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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-26
(54)【発明の名称】不稔魚
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220519BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20220519BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220519BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
A01K67/027 ZNA
C12N15/09 110
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559914
(86)(22)【出願日】2020-04-09
(85)【翻訳文提出日】2021-12-07
(86)【国際出願番号】 US2020027560
(87)【国際公開番号】W WO2020210556
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/831,293
(32)【優先日】2019-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513214088
【氏名又は名称】リコンビネティクス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＣＯＭＢＩＮＥＴＩＣＳ，ＩＮＣ．
(71)【出願人】
【識別番号】501083115
【氏名又は名称】メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】クラーク，カール ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ソンステガード，タッド エス
(72)【発明者】
【氏名】カールソン，ダニエル エフ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA41
(57)【要約】
本開示は、少なくとも、不稔魚および不稔魚を生産する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
不稔魚を生産する方法であって、精子で卵子を受精させることを含み、ここで卵子は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚から得られる、方法。
【請求項2】
遺伝子の３’－ＵＴＲの改変が、ホモ接合性改変を含む雌魚によって卵子に沈着される母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全をもたらす、請求項１に記載の方法であって、ここで母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全は、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生における始原生殖細胞の発達および／または移動を防止または低減する、方法。
【請求項3】
不稔魚が、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の配偶子を生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
受精がインビトロまたはインビボであり、インビボが雄魚とホモ接合性改変を含む雌魚とを交配させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生を、不稔魚の稚魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、稚魚を、不稔魚の幼魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、および／または、幼魚を、不稔魚を完全に成長した、成熟した、および／または成魚に発達させるのに適した条件下で維持することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
不稔魚が雄である、請求項１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
遺伝子が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与し、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、および ｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
改変が、受精卵または未受精卵において遺伝子編集され、卵がホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られるか、またはホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた卵子の受精から得られる接合子において遺伝子編集された、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
改変を含む細胞から細胞の核を得て、核を除核卵に移すことを含み、ここで核を受け取った除核卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
遺伝子編集が、マイクロインジェクション、脂質ベースのトランスフェクション、化学ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス媒介性形質導入、またはエキソソーム媒介トランスフェクション、およびそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前駆体が、雌魚に少なくとも１世代、少なくとも２世代、少なくとも３世代、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、または少なくとも１００世代先行する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
遺伝子編集がヌクレアーゼの使用を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む部位特異的遺伝子編集システムを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
遺伝子編集システムが、３’－ＵＴＲの欠失または３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む改変を作る、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
欠失または挿入が、例えばその結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または廃止することによって、原始生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる野生型３’－ＵＴＲの早期切断を作る、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
遺伝子編集がポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ポリヌクレオチドが、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に相同な１つまたは複数の領域、および／または遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に非相同な１つまたは複数の領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ポリヌクレオチドが相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を含むか、またはポリヌクレオチドがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
遺伝子編集が、ポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
非相同領域が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
非相同領域が、外因性遺伝子のコード配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
外因性遺伝子が、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体または変異体をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
不稔魚が、ティラピア、サケ、マス、マグロ、シーバス、ブリーム、タイ、バラマンディ、サバヒー、カトラ、コイ、ナマズ、カンパチ、およびゼブラフィッシュから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
改良された形質が、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法によって得られた不稔魚。
【請求項27】
遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変またはホモ接合性改変を含む細胞であって、遺伝子は原始生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与し、遺伝子はｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、 ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａから選択される、細胞。
【請求項28】
遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変またはホモ接合性改変を含む魚であって、遺伝子は原始生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与し、遺伝子はｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａから選択される、魚。
【請求項29】
ティラピア、サケ、マス、マグロ、シーバス、ブリーム、タイ、バラマンディ、サバヒー、カトラ、コイ、ナマズ、カンパチ、およびゼブラフィッシュから選択される、請求項２８に記載の魚。
【請求項30】
魚は、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含み、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、請求項２９に記載の魚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１９年４月９日に出願されたＵＳ６２／８３１，２９３の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１９年４月９日に出願されたＵＳ６２／８３１，２９３の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本願発明は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年４月７日に作られた上記のＡＳＣＩコピーは、サイズが１，９２１バイトで、「５３５４５－７３１．６０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前が付けられる。
本願発明は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年４月７日に作られた上記のＡＳＣＩコピーは、サイズが１，９２１バイトで、「５３５４５－７３１．６０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前が付けられる。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
改良された形質を有する養殖魚が逃げた場合、その改良された遺伝子を野生の魚の個体群に伝達することができる。かかる改良された魚は、その野生の近縁生物を打ち負かしてもよい。これを回避するために、養殖魚が逃げた場合、その改良された遺伝子を野生の魚の個体群に伝達できず、そしておそらく野生の魚の個体群を打ち負かし、それによって野生の多様性を減らすことができないように、不稔の改良された魚を作ることが望ましい。
改良された形質を有する養殖魚が逃げた場合、その改良された遺伝子を野生の魚の個体群に伝達することができる。かかる改良された魚は、その野生の近縁生物を打ち負かしてもよい。これを回避するために、養殖魚が逃げた場合、その改良された遺伝子を野生の魚の個体群に伝達できず、そしておそらく野生の魚の個体群を打ち負かし、それによって野生の多様性を減らすことができないように、不稔の改良された魚を作ることが望ましい。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、少なくとも、不稔魚および不稔魚を生産するための方法を提供する。
【0005】
一態様において、本開示は、不稔魚を生産するための方法を提供する。該方法は、精子で卵子を受精させる工程を含み、卵子は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚から得られる。
【0006】
遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全をもたらしてもよい。機能不全を含む母系的に発現されたｍＲＮＡは、ホモ接合性改変を含む雌魚によって卵子に沈着されてもよい。実施形態において、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全は、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生における始原生殖細胞（ＰＧＣ）の発達および／または移動を防止または低減する。
【0007】
不稔魚は、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の配偶子を生産してもよい。実施形態において、不稔魚は配偶子を生産することができない。不稔魚は、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の機能的な配偶子を生産してもよい。実施形態において、不稔魚は、機能的な配偶子を生産することができない。
【0008】
受精はインビトロであってもよく、または受精はインビボであってもよく、そして雄魚とホモ接合性改変を含む雌魚とを交配させることを含む。後者の場合、交配は卵子の体内受精または卵子の体外受精を含んでもよい。
【0009】
場合によっては、方法は、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生を、不稔魚の稚魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、該方法は、稚魚を、不稔魚の幼魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、および／または該方法は、幼魚を、完全に成長した、成熟した、および／または成魚に発達させるのに適した条件下で維持することをさらに含む。
【0010】
実施形態において、不稔魚は雄である。
【0011】
受精に使用される精子は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含んでもよく、または精子は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を欠いてもよい、つまり遺伝子編集された３’－ＵＴＲを有さなくてもよい。
【0012】
実施形態において、（３’－ＵＴＲで遺伝子編集されていない場合）遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。遺伝子は、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａの１つまたは複数であってもよい。
【0013】
（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける）改変は、未受精卵または受精卵で遺伝子編集されていてもよい。実施形態において、遺伝子編集された卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた。
【0014】
（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける）改変は、接合子で遺伝子編集されていてもよい。実施形態において、遺伝子編集された卵子は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた。
【0015】
場合によっては、方法は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含む細胞の核を得ることをさらに含む。実施形態において、方法は、改変を含む核を除核卵に移すことをさらに含む。核を受け取った除核卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する。遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、核を提供する細胞で遺伝子編集されたか、親細胞で遺伝子編集されていてもよい。
【0016】
遺伝子編集工程は、マイクロインジェクション、脂質ベースのトランスフェクション、化学ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス媒介形質導入、またはエキソソーム媒介トランスフェクションの１つまたは複数、およびそれらの組み合わせを使用してもよい。実施形態において、小核注入は前核マイクロインジェクションである。実施形態において、脂質ベースのトランスフェクションは、ナノ粒子、微粒子、またはリポソーム、およびそれらの組み合わせを含む。
【0017】
場合によっては、前駆体は、（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む）雌魚に少なくとも１世代、少なくとも２世代、少なくとも３世代、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、または少なくとも１００世代、およびそれらの間の任意の数の世代先行する。
【0018】
実施形態において、遺伝子編集は、ヌクレアーゼの使用を含む。
【0019】
場合によっては、遺伝子編集は部位特異的遺伝子編集システムを含む。遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含んでもよい。
【0020】
実施形態において、遺伝子編集システムは、３’－ＵＴＲの欠失、例えば、３’－ＵＴＲの早期切断をもたらす欠失を含む改変を作る。実施形態において、欠失は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を防止し、および／またはその結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低下または無効にする。遺伝子編集システムは、３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む改変を作ってもよい。
【0021】
遺伝子編集は、ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【0022】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に相同な１つまたは複数の領域を含み、および／またはポリヌクレオチドは、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に非相同な１つまたは複数の領域を含んでもよい。実施形態において、ポリヌクレオチドは、相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を含むか、またはポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態において、遺伝子編集は、ポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。
【0023】
実施形態において、非相同領域は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列を含む。始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列は、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低下または無効にしてもよく、および／または１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含んでもよい。場合によっては、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列は、外因性遺伝子のコード配列を含む。実施形態において、外因性遺伝子のコード配列は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む。実施形態において、外因性遺伝子は、レポーター、例えば、蛍光タンパク質をコードする。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体または変異体であってもよい。
【0024】
不稔魚は、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）であってもよい。
【0025】
遺伝子編集されたホモ接合性改変および／または前駆体を含む雌魚は、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含んでもよい。改良された形質は、遺伝子操作の結果および／または品種改良の結果であってもよい。改良された形質は、魚に導入または繁殖されており、市販の魚の価値を高める任意の形質であってもよい。改良された形質は、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数であってもよい。
【0026】
一態様において、本開示は、本明細書に開示された任意の方法によって得られた不稔魚を提供する。
【0027】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される任意の方法によって得られた不稔魚から得られた組織を含む食品を提供する。
【0028】
本開示の一態様は、インビトロ細胞である。インビトロ細胞は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変または遺伝子の３’－ＵＴＲのホモ接合性改変を含む。これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。
【0029】
実施形態において、インビトロ細胞は、体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である。
【0030】
本開示の別の態様は、インビボ細胞である。インビボ細胞は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変または遺伝子の３’－ＵＴＲのホモ接合性改変を含む。これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。
【0031】
実施形態において、インビボ細胞は、体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である。
【0032】
本開示の別の態様は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変を含む魚である。
【0033】
本開示のさらに別の態様は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にホモ接合性改変を含む魚である。
【0034】
これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。遺伝子は、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、またはｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａであってもよい。
【0035】
場合によっては、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低下または無効にする。実施形態において、改変は、３’－ＵＴＲにおける欠失、例えば、３’－ＵＴＲの早期切断を含む。実施形態において、欠失は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる。実施形態において、改変は、３’－ＵＴＲへの核酸配列、例えば、外因性遺伝子のコード配列を含む核酸配列の挿入を含む。外因性遺伝子はレポーターをコードしてもよい。実施形態において、挿入は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる。
【0036】
魚は、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ）；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）であってもよい。
【0037】
実施形態において、魚は雌である。
【0038】
場合によっては、魚は、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む。改良された形質は遺伝子操作の結果であってもよく、および／または改良された形質は品種改良の結果であってもよい。改良された形質は、魚に導入または繁殖されており、市販の魚の価値を高める任意の形質であってもよい。
【0039】
改良された形質は、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数であってもよい。
【0040】
本開示の最後の態様は、生殖質移動および／または配偶子発達に関与する遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）における遺伝子編集された改変から生じる魚の不稔性をレスキューする方法である。方法は、魚からの卵子に、遺伝子編集された改変を含む遺伝子に対応するｍＲＮＡの野生型コピーを注入することを含む。
【0041】
実施形態において、卵の子孫は稔性であるが、該子孫は不稔子孫を生産する。
【0042】
本明細書に記載の任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【0043】
以下の図を参照して、本発明の不稔魚の種々の例示的な態様および実施形態、ならびにそれに関連する方法が、詳細に説明される。
【0044】
【図1】図１Ａから図１Ｄは、魚の接合子における生殖質移動を示す図である。生殖質は、接合子／初期胚に存在する細胞質成分（特定のタンパク質やｍＲＮＡを含む）を指し、最終的に成魚の配偶子を形成する始原生殖細胞の決定を促進する。
【図7A】図７Ａから図７Ｃは、それぞれ、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏにおけるｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、およびｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１遺伝子の構造を示す。図７Ａにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号１および配列番号２によってカバーされる配列を有するｄｎｄ１／ｄｎｄ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、配列番号３によってカバーされ、ｓＧ４配列は、配列番号４によってカバーされる。ｓＧ１およびｓＧ４配列は例示的なｇＲＮＡの標的部位である。図７Ｂにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号５および配列番号６によってカバーされる配列を有するｄｄｘ４／ｖａｓａ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号７によってカバーされる。図７Ｃにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号８および配列番号９によってカバーされる配列を有するｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号１０によってカバーされる。
【図7B】図７Ａから図７Ｃは、それぞれ、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏにおけるｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、およびｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１遺伝子の構造を示す。図７Ａにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号１および配列番号２によってカバーされる配列を有するｄｎｄ１／ｄｎｄ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、配列番号３によってカバーされ、ｓＧ４配列は、配列番号４によってカバーされる。ｓＧ１およびｓＧ４配列は例示的なｇＲＮＡの標的部位である。図７Ｂにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号５および配列番号６によってカバーされる配列を有するｄｄｘ４／ｖａｓａ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号７によってカバーされる。図７Ｃにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号８および配列番号９によってカバーされる配列を有するｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号１０によってカバーされる。
【図7C】図７Ａから図７Ｃは、それぞれ、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏにおけるｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、およびｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１遺伝子の構造を示す。図７Ａにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号１および配列番号２によってカバーされる配列を有するｄｎｄ１／ｄｎｄ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、配列番号３によってカバーされ、ｓＧ４配列は、配列番号４によってカバーされる。ｓＧ１およびｓＧ４配列は例示的なｇＲＮＡの標的部位である。図７Ｂにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号５および配列番号６によってカバーされる配列を有するｄｄｘ４／ｖａｓａ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号７によってカバーされる。図７Ｃにおいて、上部および下部のＤＮＡ鎖は、配列番号８および配列番号９によってカバーされる配列を有するｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１ ３’－ＵＴＲの一部を示し、ｓＧ１配列は、例示的なｇＲＮＡの標的部位である配列番号１０によってカバーされる。
【発明を実施するための形態】
【0045】
参照による組み込み
本明細書の全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。本明細書の語と組み込まれた参照の語との間に矛盾がある場合、本明細書の語が優先する。
本明細書の全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。本明細書の語と組み込まれた参照の語との間に矛盾がある場合、本明細書の語が優先する。
【0046】
発明の詳細な説明
本開示は、部分的に、不稔魚を生産するための発見方法に基づく。
本開示は、部分的に、不稔魚を生産するための発見方法に基づく。
【0047】
導入
これまでに、５０種近くの魚が遺伝子操作されており；これらは、マス、ナマズ、ティラピア、ストライプドバス、ヒラメ、および多くの種類のサケを含む。これらの魚は、少なくとも、より速い成長、耐病性、より大きな筋肉、および温度耐性などの産業養殖により適した改良された形質のために遺伝子操作されている。トランスジェニック魚はまた、バイオインジケーターおよびバイオリアクターとして機能するように特別に作られている。ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）などの絶滅危惧種および乱獲された他の魚種から、トランスジェニック法を用いて配偶子を生産することが期待される。Ｔｏｎｅｌｌｉら、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｆｉｓｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３５巻、６号、２０１７年１１月１日、８３２－８４４ページを参照ください。
これまでに、５０種近くの魚が遺伝子操作されており；これらは、マス、ナマズ、ティラピア、ストライプドバス、ヒラメ、および多くの種類のサケを含む。これらの魚は、少なくとも、より速い成長、耐病性、より大きな筋肉、および温度耐性などの産業養殖により適した改良された形質のために遺伝子操作されている。トランスジェニック魚はまた、バイオインジケーターおよびバイオリアクターとして機能するように特別に作られている。ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）などの絶滅危惧種および乱獲された他の魚種から、トランスジェニック法を用いて配偶子を生産することが期待される。Ｔｏｎｅｌｌｉら、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｆｉｓｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３５巻、６号、２０１７年１１月１日、８３２－８４４ページを参照ください。
【0048】
２０１５年、ＦＤＡは、遺伝子操作されたサケ（ＡｑｕＡｄｖａｎｔａｇｅサーモン）を人間の消費に適したものとして承認した。このことは、ＡｑｕＡｄｖａｎｔａｇｅサーモンを、アメリカのスーパーマーケットおよびディナーテーブルのための最初に遺伝子組み換えされた動物にした。ＡｑｕＡｄｖａｎｔａｇｅサーモンは、遺伝子組み換えされたアトランティックサーモンであり、非加工の養殖サーモンよりもわずか半分の時間で市場サイズに成長する。この魚は、他のトランスジェニック魚と同様に、持続可能な養殖魚製品を市場に大量に供給することができる。
【0049】
しかしながら、（特に性的成熟までの時間が短縮された）改良された形質を含む遺伝子操作された魚が養殖場から逃げた場合、野生の魚と繁殖して打ち負かし得るという懸念がある。最近の研究で、研究者たちは、遺伝子操作された雄のアトランティックサーモンが逃げた場合、繁殖して遺伝子を野生に渡すことに成功し得ると結論付けた。さらに、かかる逃げた遺伝子操作された魚は、生物多様性の減少に深刻な脅威をもたらす。野生の個体群と繁殖する遺伝子操作された魚は、数十世代で野生の個体群の絶滅をもたらし得ると推定されている。この懸念は部分的に、米国のワシントン州およびメイン州に、トランスジェニック魚の生産の恒久的な禁止をもたらしている。
【0050】
しかしながら、改良された形質を有する魚が養殖場から逃げ、野生の魚を打ち負かすというこれらの懸念は、遺伝子操作された魚に限定されない。代わりに、この懸念は、従来の品種改良によって改良された形質を有する魚にも関連する。養殖場で選択された魚の改良された形質（例えば、より多くのタンパク質含有量、迅速な発達、および耐熱性）もまた、野生に逃げたときに養殖魚に利点を与えてもよい。
【0051】
さらに、ある地域に在来でない魚は、自然の捕食者を欠いていてもよく、在来種を新たに捕食してもよく、および／またはその地域に特に適していてもよい。かかる非在来魚は、養殖場から逃げると、競争上の利点を有する可能性がある。後に侵入種になり、在来の魚の個体群を減少させた非在来魚を水路に意図的に、そして善意で蓄えた数多くの例がある。
【0052】
本開示は、不稔魚、およびそれを生産するための方法を提供する。これらの不稔魚は、養殖場から逃げた場合、野生の個体群と繁殖することができず、在来の生物多様性を減らすことに深刻な脅威をもたらすことはできない。
【0053】
不稔魚を生産するための方法
一態様において、本開示は、不稔魚を生産するための方法を提供する。方法は、精子で卵子を受精させる工程を含み、卵子は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）における遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚から得られる。
一態様において、本開示は、不稔魚を生産するための方法を提供する。方法は、精子で卵子を受精させる工程を含み、卵子は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）における遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚から得られる。
【0054】
３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直後に続く遺伝子またはコード化されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセクションである。３’－ＵＴＲは、しばしば転写後に遺伝子発現に影響を与える調節領域を含有する。３’－ＵＴＲは、ｍＲＮＡの局在、安定性、搬出、および翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現において重要な役割を果たしてもよい。一部の３’－ＵＴＲは、マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、ポリ（Ａ）テールなど、遺伝子発現に関与する配列を含む。
【0055】
全ての有性生殖生物は、配偶子（精子および卵子）の融合から生じる。全ての配偶子は、始原生殖細胞から発生する。多くの動物種において、始原生殖細胞の決定は、初期胚の特定の細胞における特定のタンパク質およびｍＲＮＡの細胞質内局在によってもたらされる。これらの細胞質成分は、生殖質と呼ばれる。
【0056】
図１Ａから図１Ｄは、魚の接合子／胚における生殖質移動および典型的な始原生殖細胞（ＰＧＣ）発達の過程を実証する。図１Ａは、卵（未受精または受精）または生殖質が上部で合体する一細胞接合子の側面図である。図１Ｂは、母系的に沈着した生殖質ｍＲＮＡが卵黄の周りの細胞質とともに均一に沈着され、細胞質と合体して単一の細胞を形成する接合子の上面図を示す。場合によっては、母系的遺伝子は母親によってｍＲＮＡに転写され、母親によって卵子に沈着される。図１Ｃは、ｍＲＮＡが分裂溝に局在化し始める約４細胞段階での生殖質の移動を実証する。分裂溝に移動しなかった生殖質は、その後まもなく分解し始める。その後の細胞分裂の間、４つのタイトな生殖質構造は分裂している細胞間で非対称に分離し、したがって生殖質を含有する細胞の数を一定に維持する。胚の球体(sphere)段階で、生殖質は細胞質に広がるようであり、細胞分裂後、両方の細胞に受け継がれ、ＰＧＣの数の増加をもたらす。ゼブラフィッシュの卵割面の向きが胚の将来の背側面に対してランダムであることを考えると、４つのＰＧＣクラスターも胚の背側面に対してランダムな位置に見出される。図１Ｄは、千細胞胞胚における生殖質の移動を実証する。この段階で、既存の生殖質はほぼ全て胞胚の４つの極に移動しているが、他の場所のｍＲＮＡはほぼ全て分解されている。
【0057】
生殖質移動およびＰＧＣ発達は、卵子／接合子への（特定のｍＲＮＡの）機能的な母系的寄与に依存しているため、これらのｍＲＮＡの３’－ＵＴＲの改変は、ＰＧＣの不適切な移動をもたらし、最終的には減少および／または卵子／接合子から発達した成魚の配偶子の不完全な欠如をもたらす。
【0058】
図２は、魚の胚および幼生におけるＰＧＣのさらなる発達を実証する。示されるように、ＧＦＰをコードし、ＰＣＧの移動に重要な遺伝子のインタクトで機能的な３’－ＵＴＲを含む合成レポーターｍＲＮＡ。受精の２４時間後（ＨＡＦ）、ＧＦＰシグナルは個別の点状に局在し、後の幼生において（４８ＨＡＦおよび７２ＨＡＦで）、ＧＦＰシグナルは性腺隆起に移動している。したがって、ＰＣＧの移動に重要であると特定された遺伝子の３’－ＵＴＲは、適切なＰＣＧの移動を提供するために、インタクトである（つまり、改変されていない）べきである。
【0059】
本開示の方法において、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全をもたらしてもよい。当技術分野で知られているように、母系的に発現されたｍＲＮＡは、母魚によってその卵子に沈着され、少なくとも、おそらく受精卵の転写機構が完全に活性化される前に、ｍＲＮＡの迅速なタンパク質翻訳を可能にする。
【0060】
本明細書に開示される方法において、機能不全を含む母系的に発現されたｍＲＮＡは、ホモ接合性改変を含む雌魚によって卵子に沈着されてもよい。実施形態において、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全は、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生におけるＰＧＣの発達および／または移動を防止または低減する。
【0061】
不稔魚は、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の配偶子を生産してもよい。実施形態において、不稔魚は配偶子を生産することができない。不稔魚は、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の機能的な配偶子を生産してもよい。実施形態において、不稔魚は、機能的な配偶子を生産することができない。
【0062】
受精はインビトロであってもよく、または受精はインビボであってもよく、そして雄魚とホモ接合性改変を含む雌魚とを交配させることを含む。後者の場合、交配は、卵子の体内受精または卵子の体外受精を含んでもよい。
【0063】
場合によっては、方法は、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生を、不稔魚の稚魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、方法は、稚魚を、不稔魚の幼魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含み、および／または方法は、幼魚を、不稔魚を完全に成長した、成熟した、および／または成魚に発達させるのに適した条件下で維持することをさらに含む。受精卵から成魚になるまで魚を育てる任意の既知の方法および手順は、本方法で使用されてもよい。
【0064】
【0065】
不稔魚を含む任意の世代の魚は、遺伝子の３’－ＵＴＲに１つまたは複数の改変の存在を確認するために遺伝子型を決定されてもよい。細胞、組織、および魚の遺伝子型決定のための標準的な実験方法が使用されてもよい。あるいは、改変は、遺伝子の３’－ＵＴＲにおける改変の存在を示す発現されたレポーター／マーカーによって特定されてもよい。以下に説明するように、改変は、天然の３’－ＵＴＲを、例えばレポーターをコードする、外因性遺伝子で置き換えることによって作ってもよい。一例において、レポーターは、レポーターを運ぶ細胞／魚によって発現される蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）である。この場合、ＧＦＰを使用して、遺伝子の３’－ＵＴＲにおける改変の存在を確認してもよい。
【0066】
実施形態において、不稔魚は雄である。実施形態において、（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む）雌魚からの受精卵のかなりの部分は、不稔雄魚に発達する。実施形態において、受精卵の５０％超が不稔雄魚に発達する。実施形態において、受精卵の６０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超が不稔雄魚に発達する。実施形態において、（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む）雌魚からの実質的に全ての受精卵は、不稔雄魚に発達する。
【0067】
受精に使用される精子は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含んでもよく、または精子は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を欠いてもよい、つまり遺伝子編集された３’－ＵＴＲを有さなくてもよい。
【0068】
実施形態において、（３’－ＵＴＲで遺伝子編集されていない場合）遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。
【0069】
始原生殖細胞（ＰＧＣ）の発達、成熟、および／または移動に関連する多数の遺伝子が、特定されている。これらの遺伝子の非限定的な例は、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａを含む。
【0070】
例として、ｄｎｄ１／ｄｎｄ遺伝子は、ｍＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的化配列に結合するタンパク質をコードし、それによってマイクロＲＮＡを介した抑制を阻害する。この遺伝子の発現低下は、舌扁平上皮癌に関係している。それは、ｍｉＲＮＡを介した遺伝子抑制を阻害することにより、遺伝子発現を正に調節するＲＮＡ結合因子である。それは、生殖細胞におけるｍｉＲＮＡの抑制を（類似性により）緩和し、そして標的ｍＲＮＡのアクセス可能性をブロックすることにより、いくつかのｍｉＲＮＡの機能を阻害する。それは、ＰＧＣの生存中に役割を果たすと考えられるが、ＰＧＣ移動には必須ではなくてもよい。
【0071】
ｄｄｘ４／ｖａｓａ遺伝子は、タンパク質のＤＥＡＤボックスファミリーのメンバーであるＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼを有するＲＮＡ結合タンパク質をコードする。ｖａｓａ遺伝子は生殖細胞の発達に必須である。Ｖａｓａタンパク質は、主に動物界全体の胚および成体の生殖細胞に見出され、そこでは生殖細胞の決定および機能に関与しているほか、多能性幹細胞にも見出され、そこでは正確な機能は不明である。
【0072】
ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１遺伝子によって発現されるタンパク質は、精原細胞の細胞周期を調節し、Ｇ１期の長期通過を誘導する生殖細胞の未分化状態の維持に役割を果たす。それは、おそらく特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって細胞増殖に影響を及ぼす。それは、Ｂａｘ依存性および非依存性両方のアポトーシス経路を抑制することによって生殖細胞系統を維持する。移動性ＰＧＣをアポトーシスから保護することは、初期胚において必須であることが示されている。
【0073】
３’－ＵＴＲが改変される上記の遺伝子についてのヌクレオチド配列は、例えばＮＣＢＩデータベースで、公に入手可能である。部分的には公開情報に基づいて、改変に適した３’－ＵＴＲ内の部位を特定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。公開されている情報を使用して、いくつかの魚種の配列アラインメントにより、３’－ＵＴＲの欠失標的がすでに特定されている。かかる保存された領域は、３’－ＵＴＲの適切な機能のために必要となる可能性がある。さらに、魚の特定の種の遺伝子がまだ利用可能でない場合、当業者は、標準的な相同性分析を使用して、遺伝子が配列決定された種に依存することによって、３’－ＵＴＲ配列を特定し得る。
【0074】
（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける）改変は、未受精卵または受精卵で遺伝子編集されていてもよい。実施形態において、遺伝子編集された卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた。
【0075】
（遺伝子の３’－ＵＴＲにおける）改変は、接合子で遺伝子編集されていてもよい。実施形態において、遺伝子編集された卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた。
【0076】
場合によっては、方法は、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含む細胞の核を得ること、および改変を含む核を除核卵にさらに移すことをさらに含む。核を受け取った除核卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する。
【0077】
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）は、体細胞および卵細胞から生存可能な胚をクローン化するための戦略である。本明細書で使用される場合、「クローン化」なる語は、遺伝的に同一の生物の無性的な生産を意味する。ＳＣＮＴは、本開示の方法に従って、除核卵を得て、体（somatic)（体(body)）細胞からのドナー核を移植して、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する再除核卵を生産することを含む。ＳＣＮＴを実施するための方法は、当技術分野で周知である。
【0078】
特に、場合によっては、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、核を提供する細胞で遺伝子編集さているか、または親細胞で遺伝子編集されてもよい。前者の場合、ドナー核を提供する細胞は、新たに遺伝子編集されてもよい。後者の場合、細胞は、培養で増殖および拡大され、それらの核は採取されてＳＣＮＴで使用されてもよい。あるいは、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含む魚からの細胞を使用して、ドナー核を提供してもよい。ドナー魚は、改変についてホモ接合性であってもよく、または改変についてヘテロ接合性であってもよい。
【0079】
遺伝子編集工程は、マイクロインジェクション、脂質ベースのトランスフェクション、化学ベースのトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム沈殿）、エレクトロポレーション、ウイルス媒介形質導入、またはエキソソーム媒介トランスフェクション、およびそれらの組み合わせの１つまたは複数を使用してもよい。実施形態において、小核注入は、前核マイクロインジェクションである。実施形態において、脂質ベースのトランスフェクションは、ナノ粒子、マイクロ粒子、またはリポソーム、およびそれらの組み合わせを含む。ウイルス媒介形質導入のための例示的なベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、修飾されたＨＩＶ－１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、およびレトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）を含む。
【0080】
当技術分野で知られる種々の技術を使用して、遺伝子編集のためにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを細胞（例えば、卵子）に導入することができる。かかる技術は、前核マイクロインジェクション（ＵＳ４，８７３，１９１）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８－６１５２，１９８５）、胚性幹細胞への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，５６：３１３－３２１，１９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３－１８１４，１９８３）、精子を介した遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０－１４２３５，２００２；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９－２３，２００６）、および体細胞または幹細胞のインビトロ形質転換、それに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０－８１３，１９９７；およびＷａｋａｙａｍａら，Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９－３７４，１９９８）を含むが、これらに限定されない。
【0081】
遺伝子の３’－ＵＴＲにおける改変を生産した最初の遺伝子編集は、（遺伝子の３’－ＵＴＲに遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む）雌魚の１、２、またはそれ以上前の世代で生じていてもよい。場合によっては、前駆体は、雌魚に、少なくとも１世代、少なくとも２世代、少なくとも３世代、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、または少なくとも１００世代、およびそれらの間の任意の数の世代先行する。言い換えれば、遺伝子編集が前駆体で生じ、改変が安定して受け継がれると、さらなる遺伝子編集を、すなわち、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の発達、成熟および／または移動に関連する遺伝子の３’－ＵＴＲへ、実施する必要がなくてもよい。
【0082】
遺伝子編集された魚を作るための方法は、図３に示されるスキームに従ってもよい。ここでは、野生型の雄および雌魚からの受精魚卵に遺伝子編集カクテルを注入して、所望の遺伝的変化を生産する。これらの注入された魚は、任意の遺伝子編集の変化の継承においてモザイクになり、注入された魚の異系交配は、遺伝子編集カクテルおよび輸送の効率に応じて、０から９８％以上の遺伝子編集をもたらす。実施形態において、卵子を受精させる雄および雌魚は野生型ではなくてもよい。代わりに、改良された形質を含む魚系統を使用して、ＰＧＣ移動および発達に関連する遺伝子の３’－ＵＴＲを遺伝子編集してもよい。利用可能であり、改良された形質を含む任意の魚系統を、本開示の方法に従って遺伝子編集して、改良された形質を含む不稔魚を生産してもよい。
【0083】
ＰＧＣの適切な移動は、卵子に沈着された母親のｍＲＮＡに依存するため、＋／－母親（「＋」は遺伝子の野生型３’－ＵＴＲであり、「－」は遺伝子の３’－ＵＴＲに改変を有する）は、稔性－／－雌および稔性－／－雄である子孫を有してもよい。これらの稔性－／－雌は、ＰＧＣ移動および発達において機能するいくつかの母系的ｍＲＮＡを沈着させた＋／－母親から生まれ、－／－雌のＰＧＣを配偶子に形成することができる。しかしながら、（機能的な母系的ｍＲＮＡを沈着させることができない）これらの稔性－／－雌は、いくつかの魚種で表現型的に雄になる不稔子孫を生み出すことができるのみである。かかる子孫はＰＧＣの発達に欠陥を有し、したがって、標的化された修飾の標準的なメンデルの法則を有する不稔雄子孫を生産する。実際、－／－雌が＋／－雄または－／－雄のいずれかと交配されると、結果として生じる子孫は不稔雄になる。
【0084】
－／－で稔性の雄はまた、＋／－母親によって生産されてもよい。これらの－／－稔性雄と－／－稔性雌との交配は、雌のホモ接合性改変のために、常に不稔雄を生み出す。
【0085】
【0086】
遺伝子編集ツール
遺伝子編集ツールは、遺伝子編集などのＤＮＡ配列の標的化された修飾を可能にすることで、多くの生物のバイオテクノロジー、遺伝子治療および機能ゲノム研究の分野に影響を与えている。
遺伝子編集ツールは、遺伝子編集などのＤＮＡ配列の標的化された修飾を可能にすることで、多くの生物のバイオテクノロジー、遺伝子治療および機能ゲノム研究の分野に影響を与えている。
【0087】
本開示の実施形態において、遺伝子編集は、ヌクレアーゼの使用を含む。ヌクレアーゼなる語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼなる語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型または変異体酵素を指す。遺伝子編集を実施することができる当技術分野で知られている任意のヌクレアーゼを、本開示の方法で使用してもよい。
【0088】
場合によっては、遺伝子編集は、部位特異的遺伝子編集システムを含む。遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含んでもよい。
【0089】
最近では、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）は、相補的なＲＮＡ分子によって標的部位に向けられる。ＲＧＥＮは、標的化されたヌクレアーゼシステムの例であり：これらのシステムは、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、該部位はヌクレアーゼによって切断される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＥＧＥＮである。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）は、塩基配列の短い反復を含有する原核生物のＤＮＡのセグメントで構成される。各反復の後に、バクテリアウイルスまたはプラスミドへの以前の曝露からの「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが続く。「Ｃａｓ９」（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、ＣＲＩＳＰＲに関連するＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。Ｃａｓ９タンパク質および適切なガイドＲＮＡを細胞に送達することにより、生物のゲノムを任意の所望の場所で切断することができる。他のＣａｓタンパク質は、当技術分野で知られている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のＲＧＥＮツールである。
【0090】
ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。
【0091】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、遺伝子編集のための別の技術であり、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ＴＡＬＥＮに結合するためのＤＮＡ標的部位が決定され、ヌクレアーゼおよび、標的部位を認識する一連の反復可変方向残基（ＲＶＤ）を含む融合分子が作られる。結合すると、ヌクレアーゼはＤＮＡを切断して、細胞修復機構が機能して切断端で遺伝子修飾を行うことができる。ＴＡＬＥＮなる語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体が機能的である単量体ＴＡＬＥＮと、別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を必要とする他のものを含む。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核生物のＤＮＡ修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復によって、不死化したヒト細胞で遺伝子修飾を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、例えば相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型として機能する、別のポリヌクレオチドを使用してまたは使用せずに、遺伝子編集してもよい。
【0092】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、遺伝子編集に役立つ別のテクノロジーであり、ユーザーが特定された場所でＤＮＡに二本鎖切断を作ることにより、ゲノムの標的化された編集を容易にする、操作されたＤＮＡ結合タンパク質のクラスである。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように設計でき、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の固有の配列を標的化できる。内因性のＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを改変することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化する方法で使用されてもよい。遺伝子編集された細胞および生物を作製するためにジンクフィンガーおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料および方法は、例えばＵ．Ｓ．８，１０６，２５５；Ｕ．Ｓ．２０１２／０１９２２９８；Ｕ．Ｓ．２０１１／００２３１５９；およびＵ．Ｓ．２０１１／０２８１３０６に開示され、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【0093】
メガヌクレアーゼは、本開示の方法における遺伝子編集に有用な別の技術である。このシステムは、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼを使用し；その結果、この部位は通常、任意の特定のゲノムで１回のみ生じる。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼによって認識される１８塩基対の配列は、平均して、ヒトゲノムの２０倍のサイズのゲノムが偶然一度に見出される必要がある（ただし、単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノムごとに約３回生じる）。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられる。
【0094】
本方法は、現在または将来知られる任意の遺伝子編集システムを使用するように適合されてもよい。
【0095】
実施形態において、遺伝子編集システムは、３’－ＵＴＲの欠失、例えば、３’－ＵＴＲの早期切断をもたらす欠失を含む改変を作る。実施形態において、欠失は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を防止し、および／またはその結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を減少または無効にする。遺伝子編集システムは、３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む改変を作ってもよい。
【0096】
遺伝子編集は、ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【0097】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に相同な１つまたは複数の領域を含み、および／またはポリヌクレオチドは、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に非相同な１つまたは複数の領域を含んでもよい。実施形態において、ポリヌクレオチドは、相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を含むか、またはポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態において、遺伝子編集は、ポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。
【0098】
ＨＤＲは、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）病変を修復する細胞内のメカニズムである。この修復メカニズムは、病変部位に有意な相同性を有する配列を有するＨＤＲ鋳型が存在する場合に細胞により使用されることができる。特異的結合は、その語が生物学の分野で一般的に使用されているように、非標的組織と比較して比較的高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの複数の非共有相互作用を伴う。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的な配列を有する核酸間の特異的結合の一形態である。タンパク質は、例えばＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、またはＧａｌ４モチーフによって、ＤＮＡに特異的に結合することもできる。対立遺伝子の遺伝子移入は、鋳型に基づくプロセスを使用して、内因性対立遺伝子上に外因性対立遺伝子をコピーするプロセスを指す。状況によっては、内因性対立遺伝子が実際に切除され、外因性核酸対立遺伝子に置き換わる場合がある。
【0099】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列であってもよい非相同領域を含む。始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列は、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低下または無効にしてもよく、および／または１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含んでもよい。
【0100】
場合によっては、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列は、外因性遺伝子のコード配列を含む。
【0101】
外因性遺伝子は、遺伝子編集システムを介して、内因性３’－ＵＴＲに置き換わってもよい。ここで、相同領域は、ポリヌクレオチドが３’－ＵＴＲを標的化し、内因性３’－ＵＴＲの一部を置き換えるためにポリヌクレオチド内の非相同配列を配置するのを助けてもよい。
【0102】
実施形態において、外因性遺伝子は、レポーター、例えば蛍光タンパク質をコードする。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体または変異体であってもよい。ＧＦＰの誘導体および変異体は、当技術分野で周知である。
【0103】
外因性遺伝子のコード配列は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含んでもよい。実施形態において、配列は、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム侵入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性要素、またはイントロンを含む。かかる調節領域は、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を与えることによって発現を増加させてもよいが、必要ではなくてもよい。
【0104】
本開示の方法において有用なポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であってもよい。ｓｓＤＮＡ鋳型は、長さが約２０～約５０００ヌクレオチドであってもよいが、他の長さも使用できる。
【0105】
ＨＤＲ鋳型として機能する場合、ポリヌクレオチドは、結合タンパク質への３’－ＵＴＲの結合部位を無効にするヌクレオチドのランダムなコレクションを含んでもよい。または、それは、一般に３’－ＵＴＲに類似しているが、その結合タンパク質による認識／結合に必要な１つまたは複数のヌクレオチドを欠く配列を含んでもよい。ＨＤＲ機能性ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲの一部（大部分まで）を置換するように設計され、それにより短縮型３’－ＵＴＲを作ってもよい。
【0106】
ポリヌクレオチドは、標的化されたヌクレアーゼシステムに結合し、したがってシステムのＤＮＡ結合メンバーの同族結合部位である配列を含んでもよい。同族なる語は、通常相互作用する２つの生体分子、例えば受容体およびそのリガンドを指す。遺伝子編集の文脈において、生体分子の１つは、意図された、すなわち同族の、ＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合するための配列で設計されてもよい。
【0107】
場合によっては、遺伝子編集は、未受精卵、受精卵、または類似種の野生型魚と比較して改良された形質を含むゲノムを有する接合子で生じる。改良された形質は、遺伝子操作の結果および／または品種改良の結果であってもよい。
【0108】
改良された形質を遺伝子操作するための方法は、図３に示されるスキームに従ってもよい。実施形態において、野生型の雄および雌魚からの受精した魚卵に遺伝子操作カクテルを注入して、所望の遺伝的変化を生み出す。これらの注入された魚は、遺伝子操作のカクテルおよびデリバリーの効率に応じて、注入された魚の異系交配が０から９８％以上への遺伝子修飾をもたらすように、遺伝的変化の継承においてモザイクである。本開示の方法において、これらの工程は必要なくてもよい。代わりに、改良された形質を含む魚系統を、ＰＧＣの移動および発達に関連する遺伝子の３’－ＵＴＲの遺伝子編集のために使用してもよい。利用可能であり、改良された形質を含む任意の魚系統を、本開示の方法に従って遺伝子編集して、改良された形質を含む不稔魚を生産してもよい。
【0109】
改良された形質は、魚に導入または繁殖されており、市販の魚の価値を高める任意の形質であってもよい。例は、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数を含む。したがって、本開示の方法は、改良された形質をさらに含む不稔魚を生産し；これらの改良された形質は、魚が逃げ、それが稔性であった場合に、魚が野生の魚の個体群を打ち負かすことを可能にする。幸いなことに、本開示の方法は、改良された遺伝子を野生の魚の個体群に伝達することができず、おそらく野生の多様性を減少させることはできない不稔魚を生産する。
【0110】
遺伝子編集された魚および細胞
本明細書で使用されているように、魚は硬骨魚上綱のものである。魚は、条鰭綱の条鰭類であってもよい。場合によっては、魚は硬骨魚下綱の硬骨魚である。実施形態において、本開示の魚は、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、Ｂｌｕｅｆｉｎ Ｔｕｎａ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）である。
本明細書で使用されているように、魚は硬骨魚上綱のものである。魚は、条鰭綱の条鰭類であってもよい。場合によっては、魚は硬骨魚下綱の硬骨魚である。実施形態において、本開示の魚は、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、Ｂｌｕｅｆｉｎ Ｔｕｎａ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）である。
【0111】
遺伝子編集に適した任意の魚種を、本開示の方法で使用してもよい。当業者は、本明細書に記載の技術を他の種類の硬骨魚に容易に適合させることができる。
【0112】
本開示の別の態様は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変を含む魚である。
【0113】
本開示のさらに別の態様は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にホモ接合性改変を含む魚である。
【0114】
これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。遺伝子は、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、またはｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａであってもよい。
【0115】
場合によっては、遺伝子の３’－ＵＴＲの改変は、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低下または無効にする。実施形態において改変更は、３’－ＵＴＲの欠失、例えば、３’－ＵＴＲの早期切断を含む。実施形態において、欠失は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる。実施形態において、改変は、３’－ＵＴＲへの核酸配列、例えば、外因性遺伝子のコード配列を含む核酸配列の挿入を含む。外因性遺伝子はレポーターをコードしてもよい。実施形態において、挿入は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる。
【0116】
魚は、雌のティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）であってもよい。
【0117】
場合によっては、魚は、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む。改良された形質は、遺伝子操作の結果であってもよく、および／または改良された形質は品種改良の結果であってもよい。改良された形質は、魚に導入または繁殖されており、市販の魚の価値を高める任意の形質であってもよい。改良された形質は、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数であってもよい。
【0118】
一態様において、本開示は、本明細書に開示される任意の方法によって得られた不稔魚を提供する。
【0119】
別の態様において、本開示は、本明細書で開示される任意の方法によって得られた不稔魚から得られた組織を含む食品を提供する。
【0120】
本開示の一態様は、インビトロ細胞である。インビトロ細胞は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変または遺伝子の３’－ＵＴＲのホモ接合性改変を含む。これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。
【0121】
実施形態において、インビトロ細胞は、体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である。
【0122】
本開示の別の態様は、インビボ細胞である。インビボ細胞は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変または遺伝子の３’－ＵＴＲのホモ接合性改変を含む。これらの態様において、遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する。
【0123】
実施形態において、インビボ細胞は、体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である。
【0124】
胚性不稔レスキュー
本開示の一態様は、生殖質の移動および／または配偶子の発達に関与する遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の遺伝子編集された改変から生じる魚の不稔性をレスキューする方法である。方法は、魚からの卵に、遺伝子編集された改変を含む遺伝子に対応するｍＲＮＡの野生型コピーを注入することを含む。
本開示の一態様は、生殖質の移動および／または配偶子の発達に関与する遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の遺伝子編集された改変から生じる魚の不稔性をレスキューする方法である。方法は、魚からの卵に、遺伝子編集された改変を含む遺伝子に対応するｍＲＮＡの野生型コピーを注入することを含む。
【0125】
実施形態において、卵の子孫は稔性であるが、子孫は不稔子孫を生産する。
【0126】
この態様は、胚性不稔レスキューと呼ばれる。これは、（３’－ＵＴＲでの）改変についてホモ接合性であり、成熟すると不稔になる胚をレスキューすることを含む。ここでは、胚は遺伝子編集された野生型ｍＲＮＡ（３’－ＵＴＲ改変を有する）で処理される。この処理は、始原生殖細胞の成功した特定および移動を可能にする。これは、機能的な性腺の発達および稔性魚をもたらす。図６を参照ください。
【0127】
定義
本明細書で使用される語は、特定の場合を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される語は、特定の場合を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。
【0128】
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」なる語は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単一の形態だけでなく複数の形態も含むことを意図される。
【0129】
本開示および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」なる語またはそれらの変形は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語と同様の方法で包括的であることを意図される。
【0130】
「約」または「およそ」なる語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、記載された値より１０％多いまたは少ないことを意味する。別の例において、「約」は、特定の値の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味することができる。特定の値が出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」なる語は、特定の値の許容可能な誤差範囲を意味すると想定されるべきである。
【0131】
本明細書に記載の任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
【0132】
実施例
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的で与えられ、いかなる方法で本発明を限定することを意味するものでもない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在好ましい実施形態を代表するものであり、例示的であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含されるその中の変化および他の使用は、当業者に生じる。
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的で与えられ、いかなる方法で本発明を限定することを意味するものでもない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在好ましい実施形態を代表するものであり、例示的であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含されるその中の変化および他の使用は、当業者に生じる。
【実施例1】
【0133】
実施例１：魚の遺伝子操作
図３は、遺伝子操作された（遺伝子編集された）魚を作る一実施形態を実証する。図３の画像は、魚をティラピアとして例示しているが、硬骨魚などの任意の魚を、以下に説明する方法で使用してもよい。遺伝子編集の場合、特定のヌクレアーゼで構成される遺伝子編集カクテルを使用して、受精した魚卵の特定の遺伝子標的を標的化する。魚卵は、野生型であるか、または改良された形質（例えば、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性）を含んでもよい。ヌクレアーゼの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；クラスター化されたランダム間隔のパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼなどを含む。カクテルを、当技術分野で知られている任意の方法で胚に導入することができる。例えば、カクテルを、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどによって導入してもよい。カクテルによって修飾された魚は、遺伝子編集の継承のためにモザイクになる。遺伝子修飾から生じるキメラ魚は、細胞におけるほぼ完全な修飾から限られた数の修飾された細胞までの範囲の細胞のスペクトルにおける修飾に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であってもよいことが理解されるべきである。注入された母親の卵母細胞は、野生型または修飾されたのいずれか、修飾について標的化されている遺伝子の単一コピーを継承する。その継承の効率は、遺伝子編集の全体的な効率を反映する。もちろん、当業者は、修飾された子孫が雄および雌の両方に発達することを理解するであろう。したがって、ヘテロ接合（＋／－）である３’－ＵＴＲの遺伝子編集から生じる魚の個体群があり、それらは世代Ｇ０である（図４）。これらのＧ０魚の交配は、修飾（＋／＋、＋／－および－／－）についてメンデルの法則パターンを有する第１世代の子孫（Ｇ１）をもたらし、＋／＋は野生型表現型を有し、＋／－は野生型表現型を有するがヘテロ接合体であり、－／－表現型を有するコホート。ここで、「＋」は遺伝子の野生型３’－ＵＴＲであり、「－」は遺伝子の３’－ＵＴＲに改変を有する。
図３は、遺伝子操作された（遺伝子編集された）魚を作る一実施形態を実証する。図３の画像は、魚をティラピアとして例示しているが、硬骨魚などの任意の魚を、以下に説明する方法で使用してもよい。遺伝子編集の場合、特定のヌクレアーゼで構成される遺伝子編集カクテルを使用して、受精した魚卵の特定の遺伝子標的を標的化する。魚卵は、野生型であるか、または改良された形質（例えば、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性）を含んでもよい。ヌクレアーゼの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；クラスター化されたランダム間隔のパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼなどを含む。カクテルを、当技術分野で知られている任意の方法で胚に導入することができる。例えば、カクテルを、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどによって導入してもよい。カクテルによって修飾された魚は、遺伝子編集の継承のためにモザイクになる。遺伝子修飾から生じるキメラ魚は、細胞におけるほぼ完全な修飾から限られた数の修飾された細胞までの範囲の細胞のスペクトルにおける修飾に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であってもよいことが理解されるべきである。注入された母親の卵母細胞は、野生型または修飾されたのいずれか、修飾について標的化されている遺伝子の単一コピーを継承する。その継承の効率は、遺伝子編集の全体的な効率を反映する。もちろん、当業者は、修飾された子孫が雄および雌の両方に発達することを理解するであろう。したがって、ヘテロ接合（＋／－）である３’－ＵＴＲの遺伝子編集から生じる魚の個体群があり、それらは世代Ｇ０である（図４）。これらのＧ０魚の交配は、修飾（＋／＋、＋／－および－／－）についてメンデルの法則パターンを有する第１世代の子孫（Ｇ１）をもたらし、＋／＋は野生型表現型を有し、＋／－は野生型表現型を有するがヘテロ接合体であり、－／－表現型を有するコホート。ここで、「＋」は遺伝子の野生型３’－ＵＴＲであり、「－」は遺伝子の３’－ＵＴＲに改変を有する。
【0134】
当業者は、不稔として発達する一部の魚がモノセックスであることを理解する。モノセックスは、商業的な養殖で求められているアプローチである全て雄または全て雌の個体群のいずれかの養殖を指す。例えば、ティラピアおよびゼブラフィッシュは、配偶子形成が失敗した場合（例えば、不稔）に雄として発達するが、一方でサケは、配偶子の発達が不完全な雄と雌の混合体として発達するようである。
【0135】
ＰＧＣの適切な移動は、卵子に沈着した母親のｍＲＮＡに依存しているため、＋／－母親は、稔性の－／－雌および－／－雄の子孫を有してもよい。これらの稔性－／－雌は、いくつかの魚種で表現型的に雄になる稔性の子孫を生み出すことができるのみである。同様に、－／－で稔性の雄は＋／－母親によって生産されてもよい。これらの－／－稔性雄と－／－稔性雌との交配は、図４および図５に示され、後に説明されるように、常に不稔雄（ティラピアの場合）を生み出す。
【0136】
本明細書に記載されるように、図３に示されるスキームは受精卵に改良された形質を導入するために使用することができることも、理解される。
【実施例2】
【0137】
実施例２：例示的不稔雄繁殖プログラム
図４に示すように、（ＰＧＣの移動および発達に関連する）遺伝子の３’－ＵＴＲの改変についてのヘテロ接合性（＋／－）魚。ヘテロ接合性魚を交配し、結果として生じる子孫Ｇ１は、典型的なメンデルの法則による改変を有する雄および雌の通常の混合体を含有する。ヘテロ接合性のＧ１魚を、成長および繁殖特性について選択し、所望の魚を改良することができ、および／または新しいＧ０親として繁殖核を更新するために使用してもよい（「核更新」）。
図４に示すように、（ＰＧＣの移動および発達に関連する）遺伝子の３’－ＵＴＲの改変についてのヘテロ接合性（＋／－）魚。ヘテロ接合性魚を交配し、結果として生じる子孫Ｇ１は、典型的なメンデルの法則による改変を有する雄および雌の通常の混合体を含有する。ヘテロ接合性のＧ１魚を、成長および繁殖特性について選択し、所望の魚を改良することができ、および／または新しいＧ０親として繁殖核を更新するために使用してもよい（「核更新」）。
【0138】
Ｇ１世代は、３’－ＵＴＲにホモ接合性改変を有する稔性雌を含む。これらの雌は＋／－母親から生まれ、母親はＰＧＣの移動および発達に機能するいくつかの母系的ｍＲＮＡを沈着させ、－／－雌のＰＧＣを配偶子に形成することができる。
【0139】
遺伝子の３’－ＵＴＲにホモ接合性改変を有する雌は任意の雄と交配した場合、結果として生じるＧ２子孫は、任意の（ＰＧＣの移動および発達に関連する）遺伝子の機能的な母系的寄与ｍＲＮＡを欠く。かかる子孫はＰＧＣの発達に欠陥を有し、したがって、標的化された修飾の標準的なメンデルの法則を有する不稔雄子孫を生み出す。
【実施例3】
【0140】
実施例３：例示的雌拡大繁殖プログラム
図５は、遺伝子編集された稔性－／－雌の数を増幅して、不稔雄子孫の数を増やすことを容易にする方法を実証する。これは、ヘテロ接合性稔性Ｇ１雌を、ヘテロ接合性母親から入手しなければならないホモ接合性Ｇ１稔性雄と交配することによって達成される。全てのＧ２子孫は稔性になる：＋／－および－／－両方の雄および雌。通常のメンデルの法則は、半分はホモ接合性変異体である予想される雄／雌の生産率をもたらす。－／－雌が＋／－雄または－／－雄と交配すると、結果として生じる子孫は不稔雄になる。
図５は、遺伝子編集された稔性－／－雌の数を増幅して、不稔雄子孫の数を増やすことを容易にする方法を実証する。これは、ヘテロ接合性稔性Ｇ１雌を、ヘテロ接合性母親から入手しなければならないホモ接合性Ｇ１稔性雄と交配することによって達成される。全てのＧ２子孫は稔性になる：＋／－および－／－両方の雄および雌。通常のメンデルの法則は、半分はホモ接合性変異体である予想される雄／雌の生産率をもたらす。－／－雌が＋／－雄または－／－雄と交配すると、結果として生じる子孫は不稔雄になる。
【0141】
ホモ接合性雌を任意の雄に繁殖させると、雄の遺伝子型に関係なく雄不稔子孫がもたらされるため、改変についてホモ接合性である雌の数を増やすことは、養殖魚の個体群での不稔雄の増加した収量を生産する。
【実施例4】
【0142】
実施例４：胚性不稔レスキューにおける例示的工程
ホモ接合性変異体を増殖させる必要がある場合、不稔魚における始原生殖細胞の産生のための一時的な指示を含むレスキューカクテルの導入により、不稔動物において不稔性をレスキューすることができる（図６）。レスキューカクテルは、改変された遺伝子の野生型３’－ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含み、注入された卵から発達した魚における始原生殖細胞の産生についての一時的な指示を提供する。
ホモ接合性変異体を増殖させる必要がある場合、不稔魚における始原生殖細胞の産生のための一時的な指示を含むレスキューカクテルの導入により、不稔動物において不稔性をレスキューすることができる（図６）。レスキューカクテルは、改変された遺伝子の野生型３’－ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含み、注入された卵から発達した魚における始原生殖細胞の産生についての一時的な指示を提供する。
【0143】
その結果は、ともに単一世代について稔性である両方の性の子孫を提供する、生殖質の適切な移動および正しく性別された性腺の発達である。しかしながら、「レスキューされた」魚は遺伝的に－／－であるため、その後のレスキューされていないいずれの子孫も－／－であり、表現型的には雄で不稔である。したがって、注入された魚は、編集のためにホモ接合性であり、その子孫も突然変異のためにホモ接合性であり不稔である、稔性雄／雌混合子孫の世代を生産する。このように、これらのレスキュー工程は、不稔系統を増殖させ続けるために必要である。
【実施例5】
【0144】
実施例５：遺伝子編集による不稔魚の生産方法
生殖質ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内には、これらのｍＲＮＡおよびそれらの最終的な遺伝子産物の完全性、翻訳能力、および局在化を調節する重要な要素がある。これらの生殖質ｍＲＮＡは、母親によって魚の卵子に沈着され、そこで始原生殖細胞（ＰＧＣ）の発達および移動を指示する。適切な生殖細胞の発達および移動がなければ、機能的な性腺は形成されず、子孫は不稔になる。１つまたは複数の生殖質ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内の重要な要素のホモ接合性破壊を運ぶ母親からの子孫は、適切なＰＧＣの発達または移動の喪失のために不稔であるべきである。
生殖質ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内には、これらのｍＲＮＡおよびそれらの最終的な遺伝子産物の完全性、翻訳能力、および局在化を調節する重要な要素がある。これらの生殖質ｍＲＮＡは、母親によって魚の卵子に沈着され、そこで始原生殖細胞（ＰＧＣ）の発達および移動を指示する。適切な生殖細胞の発達および移動がなければ、機能的な性腺は形成されず、子孫は不稔になる。１つまたは複数の生殖質ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内の重要な要素のホモ接合性破壊を運ぶ母親からの子孫は、適切なＰＧＣの発達または移動の喪失のために不稔であるべきである。
【0145】
ここで、便利な魚のモデルとしてゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を使用した。ＰＧＣの発達または移動に関連する３つの遺伝子の３’－ＵＴＲを特徴づけ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的を選択した。図７Ａから図７ＡＣを参照ください。
【0146】
これらの遺伝子の野生型３’－ＵＴＲを標的とし、置換する（すなわち、改変する）標的化構築物を設計および構築した。例えば、図８を参照ください。標的化構築物は、標的３’－ＵＴＲへの特異的結合を可能にする相同領域および、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列を含む１つまたは複数の非相同領域を含む。図８の標的化構築物において、非相同領域は、外因性遺伝子（すなわち、ＧＦＰ）のコード配列を含んでいた。したがって、ＧＦＰを使用して、改変された３’－ＵＴＲを含む細胞をマークおよび追跡し得る。
【0147】
他の実施形態において、標的化構築物は、外因性遺伝子のコード配列を欠き、そして単に３’－ＵＴＲの機能を破壊した。これらの実施形態において、魚卵を、標的化構築物およびＰＧＣにおいてＧＦＰを発現するマーカー構築物でトランスフェクトした。実施形態において、標的化構築物でトランスフェクトした魚の子孫を、ＰＧＣにおいてＧＦＰを発現するマーカー構築物でトランスフェクトした。マーカー構築物の例は、図２の上部に示される。
【0148】
遺伝子編集システム（ここではＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９；本明細書で説明する任意の他の遺伝子編集システムも機能する）を使用して、標的化された統合により、３つの例示的な標的遺伝子（ｎａｎｏｓ３、ｄｎｄ１、およびｖａｓａ）の内因性野生型３’－ＵＴＲを、３’－ＵＴＲが機能的でないように改変された標的化構築物に置き換えた。
【0149】
３つの例示的な遺伝子（ｎａｎｏｓ３、ｄｎｄ１、およびｖａｓａ）の全てについて、標的統合および３’－ＵＴＲ置換が正確に生じた。
【0150】
生殖細胞系列の初代を特定した。Ｆ１成体（第１世代の非モザイクキャリア）を特定した。ｄｎｄ１およびｖａｓａについて、Ｆ２世代を、Ｆ１キャリアを野生型魚に異系交配して該系統を増殖させることによって得た。さらに、ｄｎｄ１およびｖａｓａの両方について、Ｆ２子孫を、それぞれｄｎｄ１およびｖａｓａ ３’－ＵＴＲの改変のためにホモ接合性胚を生産する兄弟交配によって生産した。
【0151】
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ＧＦＰ ｎａｎｏｓ３’－ＵＴＲマーカー構築物ｍＲＮＡを注入した場合、ｄｎｄ１＋／ｇ１ＳＴＯＰ交雑魚の一部の子孫は、正常に移動しないＰＧＣを有した。しかしながら、一部のＰＧＳはまだ性腺隆起に移動し；これらの適切に移動したＰＧＣは機能的でなく、そして配偶子を生じさせなくてもよい。図９Ｂの一番上の魚を参照ください。図２と比較ください。
【0152】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、ＧＦＰ ｎａｎｏｓ３’－ＵＴＲマーカー構築物ｍＲＮＡを注入した場合、Ｆ１親のヘテロ間交雑からのｄｄｘ４／ｖａｓａ－ｇＲＮＡ１ Ｆ２胚におけるＰＧＣは異所性移動を有した。図１０Ｂの右側のゲル画像は、魚の遺伝子型決定を示す。
【0153】
結果として生じる雄魚の不稔性を、稔性雌と交配することによってテストする。
【0154】
もちろん、この実施例において、３つの遺伝子の３’－ＵＴＲを改変した。本開示の教示および当業者の情報に基づいて、ＰＧＣの移動および発達に関連する他の遺伝子を同様に改変することができる。また、この実施例において、ゼブラフィッシュをモデル魚として使用した。本開示の教示および当業者の情報に基づいて、遺伝子編集に適した任意の硬骨魚を使用してもよいことが理解される。
【0155】
したがって、当業者は、本明細書に記載の技術を別の種類の硬骨魚に適合させ、任意の関連する遺伝子をＰＧＣの移動および／または発達に改変することが容易にできる。
【0156】
以下の段落は、本発明の種々の実施形態を提供する。
【0157】
実施形態１．不稔魚を生産する方法であって、精子で卵子を受精させることを含み、ここで卵子は、遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚から得られる、方法。
実施形態２．遺伝子の３’－ＵＴＲの改変が、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全をもたらす、実施形態１の方法。
実施形態３．機能不全を含む母系的に発現されたｍＲＮＡが、ホモ接合性改変を含む雌魚によって卵に沈着される、実施形態１または実施形態２の方法。
実施形態４．母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全が、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生における始原生殖細胞の発達および／または移動を防止または低減する、実施形態２または実施形態３の方法。
実施形態５．不稔魚が、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の配偶子を生産する、実施形態１～４のいずれか１つの方法。
実施形態６．不稔魚が、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の機能的な配偶子を生産する、実施形態１～５のいずれか１つの方法。
実施形態７．受精がインビトロである、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
実施形態８．受精がインビボであり、雄魚とホモ接合性改変を含む雌魚とを交配させることを含む、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
実施形態９．受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生を、不稔魚の稚魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つの方法。
実施形態１０．稚魚を、不稔魚の幼魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含む、実施形態９の方法。
実施形態２．遺伝子の３’－ＵＴＲの改変が、母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全をもたらす、実施形態１の方法。
実施形態３．機能不全を含む母系的に発現されたｍＲＮＡが、ホモ接合性改変を含む雌魚によって卵に沈着される、実施形態１または実施形態２の方法。
実施形態４．母系的に発現されたｍＲＮＡの機能不全が、受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生における始原生殖細胞の発達および／または移動を防止または低減する、実施形態２または実施形態３の方法。
実施形態５．不稔魚が、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の配偶子を生産する、実施形態１～４のいずれか１つの方法。
実施形態６．不稔魚が、ホモ接合性改変を欠く雌魚から得られた卵子の受精から生じる魚と比較して、減少した数の機能的な配偶子を生産する、実施形態１～５のいずれか１つの方法。
実施形態７．受精がインビトロである、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
実施形態８．受精がインビボであり、雄魚とホモ接合性改変を含む雌魚とを交配させることを含む、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
実施形態９．受精卵、結果として生じる接合子、および／または結果として生じる幼生を、不稔魚の稚魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つの方法。
実施形態１０．稚魚を、不稔魚の幼魚への発達に適した条件下で維持することをさらに含む、実施形態９の方法。
【0158】
実施形態１１．幼魚を、不稔魚を完全に成長した、成熟した、および／または成魚に発達させるのに適した条件下で維持することをさらに含む、実施形態１０の方法。
実施形態１２．不稔魚が雄である、実施形態１～１１のいずれか１つの方法。
実施形態１３．精子が遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含むか、または精子が遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を欠く、実施形態１～１２のいずれか１つの方法。
実施形態１４．遺伝子が始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、実施形態１～１３のいずれか１つの方法。
実施形態１５．遺伝子が、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａからなる群から選択される、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
実施形態１６．改変が、未受精卵または受精卵において遺伝子編集され、卵がホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られる、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。
実施形態１７．改変が、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた卵子の受精から得られる接合子において遺伝子編集された、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。
実施形態１８．改変を含む細胞の核を得ることをさらに含む、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．改変を含む核を除核卵に移すことをさらに含み、核を受け取った除核卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する、実施形態１８の方法。
実施形態２０．改変が、核を提供する細胞において遺伝子編集されたか、または親細胞において遺伝子編集された、実施形態１８または実施形態１９の方法。
実施形態１２．不稔魚が雄である、実施形態１～１１のいずれか１つの方法。
実施形態１３．精子が遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を含むか、または精子が遺伝子の３’－ＵＴＲの改変を欠く、実施形態１～１２のいずれか１つの方法。
実施形態１４．遺伝子が始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、実施形態１～１３のいずれか１つの方法。
実施形態１５．遺伝子が、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａからなる群から選択される、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
実施形態１６．改変が、未受精卵または受精卵において遺伝子編集され、卵がホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られる、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。
実施形態１７．改変が、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体から得られた卵子の受精から得られる接合子において遺伝子編集された、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。
実施形態１８．改変を含む細胞の核を得ることをさらに含む、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．改変を含む核を除核卵に移すことをさらに含み、核を受け取った除核卵は、ホモ接合性改変を含む雌魚の前駆体に発達する、実施形態１８の方法。
実施形態２０．改変が、核を提供する細胞において遺伝子編集されたか、または親細胞において遺伝子編集された、実施形態１８または実施形態１９の方法。
【0159】
実施形態２１．遺伝子編集が、マイクロインジェクション、脂質ベースのトランスフェクション、化学ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス媒介性形質導入、またはエキソソーム媒介トランスフェクション、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２０のいずれか１つの方法。
実施形態２２．小核注入が前核マイクロインジェクションである、実施形態２１の方法。
実施形態２３．脂質ベースのトランスフェクションが、ナノ粒子、マイクロ粒子、またはリポソーム、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態２１の方法。
実施形態２４．前駆体が、雌魚に少なくとも１世代、少なくとも２世代、少なくとも３世代、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、または少なくとも１００世代先行する、実施形態１～２３のいずれか１つの方法。
実施形態２５．遺伝子編集がヌクレアーゼの使用を含む、実施形態１～２４のいずれか１つの方法。
実施形態２６．遺伝子編集が部位特異的遺伝子編集システムを含む、実施形態１～２５のいずれか１つの方法。
実施形態２７．遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む、実施形態２６の方法。
実施形態２８．遺伝子編集システムが、３’－ＵＴＲの欠失を含む改変を作る、実施形態２６または実施形態２７の方法。
実施形態２９．欠失が３’－ＵＴＲの早期切断を含む、実施形態２８の方法。
実施形態３０．欠失が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態２８または実施形態２９の方法。
実施形態２２．小核注入が前核マイクロインジェクションである、実施形態２１の方法。
実施形態２３．脂質ベースのトランスフェクションが、ナノ粒子、マイクロ粒子、またはリポソーム、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態２１の方法。
実施形態２４．前駆体が、雌魚に少なくとも１世代、少なくとも２世代、少なくとも３世代、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、または少なくとも１００世代先行する、実施形態１～２３のいずれか１つの方法。
実施形態２５．遺伝子編集がヌクレアーゼの使用を含む、実施形態１～２４のいずれか１つの方法。
実施形態２６．遺伝子編集が部位特異的遺伝子編集システムを含む、実施形態１～２５のいずれか１つの方法。
実施形態２７．遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含む、実施形態２６の方法。
実施形態２８．遺伝子編集システムが、３’－ＵＴＲの欠失を含む改変を作る、実施形態２６または実施形態２７の方法。
実施形態２９．欠失が３’－ＵＴＲの早期切断を含む、実施形態２８の方法。
実施形態３０．欠失が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態２８または実施形態２９の方法。
【0160】
実施形態３１．欠失が、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または無効にする、実施形態２８～３０のいずれか１つの方法。
実施形態３２．遺伝子編集システムが、３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む改変を作る、実施形態２６～３１のいずれか１つの方法。
実施形態３３．遺伝子編集がポリヌクレオチドを含む、実施形態１～３２のいずれか１つの方法。
実施形態３４．ポリヌクレオチドが、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に相同な１つまたは複数の領域を含む、実施形態３３の方法。
実施形態３５．ポリヌクレオチドが、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に非相同な１つまたは複数の領域を含む、実施形態３３または実施形態３４の方法。
実施形態３６．ポリヌクレオチドが相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を含む、実施形態３３～３５のいずれか１つの方法。
実施形態３７．ポリヌクレオチドがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つの方法。
実施形態３８．遺伝子編集がポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つの方法。
実施形態３９．非相同領域が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列を含む、実施形態３５～３８のいずれか１つの方法。
実施形態４０．始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列が、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または無効にする、実施形態３９の方法。
実施形態３２．遺伝子編集システムが、３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む改変を作る、実施形態２６～３１のいずれか１つの方法。
実施形態３３．遺伝子編集がポリヌクレオチドを含む、実施形態１～３２のいずれか１つの方法。
実施形態３４．ポリヌクレオチドが、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に相同な１つまたは複数の領域を含む、実施形態３３の方法。
実施形態３５．ポリヌクレオチドが、遺伝子の３’－ＵＴＲヌクレオチド配列に非相同な１つまたは複数の領域を含む、実施形態３３または実施形態３４の方法。
実施形態３６．ポリヌクレオチドが相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を含む、実施形態３３～３５のいずれか１つの方法。
実施形態３７．ポリヌクレオチドがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つの方法。
実施形態３８．遺伝子編集がポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態３３～３６のいずれか１つの方法。
実施形態３９．非相同領域が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列を含む、実施形態３５～３８のいずれか１つの方法。
実施形態４０．始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列が、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または無効にする、実施形態３９の方法。
【0161】
実施形態４１．始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列が、１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む、実施形態３９または実施形態４０の方法。
実施形態４２．始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列が、外因性遺伝子のコード配列を含む、実施形態３９～４０のいずれか１つの方法。
実施形態４３．外因性遺伝子のコード配列がプロモーターを含む、実施形態４２の方法。
実施形態４４．プロモーターが構成的プロモーターであるかまたは組織特異的プロモーターである、実施形態４３の方法。
実施形態４５．外因性遺伝子がレポーターをコードする、実施形態４２～４４のいずれか１つの方法。
実施形態４６．レポーターが蛍光タンパク質である、実施形態４５の方法。
実施形態４７．蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体または変異体である、実施形態４６の方法。
実施形態４８．不稔魚が、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から選択される、実施形態１～４７のいずれか１つの方法。
実施形態４９．遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む、実施形態１～４８のいずれか１つの方法。
実施形態５０．前駆体が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質を含む、実施形態１６～４９のいずれか１つの方法。
実施形態４２．始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる配列が、外因性遺伝子のコード配列を含む、実施形態３９～４０のいずれか１つの方法。
実施形態４３．外因性遺伝子のコード配列がプロモーターを含む、実施形態４２の方法。
実施形態４４．プロモーターが構成的プロモーターであるかまたは組織特異的プロモーターである、実施形態４３の方法。
実施形態４５．外因性遺伝子がレポーターをコードする、実施形態４２～４４のいずれか１つの方法。
実施形態４６．レポーターが蛍光タンパク質である、実施形態４５の方法。
実施形態４７．蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体または変異体である、実施形態４６の方法。
実施形態４８．不稔魚が、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から選択される、実施形態１～４７のいずれか１つの方法。
実施形態４９．遺伝子編集されたホモ接合性改変を含む雌魚が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む、実施形態１～４８のいずれか１つの方法。
実施形態５０．前駆体が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質を含む、実施形態１６～４９のいずれか１つの方法。
【0162】
実施形態５１．改良された形質が遺伝子操作の結果である、実施形態４９または実施形態５０の方法。
実施形態５２．改良された形質が品種改良の結果である、実施形態４９～５１のいずれか１つの方法。
実施形態５３．改良された形質が、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、実施形態４９～５２のいずれか１つの方法。
実施形態５４．実施形態１～５３のいずれか１つの方法によって得られた不稔魚。
実施形態５５．実施形態５４の不稔魚から得られた組織を含む食品。
実施形態５６．生殖質の移動および／または配偶子の発達に関与する遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の遺伝子編集された改変から生じる魚の不稔性をレスキューする方法であって、該方法は、魚からの卵に、遺伝子編集された改変を含む遺伝子に対応するｍＲＮＡの野生型コピーを注入することを含む、方法。
実施形態５７．卵の子孫は稔性であるが、子孫は不稔子孫を生産する、実施形態５６の方法。
実施形態５８．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変を含むインビトロ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および/または正常な移動に寄与する、インビトロ細胞。
実施形態５９．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のホモ接合性改変を含むインビトロ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、インビトロ細胞。
実施形態６０．体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である、実施形態５８または実施形態５９のインビトロ細胞。
実施形態５２．改良された形質が品種改良の結果である、実施形態４９～５１のいずれか１つの方法。
実施形態５３．改良された形質が、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、実施形態４９～５２のいずれか１つの方法。
実施形態５４．実施形態１～５３のいずれか１つの方法によって得られた不稔魚。
実施形態５５．実施形態５４の不稔魚から得られた組織を含む食品。
実施形態５６．生殖質の移動および／または配偶子の発達に関与する遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の遺伝子編集された改変から生じる魚の不稔性をレスキューする方法であって、該方法は、魚からの卵に、遺伝子編集された改変を含む遺伝子に対応するｍＲＮＡの野生型コピーを注入することを含む、方法。
実施形態５７．卵の子孫は稔性であるが、子孫は不稔子孫を生産する、実施形態５６の方法。
実施形態５８．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変を含むインビトロ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および/または正常な移動に寄与する、インビトロ細胞。
実施形態５９．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のホモ接合性改変を含むインビトロ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、インビトロ細胞。
実施形態６０．体細胞、未受精卵、受精卵、または精子細胞である、実施形態５８または実施形態５９のインビトロ細胞。
【0163】
実施形態６１．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のヘテロ接合性改変を含むインビボ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、インビボ細胞。
実施形態６２．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のホモ接合性改変を含むインビボ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、インビボ細胞。
実施形態６４．体細胞、未受精卵、または精子細胞である、実施形態６１または実施形態６２のインビボ細胞。
実施形態６５．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変を含む魚であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、魚。
実施形態６６．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にホモ接合性改変を含む魚であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、魚。
実施形態６７．遺伝子が、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａからなる群から選択される、実施形態６５または実施形態６６の魚。
実施形態６８．改変が、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または無効にする、実施形態６５～６７のいずれか１つの魚。
実施形態６９．改変が３’－ＵＴＲの欠失を含む、実施形態６５から６８のいずれか１つの魚。
実施形態７０．欠失が３’－ＵＴＲの早期切断を含む、実施形態６９の魚。
実施形態７１．欠失が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態６９または実施形態７０の魚。
実施形態７２．改変が３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む、実施形態６５から６８のいずれか１つに記載の魚。
実施形態７３．核酸配列が外因性遺伝子のコード配列を含む、実施形態７２の魚。
実施形態７４．外因性遺伝子がレポーターをコードする、実施形態７３の魚。
実施形態７５．挿入が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態７２～７４のいずれか１つの魚。
実施形態７６．魚が、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から選択される、実施形態６５～７５のいずれか１つの魚。
実施形態７７．魚が雌である、実施形態６５～７６のいずれか１つに記載の魚。
実施形態７８．雌魚が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む、実施形態７７の魚。
実施形態７９．改良された形質が遺伝子操作の結果である、実施形態７８の魚。
実施形態８０．改良された形質が品種改良の結果である、実施形態７８または実施形態７９の魚。
実施形態８１．改良された形質が、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、実施形態７８～８０のいずれか１つの魚。
実施形態６２．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）のホモ接合性改変を含むインビボ細胞であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、インビボ細胞。
実施形態６４．体細胞、未受精卵、または精子細胞である、実施形態６１または実施形態６２のインビボ細胞。
実施形態６５．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にヘテロ接合性改変を含む魚であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、魚。
実施形態６６．遺伝子の３つの主要な非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）にホモ接合性改変を含む魚であって、ここで遺伝子は、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動に寄与する、魚。
実施形態６７．遺伝子が、ｎａｎｏｓ３／ｎａｎｏｓ／ｎａｎｏｓ１、ｄｎｄ１／ｄｎｄ、ｄｄｘ４／ｖａｓａ、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ７、ｇｒｉｐ２、ＣａＯＣ１ｑ、ｃｘｃｒ４／ｃｘｃｒ４ｂ、ｌｙ７５、ｎｌｋ１、ｎａｎｏｇ、ｃｐｓｆ６／ＣＦｌｍ６８、ｃｘｃｌ１２／ｓｄｆ１、ｋｏｐ、ｐｉｗｉ／ｚｉｗｉ、ｏｃｔ４、ｂｕｃｋｙ ｂａｌｌ、ｃｘｃｒ７、ｇｒａｎｕｌｉｔｏ、ｈｕｂ、ｍｉＲ－４３０、ｍｋｉｆ５Ｂａ、ｏｓｋａｒ、およびｐｕｆ／ｐｕｆ－Ａからなる群から選択される、実施形態６５または実施形態６６の魚。
実施形態６８．改変が、その結合タンパク質による３’－ＵＴＲの認識を低減または無効にする、実施形態６５～６７のいずれか１つの魚。
実施形態６９．改変が３’－ＵＴＲの欠失を含む、実施形態６５から６８のいずれか１つの魚。
実施形態７０．欠失が３’－ＵＴＲの早期切断を含む、実施形態６９の魚。
実施形態７１．欠失が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態６９または実施形態７０の魚。
実施形態７２．改変が３’－ＵＴＲへの核酸配列の挿入を含む、実施形態６５から６８のいずれか１つに記載の魚。
実施形態７３．核酸配列が外因性遺伝子のコード配列を含む、実施形態７２の魚。
実施形態７４．外因性遺伝子がレポーターをコードする、実施形態７３の魚。
実施形態７５．挿入が、始原生殖細胞の正常な発達および／または正常な移動を妨げる、実施形態７２～７４のいずれか１つの魚。
実施形態７６．魚が、ティラピア（例えば、モザンビークティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）およびナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）；サケ（例えば、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）、チヌークサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、およびコーホーサーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｉｓｕｔｃｈ））；マス（例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ＊）；マグロ（例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｔｈｙｎｎｕｓ）；シーバス（例えば、ヨーロッパシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）；ブリーム（例えば、ホワイトアムールブリーム（Ｐａｒａｂｒａｍｉｓ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）；タイ（例えば、マダイ＊（Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ＊）；バラマンディ＊（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）；サバヒー（Ｃｈａｎｏｓ ｃｈａｎｏｓ）；カトラ（Ｃａｔｌａ ｃａｔｌａ＊）；コイ（例えば、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ｃａｒａｓｓｉｕｓ）、ケンヒー（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ＊）、ムリガルカープ（Ｃｉｒｒｈｉｎｕｓ ｍｒｉｇａｌａ）、ソウギョ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、ハクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）、コクレン（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｎｏｂｉｌｉｓ＊）、ローフー（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ）、アオウオ（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ））；ナマズ（例えば、アメリカナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ））；カンパチ（例えば、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）；およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）から選択される、実施形態６５～７５のいずれか１つの魚。
実施形態７７．魚が雌である、実施形態６５～７６のいずれか１つに記載の魚。
実施形態７８．雌魚が、類似種の野生型魚と比較して改良された形質をさらに含む、実施形態７７の魚。
実施形態７９．改良された形質が遺伝子操作の結果である、実施形態７８の魚。
実施形態８０．改良された形質が品種改良の結果である、実施形態７８または実施形態７９の魚。
実施形態８１．改良された形質が、脂肪蓄積の領域、体型、耐病性、より速い成長、脂肪率、肉色、より多くのタンパク質含有量、改良された生殖能力、より大きな筋肉、皮膚の色、および温度耐性の１つまたは複数である、実施形態７８～８０のいずれか１つの魚。
【0164】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されているが、かかる実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかである。多数の変形、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に今や生じる。本明細書に記載の実施形態の様々な代替法が使用されてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【国際調査報告】