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特表2022-526669ジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-25
(54)【発明の名称】ジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220518BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220518BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220518BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220518BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220518BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220518BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220518BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220518BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220518BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P21/04
A61K31/7105
A61K48/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560108
(86)(22)【出願日】2020-04-12
(85)【翻訳文提出日】2021-12-07
(86)【国際出願番号】 US2020027867
(87)【国際公開番号】W WO2020210776
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/833,454
(32)【優先日】2019-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100154988
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 真知
(72)【発明者】
【氏名】ガーズバック チャールズ エイ
(72)【発明者】
【氏名】ゴフ ヴェロニカ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA94
(57)【要約】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法が本明細書中に開示されている。一態様では、本開示は、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することは、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項2】
ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することが、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項3】
融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項4】
対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする、請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項5】
対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、請求項４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項6】
少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項7】
少なくとも１個のｇＲＮＡが、ａ）配列番号１の断片、
ｂ）配列番号１の相補体もしくはその断片、
ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、または
ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列
に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項8】
少なくとも１個のｇＲＮＡが、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項9】
Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含み、Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項10】
少なくとも１個のアミノ酸突然変異が、配列番号２または３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはその組合せのうちの少なくとも１個である、請求項９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項11】
Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項12】
Ｃａｓタンパク質が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項13】
塩基編集ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項14】
シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼを含む、請求項１３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項15】
シチジンデアミナーゼドメインがＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、請求項１３または１４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項16】
シチジンデアミナーゼドメインがラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項17】
少なくとも１個のＵＧＩドメインが、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項18】
少なくとも１個のＵＧＩドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号６もしくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項19】
塩基編集ドメインが、１個のＵＧＩドメインまたは２個のＵＧＩドメインを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項20】
融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項21】
融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項22】
融合タンパク質が、核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項２１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項23】
融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、請求項２２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項24】
融合タンパク質が、配列番号７または配列番号８に対応するポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【請求項25】
請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
【請求項26】
ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチドおよびｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の単離したポリヌクレオチド。
【請求項27】
請求項２５または２６に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項28】
ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項29】
請求項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチドまたは請求項２７もしくは２８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項30】
請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
【請求項31】
請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、請求項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチド、請求項２７もしくは２８に記載のベクター、請求項２９に記載の細胞、または請求項３０に記載の組成物を含むキット。
【請求項32】
細胞または対象を、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
【請求項33】
突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＡＡ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、請求項３２または３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１９年４月１２日に出願の米国仮特許出願第６２／８３３，４５４号の優先権を主張するものである。
政府関与の記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された契約番号第Ｒ０１ＡＲ０６９０８５号の下で行われた。米国政府が本発明の特定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１９年４月１２日に出願の米国仮特許出願第６２／８３３，４５４号の優先権を主張するものである。
政府関与の記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された契約番号第Ｒ０１ＡＲ０６９０８５号の下で行われた。米国政府が本発明の特定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
【背景技術】
【0002】
序論
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、典型的にはジストロフィン遺伝子からの１個または複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊がもたらされる。ジストロフィンタンパク質の発現は、１個または複数個の追加のエクソンの排除を誘導することによってリーディングフレームを補正することによって、修復することができる。ｍＲＮＡスプライシング中のイントロンの除去および選択されたエクソンの包含は正常遺伝子機能にとって重大であり、遺伝子障害においてしばしば誤調節されている。ｍＲＮＡプロセッシングおよびエクソンスキッピング手法などのエクソン選択を変調する技術を使用して、これらの疾患を研究および処置し得る。エクソンスキッピングは、スプライセオソームによるスプライシング配列の認識を遮断して隣接イントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことによって、正しいリーディングフレームを修復するまたは選択的スプライシングを誘導することを目的としている。研究により、Ｃａｓ９をエクソンのスプライスアクセプターに標的化することによって、ＤＮＡ修復中に生じるインデルがスプライシング部位を破壊し、エクソンを排除する場合があることが示されている。しかし、ジストロフィン機能を完全におよび／または部分的に修復するためにジストロフィン遺伝子中のスプライシング部位を正確に変更する能力の必要性が残っている。
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、典型的にはジストロフィン遺伝子からの１個または複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊がもたらされる。ジストロフィンタンパク質の発現は、１個または複数個の追加のエクソンの排除を誘導することによってリーディングフレームを補正することによって、修復することができる。ｍＲＮＡスプライシング中のイントロンの除去および選択されたエクソンの包含は正常遺伝子機能にとって重大であり、遺伝子障害においてしばしば誤調節されている。ｍＲＮＡプロセッシングおよびエクソンスキッピング手法などのエクソン選択を変調する技術を使用して、これらの疾患を研究および処置し得る。エクソンスキッピングは、スプライセオソームによるスプライシング配列の認識を遮断して隣接イントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことによって、正しいリーディングフレームを修復するまたは選択的スプライシングを誘導することを目的としている。研究により、Ｃａｓ９をエクソンのスプライスアクセプターに標的化することによって、ＤＮＡ修復中に生じるインデルがスプライシング部位を破壊し、エクソンを排除する場合があることが示されている。しかし、ジストロフィン機能を完全におよび／または部分的に修復するためにジストロフィン遺伝子中のスプライシング部位を正確に変更する能力の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、本開示は、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することは、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。一態様では、本開示は、対象におけるジストロフィン機能を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、対象は突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。
さらなる一態様では、本開示は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
さらなる一態様では、本開示は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0004】
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む細胞を提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む。
本開示の別の態様は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、前記単離したポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、および／または前記組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象を、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含み得る。一部の実施形態では、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＡＡ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む。
本開示の別の態様は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、前記単離したポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、および／または前記組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象を、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含み得る。一部の実施形態では、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＡＡ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1A】Ｃａｓ９構成要素が化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などの様々な種に由来することができる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした塩基エディター設計（Komor et al., Nature (2016) 533(7603):420-4）を示す図である。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、シチジンデアミナーゼ、リンカー、ｎＣａｓ９、およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼはＵ：Ｇ→Ｃ：Ｇの復帰変異を触媒する。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、ラットシチジンデアミナーゼ、たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計はＸＴＥＮリンカー（１６ａａ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計はｎＣａｓ９（ＲＮＡにガイドおよび促進された、未編集のＧを有する鎖上のミスマッチ修復）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳ１由来のＵＧＩなどのＵＧＩを含む。
【図1B】代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした塩基エディター設計を示す図である（Koblan et al., Nat. Biotechnol. (2018) 36(9):843-846）。ＢＥ４ｍａｘ設計では、二分核移行シグナルをＮおよびＣ末端にさらに付加した。８個のコドン使用頻度を試験した。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ設計では、ＡＰＯＢＥＣに対する祖先配列再構築を使用した。一部の実施形態では、Ｃａｓ９構成要素は、化膿性連鎖球菌および黄色ブドウ球菌などの様々な種に由来することができる。
【図1C】プロトスペーサーの位置４～８の５ｂｐウィンドウ中のＣ→Ｔ（またはＧ→Ａ）の塩基編集を示す図である。
【図1D】塩基切除修復の機構を示す図である。
【図2A】塩基エディターによるＲ－ループ形成およびシチジンデアミナーゼ酵素とｓｓＤＮＡとの間の相互作用を示す模式図を示す図である。
【図2B】スプライスアクセプターを塩基編集するためのｇＲＮＡを設計するための模式図、および「ＡＧ」スプライスアクセプターがＰＡＭの利用可能性（これはＣａｓ９の種に応じて変化し、「Ｓｐ」は化膿性連鎖球菌であり、「Ｓａ」は黄色ブドウ球菌である）によって決定される編集ウィンドウ内に入るための厳密な要件を示す図である。
【図3A】ｇ１およびＧ２が塩基編集のために標的とされる、エクソン４４および４５（ならびに他の多くのもの）のスプライスアクセプター設計戦略を示す図である。
【図3B】５’－ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡ－３’（配列番号９）のエクソン４４ ｇＲＮＡを使用した、エクソン４４のスプライスアクセプター部位での％Ｇ＞Ａ塩基編集（Ｎ＝３）を示す図である。
【図3C】５’－ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１）に対応するエクソン４５ ｇＲＮＡを使用した、エクソン４５のスプライスアクセプター部位での％Ｇ＞Ａ塩基編集（Ｎ＝３）を示す図である。
【図4A】ジストロフィン遺伝子のエクソン４１～５０の模式図を示す図である。
【図4B】エクソン４４の欠失からもたらされるであろうジストロフィン遺伝子の予想される配列を示す図である。その結果、イントロン４３はイントロン４４内に直接移行するであろう。
【図4C】エクソン４４が欠失したジストロフィン遺伝子の配列を示す図である。挿入または欠失は、エクソン４４の欠失の後にイントロン４３とイントロン４４との接合部に存在し得る。
【図4D】エクソン４４中に欠失を有さないクローンｃ２と比較した、クローンｃ１１中のジストロフィン遺伝子のエクソン４４の欠失の確認を示す図である。
【図5】ｉＰＳＣの筋原性分化の模式図を示す図である。
【図6】Δ４４突然変異がジストロフィンタンパク質を切断する、ｉＰＳＣの筋原性分化を示す図である。
【図7】Δ４４ ｉＰＳＣ編集のアウトラインを示す図である。
【図8A】ＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す図である。
【図8B】ＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中のすべてのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す図である。
【図9A】ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す図である。
【図9B】ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中のすべてのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す図である。
【図10】ＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用した１２日後のΔ４４ ｉＰＳＣ編集を示す図である。
【図11】編集した細胞のＭｙｏＤ分化のＲＴ－ＰＣＲを示す図である。
【図12】７日目（Ｄ７）および１４日目（Ｄ１４）にレンチウイルスによって送達したＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す図である。
【図13】７日目（Ｄ７）および１４日目（Ｄ１４）に電気穿孔によって送達したＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す図である。
【図14】ジストロフィン遺伝子の野生型（ＷＴ）、Δ４４、およびΔ４４～４５バージョンの模式図（左）、ならびにＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびエクソン４５ ｇＲＮＡで編集したＭｙｏＤ分化したΔ４４ ｉＰＳＣ細胞のウエスタンブロット（右）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置する方法を提供する。ＤＭＤは、典型的には、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子中の欠失によって引き起こされる。内部で切断されたジストロフィンタンパク質は部分的に機能的であり続けることができることが示されているため、ＤＭＤを処置するための多くの戦略は、追加のエクソンを除去またはスキップすることによってリーディングフレームを修復することを目的としている。哺乳動物遺伝子中に、イントロンとエクソンとの間の境界を印す保存された配列が存在する。１個の重要なスプライシング部位は、エクソンに先行し、スプライスアクセプターと呼ばれる「ＡＧ」である。完全ヌクレアーゼＣａｓ９を使用して、ジストロフィンエクソンのスプライスアクセプターを標的としてスキッピングを強制しており、それによって、スプライシング部位を切断するために、ＤＮＡ修復プロセス中に形成されたセミランダムインデルに依存している。本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、「ＡＧ」スプライスアクセプターを、エクソンスキッピングを促進する「ＡＡ」へと確かに変換するための、より正確な塩基編集方法を可能にする。慣用のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによって生じたセミランダムインデルとは対照的に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導せずに単一塩基対の正確な改変のために、塩基編集技術が開発されている。塩基エディターは、Ｃを直接Ｔに、または逆鎖上のＧをＡに変えることができ、これらは、ｍＲＮＡスプライシングを変調するために様々なエクソンのスプライスドナー「ＧＴ」およびアクセプター「ＡＧ」の両方を標的とし得る。
【0007】
１．定義
本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、６～９の範囲では、６および９の数値に加えて７および８が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が明確に企図される。
本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、６～９の範囲では、６および９の数値に加えて７および８が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が明確に企図される。
【0008】
本明細書中で使用する用語「およそ」または「約」とは、当業者によって決定された特定の値について許容される誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。たとえば、「およそ」は、当分野における実施に従って、３以内または３を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「およそ」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物系または生物学的過程に関して、この用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
【0009】
本明細書中で互換性があるように使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」とは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小さなウイルスをいう。ＡＡＶは現在、疾患を引き起こすことは知られておらず、したがって、このウイルスは非常に緩和な免疫応答を引き起こす。
本明細書中で使用する「アミノ酸」とは、天然に存在するおよび天然に存在しない合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているものである。アミノ酸は、その一般的に知られている三文字表記によって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一文字標記によってのどちらかで、本明細書中で言及することができる。アミノ酸は側鎖およびポリペプチド主鎖部分を含む。
本明細書中で使用する「アミノ酸」とは、天然に存在するおよび天然に存在しない合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているものである。アミノ酸は、その一般的に知られている三文字表記によって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一文字標記によってのどちらかで、本明細書中で言及することができる。アミノ酸は側鎖およびポリペプチド主鎖部分を含む。
【0010】
本明細書中で使用する「結合領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムによって認識されてそれと結合する、標的領域内の領域をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体ＤＮＡの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体ＤＮＡの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
【0011】
本明細書中で使用する「コード配列」または「コードしている核酸」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸を投与する個体または哺乳動物の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルをさらに含むことができる。コード配列はコドン最適化されていてよい。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（たとえばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、２個の核酸配列間で共有される特性をいう。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（たとえばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、２個の核酸配列間で共有される特性をいう。
【0012】
用語「対照」、「参照レベル」、および「参照」は、本明細書中で互換性があるように使用される。参照レベルは、測定した結果をそれに対して評価するためのベンチマークとして使用する、事前に決定された値または範囲であり得る。本明細書中で使用する「対照群」とは、対照対象の群をいう。事前に決定されたレベルは対照群からのカットオフ値であり得る。事前に決定されたレベルは対照群からの平均であり得る。カットオフ値（または事前に決定されたカットオフ値）は、適応的指標モデル（ＡＩＭ）方法によって決定し得る。カットオフ値（または事前に決定されたカットオフ値）は、患者群の生体試料からの受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析によって決定し得る。生物分野において一般に知られているＲＯＣ分析は、たとえば、ＣＲＣを有する患者の同定においてそれぞれのマーカーの性能を決定するための、１つの状態を別の状態から識別するための試験の能力の決定である。ＲＯＣ分析の説明は、その開示がその全体で本明細書中に参考として組み込まれているP.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)中に提供されている。あるいは、カットオフ値は、患者群の生体試料の四分位数分析によって決定し得る。たとえば、カットオフ値は、２５～７５パーセンタイルの範囲内の任意の値に対応する値、好ましくは、２５パーセンタイル、５０パーセンタイル、または７５パーセンタイル、より好ましくは７５パーセンタイルに対応する値を選択することによって決定し得る。そのような統計分析は、当分野で知られている任意の方法を使用して行ってよく、任意数の市販のソフトウェアパッケージ（たとえば、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、英国Ｌｅｅｄｓ、ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、テキサス州Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州Ｃａｒｙのもの）によって実装することができる。標的について、またはタンパク質活性についての健康または正常なレベルまたは範囲は、標準の実施に従って定義し得る。対照は、本明細書中に詳述するコンストラクトまたはシステムを有さない対象または細胞であり得る。対照は、その病状が既知である対象、またはそれ由来の試料であり得る。対象、またはそれ由来の試料は、健康、疾患状態、疾患状態で処置前、疾患状態で処置中、もしくは疾患状態で処置後、またはその組合せであり得る。
【0013】
本明細書中で互換性があるように使用される「デュシェンヌ筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」とは、筋変性および最終的には死をもたらす、劣性の致命的なＸ連鎖の障害をいう。ＤＭＤは、３５００人に１人の男性に起こる、一般的な遺伝性の一遺伝子的疾患である。ＤＭＤは、ナンセンスまたはフレームシフトのジストロフィン遺伝子中の突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン突然変異の大多数は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の未熟な翻訳終止を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者、典型的には、小児期中に自身を物理的に支持する能力を失い、ティーンエージ期中に進行的に脆弱になり、その二十代に亡くなる。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
【0014】
本明細書中で使用する「エクソン４５」とは、ジストロフィン遺伝子の４５エクソンをいう。エクソン４５は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験で標的とされている。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードＤＮＡ配列をいう。エンハンサーは、２００ｂｐ～１ｋｂの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの５’上流側もしくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。ＤＮＡルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが１個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードＤＮＡ配列をいう。エンハンサーは、２００ｂｐ～１ｋｂの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの５’上流側もしくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。ＤＮＡルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが１個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
【0015】
本明細書中で使用する「機能的」および「完全に機能的」とは、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能的遺伝子」とは、ｍＲＮＡへと転写される遺伝子をいい、これが機能的タンパク質へと翻訳される。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた２個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた２個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
【0016】
本明細書中で使用する「ゲノム編集」とは、遺伝子を変えることをいう。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補修または修復することを含み得る。ゲノム編集は、スプライスアクセプター部位を変更するための塩基編集を含み得る。ゲノム編集、たとえば塩基編集は、目的遺伝子を変えることによって疾患を処置するまたは筋肉修復を増強させるために使用し得る。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の２個以上の配列、たとえば、１個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、２個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列（たとえば、２個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」）を含むことを示す。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の２個以上の配列、たとえば、１個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、２個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列（たとえば、２個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」）を含むことを示す。
【0017】
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書中で使用する「同一」または「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された残基百分率を有することを意味する。百分率は、２個の配列を最適にアラインメントすること、２個の配列を指定された領域にわたって比較すること、両方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除算すること、および結果を１００で乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。２個の配列が異なる長さのものである、またはアラインメントにより１個または複数個のねじれ型末端が生じ、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合は、単一配列の残基を計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は均等物としてみなし得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行い得る。
【0018】
本明細書中で互換性があるように使用される「突然変異遺伝子」または「突然変異した遺伝子」とは、検出可能な突然変異を受けた遺伝子をいう。突然変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書中で使用する「破壊された遺伝子」とは、未熟なストップコドンの原因となる突然変異を有する突然変異遺伝子をいう。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【0019】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または、二本鎖および一本鎖の配列の両方の一部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組合せを含有し得る。核酸は、化学合成方法によってまたは組換え方法によって得られ得る。
本明細書中で使用する「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。
本明細書中で使用する「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。
【0020】
核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的関係に配置されている場合に、「作動可能に連結されている」（または「稼働可能に連結されている」）。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を調節する、またはその変調に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＤＮＡ配列は典型的には連続的であり、作動可能に連結されているアミノ酸配列は、典型的には連続的であり、かつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基まで、またはそれより多く隔てられている場合に機能し、イントロン配列は可変の長さであってよいため、一部のポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されているが連続的ではない場合がある。同様に、一次ポリペプチド配列中で非連続的である特定のアミノ酸配列は、たとえばポリペプチド鎖の折り畳みのおかげで、依然として作動可能に連結されている場合がある。融合ポリペプチドに関して、用語「稼働可能に連結されている」および「作動可能に連結されている」とは、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結されて、そのように連結されていないかのように、同じ機能を行うことをいうことができる。
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、突然変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、突然変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。
【0021】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２個以上のアミノ酸の連結配列である。ポリペプチドは、天然、合成、もしくは改変、または天然と合成の組合せであることができる。ペプチドおよびポリペプチドとしては、結合タンパク質、受容体、および抗体などのタンパク質が挙げられる。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、本明細書中で互換性があるように使用される。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に秩序付けられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的に、ドメイン、たとえば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、および細胞質側末端ドメインとして知られる。「ドメイン」とは、コンパクトなポリペプチドユニットを形成し、典型的には１５～３５０個のアミノ酸の長さである、ポリペプチドの一部分である。例示的なドメインとしては、酵素活性またはリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、ベータシートおよびアルファヘリックスの区間などの、より組織性の低いセクションからなる。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次ユニットの非共有的会合によって形成された三次元構造をいう。「モチーフ」とは、ポリペプチド配列の一部分であり、少なくとも２個のアミノ酸を含む。モチーフは、たとえば、２～２０、２～１５、または２～１０個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、モチーフは３、４、５、６、または７個の連続的なアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じ種類のモチーフからなり得る。
【0022】
本明細書中で互換性があるように使用される「未熟なストップコドン」または「アウトオブフレームストップコドン」とは、野生型遺伝子中には通常見つからない位置にストップコドンをもたらす、ＤＮＡの配列中のナンセンス突然変異をいう。未熟なストップコドンは、タンパク質の完全長バージョンと比較してタンパク質が切断されるまたは短くなることを引き起こし得る。
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、または増強させることができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１個または複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、または増強させることができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１個または複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
【0023】
たとえば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用する用語「組換え」とは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されている、あるいは、細胞が、そのように改変した細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（天然に存在する）形態内に見つからない遺伝子を発現する、あるいは、そうでなければ正常もしくは異常に発現される、過少発現される、または全く発現されない、ネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞（筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種）の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞（筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種）の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
【0024】
本明細書中で使用する「骨格筋状態」とは、筋ジストロフィー、加齢、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または萎縮などの、骨格筋に関連する状態をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」および「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（たとえば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、ならびにヒト等）を含めた、任意の脊椎動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。対象は、たとえば、成人、青年、または乳児などの、任意の年齢または発生段階のものであり得る。一部の実施形態では、対象は特定の遺伝子マーカーを有する。
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」および「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（たとえば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、ならびにヒト等）を含めた、任意の脊椎動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。対象は、たとえば、成人、青年、または乳児などの、任意の年齢または発生段階のものであり得る。一部の実施形態では、対象は特定の遺伝子マーカーを有する。
【0025】
「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、本明細書中でそれぞれ互換性があるように使用され、そのような用語が適用される疾患、またはそのような疾患の１種もしくは複数種の症状の進行を逆転、軽減、または阻害することを説明する。対象の状態に応じて、この用語は疾患を防止することもいい、疾患の発症を防止すること、または疾患に関連する症状を防止することを含む。処置は、急性または慢性の様式のどちらかで行い得る。この用語はまた、疾患またはそのような疾患に関連する症状の重篤度を、疾患を罹患する前に低下させることもいう。そのような疾患の重篤度の、罹患前の防止または低下とは、本発明の抗体または医薬組成物を、投与時に疾患を患っていない対象に投与することをいう。「防止すること」とは、疾患またはそのような疾患に関連する１種もしくは複数種の症状の再発を防止することもいう。「処置」および「治療上」とは、上記定義した「処置すること」のように処置する行為をいう。
【0026】
核酸に関して本明細書中で使用する「変異体」とは、（ｉ）参照したポリヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照したポリヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照した核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照した核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一である配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも１種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性（たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも１種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性（たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【0027】
本明細書中で使用する「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。たとえば、ベクターは、配列番号７もしくは配列番号８、および／または配列番号１の少なくとも１個のｇＲＮＡポリヌクレオチド配列などの融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、本明細書中に記載するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしていてよい。
【0028】
２．ジストロフィンを修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを本明細書中で提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するために使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するためのものであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされている。融合タンパク質は２個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、ａ）配列番号１の断片、ｂ）配列番号１の相補体、またはその断片、ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを本明細書中で提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するために使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するためのものであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされている。融合タンパク質は２個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、ａ）配列番号１の断片、ｂ）配列番号１の相補体、またはその断片、ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む。
【0029】
ａ）ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
【0030】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンスまたはフレームシフトの突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。天然に存在する突然変異およびその結果は、ＤＭＤについて比較的よく理解されている。桿状ドメイン内に含有されるエクソン４５～５５領域中に起こるインフレーム欠失が、高度に機能的なジストロフィンタンパク質を産生することができ、多くのキャリアは無症候性であるか、緩和な症状を表示することが知られている。さらに、６０％を超える患者が、理論的には、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的化することによって処置し得る。ｍＲＮＡスプライシング中に非必須エクソンをスキップすること（たとえばエクソン４５スキッピング）して、内部欠失であるが機能的なジストロフィンタンパク質を生じさせることによって、ＤＭＤ患者中の破壊されたジストロフィンリーディングフレームを修復する努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（たとえばエクソン４５の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持しており、内部的に切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質を生じることができる。ジストロフィンのエクソン４５～５５の間の欠失は、ＤＭＤと比較してはるかにより緩和な表現型をもたらす。
【0031】
ある特定の実施形態では、リーディングフレームを修復するためのエクソン４５の切除は、欠失突然変異を有するＤＭＤ対象を含めたＤＭＤ対象において表現型を寛解させる。ある特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５とは、ジストロフィン遺伝子の４５番目のエクソンをいう。エクソン４５は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験において標的とされている。
【0032】
本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することは、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象におけるジストロフィン機能を修復するために使用し得る。一部の実施形態では、対象は突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。
【0033】
本明細書中に開示するシステムおよびベクターは、ジストロフィン遺伝子、たとえばヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン４５でスプライスアクセプター部位を変更することができる。スプライスアクセプター部位の変更は、エクソン４５がジストロフィンタンパク質産物から欠失すること（すなわちエクソン４５スキッピング）をもたらす可能性があり、コードされているジストロフィンタンパク質の機能もしくは活性を増加させる、または対象の病状の改善をもたらす可能性がある。ある特定の実施形態では、エクソン４５スキッピングは、ジストロフィンリーディングフレームを修復することができる。一部の実施形態では、エクソン４５でのスプライスアクセプター部位は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む配列内にある。
本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）の高効率のエクソン４５スキッピングを媒介することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復し得る。エクソン４５は、ＤＭＤ中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン４５の除去を使用して、全ＤＭＤ患者の約８％を処置することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）を、ヒトＤＭＤ細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変および変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。
本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）の高効率のエクソン４５スキッピングを媒介することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復し得る。エクソン４５は、ＤＭＤ中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン４５の除去を使用して、全ＤＭＤ患者の約８％を処置することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）を、ヒトＤＭＤ細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変および変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。
【0034】
ｂ）融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＤＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＲＮＡである。
ｉ）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲをベースにしたシステムの特異性は２個の要因、すなわち標的化配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的化または認識配列はｇＲＮＡの５’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいＤＮＡ配列で、宿主ＤＮＡ上の塩基対（標的核酸または標的ＤＮＡ）と対合するように設計されている。単にｇＲＮＡの認識配列を交換することによって、Ｃａｓタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は変更したいＤＮＡ上に位置しており、Ｃａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は種特異的であることができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＤＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＲＮＡである。
ｉ）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲをベースにしたシステムの特異性は２個の要因、すなわち標的化配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的化または認識配列はｇＲＮＡの５’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいＤＮＡ配列で、宿主ＤＮＡ上の塩基対（標的核酸または標的ＤＮＡ）と対合するように設計されている。単にｇＲＮＡの認識配列を交換することによって、Ｃａｓタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は変更したいＤＮＡ上に位置しており、Ｃａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は種特異的であることができる。
【0035】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、触媒的に死んだｄＣａｓ９などのＣａｓ９タンパク質を含み得る。Ｃａｓ９タンパク質は核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ座位によってコードされており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与している。Ｃａｓ９分子は、１個または複数個のｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメイン、ある特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子の能力は、たとえば以前に記載されている形質転換アッセイ（Jinek 2012）を使用して決定することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は化膿性連鎖球菌に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号２のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は黄色ブドウ球菌に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号３のポリペプチド配列を含む。
【0036】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性が低下または失活するように、Ｃａｓ９タンパク質を突然変異させ得る。立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするために、エンドヌクレアーゼ活性を有さない失活したＣａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）を、ｇＲＮＡによって、細菌、酵母、およびヒト細胞中の遺伝子に標的化してよい。化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列を参照した、ヌクレアーゼ活性を低下または失活させるための例示的な突然変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、および／またはＤ９８６Ａが挙げられる。黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列を参照とした、ヌクレアーゼ活性を失活させるための例示的な突然変異としては、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。一部の実施形態では、化膿性連鎖球菌由来の失活したＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる、配列番号５）を使用し得る。本明細書中で使用する「ｉＣａｓ９」および「ｄＣａｓ９」はどちらも、アミノ酸置換Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを有しており、そのヌクレアーゼ活性が失活しているＣａｓ９タンパク質を指し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、アミノ酸置換Ｄ１０Ａを有する突然変異Ｃａｓ９タンパク質であることができる（「ｎＣａｓ９」と呼ばれ、ニッカーゼ活性を有する、たとえば配列番号４）。
【0037】
Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）などの、任意の細菌または古細菌の種由来であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバシラス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、スッテレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、またはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の細菌属に由来するＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、それだけには限定されないが、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス）Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ユーバクテリウム・ベントリオスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）、ストレプトコッカス・パステリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、スフェロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、アゾルピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、パルビバキュラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、およびカンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）を含めた群から選択される。
【0038】
ある特定の実施形態では、標的核酸と相互作用してそれを切断する、Ｃａｓ９分子または突然変異Ｃａｓ９タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある特定の実施形態では、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。様々な細菌種由来のＣａｓ９分子は、様々な配列モチーフ（たとえばＰＡＭ配列）を認識することができる。ある特定の実施形態では、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＧＧ（配列番号１０）を認識する（たとえばMali 2013を参照）。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１２）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１３）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１４）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
【0039】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号１０）またはＮＧＡ（配列番号１９）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴ（配列番号１１）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は黄色ブドウ球菌のＣａｓ９タンパク質であり、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１２）、ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１３）、ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１４）、またはＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
それに加えてまたはその代わりに、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列（ＮＬＳ）を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
それに加えてまたはその代わりに、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列（ＮＬＳ）を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
【0040】
ｉｉ）塩基編集ドメイン
融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。塩基編集は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を必要とせずに、標的ゲノム座位での、特定のＤＮＡ塩基から別の塩基への直接的な不可逆的変換を可能にする。図１Ｄは塩基エディターの１個の設計プロセスを示す。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは（ｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む。
シチジンデアミナーゼドメインは、ＤＮＡ塩基シトシンをウラシルへと変換することができる（図１Ｃ参照）。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、またはその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）をｄＣａｓのＮ末端と融合させて、ＢＥ１と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む。塩基編集は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を必要とせずに、標的ゲノム座位での、特定のＤＮＡ塩基から別の塩基への直接的な不可逆的変換を可能にする。図１Ｄは塩基エディターの１個の設計プロセスを示す。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは（ｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む。
シチジンデアミナーゼドメインは、ＤＮＡ塩基シトシンをウラシルへと変換することができる（図１Ｃ参照）。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、またはその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）をｄＣａｓのＮ末端と融合させて、ＢＥ１と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
【0041】
一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を阻害することができるドメインを含む。ＵＤＧ活性は、Ｎ－グリコシド結合を切断することによってウラシルを核酸から除去することを含み得る。ＵＤＧ活性は塩基切除修復（ＢＥＲ）経路を開始し得る。ＵＤＧ活性を阻害することができるＵＧＩドメインは、続くＵ：ＧミスマッチがＣ：Ｇ塩基対へと修復されて戻ることを防止し、したがって、細胞ＤＮＡ修復プロセスを操作して所望の結果（たとえばＴ：Ａ塩基対）の収率を増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、配列番号６または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、１個のＵＧＩドメインまたは２個のＵＧＩドメインを含む。複数個のＵＧＩドメインが塩基編集ドメイン中に存在する場合、ＵＧＩドメインのわずかに異なるまたは変異の配列を使用して、２つの同一配列が同じコンストラクト上で互いに隣接している場合にそれらが組み換える傾向を回避し得る。一部の実施形態では、ＵＧＩを、ｄＣａｓのＮ末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）と融合させて、ＢＥ２と命名される塩基編集酵素を生じることができる。一部の実施形態では、２個のＵＧＩを、ｄＣａｓのＮ末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）と融合させて、ＢＥ４と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
【0042】
一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号（instance）は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。リンカーは任意のアミノ酸配列であり得る。リンカーは、たとえば、およそ２～１０、およそ５～１０、およそ５～２０、またはおよそ１０～２５個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、２０個未満、１９個未満、１８個未満、１７個未満、１６個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、または１０個未満個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、リンカーはＸＴＥＮリンカー（１６個のアミノ酸）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７または配列番号８によってコードされているまたはそれに対応するアミノ酸配列を含むことができる。
【0043】
ｃ）ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子を標的とし得る。ｇＲＮＡはジストロフィン遺伝子の一部分と結合し、それを標的とし得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列を標的とし得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列によってコードされている。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２個の非コードＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、標的化特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与している天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。たとえば４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得るこの二重鎖は、Ｃａｓ９のガイドとして役割を果たす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子を標的とし得る。ｇＲＮＡはジストロフィン遺伝子の一部分と結合し、それを標的とし得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列を標的とし得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列によってコードされている。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２個の非コードＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、標的化特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与している天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。たとえば４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得るこの二重鎖は、Ｃａｓ９のガイドとして役割を果たす。
【0044】
一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、標的領域を標的としてそれと結合し得る。一部の実施形態では、１～２０個のｇＲＮＡを、標的遺伝子を変更する、たとえばスプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。たとえば、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、または５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、２０個未満のｇＲＮＡ、１９個未満のｇＲＮＡ、１８個未満のｇＲＮＡ、１７個未満のｇＲＮＡ、１６個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１４個未満のｇＲＮＡ、１３個未満のｇＲＮＡ、１２個未満のｇＲＮＡ、１１個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、９個未満のｇＲＮＡ、８個未満のｇＲＮＡ、７個未満のｇＲＮＡ、６個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、４個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。
【0045】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、様々な配列および長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡは、配列番号１を含む標的配列、または配列番号１を含む標的配列の相補的ポリヌクレオチド配列などの、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。ｇＲＮＡは、５～４０塩基対、５～３５塩基対、５～３０塩基対、１０～３５塩基対、または１０～３０塩基対の、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、または少なくとも３５塩基対の標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、４０塩基対未満、３５塩基対未満、３０塩基対未満、２５塩基対未満、２４塩基対未満、２３塩基対未満、２２塩基対未満、２１塩基対未満、２０塩基対未満、１９塩基対未満、１８塩基対未満、１７塩基対未満、１６塩基対未満、または１５塩基対未満の、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、または転写された領域のうちの少なくとも１個を標的とし得る。ｇＲＮＡは、配列番号１、その相補体、その変異体、またはその断片のうちの少なくとも１種に対応する核酸配列を含み得る。
【0046】
３．ジストロフィン機能を修復するための組成物
本発明は、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更または除去することによってジストロフィン機能を修復するための組成物に向けられている。組成物は上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸（たとえば発現コンストラクト）を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達し得る。
本発明は、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更または除去することによってジストロフィン機能を修復するための組成物に向けられている。組成物は上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸（たとえば発現コンストラクト）を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達し得る。
【0047】
ａ）コンストラクトおよびプラスミド
上述の組成物は、本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
上述の組成物は、本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
【0048】
また、遺伝子コンストラクトは、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、弱毒化した生きた微生物中の遺伝物質の一部または細胞中に生きる組換え微生物ベクターであり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含み得る。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【0049】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質を哺乳動物の細胞中で発現させることができ得る。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質をコードしている異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸で細胞を形質移入するために有用である場合があり、形質転換させた宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの発現が起こる条件下で培養および維持する。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を減らすように選択される。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を減らすように選択される。
【0050】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている異種核酸を含んでいてよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列の下流であり得るストップコドンをさらに含んでいてよい。開始および終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列とインフレームであり得る。また、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターも含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、空間および時間における塩基編集のダイナミック制御を可能にするために、光誘導性または化学誘導性の制御下であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。また、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。また、プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容がその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。
【0051】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムまたはｓｇＲＮＡの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーを含んでいてもよい。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムまたはｓｇＲＮＡの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーを含んでいてもよい。
【0052】
ベクターは、参考として完全に組み込まれているSambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)を含めた、ルーチン技法および容易に入手可能な出発物質によってタンパク質を産生させるための発現ベクターまたはシステムであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードしている核酸配列と、配列番号１の核酸配列、その相補体、その変異体、またはその断片を含む、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている核酸配列とを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡおよびタンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））によって送達する。たとえば、精製融合タンパク質をガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＰ複合体を形成することができる。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡおよびタンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））によって送達する。たとえば、精製融合タンパク質をガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＰ複合体を形成することができる。
【0053】
ｂ）改変レンチウイルスベクター
エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、融合タンパク質コードしている第１のポリヌクレオチド配列および少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、または５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、２０個未満のｇＲＮＡ、１９個未満のｇＲＮＡ、１８個未満のｇＲＮＡ、１７個未満のｇＲＮＡ、１６個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１４個未満のｇＲＮＡ、１３個未満のｇＲＮＡ、１２個未満のｇＲＮＡ、１１個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、９個未満のｇＲＮＡ、８個未満のｇＲＮＡ、７個未満のｇＲＮＡ、６個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、４個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を含む標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、融合タンパク質コードしている第１のポリヌクレオチド配列および少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、または５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、２０個未満のｇＲＮＡ、１９個未満のｇＲＮＡ、１８個未満のｇＲＮＡ、１７個未満のｇＲＮＡ、１６個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１４個未満のｇＲＮＡ、１３個未満のｇＲＮＡ、１２個未満のｇＲＮＡ、１１個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、９個未満のｇＲＮＡ、８個未満のｇＲＮＡ、７個未満のｇＲＮＡ、６個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、４個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を含む標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
【0054】
ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、ＡＡＶは、融合タンパク質およびｇＲＮＡ発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、融合タンパク質および２個までのｇＲＮＡ発現カセットの両方を、単一のＡＡＶベクター中で４．７ｋｂのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
ＡＡＶは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、ＡＡＶは、融合タンパク質およびｇＲＮＡ発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、融合タンパク質および２個までのｇＲＮＡ発現カセットの両方を、単一のＡＡＶベクター中で４．７ｋｂのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
【0055】
上述の組成物は改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞中において部位特異的ヌクレアーゼを送達および発現させることでき得る。たとえば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１種または複数種に基づき得る。改変ＡＡＶベクターは、全身性および局所的な送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づき得る（Seto et al. Current Gene Therapy (2012) 12:139-151）。
【0056】
４．突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象においてジストロフィン機能を修復する方法
ＤＭＤを患っているおよび／または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および／または対象において、ジストロフィン機能（たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修復する方法を、本明細書中に提供する。また、それを必要としている対象において、デュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法も、本明細書中に提供する。また、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更する方法も、本明細書中に提供する。本方法は、本明細書中に詳述する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象もしくはその細胞に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
ＤＭＤを患っているおよび／または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および／または対象において、ジストロフィン機能（たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修復する方法を、本明細書中に提供する。また、それを必要としている対象において、デュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法も、本明細書中に提供する。また、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更する方法も、本明細書中に提供する。本方法は、本明細書中に詳述する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象もしくはその細胞に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
【0057】
本方法は、上述の本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。本方法は、対象の骨格筋または心筋に、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物の使用は、完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を修復し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、功を奏したかつ効率的な遺伝子改変の率が高いことで、高度なゲノム編集の利点を有する。
本方法は、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、および／または、配列番号１、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡを投与することなど、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。
本方法は、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、および／または、配列番号１、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡを投与することなど、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。
【0058】
５．医薬組成物
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ１ｎｇ～およそ１０ｍｇの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしているＤＮＡを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ１ｎｇ～およそ１０ｍｇの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしているＤＮＡを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
【0059】
形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。形質移入促進剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。形質移入促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含んでいてよく、また、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて投与して使用し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしているＤＮＡベクターは、脂質、レシチンリポソームもしくは当分野で知られている他のリポソームなどのリポソームをＤＮＡ－リポソーム混合物として（たとえばＷ０９３２４６４０号を参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤などの形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。
【0060】
６．送達方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される１個または複数個の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌもしくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの形質移入試薬を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される１個または複数個の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌもしくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの形質移入試薬を含み得る。
【0061】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達し得る。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達し得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている１個または複数個のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている１個または複数個のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
【0062】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクトまたは組成物を組織に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞内に送達した際、形質移入した細胞はｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を発現する。遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳動物に投与して、遺伝子発現を変更し得る、またはゲノムを再操作もしくは変更し得る。たとえば、遺伝子コンストラクトまたは組成物は、哺乳動物においてジストロフィン機能を修復するために、哺乳動物に投与し得る。哺乳動は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードしている遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードしている遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
【0063】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を細胞内に導入して、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）のジストロフィン機能を遺伝子修復することができる。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の筋芽細胞内に導入する。ある特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞内に導入し、遺伝子補正した繊維芽細胞をＭｙｏＤで処置して筋芽細胞への分化を誘導することができ、補正されたジストロフィンタンパク質が機能的であるかを検証するため、および／または対象を処置するために、これを対象の損傷筋肉などの対象内に移植することができる。改変細胞は、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞などの幹細胞であることもできる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、人工多能性幹細胞の神経性または筋原性の分化を引き起こし得る。
【0064】
７．投与経路
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
【0065】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、筋肉内、静脈内、またはその組合せで対象（たとえばＤＭＤを患っている対象）に投与する。獣医学的使用には、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。
【0066】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。組成物は、骨格筋または心筋内に注射し得る。たとえば、組成物は、前脛骨筋または尾部内に注射し得る。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾部静脈注入（全身性）、２）成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、ＴＡもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注入（全身性）によって投与する。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾部静脈注入（全身性）、２）成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、ＴＡもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注入（全身性）によって投与する。
【0067】
８．細胞種
これらの送達方法および／または投与経路のうちの任意のものを、本明細書中に記載した（ｄｅｓｃｉｂｅｄ）塩基編集システムを無数の細胞種に送達するために利用することができる。たとえば、細胞種としては、それだけには限定されないが、野生型およびＤＭＤ患者由来の株などの不死化筋芽細胞、一次ＤＭＤ真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞が挙げられ得る。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたシステムの一過性ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、外因性ＤＮＡの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いｉｎ ｓｉｔｕの補正および／または修復を可能にし得る。
これらの送達方法および／または投与経路のうちの任意のものを、本明細書中に記載した（ｄｅｓｃｉｂｅｄ）塩基編集システムを無数の細胞種に送達するために利用することができる。たとえば、細胞種としては、それだけには限定されないが、野生型およびＤＭＤ患者由来の株などの不死化筋芽細胞、一次ＤＭＤ真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞が挙げられ得る。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたシステムの一過性ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、外因性ＤＮＡの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いｉｎ ｓｉｔｕの補正および／または修復を可能にし得る。
【0068】
９．キット
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび／またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、ジストロフィン機能を修復するための、配列番号１のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、またはその断片と結合し、それを標的とする、またはそれによってコードされている、またはそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした編集システムを使用するための指示とを含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の塩基編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび／またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、ジストロフィン機能を修復するための、配列番号１のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、またはその断片と結合し、それを標的とする、またはそれによってコードされている、またはそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした編集システムを使用するための指示とを含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の塩基編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
【0069】
キット中に含められる指示は、梱包材料に貼り得る、または添付文書として含められ得る。指示は典型的には文書または印刷された物体であるが、これらはそれに限定されない。そのような指示を記憶し、それらを最終使用者に伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、それだけには限定されないが、電子記憶媒体（たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（たとえばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書中で使用する用語「指示」としては、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを挙げ得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のｇＲＮＡ分子および融合タンパク質を含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン４５スプライスアクセプター含有領域と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のｇＲＮＡ分子および融合タンパク質を含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン４５スプライスアクセプター含有領域と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
【実施例】
【0070】
１０．実施例
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。以下の非限定的な例によって例示されるように本発明は複数の態様を有する。
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。以下の非限定的な例によって例示されるように本発明は複数の態様を有する。
【0071】
（実施例１）
ＰＡＭの利用可能性に基づいてスプライスアクセプターを塩基編集するように、ｇＲＮＡを設計した（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。化膿性連鎖球菌および黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質の両方を有するＤＮＡ塩基エディターシステム（図１Ａおよび図１Ｂ）を、エクソン４５～５５の間のＤＭＤ遺伝子欠失のホットスポット中のヒトジストロフィンエクソンに標的化するように、ｇＲＮＡを設計した。図１Ｂに記載したＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９３）およびＡｎｃＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９４）の設計は、発現レベルが限定されていた図１Ａにおける設計よりも低い濃度でより良好に作動した。ＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘの設計は同様の性能であった。ｇＲＮＡは、すべての設計間で一定であるＣａｓ９部分と結合するため、同じｇＲＮＡを複数世代の塩基エディターを通して使用することができる（Ｃａｓ９種が同じままである限り）。
ＰＡＭの利用可能性に基づいてスプライスアクセプターを塩基編集するように、ｇＲＮＡを設計した（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。化膿性連鎖球菌および黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質の両方を有するＤＮＡ塩基エディターシステム（図１Ａおよび図１Ｂ）を、エクソン４５～５５の間のＤＭＤ遺伝子欠失のホットスポット中のヒトジストロフィンエクソンに標的化するように、ｇＲＮＡを設計した。図１Ｂに記載したＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９３）およびＡｎｃＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９４）の設計は、発現レベルが限定されていた図１Ａにおける設計よりも低い濃度でより良好に作動した。ＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘの設計は同様の性能であった。ｇＲＮＡは、すべての設計間で一定であるＣａｓ９部分と結合するため、同じｇＲＮＡを複数世代の塩基エディターを通して使用することができる（Ｃａｓ９種が同じままである限り）。
【0072】
４００ｎｇのｇＲＮＡプラスミドおよび４００ｎｇのＢＥ４ｍａｘまたはＡｎｃＢＥ４ｍａｘプラスミドを用いた、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミド形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）によって、スプライスアクセプターＧ＞Ａ塩基編集を様々なジストロフィンエクソンでアッセイした。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、％Ｇ＞Ａ塩基編集を決定した。表１を参照されたい。一部のエクソンは乏しい編集効率（すなわち＜０．１％の編集）を示した一方で、対立遺伝子の７～８％が、５’－ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１）のエクソン４５ ｇＲＮＡ配列を使用してエクソン４５で編集されたことが観察された。エクソン４５は、その除去が２番目に大きなＤＭＤ患者群（約８％）を処置する可能性があるジストロフィンエクソンである（Aartsma-Rus et al. Human Mutation (2009) 30(3):293-9）。
【0073】
【表1】
【0074】
４００ｎｇのｇＲＮＡプラスミドおよび４００ｎｇまたは１０００ｎｇのＢＥ４ｍａｘプラスミドを用いた、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミド形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）によって、スプライスアクセプターＧ＞Ａ塩基編集をエクソン４４および４５でアッセイした。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、％Ｇ＞Ａ塩基編集を決定した。塩基編集を増加するためにＢＥ３ｍａｘプラスミドの量を増加することによって、形質移入条件を最適化した。図３Ｂおよび図３Ｃに示すように、塩基編集はエクソン４５ ｇＲＮＡで７～８％まで増加した。図３Ａに示すようにＧ１およびＧ２の両方を編集することで、適切なエクソンスキッピングが提供され得る。
【0075】
エクソンスキッピングに対するスプライシング部位の破壊の効果を試験するために、ジストロフィンエクソン４４の欠失を保有するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株を作製した。図４Ａ～４Ｄを参照されたい。この多能性細胞株は、エクソン４５の除去によって補正可能な、ＤＭＤ遺伝子の破壊されたリーディングフレームを有する遺伝性のＤＭＤ突然変異をモデリングしている。ｉＰＳＣはジストロフィンを発現しないため、編集したエクソンがスキップされているかどうかを決定するのは困難である。ｉＰＳＣ中のＭｙｏＤの過剰発現を使用してジストロフィンを発現させて、ＲＮＡおよびタンパク質レベルを分析した（図５）。
【0076】
ＭｙｏＤ ｃＤＮＡのレンチウイルス形質導入によるこのΔ４４ ｉＰＳＣ株の筋原性分化により、突然変異がジストロフィンタンパク質発現を除去することが確認される。図６を参照されたい。化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９をベースにしたＡｎｃＢＥ４ｍａｘおよびｇＲＮＡカセットを、これらの細胞にレンチウイルス形質導入によって送達した。図７に手順のアウトラインを示す。２００μＬの２０×ウイルスをＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘの形質導入に使用した。図８Ａおよび図９Ａは、それぞれＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘの％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す。図８Ｂおよび図９Ｂは、それぞれＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘのすべてのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す。コンストラクト設計中のＡＰＯＢＥＣ酵素はＧ＞Ａを変換するはずであるが、場合によってはＧ＞ＴまたはＧ＞Ｃの事象も起こる。Ｇの除去をもたらすこれらの事例のうちの任意のものがスプライシングを破壊するはずであり、したがって、「非Ｇ」事象の合計は有効編集率を与える。図１０は、ＢＥ４ｍａｘおよびＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用した１２日後のΔ４４ ｉＰＳＣ編集（任意の他の塩基へと編集されたＧを有するリードの％）を示す。ディープシーケンシングにより、スプライスアクセプターの２２％が１２日後に破壊されたことが示された。図１２は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｒｕｓ）によって送達した、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す。図１３は、電気穿孔によって送達した、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す。細胞は、ｇＲＮＡレンチウイルスで７日間（Ｄ７）および１４日間（Ｄ１４）処置した後に収集した。
【0077】
この編集したΔ４４ ｉＰＳＣ株中でのＭｙｏＤの過剰発現、続いてＲＴ－ＰＣＲにより、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン４５のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することが確認された。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘがより高い編集を示したため、これらの編集した細胞をＭｙｏＤで分化させ、ＲＮＡを収集してスキッピングを探した。図１１は、以下のプライマーを用いた３５回の増幅サイクル後のＲＴ－ＰＣＲ結果を示す：５’－ＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ－３’（配列番号１６）および５’－ＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１７）。エクソン４５の頑強なスキッピングが、エクソン４５ ｇＲＮＡで処置した細胞において観察されたが、ｇＲＮＡなしの対照では観察されなかった。
この編集したΔ４４ ｉＰＳＣ株中でのＭｙｏＤの過剰発現、続いてウエスタンブロット分析により、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン４５のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することがさらに確認された。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘレンチウイルスおよびｇＲＮＡレンチウイルス、またはＷＴ ｉＰＳＣで形質導入したΔ４４ ｉＰＳＣ細胞を、上記図１１のようにＭｙｏＤで分化させた。細胞溶解液を収集し、ジストロフィンタンパク質およびＧＡＰＤＨに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット（図１４）は、未処置のΔ４４ ｉＰＳＣ細胞は、特に最も大きなアイソフォームではるかに低下したジストロフィンタンパク質発現を有していたが、塩基編集（ｇＲＮＡあり）が一部のジストロフィンタンパク質発現を修復することができたことを示す。
この編集したΔ４４ ｉＰＳＣ株中でのＭｙｏＤの過剰発現、続いてウエスタンブロット分析により、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン４５のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することがさらに確認された。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘレンチウイルスおよびｇＲＮＡレンチウイルス、またはＷＴ ｉＰＳＣで形質導入したΔ４４ ｉＰＳＣ細胞を、上記図１１のようにＭｙｏＤで分化させた。細胞溶解液を収集し、ジストロフィンタンパク質およびＧＡＰＤＨに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット（図１４）は、未処置のΔ４４ ｉＰＳＣ細胞は、特に最も大きなアイソフォームではるかに低下したジストロフィンタンパク質発現を有していたが、塩基編集（ｇＲＮＡあり）が一部のジストロフィンタンパク質発現を修復することができたことを示す。
【0078】
完全性の理由のため、本発明の様々な態様を以下の付番した条項中に記載する：
条項１．融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２．ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することが、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、条項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項３．融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項４．対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする、条項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１．融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２．ゲノムＤＮＡ中にコードされているＲＮＡスプライシング部位を変更することが、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、条項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項３．融合タンパク質および少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、融合タンパク質がＣａｓタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項４．対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする、条項３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【0079】
条項５．対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、条項４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項６．少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項１～５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項７．少なくとも１個のｇＲＮＡが、ａ）配列番号１の断片、ｂ）配列番号１の相補体もしくはその断片、ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、またはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項８．少なくとも１個のｇＲＮＡが、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、条項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項６．少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項１～５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項７．少なくとも１個のｇＲＮＡが、ａ）配列番号１の断片、ｂ）配列番号１の相補体もしくはその断片、ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、またはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項８．少なくとも１個のｇＲＮＡが、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、条項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【0080】
条項９．Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含み、Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む、条項１～８のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１０．少なくとも１個のアミノ酸突然変異が、配列番号２または３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはその組合せのうちの少なくとも１個である、条項９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１１．Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～１０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１２．Ｃａｓタンパク質が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む、条項１～１１のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１３．塩基編集ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む、条項１～１２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１０．少なくとも１個のアミノ酸突然変異が、配列番号２または３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはその組合せのうちの少なくとも１個である、条項９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１１．Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～１０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１２．Ｃａｓタンパク質が、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む、条項１～１１のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１３．塩基編集ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む、条項１～１２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【0081】
条項１４．シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼを含む、条項１３に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１５．シチジンデアミナーゼドメインがＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１３または１４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１６．シチジンデアミナーゼドメインがラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１３～１５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１７．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む、条項１３～１６のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１８．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号６もしくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、条項１７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１５．シチジンデアミナーゼドメインがＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１３または１４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１６．シチジンデアミナーゼドメインがラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１３～１５のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１７．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む、条項１３～１６のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１８．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号６もしくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、条項１７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【0082】
条項１９．塩基編集ドメインが、１個のＵＧＩドメインまたは２個のＵＧＩドメインを含む、条項１～１８のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２０．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～１９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２１．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２２．融合タンパク質が、核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む、条項２１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２３．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項２２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２０．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～１９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２１．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２２．融合タンパク質が、核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む、条項２１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２３．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ2－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項２２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
【0083】
条項２４．融合タンパク質が、配列番号７または配列番号８に対応するポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列を含む、条項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２５．条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
条項２６．ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチドおよびｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチドを含む、条項２５に記載の単離したポリヌクレオチド。
条項２７．条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２８．ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項２７に記載のベクター。
条項２９．条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチドまたは条項２７もしくは２８に記載のベクターを含む細胞。
条項２５．条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
条項２６．ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチドおよびｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチドを含む、条項２５に記載の単離したポリヌクレオチド。
条項２７．条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２８．ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項２７に記載のベクター。
条項２９．条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチドまたは条項２７もしくは２８に記載のベクターを含む細胞。
【0084】
条項３０．条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
条項３１．条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチド、条項２７もしくは２８に記載のベクター、条項２９に記載の細胞、または条項３０に記載の組成物を含む、キット。
条項３２．細胞または対象を、条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３３．突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＡＡ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される、条項３２に記載の方法。
条項３４．対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項３２または３３に記載の方法。
条項３１．条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、条項２５もしくは２６に記載の単離したポリヌクレオチド、条項２７もしくは２８に記載のベクター、条項２９に記載の細胞、または条項３０に記載の組成物を含む、キット。
条項３２．細胞または対象を、条項１～２４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３３．突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＡＡ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される、条項３２に記載の方法。
条項３４．対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項３２または３３に記載の方法。
【0085】
配列
エクソン４５ ｇＲＮＡの標的配列（配列番号１）
ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（配列番号２）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
エクソン４５ ｇＲＮＡの標的配列（配列番号１）
ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（配列番号２）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【0086】
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（配列番号３）
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
【0087】
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａを有する）（配列番号４）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
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【0088】
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４９Ａを有する）（配列番号５）
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【0089】
ＵＧＩ－１をコードしているポリヌクレオチド（配列番号６）
ACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTG
ACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTG
【0090】
ｐＣＭＶ＿ＢＥ４ｍａｘ配列（配列番号７）
ATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGCCACCATGAAACGGACAGCCGACGGAAGCGAGTTCGAGTCACCAAAGAAGAAGCGGAAAGTCTCCTCAGAGACTGGGCCTGTCGCCGTCGATCCAACCCTGCGCCGCCGGATTGAACCTCACGAGTTTGAAGTGTTCTTTGACCCCCGGGAGCTGAGAAAGGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAACTGGGGAGGCAGGCACTCCATCTGGAGGCACACCTCTCAGAACACAAATAAGCACGTGGAGGTGAACTTCATCGAGAAGTTTACCACAGAGCGGTACTTCTGCCCCAATACCAGATGTAGCATCACATGGTTTCTGAGCTGGTCCCCTTGCGGAGAGTGTAGCAGGGCCATCACCGAGTTCCTGTCCAGATATCCACACGTGACACTGTTTATCTACATCGCCAGGCTGTATCACCACGCAGACCCAAGGAATAGGCAGGGCCTGCGCGATCTGATCAGCTCCGGCGTGACCATCCAGATCATGACAGAGCAGGAGTCCGGCTACTGCTGGCGGAACTTCGTGAATTATTCTCCTAGCAACGAGGCCCACTGGCCTAGGTACCCACACCTGTGGGTGCGCCTGTACGTGCTGGAGCTGTATTGCATCATCCTGGGCCTGCCCCCTTGTCTGAATATCCTGCGGAGAAAGCAGCCCCAGCTGACCTTCTTTACAATCGCCCTGCAGTCTTGTCACTATCAGAGGCTGCCACCCCACATCCTGTGGGCCACAGGCCTGAAGTCTGGAGGATCTAGCGGAGGATCCTCTGGCAGCGAGACACCAGGAACAAGCGAGTCAGCAACACCAGAGAGCAGTGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGA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【0091】
ｐＣＭＶ＿ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ配列（配列番号８）
ATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGCCACCATGAAACGGACAGCCGACGGAAGCGAGTTCGAGTCACCAAAGAAGAAGCGGAAAGTCAGCAGTGAAACCGGACCAGTGGCAGTGGACCCAACCCTGAGGAGACGGATTGAGCCCCATGAATTTGAAGTGTTCTTTGACCCAAGGGAGCTGAGGAAGGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAAGTGGGGCACAAGCCACAAGATCTGGCGCCACAGCTCCAAGAACACCACAAAGCACGTGGAAGTGAATTTCATCGAGAAGTTTACCTCCGAGCGGCACTTCTGCCCCTCTACCAGCTGTTCCATCACATGGTTTCTGTCTTGGAGCCCTTGCGGCGAGTGTTCCAAGGCCATCACCGAGTTCCTGTCTCAGCACCCTAACGTGACCCTGGTCATCTACGTGGCCCGGCTGTATCACCACATGGACCAGCAGAACAGGCAGGGCCTGCGCGATCTGGTGAATTCTGGCGTGACCATCCAGATCATGACAGCCCCAGAGTACGACTATTGCTGGCGGAACTTCGTGAATTATCCACCTGGCAAGGAGGCACACTGGCCAAGATACCCACCCCTGTGGATGAAGCTGTATGCACTGGAGCTGCACGCAGGAATCCTGGGCCTGCCTCCATGTCTGAATATCCTGCGGAGAAAGCAGCCCCAGCTGACATTTTTCACCATTGCTCTGCAGTCTTGTCACTATCAGCGGCTGCCTCCTCATATTCTGTGGGCTACAGGCCTGAAGTCTGGAGGATCTAGCGGAGGATCCTCTGGCAGCGAGACACCAGGAACAAGCGAGTCAGCAACACCAGAGAGCAGTGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTAAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGTGACAGCGGCGGGAGCGGCGGGAGCGGGGGGAGCACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGATCCGGAGGATCTGGAGGCAGCACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTGTCTGGCGGCTCAAAAAGAACCGCCGACGGCAGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTAACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTAGGATGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGAAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACACTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCGATCTCCCGATCCCCTAGGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATC
ATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGCCACCATGAAACGGACAGCCGACGGAAGCGAGTTCGAGTCACCAAAGAAGAAGCGGAAAGTCAGCAGTGAAACCGGACCAGTGGCAGTGGACCCAACCCTGAGGAGACGGATTGAGCCCCATGAATTTGAAGTGTTCTTTGACCCAAGGGAGCTGAGGAAGGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAAGTGGGGCACAAGCCACAAGATCTGGCGCCACAGCTCCAAGAACACCACAAAGCACGTGGAAGTGAATTTCATCGAGAAGTTTACCTCCGAGCGGCACTTCTGCCCCTCTACCAGCTGTTCCATCACATGGTTTCTGTCTTGGAGCCCTTGCGGCGAGTGTTCCAAGGCCATCACCGAGTTCCTGTCTCAGCACCCTAACGTGACCCTGGTCATCTACGTGGCCCGGCTGTATCACCACATGGACCAGCAGAACAGGCAGGGCCTGCGCGATCTGGTGAATTCTGGCGTGACCATCCAGATCATGACAGCCCCAGAGTACGACTATTGCTGGCGGAACTTCGTGAATTATCCACCTGGCAAGGAGGCACACTGGCCAAGATACCCACCCCTGTGGATGAAGCTGTATGCACTGGAGCTGCACGCAGGAATCCTGGGCCTGCCTCCATGTCTGAATATCCTGCGGAGAAAGCAGCCCCAGCTGACATTTTTCACCATTGCTCTGCAGTCTTGTCACTATCAGCGGCTGCCTCCTCATATTCTGTGGGCTACAGGCCTGAAGTCTGGAGGATCTAGCGGAGGATCCTCTGGCAGCGAGACACCAGGAACAAGCGAGTCAGCAACACCAGAGAGCAGTGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTAAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGTGACAGCGGCGGGAGCGGCGGGAGCGGGGGGAGCACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGATCCGGAGGATCTGGAGGCAGCACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTGTCTGGCGGCTCAAAAAGAACCGCCGACGGCAGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTAACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTAGGATGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGAAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACACTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCGATCTCCCGATCCCCTAGGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATC
【0092】
エクソン４４ ｇＲＮＡの標的配列（配列番号９）
ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡ
ＰＡＭ（配列番号１０）
ＮＧＧ
ＰＡＭ（配列番号１１）
ＮＮＮＲＲＴ
ＰＡＭ（配列番号１２）
ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡ
ＰＡＭ（配列番号１０）
ＮＧＧ
ＰＡＭ（配列番号１１）
ＮＮＮＲＲＴ
ＰＡＭ（配列番号１２）
ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
【0093】
ＰＡＭ（配列番号１３）
ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１４）
ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１５）
ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｃ、またはＧ）
ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１６）
ＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ
ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１７）
ＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣ
ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１４）
ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１５）
ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｃ、またはＧ）
ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１６）
ＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ
ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１７）
ＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣ
【0094】
ＵＧＩ－２をコードしているポリヌクレオチド（配列番号１８）
ACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTG
ＰＡＭ（配列番号１９）
ＮＧＡ
ＵＧＩポリペプチド（配列番号２０）
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTG
ＰＡＭ（配列番号１９）
ＮＧＡ
ＵＧＩポリペプチド（配列番号２０）
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】