特表2022-526965キャプチャー前の凝集の使用による免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーの改善
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-27
(54)【発明の名称】キャプチャー前の凝集の使用による免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーの改善
(51)【国際特許分類】
C07K 1/22 20060101AFI20220520BHJP
C07K 1/34 20060101ALI20220520BHJP
C07K 1/30 20060101ALI20220520BHJP
【ＦＩ】
C07K1/22
C07K1/34
C07K1/30
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021558539
(86)(22)【出願日】2020-03-25
(85)【翻訳文提出日】2021-09-29
(86)【国際出願番号】 EP2020058439
(87)【国際公開番号】W WO2020200980
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】P1900112
(32)【優先日】2019-04-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】310008859
【氏名又は名称】リヒター ゲデオン ニュイルヴァーノシャン ミューコェデー レースヴェーニュタールシャシャーグ
【氏名又は名称原語表記】Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｇｅｄｅｏｎ Ｎｙｒｔ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ケゼイ、ジュジャンナ
(72)【発明者】
【氏名】シュテー、ゾルターン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA06
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、細胞培養採取物から免疫グロブリンを精製する新規な方法に関する。この方法は、最初のキャプチャークロマトグラフィーステップに先行する洗浄ステップを特徴とする。好ましくは、最初のキャプチャークロマトグラフィーはアフィニティークロマトグラフィーであり、キャプチャー前の洗浄効果は、凝集及び濾過によって得られる。このようなキャプチャー前の洗浄ステップを用いることにより、キャプチャーマトリックスから溶出される免疫グロブリンの品質が向上する。さらに、細胞培養液の清澄化が促進されると、アフィニティークロマトグラフィー中の沈殿が減少するため、高価なアフィニティー樹脂の寿命が延びる。これは、大規模生産における免疫グロブリン精製にとって重要な改善である。本発明はさらに、キャプチャークロマトグラフィーの下流の連続するポリッシングクロマトグラフィー及び濾過ステップに関連し、高純度の免疫グロブリンを生成する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞培養液からの免疫グロブリンのキャプチャーアフィニティークロマトグラフィーの過程での沈殿を防止する方法であって、以下のステップを以下の順序で含む方法：（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【請求項2】
ステップ（ａ）は以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること。
【請求項3】
凝集誘導化合物はカチオン性化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
カチオン性化合物は、二価金属イオン塩、水溶性有機ポリマー、及び水不溶性有機ポリマーからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
二価金属イオン塩はＣａＣｌ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
水不溶性有機ポリマーはキトサンである、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
水溶性有機ポリマーはポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）である、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）は、１０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子質量を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）は、０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）の最終濃度で、好ましくは０．０２～０．１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で、より好ましくは０．０３～０．０８（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
凝集を実施するために、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）以外のさらなる物質は添加されない、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
凝集は、室温で撹拌しながら、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも１５分間行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
プロテインＡクロマトグラフィー媒体は、リガンドとして、架橋アガロースマトリックスに結合したアルカリ耐性プロテインＡ誘導体、好ましくは、プロテインＡのドメインＢのアルカリ安定化テトラマーバリアントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｂ）における深層濾過用のフィルターは、複数の層、好ましくは２つの層を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（ｂ）と（ｃ）との間で精密濾過が行われる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の最大８時間後、好ましくはステップ（ｂ）の最大３時間後に行われる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
細胞培養液は、免疫グロブリンを発現する組換えＣＨＯ細胞から得られる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
免疫グロブリンは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃ部分はヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
免疫グロブリンを精製する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項において定義される各ステップを含み、かつ、ウイルス不活化、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、ナノ濾過、及び限外濾過／ダイアフィルトレーションから選択される、アフィニティークロマトグラフィーに続く１つ以上のさらなるステップを含む方法。
【請求項22】
前記１つ以上のさらなるステップは、（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記１つ以上のさらなるステップは、（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｈ）混合モードクロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液、又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ｇ）は結合－溶出モードで行われ、任意選択で１つ以上の洗浄ステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ステップ（ｈ）における混合モードクロマトグラフィーは結合－溶出モードで行われ、任意選択で１つ以上の洗浄ステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
クロマトグラフィー（ｈ）はフロースルーモードで行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
ステップ（ｇ）の陽イオン交換クロマトグラフィーは、強陽イオン交換媒体を含む媒体で、好ましくはリガンドとしてスルホプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３－）を用いて行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
スルホプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３－）は架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）マトリックスに結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ステップ（ｈ）の混合モードクロマトグラフィー媒体は、正に帯電した混合モード媒体で行われ、好ましくは、リガンドとして、架橋アガロースマトリックスに結合したＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
ステップ（ｈ）の陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、強陰イオン交換媒体を含む媒体で、好ましくは、リガンドとして、架橋アガロースマトリックスに結合したトリメチルアンモニウム（－Ｎ＋（ＣＨ３）３）を用いて行われる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アフィニティーキャプチャークロマトグラフィー前の凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）及び濾過ステップ、ならびに抗体を精製するためのキャプチャーステップに続くさらなるポリッシングステップを用いて、細胞培養由来の組成物からの抗体のアフィニティークロマトグラフィー中の沈殿を防止する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
組換えＤＮＡ技術によって生成されたポリペプチドを精製するための効率的で経済的な下流手順の選択は、治療用途を目的としたすべての新しいバイオ医薬品の開発における重要なステップである。最近では、モノクローナル抗体（ｍａｂ）の医療用途での治療用量が非常に高いため、より高い細胞密度、より高い発現率、そして目的の組換え抗体の＞１０ｇ／Ｌなどのより高い力価をもたらす改善された細胞培養法の使用により、モノクローナル抗体（ｍａｂ）の大規模な精製プロセスの必要性がさらに高まっている。生成物及び混入物の培養液中の濃度の増加は、キャプチャークロマトグラフィー、その前のサンプル洗浄ステップ、及びその後のポリッシングクロマトグラフィーに対してより高い要求を設定する。下流プロセス全体は、（ｉ）増加した生成物の質量を管理し、（ｉｉ）増加したプロセス及び生成物関連の不純物を定義された許容基準以下に効率的に除去し、（ｉｉｉ）経済的収率を維持し、（ｉｖ）ｍａｂの十分な品質を保証する必要がある。通常、下流のプロセスは、治療用抗体の総製造コストの大部分を占める。
【0003】
粗画分のｍａｂは通常、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）、エンドトキシン、インスリン、ウイルス、凝集体、その他の望ましくない生成物変異体、及びプロセス材料からの様々な浸出液などの不純物を伴う。これらの不純物の存在は、患者にとって潜在的な健康上のリスクであり、したがって、これらは最終生成物に存在しないことが規制要件である。非常に低い残留量のみが許容される。
【0004】
細胞培養由来のポリペプチドを精製するための古典的な手順は、キャプチャークロマトグラフィー－中間クロマトグラフィー－ポリッシングクロマトグラフィーの順序に従い、下流の手順の様々な位置で濾過、濃縮、又は透析ステップを伴う。近年、プラットフォームアプローチは、ｍａｂ精製の分野で成功裏に確立されている。ｍａｂは、共通の物理化学的特性を持つ十分に定義されたクラスの糖タンパク質であるため、一般的なプラットフォームプロセスの使用は合理的である（Ｋｅｌｌｙ Ｂ ２００９）。生成物固有の適応を多かれ少なかれ伴うそのような普遍的なプロセスは、多くのｍａｂ、特に同じクラス又はサブクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２に適用することができる。
【0005】
ｍａｂ精製に最も頻繁に使用されるキャプチャーステップの１つは、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィーである。このキャプチャーは、Ｆｃ含有分子に対して並外れた選択性を提供し、それによって１回のステップで混入物の９９．５％超を除去する。しかし、その利点以外に、２つの欠点についても言及する必要がある。１つの欠点は、毒性があることが知られているプロテインＡ又はプロテインＡのフラグメントの望ましくない浸出である（Ｇａｇｎｏｎ Ｐ １９９６）。もう１つの欠点は、特に十分な量の治療用抗体を精製するために必要な工業規模では、この種の樹脂のコストが高いことである。プロテインＡ樹脂は、イオン交換樹脂よりも約３０倍高価である。１０ｍ３の細胞培養物の下流処理の場合、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのコストは約４００万から５００万米ドルであると計算された（Ｆａｒｉｄ ＳＳ ２００９）。
【0006】
多くの場合、キャプチャーステップは粗投入（ロード）材料を使用して行われる。これにより、アフィニティーカラム樹脂の汚染（不純物の蓄積）が発生する可能性がある。適切な再生ステップがない場合、これは捕捉樹脂の再利用の成功を妨げる可能性がある。脂質、酸化剤、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）、凝集体又は粒子、金属イオン、その他の物質などの粗培養液中の混入物は、樹脂の汚れを促進し、低ｐＨ溶出中に沈殿や濁りを引き起こす可能性がある（Ｓｈｕｋｌａ ＡＡ ２００５）。結合部分への直接的な影響に加えて、マトリックスも不可逆的に汚染される可能性がある。その結果、背圧が上昇し、実行ごとに容量と流量が減少する。この問題はプロテインＡ樹脂に限定されない。クロマトグラフィー樹脂の動作寿命全体にわたる汚損は、商業的なバイオセパレーションにとって一般的に重大な問題である。疎水性相互作用クロマトグラフィー及び混合モードクロマトグラフィーに使用される疎水性リガンドは、細胞培養由来の免疫グロブリンのキャプチャーステップとして使用される場合、培養液から親油性混入物を捕捉するのに特に影響を受けやすくなる。実行後の洗浄ステップのための高度なプロトコルにもかかわらず、キャプチャーカラムの寿命は制限されており、サイクル数、実行と洗浄の操作条件、及びサンプルの組成と純度に依存する。
【0007】
ひどく汚染された培養液を清澄化し、プレクリーニングするために、細胞の破片や凝集体のほとんどを除去する機械的分離ステップが採用されている。遠心分離及び濾過トレインは、サンプルを捕捉樹脂にロードする前に行われる最も一般的な前処理ステップである。大量の場合、細胞分離器を使用して連続遠心分離が行われ、続いてデプスフィルター及び／又はマイクロフィルターを使用した濾過ステップが行われる。得られた培養液は、「清澄化細胞培養上清（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）」と呼ばれる（Ｌｉｕ ＨＦ ２０１０）。採取した培養液をプロテインＡ樹脂に直接ロードする方法がよく選択されるが（Ｆａｈｒｎｅｒ ＲＬ ２００１）、他のプラットフォーム技術では、キャプチャーカラムを保護するために、遠心分離、深層濾過、及び／又は精密濾過などの様々な清澄化ステップを利用する（Ｌｉｕ ＨＦ ２０１０、国際公開第９５２２３８９号、国際公開第２００１１５０１１０号）。これにより、固形物や粒子による樹脂の汚染が減少し、キャプチャー溶出液中の抗体の純度が向上する。遠心分離／濾過ステップに加えて、フロースルーモードで実行されるプレキャプチャークロマトグラフィーは、免疫グロブリンの大規模精製において成功裏に実証された（国際公開第２０１５１３５８８４号）。キャプチャークロマトグラフィーの上流に追加の陰イオン交換クロマトグラフィーステップを組み込むことにより、精製プロセスの全体的な費用を大幅に削減できることが見出された。キャプチャー前の陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーステップは、コストのかかるキャプチャークロマトグラフィー材料がさらされる不純物の量を減少させた。
【0008】
プロテインＡクロマトグラフィーにおける酸性ｐＨによるｍａｂの溶出中は、一般に溶出プールは濁り、カラム背圧は高くなる。調査では、この現象は、タンパク質の自己会合の結果としての液－液相分離に関連していた。ｐＨ、温度、イオン強度、タンパク質濃度などの複数の要因がこの効果に影響を与える。プロテインＡ溶出中に、温度、流速、バッファー、塩などのプロセスパラメータを注意深く選択すると、濁り及びカラム背圧の両方を低減できる（Ｌｕｏ Ｈ ２０１７）。プロテインＡ溶出プールの濁りに現れる凝集と粒子形成の問題を回避するために、同様の戦略が取られている（Ｓｈｕｋｌａ ＡＡ ２００５）。溶出バッファーに添加される塩、尿素、アミノ酸などの安定化物質、低温、洗浄及び溶出バッファーのｐＨ値の適応、又は細胞培養採取物の前処理を行って、低ｐＨで沈殿する可能性のある特定の不純物を除去することが提案された。前処理方法には、陰イオン交換クロマトグラフィー、濾過、及び汚染物質の酸による沈殿が含まれていた（Ｓｈｕｋｌａ ＡＡ ２００５）。
【0009】
凝集は、化学及び食品産業だけでなく、廃水処理でも広く実施されているプロセスである。沈殿と凝集は両方とも、細胞培養液の清澄化に問題なく使用されている。沈殿は、固体粒子を作成するために標的溶質の溶解度を下げることに依存するのに対し、凝集は、凝集剤によって誘導される架橋効果によって引き起こされる粒子（細胞、細胞破片、又は哺乳類細胞培養におけるコロイド）の集塊である。凝集剤は、分散した粒子を付着させ、より大きなサイズのクラスターにすることによってバイオコロイド懸濁液の不安定化を引き起こし、その結果、平均粒子サイズ分布が増加する（Ｆｅｌｏ Ｍ ２０１５、Ｓｉｎｇｈ Ｎ ２０１６）。凝集法は、陰イオン凝集、陽イオン凝集、及び混合型凝集に分類できる（Ｓｉｎｇｈ Ｎ ２０１６）。
【0010】
具体的には、単純な酸、二価カチオン、ポリカチオン性ポリマー、カプリル酸、及び刺激応答性ポリマーなどの凝集剤が、細胞培養物の清澄化を促進し、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、及びウイルスのレベルを低下させる能力について評価されている（Ｆｅｌｏ Ｍ ２０１５）。約１０年前から、モノクローナル抗体の大規模製造における凝集法の有用性についても集中的に研究されてきた。
【0011】
細胞の存在下で、ｐＨ調整の有無にかかわらず、様々な陽イオンと陰イオンの組み合わせによる凝集は、モノクローナル抗体の精製に問題なく適用された（国際公開第２００７０３５２８３号）。最も好ましいのは、Ｃａ２＋とリン酸塩の組み合わせであった。非凝集の対照と比較して、プロテインＡ溶出ピークにおいてＨＣＰ及び濁度の顕著な減少が強調された。
【0012】
他の方法は、採取された細胞培養液中の不純物の沈殿のために、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルスルホナート、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリリジン、又はポリアルギニンなどの高分子電解質を利用する（国際公開第２００８０９１７４０号）。凝集剤としてカプリル酸を使用する同様の方法が、混入物を沈殿させるために開発された（国際公開第２０１０１５１６３２号）。不純物の沈殿又は凝集には、多くの場合、追加のｐＨ操作が必要である。このことは、Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋などの二価カチオンによる沈殿（国際公開第２００８１２７３０５号）及びデキストランによる沈殿（国際公開第２０１６１５３９８３号）について開示された。
【0013】
刺激応答性ポリマーと呼ばれるベンジル化ポリ（アリルアミン）を使用する別の凝集プロセスが、ＣＨＯ細胞培養物からのモノクローナルＩｇＧ１精製のために開発された。刺激はリン酸ナトリウムを加えることによって設定された（Ｋａｎｇ ＹＫ ２０１３）。抗体の細胞培養採取物の清澄化において刺激応答性ポリマーとして作用するさらなる化合物が知られている（国際公開第２０１１１４６３９４号）。
【0014】
細胞含有採取物にアラントインを添加し、続いてエタクリジンを添加することによる凝集ステップは、その後の吸着及びクロマトグラフィーステップの前のコンディショニング方法として説明された（国際公開第２０１４１３３４５９号）。
【0015】
別の凝集法は、Ｃ７～Ｃ１０脂肪酸を、細胞培養採取物の清澄化のためのさらなる機能的な基質と組み合わせて使用する（国際公開第２０１４１９６９２６号）。Ｃ７～Ｃ１０脂肪酸とアラントインの組み合わせに基づく同様のプロセスが適用された（国際公開第２０１５１３０２２２号）。
【0016】
より複雑な凝集法は、細胞含有採取物中の混入物を除去するためのアラントイン、カチオン性ポリマー、及び脂肪酸の組み合わせによって開示された。３つの凝集剤、アラントイン、キトサン、及びカプリル酸の混合物が最も成功した（国際公開第２０１７２１７９３０号）。
【0017】
抗体又は他の標的分子を精製し、（ｉ）混入物を除去するための沈殿ステップ、（ｉｉ）プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続く（ｉｉｉ）１つ又は２つのフロースルークロマトグラフィーを含む全プロセスが記載された（国際公開第２０１４００４２８１号）。沈殿剤は細胞培養採取物に追加され、凝集剤も含み、追加の刺激応答要素はあってもなくてもよい。
【0018】
カチオン性水溶性ポリマーであるポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）の適用が、ｍａｂ産生ＣＨＯ細胞培養の採取物の清澄化について調査された（ＭｃＮｅｒｎｅｙ Ｔ ２０１５）。著者らは、凝集剤を培養ブロスに直接加えた。濾過トレインを優先して遠心分離を省略した。毒性のあるポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）は、その後のプロテインＡキャプチャークロマトグラフィー後に検出不可能なレベルに減少したことが示された。
【0019】
細胞の存在下での最初の凝集ステップからなり、ポリ（ジアリルメチルアンモニウムクロリド）に基づく大規模な細胞培養採取法が開発された（国際公開第２０１３０９０８２０号）。好ましい凝集方法は、凝集のさらなる促進剤、すなわち、ポリエチレングリコール及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（登録商標）Ｘ－１００を利用する。
【発明の概要】
【0020】
本発明は、アフィニティーキャプチャークロマトグラフィー媒体からの細胞培養物からの免疫グロブリンの低ｐＨ溶出中の沈殿の防止に関する。本発明はさらに、効率的かつ費用効果が高く、十分な純度及び収率で免疫グロブリンを精製する方法を提供する。特に、本発明は、キャプチャークロマトグラフィー樹脂から溶出される免疫グロブリン溶液の純度を改善することを目的とし、したがって、最終生成物の改善された品質をもたらす。
【0021】
さらに、本発明は、かなりコストのかかるクロマトグラフィー材料の再利用の点について、特に、下流プロセスのキャプチャーステップで使用されるアフィニティークロマトグラフィー材料の寿命について、及び、精製プロセスの技術的な複雑さを抑えつつ、これをどのように長期化させるかについて対処する。
【0022】
細胞培養液から免疫グロブリンを精製するための従来の下流クロマトグラフィープロセスは、通常、アフィニティーキャプチャークロマトグラフィーステップから始まる。このステップでは、免疫グロブリンを不純物と共に含むサンプルから免疫グロブリンを捕捉しなければならない。免疫グロブリンは、主にキャプチャークロマトグラフィー樹脂の親和性リガンドへの免疫グロブリンの選択的結合によって不純物から分離されるが、不純物は樹脂に結合しないためフロースルーで得られ、免疫グロブリンは溶出液中で得られる。
【0023】
アフィニティーキャプチャークロマトグラフィーは通常、免疫グロブリンの精製において最も費用のかかるステップであり、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用する場合、下流プロセス全体のコストの４０～５０％に相当する。同じことが、免疫グロブリンの精製におけるキャプチャークロマトグラフィーステップとして使用され得る代替のアフィニティークロマトグラフィーカラムにも当てはまる。
【0024】
大量の細胞培養液及び発酵ブロスからの、ならびにそのような液又はブロスに由来する清澄化されたサンプルからの免疫グロブリンの費用効果の高い精製に対する継続的な必要性が存在する。特に、費用効果が高く、しかも効率が高く、純度と収率の点で満足のいく簡単な精製方法が必要である。
【0025】
キャプチャークロマトグラフィーの上流に追加のクロマトグラフィーステップを組み込むことにより、精製プロセスの全体的な費用を大幅に削減できることが見出された。この追加のクロマトグラフィーステップにより、コストのかかるキャプチャークロマトグラフィー材料がさらされる不純物の量が軽減される。このいわゆる「プレクリーニング」ステップは、陰イオン交換又は混合モードクロマトグラフィー材料を使用して行われる。これは、後続のキャプチャーステップで使用されるクロマトグラフィー材料と比較して安価かつ強靭であり、再生が容易である（国際公開第２０１５１３５８８４号）。精製プロセスを可能な限り簡素に保つために、プレクリーニングクロマトグラフィーはフロースルーモードで行われる。つまり、精製される免疫グロブリンは樹脂に結合せず、フロースルー画分で得られるが、不純物は主に樹脂上に保持され、それによって免疫グロブリンから分離される。プレクリーニング陰イオン交換カラムとプロテインＡキャプチャーカラムを直接接続することにより、プレクリーニングステップのフロースルーは一時的に収集容器に保存されず、すぐにキャプチャークロマトグラフィー樹脂に送られ、この方法をさらに簡略化する（国際公開第２０１５１３５８８４号）。
【0026】
それにもかかわらず、プレキャプチャー清澄化ステップとして使用される陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーのそのようなプロセスは、大規模生産で成功裏に確立されたものの、依然としてさらなる改善の対象である。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＨＣＤＮＡやＨＣＰなどの主に負に帯電した物質を、カラムに保持されている非特異的に吸着された細胞片、凝集体、脂質などとともに枯渇させる。しかし、正に帯電したＨＣＰ及び非帯電分子の大部分はプレクリーニングカラムを通過できる。これにより、プロテインＡの溶出ピークに望ましくない濁りが生じる可能性がある。さらに、高い細胞密度、複雑な培地供給戦略、及び最先端の哺乳類細胞培養物の高い発現率に起因する需要の増加により、プレクリーニングカラムには、プロテインＡカラムの効率的な保護シールドとして作用するためのかなりの寸法が求められている。これには費用がかかる。最後に、陰イオン交換樹脂は、過酷で時間のかかる洗浄及び再生手順を経る必要がある。これは、一連のシリアルバッチで優先的に行われる通常の生産では歓迎されない。
【0027】
本発明は、クロマトグラフィーによるプレクリーニングの前述の問題を克服するために、プレキャプチャーステップとして使用される凝集ステップの実現可能性を研究した。治療用途を目的とした免疫グロブリンの必要な高純度を達成するために、２つ以上のクロマトグラフィーポリッシングステップが凝集ステップ及びキャプチャークロマトグラフィーステップの後に続く。
【0028】
本発明の根底にある問題は、細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供することによって解決され、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【0029】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、以下のステップを含む。
・細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
・凝集誘導化合物を上清又は濾液に添加すること。
・細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
・凝集誘導化合物を上清又は濾液に添加すること。
【0030】
凝集は、凝集剤としてカチオン性化合物を添加することによって実施することができる。カチオン性化合物は、二価金属イオン塩、水溶性有機ポリマー、及び水不溶性有機ポリマーからなる群から選択することができる。
【0031】
いくつかの実施形態では、二価金属イオン塩はＣａＣｌ２である。
いくつかの実施形態において、水溶性有機ポリマーは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）である。他の実施形態では、水不溶性有機ポリマーはキトサンである。
いくつかの実施形態において、水溶性有機ポリマーは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）である。他の実施形態では、水不溶性有機ポリマーはキトサンである。
【0032】
特定の実施形態において、凝集は、凝集剤としてポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を用いて実施される。より具体的には、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）は、１０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子質量を有する。
【0033】
典型的には、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）は、０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）の最終濃度で、好ましくは０．０２～０．１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で、より好ましくは０．０３～０．０８（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加される。
【0034】
いくつかの実施形態において、凝集を実施するために、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）以外のさらなる物質は添加されない。
いくつかの実施形態では、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる。
いくつかの実施形態では、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる。
【0035】
特定の実施形態では、凝集は、室温で撹拌しながら、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも１５分間行われる。
好ましい実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。プロテインＡクロマトグラフィー媒体は、リガンドとしてアルカリ耐性プロテインＡ誘導体、好ましくは、架橋アガロースマトリックスに結合したプロテインＡのドメインＢのアルカリ安定化テトラマーバリアントを含み得る。
好ましい実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。プロテインＡクロマトグラフィー媒体は、リガンドとしてアルカリ耐性プロテインＡ誘導体、好ましくは、架橋アガロースマトリックスに結合したプロテインＡのドメインＢのアルカリ安定化テトラマーバリアントを含み得る。
【0036】
いくつかの実施形態では、深層濾過後に精密濾過が実施される。
通常、アフィニティークロマトグラフィーは、深層濾過の最大８時間後、好ましくは深層濾過の最大３時間後に行われる。
通常、アフィニティークロマトグラフィーは、深層濾過の最大８時間後、好ましくは深層濾過の最大３時間後に行われる。
【0037】
いくつかの実施形態において、細胞培養液は、免疫グロブリンを発現する組換えＣＨＯ細胞から得られる。好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。より好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃ部分はヒトである。
【0038】
本明細書に記載の方法は、前述の実施形態のいずれか１つで定義されたステップであって、ウイルス不活化、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、ナノ濾過、及び限外濾過／ダイアフィルトレーションから選択される、アフィニティークロマトグラフィーに続く１つ以上のさらなるステップを含み得る。
【0039】
好ましくは、上記の方法は、以下のステップをさらに含む：
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｈ）混合モードクロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液、又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること。
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｈ）混合モードクロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液、又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること。
【0040】
さらに好ましい方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること、
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｈ）混合モードクロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液、又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること；
ここで、ステップｇ）は結合－溶出モードで行われ、ステップｈ）は結合－溶出モード又はフロースルーモードで行われる。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること、
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｈ）混合モードクロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
（ｉ）ステップ（ｈ）の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液、又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること；
ここで、ステップｇ）は結合－溶出モードで行われ、ステップｈ）は結合－溶出モード又はフロースルーモードで行われる。
【0041】
本発明は、免疫グロブリンの製造プロセスにおけるウイルスの安全性を高めるという問題をさらに解決する。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1-1】免疫グロブリンの従来の精製方法のプロセススキームを示す。図１Ａは、大量の細胞培養物から免疫グロブリンを精製するための普遍的なプロセススキームを示す。採取した培養液の遠心分離及び／又は濾過後に得られた清澄化されたバルク材料から始まったプロセスは、プロテインＡキャプチャーステップとそれに続く２つのポリッシングステップで構成される。このスキームには、２つの典型的なウイルス安全ステップも含まれている。プロテインＡ溶出液を低ｐＨに保つことによりウイルス不活化ステップが行われ、最後のポリッシングステップの後にウイルス除去のためのナノ濾過ステップが行われる。最終ステップは通常、タンジェンシャルフロー限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ－ＴＦＦ）であり、免疫グロブリン及び製剤成分の濃度を設定する。
【図1-2】図１Ｂは、３つのクロマトグラフィーからなる大量の細胞培養物から免疫グロブリンを精製するための古典的なプロセススキームを示す（例えば、Ｆａｈｒｎｅｒ Ｒ．Ｌ．２００１又はＫｅｌｌｙ Ｂ．２００９による）。ポリッシングステップは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシングステップ１）とそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシングステップ２）であると開示されていることを除き、図１Ａと同じプロセスである。陽イオン交換クロマトグラフィーは結合モードで行われるのに対し、陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで行われることを強調する必要がある。この古典的なスキームの頻繁に適用される同等の変形は、単にポリッシングステップ１及び２の順序の変更であることに注意する必要がある。
【図2-1】プレクリーニングステップを使用した本発明の例示的なプロセススキーム。図２Ａは、採取時に細胞の存在下で直接プレキャプチャー凝集ステップを伴う大規模なプロセススキームを示す。次に、凝集した物質を遠心分離、続いて深層濾過及び精密濾過によって除去する。凝集ステップは、カチオン性化合物を添加することによって行われる。清澄化された培養液は、プロテインＡであるキャプチャークロマトグラフィーカラムにロードされる。２つのポリッシングステップは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシングステップ１）とそれに続く混合モードクロマトグラフィー（ポリッシングステップ２）である。陽イオン交換クロマトグラフィーは、結合及び溶出モードで行われる。混合モード樹脂は正に帯電したリガンドを有し、結合及び溶出モード又はフロースルー（ＦＴ）モードで実施できる。中間のウイルス安全手順と最終的なＵＦ／ＤＦ－ＴＦＦは、図１Ａに記載されているとおりである。
【発明を実施するための形態】
【0043】
発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、「細胞培養液」という用語は、採取された細胞培養液、細胞培養上清又は前処理された細胞培養上清を指す。細胞培養液は、免疫グロブリンを産生する宿主細胞又は生物から直接得ることができる。細胞培養液は、遠心分離及び／又は濾過、例えば、精密濾過、ダイアフィルトレーション、限外濾過及び深層濾過によって部分的に清澄化又は精製されている場合がある。
本明細書で使用される場合、「細胞培養液」という用語は、採取された細胞培養液、細胞培養上清又は前処理された細胞培養上清を指す。細胞培養液は、免疫グロブリンを産生する宿主細胞又は生物から直接得ることができる。細胞培養液は、遠心分離及び／又は濾過、例えば、精密濾過、ダイアフィルトレーション、限外濾過及び深層濾過によって部分的に清澄化又は精製されている場合がある。
【0044】
本明細書で使用される場合、「前処理された」という用語は、例えば、本発明の方法で使用されるクロマトグラフィーステップのために、例えば、サンプルをバッファー交換、希釈、塩、洗浄剤、カオトロピック物質、又は有機化合物の添加、ｐＨ滴定又は濾過によりｐＨ及び／又は導電率範囲及び／又は緩衝能力を調整して所望のクロマトグラフィー性能を達成し、免疫グロブリンを安定化することからなる１つ以上の調整に供することによって調製された細胞培養上清を指す。哺乳類細胞から発現した免疫グロブリンは通常、培養プロセス中に細胞培養液中に分泌されるため、培養プロセスの最後に生成物を回収するには、細胞培養液を細胞から分離する。細胞破片の増加や、免疫グロブリン生成物の品質に影響を与える可能性のあるプロテアーゼやその他の分子の放出を回避するために、細胞分離法は細胞破壊を最小限に抑えるために穏やかでなければならない。通常、哺乳類細胞培養からの採取物は、遠心分離とそれに続く濾過を受ける。拡張床吸着クロマトグラフィーは、遠心分離／濾過法を回避するための代替方法である。クロマトグラフィーステップによる精製前のサンプルの他の処理は、細胞培養上清を、特定の免疫グロブリン濃度、ｐＨの範囲、導電率、及びバッファー種濃度に濃縮及び／又はダイアフィルトレーションすることであり得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「凝集」（同義語「凝結」及び「凝塊」）という用語は、流体中の懸濁物質が凝集誘導剤と相互作用して、より大きいサイズの凝集体又はフロックの形成をもたらすクラスター化反応を含む。「凝集剤」及び「凝集誘導剤」という用語は、本明細書で交換可能に使用することができ、カチオン性又はアニオン性化合物であり得る。好ましくは、凝集剤はカチオン性化合物である。より好ましくは、凝集剤はカチオン性水溶性ポリマーである。本発明で適用される「凝集ステップ」は、キャプチャークロマトグラフィーの上流のプレクリーニングステップとして機能する。凝集は細胞の存在下で行うことができ、これは、凝集剤が培養の最後に細胞培養液に直接添加され、細胞を含む凝集物質が遠心分離及び／又は濾過によって細胞培養液から除去されるか、又は、遠心分離によって細胞が除去された後、凝集剤が細胞培養液に添加され、その後、凝集物質が濾過によって除去されることを意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「カチオン性化合物」という用語は、金属イオン及びカチオン性ポリマー（ポリカチオン）を含む。「カチオン性ポリマー」は、水溶性ポリマー又は水不溶性ポリマーであり得る。「水溶性ポリマー」は、水に溶解して水系の物理的特性を変化させる有機物質を含む。「水不溶性ポリマー」は、水への溶解度が限られている。それらは水中で分散又は膨潤し、好ましくは親水性ポリマーを含み、これは水性懸濁液中で凝集剤として機能する。水不溶性ポリマーは、非常に低い又は非常に高いｐＨでは水に溶解し得る。凝集剤として使用されるカチオン性化合物は、水性媒体中で様々な機能を果たす。水溶性又は水不溶性の有機ポリマーは、天然資源又は化学合成に由来する幅広い物質を含む。天然の水溶性又は水不溶性の有機ポリマーの例は多数あるが、中でも多糖類（例えば、ペクチン、デキストラン、デンプン、キトサン、及びヒアルロン酸）、キサンタンガム、カラギーナンである。化学合成された有機ポリマーの例は多数あるが、中でもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸（ＰＰＡ）、ポリアクリルアミドである（レビューについてはＫａｄａｊｉｉ ＶＧ ２０１１を参照）。本発明の過程において、水溶性ポリマーは、最も好ましい凝集剤として機能する。
【0047】
「不純物」及び「混入物」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、目的の免疫グロブリンとは異なる任意の物質を指す。例としては、細胞培養培地成分、細胞破片、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、ウイルス、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プロセス材料からの浸出液、及びそれらの凝集体又は断片がある。また、不純物としてみなされるのは、凝集体、チャージバリアント、ミスフォールディングされた分子、又は精製対象の免疫グロブリンのフラグメントなどの生成物関連物質である。
【0048】
「沈殿」という用語は、不溶性の及び／又は不溶性状態にある不純物を指す。沈殿はサンプルの濁りをもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー媒体」という用語は、ビーズ、プレート、結晶、モノリス、膜、繊維、繊維の網目構造又は任意の他の固相の形態のクロマトグラフィー材料又は媒体として理解されなければならない。「媒体」は、直接又はスペーサーを介して、「マトリックス」と呼ばれる骨格に結合した「リガンド」と呼ばれる官能基を有する。例外は、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂で、通常はリガンドが付着していない。「媒体」という用語は、本発明の方法を、クロマトグラフィー樹脂を使用するカラムクロマトグラフィーのみに限定するものではなく、他のタイプのクロマトグラフィー、例えば、膜吸着剤を使用する膜クロマトグラフィーも含む。特に、イオン交換クロマトグラフィーでは、イオンクロマトグラフィー交換樹脂又はイオン交換クロマトグラフィー膜吸着剤の両方が本発明に含まれる。
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー媒体」という用語は、ビーズ、プレート、結晶、モノリス、膜、繊維、繊維の網目構造又は任意の他の固相の形態のクロマトグラフィー材料又は媒体として理解されなければならない。「媒体」は、直接又はスペーサーを介して、「マトリックス」と呼ばれる骨格に結合した「リガンド」と呼ばれる官能基を有する。例外は、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂で、通常はリガンドが付着していない。「媒体」という用語は、本発明の方法を、クロマトグラフィー樹脂を使用するカラムクロマトグラフィーのみに限定するものではなく、他のタイプのクロマトグラフィー、例えば、膜吸着剤を使用する膜クロマトグラフィーも含む。特に、イオン交換クロマトグラフィーでは、イオンクロマトグラフィー交換樹脂又はイオン交換クロマトグラフィー膜吸着剤の両方が本発明に含まれる。
【0049】
「樹脂」とは、タンパク質又は少なくとも１つの混入物と相互作用し得る結合官能基（リガンド）を有するマトリックスを含むビーズの形態の任意のクロマトグラフィー材料又は媒体を意味する。例外は、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂で、通常はリガンドが付着していない。樹脂は、様々なサイズのビーズとして供給され、カラムに詰められる。あるいは、プレパックカラムを購入することもできる。
【0050】
「マトリックス」又は「固相」という用語は、リガンドが付着することができる非水性マトリックスを意味する。本願で対象となるマトリックスは、概して、ガラス、セラミック、シリカ、セルロース、アガロース、メタクリレートポリマー又はポリスチレンを含むものである。
【0051】
「リガンド」とは、タンパク質又は少なくとも１つの混入物と相互作用し、「マトリックス」に共有結合している任意の官能基を意味する。
「結合モード」又は「結合及び溶出モード」という用語は、精製される免疫グロブリンを含むサンプルがクロマトグラフィー媒体に適用され、そこで免疫グロブリンがクロマトグラフィー媒体に結合するクロマトグラフィー条件を指す。したがって、免疫グロブリンはクロマトグラフィー媒体に保持されるが、サンプルの不純物は、フロースルー画分とも呼ばれる非結合画分に存在し得る。クロマトグラフィーステップが結合モードで行われる場合、免疫グロブリンがクロマトグラフィー媒体に結合した後、かつ媒体から免疫グロブリンを溶出する前に、１つ以上の洗浄ステップを行うことができる。次に、免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンが溶出され、溶出液中で得られ、これは、必要に応じて、さらなるクロマトグラフィーステップでさらに精製され得る。免疫グロブリンの溶出は、免疫グロブリンが溶出されている間、混入物が媒体に結合したままであることを可能にする選択的条件を使用して行われ得る。
「結合モード」又は「結合及び溶出モード」という用語は、精製される免疫グロブリンを含むサンプルがクロマトグラフィー媒体に適用され、そこで免疫グロブリンがクロマトグラフィー媒体に結合するクロマトグラフィー条件を指す。したがって、免疫グロブリンはクロマトグラフィー媒体に保持されるが、サンプルの不純物は、フロースルー画分とも呼ばれる非結合画分に存在し得る。クロマトグラフィーステップが結合モードで行われる場合、免疫グロブリンがクロマトグラフィー媒体に結合した後、かつ媒体から免疫グロブリンを溶出する前に、１つ以上の洗浄ステップを行うことができる。次に、免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンが溶出され、溶出液中で得られ、これは、必要に応じて、さらなるクロマトグラフィーステップでさらに精製され得る。免疫グロブリンの溶出は、免疫グロブリンが溶出されている間、混入物が媒体に結合したままであることを可能にする選択的条件を使用して行われ得る。
【0052】
「結合モード」でクロマトグラフィーステップを行うことは、必ずしも目的の免疫グロブリンの１００％が結合することを意味するわけではない。本発明の文脈において、「クロマトグラフィー樹脂に結合した」又は「クロマトグラフィー媒体に結合した」とは、樹脂又は媒体に、免疫グロブリンの少なくとも５０％が結合し、好ましくは免疫グロブリンの少なくとも７５％が結合し、より好ましくは少なくとも免疫グロブリンの８５％が結合し、最も好ましくは免疫グロブリンの９５％以上が結合することを意味する。
【0053】
本発明の文脈において、キャプチャークロマトグラフィーステップ及び中間陽イオン交換クロマトグラフィーステップは両方とも結合モードで行われ、キャプチャーステップは、結合モードで行われる第１のクロマトグラフィーステップと見なされることが理解される。本発明の最終ポリッシング混合モードクロマトグラフィーステップは、結合及び溶出モード又はフロースルーモードのいずれかで行われる。さらに、混合モードクロマトグラフィーの代わりに、フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィーを最終ポリッシングステップとして使用できることが理解される。
【0054】
「フロースルーモード」という用語は、目的の免疫グロブリンを含むサンプルがクロマトグラフィー樹脂又は媒体に適用され、そこでは免疫グロブリンはクロマトグラフィー樹脂に結合せず、主に、樹脂又は培地に結合しない画分に存在するため、フロースルーに含まれるクロマトグラフィー条件を指す。本発明の開発された中間クロマトグラフィーは、フロースルーモードを使用しない。しかしながら、本発明の方法は、フロースルーモードでの追加のポリッシングクロマトグラフィーによって補足することができる。このモードでは、不純物が樹脂又は媒体に結合することができる。
【0055】
「洗浄ステップ」は、サンプルがクロマトグラフィーカラムにロードされた後であるが、タンパク質がカラムから溶出される前に、結合モードのクロマトグラフィーで行われるステップである。洗浄ステップはさらに、樹脂から目的の免疫グロブリンをあまり溶出させることなく、マトリックス、免疫グロブリン、及び／又はリガンドにより弱く又は非特異的に結合した混入物を除去する。洗浄ステップでは、樹脂を所望の洗浄バッファーで洗浄する（例えば、カラムの出口で測定されるＵＶ吸収がベースラインに戻るまで、洗浄バッファーをクロマトグラフィーカラムに通す）。
【0056】
「溶出」という用語は、バッファー成分がクロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位に対して目的の分子と競合するように溶液条件を変えることによって、クロマトグラフィー樹脂から目的の免疫グロブリンを脱着させるプロセスとして理解される。例えばプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーでは、別の溶出モードが生じる。この場合、溶出バッファーはリガンド又は免疫グロブリンのコンフォメーションを変化させ、それによって結合を緩める可能性がある。移動相の緩衝イオンがイオン交換樹脂の荷電イオン部位に対して分子と競合するように、イオン交換材料を取り巻くバッファーのイオン強度を変えることによって、目的の免疫グロブリンがイオン交換樹脂から溶出され得る。あるいは、ｐＨの変化は両性タンパク質に影響を及ぼし、タンパク質のｐＩを超えるｐＨの上昇は、以降、陽イオン交換樹脂への結合を防ぎ、タンパク質が溶出する。ｐＨがタンパク質のｐＩ未満に低下すると、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂でも同じ効果が生じる。理解されるように、本明細書における「溶出」という用語は、先行する洗浄ステップの有無にかかわらず、アイソクラティック溶出、シングルステップ溶出、及びグラジエント溶出を含む。目的の免疫グロブリンの溶出は、移動相のイオン強度又は導電率を上げることによって行うことができ、これは、緩衝液中の塩濃度の増加によって影響を受ける。あるいは、ｐＨ値の上昇又は低下が適切であり得る。不連続なステップ勾配、線形勾配、非線形勾配、又はそのような勾配の適切な組み合わせを使用することができる。
【0057】
洗浄及び溶出に適したバッファーは、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、トリス－ＨＣｌ、トリス－酢酸塩、トリス－グリシン、リン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＰＨＥＰＥＳ、ビストリス、グリシン、及び、リン酸塩、硫酸塩、又は塩化物（例えばＮａＣｌやＫＣ１）などの塩を添加した他の適切な緩衝液から選択できる。溶出が達成されるイオン強度及び塩濃度は、緩衝液のｐＨ値とタンパク質のｐＩに依存する。洗浄バッファーは、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、溶媒（例えば、ヘキシレングリコール、イソプロパノール、又はエタノール）、又はポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）をさらに含み得る。さらに、洗浄バッファーは、カオトロピック試薬（例えば、尿素又はアルギニン）及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含み得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、「バッファー」という用語は、酸塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液を指す。
「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示すそれらのフラグメントであり得る。天然に存在する抗体は、様々な構造を持つ分子である。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合によって連結された２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖で構成されている。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖には可変ドメイン（ＶＨ）があり、これは可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインと呼ばれ、その後に３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖には可変軽鎖（ＶＬ）があり、これは可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てられる。
「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示すそれらのフラグメントであり得る。天然に存在する抗体は、様々な構造を持つ分子である。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合によって連結された２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖で構成されている。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖には可変ドメイン（ＶＨ）があり、これは可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインと呼ばれ、その後に３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖には可変軽鎖（ＶＬ）があり、これは可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てられる。
【0059】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、大抵はその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子；ダイアボディ；線状抗体；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。
【0060】
好ましくは、免疫グロブリンはモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生的突然変異を除いて同一である。通常、異なる決定基（エピトープ）に指向性を有する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向性を有する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【0061】
免疫グロブリンは、マウスクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ、ヒトクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ又はＩｇＥ、又はそれらの組み合わせ又はフラグメントであり得る。
【0062】
免疫グロブリンは、以下の抗原を含むがこれらに限定されないタンパク質のいずれか１つ又は組み合わせを認識し得る：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＩＬ２３ａ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ－β、及びそれらのアナログ、ＰＬＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－ｐ１、ＥＧＦ受容体、ＰＬＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、血小板受容体ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、トロンボポエイチン受容体、アポトーシス受容体ＰＤ－１、肝細胞増殖因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子ＢＬｙＳ、Ｔ細胞活性化レギュレーターＣＴＬＡ－４、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ－２、患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺、及び／又は腎臓のがん細胞及び／又はメラノーマ、グリオーマ、又は神経芽細胞腫細胞で発現するがん関連エピトープ又はタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ－４、Ｂ２インテグリン、α４β１及びα４β７インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ－α、接着分子ＶＡＰ－１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩｌｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、スクレロスチン、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆｃ－ｙ－１受容体、ＨＬＡ－ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、Ｌ－セレクチン、カリクレイン、キリン、及びＩＦＮ－γ。
【0063】
免疫グロブリンは、例えば、アフェリモマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブ、アデュカヌマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アニフロルマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ボコジズマブ、ブラジクマブ、ブレンツキシマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、カナキヌマブ、カプラシズマブ、カプロマブ、セミプリマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、クレノリキシマブ、クラウディキシマブ、クリザリズマブ、デクリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エミシズマブ、エプティネズマブ、エレヌマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、フレマネズマブ、フォラビルマブ、ガルカネズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イブリツモマブ、イムシロマブ、イダルシズマブ、イネビリズマブ、インフリキシマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、イクセキズマブ、ケリキシマブ、ラナデルマブ、レブリキズマブ、レキサツムマブ、マブリリムマブ、メポリズマブ、ミリキズマブ、モガムリズマブ、モスネツズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ポラツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラブリズマブ、レスチズマブ、リサンキズマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、ロバルピツズマブ、サシツズマブ、サリルマブ、サトラリズマブ、セクキヌマブ、シルクマブ、タネクマブ、テゼペルマブ、テゾリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスズマブ、トレメリムマブ、ウブリツキシマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブであり得る。
【0064】
本発明の免疫グロブリンは、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子などのＩｇＧ分子である。より好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。さらにより好ましくは、免疫グロブリンは、少なくともＦｃ部分がヒトであるＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。免疫グロブリンは、ＩｇＧ１のＦｃ部分がヒトであるマウス－ヒトキメラＩｇＧ１であり得る。最も好ましくは、キメラ免疫グロブリンはリツキシマブ又はインフリキシマブである。
【0065】
リツキシマブはキメラ抗ＣＤ２０抗体であり、例えば、国際公開第９４１１０２６号に詳細に記載されている。
インフリキシマブはキメラ抗ＴＮＦα抗体であり、例えば、国際公開第９２１６５５３号に詳細に記載されている。
インフリキシマブはキメラ抗ＴＮＦα抗体であり、例えば、国際公開第９２１６５５３号に詳細に記載されている。
【0066】
免疫グロブリンは、マウスプロジェニターからのヒト化ＩｇＧ１であり得る。最も好ましくは、ヒト化抗体はトラスツズマブ又はベバシズマブである。
トラスツズマブは、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体であり、例えば、国際公開第９２２２６５３号に詳細に記載されている。
トラスツズマブは、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体であり、例えば、国際公開第９２２２６５３号に詳細に記載されている。
【0067】
ベバシズマブは、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であり、例えば、国際公開第９８４５３３１号に詳細に記載されている。
免疫グロブリンは、完全ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体であり得る。最も好ましくは、ヒト抗体は、アダリムマブ（ＩｇＧ１）又はデノスマブ（ＩｇＧ２）である。
免疫グロブリンは、完全ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体であり得る。最も好ましくは、ヒト抗体は、アダリムマブ（ＩｇＧ１）又はデノスマブ（ＩｇＧ２）である。
【0068】
アダリムマブは、ヒト抗ＴＮＦα抗体であり、例えば、国際公開第９７２９１３１号に詳細に記載されている。
デノスマブは、ヒト抗ＲＡＮＫＬ抗体であり、例えば、国際公開第０３００２７１３号に詳細に記載されている。
デノスマブは、ヒト抗ＲＡＮＫＬ抗体であり、例えば、国際公開第０３００２７１３号に詳細に記載されている。
【0069】
一実施形態では、免疫グロブリンは、ベバシズマブ、トラスツズマブ、又はデノスマブである。
本願でのモノクローナル抗体は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び／又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを具体的に含む。
本願でのモノクローナル抗体は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び／又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを具体的に含む。
【0070】
さらに、本願におけるモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体も含む。そのような抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」によって得られ、動物免疫グロブリンに由来する最小限の配列のみを含む。分子のほとんどはヒトの配列である。ヒトレシピエント抗体の超可変領域からの残基は、所望の結合特性を有する非ヒトドナー抗体の超可変領域からの残基によって置き換えられる。
【0071】
最後に、本願におけるモノクローナル抗体はまた、完全ヒト抗体を含み、これは、ヒト抗体遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得られ得る。
好ましい実施形態では、サンプルは、組換えＣＨＯ細胞培養から得られる細胞培養液に由来する。好ましくは、細胞培養液は、増殖期の組換え細胞培養物から得られる。
好ましい実施形態では、サンプルは、組換えＣＨＯ細胞培養から得られる細胞培養液に由来する。好ましくは、細胞培養液は、増殖期の組換え細胞培養物から得られる。
【0072】
本発明の方法は、小規模及び大規模での免疫グロブリン精製に使用することができる。好ましくは、この方法は大規模に実施される。
「小規模」は「実験室規模」とも呼ばれ、５０ｇ未満の免疫グロブリン、１０ｇ未満の免疫グロブリン、又は１ｇ未満の免疫グロブリンを含むサンプルの精製を指す。「小規模」はまた、キャプチャーステップのカラムから溶出されたタンパク質が、５０ｇ未満の免疫グロブリン、１０ｇ未満の免疫グロブリン、又は１ｇ未満の免疫グロブリンに達する精製プロセスを指す。
「小規模」は「実験室規模」とも呼ばれ、５０ｇ未満の免疫グロブリン、１０ｇ未満の免疫グロブリン、又は１ｇ未満の免疫グロブリンを含むサンプルの精製を指す。「小規模」はまた、キャプチャーステップのカラムから溶出されたタンパク質が、５０ｇ未満の免疫グロブリン、１０ｇ未満の免疫グロブリン、又は１ｇ未満の免疫グロブリンに達する精製プロセスを指す。
【0073】
「大規模」は、「生産規模」又は「製造規模」又は「商業規模」とも呼ばれ、５０ｇを超える免疫グロブリン、１００ｇを超える免疫グロブリン、２００ｇを超える免疫グロブリン又は３００ｇを超える免疫グロブリンを含むサンプルの精製を指す。「大規模」はまた、キャプチャーステップのカラムから溶出されたタンパク質が、５０ｇを超える免疫グロブリン、１００ｇを超える免疫グロブリン、２００ｇを超える免疫グロブリン、又は３００ｇを超える免疫グロブリンに達する精製プロセスを指す。
【0074】
「さらなる処理ステップ」という用語は、濾過、透析、ウイルス不活化、希釈、濃縮、ｐＨの調整、導電率の調整、中間クロマトグラフィーステップ又は任意の目的のホールドステップなどの、タンパク質精製プロトコルにおいて一般的に適用される任意のステップを指す。さらなる処理ステップは、本発明のすべてのクロマトグラフィーステップの間で適用することができる。中間クロマトグラフィーステップは、任意のクロマトグラフィーステップの間で適用することができる。特に、「さらなる処理ステップ」という用語は、キャプチャークロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーとの間に適用される中間クロマトグラフィーステップを指す。中間クロマトグラフィーステップは、任意のモードで任意のクロマトグラフィー媒体を用いて実施することができる。中間クロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィー及び膜クロマトグラフィーを含む任意のクロマトグラフィータイプを使用することができる。
【0075】
さらなる中間ステップ又はポリッシングステップとして、他のクロマトグラフィータイプも使用することができる。例えば、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及び陰イオン交換膜クロマトグラフィーをポリッシングステップとして使用することができ、最も好ましいのはフロースルーモードである。別の可能性は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、特に結合モードのセラミックヒドロキシアパタイトを適用することである。
【0076】
本発明の第１の態様は、細胞培養液からの免疫グロブリンのキャプチャーアフィニティークロマトグラフィーの過程での沈殿を防止する方法を指し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【0077】
プレクリーニングステップ：凝集
本発明につながる実験において、無細胞採取材料（清澄化された上清）は、精製される免疫グロブリンとともに、捕捉樹脂に強く結合するいくつかの物質を依然として含むことが確認された。これは、樹脂の再利用と、捕捉樹脂からの溶出後の免疫グロブリンの品質に影響する。これは、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく追加のプレクリーニングクロマトグラフィーによって改善できる可能性がある（国際公開第２０１５１３５８８４号）。ＨＣＤＮＡ及びＨＣＰレベルの著しい低下にもかかわらず、さらなる改善が依然として求められていた。プロテインＡ溶出液は依然として濁る傾向があり、これは免疫グロブリン自体ではなく不純物によって引き起こされることが確認された。溶出に必要な低ｐＨ、不純物の相対量、及び高タンパク質濃度が濁りを促進する。濁った溶出プールに加えて、カラム背圧の増加が確認された。粘度の増加がこれを最もよく説明している。さらに、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、混入物の非常に高い負荷のために比較的大きいサイズが求められるため、歓迎されないコスト要因である。後者は、より高いｍａｂ力価、したがって経済的生産に必要な発酵時間の延長によって強化される。陰イオン交換樹脂のフィルター効果は主に負に帯電した分子の保持に限定され、濁りの原因となる不純物の一部は依然としてすり抜けるため、より簡素でより効果的なキャプチャープレクリーニング戦略が求められていた。本発明の結果によれば、適切なプレクリーニング凝集法の挿入は、驚くべきことに、採取された培養液の迅速かつ簡単な精製のための良好な解決策を表す。開発された凝集法は、さらに不純物を除去することにより、サンプルの純度を向上させ、捕捉媒体の低ｐＨ溶出中の濁りを促進する重大な汚染を減らし、高価なアフィニティーカラムを保護する。本発明の凝集方法は、簡素、迅速であり、生成物の損失がなく、そして手頃な価格である。さらに、凝集方法は、（ｉ）細胞が細胞培養液から除去される前、つまり細胞の存在下、又は（ｉｉ）細胞が細胞培養液から除去された後、つまり細胞の非存在下のいずれでも実施できることが判明した。プロテインＡステップの前後の免疫グロブリンの純度は、両方の方法で同等である。前者の方法では、細胞を含む凝集物質も遠心分離によって分離され、上清は濾過トレインによってさらに清澄化される。後者の方法では、細胞は遠心分離によって沈殿し、上清が凝集を受ける。次に、濾過トレインが凝集した物質を除去する。最も単純なモードの濾過トレインは、深層フィルターで構成されている。しかしながら、より好ましいのは、直列の深層フィルター及びマイクロフィルターである。スケールアップからフルスケール生産への過程で、細胞分離後の凝集が最善の方法であることが判明した。凝集が細胞培養物で直接行われた場合、発酵槽及びセパレータからの全細胞塊を含むフロックの除去には非常に時間がかかった。
本発明につながる実験において、無細胞採取材料（清澄化された上清）は、精製される免疫グロブリンとともに、捕捉樹脂に強く結合するいくつかの物質を依然として含むことが確認された。これは、樹脂の再利用と、捕捉樹脂からの溶出後の免疫グロブリンの品質に影響する。これは、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーに基づく追加のプレクリーニングクロマトグラフィーによって改善できる可能性がある（国際公開第２０１５１３５８８４号）。ＨＣＤＮＡ及びＨＣＰレベルの著しい低下にもかかわらず、さらなる改善が依然として求められていた。プロテインＡ溶出液は依然として濁る傾向があり、これは免疫グロブリン自体ではなく不純物によって引き起こされることが確認された。溶出に必要な低ｐＨ、不純物の相対量、及び高タンパク質濃度が濁りを促進する。濁った溶出プールに加えて、カラム背圧の増加が確認された。粘度の増加がこれを最もよく説明している。さらに、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、混入物の非常に高い負荷のために比較的大きいサイズが求められるため、歓迎されないコスト要因である。後者は、より高いｍａｂ力価、したがって経済的生産に必要な発酵時間の延長によって強化される。陰イオン交換樹脂のフィルター効果は主に負に帯電した分子の保持に限定され、濁りの原因となる不純物の一部は依然としてすり抜けるため、より簡素でより効果的なキャプチャープレクリーニング戦略が求められていた。本発明の結果によれば、適切なプレクリーニング凝集法の挿入は、驚くべきことに、採取された培養液の迅速かつ簡単な精製のための良好な解決策を表す。開発された凝集法は、さらに不純物を除去することにより、サンプルの純度を向上させ、捕捉媒体の低ｐＨ溶出中の濁りを促進する重大な汚染を減らし、高価なアフィニティーカラムを保護する。本発明の凝集方法は、簡素、迅速であり、生成物の損失がなく、そして手頃な価格である。さらに、凝集方法は、（ｉ）細胞が細胞培養液から除去される前、つまり細胞の存在下、又は（ｉｉ）細胞が細胞培養液から除去された後、つまり細胞の非存在下のいずれでも実施できることが判明した。プロテインＡステップの前後の免疫グロブリンの純度は、両方の方法で同等である。前者の方法では、細胞を含む凝集物質も遠心分離によって分離され、上清は濾過トレインによってさらに清澄化される。後者の方法では、細胞は遠心分離によって沈殿し、上清が凝集を受ける。次に、濾過トレインが凝集した物質を除去する。最も単純なモードの濾過トレインは、深層フィルターで構成されている。しかしながら、より好ましいのは、直列の深層フィルター及びマイクロフィルターである。スケールアップからフルスケール生産への過程で、細胞分離後の凝集が最善の方法であることが判明した。凝集が細胞培養物で直接行われた場合、発酵槽及びセパレータからの全細胞塊を含むフロックの除去には非常に時間がかかった。
【0078】
様々な凝集剤を使用する多数の異なる凝集方法が知られており、モノクローナル抗体を発現する哺乳類細胞培養物の清澄化に効果的であることが実験的に証明された。ほとんどの方法は、物質の組み合わせ及び／又は培養液のｐＨ適応などのさらなる操作を必要とする。さらに、公開されている多くの方法では、遠心分離ステップの代わりに凝集を利用している。対照的に、本発明は培養液を最適に清澄化するために、１）遠心分離又は濾過による細胞分離、２）凝集、及び３）深層濾過の３つの方法を、この順に組み合わせている。
【0079】
培養液のｐＨが精製する抗体のｐＩ未満の場合、抗体は正味の正電荷を帯びる。これらの条件下では、カチオン性電解質が不純物、残留細胞及び細胞破片を凝集又は沈殿させ、抗体を溶液中に残すことができる。次に、フロックを、遠心分離及び／又は深層濾過、任意選択でさらに精密濾過によって除去することができる。
【0080】
本発明は、凝集を誘導するために、二価金属イオン、水溶性有機ポリマー、又は水不溶性有機ポリマーなどの単一のカチオン性化合物を利用する。本発明の凝集ステップを実施するために、刺激応答性ポリマー又は塩などのさらなる物質は必要ない。同様に、本発明の凝集方法は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく実施される。
【0081】
「以下の順序で」という用語は、言及されたプロセスステップが挙げられた順序で行われることを意味すると理解されるべきである。挙げられたプロセスステップの前、後、及び間に、さらなるプロセスステップを組み込むことができる。
【0082】
クロマトグラフィー媒体は、使い捨てでもよいし、再利用可能なものでもよい。一実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は再利用可能である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のクロマトグラフィー樹脂は再利用可能である。
【0083】
再利用可能なクロマトグラフィー媒体は、使い捨て用に構成されたクロマトグラフィー媒体と比較して費用効果が高い。特に、キャプチャークロマトグラフィーには、大量のクロマトグラフィー媒体が使用される。したがって、再利用可能なクロマトグラフィー媒体、例えば、キャプチャーステップのために頻繁に再利用可能なアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用することは特に有利である。本発明のプレクリーニングステップの使用は、高価なアフィニティーキャプチャーカラムのある種のダウンスケーリングを可能にし、寿命を延ばし、したがって、商品の全体的なコストを削減する。
【0084】
本明細書で使用される「再利用可能」という用語は、媒体又は樹脂が、複数の精製サイクル、すなわち、少なくとも２、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００又はそれ以上の精製サイクルで再利用されるように構成されていることを意味する。各サイクルの間に、クロマトグラフィー媒体又は樹脂は、洗浄及び／又は再生及び／又は滅菌及び／又は保存され得る。
【0085】
好ましい実施形態では、凝集剤として使用されるカチオン性化合物は、二価金属イオン塩、水溶性有機ポリマー、及び水不溶性有機ポリマーから選択される。より好ましいのは水溶性有機ポリマーである。
【0086】
二価金属イオン塩は、例えば、ＣａＣｌ２であり得る。水溶性有機ポリマーは、例えば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）であり得る。水不溶性有機ポリマーは、例えばキトサンであり得る。さらにより好ましくは、凝集剤はポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）である。
【0087】
一実施形態では、水溶性有機ポリマーは、０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０２～０．１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０２５～０．０９０％（ｗ／ｖ）の最終濃度で適用される。好ましい実施形態では、水溶性有機ポリマーは、０．０３７５～０．０７５％（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加される。さらに好ましい実施形態では、水溶性有機ポリマーは、０．０１５～０．０５％（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加される。
【0088】
好ましい実施形態では、凝集を誘導するために使用される水溶性有機ポリマーは、１０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子質量を有するポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）である。別の好ましい実施形態において、凝集ステップは、撹拌下、室温で、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、又は少なくとも２０分間、好ましくは少なくとも３０分間行われる。本発明における室温とは、１５～２５℃、２０～２５℃、好ましくは１８～２２℃を意味する。撹拌とは、適切な機械的装置を使用した連続的なアジテーション及び／又は撹拌を意味する。
【0089】
さらに好ましい実施形態では、凝集を誘導するために培養液に添加されるポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）出発溶液は、５～１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは９～１１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。最も好ましいのは、中性ｐＨであり、塩化ジアリルアンモニウムが０．１％未満であり、微生物数が１０ＣＦＵ／ｍｌ未満であり、塩化ナトリウムを含まない溶液である。
【0090】
本発明の一実施形態では、凝集ステップは、培養期間の終わりに凝集剤を発酵槽に直接加えることによって細胞が細胞培養液から除去される前に行われる。言い換えれば、そのような実施形態では、凝集ステップの前に、さらなる遠心分離及び／又は濾過ステップは行われない。次に、細胞を含むフロックは、遠心分離機、好ましくは大容量に適したディスクスタック遠心分離機での沈降によって除去される。得られた上清は、深層濾過、任意選択でさらに精密濾過によって、より清澄化することができる。
【0091】
他の実施形態では、ステップ（ａ）は、以下のステップを含む：
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；及び
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること。
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；及び
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること。
【0092】
換言すれば、凝集ステップは、遠心分離及び／又は濾過ステップが行われた後、凝集剤を上清に添加することによって細胞培養液から細胞が除去された後に行われる。
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ２）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ２）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【0093】
好ましくは、ステップ（ａ２）のフロックは、深層濾過により、任意選択でその後精密濾過により除去される。
好ましくは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を除いて、凝集を実施するためのさらなる物質は添加されない。換言すれば、ステップ（ａ）において、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）以外にさらなる凝集誘導化合物は添加されない。
好ましくは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を除いて、凝集を実施するためのさらなる物質は添加されない。換言すれば、ステップ（ａ）において、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）以外にさらなる凝集誘導化合物は添加されない。
【0094】
好ましくは、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる。これは、アフィニティークロマトグラフィーの前の凝集ステップ及び次の濾過ステップ、特に凝集ステップ（ａ２）では、ｐＨ又は導電率が調整されないことを意味する。
【0095】
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ２）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること、
ここで、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を除き、凝集を行うためのさらなる物質は添加されず、
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる。
（ａ１）細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
（ａ２）ステップ（ａ１）で得られた上清又は濾液に凝集誘導化合物を添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ２）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること、
ここで、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を除き、凝集を行うためのさらなる物質は添加されず、
ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）による凝集は、ｐＨ又は導電率をさらに調整することなく行われる。
【0096】
アフィニティーキャプチャークロマトグラフィーステップ：プロテインＡクロマトグラフィー
「キャプチャーステップ」という用語は、結合モードで実施される第１のクロマトグラフィーステップとして理解される。培養液から免疫グロブリンを精製するためのキャプチャーステップは、通常、アフィニティークロマトグラフィーステップとして行われる。プロテインＡ又はその誘導体又はアナログは、主にアフィニティーキャプチャーとして使用される。本発明によれば、アフィニティークロマトグラフィーを使用したところ、免疫グロブリンの捕捉に成功した。本発明の「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、リガンドと免疫グロブリンとの間の非常に特異的な相互作用に基づいて、培養液から免疫グロブリンを選択的に結合させる方法を意味する。
「キャプチャーステップ」という用語は、結合モードで実施される第１のクロマトグラフィーステップとして理解される。培養液から免疫グロブリンを精製するためのキャプチャーステップは、通常、アフィニティークロマトグラフィーステップとして行われる。プロテインＡ又はその誘導体又はアナログは、主にアフィニティーキャプチャーとして使用される。本発明によれば、アフィニティークロマトグラフィーを使用したところ、免疫グロブリンの捕捉に成功した。本発明の「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、リガンドと免疫グロブリンとの間の非常に特異的な相互作用に基づいて、培養液から免疫グロブリンを選択的に結合させる方法を意味する。
【0097】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチドアフィニティークロマトグラフィー」という用語は、リガンドとして、微生物起源（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカスマグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ））の組換えタンパク質又はそれらに由来する変異体、又は免疫グロブリンに結合する能力を有する微生物起源のものであってもよい合成ペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーを指す。例示的な免疫グロブリン結合タンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、又はプロテインＡ／Ｇであり得る。この微生物起源の結合タンパク質に加えて、ＦｃガンマＡ受容体に由来するタンパク質又はペプチド（ＦｃＲ－ＩＩＩＡ）も例示的な親和性リガンドである。好ましくは、免疫グロブリン結合タンパク質又はペプチドはプロテインＡである。リガンドは、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインのうちの１つ以上を含み得る。より好ましくは、リガンドは、プロテインＡのドメインＢ又は改変されたプロテインＺを含む。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて組換え技術により産生された１４ｋＤペプチドをリガンドとして使用する例示的な樹脂は、ＩｇＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。このリガンドについてこれ以上の情報は入手できないが、ヒトＩｇＧ－Ｆｃのすべてのサブクラスへの高い親和性のために特別に設計された。
【0098】
プレクリーニング凝集ステップ後のキャプチャーステップとしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップを使用することにより、本発明の方法は、免疫グロブリンの精製におけるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの顕著な結合特異性を利用しながら、費用効果の高い免疫グロブリン精製方法を提供する。
【0099】
好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をプロテインＡクロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してプロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をプロテインＡクロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してプロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【0100】
好ましい実施形態では、キャプチャーステップに使用されるプロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、高度に架橋されたアガロースに結合した、アルカリ耐性プロテインＡ誘導体をリガンドとして含む。より好ましい実施形態では、アルカリ耐性プロテインＡ誘導体は、プロテインＡのドメインＢのアルカリ安定化四量体バリアントである。
【0101】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂を過酷なクリーニング条件に対してより耐性にし、実施の合間の（ｉｎｔｅｒ－ｒｕｎ）相互汚染効果に対する保護を提供するために、アルカリ耐性、高い結合能力、及び低いリガンド漏出を確保するために特別に設計されたリガンドを有する改良されたプロテインＡアフィニティー樹脂を使用することが今日では一般的である。ただし、これらの改良された樹脂の主な欠点の１つは、従来のプロテインＡ樹脂よりも大幅にコストがかかることである。従来のプロテインＡ樹脂と、より最近の新世代のプロテインＡ樹脂製品の両方を使用できることは、本発明の方法の重要な利点である。プロテインＡ樹脂にさらされる不純物量が少ないため、穏やかな再生条件に制限されているにもかかわらず、従来の安価なプロテインＡ樹脂が許容できるようになる。しかしながら、本発明のプレクリーニングステップの結果として、及び選択されたプロテインＡ樹脂とは独立して、従来の樹脂と新世代の樹脂の両方をより長い寿命にわたって使用することができる。さらに、プロテインＡカラムのクリーニングが容易になるため、プロセスがより経済的になる。
【0102】
本発明の目的に使用できる一般的なプロテインＡ樹脂の例には、限定するものではないが、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ ＳＵＰｒＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｐｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰｒｏＳｅｐ ＨＣ、ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ、及びＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＩｇＳｅｌｅｃｔ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｒａｅｓｔｏ Ａ、Ｐｒａｅｓｔｏ ＡＰ、Ｐｒａｅｓｔｏ ＡＰｃ、Ｐｒａｅｓｔｏ Ｊｅｔｔｅｄ Ａ５０（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれ得る。
【0103】
本明細書で使用される場合、「プロテインＡ」という用語は、その天然源から回収されたプロテインＡ、合成により又は生合成により（例えば、ペプチド合成又は組換え技術によって）生成されたプロテインＡ、及びＣＨ２／ＣＨ３及び／又はＦｃ領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそのバリアントを包含する。好ましくは、高い結合能力及び／又はアルカリ安定性を有する樹脂が使用され得る。例えば、プロテインＡ、プロテインＡ誘導体、又はアルカリ安定化プロテインＡ由来の親和性媒体を使用することができる。好ましくは、アルカリ安定化プロテインＡ由来（大腸菌、出芽酵母）リガンドが使用され得る。アルカリ安定化されたプロテインＡ由来のリガンドは、高度に架橋されたアガロースマトリックスに結合することができ、好ましくは化学的に安定なチオエーテル結合で固定化され得る。一例として、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅがある。これは、最大０．５Ｍ ＮａＯＨでの実施後に迅速かつ効率的にクリーニングできる。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅのアルカリ安定化リガンドはプロテインＡのＢドメインに由来し、本質的にＶＨ３結合ドメインを欠いており、より高い溶出ｐＨを提供する。好ましい製品は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅよりも高い結合能力を有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸである。
【0104】
プロテインＡアフィニティーカラムへのサンプルロードとプロテインＡカラムからの免疫グロブリンの溶出との間に、特別な洗浄バッファーを使用する１つ又は複数の洗浄ステップを含めてもよい。洗浄バッファーは、プロテインＡに結合した目的の免疫グロブリンをあまり大量に除去することなくプロテインＡ樹脂から不純物を除去するために使用されるバッファーである。洗浄緩衝液は、塩及び界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩及び溶媒（例えば、ヘキシレングリコール）；高濃度の塩（例えば、高モル濃度のトリス緩衝液）；又は塩及びポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を含み得る。さらに、洗浄バッファーは、カオトロピック試薬（例えば、尿素又はアルギニン）及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含み得る。最後に、洗浄バッファーは、ローディングバッファーとしてより低いｐＨ及び／又は溶出バッファーとしてより高いｐＨを有し得る。
【0105】
プロテインＡカラムから目的の免疫グロブリンを溶出するために、溶出バッファーが適用される。好ましくは、溶出バッファーは低いｐＨを有することで、タンパク質のコンフォメーションを変化させることにより、プロテインＡと目的の免疫グロブリンとの間の相互作用を破壊する。好ましくは、低ｐＨ溶出バッファーは、約２～約５の範囲、最も好ましくは約３～約４の範囲のｐＨを有する。この範囲内でｐＨを制御するバッファーの例には、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシンバッファー、及びアンモニウムバッファー、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。
【0106】
そのような好ましいバッファーはクエン酸バッファー及び酢酸バッファー、最も好ましくはクエン酸ナトリウムバッファー又は酢酸ナトリウムバッファーである。高ｐＨバッファー（例えば、９以上のｐＨを有するもの）又は目的の免疫グロブリンを溶出するためのＭｇＣｌ２（２ｍＭ）などの化合物又は組成物を含むバッファーを含む、他の溶出バッファーも企図される。
【0107】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、０．１～０．５ＮａＯＨを用いて、好ましくはカラム内で再生され得る（定置洗浄）。
中間／ポリッシングクロマトグラフィーステップ：陽イオン交換クロマトグラフィー
本明細書に記載の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップをさらに含み得る。
中間／ポリッシングクロマトグラフィーステップ：陽イオン交換クロマトグラフィー
本明細書に記載の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップをさらに含み得る。
【0108】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、サンプル中のタンパク質と樹脂に固定化された電荷との間の電荷－電荷相互作用に依存している。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、結合させる分子は正に帯電し、固定化された官能基（リガンド）は負に帯電している。一般的に使用される陽イオン交換樹脂は、Ｓ樹脂（スルホナート）、ＳＰ樹脂（スルホプロピル）、ＳｉＢ樹脂（スルホイソブチル）、ＳＥ樹脂（スルホエチル）、及びＣＭ樹脂（カルボキシメチル）である。
【0109】
しかしながら、全般的には、陽イオン交換クロマトグラフィーステップは、すべての一般的な市販の陽イオン交換樹脂又は膜を使用して行うことができる。陽イオン交換樹脂は、官能基、例えば、スルホン酸が固定されたプレパックカラム又は膜の形態で使用することができる。あるいは、樹脂をバルク材料として購入し、ユーザがカラムに詰めることもできる。カラムの容量や寸法には、通常とは異なる特別な制限はない。陽イオン交換樹脂の量及び使用されるカラムのサイズは当業者に知られている。これは、プロセスの全体的な規模によって異なる。
【0110】
典型的な市販品には、例えば、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｓ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｓ４０、Ｎｕｖｉａ Ｓ、及びＮｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ６５０Ｆ、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｒｏＲｅｓ Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ドイツ）、Ｂｉｏｓｅｐｒａ ＣＭ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｓ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｅｒａｔｉｏｎ、米国ニューヨーク州）、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｓ、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ Ｓ７５（ＹＭＣ 欧州）、Ｐｒａｅｓｔｏ ＳＰ、Ｐｒａｅｓｔｏ Ｊｅｔｔｅｄ ＳＰ３５（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、欧州）、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、及びＳｏｕｒｃｅ Ｓ（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ）が含まれる。
【0111】
一般的に、陽イオン交換クロマトグラフィーは、４～７のｐＨ値のバッファーを使用して行われる。
本発明の好ましい陽イオン交換樹脂は、スルホン酸、スルホプロピル、又はスルホイソブチルリガンドを使用する強陽イオン交換樹脂である。最も好ましいのは、高度に架橋されたアガロース（例えば、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ）、又はポリ（スチレンビニルベンゼン）（例えば、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ）、又はポリメタクリラート（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｓ０３）などの硬いマトリックスに連結されたスルホン酸又はスルホプロピルリガンドである。最も好ましい陽イオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）マトリックスに結合したスルホプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３ －）リガンドを有するＰｏｒｏｓ ＨＳ ５０である。
本発明の好ましい陽イオン交換樹脂は、スルホン酸、スルホプロピル、又はスルホイソブチルリガンドを使用する強陽イオン交換樹脂である。最も好ましいのは、高度に架橋されたアガロース（例えば、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ）、又はポリ（スチレンビニルベンゼン）（例えば、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ）、又はポリメタクリラート（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｓ０３）などの硬いマトリックスに連結されたスルホン酸又はスルホプロピルリガンドである。最も好ましい陽イオン交換樹脂は、架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）マトリックスに結合したスルホプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３ －）リガンドを有するＰｏｒｏｓ ＨＳ ５０である。
【0112】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、約ｐＨ４～約ｐＨ８のｐＨを有するバッファーで平衡化することができる。バッファー濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭの範囲、好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭの範囲であり得る。
【0113】
陽イオン交換クロマトグラフィーに使用されるバッファーの例は、クエン酸、乳酸、コハク酸、ギ酸、ブタン二酸、酢酸、マロン酸、グリシン、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、ビストリス、又はそれらの混合物である。
【0114】
陽イオン交換クロマトグラフィーステップは、免疫グロブリンのチャージバリアントを分離し、残留宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、凝集体、フラグメント、ウイルス、エンドトキシン、凝集剤、及び浸出プロテインＡを枯渇させることができる。
【0115】
免疫グロブリンは、免疫グロブリンの等電点（ｐＩ）より低いｐＨ値及び低い導電率で樹脂に結合し得る。
タンパク質の等電点すなわちｐＩは、タンパク質の正味の全体電荷がゼロに等しいｐＨ、つまりタンパク質の正電荷と負電荷の数が等しいｐＨを指す。ｐＩの決定は、等電点電気泳動などの従来技術で確立された技術に従って達成することができる。
タンパク質の等電点すなわちｐＩは、タンパク質の正味の全体電荷がゼロに等しいｐＨ、つまりタンパク質の正電荷と負電荷の数が等しいｐＨを指す。ｐＩの決定は、等電点電気泳動などの従来技術で確立された技術に従って達成することができる。
【0116】
低い導電率とは、２ｍＳ／ｃｍ未満であることを意味する。
溶出には、シングルステップ又はグラジエントのいずれかによって提供される溶出バッファーのイオン強度の増加を使用することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出に使用される例示的な塩は、塩化物塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、又は酢酸塩である。好ましくは、ＮａＣｌ又はＫＣｌが使用される。イオン強度は最大１Ｍまで上げることができる。
溶出には、シングルステップ又はグラジエントのいずれかによって提供される溶出バッファーのイオン強度の増加を使用することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出に使用される例示的な塩は、塩化物塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、又は酢酸塩である。好ましくは、ＮａＣｌ又はＫＣｌが使用される。イオン強度は最大１Ｍまで上げることができる。
【0117】
あるいは、シングルステップ又はグラジエントのいずれかによって提供される、溶出バッファーのｐＨの増加を使用することができる。
陽イオン交換クロマトグラフィーの性能のための好ましい実施形態は、４～６の間のｐＨ作業範囲、より好ましくは、４．５～５．５の間のｐＨ範囲である。緩衝物質としては炭酸又はアミノ酸のいずれを使用することもでき、クエン酸又はグリシンが最も好ましい。
陽イオン交換クロマトグラフィーの性能のための好ましい実施形態は、４～６の間のｐＨ作業範囲、より好ましくは、４．５～５．５の間のｐＨ範囲である。緩衝物質としては炭酸又はアミノ酸のいずれを使用することもでき、クエン酸又はグリシンが最も好ましい。
【0118】
さらに好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂に結合した免疫グロブリンの溶出は、ｐＨ値の変化、すなわち、ｐＨの増加によって行われる。これは、２つの異なる緩衝液の混合によって提供される低ｐＨから高ｐＨへの勾配によって達成することができる。低ｐＨ用のクエン酸バッファー及び高ｐＨ用のリン酸バッファーが好ましい。好ましい実施形態では、ｐＨ勾配は、約ｐＨ５～６のクエン酸バッファーを約ｐＨ７～９のリン酸バッファーと混合することによって形成される。バッファーは、１０～５０ｍＭの濃度の酸のナトリウム塩を使用することによって調製することができる。ｐＨ勾配の好ましい範囲は５．０～７．５の間である。別の好ましい実施形態では、ｐＨ勾配は、ｐＨ８．７及びｐＨ１０．５のグリシンバッファーを混合することによって形成される。任意選択で、溶出プールのｐＨを、最終的なクロマトグラフィーカラムにロードする前に、例えば酢酸で調整する。
【0119】
あるいは、シングルステップ又はグラジエントのいずれかによって提供される溶出バッファーのｐＨ及びイオン強度の両方の増加を、溶出に使用することができる。
一実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーの溶出液は、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝露される。
一実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーの溶出液は、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝露される。
【0120】
通常、プロテインＡクロマトグラフィーの溶出液は、ウイルス不活化ステップとそれに続く陽イオン交換クロマトグラフィーにさらされる。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含み得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含み得る。
【0121】
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；及び
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと。
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；及び
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと。
【0122】
陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、３～５カラム容量の１Ｍ ＮａＣｌで再生することができる。さらに、以下のステップを含む定置洗浄手順を適用することができる：（ａ）１～５カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌでの洗浄、（ｂ）１～５カラム容量の１Ｍ酢酸又はＴＦＡでの洗浄、（ｃ）再平衡化。
【0123】
ポリッシングクロマトグラフィーステップ：混合モードクロマトグラフィー
本発明の方法は、ポリッシングステップとして混合モードクロマトグラフィーステップをさらに含み得る。すなわち、それは、アフィニティークロマトグラフィーの後に続いて（単一の又はいくつかのステップのうちの１つとして）行われる。
本発明の方法は、ポリッシングステップとして混合モードクロマトグラフィーステップをさらに含み得る。すなわち、それは、アフィニティークロマトグラフィーの後に続いて（単一の又はいくつかのステップのうちの１つとして）行われる。
【0124】
混合モード媒体又は樹脂と呼ばれる媒体は、荷電疎水性イオン交換リガンド、又は、ヒドロキシアパタイト又はフルオロアパタイトなどの結晶性鉱物のいずれかからなる官能基を有するクロマトグラフィー媒体である。「混合モードクロマトグラフィー」の代わりに、「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語や、特定の手順に関連して「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー」が使用されることがある。混合モードクロマトグラフィーは、疎水性相互作用とイオン交換、又は、金属親和性相互作用とイオン交換の少なくとも２つの原理の相互作用である。混合モードクロマトグラフィーは、それぞれイオン交換や疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのシングルモードクロマトグラフィー法では再現できない、予測しにくい選択性を提供する。正に帯電した疎水性リガンドは陰イオン交換体混合モード（例えば、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）のグループに属し、負に帯電したリガンドは陽イオン交換体混合モード（例えば、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ）に属する。一部の混合モード媒体は、双性イオン特性を有する（例えば、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢｘ）。他の混合モード媒体は、イオン化可能であり、ｐＨを下げることによって非荷電から正荷電に変換する疎水性リガンドを有する（例えば、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ）。最後に、ヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイト媒体は、正に帯電したカルシウムイオン及び負に帯電したリン酸基を有することにより、より複雑な混合モード機能を有する。
【0125】
好ましい実施形態では、ポリッシングステップとして使用される混合モードクロマトグラフィーは、疎水性及び陰イオン交換機能を有する樹脂を利用する。より好ましいのは、高度に架橋されたアガロースマトリックスに結合している、正に帯電したＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンリガンドを含む混合モード樹脂である。
【0126】
いくつかの実施形態では、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；及び
（ｈ）混合モードクロマトグラフィーを行うこと。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；及び
（ｈ）混合モードクロマトグラフィーを行うこと。
【0127】
好ましくは、混合モードクロマトグラフィーステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーの後に続く。より好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーに続く混合モードクロマトグラフィーステップは、正に帯電したリガンドを含む媒体を用いて行われる。より好ましくは、正に帯電したリガンドはＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンであり、リガンドは高度に架橋されたアガロースに結合している。
【0128】
正に帯電した混合モードクロマトグラフィー樹脂を結合及び溶出モードでロードする場合、以下の条件を適用することができる：ｐＨ６～ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．０～８．５；導電率０．５～１０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは１～４ｍＳ／ｃｍ。１つ以上の洗浄ステップを使用してもよい。条件は免疫グロブリンのｐＩに依存し、目的の分離に応じて具体的に調整できる。
【0129】
ポリッシングステップ（ｄ）に使用される最も好ましい混合モード樹脂は、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）である。
結合モードでのＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの好ましいローディング条件は次のものであり得る：樹脂を０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）で平衡化する。サンプル（陽イオン交換プール）を、ｐＨ８．０～８．５及び導電率１～４ｍＳ／ｃｍに調整し、カラムにロードする。平衡化バッファー２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．２で洗浄した後、目的の免疫グロブリンが、例えば２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５～７、優先的にｐＨ５．５～６．５を用いてＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ樹脂から溶出され得る。
結合モードでのＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの好ましいローディング条件は次のものであり得る：樹脂を０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）で平衡化する。サンプル（陽イオン交換プール）を、ｐＨ８．０～８．５及び導電率１～４ｍＳ／ｃｍに調整し、カラムにロードする。平衡化バッファー２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．２で洗浄した後、目的の免疫グロブリンが、例えば２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５～７、優先的にｐＨ５．５～６．５を用いてＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ樹脂から溶出され得る。
【0130】
あるいは、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーをフロースルーモードで行うことができる。それにより、ｐＨとイオン強度は、免疫グロブリンが混合モードリガンドに結合せず、除去されるべき残留混入物（ＤＮＡ、凝集体、浸出プロテインＡ、宿主細胞タンパク質）は結合したままであるように調整する必要がある。上記条件は免疫グロブリンのｐＩに依存する。好ましくは、リン酸バッファー又はトリスバッファーは、６．５～８．５のｐＨ範囲、より好ましくはｐＨ７～８の間で使用される。導電率は、ＮａＣｌなどの塩又はバッファー濃度によって調整される。最も好ましいのは、５０～２００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌを添加した１０～５０ｍＭの濃度範囲のリン酸ナトリウムバッファーである。高塩濃度は、イオン相互作用を脱着するが、リガンドとの疎水性相互作用を促進することを考慮する必要がある。
【0131】
混合モード樹脂の再生（定置洗浄）は、例えば１０～２００ｍＭのクエン酸、０．５～２ＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭ～１ＭのＮａＯＨを使用して、低ｐＨ、高塩、及び高ｐＨで実施できる。
【0132】
好ましい再生手順は、溶液Ａ～Ｄで順番に洗浄することによって実施される：溶液Ａ：１００ｍＭクエン酸、２Ｍ ＮａＣｌ；溶液Ｂ：２Ｍ ＮａＣｌ；溶液Ｃ：１Ｍ ＮａＯＨ；溶液Ｄ：１０ｍＭ ＮａＯＨ。樹脂の貯蔵は、溶液Ｄで行うことができる。
【0133】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；及び
・強陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；及び
・正に帯電した混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、樹脂はｐＨ８～８．５のリン酸バッファーで平衡化され、免疫グロブリンは正に帯電した混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、免疫グロブリンの溶出はｐＨ５～７のリン酸バッファーで行われること。
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；及び
・強陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；及び
・正に帯電した混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、樹脂はｐＨ８～８．５のリン酸バッファーで平衡化され、免疫グロブリンは正に帯電した混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、免疫グロブリンの溶出はｐＨ５～７のリン酸バッファーで行われること。
【0134】
ポリッシングクロマトグラフィーステップ：陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明の方法は、ポリッシングステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーステップをさらに含み得る。すなわち、それは、アフィニティークロマトグラフィーの後の順序で（単一の、又はいくつかのステップのうちの１つとして）実施される。
本発明の方法は、ポリッシングステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーステップをさらに含み得る。すなわち、それは、アフィニティークロマトグラフィーの後の順序で（単一の、又はいくつかのステップのうちの１つとして）実施される。
【0135】
陰イオン交換媒体又は樹脂と呼ばれる媒体は、正に帯電したイオン交換リガンドからなる官能基を有するクロマトグラフィー媒体である。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、陰イオン交換膜を含む、強い又は弱い陰イオン交換クロマトグラフィー媒体であり得る。
【0136】
陰イオン交換クロマトグラフィーでは、結合する分子は負に帯電し、固定化された官能基（リガンド）は正に帯電する。一般的に使用される陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、Ｑ媒体（第４級アミンリガンド）、ＴＭＡＥ樹脂（トリメチルアミノエチルリガンド）、及びＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエチルリガンド）である。しかしながら、大抵の場合、陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、すべての一般的な市販の陰イオン交換媒体を用いて行うことができる。陰イオン交換媒体は、プレパックカラムの形態で、又は膜として使用できる。あるいは、樹脂をバルク材料として購入し、ユーザがカラムに詰めることもできる。カラムの容量や寸法には、通常とは異なる特別な制限はない。陽イオン交換樹脂の量及び使用されるカラムのサイズは当業者に知られている。これは、プロセスの全体的な規模によって異なる。
【0137】
特に、強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、残留不純物を除去するのに効果的であることが見出された。
好ましくは、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、第四級アンモニウム部分及びトリメチルアンモニウム部分からなる群から選択されるリガンドを含む強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体が使用される。
好ましくは、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、第四級アンモニウム部分及びトリメチルアンモニウム部分からなる群から選択されるリガンドを含む強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体が使用される。
【0138】
本発明の目的のために使用することができる典型的な強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、以下のような官能基を含む：第四アミノエチル（ＱＡＥ）部分、樹脂は、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツから入手可能）、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ ＱＡＥ（セルロースの四級アミノエチル誘導体、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州から入手可能）、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツから入手可能）などを含む；第四級アンモニウム（Ｑ）部分、樹脂は、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍＰｒｅｓ（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツから入手可能）、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）、Ｑ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ、米国ニューヨーク州から入手可能）、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア、米国）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツから入手可能）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州から入手可能）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ（ＹＭＣ 欧州）、Ｐｒａｅｓｔｏ Ｑ、Ｐｒａｅｓｔｏ Ｊｅｔｔｅｄ Ｑ３５（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、欧州）、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、ドイツ）を含むトリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）、及びトリメチルアンモニウム樹脂は、例えばＮｕｖｉａ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州から入手可能）を含む。
【0139】
より好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、高度に架橋されたアガロース（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ドイツから入手可能なＣａｐｔｏＱ）、又は同様の特性を有する媒体に結合した－Ｎ（ＣＨ３）３
＋（トリメチルアンモニウム）を有する強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して行われる強陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。
【0140】
いくつかの実施形態では、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；及び
（ｈ）陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと。
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨ値で少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；及び
（ｈ）陰イオン交換クロマトグラフィーを行うこと。
【0141】
別の好ましい実施形態は、結合モードでの陽イオン交換クロマトグラフィーステップに続くフロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、以下のステップを以下の順序で伴う方法を提供する。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、以下のステップを以下の順序で伴う方法を提供する。
【0142】
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合するすること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／１の洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄する。
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合するすること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／１の洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄する。
【0143】
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；及び
・強陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；及び
・強陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
・強陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；及び
・強陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
【0144】
最も好ましい陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ドイツ）である。フロースルーモードでのＣａｐｔｏ Ｑクロマトグラフィーの好ましいローディング条件は以下のものであり得る：樹脂は２５ｍＭトリスバッファーｐＨ８で平衡化され、クロマトグラフィーは同じバッファーで行われる。
【0145】
好ましい再生手順は、溶液Ａ～Ｃで順番に洗浄することによって実施される：溶液Ａ：２Ｍ ＮａＣｌ；溶液Ｂ：１Ｍ ＮａＯＨ；溶液Ｃ：１０ｍＭ ＮａＯＨ。樹脂の貯蔵は、溶液Ｃで行うことができる。
【0146】
深層濾過
さらに、本発明の方法は、１つ以上の深層濾過ステップを含み得る。膜の表面に粒子を保持することによって分離する膜フィルターとは対照的に、深層フィルターは繊維又はビーズのマトリックスで構成され、分離はその表面ではなくマトリックス全体で行われる。
さらに、本発明の方法は、１つ以上の深層濾過ステップを含み得る。膜の表面に粒子を保持することによって分離する膜フィルターとは対照的に、深層フィルターは繊維又はビーズのマトリックスで構成され、分離はその表面ではなくマトリックス全体で行われる。
【0147】
デプスフィルターの例には、限定するものではないが、Ｐａｌｌ ＳＸＬシリーズ（例えば、ＳＸＬＰ７００４１６及びＳＸＬＰＤＥ２４０８ＳＰフィルターカプセル、Ｐａｌｌ ＨＰシリーズ（例えば、ＰＤＤ１、ＰＤＥ２、ＰＤＨ４、ＰＤＫ５、ＰＥＲＭ）（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋシリーズ（例えば、ＸＯＨＣ、ＦＯＨＣ、ＤＯＨＣ、ＡｌＨＣ、及びＢｌＨＣ Ｐｏｄフィルター）、ＨＣ－Ｐｒｏシリーズ、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅシリーズ（例えば、４０ＭＳ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又はＺｅｔａ Ｐｌｕｓシリーズ（９０ＺＢ０８、３０ＺＡ／６０ＺＡ、６０ＺＮ９０ＺＡ、デリピッド、ＶＲ０７、及びＶＲ０５フィルターカプセル）（３Ｍ）が含まれる。
【0148】
好ましくは、デプスフィルターは、事前に抽出された無機濾過助剤、セルロース、及び例えば英国の３Ｍ製のＺｅｔａ Ｐｌｕｓのような、フィルターマトリックスに強い正電荷を与える樹脂系から構成される。
【0149】
別の好ましいフィルターモジュールは、陰イオン交換機能を備えたデプスフィルターであるＥｍｐｈａｚｅ ＡＥＸ ハイブリッド精製器（３Ｍ）である。
本発明に使用される最も好ましいデプスフィルターは、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＰＤＥ２、ＰＤＨ４及びＰ７００シリーズのフィルターカプセルである。
本発明に使用される最も好ましいデプスフィルターは、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＰＤＥ２、ＰＤＨ４及びＰ７００シリーズのフィルターカプセルである。
【0150】
深層濾過を実施するためのプロセスパラメータは、１００～２０００Ｌ／ｍ２、好ましくは２００～１５００Ｌ／ｍ２、より好ましくは１２００Ｌ／ｍ２未満、最も好ましくは４００～１０００Ｌ／ｍ２の体積負荷、２０～２００ｋＰａ（０．２～２．０バール）、好ましくは４０～６０ｋＰａ（０．４～０．６バール）の圧力及び室温を含む。
【0151】
さらなる実施形態において、精製は、第１のクロマトグラフィーステップに先行する１つ以上の濾過ステップを含み得る。好ましい実施形態では、精製は、１つの遠心分離ステップ及び１つ以上の濾過ステップを含み得る。別の好ましい実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップに先立ち、凝集後に深層濾過及び精密濾過ステップが行われる。より好ましい実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップの前に、細胞分離ステップ、凝集ステップ、深層濾過ステップ、及び精密濾過ステップが行われる。正及び／又は負に帯電した膜を使用する追加の濾過ステップは、凝集後及びキャプチャークロマトグラフィーステップの前にサンプルを清澄化する濾過トレインに含まれ得る。帯電及び非帯電の異なる材料を組み合わせたフィルターモジュールもまた、好ましい実施形態に含まれる。
【0152】
好ましくは、深層濾過フィルターは複数の層を含む。例えば、深層濾過には二層フィルターを使用することができる。
限外濾過、ウイルス濾過、精密濾過
さらに、本発明の方法は、１つ以上の精密濾過、限外濾過、及び／又はナノ濾過のステップを含み得る。限外濾過は、圧力が液体を半透膜に押し付ける膜濾過の一形態である。浮遊固体と高分子量の溶質は保持されるが、水と低分子量の溶質は膜を通過する。限外濾過は、高分子溶液、特にタンパク質溶液を分離、精製、及び濃縮するために一般的に使用される方法である。限外濾過は、ダイアフィルトレーションと組み合わせることができる。このモードは、繰り返される又は連続的な希釈と再濃縮によって溶液から塩や他の微小種を除去するためのバッファー交換に適している。限外濾過は、特に大量のサンプルを処理する場合に、積み重ねられた膜を用いて、タンジェンシャルフロー又はクロスフロー濾過システム（ＴＦＦ又はＴＦ－ＵＦ）で実施され得る。あるいは、限外濾過には中空繊維システムが一般的に使用される。膜のカットオフサイズの範囲は約１～３００ｋＤである。免疫グロブリンの場合、限外濾過膜の典型的なカットオフは１０～１００ｋＤである。本発明の枠組み内では、ＵＦ膜について３０又は５０ｋＤの分子量カットオフが好ましい。
限外濾過、ウイルス濾過、精密濾過
さらに、本発明の方法は、１つ以上の精密濾過、限外濾過、及び／又はナノ濾過のステップを含み得る。限外濾過は、圧力が液体を半透膜に押し付ける膜濾過の一形態である。浮遊固体と高分子量の溶質は保持されるが、水と低分子量の溶質は膜を通過する。限外濾過は、高分子溶液、特にタンパク質溶液を分離、精製、及び濃縮するために一般的に使用される方法である。限外濾過は、ダイアフィルトレーションと組み合わせることができる。このモードは、繰り返される又は連続的な希釈と再濃縮によって溶液から塩や他の微小種を除去するためのバッファー交換に適している。限外濾過は、特に大量のサンプルを処理する場合に、積み重ねられた膜を用いて、タンジェンシャルフロー又はクロスフロー濾過システム（ＴＦＦ又はＴＦ－ＵＦ）で実施され得る。あるいは、限外濾過には中空繊維システムが一般的に使用される。膜のカットオフサイズの範囲は約１～３００ｋＤである。免疫グロブリンの場合、限外濾過膜の典型的なカットオフは１０～１００ｋＤである。本発明の枠組み内では、ＵＦ膜について３０又は５０ｋＤの分子量カットオフが好ましい。
【0153】
精密濾過は、ポアサイズが約０．１～１０μｍの膜を使用する粒子濾過法である。環境に特別な要件を課す滅菌濾過では、ポアサイズが約０．２μｍの滅菌済みマイクロフィルターを使用する。より大きいポアサイズ（０．４５μｍ、３μｍ）を有する追加のプレフィルターを使用するのが一般的である。これにより、小さいポアサイズのフィルターが急速にブロックされて流量が減少してしまうのを防止する。
【0154】
最後に、バイオ医薬品の製造では、ナノ濾過は主にウイルスの濾過に使用され、哺乳類細胞培養で製造された治療用タンパク質の安全性に必要である。ナノ濾過ステップは通常、精製された免疫グロブリンの大部分の充填に近い下流の終わりに行われる。よく使用されるナノフィルターのポアサイズは１５～３５ｎｍの範囲である（Ｐｌａｎｏｖａ、旭化成、日本、又はＶｉｒｅｓｏｌｖｅ、ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ）。
【0155】
本発明の範囲内で、「ナノ濾過」及び「ウイルス濾過」という用語は同義語として使用される。
本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製するためのさらなる方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
・凝集誘導化合物を上清又は濾液に添加すること；
・深層濾過；
・精密濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製するためのさらなる方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・細胞培養液の遠心分離及び／又は濾過；
・凝集誘導化合物を上清又は濾液に添加すること；
・深層濾過；
・精密濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；及び
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること。
【0156】
本発明の好ましい実施形態では、精製のプロセスは、１つ以上の限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ及び／又はナノ濾過ステップを含む。これらの濾過ステップは、市販の濾過装置、例えば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、 ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、又はＳａｒｔｏｒｉｕｓから入手できるものを使用して行うことができる。
【0157】
さらなる実施形態では、この方法は、アフィニティークロマトグラフィー又はポリッシングステップから得られた溶出液、又はそれから誘導され、前記クロマトグラフィーステップの後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露するさらなるステップを含む。好ましくは、パルボウイルスを保持することができるフィルター、最も好ましくは１５～３５ｎｍのポアサイズを有するフィルターを、ナノ濾過に適用することができる。
【0158】
いくつかの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得するか、又は、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ウイルスフィルターを通した溶出液の濾過、任意選択でそれに続く限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ。
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得するか、又は、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ウイルスフィルターを通した溶出液の濾過、任意選択でそれに続く限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ。
【0159】
さらなる実施形態において、本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ウイルスフィルターを通した溶出液の濾過、任意選択でそれに続く限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ。
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ウイルスフィルターを通した溶出液の濾過、任意選択でそれに続く限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ。
【0160】
好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・混合物の深層濾過；
・濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・ナノ濾過；及び
・限外濾過／ダイアフィルトレーション。
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・混合物の深層濾過；
・濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・混合モードクロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合し、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・ナノ濾過；及び
・限外濾過／ダイアフィルトレーション。
【0161】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ナノ濾過；及び
・限外濾過／ダイアフィルトレーション。
・凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
・深層濾過；
・アフィニティークロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
・ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
・ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
・陽イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
・陰イオン交換クロマトグラフィーであって、このステップで、免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで免疫グロブリンを取得すること；及び
・ナノ濾過；及び
・限外濾過／ダイアフィルトレーション。
【0162】
ウイルス不活化
細胞培養により産生されるモノクローナル抗体などの組換えタンパク質医薬品の製造過程には、原材料又は製造ステップからのウイルスによる偶発的な汚染の懸念があるため、ウイルスの除去及び／又は不活化が必要である。その結果、すべての製造プロセスのウイルスの安全性に対するかなりの規制上の要求があり、その結果、細胞培養物に由来する生物学的治療用タンパク質が得られる。
細胞培養により産生されるモノクローナル抗体などの組換えタンパク質医薬品の製造過程には、原材料又は製造ステップからのウイルスによる偶発的な汚染の懸念があるため、ウイルスの除去及び／又は不活化が必要である。その結果、すべての製造プロセスのウイルスの安全性に対するかなりの規制上の要求があり、その結果、細胞培養物に由来する生物学的治療用タンパク質が得られる。
【0163】
ウイルス不活化ステップは、アフィニティーキャプチャークロマトグラフィーの後に、溶出液を低ｐＨに保つことによって行われる。アフィニティーマトリックスからの低ｐＨ溶出を利用する。このような酸性の水性環境では、多くのウイルス、特にエンベロープタイプのウイルスは不安定で崩壊する。
【0164】
低ｐＨとは、２～５の間、好ましくは２．５～４．５の間、より好ましくは３～４の間のｐＨ値を意味する。
好ましい実施形態において、ウイルス不活化のためのインキュベーション時間は、１０分～２時間であり、より好ましくは３０分～９０分であり、最も好ましくは４５分～７５分である。
好ましい実施形態において、ウイルス不活化のためのインキュベーション時間は、１０分～２時間であり、より好ましくは３０分～９０分であり、最も好ましくは４５分～７５分である。
【0165】
好ましい実施形態では、ウイルス不活化は、撹拌しながら室温で行われ、インキュベーション後にｐＨが上げられる。
本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：（ａ１）沈降により細胞培養液から細胞を分離すること；
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨで少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）ステップ（ｆ）でのウイルス不活化後の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｆ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーに曝露し、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を混合モードクロマトグラフィーに曝露し、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することにより、溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
（ｉ）ステップ（ｈ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること。
本発明は、免疫グロブリン及び少なくとも１つの不純物を含む細胞培養液から免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを以下の順序で含む：（ａ１）沈降により細胞培養液から細胞を分離すること；
（ａ）凝集誘導化合物を細胞培養液に添加すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物の深層濾過；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた濾液をアフィニティークロマトグラフィーに曝露することであって、このステップで、免疫グロブリンはアフィニティークロマトグラフィー媒体に結合すること；
（ｄ）ｐＨ値が５～９及びイオン強度が０．１～５．０ｍｏｌ／ｌの洗浄バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー媒体を洗浄すること；
（ｅ）ｐＨ値２．５～４．５の溶出バッファーを使用してアフィニティークロマトグラフィー樹脂から免疫グロブリンを溶出すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の溶出液を、ウイルス不活化のために、２．５～４．５の低ｐＨで少なくとも１０分間インキュベートすること；
（ｇ）ステップ（ｆ）でのウイルス不活化後の溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｆ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーに曝露し、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することによって溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を混合モードクロマトグラフィーに曝露し、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を脱着することにより、溶出液中の免疫グロブリンを取得すること；
（ｉ）ステップ（ｈ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｈ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物をナノ濾過に曝露すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）の濾液又はそれから誘導され、ステップ（ｉ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を限外濾過／ダイアフィルトレーションに曝露すること。
【0166】
さらなる実施形態では、ステップｈ）は以下のとおりである：
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を混合モードクロマトグラフィーに曝露し、ここでは免疫グロブリンは混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合せず、混合モードクロマトグラフィー樹脂からのフロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を混合モードクロマトグラフィーに曝露し、ここでは免疫グロブリンは混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合せず、混合モードクロマトグラフィー樹脂からのフロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
【0167】
又は、混合モードクロマトグラフィーの代わりに陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することができ、ステップｈ）は以下のとおりである：
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに曝露し、ここでは免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からのフロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた溶出液、又はそれから誘導され、ステップ（ｇ）の後に行われた１つ以上のさらなる処理ステップの後に得られた組成物を陰イオン交換クロマトグラフィーに曝露し、ここでは免疫グロブリンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合せず、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からのフロースルーで免疫グロブリンを取得すること。
【0168】
好ましい実施形態では、限外濾過／ダイアフィルトレーションは、免疫グロブリンの精製の最後のステップであり、ステップ（ｃ）、（ｇ）、及び（ｈ）へのさらなるクロマトグラフィーは行われない。
【0169】
実施例
免疫グロブリンを精製するための本発明の方法は、以下の例を参照することによって裏付けられ及び例示される。これらの例は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを強調しておく。
免疫グロブリンを精製するための本発明の方法は、以下の例を参照することによって裏付けられ及び例示される。これらの例は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを強調しておく。
【0170】
実施例１：免疫グロブリン及び細胞培養
本発明の方法は、免疫グロブリンの発現に使用される特定の抗体にも特定の宿主細胞にも依存しない。同じことが、採取物の最大収率のために最適化された発現様式及び選択された培養条件にも当てはまる。本発明の方法の開発中に、異なるモノクローナル抗体が使用された。それらは、本発明の方法に従って様々な規模で正常に精製された。表に示されている選択された実験のほとんどは、ヒト化抗ＶＥＧＦ、ＩｇＧ１抗体であるベバシズマブを使用して実施された。さらに、他のいくつかの実験は、ヒト化抗ＨＥＲ２、ＩｇＧ１抗体であるトラスツズマブ及び完全ヒト抗ＲＡＮＫＬ ＩｇＧ２抗体であるデノスマブを使用して実施された。３つの抗体はすべてＣＨＯ細胞で組換え発現され、異なるスケールの流加培養で増殖した。開発段階での凝集実験のほとんどは、１０Ｌの実験室スケール又は１００Ｌ又は２００Ｌのパイロットスケールからの培養液を使用して行われた。実施例で使用した生産スケール及び最大培養量は５０００Ｌであった。いくつかの実験は、１０００Ｌのより小さい生産スケールを使用して実施された。特に明記されていない限り、スケールは常に培養量を指す。
本発明の方法は、免疫グロブリンの発現に使用される特定の抗体にも特定の宿主細胞にも依存しない。同じことが、採取物の最大収率のために最適化された発現様式及び選択された培養条件にも当てはまる。本発明の方法の開発中に、異なるモノクローナル抗体が使用された。それらは、本発明の方法に従って様々な規模で正常に精製された。表に示されている選択された実験のほとんどは、ヒト化抗ＶＥＧＦ、ＩｇＧ１抗体であるベバシズマブを使用して実施された。さらに、他のいくつかの実験は、ヒト化抗ＨＥＲ２、ＩｇＧ１抗体であるトラスツズマブ及び完全ヒト抗ＲＡＮＫＬ ＩｇＧ２抗体であるデノスマブを使用して実施された。３つの抗体はすべてＣＨＯ細胞で組換え発現され、異なるスケールの流加培養で増殖した。開発段階での凝集実験のほとんどは、１０Ｌの実験室スケール又は１００Ｌ又は２００Ｌのパイロットスケールからの培養液を使用して行われた。実施例で使用した生産スケール及び最大培養量は５０００Ｌであった。いくつかの実験は、１０００Ｌのより小さい生産スケールを使用して実施された。特に明記されていない限り、スケールは常に培養量を指す。
【0171】
実施例２：異なる凝集剤の比較（表１～３）
表１～３の凝集実験は、ＩｇＧ１サブクラス（ベバシズマブ）のヒト化抗体を産生するＣＨＯ細胞のパイロットスケール（１００Ｌ）培養を使用して、異なるシリーズで実施された。抗体の力価は１．１６～１．５２ｇ／Ｌであった。凝集剤は、発酵の終わりに、細胞の分離前に、細胞培養ブロスの２０ｍｌアリコートに加えられた。３つの異なるカチオン性物質を異なる濃度で試験した。１）ｐＤＡＤＭＡＣ＝ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、２）キトサン、及び３）塩化カルシウム。ｐＤＡＤＭＡＣは１０％（ｗ／ｖ）溶液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）として購入した。キトサンは固形物（Ｓｉｇｍａ）として購入し、１％（ｗ／ｖ）を０．１Ｍ酢酸に溶解した。キトサンのｐＨ操作範囲は約４．５～５．０である。塩化カルシウムは、ストック水溶液を使用して追加された。
表１～３の凝集実験は、ＩｇＧ１サブクラス（ベバシズマブ）のヒト化抗体を産生するＣＨＯ細胞のパイロットスケール（１００Ｌ）培養を使用して、異なるシリーズで実施された。抗体の力価は１．１６～１．５２ｇ／Ｌであった。凝集剤は、発酵の終わりに、細胞の分離前に、細胞培養ブロスの２０ｍｌアリコートに加えられた。３つの異なるカチオン性物質を異なる濃度で試験した。１）ｐＤＡＤＭＡＣ＝ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、２）キトサン、及び３）塩化カルシウム。ｐＤＡＤＭＡＣは１０％（ｗ／ｖ）溶液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）として購入した。キトサンは固形物（Ｓｉｇｍａ）として購入し、１％（ｗ／ｖ）を０．１Ｍ酢酸に溶解した。キトサンのｐＨ操作範囲は約４．５～５．０である。塩化カルシウムは、ストック水溶液を使用して追加された。
【0172】
実験は、以下の順序のステップに従って実施された。
・発酵ブロスから２０ｍｌのアリコートを収集する
・凝集剤を追加する
・撹拌しながら室温で１５分間インキュベーション
・４６００ｒｐｍ／１０分の遠心分離（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）
・精密濾過（ＰＶＤＦ、０．２μｍ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・濁度、ＨＣＤＮＡ、及びＨＣＰの分析
異なる濃度の異なる凝集剤の直接的な効果を評価するために、深層濾過は行われなかった。遠心分離ステップは、フロック、細胞、及び細胞片を除去する。その後の精密濾過は、残留する粒子を除去する。対照（ゼロ値）の場合、凝集剤は添加されず、インキュベーションは行われなかった。ただし、分析前にサンプルを遠心分離して濾過した。プロテインＡベースのＨＰＬＣ法により、抗体濃度を測定した。
・発酵ブロスから２０ｍｌのアリコートを収集する
・凝集剤を追加する
・撹拌しながら室温で１５分間インキュベーション
・４６００ｒｐｍ／１０分の遠心分離（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）
・精密濾過（ＰＶＤＦ、０．２μｍ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・濁度、ＨＣＤＮＡ、及びＨＣＰの分析
異なる濃度の異なる凝集剤の直接的な効果を評価するために、深層濾過は行われなかった。遠心分離ステップは、フロック、細胞、及び細胞片を除去する。その後の精密濾過は、残留する粒子を除去する。対照（ゼロ値）の場合、凝集剤は添加されず、インキュベーションは行われなかった。ただし、分析前にサンプルを遠心分離して濾過した。プロテインＡベースのＨＰＬＣ法により、抗体濃度を測定した。
【0173】
【表1a】
【0174】
【表1b】
【0175】
【表1c】
【0176】
表１ａ～１ｃは、３つの異なる凝集剤を使用したＨＣＤＮＡ及び濁度の低下に対する凝集の結果を示している。ＨＣＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）高感度ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びｑＰＣＲ（ＰｒｅｐＳＥＱ（商標）残留ＤＮＡサンプル調製キット及びｒｅｓＤＮＡＳＥＱ（商標）定量ＣＨＯ ＤＮＡキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって決定された。濁度測定は、Ｈａｃｈ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ ２１００Ｑで行われ、Ｆｏｒｍａｚｉｎ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ Ｕｎｉｔｓ（ＦＮＵ）として表された。この装置は、入射赤外光から９０度の角度でサンプルからの散乱光を測定している。
【0177】
表１ａは、０．０９％（ｗ／ｖ）までのｐＤＡＤＭＡＣの効果を示している。既に最低濃度（０．０２５％ｗ／ｖ）で、ＨＣＤＮＡはほぼ完全に除去された（９９．９％、３桁の低下）。０．０７５％（ｗ／ｖ）ｐＤＡＤＭＡＣを使用すると、８７％の濁度低下を達成できる。この実験では、ｐＤＡＤＭＡＣ濃度を高くしても、濁度をさらに下げることはできなかった。
【0178】
表１ｂに示すキトサンの結果は、効果的なＨＣＤＮＡ除去を示しているが、ｐＤＡＤＭＡＣで求められるよりも高い濃度であった。０．４％（ｗ／ｖ）で約９１．５％の低下が得られた。濁度の低下に関しては、１９％以下の低下が測定された。
【0179】
ＣａＣｌ２実験の結果を表１ｃに示す。この凝集剤についても、非常に効果的なＨＣＤＮＡ低下が得られた。７０ｍＭで９９％の低下が測定され、１２０ｍＭ ＣａＣｌ２で９９．９％の低下が測定された。濁度の低下はキトサンの場合は大きかったが、ｐＤＡＤＭＡＣの場合は小さかった。１２０ｍＭで約６３％の低下を達成できた。より高いＣａＣｌ２濃度は試験していない。
【0180】
結論（表１ａ～ｃ）：ＨＣＤＮＡの初期濃度（すなわち、凝集のない対照）は、それぞれ６２．９μｇ／ｍｌの細胞培養上清と５１．１ｍｇ／ｇのＩｇＧであった。総タンパク質又は抗体の損失は、試験したすべての凝集剤及び濃度で検出できなかった。同様に、凝集によって引き起こされる細胞破裂の増加は観察されなかった。驚くべきことに、ＨＣＤＮＡが濁度にほとんど寄与していないことは明らかである。例えば、０．４％（ｗ／ｖ）のキトサンでは、ＨＣＤＮＡの約９１．５％が凝集して除去されたが、濁度はほとんど低下せず、対照の８２％のままであった（表１ｂ）。ＨＣＤＮＡと濁度の両方を低下させるには、凝集剤ｐＤＡＤＭＡＣが優れている。
【0181】
【表2a】
【0182】
【表2b】
【0183】
【表2c】
【0184】
表２ａ～２ｃは、３つの異なる凝集剤を使用したＨＣＰの低下に対する凝集の結果を示している。ＨＣＰは、ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、３Ｇ（Ｃｙｇｎｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。
【0185】
表２ａは、ＨＣＰの除去に対するｐＤＡＤＭＡＣの効果を示している。試験した最高濃度（０．０９％ｗ／ｖ）でも、低下は約１０．８％のみであった。
表２ｂに示すように、凝集剤としてのキトサンがＨＣＰの低下に及ぼす影響はわずかであった。最も低下したのは０．２％（ｗ／ｖ）で測定された約８．１％であった。
表２ｂに示すように、凝集剤としてのキトサンがＨＣＰの低下に及ぼす影響はわずかであった。最も低下したのは０．２％（ｗ／ｖ）で測定された約８．１％であった。
【0186】
表２ｃに示すように、ＣａＣｌ２実験ではＨＣＰのより良好な低下が得られた。７０ｍＭで２９．１％の低下が測定された。より高い濃度はより良好な低下をもたらし得るが、試験はされなかった。
【0187】
結論（表２ａ～ｃ）：ＨＣＰの初期濃度は１．４～２．３ｍｇ／ｍｌの間であった。質量で、これはＨＣＤＮＡの負荷の約２０倍から４０倍高い。また、ＨＣＰも濁度にほとんど寄与しないことは明らかである。例えば、０．０７５％（ｗ／ｖ）ｐＤＡＤＭＡＣは濁度を約８７％低下させるが（表１ａ）、ＨＣＰの低下は約９％のみであった（表２ａ）。凝集によるＨＣＰの低下には、ＣａＣｌ２が優れていた。以下の表３ａ～３ｃは、ＨＣＤＮＡ、濁度、及びＨＣＰの低下について試験した３つの凝集剤の好ましい濃度をまとめたものである。
【0188】
【表3a】
【0189】
【表3b】
【0190】
【表3c】
【0191】
３つの凝集剤はすべてカチオン性であるため、ＨＣＤＮＡを効率的に除去することができた。本発明の最初の問題は主にプロテインＡ溶出プールで観察された濁度に関連していたので、ｐＤＡＤＭＡＣが最も適切な凝集剤として選択された。このポリマーは低濃度で使用でき、驚くべきことに、既に試験された最低濃度でＨＣＤＮＡがほぼ完全に除去される。
【0192】
実施例３：ｐＤＡＤＭＡＣを使用したさらなる凝集実験（表４～６）
その後のより拡張された一連の試験では、ベバシズマブを発現する６つの異なる細胞培養物からのサンプルを使用した並行実験で、ＨＣＤＮＡ及び濁度の低下に対するｐＤＡＤＭＡＣの影響を調査した。試験方法は、実施例２について記載したものと同じであった。凝集していない上清（対照）の範囲は、４４．３～６２．９μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ、１９．９～２９．１ＦＮＵ濁度、及び１．２４～２．１４ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰであった。抗体価は１．１６～１．５２ｍｇ／ｍｌであった。５つの異なるｐＤＡＤＭＡＣ濃度を試験し、低下％の平均値を計算した。
その後のより拡張された一連の試験では、ベバシズマブを発現する６つの異なる細胞培養物からのサンプルを使用した並行実験で、ＨＣＤＮＡ及び濁度の低下に対するｐＤＡＤＭＡＣの影響を調査した。試験方法は、実施例２について記載したものと同じであった。凝集していない上清（対照）の範囲は、４４．３～６２．９μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ、１９．９～２９．１ＦＮＵ濁度、及び１．２４～２．１４ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰであった。抗体価は１．１６～１．５２ｍｇ／ｍｌであった。５つの異なるｐＤＡＤＭＡＣ濃度を試験し、低下％の平均値を計算した。
【0193】
【表4a】
【0194】
表４ａの結果は、ＨＣＤＮＡの凝集に対するカチオン性ポリマーｐＤＡＤＭＡＣの高い可能性を再度確認している。既に試験された最低濃度（０．０２５％ｗ／ｖ）によって、６つの細胞培養物すべてでほぼ１００％の低下が得られた。下流処理の初期段階でＨＣＤＮＡをほぼ定量的に除去することは非常に有利であり、その後の濾過とキャプチャークロマトグラフィーの負担を軽減する。
【0195】
濁度の低下は、プレクリーニングステップの開発にとって最も重要な要求である。ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体（例えば、ベバシズマブ、トラスツズマブ、及びデノスマブ）を発現するいくつかの細胞培養物では、濁りはキャプチャークロマトグラフィーカラムから溶出された濃縮溶液で発生する。本発明の実験において、プレクリーニングステップにおける濁度の低下は、プロセスステップが中断することなく実行される場合、キャプチャークロマトグラフィー後の濁りも防止することが観察された。プロテインＡ溶出プールの濁りの再現は観察されなかった。
【0196】
【表4b】
【0197】
表４ｂに示す結果は、凝集剤としてのｐＤＡＤＭＡＣの使用を裏付けている。０．０５％（ｗ／ｖ）では、細胞培養物における低下平均値は８０％を超えていた。０．０７５％（ｗ／ｖ）の濃度では、低下平均値は約８８％であった。より高い濃度（０．０９％ｗ／ｖ）ではそれ以上の増加はなかった。
【0198】
別の研究では、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集（その後の深層濾過なし）を、高密度細胞培養フィードストリームの一次清澄化のために評価した。以前の実験とは対照的に、細胞培養サンプルは、ベバシズマブを発現する、選択された１０００Ｌ発酵スケール（細胞密度９．３×１０６細胞／ｍｌ）のアリコートであった。
【0199】
実験は、以下の順序のステップに従って行った。
・発酵ブロス（５０ｍｌチューブ）から４０ｍｌのアリコートを収集する
・異なる濃度で凝集剤を追加する
・穏やかに撹拌しながら室温で１５分間インキュベーション
・３０００ｒｐｍ／２０００ｇ／５分の遠心分離
・精密濾過（Ｍｉｌｌｅｘ Ｆｉｌｔｅｒ、０．２μｍ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・濁度の即時分析
・その後のｍａｂ濃度、ＨＣＤＮＡ、及びＨＣＰの分析
表５は、この調査の結果をまとめたものである。濁度は、Ｈａｃｈ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ ２１００Ｑで測定され、比濁法濁度単位（ＮＴＵ）として表される以前の実験とは対照的である。この装置は、入射白色光から９０度の角度でサンプルからの散乱光を測定している。
・発酵ブロス（５０ｍｌチューブ）から４０ｍｌのアリコートを収集する
・異なる濃度で凝集剤を追加する
・穏やかに撹拌しながら室温で１５分間インキュベーション
・３０００ｒｐｍ／２０００ｇ／５分の遠心分離
・精密濾過（Ｍｉｌｌｅｘ Ｆｉｌｔｅｒ、０．２μｍ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・濁度の即時分析
・その後のｍａｂ濃度、ＨＣＤＮＡ、及びＨＣＰの分析
表５は、この調査の結果をまとめたものである。濁度は、Ｈａｃｈ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ ２１００Ｑで測定され、比濁法濁度単位（ＮＴＵ）として表される以前の実験とは対照的である。この装置は、入射白色光から９０度の角度でサンプルからの散乱光を測定している。
【0200】
【表5】
【0201】
表５に示す結果は、ＨＣＤＮＡ、濁度、及びＨＣＰの低下に関する以前の調査結果を裏付けている（表１ａ、２ａ、４ａ、及び４ｂを参照）。ｐＤＡＤＭＡＣの最適用量は、上清の濁度の有意な低下につながるポリマーの最小濃度として定義される。より高濃度のｐＤＡＤＭＡＣを追加することは有益ではないかもしれない。濃度が高くなると、濁度レベルがわずかに低くなるだけであるか（表５、０．１％ｗ／ｖ ｐＤＡＤＭＡＣを参照）、又は上清中の目的生成物の濃度がわずかに低下する可能性があるか（０．１％ｗ／ｖ ｐＤＡＤＭＡＣまで観察されない）、又はより高速な濁度の回復を促進し得る（表６を参照）。より高い濃度はまた、より小さい凝集体の集団の生成につながる可能性があり、それはデプスフィルターを突破する可能性がある。最適なｐＤＡＤＭＡＣ濃度は、０．０３７５～０．０７５％（ｗ／ｖ）の範囲である。これは、この実験の条件下で約４０～８０ｐｇ／細胞を指す。この範囲内で、ＨＣＤＮＡの減少は１００％、濁度の減少は約９２～９７％、ＨＣＰの減少は７～８％であった。凝集がｍａｂの検出可能な損失を引き起こさなかったことを強調しておく。
【0202】
表５の実験に使用したものと同じ出発物質を使用してさらなる実験を行い、凝集、遠心分離、及び精密濾過を実施した後の濁度の安定性をモニタリングした。実施例１に記載されたのと同じ方法が適用された。３つの濃度のｐＤＡＤＭＡＣ（０．０３７５％ｗ／ｖ、０．０７５％ｗ／ｖ、及び０．０９％ｗ／ｖ）で凝集させた後、滅菌濾過した上清の濁度を室温で２４時間にわたり測定した。並行調査により、遠心分離と精密濾過では残留遊離ｐＤＡＤＭＡＣが除去されなかったことが判明した。対照的に、クロマトグラフィーステップ（例えば、プロテインＡ）はポリマーを定量的に除去した。表６に、安定性実験の結果と濁度の再現速度を示す。
【0203】
【表6】
【0204】
驚くべきことに、濁度レベルは３時間後に上昇し、沈殿が続いていることを示している。効果はｐＤＡＤＭＡＣ濃度に強く依存する。３時間後の濁度の上昇は、０．０３７５％（ｗ／ｖ）では２５％であるが、０．０９％（ｗ／ｖ）では約７８％である。２４時間後、最高のｐＤＡＤＭＡＣ濃度での濁度は、凝集していない（対照）値に達した（表４ｂを参照）。凝集による最初の濁度の低下は無効にした。
【0205】
これらの結果から、１）凝集及び濾過された上清は、迅速なさらなる処理（深層濾過、プロテインＡクロマトグラフィー）が必要であり、２）ｐＤＡＤＭＡＣの最小有効量を選択する必要があると結論付けられた。０．０７５％（ｗ／ｖ）と比較して、０．０３７５％（ｗ／ｖ）の上清の安定性ははるかに優れており、８時間までほとんど上昇しない。これは、日常的な生産に適した時間枠である。
【0206】
実施例４：凝集がある場合とない場合の深層濾過実験
大規模（５，０００Ｌ）の発酵液で０．０３７５～０．０７５％（ｗ／ｖ）ｐＤＡＤＭＡＣを使用して凝集を行うと、フロックと細胞を除去する細胞分離器に高い負荷がかかり、実行後のクリーニングに時間を要した。これは、残留するフロックから解放されなければならない発酵槽にも当てはまる。したがって、さらなる実験では、この欠点を克服するための代替のプレクリーニング戦略を試験した。
大規模（５，０００Ｌ）の発酵液で０．０３７５～０．０７５％（ｗ／ｖ）ｐＤＡＤＭＡＣを使用して凝集を行うと、フロックと細胞を除去する細胞分離器に高い負荷がかかり、実行後のクリーニングに時間を要した。これは、残留するフロックから解放されなければならない発酵槽にも当てはまる。したがって、さらなる実験では、この欠点を克服するための代替のプレクリーニング戦略を試験した。
【0207】
最初に、凝集ステップを省略して、２ステップの深層濾過を含む様々な設定のデプスフィルターに置き換えることができるかどうかを調査した。プレフィルターを含むいくつかの確立されたフィルターシステムを多くの組み合わせで試験したが、結果は満足のいくものではなかった。すなわち、細胞分離及び深層濾過後の濁度は約１０ＦＮＵを維持し、その後のプロテインＡ溶出プールの沈殿は、最適なフィルター設定で約３０ＦＮＵの濁度であるように見えた。さらに、デプスフィルターはＨＣＤＮＡ及びＨＣＰを低下させなかった。
【0208】
第二に、デプスフィルターのみを使用する場合、凝集後のセパレータを省略できるかどうかを調査した。実際、一部のフィルター設定は、凝集した細胞培養液を許容可能な低フロースルー濁度（１～２ＦＮＵ）で十分に清澄化した。この戦略は有望なクリアランスをもたらすが、必要なフィルターサイズと処理時間はかなり高く、重要な経済的要因になった。この戦略は追求されなかった。
【0209】
実施例５：無細胞培養上清を用いた凝集実験
この例では、１つの好ましいプレクリーニング戦略を精査した。プレクリーニングステップの順序は以下のとおりである（図２Ｂも参照）：
・細胞培養液の採取
・細胞分離／遠心分離
・ｐＤＡＤＭＡＣによる凝集（０．０３７５％ｗ／ｖ～０．０７５％ｗ／ｖ）
・深層濾過
・精密濾過（０．２μｍ）
・プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＬＸ）
実施例２及び３と比較して、凝集は、細胞分離／遠心分離の後に行われ、続いて深層濾過が行われた。この方法は、１Ｌ、１０Ｌ、１００Ｌ、及び５０００Ｌの培養液（ベバシズマブ）を使用して行われ、深層濾過のいくつかのパラメータが比較され、最適化された。凝集前の上清の濁度は、５０００Ｌスケールで３０～１００ＦＮＵの範囲であった。
この例では、１つの好ましいプレクリーニング戦略を精査した。プレクリーニングステップの順序は以下のとおりである（図２Ｂも参照）：
・細胞培養液の採取
・細胞分離／遠心分離
・ｐＤＡＤＭＡＣによる凝集（０．０３７５％ｗ／ｖ～０．０７５％ｗ／ｖ）
・深層濾過
・精密濾過（０．２μｍ）
・プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＬＸ）
実施例２及び３と比較して、凝集は、細胞分離／遠心分離の後に行われ、続いて深層濾過が行われた。この方法は、１Ｌ、１０Ｌ、１００Ｌ、及び５０００Ｌの培養液（ベバシズマブ）を使用して行われ、深層濾過のいくつかのパラメータが比較され、最適化された。凝集前の上清の濁度は、５０００Ｌスケールで３０～１００ＦＮＵの範囲であった。
【0210】
以下のタイプのデプスフィルターを調査した：
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＨ４
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＥ２
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＤ１
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＥＫＭ
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＥＫＸ
・３Ｍ ＢＣ２５ ９０ＺＢ０８Ａ
・３Ｍ ＢＶ８ Ｅｍｐｈａｚｅ ＡＥＸ ハイブリッド精製器
ここでも、ＨＣＤＮＡ、濁度、ＨＣＰ、及びｍａｂ濃度を分析し（方法は前の実施例を参照）、これらの結果によると、ＰＥＫＭ、ＰＤＤ１、及びＰＤＥ２は、許容可能な速度で凝集した上清を清澄化するのに最も適している。ＰＤＤ１及びＰＤＥ２は、二層構成であることから、ＰＥＫＭ（単層）よりもしっかりした処理を示したため、フロックの除去に好ましいデプスフィルターであった。デプスフィルターの後方のフロースルー濁度は１～２ＦＮＵであった。濾過時間は、２５０～５００Ｌ／ｍ２の負荷で８０～２４０分であった。ＰＤＤ１とＰＤＥ２の両方の濾液は、２４時間の間にわずかな濁度の増加しか示さず、両方の濾液は、プロテインＡでさらに処理するのに十分安定していると見なされる。
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＨ４
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＥ２
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＤ１
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＥＫＭ
・Ｐａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＥＫＸ
・３Ｍ ＢＣ２５ ９０ＺＢ０８Ａ
・３Ｍ ＢＶ８ Ｅｍｐｈａｚｅ ＡＥＸ ハイブリッド精製器
ここでも、ＨＣＤＮＡ、濁度、ＨＣＰ、及びｍａｂ濃度を分析し（方法は前の実施例を参照）、これらの結果によると、ＰＥＫＭ、ＰＤＤ１、及びＰＤＥ２は、許容可能な速度で凝集した上清を清澄化するのに最も適している。ＰＤＤ１及びＰＤＥ２は、二層構成であることから、ＰＥＫＭ（単層）よりもしっかりした処理を示したため、フロックの除去に好ましいデプスフィルターであった。デプスフィルターの後方のフロースルー濁度は１～２ＦＮＵであった。濾過時間は、２５０～５００Ｌ／ｍ２の負荷で８０～２４０分であった。ＰＤＤ１とＰＤＥ２の両方の濾液は、２４時間の間にわずかな濁度の増加しか示さず、両方の濾液は、プロテインＡでさらに処理するのに十分安定していると見なされる。
【0211】
結論：無細胞上清を用いた凝集（分離／遠心分離後）は、好ましいプレクリーニング戦略であり、免疫グロブリンの大規模生産に適していることが判明した。濁度が３０～１００ＦＮＵの凝集した上清は、ＰＤＤ１やＰＤＥ２などの二層デプスフィルターで正常に処理することができた。これらのタイプのフィルターには、少なくとも５００Ｌ／ｍ２をロードすることができる。濁度が高い（＞１００ＦＮＵ）上清の場合、有効フィルター面積を増やして処理時間の延長を回避できる。最終的に選択されたｐＤＡＤＭＡＣ濃度は０．０３７５％（ｗ／ｖ）であり、細胞が存在し、深層濾過がない場合の小規模凝集実験と完全に一致している（実施例１～３）。
【0212】
実施例６：様々なｐＤＡＤＭＡＣ濃度を用いたより高いＩｇＧ濃度での細胞培養上清の凝集（表７）
この実験では、２つの異なる小規模細胞培養物を比較したところ、異なる量のＩｇＧ２抗体（デノスマブ）が蓄積された。培養量は１０Ｌであり、出発物質のために２つの１０Ｌ培養物を合わせた。培養物をそれぞれ８日及び１０日後に採取した。プールされた８日目の培養物は、３．８６ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ、４２．４μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ、及び０．４５４ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰであった。１０日目の培養物は、５．７９ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ（＋５０％）、８５．μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ（＋１０２％）、及び０．５０６ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰ（＋１１％）であった。細胞培養上清を、実施例１に記載されているように遠心分離し（４６００ｒｐｍで１０分間）、凝集させた（１５分間のインキュベーション）。
この実験では、２つの異なる小規模細胞培養物を比較したところ、異なる量のＩｇＧ２抗体（デノスマブ）が蓄積された。培養量は１０Ｌであり、出発物質のために２つの１０Ｌ培養物を合わせた。培養物をそれぞれ８日及び１０日後に採取した。プールされた８日目の培養物は、３．８６ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ、４２．４μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ、及び０．４５４ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰであった。１０日目の培養物は、５．７９ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ（＋５０％）、８５．μｇ／ｍｌ ＨＣＤＮＡ（＋１０２％）、及び０．５０６ｍｇ／ｍｌ ＨＣＰ（＋１１％）であった。細胞培養上清を、実施例１に記載されているように遠心分離し（４６００ｒｐｍで１０分間）、凝集させた（１５分間のインキュベーション）。
【0213】
【表7】
【0214】
驚くべきことに、２つの非常に異なる培養物は、凝集実験でかなり類似した挙動を示した。ここでも、ＨＣＤＮＡの除去に対するｐＤＡＤＭＡＣの高い可能性がもう一度確認された。０．０２５％ｐＤＡＤＭＡＣまでに、ＨＣＤＮＡの低下は既に１００％（約５桁）であった。濁度を見ると、０．０３７５％及び０．０７５％のｐＤＡＤＭＡＣで９７～９８％の低下に達する。この範囲では、ＨＣＰはそれぞれ２２％及び２８％低下した。驚くべきことに、凝集プレクリーニング戦略は、抗体の種類、細胞密度、及びｍａｂ力価に関してかなり安定していることが判明した。培養物に固有の化学量論的投与は必須ではない。
【0215】
実施例７：プロテインＡによるアフィニティーキャプチャー後の不純物に対する凝集の影響（表８～１０）
この実施例は、プロテインＡ溶出プール内の残留不純物に対する凝集の影響を示している。出発物質は、パイロットスケール（２００Ｌ、表８）ではトラスツズマブ（ＩｇＧ１）を発現する細胞培養物、フルスケール（５０００Ｌ、表９）ではベバシズマブを発現する細胞培養物であった。実施例８．２に記載されているようにプロテインＡクロマトグラフィーを実施した。ｐＤＡＤＭＡＣ濃度は０．０３７５％（ｗ／ｖ）であり、デプスフィルターはＰａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＥ２であった。
この実施例は、プロテインＡ溶出プール内の残留不純物に対する凝集の影響を示している。出発物質は、パイロットスケール（２００Ｌ、表８）ではトラスツズマブ（ＩｇＧ１）を発現する細胞培養物、フルスケール（５０００Ｌ、表９）ではベバシズマブを発現する細胞培養物であった。実施例８．２に記載されているようにプロテインＡクロマトグラフィーを実施した。ｐＤＡＤＭＡＣ濃度は０．０３７５％（ｗ／ｖ）であり、デプスフィルターはＰａｌｌ Ｓｕｐｅｒｃａｐ ５０ ＰＤＥ２であった。
【0216】
【表8】
【0217】
プロテインＡ溶出液中のＩｇＧ濃度は、凝集していない対照では２０．３６ｍｇ／ｍｌであり、凝集プロセスでは２３．３２ｍｇ／ｍｌであった。対照プロセスでは、凝集は行われず、遠心分離後の上清を直接深層濾過し、プロテインＡでクロマトグラフィーにかけた。プロテインＡ溶出プールは、対照の約４３ＦＮＵの濁度に関して有意な沈殿を示した。対照的に、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集を伴うプロセスでは、濁度は約８０％の大幅な低下を示した。ＨＣＤＮＡは９０％以上低下し、ほとんど検出できない０．０７６ｐｐｍの非常に低いレベルになった。残留ＨＣＰはより顕著で、つまり２０４ｐｐｍであり、出発材料の２～３桁高い負荷を反映している。その濃度は対照と比較して約半分であった。これらの結果は、プロテインＡ溶出液の生成物純度に対するｐＤＡＤＭＡＣ凝集の顕著な正の効果を明確に示している。
【0218】
以下の表９ａ及び９ｂには、２つの生産バッチ（５０００Ｌベバシズマブ）の通常の工程内管理データが示され、プロテインＡクロマトグラフィーの前後で不純物の減少が驚くほど大きいことをさらに実証している。プロテインＡクロマトグラフィーは、高価な樹脂のカラム容量を減らすために、総量の５０％で２回連続して行った。ウイルス不活化のためのその後のインキュベーションは、実施例９．３に記載されているように行った。
【0219】
【表9a】
【0220】
【表9b】
【0221】
ＨＣＤＮＡは、凝集後はほとんど検出できず、後続のステップで検出限界を下回った（表９ａ）。凝集及び深層濾過は、ＨＣＰを約１５％しか低下させなかった（表９ｂ）。しかし、プロテインＡクロマトグラフィーは、ＩｇＧ－Ｆｃに対する選択性が高いため、ＨＣＰ不純物を９９．９％以上低下させた。それにもかかわらず、プロテインＡクロマトグラフィー後の１６０～２７０ｐｐｍの残留ＨＣＰ濃度は、少なくともヒト用の治療用抗体の場合、さらなるポリッシングステップが必要であることを示している。
【0222】
表１０：様々なプロセスでの浸出プロテインＡの比較
表１０の元になっている実験では、プロテインＡ溶出プール中の浸出プロテインＡについて３つの異なるプロセスを比較した。プロセスＣは、実施例７／表８（２００Ｌのトラスツズマブ）に記載されているのと同じ条件下で、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集を利用する本発明によるプロセスである。２回の実験の結果を、プロテインＡステップの前に陰イオン交換フロースルークロマトグラフィー（Ｎｕｖｉａ Ｑ）を利用する以前に確立されたプロセス（プロセスＢ）と比較した。プロセスＡは、プレクリーニングステップなし（遠心分離及び濾過を除く）のさらなる対照である。プロセスＡ及びＢは、国際公開第２０１５１３５８８４号に記載されている。すべてのプロセスは室温で行った。プロテインＡクロマトグラフィーは、実施例８．２に記載されているように実施した。
表１０の元になっている実験では、プロテインＡ溶出プール中の浸出プロテインＡについて３つの異なるプロセスを比較した。プロセスＣは、実施例７／表８（２００Ｌのトラスツズマブ）に記載されているのと同じ条件下で、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集を利用する本発明によるプロセスである。２回の実験の結果を、プロテインＡステップの前に陰イオン交換フロースルークロマトグラフィー（Ｎｕｖｉａ Ｑ）を利用する以前に確立されたプロセス（プロセスＢ）と比較した。プロセスＡは、プレクリーニングステップなし（遠心分離及び濾過を除く）のさらなる対照である。プロセスＡ及びＢは、国際公開第２０１５１３５８８４号に記載されている。すべてのプロセスは室温で行った。プロテインＡクロマトグラフィーは、実施例８．２に記載されているように実施した。
【0223】
【表10】
【0224】
プロセスＡ：細胞分離→深層濾過→精密濾過→プロテインＡ
プロセスＢ：細胞分離→深層濾過→精密濾過→陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｎｕｖｉａ Ｑ、フロースルー）→プロテインＡ（国際公開第２０１５１３５８８４号に記載）
プロセスＣ：細胞分離→凝集（ｐＤＡＤＭＡＣ）→深層濾過→精密濾過→プロテインＡ
プロセスＣでの浸出プロテインＡは、対照プロセスＡと比較して浸出プロテインＡを低くするために既に有益な改善となっているプロセスＢよりも大幅に低いものであった。プロセスＣでの浸出プロテインの減少は、プロセスＢと比較して約４８％、プロセスＡと比較して約７９％であった。したがって、ＨＣＤＮＡ及び濁度の顕著な低下に加えて、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集は、浸出プロテインＡをさらに著しく減少させる。
プロセスＢ：細胞分離→深層濾過→精密濾過→陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｎｕｖｉａ Ｑ、フロースルー）→プロテインＡ（国際公開第２０１５１３５８８４号に記載）
プロセスＣ：細胞分離→凝集（ｐＤＡＤＭＡＣ）→深層濾過→精密濾過→プロテインＡ
プロセスＣでの浸出プロテインＡは、対照プロセスＡと比較して浸出プロテインＡを低くするために既に有益な改善となっているプロセスＢよりも大幅に低いものであった。プロセスＣでの浸出プロテインの減少は、プロセスＢと比較して約４８％、プロセスＡと比較して約７９％であった。したがって、ＨＣＤＮＡ及び濁度の顕著な低下に加えて、ｐＤＡＤＭＡＣ凝集は、浸出プロテインＡをさらに著しく減少させる。
【0225】
実施例８：下流プロセス－プレクリーニングした培養上清からの免疫グロブリンの精製
以下では、小規模で開発され、最初にベバシズマブ（ＩｇＧ１）の１００Ｌパイロットスケールプロセスに適用された方法について説明する。同じプロセスにわずかな改変のみ加えて、後に５０００Ｌまでのスケールアップに成功した。さらにわずかな改変の後、このプロセスはトラスツズマブ（ＩｇＧ１）及びデンソスマブ（ＩｇＧ２）でも確立された。
以下では、小規模で開発され、最初にベバシズマブ（ＩｇＧ１）の１００Ｌパイロットスケールプロセスに適用された方法について説明する。同じプロセスにわずかな改変のみ加えて、後に５０００Ｌまでのスケールアップに成功した。さらにわずかな改変の後、このプロセスはトラスツズマブ（ＩｇＧ１）及びデンソスマブ（ＩｇＧ２）でも確立された。
【0226】
実施例８．１：クロマトグラフィー樹脂の選択（表１１）
国際公開第２０１５１３５８８４号に開示された、キャプチャーステップ、中間ステップ、及びポリッシングステップのために一般的に使用されるクロマトグラフィー媒体の拡張スクリーニングに続いて、免疫グロブリンの下流プロセスのために以下のクロマトグラフィー樹脂が選択された（表１１）：
国際公開第２０１５１３５８８４号に開示された、キャプチャーステップ、中間ステップ、及びポリッシングステップのために一般的に使用されるクロマトグラフィー媒体の拡張スクリーニングに続いて、免疫グロブリンの下流プロセスのために以下のクロマトグラフィー樹脂が選択された（表１１）：
【0227】
【表11】
【0228】
クロマトグラフィーの実行は、Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して室温で行った。
実施例８．２：プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸを使用して行った（表１１）。実施例５に記載されるように、凝集した上清の深層濾過及び精密濾過の後にサンプルを採取した。カラムの寸法は、直径２０ｃｍ×ベッド高１０．４ｃｍ（充填量約３．３Ｌ）であった。プロテインＡカラムは、２０ｍＭトリス－酢酸バッファー、ｐＨ７．２で平衡化した。生成物溶液（約４９．５Ｌ）を、１５．８～４０．６タンパク質／Ｌ樹脂でロードした。カラムを平衡化バッファー（２ＣＶ）で洗浄し、続いて４０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で洗浄した。溶出は１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で行った。流量は２１０ｃｍ／ｈであった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ樹脂の再生は、（ｉ）０．２Ｍ ＮａＯＨ（２ＣＶ）、（ｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）、３．５％酢酸、１００ｍＭ硫酸ナトリウム（２ＣＶ）及び（ｉｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）で連続して逆方向に洗浄することにより行った。カラムは次の実行のために再平衡化するか、２０％エタノール中で保存した。収率は９４～９８％であった。
実施例８．２：プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸを使用して行った（表１１）。実施例５に記載されるように、凝集した上清の深層濾過及び精密濾過の後にサンプルを採取した。カラムの寸法は、直径２０ｃｍ×ベッド高１０．４ｃｍ（充填量約３．３Ｌ）であった。プロテインＡカラムは、２０ｍＭトリス－酢酸バッファー、ｐＨ７．２で平衡化した。生成物溶液（約４９．５Ｌ）を、１５．８～４０．６タンパク質／Ｌ樹脂でロードした。カラムを平衡化バッファー（２ＣＶ）で洗浄し、続いて４０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で洗浄した。溶出は１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で行った。流量は２１０ｃｍ／ｈであった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ樹脂の再生は、（ｉ）０．２Ｍ ＮａＯＨ（２ＣＶ）、（ｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）、３．５％酢酸、１００ｍＭ硫酸ナトリウム（２ＣＶ）及び（ｉｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）で連続して逆方向に洗浄することにより行った。カラムは次の実行のために再平衡化するか、２０％エタノール中で保存した。収率は９４～９８％であった。
【0229】
実施例８．３：ウイルス不活化
図１及び２に示すように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後にウイルス不活化ステップが行われる。アフィニティーマトリックスからの低ｐＨ溶出物を利用する。このような酸性の水性環境では、多くのウイルス、特にエンベロープタイプのウイルスは不安定であり、崩壊する。本発明のために開発されたプロテインＡ法は、ｐＨが３．５の溶出液を生成する（実施例８．２を参照のこと）。モノクローナル抗体は、１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）中のプロテインＡカラムからウイルス不活化タンクＡに直接溶出された。溶出液はタンクＡで直接ＷＦＩによって約２倍に希釈された。溶液のｐＨを制御し、必要に応じて１００ｍＭクエン酸で３．５に再調整し、続いて溶液をウイルス不活化タンクＢに移し、６５ｒｐｍ、温度２０～２４℃で６０分間撹拌した。次に、溶液のｐＨを１００ｍＭ ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整し、後続の陽イオン交換クロマトグラフィーステップの開始条件を提供した。
図１及び２に示すように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後にウイルス不活化ステップが行われる。アフィニティーマトリックスからの低ｐＨ溶出物を利用する。このような酸性の水性環境では、多くのウイルス、特にエンベロープタイプのウイルスは不安定であり、崩壊する。本発明のために開発されたプロテインＡ法は、ｐＨが３．５の溶出液を生成する（実施例８．２を参照のこと）。モノクローナル抗体は、１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）中のプロテインＡカラムからウイルス不活化タンクＡに直接溶出された。溶出液はタンクＡで直接ＷＦＩによって約２倍に希釈された。溶液のｐＨを制御し、必要に応じて１００ｍＭクエン酸で３．５に再調整し、続いて溶液をウイルス不活化タンクＢに移し、６５ｒｐｍ、温度２０～２４℃で６０分間撹拌した。次に、溶液のｐＨを１００ｍＭ ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整し、後続の陽イオン交換クロマトグラフィーステップの開始条件を提供した。
【0230】
実施例８．４：Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳを使用した陽イオン交換クロマトグラフィー
ＨＣＰや浸出プロテインＡなどの混入物、及びチャージバリアントや凝集体などの生成物関連物質の分離は、中間ステップとして使用されるスルホプロピル（ＳＰ）リガンド（表１１）を使用した強陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われた。Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ樹脂を充填したカラム（寸法＝直径１４ｃｍ×ベッド高４１ｃｍ、充填量約６．３Ｌ）を、（ｉ）ＷＦＩ（注射用水、２ＣＶ）及び（ｉｉ）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９（２ＣＶ）で連続して平衡化した。実施例８．３に記載のウイルス不活化及びサンプル調整（ｐＨ４．５）後に得られた生成物溶液を、約７．３～１７．１ｇタンパク質／Ｌ樹脂でカラムにロードし、それにより、０．４５μｍのＫｌｅｅｎｐａｋ Ｎｏｖａプレフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通過させた。グラジエント溶出を行う前に、カラムをＷＦＩ（１ＣＶ）及び平衡化バッファー（２ＣＶ）で洗浄した。グラジエントは、勾配の異なる２つの部分で構成される。グラジエントは、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９（バッファーＡ）と４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２（バッファーＢ）とを次の比率と順序で混合することによって形成された：（ｉ）１００％Ａ（０．２ＣＶ）、（ｉｉ）４０％Ａ＋６０％Ｂ（２ＣＶ）への線形勾配；（ｉｉｉ）１００％Ｂ（１０ＣＶ）への線形勾配；（ｉｖ）１００％Ｂ（２ＣＶ）。グラジエント中の流量は７５ｃｍ／ｈ、それ以外は１５０ｃｍ／ｈであった。溶出液を画分に分けて、特定のプーリングを可能にした。グラジエント溶出中の画分の収集は、Ａ２８０が０．１ＡＵを超える値に上昇したときに開始した。画分体積は約２Ｌであった。合計で約２０の画分を収集した。Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ樹脂の再生は、（ｉ）１Ｍ ＮａＣｌ（２ＣＶ）及び（ｉｉ）１Ｍ ＮａＯＨ（２ＣＶ）で連続して洗浄することにより行った。その後、カラムを１０ｍＭ ＮａＯＨに保存した。選択したプールの収率は、生成物に関連する不純物が大量に枯渇したため、約６２～６８％であった。
ＨＣＰや浸出プロテインＡなどの混入物、及びチャージバリアントや凝集体などの生成物関連物質の分離は、中間ステップとして使用されるスルホプロピル（ＳＰ）リガンド（表１１）を使用した強陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われた。Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ樹脂を充填したカラム（寸法＝直径１４ｃｍ×ベッド高４１ｃｍ、充填量約６．３Ｌ）を、（ｉ）ＷＦＩ（注射用水、２ＣＶ）及び（ｉｉ）２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９（２ＣＶ）で連続して平衡化した。実施例８．３に記載のウイルス不活化及びサンプル調整（ｐＨ４．５）後に得られた生成物溶液を、約７．３～１７．１ｇタンパク質／Ｌ樹脂でカラムにロードし、それにより、０．４５μｍのＫｌｅｅｎｐａｋ Ｎｏｖａプレフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通過させた。グラジエント溶出を行う前に、カラムをＷＦＩ（１ＣＶ）及び平衡化バッファー（２ＣＶ）で洗浄した。グラジエントは、勾配の異なる２つの部分で構成される。グラジエントは、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．９（バッファーＡ）と４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２（バッファーＢ）とを次の比率と順序で混合することによって形成された：（ｉ）１００％Ａ（０．２ＣＶ）、（ｉｉ）４０％Ａ＋６０％Ｂ（２ＣＶ）への線形勾配；（ｉｉｉ）１００％Ｂ（１０ＣＶ）への線形勾配；（ｉｖ）１００％Ｂ（２ＣＶ）。グラジエント中の流量は７５ｃｍ／ｈ、それ以外は１５０ｃｍ／ｈであった。溶出液を画分に分けて、特定のプーリングを可能にした。グラジエント溶出中の画分の収集は、Ａ２８０が０．１ＡＵを超える値に上昇したときに開始した。画分体積は約２Ｌであった。合計で約２０の画分を収集した。Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ樹脂の再生は、（ｉ）１Ｍ ＮａＣｌ（２ＣＶ）及び（ｉｉ）１Ｍ ＮａＯＨ（２ＣＶ）で連続して洗浄することにより行った。その後、カラムを１０ｍＭ ＮａＯＨに保存した。選択したプールの収率は、生成物に関連する不純物が大量に枯渇したため、約６２～６８％であった。
【0231】
実施例８．５：ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅを使用した混合モードクロマトグラフィー
最終ポリッシングステップは、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンリガンドを使用するＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ混合モード樹脂を使用して行われた（表１１）。リガンドは正に帯電した基を有するため、疎水性相互作用のほかに陰イオン交換体機能も提供する。クロマトグラフィーは、ＨＣＤＮＡ、ＨＣＰ、塩基性チャージバリアントなどの残りの微量混入物を減らすことができる。残留浸出プロテインＡ、生成物凝集体、及び生成物断片もこのステップで除去することができる。ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅポリッシングステップは結合モードで実施される。これにより、選択した最終バッファーへのバッファー交換の利点が得られる。
最終ポリッシングステップは、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンリガンドを使用するＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ混合モード樹脂を使用して行われた（表１１）。リガンドは正に帯電した基を有するため、疎水性相互作用のほかに陰イオン交換体機能も提供する。クロマトグラフィーは、ＨＣＤＮＡ、ＨＣＰ、塩基性チャージバリアントなどの残りの微量混入物を減らすことができる。残留浸出プロテインＡ、生成物凝集体、及び生成物断片もこのステップで除去することができる。ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅポリッシングステップは結合モードで実施される。これにより、選択した最終バッファーへのバッファー交換の利点が得られる。
【0232】
実施例８．４に記載の手順の後に得られたＰｏｒｏｓ ５０ ＨＳプールのｐＨを、１００ｍＭ ＮａＯＨを加えることによりｐＨ７．２に調整した。充填カラムのサイズは、直径１４ｃｍ×ベッド高２３ｃｍ（充填容量約３．５Ｌ）であった。樹脂を５０．４８ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２（３ＣＶ）で平衡化した。生成物溶液を、６．３～１７．８ｇタンパク質／Ｌ樹脂でカラムにロードし、続いて平衡化バッファー（３ＣＶ）をロードした。溶出は５０．４８ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で行った。流量は２４０ｃｍ／ｈであった。収率は８７～９８％の範囲であった。カラムは、２Ｍ ＮａＣｌ＋１００ｍＭクエン酸（２ＣＶ）及び１Ｍ ＮａＯＨ（２ＣＶ）を逆流させて再生した。
【0233】
実施例８．６：ＣａｐｔｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
この例では、混合モードクロマトグラフィーの代わりに、ＣａｐｔｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィーを最終ポリッシングステップとして行った。陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実施した。カラムにロードする前に、陽イオン交換クロマトグラフィーのプールされた画分を酢酸でｐＨ８．０に調整した。ＣａｐｔｏＱカラムは、２５ｍＭトリスバッファー、ｐＨ８．０で平衡化した。サンプルをロードした後、同じバッファーでクロマトグラフィーを実施した。免疫グロブリンはクロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで得られた。
この例では、混合モードクロマトグラフィーの代わりに、ＣａｐｔｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィーを最終ポリッシングステップとして行った。陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実施した。カラムにロードする前に、陽イオン交換クロマトグラフィーのプールされた画分を酢酸でｐＨ８．０に調整した。ＣａｐｔｏＱカラムは、２５ｍＭトリスバッファー、ｐＨ８．０で平衡化した。サンプルをロードした後、同じバッファーでクロマトグラフィーを実施した。免疫グロブリンはクロマトグラフィー樹脂に結合せず、フロースルーで得られた。
【0234】
例８．７：ウイルス濾過
ナノ濾過は、最終的なウイルス除去ステップであり、ナノメートル範囲のサイズ排除に基づいて動作する最も要求が厳しく、最も信頼性の高いウイルス除去方法である。ウイルス濾過は、実施例８．５のＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ溶出プール又は実施例８．６のＣａｐｔｏＱフロースループールを使用する混合モードクロマトグラフィーの直後に、リン酸ナトリウムでｐＨを６．２又は酢酸でｐＨ５．０に適合させた後に行った。ウイルス除去濾過は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏ Ｍｏｄｕｓ １．１デバイス（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＱｕａｔｔｒｏＦｌｏｗ １５０ダイアフラムポンプを使用して室温で行った。凝集体によるウイルスフィルターの目詰まりを避けるために、０．１μｍのポアサイズのＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ １５０ ＰＥＳフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をウイルスフィルターの前に配置した。フィルターを、１．５Ｌの製剤用バッファー、例えば、５０．４８ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．２又は１８ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２でコンディショニングした。濾過プロセス中の圧力設定値は２００±２０ｋＰａ（２±０．２バール）であった。約５００～６００Ｌ／ｍ２でのローディング後、約０．５～１Ｌの製剤用バッファー、例えば５０．４８ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．２を使用して、フィルタートレインから残留ｍａｂを洗い流した。３４０ｋＰａ（３．４バール）の圧力と１分のテスト期間でウイルスフィルターの完全性試験を行った。
ナノ濾過は、最終的なウイルス除去ステップであり、ナノメートル範囲のサイズ排除に基づいて動作する最も要求が厳しく、最も信頼性の高いウイルス除去方法である。ウイルス濾過は、実施例８．５のＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ溶出プール又は実施例８．６のＣａｐｔｏＱフロースループールを使用する混合モードクロマトグラフィーの直後に、リン酸ナトリウムでｐＨを６．２又は酢酸でｐＨ５．０に適合させた後に行った。ウイルス除去濾過は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏ Ｍｏｄｕｓ １．１デバイス（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＱｕａｔｔｒｏＦｌｏｗ １５０ダイアフラムポンプを使用して室温で行った。凝集体によるウイルスフィルターの目詰まりを避けるために、０．１μｍのポアサイズのＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ １５０ ＰＥＳフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をウイルスフィルターの前に配置した。フィルターを、１．５Ｌの製剤用バッファー、例えば、５０．４８ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．２又は１８ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２でコンディショニングした。濾過プロセス中の圧力設定値は２００±２０ｋＰａ（２±０．２バール）であった。約５００～６００Ｌ／ｍ２でのローディング後、約０．５～１Ｌの製剤用バッファー、例えば５０．４８ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．２を使用して、フィルタートレインから残留ｍａｂを洗い流した。３４０ｋＰａ（３．４バール）の圧力と１分のテスト期間でウイルスフィルターの完全性試験を行った。
【0235】
実施例８．８：タンジェンシャルフロー限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＴＦ－ＵＦ／ＤＦ）
最終的な限外濾過／ダイアフィルトレーションステップの役割は、タンパク質溶液の濃度を調整し、必要に応じて医薬品バルク製剤へのバッファー交換を実施することである。最終ポリッシングステップが結合モードの混合モードクロマトグラフィーであった場合、結合モードによって可能になった混合モードクロマトグラフィーのレベルでバッファー交換は既に行われている（実施例８．５を参照）。さらに、バッファーに加えて、界面活性剤、安定剤及び／又は凍結保存剤などの最終バルク製剤の他の成分を、ダイアフィルトレーションを介して導入することができる。あるいは、濃縮ｍａｂ溶液にこれらの物質を直接補充する。
最終的な限外濾過／ダイアフィルトレーションステップの役割は、タンパク質溶液の濃度を調整し、必要に応じて医薬品バルク製剤へのバッファー交換を実施することである。最終ポリッシングステップが結合モードの混合モードクロマトグラフィーであった場合、結合モードによって可能になった混合モードクロマトグラフィーのレベルでバッファー交換は既に行われている（実施例８．５を参照）。さらに、バッファーに加えて、界面活性剤、安定剤及び／又は凍結保存剤などの最終バルク製剤の他の成分を、ダイアフィルトレーションを介して導入することができる。あるいは、濃縮ｍａｂ溶液にこれらの物質を直接補充する。
【0236】
実施例８．７のナノ濾過された生成物溶液を、ＵＦ／ＤＦスキッドのタンクに収集し、Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅメンブレンカセット（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、３０ｋＤカットオフ）を使用して約４０＋／－２ｇ／Ｌに濃縮した。供給圧力は、ＱｕａｔｔｒｏＦｌｏｗ１５０ダイアフラムポンプで提供された。膜貫通圧力は１００ｋＰａ（１バール）に設定され、供給圧力と保持液圧力はそれぞれ１００ｋＰａ（１．０バール）及び６０ｋＰａ（０．６バール）であった。このステップでは、ｍａｂの損失はなかった。濃縮された生成物溶液には、ポリソルベート２０及びトレハロース又はソルビトールが補充された。ｍａｂの最終バルク濃度は、例えば３０＋／－２ｇ／Ｌ又は８０＋／－５ｇ／Ｌに調整された。最終的な精密濾過（滅菌濾過）は、０．２μｍ Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターカプセル（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。
【0237】
参考文献一覧
【0238】
【表12-1】
【0239】
【表12-2】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【国際調査報告】