特表2022-526639組換えアデノ随伴ウイルス組成物の特性評価のためのサイズ排除クロマトグラフィーの方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-25
(54)【発明の名称】組換えアデノ随伴ウイルス組成物の特性評価のためのサイズ排除クロマトグラフィーの方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20220518BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20220518BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20220518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 112Z
C12Q1/6806 Z
C12N7/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559728
(86)(22)【出願日】2020-04-10
(85)【翻訳文提出日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 US2020027629
(87)【国際公開番号】W WO2020210600
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/832,364
(32)【優先日】2019-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/839,182
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】518278029
【氏名又は名称】リジェネクスバイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】チー リ
(72)【発明者】
【氏名】ウー ジュチュン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA13
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QS10
4B063QS17
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX01
4B065AA95X
4B065BD14
4B065CA23
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＡＡＶゲノムを単離すること、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定すること、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価すること、及び単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定することに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；およびｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
ｒＡＡＶゲノムを単離する方法。
【請求項2】
ＡＡＶゲノムを回収する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する方法であって、前記方法が、ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【請求項5】
カプシド内のＡＡＶベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法であって、前記方法が、ａ）組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；ならびに
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【請求項6】
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定する方法であって、前記方法が、ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のＶｇを決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【請求項7】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件に、前記組成物を曝露することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるのに必要な最低温度と比べて１０℃以内で上回る温度に、前記組成物を曝露することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす条件に、前記組成物を供することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する熱変性に、前記組成物を曝露することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす熱変性に、前記組成物を供することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を、約６５℃～約９５℃、任意選択で約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃の温度でインキュベートすることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記インキュベートが、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、または約９０℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記インキュベートが約７５℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記インキュベートが約８０℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記インキュベートが約８５℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記インキュベートが、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、または約６０分間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記インキュベートが約１０分間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記インキュベートが約１５分間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記インキュベートが約２０分間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、界面活性剤の存在下で前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記界面活性剤が、ＳＤＳ、臭化トリメチルアンモニウム（ＥＴＭＡＢ）、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはそれらの組合せを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％の濃度を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％のＳＤＳを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記界面活性剤が、約０．０５％のＳＤＳを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項27】
前記変性プロセスによって、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子が変性する、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記変性プロセスによって、試料中の少なくとも約９５％のウイルス粒子が変性する、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階が、前記組成物を、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの公称孔径を備えるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に接触させることを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記公称孔径が、約１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、または４００ｎｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記公称孔径が約２００ｎｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
サイズ排除クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記移動相が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組合せからなる群から選択される塩を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記移動相が、塩化ナトリウムを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記移動相が、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはＢＲＩＪ ３５、及びそれらの組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記移動相が、ポリソルベート８０を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記移動相が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記移動相が、メタノールを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、緩衝剤をさらに含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス、ビス－トリス、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ビシン、グリシン、トリシン、Ｎ－グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、及びメタノールを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記移動相が、約５ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１００ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０１％～約０．５％のポリソルベート８０、及び約５％～約５０％のメタノールを含み、かつ約６．０～８．５のｐＨを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記移動相が、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約３００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０５％のポリソルベート８０、及び約２０％のメタノールを含み、かつ約７．５のｐＨを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物が、約２Ｅ＋１０ゲノムコピー／ｍｌ～約１Ｅ＋１４ゲノムコピー／ｍｌを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＡＡＶゲノムを単離すること、およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物を特性評価することに関する。
【背景技術】
【0002】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクターシステムの使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における点で、送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的とし、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベース遺伝子療法がより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用され得る前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクターシステムの使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における点で、送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的とし、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベース遺伝子療法がより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用され得る前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
【0003】
製品の純度は、安全性と有効性に影響を及ぼし得る治療用生物製剤の重要な品質属性であるため、リリース試験を含む管理の保証が重要である。ＡＡＶベクターゲノムは細胞核に送達され、カプシドタンパク質よりもはるかに長く、長期間持続し得る。したがって、ＡＡＶ製品のベクターゲノム純度を評価することが望ましい。空のカプシドと完全なカプシドの比を定量化するインタクトなＡＡＶの相対純度は、分析用超遠心法（ＡＵＣ）、低温電子顕微鏡法、及びイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。さらに、充填不完全なカプシドと呼ばれることが多い、断片化ゲノム及び非導入遺伝子に関連するＤＮＡ混入物を有するベクターの存在は、ＡＵＣによって解決することができる。カプシドタンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＳＤＳ－ＣＧＥで測定することができる。キャピラリー電気泳動及びゲル電気泳動によってＡＡＶゲノムを分析するためのいくつかの研究が発表されているものの、ＡＡＶゲノムの純度に関するコンセンサスのとれた方法は確立されていない。
【0004】
したがって、当技術分野では、ＡＡＶベクターゲノムの純度及び構造を高感度及び高再現性で評価する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0006】
さらなる態様では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を特性評価する方法を提供する。単離されたｒＡＡＶ粒子の特性評価には、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）の決定が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、バッチリリース、例えば、バッチリリース試験及び／またはロットリリース試験に適している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を、ロットリリース試験の一部として実施する。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示は以下を提供する。
【0009】
［１．］
ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；および
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
ｒＡＡＶゲノムを単離する方法。
ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；および
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
ｒＡＡＶゲノムを単離する方法。
【0010】
［２．］
ＡＡＶゲノムを回収する段階をさらに含む、［１］の方法。
ＡＡＶゲノムを回収する段階をさらに含む、［１］の方法。
【0011】
［３．］
約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階をさらに含む、［１］の方法。
約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階をさらに含む、［１］の方法。
【0012】
［４．］
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【0013】
［５．］
カプシド内のＡＡＶベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；ならびに
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
カプシド内のＡＡＶベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法であって、前記方法が、
ａ）組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；ならびに
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【0014】
［６．］
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定する方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のＶｇを決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定する方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階；
ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階；
ｃ）約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方で、溶出液のＵＶ吸光度を測定する段階；ならびに
ｄ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物のＶｇを決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
【0015】
［７．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0016】
［８．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるのに必要な最低温度と比べて１０℃以内で上回る温度に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるのに必要な最低温度と比べて１０℃以内で上回る温度に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0017】
［９．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす条件に、前記組成物を供することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす条件に、前記組成物を供することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0018】
［１０．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する熱変性に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する熱変性に、前記組成物を曝露することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0019】
［１１．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす熱変性に、前記組成物を供することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、ＡＵＣによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する、断片ＤＮＡの割合（％）の決定をもたらす熱変性に、前記組成物を供することを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0020】
［１２．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を、約６５℃～約９５℃、任意選択で約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃の温度でインキュベートすることを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を、約６５℃～約９５℃、任意選択で約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃の温度でインキュベートすることを含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。
【0021】
［１３．］
前記インキュベートが、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、または約９０℃である、［１２］の方法。
前記インキュベートが、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、または約９０℃である、［１２］の方法。
【0022】
［１４．］
前記インキュベートが約７５℃である、［１２］の方法。
前記インキュベートが約７５℃である、［１２］の方法。
【0023】
［１５．］
前記インキュベートが約８０℃である、［１２］の方法。
前記インキュベートが約８０℃である、［１２］の方法。
【0024】
［１６．］
前記インキュベートが約８５℃である、［１２］の方法。
前記インキュベートが約８５℃である、［１２］の方法。
【0025】
［１７．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、［１２］～［１６］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、［１２］～［１６］のいずれか１つの方法。
【0026】
［１８．］
前記インキュベートが、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、または約６０分間である、［１７］の方法。
前記インキュベートが、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、または約６０分間である、［１７］の方法。
【0027】
［１９．］
前記インキュベートが約１０分間である、［１７］の方法。
前記インキュベートが約１０分間である、［１７］の方法。
【0028】
［２０．］
前記インキュベートが約１５分間である、［１７］の方法。
前記インキュベートが約１５分間である、［１７］の方法。
【0029】
［２１．］
前記インキュベートが約２０分間である、［１７］の方法。
前記インキュベートが約２０分間である、［１７］の方法。
【0030】
［２２．］
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、界面活性剤の存在下で前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、［１２］～［２１］のいずれか１つの方法。
前記組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供する段階が、界面活性剤の存在下で前記組成物を約６５℃～約９５℃の温度で約５分～６０分間インキュベートすることを含む、［１２］～［２１］のいずれか１つの方法。
【0031】
［２３．］
前記界面活性剤が、ＳＤＳ、臭化トリメチルアンモニウム（ＥＴＭＡＢ）、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはそれらの組合せを含む、［２２］の方法。
前記界面活性剤が、ＳＤＳ、臭化トリメチルアンモニウム（ＥＴＭＡＢ）、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはそれらの組合せを含む、［２２］の方法。
【0032】
［２４．］
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％の濃度を有する、［２２］の方法。
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％の濃度を有する、［２２］の方法。
【0033】
［２５．］
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％のＳＤＳを含む、［２２］の方法。
前記界面活性剤が、約０．００５％～約０．５％のＳＤＳを含む、［２２］の方法。
【0034】
［２６．］
前記界面活性剤が、約０．０５％のＳＤＳを含む、［２２］の方法。
前記界面活性剤が、約０．０５％のＳＤＳを含む、［２２］の方法。
【0035】
［２７．］
前記変性プロセスによって、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子が変性する、［１２］～［２６］のいずれか１つの方法。
前記変性プロセスによって、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子が変性する、［１２］～［２６］のいずれか１つの方法。
【0036】
［２８．］
前記変性プロセスによって、試料中の少なくとも約９５％のウイルス粒子が変性する、［１２］～［２６］のいずれか１つの方法。
前記変性プロセスによって、試料中の少なくとも約９５％のウイルス粒子が変性する、［１２］～［２６］のいずれか１つの方法。
【0037】
［２９．］
変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階が、前記組成物を、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの公称孔径を備えるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に接触させることを含む、［１］～［２８］のいずれか１つの方法。
変性したｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階が、前記組成物を、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの公称孔径を備えるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に接触させることを含む、［１］～［２８］のいずれか１つの方法。
【0038】
［３０．］
前記公称孔径が、約１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、または４００ｎｍである、［２９］の方法。
前記公称孔径が、約１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、または４００ｎｍである、［２９］の方法。
【0039】
［３１．］
前記公称孔径が約２００ｎｍである、［２９］の方法。
前記公称孔径が約２００ｎｍである、［２９］の方法。
【0040】
［３２．］
サイズ排除クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む、［１］～［３１］のいずれか１つの方法。
サイズ排除クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む、［１］～［３１］のいずれか１つの方法。
【0041】
［３３．］
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む、［１］～［３２］のいずれか１つの方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む、［１］～［３２］のいずれか１つの方法。
【0042】
［３４．］
前記移動相が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組合せからなる群から選択される塩を含む、［１］～［３３］のいずれか１つの方法。
前記移動相が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組合せからなる群から選択される塩を含む、［１］～［３３］のいずれか１つの方法。
【0043】
［３５．］
前記移動相が、塩化ナトリウムを含む、［３４］の方法。
前記移動相が、塩化ナトリウムを含む、［３４］の方法。
【0044】
［３６．］
前記移動相が、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはＢＲＩＪ ３５、及びそれらの組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む、［１］～［３５］のいずれか１つの方法。
前記移動相が、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはＢＲＩＪ ３５、及びそれらの組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む、［１］～［３５］のいずれか１つの方法。
【0045】
［３７．］
前記移動相が、ポリソルベート８０を含む、［３６］の方法。
前記移動相が、ポリソルベート８０を含む、［３６］の方法。
【0046】
［３８．］
前記移動相が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒を含む、［１］～［３７］のいずれか１つの方法。
前記移動相が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒を含む、［１］～［３７］のいずれか１つの方法。
【0047】
［３９．］
前記移動相が、メタノールを含む、［３８］の方法。
前記移動相が、メタノールを含む、［３８］の方法。
【0048】
［４０．］
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、緩衝剤をさらに含む、［１］～［３９］のいずれか１つの方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、緩衝剤をさらに含む、［１］～［３９］のいずれか１つの方法。
【0049】
［４１．］
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス、ビス－トリス、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ビシン、グリシン、トリシン、Ｎ－グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、［４０］の方法。
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス、ビス－トリス、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ビシン、グリシン、トリシン、Ｎ－グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、［４０］の方法。
【0050】
［４２．］
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、［４０］の方法。
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、［４０］の方法。
【0051】
［４３．］
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、及びメタノールを含む、［１］～［４２］のいずれか１つの方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、及びメタノールを含む、［１］～［４２］のいずれか１つの方法。
【0052】
［４４．］
前記移動相が、約５ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１００ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０１％～約０．５％のポリソルベート８０、及び約５％～約５０％のメタノールを含み、かつ約６．０～８．５のｐＨを有する、［４３］の方法。
前記移動相が、約５ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１００ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０１％～約０．５％のポリソルベート８０、及び約５％～約５０％のメタノールを含み、かつ約６．０～８．５のｐＨを有する、［４３］の方法。
【0053】
［４５．］
前記移動相が、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約３００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０５％のポリソルベート８０、及び約２０％のメタノールを含み、かつ約７．５のｐＨを有する、［４３］の方法。
前記移動相が、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約３００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０５％のポリソルベート８０、及び約２０％のメタノールを含み、かつ約７．５のｐＨを有する、［４３］の方法。
【0054】
［４６．］
ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物が、約２Ｅ＋１０ゲノムコピー／ｍｌ～約１Ｅ＋１４ゲノムコピー／ｍｌを含む、［１］～［４５］のいずれか１つの方法。
ｒＡＡＶ粒子を含む前記組成物が、約２Ｅ＋１０ゲノムコピー／ｍｌ～約１Ｅ＋１４ゲノムコピー／ｍｌを含む、［１］～［４５］のいずれか１つの方法。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む安定な製剤を製造することを含み、ｒＡＡＶ粒子を、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することによって生成し、ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法は、１つ以上の処理工程を含む。いくつかの実施形態では、処理は、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、遠心分離または深層濾過による）、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態では、処理は、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、遠心分離または深層濾過による）、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態では、処理は、回収した細胞培養物の遠心分離を含まない。
【0056】
本開示は、（ａ）不純物を含むフィードから、遠心分離、深層濾過、タンジェンシャルフロー濾過、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上によってｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を用いて特性評価し、（ｃ）単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む安定な製剤の製造方法を提供する。
【0057】
本開示は、（ａ）不純物を含むフィードから、遠心分離、深層濾過、タンジェンシャルフロー濾過、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上によってｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を用いて特性評価し、（ｃ）単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む安定な製剤の医薬単位用量の製造方法を提供する。
【0058】
本明細書に記載の組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に、以下の詳細な説明を読むことにより、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】ｒＡＡＶゲノムＤＮＡを分析するためのサイズ排除ＨＰＬＣ－方法の概要。
【図2】ｒＡＡＶカプシドの変性。図２Ａは、０．０５％ＳＤＳの存在下で、６５℃に１０分間または７５℃に１０分間曝露させたｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を示す。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。矢印は、６５℃、１０分間の処理によって変性しなかった粒子を示す。図２Ｂは、完全に変性したｒＡＡＶ試料とマーカーＤＮＡ断片のＳＥＣ特性である。主要なベクターＤＮＡのピークは、完全長のベクターゲノムに対応する。
【図3】３つの異なるｒＡＡＶ製品の重ね合わせたクロマトグラム。試料を、０．０５％ＳＤＳの存在下で８０℃にて２０分間インキュベートすることにより変性させた。
【図4】ｓｓＤＮＡの変性及び構造の特性評価。０．０５％ＳＤＳの存在下で、７５℃に１０分間、８５℃に１０分間、または８５℃に２０分間曝露させたｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を示す。７５℃に１０分間曝露した試料中にｓｓＤＮＡが存在することは、熱処理によって完全に変性されていなかったことを示している。８５℃、２０分間が、ｓｓＤＮＡの変性／線形化に最適であった。すべての試料で少量のトランケートされたベクターゲノムが観察された。
【図5】７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃で２０分間熱変性させた後のＡＡＶ製剤のＵＶ２６０吸光度曲線。
【図6】ＤＮＡ－ＳＥＣによる断片ＤＮＡの割合（％）と分析用超遠心法による充填不完全なカプシドの割合（％）との比較。
【図7】弱い、強い、及び非常に強い変性後のＡＡＶ製剤のＵＶ２６０吸光度曲線。
【図8】ＤＮＡ－ＳＥＣによって評価したプロセス最適化。
【発明を実施するための形態】
【0060】
詳細な説明
本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。
本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。
【0061】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を特性評価する方法も提供する。単離されたｒＡＡＶ粒子の特性評価には、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）の決定が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を、改変されたプロセスによって生成されるｒＡＡＶ粒子の品質、例えば純度を迅速に評価することによって、製品開発及びプロセス最適化をサポートするために使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して、ｒＡＡＶ製造プロセスの異なる段階でのｒＡＡＶ粒子の品質を評価する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0062】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
【0063】
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態では、「約」とは、示された数または範囲の±１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示す。
【0064】
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ－４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ－５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ－６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ－７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ－８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ－９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。
【0065】
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
【0066】
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターゲノムとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、もしくはＡＡＶ－１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ． ２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。
【0067】
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。
【0068】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６からなる群より選択される血清型、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。
【0069】
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料に由来するターゲット生成物、例えば、ｒＡＡＶ粒子とｒＡＡＶゲノムの純度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは部分的に）除去することによって、高められる。いくつかの実施形態では、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書に記載の方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは部分的に）除去することによって増加する。
【0070】
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
【0071】
諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
【0072】
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【0073】
本開示の実施形態がマルクーシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループのすべての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
【0074】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、及びメタノールを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、及びメタノールを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を特性評価する方法を提供する。単離されたｒＡＡＶ粒子の特性評価には、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）の決定が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供した後、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムの単離方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ＡＡＶゲノムを回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、サイズ排除クロマトグラフィーの溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方でのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。
【0077】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズの純度を決定する方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し；そして（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーの溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方でのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノムサイズの純度を、ＵＶ吸収曲線の相対的なピーク面積を分析することによって決定する。
【0078】
いくつかの実施形態では、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し；そして（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーの溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を決定することを含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定する方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し；そして（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーの溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方でのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定することをさらに含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を特性評価する方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し；そして（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーの溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの一方または両方でのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、溶出液中のＡＡＶゲノム濃度を、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって決定する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の特性を決定することをさらに含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供することを含む。ｒＡＡＶカプシドポリペプチドを変性させることができる当業者に公知の任意の方法を使用して、本明細書に開示する方法を実施することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶカプシドポリペプチドを変性させるためのプロセスはまた、ｒＡＡＶゲノムも変性させることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶゲノムが変性する条件に供することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶカプシドポリペプチドとｒＡＡＶゲノムの両方が変性する条件に供することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、例えば、約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることによって、ｒＡＡＶ粒子を熱に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７５℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、それらをカオトロピック剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、それらを界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、それらを、熱、カオトロピック剤、及び界面活性剤のうちの少なくとも２つに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、それらを、界面活性剤の存在下で熱に曝露することを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件に、粒子を曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件に、粒子を曝露することを含む。ｒＡＡＶ組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する変性条件は、本明細書に開示する方法を使用して、例えば、異なる変性条件に供した試料のＤＮＡのＳＥＣ特性を分析することによって決定することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定されるｒＡＡＶ組成物の断片ＤＮＡ含有率（％）は、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が、約１未満、約２未満、約３未満、約４未満、約５未満、または約１０未満の場合に、相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約１未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約３未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約５未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）（これは、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する）をもたらす条件に供することを含む。
【0084】
本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、それらを熱に曝露することを含む。本明細書に開示するように、ＡＡＶ粒子を変性させるために使用する熱変性条件は、その後に得られるＤＮＡ－ＳＥＣ特性に影響を与える。例えば、試料中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させない温度を使用することによる次善の熱変性を行うことにより、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを低下させ、ｓｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを生じさせることができる。熱変性温度を上げて試料中の実質的にすべてのウイルスゲノムの変性を達成することにより、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを増加させ、ｓｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを低下させるか、または排除することができる。例えば、試料中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるために必要な最低温度を上回る温度を使用することによる過度の熱変性は、ｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルの損失を招き得る。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、過度の熱変性は、物質の損失及び／または人工的なＤＮＡ断片の作出を引き起こし得る。過度の熱変性によるｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルの損失は、ベクター配列とＤＮＡコンストラクトの設計に関連している可能性がある。その結果、最適な熱変性条件は、異なるｒＡＡＶ粒子を含む異なる組成物間で様々に異なる可能性がある。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する条件下で、粒子を熱変性に曝露することを含む。ｒＡＡＶ組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する熱変性条件は、本明細書に開示する方法を使用して、例えば、異なる熱変性条件に供した試料のＤＮＡのＳＥＣ特性を分析することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する温度の５℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する温度の１０℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物のｄｓＤＮＡのＳＥＣシグナルを実質的に最大化する温度の１５℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるために必要な最低温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるために必要な最低温度より５℃以内で上回る温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるために必要な最低温度より１０℃以内で上回る温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、同じｒＡＡＶ粒子を含む参照組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるために必要な最低温度より１５℃以内で上回る温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定されるｒＡＡＶ組成物の断片ＤＮＡ含有率（％）は、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が、約１未満、約２未満、約３未満、約４未満、約５未満、または約１０未満の場合に、相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約１未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約３未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）と、ＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）とは、その２つの値の差が約５未満である場合に相関する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）（これは、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する）をもたらす条件下で、熱変性に供することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）（これは、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する）をもたらす温度の５℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）（これは、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する）をもたらす温度の１０℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、本明細書に開示する方法を使用して決定される断片ＤＮＡ含有率（％）（これは、ＡＵＣによって決定される同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合（％）と相関する）をもたらす温度の１５℃以内の温度で、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をインキュベートすることを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、約６５℃～約９５℃の温度で、５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、界面活性剤の存在下で、約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、界面活性剤の存在下で、約６５℃～約９５℃の温度で、５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＳＤＳである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．００５％～約０．５％の濃度のＳＤＳである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．０５％の濃度のＳＤＳである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７５℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約８０℃～約８５℃である。
【0088】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、または約９０℃で、約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約６５℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約７０℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約７５℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約８０℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約８５℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約９０℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、組成物を、約９５℃で約５分間～６０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、組成物を、約５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約１０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約１５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約２０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約２５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約３０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約３５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約４０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約４５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約５０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約５５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約６０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、界面活性剤の存在下でインキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、ＳＤＳの存在下でインキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８の存在下でインキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約０．００５％～約０．５％の濃度のＳＤＳの存在下でインキュベートする。いくつかの実施形態では、組成物を、約０．０５％の濃度のＳＤＳの存在下でインキュベートする。
【0089】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は変性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤はアニオン性変性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤はカチオン性変性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはエチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％の界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％の界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％のＳＤＳに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％のＳＤＳに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％のＥＴＭＡＢに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％のＥＴＭＡＢに曝露することを含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％の界面活性剤に曝露することを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を界面活性剤に曝露し、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはエチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％の界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％の界面活性剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％のＳＤＳに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％のＳＤＳに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．００５％～約０．５％のＥＴＭＡＢに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子を約０．０５％のＥＴＭＡＢに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７５℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約８０℃～約８５℃である。
【0092】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子をカオトロピック剤に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、フェノール、チオ尿素、尿素、またはそれらの組合せを含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の変性は、ｒＡＡＶ粒子をカオトロピック剤に曝露し、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、フェノール、チオ尿素、尿素、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７５℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約８０℃～約８５℃である。
【0094】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供することを含む。いくつかの実施形態では、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子を、変性プロセスによって変性させる。いくつかの実施形態では、試料中のウイルス粒子の少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を、変性プロセスによって変性させる。
【0095】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、変性したカプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、非変性のｒＡＡＶ粒子を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物中のカプシドポリペプチドの約５％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満が、非変性ｒＡＡＶ粒子の一部である。
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供することは、組成物をサイズ排除クロマトグラフィー樹脂と接触させることを含む。ウイルスゲノム断片から完全長ウイルスゲノムを分離するのに適した任意のサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を使用することができる。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、シリカ粒子（例えば、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ樹脂及びＳｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ樹脂）、アリルデキストランとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドの架橋コポリマー（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標））、または架橋されたビーズ状のアガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標））を含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、シリカ粒子を含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、高純度の、機械的安定性を強化されたシリカ上に化学結合した、均一、親水性、かつ中性のナノメートル厚のフィルムを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約５０ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約１００ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約２００ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約３００ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約４００ｎｍの公称孔径を備える。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、約５００ｎｍの公称孔径を備える。
【0097】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含み、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、及び界面活性剤のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含み、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、緩衝剤、塩、有機溶媒、及び界面活性剤のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、緩衝剤、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、移動相は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、マグネシウム塩、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、またはそれらの混合物を含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１００ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２００ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２００ｍＭ～約４００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、ナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウムを含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、または約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約３００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約３５０ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約４００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５００ｍＭの塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、ナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウムを含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、移動相は、緩衝剤を含む。緩衝剤は当技術分野で周知であり、限定されないが、リン酸緩衝液、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス、ビス－トリス、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ビシン、グリシン、トリシン、Ｎ－グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、トリスを含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２０ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、または約４０ｍＭの緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０ｍＭの緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、トリスを含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２０ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、または約４０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、移動相は、約６．０～８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約６．０～７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．０～８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約８．０～８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．２～７．８のｐＨを有する。
【0107】
いくつかの実施形態では、移動相は、約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．３のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．８のｐＨを有する。
【0108】
いくつかの実施形態では、移動相は、約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、移動相は、約８．０のｐＨを有する。
【0109】
いくつかの実施形態では、移動相は、約７．５のｐＨを有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、移動相は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は変性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は非変性界面活性剤である。許容される界面活性剤として、限定されないが、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、またはＢＲＩＪ ３５が挙げられる。いくつかの実施形態では、移動相は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、ＢＲＩＪ ３５、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ポリソルベート８０を含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ｒＡＡＶ粒子を第１の界面活性剤に曝露し、変性したｒＡＡＶ粒子をサイズ排除クロマトグラフィーに供することを含むプロセスによってｒＡＡＶ粒子を変性させることを含み、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、第２の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を第１の界面活性剤に曝露し、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を約６５℃～約９５℃の温度でインキュベートすることを含むプロセスによって、ｒＡＡＶ粒子を変性させ、（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子をサイズ排除クロマトグラフィーに供することを含み、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、第２の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃、約７５℃～約８５℃、または約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７０℃～約９０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約７５℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約８０℃～約８５℃である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の界面活性剤は、同じ界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の界面活性剤は、異なる界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の界面活性剤は変性界面活性剤を含み、第２の界面活性剤は非変性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の界面活性剤はＳＤＳを含み、第２の界面活性剤は非変性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の界面活性剤はＳＤＳを含み、第２の界面活性剤はポリソルベート８０を含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、移動相は、約０．００１％～約５％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０５％～約２％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０５％～約２％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１％～約１％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．６％、約０．８％、または約０．９％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、移動相は、約０．００１％～約５％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０５％～約２％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０５％～約２％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１％～約１％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．６％、約０．８％、または約０．９％のポリソルベート８０を含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、移動相は、約０．１％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．２％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．３％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．４％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．５％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．６％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．７％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．８％のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約０．９％のポリソルベート８０を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、移動相は、有機溶媒を含む。許容される有機溶媒として、限定されないが、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、移動相は、メタノールを含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、移動相は、約５％～約５０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約４０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約３０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約５０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５％～約２０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２０％～約５０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２０％～約４０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、メタノールを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、移動相は、約５％～約５０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約４０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約３０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％～約５０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５％～約２０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２０％～約５０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２０％～約４０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のメタノールを含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約１５％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約２５％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約３０％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約３５％のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約４０％のメタノールを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、移動相は、約５ｍＭ～約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１００ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０１％～約０．５％のポリソルベート８０、及び約５％～約５０％のメタノールを含み、約６．５～８．５のｐＨを有する。
【0120】
いくつかの実施形態では、移動相は、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約３００ｍＭの塩化ナトリウム、約０．０５％のポリソルベート８０、及び約２０％のメタノールを含み、約７．５のｐＨを有する。
【0121】
いくつかの実施形態では、本明細書の開示は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、ｒＡＡＶ粒子が変性する条件に供し；（ｂ）変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、約２Ｅ＋１０ゲノムコピー／ｍｌ～約１Ｅ＋１４ゲノムコピー／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２．０Ｅ＋１０ＧＣ／ｍＬ、約１．０Ｅ＋１１ＧＣ／ｍＬ、約１．０Ｅ＋１２ＧＣ／ｍＬ、約１．０Ｅ＋１３ＧＣ／ｍＬ、または約１．０Ｅ＋１４ＧＣ／ｍＬのｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型、またはそれらの組合せのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＡＶ－８血清型、ＡＡＶ－９血清型、またはそれらの組合せのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。
【0122】
本明細書に開示する方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子に適用することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８及びＡＡＶ－９から選択されるＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0124】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、フィード組成物中のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ－９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0126】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプのｒＡＡＶ粒子を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ベクターゲノムサイズの純度を決定し、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価し、及び／またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を決定することを含む。ｒＡＡＶ粒子を含む組成物のこれらの特性を、本明細書に開示する方法を使用して得られるＵＶ吸光度測定値から決定するための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１９／２１２９２２に開示されるように、当業者に公知である。
【0128】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を、改変されたプロセスによって生成されるｒＡＡＶ粒子の品質を迅速に評価することによって、製品開発及びプロセス最適化をサポートするために使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、改変されたプロセスによって生成されるｒＡＡＶ粒子の品質に対するプロセス改変の効果を判定することを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の品質を、ｒＡＡＶ粒子における断片化ＤＮＡの割合（％）を決定することによって評価する。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を使用して、ｒＡＡＶ製造プロセスの異なる段階でのｒＡＡＶ粒子の品質を評価する。例えば、本明細書に開示する方法を使用して、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、遠心分離または深層濾過による）、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び滅菌濾過後のｒＡＡＶ粒子の品質を評価することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の品質の評価は、粒子の断片化ＤＮＡ含有率（％）を決定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、バッチリリース、例えば、バッチリリース試験及び／またはロットリリース試験に適している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法を、ロットリリース試験の一部として実施する。
【0130】
ｒＡＡＶ粒子
提供する方法は、任意の単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び任意の単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）の決定を含むがこれらに限定されない、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の特性評価に適している。さらに、提供する方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子から、ＡＡＶゲノムを単離するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらのうちの２つ以上の組合せである。
提供する方法は、任意の単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び任意の単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）の決定を含むがこれらに限定されない、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の特性評価に適している。さらに、提供する方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子から、ＡＡＶゲノムを単離するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらのうちの２つ以上の組合せである。
【0131】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号；第９４５８５１７号；及び第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号；第９，４５８，５１７号；及び第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が援用される）で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号；ＵＳ８，９２７，５１４；ＵＳ９，９２３，１２０及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0134】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号；第７，９０６，１１１号；第８，５２４，４４６号；第８，９９９，６７８号；第８，６２８，９６６号；第８，９２７，５１４号；第８，７３４，８０９号；第ＵＳ９，２８４，３５７号；第９，４０９，９５３号；第９，１６９，２９９号；第９，１９３，９５６号；第９４５８５１７号；及び第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；第２０１５／０１２６５８８号；第２０１７／００６７９０８号；第２０１３／０２２４８３６号；第２０１６／０２１５０２４号；第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号；第７，９０６，１１１号；第８，５２４，４４６号；第８，９９９，６７８号；第８，６２８，９６６号；第８，９２７，５１４号；第８，７３４，８０９号；第ＵＳ９，２８４，３５７号；第９，４０９，９５３号；第９，１６９，２９９号；第９，１９３，９５６号；第９４５８５１７号；及び第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；第２０１５／０１２６５８８号；第２０１７／００６７９０８号；第２０１３／０２２４８３６号；第２０１６／０２１５０２４号；第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
【0135】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）。
【0136】
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドの作製方法は、例えば、以下に示されている：米国特許第７，２８２，１９９号；第７，９０６，１１１号；第８，５２４，４４６号；第８，９９９，６７８号；第８，６２８，９６６号；第８，９２７，５１４号；第８，７３４，８０９号；第ＵＳ９，２８４，３５７号；第９，４０９，９５３号；第９，１６９，２９９号；第９，１９３，９５６号；第９４５８５１７号；及び第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；第２０１５／０１２６５８８号；第２０１７／００６７９０８号；第２０１３／０２２４８３６号；第２０１６／０２１５０２４号；第２０１７／００５１２５７号；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号；第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
【0137】
提供する方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。いくつかの実施形態では、本明細書において、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、本明細書において、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターを提供する。さらに特定の実施形態では、本明細書において、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、本明細書において、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、本明細書において、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、本明細書において、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、本明細書において、ＴＰＰをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターを提供する。
【0138】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子の生成方法及び使用方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0139】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型由来の２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【0140】
特定の実施形態では、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。特定の実施形態では、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
【0141】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９から選択されるＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0142】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ－９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0144】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型由来のウイルスカプシドタンパク質の混合物からなる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【0145】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプのｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクターと（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６）に由来するカプシドタンパク質からなるカプシドを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、ならびにＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質からなるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質からなるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子の生成方法及び使用方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0146】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型由来の１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ｒＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質であって、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型である、カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質であって、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型である、カプシドタンパク質を含む。
【0147】
ｒＡＡＶ粒子の単離方法
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤の製造方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価し、そして（ｃ）単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化して、製剤を製造することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤の製造方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離し、（ｂ）単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価し、そして（ｃ）単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化して、製剤を製造することを含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、本開示はさらに、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離し、単離されたｒＡＡＶ粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価し、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤の医薬単位用量の製造方法を提供する。
【0149】
単離されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で公知の方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の単離方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、遠心分離または深層濾過による）、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、下流処理は、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、遠心分離または深層濾過による）、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態では、下流処理は、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、深層濾過による）、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、下流処理は、回収した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、下流処理は、回収した細胞培養物の深層濾過による清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の単離方法は、細胞培養物の回収、回収した細胞培養物の清澄化（例えば、深層濾過による）、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の単離方法は、回収した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の単離方法は、回収した細胞培養物の深層濾過による清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0151】
ｒＡＡＶ粒子の生成方法については、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成システム（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含めた多数の方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、またはバキュロウイルス生成システムの場合では、昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む、好適な宿主細胞；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成をサポートするための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で公知の好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。そのような培地としては、限定されるものではないないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨ製の培地が挙げられる。
【0152】
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用している特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に増殖させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着性容器、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター中で培養することができる付着性培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物には、様々な方法、例えば、スピナーフラスコ、撹拌槽型バイオリアクター、及びディスポーザブルシステム、例えば、ウェーブバッグシステムで培養することができる、浮遊適応性宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ベロ、及びこれらの派生物、ならびにＳＦ－９細胞も含まれ得る。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で公知であり、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
【0153】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の生成方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を提供し；細胞培養物に、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を終濃度約０．１ｍＭ～約２０ｍＭになるまで加え；ｒＡＡＶ粒子を生成可能な条件下で細胞培養物を維持することを包含する。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。
【0154】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を、ＷＯ２０２０／０３３８４２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているように生成させる。
【0155】
組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞を培養することを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を回収することにより、または生成培養物から消費培地を回収することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から回収することができる。組換えＡＡＶ粒子はまた、ｒＡＡＶ生成培養物から、生成培養物の宿主細胞を溶解することによって回収することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で公知であり、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
【0156】
回収時、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
【0157】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生成培養物回収物を清澄化して、宿主細胞デブリを除去する。いくつかの実施形態では、生成培養物回収物を、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化する。清澄化はまた、当技術分野で公知の他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で公知の０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態ではまた、回収した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、生成培養物回収物を、遠心分離によって清澄化する。いくつかの実施形態では、生成培養物回収物の清澄化は、遠心分離を含まない。
【0158】
いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物を、濾過を用いて清澄化する。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物を、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化する。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態では、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物を、深層フィルターに接触させる前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理は、回収した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態では、前処理は、回収した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態では、回収した細胞培養物を、深層フィルターに接触させる前に前処理しない。
【0159】
いくつかの実施形態では、生成培養回収物を、濾過によって清澄化し、これはＷＯ２０１９／２１２９２１に開示されている（参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0160】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生成培養回収物を、ヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来エンドヌクレアーゼ）で処理して、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化する。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で公知の標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化を、終濃度１～２．５ユニット／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で、周囲温度～３７℃の範囲の温度にて、３０分間～数時間実施する。
【0161】
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの公称孔径の組合せである。いくつかの実施形態では、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。
【0162】
いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮した後、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用する。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模スケール濃縮は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）に記載されている。清澄化したフィードのＴＦＦ濃縮により、技術的に管理可能な量の清澄化したフィードをクロマトグラフィーに供することが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを、少なくとも２倍～少なくとも１０倍に濃縮する。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを、少なくとも１０倍～少なくとも２０倍に濃縮する。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを、少なくとも２０倍～少なくとも５０倍に濃縮する。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを、約２０倍に濃縮する。また、当業者であれば、透析濾過を介して清澄化したフィードから、ＴＦＦを使用して、小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去することができることも認識するであろう。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードを透析濾過に供して、小分子不純物を除去する。いくつかの実施形態では、透析濾過は、約３～約１０の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態では、透析濾過は、約５の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。当業者であればまた、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦを使用することができることも認識するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する、清澄化したフィードからのｒＡＡＶの単離方法は、ＴＦＦを使用して緩衝液を交換することを含む。
【0163】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態では、清澄化したフィードから、アフィニティークロマトグラフィーを使用してｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態では、タンジェンシャルフロー濾過に供して清澄化したフィードから、アフィニティークロマトグラフィーを使用してｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で公知であり、限定されないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
【0164】
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーの後に、最終濃縮及び研磨ステップとしてアニオン交換クロマトグラフィーを使用する。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で公知であり、限定されないが、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ－荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で公知のＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ６（５）：６７８－６８６（２００２）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２０７９－２０９１（２０００））。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態では、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態では、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態では、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ－８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者であれば、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液を特定し得ることを理解することができる。
【0165】
いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーを、ＷＯ２０１９／２４１５３５に開示された方法に従って実施する（参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0166】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の単離方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物中のベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシドと空のカプシドの比を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム力価を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定する。いくつかの実施形態では、カプシド力価を、血清型特異的ＥＬＩＳＡによって測定する。いくつかの実施形態では、完全なカプシドと空のカプシドの比は、分析用超遠心法（ＡＵＣ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって測定する。
【0167】
いくつかの実施形態では、ベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシドと空のカプシドの比を、分光測光法により、例えば、２６０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、測定する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性しない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性する。いくつかの実施形態では、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を、分光光度計を用いて測定する。いくつかの実施形態では、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を、ＨＰＬＣを用いて測定する。いくつかの実施形態では、吸光度はピーク吸光度である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定するためのいくつかの方法が、当技術分野で知られている。単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価及びカプシド力価の測定方法は、ＷＯ２０１９／２１２９２２に開示されている（参照によりその全体が援用される）。
【実施例】
【0168】
実施例１．高性能サイズ排除クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターゲノムの純度及び構造の評価
製品の純度は、安全性と有効性に影響を及ぼし得る治療用生物製剤の重要な品質属性であるため、リリース試験を含む管理の保証が重要である。ＡＡＶベクターゲノムは細胞核に送達され、カプシドタンパク質よりもはるかに長く、長期間持続し得る。したがって、ＡＡＶ製品のベクターゲノム純度を評価することが望ましい。空のカプシドと完全なカプシドの比を定量化するインタクトなＡＡＶの相対純度は、分析用超遠心法（ＡＵＣ）、低温電子顕微鏡法、及びイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。さらに、充填不完全なカプシドと呼ばれることが多い、断片化ゲノム及び非導入遺伝子に関連するＤＮＡ混入物を有するベクターの存在は、ＡＵＣによって解決することができる。カプシドタンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＳＤＳ－ＣＧＥで測定することができる。キャピラリー電気泳動及びゲル電気泳動によってＡＡＶゲノムを分析するためのいくつかの研究が発表されているものの、ＡＡＶゲノムの純度を決定するためのコンセンサスのとれた方法は確立されていない。本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ＡＡＶベクターゲノムの純度及び構造を高感度かつ高再現性で評価するためのハイスループット法を開示する。
製品の純度は、安全性と有効性に影響を及ぼし得る治療用生物製剤の重要な品質属性であるため、リリース試験を含む管理の保証が重要である。ＡＡＶベクターゲノムは細胞核に送達され、カプシドタンパク質よりもはるかに長く、長期間持続し得る。したがって、ＡＡＶ製品のベクターゲノム純度を評価することが望ましい。空のカプシドと完全なカプシドの比を定量化するインタクトなＡＡＶの相対純度は、分析用超遠心法（ＡＵＣ）、低温電子顕微鏡法、及びイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。さらに、充填不完全なカプシドと呼ばれることが多い、断片化ゲノム及び非導入遺伝子に関連するＤＮＡ混入物を有するベクターの存在は、ＡＵＣによって解決することができる。カプシドタンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＳＤＳ－ＣＧＥで測定することができる。キャピラリー電気泳動及びゲル電気泳動によってＡＡＶゲノムを分析するためのいくつかの研究が発表されているものの、ＡＡＶゲノムの純度を決定するためのコンセンサスのとれた方法は確立されていない。本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ＡＡＶベクターゲノムの純度及び構造を高感度かつ高再現性で評価するためのハイスループット法を開示する。
【0169】
ＡＡＶベクターゲノムは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり、個々のＡＡＶ粒子は、等しい出現頻度のプラス鎖またはマイナス鎖のＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶベクターから遊離すると、プラス鎖及びマイナス鎖の一本鎖ＤＮＡゲノムが自発的にアニーリングして、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成し得る。ｄｓＤＮＡの形成は、一本鎖ゲノムを遊離させるために使用する変性条件に依存する。変性が不完全な低温では、ｄｓＤＮＡに加えて、異なる二次構造を有するｓｓＤＮＡがＳＥＣで検出され得る。高温での完全な変性条件下では、すべてのｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡに変換された。驚くべきことに、変性温度を、試料に特異的な最適値よりもさらに高くすると、ＳＥＣ中にシグナルが失われる。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、これらの最適温度を上回る温度、すなわち、９０℃及び９５℃でのインキュベーションは、物質の損失及び／または人工的なＤＮＡ断片を生じさせ得る。観察された物質の損失及び断片化は、ＡＡＶベクターゲノムの熱不安定性を示しており、これはＡＡＶ製品ごとに異なる可能性があり、おそらくベクター配列及びＤＮＡコンストラクトの設計に関連している。
【0170】
ＡＡＶ製品間の変動に加えて、熱変性への応答もまた、同じ製品内のＡＡＶ亜集団間で異なり得る。例えば、アニオン交換クロマトグラフィーから分離された特定のＡＡＶ亜集団は、変性に対する耐性の増加を示し、これらのＡＡＶベクターがコンパクトな構造のｓｓＤＮＡを含む可能性があることが示唆された。ｄｄＰＣＲによって決定されたこれらのＡＡＶベクターのゲノム含有量は、分光光度法またはＳＥＣ定量化によって決定された含有量よりも低く、これは、コンパクトなＤＮＡ構造の存在と、ＰＣＲ効率を向上させるためのさらなる変性の必要性を示している。
【0171】
試料に特異的な最適温度で完全に変性させると、遊離するすべてのベクターゲノムがｄｓＤＮＡを形成するが、これを、ＳＥＣによって、宿主細胞の残留ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノム断片などの不純物から分離することができる。ＡＡＶから遊離するＤＮＡのＳＥＣによる分析は、ＡＡＶベクターゲノムのサイズ純度の定量的評価を提供する。この方法で決定されるＤＮＡ断片の割合は、ＡＵＣで決定される充填不完全なカプシドの割合とよく相関する。ＡＵＣ分析は時間がかかり、システム操作とデータ分析のための高度な技術と知識を必要とし、多くの場合、大きな試料サイズを消費する。対照的に、本明細書に開示するようなＳＥＣによる純度分析は、高速で再現性があり、高感度で定量限界（ＬｏＱ）が向上しており、高スループット分析のために自動化することができる。図１（図９も参照）。本明細書に開示するＳＥＣ法を、充填不完全なカプシドを迅速に評価して、製品開発及びプロセス最適化をサポートするために、及びＡＡＶ製品の特性評価のための直交法として使用した。さらに、このＳＥＣ法によって２６０ｎｍでのＵＶ吸光度で検出されたピーク面積を使用して、ベクターゲノム力価を決定することができる。
【0172】
試料調製。２０～４０μＬのＡＡＶベクター試料を、ヒートブロック上で０．０５％ＳＤＳの存在下で目的の温度に加熱した。適切な加熱ブロックを使用することにより、複数の試料、例えば最大５０～１００の試料を調製することができる。ＳＥＣでのインタクトなＡＡＶピークの完全な破壊、及び純粋なベクターゲノムＤＮＡと断片ＤＮＡピークの出現によって検証されるように、各ＡＡＶベクター製品について個別に、熱変性の最適な温度と持続時間を時間経過研究によって評価し、決定した。図２及び３。
【0173】
サイズ排除ＨＰＬＣ。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。注入量は、試料の推定ゲノム濃度に基づく。＞５Ｅ＋１２ＧＣ／ｍＬの試料の場合、１０μＬｉｎを注入し、＜５Ｅ＋１２ＧＣ／ｍＬの試料の場合、１５～２０μＬを分析用に注入する。６ｃｍの光路長のフローセルを備えたダイオードアレイ検出器を使用して、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍでのＵＶ吸光度をモニタリングした。蛍光検出器を使用して、ＤＮＡの純度を確認した。約５×１０１０ＧＣの熱変性させたＡＡＶベクターの試料を、周囲温度でＳＲＴ ＳＥＣ２０００（３００×４．６ｍｍ（内径）、孔径２０００ｎｍ）ＳＥＣカラム（ＳＥＰＡＸ）にロードした。１０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ポリソルベート８０、２０％メタノール、ｐＨ７．５の移動相を、０．２ｍｌ／分の流速で合計実行時間４５分間使用するアイソクラティックグラジエントを使用して、各試料を測定した。データ分析は、ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。図３は、同じ配列内で実行する３つの別々の製品のＳＥＣ特性を示す。
【0174】
実施例２．ｓｓＤＮＡの変性及び構造の特性評価
ｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を、７５℃で１０分間、８５℃で１０分間、または８５℃で２０分間の変性後に分析した。図４。７５℃に１０分間曝露した試料に、一部が二次構造を有するｓｓＤＮＡが存在していたことは、熱処理によって完全に変性していなかったことを示している。ｓｓＤＮＡの完全な変性／線形化にとって、８５℃、２０分間は最適であった。３つすべての試料で少量のトランケートされたベクターゲノムが観察された。７５℃で１０分間の変性後の同じｒＡＡＶの異なる製剤のＳＥＣ分析により、一部が二次構造を有するｓｓＤＮＡのレベルが、異なる製剤間で異なることが示された。
ｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を、７５℃で１０分間、８５℃で１０分間、または８５℃で２０分間の変性後に分析した。図４。７５℃に１０分間曝露した試料に、一部が二次構造を有するｓｓＤＮＡが存在していたことは、熱処理によって完全に変性していなかったことを示している。ｓｓＤＮＡの完全な変性／線形化にとって、８５℃、２０分間は最適であった。３つすべての試料で少量のトランケートされたベクターゲノムが観察された。７５℃で１０分間の変性後の同じｒＡＡＶの異なる製剤のＳＥＣ分析により、一部が二次構造を有するｓｓＤＮＡのレベルが、異なる製剤間で異なることが示された。
【0175】
実施例３．過度の熱変性はシグナル損失をもたらす
ｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃で２０分間の熱変性後に分析した。図５。ｄｓＤＮＡのシグナル強度は、例えば実施例２に示すデータに基づいて予想されるように、７５℃よりも８０℃及び８５℃での熱変性後に高かった。驚くべきことに、熱変性温度を９０℃及び９５℃までさらに上昇させることにより、ｄｓＤＮＡシグナルが失われた。これらの結果は、最大のシグナルをもたらす最適な熱変性温度があり、試験した特定の試料の最適な熱変性温度が約８０℃～約８５℃の範囲であったことを示した。９０℃及び９５℃での２０分間のインキュベーションでは、ＡＡＶゲノムが有意に分解されるとは予想されなかったため、この観察結果は驚くべきものであった。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、高温、すなわち、９０℃及び９５℃でのインキュベーションは、物質の損失を生じさせ得、及び／または人工的なＤＮＡ断片を生じさせ得る。観察された物質の損失及び断片化は、ＡＡＶベクターゲノムの熱不安定性を示していたが、これはＡＡＶ製品ごとに異なる可能性があり、おそらくベクター配列及びＤＮＡコンストラクトの設計に関連している。
ｒＡＡＶ試料のＳＥＣ特性を、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃で２０分間の熱変性後に分析した。図５。ｄｓＤＮＡのシグナル強度は、例えば実施例２に示すデータに基づいて予想されるように、７５℃よりも８０℃及び８５℃での熱変性後に高かった。驚くべきことに、熱変性温度を９０℃及び９５℃までさらに上昇させることにより、ｄｓＤＮＡシグナルが失われた。これらの結果は、最大のシグナルをもたらす最適な熱変性温度があり、試験した特定の試料の最適な熱変性温度が約８０℃～約８５℃の範囲であったことを示した。９０℃及び９５℃での２０分間のインキュベーションでは、ＡＡＶゲノムが有意に分解されるとは予想されなかったため、この観察結果は驚くべきものであった。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、高温、すなわち、９０℃及び９５℃でのインキュベーションは、物質の損失を生じさせ得、及び／または人工的なＤＮＡ断片を生じさせ得る。観察された物質の損失及び断片化は、ＡＡＶベクターゲノムの熱不安定性を示していたが、これはＡＡＶ製品ごとに異なる可能性があり、おそらくベクター配列及びＤＮＡコンストラクトの設計に関連している。
【0176】
製品に特異的な最適の熱変性条件を決定することは、本明細書に開示する方法を使用してハイスループットスクリーニングアッセイを開発するために重要である。以下の実施例に示すように、本明細書に記載のアッセイは、例えば、トランケート型ベクターゲノムを含む部分充填ｒＡＡＶ粒子の比率を定量化するためのＡＵＣに対する直交法として有用である。ＤＮＡ－ＳＥＣによって決定される断片ＤＮＡの割合（％）とＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）の間の信頼できる良好な相関関係は、本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣアッセイの製品に特異的な最適の熱変性条件を使用することによって達成することができる。
【0177】
実施例４．ＡＵＣとＤＮＡ－ＳＥＣの間のトランケート型ベクターゲノムのブリッジング分析
８５℃で２０分間の処理による完全な変性の後、３つの異なるｒＡＡＶ粒子を含む組成物中に低レベルの断片化ＤＮＡが観察された。図３。ＡＵＣによって決定された部分充填ｒＡＡＶ粒子のレベルと、ＤＮＡ－ＳＥＣによって検出された断片化ＤＮＡのレベルは、一致した結果を示した。図６。したがって、本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ法を、ＡＵＣに対するハイスループット直交法として使用して、トランケート型ベクターゲノムを含む部分充填ｒＡＡＶ粒子の比率を定量化することができる。
ＤＮＡ－ＳＥＣによって決定される断片ＤＮＡの割合（％）とＡＵＣによって決定される充填不完全なカプシドの割合（％）の間の良好な相関は、ＤＮＡ－ＳＥＣを使用して、多数の試料中の充填不完全なカプシドのレベルを迅速に評価して、製品開発及びプロセス最適化をサポートすることができることを示している。
８５℃で２０分間の処理による完全な変性の後、３つの異なるｒＡＡＶ粒子を含む組成物中に低レベルの断片化ＤＮＡが観察された。図３。ＡＵＣによって決定された部分充填ｒＡＡＶ粒子のレベルと、ＤＮＡ－ＳＥＣによって検出された断片化ＤＮＡのレベルは、一致した結果を示した。図６。したがって、本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ法を、ＡＵＣに対するハイスループット直交法として使用して、トランケート型ベクターゲノムを含む部分充填ｒＡＡＶ粒子の比率を定量化することができる。
【0178】
実施例５．ｄｄＰＣＲ及びＤＮＡ－ＳＥＣによるＶＧＣ力価
本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ及びｄｄＰＣＲを使用して、複数のｒＡＡＶ製剤について、ウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）力価を測定した。ＤＮＡ－ＳＥＣ及びｄｄＰＣＲは、ＡＡＶ製品に対して全体的に一致したＶＧＣ力価の結果を示した。
本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ及びｄｄＰＣＲを使用して、複数のｒＡＡＶ製剤について、ウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）力価を測定した。ＤＮＡ－ＳＥＣ及びｄｄＰＣＲは、ＡＡＶ製品に対して全体的に一致したＶＧＣ力価の結果を示した。
【0179】
本明細書に開示する方法の利点は、大量のトランケート型ゲノムを有するｒＡＡＶ組成物の場合、ＤＮＡ－ＳＥＣによるＶＧＣ力価が完全長ベクターゲノムのＶＧＣを報告することができることである。
【0180】
実施例６．ＡＡＶベクターゲノムのフォールディングの特性評価
特定のＡＡＶ集団、例えば、アニオン交換クロマトグラフィーから分離されたＡＡＶ集団（図７中のＡＡＶ＿２）は、変性に対する耐性の増加を示した。ｄｄＰＣＲによって決定されたこれらのＡＡＶベクターのゲノム含有量は、分光光度法またはＳＥＣ定量化によって決定された含有量よりも低く、これは、コンパクトなＤＮＡ構造の存在と、ＰＣＲ効率を向上させるためのさらなる変性の必要性を示している。本明細書に示すように、様々な変性条件を使用することにより、本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ法を使用して、カプシド内のＡＡＶベクターゲノムの二次構造／フォールディングに関する情報を提供することができ、これは、潜在的にＰＣＲベースのアッセイの効率と効力に影響を与え得る。
特定のＡＡＶ集団、例えば、アニオン交換クロマトグラフィーから分離されたＡＡＶ集団（図７中のＡＡＶ＿２）は、変性に対する耐性の増加を示した。ｄｄＰＣＲによって決定されたこれらのＡＡＶベクターのゲノム含有量は、分光光度法またはＳＥＣ定量化によって決定された含有量よりも低く、これは、コンパクトなＤＮＡ構造の存在と、ＰＣＲ効率を向上させるためのさらなる変性の必要性を示している。本明細書に示すように、様々な変性条件を使用することにより、本明細書に開示するＤＮＡ－ＳＥＣ法を使用して、カプシド内のＡＡＶベクターゲノムの二次構造／フォールディングに関する情報を提供することができ、これは、潜在的にＰＣＲベースのアッセイの効率と効力に影響を与え得る。
【0181】
実施例７．ＤＮＡ－ＳＥＣによって評価したプロセス最適化
ＤＮＡ－ＳＥＣは、プロセス最適化と製品の特性評価をサポートするハイスループットスクリーニングアッセイとして使用することができる。図８は、５つの異なる最適化されたプロセスによって生成される５つのｒＡＡＶ製剤のＤＮＡ－ＳＥＣ特性を示す。弱い変性と強い変性の両方の後に、ＤＮＡ－ＳＥＣ特性を決定した。ゲノム断片の割合（％）は、５つのｒＡＡＶ製剤間で、３．９％から７．７％の間で様々に異なっていた。
ＤＮＡ－ＳＥＣは、プロセス最適化と製品の特性評価をサポートするハイスループットスクリーニングアッセイとして使用することができる。図８は、５つの異なる最適化されたプロセスによって生成される５つのｒＡＡＶ製剤のＤＮＡ－ＳＥＣ特性を示す。弱い変性と強い変性の両方の後に、ＤＮＡ－ＳＥＣ特性を決定した。ゲノム断片の割合（％）は、５つのｒＡＡＶ製剤間で、３．９％から７．７％の間で様々に異なっていた。
【0182】
実施例８．ＤＮＡ－ＳＥＣアッセイの性能評価
本明細書に記載のＤＮＡ－ＳＥＣアッセイは、信頼性の高い方法を提供し、このアッセイを、精度、線形性及び定量限界（ＬｏＱ）に関する性能について試験した。再現性は、同じＳＥＣ実行中の５％以内の繰り返し性、１０％以内の中間精度であった。アッセイは線形性を示し、ＡＡＶの２．９Ｅ＋１０～２９Ｅ＋１０ＧＣの検出範囲、及びＡＡＶの約２Ｅ＋１０ＧＣのＬｏＱであった。図９。
本明細書に記載のＤＮＡ－ＳＥＣアッセイは、信頼性の高い方法を提供し、このアッセイを、精度、線形性及び定量限界（ＬｏＱ）に関する性能について試験した。再現性は、同じＳＥＣ実行中の５％以内の繰り返し性、１０％以内の中間精度であった。アッセイは線形性を示し、ＡＡＶの２．９Ｅ＋１０～２９Ｅ＋１０ＧＣの検出範囲、及びＡＡＶの約２Ｅ＋１０ＧＣのＬｏＱであった。図９。
【0183】
本開示の方法を、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示される実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
【0184】
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む登録番号／データベースの配列は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または登録番号／データベースの配列が、あたかも具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】