療方法の開発がなお求められている。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントと、ＡＮＧ２に特異的に結合する抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体とを含み、ここで、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、ペプチド結合を介して直接的に又はリンカーを介して間接的に抗ＶＥＧＦ抗体に共有結合で接続されている。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体はモノクローナル抗体である。
【0009】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖アミノ末端、重鎖カルボキシル末端、軽鎖アミノ末端、又は軽鎖カルボキシル末端に接続されている。
【0010】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖カルボキシル末端に接続されている。
【0011】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号５に示されるＣＤＲ１又はそれと比較して多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２又はそれと比較して多くて６、多くて５、多くて４、多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３又はそれと比較して多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸置換変異を有するＣＤＲ３とを含む。例示的には、配列番号５（ＤＦＧＭＳ）の第１アミノ酸ＤはＳで置換され、第２アミノ酸ＦはＹで置換される。
【0012】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号１４に示されるＣＤＲ１と、配列番号１５に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを含み、それらの配列はそれぞれ以下の通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；及びＸ９はＹ又はＧから選択される。
【化1】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；及びＸ９はＹ又はＧから選択される。
【0013】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、それぞれ以下に示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む：
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
【0014】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、ラマ抗体又はヒト化抗体である。
【0015】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号１６に示されるＶＨＨを含むか、又はからなり、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、又は配列番号１３に示されるＶＨＨを含むか、又はからなり、ここで、配列番号１６は以下に示される通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【化2】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【0016】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体の配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号１２又は配列番号１３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0017】
他の実施形態では、二重特異性抗体に含まれるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体に由来する重鎖フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントを含み、ここで、フレームワーク領域バリアントは、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に多くて１０個のアミノ酸復帰突然変異を有し；
好ましくは、復帰突然変異（単数又は複数）は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数であり、ここで、５Ｑは、カバットの基準によれば、ＶＨＨの５位のアミノ酸がＱ（Ｇｌｎ、グルタミン）であることを表しており、他も同様である。
好ましくは、復帰突然変異（単数又は複数）は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数であり、ここで、５Ｑは、カバットの基準によれば、ＶＨＨの５位のアミノ酸がＱ（Ｇｌｎ、グルタミン）であることを表しており、他も同様である。
【0018】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、以下に示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む：
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
これらのフレームワーク領域は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数の復帰突然変異を含む。
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
これらのフレームワーク領域は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数の復帰突然変異を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２７に示される配列を含むか、又はからなり、好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６に示される配列を含むか、又はからなり、ここで、配列番号２７の配列は以下に示される通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【化3】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【0020】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体の配列は、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６に対して、それぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0021】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは以下を含む：
配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；並びに配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３。
配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３；並びに配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３。
【0022】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２８に示される軽鎖可変領域と、配列番号３０に示される重鎖可変領域とを含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２９に示される軽鎖と、配列番号３１若しくは５４に示される重鎖とを含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５５若しくは５６に示されるいずれか１つから選択される第１ポリペプチド鎖、及び／又は配列番号２９に示される第２ポリペプチド鎖を含む。
【0025】
本開示は、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体のクラスも提供する。
【0026】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号５に示されるＣＤＲ１又はそれと比較して多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸変異を有するＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２又はそれと比較して多くて６、多くて５、多くて４、多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸変異を有するＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３又はそれと比較して多くて３、多くて２若しくは１個のアミノ酸変異を有するＣＤＲ３とを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号１４に示されるＣＤＲ１と、配列番号１５に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを含み、ＣＤＲ配列は以下に示される通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；及びＸ９はＹ又はＧから選択される。
【化4】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；及びＸ９はＹ又はＧから選択される。
【0028】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、それぞれ以下に示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む：
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３。
【0029】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、ラマ抗体又はヒト化抗体から選択される。
【0030】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、配列番号１６に示される配列を含むか、又はからなり、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２又は配列番号１３に示される配列を含むか、又はからなり、ここで、配列番号１６は以下に示される配列を有する：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【化5】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【0031】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体の配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号１２又は配列番号１３に対して、それぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0032】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する重鎖フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントを含み、フレームワークバリアントは、ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に多くて１０個のアミノ酸復帰突然変異を有し、
好ましくは、復帰突然変異は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数である。
好ましくは、復帰突然変異は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数である。
【0033】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２ヒト化抗体の配列は、配列番号２２に示される通りであるか、又は配列番号２２に基づいて５Ｑ、３０Ｎ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、以下に示されるＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３とを含む：
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
これらのフレームワーク領域は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数の復帰突然変異を含む。
ｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号８に示されるＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；又は
ｉｖ）配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３；
これらのフレームワーク領域は、５Ｑ、３０Ｎ、８３Ｋ、８４Ｐ、９３Ｎ及び９４Ａからなる群より選択される１つ又は複数の復帰突然変異を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２７に示される配列を含むか、又はからなり、好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６に示される配列を含むか、又はからなり、ここで、配列番号２７は、以下に示される配列を有する：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【化6】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【0036】
いくつかの実施形態では、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体の配列は、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0037】
本開示はまた、前述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体と競合してヒトＡＮＧ２に結合する抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を提供する。
【0038】
本開示はまた、抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体であって、配列番号３、配列番号４、配列番号１２又は配列番号１３に示される単一ドメイン抗体と同じＣＤＲ１とＣＤＲ２とＣＤＲ３配列とを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【0039】
本開示はまた、上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体を提供する。
【0040】
本開示はまた、前述のいずれか１つに記載の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含む二重特異性抗体を提供する。
【0041】
本開示は、治療有効量の、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体に加えて、１つ若しくは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤若しくは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0042】
本開示はまた、上述の二重特異性抗体若しくは抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【0043】
本開示はまた、上述の核酸分子を含むベクターを提供する。
【0044】
本開示はまた、前述のベクターで形質転換された宿主細胞であって、原核細胞及び真核細胞からなる群より選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞又は昆虫細胞である宿主細胞を提供する。
【0045】
本開示はまた、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を製造する方法であって、上述の宿主細胞を培地で培養して上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を形成し、及び蓄積するプロセスと、培養物から上述の二重特異性抗体、又は抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体若しくはその抗原結合フラグメントを回収するプロセスとを含む方法を提供する。
【0046】
本開示は、上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又は上述の二重特異性抗体を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトＡＮＧ２の検出又は測定方法を提供する。
【0047】
本開示は、ヒトＡＮＧ２の検出又は測定用の試薬を調製する際の、上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又は二重特異性抗体の使用を提供する。
【0048】
本開示はまた、上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体又は二重特異性抗体を含むキットを提供する。
【0049】
本開示はまた、治療有効量の上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体、又は上述の医薬組成物を被験体に投与することを含むＶＥＧＦ媒介性及び／又はＡＮＧ２媒介性血管新生作用に関連する疾患の治療方法を提供し；好ましくは、治療有効量は、０．１～３０００ｍｇの上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体を含む組成物の単位用量である。
【0050】
本開示はまた、治療有効量の上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一可変ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体、又は上述の医薬組成物を被験体に投与することを含むがん又は血管新生眼疾患の治療方法を提供し；好ましくは、前記がんは、乳がん、副腎腫瘍、卵管がん、扁平上皮がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、非小細胞肺がん、胆管がん、膀胱がん、膵臓がん、皮膚がん及び肝臓がんからなる群より選択され；前記血管新生眼疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩角膜血管新生（ルベオーシス）、眼内新生血管疾患、血管再狭窄及び動静脈奇形（ＡＶＭ）からなる群より選択される。
【0051】
本開示はまた、ＶＥＧＦ媒介性及び／又はＡＮＧ２媒介性血管新生作用に関連する疾患の治療用医薬品を調製する際の、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体、又は上述の医薬組成物の使用を提供する。
【0052】
本開示はまた、がん又は血管新生眼疾患の治療用医薬品を調製する際の、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体、又は上述の医薬組成物の使用を提供し；好ましくは、前記がんは、乳がん、副腎腫瘍、卵管がん、扁平上皮がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、非小細胞肺がん、胆管がん、膀胱がん、膵臓がん、皮膚がん及び肝臓がんからなる群より選択され；前記血管新生眼疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩角膜血管新生（ルベオーシス）、眼内新生血管疾患、血管再狭窄及び動静脈奇形（ＡＶＭ）からなる群より選択される。
【0053】
本開示はまた、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体を使用する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトＡＮＧ２の検出又は測定方法を提供する。
【0054】
本開示はまた、医薬品として使用するための、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体を提供し、前記医薬品は、ＶＥＧＦ媒介性及び／又はＡＮＧ２媒介性血管新生作用に関連する疾患の治療のためのものであり、好ましくは、がん又は血管新生眼疾患の治療のためのものである。
【0055】
本開示はまた、医薬品として使用するための、上述の二重特異性抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体、又は上述の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を含むモノクローナル抗体を提供し、前記医薬品は、がん又は血管新生眼疾患の治療のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】本開示の二重特異性抗体の構造を示す模式図である。
【図2A】単一ドメイン抗体のヒトＡＮＧ２に対する結合活性を示す図である。
【図2B】単一ドメイン抗体のヒトＡＮＧ１に対する結合活性を示す図である。
【図3】二重特異性抗体が、細胞表面のＴｉｅ２に結合するＡＮＧ２の活性を阻害することを示す図である。
【図4】二重特異性抗体が、ＡＮＧ２によって誘導されるＴｉｅ２のリン酸化を抑制した結果を示す図である。
【図5】ＶＥＧＦによって誘導されるＶＥＧＦＲのリン酸化を抑制する二重特異性抗体の活性を示す図である。
【図6】ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣの増殖を抑制する二重特異性抗体の活性を示す図である。
【図7】ヒト結腸がん細胞の皮下移植腫瘍の増殖抑制に対する二重特異性抗体の効果を示す図である。
【図8A】非小細胞肺がんの皮下移植腫瘍の増殖抑制に対する当該抗体の効果を示す図である。
【図8B】マウスにおいて非小細胞肺がんの肝転移を観察した結果を示す図である。
【図9A】ヒトＡ４３１マウス移植腫瘍モデルの抑制における当該抗体の薬理効果を示す図である。
【図9B】ヒトＰＣ－３マウス移植腫瘍モデルの抑制における当該抗体の薬理効果を示す図である。
【図10A】アカゲザルの目の蛍光漏出面積の二重特異性抗体の改善率を示す図である。
【図10B】アカゲザルの目のレベル４蛍光スポット数に対する二重特異性抗体の効果を示す図である。
【図11】眼球投与した２８日後のアカゲザルの房水中のＶＥＧＦ濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0057】
本開示の理解を容易にするために、特定の技術的及び科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書において別段の定めが明確にない限り、本明細書において使用される他の全ての技術的及び科学的用語は、本開示の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有する。
【0058】
本開示で使用されるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８ （１９６８）に記載されている通りである。
【0059】
「ＡＮＧ－２」という用語は、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）（又は、ＡＮＧＰＴ２若しくはＡＮＧ２と略記される）を指し、これは、例えば、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７ （１９９７） ５５－６０及びＣｈｅｕｎｇ， Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４８ （１９９８） ３８９－９１に記述されている。アンジオポエチン－１及び－２は、Ｔｉｅ（すなわち、血管の内皮に選択的に発現されるチロシンキナーゼファミリー）のリガンドであることが判明している（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０７ （２０００） ２４２－４８）。現在、アンジオポエチンファミリーに属するメンバーが４つ確認されている。アンジオポエチン－３及び－４（ＡＮＧ－３及びＡＮＧ－４）は、マウス及びヒトの同じ遺伝子座の広範な領域の対応物となることができる。Ｋｉｍ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ ４４３ （１９９９） ３５３－５６； Ｋｉｍ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４ （１９９９） ２６５２３－２８。ＡＮＧ１及びＡＮＧ２は、当初、組織培養実験において、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして同定された（ＡＮＧ１については、Ｄａｖｉｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８７ （１９９６） １１６１－６９を参照；ＡＮＧ２については、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７ （１９９７） ５５－６０を参照）。全ての既知のアンジオポエチンは主にＴｉｅ２に結合し、ＡＮＧ１と２の両方が３ｎＭ（Ｋｄ）の親和性でＴｉｅ２に結合する（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， Ｐ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７ （１９９７） ５５－６０）。
【0060】
「ＶＥＧＦ」という用語は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）を指し、これは、例えば、Ｌｅｕｎｇ， Ｄ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６ （１９８９） １３０６－９； Ｋｅｃｋ， Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６ （１９８９） １３０９－１２，及びＣｏｎｎｏｌｌｙ， Ｄ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４ （１９８９） ２００１７－２４に記述されている。ＶＥＧＦは、正常及び異常な血管新生の制御並びに腫瘍及び眼内疾患に伴う血管新生に関与している（Ｆｅｒｒａｒａ， Ｎ．， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １８ （１９９７） ４－２５； Ｂｅｒｋｍａｎ， Ｒ．Ａ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１ （１９９３） １５３－１５９； Ｂｒｏｗｎ， Ｌ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ． ２６ （１９９５） ８６－９１； Ｂｒｏｗｎ， Ｌ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３ （１９９３） ４７２７－４７３５； Ｍａｔｔｅｒｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ７３ （１９９６） ９３１－９３４； ａｎｄ Ｄｖｏｒａｋ， Ｈ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４６ （１９９５） １０２９－１０３９）。ＶＥＧＦは、内皮細胞の有糸分裂を促進することができるホモ二量体糖タンパク質である。
【0061】
「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原（又は同じ抗原の異なるエピトープ）に対して結合活性を有する抗体のことである。本開示の抗体は、２つの異なる抗原、すなわち、第１抗原としてのＶＥＧＦ及び第２抗原としてのＡＮＧ２に特異的である。
【0062】
「結合部位」又は「抗原結合部位」という用語は、リガンドが実際に結合する抗体分子内の領域を指す。「抗原結合部位」という用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含むか、又は抗体重鎖可変ドメイン若しくは軽鎖可変ドメインのいずれかを含む。
【0063】
「単一ドメイン抗体」とは、単一ドメインのＦｖユニットからなる抗体フラグメントのことである。全抗体と同様に、抗原に選択的かつ特異的に結合することができる。単一ドメイン抗体の分子量はわずか１２～１５ｋＤａであり、２本の重鎖と２本の軽鎖からなる一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖と重鎖の半分）又は単鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、１つは軽鎖から、もう１つは重鎖から）よりもさらに小さい。本開示における単一ドメイン抗体には、重鎖抗体（ＶＨＨなどの軽鎖をもともと欠く抗体）、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、改変抗体、及び抗体由来のものとは異なる単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野に存在する、又は将来発見される任意の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ヤマ、ラマ、グアナコ、ヤギ、ウサギ、ウシ、サメなどを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。
【0064】
「単一ドメイン抗体」の抗原結合部位は、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインによって形成されている。これにより、「単一ドメイン抗体」は、「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメント（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等）（２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する）と区別される。一般に、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、すなわち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与することになる。対照的に、単一ドメイン抗体の抗原結合部位は、単一のＶＨ又はＶＬドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリンの単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
【0065】
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ又はＶＨＨ抗体フラグメントとしても知られているが、当初は「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記述されていた（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ， Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ， Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ， Ｈａｍｅｒｓ Ｃ， Ｓｏｎｇａ ＥＢ， Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ， Ｈａｍｅｒｓ Ｒ．： “Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ”； Ｎａｔｕｒｅ ３６３ （１９９３） ４４６－４４８）。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」又は「ＶＨ」と呼ぶ）、及び従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」又は「ＶＬ」と呼ぶ）と区別している。ＶＨＨドメインは、他の抗原結合ドメインが存在しない場合に、エピトープに特異的に結合することができる（対照的に、従来の４本鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインについては、ＶＨドメインとともにＶＬドメインによってエピトープが認識される）。ＶＨＨドメインは、単一の免疫グロブリンドメインによって形成された、小型で安定した高効率の抗原認識ユニットである。
【0066】
本開示の文脈では、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体フラグメント、ＶＨＨ抗体、並びに「ナノボディ」及び「単一ドメイン抗体」という用語は、交換可能に使用され、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４構造を有する免疫グロブリン単一可変ドメインであって、他の免疫グロブリン可変ドメインなしでエピトープに特異的に結合するものを指す。
【0067】
「抗体（Ａｂ）」という用語は、特定の抗原（例えばＡＮＧ２）と特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合分子又は分子複合体を含む。
【0068】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖との４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子及びそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含む。この重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つの領域（ドメイン）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域と呼ばれるより保存的な領域（ＦＲ、フレームワーク領域とも呼ばれる）が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示の異なる例では、抗ＡＮＧ２抗体（又はその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列と同じであり得るか、天然又は人工的に改変され得る。抗体は、異なるサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。
【0069】
「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントも含まれる。抗体の「抗原結合部位」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」などの用語には、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然の、酵素的に産生された、合成された、若しくは遺伝子操作されたペプチド又は糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、全抗体分子から、任意の適切な標準技術、例えばタンパク質分解消化又は抗体の可変領域及び（必要に応じて）定常領域をコードするＤＮＡの操作並びに発現を伴う組換え遺伝子工学技術を用いて得ることができる。そのようなＤＮＡは既知であり、及び／又は、例えば、市販の供給源、ＤＮＡデータベース（例えば、ファージ抗体データベースを含む）から容易に入手することができ、若しくは合成することができる。そのようなＤＮＡは、例えば、１つ又は複数の可変及び／若しくは定常領域を適切な構成に配置し、又はコドンを導入し、又はシステイン残基を生成し、及びアミノ酸を修飾し、追加し、若しくは削除するなど、化学的に又は分子バイオテクノロジーを使用して配列を決定し、操作することができる。
【0070】
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）又は制限的ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド。他の人工分子、例えば領域特異的抗体、単一ドメイン抗体、領域欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）及びサメ可変ＩｇＮＡＲ領域も、本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語に包含される。
【0071】
抗原結合フラグメントは、通常、少なくとも１つの可変領域を含む。可変領域は、任意のサイズ又はアミノ酸組成の領域であり得、一般に、１つ若しくは複数のフレームワーク配列のフレームワークに隣接するか、又はその中にあるＣＤＲを含む。
【0072】
特定の例では、抗原結合フラグメントの可変領域及び定常領域の任意の構成において、可変領域と定常領域は互いに直接連結し得るか、又はインタクト若しくは部分的なヒンジ又はリンカー領域を介して連結し得る。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなり得るため、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変領域及び／又は定常領域の間に柔軟性及び半柔軟性のある接続を作り出す。本開示における「マウス抗体」という用語は、当該技術分野の知識と技能に従って調製されたマウス又はラット由来のモノクローナル抗体である。調製の際には、被験体に抗原を注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。注射を受けた被験体がマウスの場合、産生される抗体はマウス由来の抗体であり、注射を受けた被験体がラットの場合、産生される抗体はラット由来の抗体である。
【0073】
「キメラ抗体」とは、第１種（マウス等）の抗体の可変領域と、第１種の抗体によって誘発される免疫反応を緩和することができる第２種（ヒト等）の抗体の定常領域とを融合して形成される抗体のことである。キメラ抗体を樹立するには、まず第１種の特定のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、次にハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、必要に応じて第２種の抗体定常領域遺伝子をクローニングし、マウスの可変領域遺伝子と第２種の定常領域遺伝子とを連結してキメラ遺伝子を形成し、発現ベクターに挿入し、最終的に真核生物系又は原核生物系でキメラ抗体分子を発現させる必要がある。ＣＤＲ移植抗体を含む「ヒト化抗体」という用語は、動物（例えばマウス）由来の抗体のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域に移植して産生された抗体を指す。ヒト化抗体は、多量の異種タンパク質成分を含むキメラ抗体によって引き起こされる不均一反応を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／で入手可能）、並びにＫａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見つけることができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列に最小限の逆突然変異又は復帰突然変異を加えて活性を維持することができる。また、本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲがさらなるファージディスプレイによる親和性成熟を受けたヒト化抗体も含む。
【0074】
抗原の接触残基のために、ＣＤＲ移植化は、抗原と接触しているフレームワーク残基のために、生産された抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらす可能性がある。そのような相互作用は、体細胞の超変異の結果であり得る。したがって、そのようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体のフレームワークに移植することが依然として必要である場合がある。抗原結合に関与する、非ヒト抗体又はそれらの抗原結合フラグメント由来のアミノ酸残基は、動物モノクローナル抗体の可変領域の配列及び構造を調べることによって同定することができる。生殖細胞系列と異なるＣＤＲドナーフレームワークの残基は、関連性があると見なすことができる。最も近い生殖細胞系列を特定できない場合、その配列をサブクラスのコンセンサス配列又は類似度の高い動物抗体配列と比較することができる。希少なフレームワーク残基は、体細胞の超変異の結果であると考えられており、したがって結合において重要な役割を果たしている。
【0075】
本開示の一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト若しくはマウスのκ鎖、λ鎖又はそのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み得るか、又はヒト若しくはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み得る。
【0076】
ヒト抗体重鎖定常領域及びヒト抗体軽鎖定常領域の「従来のバリアント」とは、従来技術で開示されているヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域のバリアントであって、抗体可変領域の構造及び機能を変更していないものを指す。例示的なバリアントとしては、重鎖定常領域に部位特異的修飾及びアミノ酸置換を施したＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントが挙げられる。具体的な置換としては、ＹＴＥ、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ、又はＳ２２８Ｐ変異、又は当該技術分野で知られているｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ構造を得るための変異（抗体重鎖がｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃの組み合わせを持つようにする）などが挙げられる。これらの変異は、抗体に新たな特性を持たせることが確認されているが、抗体可変領域の機能を変えるものではない。
【0077】
「ヒト抗体」及び「ヒト由来抗体」は、交換可能に使用することができ、ヒト由来の抗体又は抗原刺激に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニック生物から得られた抗体であり得、当該技術分野で知られている任意の方法で産生することができる。いくつかの技術では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座が標的破壊された胚性幹細胞株に由来する生物の細胞株に導入する。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、この生物を用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖がヒトＤＮＡ起源に由来する１つ又は複数のヌクレオチド配列によってコードされている抗体でもあり得る。完全ヒト抗体は、遺伝子又は染色体トランスフェクション法及びファージディスプレイ技術によって構築することも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞によって構築することもでき、これらは全て当該技術分野で知られている。
【0078】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、考え得るバリアント抗体（例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じた変異を含み、これらのバリアントは通常少量しか存在しない）を除いて、個々の抗体からなる集団が同じエピトープを認識し、及び／又は同じエピトープと結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物（調製物）の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示すものであり、抗体の製造に特定の方法を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、並びに完全又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技術によって調製することができる。モノクローナル抗体を調製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。本開示のモノクローナル抗体は、完全長の抗体である。
【0079】
「全長抗体」、「インタクト抗体」、「完全抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、以下に定義される抗原結合フラグメントとは区別される、実質的に無傷の形態の抗体を指す。これらの用語は、具体的には、重鎖がＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域及びＦｃ領域を順にアミノ末端からカルボキシル末端に含み、軽鎖がＶＬ領域及びＣＬ領域を順にアミノ末端からカルボキシル末端に含む抗体を指す。
【0080】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子にコードされているが、組換え法を用いてそれらを合成リンカーで連結することにより、それらをＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖として製造することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５： ５８７９－５８８３を参照）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図されている。そのような抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、そのフラグメントは、インタクト抗体の場合と同様の方法で機能性についてスクリーニングされる。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的フラグメント化によって製造することができる。
【0081】
抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むこともでき、これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７－１０６２； ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，６４１，８７０）。
【0082】
Ｆａｂは、分子量約５０，０００Ｄａの抗体フラグメントであり、ＩｇＧ抗体分子をプロテアーゼパパイン（Ｈ鎖の２２４位のアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られ、抗原結合活性を有し、Ｎ末端側のそのＨ鎖の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で連結している。
【0083】
Ｆ（ａｂ’）２は、分子量約１００，０００Ｄａの抗体フラグメントであり、ＩｇＧのヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合の下部をペプシンで消化することによって得られる。それは抗原結合活性を有し、ヒンジ位置で連結した２つのＦａｂ領域を含む。
【0084】
Ｆａｂ’は、抗原結合活性を有する分子量約５０，０００Ｄａの抗体フラグメントであり、前述のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。Ｆａｂ’は、例えばジチオスレイトールなどの還元剤を使用して、抗原を特異的に認識して結合するＦ（ａｂ’）２を処理することにより製造することができる。
【0085】
さらに、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物又は真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることにより、Ｆａｂ’を製造することができる。
【0086】
「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーで連結された抗体重鎖可変ドメイン（すなわち領域；ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（すなわち領域；ＶＬ）とを含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有することができる。先行技術の適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそれらのバリアントからなり、例えば、１～４（１、２、３又は４を含む）の反復バリアントを使用する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４－６４４８）。本開示で使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５０：５１－５９に記載されている。
【0087】
「リンカー」は、ポリペプチド（タンパク質ドメインなど）を接続するために使用されるポリペプチド配列を指し、通常、ある程度の柔軟性を持っている。リンカーを使用することで、タンパク質ドメインの本来の構造及び機能が失われることはない。
【0088】
ダイアボディは、二量体化したｓｃＦｖの抗体フラグメントを指し、二価の抗原結合活性を持つ抗体フラグメントである。二価の抗原結合活性では、２つの抗原は同じであっても異なっていてもよい。
【0089】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬのそれぞれの１つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して接続することにより得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、抗体の三次元構造予測に基づく既知の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ７：６９７ （１９９４））に従って選択することができる。
【0090】
本開示のいくつかの例における抗原結合フラグメントは、以下の工程によって製造することができる：抗原を特異的に認識して結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及び／又はＶＬ並びにその他の必要なドメインをコードするｃＤＮＡを取得し、抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して抗原結合フラグメントを発現させる。
【0091】
「Ｆｃ領域」は、ネイティブＦｃ領域配列又はＦｃ領域バリアントであり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化する場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで延びていると定義される。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１に記載されているＥＵインデックスのナンバリングに従っている。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常ＣＨ２とＣＨ３の２つの定常領域ドメインを持つ。本開示の「ｋｎｏｂ－Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に含まれる点変異Ｔ３６６Ｗにより、ノブ状の空間構造を形成したものを指す。これに対応して、「ｈｏｌｅ－Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に含まれる点変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖが、ホール状の空間構造を形成したものを指す。Ｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃは、立体障害のためにヘテロ二量体を形成しやすい。ヘテロ二量体の形成をさらに促進するために、点変異Ｓ３５４ＣとＹ３４９Ｃをそれぞれｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃに導入し、ジスルフィド結合を介してヘテロ二量体の形成をさらに促進することができる。同時に、抗体Ｆｃによって引き起こされるＡＤＣＣ効果を排除する、又は弱めるために、置換変異２３４Ａ及び２３５ＡをＦｃに導入することもできる。例えば、本開示の好ましいｋｎｏｂ－Ｆｃ及びホール－Ｆｃは、それぞれ配列番号６９及び７０に示す通りである。二重特異性抗体では、ｋｎｏｂ－Ｆｃ又はホール－Ｆｃは、第１ポリペプチド鎖のＦｃ領域又は第２ポリペプチド鎖のＦｃ領域のいずれかとして使用することができる。１つの二重特異性抗体において、第１ポリペプチド鎖のＦｃ領域と第２ポリペプチド鎖のＦｃ領域とが同時にｋｎｏｂ－Ｆｃ又はホール－Ｆｃであることはできない。
【0092】
「アミノ酸差」又は「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質又はポリペプチドと比較して、タンパク質又はポリペプチドバリアントがアミノ酸の変化若しくは変異を有することを意味し、元のタンパク質又はポリペプチドを基準として、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失若しくは置換が挙げられる。
【0093】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）単独若しくはそれらを組み合わせたものを指す。当該技術分野で知られているように、重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域とも呼ばれる）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）で構成されている。各鎖のＣＤＲはＦＲによって強固に保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定する手法としては、少なくとも２つの手法がある：（１）異種間配列変動性に基づく方法（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， （５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；及び（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８ （１９９７））。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかの方法又は２つの方法の組み合わせによって決定されるＣＤＲを指すことができる。
【0094】
「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部を指し、これは可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場として機能する。基本的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。
【0095】
「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗体の可変領域に存在する超可変領域のうち、主に抗原結合に寄与する領域を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。様々な周知のスキームのいずれかを使用してＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができ、これには、「Ｋａｂａｔ」のナンバリング規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」のナンバリング規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のナンバリング規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ． Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ， ７， １３２－１３６ （１９９９）； Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ５５－７７ （２００３））などがある。例えば、古典的な形式では、Ｋａｂａｔの規則に従うと、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基番号は、３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）であり；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基番号は、２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）及び８９－９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａの規則に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸番号は、２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５２－５６（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）であり；ＶＬのアミノ酸残基番号は、２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）及び９１－９６（ＬＣＤＲ３）である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）及び８９－９７（ＬＣＤＲ３）とからなる。ＩＭＧＴの規則に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基番号は、おおよそ２６－３５（ＣＤＲ１）、５１－５７（ＣＤＲ２）及び９３－１０２（ＣＤＲ３）であり、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基番号は、おおよそ２７－３２（ＣＤＲ１）、５０－５２（ＣＤＲ２）及び８９－９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴの規則に従うと、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎというプログラムを使って、抗体のＣＤＲ領域を決定することができる。
【0096】
「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域又はその任意のＣＤＲバリアント」における「その任意のＣＤＲバリアント」とは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域のうち、いずれか１つ、又は２つ、又は３つの領域にアミノ酸変異を与えて得られるバリアントを指す。
【0097】
「抗体定常領域ドメイン」は、抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域に由来するドメインを指し、様々なタイプの抗体に由来するＣＬ及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインが含まれる。
【0098】
「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは通常、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個の連続又は非連続アミノ酸を含み、固有の空間的構造をしている。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６６， Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ． （１９９６）を参照。
【0099】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを指す。
【0100】
「競合」という用語が、同じエピトープをめぐって競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質又は中和抗体）の文脈で使用される場合、それは抗原結合タンパク質間の競合を意味し、これは、試験対象の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）が、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド又は参照抗体）の共通抗原に対する特異的結合を阻止又は阻害する（例えば、低減させる）アッセイによって測定される。多数のタイプの競合結合アッセイを使用して、ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを測定することができ、これらのアッセイは、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３６１４－３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ－１２５標識による固相直接標識ＲＩＡ（例えばＭｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５： ７－１５を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えばＣｈｅｕｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６： ５４６－５５２を参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：７７－８２）である。一般に、このアッセイでは、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質に結合することができる精製抗原（抗原は固体表面又は細胞表面上にある）の使用を伴う。競合阻害は、試験対象の抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、試験対象の抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；及び参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに十分に近い隣接エピトープに結合し、２つのエピトープが立体的に互いの結合を妨げる抗原結合タンパク質が含まれる。競合的結合を測定するために使用される方法に関する追加の詳細は、本明細書の実施例に記載されている。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、参照抗原結合タンパク質の共通抗原に対する特異的結合のうち、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、又は７５％以上を阻害する（例えば、減少させる）。場合によっては、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、又は９７％以上阻害される。
【0101】
「親和性」という用語は、単一エピトープにおける抗体と抗原間の相互作用の強さを意味する。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して複数のアミノ酸部位で抗原と相互作用する；その相互作用が大きいほど、親和性は強くなる。本明細書で使用される場合、抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂフラグメント）の「高親和性」という用語は、一般的にＫＤが１Ｅ－９Ｍ以下（例えば、ＫＤが１Ｅ－１０Ｍ以下、ＫＤが１Ｅ－１１Ｍ以下、ＫＤが１Ｅ－１２Ｍ以下、ＫＤが１Ｅ－１３Ｍ以下、ＫＤが１Ｅ－１４Ｍ以下等）の抗体又は抗原結合フラグメントを指す。
【0102】
「ＫＤ」又は「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。一般的に、抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いたＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定した解離平衡定数（ＫＤ）が、約１Ｅ－８Ｍ未満、例えば約１Ｅ－９Ｍ未満、１Ｅ－１０Ｍ又は約１Ｅ－１１Ｍ以下の抗原に結合する。ＫＤ値が小さいほど、親和性が高い。
【0103】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でもよいが、好ましくは二本鎖のＤＮＡ又はｍＲＮＡである。核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれると、その核酸は「作動可能に連結している」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコーディング配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーはコーディング配列に作動可能に連結している。
【0104】
「ベクター」という用語は、１つ又は複数の標的遺伝子又は配列を送達することができ、好ましくは宿主細胞内でそれを発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性凝集剤と会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター及び産生細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0105】
抗体及び抗原結合フラグメントの製造・精製方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５－８ ａｎｄ １５などの先行技術においてよく知られている。例えば、マウスを抗原又はそのフラグメントで免疫し、得られた抗体を復元して精製し、従来の方法を使用してアミノ酸配列決定を行うことができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法を使用して調製することができる。本開示による抗体又は抗原結合フラグメントは、非ヒトＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を付加するように遺伝子操作されている。ヒトＦＲ生殖細胞系配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ <http://www.imgt.org/>から、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することにより入手することができ、 <http://www.imgt.org/>又はＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， ２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から入手することができる。
【0106】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物又は動物の細胞が含まれ得る。容易に形質転換できる細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌又はサルモネラ菌株；バシラス科、例えば枯草菌；肺炎球菌；連鎖球菌及びインフルエンザ菌などが挙げられる。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ及びピキア・パストリスが挙げられる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｅ細胞などの非限定的な例）及びＮＳ０細胞が挙げられる。
【0107】
改変抗体又は抗原結合フラグメントは、従来の方法で調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み換えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクトすることができる。代替となる先行技術として、哺乳動物の発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位において、抗体のグリコシル化をもたらす可能性がある。抗原と特異的に結合する抗体を発現させることで、安定したクローンが得られる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地で増殖して抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、従来技法で精製することができる。例えば、精製には、調整された緩衝液を含むプロテインＡ又はプロテインＧセファロースＦＦカラムを用いる。非特異的に結合した成分は洗い流される。その後、結合した抗体をｐＨグラジエント法で溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出して回収する。この抗体を従来の方法で濾過し、濃縮することができる。可溶性混合物及びポリマーも、例えばモレキュラーシーブ及びイオン交換などの従来の方法で除去することができる。得られた生成物は、－７０℃などで直ちに凍結するか、凍結乾燥する必要がある。
【0108】
「投与する」、「投与」、「与える」及び「処理する」は、動物、ヒト、実験被験体、細胞、組織、器官又は生体液に適用される場合、外因性医薬品、治療剤、診断薬、組成物又は手動手術（例えば、実施例では「安楽死」）を、動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官又は生体液に提供することを意味する。「与える」及び「処理する」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究及び実験方法を意味し得る。細胞の処理には、試薬を細胞に接触させること、及び試薬を流体に接触させることが含まれ、その際、流体は細胞と接触する。「与える」及び「処理する」は、例えば、試薬、診断、結合組成物によって、又は別の種類の細胞によってｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで細胞を処理することも意味する。「処理する」は、ヒト、獣医又は研究対象に適用される場合、治療的処理、予防又は予防措置、研究及び診断用途を意味する。
【0109】
「治療」は、内用又は外用治療剤、例えば本開示の化合物のいずれか１つを含む組成物を、当該治療剤が治療効果を有することが知られている１つ又は複数の疾患症状を有する（又は有することが疑われる、又は罹患しやすい）被験体に与えることを意味する。一般に、治療剤は、治療を受ける患者又は集団の１つ又は複数の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与され、そのような症状の退行を誘導するか、そのような症状の発現を臨床的に測定される程度まで抑制する。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、様々な要因、例えば患者（又は被験体）の病状、年齢及び体重並びに被験体において所望の治療効果をもたらす医薬の能力などによって異なる場合がある。疾患の症状が緩和されたかどうかは、医師又は他の医療専門家によって一般的に使用されて、症状の重症度又は進行度を評価する任意の臨床試験方法によって評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各標的疾患症状を緩和する効果はない場合があるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・アンド・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定及びウィルコクソン検定などの当該技術分野で知られている任意の統計的検定方法に従って判断すると、それらは統計的に有意な数の被験体において標的疾患症状を軽減するはずである。
【0110】
「アミノ酸の保存的修飾」又は「アミノ酸の保存的置換」とは、タンパク質又はポリペプチド中のアミノ酸を、同様の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、主鎖の構造及び剛性等）を有する他のアミノ酸で置換することで、タンパク質又はポリペプチドの生物活性又は他の必要な特性（例えば、抗原親和性及び／若しくは特異性）を変えることなく頻繁な変更を可能にすることを指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｐａｇｅ ２２４， （４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。さらに、類似の構造又は機能を有するアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性が低い。例示的なアミノ酸の保存的置換を以下の表に示す：
【0111】
【表1】
【0112】
「有効量」及び「有効用量」は、１つ又は複数の有益な若しくは所望の治療結果を得るために必要な医薬、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的用途の場合、有益な又は所望の結果には、リスクの排除若しくは低減、重症度の低減又は疾患の生化学的、組織学的及び／若しくは行動学的症状、それらの合併症並びに疾患の発症中に現れる中間的な病理学的表現型を含む疾患の発症の遅延が挙げられる。治療用途の場合、有益な又は所望の結果には、例えば、本開示の様々な標的抗原関連障害の発生率を低減させる、又は障害の１つ若しくは複数の症状を改善する、障害の治療に必要な他の薬剤の用量を低減させる、別の薬剤の治療効果を増強させる、及び／又は被験体における本開示の標的抗原関連障害の進行を遅らせる臨床結果が含まれる。
【0113】
「外因性」とは、状況に応じて生物、細胞又は人体の外部で生成される物質を指す。「内因性」とは、状況に応じて細胞、生物又は人間の内部で生成される物質を指す。
【0114】
「相同性」及び「同一性」は、本明細書では交換可能であり、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。比較した２つの配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列に共通して一致する又は相同な位置の数を、比較した位置の数で割った値×１００の関数である。例えば、最適な配列アラインメントでは、２つの配列の１０の位置のうち６つの一致又は相同性がある場合、２つの配列は６０％の相同性を有する；２つの配列の１００の位置のうち９５の一致又は相同性がある場合、２つの配列は９５％の相同性を有する。一般的に、２つの配列をアラインする際には、相同性の割合が最大になるように比較を行う。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて比較を行うことができ、この場合、アルゴリズムのパラメータは、各参照配列の全長にわたって各配列間の一致が最大になるように選択される。
【0115】
以下の参考文献は、配列解析によく用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ： Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０； Ｇｉｓｈ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６－２７２； Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１－１４１； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２； Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴが提供するような他の従来のＢＬＡＳＴアルゴリズムも当業者にはよく知られている。
【0116】
「単離された」とは、元の状態からの分離を意味し、この状態にあるということは、指定の分子が他の生体分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質、例えば細胞残屑及び増殖培地を実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載されている化合物の実験的又は治療的使用を著しく妨げる量で存在しない限り、これらの物質が完全に存在しないこと、又は水、緩衝剤若しくは塩が存在しないことを意味するものではない。
【0117】
「任意選択の」又は「任意選択で」とは、後述する事象又は状況が発生する可能性はあるが、必ずしも発生する必要はないことを意味し、本記述には、事象又は状況が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。
【0118】
「医薬組成物」は、本開示に記載されている１つ若しくは複数の化合物、又はその生理学的／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、並びにその他の化学組成物、例えば生理学的／薬学的に許容される担体及び賦形剤を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への投与を促進することで、有効成分の吸収を容易にし、それによって生物活性を発揮することである。
【0119】
「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントの送達用製剤に使用するのに適した任意の不活性物質を指す。担体は、付着防止剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤又は希釈剤、防腐剤（酸化防止剤、抗菌剤若しくは抗真菌剤等）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等であり得る。適切な薬学的に許容される担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール等）、デキストロース、植物油（例えばオリーブオイル）、生理食塩水、緩衝剤、緩衝生理食塩水及び等張剤、例えば糖、ポリオール、ソルビトール及び塩化ナトリウムが挙げられる。
【0120】
さらに、本開示の別の態様は、標的抗原を特異的に認識して結合する本開示のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含む、標的抗原陽性細胞に関連する疾患を診断するための、標的抗原の免疫検出又は判定方法、標的抗原の免疫検出又は判定試薬、標的抗原を発現する細胞の免疫検出又は判定方法及び診断薬に関するものである。
【0121】
本開示において、標的抗原の量を検出又は測定するために用いられる方法は、任意の既知の方法であり得る。例えば、免疫検出又は測定方法が挙げられる。
【0122】
免疫検出法又は測定方法は、標識された抗原若しくは抗体を用いて、抗体若しくは抗原の量を検出又は測定する方法である。免疫検出又は測定方法の例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、物理化学的方法等が挙げられる。
【0123】
本開示のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを用いて、標的抗原を発現している細胞を検出又は測定することにより、標的抗原陽性細胞に関連する前述の疾患を診断することができる。
【0124】
ポリペプチドを発現している細胞を検出するために、既知の免疫検出法を用いることができ、好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織化学的染色法などを用いる。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を利用した蛍光抗体染色法を用いることもできる。
【0125】
本開示において、標的抗原の検出又は測定に用いる生サンプルは、標的抗原を発現する細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液又は培養液などが挙げられる。
【0126】
必要な診断方法によれば、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含む診断薬は、抗原抗体反応を行うための試薬又は反応を検出するための試薬も含み得る。抗原抗体反応を行うための試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出に用いる試薬としては、免疫検出法又は測定法に一般的に用いられる試薬、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメント又はそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体及びその標識に対応する基質等が挙げられる。
【0127】
「がん」及び「がん性」という用語は、一般的に無秩序な細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指す、又は説明する。本開示の二重特異性結合分子で治療することができるがんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。ＵＳ２００８／００１４１９６においてＶＥＧＦアンタゴニストでの治療が示唆されているこれらのがんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮細胞癌、腹膜がん、肝がん、消化管がん、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん又は子宮体がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、胃がん、黒色腫、皮膚がん及び各種頭頸部がんが挙げられる。血管新生の異常な制御は、本開示の組成物及び方法によって治療することができる多くの状態をもたらし得る。これらの状態には、非腫瘍性症状と腫瘍性症状の両方が含まれる。腫瘍性症状には前述の症状が含まれるが、これらに限定されない。
【0128】
非腫瘍性状態には、ＵＳ２００８／００１４１９６に記載されているようなＶＥＧＦアンタゴニストで治療される以下の状態が含まれるが、これらに限定されない：望ましくない又は異常な肥大、関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性プラーク、糖尿病性及びその他の増殖性網膜症（未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、虹彩角膜血管新生（ルベオーシス）、眼球血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（バセドウ病を含む））、角膜及びその他の組織の移植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出液、脳浮腫（例えば、急性脳梗塞／閉鎖性頭部外傷／外傷に関連するもの）、滑膜炎、関節リウマチ（ＲＡ）のパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、変形性関節症（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、体液のサードスペーシング疾患（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷及び腸疾患）、子宮筋腫、早産、ＩＢＤ（クローン病及び潰瘍性大腸炎）などの慢性炎症、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織増殖（非がん性）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、発毛抑制、オスラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢液貯留（例えば、心膜炎に関連する心嚢液貯留）並びに胸水。本開示は、実施例と組み合わせて以下にさらに説明されるが、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例において具体的な条件を指定していない実験方法は、通常、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒなどの従来の条件に従うものであるか；又は原料若しくは商品のメーカーが推奨する条件に従うものである。具体的なの供給源が明記されていない試薬は、市場で購入した従来試薬である。
【0129】
（実施例１．ＡＮＧ２及びＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２の発現）
ヒトＩｇＧ１－Ｆｃタグ付きのヒトＡＮＧ２及びヒトＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２の細胞外領域をコードする配列をｐｈｒベクターに挿入して発現プラスミドを構築し、これをＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。具体的なトランスフェクション工程は以下の通りである：トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地（１％ＦＢＳ含有、Ｇｉｂｃｏ、１２３３８－０２６）に１×１０６／ｍｌで播種し、３７℃の恒温シェーカー（１２０ｒｐｍ）に乗せて２４時間連続培養した。２４時間後、トランスフェクションプラスミド及びトランスフェクション試薬ＰＥＩを０．２２μｍフィルターで滅菌した後、トランスフェクションプラスミドを１００μｇ／１００ｍｌ細胞に調整し、ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）とプラスミドの質量比を２：１とした。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ１０ｍｌ及び２００μｇのプラスミドを取り、よく混合して５分間静置した；さらにＯｐｔｉ－ＭＥＭ１０ｍｌ及び４００μｇのＰＥＩを取り、よく混合して５分間静置した。プラスミド及びＰＥＩをよく混合し、１５分間静置した。プラスミド及びＰＥＩの混合液を２００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに載せて培養した。トランスフェクション３日目に、培養液に１０％容量の補助培地（２０ｍＭグルコース＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸）を補充した。トランスフェクション６日目までサンプルを採取し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞上清を回収した。組換えＡＮＧ２又はＴｉｅ２受容体タンパク質を含む上清を、実施例２に記載のように精製した。精製したタンパク質は、以下の実施例又は試験例で使用することができる。
ヒトＩｇＧ１－Ｆｃタグ付きのヒトＡＮＧ２及びヒトＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２の細胞外領域をコードする配列をｐｈｒベクターに挿入して発現プラスミドを構築し、これをＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。具体的なトランスフェクション工程は以下の通りである：トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地（１％ＦＢＳ含有、Ｇｉｂｃｏ、１２３３８－０２６）に１×１０６／ｍｌで播種し、３７℃の恒温シェーカー（１２０ｒｐｍ）に乗せて２４時間連続培養した。２４時間後、トランスフェクションプラスミド及びトランスフェクション試薬ＰＥＩを０．２２μｍフィルターで滅菌した後、トランスフェクションプラスミドを１００μｇ／１００ｍｌ細胞に調整し、ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）とプラスミドの質量比を２：１とした。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ１０ｍｌ及び２００μｇのプラスミドを取り、よく混合して５分間静置した；さらにＯｐｔｉ－ＭＥＭ１０ｍｌ及び４００μｇのＰＥＩを取り、よく混合して５分間静置した。プラスミド及びＰＥＩをよく混合し、１５分間静置した。プラスミド及びＰＥＩの混合液を２００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに載せて培養した。トランスフェクション３日目に、培養液に１０％容量の補助培地（２０ｍＭグルコース＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸）を補充した。トランスフェクション６日目までサンプルを採取し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞上清を回収した。組換えＡＮＧ２又はＴｉｅ２受容体タンパク質を含む上清を、実施例２に記載のように精製した。精製したタンパク質は、以下の実施例又は試験例で使用することができる。
【0130】
その中でも、ヒトＡＮＧ２のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、Ｔｉｅ２細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示す通りである。
【0131】
関連する配列は以下の通りである：
・ ヒトＦｃタグ付きヒトＡＮＧ２のアミノ酸配列
注：下線部はＡＮＧ２タンパク質の全長配列を表し、点線はリンカーを表し、イタリック体部分はヒトＩｇＧ１Ｆｃタグを表す。
（２）ヒトＦｃタグ付きＴｉｅ２のアミノ酸配列
注：下線部はＴｉｅ２の細胞外領域を表し、イタリック体部分はヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを表す。
・ ヒトＦｃタグ付きヒトＡＮＧ２のアミノ酸配列
【化7】
注：下線部はＡＮＧ２タンパク質の全長配列を表し、点線はリンカーを表し、イタリック体部分はヒトＩｇＧ１Ｆｃタグを表す。
（２）ヒトＦｃタグ付きＴｉｅ２のアミノ酸配列
【化8】
注：下線部はＴｉｅ２の細胞外領域を表し、イタリック体部分はヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを表す。
【0132】
（実施例２．プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによるＦｃタグ付き組換えタンパク質又は抗体の精製）
細胞で発現した抗体又はＡＮＧ２及びＴｉｅ２の上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまでＰＢＳでカラムを洗浄した。標的タンパク質を１００Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳ平衡化ゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を用いてさらに精製した。電気泳動、ペプチドマップ及びＬＣ－ＭＳを経て、得られたタンパク質を正しいものと同定し、後で使用するために分注した。
細胞で発現した抗体又はＡＮＧ２及びＴｉｅ２の上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまでＰＢＳでカラムを洗浄した。標的タンパク質を１００Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳ平衡化ゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を用いてさらに精製した。電気泳動、ペプチドマップ及びＬＣ－ＭＳを経て、得られたタンパク質を正しいものと同定し、後で使用するために分注した。
【0133】
（実施例３．組換えＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２を発現する細胞株の構築及び同定）
本開示では、機能性抗体のスクリーニング用に、Ｔｉｅ２を発現するＣＨＯ－Ｋ１／Ｔｉｅ２細胞株を構築した。
本開示では、機能性抗体のスクリーニング用に、Ｔｉｅ２を発現するＣＨＯ－Ｋ１／Ｔｉｅ２細胞株を構築した。
【0134】
ヒトＴｉｅ２完全長遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクターｐＢＡＢＥにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）に３つのプラスミドｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＧａｇ－ｐｏｌ及びｐＢＡＢＥ－Ｔｉｅ２をコトランスフェクトし、ウイルスをパッケージ化した。トランスフェクションから４８時間後、ウイルスを回収してＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－９６１８）に感染させた。
【0135】
感染から７２時間後、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて加圧下で選択した。コロニーを拡大・増殖させた後、細胞を消化し、ＦＡＣＳで発現量を検出した。陽性率は約４０％であり、その後モノクローナル細胞を選別し、Ｔｉｅ２を発現する単一クローン１Ｂ１１を得た。
【0136】
（実施例４．抗ヒトＡＮＧ２単一ドメイン抗体の調製及びスクリーニング）
本開示では、ラマを免疫して免疫ライブラリーを得た後、その免疫ライブラリーを濃縮し、ヒトＡＮＧ２に対するラマ由来モノクローナル抗体をスクリーニングした。得られた抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合することができ、ｃｙｎｏ及びマウスＡｎｇ２と交差反応性を示し、ＡＮＧ２とその受容体との結合を阻害することができ、ＡＮＧ２を介したＴｉｅ２のリン酸化を阻害することができる。
本開示では、ラマを免疫して免疫ライブラリーを得た後、その免疫ライブラリーを濃縮し、ヒトＡＮＧ２に対するラマ由来モノクローナル抗体をスクリーニングした。得られた抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合することができ、ｃｙｎｏ及びマウスＡｎｇ２と交差反応性を示し、ＡＮＧ２とその受容体との結合を阻害することができ、ＡＮＧ２を介したＴｉｅ２のリン酸化を阻害することができる。
【0137】
具体的には、フロイントアジュバントと混合したヒトＡｎｇ２－Ｆｃタンパク質でのラマの免疫を、１回の免疫に２５０μｇのタンパク質を使用して、３週間に１回行った。合計４回の免疫後、２００ｍｌの血液を採取してＰＢＭＣを分離し、ＰＢＭＣから全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを鋳型として使用して抗体遺伝子配列を増幅した。この抗体遺伝子を制限酵素消化及びライゲーションによりファージミドベクターに連結し、ＴＧ１コンピテント細胞に電気形質転換した。５ｎＭ及び２ｎＭのビオチン－ｈＡｎｇ２－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０６９１－Ｈ０７Ｈ）による２回の濃縮後、濃縮したライブラリを、ヒトＡＮＧ２へのＥＬＩＳＡ結合（試験例１を参照）、ＡＮＧ２及びＴｉｅ２の結合の遮断（試験例２、試験例３を参照）、並びにマウスＡＮＧ２との交差結合（試験例１を参照）によってスクリーニングした。優れた活性を有する様々な単一ドメイン抗体、例えばナノ１４及びナノ１５をスクリーニングし、それらの具体的な配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。
ラマ由来単一ドメイン抗体ナノ１４
ラマ由来単一ドメイン抗体ナノ１５
ラマ由来単一ドメイン抗体ナノ１４
【化9】
ラマ由来単一ドメイン抗体ナノ１５
【化10】
【0138】
本開示におけるラマ由来単一ドメイン抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ基準によって決定され、アノテーションされたものであり、その具体的な配列を表１に記載する。
表１．ラマ由来抗体のＣＤＲ領域配列
表１．ラマ由来抗体のＣＤＲ領域配列
【表2】
【0139】
（実施例５．抗ヒトＡＮＧ２単一ドメイン抗体のＣＤＲ変異及びヒト化）
（１．ＣＤＲ変異の設計）
単一ドメイン抗体ナノ１４のＣＤＲ２を変異させ、以下に示すような新しいＣＤＲ２配列を含む単一ドメイン抗体ナノ１４．１及びナノ１４．２を得た。
表２．変異後に得られた単一ドメイン抗体のＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ基準によって決定）
（１．ＣＤＲ変異の設計）
単一ドメイン抗体ナノ１４のＣＤＲ２を変異させ、以下に示すような新しいＣＤＲ２配列を含む単一ドメイン抗体ナノ１４．１及びナノ１４．２を得た。
表２．変異後に得られた単一ドメイン抗体のＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ基準によって決定）
【表3】
【0140】
変異後に得られたナノ１４．１及びナノ１４．２の完全長配列は、以下の通りである：
ラマ ナノ１４．１：
ラマ ナノ１４．２：
ラマ ナノ１４．１：
【化11】
ラマ ナノ１４．２：
【化12】
【0141】
以上のことから、本開示における抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体のＣＤＲ配列は非常に類似していることが分かり、その一般式配列は以下の通りである：
表３．ラマ単一ドメイン抗体のＣＤＲ一般式
【表4】
【0142】
得られたラマ抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体の一般式は以下の通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【化13】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１０はＤ又はＮから選択される、及びＸ１１はＶ又はＬから選択される。
【0143】
（２．ラマ由来抗ヒトＡＮＧ２単一ドメイン抗体のヒト化）
ラマ由来抗体の免疫原性を低下させるために、本開示では、優れたｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するスクリーニングされた抗体をヒト化した。
ラマ由来抗体の免疫原性を低下させるために、本開示では、優れたｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するスクリーニングされた抗体をヒト化した。
【0144】
ラマ由来抗ヒトＡＮＧ２単一ドメイン抗体のヒト化は、当該技術分野の多くの文献に掲載されている方法に従って行った。簡潔に言えば、ラクダ由来単一ドメイン抗体は重鎖可変領域を１つしか持たないため、それらのＣＤＲを最も相同性の高いヒト重鎖鋳型に移植し、同時にＦＲ領域に復帰突然変異を施した。「移植」とは、ラマ由来抗体のＣＤＲ領域を鋳型配列のＦＲに移植することを表し、復帰突然変異の位置はＫａｂａｔ基準に従って決定した。
【0145】
（２．１ ナノ１４のヒトＦＲ領域の選択及び主要アミノ酸の復帰突然変異）
ナノ１４のＶＨの鋳型としてＩＧＨＶ３－２３＊０４を選択し、Ｊ領域の鋳型としてＩＧＨＪ６＊０１を選択した（ＦＲ４）。ナノ１４のＣＤＲをヒト鋳型に移植し、ＭＯＥソフトウェアを用いて埋め込み残基及びＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を見つけ、復帰突然変異を起こし、表４に示すように異なる重鎖可変領域を持つヒト化抗体を設計した。
注：例えば、Ａ９３Ｎは、Ｋａｂａｔ基準に従い、９３位のＡがＮに変異したことを表す。移植は、ラマ抗体のＣＤＲがヒト生殖細胞系列のＦＲ領域配列に移植されたことを表す。
ナノ１４のＶＨの鋳型としてＩＧＨＶ３－２３＊０４を選択し、Ｊ領域の鋳型としてＩＧＨＪ６＊０１を選択した（ＦＲ４）。ナノ１４のＣＤＲをヒト鋳型に移植し、ＭＯＥソフトウェアを用いて埋め込み残基及びＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を見つけ、復帰突然変異を起こし、表４に示すように異なる重鎖可変領域を持つヒト化抗体を設計した。
【表5】
注：例えば、Ａ９３Ｎは、Ｋａｂａｔ基準に従い、９３位のＡがＮに変異したことを表す。移植は、ラマ抗体のＣＤＲがヒト生殖細胞系列のＦＲ領域配列に移植されたことを表す。
【0146】
ラマ抗ＡＮＧ２ナノ１４抗体のヒト化後に得られた抗体配列は以下の通りであり、ＣＤＲ領域のアミノ酸残基の決定はＫａｂａｔ基準によって決定され、アノテーションされたものである。
【化14】
【0147】
前述のＶＨＨを、配列番号３１に示すラニビズマブ重鎖可変領域＋ＩｇＧ１重鎖定常領域のＣ末端に融合させ、二重特異性抗体の重鎖を形成した。
【0148】
（２．２ ナノ１５のヒトＦＲ領域の選択及び復帰突然変異）
ナノ１５のＶＨの鋳型としてＩＧＨＶ３－２３＊０４を選択し、Ｊ領域の鋳型としてＩＧＨＪ６＊０１を選択した（ＦＲ４）。ナノ１５のＣＤＲをヒト鋳型に移植し、ＭＯＥソフトウェアを用いて埋め込み残基及びＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を見つけ、復帰突然変異を起こし、表５に示すように異なる重鎖可変領域を持つヒト化抗体を設計した。
注：例えば、Ａ９３Ｎは、Ｋａｂａｔ基準に従い、９３位のＡがＮに変異したことを表す。移植は、ラマ抗体のＣＤＲがヒト生殖細胞系列のＦＲ領域配列に移植されたことを表す。
ナノ１５のＶＨの鋳型としてＩＧＨＶ３－２３＊０４を選択し、Ｊ領域の鋳型としてＩＧＨＪ６＊０１を選択した（ＦＲ４）。ナノ１５のＣＤＲをヒト鋳型に移植し、ＭＯＥソフトウェアを用いて埋め込み残基及びＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を見つけ、復帰突然変異を起こし、表５に示すように異なる重鎖可変領域を持つヒト化抗体を設計した。
【表6】
注：例えば、Ａ９３Ｎは、Ｋａｂａｔ基準に従い、９３位のＡがＮに変異したことを表す。移植は、ラマ抗体のＣＤＲがヒト生殖細胞系列のＦＲ領域配列に移植されたことを表す。
【0149】
ヒト化ナノ１５抗体の可変領域の具体的な配列は以下の通りである：
【化15】
【0150】
ヒト化後に得られた単一ドメイン抗体の完全長一般式配列は以下の通りである：
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【化16】
ここで、Ｘ１はＤ又はＳから選択される；Ｘ２はＦ又はＹから選択される；Ｘ３はＧ又はＡから選択される；Ｘ４はＳ又はＴから選択される；Ｘ５はＴ又はＮから選択される；Ｘ６はＷ又はＳから選択される；Ｘ７はＮ、Ｇ又はＳから選択される；Ｘ８はＲ又はＳから選択される；Ｘ９はＹ又はＧから選択される；Ｘ１２はＶ又はＱから選択される；Ｘ１３はＳ又はＮから選択され、Ｘ１４はＲ又はＫから選択され、Ｘ１５はＡ又はＰから選択され、Ｘ１６はＡ又はＮから選択され、Ｘ１７はＫ又はＡから選択される。
【0151】
（実施例６．抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体の調製及び同定）
本開示の二重特異性抗体中に存在する抗ＶＥＧＦ抗体は、アバスチン、ＲＡＺＵＭＡＢ（Ａｘｘｉｏｍ社）、ＧＮＲ－０１１（Ａｆｆｉｔｅｃｈ Ａ／Ｓ）、Ｒ－ＴＰＲ－０２４（Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕ）、ラムシルマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの、ＶＥＧＦに対する任意の現在入手可能な抗体であってよい。例示的な抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のＦａｂ抗体ラニビズマブ（ルセンティス）であり、その軽鎖可変領域配列は配列番号２８に示す通りである（ＷＯ１９９８０４５３３２又はＣＡＳ登録番号：３４７３９６－８２－１を参照）。抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖は、ラニビズマブの重鎖可変領域（配列番号３０に示す、ＷＯ１９９８０４５３３２を参照）とヒトＩｇＧ１定常領域を組み合わせて形成された完全ＩｇＧ１重鎖であり、末端のＫはＧに変異している。その具体的な配列は配列番号３１に示す通りである。関連する配列は以下の通りである：
（１）ラニビズマブの軽鎖可変領域
（２）ラニビズマブの軽鎖
（３）ラニビズマブの重鎖可変領域
（４）ラニビズマブの重鎖可変領域＋ＩｇＧ１定常領域（重鎖）
（５）ラニビズマブの重鎖可変領域＋ＩｇＧ１定常領域バリアント（重鎖）
注：順序は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。配列中、イタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表し、点線は定常領域配列を表す。
本開示の二重特異性抗体中に存在する抗ＶＥＧＦ抗体は、アバスチン、ＲＡＺＵＭＡＢ（Ａｘｘｉｏｍ社）、ＧＮＲ－０１１（Ａｆｆｉｔｅｃｈ Ａ／Ｓ）、Ｒ－ＴＰＲ－０２４（Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕ）、ラムシルマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの、ＶＥＧＦに対する任意の現在入手可能な抗体であってよい。例示的な抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のＦａｂ抗体ラニビズマブ（ルセンティス）であり、その軽鎖可変領域配列は配列番号２８に示す通りである（ＷＯ１９９８０４５３３２又はＣＡＳ登録番号：３４７３９６－８２－１を参照）。抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖は、ラニビズマブの重鎖可変領域（配列番号３０に示す、ＷＯ１９９８０４５３３２を参照）とヒトＩｇＧ１定常領域を組み合わせて形成された完全ＩｇＧ１重鎖であり、末端のＫはＧに変異している。その具体的な配列は配列番号３１に示す通りである。関連する配列は以下の通りである：
（１）ラニビズマブの軽鎖可変領域
【化17】
（２）ラニビズマブの軽鎖
【化18】
（３）ラニビズマブの重鎖可変領域
【化19】
（４）ラニビズマブの重鎖可変領域＋ＩｇＧ１定常領域（重鎖）
【化20】
（５）ラニビズマブの重鎖可変領域＋ＩｇＧ１定常領域バリアント（重鎖）
【化21】
注：順序は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。配列中、イタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表し、点線は定常領域配列を表す。
【表7】
【0152】
本開示の抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体のＮ末端アミノ酸を、相同組換え技術を用いて、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖のＣ末端アミノ酸に直接的に（ペプチド結合を介して）又はリンカー（ＧＧなど）を介して間接的に接続し、従来は２９３発現系を介して発現させて、二重特異性抗体を得た。図１に二重特異性抗体の概略構造を示す。
＊注：Ａｂは、任意の種類の抗ＶＥＧＦ抗体であり得る。
【表8】
＊注：Ａｂは、任意の種類の抗ＶＥＧＦ抗体であり得る。
【0153】
抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖のアミノ末端若しくはカルボキシル末端、又は抗ＶＥＧＲ抗体の軽鎖のアミノ末端に接続することができる。抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖のカルボキシル末端に接続して得られた二重特異性抗体は、より良好な安定性を持つことが確認されている。
【0154】
例として、異なる抗ＡＮＧ２単一ドメイン抗体を、アミノ末端でラニビズマブの重鎖のカルボキシル末端に、（Ｇ）ｎ（ｎ＞＝１）リンカーなどのリンカーを介して接続し、以下の二重特異性抗体を形成した。
注：第１鎖の順序は、ラニビズマブＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－ＣＨ－リンカー－単一ドメイン抗体ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。配列中、通常の書式部分はラニビズマブの可変領域のＦＲ配列を表し、波状の下線はラニビズマブのＣＤＲ配列を表し、点線はＩｇＧ１重鎖の定常領域配列を表し、二重下線はリンカーを表し、イタリック体部分は単一ドメイン抗体配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【表9-6】
【表9-7】
注：第１鎖の順序は、ラニビズマブＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－ＣＨ－リンカー－単一ドメイン抗体ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。配列中、通常の書式部分はラニビズマブの可変領域のＦＲ配列を表し、波状の下線はラニビズマブのＣＤＲ配列を表し、点線はＩｇＧ１重鎖の定常領域配列を表し、二重下線はリンカーを表し、イタリック体部分は単一ドメイン抗体配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。
【0155】
実施例２の精製方法によれば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いた精製により、純度＞９８％の二重特異性抗体分子を得ることができる。
【0156】
同時に、Ｒｏｃｈｅ社のＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体クロスマブ（バヌシズマブ）を陽性対照として使用し、その配列は配列番号４８及び配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１に示す通りである（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ． １， ２０１５を参照）。さらに、アバスチンを陽性対照として使用し、その重鎖配列は配列番号５２に示す通りであり、軽鎖配列は配列番号５３に示す通りである（ＣＡＳ登録番号：２１６９７４－７５－３を参照）。
＞クロスマブ抗ＡＮＧ２重鎖
＞クロスマブ抗ＡＮＧ２軽鎖
＞クロスマブ抗ＶＥＧＦ重鎖
＞クロスマブ抗ＶＥＧＦ軽鎖
注：下線は可変領域配列を表し、それ以外は定常領域配列を表す。
＞アバスチン重鎖
＞アバスチン軽鎖
＞ＲＧ７７１６（ＣＮ１０５１４３２６２ＡのＶＥＧＦａｎｇ２－００１６を参照して調製）：
抗ＶＥＧＦ重鎖（Ｋｎｏｂ）
抗Ａｎｇ２重鎖（Ｈｏｌｅ）
抗ＶＥＧＦ軽鎖
抗Ａｎｇ２軽鎖
＞クロスマブ抗ＡＮＧ２重鎖
【化22】
＞クロスマブ抗ＡＮＧ２軽鎖
【化23】
＞クロスマブ抗ＶＥＧＦ重鎖
【化24】
＞クロスマブ抗ＶＥＧＦ軽鎖
【化25】
注：下線は可変領域配列を表し、それ以外は定常領域配列を表す。
＞アバスチン重鎖
【化26】
＞アバスチン軽鎖
【化27】
＞ＲＧ７７１６（ＣＮ１０５１４３２６２ＡのＶＥＧＦａｎｇ２－００１６を参照して調製）：
抗ＶＥＧＦ重鎖（Ｋｎｏｂ）
【化28】
抗Ａｎｇ２重鎖（Ｈｏｌｅ）
【化29】
抗ＶＥＧＦ軽鎖
【化30】
抗Ａｎｇ２軽鎖
【化31】
【0157】
さらに、本開示で用いられる陰性対照（ＮＣ）とは、ＨＩＶに対するＩｇＧ型モノクローナル抗体を指す。
【0158】
（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の生物学的評価）
（試験例１．ＡＮＧ２及びその同族タンパク質であるＡＮＧ１に対するＡＮＧ２抗体の親和性のＥＬＩＳＡ判定）
（１）ヒトＡＮＧ２－Ｈｉｓ結合ＥＬＩＳＡ
プレートにストレプトアビジン（ａｂｃａｍ、ａｂ１２３４８０）を１ｎｇ／μｌの濃度で１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コーティングした後、その上清を除去した。２５０μｌの５％脱脂粉乳を加えて３７℃で１時間ブロッキングした後、プレートを洗浄機で３回洗浄した。０．５ｎｇ／μｌのビオチン－ｈＡｎｇ２－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０６９１－Ｈ０７Ｈ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌの１：１希釈ファージ上清を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１：１００００に希釈した抗Ｍ１３－ＨＲＰ（ＧＥ、２７－９４２１－０１）１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加えて発色させた。５～１０分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して発色を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。その結果を図２Ａに示す。
（試験例１．ＡＮＧ２及びその同族タンパク質であるＡＮＧ１に対するＡＮＧ２抗体の親和性のＥＬＩＳＡ判定）
（１）ヒトＡＮＧ２－Ｈｉｓ結合ＥＬＩＳＡ
プレートにストレプトアビジン（ａｂｃａｍ、ａｂ１２３４８０）を１ｎｇ／μｌの濃度で１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コーティングした後、その上清を除去した。２５０μｌの５％脱脂粉乳を加えて３７℃で１時間ブロッキングした後、プレートを洗浄機で３回洗浄した。０．５ｎｇ／μｌのビオチン－ｈＡｎｇ２－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０６９１－Ｈ０７Ｈ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌの１：１希釈ファージ上清を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１：１００００に希釈した抗Ｍ１３－ＨＲＰ（ＧＥ、２７－９４２１－０１）１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加えて発色させた。５～１０分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して発色を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。その結果を図２Ａに示す。
【0159】
（２）ＡＮＧ１結合ＥＬＩＳＡ
プレートにヒトＡＮＧ１（ＲＤ、９２３－ＡＮ）を１ｎｇ／μｌの濃度で１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コーティングした。上清を除去し、２５０μｌの５％脱脂粉乳を加えて３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌの１：１希釈ファージ上清を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１：１００００に希釈したＭ１３－ＨＲＰ１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加えて発色させた。５～１０分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して発色を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。その結果を図２Ｂに示す。
プレートにヒトＡＮＧ１（ＲＤ、９２３－ＡＮ）を１ｎｇ／μｌの濃度で１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コーティングした。上清を除去し、２５０μｌの５％脱脂粉乳を加えて３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌの１：１希釈ファージ上清を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１：１００００に希釈したＭ１３－ＨＲＰ１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄機で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加えて発色させた。５～１０分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して発色を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。その結果を図２Ｂに示す。
【0160】
結果は、ナノ１４及びナノ１５がヒトＡＮＧ２に対して非常に強い結合能力を示すが、ヒトＡＮＧ１には結合しないため、良好な選択性を有することを示した。
【0161】
（試験例２．異なる種のＶＥＧＦ／ＡＮＧ２とのＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体の親和性のＢｉａｃｏｒｅ測定）
ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＶＥＧＦ並びにＡＮＧ２に対する試験対象のヒト化ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）装置を用いて測定した。
ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＶＥＧＦ並びにＡＮＧ２に対する試験対象のヒト化ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２二重特異性抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）装置を用いて測定した。
【0162】
これら抗体をプロテインＡバイオセンサーチップを用いてアフィニティキャプチャーした後、それらの抗原、すなわちヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ、２９３－ＶＥ）、ｃｙｎｏ ＶＥＧＦ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１０６６）、マウスＶＥＧＦ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５１０５９）、ヒトＡＮＧ２（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０６９１－Ｈ０８Ｈ）、ｃｙｎｏ ＡＮＧ２（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、９００２６－Ｃ０７Ｈ）及びマウスＡＮＧ２（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０２９８－Ｍ０７Ｈ）をチップ表面に流した。反応シグナルをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いてリアルタイムで検出し、結合曲線及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ再生緩衝液（ｐＨ１．５）で再生した。ＢＩＡ評価バージョン４．１、ＧＥソフトウェアを用いてデータを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに当てはめ、表９に示すように、親和性の値を得た。
【表10】
【0163】
結果は、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、試験した全ての種のＶＥＧＦ（マウスＶＥＧＦを除く）及びＡＮＧ２と比較的高い親和性を有することを示している。
【0164】
（試験例３．ＡＮＧ２のＴｉｅ２受容体への結合を遮断する抗体のＥＬＩＳＡベースの実験）
ＡＮＧ２は、血管内皮細胞の表面にあるＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２に結合し、Ｔｉｅ２細胞のチロシンキナーゼのリン酸化を誘発し、血管内皮細胞から末梢細胞を剥離させるシグナルを伝達し、血管を不安定で増殖しやすい状態にする。したがって、ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を抗体で遮断することで、血管をより安定させ、新生血管を抑制することができる。この実験の同定結果は、二重特異性抗体が、組換え発現したＴｉｅ２タンパク質の細胞外ドメインへのＡＮＧ２の結合を遮断できることを示している。
ＡＮＧ２は、血管内皮細胞の表面にあるＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２に結合し、Ｔｉｅ２細胞のチロシンキナーゼのリン酸化を誘発し、血管内皮細胞から末梢細胞を剥離させるシグナルを伝達し、血管を不安定で増殖しやすい状態にする。したがって、ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を抗体で遮断することで、血管をより安定させ、新生血管を抑制することができる。この実験の同定結果は、二重特異性抗体が、組換え発現したＴｉｅ２タンパク質の細胞外ドメインへのＡＮＧ２の結合を遮断できることを示している。
【0165】
具体的方法：ＥＬＩＳＡプレートにＴｉｅ２－Ｆｃ（配列番号２、ＰＢＳに溶解した３μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）を４℃で一晩コーティングした後、コーティング溶液を除去し、ＰＢＳで希釈した５％脱脂粉乳ブロッキング溶液を２００μｌ／ウェル添加し、３７℃のインキュベーターで２時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５回洗浄した。次に、１％ＢＳＡで希釈したビオチン標識キット（同仁化学研究所、ＬＫ０３）で標識したｈｕＡＮＧ２－Ｆｃ（配列番号１、ｂｉｏ－ｈｕＡＮＧ２－Ｆｃ、最終濃度０．１５μｇ／ｍｌ）５０μｌと、試験対象抗体５０μｌ（初期濃度１０μｇ／ｍｌ、３倍段階希釈）を加えた。この溶液をよく混合した後、３７℃で１５分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、ＥＬＩＳＡプレート内の反応液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、１：４０００に希釈したストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を１００μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、５２－００－０３）を１００μｌ／ウェル添加し、室温で３～１０分間インキュベートし、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウェル添加して反応を停止させた。ＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸収値を読み取り、ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を遮断する抗体のＩＣ５０値を算出した。結果は、ＡＮＧ２単一ドメイン抗体及び二重特異性抗体の両方が、ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を強力に阻害できることを示している（表１０及び表１１を参照）。
【表11】
【表12】
【0166】
（試験例４．ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を遮断する二重特異性抗体のＦＡＣＳベースの実験）
選択した二重特異性抗体が細胞表面のＴｉｅ２受容体を遮断できることを確認するために、Ｔｉｅ２を高度に発現するＣＨＯＫ１組換え細胞株を構築した。この実験により、二重特異性抗体が、ＣＨＯＫ１細胞株の表面にある組換えＴｉｅ２へのＡＮＧ２の結合を遮断できることが確認された。
選択した二重特異性抗体が細胞表面のＴｉｅ２受容体を遮断できることを確認するために、Ｔｉｅ２を高度に発現するＣＨＯＫ１組換え細胞株を構築した。この実験により、二重特異性抗体が、ＣＨＯＫ１細胞株の表面にある組換えＴｉｅ２へのＡＮＧ２の結合を遮断できることが確認された。
【0167】
具体的な方法は以下の通りである：
細胞実験中、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを実験緩衝液として使用した。安定的にトランスフェクトされＴｉｅ２を過剰発現する株ＣＨＯ－Ｔｉｅ２＃１Ｂ１１を消化して再懸濁した後、細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで１回洗浄し、再懸濁し、密度を２．０×１０６細胞／ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル丸底培養プレートに５０μｌ／ウェルで、すなわち１．０×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。Ｂｉｏ－ｈｕＡＮＧ２－Ｆｃ、抗体及び陰性対照をそれぞれ２％ＦＢＳ／ＰＢＳで希釈し、等量ずつ十分に混合した。３７℃で１５分間インキュベートした後、５０μｌの抗原－抗体混合物を細胞懸濁液に加えた。混合系のｂｉｏ－ｈｕＡＮＧ２－Ｆｃの最終濃度は０．２０μｇ／ｍｌであり、試験した抗体の初期濃度を３倍段階希釈で１０ｎＭとした。この混合液を４℃で１時間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。１：１０００に希釈したＰＥ－ストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ５５４０６１）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。２％ＦＢＳ／ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加えて細胞を再懸濁した後、フローサイトメーターで検出し、１ウェルあたり１０，０００個の細胞のデータを解析した。ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を遮断する二重特異性抗体のＩＣ５０値を、蛍光シグナル値に応じて算出した。結果は図３の通りである。
細胞実験中、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを実験緩衝液として使用した。安定的にトランスフェクトされＴｉｅ２を過剰発現する株ＣＨＯ－Ｔｉｅ２＃１Ｂ１１を消化して再懸濁した後、細胞を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで１回洗浄し、再懸濁し、密度を２．０×１０６細胞／ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル丸底培養プレートに５０μｌ／ウェルで、すなわち１．０×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。Ｂｉｏ－ｈｕＡＮＧ２－Ｆｃ、抗体及び陰性対照をそれぞれ２％ＦＢＳ／ＰＢＳで希釈し、等量ずつ十分に混合した。３７℃で１５分間インキュベートした後、５０μｌの抗原－抗体混合物を細胞懸濁液に加えた。混合系のｂｉｏ－ｈｕＡＮＧ２－Ｆｃの最終濃度は０．２０μｇ／ｍｌであり、試験した抗体の初期濃度を３倍段階希釈で１０ｎＭとした。この混合液を４℃で１時間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。１：１０００に希釈したＰＥ－ストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ５５４０６１）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。２％ＦＢＳ／ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加えて細胞を再懸濁した後、フローサイトメーターで検出し、１ウェルあたり１０，０００個の細胞のデータを解析した。ＡＮＧ２とＴｉｅ２の結合を遮断する二重特異性抗体のＩＣ５０値を、蛍光シグナル値に応じて算出した。結果は図３の通りである。
【0168】
結果は、抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが細胞表面のＴｉｅ２へのＡＮＧ２の結合を遮断する能力が、陽性抗体よりもそれぞれ強いことを示している。
【0169】
（試験例５．ＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化を阻害する二重特異性抗体）
ＡＮＧ２は、血管内皮細胞の表面に存在するＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２に結合し、Ｔｉｅ２細胞のチロシンキナーゼのリン酸化を誘発し、血管内皮細胞から末梢細胞を剥離させるシグナルを伝達することで、血管を不安定で増殖しやすい状態にする。この実験は、二重特異性抗体がＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化を阻害できることを確認するためのものであった。
ＡＮＧ２は、血管内皮細胞の表面に存在するＡＮＧ２受容体Ｔｉｅ２に結合し、Ｔｉｅ２細胞のチロシンキナーゼのリン酸化を誘発し、血管内皮細胞から末梢細胞を剥離させるシグナルを伝達することで、血管を不安定で増殖しやすい状態にする。この実験は、二重特異性抗体がＡＮＧ２誘導性Ｔｉｅ２リン酸化を阻害できることを確認するためのものであった。
【0170】
具体的な実験方法は以下の通りである：
安定的にトランスフェクトされｈｕＴｉｅ２を過剰発現する株ＣＨＯ－Ｔｉｅ２＃１Ｂ１１－１を消化して再懸濁した後、その密度を完全培地で２．５×１０５細胞／ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌ／ウェルで、すなわち２．５×１０４細胞／ウェルでプレーティングした。４～５時間後に培地を交換し（ＤＭＥ／Ｆ－１２、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｃａｔ＃ＳＨ３００２３．０１＋０．１％ＢＳＡ＋２０μｇ／ｍｌピューロマイシン、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃ Ａ１１１３８０３）、細胞を一晩飢餓状態にした。プレートに４．０μｇ／ｍｌの抗ｈｕＴｉｅ２キャプチャー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＤＹＣ２７２０Ｅ）を１００μｌ／ウェルで、室温で一晩かけてコーティングした。コーティング溶液を除去し、プレートを１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３ブロッキング溶液で、２５０μｌ／ウェルで、室温で２時間かけてブロッキングした。２５μｌのｈｕＡｎｇ２－Ｆｃ（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）と、３倍段階希釈した試験対象抗体２５μｌ（最大濃度５０．０ｎＭ）を等量ずつ混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、Ｎａ３ＶＯ４（１．０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ Ｓ６５０８）を加えてよく混合した。細胞を一晩培養し、培養上清５０μｌを廃棄し、調製した抗原抗体混合物５０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの洗浄液（ＰＢＳ＋２．０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）で２回洗浄し、９０μｌの溶解緩衝液（（１倍溶解緩衝液＋１０μｇ／ｍｌロイペプチンヘミ硫酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｃａｔ＃ １１６７）＋１０．０μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ ＳＲＥ００５０））を加えて、氷上で１０～１５分かけて細胞を溶解した。細胞溶解物を４０００ｇで５分間遠心分離して回収し、遮断したＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１：１０００に希釈した二次抗体抗ＰＹ－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＤＹＣ２７２０Ｅ）を加え、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢで１５～３０分発色させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。Ｖｅｒｓａ Ｍａｘマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０を読み取り、ＩＣ５０を算出した。結果（図４を参照）は、抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、ＡＮＧ２媒介性Ｔｉｅ２リン酸化を阻害する非常に強い能力を有することを示している。
安定的にトランスフェクトされｈｕＴｉｅ２を過剰発現する株ＣＨＯ－Ｔｉｅ２＃１Ｂ１１－１を消化して再懸濁した後、その密度を完全培地で２．５×１０５細胞／ｍｌに調整し、細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌ／ウェルで、すなわち２．５×１０４細胞／ウェルでプレーティングした。４～５時間後に培地を交換し（ＤＭＥ／Ｆ－１２、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｃａｔ＃ＳＨ３００２３．０１＋０．１％ＢＳＡ＋２０μｇ／ｍｌピューロマイシン、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃ Ａ１１１３８０３）、細胞を一晩飢餓状態にした。プレートに４．０μｇ／ｍｌの抗ｈｕＴｉｅ２キャプチャー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＤＹＣ２７２０Ｅ）を１００μｌ／ウェルで、室温で一晩かけてコーティングした。コーティング溶液を除去し、プレートを１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３ブロッキング溶液で、２５０μｌ／ウェルで、室温で２時間かけてブロッキングした。２５μｌのｈｕＡｎｇ２－Ｆｃ（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）と、３倍段階希釈した試験対象抗体２５μｌ（最大濃度５０．０ｎＭ）を等量ずつ混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、Ｎａ３ＶＯ４（１．０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ Ｓ６５０８）を加えてよく混合した。細胞を一晩培養し、培養上清５０μｌを廃棄し、調製した抗原抗体混合物５０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの洗浄液（ＰＢＳ＋２．０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）で２回洗浄し、９０μｌの溶解緩衝液（（１倍溶解緩衝液＋１０μｇ／ｍｌロイペプチンヘミ硫酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｃａｔ＃ １１６７）＋１０．０μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ ＳＲＥ００５０））を加えて、氷上で１０～１５分かけて細胞を溶解した。細胞溶解物を４０００ｇで５分間遠心分離して回収し、遮断したＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１：１０００に希釈した二次抗体抗ＰＹ－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＤＹＣ２７２０Ｅ）を加え、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢで１５～３０分発色させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。Ｖｅｒｓａ Ｍａｘマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４５０を読み取り、ＩＣ５０を算出した。結果（図４を参照）は、抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、ＡＮＧ２媒介性Ｔｉｅ２リン酸化を阻害する非常に強い能力を有することを示している。
【0171】
（試験例６．ＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲリン酸化を阻害する二重特異性抗体）
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞に存在するＶＥＧＦＲに結合して、ＶＥＧＦＲ細胞内のキナーゼをリン酸化し、内皮細胞の増殖を促進して新しい血管を形成することで、腫瘍細胞の増殖及び転移を促進する。この実験は、二重特異性抗体がＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲリン酸化を阻害できることを確認するためのものであった。
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞に存在するＶＥＧＦＲに結合して、ＶＥＧＦＲ細胞内のキナーゼをリン酸化し、内皮細胞の増殖を促進して新しい血管を形成することで、腫瘍細胞の増殖及び転移を促進する。この実験は、二重特異性抗体がＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲリン酸化を阻害できることを確認するためのものであった。
【0172】
具体的には：ＨＵＶＥＣ細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ／ＭＴ－Ｂｉｏ、Ｃ－１２２０５）を消化した後、その細胞密度を完全培地で１．５×１０５細胞／５００μｌに調整し、細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μｌずつ添加した。３７℃のインキュベーターで一晩培養した後、培地を廃棄した。細胞を５００μｌの氷冷ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０－２５０）で１回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含む最小培地２００μｌを各ウェルに加えて３０分間飢餓培養した。試験対象抗体を最小培地で１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．１ｎＭに希釈した（クロスマブは２０ｎＭ、２ｎＭ及び０．２ｎＭ）。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｔ＃２９３－ＶＥ）を、最小培地で４００ｎｇ／ｍｌに希釈した。希釈したＶＥＧＦと抗体を同量ずつ取り、よく混合し、２００μｌの混合液を培養プレートの対応するウェルに加え、３７℃で５分間インキュベートした。４倍溶解緩衝液＃１（ｃｉｓｂｉｏ、６３ＡＤＫ０４１ＰＥＧ）をｄｄ Ｈ２Ｏで１倍に希釈した。ブロッキング溶液を１倍溶解緩衝液で１００倍に希釈し、溶解溶液を調製した。細胞培養プレートを取り出し、その中の培地を廃棄した。５００μｌの氷冷ＰＢＳを加え、少し振ってから廃棄した。調製した溶解緩衝液５０μｌを直ちに加え、プレートをシェーカーに乗せて、室温で３０分間インキュベートした。２４００ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した。上清中のｐ－ＶＥＧＦＲの検出には、ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）キット（ｃｉｓｂｉｏ、６３ＡＤＫ０４１ＰＥＧ）を用いた。検出方法は以下の通りである：１０μｌのホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）ｄ２抗体を取り、２００μｌの検出用緩衝液を加えて作業溶液を調製した。１０μｌのホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）クリプテート抗体を取り、２００μｌの検出用緩衝液を加えて作業溶液を調製した。ｄ２抗体作業溶液とクリプテート抗体作業溶液を等量ずつ混合した。細胞溶解液１６μｌ、及びｄ２抗体とクリプテート抗体との混合液４μｌをＨＴＲＦ ９６ウェルマイクロタイタープレートに加え、封入膜でプレートを封入し、遠心分離機で１分間遠心分離した後、室温で４～２４時間、暗所でインキュベートした。波長３４０ｎｍで励起し、波長６６５ｎｍ及び６２０ｎｍで放出された蛍光値を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ多機能マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。データ処理：比率＝シグナル６６５ｎｍ／シグナル６２０ｎｍ×１００００、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を用いてヒストグラムをプロットした。結果は図５の通りである。
【0173】
結果は、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、ＶＥＧＦによって引き起こされるＨＵＶＥＣ細胞におけるリン酸化ＶＥＧＦＲレベルの上昇を有意に抑制できることを示している。
【0174】
（試験例７．ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖を阻害する二重特異性抗体）
ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣに存在するＶＥＧＦＲに結合して、ＶＥＧＦＲ細胞内のキナーゼをリン酸化し、ＨＵＶＥＣの増殖を促進する。この実験は、二重特異性抗体がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖を阻止できることを確認するために利用した。
ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣに存在するＶＥＧＦＲに結合して、ＶＥＧＦＲ細胞内のキナーゼをリン酸化し、ＨＵＶＥＣの増殖を促進する。この実験は、二重特異性抗体がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖を阻止できることを確認するために利用した。
【0175】
具体的な方法は以下の通りである：
Ｔ７５細胞フラスコにＨＵＶＥＣを５×１０４細胞／ｍｌの密度で播種し、細胞を約２～３日で対数増殖期まで増殖させた。対数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を０．０８％トリプシンにより室温で約１～２分消化し、１０％ＦＢＳを加えて消化を停止させた。消化したＨＵＶＥＣを回収し、８００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＵＶＥＣの増殖を刺激し得る培地中のサイトカインを除去した（８００ｒｐｍ／分、５分間遠心分離）。このＨＵＶＥＣ細胞を６％ＦＢＳ培地に再懸濁した。細胞の計数後、細胞を白色９６ウェル細胞培養プレートに４０００細胞／５０μｌ／ウェルで播種し、インキュベーターで２時間培養した。ＶＥＧＦを初期濃度が３００ｎｇ／ｍｌになるように調整し、滅菌した９６ウェルプレートに１２０μｌ／ウェルで添加した。試験対象抗体は、６００ｎＭの初期濃度から４倍段階希釈で段階希釈し、上記９６ウェルプレートに等量ずつ添加し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、付着したＨＵＶＥＣ細胞に、抗体と抗原の混合物を１００μｌ／ウェル添加し、インキュベーターで５日間培養した。培養が終了した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｇ７５７３、ＰＲＯＭＥＧＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１０分間、暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５細胞イメージャーのＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプログラムを用いて検出した。その結果は図６の通りである。結果は、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、ＶＥＧＦによって引き起こされるＨＵＶＥＣの増殖を有意に抑制できることを示している。
Ｔ７５細胞フラスコにＨＵＶＥＣを５×１０４細胞／ｍｌの密度で播種し、細胞を約２～３日で対数増殖期まで増殖させた。対数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を０．０８％トリプシンにより室温で約１～２分消化し、１０％ＦＢＳを加えて消化を停止させた。消化したＨＵＶＥＣを回収し、８００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＵＶＥＣの増殖を刺激し得る培地中のサイトカインを除去した（８００ｒｐｍ／分、５分間遠心分離）。このＨＵＶＥＣ細胞を６％ＦＢＳ培地に再懸濁した。細胞の計数後、細胞を白色９６ウェル細胞培養プレートに４０００細胞／５０μｌ／ウェルで播種し、インキュベーターで２時間培養した。ＶＥＧＦを初期濃度が３００ｎｇ／ｍｌになるように調整し、滅菌した９６ウェルプレートに１２０μｌ／ウェルで添加した。試験対象抗体は、６００ｎＭの初期濃度から４倍段階希釈で段階希釈し、上記９６ウェルプレートに等量ずつ添加し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、付着したＨＵＶＥＣ細胞に、抗体と抗原の混合物を１００μｌ／ウェル添加し、インキュベーターで５日間培養した。培養が終了した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｇ７５７３、ＰＲＯＭＥＧＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１０分間、暗所でインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５細胞イメージャーのＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプログラムを用いて検出した。その結果は図６の通りである。結果は、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖが、ＶＥＧＦによって引き起こされるＨＵＶＥＣの増殖を有意に抑制できることを示している。
【0176】
（Ｉｎ ｖｉｖｏ活性の生物学的評価）
（試験例８．ＣＯＬＯ２０５腫瘍を移植されたヌードマウスにおける二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性）
この実験では、ヒト結腸がん細胞ＣＯＬＯ２０５を移植されたヌードマウスに腹腔内注射した後のＡＮＧ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体及び対照抗体アバスチンの有効性を評価した。
（試験例８．ＣＯＬＯ２０５腫瘍を移植されたヌードマウスにおける二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性）
この実験では、ヒト結腸がん細胞ＣＯＬＯ２０５を移植されたヌードマウスに腹腔内注射した後のＡＮＧ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体及び対照抗体アバスチンの有効性を評価した。
【0177】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ＳＰＦ、１６～１８ｇ、♀）を、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社から購入した。Ｃｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２２（商標））を１００匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右肋骨に３×１０６細胞／マウス／１００μｌで皮下接種した。担がんマウスの腫瘍体積が約１２０ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為に４グループに分けた：すなわち、ビヒクル（ＰＢＳ）グループ、アバスチン３ｍｐｋグループ、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ ３．５ｍｐｋグループ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖ ３．５ｍｐｋグループ（それぞれ８匹ずつ）。グルーピングの日を実験の０日目とした。各抗体の腹腔内投与は、グルーピングの日に開始し、週２回続けて、合計８回投与した。腫瘍の体積及び動物の体重を週２回モニターし、データを記録した。腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えたとき、又はほとんどの腫瘍が破裂したとき、又は体重が２０％減少したとき、実験のエンドポイントとして、担がん動物を安楽死させた。全てのデータは、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いてプロットし、統計的に分析した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は以下の通りである：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂはそれぞれ縦及び幅を表す）。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００（式中、Ｔ及びＣは実験終了時の治療グループ及びＰＢＳ対照グループの腫瘍体積を表す；Ｔ０及びＣ０は実験開始時の腫瘍体積を表す）。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００（式中、Ｔ及びＣは実験終了時の治療グループ及びＰＢＳ対照グループの腫瘍体積を表す；Ｔ０及びＣ０は実験開始時の腫瘍体積を表す）。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0178】
【0179】
本開示の候補二重特異性抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖの実験結果は、以下のことを示している：ビヒクルグループと比較して、ＶＥＧＦモノクローナル抗体アバスチン及び各試験抗体を含む本実験の全ての抗体が、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下移植されたＣｏｌｏ２０５腫瘍の増殖を抑制することができ、投与を終了した２７日目には、いずれもビヒクルグループと比較して非常に有意な差を示している（表１２及び図７）。腫瘍増殖抑制率に関して、投与プロセス全体を通じて、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖは、ＶＥＧＦモノクローナル抗体アバスチン－ｈＩｇＧ１よりも常に高い腫瘍増殖抑制率を示し、６回投与後、投与終了時まで、腫瘍体積のアバスチングループとの統計的差異を示している（投与終了時、ｐ＝０．００８１）。
【0180】
（試験例９．転移性の高い非小細胞肺がんＨ４６０－Ｌｕｃ細胞株を皮下移植したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルにおける二重特異性抗体の有効性）
この実験では、腹腔内注射後のＡＮＧ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体及び対照抗体のアバスチン、ラニビズマブ－ｈＩｇＧ１及びクロスマブが、ヒト非小細胞肺がんＨ４６０移植腫瘍の増殖及び転移を抑制する効果を評価した。
この実験では、腹腔内注射後のＡＮＧ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体及び対照抗体のアバスチン、ラニビズマブ－ｈＩｇＧ１及びクロスマブが、ヒト非小細胞肺がんＨ４６０移植腫瘍の増殖及び転移を抑制する効果を評価した。
【0181】
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、４～５週、１８～２０ｇ）を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈ株式会社から購入した。ヒト非小細胞肺がんＨ４６０－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子で安定的にトランスフェクトしたもの）を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター内で培養した。この細胞を５世代連続培養し、マウスの皮下に接種した。接種前にマウスを３～４％イソフルランで麻酔した。約１×１０６個のＨ４６０細胞を無血清培地及びマトリゲルを含む懸濁液（培地：マトリゲル＝５０％：５０％）に再懸濁し、２００μＬの接種量で１００匹のマウスに皮下注射で接種した。腫瘍が平均約１００～１５０ｍｍ３に成長した時点で、適切な腫瘍サイズのマウス７２匹を、腫瘍サイズ及び体重に応じて無作為に８グループに分け、各グループにマウス８匹とした。グルーピング及び投与日を０日目とした。グルーピング及び投与計画は、表１３の通りである。
【表14】
【0182】
グルーピング後、週２回、３週間連続で腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（Ｖ）の算出方法は以下の通りである：
Ｖ＝（縦×横２）／２。
Ｖ＝（縦×横２）／２。
【0183】
各マウスの相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の算出方法は以下の通りである：
ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（式中、Ｖｔは毎日測定した体積であり、Ｖ０は治療開始時の体積である）。
ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（式中、Ｖｔは毎日測定した体積であり、Ｖ０は治療開始時の体積である）。
【0184】
実験終了時には、全ての担がん動物の写真を撮り、全ての腫瘍を取り出し、重量を測定し、写真を撮った。
【0185】
（統計解析）
結果を平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。２グループ間の比較はダネットの多重比較検定によって試験した。ｐ＜０．０５の場合、その差は統計的に有意であると見なした。
結果を平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。２グループ間の比較はダネットの多重比較検定によって試験した。ｐ＜０．０５の場合、その差は統計的に有意であると見なした。
【0186】
（肝転移及び肺転移の検出法）
Ｈ４６０細胞株にはルシフェラーゼ標識が含まれていたため、マウスを安楽死させた後、各グループのマウスの肝臓を解剖し、蛍光イメージングにより肝転移病変を収集し、蛍光シグナルの強度により転移の程度を算出した。
Ｈ４６０細胞株にはルシフェラーゼ標識が含まれていたため、マウスを安楽死させた後、各グループのマウスの肝臓を解剖し、蛍光イメージングにより肝転移病変を収集し、蛍光シグナルの強度により転移の程度を算出した。
【0187】
【0188】
図８Ａは、本候補分子ｈｕ１５．Ｅ－Ｖが、Ｈ４６０腫瘍の成長を有意に抑制できることを示している。また、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖは、用量依存的効果を示す。３．５ｍｐｋ ｈｕ１５．Ｅ－Ｖは、同一モルの３ｍｐｋアバスチン及びラニビズマブ－ｈＩｇＧ１と比較して、腫瘍増殖を抑制する効果が強く、腫瘍増殖抑制率に統計的差異がある。図８Ｂは、同一モルのアバスチン及びラニビズマブ－ｈＩｇＧ１の両方でより重度の肝転移及び肺転移が見られるのに対し、二重特異性抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖは腫瘍の肝転移及び肺転移を有意に抑制することができ、本グループのどのマウスにも転移が検出されなかったことを示している。
【0189】
（試験例１０．ヒト皮膚がん細胞及び前立腺がん細胞を皮下移植したマウスモデルに対する二重特異性抗体の有効性）
２×１０６細胞／マウス／１００μｌのＡ４３１細胞又は５×１０６のＰＣ－３細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右肋骨に皮下接種した。担がんマウスの腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為にそれぞれ３グループに分けた：ビヒクル（ＰＢＳ）、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ ３．５ｍｐｋ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖ ３．５ｍｐｋ（各グループに８匹ずつ）。グルーピングの日を０日目とした。各抗体は、グルーピングの日に腹腔内注射を開始し、週２回、合計６回投与した。腫瘍体積及び動物の体重を週に２回モニターし、データを記録した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたとき、又はほとんどの腫瘍が破裂したとき、又は体重が２０％減少したとき、実験のエンドポイントとして、担がん動物を安楽死させた。全てのデータは、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いてプロットし、統計的に分析した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は以下の通りである：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂはそれぞれ縦及び幅を表す）。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００（式中、Ｔ及びＣは実験終了時の治療グループ及び対照グループの腫瘍体積を表す；Ｔ０及びＣ０は実験開始時の腫瘍体積を表す）。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
２×１０６細胞／マウス／１００μｌのＡ４３１細胞又は５×１０６のＰＣ－３細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右肋骨に皮下接種した。担がんマウスの腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為にそれぞれ３グループに分けた：ビヒクル（ＰＢＳ）、ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ ３．５ｍｐｋ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖ ３．５ｍｐｋ（各グループに８匹ずつ）。グルーピングの日を０日目とした。各抗体は、グルーピングの日に腹腔内注射を開始し、週２回、合計６回投与した。腫瘍体積及び動物の体重を週に２回モニターし、データを記録した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えたとき、又はほとんどの腫瘍が破裂したとき、又は体重が２０％減少したとき、実験のエンドポイントとして、担がん動物を安楽死させた。全てのデータは、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いてプロットし、統計的に分析した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は以下の通りである：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂはそれぞれ縦及び幅を表す）。
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００（式中、Ｔ及びＣは実験終了時の治療グループ及び対照グループの腫瘍体積を表す；Ｔ０及びＣ０は実験開始時の腫瘍体積を表す）。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
【0190】
【0191】
その結果は表１４並びに図９Ａ及び図９Ｂに示しており、これらは本開示における二重特異性抗体ｈｕ１５．Ｅ－Ｖ及びｈｕ１４．２Ｂ－Ｖの両方が、Ａ４３１腫瘍及びＰＣ－３腫瘍の増殖を有意に抑制できることを示している。
【0192】
（試験例１１．アカゲザルにおけるレーザー誘起脈絡膜血管新生に対する二重特異性抗体の抑制機能の試験）
本試験例は、アカゲザルにおけるレーザー誘起脈絡膜血管新生の漏出及び成長に対する眼球硝子体内注射投与の効果を通じて、本願の二重特異性抗体が硝子体内注射による加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの疾患の治療に使用され得ることを検証するものである。具体的な方法は以下の通りである：
アカゲザルの眼底の黄斑中心窩周辺にレーザー光凝固術を行い、眼底に脈絡膜血管新生を誘発することで、ヒトの脈絡膜血管新生に類似した動物モデルを構築した。光凝固前及び光凝固後２０日目にフルオレセイン眼底血管造影を行い、モデリングの状況を確認した。１６匹のアカゲザルの成功モデル（Ｓｉｃｈｕａｎ Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社、生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｓｉｃｈｕａｎ）２０１４－０１３、実験動物品質証明書番号：Ｎｏ：００２２２０２）を選択し、無作為に溶媒対照グループ、ラニビズマブ（９６μｇ、４μＭ）グループ、ＲＧ７７１６（２９２μｇ、２μＭ）グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１（１７０μｇ、１μＭ）グループの合計４グループに分け、各グループにサル４匹とした。
本試験例は、アカゲザルにおけるレーザー誘起脈絡膜血管新生の漏出及び成長に対する眼球硝子体内注射投与の効果を通じて、本願の二重特異性抗体が硝子体内注射による加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの疾患の治療に使用され得ることを検証するものである。具体的な方法は以下の通りである：
アカゲザルの眼底の黄斑中心窩周辺にレーザー光凝固術を行い、眼底に脈絡膜血管新生を誘発することで、ヒトの脈絡膜血管新生に類似した動物モデルを構築した。光凝固前及び光凝固後２０日目にフルオレセイン眼底血管造影を行い、モデリングの状況を確認した。１６匹のアカゲザルの成功モデル（Ｓｉｃｈｕａｎ Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社、生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｓｉｃｈｕａｎ）２０１４－０１３、実験動物品質証明書番号：Ｎｏ：００２２２０２）を選択し、無作為に溶媒対照グループ、ラニビズマブ（９６μｇ、４μＭ）グループ、ＲＧ７７１６（２９２μｇ、２μＭ）グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１（１７０μｇ、１μＭ）グループの合計４グループに分け、各グループにサル４匹とした。
【0193】
光凝固から２１日後、ラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６ ２９２グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループに、それぞれ９６μｇ、２９２μｇ及び１７０μｇ／眼球を基準に、ラニビズマブを１．９２ｍｇ／ｍＬ、ＲＧ７７１６を５．８４ｍｇ／ｍＬ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１を３．４ｍｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ、両眼に硝子体内注射した。溶媒対照グループには等量の溶媒を投与した。各グループの動物について、投与後７、１４及び２８日目に、眼圧検査、眼底カラー写真、フルオレセイン眼底血管造影及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により、抗体による脈絡膜血管新生の抑制を観察した。投与後２８日目に、１００～２００μＬの房水を収集し、そのうちの１００μＬを房水中のＶＥＧＦの測定に使用した。投与後２９日目に安楽死させた後、各グループから３つの眼球を採取し、ＨＥ染色による組織学的検査を行った。その結果は以下の通りである：
【0194】
（ＡＭＤモデリング）
レーザーモデリングから２０日後、実験に含まれた１６匹のサルにおいて、両眼の黄斑部周辺に９個のレーザースポットを眼底のカラー写真で確認した。全ての動物において、眼底の黄斑部周辺に蛍光性の高いレーザースポットが存在し、蛍光スポットの縁を超える明らかなフルオレセインの漏出が見られる。レーザーモデリングから２０日後（投与前）、ビヒクル対照グループ、ラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループのレベル４蛍光スポットの数は、それぞれ４６、４２、４０及び４０であった。上記の変化は、臨床的な脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の変化と類似しており、モデリングが成功したことを示唆している。
レーザーモデリングから２０日後、実験に含まれた１６匹のサルにおいて、両眼の黄斑部周辺に９個のレーザースポットを眼底のカラー写真で確認した。全ての動物において、眼底の黄斑部周辺に蛍光性の高いレーザースポットが存在し、蛍光スポットの縁を超える明らかなフルオレセインの漏出が見られる。レーザーモデリングから２０日後（投与前）、ビヒクル対照グループ、ラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループのレベル４蛍光スポットの数は、それぞれ４６、４２、４０及び４０であった。上記の変化は、臨床的な脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の変化と類似しており、モデリングが成功したことを示唆している。
【0195】
（フルオログラフィー検査）
ラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループでは、投与後７、１４及び２８日目に蛍光スポットの面積がある程度減少した。各グループの蛍光漏出面積の改善率及び蛍光漏出面積の減少量は、いずれも溶媒対照グループよりも優れており、各グループのレベル４蛍光スポットの数は溶媒対照グループよりも有意に少ない。１μＭの用量のｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループ、４μＭの用量のラニビズマブグループ及び２μＭの用量のＲＧ７７１６グループでは、各時点での蛍光漏出面積の改善率は同等であった。その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。
ラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループでは、投与後７、１４及び２８日目に蛍光スポットの面積がある程度減少した。各グループの蛍光漏出面積の改善率及び蛍光漏出面積の減少量は、いずれも溶媒対照グループよりも優れており、各グループのレベル４蛍光スポットの数は溶媒対照グループよりも有意に少ない。１μＭの用量のｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループ、４μＭの用量のラニビズマブグループ及び２μＭの用量のＲＧ７７１６グループでは、各時点での蛍光漏出面積の改善率は同等であった。その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。
【0196】
（房水のＶＥＧＦ）
投与後２８日目のラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６ ２９２グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１ １７０グループの房水中のＶＥＧＦ発現量は、溶媒対照グループよりも有意に低い。ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループの両方の房水中のＶＥＧＦ発現量は、ラニビズマブグループよりも有意に低い。その結果を図１１に示す。
投与後２８日目のラニビズマブグループ、ＲＧ７７１６ ２９２グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１ １７０グループの房水中のＶＥＧＦ発現量は、溶媒対照グループよりも有意に低い。ＲＧ７７１６グループ及びｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１グループの両方の房水中のＶＥＧＦ発現量は、ラニビズマブグループよりも有意に低い。その結果を図１１に示す。
【0197】
要約すると、１７０μｇ／眼球の用量のｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１は、本実験の条件下のサルのＣＮＶに対して、すなわち、１７０μｇ／眼球の用量のｈｕ１５．Ｅ－Ｖ１を両眼に単回硝子体内注射で投与し、網膜蛍光血管造影法、光干渉断層撮影並びに房水ＶＥＧＦ及び眼球組織病理学検査で検査したレーザーＣＮＶアカゲザルモデルに対して、有意な抑制効果がある。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】