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特表2022-526607人工的代謝を有する動的材料を生成するためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-25
(54)【発明の名称】人工的代謝を有する動的材料を生成するためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20220518BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220518BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220518BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220518BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20220518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12M1/00 A
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6844 Z
C12P21/00 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559261
(86)(22)【出願日】2020-04-03
(85)【翻訳文提出日】2021-11-16
(86)【国際出願番号】 US2020026680
(87)【国際公開番号】W WO2020206326
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】62/829,702
(32)【優先日】2019-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508298488
【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ダン・ルオ
(72)【発明者】
【氏名】▲浜▼田 省吾
(72)【発明者】
【氏名】ケネス・ジーン・ヴァンシー
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QX01
4B064AG01
4B064CA21
(57)【要約】
本開示は、規則構造および人工的代謝を有する動的材料の生成に関する。本明細書で開示されるアプローチは、不可逆的合成（および場合により分解）および散逸的集合プロセスの両方を同時に結び付けることによって、構造的階層を有する材料の自律的かつ動的生成を、人工的な様式で可能にする。例示的な実施形態のように、階層的ＤＮＡ集合・合成（または「ＤＡＳＨ：ＤＮＡ－ｂａｓｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ」）素材が生成された。素材を生成するためのシステム、装置、試薬および方法、ならびに本方法論のさらなる適用が開示される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するためのシステムであって、装置および生成ミックスを含み、
ここで該生成ミックスは、ポリマーを形成するための成分を含む試薬であり、
ここで該装置は、それを通過する溶液の有向の流れを可能にするよう設計されたメインチャンバーを含み、該メインチャンバーは、装置において合成されたポリマーの集合を開始および促進し、該材料を形成するように、生成ミックスを含む溶液の有向の流れにおける渦度を引き起こす障害物を含む、前記システム。
【請求項2】
メインチャンバーは、少なくとも１つの入口ポートを通ったメインチャンバーへの生成ミックスを含む溶液の注入、ならびに少なくとも１つの入口ポートからメインチャンバーを通って少なくとも１つの出口ポートへの流れを可能にする、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
ポリマーを脱重合するための試薬を含む分解ミックスをさらに含む、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項4】
メインチャンバーは、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を別々に注入するための少なくとも２つの入口ポートを含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
メインチャンバーは、３つの入口ポートを含み、ここで真ん中の入口ポートは生成ミックスを含む溶液を注入するためのものであり、ここで２つの外側の入口ポートは分解ミックスを含む溶液を注入するためのものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項6】
装置は複数のメインチャンバーを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項7】
前記材料は静的パターンを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項8】
前記材料は動的パターンを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項9】
パターンは移動挙動であるか、または２つの移動体の間の競争挙動である、請求項８に記載のシステム。
【請求項10】
ポリマーはＤＮＡである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項11】
ポリマーはＲＮＡである、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項12】
生成ミックスはｄＮＴＰ、鋳型核酸、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項13】
プライマーおよび鋳型核酸は、メインチャンバーに供給される前にアニーリングされる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項14】
鋳型核酸は環状ＤＮＡである、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項15】
ＤＮＡポリメラーゼはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項16】
分解ミックスは１つまたはそれ以上のヌクレアーゼを含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項17】
生成ミックスは検出可能な信号を生じる試薬を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項18】
ポリマーはＤＮＡであり、生成ミックスは（ｉ）ｄＮＴＰ、鋳型核酸、およびＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）ｄＮＴＰ、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ、または（ｉｉｉ）ｄＮＴＰ、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびリガーゼを含む、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項19】
メインチャンバーは少なくとも実質的に平面形状を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項20】
メインチャンバーは、有向の流れの方向に沿ってミクロンからミリメートルスケールの寸法を有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項21】
規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するための方法であって、装置および生成ミックスを提供する工程であって、
ここで該生成ミックスは、ポリマーを形成するための成分を含む試薬であり、ここで該装置は、それを通過する溶液の有向の流れを可能にするよう設計されたメインチャンバーを含み、該メインチャンバーは、溶液の有向の流れにおける渦度を引き起こす障害物を含む、工程；ならびに
生成ミックスを含む溶液をメインチャンバーに供給し、メインチャンバーを通った溶液の流れを方向づけ、それによってポリマーの合成および合成されたポリマーの集合を可能にして、該材料を形成する、工程
を含む、前記方法。
【請求項22】
メインチャンバーは、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートを含み、ここで生成ミックスを含む溶液は、少なくとも１つの入口ポートを通ってメインチャンバーに注入され、少なくとも１つの入口ポートからメインチャンバーを通って少なくとも１つの出口ポートへ流れるよう方向づけられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するための方法であって、装置、生成ミックス、および分解ミックスを提供する工程であって、
ここで該生成ミックスは、ポリマーを形成するための成分を含む試薬であり、該分解ミックスはポリマーを脱重合するための成分を含み、
ここで該装置は、それを通過する溶液の有向の流れを可能にするよう設計されたメインチャンバーを含み、予め定められたパターンで間隔を保たれ、溶液の有向の流れにおける渦度の発生を可能にする形状およびサイズである障害物を有する、工程；ならびに
生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を装置のメインチャンバーに供給し、メインチャンバーを通って溶液の流れを方向づけてポリマー合成および集合のプロセスならびにポリマー分解のプロセスが自律的に、かつ組み合わせで起こることを可能にし、それによって該材料を形成する、工程
を含む、前記方法。
【請求項24】
メインチャンバーは、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を別々に注入するための少なくとも２つの入口ポートを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
メインチャンバーは、３つの入口ポートを含み、ここで真ん中の入口ポートは生成ミックスを含む溶液を注入するためのものであり、ここで２つの外側の入口ポートは分解ミックスを含む溶液を注入するためのものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液は同時に、連続的に、または予め定められた順序でメインチャンバーに注入される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
生成された材料のパターンを可視化する工程をさらに含む、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
可視化は裸眼、カメラ、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、または電子顕微鏡によって達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記材料は静的パターンを有する、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記材料は動的パターンを有する、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
パターンは、移動挙動、または２つの移動体の間の競争挙動である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ポリマーはＤＮＡである、請求項２１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
ポリマーはＲＮＡである、請求項２１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
生成ミックスはｄＮＴＰ、鋳型核酸、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
プライマーおよび鋳型核酸は、メインチャンバーに供給される前にアニーリングされ、ここで、場合により該鋳型核酸は環状ＤＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
ＤＮＡポリメラーゼはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項37】
分解ミックスは１つまたはそれ以上のヌクレアーゼを含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
生成ミックスは検出可能な信号を生じる試薬を含む、請求項２１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
メインチャンバーは平面形状を有する、請求項２１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
メインチャンバーはミクロンからミリメートルスケールの寸法を有する、請求項２１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
請求項２１～４０のいずれか１項に記載の方法に従って製造される材料。
【請求項42】
病原体の核酸を検出するための方法であって、装置、生成ミックス、および試料を提供する工程であって、
ここで該生成ミックスは、（ｉ）プライマーなしで、ｄＮＴＰ、鋳型核酸、およびＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｉ）鋳型核酸なしで、ｄＮＴＰ、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ；または（ｉｉｉ）ｄＮＴＰ、鋳型ＤＮＡ、プライマー、およびリガーゼを含む試薬であり、ここで該鋳型ＤＮＡは該病原体の核酸および該リガーゼの存在下で環状化し、
ここで該装置は、それを通過する溶液の有向の流れを可能にするよう設計されたメインチャンバーを含み、該メインチャンバーは、溶液の有向の流れにおける渦度を引き起こす障害物を含む、工程；ならびに
メインチャンバーに（ｉ）生成ミックスおよび試料を含む溶液または（ｉｉ）生成ミックスを含む溶液を供給する工程であって、ここで鋳型ＤＮＡは試料およびリガーゼで処理され、試料中に該病原体の核酸が存在する場合に鋳型ＤＮＡの環状化を可能にする、工程；ならびに
メインチャンバーを通った溶液の流れを方向づけ、それによってポリマーの合成および合成されたポリマーの集合を可能にし、試料中に病原体の核酸が存在する場合に規則構造および人工的代謝を有するＤＡＳＨ素材を形成する、工程
を含む、前記方法。
【請求項43】
メインチャンバーは、少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートを含み、ここで生成ミックスを含む溶液は、少なくとも１つの入口ポートを通ってメインチャンバーに注入され、少なくとも１つの入口ポートからメインチャンバーを通って少なくとも１つの出口ポートへと流れるよう方向づけられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
メインチャンバーはミクロンからミリメートルスケールの寸法を有し、平面形状を有する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項45】
病原体の核酸はＤＮＡである、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
病原体の核酸はＲＮＡである、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
病原体は細菌、菌類またはウイルスである、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
ＤＮＡポリメラーゼはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
生成ミックスは検出可能な信号を生じる試薬を含む、請求項４２～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
試薬はＤＮＡに結合する蛍光化合物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
ハイブリッド材料を製造する方法であって、請求項２１～４０のいずれか１項に記載の方法に従って規則構造および人工的代謝を有する材料を生成する工程であって、ここでポリマーはＤＮＡである、工程、ならびに
集合したＤＮＡから形成される該材料に結合する試薬を含む溶液をメインチャンバーに注入し、それによってハイブリッド材料を形成し、ここで集合したＤＮＡから形成された規則構造および人工的代謝を有する材料は該試薬と結合する、工程
を含む、前記方法。
【請求項52】
試薬はアビジンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
酵素（ＨＲＰのような）または量子ドットと結合するビオチンを含む溶液をメインチャンバーにさらに注入する、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
試薬は金ナノ粒子を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項55】
無細胞タンパク質発現の方法であって：請求項２１～４０のいずれか１項に記載の方法に従って規則構造および人工的代謝を有する材料を生成する工程であって、ここでポリマーはＤＮＡである、工程、ならびに
無細胞タンパク質発現溶液をメインチャンバーに注入し、材料中のＤＮＡによってコードされるタンパク質の生成を可能にする、工程
を含む、前記方法。
【請求項56】
規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するための装置のメインチャンバーのための障害物を設計するための方法であって：規則構造を有する材料を生成するためのメインチャンバーを定義する工程；
その中で生成される材料のパターンを定義する工程；ならびに
メインチャンバー内および隣接する障害物間の最短の経路に沿って溶液の流れを方向づけるのに必要な装置のメインチャンバー中の複数の障害物のサイズ、形状および位置を決定する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み入れる、２０１９年４月５日に出願した米国仮出願第６２／８２９，７０２号の優先権を主張するものである。
本出願は、全体が参照により本明細書に組み入れる、２０１９年４月５日に出願した米国仮出願第６２／８２９，７０２号の優先権を主張するものである。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた認可番号第ＥＦＲＩ－１３３１５８３号および第ＳＮＭ－１５３０５２２号で政府援助を受けて実施された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた認可番号第ＥＦＲＩ－１３３１５８３号および第ＳＮＭ－１５３０５２２号で政府援助を受けて実施された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
配列表の参照による組み込み
２０２０年３月３０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標局に提出された、３７２５５ＰＣＴ＿７７８７＿０２＿ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイル中の配列表を、参照により本明細書に組み入れる。
２０２０年３月３０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標局に提出された、３７２５５ＰＣＴ＿７７８７＿０２＿ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイル中の配列表を、参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【0004】
生物の動的な自己生成等の生命の特徴的な性質は、代謝によって維持されている。物質およびエネルギーの流れを用いて、一連の生物学的反応によって成分から不可逆的に分子が合成され、次いでさらに動的に集合して高分子、さらにそれ以上になり、生命の材料の構造的階層が生じる。生体工学によって動的材料を設計する種々のアプローチが報告されているが、一から代謝を模倣することによる材料の構築は達成されていない。例えば、設計された生物材料は、生命による材料生成を可能にするが、報告されているアプローチは、材料を生成する細胞のような、外的な生物系に依存している。同様に、能動的な細胞骨格のような他の動的生体材料は、生命によって設計された既存の代謝を直接使用する。一般に、生命工学的アプローチは、洗練された能動的な挙動を備えた新しい動的生体材料を作り出す可能性を有するが、現在のアプローチは、生命の既存の代謝に基づき、そのため生命の既存の代謝に根本的に限定される。種々の化学的アプローチ、特に散逸的自己集合は、化学反応を使用したゼロからの動的材料の構築を可能にした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、規則構造および人工的代謝を有する動的材料を生成するためのシステムおよび方法に関する。自然界で見られる代謝に類似して、本明細書で開示されるアプローチは、不可逆的合成（および場合により分解）ならびに散逸的集合プロセスの両方を同時に結び付けることによって、構造的階層を有する材料の自律的および動的生成を、人工的な様式で可能にする。人工的代謝は、集合と組み合わせた合成のボトムアップ設計によって、分子および反応、例えば、生命自体に制限されないが、生体分子および生体反応を使用して設計される。
【0006】
本システムおよび方法論を説明するために、ならびに例示的実施形態として、人工的代謝を使用して生体分子の構築用ブロックから動的材料を作り出すメソスケールのアプローチを使用して、階層的ＤＮＡ集合・合成（または「ＤＡＳＨ：ＤＮＡ－ｂａｓｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ」）素材が生成された（図１Ａ）。生体における材料と類似して、ＤＡＳＨによって生成された材料は、同化作用を介してプリコードされたパターンに合成および集合し得る。さらに、同化作用（生成）を異化作用（分解）と統合することによって、生来の時間空間的フィードバックに応答して規則正しく生成および分解の両方を組み合わせることによって、生成された材料を自律的に分解し、ｉｎ ｓｉｔｕで周期的に再生させることもできる。様々なパターンを有するＤＡＳＨ素材が生成された。また、スライド金型に似た創発的（ｅｍｅｒｇｅｎｔ）「移動」挙動を示すＤＡＳＨ素材が生成された。さらに、創発的な競争挙動を示す２つの移動体（ｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ ｂｏｄｙ）を有するＤＡＳＨ素材もまた、生成された。本明細書で開示される動的材料は、ハイブリッド材料を形成するためのさらなる機能化のための足場として利用し得る。材料がＤＡＳＨ素材である実施形態において、材料は、（無細胞タンパク質発現のような）無細胞設定におけるＤＮＡの機能を提供するためのプラットフォームとして働き得る。さらに、本明細書で開示される、動的材料を生成するための本システムおよび方法は、病原体検出に適用し得る。
【0007】
ある態様において、本開示は、規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するためのシステムを提供する。システムは、装置および生成ミックス（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｘ）を含み、ここで該生成ミックスは、ポリマーを形成するための成分を含む試薬であり、ここで該装置は、装置において合成されたポリマーの集合を開始および促進し、それによって材料を形成するように、それを通る溶液の有向の流れを可能にし、予め定められたパターンで間隔を保たれ、生成ミックスを含む溶液の有向の流れにおける渦度の発生を可能にする形状およびサイズである障害物を有するよう設計されたメインチャンバーを含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、装置は、フローセルの形態であり、メインチャンバーは少なくとも１つの入口ポート、および少なくとも１つの出口ポートを含む。生成ミックスを含む溶液は、少なくとも１つの入口ポートから、メインチャンバーを通って、すなわち障害物の間の流路または空間を通って、少なくとも１つの出口ポートへ流れるよう方向づけられる。いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、ミクロン範囲の寸法、例えばマイクロ流体チャンバー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｍｂｅｒ）を有する。いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、平面形状を有する。
【0009】
いくつかの実施形態において、システムは、生成ミックスおよび装置に加えて、分解ミックス（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｘ）をさらに含み、ここで該分解ミックスは、生成ミックスによって生成されたポリマーを脱重合する試薬を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を受け取ること、ならびに有向の流れを可能にするよう設計される。いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を別々に注入するための少なくとも２つの入口ポート、ならびに少なくとも１つの出口ポートを含み、ここでメインチャンバーを通った溶液の有向の流れの上で、ポリマー合成および集合のプロセスならびにポリマー分解のプロセスは自律的に、かつ組み合わせで起こり、規則構造および人工的代謝を有する材料の形成につながる。
【0011】
いくつかの実施形態において、本システムによって生成された材料は、任意の形状および形態をとり得る静的パターンを有する。いくつかの実施形態において、生成された材料は、例えば創発的移動挙動を示すか、または競争挙動を示す２つの移動体を有する、動的パターンを有する。
【0012】
いくつかの実施形態において、装置は、生成し得る材料のパターンのタイプを拡張する、複数のメインチャンバーを含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、ポリマーはＤＮＡであり、生成された材料はまた、ＤＡＳＨ素材と呼ばれる。いくつかの実施形態において、生成ミックスは、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、鋳型核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、プライマーおよび鋳型は、メインチャンバーに注入される前にアニーリングし得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は環状ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、プライマーおよびリガーゼの存在下で直鎖ＤＮＡから形成された環状ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、分解ミックスは、例えばエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、デオキシヌクレアーゼを含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、生成ミックスは、生成された材料を見るのを容易にする、検出可能な信号（例えば、蛍光）を生じる試薬を含む。
【0015】
さらなる態様において、本開示は、規則構造および人工的代謝を有する材料を生成するための方法を提供する。
【0016】
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載される装置および生成ミックスを提供する工程、生成ミックスを含む溶液を装置のメインチャンバーに供給する工程、ならびにメインチャンバーを通る溶液の流れを方向づけ、それによってポリマーの合成および合成されたポリマーの集合を可能にして材料を形成する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、フローセルの形態の装置を利用し、メインチャンバーは少なくとも１つの入口ポート、および少なくとも１つの出口ポートを含む。生成ミックスを含む溶液は、少なくとも１つの入口ポートからメインチャンバーを通って、すなわち障害物の間の流路または空間を通って、少なくとも１つの出口ポートへ流れるよう方向づけられることができる。
【0017】
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載される装置、生成ミックス、および分解ミックスを提供する工程、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を装置のメインチャンバーに供給する工程、ならびにメインチャンバーを通った溶液の流れを方向づけ、それによって材料を生成する工程を含む。いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液を別々に注入するための少なくとも２つの入口ポート、ならびに少なくとも１つの出口ポートを含み、ここでメインチャンバーを通る溶液の有向の流れの上で、ポリマー合成および集合のプロセスならびにポリマー分解のプロセスは自律的に、かつ組み合わせで起こり、規則構造および人工的代謝を有する材料の形成につながる。生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液は、同時に、連続的に、または予め定められた順序でメインチャンバーに注入し得る。
【0018】
生成された材料は、裸眼、カメラ、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、または電子顕微鏡によって可視化し得る。
【0019】
別の態様において、本開示は、病原体の核酸を検出するためのシステムおよび装置を提供する。この態様に従って、本明細書に記載される装置および生成ミックスが利用される。しかしながら、ＤＮＡ合成およびＤＡＳＨ素材の生成は、試料中に標的病原体核酸が存在する場合にのみ生じる。いくつかの実施形態において、生成ミックスはｄＮＴＰ、最初の直鎖形態の鋳型ＤＮＡ、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで鋳型ＤＮＡは病原体の核酸、リガーゼの存在下で環状化し、環状化ＤＮＡは装置においてＤＮＡ合成のための鋳型として機能する（例えば、ローリングサークル増幅を介して）。これらの実施形態において、最初の直鎖状形態の鋳型ＤＮＡを、メインチャンバーに供給する前に、試験される試料およびリガーゼと接触させて、試料中に標的病原体核酸が存在する場合に鋳型ＤＮＡの環状化を可能にすることができる。あるいは、最初の直鎖状形態の鋳型ＤＮＡは、生成ミックス中の他の成分、リガーゼ、および試料とともに、メインチャンバーに供給され、環状化、ならびにポリマー合成および集合は、メインチャンバーにおいて起こる。他の実施形態において、鋳型核酸なしでｄＮＴＰ、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む生成ミックスが利用される。病原体の標的核酸は、試料中に存在する場合、ポリマー合成のための鋳型として働く。さらに他の実施形態において、プライマーなしでｄＮＴＰ、鋳型核酸、およびＤＮＡポリメラーゼを含む生成ミックスが利用される。病原体の標的核酸は、試料中に存在する場合、ポリマー合成のためのプライマーとして働く。検出は、生成ミックス（および、いくつかの実施形態においては試料）を含む溶液を装置のメインチャンバーに供給すること、ならびにメインチャンバーを通る溶液の流れを方向づけることによって達成し得、それによって、試料中に病原体の核酸が存在する場合、ＤＮＡの、規則構造および人工的代謝を有する材料への生成および集合が可能になり、ここで材料の生成は病原体核酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、病原体の核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、病原体の核酸はＲＮＡである。
【0020】
さらなる態様において、本明細書で生成される材料は、さらなる機能性材料を生成するための足場として使用される。いくつかの実施形態において、ＤＡＳＨ素材を、ＤＡＳＨ素材が形成された装置のメインチャンバーに供給されるＤＮＡ結合試薬と接触させる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合試薬は、例えばアビジン、量子ドット、および金ナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合試薬と結合したＤＡＳＨ素材はさらに機能化し得、例えば、アビジンと結合したＤＡＳＨ素材は、ビオチン複合酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と接触させ得る。
【0021】
別の態様において、ＤＡＳＨ素材を使用して、無細胞タンパク質発現が提供される。
【0022】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に記載される材料を生成するための装置のメインチャンバーに配置される障害物を設計するための方法を提供する。方法は、規則構造を有する材料を生成するためのメインチャンバーを定義する工程、そこで生成される材料のパターンを定義する工程、ならびに、メインチャンバー内かつ隣接する障害物の間の最短経路に沿って溶液の流れを方向づけるのに必要な、装置のメインチャンバー中の複数の障害物のサイズ、形状および位置を決定する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1-1】図１Ａ～１Ｋは、ＤＡＳＨおよび生成された材料を示す図である。（Ａ）人工的代謝の同化作用／異化作用経路を説明する。（Ｂ）～（Ｃ）ＤＡＳＨの実行。（Ｂ）ＲＣＡによる前駆体ＤＮＡの合成。（Ｃ）、マイクロ流体装置において障害物とともに流れを使用した散逸的集合によるＤＡＳＨパターンの形成。（Ｄ）～（Ｋ）生成されたＤＡＳＨパターン。（Ｄ）最大１５μｍ幅の一次元の線。（Ｅ）、最小幅を有する一次元の線。（Ｆ）二次元の網目パターン。（Ｇ）二次元の図（二重らせんパターン）。（Ｈ）二次元の図（正方形）。（Ｉ）～（Ｋ）二次元の図（Ｄ、Ｎ、Ａの文字の形状）。サブ図（ｓｕｂｆｉｇｕｒｅ）Ｄ～Ｆ中の点線は、障害物の境界を示す。設計のさらなる詳細については、図２８～４２を参照のこと。スケールバー：（Ｄ）～（Ｆ）１０μｍ、（Ｇ）１００μｍ、（Ｈ）５０μｍ、（Ｉ）～（Ｋ）１００μｍ。全ての流速：０．１μＬ／分。
【図2-1】図２Ａ～２Ｈは、ＤＡＳＨパターンの詳細な形態学的および流体力学的研究を示す図である。Ａ～Ｄ ＤＡＳＨパターンの詳細な画像である。（Ａ）柱およびＤＡＳＨパターンの両方を示す、共焦点蛍光顕微鏡観察による明視野および緑色蛍光チャンネルのオーバーレイ。スケールバー＝５０μｍ。（Ｂ）再構成されたＡの三次元画像。点線は柱の境界を示す。（Ｃ）ＤＡＳＨパターンのＳＥＭ観察。スケールバー＝１０μｍ。（Ｄ）（Ｃ）のクローズアップ画像。球状構造が埋め込まれた異方性のネットワークが観察された。スケールバー＝１μｍ。（Ｅ）～（Ｈ）ＤＡＳＨパターン生成の流体力学的研究。（Ｅ）生成プロセスのタイムラプス録画からのスナップ写真（実験結果）。（Ｆ）～（Ｈ）ＣＦＤシミュレーション結果。（Ｆ）流速ベクトル地図。横のサブ図は、星印で示される、対応する位置の断片を示す。（Ｇ）流速ヒートマップ。（Ｈ）流速ヒートマップ。点線の矢印は、流れの方向を示す。全ての流速：０．１μＬ／分。
【図3-1】図３Ａ～３Ｉは、人工的代謝によって駆動される機械としてのＤＡＳＨパターンの動的挙動を示す図である。（Ａ）～（Ｃ）静的位置での連続的な生成および分解挙動。（Ａ）装置および流れの結線図。（Ｂ）ＦＳＡによる挙動の抽象的な表示。（Ｃ）タイムラプス録画からのスナップ写真（２、３、４、５時間）およびＤＡＳＨパターンの位置での平均蛍光強度プロット。（Ｄ）～（Ｆ）創発的移動挙動。Ｄ、ＦＳＡおよびプログラム。ＦＳＡの設計は、変化した流れの信号の受信／発信によって拡張される。各ＦＳＡを単位として使用することによって、変化した流れの信号を介して連続的にそれらを連結させることで、挙動がプログラムされた。開始から成長への状態遷移までの異なる待ち時間（ｔ１＜ｔ２＜．．．＜ｔ６）をパラメータとして使用する。解釈は、プログラムの同等な実験的実行を示す。（Ｅ）実験において使用されたトラックの最終的な設計の詳細。（Ｆ）狭いトラックにおける体の移動を示す、スナップ写真および質量中心プロット（原点からのｘ軸距離）（６０分、７５分、９２．５分）。（Ｇ）～（Ｉ）２つの移動体の間の創発的競争挙動。（Ｇ）２つの移動挙動プログラム（Ｄ）を２つのトラックの間の信号と平行に配置することによって達成される挙動についての、対応するプログラム。（Ｈ）実際の実行についてのプログラムの解釈。（Ｉ）挙動のスナップ写真。両方のトラックによって体が生成され（７５分）、次いで上流に向かって移動が開始された（１０７．５分）。一度対称が破れると、トラック番号２の体は競争を先導し（点線）、トラック番号１の体は、体を分解することによって速度を落とし始めた（１２７．５分）。ゴールに到達することによってトラック番号２の体が競争に勝利した後（１３５分）、トラック番号１の体は完全に分解された（約１８０分）。生成用および分解ミックスの両方について、適用された流速は：（Ｃ）０．１μＬ／分。（Ｆ）、（Ｉ）、０．１５μＬ／分であった。
【図4-1】図４Ａ～４Ｅは、ＤＡＳＨ素材の他の適用を示す図である。（Ａ）生成されたＤＡＳＨパターンによる病原体ＤＮＡ／ＲＮＡ検出。５００および５０ｐＭの陽性の試料が、生成されたパターンによって成功裏に検出された。２塩基対のミスマッチを有する非標的配列を使用した対照試料では、パターン生成がなかった。（Ｂ）～（Ｄ）ハイブリッド材料。（Ｂ）蛍光分子複合アビジン結合。３つの入口を有する装置（３－ｉｎｌｅｔ ｄｅｖｉｃｅ）を使用することによって、二色の勾配が達成された（中央の流れ：テキサスレッド（赤色）、横の流れ：ＦＩＴＣ（緑色））。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）アビジン結合によって媒介される、量子ドット付着。スケールバー＝１０μｍ。（Ｄ）暗視野顕微鏡観察によって観察された、ＤＡＳＨパターン上のＤＮＡ結合金ナノ粒子付着。スケールバー＝１０μｍ。（Ｅ）ｓｆＧＦＰに対するレポーター遺伝子を組み込むＤＡＳＨパターンからの無細胞タンパク質発現。エラーバーは標準偏差を示す。ＤＡＳＨパターン生成の間に適用された全ての流速：０．１μＬ／分。
【図5】生成の種（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｅｄ）の調製の結線図である。鋳型およびプライマーＤＮＡを等モル比で混合し、次いで９５℃から４℃までアニーリングした。ハイブリダイゼーションされた溶液にＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で一晩インキュベートしてライゲーションさせた。
【図6】ＤＡＳＨ装置の全体的な装置のレイアウトを示す図である。５００μｍ幅のメインチャンバー；入口（正方形）／出口（家形）ポートに連結された５０μｍ幅の流路。
【図7】（Ａ）～（Ｈ）ＤＡＳＨパターンの標準的な構造体要素を示す図である。ＤＡＳＨパターンは、連結図で記載される、「一直線（Ｓｔｒａｉｇｈｔ）」、「分かれる（Ｄｉｖｉｄｅ）」、および「併合する（Ｍｅｒｇｅ）」のような３つの要素の組み合わせに単純化することができる。節点は柱または障害物に変換される；つながり（ｌｉｎｋ）は実際のＤＡＳＨ構造に変換される。実際の障害物の表示は、層状の流れを変化させて特定の点で渦度を生じさせ得る、三角形、正方形、または他のタイプの形状であり得る。境界は、装置内の流れの対称性を考慮することによって排除し得る。
【図8】ＤＡＳＨ生成の実験の構成を示す図である。ＤＡＳＨ装置は、配管およびシリンジに連結されていた。シリンジポンプが、一定の流速で生成ミックスを注入する。
【図9】ＤＡＳＨデータ解析ソフトウエアの全体的なプロセスを示す図である。結線図は、ソフトウエアの全体的な流れを示す。
【図10】３つのチャンバーを有する装置（３－ｃｈａｍｂｅｒ ｄｅｖｉｃｅ）内の速度マッピングのＣＦＤシミュレーションを示す図である。入口からの流速は、（Ａ）０．１１５５μＬ／分；（Ｂ）０．２３１μＬ／分；（Ｃ）０．４６２μＬ／分として設定した。（Ｃ）は高い流量のために異なるスケールバーを有することに留意されたい。
【図11】３つのチャンバーを有する装置内の渦度マッピングのＣＦＤシミュレーションを示す図である。入口からの流速は、（Ａ）０．１１５５μＬ／分；（Ｂ）０．２３１μＬ／分；（Ｃ）０．４６２μＬ／分として設定した。
【図12】生成開始時間解析に使用した試料ＳＮＲデータを示す図である。凡例は、装置の特徴的な流速と対応する（紫（高）－水色（低）；詳細については補充書面参照）。最初の高信号／信号の減少は、試料中の比較的低い雑音によるものであり（すなわち、ＤＡＳＨパターンがないだけでなく、雑音値が低かった）、そのため測定に関して無視した。信号比が増加し始め、第一のフレームが２．０のＳＮＲ値を超える時点（フレーム）（赤色の点線で示す）を、パターン生成開始時間として使用した。
【図13】異なる柱の形状を有する２つの装置の流速ヒートマップである。（Ａ）正方形の柱の装置（＃３－１）；（Ｂ）菱形の柱の装置（＃３－２）。両方のヒートマップの全体的な流速分布は同等であった。
【図14】異なる柱の形状を有する２つの装置の流速ヒートマップを示す図である。（Ａ）正方形の柱の装置（＃３－１）；（Ｂ）菱形の柱の装置（＃３－２）。柱の横の高い渦度は、正方形の柱の装置でのみ観察された。
【図15】ＤＡＳＨパターン発生の柱の形状の比較を示す図である。赤色：正方形の柱の装置（＃３－１）；青色：菱形の柱の装置（＃３－２）。Ｓ／Ｎの増加の時間差は、正方形の柱の装置（より高い渦度）が、菱形の柱の装置（より低い渦度）よりも速くパターンを生成し始めたことを表す。
【図16】生成／分解プロセスの間のＣＦＤシミュレーション（２つの入口からの粒子トレース）を示す図である。（Ａ）制御された蓄積が起こる前に、層状の流れが２つの領域（赤色／黒色）を作り出す；（Ｂ）制御された蓄積が開始されて流れを変化させる；（Ｃ～Ｄ）中央の大きい蓄積が２つのタイプの溶液を混合する。
【図17】静的位置での、繰り返されるＤＡＳＨパターンの生成／分解を示す図である。生成および分解の２つのサイクルが観察された（およそ３７０～４００分で第一のピーク、次いでおよそ６８０分で第二のピーク）。
【図18】ＤＡＳＨによって駆動されるＤＮＡ／ＲＮＡ検出を示す図である。検出プロセスは３つの工程：認識、増幅、および読み出しを有する。ＤＡＳＨパターン生成および認識は、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを使用した認識工程に続く、増幅（酵素的合成および流れに基づく集合（ｆｌｏｗ－ｂａｓｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ）ならびに読み出し（メソスケールのパターン）の両方を達成する。
【図19A】陽性ＣＭＶ標的試料由来の、生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音（ＳＮＲ：ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ）比を示す図である。（Ａ）画像において生成されたＤＡＳＨパターンの電力対電力比（ｐｏｗｅｒ－ｔｏ－ｐｏｗｅｒ ｒａｔｉｏ）としてＳＮＲ値を得た（ＤＡＳＨパターンに対応する空間周波数由来の電力／他の空間周波数由来の総電力）。５００ｐＭおよび５０ｐＭの標的濃度由来の全ての試料はＤＡＳＨパターンを生成することができ、これはこの定量的ＳＮＲの表示とよく対応した。観察において、５ｐＭの試料はＤＡＳＨパターンを生成することができなかった。各試料由来の最高のＳＮＲの時点での対応する画像もまた示した（Ｂ）。
【図19B】陽性ＣＭＶ標的試料由来の、生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音（ＳＮＲ：ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｎｏｉｓｅ）比を示す図である。（Ａ）画像において生成されたＤＡＳＨパターンの電力対電力比（ｐｏｗｅｒ－ｔｏ－ｐｏｗｅｒ ｒａｔｉｏ）としてＳＮＲ値を得た（ＤＡＳＨパターンに対応する空間周波数由来の電力／他の空間周波数由来の総電力）。５００ｐＭおよび５０ｐＭの標的濃度由来の全ての試料はＤＡＳＨパターンを生成することができ、これはこの定量的ＳＮＲの表示とよく対応した。観察において、５ｐＭの試料はＤＡＳＨパターンを生成することができなかった。各試料由来の最高のＳＮＲの時点での対応する画像もまた示した（Ｂ）。
【図20A】非標的試料由来の生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音（ＳＮＲ）比を示す図である。（Ａ）全ての試料は閾値より低く、これは我々の観察とよく対応した（ＤＡＳＨパターンを生成しなかった）。各試料由来の最高のＳＮＲの時点での対応する画像もまた示した（Ｂ）。
【図20B】非標的試料由来の生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音（ＳＮＲ）比を示す図である。（Ａ）全ての試料は閾値より低く、これは我々の観察とよく対応した（ＤＡＳＨパターンを生成しなかった）。各試料由来の最高のＳＮＲの時点での対応する画像もまた示した（Ｂ）。
【図21】陽性および陰性標的試料を用いたＤＡＳＨパターンの平均強度対信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。同様の平均蛍光強度にもかかわらず（緑色＝５００ｐＭ、シアン＝５０ｐＭ、青色＝５ｐＭ；黒丸：パターンが検出された、白丸：パターンが検出されなかった）、５００および５０ｐＭの陽性試料は、ＤＡＳＨを使用して成功裏に検出された（Ｓ／Ｎの任意の閾値＝１５、灰色の点線として示す）。２塩基対のミスマッチを有する非標的配列を使用した陰性対照試料（黒色＝５００ｐＭ、灰色＝５０ｐＭ、薄い灰色＝５ｐＭ）は、同様の平均蛍光強度を生じたが、パターン生成はなかった。
【図22】ＤＡＳＨ－アビジン結合結果を示す図である。（Ａ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＤＮＡ）を示す緑色蛍光チャンネル；（Ｂ）アビジン－テキサスレッドコンジュゲートを示す赤色蛍光チャンネル。画像は、アビジンがＤＡＳＨパターンに成功裏に結合したことを示す。
【図23】ＤＡＳＨ－ストレプトアビジン結合結果を示す図である。（Ａ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＤＮＡ）を示す緑色蛍光チャンネル；（Ｂ）ストレプトアビジン－テキサスレッドコンジュゲートを示す赤色蛍光チャンネル。画像は、ストレプトアビジンがＤＡＳＨパターンに結合していないことを示す。
【図24】ＤＡＳＨ－量子ドット（Ｑｄｏｔ）付着結果を示す図である。全ての画像は、フィルター（励起光４２０ｎｍ、発光６０５ｎｍ）を含む同じ捕捉条件および画像の正規化を使用して撮影された。（Ａ）Ｑｄｏｔ付着後、さらなる１時間の洗浄の前の陽性試料；（Ｂ）結合を確認するための、サブ図ａの１時間の洗浄の後。全体的なバックグラウンドが減少しているが、ＤＡＳＨパターンへのＱｄｏｔ付着が残っていることに留意されたい；（Ｃ）アビジン結合のない陰性対照試料。いくつかのＱｄｏｔは集合するようになったが、ＤＡＳＨパターンに付着していなかった（サブ図ａと比較して、結合していないＱｄｏｔによる高いバックグラウンドを参照）；（Ｄ）（Ａ）のクローズアップ画像。ＤＡＳＨ構造へのＱｄｏｔの均一な付着の成功が、この方法によって達成された。
【図25】ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰパターンを示す図である。ＤＡＳＨパターンの橙色／赤色濃淡は、構造へのＡｕＮＰの付着の成功を示す。
【図26】ＤＡＳＨパターン由来のＣＦＰＥの直接的観察を示す図である。ａ．ＣＦＰＥの前のＤＡＳＨ装置の観察。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素で染色したために、ＤＡＳＨパターンは青色で示した。（Ａ）（左）ＤＡＳＨ生成のない装置。（右）ＤＡＳＨ生成のある装置；（Ｂ）ＣＦＰＥの後。（左）ＤＡＳＨ生成がなく、ＣＦＰＥの後の装置。（右）ＣＦＰＥの後の、ＤＡＳＨ生成のある装置。
【図28】（Ａ）～（Ｃ）設計＃３－１を示す図である。構成：一次元の線（最大１５μｍ幅）。１つの入口／１つの出口。柱に基づく（ｐｉｌｌａｒ－ｂａｓｅｄ）（仮想境界）。ねじれ型の幾何学的形状を有する５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。ねじれ型の柱の間の１５μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察；典型的なチャンバーよりも短い全長。
【図29】（Ａ）～（Ｃ）設計＃４－５を示す図である。構成：一次元の線（最小幅）。１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ）（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の０μｍの横方向距離。横のバイパス流路；過成長による閉塞を減少させるための、チャンバーの入口および出口のさらなる柱。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図30】（Ａ）～（Ｃ）設計＃９－１を示す図である。構成：ジグザグの線（二次元の網目パターンを作り出す）。１つの入口／１つの出口。柱に基づく（仮想境界）。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察
【図31】（Ａ）～（Ｃ）設計＃１８－３を示す図である。構成：「ＤＮＡ二重らせん」パターンを有する二次元形状。それぞれが３つの流路に分かれた１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には０μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図32-1】（Ａ）～（Ｃ）設計＃３－３を示す図である。構成：二次元の正方形（正方形の境界を有する一次元の線）。１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の０μｍの横方向距離。縦に並んで配置された３つの正方形の装置（正方形の境界のチャンバー幅が異なる）。
【図33】（Ａ）～（Ｃ）設計＃８－２を示す図である。構成：「文字Ｄ」パターンを有する二次元図。１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には０μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図34】（Ａ）～（Ｃ）設計＃１１－２を示す図である。構成：「文字Ｎ」パターンを有する二次元図。１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には０μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察
【図35】（Ａ）～（Ｃ）設計＃５－１を示す図である。構成：「文字Ａ」パターンを有する二次元図。１つの入口／１つの出口。障害物に基づく（物理的境界）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。三角形の障害物の頂点の間の、典型的には０μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図36A】（Ａ）～（Ｂ）設計＃１４－２を示す図である。構成：ジグザグの線（二次元の網目パターンを作り出す）；９－１設計の別形（同一の柱設計）。３つの入口／１つの出口、入口２は２つの側に分かれている。柱に基づく（仮想境界）。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。生成－分解実験のための最適化された設計。
【図36B】（Ａ）～（Ｂ）設計＃１４－２を示す図である。構成：ジグザグの線（二次元の網目パターンを作り出す）；９－１設計の別形（同一の柱設計）。３つの入口／１つの出口、入口２は２つの側に分かれている。柱に基づく（仮想境界）。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。生成－分解実験のための最適化された設計。
【図37A】（Ａ）～（Ｂ）設計＃２０－２を示す図である。構成：さらなるＴ字路モジュールと統合された、＃１４－２と同じ装置。再生実験のための、最適化された設計。
【図37B】（Ａ）～（Ｂ）設計＃２０－２を示す図である。構成：さらなるＴ字路モジュールと統合された、＃１４－２と同じ装置。再生実験のための、最適化された設計。
【図38】（Ａ）～（Ｂ）設計＃１２－１を示す図である。構成：一次元の線。同じ源から３つの個々のチャンバーに分かれている、１つの入口／１つの出口。３－１設計の別形（同一の柱設計）。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。流速－ＤＡＳＨ生成測定試験のための、最適化された設計。
【図39】（Ａ）～（Ｃ）設計＃３－２を示す図である。構成：渦度比較のための、３－１の別形（正方形の代わりに、菱形の柱）［同等の流速を有するように、３－１と同じ柱の幅、同じ位置、同じ数］。一次元の線（菱形の柱）。１つの入口／１つの出口。柱に基づく（仮想境界）。ねじれ型の幾何学的形状を有する５０μｍの距離（流れの方向に沿って）。ねじれ型の柱の間の１５μｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察；典型的なチャンバーよりも短い全長。
【図40】（Ａ）～（Ｂ）設計＃２２－３を示す図である。構成：ＤＡＳＨによって駆動される移動のための、様々な横方向の柱の距離を有する＃１４－２の別形。一次元の線（広いトラック）。３つの入口／１つの出口、入口２は２つの側に分かれている。柱に基づく（仮想境界）。トラック幅：５００μｍ；隣接する柱の間の、１０、１５、２０、２５、３０、３５ｕｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図41】（Ａ）～（Ｂ）設計＃２３－３を示す図である。構成：ＤＡＳＨによって駆動される移動のための、より単純な設計のための、狭い（１５０μｍ）トラック幅を有し、二層の層状の流れを有する＃２２－３の別形。一次元の線（狭いトラック）。２つの入口／１つの出口。柱に基づく（仮想境界）。トラック幅：１５０μｍ；隣接する柱の間の１０、１５、２０、２５、３０、３５ｕｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【図42】（Ａ）～（Ｂ）設計＃２３－４を示す図である。構成：ＤＡＳＨによって駆動される移動のための、曲がった幾何学的形状を有する＃２２－３の別形。一次元の線（広いトラック、Ｕ字型の曲線）。３つの入口／１つの出口、入口２は２つの側に分かれている。柱に基づく（仮想境界）。トラック幅：５００μｍ；隣接する柱の間の１０、１５、２０、２５、３０、３５ｕｍの横方向距離。一致するｉｎ ｓｉｔｕ観察。
【発明を実施するための形態】
【0024】
他に定義されない限りは、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似した、または同等な任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができ、好ましい方法および材料を次に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられ、刊行物が引用されるものと関連した方法および／または材料を開示および記載する。
【0025】
材料
本開示は、規則構造および人工的代謝を有する材料の生成を対象とする。
本開示は、規則構造および人工的代謝を有する材料の生成を対象とする。
【0026】
用語「人工的代謝」は、本明細書で、材料を生成するための本方法論の構成、および生成された材料の特性の両方を記載するよう使用される。自然界に見られる代謝に類似して、本明細書で開示される方法論は、不可逆的合成／分解および散逸的集合プロセスの両方を同時に結び付けることによって、構造的階層を有する材料の自律的かつ動的生成を、人工的な様式で可能にする。同化作用（生成）を異化作用（分解）と統合させることによって、本明細書で開示される方法論は、生来の時間空間的フィードバックに応答してｉｎ ｓｉｔｕで規則的に生成および分解の両方を組み合わせることによって、自律的に分解され、周期的に再生もされる材料の生成を可能にする。よって、生成された材料は、不可逆的合成および散逸的集合プロセスを同時に結び付けることによって、材料が、材料の基礎となる分子構造が自律的かつ動的に生成される（同化作用）という意味で「代謝」を有するので、「人工的代謝」を有すると言われており、分解がさらに含まれる実施形態においては、材料の基礎となる分子構造はまた、自律的に分解されている（異化作用）；言い換えれば、材料の基礎となる分子構造は、ｉｎ ｓｉｔｕで自律的および動的に生成され、分解され、周期的に再生もされる。関与するプロセスが人工的に作成されているので、上述の代謝は人工的代謝と言われている。
【0027】
用語「規則構造」は、本明細書で、本明細書で生成される材料の階層構造機構を記載するよう使用される。例えば、ＤＡＳＨ材料は、一次元のミクロンスケールのＤＮＡ分子のネットワークの束で構成される繊維構造を有し得（散逸的集合の結果として）、次いでＤＮＡ分子は、ナノスケールのモノマーから形成されるポリマーである（ポリマー合成の結果として）。
【0028】
本明細書で生成される材料は、任意のパターンであり得る。本明細書で生成される材料に言及して、用語「パターン」は、形状および寸法の特性の両方、ならびに挙動特性を含む。例えば、図１Ｄ～Ｋおよび図４２において説明されるように、周期的パターンの一次元の線から二次元の任意の形状に、多種多様なメソスケールのパターンおよび形状の材料が生成された。動的パターンを有する材料、例えば創発的移動挙動を示すＤＡＳＨ素材、競争挙動を示す２つの移動体を有するＤＡＳＨ素材が生成されている。本明細書で開示されるように、材料のパターンは、好ましくは計算流体力学（「ＣＦＤ：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ」）シミュレーションの助けを用いて、予め決められたサイズおよび形状を有する障害物の位置に基づいて設計および達成し得る。
【0029】
規則構造および人工的代謝を有する材料は、様々なタイプの構築用ブロック、すなわちモノマー、ダイマー、トリマー、またはオリゴマーから生成し得、ｉｎ ｓｉｔｕでポリマーを合成するのに使用し得、ここで合成されたポリマーはまた、ｉｎ ｓｉｔｕで脱重合し得る。いくつかの実施形態において、ポリマーはＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0030】
生成ミックス
ｉｎ ｓｉｔｕのポリマー合成のプロセスは、ポリマーの合成に必要な成分を、本明細書に記載される材料を生成するために設計された装置に供給することによって達成される。用語「生成ミックス」は、本明細書で、ポリマー合成に必要な成分を含む試薬を記載するよう使用される。
ｉｎ ｓｉｔｕのポリマー合成のプロセスは、ポリマーの合成に必要な成分を、本明細書に記載される材料を生成するために設計された装置に供給することによって達成される。用語「生成ミックス」は、本明細書で、ポリマー合成に必要な成分を含む試薬を記載するよう使用される。
【0031】
ポリマーがＤＮＡである実施形態のいくつかにおいて、生成ミックスはＤＮＡ鋳型（二本鎖または一本鎖、直鎖状または環状）、プライマー、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、およびＤＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ鋳型およびプライマーは使用の前に合わせてアニーリングし得る。いくつかの実施形態において、鋳型は、プライマーおよびリガーゼの存在下で環状化された環状ＤＮＡである。本明細書での使用に適したＤＮＡポリメラーゼとしては、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物由来のＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩのような）原核生物由来または真核生物由来（例えば、ＤＮＡ Ｐｏｌ α、β、γ、δ、およびε）のＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されず、これらの多くは市販されている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ：Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によるＤＮＡ合成を達成し得るＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。ポリマーがＤＮＡである実施形態のいくつかにおいて、生成ミックスはＲＮＡ鋳型、プライマー、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、および逆転写酵素を含み得る。
【0032】
ポリマーがＲＮＡである実施形態のいくつかにおいて、生成ミックスは、ＤＮＡ鋳型（二本鎖または一本鎖）、プライマー、ヌクレオチド（ＮＴＰ）、ＲＮＡポリメラーゼ、および含めるのに適切な任意の転写因子を含み得る。本明細書での使用に適したＲＮＡポリメラーゼとしては、原核生物または真核生物由来のＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されず、これらの多くは市販されている。
【0033】
いくつかの実施形態において、生成ミックスは、ｉｎ ｓｉｔｕでのポリマーの合成のための全ての必要な成分を含み得る。いくつかの実施形態において、生成ミックスは、ポリマーの合成のための必要な成分を含み得るが、合成は、試験される試料中に標的核酸が存在する場合にのみ起こる。例えば、本システムおよび方法論が病原体ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する目的で適用される実施形態において、生成ミックスは、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡ合成のための全ての必要な成分を含み得るが、鋳型ＤＮＡが直鎖状形態で提供され、試料中に標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合にのみリガーゼによって環状化された後にのみ鋳型として機能する。他の実施形態において、生成ミックスは、ポリマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の合成のための病原体成分が、試料中に存在する場合、次いで集合して可視化され得る予め決められたパターンを有する材料になる、ＤＮＡ分子の合成を開始させるための鋳型として働き、病原体ＤＮＡまたはＲＮＡが試料中にない場合にＤＮＡの合成が起こらず、材料が形成されないように、核酸鋳型を除いて、ポリマーの合成のための成分を含み得る。
【0034】
いくつかの実施形態において、生成ミックスは、生成された材料に結合して材料のパターンを見ることを可能にする化合物を含む。例えば、生成ミックスは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのような、ＤＮＡに結合する色素を含み得る。
【0035】
分解ミックス
ポリマー合成脱重合、または合成されたポリマーの分解のプロセスは、ポリマーの脱重合に必要な成分を、本明細書に記載される材料を生成するために設計された装置に供給することによって達成し得る。用語「分解ミックス」は、本明細書で、ポリマーの脱重合に必要な成分を含む試薬を記載するよう使用される。
ポリマー合成脱重合、または合成されたポリマーの分解のプロセスは、ポリマーの脱重合に必要な成分を、本明細書に記載される材料を生成するために設計された装置に供給することによって達成し得る。用語「分解ミックス」は、本明細書で、ポリマーの脱重合に必要な成分を含む試薬を記載するよう使用される。
【0036】
ポリマーがＤＮＡである実施形態のいくつかにおいて、分解ミックスは、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）を含み得、これはエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ（制限酵素を含む）であり得、これらの多くは市販されている。いくつかの実施形態において、分解ミックスは、１つまたはそれ以上のエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩＩを含み得る。
【0037】
ポリマーがＲＮＡである実施形態のいくつかにおいて、分解ミックスは、１つまたはそれ以上のリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮアーゼはエンドリボヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮアーゼはエキソリボヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、エンドリボヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＵ２、およびＲＮアーゼＶからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、エキソリボヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）、ＲＮアーゼＰＨ、ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＴ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩからなる群より選択される。
【0038】
装置
ポリマー合成および集合のプロセス、ならびに脱重合のプロセスは、特定のプリコードされたパターンを有する材料を生成するために設計された装置を使用して達成し得る。
ポリマー合成および集合のプロセス、ならびに脱重合のプロセスは、特定のプリコードされたパターンを有する材料を生成するために設計された装置を使用して達成し得る。
【0039】
装置は、ポリマー合成および集合のプロセス、ならびに場合により、所望により脱重合のプロセスが起こる、メインチャンバーを含む。一般的に言って、メインチャンバーは、チャンバーが生成ミックスを含む溶液の供給、および所望により分解ミックスを含む溶液の供給を可能にし、供給された溶液がチャンバーを通った有向の流れ（例えば、入口ポートを有するチャンバーの一端から出口ポートを有する別の端への流れ）を有して予め設計されたパターンの材料を生成することを可能にする限りは、いかなる特定の形状または寸法にも限定されない。いくつかの実施形態において、装置はマイクロ流体装置であり、ここでメインチャンバーは、例えば図１Ｂ～１Ｃに示されるように、ミクロン範囲の寸法を有し、実質的に平面形状をとる。
【0040】
規則構造および特定のパターンを有する材料の生成のために、メインチャンバーは、意図した材料産物のパターンに基づいて予め決められた様式で間隔を保たれた（すなわち、配置された）複数の障害物を含み、障害物はメインチャンバーを通って方向づけられた溶液の流れに渦度を引き起こす形状およびサイズに形づくられている。いくつかの例において、複数の障害物は均一である。いくつかの例において、複数の障害物は少なくとも１つの第一の障害物および少なくとも１つの第二の障害物を含み、少なくとも１つの第一の障害物は、少なくとも１つの第二の障害物と異なるサイズおよび／または異なる形状を有する。いくつかの例において、複数の障害物の間隔は均一である。いくつかの例において、複数の障害物の少なくともいくつかの間の間隔は、複数の障害物の他のものの間の間隔と異なる。いくつかの実施形態において、メインチャンバーは、実質的に平面形状をとらない。
【0041】
特定のパターンを有する規則構造を有する材料を生成するための形状、サイズおよび位置を含む障害物の設計は、本明細書に記載される実験からの観察に基づいて本発明者らによって開発されたガイドラインに従うことによって達成し得る。具体的には、本発明者らは、最終産物の集合の背後の機構が、ｉｎ ｓｉｔｕで合成されたポリマーの新しいネットワークの渦励起の動的形成と、予め形成されたネットワークの流れによって方向づけられた再分布の組み合わせであることを見出した。より具体的には、本発明者らは、ＤＮＡネットワーク形成が、チャンバーの真ん中（すなわち、ｚ軸の中央）の柱の側端から開始され、次いでさらなる生成とともに、これらのＤＮＡネットワークが柱の間の１つの連続的繊維構造へと連結され始めることを観察した。さらに、本発明者らは、柱の側面が高い渦度の領域に一致すること（例えば、図２Ｈにおいて説明されているように）、およびより高い渦度を生じる柱の形状を有する装置が、より速くＤＡＳＨパターンを生成すること（例えば、図１３～１５において説明されるように）を見出した。これらの観察から、流れ、特に渦度が、局所的かつ動的に柱の側面でのネットワークへのＤＮＡの物理的もつれを誘発することによる形成プロセスにおいて重要であることが示される。柱の横でのより大きい渦度は、より早い生成開始時間につながる。形成されたネットワークは、次いで最も速度の高い領域において、流れの方向に沿って再分布し、流れの方向に沿って、連続的で繊維状の異方性の構造を形成する（図２Ｆ、２Ｇ）。構造の厚さは、その後、最終的にはＤＮＡネットワークで満たされる柱の間のギャップとともに増大する。
【0042】
最終産物の集合が、ｉｎ ｓｉｔｕで合成されたポリマーの新しいネットワークの渦励起の動的形成と、予め形成されたネットワークの流れによって方向づけられた再分布の組み合わせであるという認識に基づき、計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを用いて、本発明者らは、材料の所望のパターンを考慮すると、チャンバーにおける障害物のパターン（すなわち、形状、サイズおよび位置）が２つの単純なガイドラインに基づいて設計され得ることを確証した：パターンは、いずれも流れの方向に従って、チャンバー内で最短の経路をとること、および隣接する柱（障害物）を連結させることによって予測し得る。説明のように、７つのタイプの構造単位を使用した単純な組み合わせのルールによって、マイクロ流体装置が設計された（図７）。単位の組み合わせによって、両方のガイドラインを満たすように装置における流れの経路に沿って柱の位置がコードされ、ＤＡＳＨパターンの一般的な設計戦略が可能になる。図２７は、材料の多数のパターン、およびかかる材料のパターンを有する材料を生成するための、障害物の基礎となるパターン（形状、サイズおよび位置）を説明する。一般的に言って、障害物は、つながりによって連結された複数の節点として認識され得、「節点」は渦度の高い領域であり、幾何学に関しては障害物の横の「先端または端」に対応する領域であり（例えば、図７Ａ～７Ｇ中で言及される点ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、正方形の柱の側端等）、「つながり」は、流れの方向に沿った、これらの点の間の最短の連結である。
【0043】
いくつかの実施形態において、一度可視化された材料のパターンは、静的、すなわち動的でない外見を有する。例えば、ＤＡＳＨ素材は、例えば周期的なパターンを有する一次元の線から二次元の任意の形状まで、多種多様なパターンで生成されている（図１Ｄ～Ｋおよび図２７）。
【0044】
いくつかの実施形態において、材料のパターンは動的である（すなわち、動く）。
【0045】
いくつかの実施形態における、創発的移動挙動を示す材料。説明のように、本発明者らは、創発的移動挙動を示すＤＡＳＨ素材の生成を実証した。材料の全体的な挙動は、自律的かつ周期的状態遷移を伴う開始、成長、および崩壊の３つの状態を有する有限状態オートマトン（「ＦＳＡ：ｆｉｎｉｔｅ－ｓｔａｔｅ ａｕｔｏｍａｔｏｎ」）を使用することによって記載される（図３Ｂ）。不連続状態および状態遷移を有するこの抽象概念は、機械的ロボットにおいて使用される方法と同様に、機械としての材料の全体的な挙動の解釈を可能にし、そのため挙動のさらなるプログラミングを可能にした。特に、成長と崩壊との間の状態遷移は、時間空間的フィードバックによって切り替わった。３つの入口ポートおよび１つの出口ポートを有するマイクロ流体装置を使用して、この実施形態を説明した（図１６）。真ん中の入口ポートを通って生成ミックスを装置に注入したが、分解ミックスを外側の他の２つの入口ポートを通って装置に注入した。最初に、装置に流入する３つ全ての溶液は層状のままであった（「開始」状態）。よって、分解ミックスは生成ミックスから分離されたままで、同化作用のプロセスが装置の中央で開始した（「成長」状態）。次第に、再分布したＤＮＡネットワークによる集合が、柱の間のギャップを満たし始め、実質的に流れの動態を変化させた。この時間空間的フィードバックによって、生成用および分解用溶液（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の両方を混合し、そのため状態遷移を誘発することが可能になった。次に異化作用プロセスが優位を占め始め、最終的に材料が分解される（「崩壊」状態）。実験によって、トラックに沿って領域別に小さい（下流）から大きい（上流）ように調整された隣接する柱の間のギャップを有する予め定義されたトラックとして（図３Ｅ）生成用および分解ミックスを含む入口流路を準備した。各領域は、各ＦＳＡに対応する（開始、成長、および崩壊）。渦度の大きさを定義するギャップのサイズは、開始から成長への状態遷移を誘発するように、各単位におけるパラメータ（待ち時間）を示す。プログラムされたように、この渦度の勾配は、トラックの下流領域から開始して、開始から成長状態への遷移の時間空間的な遅れを誘発した。要するに、移動の方向は、一定の流速下での渦度の大きさの勾配であると、実験によって解釈された。移動の方向は、全ての例において流れの方向に逆らうように計画的にプログラムされた。下流領域で開始した自律的生成およびＤＡＳＨパターンによって構築された体が成長し始めた後、生成されたパターンによる空間的フィードバックは、同様に下流から開始した崩壊状態への遷移を誘発した。崩壊状態への遷移もまた、異化作用がこれらの領域において優位を示すと仮定して、流れによって下流領域に伝播する。同時に、開始から成長状態への遷移は、上流領域に向かって続いた（すなわち、渦度の勾配を下る）。結果として、流れの方向に逆らったトラックに沿った体の全体的移動挙動は、一連のＦＳＡによってプログラムされたように現れた。
【0046】
いくつかの実施形態において、材料は、２つの競争する体の創発的競争挙動を示す。これらの実施形態を説明するために、本発明者らは、２つの連続したＦＳＡをプログラムすることによって、創発的競争挙動を示す２つの移動体を有するＤＡＳＨ素材の生成を実証した（図３Ｇ）。創発的移動挙動の例と同様に各連続を設計した；また、２つの移動体の間に単純な干渉を追加した。具体的には、成長から崩壊への状態遷移信号はまた、トラックの間で干渉し得る；より速い運動体は、別のトラックの状態に影響を与えて崩壊に変化させ得、そのため生成を誘発することによって他方のトラックで体の移動を「減速」させ得る。実験によって、単純に流れのタイプを逆にすることによって、設計が実行された（外側の流路上の生成ミックス、および内側の流路上の分解ミックス）。２つのトラックの間に境界がなく、そのため１つのトラックの変化した流れはまた、他方のトラックの状態に影響を及ぼし得る。結果から、トラック番号２が勝者となる、２つの体の間の競争が説明される（図３Ｉ）。プログラムされたように、おそらく流れおよび体のランダム性によって一度２つの体の間の対称性が崩れると、トラック番号２で先導する体によって引き起こされた崩壊状態はトラック番号１の体に影響を与え、体の分解を生じる。トラック番号２の体がゴールに到達した後、最後に挙動はトラック番号１の体の完全な分解で終わった。
【0047】
方法および装置構成
材料を生成するために、生成ミックスを含む溶液を装置のメインチャンバーに供給し、障害物の間の流路（すなわち、空間）に沿って装置のメインチャンバーを通って流れるよう方向づけられる。いくつかの実施形態において、生成ミックスを含む溶液を、入口ポートを通って出口ポートに向かってメインチャンバーに注入する。流れの速度は、種々の手段によって、例えば入口または出口ポートに連結したポンプを介して制御し得る。一度溶液がメインチャンバーに供給されると、ポリマーの合成および集合の同時のプロセスが起こり、自律的に継続する。
材料を生成するために、生成ミックスを含む溶液を装置のメインチャンバーに供給し、障害物の間の流路（すなわち、空間）に沿って装置のメインチャンバーを通って流れるよう方向づけられる。いくつかの実施形態において、生成ミックスを含む溶液を、入口ポートを通って出口ポートに向かってメインチャンバーに注入する。流れの速度は、種々の手段によって、例えば入口または出口ポートに連結したポンプを介して制御し得る。一度溶液がメインチャンバーに供給されると、ポリマーの合成および集合の同時のプロセスが起こり、自律的に継続する。
【0048】
いくつかの実施形態において、生成ミックスを含む溶液および分解ミックスを含む溶液が、ともに装置のメインチャンバーに供給され、メインチャンバーを通って流れるよう方向づけられる。２つの溶液を同時に、連続的に、または予め定められた順序でメインチャンバーに供給し、種々のパターンの生成を可能にし得る。いくつかの実施形態において、２つの溶液は、種々の様式で配置された別々の入口ポートを通って、例えば真ん中のポートが生成ミックスに使用され、外側のポートが分解ミックスに使用される３つの入口ポートを通って；またはその逆で、注入される。一度溶液がメインチャンバーに供給されると、ポリマーの合成／分解および集合の同時のプロセスが起こり、自律的に継続する。
【0049】
生成された材料は、例えば裸眼、カメラ、蛍光顕微鏡（ポリマーが、例えば蛍光化合物と結合している）、光学顕微鏡、または電子顕微鏡を含む種々の手段によって可視化し得る。
【0050】
ＤＡＳＨ素材のさらなる適用
さらなる態様において、ＤＡＳＨ素材を生成するための本方法論が病原体検出に適用された。開示の本態様に従って、生成ミックスを調製して、試料中に標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在する場合にのみ、ＤＡＳＨ素材の選択的増幅および生成を提供し得る。
さらなる態様において、ＤＡＳＨ素材を生成するための本方法論が病原体検出に適用された。開示の本態様に従って、生成ミックスを調製して、試料中に標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在する場合にのみ、ＤＡＳＨ素材の選択的増幅および生成を提供し得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、生成ミックスは、ｄＮＴＰ、最初の直鎖状形態の鋳型ＤＮＡ、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで該鋳型ＤＮＡは、病原体の核酸およびリガーゼの存在下で環状化し、装置において、環状化したＤＮＡはＤＮＡ合成のための鋳型として働く（例えば、ローリングサークル増幅を介して）。これらの実施形態において、最初の直鎖状形態の鋳型ＤＮＡは、メインチャンバーに供給される前に、試験される試料およびリガーゼと接触させて、試料中に標的病原体核酸が存在する場合に鋳型ＤＮＡの環状化を可能にし得る。あるいは、生成ミックス中の他の成分とともに、最初の直鎖状形態の鋳型ＤＮＡ、リガーゼ、および試料がメインチャンバーに供給され、環状化、ならびにポリマー合成および集合がメインチャンバー中で起こる。いくつかの実施形態において、生成ミックスは、ＤＮＡ合成を開始するのに必要なプライマーなしに、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを含み得る；標的病原体ＤＮＡは、試料中に存在する場合、生成ミックスと組み合わされると、ＤＮＡ合成を開始するのに必要なプライマーとして働く。いくつかの実施形態において、生成ミックスは、ＤＮＡ合成を開始するのに必要な鋳型なしに、プライマー、ｄＮＴＰ、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（または逆転写酵素）を含み得る；標的病原体ＲＮＡは、試料中に存在する場合、生成ミックスと組み合わされると、ＤＮＡ合成を開始するのに必要な鋳型として働く。
【0052】
生成ミックスおよび試料を含む溶液は、本明細書で上述した装置のメインチャンバーに注入され、試料中に標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合にのみＤＡＳＨ素材が形成される。生成ミックスおよび標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液が装置に供給される対照試験を、並行して実施し得る。
【0053】
開示の本態様を使用して、例えば細菌、菌類、またはウイルスを含む任意の病原体のＤＮＡまたはＲＮＡを検出し得る。使用に適した試料としては、環境試料（例えば、土、水）、農産物または食品生産物（例えば、果物、野菜、および家禽）、ヒトまたは非ヒト動物から得られた試料（例えば、口または鼻のスワッブ試料、血液試料、尿または糞便試料等）を含む、疑いのある病原体を含む任意の試料が挙げられる。試料は、例えば、装置に注入される前に、元の試料を遠心分離、細胞溶解、分画、または標的病原体ＤＮＡまたはＲＮＡの遊離、精製、および／もしくは濃縮を容易にし得る任意の他の手順に供することによって、加工された試料であり得る。
【0054】
開示の本態様を説明するために、本発明者らは、モデル病原体として、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）から採取された標的配列を選択し、自己生成されたＤＡＳＨパターンを認識することによって、５００および５０ｐＭの濃度で標的の検出の成功を実証した（図４Ａおよび１９～２１）。対照的に、２塩基対のみのミスマッチを有する陰性対照標的配列はパターンを生成せず、検出方法の特異性が実証された。
【0055】
さらに別の態様において、生成される材料は、さらなる機能性材料を生成するための足場として使用される。例えば、ＤＡＳＨ素材は、ＤＮＡを越えた多様な範囲の機能性ナノ材料を生成するための、多用途のメソスケールの足場として働き得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、一度形成されたＤＡＳＨ素材を、ＤＮＡに結合する試薬と接触させる。試薬は、ＤＡＳＨ素材が形成された装置のメインチャンバーに注入し得、アビジン、量子ドット、および金ナノ粒子のような無機ナノ粒子を含む材料の範囲であり得る。これらの試薬のいずれかと結合したＤＡＳＨ素材は、さらに機能化させ得る。例えば、アビジンと結合したＤＡＳＨ素材は、ビオチン複合酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と接触させ得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、ＤＡＳＨ素材内のＤＮＡ分子を使用して、無細胞様式で、かつ時間空間的に制御された様式で、ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質を生成する。これは、無細胞タンパク質発現系を含む溶液を、ＤＡＳＨ素材が形成された装置に供給することによって達成され得る。無細胞タンパク質発現系は当該分野で公知であり、また、市販されている。いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系は、タンパク質合成に必要な成分を含む溶解物を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質合成に必要な成分はｔＲＮＡ、リボソーム、アミノ酸、開始、伸長および終結因子を含む。いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系は、大腸菌溶解物を含む。いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系は、小麦胚芽溶解物を含む。いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系は、ＨｅＬａに基づく溶解物を含む。
【0058】
いくつかの実施形態において、無細胞タンパク質発現系はまた、ＤＡＳＨ素材のＤＮＡ中のプロモーターに結合し、これを活性化するよう設計されたプライマーを含み、それによって所望のタンパク質をコードする遺伝子の転写、およびそれに続くタンパク生成を開始させる。
【0059】
以下に列挙される特定の実施例は単なる例であって、決して限定ではない。
【実施例1】
【0060】
ＤＡＳＨの同化作用経路は、人工的代謝の概念を表す２つの重要な同時かつ自律的プロセスからなる：１）ｉｎ ｓｉｔｕでの酵素反応によって達成される、材料の前駆体としてのＤＮＡ分子の生化学的合成、ならびに２）流れによって、プリコードされたパターンおよび形状を有する材料を形成する、前駆体の散逸的集合。具体的には、前駆体合成のプロセスにおいて、ｉｎ ｓｉｔｕのＤＮＡ合成は、種（プライマーを伴うＤＮＡ鋳型）および構築用ブロックも含む生成ミックスにおいて、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用したローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって達成された（図１Ｂおよび図５）。散逸的集合のプロセスの間に、マイクロ流体装置において流れを使用して、前駆体ＤＮＡから特定のパターンを直接集合させた。具体的には、生成ミックスを、正確に間隔を保たれた障害物を有するマイクロ流体装置に連続的に注入して、前駆体ＤＮＡをプリコードされた特定のパターンに集合させた（図１Ｃ、図６、および図８）。ＤＡＳＨはこのようにして、スケールを渡って：全て同時のプロセスを介して、ナノスケールの構築用ブロックから開始し、ポリマー前駆体、ミクロンスケールのネットワーク（ハイドロゲル）、最終的にメソスケールのパターンおよび形状へと、構造的階層を有する材料を自律的に生成することによって、前述の同化作用経路を達成した。
【0061】
実験によって、周期的なパターンを有する一次元の線から二次元の任意の形状まで、多種多様なメソスケールのパターンおよび形状が生成され、材料の同化作用経路が実証された（図１Ｄ～Ｋおよび図２７Ａ～２７Ｈ）。経路は、一次元の、ミクロンの厚さの繊維状のＤＮＡネットワークを組織することによって、パターンを有する材料の自律的生成を可能にした。計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを用いて、これらのＤＡＳＨパターンは２つの単純なガイドラインに基づいて決定論的に設計し得ることが見出された：パターンは、流路内で最短の経路をとること、および隣接する柱（障害物）を連結させることによって予測され、これらはともに流れの方向に従う。プロセスを単純化するために、７つのタイプの構造単位を使用した単純な組み合わせのルールによって、マイクロ流体装置が設計された（図７Ａ～７Ｇ）。単位の組み合わせによって、両方のガイドラインを満たすように装置における流れの経路に沿って柱の位置がコードされ、ＤＡＳＨパターンの一般的な設計戦略が可能になる。
【0062】
共焦点蛍光顕微鏡観察および走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ：ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって、生成された材料の詳細な形態が明らかになった。二次元の網目パターンの共焦点顕微鏡観察によって、繊維状の形態を有して、マイクロ流体チャンバーの真ん中（チャンバーの上端および下端から離れている）で材料が形成されたことが示された（図２Ａおよび２Ｂ）。ＳＥＭ観察によって、より詳細な形態が明らかになった（図２Ｃおよび２Ｄ）：繊維構造は、配向が流れの方向と一致する異方性のＤＮＡネットワークの束でできている。ここで、観察のために遷移がより簡単であるため、一次元の線パターンを有する装置が選択された。材料のほとんどは、流れの方向に平行な柱の側端およびそれらの間の空間に局在し、識別できるＤＮＡは、柱の周りに少ししか覆っていなかった。また、ＳＥＭ観察によって、物理的にもつれたＤＮＡハイドロゲルに関する先の報告（Ｊ．Ｂ．Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．７、８１６～８２０頁（２０１２年））と同様に、ネットワークの内部に埋め込まれた、平均直径約０．３μｍの球状構造が明らかになった。しかしながら、異方性ネットワークは、ここで、球状構造の間で明らかであったが、おそらく有向の流れのために、ＤＮＡハイドロゲルにおいては明らかでなかった。
【0063】
ＤＡＳＨによるパターン生成の背後の機構をより理解するために、タイムラプス動画を記録し、定量化した（図２Ｅ）。流れの開始とパターン生成の始まりとの間の経過時間の存在によって、合成された前駆体ＤＮＡの最小分子量（例えば、５ｎＭの生成ミックスを用いた二次元の網目パターンの場合、３．３×１０７の推定分子量）に依存したネットワーク形成が示唆された。興味深いことに、我々は、ネットワーク形成がチャンバーの真ん中（すなわち、ｚ軸の中央）の柱の側端から開始し、次いでさらなる生成があり、これらのＤＮＡネットワークが柱の間で１つの連続した繊維構造に連結され始めたことを観察した。優位な機構が柱の周りをＤＮＡネットワークで覆っている場合、繊維状の形態は柱の側端の代わりに上流の端から開始したはずであり、全体的なパターン生成は装置の上流領域から開始したはずである。本明細書で開示される観察から、そうではないことが示された；柱の側端は、集合が開始する主要な場所であった。よって、本発明者らは、ＤＡＳＨパターンの集合の機構は、２つのプロセス：柱の側端で誘発されるＤＮＡネットワークの形成、および予め形成されたネットワークの、流れの方向に沿った連続的で繊維状の異方性構造への再分布（ｉｎ ｓｉｔｕおよび流れる溶液中の両方で）の組み合わせであると仮説を立てた。タイムラプス画像から、構造の厚さが後の段階で増大し、最終的にはＤＮＡネットワークで柱の間のギャップが満たされることが説明された。この、さらに厚くなることによって、溶液中で形成された過剰なＤＮＡネットワークの再分布が、より早い時点ではなく、パターン形成のプロセスのより後の時点で起こったことが強く示唆された。
【0064】
集合プロセスの基礎となる機構を調べるために、本発明者らは、まずＣＦＤシミュレーションを行い、次いで実験によって、それらを２つの側面：新しいネットワークの形成、および予め形成されたネットワークの繊維状の形態への再分布から確かめた（図２Ｆ～２Ｈ）。幾何学的な単純さにより、比較のために一次元の線を有するＤＡＳＨパターンを選択した。形成については、柱の側面が渦度の高い領域に一致することが見出された（図２Ｈ）。感度測定（図１０Ａ～１０Ｃ、図１１Ａ～１１Ｃ、および図１２）および柱の形状の比較実験（図１３Ａ～１３Ｂ、図１４Ａ～１４Ｂおよび図１５）とともに、これらの結果から、流れ、特に渦度が、局所的かつ動的に柱の側面でのネットワークへのＤＮＡの物理的もつれを誘発することによる形成プロセスにおいて重要であることが示唆された。要するに、柱の側面でのより大きい渦度は、より早い生成開始時間につながる。同様の、バイオフィルムおよびタンパク質において観察される、渦度によって誘発された構造形成もまた、この仮説を支持した。再分布については、タイムラプス動画と流速のシミュレーションとのオーバーレイから、速度が最も高い領域で流れの方向に沿って繊維構造が実際に形成されたことが明らかに示され、これは再分布の機構と一致した（図２Ｆ～２Ｇ）。したがって、集合の背後の機構は、新しいネットワークの渦励起の動的形成と、予め形成されたネットワークの、流れに誘導された再分布の組み合わせである可能性が最も高い。
【0065】
上述の同化作用の生成プロセスを、ＤＮＡ加水分解酵素を介した異化作用の分解プロセスと統合することによって、人工的代謝の代謝経路をさらに拡張した。最初に、同化作用および異化作用の両方の経路を使用して、静的位置でのパターンの連続的な生成および分解を誘導した。ここで、ＤＡＳＨパターンは、酵素反応および流れの組み合わせによって、自律的に生成し、次いで同調的かつ自律的に分解された（図３Ａ～３Ｃ）。生成および分解の両方に必要な試薬を同時にマイクロ流体装置に流入させた。重要なことに、一度流れが開始すると、生成および分解の両方のプロセスは、いかなる外部操作もなしに実行された。３つの入口を有するマイクロ流体装置は、ＤＮＡポリメラーゼを有する生成ミックスを含む中央の入口とともに使用されたが、いずれの側の入口もＤＮＡ加水分解酵素、ＤＮアーゼＩを有する分解ミックスを含んでいた。材料の全体的な挙動は、自律的かつ周期的状態遷移を伴う開始、成長、および崩壊の３つの状態を有するＦＳＡを使用することによって記載した（図３Ｂ）。不連続状態および状態遷移を有するこの抽象概念は、機械的ロボットにおいて使用される方法と同様に、機械としての材料の全体的な挙動の解釈を可能にし、後述の挙動のさらなるプログラミングを可能にした。特に、成長と崩壊との間の状態遷移は、時間空間的フィードバックによって切り替わった。ＣＦＤシミュレーションから、プロセスの間の流体力学が説明された（図１６Ａ～１６Ｄ）。最初に、装置に流入する３つ全ての溶液は層状のままであった（開始）。よって、分解ミックスは生成ミックスから分離されたままで、同化作用のプロセスが装置の中央で開始した（成長）。次第に、再分布したＤＮＡネットワークによる集合が、柱の間のギャップを満たし始め、実質的に流れの動態を変化させた。この時間空間的フィードバックによって、生成用および分解用溶液の両方を混合し、そのため状態遷移を誘発することが可能になった。次に異化作用プロセスが優位を占め始め、最終的に材料が分解された（崩壊）。さらなる実験試験から、生成および分解の連続的発生（周期的再生）が、ＤＮＡ合成時間が一定である場合、少なくとも２回、自律的に繰り返され得ることが示され（図１７）、同化作用および異化作用の両方の経路が、外部からのいかなる干渉もなしに再生式に継ぎ目なく統合および調節され得ることが実証された。
【0066】
静的位置での材料の動的生成および分解挙動に基づいて、ＤＡＳＨを使用した人工的代謝によって駆動される移動挙動をプログラムした（図３Ｄ～３Ｆ）。細胞性粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの偽変形体（ナメクジ）の形状および移動挙動に示唆されて（Ｊ．Ｔ．Ｂｏｎｎｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ．３１、１７５頁（１９４４年））、ナメクジ様体がＤＡＳＨパターンの自律的成長によって最初に生成され、それに続いて一定の流れに逆らってトラックに沿った体の自律的移動が起こるよう挙動がプログラムされた。移動は、連続的で分極した再生に基づく創発的挙動として実現された：前端がその体を生成し、後端が自身を分解する。抽象的な設計レベルで、挙動は、連続的に連結された様式で（Ｍ１～Ｍ６）、上で紹介されたＦＳＡを拡張することによってプログラムされ、各ＦＳＡは自律的なモジュール単位として見なされた（図３Ｄ）。各単位（Ｍｎ）は、成長から崩壊への状態遷移を誘発する、隣接する単位（Ｍｎ＋１）から「変化した流れ」の信号を受け入れ得、また、次（Ｍｎ－１）へと信号を伝播させ得る。移動挙動は、開始と成長の間の状態遷移が誘発されるまでの異なる待ち時間（ｔ１＜ｔ２＜．．．＜ｔ６）を設定することによってプログラムされた。各ＦＳＡの成長は、待ち時間に従ってＭ１から開始する。一度単位Ｍｎがその内部フィードバックにより状態を崩壊に変化させると、変化した流れの信号は隣接する単位Ｍｎ－１およびその次へと伝播し、体の後端での状態遷移を確実にする。結果として、移動の方向は、成長およびそれに続く崩壊への遷移の時間空間的遅れとして表される。実験によって、挙動のための予め決定されたトラックとして生成用および分解ミックスを含む、同様の複数の入口を有する流路を準備した（図３Ｅ）。ここで、隣接する柱の間のギャップは、トラックに沿って領域別に小さい（下流）から大きい（上流）ように調整された。各領域は、各ＦＳＡに対応する。渦度の大きさを定義するギャップのサイズは、開始から成長への状態遷移を誘発するように、各単位におけるパラメータ（待ち時間）を示す。プログラムされたように、この渦度の勾配は、トラックの下流領域から開始して、開始から成長状態への遷移の時間空間的な遅れを誘発した。要するに、移動の方向は、一定の流速下での渦度の大きさの勾配であると、実験によって解釈された。移動の方向は、全ての例において流れの方向に逆らうように計画的にプログラムされたことを、ここでも本発明者らは強調する。下流領域で開始した自律的生成およびＤＡＳＨパターンによって構築された体が成長し始めた後、生成されたパターンによる空間的フィードバックは、同様に下流から開始した崩壊状態への遷移を誘発した。崩壊状態への遷移もまた、異化作用がこれらの領域において優位を示すと仮定して、流れ（Ｍｎ－１に送られた「変化した流れ」の信号として表される）によって下流領域に伝播する。同時に、開始から成長状態への遷移は、上流領域に向かって続いた（すなわち、渦度の勾配を下る）。結果として、流れの方向に逆らったトラックに沿った体の全体的移動挙動は、一連のＦＳＡによってプログラムされたように現れた。挙動は、一直線（広い幅および狭い幅）および曲がったトラックの両方において、実験によって観察され、これによって軌道の設計柔軟性が説明された。移動速度は、狭いトラックで２．３ｍｍ／時間として測定された（図３Ｆ）。
【0067】
機械としての材料の適用をさらに実証するために、抽象的なプログラミング方法の力を利用することによって、設計を拡張し、２つの連続したＦＳＡによって２つの競争する体の創発的な競争挙動が達成された（図３Ｇ）。先の創発的移動挙動と同様に各連続（Ｍ１１～Ｍ６１、Ｍ１２～Ｍ６２）を設計する；また、ここで、２つの移動体の間に単純な干渉をさらに追加した。具体的には、成長から崩壊への状態遷移信号はまた、トラックの間で干渉し得る（２つの連続したＦＳＡの間の矢印によって示される）；より速い運動体は、別のトラックの状態に影響を与えて崩壊に変化させ得、そのため分解を誘発することによって他方のトラックで体の移動を「減速」させ得る。このプログラムは、互いの間にいかなる物理的境界もなしに並んで配置された２つの連続したＦＳＡを表す２つのトラックとして解釈し得る（図３Ｈ）。実験によって、前項で紹介した幅広のトラックにおいて、単純に流れのタイプを逆にすることによって、設計が実行された（外側の生成ミックス、および内側の分解ミックス）。２つのトラックの間に境界がないので、１つのトラックの変化した流れはまた、他方のトラックの状態に影響を及ぼし得る。結果から、トラック番号２が勝者となる、２つの体の間の競争が成功裏に示された（図３Ｉ）。プログラムされたように、おそらく流れおよび体のランダム性によって一度２つの体の間の対称性が崩れると、トラック番号２で先導する体によって引き起こされた崩壊状態はトラック番号１の体に影響を与え、体の分解を生じる（１２７．５分のスナップ写真参照）。トラック番号２の体がゴールに到達した後（１３５分）、最後に挙動はトラック番号１の体の完全な分解で終わった（１８０分）。
【0068】
最終的に、機械適用におけるＤＡＳＨ素材の使用に加えて、いくつかの他の適用を開発した。適用の一つは核酸検出であった（図１８）。この適用の目標は、材料の自己生成特性の利点を実証することであった。試料中に標的病原体ＤＮＡ／ＲＮＡ配列が存在する場合にのみ増幅可能な生成の種が調製された。材料の同化作用特性は、このようにして、標的化ＤＮＡ／ＲＮＡについてのみの選択的増幅プロセスとして働くよう変換された。生成されたＤＡＳＨパターンは、次いで裸眼の観察によって、またはフーリエ変換に基づくパターン認識アルゴリズムによって、読み取られ、二値の読み出し方法として機構を採用した（図９）。実験によって、モデル病原体として、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）から採取された標的配列を選択した。自己生成されたＤＡＳＨパターンを認識することによって、５００および５０ｐＭの濃度で標的が成功裏に検出された（図４Ａ、図１９Ａ～１９Ｂ、図２０Ａ～２０Ｂ、および図２１）。２塩基対のみのミスマッチを有する対照標的はパターンを生成せず、検出方法の特異性が実証された。次いで、自己生成された材料の潜在的な使用を説明するために、種々のハイブリッド機能性材料がＤＡＳＨパターンから作り出された。ＤＡＳＨ素材は、アビジン（図４Ｂ、図２２Ａ～２２Ｂ、図２３Ａ～２３Ｂ）、量子ドット（図４Ｃ、図２４Ａ～２４Ｄ）、およびＤＮＡ結合金ナノ粒子（図４Ｄ、図２５）のような、タンパク質から無機ナノ粒子の範囲のＤＮＡを越えた多様な範囲の機能性ナノ材料のための多用途のメソスケールの足場として働いた。生成されたパターンはまた、酵素と結合した場合に触媒活性によって機能的になった。ＤＡＳＨパターン内のＤＮＡ分子がＤＮＡの遺伝的特性を保持すること、およびｓｆＧＦＰに対するレポーター遺伝子を組み込むことによって無細胞的に材料自体が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を成功裏に生成されたことが示された（図４Ｅ、図２６Ａ～２６Ｂ）。材料のタンパク質生成能力によって、時間空間的に制御された、酵素を含むタンパク質の、将来の無細胞生成の基礎が樹立された。
【0069】
結論として、本開示は、生化学的合成および散逸的集合の同時のプロセスを使用した人工的代謝によって駆動される動的材料を対象とする。ＤＡＳＨの概念の実行によって、材料の種々の適用が成功裏に実証された。特に、本発明者らは、一連のＦＳＡとしてプログラムすることによって、創発的な再生、移動、および競争挙動を有するこの新規の動的生体材料からの機械の構築に成功した。生命の制限のない生体工学の基礎に基づくボトムアップ設計は、根本的にこれらの能動的でプログラム可能な挙動を可能にした。この材料は、生体分子の機械およびロボットにおける移動性要素として統合され得る。ＤＡＳＨパターンは、裸眼またはスマートフォンによって容易に認識され得、ポイントオブケア設定においてより実行可能な、より良い検出技術につながる。ＤＡＳＨはまた、他の材料のための鋳型として使用して、例えば、タンパク質発現またはナノ粒子集合の動的波を作り出し得る。
【実施例2】
【0070】
材料および方法
材料
Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）バッファー（４００ｍＭ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、および４０ｍＭ ＤＴＴ）およびデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を得た。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からＴ４ ＤＮＡリガーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩを得た。Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）からアデノシン三リン酸（ＡＴＰ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を得た。オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）による標準的な脱塩方法を使用して精製した。ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）からＧｅｌＲｅｄ（商標）核酸ゲル染色液およびヌクレアーゼフリー水を得た。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、４０％アクリルアミド／Ｂｉｓ（１９：１）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ：Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）シリコーンエラストマーキット（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を得た。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ：Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｄｉａｍｉｎｅ）を得た。
材料
Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）バッファー（４００ｍＭ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、および４０ｍＭ ＤＴＴ）およびデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を得た。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からＴ４ ＤＮＡリガーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩを得た。Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）からアデノシン三リン酸（ＡＴＰ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を得た。オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）による標準的な脱塩方法を使用して精製した。ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）からＧｅｌＲｅｄ（商標）核酸ゲル染色液およびヌクレアーゼフリー水を得た。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、４０％アクリルアミド／Ｂｉｓ（１９：１）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ：Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）シリコーンエラストマーキット（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を得た。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ：Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｄｉａｍｉｎｅ）を得た。
【0071】
生成ミックス調製
プライマーＤＮＡとともに鋳型ＤＮＡを環状化することによって、生成の種を調製した（図５）。最初に、化学的に合成された鋳型およびプライマーＤＮＡを、最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中で、最終１μＭの等モル濃度で混合し、次いでサーマルサイクラーによって９５℃から４℃までアニーリングした（－１℃／分）。２００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰ（最終１．２５ｍＭ）を加え、次いで反応のために４℃で一晩インキュベートした（合計２０μＬスケール、最終種濃度０．５μＭ）。終濃度５ｎＭ（またはその他の記載がある）でライゲーションされた生成の種溶液を、次いで氷上で、生成ミックスのために、最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中で、それぞれ最終１ｍＭのｄＮＴＰ、最終１ｘ濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、および５．７単位／μＬのＰｈｉ２９と混合した。
プライマーＤＮＡとともに鋳型ＤＮＡを環状化することによって、生成の種を調製した（図５）。最初に、化学的に合成された鋳型およびプライマーＤＮＡを、最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中で、最終１μＭの等モル濃度で混合し、次いでサーマルサイクラーによって９５℃から４℃までアニーリングした（－１℃／分）。２００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰ（最終１．２５ｍＭ）を加え、次いで反応のために４℃で一晩インキュベートした（合計２０μＬスケール、最終種濃度０．５μＭ）。終濃度５ｎＭ（またはその他の記載がある）でライゲーションされた生成の種溶液を、次いで氷上で、生成ミックスのために、最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中で、それぞれ最終１ｍＭのｄＮＴＰ、最終１ｘ濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、および５．７単位／μＬのＰｈｉ２９と混合した。
【0072】
マイクロ流体装置設計
３つの工程に従うことによって、装置を設計した。最初に、最終的なＤＡＳＨパターンのレイアウトを概略的に決定した。次に、連結図に基づく抽象的な方法を使用したパターンに従うことによって、障害物を割り当てた。全部で７つのタイプの標準的構造単位を、設計のために使用した。最後に、メインチャンバー設計を入口／出口流路に連結させた。
３つの工程に従うことによって、装置を設計した。最初に、最終的なＤＡＳＨパターンのレイアウトを概略的に決定した。次に、連結図に基づく抽象的な方法を使用したパターンに従うことによって、障害物を割り当てた。全部で７つのタイプの標準的構造単位を、設計のために使用した。最後に、メインチャンバー設計を入口／出口流路に連結させた。
【0073】
全ての装置は、ＬａｙｏｕｔＥｄｉｔｏｒ（Ｊｕｓｐｅｒｔｏｒ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＫＬａｙｏｕｔ（Ｋｌａｙｏｕｔウェブサイト）によって設計し、ＧＤＳＩＩフォーマットにエクスポートした。Ｃｏｒｎｅｌｌ ＮａｎｏＳｃａｌｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＣＮＦ）（Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）での最初の試験を除いて、外部業者（Ｓｕｚｈｏｕ Ｍａｓｋ－Ｆａｂ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈｉｎａ）によって、Ｃｈｒｏｍｅフォトマスク加工を行った。ＣＮＦにおいて、マスク描画のためにＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＤＷＬ２０００を使用した；現像および後処理のためのＨａｍａｔｅｃｈ－Ｓｔｅａｇ Ｍａｓｋ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ。
【0074】
ガラスウエハ（直径４インチ）を水で洗浄し、次いで５分間の超音波処理とともにアセトンに浸漬した。次いで、それらをさらに５分間、超音波処理とともにイソプロパノールに移した。その後、ウエハを脱イオン水で洗浄し、清浄な空気流中で乾燥させた。全てのガラスウエハは、フォトレジストコーティングの前にヘキサメチルジシラザンによって前処理した。ＡＺ Ｐ４６２０フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をウエハ中央に浸し、スピンコータ上で１０００ｒ．ｐ．ｍで２分間スピンさせて、およそ１６μｍの厚さを達成した。次いで、ウエハをホットプレート上で９５℃で８分間焼き、次第に室温まで冷却した。コーティングされたウエハを、石英マスクを用いてＭＡ／ＢＡ６マスク／ボンドアライナ（ＳＵＳＳ ＭｉｃｒｏＴｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で３０秒間ＵＶ光に曝し、次いで１：３の比でａｚ ４００Ｋおよび脱イオン水で構成される現像液に２分間入れた。現像されたウエハを脱イオン水ですすぎ、空気流によって乾燥させた。最後に、ウエハをホットプレート上で１００℃で３０分間焼き、フォトレジスト接着を向上させた。ガラスウエハをペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）に置き、造型プロセスのために端の四辺をテープで留めることによって固定した。１０：１のＢａｓｅ Ｃｕｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ比（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）でポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）シリコーンエラストマーでマイクロ流体装置の造型をした。７０℃で１時間焼いた後、個々の装置をペトリ皿から切り出し、次いで入口および出口ポートを打ち抜いた。最後に、酸素プラズマ処理を介して、装置をＰＤＭＳコーティングされた顕微鏡スライドガラス（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）に共有結合させた。
【0075】
装置の設計プロセス
実験結果およびＣＦＤシミュレーションに基づいて、２つの経験的ガイドラインを見出した：パターンは、１）装置の内部の流れの方向に従うことによって形成され、２）柱の間を連結する、流路の内部の最短の経路をとった。これらのガイドラインに基づいて、以下の決定論的方法に従って装置を設計した。
実験結果およびＣＦＤシミュレーションに基づいて、２つの経験的ガイドラインを見出した：パターンは、１）装置の内部の流れの方向に従うことによって形成され、２）柱の間を連結する、流路の内部の最短の経路をとった。これらのガイドラインに基づいて、以下の決定論的方法に従って装置を設計した。
【0076】
装置レイアウト
最初に、入口／出口とメインチャンバーとの間の流路を含む全体的な装置のサイズを設計した。本書類において、配管に連結された時に蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）の対物レンズでの干渉を避けるように、流路の長さを設定した；顕微鏡の画像サイズに基づいて、典型的なメインチャンバー長（２ｍｍ）を設定した。メインチャンバーと入口／出口との間の流路幅を５０μｍに固定した；典型的なメインチャンバー幅（文字「Ｄ、Ｎ、Ａ」および「二重らせん」図のような複雑な幾何学的形状を除き、渦度制御実験のための３つのチャンバーを有する装置、および移動のための狭い一直線のトラック）は、一貫性のために設計全体を通して５００μｍに設定した（図６）。個々の装置を切り出すためにさらなる余裕を含めることによって、および加工プロセスの間装置を密閉するために、ガラスウエハのサイズ（７ｃｍ平方）によって装置の全体的なサイズを制限する。
最初に、入口／出口とメインチャンバーとの間の流路を含む全体的な装置のサイズを設計した。本書類において、配管に連結された時に蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）の対物レンズでの干渉を避けるように、流路の長さを設定した；顕微鏡の画像サイズに基づいて、典型的なメインチャンバー長（２ｍｍ）を設定した。メインチャンバーと入口／出口との間の流路幅を５０μｍに固定した；典型的なメインチャンバー幅（文字「Ｄ、Ｎ、Ａ」および「二重らせん」図のような複雑な幾何学的形状を除き、渦度制御実験のための３つのチャンバーを有する装置、および移動のための狭い一直線のトラック）は、一貫性のために設計全体を通して５００μｍに設定した（図６）。個々の装置を切り出すためにさらなる余裕を含めることによって、および加工プロセスの間装置を密閉するために、ガラスウエハのサイズ（７ｃｍ平方）によって装置の全体的なサイズを制限する。
【0077】
メインチャンバー設計
３つの工程に従うことによって、メインチャンバーのレイアウトを設計した。最初に、最終的なＤＡＳＨパターンのレイアウトを概略的に決定した。次に、最初の工程で描かれた線に従うことによって、障害物を割り当てた。最後に、障害物を流路およびメインチャンバー設計と併合させた。
３つの工程に従うことによって、メインチャンバーのレイアウトを設計した。最初に、最終的なＤＡＳＨパターンのレイアウトを概略的に決定した。次に、最初の工程で描かれた線に従うことによって、障害物を割り当てた。最後に、障害物を流路およびメインチャンバー設計と併合させた。
【0078】
境界および／または柱の組み合わせに基づいて、障害物を設計した。全部で７つのタイプの標準的な構造体要素を設計に使用した（図７Ａ～７Ｇ）。構造体要素は、連結図の抽象的なパターンの形態学的特性によって、「一直線」、「分かれる」および「併合する」のような３つのクラスに分類された。つながりは、ＤＡＳＨ構造の最終的な再分布形態を表し、節点はＤＡＳＨ構造が生成された点を表す。基本的な幾何学的形状は、三角形の障害物を有する固体境界に基づいた（図７Ａ、７Ｂ、７Ｆ、および７Ｇ）。固体境界（図７中の灰色の領域）は、装置における全体的な層状の流れの方向を定義する（図７中の青色の線）。ＤＡＳＨ構造は、障害物の頂点（点ｐ、ｑ）の間の最短の一直線の経路をとるため、２つの点を結ぶ直線（図７中の緑色の線）が生成された。典型的には、加工プロセスにおける制限のために、流路幅は２０μｍより広く設計された。「分かれる」および「併合する」レイアウトの場合、流れの方向は側流路の全体的な設計を定義する。流れが、生成されたＤＡＳＨ構造を流れの方向とともに再分布させるため、分岐の湾曲の内隅（点ｒ、ｕ）は、角が生成および定着の点となるように（すなわち、ＤＡＳＨ構造は、正確な位置で併合する／分かれる）、常に鋭角になっている必要がある。隣接する生成点の間の角度（ｒ－ｓ、ｔ－ｕの間）は、生成された分岐構造の角度を定義する。また、長方形の障害物もまた、三角形の障害物の代わりに使用し得る（図７Ｂ）。さらに、物理的境界に加えて、装置内部の層状の流れの対称性を利用することによって、「仮想」境界にまでこの戦略を拡張し得る（図７Ｃ、７Ｄ、および７Ｅ）。線対称な柱構造（青色の破線）を一度設計すると、層状の流れもまた軸対称になる（対称な流れを確認するためにＣＦＤシミュレーションを必要とする）；結果として、境界構造を基本的に排除し、柱によって障害物の設計を大いに単純化し得る。本書類において、仮想境界を有する３つのタイプの要素を使用した：柱の間の横方向距離ゼロ（ｃ）、正の距離（＋ｘ）（ｄ）、および負の距離（－ｘ）、（ｅ）。正の距離は、ＤＡＳＨ構造の最大幅を定義する（図１Ｄ）；ゼロ（図１Ｅ）および負の（図１Ｆ）距離によって、最小幅を有するＤＡＳＨの生成が可能になる。「文字Ｄ」のような軸対称設計の場合、幾何学的形状の上半分のほとんどを下半分に単純に複製することによって、設計プロセスが減少し得ることに留意されたい。
【0079】
最後に、障害物を流路およびメインチャンバー設計と併合させた。プロセス全体を繰り返して、実際のＤＡＳＨパターン形成またはＣＦＤシミュレーション結果を検査することによってパターンを改良した。繰り返しの後に、最終的な最適化された設計を決定し、実際のＤＡＳＨ生成実験で試験した。
【0080】
装置設計カタログ
記載された方法を使用することによって、パターンの生成のために様々なタイプのＤＡＳＨ装置およびトラックを設計した（図２７および図２８～４２）。本書類において、全部で１５個のタイプの設計を使用した。カタログは、柱／障害物の設計、装置／トラックの全体的な幾何学的形状、および構成を要約している。
記載された方法を使用することによって、パターンの生成のために様々なタイプのＤＡＳＨ装置およびトラックを設計した（図２７および図２８～４２）。本書類において、全部で１５個のタイプの設計を使用した。カタログは、柱／障害物の設計、装置／トラックの全体的な幾何学的形状、および構成を要約している。
【0081】
ＤＡＳＨ装置の断面高さ測定
刃によって切断された実際のＰＤＭＳ装置の試料採取によって、チャンバーの高さを確認した。全部で４２個の断片を、分析のために測定した。結果から、１．１μｍの標準偏差で１７．４μｍの平均高さが示され、これは１６μｍの理想的な厚さと比較して、妥当な範囲（およそ８％差）である。
刃によって切断された実際のＰＤＭＳ装置の試料採取によって、チャンバーの高さを確認した。全部で４２個の断片を、分析のために測定した。結果から、１．１μｍの標準偏差で１７．４μｍの平均高さが示され、これは１６μｍの理想的な厚さと比較して、妥当な範囲（およそ８％差）である。
【0082】
装置の実験構成
マイクロ流を使用した同時の合成および集合を、配管およびシリンジに連結されたマイクロ流体装置の組み合わせによって具体化した（図８）。調製された生成ミックス溶液を、１ｍＬ ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、および挿入先端としての短いＭｉｃｒｏｇｒｏｕｐ皮下管留置（Ｍｅｄｗａｙ、ＭＡ）に連結されたＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ Ｐｕｒｉ－Ｆｌｅｘ Ａｕｔｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）に引き入れた。溶液を調製した直後に、次いでシリンジをＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ－２０００シリンジポンプ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に付け、注入した。実験の前に、ＤＡＳＨ装置をヌクレアーゼフリー水で事前に満たした；入口および出口の両方もまた、水で覆った。一度生成ミックスが先端に現れると、次いで先端をＤＡＳＨ装置に直ちに挿入する。装置および先端はともに溶液で覆って、プロセスの間に確実に気泡が装置に入らないようにした。典型的には、生成ミックスは０．１μＬ／分でＤＡＳＨ装置に注入した。
マイクロ流を使用した同時の合成および集合を、配管およびシリンジに連結されたマイクロ流体装置の組み合わせによって具体化した（図８）。調製された生成ミックス溶液を、１ｍＬ ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、および挿入先端としての短いＭｉｃｒｏｇｒｏｕｐ皮下管留置（Ｍｅｄｗａｙ、ＭＡ）に連結されたＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ Ｐｕｒｉ－Ｆｌｅｘ Ａｕｔｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）に引き入れた。溶液を調製した直後に、次いでシリンジをＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ－２０００シリンジポンプ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に付け、注入した。実験の前に、ＤＡＳＨ装置をヌクレアーゼフリー水で事前に満たした；入口および出口の両方もまた、水で覆った。一度生成ミックスが先端に現れると、次いで先端をＤＡＳＨ装置に直ちに挿入する。装置および先端はともに溶液で覆って、プロセスの間に確実に気泡が装置に入らないようにした。典型的には、生成ミックスは０．１μＬ／分でＤＡＳＨ装置に注入した。
【0083】
生成－分解実験のために、３つの入口を有する設計（図３６、＃１４－２）を設計した。中央の入口を生成用溶液（最終種濃度０．１ｎＭ）に連結させた。横の入口を分解用溶液（最終１ｘ Ｐｈｉ２９反応バッファー中のＤＮアーゼＩ（１単位／μＬ））に連結させた。生成用および分解用溶液の両方を０．１μＬ／分で注入した。創発的な移動実験のために、勾配渦度領域を有する２つおよび３つの入口を有するトラック（図４０、４１、４２、＃２２－３、２３－３、２３－４）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。創発的な競争実験のために、勾配渦度領域を有する３つの入口を有するトラック（図４１、＃２３－３）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。
【0084】
蛍光顕微鏡観察
形態学的研究および定量分析のために使用する蛍光顕微鏡観察画像を、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｍｂｄａ ＬＳ Ｘｅｎｏｎ光源（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－６１顕微鏡（Ｊａｐａｎ）によって撮影した。緑色蛍光（励起光４８４ｎｍ、発光５２０ｎｍ）、赤色蛍光（励起光５５５ｎｍ、発光６０５ｎｍ）、および赤色量子ドット（励起光４２０ｎｍ、発光６０５ｎｍ）フィルターをＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）から購入した。オリンパス株式会社（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）による４ｘおよび１０ｘ対物レンズを使用した。明視野チャンネルの露出時間を１００ミリ秒に設定した；全ての実験を通して、蛍光チャンネルを２０００ミリ秒に設定した。１５０秒／フレームを使用して（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｏｖｉｅ Ｓ６における短い観察間隔動画（１５秒／フレーム）を除いて）、４ｘ対物レンズでタイムラプス動画を撮影した。Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）によって、生のデータを含む画像を捕捉した。生のデータ（１６ビットｔｉｆｆファイル）をインポートし、詳細な観察について組織内のソフトウエアによって処理した。
形態学的研究および定量分析のために使用する蛍光顕微鏡観察画像を、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｍｂｄａ ＬＳ Ｘｅｎｏｎ光源（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－６１顕微鏡（Ｊａｐａｎ）によって撮影した。緑色蛍光（励起光４８４ｎｍ、発光５２０ｎｍ）、赤色蛍光（励起光５５５ｎｍ、発光６０５ｎｍ）、および赤色量子ドット（励起光４２０ｎｍ、発光６０５ｎｍ）フィルターをＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）から購入した。オリンパス株式会社（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）による４ｘおよび１０ｘ対物レンズを使用した。明視野チャンネルの露出時間を１００ミリ秒に設定した；全ての実験を通して、蛍光チャンネルを２０００ミリ秒に設定した。１５０秒／フレームを使用して（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｏｖｉｅ Ｓ６における短い観察間隔動画（１５秒／フレーム）を除いて）、４ｘ対物レンズでタイムラプス動画を撮影した。Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）によって、生のデータを含む画像を捕捉した。生のデータ（１６ビットｔｉｆｆファイル）をインポートし、詳細な観察について組織内のソフトウエアによって処理した。
【0085】
２つの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７１０（Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－８１（Ｊａｐａｎ））によって、共焦点レーザー顕微鏡観察（ＣＬＳＭ：ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）画像およびｚスタック動画を撮影した。タイムラプス録画（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｏｖｉｅ Ｓ２）のために、最終５ｎＭの生成ミックスとともに装置＃９－１（図３０）を選択した。焦点距離により、観察のために１０ｘ対物レンズを選択した。緑色蛍光チャンネルのために、励起光４８８ｎｍ、発光５２０ｎｍのフィルターを使用した。捕捉間隔を１１０秒に設定した；全部で３０個のフレームを記録した。各スタックについて３０枚のレイヤー（ｚ軸）を撮影した。
【0086】
ＳＥＭ
ＤＡＳＨパターンの生成の後に、４％パラホルムアルデヒド定着液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を装置に１０分間流入させた（０．１μＬ／分）。４℃で２４時間の固定の後、装置を開き、ＰＤＭＳ基板上でパターンを固定した。ヌクレアーゼフリー水ですすぐ際に、パターンを一連の段階的なエタノール（１０％、２５％、５０％、７５％、９０％および１００％）中で、および１００％エタノールに浸漬して脱水した。その後、パターンを、Ｂａｌｔｅｃ（Ｌｅｉｃａ）ＣＰＤ ４０８（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した臨界点乾燥プロセスで乾燥させ、次いでＬＥＯ（Ｚｅｉｓｓ）１５５０ ＦＥＳＥＭ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で調査した。
ＤＡＳＨパターンの生成の後に、４％パラホルムアルデヒド定着液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を装置に１０分間流入させた（０．１μＬ／分）。４℃で２４時間の固定の後、装置を開き、ＰＤＭＳ基板上でパターンを固定した。ヌクレアーゼフリー水ですすぐ際に、パターンを一連の段階的なエタノール（１０％、２５％、５０％、７５％、９０％および１００％）中で、および１００％エタノールに浸漬して脱水した。その後、パターンを、Ｂａｌｔｅｃ（Ｌｅｉｃａ）ＣＰＤ ４０８（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した臨界点乾燥プロセスで乾燥させ、次いでＬＥＯ（Ｚｅｉｓｓ）１５５０ ＦＥＳＥＭ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で調査した。
【0087】
ＣＦＤシミュレーション
元のＣＡＤ設計（ＧＤＳＩＩ）から二次元ＣＡＤファイルをＤＸＦフォーマットにエクスポートし、次いでＲｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ（Ｒｏｂｅｒｔ ＭｃＮｅｅｌ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にインポートし、Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ＣＦＤ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を使用してシミュレーションした。Ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ内で、元の二次元ＣＡＤファイルを、実際のＤＡＳＨ装置に相当する高さを有する三次元容積に成形した。次いで、ＣＦＤソフトウエア内の作成ソフトウエアにインポートするために、モデルをＳＴＥＰファイルとしてエクスポートした。幾何学的形状を通って流れる流体について、単純化のために初期設定の水プロファイルを使用した。固体構造については、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｒｕｂｂｅｒの既存の初期設定の材料と同様の特性を適用させた。次いで、最大５００回の繰り返しについて、または結果が収束に到達するまで（Ａｕｔｏｄｅｓｋ ＣＦＤソフトウエアによって自動的に検出および停止される）シミュレーションを実行した。シミュレーションの結果の可視化のために、３つの方法を使用した：ヒートマップ、ベクトル場、および粒子トレース。全ての結果の間でヒートマップおよびベクトル場を正規化し、均一性を維持し、容積の下から８μｍに配置した（中点）。
元のＣＡＤ設計（ＧＤＳＩＩ）から二次元ＣＡＤファイルをＤＸＦフォーマットにエクスポートし、次いでＲｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ（Ｒｏｂｅｒｔ ＭｃＮｅｅｌ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にインポートし、Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ＣＦＤ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を使用してシミュレーションした。Ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ内で、元の二次元ＣＡＤファイルを、実際のＤＡＳＨ装置に相当する高さを有する三次元容積に成形した。次いで、ＣＦＤソフトウエア内の作成ソフトウエアにインポートするために、モデルをＳＴＥＰファイルとしてエクスポートした。幾何学的形状を通って流れる流体について、単純化のために初期設定の水プロファイルを使用した。固体構造については、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｒｕｂｂｅｒの既存の初期設定の材料と同様の特性を適用させた。次いで、最大５００回の繰り返しについて、または結果が収束に到達するまで（Ａｕｔｏｄｅｓｋ ＣＦＤソフトウエアによって自動的に検出および停止される）シミュレーションを実行した。シミュレーションの結果の可視化のために、３つの方法を使用した：ヒートマップ、ベクトル場、および粒子トレース。全ての結果の間でヒートマップおよびベクトル場を正規化し、均一性を維持し、容積の下から８μｍに配置した（中点）。
【0088】
ＣＦＤシミュレーション（詳細なプロトコール）
導入
種々の幾何学的パターンを通る流れの小規模な傾向を見出すために、単純な計算流体力学（ＣＦＤ）モデルを構築および実行した。このシミュレーションの狙いは、（多くの概括論とともに）単純なパイプラインを確立して、ＤＡＳＨ装置の内部の流れの挙動を推定することである。次いで、この情報は新しいＤＡＳＨ装置の設計のため、および生成機構の推定のための補助として使用された。このシミュレーションの範囲はマイクロスケールであり、装置の内部の流れの全体的な挙動を観察することに留意されたい；もつれおよびネットワーク形成を含む流れおよびポリマーのナノスケールの挙動のような詳細な挙動のさらなる推定は、このシミュレーションにおいては考慮しなかった。
導入
種々の幾何学的パターンを通る流れの小規模な傾向を見出すために、単純な計算流体力学（ＣＦＤ）モデルを構築および実行した。このシミュレーションの狙いは、（多くの概括論とともに）単純なパイプラインを確立して、ＤＡＳＨ装置の内部の流れの挙動を推定することである。次いで、この情報は新しいＤＡＳＨ装置の設計のため、および生成機構の推定のための補助として使用された。このシミュレーションの範囲はマイクロスケールであり、装置の内部の流れの全体的な挙動を観察することに留意されたい；もつれおよびネットワーク形成を含む流れおよびポリマーのナノスケールの挙動のような詳細な挙動のさらなる推定は、このシミュレーションにおいては考慮しなかった。
【0089】
幾何学的形状の調製
元のＣＡＤ設計（ＧＤＳＩＩ）から二次元ＣＡＤファイルをＤＸＦフォーマットにエクスポートし、次いでＲｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ（Ｒｏｂｅｒｔ ＭｃＮｅｅｌ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にインポートし、Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ＣＦＤ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を使用してシミュレーションした。Ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ内で、元の二次元ＣＡＤファイルを、実際のＤＡＳＨ装置に相当する高さを有する三次元容積に成形した。加工プロセスによって物理的にわずかに丸みを帯びたがモデルにおいては設計されたように正方形のままであった角を含み、実際の物理装置と比較して、この三次元モデルにおいていくつかの単純化を行った。同様に、装置加工プロセスによって起こった実際の物理的ＤＡＳＨ装置における「柱状壁」での任意の丸み付けを直壁として設計した。モデルの入口／出口流路を物理装置の場合と同様だが低い程度で拡張した。これらの流路の拡張は、流れ挙動の変化の提供が非常に少なく、メッシュ数、したがって各繰り返しの計算時間が増大するだけである。
元のＣＡＤ設計（ＧＤＳＩＩ）から二次元ＣＡＤファイルをＤＸＦフォーマットにエクスポートし、次いでＲｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ（Ｒｏｂｅｒｔ ＭｃＮｅｅｌ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にインポートし、Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ＣＦＤ（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を使用してシミュレーションした。Ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ３Ｄ内で、元の二次元ＣＡＤファイルを、実際のＤＡＳＨ装置に相当する高さを有する三次元容積に成形した。加工プロセスによって物理的にわずかに丸みを帯びたがモデルにおいては設計されたように正方形のままであった角を含み、実際の物理装置と比較して、この三次元モデルにおいていくつかの単純化を行った。同様に、装置加工プロセスによって起こった実際の物理的ＤＡＳＨ装置における「柱状壁」での任意の丸み付けを直壁として設計した。モデルの入口／出口流路を物理装置の場合と同様だが低い程度で拡張した。これらの流路の拡張は、流れ挙動の変化の提供が非常に少なく、メッシュ数、したがって各繰り返しの計算時間が増大するだけである。
【0090】
ファイル転送および構成
次いで、ＣＦＤソフトウエア内の作成ソフトウエアにインポートするために、ＲｈｉｎｏモデルをＳＴＥＰファイルとしてエクスポートした。ＣＦＤ内で材料を適用した。幾何学的形状を通って流れる流体について、単純化のために初期設定の水プロファイルを使用した。固体構造については、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｒｕｂｂｅｒの既存の初期設定の材料と同様の以下の特性を適用させた。これらの材料は実験と正確に同じ材料特性を有さないが、これらは目下の目的のための許容可能な概算であった。
次いで、ＣＦＤソフトウエア内の作成ソフトウエアにインポートするために、ＲｈｉｎｏモデルをＳＴＥＰファイルとしてエクスポートした。ＣＦＤ内で材料を適用した。幾何学的形状を通って流れる流体について、単純化のために初期設定の水プロファイルを使用した。固体構造については、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｒｕｂｂｅｒの既存の初期設定の材料と同様の以下の特性を適用させた。これらの材料は実験と正確に同じ材料特性を有さないが、これらは目下の目的のための許容可能な概算であった。
【0091】
シミュレーション
次いで、最大５００回の繰り返しについて、または結果が収束に到達するまで（Ａｕｔｏｄｅｓｋ ＣＦＤソフトウエアによって自動的に検出および停止される）シミュレーションを実行した。シミュレーションの結果の可視化のために、３つの方法を使用した：ヒートマップ、ベクトル場、および粒子トレース。全ての結果の間でヒートマップおよびベクトル場を正規化し、均一性を維持し、容積の下から８μｍに配置した（中点）。１３．８μｍの半径および１．３４ｇ／ｃｍ３の密度を有する粒子を使用して、粒子トレースを行った。これらの粒子を、幾何学的形状の入口面にまいた。
次いで、最大５００回の繰り返しについて、または結果が収束に到達するまで（Ａｕｔｏｄｅｓｋ ＣＦＤソフトウエアによって自動的に検出および停止される）シミュレーションを実行した。シミュレーションの結果の可視化のために、３つの方法を使用した：ヒートマップ、ベクトル場、および粒子トレース。全ての結果の間でヒートマップおよびベクトル場を正規化し、均一性を維持し、容積の下から８μｍに配置した（中点）。１３．８μｍの半径および１．３４ｇ／ｃｍ３の密度を有する粒子を使用して、粒子トレースを行った。これらの粒子を、幾何学的形状の入口面にまいた。
【0092】
ＤＡＳＨデータインポートおよび解析ソフトウエア
ＭＡＴＬＡＢ（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いて、離散フーリエ変換に基づくＤＡＳＨデータ解析ソフトウエアを開発した（図９）。ソフトウエアは、蛍光顕微鏡観察によって捕捉される複数のチャンネル（ＤＡＳＨパターンを含む蛍光チャンネル、全体的な装置概要を含む明視野チャンネル）をインプットとして用いて生の強度画像または動画を使用し、高速フーリエ変換（ＦＦＴ：Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）によって画像に現れたＤＡＳＨパターンの「強度」を定量的に変換および解析する。ソフトウエアは主に病原体検出のためのＤＡＳＨパターンの「二値」検出（パターンの存在／非存在を区別する「裸眼」検出として知られている）の定量測定のために使用されたが、染色方法、生成ミックスのタイプ、および空間周波数にかかわらず、全体的なプロセスは一次元の線または周期的な二次元パターンを有するＤＡＳＨパターンの一般的な定量分析方法として容易に適用し得ることに留意されたい。
ＭＡＴＬＡＢ（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いて、離散フーリエ変換に基づくＤＡＳＨデータ解析ソフトウエアを開発した（図９）。ソフトウエアは、蛍光顕微鏡観察によって捕捉される複数のチャンネル（ＤＡＳＨパターンを含む蛍光チャンネル、全体的な装置概要を含む明視野チャンネル）をインプットとして用いて生の強度画像または動画を使用し、高速フーリエ変換（ＦＦＴ：Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）によって画像に現れたＤＡＳＨパターンの「強度」を定量的に変換および解析する。ソフトウエアは主に病原体検出のためのＤＡＳＨパターンの「二値」検出（パターンの存在／非存在を区別する「裸眼」検出として知られている）の定量測定のために使用されたが、染色方法、生成ミックスのタイプ、および空間周波数にかかわらず、全体的なプロセスは一次元の線または周期的な二次元パターンを有するＤＡＳＨパターンの一般的な定量分析方法として容易に適用し得ることに留意されたい。
【0093】
ここで、本書類中で使用されている全体的なプロセスを簡単に記載する。最初に、生の画像（動画）をインポートし、前処理した。元の生の画像中のランダムな角度のランダムな位置で装置を記録したので、蛍光チャンネルにおけるバックグラウンド値を引くことに加えて、装置の回転および位置を補正し、それに続いて画像をクロッピングすることによって、第一の工程はデータを標準化する必要がある。バックグラウンド強度を、画像中１００ピクセルの平均強度（ＤＡＳＨパターンを含まないチャンバーの内部の領域から選ばれた）から引いた。動画中の全てのフレームについてプロセスを繰り返した。いくつかの場合において、ＰＤＭＳに基づく装置の弾性特性のために、観察の間に装置自体がゆっくり移動した。これらの場合、前処理の前にさらなる画像安定化プロセスを適用して、全てのフレーム全体を通した一貫性を確実にした。書類全体を通して、インポートされた画像および動画を使用した。
【0094】
次に、フレームごとにＦＦＴを画像に適用した。ＣＭＶ病原体検出の場合、網目パターンを有するジグザグの幾何学的形状（図３０、＃９－１）を実験に使用したので、二次元ＦＦＴを変換方法として選択した。試料画像から正方形の領域（３１０ｐｘ×３１０ｐｘ、元のサイズの５００μｍ×５００μｍに相当）を選択し、周波数領域に変換した。動画における全てのフレーム全体を通して同じ位置を選択した。（一次元ＦＦＴの場合、列の各一片（１ｐｘ×３１０ｐｘ）を１つずつ変換した。）変換の後、ＤＡＳＨパターンと一致する空間周波数ピークを選択した。二次元のジグザグの幾何学的形状の場合、対応する角度を有するｆ＝１０（Ｈｚ）の基本周波数を選択した。このプロセスは、典型的なノッチフィルタリング（ｎｏｔｃｈ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）プロセスの「逆」のように解釈し得る。通常、ノッチフィルターは、スペクトルの周期雑音を排除するために、周波数領域画像中の特定のピークを除去する。しかしながら、このＤＡＳＨパターンの場合、特定のスペクトルピークを有するこれらの周期的パターンは、雑音の代わりに信号である（およびその逆）。この方法の強みは、一度ＤＡＳＨパターンを設計すると、次いで調整のためのいかなる任意のパラメータもなしに空間周波数およびパターンの角度が決定論的に定義されたことである。この方法は、全体的な定量分析を大いに単純化し、正確性を確実にし得る。例えば、この二次元ＦＦＴ法は特定の角度を有する特定の空間周波数を選択し得るので、柱への弱いＤＮＡ付着のような他のスペクトルおよび／または角度を有する雑音（同じまたは類似しているが異なる角度を有する周波数を含む）、ならびにランダムな高いバックグラウンドを、実際のＤＡＳＨパターン（信号）から自動的に区別し、雑音として計数し得る。最後に、画像中のＤＡＳＨパターンの信号の信号対雑音比（ＳＮＲ）をフレームごとに計算し（より高いとＤＡＳＨパターン生成がより強い）、生成されたパターンの定量的インジケーターとして使用した（図３３）。
【0095】
ＤＡＳＨに基づく病原体検出
標的のために、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）から採取された配列を使用した。非標的のために、配列変化の合計２塩基対のミスマッチ（ライゲーション部位の両側に１塩基対）を作成した。実験の単純化のために、全標的配列長を３３塩基長に短縮した；ＲＮＡの代わりに、化学的に合成された一本鎖ＤＮＡを使用した。最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９バッファー中の鋳型およびプライマーＤＮＡを含む溶液に標的ＤＮＡを加えることによって、認識を行った。アニーリング方法（－１℃／分で９５℃から室温に）に従って、最終１０単位／μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを１．１９ｍＭ ＡＴＰとともに加え、反応を４℃で一晩放置した。次いで、対応する濃度のライゲーションされた鋳型－プライマー混合物を用いた標準的な方法に従うことによって、増幅のための生成ミックス（ＤＡＳＨパターン生成）を調製した；次いで、０．１μＬ／分で最大４時間、溶液を装置に注入した（図３０、＃９－１）。プロセスの間、タイムラプス動画を記録した；次いで、組織内のソフトウエアを使用して、結果をインポートした。
標的のために、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）から採取された配列を使用した。非標的のために、配列変化の合計２塩基対のミスマッチ（ライゲーション部位の両側に１塩基対）を作成した。実験の単純化のために、全標的配列長を３３塩基長に短縮した；ＲＮＡの代わりに、化学的に合成された一本鎖ＤＮＡを使用した。最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９バッファー中の鋳型およびプライマーＤＮＡを含む溶液に標的ＤＮＡを加えることによって、認識を行った。アニーリング方法（－１℃／分で９５℃から室温に）に従って、最終１０単位／μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼを１．１９ｍＭ ＡＴＰとともに加え、反応を４℃で一晩放置した。次いで、対応する濃度のライゲーションされた鋳型－プライマー混合物を用いた標準的な方法に従うことによって、増幅のための生成ミックス（ＤＡＳＨパターン生成）を調製した；次いで、０．１μＬ／分で最大４時間、溶液を装置に注入した（図３０、＃９－１）。プロセスの間、タイムラプス動画を記録した；次いで、組織内のソフトウエアを使用して、結果をインポートした。
【0096】
ＤＡＳＨ－アビジン／ストレプトアビジンハイブリッド材料
ジグザグパターンの装置（図３０、＃９－１）を用いた標準的なプロトコールを１時間～１時間２０分にわたって使用して、ＤＡＳＨパターンを生成した。ＤＡＳＨパターンが正確に形成されたことを確かめるために、１ｘ最終濃度のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを生成ミックスに含めた。ＤＡＳＨ生成の直後に、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中のテキサスレッド複合アビジンまたはテキサスレッド複合ストレプトアビジンのいずれかの５０μｇ／ｍＬ溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置を通って流した。次いで、新鮮な１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファーを３０分間、装置を通って流して、画像化の前に結合していない任意のタンパク質を除去した。
ジグザグパターンの装置（図３０、＃９－１）を用いた標準的なプロトコールを１時間～１時間２０分にわたって使用して、ＤＡＳＨパターンを生成した。ＤＡＳＨパターンが正確に形成されたことを確かめるために、１ｘ最終濃度のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを生成ミックスに含めた。ＤＡＳＨ生成の直後に、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中のテキサスレッド複合アビジンまたはテキサスレッド複合ストレプトアビジンのいずれかの５０μｇ／ｍＬ溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置を通って流した。次いで、新鮮な１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファーを３０分間、装置を通って流して、画像化の前に結合していない任意のタンパク質を除去した。
【0097】
ＤＡＳＨパターンが装置全体を通して確実に均等に形成されるために、二色のアビジン結合のために全ての入口を通ってＤＡＳＨ生成用溶液を同時にポンプで注入した（それぞれ０．１μＬ／分で）。ＦＩＴＣ結合アビジンとのスペクトル重複を避けるために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは生成ミックスに含めなかった。ＤＡＳＨ形成の後、５０μｇ／ｍＬのテキサスレッド複合アビジンおよび５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ複合アビジンを同時に装置（１つの入口につき１つのアビジンコンジュゲート）に０．１μＬ／分でそれぞれ１時間ポンプで注入した。画像化の前に、装置を１ｘ Ｐｈｉ２９反応バッファーで１５～３０分間洗い流し、バックグラウンドを減少させた。
【0098】
ＤＡＳＨ－量子ドットハイブリッド材料
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなしで、標準的なプロトコールを１時間３０分にわたって使用して、ＤＡＳＨパターンを生成した。ＤＡＳＨ生成の直後に、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中のＦＩＴＣ複合アビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の２５０μｇ／ｍＬ溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置を通って流し、次いで１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中の最終０．２μＭのビオチン標識Ｑｄｏｔ６０５ナノ結晶（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で１０～３０分間、装置を通って流した。ＦＩＴＣ複合アビジン結合プロセスなしに、対照試料を試験した。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなしで、標準的なプロトコールを１時間３０分にわたって使用して、ＤＡＳＨパターンを生成した。ＤＡＳＨ生成の直後に、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中のＦＩＴＣ複合アビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の２５０μｇ／ｍＬ溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置を通って流し、次いで１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中の最終０．２μＭのビオチン標識Ｑｄｏｔ６０５ナノ結晶（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で１０～３０分間、装置を通って流した。ＦＩＴＣ複合アビジン結合プロセスなしに、対照試料を試験した。
【0099】
ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰハイブリッド材料
Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ（Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）から、クエン酸被覆された４０ｎｍおよび５ｎｍ金ナノ粒子を購入した。使用されたオリゴヌクレオチドは、規則正しく、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの５’チオール基と結合させ、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ：トリス（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を使用した脱保護による付着の前に活性化させた。１対５（ＤＮＡ：ＴＣＥＰ）の比でオリゴヌクレオチドをインキュベートした。次いで、脱保護されたＤＮＡを、５ｎｍ金ナノ粒子について８０：１のＤＮＡ：ＡｕＮＰ比で、４０ｎｍについて４２００：１の比で、ＡｕＮＰに加え、最大表面被覆率を確実にし、次いで室温で５００ｒｐｍで一晩振とうした。次いで、８時間の期間にわたって終濃度５００ｍＭまでＮａＣｌをゆっくり加え、ＤＮＡ－ＤＮＡ反発作用を減少させ、ＤＮＡ被覆率をさらに増大させた。次いで、ヌクレアーゼフリー水中の５回の遠心分離によってナノ粒子から塩および過剰なＤＮＡを除いて精製した。
Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ（Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）から、クエン酸被覆された４０ｎｍおよび５ｎｍ金ナノ粒子を購入した。使用されたオリゴヌクレオチドは、規則正しく、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの５’チオール基と結合させ、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ：トリス（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を使用した脱保護による付着の前に活性化させた。１対５（ＤＮＡ：ＴＣＥＰ）の比でオリゴヌクレオチドをインキュベートした。次いで、脱保護されたＤＮＡを、５ｎｍ金ナノ粒子について８０：１のＤＮＡ：ＡｕＮＰ比で、４０ｎｍについて４２００：１の比で、ＡｕＮＰに加え、最大表面被覆率を確実にし、次いで室温で５００ｒｐｍで一晩振とうした。次いで、８時間の期間にわたって終濃度５００ｍＭまでＮａＣｌをゆっくり加え、ＤＮＡ－ＤＮＡ反発作用を減少させ、ＤＮＡ被覆率をさらに増大させた。次いで、ヌクレアーゼフリー水中の５回の遠心分離によってナノ粒子から塩および過剰なＤＮＡを除いて精製した。
【0100】
装置＃９－１を使用した標準的なプロトコールを使用して、ＤＡＳＨパターンを生成した（図３０）。７０分間の生成の後に、最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファーを有するＤＮＡ結合５ｎｍまたは４０ｎｍ ＡｕＮＰ溶液を装置の内部に４５分間流した（０．１μＬ／分）。顕微鏡によってプロセスを常にモニタリングして、ナノ粒子の十分な付着を確実にした。
【0101】
無細胞タンパク質発現
最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファー中の８ｍＭ混合物のｄＮＴＰ、４単位／μＬのＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、および０．５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いた１５ｎＭの最終種濃度で標準的なプロトコールと同様のプロトコールに従うことによって、ＤＡＳＨパターン生成を行った。その後のタンパク質発現工程のためのｓｆＧＦＰの緑色発光波長と重複しないように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの代わりに青色のＨｏｅｃｈｓｔ色素を使用して、ＤＡＳＨパターン生成の確認のためにＤＮＡを染色した。パターン生成が完了するまで、タイムラプス観察によって生成プロセスをモニタリングした。
最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファー中の８ｍＭ混合物のｄＮＴＰ、４単位／μＬのＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、および０．５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いた１５ｎＭの最終種濃度で標準的なプロトコールと同様のプロトコールに従うことによって、ＤＡＳＨパターン生成を行った。その後のタンパク質発現工程のためのｓｆＧＦＰの緑色発光波長と重複しないように、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの代わりに青色のＨｏｅｃｈｓｔ色素を使用して、ＤＡＳＨパターン生成の確認のためにＤＮＡを染色した。パターン生成が完了するまで、タイムラプス観察によって生成プロセスをモニタリングした。
【0102】
ＤＡＳＨパターン生成プロセスの後、タンパク質発現プライマーを０．１μＬ／分で６０分間注入した。プライマー配列を、タンパク質発現を活性化するために、ＤＡＳＨパターンに存在するＴ７プロモーター領域に結合させるよう設計した。次いで、タンパク質発現のために、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳ３０ Ｔ７ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用した。ヌクレアーゼフリー水、Ｓ３０ Ｐｒｅｍｉｘ ＰｌｕｓおよびＳ３０ Ｔ７ Ｅｘｔｒａｃｔ（ともにキットを供給されている）を２．４：４：３．６比で混合し、０．１μＬ／分で注入した。ＤＡＳＨ装置におけるＣＦＰＥの直接的観察のために、ポンプが２０分ごとに停止して滞留時間が増加するようにプログラムして、マイクロ流体装置における蛍光を直接観察した。定量測定のために（図４Ｅ）、装置における合計２時間のＣＦＰＥから溶液を収集し、ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）のＳｙｎｅｒｇｙ ４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（励起光４７５ｎｍ、発光５０８ｎｍのフィルターを有する）を使用して蛍光を測定した。
【0103】
配列
鋳型およびプライマーＤＮＡの組み合わせによって、生成の種を設計した。この開示において、全ての生成および分解実験全体を通して、以下の配列を使用した（いくつかの対照実験、ＤＡＳＨに基づく検出、および無細胞タンパク質発現実験を除く）。
プライマー（Ｔ１ｃ）：ＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＴＣＣＡＡＡＧＣ（配列番号：１）
鋳型（Ｔ２－Ｅｃｏ）：ＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（配列番号：２）
鋳型およびプライマーＤＮＡの組み合わせによって、生成の種を設計した。この開示において、全ての生成および分解実験全体を通して、以下の配列を使用した（いくつかの対照実験、ＤＡＳＨに基づく検出、および無細胞タンパク質発現実験を除く）。
プライマー（Ｔ１ｃ）：ＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＴＣＣＡＡＡＧＣ（配列番号：１）
鋳型（Ｔ２－Ｅｃｏ）：ＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（配列番号：２）
【0104】
記：配列は、５’－＞３’方向で書いた。５’および３’対は、相補配列を表す。ライゲーションプロセスのために、５’リン酸化で鋳型ＤＮＡを調製した。
プライマー（Ｔ１ｃ－ＮＣＴＲＬ）：ＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣ（配列番号：３）
鋳型（Ｔ２－ＮＣＴＲＬ）：ＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧ（配列番号：５）
プライマー（Ｔ１ｃ－ＮＣＴＲＬ）：ＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣ（配列番号：３）
鋳型（Ｔ２－ＮＣＴＲＬ）：ＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧ（配列番号：５）
【0105】
鋳型配列は、ポリＴ配列を使用したリンカーによって連結されたさらなる中央ドメインを有する、プライマー（青色および赤色）に対する相補配列の２つのセグメントで構成される。Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｗｉｎｆｒｅｅグループ（Ｃａｌｔｅｃｈ Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ ＤＮＡｄｅｓｉｇｎウェブサイト）によって、元のＭＡＴＬＡＢバージョンを開発した）上で実行される組織内のバージョンのＤＮＡＤｅｓｉｇｎ ＭＡＴＬＡＢツールボックスによって配列を設計した。病原体検出およびタンパク質発現のような適用のために、特異的配列を有する異なる組の鋳型／プライマーを、生成の種のために設計した。
【0106】
生成の種の調製：ゲル電気泳動
ゲル電気泳動によって、反応の後に１ｘおよび２ｘサイズの環状鋳型が成功裏に形成されたことを確認した。この場合、結果によると、鋳型中の回文配列によって、２ｘ環状鋳型もまた生成され、これが別の鋳型とのハイブリダイゼーションにつながり、二倍の長さで終わった。Ｔ２－ＮＣＴＲＬおよびＴ１ｃ－ＮＣＴＲＬは、ライゲーションの後の１ｘサイズの環状鋳型形成のみを示した。
ゲル電気泳動によって、反応の後に１ｘおよび２ｘサイズの環状鋳型が成功裏に形成されたことを確認した。この場合、結果によると、鋳型中の回文配列によって、２ｘ環状鋳型もまた生成され、これが別の鋳型とのハイブリダイゼーションにつながり、二倍の長さで終わった。Ｔ２－ＮＣＴＲＬおよびＴ１ｃ－ＮＣＴＲＬは、ライゲーションの後の１ｘサイズの環状鋳型形成のみを示した。
【0107】
装置の実験構成
マイクロ流を使用した同時の合成および集合を、配管およびシリンジに連結されたマイクロ流体装置の組み合わせによって具体化した（図８）。調製された生成ミックス溶液を、１ｍＬ ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、および挿入先端としての短いＭｉｃｒｏｇｒｏｕｐ皮下管留置（Ｍｅｄｗａｙ、ＭＡ）に連結されたＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ Ｐｕｒｉ－Ｆｌｅｘ Ａｕｔｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）に引き入れた。溶液を調製した直後に、次いでシリンジをＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ－２０００シリンジポンプ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に付け、注入した。実験の前に、ＤＡＳＨ装置をヌクレアーゼフリー水で事前に満たした；入口および出口の両方もまた、水で覆った。一度生成ミックスが先端に現れると、次いで先端をＤＡＳＨ装置に直ちに挿入する。装置および先端はともに溶液で覆って、プロセスの間に確実に気泡が装置に入らないようにしたことに留意されたい。典型的には、生成ミックスは０．１μＬ／分でＤＡＳＨ装置に注入した。
マイクロ流を使用した同時の合成および集合を、配管およびシリンジに連結されたマイクロ流体装置の組み合わせによって具体化した（図８）。調製された生成ミックス溶液を、１ｍＬ ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、および挿入先端としての短いＭｉｃｒｏｇｒｏｕｐ皮下管留置（Ｍｅｄｗａｙ、ＭＡ）に連結されたＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ Ｐｕｒｉ－Ｆｌｅｘ Ａｕｔｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）に引き入れた。溶液を調製した直後に、次いでシリンジをＨａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＰＨＤ－２０００シリンジポンプ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に付け、注入した。実験の前に、ＤＡＳＨ装置をヌクレアーゼフリー水で事前に満たした；入口および出口の両方もまた、水で覆った。一度生成ミックスが先端に現れると、次いで先端をＤＡＳＨ装置に直ちに挿入する。装置および先端はともに溶液で覆って、プロセスの間に確実に気泡が装置に入らないようにしたことに留意されたい。典型的には、生成ミックスは０．１μＬ／分でＤＡＳＨ装置に注入した。
【0108】
生成－分解／移動／競争実験の構成に関するさらなる記録
生成－分解、移動、および競争実験
生成－分解実験のために、３つの入口を有する設計（図３６、＃１４－２）を設計した。中央の入口（１：＃１４－２カタログ中の赤色）を生成溶液（最終種濃度０．１ｎＭ）に連結させる。横の入口（２：青色、２つの入口に分かれる）を分解用溶液（最終１ｘ Ｐｈｉ２９反応バッファー中のＤＮアーゼＩ（１単位／μＬ））に連結させた。生成用および分解用溶液の両方を０．１μＬ／分で注入した。創発的な移動実験のために、勾配渦度領域を有する２つおよび３つの入口を有するトラック（図４０、４１、４２、＃２２－３、２３－３、２３－４）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。創発的な競争実験のために、勾配渦度領域を有する３つの入口を有するトラック（図４１、＃２３－３）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。
生成－分解、移動、および競争実験
生成－分解実験のために、３つの入口を有する設計（図３６、＃１４－２）を設計した。中央の入口（１：＃１４－２カタログ中の赤色）を生成溶液（最終種濃度０．１ｎＭ）に連結させる。横の入口（２：青色、２つの入口に分かれる）を分解用溶液（最終１ｘ Ｐｈｉ２９反応バッファー中のＤＮアーゼＩ（１単位／μＬ））に連結させた。生成用および分解用溶液の両方を０．１μＬ／分で注入した。創発的な移動実験のために、勾配渦度領域を有する２つおよび３つの入口を有するトラック（図４０、４１、４２、＃２２－３、２３－３、２３－４）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。創発的な競争実験のために、勾配渦度領域を有する３つの入口を有するトラック（図４１、＃２３－３）を使用した。両方の溶液を０．１５μＬ／分で注入した。
【0109】
繰り返される生成－分解実験
一定の合成反応時間を確実にするために、さらなるＴ字路モジュールを有する、３つの入口を有する装置（ＩＤ＃２０－２）を設計した。２時間の合成反応時間（０．１μＬ／分の流速下）に対応する長さの外部配管がＴ字路の出口と２つの入口を有する装置の入口１との間を連結した。Ｐｈｉ２９酵素を含むがｄＮＴＰを含まない反応混合溶液を入口１－１に使用し；Ｐｈｉ２９を含まないが最終２ｍＭ ｄＮＴＰを含む溶液を入口１－２に使用した。１－１および１－２はともに０．０５μＬ／分で注入した。Ｔ字路の中央の貯水器で溶液を混合した；外部配管を通って２時間流れている間に合成が起こった。入口２については、生成－分解実験で使用されたのと同じＤＮアーゼＩ溶液を使用した（０．１μＬ／分で注入した）。
一定の合成反応時間を確実にするために、さらなるＴ字路モジュールを有する、３つの入口を有する装置（ＩＤ＃２０－２）を設計した。２時間の合成反応時間（０．１μＬ／分の流速下）に対応する長さの外部配管がＴ字路の出口と２つの入口を有する装置の入口１との間を連結した。Ｐｈｉ２９酵素を含むがｄＮＴＰを含まない反応混合溶液を入口１－１に使用し；Ｐｈｉ２９を含まないが最終２ｍＭ ｄＮＴＰを含む溶液を入口１－２に使用した。１－１および１－２はともに０．０５μＬ／分で注入した。Ｔ字路の中央の貯水器で溶液を混合した；外部配管を通って２時間流れている間に合成が起こった。入口２については、生成－分解実験で使用されたのと同じＤＮアーゼＩ溶液を使用した（０．１μＬ／分で注入した）。
【0110】
ＳＥＭ観察のための転写方法
ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰパターンを含む試料のＳＥＭ観察のために、粘着テープを基板として使用した「剥離可能な」ＰＤＭＳ装置構成によって、転写可能なＤＡＳＨ装置を調製した。全体的なプロセスを、ＳＥＭ試料調製に加えて、このＤＡＳＨプラットフォームの将来の適用のための一般的な転写技術として使用し得ることに留意されたい。スライドガラス上に逆さまに置くことによって（すなわち、粘着面を上にして）、３Ｍ Ｓｃｏｔｃｈテープ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）を基板として使用し、次いでＰＤＭＳチャンバー装置を優しく上に置き、封をした。前述の典型的な方法に従うことによるＤＡＳＨパターン生成および金ナノ粒子付着の後、－８０℃の冷凍庫で一晩、装置を直ちに冷凍した。次いで、チャンバーの内部の溶液が溶け始める前に、室温でＰＤＭＳ装置を基板から剥離させた。結果として、除去プロセスの間、氷の内部に構造が残るので、ＤＡＳＨパターンが基板側に転写された。
ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰパターンを含む試料のＳＥＭ観察のために、粘着テープを基板として使用した「剥離可能な」ＰＤＭＳ装置構成によって、転写可能なＤＡＳＨ装置を調製した。全体的なプロセスを、ＳＥＭ試料調製に加えて、このＤＡＳＨプラットフォームの将来の適用のための一般的な転写技術として使用し得ることに留意されたい。スライドガラス上に逆さまに置くことによって（すなわち、粘着面を上にして）、３Ｍ Ｓｃｏｔｃｈテープ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）を基板として使用し、次いでＰＤＭＳチャンバー装置を優しく上に置き、封をした。前述の典型的な方法に従うことによるＤＡＳＨパターン生成および金ナノ粒子付着の後、－８０℃の冷凍庫で一晩、装置を直ちに冷凍した。次いで、チャンバーの内部の溶液が溶け始める前に、室温でＰＤＭＳ装置を基板から剥離させた。結果として、除去プロセスの間、氷の内部に構造が残るので、ＤＡＳＨパターンが基板側に転写された。
【0111】
病原体検出に使用される配列
ＣＭＶ標的：ＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣ（配列番号：５）。
非標的：ＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣ（配列番号：６）。
鋳型：ＧＣＣＴＡＧＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＧＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧ（配列番号：７）。
ＤＡＳＨ生成プライマー：ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＧ（配列番号：８）。
ＣＭＶ標的：ＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣ（配列番号：５）。
非標的：ＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣ（配列番号：６）。
鋳型：ＧＣＣＴＡＧＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＧＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧ（配列番号：７）。
ＤＡＳＨ生成プライマー：ＧＴＡＧＡＧＣＧＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＧ（配列番号：８）。
【0112】
ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰハイブリッド材料生成に使用される配列
【化1】
【0113】
リンカーＤＮＡは、ポリＴと、それに続く、Ｔ２－Ｅｃｏ鋳型由来の合成されたＤＮＡの相補配列を有するセグメント（イタリック体で示す）を用いて設計した。上述のコンジュゲーションプロセスのために、５’側にチオール基修飾を加えた。
【0114】
ＤＡＳＨ－酵素機能化方法
５００ｐＭの最終種濃度の標準的なプロトコールに従うことによって、ＤＡＳＨパターン生成を行った。蛍光顕微鏡によって、パターン生成が完了するまで最大４時間、生成プロセスをモニタリングした。パターン生成に従って、Ｂｉｏ－ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のアビジン－ＨＲＰ溶液を、最終１ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを有する最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファー中１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度で調製し、０．１μＬ／分で１時間、装置に注入した。次いで、最終１ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを有する最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファーの溶液を０．１μＬ／分で１時間注ぎ流すことによって、過剰なアビジン－ＨＲＰを洗浄した。ＤＡＳＨパターンに結合したＨＲＰ活性アッセイのために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液を使用した。ＴＭＢ基質溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置に注入した。ＤＡＳＨパターンからのＨＲＰ活性の局在の確認のために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のＱｕａｎｔａＲｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＲＰ反応をモニタリングした。１ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬのＱｕａｎｔａＲｅｄ溶液を、０．１μＬ／分の流速で装置に注入し、蛍光顕微鏡によって、最大２時間連続的にモニタリングした。
５００ｐＭの最終種濃度の標準的なプロトコールに従うことによって、ＤＡＳＨパターン生成を行った。蛍光顕微鏡によって、パターン生成が完了するまで最大４時間、生成プロセスをモニタリングした。パターン生成に従って、Ｂｉｏ－ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のアビジン－ＨＲＰ溶液を、最終１ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを有する最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファー中１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度で調製し、０．１μＬ／分で１時間、装置に注入した。次いで、最終１ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを有する最終１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩバッファーの溶液を０．１μＬ／分で１時間注ぎ流すことによって、過剰なアビジン－ＨＲＰを洗浄した。ＤＡＳＨパターンに結合したＨＲＰ活性アッセイのために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液を使用した。ＴＭＢ基質溶液を、０．１μＬ／分で１時間、装置に注入した。ＤＡＳＨパターンからのＨＲＰ活性の局在の確認のために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のＱｕａｎｔａＲｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＲＰ反応をモニタリングした。１ｎｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬのＱｕａｎｔａＲｅｄ溶液を、０．１μＬ／分の流速で装置に注入し、蛍光顕微鏡によって、最大２時間連続的にモニタリングした。
【0115】
無細胞タンパク質発現に使用される、さらなる方法および配列
生成の種の調製
ｓｆＧＦＰ（ｓｕｐｅｒ－ｆｏｌｄｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）配列を含むプラスミドを使用することによって、ＤＡＳＨ生成の種のための環状ＤＮＡ鋳型を調製した。最初に、最終０．２５単位／μＬのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のＮｂ．ＢｓｍＩニッキングエンドヌクレアーゼと混合されたＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の最終１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒの溶液中で１００ｎｇのプラスミドを調製した。溶液を６５℃で５時間インキュベートし、その後８０℃で２０分間、次いで－１℃／分で室温まで冷却して、酵素不活性化工程を行った。次に、最終０．２単位／μＬのエキソヌクレアーゼＩおよび最終１単位／μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩを、次いで加え、反応物を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、エキソヌクレアーゼを８０℃で２０分間不活性化し、その後－１℃／分で室温までアニーリングプロセスを行った。ゲルバンドから、元の二本鎖プラスミドＤＮＡからの、環状鋳型ＤＮＡの形成の成功が示された。次いで、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の３０ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターを反応溶液１μｌあたり８μｌのヌクレアーゼフリー水とともに使用すること、および１０，０００ｘｇでの遠心分離によって、一本鎖環状鋳型を含む溶液をバッファー交換した。鋳型を収集する前に、水の添加、およびそれに続く遠心分離を２回繰り返した。次いで、９５℃から室温まで－１℃／分で溶液をアニーリングすることによって、ＤＡＳＨ生成プライマーを１：１モル比で鋳型にハイブリダイゼーションした。
配列
ＤＡＳＨ生成プライマー：ＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣ（配列番号：１０）
タンパク質発現プライマー：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１１）
緑色蛍光タンパク質発現鋳型（プラスミド）（配列番号：１２）。
生成の種の調製
ｓｆＧＦＰ（ｓｕｐｅｒ－ｆｏｌｄｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）配列を含むプラスミドを使用することによって、ＤＡＳＨ生成の種のための環状ＤＮＡ鋳型を調製した。最初に、最終０．２５単位／μＬのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のＮｂ．ＢｓｍＩニッキングエンドヌクレアーゼと混合されたＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の最終１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒの溶液中で１００ｎｇのプラスミドを調製した。溶液を６５℃で５時間インキュベートし、その後８０℃で２０分間、次いで－１℃／分で室温まで冷却して、酵素不活性化工程を行った。次に、最終０．２単位／μＬのエキソヌクレアーゼＩおよび最終１単位／μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩを、次いで加え、反応物を３７℃で５時間インキュベートした。次いで、エキソヌクレアーゼを８０℃で２０分間不活性化し、その後－１℃／分で室温までアニーリングプロセスを行った。ゲルバンドから、元の二本鎖プラスミドＤＮＡからの、環状鋳型ＤＮＡの形成の成功が示された。次いで、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の３０ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターを反応溶液１μｌあたり８μｌのヌクレアーゼフリー水とともに使用すること、および１０，０００ｘｇでの遠心分離によって、一本鎖環状鋳型を含む溶液をバッファー交換した。鋳型を収集する前に、水の添加、およびそれに続く遠心分離を２回繰り返した。次いで、９５℃から室温まで－１℃／分で溶液をアニーリングすることによって、ＤＡＳＨ生成プライマーを１：１モル比で鋳型にハイブリダイゼーションした。
配列
ＤＡＳＨ生成プライマー：ＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣ（配列番号：１０）
タンパク質発現プライマー：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１１）
緑色蛍光タンパク質発現鋳型（プラスミド）（配列番号：１２）。
【実施例3】
【0116】
ＤＡＳＨパターン形成プロセスの対照実験
大きい（ゲル様）ネットワークの予備形成後の再分布
同時の合成および形成の代わりに、対照のために、予備形成されたＤＮＡネットワークをＤＡＳＨ装置の内部に再分布させた。０．６ｍＬチューブ内で生成ミックス（最終０．５ｎＭ）を室温で１、２、４時間インキュベートし、次いで９０℃まで２０分間加熱し、氷によって直ちにクエンチし、装置を通過して２時間流した（０．１μＬ／分）。試料を加熱して、集合（装置－流れ）プロセスの間に酵素反応を不活性化してさらなる合成を停止し、その後で直ちにクエンチしてネットワークの形成を促進したことに留意されたい。同等な条件（装置タイプ、流速、種濃度）で、ＤＡＳＨ構造は、典型的には、反応の開始のおよそ２．５時間後に、繊維状のネットワーク構造を形成し始める。しかしながら、全ての試料は、この条件を有する装置全体を通して、ランダムなゲル様集合体を作り出した；ＤＡＳＨパターンは観察されなかった。この結果から、小さいネットワーク（およびｉｎ ｓｉｔｕのネットワーク形成）の再分布がＤＡＳＨ形成の背後の重要な機構の１つであり得ることが示唆される（すなわち、予備形成された大きい集合体は、一度それらが形成されると、再分布プロセスの間に繊維状パターンへと形態を容易に変化させ得ない）。
大きい（ゲル様）ネットワークの予備形成後の再分布
同時の合成および形成の代わりに、対照のために、予備形成されたＤＮＡネットワークをＤＡＳＨ装置の内部に再分布させた。０．６ｍＬチューブ内で生成ミックス（最終０．５ｎＭ）を室温で１、２、４時間インキュベートし、次いで９０℃まで２０分間加熱し、氷によって直ちにクエンチし、装置を通過して２時間流した（０．１μＬ／分）。試料を加熱して、集合（装置－流れ）プロセスの間に酵素反応を不活性化してさらなる合成を停止し、その後で直ちにクエンチしてネットワークの形成を促進したことに留意されたい。同等な条件（装置タイプ、流速、種濃度）で、ＤＡＳＨ構造は、典型的には、反応の開始のおよそ２．５時間後に、繊維状のネットワーク構造を形成し始める。しかしながら、全ての試料は、この条件を有する装置全体を通して、ランダムなゲル様集合体を作り出した；ＤＡＳＨパターンは観察されなかった。この結果から、小さいネットワーク（およびｉｎ ｓｉｔｕのネットワーク形成）の再分布がＤＡＳＨ形成の背後の重要な機構の１つであり得ることが示唆される（すなわち、予備形成された大きい集合体は、一度それらが形成されると、再分布プロセスの間に繊維状パターンへと形態を容易に変化させ得ない）。
【0117】
大きいゲル様ネットワークの予備形成なしの再分布
ＤＡＳＨ生成の間の形成プロセスを明らかにするために、別の対照実験を行った。最適なタイミング（２．５時間）で、しかしこの時はクエンチによってゲル様の大きい集合体の予備形成を促進することなく（すなわち、全てのプロセスは室温で行われた）、予め合成されたＤＮＡ（Ｔ２－ＮＣＴＲＬ鋳型、最終５ｎＭ）の再分布を試験した。ここで、０．６ｍＬチューブ内の２．５時間の成長の後、熱に基づく酵素反応の不活性化を使用する代わりに、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのプロテイナーゼＫ（最終０．０２単位／μＬ）を混合した。次いで、溶液を０．１μＬ／分で４時間流した。
ＤＡＳＨ生成の間の形成プロセスを明らかにするために、別の対照実験を行った。最適なタイミング（２．５時間）で、しかしこの時はクエンチによってゲル様の大きい集合体の予備形成を促進することなく（すなわち、全てのプロセスは室温で行われた）、予め合成されたＤＮＡ（Ｔ２－ＮＣＴＲＬ鋳型、最終５ｎＭ）の再分布を試験した。ここで、０．６ｍＬチューブ内の２．５時間の成長の後、熱に基づく酵素反応の不活性化を使用する代わりに、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのプロテイナーゼＫ（最終０．０２単位／μＬ）を混合した。次いで、溶液を０．１μＬ／分で４時間流した。
【0118】
結果から、この方法で（非自律的に、手動の操作に基づいて）、予め合成された長いＤＮＡが再分布され得、ＤＡＳＨパターンを形成し得ることが示される。しかしながら、この場合、単純に、おそらくより小さい予備形成されたネットワークの形態で、合成された長いＤＮＡの再分布により形成が起こるので、装置の内部に不均一なパターンが観察される（すなわち、上流側（画像の右半分）のみが繊維状パターンを含んでいた）。本文で言及されるように、連続的かつ自律的合成および流れ、特に渦度は、柱の側面でのネットワークの局所的形成を誘発するのに重要であり、そのため装置の内部のＤＡＳＨパターンの均一な生成につながる。
【0119】
形成プロセスの間のＤＮＡハイブリダイゼーションの寄与
最後に、上に示した実験と同様に再分布を使用して、ネットワーク形成の背後の機構をさらに調べる。最終５ｎＭ濃度のＴ２－ＮＣＴＲＬ鋳型を、生成ミックスに使用した。ここで、チューブにおける２．５時間の合成の後、プロテイナーゼＫを先の試験と同様に混合し、次いでホルムアミド（最終５０％）もまた溶液に混合した。ホルムアミドを使用することは、ＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための周知の方法であり、基本的に、直鎖様式の二本鎖の融解温度を、ホルムアミドの各パーセントについておよそ０．６５℃低下させる。
最後に、上に示した実験と同様に再分布を使用して、ネットワーク形成の背後の機構をさらに調べる。最終５ｎＭ濃度のＴ２－ＮＣＴＲＬ鋳型を、生成ミックスに使用した。ここで、チューブにおける２．５時間の合成の後、プロテイナーゼＫを先の試験と同様に混合し、次いでホルムアミド（最終５０％）もまた溶液に混合した。ホルムアミドを使用することは、ＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための周知の方法であり、基本的に、直鎖様式の二本鎖の融解温度を、ホルムアミドの各パーセントについておよそ０．６５℃低下させる。
【0120】
三つ組の試験から、ホルムアミド処理の後の試料を使用して、ＤＡＳＨパターンが観察されなかったことが示された。前の節で示された、成功した再分布結果と比較して、結果から、長いＤＮＡポリマーによる物理的なもつれに加えて、ハイブリダイゼーションがこの生成プロセスにおいて少なくとも一部の役割を果たすことが示唆される。
【実施例4】
【0121】
繊維状ネットワークにおけるＤＡＳＨパターンおよび球状構造のＳＥＭ画像
測定
試料ＳＥＭ画像から選ばれた、合計３０個の点を使用して、ＤＡＳＨパターンに見られる球状構造の直径を測定した（補足図Ｓ１２）。０．２６±０．１０μｍの平均を得た。
測定
試料ＳＥＭ画像から選ばれた、合計３０個の点を使用して、ＤＡＳＨパターンに見られる球状構造の直径を測定した（補足図Ｓ１２）。０．２６±０．１０μｍの平均を得た。
【0122】
ＤＡＳＨ形成のための、ｓｓＤＮＡの推定される臨界分子量
製造業者によって提供された技術仕様書に従うことによって、反応によって合成された平均ｓｓＤＮＡ長を、概略的に推定し得る。製造業者によると、１単位のＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９は、３０分の間に２５ｐｍｏｌのｄＮＴＰを処理し得、すなわち、１時間の間に５０ｐｍｏｌのｄＮＴＰをｓｓＤＮＡに組み込む。典型的な反応は、最終５ｎＭの生成の種濃度で５．７単位／μＬの酵素を含む。このパラメータに基づく１時間の合成の後のｓｓＤＮＡの平均長は：
製造業者によって提供された技術仕様書に従うことによって、反応によって合成された平均ｓｓＤＮＡ長を、概略的に推定し得る。製造業者によると、１単位のＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９は、３０分の間に２５ｐｍｏｌのｄＮＴＰを処理し得、すなわち、１時間の間に５０ｐｍｏｌのｄＮＴＰをｓｓＤＮＡに組み込む。典型的な反応は、最終５ｎＭの生成の種濃度で５．７単位／μＬの酵素を含む。このパラメータに基づく１時間の合成の後のｓｓＤＮＡの平均長は：
【数1】
【0123】
例えば、５ｎＭの生成の種濃度を用いた装置＃９－１（図３０）に必要な典型的な最小生成時間は、およそ２時間であった。よって、この場合、Ｎ（２時間）の平均長＝１．１×１０５ｎｔ、すなわち、３．３×１０７の分子量である（１０００万Ｄａを超える分子質量）を、この条件下でのＤＡＳＨ形成のための臨界分子量の概略的推定として計算した。
【実施例5】
【0124】
渦度および流速の感度分析のための対照実験
柱の側面でのＤＡＳＨ生成と流れ（速度（ｒａｔｅ）、速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、渦度）の間の関係を概略的に理解するために、同じ柱の幾何学的形状を有する装置を使用した実際の実験およびＣＦＤシミュレーションを使用して、いくつかのさらなる測定および比較を行った。
柱の側面でのＤＡＳＨ生成と流れ（速度（ｒａｔｅ）、速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、渦度）の間の関係を概略的に理解するために、同じ柱の幾何学的形状を有する装置を使用した実際の実験およびＣＦＤシミュレーションを使用して、いくつかのさらなる測定および比較を行った。
【0125】
３つのチャンバーを有する装置を使用した実験
３つのチャンバーを有する装置（図３８、＃１２－１）を使用して、流速とＤＡＳＨ生成開始時間との間の関係を測定した。全部で３つのチャンバーは、同じ柱寸法を共有した（＃３－１と同じ）；メインチャンバーの幅（狭い：１７５μｍ、中位：３８５μｍ、広い：８０５μｍ）のみが異なった。顕微鏡の最大画像捕捉サイズに基づいて、幅を決定した。この設計によって、１つの試験において、同じ柱設計で３つの異なる流速での同時のＤＡＳＨ生成試験が可能になった。シミュレーションおよび実際の実験の両方において、３つの流速（遅い：０．１１５５μＬ／分、中位：０．２３１μＬ／分、速い：０．４６２μＬ／分）を選択した。真ん中のチャンバー（例えば、０．１μＬ／分の流速（およそ０．２～０．５ｍｍ／秒の間）での装置＃３－１（５００μｍ幅））での標準的な実験（１つの入口を有する装置（１－ｉｎｌｅｔ ｄｅｖｉｃｅ）で）の同等の流速を有するために、真ん中の流速を設定した。ＣＦＤシミュレーション結果から、意図した通り、チャンバーの幅および流速に対応する、装置の内部の流速および渦度の差が成功裏に示された（図１０Ａ～１０Ｃおよび図１１Ａ～１１Ｃ）。
３つのチャンバーを有する装置（図３８、＃１２－１）を使用して、流速とＤＡＳＨ生成開始時間との間の関係を測定した。全部で３つのチャンバーは、同じ柱寸法を共有した（＃３－１と同じ）；メインチャンバーの幅（狭い：１７５μｍ、中位：３８５μｍ、広い：８０５μｍ）のみが異なった。顕微鏡の最大画像捕捉サイズに基づいて、幅を決定した。この設計によって、１つの試験において、同じ柱設計で３つの異なる流速での同時のＤＡＳＨ生成試験が可能になった。シミュレーションおよび実際の実験の両方において、３つの流速（遅い：０．１１５５μＬ／分、中位：０．２３１μＬ／分、速い：０．４６２μＬ／分）を選択した。真ん中のチャンバー（例えば、０．１μＬ／分の流速（およそ０．２～０．５ｍｍ／秒の間）での装置＃３－１（５００μｍ幅））での標準的な実験（１つの入口を有する装置（１－ｉｎｌｅｔ ｄｅｖｉｃｅ）で）の同等の流速を有するために、真ん中の流速を設定した。ＣＦＤシミュレーション結果から、意図した通り、チャンバーの幅および流速に対応する、装置の内部の流速および渦度の差が成功裏に示された（図１０Ａ～１０Ｃおよび図１１Ａ～１１Ｃ）。
【0126】
渦度／速度およびＤＡＳＨ生成開始時間との間の関係
実際の実験でかかったＤＡＳＨ生成の開始時間に対して、柱の側面の平均渦度を比較した。５ｎＭの生成の種濃度で＃１２－１装置を使用し、上述の３つの異なる流速を設定することによって、実際の実験を試験した；蛍光顕微鏡によって各生成プロセスを測定した（１５０秒／フレーム）。一次元フーリエ変換に基づく、生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（ＳＮＲ）計算を、行ごと、チャンバーごと、およびフレームごとに実行し、次いで各チャンバーにおいて６つの連続した行の試料（行番号２１３～２１８）を選択し、各条件のＤＡＳＨ生成プロセスを表す試料データとして平均値を使用する（図１２）。２．０のＳＮＲ値を、定量的に生成開始時点を決定する任意の閾値として設定した；各試料において閾値を上回る時点（フレーム番号）を、ＤＡＳＨ生成の開始フレームとして記録した。装置の内部の「特徴的な」流速（μｍ／秒）がグラフ中の凡例として使用されたことに留意されたい；値は、チャンバーの断面サイズに基づいて単純に計算した（Ｗ×Ｈ（μｍ２）；Ｗ＝チャンバー幅、Ｈ＝１７．４μｍおよび流速（μＬ／分）。次いで、それぞれの条件下で各特徴的な流速を、ＣＦＤシミュレーションによって渦度に変換した。特徴的な流速と渦度との間のプロットから、２つの値の間の明らかな相関が示された。
実際の実験でかかったＤＡＳＨ生成の開始時間に対して、柱の側面の平均渦度を比較した。５ｎＭの生成の種濃度で＃１２－１装置を使用し、上述の３つの異なる流速を設定することによって、実際の実験を試験した；蛍光顕微鏡によって各生成プロセスを測定した（１５０秒／フレーム）。一次元フーリエ変換に基づく、生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（ＳＮＲ）計算を、行ごと、チャンバーごと、およびフレームごとに実行し、次いで各チャンバーにおいて６つの連続した行の試料（行番号２１３～２１８）を選択し、各条件のＤＡＳＨ生成プロセスを表す試料データとして平均値を使用する（図１２）。２．０のＳＮＲ値を、定量的に生成開始時点を決定する任意の閾値として設定した；各試料において閾値を上回る時点（フレーム番号）を、ＤＡＳＨ生成の開始フレームとして記録した。装置の内部の「特徴的な」流速（μｍ／秒）がグラフ中の凡例として使用されたことに留意されたい；値は、チャンバーの断面サイズに基づいて単純に計算した（Ｗ×Ｈ（μｍ２）；Ｗ＝チャンバー幅、Ｈ＝１７．４μｍおよび流速（μＬ／分）。次いで、それぞれの条件下で各特徴的な流速を、ＣＦＤシミュレーションによって渦度に変換した。特徴的な流速と渦度との間のプロットから、２つの値の間の明らかな相関が示された。
【0127】
これらのデータに基づいて、渦度とＤＡＳＨ生成開始時間との間の比較をプロットした。グラフから、渦度と生成開始時間の逆関数との間の相関（１／フレーム）が概略的に示され、渦度およびＤＡＳＨ生成開始時間は逆相関（すなわち、より高い渦度は、より早い生成開始時間を生じる）を有することが示唆された。
【実施例6】
【0128】
異なる柱の形状の間の渦度比較
シミュレーション
材料および方法（実施例２）で言及されたプロトコールに基づいて、種々の装置の幾何学的形状のＣＦＤシミュレーションを試験した。具体的には、正方形の柱（図２８、＃３－１）および菱形の柱（図３９、＃３－２）の装置は、装置の、同じ全体的な幾何学的形状を共有する（柱の間の同じ周期性、柱の数、および柱の同じ幅を含む）が、柱の形状が異なる。結果として、全体的な流速はほとんど同一になった（図１３Ａ～１３Ｂ）が、柱の側面での渦度の大きさは、正方形の柱と比較して、菱形の柱では、その流線型の形状のために大幅に減少した（図１４Ａ～１４Ｂ）。２つの幾何学的形状の間のこの差を、柱の側面の高い渦度の領域の程度およびサイズの差がＤＡＳＨ生成プロセスに影響を与えるか否かの比較のためのモデルケースとして使用し得る。
シミュレーション
材料および方法（実施例２）で言及されたプロトコールに基づいて、種々の装置の幾何学的形状のＣＦＤシミュレーションを試験した。具体的には、正方形の柱（図２８、＃３－１）および菱形の柱（図３９、＃３－２）の装置は、装置の、同じ全体的な幾何学的形状を共有する（柱の間の同じ周期性、柱の数、および柱の同じ幅を含む）が、柱の形状が異なる。結果として、全体的な流速はほとんど同一になった（図１３Ａ～１３Ｂ）が、柱の側面での渦度の大きさは、正方形の柱と比較して、菱形の柱では、その流線型の形状のために大幅に減少した（図１４Ａ～１４Ｂ）。２つの幾何学的形状の間のこの差を、柱の側面の高い渦度の領域の程度およびサイズの差がＤＡＳＨ生成プロセスに影響を与えるか否かの比較のためのモデルケースとして使用し得る。
【0129】
生成時間比較実験
渦度の差による効果を調べるために、正方形および菱形の柱の装置の両方から生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（ＳＮＲ）を、プロセスの間のタイムラプス観察によって実験的に測定した。値は、各フレームで観察された、生成されたＤＡＳＨパターン（一次元の線パターン）の「強度」を定量的に表す（より高いＳ／Ｎは、より強いパターン生成を表す）。同じ実験条件で（０．５ｎＭの生成の種濃度、０．１μＬ／分の流速）、三つ組（赤色：四角形の柱、青色：菱形の柱）で試験を実行した。
渦度の差による効果を調べるために、正方形および菱形の柱の装置の両方から生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（ＳＮＲ）を、プロセスの間のタイムラプス観察によって実験的に測定した。値は、各フレームで観察された、生成されたＤＡＳＨパターン（一次元の線パターン）の「強度」を定量的に表す（より高いＳ／Ｎは、より強いパターン生成を表す）。同じ実験条件で（０．５ｎＭの生成の種濃度、０．１μＬ／分の流速）、三つ組（赤色：四角形の柱、青色：菱形の柱）で試験を実行した。
【0130】
結果（図１５）から、２つのタイプの柱の形状の間の差に明らかな傾向があることが示された；正方形の柱を有する装置は、流速および種濃度を含む他のパラメータが同じでも、菱形の柱の装置よりも速くＤＡＳＨパターンを生成した。結果から、柱の側面での渦度の差が生成プロセスに影響を及ぼしたことが示唆される（より高い渦度は、より速い生成をもたらす）。
【実施例7】
【0131】
ＤＡＳＨパターンの生成－分解
ＦＳＡ表示
ロボット工学、システムエンジニアリングおよびコンピュータサイエンスにおいて一般的に使用される数学的モデルである有限状態オートマトン（ＦＳＡ）として、連続的生成および分解挙動を記載する（図３Ｂ）。
Ｍ：Ｑ＝｛開始、成長、崩壊｝
Σ＝｛開始した生成、変化した流れ、完了した消化｝
Ｆ＝｛開始｝
ＦＳＡ表示
ロボット工学、システムエンジニアリングおよびコンピュータサイエンスにおいて一般的に使用される数学的モデルである有限状態オートマトン（ＦＳＡ）として、連続的生成および分解挙動を記載する（図３Ｂ）。
Ｍ：Ｑ＝｛開始、成長、崩壊｝
Σ＝｛開始した生成、変化した流れ、完了した消化｝
Ｆ＝｛開始｝
【0132】
ここで、Ｑは一組の状態（挙動）を表し、Σは一組の入力刺激（各挙動の解発因）、Ｆは最終状態である。モデルによって、開始、成長、および崩壊のような３つの異なる状態を使用して個別に全体的な挙動の概算が可能になる。開始は、いかなるＤＡＳＨ形成もない開始状態を表す；装置に流入する３つ全ての溶液は層状のままであった。ＤＡＳＨパターン生成は成長状態への状態遷移を誘発する。この状態の間、層状の流れにより、分解ミックスは生成ミックスと分離されたままであるため、同化作用プロセスが起こる。生成されたＤＡＳＨパターンが柱の間のギャップを一度満たし始めると、流れはこの物理的フィードバックによって変化し、そのため状態遷移が起こり、崩壊状態に変化する。生成用および分解用溶液の混合により、異化作用プロセスが装置の内部で優位を占め、そのためパターンが分解する。消化が完了すると、状態は元の開始状態に戻り、ＤＮＡ合成時間が一定に保たれている場合、ループを繰り返し得る。
【0133】
実験結果の詳細な説明
標準的なプロトコールを使用して、タイムラプス動画を記録した。列１２０～１９０の間の行８３７（ＤＡＳＨパターンの複数のセグメントと交差する）の平均強度を測定することによって、本文中の平均蛍光強度プロット（図３Ｃ）をプロットした。複数の位置で同調的に生成／分解が起こったことをさらに示すために、例えば、３つの標本点からの蛍光強度をプロットした。３つ全ての標本点において、およそ２００～２５０分に単一の強度ピークが観察され、これは上述の平均蛍光強度とよく一致する。ＤＡＳＨパターンの３つの異なるセグメントから点を選択した。また、長方形の領域（ＤＡＳＨパターンの２つのセグメントを含む）の平均強度もまた、計算して、挙動が特定の標本点の変則的な挙動によらないが全体的な生成／分解挙動によることをさらに示した。３つの異なるＤＡＳＨ装置からの三つ組の記録は、同様の傾向を成功裏に繰り返した。また、陰性対照試験（ＤＮアーゼＩなしの分解ミックス）は、崩壊挙動を示さなかった。結果から、ＤＡＳＨパターンが生成され（およそ２５０分まで）、次いでＤＮアーゼＩ活性のために同調的に完全に分解されたことが示される。
標準的なプロトコールを使用して、タイムラプス動画を記録した。列１２０～１９０の間の行８３７（ＤＡＳＨパターンの複数のセグメントと交差する）の平均強度を測定することによって、本文中の平均蛍光強度プロット（図３Ｃ）をプロットした。複数の位置で同調的に生成／分解が起こったことをさらに示すために、例えば、３つの標本点からの蛍光強度をプロットした。３つ全ての標本点において、およそ２００～２５０分に単一の強度ピークが観察され、これは上述の平均蛍光強度とよく一致する。ＤＡＳＨパターンの３つの異なるセグメントから点を選択した。また、長方形の領域（ＤＡＳＨパターンの２つのセグメントを含む）の平均強度もまた、計算して、挙動が特定の標本点の変則的な挙動によらないが全体的な生成／分解挙動によることをさらに示した。３つの異なるＤＡＳＨ装置からの三つ組の記録は、同様の傾向を成功裏に繰り返した。また、陰性対照試験（ＤＮアーゼＩなしの分解ミックス）は、崩壊挙動を示さなかった。結果から、ＤＡＳＨパターンが生成され（およそ２５０分まで）、次いでＤＮアーゼＩ活性のために同調的に完全に分解されたことが示される。
【0134】
ＣＦＤシミュレーション
ここで、我々は、制御された蓄積を伴うＤＡＳＨパターンの展開に従って、ＤＡＳＨ装置の内部の流れの挙動をシミュレーションした（補足図Ｓ２４）；構成を単純化するために、我々は、固体領域として認識される、実験から蓄積した領域を追跡し、ＣＦＤシミュレーションを行った。粒子トレースモデル（粒子密度：１．３４ｇ／ｃｍ３；粒子半径：１３．８μｍ、反発係数：０．５）を適用した。中央の入口からの粒子（入口１；生成ミックス）を黒色で着色した；横からの粒子を赤色で着色した。
ここで、我々は、制御された蓄積を伴うＤＡＳＨパターンの展開に従って、ＤＡＳＨ装置の内部の流れの挙動をシミュレーションした（補足図Ｓ２４）；構成を単純化するために、我々は、固体領域として認識される、実験から蓄積した領域を追跡し、ＣＦＤシミュレーションを行った。粒子トレースモデル（粒子密度：１．３４ｇ／ｃｍ３；粒子半径：１３．８μｍ、反発係数：０．５）を適用した。中央の入口からの粒子（入口１；生成ミックス）を黒色で着色した；横からの粒子を赤色で着色した。
【0135】
最初に、黒色の粒子（生成ミックス）のある領域で生成プロセスの間に横からの分解用溶液の効果が最小に維持されるように、層状の流れが流路の内部で２つの個別の領域を作り出し（図１６Ａ）、そのため実際の実験において、装置の中央の領域にＤＡＳＨパターンが生成された。一度装置の中央で制御された蓄積が起こると（図１６Ｂ）、展開の間、この構造変化が溶液を変化させ始め、黒色および赤色の粒子の混合物をもたらす（すなわち、生成用および分解用溶液の混合物）（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）。結果として、分解ミックスは、混合された領域では生成を越え、そのためＤＡＳＨパターンは消化された。ＣＦＤシミュレーションから、成長から崩壊への状態の切り替えが、制御されたＤＡＳＨパターンの蓄積によって誘発された時間空間的フィードバックによることが明らかに示された。
【0136】
繰り返される生成－分解
生成／分解実験と同様に、静的位置での、ＤＡＳＨパターンの繰り返される生成／分解を、装置＃２０－２を使用して試験した。ここで、装置の内部の不可逆的蓄積を最小化し、１２時間の観察全体を通して反復可能な再分布プロセスを可能にするために、我々は合成時間を一定の２時間の反応に制御したことに留意されたい。他の実験と同じく、この実験はまた、人間の操作／介入なしに行われる；全ての生成／分解反応が自律的に実行された。
生成／分解実験と同様に、静的位置での、ＤＡＳＨパターンの繰り返される生成／分解を、装置＃２０－２を使用して試験した。ここで、装置の内部の不可逆的蓄積を最小化し、１２時間の観察全体を通して反復可能な再分布プロセスを可能にするために、我々は合成時間を一定の２時間の反応に制御したことに留意されたい。他の実験と同じく、この実験はまた、人間の操作／介入なしに行われる；全ての生成／分解反応が自律的に実行された。
【0137】
最終０．１ｎＭの生成ミックス溶液を用いて試験を試した。グラフ（図１７）は、列１３５～１６５の間の行８２２（ＤＡＳＨパターンの複数のセグメントと交差する）で平均をとることによる全体的な挙動を示す。また、異なる位置での同調的挙動を示すために、タイムラプス動画から３つの標本点を選択し、強度をプロットした。さらに、現象が特定の標本点の変則的挙動によらないことを示すために、ＤＡＳＨパターン（１つの繊維セグメント）を含む長方形の領域からの平均もまたプロットした。１２時間の試験の間に２つのピークを示すことによって、全ての結果は、２サイクルの生成および分解に全体的な一貫性を示した。同様の結果はまた、異なる濃度の生成ミックス（０．５ｎＭ）を使用することによって繰り返された。
【実施例8】
【0138】
ＤＡＳＨによって駆動される創発的移動挙動
分析
本発明者らは、質量中心プロット（ＣｏＭ）および境界線検出のような２つのパラメータによって、体の移動を定量的に分析した。ＣｏＭは、画像における質量の全体的な移動を表す；境界線は、実体の連続的な移動を示す。
分析
本発明者らは、質量中心プロット（ＣｏＭ）および境界線検出のような２つのパラメータによって、体の移動を定量的に分析した。ＣｏＭは、画像における質量の全体的な移動を表す；境界線は、実体の連続的な移動を示す。
【0139】
ＣｏＭプロット
２つのタイプの一直線のトラック（広い幅：図４０、＃２２－３および狭い幅：図４１、＃２３－３）を用いた移動の間のＤＡＳＨパターンの質量中心（ＣｏＭ）をプロットした（図３Ｄ）。ＣｏＭとタイムラプス画像の左端との間のｘ軸距離を、移動の間プロットした。
２つのタイプの一直線のトラック（広い幅：図４０、＃２２－３および狭い幅：図４１、＃２３－３）を用いた移動の間のＤＡＳＨパターンの質量中心（ＣｏＭ）をプロットした（図３Ｄ）。ＣｏＭとタイムラプス画像の左端との間のｘ軸距離を、移動の間プロットした。
【0140】
値の最初の減少（すなわち、下流側に向かったＣｏＭ移動）は、装置の最左端（下流）のパターンの最初の展開によるものである。（装置の内部でパターン生成が起こらなかったため、初期設定のＣｏＭの位置は画像の中央である；最終的には、ＣｏＭは最下流領域での最初のパターン生成によって移動した。）一度パターンが流れの方向に逆らって上流に向かって移動すると、ＣｏＭはパターンの位置に対応し、移動を正確に表した。一度パターンが装置の右端（最上流領域）に到達すると、ＣｏＭは最終的な位置でほぼ「停止した」。移動の平均速度を、ＣｏＭの最初および最後の位置から１．２ｍｍ／時間（＃２２－３）および２．３ｍｍ／時間（＃２３－３）として計算した。
【0141】
境界線分析
流路中で最も広い連続した領域を占めるＤＡＳＨパターンとして、体を定義した。この定義に基づき、ＭＡＴＬＡＢを使用した以下のアルゴリズムに基づいて境界線分析を計算した。最初に、組織内のソフトウエアを使用して、蛍光顕微鏡からのタイムラプス画像をフレームごとに読み込み、次いで任意の閾値（０．０１５）を使用して二値（黒色および白色）画像に変換した。次いで、二値画像中の「穴」を埋め、体の領域を決定した。最後に、画像中で最も広い、占められた領域をフレームごとに選択し、次いで領域の境界線を、動画に示されるように表示した。
流路中で最も広い連続した領域を占めるＤＡＳＨパターンとして、体を定義した。この定義に基づき、ＭＡＴＬＡＢを使用した以下のアルゴリズムに基づいて境界線分析を計算した。最初に、組織内のソフトウエアを使用して、蛍光顕微鏡からのタイムラプス画像をフレームごとに読み込み、次いで任意の閾値（０．０１５）を使用して二値（黒色および白色）画像に変換した。次いで、二値画像中の「穴」を埋め、体の領域を決定した。最後に、画像中で最も広い、占められた領域をフレームごとに選択し、次いで領域の境界線を、動画に示されるように表示した。
【実施例9】
【0142】
ＤＡＳＨに基づく検出の詳細
ハイブリダイゼーション／ライゲーションに基づく認識、ＤＡＳＨパターン生成に基づく増幅、およびＤＡＳＨパターン認識に基づく読み出しの組み合わせを使用して、ＤＡＳＨに基づく検出を設計した（図１８）。認識プロセスは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの相補配列を有する鋳型を使用する；例を単純化するために、この実証において、陰性対照は、鋳型のライゲーション部位に２塩基対のミスマッチを有する「不正確な」標的配列を使用する。正確な標的および鋳型の組み合わせのみ、鋳型のライゲーション（環状化）が成功に終わり、これによって、次の増幅工程のための酵素的合成プロセスが可能になる。ＤＡＳＨのメソスケールのパターン生成能力を利用することによって、増幅および読み出しの両方が同時かつ自律的に行われたことに留意されたい。
ハイブリダイゼーション／ライゲーションに基づく認識、ＤＡＳＨパターン生成に基づく増幅、およびＤＡＳＨパターン認識に基づく読み出しの組み合わせを使用して、ＤＡＳＨに基づく検出を設計した（図１８）。認識プロセスは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの相補配列を有する鋳型を使用する；例を単純化するために、この実証において、陰性対照は、鋳型のライゲーション部位に２塩基対のミスマッチを有する「不正確な」標的配列を使用する。正確な標的および鋳型の組み合わせのみ、鋳型のライゲーション（環状化）が成功に終わり、これによって、次の増幅工程のための酵素的合成プロセスが可能になる。ＤＡＳＨのメソスケールのパターン生成能力を利用することによって、増幅および読み出しの両方が同時かつ自律的に行われたことに留意されたい。
【0143】
結果
合計７８個のフレームについて（１５０秒／フレーム）を使用して、タイムラプス記録を使用して、陽性および非標的（５ｐＭ～５００ｐＭ）の両方由来の三つ組の試料を観察した。装置の内部のパターンの存在を定量的に表すために、組織内のＦＦＴソフトウエアを使用して、生成結果を分析およびプロットした（図１９Ａ～１９Ｂおよび図２０Ａ～２０Ｂ）。生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（Ｓ／ＮまたはＳＮＲ）の最大値を１つの軸として使用し、チャンバーの内部の平均蛍光強度からの最大値（バックグラウンド強度を引いた後）をプロットすることによって別の軸を使用することによって、比較プロット（図２１）を生成した。ここで、ＳＮＲ表示を使用して、パターンの存在／非存在を定量的に示した（すなわち、定量的に裸眼の読み出しをシミュレーションする）；我々がＳＮＲの任意の閾値＝１５を設定すると、図４Ａに示されるように、結果は我々の定性的観察結果とよく対応した。プロットはまた、我々のパターン認識に基づく検出が、平均強度値（両方の濃度で検出不可能であった）と比較して、標的濃度を用いて検出感度を１０倍より高く（５００ｐＭおよび５０ｐＭで検出可能）向上させ得、陰性対照試料（２塩基対のミスマッチを有する標的配列）と比較して特異性を維持し得るという明らかな比較を示した。
合計７８個のフレームについて（１５０秒／フレーム）を使用して、タイムラプス記録を使用して、陽性および非標的（５ｐＭ～５００ｐＭ）の両方由来の三つ組の試料を観察した。装置の内部のパターンの存在を定量的に表すために、組織内のＦＦＴソフトウエアを使用して、生成結果を分析およびプロットした（図１９Ａ～１９Ｂおよび図２０Ａ～２０Ｂ）。生成されたＤＡＳＨパターンの信号対雑音比（Ｓ／ＮまたはＳＮＲ）の最大値を１つの軸として使用し、チャンバーの内部の平均蛍光強度からの最大値（バックグラウンド強度を引いた後）をプロットすることによって別の軸を使用することによって、比較プロット（図２１）を生成した。ここで、ＳＮＲ表示を使用して、パターンの存在／非存在を定量的に示した（すなわち、定量的に裸眼の読み出しをシミュレーションする）；我々がＳＮＲの任意の閾値＝１５を設定すると、図４Ａに示されるように、結果は我々の定性的観察結果とよく対応した。プロットはまた、我々のパターン認識に基づく検出が、平均強度値（両方の濃度で検出不可能であった）と比較して、標的濃度を用いて検出感度を１０倍より高く（５００ｐＭおよび５０ｐＭで検出可能）向上させ得、陰性対照試料（２塩基対のミスマッチを有する標的配列）と比較して特異性を維持し得るという明らかな比較を示した。
【実施例10】
【0144】
ＤＡＳＨ－アビジンハイブリッド材料
結果から、アビジンが成功裏にＤＡＳＨに結合した（図４Ｂおよび図２２Ａ～２２Ｂ）が対照実験としてのストレプトアビジンでは結合しなかった（図２３Ａ～２３Ｂ）ことが示される。アビジンおよびストレプトアビジンはともに、補酵素ビオチンに結合するそれらの能力が周知である。しかしながら、これらの関連のあるタンパク質の間には、ＤＮＡに対する親和性（ＤＡＳＨパターンを含む）における観察された差を説明する明確な生化学的差がある。最初に、アビジンは、およそ１０の強塩基性の等電点を有し、ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー（ｐＨ７．５）中でそれ自体正味の正電荷を有する。よって、アビジンは高度の負電荷を有するＤＮＡに静電気的に引かれる。一方、ストレプトアビジンは、約５または６のｐＩを有し、そのためＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中でわずかに負の正味電荷を有する。静電引力を越えて、アビジンはグリコシル化されるが、ストレプトアビジンはアビジンと種々の基質との間の非特異的結合の増大に寄与していない。先の研究において、アビジンとＤＮＡとの間の非特異的相互作用は詳細に特徴づけられており、全体的な正電荷およびタンパク質の独特の構造モチーフの両方のために親和性が高いことが示されている。
結果から、アビジンが成功裏にＤＡＳＨに結合した（図４Ｂおよび図２２Ａ～２２Ｂ）が対照実験としてのストレプトアビジンでは結合しなかった（図２３Ａ～２３Ｂ）ことが示される。アビジンおよびストレプトアビジンはともに、補酵素ビオチンに結合するそれらの能力が周知である。しかしながら、これらの関連のあるタンパク質の間には、ＤＮＡに対する親和性（ＤＡＳＨパターンを含む）における観察された差を説明する明確な生化学的差がある。最初に、アビジンは、およそ１０の強塩基性の等電点を有し、ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー（ｐＨ７．５）中でそれ自体正味の正電荷を有する。よって、アビジンは高度の負電荷を有するＤＮＡに静電気的に引かれる。一方、ストレプトアビジンは、約５または６のｐＩを有し、そのためＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファー中でわずかに負の正味電荷を有する。静電引力を越えて、アビジンはグリコシル化されるが、ストレプトアビジンはアビジンと種々の基質との間の非特異的結合の増大に寄与していない。先の研究において、アビジンとＤＮＡとの間の非特異的相互作用は詳細に特徴づけられており、全体的な正電荷およびタンパク質の独特の構造モチーフの両方のために親和性が高いことが示されている。
【0145】
このアビジンに基づく結合は、アビジン－ビオチン相互作用を使用した、アビジン－タンパク質コンジュゲートまたはビオチン結合分子を介したＤＡＳＨパターンのための標準的な機能化方法として利用し得る。本発明者らはさらに、この方法に基づく、量子ドットおよびＨＲＰによるＤＡＳＨパターンの機能化を実証した。
【実施例11】
【0146】
ＤＡＳＨ－量子ドットハイブリッド材料
ＤＡＳＨパターンへの蛍光－アビジンコンジュゲートの結合の成功裏の結果に基づいて、ＤＡＳＨパターンの多用途の機能化方法として、この技術を拡張させた。「サンドイッチ」結合方法を使用することによって、ＤＡＳＨパターンへの量子ドット（Ｑｄｏｔ）付着（ＤＡＳＨ－Ｑｄｏｔ）を試験した。最初に、アビジンをＤＡＳＨパターンに付着させ、次いでアビジン－ビオチン相互作用を使用することによって、ビオチン結合量子ドットを構造に付着させた。
ＤＡＳＨパターンへの蛍光－アビジンコンジュゲートの結合の成功裏の結果に基づいて、ＤＡＳＨパターンの多用途の機能化方法として、この技術を拡張させた。「サンドイッチ」結合方法を使用することによって、ＤＡＳＨパターンへの量子ドット（Ｑｄｏｔ）付着（ＤＡＳＨ－Ｑｄｏｔ）を試験した。最初に、アビジンをＤＡＳＨパターンに付着させ、次いでアビジン－ビオチン相互作用を使用することによって、ビオチン結合量子ドットを構造に付着させた。
【0147】
陽性および対照実験
陽性および対照試料の両方を三つ組を用いて試験して、結果の一貫性を確認した。陽性および対照試料からの代表的な結果を示した（図４Ｃおよび図２４Ａ～２４Ｄ）。結果から、陽性試料（アビジンおよび次いでＱｄｏｔを有する）のみが、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファーで１時間のさらなる洗浄後でもＤＡＳＨパターンへのＱｄｏｔの結合に成功したことが明らかに示された。一方、対照試料では結合は観察されなかった（アビジン結合なし）。結果から、Ｑｄｏｔの機能化の成功が示され、また、Ｑｄｏｔの結合機構が実際にアビジン－ビオチン相互作用に基づくことが示唆される。この結果は、ＨＲＰ結合での結果とともに、この「サンドイッチ」方法（アビジンを使用し、次いでビオチン結合標的分子を使用する）によるＤＡＳＨの機能化を、有機（タンパク質）から無機（ナノ粒子）までの幅広い分子まで拡張し得ることを示唆する。
陽性および対照試料の両方を三つ組を用いて試験して、結果の一貫性を確認した。陽性および対照試料からの代表的な結果を示した（図４Ｃおよび図２４Ａ～２４Ｄ）。結果から、陽性試料（アビジンおよび次いでＱｄｏｔを有する）のみが、１ｘ ＲｅｐｌｉＰＨＩ反応バッファーで１時間のさらなる洗浄後でもＤＡＳＨパターンへのＱｄｏｔの結合に成功したことが明らかに示された。一方、対照試料では結合は観察されなかった（アビジン結合なし）。結果から、Ｑｄｏｔの機能化の成功が示され、また、Ｑｄｏｔの結合機構が実際にアビジン－ビオチン相互作用に基づくことが示唆される。この結果は、ＨＲＰ結合での結果とともに、この「サンドイッチ」方法（アビジンを使用し、次いでビオチン結合標的分子を使用する）によるＤＡＳＨの機能化を、有機（タンパク質）から無機（ナノ粒子）までの幅広い分子まで拡張し得ることを示唆する。
【実施例12】
【0148】
ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰハイブリッド材料
暗視野顕微鏡
暗視野光学顕微鏡によって、強い光散乱による金ナノ粒子の明らかな特徴づけが可能になる。ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰパターンの観察のために、暗視野構成のＯｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２顕微鏡（Ｊａｐａｎ）を使用した（下記の結果のために、４０ｎｍ ＡｕＮＰを使用した）（図４Ｄおよび図２５）。
暗視野顕微鏡
暗視野光学顕微鏡によって、強い光散乱による金ナノ粒子の明らかな特徴づけが可能になる。ＤＡＳＨ－ＡｕＮＰパターンの観察のために、暗視野構成のＯｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２顕微鏡（Ｊａｐａｎ）を使用した（下記の結果のために、４０ｎｍ ＡｕＮＰを使用した）（図４Ｄおよび図２５）。
【0149】
ＳＥＭ
ＤＡＳＨパターンへのＡｕＮＰ－ＤＮＡ付着の成功をＳＥＭによって確認した。試料調製のために、転写可能なＤＡＳＨ装置構成を使用した。金ナノ粒子は、ＤＡＳＨ構造の繊維状の形態に沿って明らかに付着した；いくつかは「針金様の」規則的金ナノ粒子を示す。
ＤＡＳＨパターンへのＡｕＮＰ－ＤＮＡ付着の成功をＳＥＭによって確認した。試料調製のために、転写可能なＤＡＳＨ装置構成を使用した。金ナノ粒子は、ＤＡＳＨ構造の繊維状の形態に沿って明らかに付着した；いくつかは「針金様の」規則的金ナノ粒子を示す。
【実施例13】
【0150】
アビジン－ＨＲＰによるＤＡＳＨパターンの機能化
蛍光－アビジンコンジュゲートおよびビオチン結合分子の（「サンドイッチ」結合方法を介する）、ＤＡＳＨパターンへの結合実験の成功に基づいて、他のアビジン結合機能分子（この場合において酵素）を付着させることによって技術をさらに拡張し、酵素がＤＡＳＨパターン上でその生化学的活性を維持しているか否かを試験した。ここで、モデル酵素としてアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（アビジン－ＨＲＰ）を選択し、ＤＡＳＨパターンに付着させた；酵素活性を測定して、ＤＡＳＨパターンの機能化の成功を示した。
蛍光－アビジンコンジュゲートおよびビオチン結合分子の（「サンドイッチ」結合方法を介する）、ＤＡＳＨパターンへの結合実験の成功に基づいて、他のアビジン結合機能分子（この場合において酵素）を付着させることによって技術をさらに拡張し、酵素がＤＡＳＨパターン上でその生化学的活性を維持しているか否かを試験した。ここで、モデル酵素としてアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（アビジン－ＨＲＰ）を選択し、ＤＡＳＨパターンに付着させた；酵素活性を測定して、ＤＡＳＨパターンの機能化の成功を示した。
【0151】
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液を使用することによって、ＤＡＳＨパターンに結合したＨＲＰの活性を最初に確かめた。キットは、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を青色の（中間）複合体（Ａｍａｘ＝３７０ｎｍおよび６５２ｎｍ）に変換することによって、ＨＲＰ活性を検出する。ＴＭＢの青色の産物は、おそらく負電荷を有するＤＮＡおよび正電荷を有するＴＭＢ産物の静電気的相互作用のために、ＤＡＳＨパターンを直接染色することが見出された。結果はまた、肉眼によっても観察し得る。
【0152】
次に、ＨＲＰ活性がＤＡＳＨパターンに局在化することをさらに確認するために、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＲＰ反応を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のＱｕａｎｔａＲｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ基質キットを使用することによってモニタリングした。ＱｕａｎｔａＲｅｄ基質はＡＤＨＰ（アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）化学蛍光反応を使用し、ＨＲＰと反応することによって、非蛍光化合物から、５７０／５８５ｎｍの励起光／発行の蛍光化合物のレゾルフィンへ変換する。ＱｕａｎｔａＲｅｄ溶液を装置に注入し、蛍光顕微鏡によって連続的にモニタリングした。プロセスの間、産物は、おそらく反応の高い感度のために、装置全体を通して全体的な蛍光が飽和になるまで、ＤＡＳＨパターンの位置に対応して（かつ下流で）実際に展開し始めたことが観察された。
【0153】
ＤＡＳＨパターンからの無細胞タンパク質発現
発現されたタンパク質の定量測定に加えて（図４Ｅ）、ＤＡＳＨパターンからのＣＦＰＥの直接的観察を行った（図４Ｅおよび図２６Ａ～２６Ｂ）。観察は、蛍光顕微鏡を使用することによって、標準的なプロトコールに従った。結果から、ｓｆＧＦＰ発現の成功がＤＡＳＨパターンを有する装置からのみ起こったことが示される。
発現されたタンパク質の定量測定に加えて（図４Ｅ）、ＤＡＳＨパターンからのＣＦＰＥの直接的観察を行った（図４Ｅおよび図２６Ａ～２６Ｂ）。観察は、蛍光顕微鏡を使用することによって、標準的なプロトコールに従った。結果から、ｓｆＧＦＰ発現の成功がＤＡＳＨパターンを有する装置からのみ起こったことが示される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32-1】
【図32-2】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36A】
【図36B】
【図37A】
【図37B】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】
【国際調査報告】