特表 2022-526595 ＰＳＭＡに結合する重鎖抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-25

(54)【発明の名称】ＰＳＭＡに結合する重鎖抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220518BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20220518BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220518BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220518BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220518BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220518BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220518BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220518BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220518BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/40 ZNA

C07K16/46

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61P43/00 111

A61P35/00

A61K35/17 Z

A61K39/395 L

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021559093

(86)(22)【出願日】2020-04-03

(85)【翻訳文提出日】2021-11-30

(86)【国際出願番号】 US2020026686

(87)【国際公開番号】W WO2020206330

(87)【国際公開日】2020-10-08

(31)【優先権主張番号】62/830,130

(32)【優先日】2019-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518452881

【氏名又は名称】テネオバイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン ショーテン， ウィム

(72)【発明者】

【氏名】クラーク， スターリン

(72)【発明者】

【氏名】ダン， ケビン

(72)【発明者】

【氏名】ビューロウ， ベン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB36

4C085CC23

4C085DD21

4C085DD31

4C085DD88

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC41

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＰＳＭＡ重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））を、そのような抗体の作製方法、そのような抗体を含む、医薬組成物を含む組成物、及びＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を治療するためのそれらの使用とともに開示する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
（ａ）配列番号１～１０のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または
（ｂ）配列番号１１～１７のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）配列番号１８～２３のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む、
第１の重鎖可変領域を含む、前記抗体。

【請求項2】

（ａ）配列番号１～１０のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または
（ｂ）配列番号１１～１７のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）配列番号１８～２３のアミノ酸配列のいずれかに２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む、
第２の重鎖可変領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、ヒトフレームワークに存在する、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項4】

重鎖定常領域配列をさらに含み、ＣＨ１配列を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

前記第１の重鎖可変領域が：
（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または
（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

前記第２の重鎖可変領域が：
（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または
（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、
請求項２～５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び
（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び
（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、
請求項５～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

前記第２の重鎖可変領域が：
（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び
（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び
（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、
請求項５～７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

（ａ）配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列、または
（ｂ）配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

配列番号２４～５８の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

配列番号２４～５８からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

前記重鎖可変領域配列が、配列番号２５及び配列番号３８からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。

【請求項13】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
（ａ）次式のＣＤＲ１配列であって：
ＧＧＳＩＳＳＸ_１Ｘ_２ＹＸ_３（配列番号６７）
式中、Ｘ_１が、ＳまたはＮであり、
Ｘ_２が、ＳまたはＮであり、及び
Ｘ_３が、ＹまたはＦである、前記ＣＤＲ１配列、ならびに
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列であって：
Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＳＧＸ_７Ｔ（配列番号６８）
式中、Ｘ_４が、ＩまたはＶであり、
Ｘ_５が、ＤまたはＹであり、
Ｘ_６が、ＹまたはＤであり、及び
Ｘ_７が、ＹまたはＳである、前記ＣＤＲ２配列、ならびに
（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＨＫＡＡＴＡＤＦＤＹ（配列番号６９）を含む、
第１の重鎖可変領域を一価または二価の形式で含む、前記抗体。

【請求項14】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
（ａ）次式のＣＤＲ１配列であって：
ＧＦＸ_１ＦＸ_２Ｘ_３ＹＧ（配列番号７０）
式中、Ｘ_１が、ＳまたはＩまたはＴであり、
Ｘ_２が、ＳまたはＴまたはＲまたはＩであり、及び
Ｘ_３が、ＲまたはＳである、前記ＣＤＲ１配列、ならびに
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列であって：
ＩＸ_４ＹＤＧＳＮＸ_５（配列番号７１）
式中、Ｘ_４が、ＷまたはＳであり、及び
Ｘ_５が、ＲまたはＫである、前記ＣＤＲ２配列、ならびに
（ｃ）次式のＣＤＲ３配列であって：
ＡＲＥＰＲＸ_６ＧＹＹＹＸ_７Ｘ_８ＳＧＹＸ_９ＳＬＤＹ（配列番号７２）
式中、Ｘ_６が、ＩまたはＶであり、
Ｘ_７が、ＥまたはＤであり、
Ｘ_８が、ＳまたはＴであり、及び
Ｘ_９が、ＹまたはＤである、前記ＣＤＲ３配列を含む、
第１の重鎖可変領域を一価または二価の形式で含む、前記抗体。

【請求項15】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
（ａ）次式のＣＤＲ１配列であって：
ＧＧＳＩＳＳＸ_１Ｘ_２ＹＸ_３（配列番号６７）
式中、Ｘ_１が、ＳまたはＮであり、
Ｘ_２が、ＳまたはＮであり、及び
Ｘ_３が、ＹまたはＦである、前記ＣＤＲ１配列、ならびに
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列であって：
Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＳＧＸ_７Ｔ（配列番号６８）
式中、Ｘ_４が、ＩまたはＶであり、
Ｘ_５が、ＤまたはＹであり、
Ｘ_６が、ＹまたはＤであり、及び
Ｘ_７が、ＹまたはＳである、前記ＣＤＲ２配列、ならびに
（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＨＫＡＡＴＡＤＦＤＹ（配列番号６９）を含む、
第１の重鎖可変領域、ならびに
（ａ）次式のＣＤＲ１配列であって：
ＧＦＸ_１ＦＸ_２Ｘ_３ＹＧ（配列番号７０）
式中、Ｘ_１が、ＳまたはＩまたはＴであり、
Ｘ_２が、ＳまたはＴまたはＲまたはＩであり、及び
Ｘ_３が、ＲまたはＳである、前記ＣＤＲ１配列、ならびに
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列であって：
ＩＸ_４ＹＤＧＳＮＸ_５（配列番号７１）
式中、Ｘ_４が、ＷまたはＳであり、及び
Ｘ_５が、ＲまたはＫである、前記ＣＤＲ２配列、ならびに
（ｃ）次式のＣＤＲ３配列であって：
ＡＲＥＰＲＸ_６ＧＹＹＹＸ_７Ｘ_８ＳＧＹＸ_９ＳＬＤＹ（配列番号７２）
式中、Ｘ_６が、ＩまたはＶであり、
Ｘ_７が、ＥまたはＤであり、
Ｘ_８が、ＳまたはＴであり、及び
Ｘ_９が、ＹまたはＤである、前記ＣＤＲ３配列を含む、
第２の重鎖可変領域を含む、前記抗体。

【請求項16】

前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域に比べて、Ｎ末端のより近位に位置する、請求項１５に記載の抗体。

【請求項17】

前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する、請求項１５に記載の抗体。

【請求項18】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって、ヒトＶＨフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ配列が、配列番号１～２３からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列を含む、前記抗体。

【請求項19】

ヒトＶＨフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ配列が、配列番号１～２３からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗体。

【請求項20】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む、前記抗体。

【請求項21】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を一価または二価の構成で含む、前記抗体。

【請求項22】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む、前記抗体。

【請求項23】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を一価または二価の構成で含む、前記抗体。

【請求項24】

ＰＳＭＡに結合する抗体であって：
配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、第１の重鎖可変領域、ならびに
配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、第２の重鎖可変領域を、
ヒトＶＨフレームワークにおいて含む、前記抗体。

【請求項25】

前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域に比べて、Ｎ末端のより近位に位置する、請求項２４に記載の抗体。

【請求項26】

前記第１の重鎖可変領域が、前記第２の重鎖可変領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する、請求項２４に記載の抗体。

【請求項27】

単一特異性である、請求項１～１４及び１８～２３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項28】

多重特異性である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項29】

二重特異性である、請求項２８に記載の抗体。

【請求項30】

ＣＤ３タンパク質及びＰＳＭＡタンパク質に結合親和性を有する、請求項２８または２９に記載の抗体。

【請求項31】

同じＰＳＭＡタンパク質上の２つの異なるエピトープに結合親和性を有する、請求項２８または２９に記載の抗体。

【請求項32】

エフェクター細胞への結合親和性を有する、請求項２８または２９に記載の抗体。

【請求項33】

Ｔ細胞抗原に結合親和性を有する、請求項３２に記載の抗体。

【請求項34】

ＣＤ３に結合親和性を有する、請求項３３に記載の抗体。

【請求項35】

ＣＡＲ－Ｔ形式である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項36】

二重特異性抗体であって：
（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、
（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域、ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメイン、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項37】

二重特異性抗体であって：
（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、
（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域、ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を一価または二価の構成で含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメイン、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項38】

二重特異性抗体であって：
（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、
（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域、ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメイン、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項39】

二重特異性抗体であって：
（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、
（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域、ならびに
（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を一価または二価の構成で含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメイン、
を含む、前記二重特異性抗体。

【請求項40】

多重特異性抗体であって：
（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、
（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域、ならびに
（ｉｉｉ）第１及び第２の抗原結合領域を二価の構成で含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインであって、
前記第１の抗原結合領域が、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含み、ならびに
前記第２の抗原結合領域が、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、前記結合ドメイン、
を含む、前記多重特異性抗体。

【請求項41】

前記第１の抗原結合領域が、前記第２の抗原結合領域に比べて、Ｎ末端のより近位に位置する、請求項４０に記載の多重特異性抗体。

【請求項42】

前記第１の抗原結合領域が、前記第２の抗原結合領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する、請求項４０に記載の多重特異性抗体。

【請求項43】

前記抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の前記抗原結合ドメインの前記第一及び第二の抗原結合領域が、ポリペプチドリンカーによって接続されている、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体または二重特異性抗体。

【請求項44】

前記ポリペプチドリンカーがＧＳリンカーである、請求項４３に記載の多重特異性抗体または二重特異性抗体。

【請求項45】

前記ＧＳリンカーが、配列番号７３または配列番号７４の配列からなる、請求項４４に記載の多重特異性抗体または二重特異性抗体。

【請求項46】

前記抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の前記抗原結合ドメインがモノパラトピックであり、バイパラトピック抗原結合ドメインに比べてより少ないサイトカイン産生を誘導する、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項47】

前記抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の前記抗原結合ドメインがモノパラトピックであり、バイパラトピック抗原結合ドメインと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞をより多く増殖させる、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項48】

前記抗体がバイパラトピックであり、モノパラトピック抗ＰＳＭＡ抗体と比較して、ＰＳＭＡに対してより高い親和性を有する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項49】

前記抗体がバイパラトピックであり、モノパラトピック抗ＰＳＭＡ抗体と比較して、ＰＳＭＡに対してより高いエフェクター機能を有する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項50】

請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。

【請求項51】

ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害の治療方法であって、前記障害を有する対象に、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体、または請求項５０に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記治療方法。

【請求項52】

ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を治療するための薬剤の調製における、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体の使用。

【請求項53】

ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害の治療に使用するための、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項54】

前記障害が前立腺癌である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体。

【請求項55】

請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項56】

請求項５５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項57】

請求項５６に記載のベクターを含む細胞。

【請求項58】

請求項５７に記載の細胞を、前記抗体の発現を許容する条件下で増殖させ、前記細胞から前記抗体を単離することを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体の産生方法。

【請求項59】

ＵｎｉＲａｔ動物をＰＳＭＡタンパク質で免疫し、ＰＳＭＡ結合抗体配列を同定することを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。

【請求項60】

有効用量の請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体、または請求項５０に記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与することを含む、治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８３０，１３０号の出願日の優先権を主張し、その出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、ＰＳＭＡに結合するヒト重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））に関する。本発明はさらに、そのような抗体の作製方法、そのような抗体を含む医薬組成物などの組成物、及びＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を治療するためのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

ＰＳＭＡ
ＰＳＭＡは、前立腺特異的膜抗原及びグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０４６０９）とも呼ばれ、Ｎ－アセチル化－α結合－酸性ジペプチダーゼ、葉酸ヒドロラーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼ活性を有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。これは、ヒトのＦＯＬＨ１遺伝子によってコードされており、１９アミノ酸の細胞質ドメイン、２４アミノ酸の膜貫通部分、及び７０７アミノ酸の細胞外部分からなる。このタンパク質は、非共有結合ホモダイマーとして酵素的に活性である。ＰＳＭＡは、前立腺上皮組織に発現し、前立腺癌及び固形腫瘍の新生血管系で上方制御される。また、脳、腎臓、唾液腺などの健康な組織でも低レベルで発現するが、悪性前立腺組織での過剰発現は、前立腺癌の治療的処置の魅力的な標的となる。また、悪性新生血管系での発現が高いことから、固形腫瘍の治療または画像診断にも適し得る。ＰＳＭＡを標的とするモノクローナル抗体、抗体薬物複合体、及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞は、転移性前立腺癌の治療に関して記載されている（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｈｏｙｏｓ ｅｔ ａｌ ２０１６，ＰＭＩＤ：２７４０６９８５、ＤｉＰｉｐｐｏ ｅｔ ａｌ ２０１４，ＰＭＩＤ：２５３２７９８６、Ｓｅｒｇａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ ２０１６，ＰＭＩＤ：２８３４５０２３）。さらに、ＰＳＭＡに特異的な放射性核種複合体が、前立腺癌の画像化及び治療のために調査されているところである（例えば、Ｈｏｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８ ＰＭＩＤ：２９７５２１８０）。

【0004】

重鎖抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖の会合は、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に部分的に起因している。重鎖フレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域にも、重鎖と軽鎖の間のこの疎水性相互作用に寄与する追加の残基が存在する。

【0005】

しかしながら、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマを含むＴｙｌｏｐｏｄａ亜目）の血清には、対になったＨ鎖のみからなる主要なタイプの抗体（重鎖のみ抗体またはＵｎｉＡｂｓ（商標））が含まれていることが知られている。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ、Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、Ｌａｍａ ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ ｇｕａｎａｃｏ、Ｌａｍａ ａｌｐａｃａ及びＬａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ）のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域及び２個の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる固有の構造を有し、これら定常ドメインは、古典的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと高度に相同性がある。これらＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ゲノム中に存在するが、ｍＲＮＡプロセシング中にスプライシング除去される定常領域（ＣＨ１）の第１のドメインを欠損している。ＣＨ１ドメインがないということが、ＵｎｉＡｂｓ（商標）に軽鎖がないことを説明しており、なぜなら、このドメインが軽鎖の定常ドメインの固定場所であるからである。そのようなＵｎｉＡｂｓ（商標）は、従来の抗体またはその断片に由来する３つのＣＤＲによって、その抗原結合特異性及び高親和性を付与するように自然進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７－３０２、Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１－１２４）。サメなどの軟骨魚も、ＩｇＮＡＲと呼ばれる独特のタイプの免疫グロブリンを進化させており、これは、軽鎖ポリペプチドを欠損し、完全に重鎖からなる。ＩｇＮＡＲ分子を、分子工学によって操作し、単一の重鎖ポリペプチド（ｖＮＡＲ）の可変ドメインを生成することができる（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）、Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）、Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0006】

軽鎖を欠く重鎖のみの抗体が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立された（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５－４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体と比較して抗原結合活性の８０％を保持していた。Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１－７９０は、再構成したマウスμ遺伝子由来のＣＨ１ドメインを除去することにより、哺乳類細胞培養物中において、軽鎖を欠損した重鎖のみの抗体が産生されることを示した。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性を保持するとともに、エフェクター機能を有していた。

【0007】

免疫化によって、高い特異性と親和性を備えた重鎖抗体を、様々な抗原に対して生成することができ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ． １４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は、容易に酵母中でクローニングし、発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントに比べて有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。

【0008】

λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖遺伝子座及び／またはλ及びκ（カッパ）Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされているマウス、ならびにそのようなマウスによって産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号及び第８，３６７，８８８号に記載されている。マウス及びラットにおける重鎖のみの抗体の組換え産生は、例えば、ＷＯ２００６００８５４８、米国出願公開第２０１００１２２３５８号、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３－１０１、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７－９０、及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１－３２８３に報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの作製は、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。可溶性重鎖のみ抗体及びそのような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を有するトランスジェニック齧歯動物は、米国特許第８，８８３，１５０号及び第９，３６５，６５５号に記載されている。結合（ターゲティング）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ－Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６に記載されている。

【発明の概要】

【0009】

本発明の態様は、限定されないが、ＵｎｉＡｂｓ（商標）などの、ＰＳＭＡへの結合親和性を有する重鎖抗体に関する。本発明のさらなる態様は、そのような抗体の作製方法、そのような抗体を含む組成物、及びＰＳＭＡの発現を特徴とする障害の治療におけるそれらの使用に関する。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、（ａ）配列番号１～１０のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または（ｂ）配列番号１１～１７のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または（ｃ）配列番号１８～２３のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む第１の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体はさらに、（ａ）配列番号１～１０のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ１、及び／または（ｂ）配列番号１１～１７のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ２、及び／または（ｃ）配列番号１８～２３のアミノ酸配列のいずれかにおいて２つ以下の置換を有するＣＤＲ３を含む第２の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、ヒトのフレームワークに存在する。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖定常領域配列をさらに含み、ＣＨ１配列を含まない。

【0011】

いくつかの実施形態では、抗体の第１の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、抗体はさらに、（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１～１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び（ｂ）配列番号１１～１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び（ｃ）配列番号１８～２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列、または（ｂ）配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４～５８の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４～５８からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２５及び配列番号３８からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、（ａ）次式のＣＤＲ１配列：
ＧＧＳＩＳＳＸ_１Ｘ_２ＹＸ_３（配列番号６７）
（式中、Ｘ_１はＳまたはＮであり、Ｘ_２はＳまたはＮであり、Ｘ_３はＹまたはＦである）、及び（ｂ）次式のＣＤＲ２配列：
Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＳＧＸ_７Ｔ（配列番号６８）
（式中、Ｘ_４は、ＩまたはＶであり、Ｘ_５は、ＤまたはＹであり、Ｘ_６は、ＹまたはＤであり、Ｘ_７は、ＹまたはＳである）、及び（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＨＫＡＡＴＡＤＦＤＹ（配列番号６９）を含む、第１の重鎖可変領域を、一価または二価の形式で含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、（ａ）次式のＣＤＲ１配列：
ＧＦＸ_１ＦＸ_２Ｘ_３ＹＧ（配列番号７０）
（式中、Ｘ_１は、ＳまたはＩまたはＴであり、Ｘ_２は、ＳまたはＴまたはＲまたはＩであり、Ｘ_３は、ＲまたはＳである）、及び（ｂ）次式のＣＤＲ２配列：
ＩＸ_４ＹＤＧＳＮＸ_５（配列番号７１）
（式中、Ｘ_４は、ＷまたはＳであり、Ｘ_５は、ＲまたはＫである）、及び（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＥＰＲＸ_６ＧＹＹＹＸ_７Ｘ_８ＳＧＹＸ_９ＳＬＤＹ（配列番号７２）
（式中、Ｘ_６は、ＩまたはＶであり、Ｘ_７は、ＥまたはＤであり、Ｘ_８は、ＳまたはＴであり、Ｘ_９は、ＹまたはＤである）を含む第１の重鎖可変領域を、一価または二価の形式で含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、（ａ）次式のＣＤＲ１配列：
ＧＧＳＩＳＳＸ_１Ｘ_２ＹＸ_３（配列番号６７）
（式中、Ｘ_１は、ＳまたはＮであり、Ｘ_２は、ＳまたはＮであり、Ｘ_３は、ＹまたはＦである）、及び（ｂ）次式のＣＤＲ２配列：
Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＳＧＸ_７Ｔ（配列番号６８）
（式中、Ｘ_４は、ＩまたはＶであり、Ｘ_５は、ＤまたはＹであり、Ｘ_６は、ＹまたはＤであり、Ｘ_７は、ＹまたはＳである）、及び（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＨＫＡＡＴＡＤＦＤＹ（配列番号６９）を含む第１の重鎖可変領域、ならびに（ａ）次式のＣＤＲ１配列：
ＧＦＸ_１ＦＸ_２Ｘ_３ＹＧ（配列番号７０）
（式中、Ｘ_１は、ＳまたはＩまたはＴであり、Ｘ_２は、ＳまたはＴまたはＲまたはＩであり、Ｘ_３は、ＲまたはＳである）、及び（ｂ）次式のＣＤＲ２配列：
ＩＸ_４ＹＤＧＳＮＸ_５（配列番号７１）
（式中、Ｘ_４は、ＷまたはＳであり、Ｘ_５は、ＲまたはＫである）、及び（ｃ）次式のＣＤＲ３配列：
ＡＲＥＰＲＸ_６ＧＹＹＹＸ_７Ｘ_８ＳＧＹＸ_９ＳＬＤＹ（配列番号７２）
（式中、Ｘ_６は、ＩまたはＶであり、Ｘ_７は、ＥまたはＤであり、Ｘ_８は、ＳまたはＴであり、Ｘ_９は、ＹまたはＤである）を含む第２の重鎖可変領域を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、抗体は、第１及び第２の重鎖可変領域を含み、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域に比べて、Ｎ末端のより近位に位置する。いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１～２３からなる群から選択されるＣＤＲ配列において２つ以下の置換を有する配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１～２３からなる群から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を、一価または二価の構成で含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を、一価または二価の形式で含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに結合する抗体は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域、ならびに配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、第２の重鎖可変領域に比べてＮ末端のより近位に位置する第１の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗体は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は多重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３タンパク質及びＰＳＭＡタンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、同じＰＳＭＡタンパク質上の２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター細胞に対して結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞抗原に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＡＲ－Ｔ形式である。

【0027】

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を含む。

【0028】

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を、一価または二価の構成で含む。

【0029】

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を含む。

【0030】

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を、一価または二価の構成で含む。

【0031】

本発明の態様は、（ｉ）ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３への結合親和性を有する重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を含み、抗原結合ドメインは、二価の構成で、第１及び第２の抗原結合領域を含み、第１の抗原結合領域は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合領域は、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、第１の抗原結合領域は、第２の抗原結合領域に比べて、Ｎ末端のより近位に位置する。特定の他の実施形態では、第１の抗原結合領域は、第２の抗原結合領域に比べて、Ｃ末端のより近位に位置する。

【0032】

本発明の態様は、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインの第１及び第２の抗原結合領域がポリペプチドリンカーによって接続されている多重特異性抗体または二重特異性抗体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、配列番号７３または配列番号７４の配列からなる。いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインは、モノパラトピックであり、バイパラトピック抗原結合ドメインと比較して、より少ないサイトカイン産生を誘導する。いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ重鎖抗体の抗原結合ドメインは、モノパラトピックであり、バイパラトピック抗原結合ドメインと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞をより多く増殖させる。

【0033】

いくつかの実施形態では、抗体は、バイパラトピックであり、モノパラトピック抗ＰＳＭＡ抗体と比較して、ＰＳＭＡに対してより高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、バイパラトピックであり、モノパラトピック抗ＰＳＭＡ抗体と比較して、より高いエフェクター機能を有する。

【0034】

本発明の態様は、本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物に関する。

【0035】

本発明の態様は、ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を有する対象に本明細書に記載の抗体または医薬組成物を投与することを含む、当該障害の治療方法に関する。特定の他の態様では、本発明は、ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害の治療のための薬剤の調製における、本明細書に記載の抗体の使用に関する。さらに他の態様では、本発明は、ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害の治療に使用するための本明細書に記載の抗体に関する。特定の他の態様では、本発明は、本明細書に記載の有効用量の抗体または医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、治療方法に関する。これらの態様に関して、及びいくつかの実施形態では、障害は前立腺癌である。

【0036】

本発明の態様は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなベクターを含む細胞に関する。

【0037】

本発明の態様は、抗体の発現を許容する条件下で本明細書に記載の細胞を増殖させること、及び細胞から抗体を単離することを含む、本明細書に記載の抗体の産生方法に関する。

【0038】

本発明の態様は、ＰＳＭＡタンパク質でＵｎｉＲａｔ動物を免疫すること、及びＰＳＭＡ結合抗体配列を同定することを含む、本明細書に記載の抗体の作製方法に関する。

【0039】

これらの態様、及びさらなる態様は、実施例を含む本開示の残りの部分において、さらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】パネルＡ～Ｂは、希釈の関数としての血清力価を示す一連のグラフを提供する。

【図2】パネルＡは、ヒトＰＳＭＡへの細胞結合を示すグラフである。パネルＢは、カニクイザルＰＳＭＡへの細胞結合を示すグラフである。

【図3】本発明の実施形態による２つの抗体ファミリー間の結合競合を示すグラフである。

【図4】パネルＡは、ＣＤ３及びＰＳＭＡへの結合親和性を有する二重特異性抗体の細胞表面発現ＰＳＭＡへの結合親和性を示すスキャッチャードプロットであり、ＰＳＭＡアームは、本発明の実施形態に従って、モノパラトピック及び一価である。パネルＢは、ＣＤ３及びＰＳＭＡへの結合親和性を有する二重特異性抗体の細胞表面発現ＰＳＭＡへの結合親和性を示すスキャッチャードプロットであり、ＰＳＭＡアームは、本発明の実施形態に従って、バイパラトピックである。

【図5】パネルＡ～Ｃは、本発明の実施形態による、抗ＣＤ３×一価、単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体（パネルＡ）、抗ＣＤ３×二価、単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体（パネルＢ）、及び抗ＣＤ３×二価、バイパラトピック抗ＰＳＭＡ抗体（パネルＣ）の概略図を示す。

【図6】事前に活性化されたＴ細胞を使用したＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示すグラフである。

【図7】未刺激Ｔ細胞を使用したＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示すグラフである。

【図8】事前に活性化されたＴ細胞の存在下での多重特異性抗体濃度の関数としてのＰＳＭＡ陰性ＤＵ１４５細胞の特異的溶解率（％）を示すグラフである。

【図9】ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＰＳＭＡ陽性細胞及び陰性細胞への結合を示すグラフである。

【図10】ＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示すグラフである。

【図11】パネルＡは、抗体濃度の関数としてのＴ細胞増殖を示すグラフである。パネルＢは、抗体濃度の関数としてのＴ細胞増殖を示すグラフである。パネルＣは、増殖したＴ細胞のＣＤ４に対するＣＤ８の比率を示すグラフである。パネルＤは、増殖したＴ細胞のＣＤ４に対するＣＤ８の比率を示すグラフである。

【図12】パネルＡは、抗体濃度の関数としてのＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示すグラフである。パネルＢは、抗体濃度の関数としてのサイトカイン（ＩＦＮγ）放出を示すグラフである。パネルＣは、抗体濃度の関数としてのサイトカイン（ＩＬ－２）放出を示すグラフである。

【図13】腫瘍異種移植モデルにおける２２Ｒｖ１腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0041】

本発明の実施は、特に明記しない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献において完全に説明されている。

【0042】

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。

【0043】

特に明記しない限り、本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリング方式に従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。

【0044】

以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を伴わずに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを回避するために、周知の特徴及び当業者に周知の手順は記載されていない。

【0045】

特許出願及び公報を含む、本開示を通じて引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0046】

Ｉ．定義
「含む」とは、記載する要素が組成物／方法／キットに必要であることを意味するが、特許請求の範囲内で他の要素が組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得る。

【0047】

「～から本質的になる」とは、記載する組成物または方法の範囲を、本発明の基本的及び新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない特定の物質またはステップに限定することを意味する。

【0048】

「～からなる」とは、特許請求の範囲で指定されていない任意の要素、ステップ、または成分が、組成物、方法、またはキットから除外されることを意味する。

【0049】

本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリング方式及びＥＵナンバリング方式に従って番号付けされている。Ｋａｂａｔナンバリング方式は、一般的に、可変ドメイン内の残基（およそ、重鎖の１～１１３残基）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリング方式」または「ＥＵインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）で報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリング方式による残基ナンバリングを意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵナンバリング方式による残基ナンバリングを意味する。

【0050】

免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、従来、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインは配列が可変であるため、一般的に可変領域ドメインまたは可変重鎖（ＶＨ）ドメインもしくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと呼ばれる。２つのドメインは従来、会合して特異的結合領域を形成するが、本明細書で論じるように、特異的結合はまた、重鎖のみの可変配列で得ることができ、抗体の様々な非天然構成が知られており、当技術分野で使用されている。

【0051】

「機能的」または「生物学的に活性な」抗体または抗原結合分子（重鎖のみ抗体及び多重特異性（例えば、二重特異性）三本鎖抗体様分子（本明細書に記載のＴＣＡ）を含む）は、構造的、調節的、生化学的または生物物理学的事象において、その天然の活性の１つ以上を発揮することができる分子である。例えば、機能的抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡは、抗原に特異的に結合する能力を有し得、その結合は、次に、シグナル伝達または酵素活性などの細胞事象または分子事象を誘発または変化させ得る。機能的抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡはまた、受容体のリガンド活性化を遮断するか、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用し得る。抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡがその天然の活性の１つ以上を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディング及び集合を含むいくつかの要因に依存する。

【0052】

本明細書における用語「抗体」は、最も広義に使用され、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖のみ抗体、三本鎖抗体、ＴＣＡ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディなどが含まれ、さらに、所望の生体活性を呈する限り、抗体断片も含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであってもよい。

【0053】

抗体という用語は、全長の重鎖、全長の軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子、またはこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的またはその一部の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指すものであり得、そのような標的には、がん細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示する免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、またはサブクラス（エフェクター細胞活性を減弱させるまたは増強する改変Ｆｃ部分により操作されたサブクラスを含む）のものであり得る。対象の抗体の軽鎖は、κ軽鎖（Ｖκ）またはλ軽鎖（Ｖλ）であり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。一態様では、免疫グロブリンは、主にヒト起源である。

【0054】

本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を指向し、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。本発明によるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、例えば、組換えタンパク質産生法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）を介して作製することもできる。

【0055】

抗体に関連して使用する用語「可変」とは、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なっており、その配列が各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのいずれにおいても超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲを含み、これらは主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、これら超可変領域は、βシート構造に連結するループを形成し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。

【0056】

本明細書中で使用する場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメインの残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／または重鎖可変ドメインの「超可変ループ」残基２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）由来の残基、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。いくつかの実施形態では、「ＣＤＲ」とは、Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＰ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：２０９－２１２（１９９９）において定義されるような抗体の相補性決定領域を意味する。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域／ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0057】

例示的なＣＤＲの呼称を本明細書に示すが、当業者であれば、配列の変動性に基づき、最も一般的に使用されているＫａｂａｔ定義（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４－７００を参照のこと）を含む、ＣＤＲのいくつかの定義が一般的に使用されていることを理解するであろう。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７－８８３）。目的の代替のＣＤＲ定義には、限定されないが、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７－６７０、Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０－６２３５、Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２－１４３、及びＰａｄｌａｎｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｆａｓｅｂ Ｊ．１９９５；９：１３３－１３９．によって開示された定義が含まれ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に具体的に援用される。

【0058】

用語「重鎖のみ抗体」及び「重鎖抗体」とは、本明細書では同じ意味で用いられ、最も広い意味で、抗体、または抗体の１つ以上の部分、例えば、従来の抗体の軽鎖を欠損した抗体の１つ以上のアームを指す。これらの用語には、具体的には、限定されないが、ＶＨ抗原結合ドメインならびにＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを含むがＣＨ１ドメインがないホモ二量体抗体、そのような抗体の機能的（抗原結合）バリアント、可溶性ＶＨバリアント、１つの可変ドメイン（Ｖ－ＮＡＲ）と５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ－ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ－ＮＡＲ及びその機能的断片、ならびに可溶性単一ドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂｓ（商標））が含まれる。一実施形態では、重鎖のみ抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４からなる可変領域抗原結合ドメインからなる。別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインからなる。さらなる実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインからなる。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが短縮された重鎖のみ抗体もまた、本明細書に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン、及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインからなるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖のみ抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、そうでなければ、共有結合または非共有結合で互いに結合している二量体の形態であり得る。重鎖のみ抗体は、ＩｇＧサブクラスに属していてもよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体もまた、本明細書に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプのものである。一実施形態では、本明細書における重鎖のみ抗体を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用する。この定義には、具体的には、ＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれるヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））によって産生されるヒト重鎖のみ抗体が含まれる。ＵｎｉＡｂｓ（商標）の可変領域（ＶＨ）は、ＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、また、多重特異性を有し、効力が増加し、半減期が延長された新規治療薬を開発するために、Ｆｃ領域または血清アルブミンに結合することができる可変性ビルディングブロックである。ホモ二量体型のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、軽鎖を欠損しており、したがってＶＬドメインを欠いているため、抗原は、単一のドメイン、すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＨＨ）によって認識される。

【0059】

本明細書中で使用する「インタクトな抗体鎖」とは、全長の可変領域及び全長の定常領域（Ｆｃ）を含む抗体鎖である。インタクトな「従来の」抗体は、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに分泌型ＩｇＧ用の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有している場合がある。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、これは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体の下方調節が挙げられる。定常領域バリアントには、エフェクター特性、Ｆｃ受容体への結合などを変化させるバリアントが含まれる。

【0060】

重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、抗体及び様々な抗原結合タンパク質は、異なるクラスとして提供され得る。５つの主要な重鎖Ｆｃ領域のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの抗体に対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれ得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。Ｉｇの形態には、ヒンジ修飾またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３－４０９０、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６－７２５６、ＵＳ２００５／００４８５７２、ＵＳ２００４／０２２９３１０）。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。本発明の実施形態による抗体は、κ軽鎖配列またはλ軽鎖配列を含み得る。

【0061】

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。エフェクター機能の非限定的な例として、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦＣγＲＩＩＢ２、ＦＣγＲＩＩＩＡ、ＦＣγＲＩＩＩＢ受容体、及び低親和性ＦｃＲｎ受容体と相互作用することを必要とし、そして、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。「死んだ」または「サイレンシングされた」Ｆｃとは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を保持するように変異導入されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないか、またはＦｃ受容体に対する親和性が低下しているＦｃである。

【0062】

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然のバリアントが含まれる。

【0063】

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換（複数可）によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１～約１０個のアミノ酸置換、及び好ましくは約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、ならびに最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも約９５％の相同性を保有する。

【0064】

バリアントＦｃ配列は、ＥＵインデックス位置２３４、２３５、及び２３７でのＦｃγＲＩ結合を低下させるために、ＣＨ２領域に３つのアミノ酸置換を含み得る（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３を参照のこと）。ＥＵインデックス位置３３０及び３３１の補体Ｃ１ｑ結合部位における２つのアミノ酸置換は、補体結合を低下させる（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照のこと）。位置２３３～２３６でのヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２残基ならびに位置３２７、３３０及び３３１でのＩｇＧ４残基への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４、及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４を参照のこと）。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｐ０１８６１）は、本明細書において配列番号７６として提供される。サイレンシングされたＩｇＧ１は、例えば、Ｂｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｆｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５－２７に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0065】

他のＦｃバリアントが可能であり、これには、限定されないが、ジスルフィド結合を形成することができる領域が欠失しているバリアント、または天然ＦｃのＮ末端において特定のアミノ酸残基が除去されているバリアント、またはメチオニン残基が付加されているバリアントが含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上のＦｃ部分は、ジスルフィド結合を排除するために、ヒンジ領域に１つ以上の変異を含み得る。さらに別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去することができる。さらに別の実施形態では、抗体は、Ｆｃバリアントを含み得る。

【0066】

さらに、Ｆｃバリアントは、補体結合またはＦｃ受容体結合をもたらすために、アミノ酸残基を置換（変異）、欠失、または付加することによってエフェクター機能を除去または実質的に低減するように構築することができる。例えば、限定されないが、欠失を、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位で行ってもよい。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製するための技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８に開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾され得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書において、任意選択でＩｇＧ４ ＣＨ３ノブ配列と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、及びＹ４０７Ｖ変異を含むバリアントヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン配列を含み、これは、本明細書において、任意選択でＩｇＧ４ ＣＨ３ホール配列と呼ばれ得る。抗体二量体の第１の単量体の第１の重鎖定常領域に「ノブ」を配置し、抗体二量体の第２の単量体の第２の重鎖定常領域に「ホール」を配置し、それにより、抗体中の重鎖ポリペプチドサブユニットの所望のペアの適切な対形成（ヘテロ二量体化）を促進するために、本明細書に記載のＩｇＧ４ ＣＨ３変異を任意の適切な方法で利用することができる。

【0068】

いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ変異、Ｆ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、及びＴ３６６Ｗ変異（ノブ）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ変異、Ｆ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、及びＴ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、及びＹ４０７Ｖ変異（ホール）を含むバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む重鎖ポリペプチドサブユニットを含む。

【0069】

用語「Ｆｃ領域を含む抗体」とは、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリング方式による残基４４７）を、例えば、抗体の精製中に、または抗体をコードする核酸の組換え操作により除去してもよい。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を含むか、または含まない抗体を含み得る。

【0070】

本発明の態様は、一価または二価構成の重鎖のみの可変領域を含む抗体を含む。本明細書中で使用する場合、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用する用語「一価構成」とは、単一の結合部位を有する、重鎖のみの可変領域ドメインが１つだけ存在することを意味する（図５、パネルＡ、抗体の右アームを参照のこと）。対照的に、重鎖のみの可変領域ドメインに関して使用する用語「二価構成」とは、２つの重鎖のみの可変領域ドメインが存在し（それぞれが単一の結合部位を有する）、リンカー配列によって接続されていることを意味する（図５、パネルＢ及びＣ、抗体の右アームを参照のこと）。リンカー配列の非限定的な例を、本明細書でさらに議論し、これには、限定されないが、様々な長さのＧＳリンカー配列が含まれる。重鎖のみの可変領域が二価構成にある場合、２つの重鎖のみの可変領域ドメインのそれぞれは、同じ抗原または異なる抗原（例えば、同じタンパク質上の異なるエピトープに対して、２つの異なるタンパク質に対して、など）に対する結合親和性を有する。しかしながら、特に明記しない限り、「二価構成」にあると示される重鎖のみの可変領域は、リンカー配列によって接続された２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインを含むと理解され、その場合、２つの同一の重鎖のみの可変領域ドメインのそれぞれは、同じ標的抗原に対して結合親和性を有する。

【0071】

本発明の態様は、限定されないが、二重特異性、三重特異性などを含む多重特異性構成を有する抗体を含む。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などにおいて多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、使用されている。

【0072】

多価人工抗体を産生するための様々な方法が、２つ以上の抗体の可変ドメインを組換え的に融合することによって開発されてきた。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の第１及び第２の抗原結合ドメインを、ポリペプチドリンカーによって接続する。そのようなポリペプチドリンカーの１つの非限定的な例は、４つのグリシン残基とそれに続く１つのセリン残基のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり、ＧＳリンカー中でこの配列はｎ回繰り返され、ｎは、１～約１０の範囲の整数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９である。そのようなリンカーの非限定的な例として、ＧＧＧＧＳ（配列番号７３）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４（ｎ＝２）が挙げられる。他の適切なリンカーも使用することができ、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－６９に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0073】

用語「三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」は、本明細書中では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる抗体様分子を指すために用いられ、そのうちの２つは、抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含む、モノクローナル抗体の１つの重鎖及び１つの軽鎖、またはそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖ペアは、第１の抗原に対して結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分、及び第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、２つの抗原結合ドメイン）を含む重鎖のみ抗体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、そのような結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域に由来するか、またはそれに対して配列同一性を有する。そのような可変領域の部分は、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再配置されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ、またはＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。

【0074】

ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖のみ抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」を利用し、これは、本明細書中で使用する場合、重鎖定常領域ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４を含むが、ＣＨ１ドメインは含まない単鎖抗体を意味する。一実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインからなる。さらなる実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインからなる。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが短縮された重鎖抗体もまた、本明細書に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン、及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインからなるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖のみ抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合しているか、または互いに共有結合もしくは非共有結合している二量体の形態であり得、任意選択で、ポリペプチド鎖間の適切なペアリングを促進するために、１つ以上のＣＨドメイン間に非対称界面を含み得る。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属していてもよいが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体もまた、本明細書に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのものである。ＴＣＡ結合化合物の非限定的な例は、例えば、ＷＯ２０１７／２２３１１１及びＷＯ２０１８／０５２５０３に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0075】

重鎖抗体は、ラクダ類、例えばラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６－４４８（１９９３））。これらの抗体は、２本の重鎖によって形成されるが、軽鎖を有さない。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと呼ばれ、それは、長さがわずか約１２０アミノ酸の、最小の天然のインタクトな抗原結合部位を表す（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５－２６２９０（２００１））。免疫化によって、高い特異性と親和性を備えた重鎖抗体を、様々な抗原に対して生成することができ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７－４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は、容易に酵母中でクローニングし、発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１－２１（２０００））。それらの発現、溶解度及び安定性のレベルは、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントに比べて有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１－５２６（１９９７））。サメはまた、ＶＮＡＲと呼ばれる抗体に単一のＶＨ様ドメインを有することが示されている。（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４（２００３）、Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７－１９７（２００４）、Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５－３３（２００３））。

【0076】

本明細書中で使用する用語「ＰＳＭＡ」とは、Ｎ－アセチル化－α結合酸性デペプチダーゼ、葉酸ヒドロラーゼ及びジペプチジルペプチダーゼ活性を有するＩＩ型膜貫通タンパク質を指す。用語「ＰＳＭＡ」には、任意のヒト及び非ヒト動物種のＰＳＭＡタンパク質が含まれ、具体的には、ヒトＰＳＭＡならびに非ヒト哺乳類のＰＳＭＡが含まれる。

【0077】

本明細書中で使用する用語「ヒトＰＳＭＡ」には、その供給源または調製様式に関係なく、ヒトＰＳＭＡの任意のバリアント、アイソフォーム及び種相同体（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０４６０９）が含まれる。したがって、「ヒトＰＳＭＡ」には、細胞が天然に発現するヒトＰＳＭＡと、ヒトＰＳＭＡ遺伝子を形質移入した細胞上で発現するＰＳＭＡが含まれる。

【0078】

上記で定義されたように、用語「抗ＰＳＭＡ重鎖のみ抗体」、「ＰＳＭＡ重鎖のみ抗体」、「抗ＰＳＭＡ重鎖抗体」及び「ＰＳＭＡ重鎖抗体」は、本明細書中では、上記で定義されたようにヒトＰＳＭＡを含むＰＳＭＡに免疫特異的に結合する重鎖のみ抗体を指すために同じ意味で用いられる。この定義には、限定されないが、上記で定義されたようにヒト抗ＰＳＭＡ ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含む、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物によって産生されるヒト重鎖抗体が含まれる。

【0079】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される（いずれの保存的置換も配列同一性の一部としてみなさない）。アミノ酸配列同一性の割合を決定することを目的としたアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内である様々な方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較している配列の全長にわたる最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用してアミノ酸配列同一性の値（％）を生成する。

【0080】

「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から同定され、分離され、及び／または回収された抗体である。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げる物質であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）ローリー法により判定した場合に抗体の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超になるまで、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用して少なくとも１５残基のＮ末端配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いて還元条件もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、均質になるまで精製する。単離された抗体には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でのｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。

【0081】

本発明の抗体には、多重特異性抗体が含まれる。多重特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。用語「多重特異性」には、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびに高次のポリエピトープ特異性などの高次の独立した特異的結合親和性、ならびに四価抗体及び抗体断片が含まれる。用語「多重特異性抗体」、「多重特異性重鎖のみ抗体」、「多重特異性重鎖抗体」、及び「多重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」は、本明細書中では最も広い意味で用いられ、複数の結合特異性を有するすべての抗体を包含する。本発明の多重特異性重鎖抗ＰＳＭＡ抗体には、具体的には、ヒトＰＳＭＡ（すなわち、二価及びバイパラトピック）などのＰＳＭＡタンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに免疫特異的に結合する抗体が含まれる。本発明の多重特異性重鎖抗ＰＳＭＡ抗体にはまた、具体的には、ヒトＰＳＭＡなどのＰＳＭＡタンパク質上のエピトープ、及び例えば、ＣＤ３タンパク質、例えば、ヒトＣＤ３（すなわち、二価及びバイパラトピック）などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体が含まれる。本発明の多重特異性重鎖抗ＰＳＭＡ抗体にはまた、具体的には、ヒトＰＳＭＡなどのＰＳＭＡタンパク質上の２つ以上の重複しないまたは部分的に重複するエピトープ、及び例えば、ＣＤ３タンパク質、例えば、ヒトＣＤ３タンパク質（すなわち、二価及びバイパラトピック）などの異なるタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体が含まれる。

【0082】

本発明の抗体には、１つの結合特異性を有する単一特異性抗体が含まれる。単一特異性抗体には、具体的には、単一の結合特異性を有する抗体、及び同じ結合特異性を有する複数の結合ユニットを含む抗体が含まれる。用語「単一特異性抗体」、「単一特異性重鎖のみ抗体」、「単一特異性重鎖抗体」、及び「単一特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」は、本明細書中では最も広い意味で用いられ、単一の結合特異性を有するすべての抗体を包含する。本発明の単一特異性重鎖抗ＰＳＭＡ抗体には、具体的には、ヒトＰＳＭＡ（一価及び単一特異性）などのＰＳＭＡタンパク質上の１つのエピトープに免疫特異的に結合する抗体が含まれる。本発明の単一特異性重鎖抗ＰＳＭＡ抗体にはまた、具体的には、ヒトＰＳＭＡなどのＰＳＭＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する２つ以上の結合ユニットを有する抗体（例えば、多価抗体）が含まれる。例えば、本発明の実施形態による単一特異性抗体は、２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含み得、各抗原結合ドメインは、ＰＳＭＡタンパク質上の同じエピトープ（すなわち、二価及び単一特異性）に結合する。

【0083】

「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般的に、抗原はいくつかまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語には、具体的には、直鎖状エピトープ及び立体構造エピトープが含まれる。

【0084】

「エピトープマッピング」とは、標的抗原上の抗体の結合部位またはエピトープを同定するプロセスである。抗体エピトープは、直鎖状エピトープまたは立体構造エピトープであり得る。直鎖状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体構造エピトープは、タンパク質配列が不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折りたたまれると一緒になるアミノ酸により形成される。

【0085】

「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明には、具体的には、ポリエピトープ特異性を有する抗ＰＳＭＡ重鎖抗体、すなわち、ヒトＰＳＭＡなどのＰＳＭＡタンパク質上の１つ以上の重複しないエピトープに結合する抗ＰＳＭＡ重鎖抗体、ならびにＰＳＭＡタンパク質上の１つ以上のエピトープ、及び例えば、ＣＤ３タンパク質などの異なるタンパク質上のエピトープに結合する抗ＰＳＭＡ重鎖抗体が含まれる。抗原の「重複しないエピトープ（複数可）」または「非競合的エピトープ（複数可）」という用語は、本明細書中では、抗原特異的抗体のペアの一方のメンバーによって認識されるが、他方のメンバーには認識されないエピトープ（複数可）を意味するものとして定義される。重複しないエピトープを認識する抗体のペア、または多重特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗原結合領域は、その抗原への結合をめぐって競合せず、同時にその抗原に結合することができる。

【0086】

２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために最も広く使用されている迅速な方法は競合アッセイであり、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、様々な形式で構成することができる。通常、抗原を９６ウェルプレートに固定化し、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を、放射性標識または酵素標識を使用して測定する。

【0087】

本明細書中で使用する用語「価」とは、抗体分子内の特定の数の結合部位を指す。

【0088】

「一価」抗体は、１つの結合部位を有する。したがって、一価抗体は、単一特異性でもある。

【0089】

「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、用語「二価」、「三価」、及び「四価」とは、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位が存在することを指す。したがって、本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価、四価、または多価であり得る。本発明の実施形態による二価抗体は、同じエピトープ（すなわち、二価、モノパラトピック）、または２つの異なるエピトープ（すなわち、二価、バイパラトピック）に対する２つの結合部位を有し得る。

【0090】

二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などを調製するための多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、使用されている。

【0091】

用語「三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」は、本明細書中では、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる抗体様分子を指すために用いられ、そのうちの２つは、抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含む、モノクローナル抗体の１つの重鎖及び１つの軽鎖、またはそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖ペアは、第１の抗原に対して結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分、及び第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む重鎖のみ抗体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、そのような結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域に由来するか、またはそれに対して配列同一性を有する。そのような可変領域の部分は、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再配置されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ、またはＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。ＴＣＡタンパク質は、上記で定義されたような重鎖のみ抗体を利用する。

【0092】

用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書中では最も広い意味で用いられ、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を移植する改変型受容体を指す。通常、受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作成するために用いられる。（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９、及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０－３８３）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫療法で使用するための人工Ｔ細胞受容体を産生するように遺伝子改変されたＴ細胞である。一実施形態では、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」とは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞質ゾルドメインから最小限に構成される１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子を発現する治療用Ｔ細胞を意味する。

【0093】

用語「ヒト抗体」は、本明細書中では、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むように使用される。本明細書のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異が含まれ得る。用語「ヒト抗体」には、具体的には、上記で定義されたように、トランスジェニックラットまたはマウスなどのトランスジェニック動物によって産生されるヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖のみ抗体、特にＵｎｉＲａｔｓ（商標）によって生成されるＵｎｉＡｂｓ（商標）が含まれる。

【0094】

「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座由来のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分を含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体には、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体、及びヒトイディオタイプが含まれる。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するように改変された本発明の動物から単離することができる。

【0095】

本明細書中で使用する場合、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知及び活性化段階とは対照的に、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を果たす。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球とマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅と免疫系の他の成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。

【0096】

「ヒトエフェクター細胞」とは、Ｔ細胞受容体やＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球のことである。好ましくは、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載するように、その天然の供給源から、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離され得る。

【0097】

用語「免疫細胞」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定されないが、骨髄またはリンパ球起源の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球が挙げられる。

【0098】

抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に帰属する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。

【0099】

「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的とする分子のＡＤＣＣ活性を、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価してもよい。

【0100】

「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。

【0101】

「結合親和性」とは、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書中で使用する場合、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する、本来の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、通常、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、通常、抗原により早く結合し、結合したままである傾向がある。

【0102】

本明細書中で使用する場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を反応速度モードで使用して、バイオレイヤー干渉法によって測定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーに、マウスＦｃ融合抗原をロードし、抗体を含有するウェルに浸して、濃度依存性の会合速度（ｋｏｎ）を測定する。緩衝液のみを含有するウェルにセンサーを浸す最終ステップにおいて、抗体の解離速度（ｋｏｆｆ）を測定する。Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。（詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１－８００，２００９を参照のこと）。

【0103】

用語「治療」、「治療する」などは、一般的に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するものとして本明細書中で使用される。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書中で使用する「治療」は、哺乳類における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象における発症を予防するか、（ｂ）その疾患を阻害する、すなわち、その発現を阻止するか、または（ｃ）その疾患を軽減する、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与してもよい。進行中の疾患の治療で、その治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化するか、または軽減するものは、特に興味深い。そのような治療は、影響を受けた組織の機能が完全に失われる前に実施することが望ましい。対象の治療薬は、疾患の症候期の間、及びいくつかの場合では疾患の症候期の後に投与してもよい。

【0104】

「治療有効量」は、対象に治療効果を与えるために必要な活性薬剤の量を意図している。例えば、「治療有効量」とは、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行または生理学的状態の改善を誘発、寛解、または引き起こすか、または障害に対する耐性を改善する量である。

【0105】

本明細書中で使用する用語「前立腺癌」とは、前立腺にある腺起源の悪性腫瘍を指す。

【0106】

用語「ＰＳＭＡの発現を特徴とする」とは、ＰＳＭＡ発現が、疾患または障害に特徴的な１つ以上の病理学的プロセスに関連するか、または関与する任意の疾患または障害を広く指す。そのような障害として、前立腺癌が挙げられるが、これに限定されない。

【0107】

用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書中では同じ意味で用いられ、治療について評価されている、及び／または治療されている哺乳類を指す。一実施形態では、哺乳類は、ヒトである。用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、限定されないが、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染症を有する個体などを包含する。対象はヒトであり得るが、他の哺乳類、特にヒトの疾患の実験室モデルとして有用な哺乳類、例えば、マウス、ラットなども含まれる。

【0108】

用語「医薬製剤」とは、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、及び製剤を投与する対象にとって許容できない程度に毒性である追加の成分を含有しない製剤を指す。そのような製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、対象哺乳類に適度に投与して、用いる有効用量の活性成分を提供することができる賦形剤である。

【0109】

「無菌」製剤は、無菌であるか、またはすべての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、もしくはそれらを本質的に含まない。「凍結」製剤は、温度が０℃未満の製剤である。

【0110】

「安定」製剤とは、内部のタンパク質が保管時にその物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。保管期間は、一般的に、製剤の意図される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１． Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０）（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することによって、及び／または目視検査によって）、カチオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）またはキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷不均一性を評定することによって、アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析、質量分光分析、還元されたインタクトな抗体を比較するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、ペプチドマッピング（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ－Ｃ）分析、抗体の生物学的活性または抗原結合機能の評価などを含む様々な異なる方法で、質的及び／または量的に評価され得る。不安定性には、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、対形成していないシステイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の差異などのうちのいずれか１つ以上が含まれ得る。

【0111】

ＩＩ．詳細な説明
抗ＰＳＭＡ抗体
本発明は、ヒトＰＳＭＡに結合する、近縁の抗体ファミリーを提供する。このファミリーの抗体は、本明細書で定義され、表１に示すＣＤＲ配列のセットを含み、表２に示す配列番号２４～５４の提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列によって例示される。この抗体のファミリーは、臨床治療薬（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を提供する。抗体には、様々な結合親和性を有するメンバーが含まれているため、所望の結合親和性を有する特定の配列が選択され得る。

【0112】

【0113】

【0114】

適切な抗体は、例えば、図５のパネルＡ～Ｃに示すように、限定されないが、二重特異性抗体、もしくは三重特異性抗体、またはＣＡＲ－Ｔ構造の一部としての使用を含む、開発及び治療または他の使用のために本明細書に提供する抗体から選択され得る。図５のパネルＡ～Ｃは、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ多重特異性抗体の図解を提供し、抗ＰＳＭＡドメインは、一価及び単一特異性、二価及び単一特異性、または二価及び二重特異性（バイパラトピック）である。抗ＣＤ３ドメインはＣＨ１ドメインを含み、軽鎖とペア形成し、一方、抗ＰＳＭＡドメインは重鎖のみ抗体に由来し、ＣＨ１ドメインを含まず、軽鎖と相互作用しない。いくつかの実施形態では、２つの重鎖を、例えば、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ技術を使用してペア形成させる。図５に示す抗体に目を向けると、パネルＡは、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体を示しており、この場合、抗ＰＳＭＡ結合アームは一価及び単一特異性であり、抗ＰＳＭＡアームの抗原結合ドメインは一価構成にあり、これは１つの抗原結合ドメインのみが存在することを意味する。パネルＢは、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体を示しており、この場合、抗ＰＳＭＡ結合アームは二価及び単一特異性であり、抗ＰＳＭＡアームの抗原結合ドメインは二価構成にあり、これはタンデムに配置された２つの同一の抗原結合ドメインが存在することを意味する。パネルＣは、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体を示しており、この場合、抗ＰＳＭＡ結合アームは二価及びバイパラトピックであり、抗ＰＳＭＡアームの抗原結合ドメインは二価構成にある。

【0115】

候補タンパク質に対する親和性の測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。抗体ファミリーのメンバーは、限定されないが、約１０^－６～約１０^－１０、約１０^－６～約１０^－９、約１０^－６～約１０^－８、約１０^－８～約１０^－１１、約１０^－８～約１０^－１０、約１０^－８～約１０^－９、約１０^－９～約１０^－１１、約１０^－９～約１０^－１０、またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０^－６～約１０^－１１のＫｄでＰＳＭＡに対する親和性を有し得る。親和性の選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含む、ＰＳＭＡの生物学的活性を調節する、例えば遮断するための生物学的評価、ならびに潜在的な毒性の評価によって確認することができる。

【0116】

本明細書の抗体ファミリーのメンバーは、カニクイザルマカクのＰＳＭＡタンパク質と交差反応性ではないが、必要に応じて、カニクイザルマカクのＰＳＭＡタンパク質または任意の他の動物種のＰＳＭＡと交差反応性を提供するように改変することができる。

【0117】

本明細書のＰＳＭＡ特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワークにおいてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、一例として、配列番号２４～５８に示す、提供する例示的な可変領域配列のそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸残基２６～３３、５１～５８、及び９７～１１６付近の領域に位置し得る。当業者であれば、異なるフレームワーク配列が選択される場合、一般的に配列の順序は同じままであるが、ＣＤＲ配列は異なる位置にあり得ることが理解するであろう。

【0118】

本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、以下の構造式に包含され得、式中、Ｘは、可変アミノ酸を示しており、これは、以下に示すように特定のアミノ酸であり得る。
ＣＤＲ１
ＧＧＳＩＳＳＸ_１Ｘ_２ＹＸ_３（配列番号６７）
式中、Ｘ_１は、ＳまたはＮであり、
Ｘ_２は、ＳまたはＮであり、及び
Ｘ_３は、ＹまたはＦであり、ならびに
ＣＤＲ２
Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＳＧＸ_７Ｔ（配列番号６８）
式中、Ｘ_４は、ＩまたはＶであり、
Ｘ_５は、ＤまたはＹであり、
Ｘ_６は、ＹまたはＤであり、及び
Ｘ_７は、ＹまたはＳであり、ならびに
ＣＤＲ３
ＡＲＨＫＡＡＴＡＤＦＤＹ（配列番号６９）

【0119】

本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、以下の構造式に包含され得、式中、Ｘは、可変アミノ酸を示しており、これは、以下に示すように特定のアミノ酸であり得る。
ＣＤＲ１
ＧＦＸ_１ＦＸ_２Ｘ_３ＹＧ（配列番号７０）
式中、Ｘ_１は、ＳまたはＩまたはＴであり、
Ｘ_２は、ＳまたはＴまたはＲまたはＩであり、及び
Ｘ_３は、ＲまたはＳであり、ならびに
ＣＤＲ２
ＩＸ_４ＹＤＧＳＮＸ_５（配列番号７１）
式中、Ｘ_４はＷまたはＳであり、及び
Ｘ_５は、ＲまたはＫであり、ならびに
ＣＤＲ３
ＡＲＥＰＲＸ_６ＧＹＹＹＸ_７Ｘ_８ＳＧＹＸ_９ＳＬＤＹ（配列番号７２）
式中、Ｘ_６は、ＩまたはＶであり、
Ｘ_７は、ＥまたはＤであり、
Ｘ_８は、ＳまたはＴであり、及び
Ｘ_８は、ＹまたはＤである。

【0120】

代表的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を、表１及び３に示す。

【0121】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１～１０のいずれか１つのＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ１配列は、配列番号２または７である。

【0122】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１１～１７のいずれか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ２配列は、配列番号１１または１５である。

【0123】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号１８～２３のいずれか１つのＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ３配列は、配列番号１８または２０である。

【0124】

さらなる実施形態では、抗ＰＳＭＡ重鎖のみ抗体は、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号１１のＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ３配列を含む。

【0125】

さらなる実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号７のＣＤＲ１配列、配列番号１５のＣＤＲ２配列、及び配列番号２０のＣＤＲ３配列を含む。

【0126】

さらなる実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号２４～５８の重鎖可変領域アミノ酸配列のいずれかを含む（表２）。

【0127】

さらに別の実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号２５の重鎖可変領域配列を含む。

【0128】

さらに別の実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号３８の重鎖可変領域配列を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体におけるＣＤＲ配列は、配列番号１～２３のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３配列またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列のセット（表１）に対して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、好ましくは、ＣＤＲ３配列が、いずれか１つの抗体（そのＣＤＲ３配列が表１に示されている）のＣＤＲ３配列に対して、アミノ酸レベルで８０％以上、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、ＰＳＭＡに結合する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、好ましくは、ＣＤＲ１、２、及び３のフルセット（組み合わせ）が、抗体（そのＣＤＲ配列が表１に示されている）のＣＤＲ１、２、及び３（組み合わせ）に対して、アミノ酸レベルで８５パーセント（８５％）以上の配列同一性を有し、ＰＳＭＡに結合する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、好ましくは、ＣＤＲ１、２、及び３のフルセット（組み合わせ）が、抗体（そのＣＤＲ配列が表３に示されている）のＣＤＲ１、２、及び３（組み合わせ）に対して、アミノ酸レベルで８５パーセント（８５％）以上の配列同一性を有し、ＰＳＭＡに結合する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、配列番号２４～５８（表２に示されている）の重鎖可変領域配列のいずれかに対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＰＳＭＡに結合する、重鎖可変領域配列を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体を提供し、これは、限定されないが、二重特異性三本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む、本明細書中で述べる構成のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域、及びＰＳＭＡ以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む重鎖可変領域を含み得、抗原結合ドメインのそれぞれは、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１の抗原（例えば、ＣＤ３）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖ペア、及び重鎖のみ抗体由来の重鎖を含み得る。特定の実施形態では、重鎖のみ抗体由来の重鎖は、ＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む。特定の一実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖ペア、及びＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖のみ抗体由来の重鎖を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、軽鎖可変ドメインとペア形成しているＣＤ３結合ＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、軽鎖は、固定軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、ヒトＶＨフレームワークにおいて、配列番号５９のＣＤＲ１配列、配列番号６０のＣＤＲ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、固定軽鎖は、ヒトＶＬフレームワークにおいて、配列番号６２のＣＤＲ１配列、配列番号６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号６４のＣＤＲ３配列を含む。合わせて、ＣＤ３結合ＶＨドメインと軽鎖可変ドメインはＣＤ３に対して結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号６５の重鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、配列番号６５の重鎖可変領域配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、固定軽鎖は、配列番号６６の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、固定軽鎖は、配列番号６６の重鎖可変領域配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。

【0136】

上記のＣＤ３結合ＶＨドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む多重特異性抗体は、例えば、公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８／０５２５０３号（その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているように、有利な特性を有する。ＰＳＭＡへの結合親和性を有する、本明細書に記載の多重特異性抗体及び抗原結合ドメインのいずれも、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメイン及び固定軽鎖ドメイン（例えば、表４及び表５を参照のこと）、ならびに表６及び表７に示すような追加の配列と組み合わせて、１つ以上のＰＳＭＡエピトープ及びＣＤ３に結合親和性を有する多重特異性抗体を生成することができる。

【0137】

いくつかの実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体を提供し、これは、限定されないが、二重特異性三本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む、本明細書中で述べる構成のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域、及びＰＳＭＡ以外のタンパク質に対する結合特異性を有する少なくとも１つの重鎖可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖ペア、及びＣＨ１ドメインを含まず、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖のみ抗体由来の重鎖、ならびに第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインを含み得る。特定の一実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）に対する結合特異性を有する重鎖／軽鎖ペア、及びＰＳＭＡに対する結合特異性を有する抗原結合ドメインを含む重鎖のみ抗体由来の重鎖を含む。

【0138】

本発明の抗体が二重特異性抗体であるいくつかの実施形態では、抗体の一方のアーム（１つの結合部分または１つの結合ユニット）は、ヒトＰＳＭＡに特異的であり、他方のアームは、標的細胞、腫瘍関連抗原、標的化抗原、例えば、インテグリンなど、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的であり得る。標的細胞には、具体的には、以下に述べるように、限定されないが、固形腫瘍、例えば、前立腺腫瘍由来の細胞を含むがん細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体の一方のアーム（１つの結合部分、または１つの結合ユニット）は、ヒトＰＳＭＡに特異的であり、他方のアームは、ＣＤ３に特異的である。

【0139】

いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７９の配列に連結された配列番号６６の配列を含む抗ＣＤ３軽鎖ポリペプチド、配列番号８０、８１、８２、８３、８４または８５のいずれか１つの配列を含む抗ＣＤ３重鎖ポリペプチド、及び配列番号７５、７６、７７、７８、８４または８５のいずれか１つの配列に連結された一価または二価の構成の配列番号２４～５８のいずれか１つの配列を含む抗ＰＳＭＡ重鎖ポリペプチドを含む。これらの配列を様々な方法で組み合わせて、所望のＩｇＧサブクラスの二重特異性抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、サイレンシングされたＩｇＧ１、サイレンシングされたＩｇＧ４を生成することができる。好ましい一実施形態では、抗体は、配列番号８６を含む第１のポリペプチド、配列番号８７を含む第２のポリペプチド、及び配列番号８８、８９、９０、９１、９２または９３を含む第３のポリペプチドを含むＴＣＡである。好ましい一実施形態では、抗体は、配列番号８６からなる第１のポリペプチド、配列番号８７からなる第２のポリペプチド、及び配列番号８８、８９、９０、９１、９２または９３からなる第３のポリペプチドからなるＴＣＡである。

【0140】

限定されないが、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれらの倍数を含む、様々な形態の多重特異性抗体が本発明の範囲内にある。本明細書の多重特異性抗体には、具体的には、ＰＳＭＡ及びＣＤ３に結合するＴ細胞多重特異性（例えば、二重特異性）抗体（抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３抗体）が含まれる。そのような抗体は、ＰＳＭＡを発現する細胞の強力なＴ細胞媒介性細胞死を誘導する。

【0141】

抗ＰＳＭＡ抗体の調製
本発明の抗体は、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。好ましい実施形態では、本明細書の抗体は、内在性免疫グロブリン遺伝子がノックアウトまたは無効化されているトランスジェニックマウス及びラットを含むトランスジェニック動物、好ましくはラットによって産生される。好ましい実施形態では、本明細書の重鎖抗体は、ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生される。ＵｎｉＲａｔ（商標）は、内在性免疫グロブリン遺伝子がサイレンシングされており、ヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子座を使用して、完全ヒトＨＣＡｂの多様で天然に最適化されたレパートリーを発現する。ラットの内在性免疫グロブリン遺伝子座は、様々な技術を使用してノックアウトまたはサイレンシングすることができるが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を使用して、内在性ラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化した。卵母細胞へのマイクロインジェクション用のＺＮＦ構築物は、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）系統を生成することができる。詳細については、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照のこと。Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの特徴決定は、Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２－２９４１によって報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、最大、数ｋｂの欠失を介して遺伝子または遺伝子座をサイレンシングするための非相同末端結合もまた、相同組込みの標的部位を提供することができる点である（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：６４－６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されたヒト重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれ、従来の抗体で攻撃することができないエピトープに結合することができる。それらの高い特異性、親和性、及びサイズの小ささは、単一及び多特異的な応用に理想的である。

【0142】

ＵｎｉＡｂｓ（商標）に加えて、具体的には、ラクダ類のＶＨＨフレームワーク及び変異、ならびにそれらの機能的なＶＨ領域を欠く重鎖のみ抗体が本明細書に含まれる。そのような重鎖のみ抗体は、例えば、ＷＯ２００６／００８５４８に記載されているように、完全にヒトの重鎖のみの遺伝子座を含むトランスジェニックラットまたはマウスで産生することができるが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳類も使用することができ、ラット及びマウスが好ましい。ＶＨＨまたはＶＨ機能断片を含む重鎖のみ抗体はまた、組換えＤＮＡ技術によって、例えば哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母を含む適切な真核生物または原核生物宿主内でコード化核酸を発現させることによって産生することができる。

【0143】

重鎖のみ抗体のドメインは、抗体と小分子薬の利点を兼ね備えており、一価または多価で有り得、毒性が低く、製造に対して費用効果がある。サイズが小さいため、これらのドメインは経口投与または局所投与を含めて投与が容易であり、胃腸の安定性を含む高い安定性を特徴とし、そして、それらの半減期は、所望の用途または効能に合わせて調整することができる。さらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、費用効果の高い方法で製造することができる。

【0144】

特定の実施形態では、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、ＦＲ４領域の第１の位置（Ｋａｂａｔナンバリング方式によるアミノ酸位置１０１）の天然アミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、これにより、その位置の天然アミノ酸残基を含むか、またはそれに関連する表面に露出した疎水性パッチが破壊され得る。そのような疎水性パッチは、通常、抗体の軽鎖定常領域との界面に埋もれるが、ＨＣＡｂでは表面に露出し、少なくとも部分的に、ＨＣＡｂの望ましくない凝集と軽鎖の会合に用いられる。置換アミノ酸残基は、好ましくは荷電しており、より好ましくは、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）など、正に荷電している。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物に由来する重鎖のみ抗体は、位置１０１にＴｒｐからＡｒｇへの変異を含む。得られるＨＣＡｂは、好ましくは、凝集のない生理学的条件下で高い抗原結合親和性及び溶解性を有する。

【0145】

本発明の一部として、ＥＬＩＳＡタンパク質及び細胞結合アッセイにおいてヒトＰＳＭＡに結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物由来の固有の配列を有するヒトＩｇＧ抗ＰＳＭＡ重鎖抗体（ＵｎｉＡｂ（商標））を同定した。同定した重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、ヒトＰＳＭＡタンパク質結合及び／またはＰＳＭＡ＋細胞への結合について陽性であり、ＰＳＭＡを発現しない細胞への結合についてはすべて陰性である。例えば、表８を参照されたい。

【0146】

ＰＳＭＡタンパク質上の重複しないエピトープに結合する重鎖抗体、例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）またはフローサイトメトリー競合結合アッセイなどの競合結合アッセイによって同定することができる。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体と目的の抗体との間の競合を使用することができる。このアプローチを使用することにより、抗体のセットを、参照抗体と競合するものと競合しないものに分類することができる。非競合抗体は、参照抗体が結合するエピトープと重複しない別個のエピトープに結合するものとして同定される。多くの場合、１つの抗体を固定化し、抗原を結合させ、第２の標識された（例えば、ビオチン化された）抗体を、捕捉された抗原への結合能力についてＥＬＩＳＡアッセイで試験する。これは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＭＸ９６ ＳＰＲイメージャー（Ｉｂｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ．）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プラットフォーム、ならびにＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４及びＯｃｔｅｔ ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉法プラットフォームを使用して実行することもできる。詳細については、本明細書の実施例を参照されたい。

【0147】

一般的には、抗体が、上記の競合結合アッセイなどの標準的な技術によって測定される、標的抗原への参照抗体の結合において約１５～１００％の減少を引き起こす場合、その抗体は参照抗体と「競合」する。様々な実施形態において、相対的阻害は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上である。

【0148】

医薬組成物、使用及び治療方法
適切な薬学的に許容される担体と混合させた本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供することは、本発明の別の態様である。本明細書中で使用する薬学的に許容される担体は、アジュバント、固体担体、水、緩衝液、もしくは治療成分を保持するために当技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。

【0149】

一実施形態では、医薬組成物は、ＰＳＭＡに結合する重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、ＰＳＭＡタンパク質上の２つ以上の重複しないエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＰＳＭＡへの結合特異性及びエフェクター細胞上の結合標的（例えば、Ｔ細胞上の結合標的、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質）への結合特異性を有する多重特異性（二重特異性及びＴＣＡを含む）重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））を含む。

【0150】

本発明に従って使用される抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するタンパク質を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0151】

経口投与用の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与の用量）で提供することができる。製剤化は、選択した投与経路に依存する。本明細書の抗体は、静脈内への注射もしくは注入によって投与するか、または皮下投与することができる。注射による投与の場合、本明細書の抗体を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液中に製剤化して、注射部位の不快感を軽減することができる。溶液は、上記のように、担体、賦形剤、または安定剤を含有し得る。あるいは、抗体を、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリー水を用いて構成するために、凍結乾燥形態とすることができる。

【0152】

抗体製剤は、例えば、米国特許第９，０３４，３２４号に開示されている。同様の製剤を、本発明のＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む重鎖抗体に使用することができる。皮下抗体製剤は、例えば、ＵＳ２０１６０３５５５９１及びＵＳ２０１６０１６６６８９に記載されている。

【0153】

使用方法
本明細書に記載の抗ＰＳＭＡ抗体及び医薬組成物は、限定されないが、本明細書にさらに記載する病態及び疾患を含む、ＰＳＭＡの発現を特徴とする疾患及び病態の治療に使用することができる。

【0154】

ＰＳＭＡは、前立腺上皮組織に発現し、前立腺癌及び固形腫瘍の新生血管系で上方制御されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。また、脳、腎臓、唾液腺などの健康な組織でも低レベルで発現するが、悪性前立腺組織での過剰発現は、前立腺癌の治療的処置の魅力的な標的となる。また、悪性新生血管系での発現が高いことから、固形腫瘍の治療または画像診断にも適し得る。ＰＳＭＡを標的とするモノクローナル抗体、抗体薬物複合体、及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞は、転移性前立腺癌の治療に関して記載されている（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｈｏｙｏｓ ｅｔ ａｌ ２０１６，ＰＭＩＤ：２７４０６９８５、ＤｉＰｉｐｐｏ ｅｔ ａｌ ２０１４，ＰＭＩＤ：２５３２７９８６、Ｓｅｒｇａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ ２０１６，ＰＭＩＤ：２８３４５０２３）。さらに、ＰＳＭＡに特異的な放射性核種複合体が、前立腺癌の画像化及び治療のために調査されているところである（例えば、Ｈｏｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８ ＰＭＩＤ：２９７５２１８０）。

【0155】

一態様では、本明細書の抗ＰＳＭＡ抗体（例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標））及び医薬組成物を使用して、限定されないが、前立腺癌及び固形腫瘍を含む、ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を治療することができる。

【0156】

疾患を治療するための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与する他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因によって様々に異なる。通常、患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどの伴侶動物や、例えば、ウサギ、マウス、ラットなどの実験用哺乳類などもまた、処置され得る。処置用量を漸増させて、安全性及び有効性を最適化することができる。

【0157】

用量レベルは、当業者によって容易に決定され得るが、必要に応じて、例えば、治療への対象の応答を変化させる必要に応じて、変化させることができる。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療する宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。一般的に、単位剤形は、約１ｍｇ～約５００ｍｇの活性成分を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、薬剤の治療用量は、宿主の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で有り得る。例示的な治療計画は、２週間に１回もしくは１か月に１回または３～６か月に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数回投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月または毎年とすることができる。間隔はまた、患者における治療物質の血中レベルを測定することによって指定されるように、不定期とすることもできる。あるいは、本発明の治療物質を徐放性製剤として投与することができ、その場合、あまり頻繁な投与を必要としない。用量と頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に依存して様々に異なる。

【0159】

一般的に、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適した固体形態もまた、調製することができる。本明細書の医薬組成物は、直接の、または固体（例えば、凍結乾燥）組成物の再構成後の静脈内または皮下投与に適している。製剤はまた、上記のように、アジュバント効果を増強するために、リポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどの微粒子に乳化またはカプセル化することができる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の徐放またはパルス放出を可能にするような方法で製剤化することが可能な、デポー注射またはインプラント製剤の形態で投与することができる。医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張であり、米国食品医薬品局のすべての優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）の規制に完全に準拠して製剤化される。

【0160】

本明細書に記載の抗体及び抗体構造の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対する致死用量）を測定することによって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトでの使用に毒性のない用量範囲を策定する際に用いることができる。本明細書に記載の抗体の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で様々に異なり得る。正確な製剤化、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。

【0161】

投与用の組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した抗体または他の削磨剤を含むであろう。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の周知の滅菌技法によって無菌化してもよい。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質（ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は大きく変動し得、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに従って、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。

【0162】

本発明の活性薬剤及びその製剤ならびに使用のための指示書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、例えば化学療法薬などを含み得る。キットは通常、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。本明細書中で使用する用語「ラベル」には、キット上にもしくはキットと共に供給されるか、または他の方法でキットに付随する、あらゆる書面または記録物が含まれる。

【0163】

ここで十分に説明されている本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行い得ることが当業者に明らかとなるであろう。

【実施例】

【0164】

材料及び方法
実施例１：組換えヒトＰＳＭＡによるＵｎｉＲａｔ（商標）免疫化
１２匹のＵｎｉＲａｔ（商標）動物を、ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号：４２３４－ＺＮ）に融合させた組換えヒトＰＳＭＡタンパク質で免疫化した。動物を、８週間にわたって週２回、免疫化した。３５日間の免疫化の時間経過後、ラットから血清を回収し、血清力価を測定した。

【0165】

血清力価の測定結果
血清力価の要約情報を図１のパネルＡ～Ｂに示す。図１のパネルＡ～Ｂに示すグラフにおいて、各線は個々の動物を表す。グラフの凡例は、個々の動物のＩＤ番号を示している。ＥＬＩＳＡにより、血清の１２点希釈系列の結合活性を、ｈｕＰＳＭＡ＋Ｈｉｓタグタンパク質とＨｉｓタグオフターゲットタンパク質に対して試験した。この群の動物の中で、ヒトＰＳＭＡタンパク質に対する、一定範囲の血清反応レベルが観察された。Ｈｉｓタグオフターゲットタンパク質に対する血清反応は観察されなかった。

【0166】

実施例２：抗ＰＳＭＡ ＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＰＳＭＡ陽性及び陰性細胞への結合のフローサイトメトリー分析
ヒトＰＳＭＡまたはＤＵ－１４５細胞株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－８１）を発現するように安定的に形質移入されたＬＮＣａＰ細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１７４０）、２２Ｒｖ１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２５０５）、ＰＣ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４３５）を使用したフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ，ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、ＰＳＭＡ陽性細胞への結合を評価した。簡潔に述べると、５０，０００個の標的細胞を、精製ＵｎｉＡｂｓ（商標）の希釈系列で、４℃にて３０分間染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）で２回洗浄し、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）と複合体化したヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇＧで染色して（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４２－０９）、細胞に結合した抗体を検出した。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで測定した。二次抗体のみで染色された細胞のＭＦＩをバックグラウンドシグナルの測定に使用し、各抗体の結合をバックグラウンドの倍数に変換した。カニクイザルＰＳＭＡ陽性細胞への結合を、以下の変更を加えた同じプロトコルを使用して測定した：標的細胞は、カニクイザルＰＳＭＡの細胞外ドメインを発現するように一過性に形質移入したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ７９００７）由来の細胞であった。いくつかの実験では、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して計算した。

【0167】

表８は、本明細書に記載のいくつかの抗ＰＳＭＡ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の標的結合活性をまとめたものである。列１は、ＨＣＡｂのクローンＩＤを示す。列２は、バックグラウンドＭＦＩシグナルの倍数として測定されたＬＮＣａＰ細胞への結合を示す。

【0168】

図２のパネルＡ及びＢに示すように、カニクイザルＰＳＭＡへの結合の差異は、ＨＣＡｂ３４６１８１及び３４５４９７によって認識されるヒトＰＳＭＡエピトープの違いを裏付けている。

【0169】

実施例３：バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による組換えタンパク質の結合
バイオレイヤー干渉法を使用して、クローンＩＤ３４５４９７とクローンＩＤ３４６１８１がメンバーである２つの抗体ファミリー間の結合競合を評価した。抗原－抗体エピトープビニング分析を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ－３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で実施した。簡潔に述べると、抗ペンタＨＩＳ捕捉（ＨＩＳ１Ｋ）センサーを使用して、抗原－組換えヒトＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号：４２３４－ＺＮ）を１２０秒間固定化した。ベースラインの読み取り後、抗体１（３２５８６７）を含有する溶液にセンサーを３００秒間浸し、別のベースラインを６０秒間設定した。次いで、センサーを、ブロッキングの陽性対照としての抗体１か、または抗体２（３２５９２０）のいずれかを含有するウェルに浸した。結合速度及び解離速度を、それぞれ３００秒間及び６００秒間測定した。Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ ｖ１１．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してデータ分析を実施した。図３に示すように、３２５９２０は、３２５８６７抗体と事前に結合させたＰＳＭＡタンパク質に結合したが、このことは、これら２つの抗体がＰＳＭＡ上の重複しないエピトープを認識することを示している。結合シグナルのシフトはナノメートルで報告している。

【0170】

実施例４：バイパラトピック及び二価抗ＰＳＭＡ抗体の組成
表９に示すように、クローンＩＤ３５０１２３は、架橋配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４）でクローンＩＤ３４５４９７配列に連結されたクローンＩＤ３４６１８１配列からなる。クローンＩＤ３５０１２２は、同じリンカー配列によって連結されたクローンＩＤ３４６１８１の２つの繰り返しからなる。クローンＩＤ３５０１２３は、ＰＳＭＡ上の異なるエピトープを認識する２つの抗ＰＳＭＡドメインからなるため、バイパラトピックである。クローンＩＤ３５０１２２は二価であるが、同じ抗ＰＳＭＡドメインのタンデムからなるため、バイパラトピックではない。様々な抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３抗体の模式図を図５のパネルＡ～Ｃに示す。

【0171】

実施例５：細胞表面に発現したヒトＰＳＭＡへの親和性の測定
ＰＳＭＡ細胞表面の親和性を、ヒト前立腺癌細胞株２２Ｒｖ１を使用したスキャッチャード分析によって測定した。最初に、ＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ５－ＳＤＰ Ｅｓｔｅｒキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ３００５２）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した。次いで、２２Ｒｖ１への結合をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ，ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で評価した。簡潔に述べると、１００，０００個の標的細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した多重特異性抗体の希釈系列を用いて、４℃で１時間染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、次いで平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。

【0172】

等価の可溶性フルオロフォア（ＭＥＳＦ）の分子を計算するための標準曲線を確立するために、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂ Ｑｕａｎｔｕｍ Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＭＥＳＦビーズ集団１～４を単一のチューブ中で組み合わせ、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴで実行した。ブランクビーズを別のチューブで分析した。各ビーズ集団のＭＦＩを、ＦＩＴＣチャネルについて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して、Ｌｏｇ１０（ＭＥＳＦ）に対するＬｏｇ１０（ＭＦＩ）の線形回帰をプロットした。

【0173】

各実験試料のＭＦＩを検量線で補間し、各試料のＭＥＳＦを決定した。続いて、細胞あたりの結合抗体の平均数（ＡＢＣ）を、平均ＭＥＳＦを抗体の標識度（ＤＯＬ）で割ることによって計算した。ＡＢＣの数に細胞濃度を掛けて、結合抗体の総濃度を決定した。染色濃度（開始用量）から結合抗体濃度を差し引くことにより、遊離抗体濃度を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で、結合抗体濃度に対する遊離抗体濃度をプロットした。得られたプロットを非線形回帰の単一部位特異的結合関数にフィッティングして、図４のパネルＡ及びＢに示すように親和性を決定した。

【0174】

実施例６：Ｔ細胞リダイレクトによるＰＳＭＡ陽性前立腺腫瘍細胞の多重特異性抗体媒介性細胞死滅
休止Ｔ細胞を使用したアッセイ
標的細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり１５，０００細胞で播種し、３７℃で一晩増殖させた。インキュベーション後、休止状態のヒトＴ細胞と一緒に、多量の多重特異性抗体を、エフェクター細胞と標的細胞の比率１０：１で添加し、３７℃でさらに４８時間または７２時間インキュベートした（ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ－ＰＣａ－２ｂ及びＰＣ３－ＰＳＭＡ細胞でのアッセイでは４８時間、２２Ｒｖ１細胞でのアッセイでは７２時間）。細胞増殖試薬ＷＳＴ－１（Ｓｉｇｍａカタログ番号：１１６４４８０７００１）またはフローサイトメトリーのいずれかを使用して細胞死を測定した。いくつかの実験では、インキュベーション後、ただし標的細胞の生存率の分析より前に、各上清の少量の試料を回収し、サイトカイン産生の分析用に保存した。細胞生存率をＷＳＴ－１試薬で分析した場合、試薬ストックを各ウェルに１：１０希釈で添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、４５０ｎｍ（参照６９０ｎｍ）で吸光度を測定し、特異的溶解率（％）を計算した。

【0175】

標的細胞の生存率をフローサイトメトリーで分析した場合は、次いで、標的細胞を標識した後、膜色素ＤｉＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄ１２７３１）でアッセイを開始した。Ｔ細胞及び抗体とのインキュベーション後、上清をサイトカイン分析のために保存するか、または廃棄した。次いで、ウェルを１回洗浄して、死んだ腫瘍細胞とＴ細胞を回収し、フローサイトメトリープレートに移した。残りの付着した腫瘍細胞をトリプシン処理し、次いでフローサイトメトリープレートの対応するウェルに加えた。アネキシンＶ試薬を使用して死細胞を染色し、フローサイトメトリーを実施して（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）、ＤｉＲ染色によってゲーティングした各試料中の死んだ腫瘍細胞の割合を定量化した。未処理の標的細胞を含有するウェルを使用して、自発的な細胞死に対して正規化した。いくつかの実験では、ＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性分子と同じＣＤ３ターゲティングアームからなるが、腫瘍ターゲティングアームがＨＩＶタンパク質ｇｐ１２０に特異的なＶＨに置換された陰性対照抗体を使用した。

【0176】

図７は、非刺激のＴ細胞を使用したＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示す。非刺激のヒトＴ細胞を、ＰＳＭＡ発現細胞（ＬＮＣａＰ）及び様々な濃度の多重特異性抗体と共にインキュベートした。バイパラトピック抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体（３５０１２３×ＣＤ３）は、モノパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体（３４６１８１×ＣＤ３）より優れていた。

【0177】

事前に活性化されたＴ細胞を使用したアッセイ
ヒト汎Ｔ細胞をプレート結合ＯＫＴ３及びＩＬ－２で３日間、事前活性化した後、新鮮なＩＬ－２中でさらに１日インキュベートした。標的細胞をトリプシン処理し、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃ３１００ＭＰ）をロードし、活性化Ｔ細胞とＥ：Ｔ比率２０：１で混合し、９６ウェルプレートのウェルに添加した。異なる多重特異性抗体の希釈系列を加えた後、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、上清を黒色の９６ウェルプレートに移し、吸光度を４８０ｎｍ／５２０ｎｍ ｅｘ／ｅｍで測定し、カルセインの放出を定量化した。Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした標的細胞を使用して、インタクトな腫瘍細胞の自発的なカルセインの放出を正規化した。標的細胞を含有する対照ウェルへ２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを添加することにより、最大の細胞溶解に対応するカルセインシグナルを計算することができた。この値を使用して、各実験ウェルを、最大の細胞溶解に対する割合として報告した。ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ７を使用してデータ分析を実施した。

【0178】

図６は、事前に活性化されたＴ細胞を使用したＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示す。事前に活性化されたヒトＴ細胞を、ヒトＰＳＭＡ発現細胞（ＬＮＣａＰ）及び様々な濃度の多重特異性抗体と共にインキュベートした。腫瘍細胞死をカルセイン放出によって測定し、Ｔ細胞の非存在下での腫瘍細胞の自発的放出に対して正規化した。バイパラトピック抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体（３５０１２３×ＣＤ３）は、両方のモノパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体より優れていた。

【0179】

図８は、多重特異性抗体がＰＳＭＡ陰性細胞を溶解しないことを示す。事前に活性化されたヒトＴ細胞を、ＰＳＭＡ陰性前立腺癌細胞（ＤＵ１４５）及び様々な濃度の多重特異性抗体と共にインキュベートした。試験した抗体のいずれによっても、これらの細胞の溶解は起こらなかった。

【0180】

図９は、ＰＳＭＡ陽性細胞及び陰性細胞へのＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体の結合を示す。多重特異性抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３抗体は、ＰＳＭＡ陽性前立腺腫瘍細胞（２２Ｒｖ１）への結合を示すが、ＰＳＭＡ陰性前立腺腫瘍細胞（ＤＵ１４５）への結合は示さない。バイパラトピック分子（３５０１２３）は、最も強いオンターゲット細胞結合を示した。

【0181】

図１０は、ＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解を示す。図１０のデータは、２つの異なるエピトープを介したＰＳＭＡへの結合が、二価であるが単一特異性であるバージョンの抗体と比較して、細胞死滅を増加させることを示している。

【0182】

実施例７：モノパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、バイパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体に比べてサイトカイン産生を誘導しない
休止Ｔ細胞を用いた腫瘍細胞傷害性アッセイにおいて、サイトカイン産生を分析した。これらのアッセイの設計については、他の場所で詳しく説明されている。アッセイの完了時に上清を回収した（２２Ｒｖ１細胞を使用したアッセイでは７２時間のインキュベーション後、他のすべての細胞株では４８時間後）。ＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４３１８０４）及びＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４３０１０４）を検出するために、ＥＬＩＳＡキットを製造元のプロトコルに従って使用した。サイトカインのレベルが各キットに付属の標準曲線の直線部分内に収まるように、ＥＬＩＳＡ分析の前に試験上清を希釈した。いくつかの場合では、試験ウェル中でサイトカインを検出することができず、値がアッセイの定量下限以下であると報告された。

【0183】

図１２のパネルＡ～Ｃは、ＰＳＭＡ陽性細胞のＴ細胞媒介性溶解、及びサイトカイン産生との比較を示す。多重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体は、ＰＳＭＡ陽性前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰのＴ細胞媒介性溶解を誘導する。バイパラトピック分子（３５０１２３）は、モノパラトピック分子（３４６１８１）と比較して、腫瘍細胞の死滅をより強力に刺激したが、図１２のパネルＢ及びパネルＣに示すように、サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）のより高レベルの産生も引き起こした。

【0184】

表１０は、４種のＰＳＭＡ陽性前立腺腫瘍細胞株に対するＴ細胞媒介性溶解及びサイトカイン産生を示す。ＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を、非刺激のＴ細胞及び４種のＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞株パネルに対する一連の用量の抗体を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の細胞傷害性アッセイで試験した。７２時間（２２Ｒｖ１）または４８時間（ＭＤＡ－ＰＣａ－２ｂ、ＬＮＣＡＰ、ＰＣ３－ＰＳＭＡ）後、腫瘍細胞死の割合を計算し、ＥＣ５０で記載し、達成された最高の死滅率も記載した。これらの試験ウェルから上清を回収し、サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）またはインターロイキン－２（ＩＬ－２）について、ＥＬＩＳＡにより分析した。モノパラトピック分子（３４６１８８１）は、バイパラトピック分子と比較して、試験した４種の細胞株すべてに対してほぼ同等レベルの腫瘍細胞傷害性を誘発したが、サイトカイン産生のＥＣ５０がより高く、ほとんどの場合で最大サイトカイン産生の刺激レベルは低かった。

【0185】

【0186】

実施例８：ＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体はＴ細胞の増殖を誘導する
ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり２５，０００細胞で播種し、３７℃で一晩増殖させた。休止ＰＢＭＣから分離されたヒト汎Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０９６－５３５）を、製造元の説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃ３４５５４）に従って系統追跡色素ＣＦＳＥで標識した。次いで、１００，０００個の標識された汎Ｔ細胞を、腫瘍細胞を含有するウェルに加え、続いて一連の抗体を希釈し、３７℃、８％ＣＯ_２でインキュベートした。５日間のインキュベーション後、細胞を穏やかに混合し、フローサイトメトリープレートに移した。細胞をペレット化し、上清を除去した後、ＡＰＣと複合体化した抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０１０４９）及びＰＥと複合体化した抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１７４１０）により、氷上で２０分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、分析のためにフローサイトメトリー緩衝液（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ）に再懸濁した。細胞を、前方散乱及び側方散乱、ならびにＣＤ４発現またはＣＤ８発現でゲーティングした。ＣＤ４またはＣＤ８陽性染色及び低または陰性ＣＦＳＥシグナルによって示されるように、増殖したＴ細胞の割合を、Ｔ細胞集団全体ならびにＣＤ４及びＣＤ８サブセットについて計算した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７においてプロットした。

【0187】

図１１のパネルＡ～Ｄは、ＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体がＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞の存在下でＴ細胞増殖を刺激し、モノパラトピックＰＳＭＡ二重特異性抗体がＣＤ３ Ｔ細胞を優先的に活性化することを示す。多重特異性抗体を、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞及び系統追跡色素ＣＦＳＥで標識されたＴ細胞と一緒にインキュベートした。５日間のインキュベーション後、Ｔ細胞増殖及び増殖したＴ細胞の組成（ＣＤ８＋対ＣＤ４＋）をフローサイトメトリーによって分析した。パネルＡ及びＢは、Ｔ細胞の総増殖を示しており、一方、パネルＣ及びＤは、増殖したウェルにおけるＣＤ８＋とＣＤ４＋のＴ細胞の比率を示している。水平の破線は、非刺激のＴ細胞のＣＤ８：ＣＤ４の比率を示しており、およそ１：２（実際の値＝０．６４）である。モノパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（３４６１８１）は、ＣＤ８ Ｔ細胞を優先的に活性化し（増殖後のＣＤ８：ＣＤ４の比率はおよそ２：１）、一方、バイパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体（３５０１２３）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞をあまり優先的に活性化しない（ＣＤ８：ＣＤ４の比率は約１：１）。

【0188】

実施例９：多重特異性抗体は、異種移植モデルにおいて前立腺腫瘍の成長を抑制する
５～６週齢の雄免疫不全ＣＩＥＡ－ＮＯＧマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に対し、右下側腹部に１，０００万個の２２Ｒｖ１細胞を皮下移植し、腫瘍移植の１日後に尾静脈注射により１，０００万個のヒトＰＢＭＣを加えた。この動物に対し、腫瘍移植の１日後に尾静脈注射により開始して、１、５、９、及び１３日目に１００μｇの多重特異性抗体またはビヒクルを処置した。キャリパーを使用して腫瘍体積を定量化し、２５日間記録した。

【0189】

図１３は、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植モデルの結果を示す。バイパラトピックＰＳＭＡ×ＣＤ３分子（３５０１２３）は、腫瘍異種移植モデルにおいて２２Ｒｖ１腫瘍増殖の阻害を示した。各処置群について３匹のマウスを試験し、各動物の腫瘍体積の変化を、立法ミリメートルでプロットした。動物に腫瘍移植後１日目にＰＢＭＣを投与し、１、５、９、及び１３日目に抗体で処置した。多重特異性抗体を処置した３匹の動物のうちの２匹が腫瘍進行の遅延を示した。

【0190】

本発明の好適な実施形態を、本明細書中に示し、記載してきたが、そのような実施形態が単に例示として示すものに過ぎないことは、当業者には自明であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置換を見出すであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する様々な代替手段が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】