特表2022-527062製剤化された生物製剤製品のための、天然存在比での二次元（２Ｄ）核磁気共鳴技術によって治療用タンパク質をフィンガープリントする方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-30
(54)【発明の名称】製剤化された生物製剤製品のための、天然存在比での二次元（２Ｄ）核磁気共鳴技術によって治療用タンパク質をフィンガープリントする方法
(51)【国際特許分類】
G01N 24/08 20060101AFI20220523BHJP
G01N 24/00 20060101ALI20220523BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20220523BHJP
A61K 38/02 20060101ALN20220523BHJP
A61K 47/10 20060101ALN20220523BHJP
A61K 47/26 20060101ALN20220523BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20220523BHJP
【ＦＩ】
G01N24/08 510Q
G01N24/00 530M
G01N24/00 530J
A61K39/395 N
A61K38/02
A61K47/10
A61K47/26
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021557088
(86)(22)【出願日】2020-03-26
(85)【翻訳文提出日】2021-09-22
(86)【国際出願番号】 US2020025078
(87)【国際公開番号】W WO2020198538
(87)【国際公開日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】62/824,947
(32)【優先日】2019-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500203709
【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ツァン－リン
(72)【発明者】
【氏名】ウィクストローム， マッツ エイチ．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076DD38
4C076DD67
4C076FF70
4C084AA01
4C084NA05
4C084NA20
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA50
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする方法が開示される。開示されたＮＭＲ法により、既存のＮＭＲ技術に対するいくつかの変更及び改良がもたらされる。いくつかの実施形態では、方法は、高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、水抑制技術（ＷＥＴ）を適用することとを含む、シグナル処理工程のサイクルを適用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする方法であって、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも含む前記組成物を提供することであって、前記シグナルの各々は、０ではない核スピンを有する前記それぞれの分子の各々から生じる、前記組成物を提供することと、
シグナル処理工程のサイクルを適用することであって、前記サイクルが、
高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、
１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、
水抑制技術（ＷＥＴ）を適用することであって、
前記第１のＮＭＲシグナル、前記第２のＮＭＲシグナル、及び前記第３のＮＭＲシグナルは、１３Ｃメチルシグナルの定義されたｐｐｍ範囲のＮＭＲスペクトルの領域に位置することと
を含む、シグナル処理工程のサイクルを適用することと、
増強された前記組成物のシグナルを取得するために、前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことと、
前記増強された前記組成物のシグナルに基づいて、前記特定の分子をフィンガープリントすることと、
を含む、方法。
【請求項2】
ＮＭＲスペクトルの前記領域が、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＮＭＲスペクトルの前記領域が、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＮＭＲスペクトルの前記領域が、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＮＭＲスペクトルの前記領域が、約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＦパルスが、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルスの組み合わせ、又は非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、前記第１のＮＭＲシグナルを励起する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記広帯域反転パルスが、前記ＮＭＲシグナルの各々を励起し、前記Ｇ３反転パルスが、前記第２のＮＭＲシグナルを抑制する、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記非対称断熱パルスが、前記第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら前記第１のＮＭＲシグナルを励起する、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記第１のＮＭＲシグナルが、１３Ｃメチルに関連するＮＭＲシグナルであり、前記第２のＮＭＲシグナルが、１３Ｃスクロースに関連するシグナルであり、前記第３のＮＭＲシグナルが、１Ｈアセテート、又はグルタメート、プロリン、アルギニン、若しくはマンニトールのうちの１つからなる他の賦形剤からの１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲシグナルに少なくとも関連するシグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、約５００μｓ～約１０００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、約６００μｓ～約９００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項14】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、約６００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項15】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２００μｓ～約２５００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項16】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２００μｓ～約２０００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項17】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２００μｓ～約１５００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２５０μｓ～約１０００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項19】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２５０μｓ～約７５０μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項20】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約６２０μｓ～６６０μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項21】
前記ＢＩＰが約１２０μｓ～１６０μｓのパルス長を有し、前記Ｇ３反転パルスが約５００μｓのパルス長を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約２５００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項23】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約２０００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項24】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約１５００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項25】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約１０００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項26】
前記非対称断熱パルスが、約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項27】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約９９０μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約９００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約８００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項30】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約７００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項31】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約６００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項32】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約５００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項33】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約４００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項34】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約３００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項35】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約２５０μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項36】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約２００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項37】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約１５０μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項38】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約１００μｓのパルス長範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項39】
前記勾配パルスの後に、同一のパルス長範囲を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、同一のパルス長範囲を有する別の勾配パルスが続く、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことが、約１０μｓ～約９９０μｓの範囲の前記繰り返しにおける遅延を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項42】
前記遅延が、約３０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約１００μｓ～約６００μｓ、約１５０μｓ～約５００μｓ、又は約２００μｓ～約３００μｓである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする方法であって、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも含む前記組成物を提供することであって、前記シグナルの各々は、０ではない核スピンを有する前記それぞれの分子の各々から生じる、前記組成物を提供することと、
シグナル処理工程のサイクルを適用することであって、前記サイクルが、
高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、
勾配パルスを印加することであって、
前記第１のＮＭＲシグナル、前記第２のＮＭＲシグナル、及び前記第３のＮＭＲシグナルが、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウの領域に位置することと
を含む、シグナル処理工程のサイクルを適用することと、
増強された前記組成物のシグナルを取得するために、前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことと、
前記増強された前記組成物のシグナルに基づいて、前記特定の分子をフィンガープリントすることと、
を含む、方法。
【請求項44】
前記サイクルが、前記第３のＮＭＲシグナルを抑制するために水抑制技術（ＷＥＴ）シーケンスを適用すること
をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
ＮＭＲスペクトルの前記領域が、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、又は約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
前記ＲＦパルスが、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルスの組み合わせ、並びに非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項47】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、前記第１のＮＭＲシグナルを励起する、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記広帯域反転パルスが、広範囲のＮＭＲシグナルを励起し、前記Ｇ３反転パルスが、前記第２のＮＭＲシグナルを抑制する、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記非対称断熱パルスが、前記第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら前記第１のＮＭＲシグナルを励起する、請求項４６に記載の方法。
【請求項50】
前記第１のＮＭＲシグナルが、１３Ｃメチルに関連するＮＭＲシグナルであり、前記第２のＮＭＲシグナルが、１３Ｃスクロースに関連するＮＭＲシグナルに関連するシグナルであり、前記第３のＮＭＲシグナルが、１Ｈアセテート、又はグルタメート、プロリン、アルギニン、若しくはマンニトールのうちの１つからの１３Ｃ ＮＭＲシグナルに少なくとも関連するシグナルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項51】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項４３に記載の方法。
【請求項52】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、約５００μｓ～約１０００μｓ、約６００μｓ～約９００μｓ、又は約６００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項53】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２００μｓ～約２５００μｓ、約２００μｓ～約２０００μｓ、約２００μｓ～約１５００μｓ、約２５０μｓ～約１０００μｓ、又は約２５０μｓ～約７５０μｓのパルス長を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項54】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約６２０μｓ～６６０μｓのパルス長を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項55】
前記ＢＩＰが約１２０μｓ～１６０μｓのパルス長を有し、前記Ｇ３反転パルスが約５００μｓのパルス長を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約２５００μｓ、約５０μｓ～約２０００μｓ、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、又は約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項57】
前記勾配パルスが、１０００μｓ以下のパルス長を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項58】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約１０００μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長範囲を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項59】
前記勾配パルスの後に、同一のパルス長又は同一のパルス長範囲を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く、請求項５７又は５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、同一のパルス長範囲を有する別の勾配パルスが続く、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことが、約１０μｓ～約９９０μｓ、約３０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約１００μｓ～約６００μｓ、約１５０μｓ～約５００μｓ、又は約２００μｓ～約３００μｓの範囲の前記繰り返しにおける遅延を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項62】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする方法であって、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも含む前記組成物を提供することであって、前記シグナルの各々は、０ではない核スピンを有する前記それぞれの分子の各々から生じる、前記組成物を提供することと、
前記第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら前記第１のＮＭＲシグナルを励起するために、高周波（ＲＦ）パルスを前記組成物に印加することであって、前記ＲＦパルスは、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス及びガウシアン反転パルスの組み合わせ、並びに非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む、高周波（ＲＦ）パルスを前記組成物に印加することと、
１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、
前記第３のＮＭＲシグナルを抑制するために水抑制技術（ＷＥＴ）シーケンスを適用することと、
増強された前記組成物のシグナルを取得することと、
前記増強された前記組成物のシグナルに基づいて、前記特定の分子をフィンガープリントすることと、
を含む、方法。
【請求項63】
前記第１のＮＭＲシグナル、前記第２のＮＭＲシグナル、及び前記第３のＮＭＲシグナルが、１３Ｃメチルシグナルの近傍のＮＭＲスペクトルの領域に位置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記第１のＮＭＲシグナル、前記第２のＮＭＲシグナル、及び前記第３のＮＭＲシグナルが、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウに位置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項65】
前記第１のＮＭＲシグナル、前記第２のＮＭＲシグナル、及び前記第３のＮＭＲシグナルが、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、又は約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウに位置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項66】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項６２に記載の方法。
【請求項67】
前記Ｒｅｂｕｒｐパルスが、約５００μｓ～約１０００μｓ、約６００μｓ～約９００μｓ、又は約６００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項68】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約２００μｓ～約２５００μｓ、約２００μｓ～約２０００μｓ、約２００μｓ～約１５００μｓ、約２５０μｓ～約１０００μｓ、又は約２５０μｓ～約７５０μｓのパルス長を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項69】
前記ＢＩＰ及び前記Ｇ３反転パルスの前記組み合わせが、約６２０μｓ～６６０μｓのパルス長を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項70】
前記ＢＩＰが約１２０μｓ～１６０μｓのパルス長を有し、前記Ｇ３反転パルスが約５００μｓのパルス長を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記非対称断熱パルスが、約５０μｓ～約２５００μｓ、約５０μｓ～約２０００μｓ、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、又は約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項72】
前記勾配パルスが、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長範囲を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項73】
前記勾配パルスの後に、同一のパルス長範囲を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、同一のパルス長範囲を有する別の勾配パルスが続く、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記ＲＦパルス、前記勾配パルス、及び前記ＷＥＴシーケンスを前記印加することが、シグナル処理工程のサイクルを構成し、前記方法は、前記増強された前記組成物のシグナルを取得するために、前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項76】
前記サイクルを少なくとも３回繰り返すことが、約１０μｓ～約９９０μｓ、約３０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約１００μｓ～約６００μｓ、約１５０μｓ～約５００μｓ、又は約２００μｓ～約３００μｓの範囲の前記繰り返しにおける遅延を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
１３Ｃメチルに関連する前記第１のＮＭＲシグナルが、抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＦＬＴ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（ブリナツモマブ）並びにソリトマブからなる群から選択されるＢｉＴＥ（登録商標）分子；アダリムマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エレヌマブ、エボロクマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、及びトラスツズマブからなる群から選択される抗体、並びに表Ａから選択される抗体；並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質によってもたらされる、請求項１０又は５０に記載の方法。
【請求項78】
前記第１のＮＭＲシグナルが、１３Ｃメチルに関連するＮＭＲシグナルであり、前記第２のＮＭＲシグナルが、１３Ｃスクロースに関連するＮＭＲシグナルに関連するシグナルであり、前記第３のＮＭＲシグナルが、１Ｈアセテート、又はグルタメート、プロリン、アルギニン、若しくはマンニトールのうちの１つからの１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲシグナルに少なくとも関連するシグナルである、請求項６２に記載の方法。
【請求項79】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約５００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約５００ＭＨｚ～約１０００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約９００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項82】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約８００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約７００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約６００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
ＮＭＲを使用するための前記方法が、約５００ＭＨｚの周波数範囲で実行される、請求項１１、５１又は６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記第３のＮＭＲシグナルが、グルタメート又はプロリンに関連する、請求項１０、５０又は７８のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。「０４１９２５－０９２４＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提出された配列表は、２０２０年１月６日に作成され、サイズは２６５ＫＢである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。「０４１９２５－０９２４＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提出された配列表は、２０２０年１月６日に作成され、サイズは２６５ＫＢである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
抗体などの医薬的に活性なタンパク質、及び組換え治療用タンパク質（部類としては「治療用タンパク質」）は、多くの場合、注射剤用などの液体溶液中で製剤化される。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透性を変更、維持又は保護するための作用物質を含み得る。
【0003】
一般に、賦形剤は、それにより様々な化学的及び物理的ストレスに対してタンパク質を安定化させる機序に基づいて分類され得る。一部の賦形剤は、特定のストレスの影響を緩和するか、又は特異的ポリペプチドの特定の感受性を調節する。その他の賦形剤は、タンパク質の物理的安定性及び共有結合の安定性に対してより一般的な効果を有する。医薬的液状タンパク質製剤の一般的な賦形剤は、例えば、Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ ＴＪ，Ｅｓｆａｎｄｉａｒｙ Ｒ，Ｊｏｓｈｉ ＳＢ，Ｍｉｄｄａｕｇｈ ＣＲ，Ｖｏｌｋｉｎ ＤＢ．２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６３：１１１８－５９に記載されている。
【0004】
医薬製剤／組成物の開発、製造、及び製剤化の際の治療用タンパク質の高次構造（例えば、二次構造、三次構造、及び四次構造；ＨＯＳ）は、治療用タンパク質の有効性及び安全性を確保するために評価される。これは、ＨＯＳが品質、安定性、安全性及び有効性に影響を与え得る（ＨＯＳが経時的に変化すると、免疫原性が機能を損失する可能性が大きくなる）重要品質特性（ＣＱＡ）であるためである。ＣＱＡは、特定の値又は範囲の値内に存在する化学的、物理的、又は生物学的特性である。ポリペプチドの治療用高分子において、物理的属性及びアミノ酸（ポリペプチドのビルディングブロック）の修飾は重要なＣＱＡであり、製造中及び製造後（並びに薬物開発中）に監視される。同様に、ＨＯＳはＣＱＡではあるが、製剤中の賦形剤（例えば、スクロース及びアセテート）が、（抗体若しくはそれらのフラグメント、又は誘導体及びそれらの類縁体などの）治療用タンパク質のメチルピークと強力に干渉するため、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、製剤化された治療用タンパク質のＨＯＳを検出することが困難な場合がある。
ＮＭＲに基づく方法及び技術は、タンパク質のＨＯＳを検出するのに有用ではあるが、多成分溶液中の標的タンパク質のフィンガープリントを対象とする場合、実行することが困難な場合がある。特に、生成されたＮＭＲスペクトルにおいて、特に治療用タンパク質によって生成されるシグナルと同一の検出領域でシグナルを生成するような、溶液中の他の分子からのシグナルに対して、標的分子（例えば治療用タンパク質）からの物標シグナルを検出するようにＮＭＲ技術を向上させるという課題が残されている。したがって、この課題を解決するための画期的な手法が必要とされている。
ＮＭＲに基づく方法及び技術は、タンパク質のＨＯＳを検出するのに有用ではあるが、多成分溶液中の標的タンパク質のフィンガープリントを対象とする場合、実行することが困難な場合がある。特に、生成されたＮＭＲスペクトルにおいて、特に治療用タンパク質によって生成されるシグナルと同一の検出領域でシグナルを生成するような、溶液中の他の分子からのシグナルに対して、標的分子（例えば治療用タンパク質）からの物標シグナルを検出するようにＮＭＲ技術を向上させるという課題が残されている。したがって、この課題を解決するための画期的な手法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ ＴＪ，Ｅｓｆａｎｄｉａｒｙ Ｒ，Ｊｏｓｈｉ ＳＢ，Ｍｉｄｄａｕｇｈ ＣＲ，Ｖｏｌｋｉｎ ＤＢ．２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６３：１１１８－５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。この方法では、シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、シグナル処理工程のサイクルを適用することを含む。このサイクルは、高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、水抑制技術（ＷＥＴ）を適用することとを含む。この方法では、第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、ＮＭＲスペクトルの定義された領域に位置する。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0007】
ＮＭＲを使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする別の例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。この方法では、シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、シグナル処理工程のサイクルを適用することを含む。サイクルは、ＲＦパルスを印加することと、勾配パルスを印加することとを含む。この方法では、第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウの領域に位置する。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0008】
さらに、ＮＭＲを使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする別の例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。この方法では、シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら第１のＮＭＲシグナルを励起するために、ＲＦパルスを組成物に印加することを含む。ＲＦパルスは、Ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｂａｎｄ－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ ｗｉｔｈ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｐｈａｓｅ（Ｒｅｂｕｒｐ）パルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルスの組み合わせ、並びに非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む。方法はまた、１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、第３のＮＭＲシグナルを抑制するためにＷＥＴシーケンスを適用することとを含む。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0009】
これら及び他の態様及び実装形態を、下記で詳細に述べる。前述の情報及び以下の発明を実施するための形態は、種々の態様及び実装形態の実例を含んでおり、開示される態様及び実装形態の性質及び特徴を理解するための概要又は機構を提供するものである。図面は、種々の様態及び実装形態の図解及び更なる理解を提供するものであり、本明細書の一部に組み込まれるとともに本明細書の一部をなすものである。
【0010】
添付図面は縮尺通りに描かれていることを意図していない。異なる図面における類似の参照番号及び表記は、類似の構成要素を示す。明確にするために、すべての図面にすべての構成要素を標記することは不可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】従来のプロトン－炭素（１Ｈ－１３Ｃ）感度増強Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＱＣ）実験と、本明細書に記載される実験スキームに基づく追加のシグナル処理工程との組み合わせを使用した、例示的なＮＭＲシグナル増強技術を示す。
【図2】本明細書に開示されるような１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づく、ＮＭＲシグナル増強技術の別の例を示す。
【図3A-3F】
１３Ｃスクロースシグナルを抑制するための、異なる形状を有するパルスの例示的な励起プロファイルを示す。
【図4】
１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づいて、スクロース、アセテート、及びメチルピークのシグナル強度を図で比較したものを示す。
【図5】例示的なＨＳＱＣ実験において異なるＲＦパルスを使用した、本明細書に開示される１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づいて、スクロース及びメチルピークのシグナル強度を図で比較したものを示す。
【図6A】特定のＮＭＲ増強方法の有効性を比較するための、異なる１３Ｃ ２Ｄメチルフィンガープリントのプロットを示す。
【図6B】同上。
【図6C】同上。
【図7】様々な実施形態による、１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づく、ＮＭＲシグナル増強技術の別の例を示す。
【図8】実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態（８０２）、及び抑制した状態（８０４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトルを示す。
【図9A】実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図9B】実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図10】実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制していない状態（１００２）、及び抑制した状態（１００４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトルを示す。
【図11A】実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図11B】実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図12】実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態（１２０２）、及び抑制した状態（１２０４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトルを示す。
【図13】様々な実施形態による、ダブルＷＥＴスキームに基づく、ＮＭＲシグナル増強技術の別の例を示す。
【図14A】実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図14B】実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図15A-15E】
１３Ｃスクロースシグナルを抑制するための、異なる形状を有するパルスの例示的な励起プロファイルを示す。
【図16A】リフォーカシング要素として、トランスミッターオフセット１６ｐｐｍ、パルス長３７５μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝５０、０．１Ｔｐ］、及び１Ｈアセテートシグナルを抑制するためのＷＥＴシーケンスを使用した、ＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図16B】トランスミッターオフセット１８ｐｐｍ、パルス長７５０μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝７０、０．１Ｔｐ］を使用した、ＨＳＱＣスペクトルの２Ｄメチル領域を示す。
【図17】８００ＭＨｚのＮＭＲシステムを使用して得られた、例示的なＨＳＱＣ実験において異なるＲＦパルスを使用した１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づく、メチルピークのシグナル強度を図で比較したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
一般に、本開示は、化学的組成物の構造をマッピングするための２次元（２Ｄ）核磁気共鳴技術によって、複合体の治療用タンパク質をフィンガープリントする方法に関する。
【0013】
近年、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのタンパク質分子の構造をマッピングするために、２Ｄ １３Ｃ ＮＭＲメチルフィンガープリント法が導入されているが、現況技術のＮＭＲ技術又は方法は、スクロース及びアセテートなどの脂肪族化合物の賦形剤を高濃度に含有する、製剤化されたタンパク質のＨＯＳを評価するためには適用されていなかった。これらの技術の適用は、これらの賦形剤によるスペクトル干渉によって阻まれている。この賦形剤の干渉は、賦形剤のシグナルが多くの場合タンパク質などの標的化学的組成物のシグナルよりも大きなオーダーである場合の適用に特に問題となる可能性があり、ベースラインの歪みが導入されることによって計量化学分析に負の影響を与えたり、又は賦形剤シグナルの近傍において選ばれたピークパラメータの忠実度に影響を与える可能性がある。
【0014】
開示されるＮＭＲ法は、既存のＮＭＲ技術に対して変更と改良とをもたらし、メチルピークに関するスクロース及びアセテートシグナルの強い干渉を克服するものである。記載されている変更されたＮＭＲ技術の使用についての有効性を評価するための、いくつかのサンプル及びサンプルの種類における各種実験の際に、上記で説明した干渉の問題が克服されていることが出願人によって発見された。
【0015】
このように、パルスプロファイルを変更することにより、驚くべきことに、様々なＮＭＲ領域のシグナル対雑音比に大幅な影響を与えることができるということが見出された。例えば、特定のパルスプロファイルを使用して、スクロースに由来するような１３Ｃ賦形剤シグナルを抑制しながら、治療用分子からの１３Ｃメチルシグナルを励起することができる。１ミリ秒（ｍｓ）未満のより短い勾配パルスを印加することによってシグナルをさらに増強し、１３Ｃメチルシグナルの強度を増大させることができる。
【0016】
続いて、改良されたＮＭＲ法における各種特殊因子、並びに、これらの特に記載されている因子の各種組み合わせを利用して、関連する実施形態の評価についての考察及び有効性の検証を行う。
【0017】
開示されたＮＭＲ法の関連する実施形態によれば、方法は、Ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｂａｎｄ－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ ｗｉｔｈ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｐｈａｓｅ（Ｒｅｂｕｒｐ）パルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルス、並びに非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを印加することを含み得る。３種類の異なるパルスのうちの少なくとも１つを印加することにより、スクロースに由来するシグナルなどの１３Ｃ賦形剤シグナルが抑制される一方で、治療用分子の１３Ｃメチルシグナルが励起される。方法はまた、水抑制技術（ＷＥＴ）シーケンスを適用して、１３Ｃシグナルが３種類の異なるパルス（Ｒｅｂｕｒｐ、ＢＩＰ、Ｇ３、断熱）のうちの少なくとも１つによって抑制することができないメチル領域に当たる、１Ｈアセテートシグナル（及び／又は他の賦形剤からのシグナル）を抑制することができる。方法は、治療用分子の１３Ｃメチルシグナルの強度を増大させるために、より短い勾配パルスを印加することをさらに含む。上述したパルスの印加は、医薬製剤などにおけるペプチド及びタンパク質を含む特定の組成物を検出するように、２Ｄ １３Ｃ ＮＭＲメチルフィンガープリントを実行するために使用することができる、開示されたＮＭＲ法において可能となる。
【0018】
ここで、図を参照すると、図１は、いくつかの実施形態による、１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験及び追加のシグナル処理工程の組み合わせを使用する、例示的なＮＭＲシグナル増強パルスプロファイル１００を示す。図２は、いくつかの実施形態による、１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づく、ＮＭＲシグナル増強パルスプロファイル２００の別の例を示す。図３Ａ～３Ｆは、いくつかの実施形態による、１３Ｃスクロースシグナルを抑制するための、異なる形状を有するパルスの例示的な励起プロファイル３００ａ、３００ｂ、及び３００ｃをそれぞれ示す。図１、２、及び３Ａ～３Ｆに示される例示的なＮＭＲシグナル増強技術は、例証を目的としたものにすぎない。
【0019】
図１は、ｍＡｂの２Ｄ １３Ｃ ＮＭＲメチルフィンガープリントに適用されているシグナル処理工程の特定のセットを使用して、現況技術の１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験に、追加のシグナル処理工程を実施したものを示している。図示されるように、特定のシグナルプロファイルを有するＲＦパルスである、図１のパルスプロファイル１００が印加され、プロトン（１Ｈ）磁化を誘起し、続いてＩｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＮＥＰＴ）処理工程によって、直接結合した炭素（１３Ｃ）磁化に移行する。図１において、Δ＝１／２＊Ｊ、δ＝１／８＊Ｊであり、ここで、Ｊを１４５Ｈｚ、φ１＝０，２；及びφｒｅｃ＝０，２に設定した。１ｍｓでＧ１＝８０％、及び１ｍｓでＧ２＝２０．１％（又は２５０μｓでＧ１＝８０％、及び２４６μｓでＧ２＝２０．１％）。１ｍｓでＧ７＝－８０％、１ｍｓでＧ８＝－４０％、１ｍｓでＧ９＝－２０％、１ｍｓでＧ１０＝－１０％、１ｍｓでＧ１１＝５０％、６００μｓでＧ５＝５％、１ｍｓでＧ６＝－２％。１００％での最大勾配強度は約５３．５Ｇ／ｃｍであった（ｔ１及びｔ２は、Ｆ１（ｔ１データ点のフーリエ変換後の周波数１）及びＦ２（ｔ２データ点のフーリエ変換後の周波数２）次元のそれぞれの時間領域データを取得するための期間である）。
【0020】
ＩＮＥＰＴ処理工程を適用すると、Ｔ１展開期の後、炭素磁化の際に炭素周波数が符号化される。続いて、炭素磁化は、感度を増強した逆ＩＮＥＰＴ処理工程の適用による検出のために、再度プロトン磁化に移行する。様々な実装形態では、１Ｈ－１３Ｃ磁化のコヒーレンス選択、（ＮＭＲアクティブでない）１２Ｃに結合するプロトン磁化の抑制、及び２Ｄデータにおける吸収線の形状は、Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｌ．；Ｋｅｅｌｅｒ，Ｊ．；Ｌａｕｅ，Ｅ．Ｄ．；Ｍｏｓｋａｕ，Ｄ．；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｐｕｒｅ－ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｕｓｉｎｇ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１９９２，９８，２０７－２１６；Ｋａｙ，Ｌ．；Ｋｅｉｆｅｒ，Ｐ．；Ｓａａｒｉｎｅｎ，Ｔ．；Ｐｕｒｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，１０６６３－１０６６５；及びＪ．Ｓｃｈｌｅｕｃｈｅｒ，Ｊ．；Ｓｃｈｗｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．；Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．；Ｓｃｈｅｄｌｅｔｚｋｙ，Ｏ．；Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．Ｊ．；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｗ．；及びＧｒｉｅｓｉｎｇｅｒ，Ｏ．Ｗ．；Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｃｈｅｍｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＮＭＲ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ １９９４，４，３０１－３０６に記載されるような、勾配パルス及びエコー／アンチエコースキームを併用することによって達成される。２Ｄ １３Ｃ ＮＭＲメチルフィンガープリント用の現在のＮＩＳＴプロトコルでは、炭素帯域幅は７～３５ｐｐｍに設定され、トランスミッター周波数は２１ｐｐｍである。（図３Ａに示されるように）スクロースの炭素シグナルが６０～１０３ｐｐｍの範囲であるため、このシグナルにより、ＨＳＱＣスペクトルでは７～３５ｐｐｍの範囲で折り返し現象が生じることとなる。場合によっては、折り返されたスクロースシグナルは、適切に位相合わせすることができず、Ｆ２領域の末端領域においてシグナルが分散する結果となる。場合によっては、これらの折り返されたシグナルは、図６Ａに関してさらに詳細に説明するように、メチルピーク分析と干渉する。
【0021】
図１のスクロースシグナルの折り返しによる問題を解決するために、開示されるＮＭＲ法は、エコー／アンチエコースキームの符号化期間に１３Ｃスクロースシグナルを抑制しながら１３Ｃメチルシグナルを励起するように変更されたパルスプロファイルによってパルス設計を改良することを含む。関連する実施形態では、１３Ｃスクロースシグナルを抑制するようにパルスプロファイルを設計することができる。関連する実施形態では、１Ｈスクロースシグナルを抑制するようにパルスプロファイルを設計することができる。関連する実施形態では、プロトンシグナルよりも炭素シグナルの方が分散されているために、１３Ｃスクロースシグナルの抑制は、１Ｈスクロースシグナルの抑制よりも容易である可能性がある。図１に示される励起バンドが７ｐｐｍ～３５ｐｐｍをカバーし、抑制バンドが６０ｐｐｍを超えていることから、移行バンドを例えば６０～３５ｐｐｍに設定することができる。したがって、６００ＭＨｚで動作するＮＭＲシステムの場合、２５ｐｐｍの帯域幅は３７７２．５Ｈｚである（１５０．９Ｈｚ／ｐｐｍ）。しかしながら、プロトン移行は、３．５～２ｐｐｍ以下の、約１．５ｐｐｍ（９００Ｈｚ、６００Ｈｚ／ｐｐｍ）のみであってもよい。帯域幅はＮＭＲ動作周波数に応じて変更することができ、１００ＭＨｚ～２０００ＭＨｚとすることができる。様々な実施形態によれば、ＮＭＲの動作周波数は、約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ～約１０００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ～約９００ＭＨｚ、約６００ＭＨｚ～約８００ＭＨｚの範囲（それらの間のあらゆる周波数範囲を含む）に及ぶことができる。様々な実施形態によれば、ＮＭＲシステムは、約１００ＭＨｚ、約２００ＭＨｚ、約３００ＭＨｚ、約４００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ、約６００ＭＨｚ、約７００ＭＨｚ、約８００ＭＨｚ、約９００ＭＨｚ、約１０００ＭＨｚ、約１１００ＭＨｚ、約１２００ＭＨｚ、約１３００ＭＨｚ、約１４００ＭＨｚ、約１５００ＭＨｚ、約１６００ＭＨｚ、約１７００ＭＨｚ、約１８００ＭＨｚ、約１９００ＭＨｚ、約２０００ＭＨｚの周波数（それらの間のあらゆる周波数を含む）で動作することができる。例証の目的のために、本明細書に記載される実施例１及び２の実験では６００ＭＨｚのＮＭＲシステムを使用し、実施例３の実験では８００ＭＨｚのＮＭＲシステムを使用する。他の磁場強度の場合は、Ｒｅｂｕｒｐ及びＧ３の長さ、並びに非対称断熱パルス用のｐｐｍスケールでのトランスミッターオフセットの位置などの、下記に述べる様々なパルスの特定のパラメータを調整することができる。さらに、動作周波数に応じて、Ｇ２又はＧ４の長さなどの、様々なパルスの特定のパラメータを調整することができる。例えば、８００ＭＨｚのＮＭＲでは、勾配のパルス長は２４８μｓとすることができ、Ｇ２は４０．００％～４０．５０％とすることができ、Ｇ４は－４０．００％～－４０．５０％とすることができる。しかしながら、非対称断熱パルスの性能は、磁界強度に依存する。
【0022】
図２に示される例では、開示されたＮＭＲ法は、例えば、Ｍａｎｄｅｌｓｈｔａｍ，Ｖ．Ａ．；Ｈｕ，Ｈ．；Ｓｈａｋａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＨＳＱＣ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｌｔｅｒ ｄｉａｇｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．１９９８，３６，Ｓ１７－Ｓ２８；及びＨｕ，Ｈ．；Ｓｈａｋａ，Ａ．Ｊ．，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｆｏｃｕｓｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔｓ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｔｉｍｅ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１９９９，１３６，５４－６２に記載されているようなＣＬＵＢサンドイッチ手法を、エコー／アンチエコースキームの符号化期間の間に使用することを含む。ダブルエコー手法を使用してリフォーカシングパルスを設計するとき、設計プロセスは、ダブルエコーシーケンスの終了時の位相がシーケンスの開始時の位相と同一である場合、ダブルエコーシーケンスに使用される要素の反転プロファイルを精査するために単純化される。この手法によって、リフォーカシングプロファイルは、例えば、Ｈｗａｎｇ，Ｔ．－Ｌ．；Ｓｈａｋａ，Ａ．Ｊ．，Ｗａｔｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｗｏｒｋｓ．Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｗａｖｅｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ａ １９９５，１１２，２７５－２７９に記載されるように、二乗した反転要素を用いたスピンフリップの確率となる。これは、ＲＦパルス及びオフセットの影響下における磁化の振幅及び位相応答の両方を考慮する必要がある、Ｒｅｂｕｒｐ又は類似のリフォーカシングパルスの設計とは異なるものである。
【0023】
上記で説明したように、図３Ａ～３Ｆは、いくつかの実施形態による、１３Ｃスクロースシグナルを抑制するための、異なる形状を有するパルスの例示的な励起プロファイルを示す。測定に使用されるサンプルは、重水（Ｄ２Ｏ）中に０．１ｍｇ／ｍｌの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３）を含む１％の水である。上述したように、図３Ａは、スクロース及びアセテートシグナル領域の１３Ｃシグナルのパルスプロファイル３００ａを示している。この図では、スクロース及びアセテートシグナルの両方の相対強度を観察することができる。
【0024】
図３Ｂは、関連する実施形態による、Ｒｅｂｕｒｐプロファイルのパルスプロファイル３００ｂを示している。様々な実施形態では、開示されるＮＭＲ法は、メチル１３Ｃ領域の励起帯域幅をカバーする、トランスミッターオフセットが２１ｐｐｍで７５０μｓのＲｅｂｕｒｐリフォーカシングパルスを従来のハードパルスと置き換えることによってスクロースシグナルを除去するための、図３Ｂに示されるようなＲｅｂｕｒｐリフォーカシングパルス３００ｂを含む。励起したサイドローブが移行期間に存在するものの、図３Ｂに示されるように、励起したピークの強度は小さく、６０ｐｐｍ領域近辺にある。
【0025】
図３Ｃは、関連する実施形態による、ＢＩＰ及びＧ３を組み合わせたパルスプロファイル３００ｃを示している。図３Ｃに示された、このパルスを組み合わせた励起プロファイルにより、結果としてスクロースシグナルが良好に抑制される。図２に図示されるように、第１のＣＬＵＢサンドイッチ要素は、広範囲の磁化を励起するために、５５ｐｐｍに位置し、１２０μｓの持続時間を有する広帯域ＢＩＰパルスと、スクロースシグナルを抑制するために、８１．５ｐｐｍに位置し、５００μｓの持続時間を有するＧ３反転パルスとの組み合わせを使用する。
【0026】
ＮＭＲ測定技術を使用したいくつかの実験では、帯域幅の一方の側の磁化を反転又は励起することが必要となる。様々な実装形態では、例えば、Ｈｗａｎｇ，Ｔ．－Ｌ．；ｖａｎ Ｚｉｊｌ，Ｐ．Ｃ．Ｍ．；Ｇａｒｗｏｏｄ，Ｍ．，Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｄｉａｂａｔｉｃ ｐｕｌｓｅｓ ｆｏｒ ＮＨ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１９９９，１３８，１７３－１７７に記載されているような、異なるＲ値（Ｒ＝パルス長（秒）＊帯域幅（Ｈｚ））及びパルス長（Ｔｐ）を有するＨＳ１／２及びｔａｎｈ／ｔａｎ変調関数に由来する２つの半通過（ｈａｌｆ ｐａｓｓａｇｅ）を含有する非対称断熱全通過（ｆｕｌｌ ｐａｓｓａｇｅ）によって、スペクトルの一方の側で帯域幅の反転又は励起を達成しながら移行帯域幅を狭めることができる。
【0027】
図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆは、１３Ｃスクロースシグナルを抑制しながら１３Ｃメチルシグナルを反転するために、異なるパルス長によって最適化された、３つの例示的な非対称断熱パルス３００ｄ、３００ｅ及び３００ｆをそれぞれ示している。各図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆにおいて、Ｔｘはトランスミッターオフセットであり、１ｐｐｍの間隔でオフセットを増分することによってプロファイルを生成した。
【0028】
図３Ｄは、例えば、Ｈｗａｎｇ，Ｔ．－Ｌ．；ｖａｎ Ｚｉｊｌ，Ｐ．Ｃ．Ｍ．；Ｇａｒｗｏｏｄ，Ｍ．，Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｄｉａｂａｔｉｃ ｐｕｌｓｅｓ ｆｏｒ ＮＨ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１９９９，１３８，１７３－１７７に記載されるような、トランスミッターオフセット４３ｐｐｍ、パルス長１５００μｓの（１）［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４０、０．１Ｔｐ］として示されるパルスプロファイル３００ｄを示している。結果として、スクロースの炭素シグナルを抑制しながら、励起バンドがメチル領域をカバーすることが可能となる。パルス長が１５００μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４０、０．１Ｔｐ］の移行帯域幅は、約７００Ｈｚである（図３Ｄ）。パルスプロファイル全体を、パルスのトランスミッターオフセットの位置に応じてその近辺に移動させることができるということに留意されたい。換言すれば、パルスのトランスミッターオフセットが２１ｐｐｍに位置する場合、それに応じて励起バンドがより低いｐｐｍ範囲に移動するが、この励起バンドはＣβ炭素シグナルを抑制しながらも、なおメチル領域をカバーする。
【0029】
図３Ｅは、トランスミッターオフセット３０ｐｐｍ、パルス長７５０μｓの（２）［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝７０、０．１Ｔｐ］として示されるパルスプロファイル３００ｅを示している。励起バンドは、スクロースの炭素シグナルを抑制しながら、治療用分子のメチル領域をカバーしている。
【0030】
図３Ｆは、トランスミッターオフセット２ｐｐｍ、パルス長３７５μｓの（３）［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝５０、０．１Ｔｐ］として示されるパルスプロファイル３００ｆを示している。同様に、励起バンドは、スクロースの炭素シグナルを抑制しながら、治療用分子のメチル領域をカバーすることができる。図３Ｆでは、パルス長が３７５μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝５０、０．１Ｔｐ］の移行帯域幅が非常に広い範囲となっているが、ｍＡｂの磁化のＴ２及びＴ１ρ緩和が極めて短いため、より短いパルス長でメチルピークの強度損失が低減される。
【0031】
図４は、時間領域の自由誘導減衰データを周波数領域データにフーリエ変換した結果であり、これによって異なるｐｐｍで現れるＮＭＲピークを視角化したスペクトルのグラフ４００である。Ｘ軸はｐｐｍとして表され、分光計周波数とは独立しており、これによって異なる磁界強度でスペクトルを比較することができる。図４に示されるように、グラフ４００は、関連する実施形態により、１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づいて、スクロース、アセテート及びメチルピークのシグナル強度を比較したものを示している。１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ実験における異なる成分の強度は、エコー／アンチエコーの符号化期間におけるハードリフォーカシングパルスを使用して測定する。図４に示されるように、スクロースシグナルの強度は、メチルピークの強度よりもはるかに大きく、２Ｄスペクトルにおけるシグナル干渉問題の原因となる。
【0032】
図５は、時間領域の自由誘導減衰データを周波数領域データにフーリエ変換し、異なるｐｐｍで現れるＮＭＲピークを視角化することができるスペクトルを示すグラフ５００である。Ｘ軸はｐｐｍとして表され、分光計周波数とは独立しており、これによって異なる磁界強度でスペクトルを比較することができる。図５に示されるように、グラフ５００は、いくつかの実施形態により、エコー／アンチエコースキームの符号化期間において別に提示されたＲＦパルスを使用する本発明の１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づいて、スクロース及びメチルピークのシグナル強度を比較したものを示している。特に、図５に示されるシグナルプロファイルは、エコー／アンチエコースキームの符号化期間において、新たに提案されたリフォーカシングパルス（すなわち、Ｒｅｂｕｒｐ、ＢＩＰ＋Ｇ３、及び非対称断熱パルス）を使用した１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ実験により測定された、異なる成分のシグナル強度からのものである。様々な実施形態では、アセテートシグナルを抑制するために、水抑制技術（ＷＥＴ）スキームが適用される。様々な実施形態では、水シグナルをさらに除去するために、デジタルフィルタが適用される。
【0033】
また、図５は、スクロースシグナルの強度がメチルピークの強度とほぼ同じオーダーであることを示している。２Ｄのスペクトルでは、これらのスクロースシグナルはＴ１のノイズのように振る舞い、メチルピーク分析とは干渉しない（図６Ｂ及び６Ｃに示される通り）。これらのスペクトルはまた、メチルピークの強度が、異なるパルス長を有するパルスに対してわずかに変動することを示している。例えば、２１ｐｐｍに位置するパルス長１５００μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４０、０．１Ｔｐ］のパルスプロファイルはＣβシグナルを励起せず、図５に示されるように、対応する３ｐｐｍ近辺のＨβピークが消失する。
【0034】
様々な実施形態では、小型のペプチドのシグナルのＴ２及びＴ１ρ緩和は、大型のｍＡｂの緩和よりもはるかに遅くなる。逆に言えば、ｍＡｂのＴ２及びＴ１ρ緩和、並びに／又は拡散効果による強度損失は、パルス長のわずかな違いで重大なものとなり得る。その結果、パルス長のあらゆるわずかな違いは、ｍＡｂのメチルピークの強度に重大な影響を与え得る。開示されたＮＭＲ法の関連する実施形態によれば、エコー／アンチエコー期間の間に、勾配パルスを１０００μｓから２５０μｓに短くすることによって、パルスシーケンスを改良することができる。この手法を、サンプル３を使用して実験する。ＣＬＵＢサンドイッチにおける勾配の異なる極性により、渦電流を無効にすることができるため、勾配回復をさらに従来の２００μｓから５０μｓに低減することができる。これらの最適化された値を、－０．５～２ｐｐｍのメチルピーク面積を積分することによって、現行の及び新規の１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ実験に適用した際の、異なる実験による相対的な積分値を下記の表１で比較する。
【0035】
【表1】
【0036】
表１のデータは、１ｍｓ（１０００μｓ）の長さの勾配を有する本来のハードリフォーカシング実験が、０．７３の最小の相対強度であることを示している。勾配パルス長を約２５０μｓに短くした後、相対的なメチル強度は大幅に増加して１となった。
【0037】
図６Ａ～６Ｃは、特定のＮＭＲ増強方法の有効性を比較するための、異なる１３Ｃ ２Ｄメチルフィンガープリントのプロット６００ａ、６００ｂ、及び６００ｃをそれぞれ示している。図６Ａは、３％Ｄ２Ｏと混合した、ｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート、０．０１％ポリソルベート（ＰＳ）８０をｐＨ＝５．２で含有するサンプルに対し、従来のＮＭＲ法（すなわちＮＩＳＴプロトコル）を用いた実験結果を示している。スクロースシグナルはメチル領域に対して折り返し、アセテートシグナルのストリップは２ｐｐｍ近辺に現れた。これらのアーチファクトはメチルピーク分析と干渉していた。対照的に、図６Ｂは、スクロース及びアセテートシグナルからの干渉がなく、明確なメチル領域を表している。この結果は、リフォーカシング要素として、トランスミッターオフセット２ｐｐｍ、パルス長３７５μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝５０、０．１Ｔｐ］、及び１Ｈアセテートシグナルを抑制するためのＷＥＴシーケンスを使用することによって得られる。図６Ｃは、トランスミッターオフセット２１ｐｐｍ、パルス長１５００μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４０、０．１Ｔｐ］を使用することによって、Ｃβ領域をさらに抑制することができることを示している。
【0038】
治療用タンパク質
「治療用タンパク質」とは、治療的生物活性を示すあらゆるタンパク質分子を意味する。治療用タンパク質分子は、例えば、全長タンパク質であってよい。他の実施形態では、治療用タンパク質は全長タンパク質の活性フラグメントである。治療用タンパク質は、その天然源から作製及び精製してもよい。或いは、「組換え治療用タンパク質」という用語には、組換えＤＮＡ技術によって得られるあらゆる治療用タンパク質が含まれる。
「治療用タンパク質」とは、治療的生物活性を示すあらゆるタンパク質分子を意味する。治療用タンパク質分子は、例えば、全長タンパク質であってよい。他の実施形態では、治療用タンパク質は全長タンパク質の活性フラグメントである。治療用タンパク質は、その天然源から作製及び精製してもよい。或いは、「組換え治療用タンパク質」という用語には、組換えＤＮＡ技術によって得られるあらゆる治療用タンパク質が含まれる。
【0039】
以下の１つ以上に結合するものを含むタンパク質を、開示される方法で使用することができる。これらには、受容体結合を妨害するものを含む、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０及びＣＤ３４を含むＣＤタンパク質が含まれる。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びＥＧＦ受容体を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質。細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－Ｉ、ＭｏＩ、ｐｌ５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＶＣＡＭ、及びα ｖ／β ３インテグリン。成長因子、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管阻害物質、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ－Ｉ－α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ－βなどの神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦを含む線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、特に、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βを含む、例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４又はＴＧＦ－β５を含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、並びに骨誘導因子。インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様成長因子結合タンパク質を含むインスリン及びインスリン関連タンパク質。特に、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、α－１－アンチトリプシンなどの凝固タンパク質及び凝固関連タンパク質、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ－ＰＡ」）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）、トロンビン及びトロンボポエチン；アルブミン、ＩｇＥ及び血液型抗原を含むがそれらに限定されない他の血液タンパク質及び血清タンパク質。コロニー刺激因子及びその受容体、例えば以下のもの、特に、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ、並びにそれらの受容体、例えばＣＳＦ－１受容体（ｃ－ｆｍｓ）。例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ＬＤＬ受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ－Ｒ」、「ｃ－ｍｐｌ」）、グルカゴン受容体、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、Ｔ細胞受容体、ｃ－Ｋｉｔなどの幹細胞因子受容体及び他の受容体を含む、受容体タンパク質及び受容体関連タンパク質。例えば、ＯＸ４０受容体のリガンドであるＯＸ４０Ｌを含む、受容体リガンド。骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びニューロトロフィン－３、－４、－５、又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）を含む、神経栄養因子。リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン；例えば、インターフェロン－α、－β、及び－γ、並びにそれらの受容体を含むインターフェロン及びインターフェロン受容体。ＩＬ－１～ＩＬ－３３及びＩＬ－１～ＩＬ－３３受容体、例えば、特に、ＩＬ－８受容体を含む、インターロイキン及びインターロイキン受容体。ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原を含む、ウイルス抗原。リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、腫瘍壊死因子α及びβ、エンケファリナーゼ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ；ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮａｓｅ、インヒビン及びアクチビン。インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドディスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体。ミオスタチン、ＴＡＬＬ－Ｉ、アミロイドタンパク質、例えば、以下に限定されないが、アミロイドβタンパク質、胸腺間質性リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ」）、ＲＡＮＫリガンド（「ＯＰＧＬ」）、ｃ－ｋｉｔを含むＴＡＬＬタンパク質、ＴＮＦ受容体１型を含むＴＮＦ受容体、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、アンジオポエチン及び前述のいずれかの生物活性フラグメント又はアナログ又は変異体。
【0040】
他の治療用タンパク質としては、Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）；アリロクマブ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン－アルファ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ、又はエリスロポエチン）；Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ－Ｉａ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロン－β）；ボコシズマブ（Ｌ１Ｌ３と呼ばれる抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体、米国特許第８，０８０，２４３号明細書を参照のこと）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）；Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）；ＭＬＮ０００２（抗α４β７ Ａｂ）；ＭＬＮ１２０２（抗ＣＣＲ２ケモカイン受容体Ａｂ）；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；Ｅｐｒｅｘ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）；エボロクマブ；Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（ソマトロピン）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ソマトロピン［ｒＤＮＡ由来］注射用）；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（インターフェロンアルファコン－１）；Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド）；Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）；Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）（ベリムマブ）；Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標）（テネクテプラーゼ）；Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）；Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（セルトリズマブペゴル）；Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）；パキセリズマブ（抗Ｃ５補体）；ＭＥＤＩ－５２４（Ｎｕｍａｘ（登録商標））；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））；Ｔｒａｂｉｏ（登録商標）（レルデリムマブ）；ＴｈｅｒａＣｉｍ ｈＲ３（ニモツズマブ）；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（ペルツズマブ、２Ｃ４）；Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ－Ｉ）；ＯｖａＲｅｘ（登録商標）（Ｂ４３．１３）；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）；カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２－ＤＭｌ）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグ化フィルグラスチム、ペグ化Ｇ－ＣＳＦ、ペグ化ｈｕ－Ｍｅｔ－Ｇ－ＣＳＦ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ－ＣＤ３）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）（抗ＩＬ６受容体Ａｂ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４（ザノリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）（ウステキヌマブ）、Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）；１４６Ｂ７－ＣＨＯ（抗ＩＬ１５抗体、米国特許第７，１５３，５０７号明細書を参照のこと）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）；Ｖａｌｏｒｔｉｍ（登録商標）（ＭＤＸ－１３０３、抗炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原Ａｂ）；ＡＢｔｈｒａｘ（商標）；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＥＴＩ２１１（抗ＭＲＳＡ Ａｂ）、ＩＬ－Ｉ Ｔｒａｐ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及びＩＬ－Ｉ受容体成分の両方の細胞外ドメイン（Ｉ型受容体及び受容体アクセサリータンパク質））、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（ＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、Ａｔａｃｉｃｅｐｔ（ＴＡＣＩ－Ｉｇ）、抗α４β７ Ａｂ（ベドリズマブ）；ガリキシマブ（抗ＣＤ８０モノクローナル抗体）、抗ＣＤ２３ Ａｂ（ルミリキシマブ）；ＢＲ２－Ｆｃ（ｈｕＢＲ３／ｈｕＦｃ融合タンパク質、可溶性ＢＡＦＦアンタゴニスト）；Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；マパツムマブ（ヒト抗ＴＲＡＩＬ受容体－１ Ａｂ）；オクレリズマブ（抗ＣＤ２０ヒトＡｂ）；ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ザルツムマブ）；Ｍ２００（ボロシキシマブ、抗α５β１インテグリンＡｂ）；ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ－４ Ａｂ及びＶＥＧＦＲ１（ＩＭＣ－１８Ｆ１）；抗ＢＲ３ Ａｂ；抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及び毒素Ｂ Ｃ Ａｂ ＭＤＸ－０６６（ＣＤＡ－Ｉ）及びＭＤＸ－１３８８）；抗ＣＤ２２ ｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－３８８８及びＣＡＴ－８０１５）；抗ＣＤ２５ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＴＳＬＰ抗体；抗ＴＳＬＰ受容体抗体（米国特許第８，１０１，１８２号明細書を参照のこと）；Ａ５と呼ばれる抗ＴＳＬＰ抗体（米国特許第７，９８２，０１６号明細書を参照のこと）；（抗ＣＤ３ Ａｂ（ＮＩ－０４０１）を参照のこと；アデカツムマブ（ＭＴ２０１、抗ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３２６ Ａｂ）；ＭＤＸ－０６０、ＳＧＮ－３０、ＳＧＮ－３５（抗ＣＤ３０ Ａｂ）；ＭＤＸ－１３３３（抗ＩＦＮＡＲ）；ＨｕＭａｘ ＣＤ３８（抗ＣＤ３８ Ａｂ）；抗ＣＤ４０Ｌ Ａｂ；抗Ｃｒｉｐｔｏ Ａｂ；抗ＣＴＧＦ特発性肺線維症Ｉ期Ｆｉｂｒｏｇｅｎ（ＦＧ－３０１９）；抗ＣＴＬＡ４ Ａｂ；抗エオタキシン Ａｂ（ＣＡＴ－２１３）；抗ＦＧＦ８ Ａｂ；抗ガングリオシドＧＤ２ Ａｂ；抗スクレロスチン抗体（米国特許第８，７１５，６６３号明細書又は米国特許第７，５９２，４２９号明細書を参照のこと）、Ａｂ－５と呼ばれる抗スクレロスチン抗体（米国特許第８，７１５，６６３号明細書又は米国特許第７，５９２，４２９号明細書を参照のこと）；抗ガングリオシドＧＭ２ Ａｂ；抗ＧＤＦ－８ヒトＡｂ（ＭＹＯ－０２９）；抗ＧＭ－ＣＳＦ受容体Ａｂ（ＣＡＭ－３００１）；抗ＨｅｐＣ Ａｂ（ＨｕＭａｘ ＨｅｐＣ）；ＭＥＤＩ－５４５、ＭＤＸ－１１０３（抗ＩＦＮα Ａｂ）；抗ＩＧＦＩＲ Ａｂ；抗ＩＧＦ－ＩＲ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０ Ａｂ（ブリアキヌマブ）；抗ＩＬ－２３ｐ１９ Ａｂ（ＬＹ２５２５６２３）；抗ＩＬ１３ Ａｂ（ＣＡＴ－３５４）；抗ＩＬ－１７ Ａｂ（ＡＩＮ４５７）；抗ＩＬ２Ｒａ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＩＬ５ 受容体Ａｂ；抗インテグリン受容体Ａｂ（ＭＤＸ－Ｏｌ８、ＣＮＴＯ ９５）；抗ＩＰＩＯ潰瘍性大腸炎Ａｂ（ＭＤＸ－１１００）；抗ＬＬＹ抗体；ＢＭＳ－６６５１３；抗マンノース受容体／ｈＣＧβ Ａｂ（ＭＤＸ－１３０７）；抗メソセリンｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－５００１）；抗ＰＤｌＡｂ（ＭＤＸ－１ １０６（ＯＮＯ－４５３８））；抗ＰＤＧＦＲα抗体（ＩＭＣ－３Ｇ３）；抗ＴＧＦβ Ａｂ（ＧＣ－１００８）；抗ＴＲＡＩＬ受容体－２ヒトＡｂ（ＨＧＳ－ＥＴＲ２）；抗ＴＷＥＡＫ Ａｂ；抗ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ－１ Ａｂ；抗ＺＰ３ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＺＰ３）；ＮＶＳ抗体＃１；ＮＶＳ抗体＃２；並びに配列番号８及び配列番号６の配列を含むアミロイドβモノクローナル抗体（米国特許第７，９０６，６２５号明細書を参照のこと）が挙げられる。
【0041】
開示された方法において使用可能な抗体の例としては、表Ａに示される抗体が挙げられる。好適な抗体のその他の例としては、インフリキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトックス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトックス、ムロモナブ－ｃｄ３、ナコロマブタフェナトックス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトックス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ １４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトックス、テフィバズマブ、テリモマブアリトックス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、及びゾリモマブアリトックスが挙げられる。
【0042】
開示される方法における使用のための最も好ましい抗体は、アダリムマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エレヌマブ、エボロクマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、及びトラスツズマブ、並びに表Ａから選択される抗体である。
【0043】
【表A-1】
【0044】
【表A-2】
【0045】
ムテイン
ムテインとは、置換、欠失又は挿入などの核酸配列の突然変異による、少なくともアミノ酸の変異を有するタンパク質のことである。例示的なムテインは、野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は約９０％（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）を超える配列相同性を有する。加えて、ムテインは、上記で説明したような融合タンパク質であってよい。例示的な実施形態では、ムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸を類似した性質、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香族性を有する別のアミノ酸に置換することを意味するものであり、以下の５つの群のうちの１つの範囲内における交換を含む：
Ｉ．小型で脂肪族の、無極性又は微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそれらのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型で脂肪族の、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
ムテインとは、置換、欠失又は挿入などの核酸配列の突然変異による、少なくともアミノ酸の変異を有するタンパク質のことである。例示的なムテインは、野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は約９０％（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）を超える配列相同性を有する。加えて、ムテインは、上記で説明したような融合タンパク質であってよい。例示的な実施形態では、ムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸を類似した性質、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香族性を有する別のアミノ酸に置換することを意味するものであり、以下の５つの群のうちの１つの範囲内における交換を含む：
Ｉ．小型で脂肪族の、無極性又は微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそれらのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型で脂肪族の、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
【0046】
例示的な実施形態では、ムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は非保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「非保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸を異なる性質、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香族性を有する別のアミノ酸に置換することとして本明細書では定義され、上記の５つの群の範囲外における交換を含む。
【0047】
例示的な態様では、ムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸は天然に生じるアミノ酸である。「天然に生じるアミノ酸」又は「標準アミノ酸（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」又は「標準アミノ酸（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、普遍的遺伝コードの、コドンによって直接コードされ、真核生物に見られる２０個のαアミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）のうちの１つを意味する。例示的な態様では、ムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸は非標準アミノ酸であるか、又は翻訳の際にタンパク質に組み入れられなかったアミノ酸である。非標準アミノ酸としては、セレノシステイン、ピロリジン、オルニチン、ノルロイシン、β－アミノ酸（例えば、β－アラニン、β－アミノイソ酪酸、β－フェニルアラニン、β－ホモフェニルアラニン、β－グルタミン酸、β－グルタミン、β－ホモトリプトファン、β－ロイシン、β－リジン）、ホモアミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、ホモアルギニン、モノシステイン、ホモシスチン）、Ｎ－メチルアミノ酸（例えば、Ｌ－アブリン、Ｎ－メチル－アラニン、Ｎ－メチル－イソロイシン、Ｎ－メチル－ロイシン）、２－アミノカプリル酸、７－アミノセファロスポラン酸、４－アミノけい皮酸、α－アミノシクロヘキサンプロピオン酸、アミノ－（４－ヒドロキシフェニル）酢酸、４－アミノ－ニコチン酸、３－アミノフェニル酢酸などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0048】
ＢｉＴＥ（登録商標）分子
二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）分子とは、共に連結された２つの抗体結合ドメイン（又は標的領域）を含む、二重特異性抗体コンストラクト又は二重特異性融合タンパク質のことである。分子の一方のアームは細胞傷害性Ｔ細胞の表面に見られるタンパク質と結合するように改変され、もう一方のアームは、主に腫瘍細胞に見られる特定のタンパク質と結合するように設計されている。ＢｉＴＥ分子は、両標的に結合すると、細胞障害性Ｔ細胞と腫瘍細胞の間に架橋を形成し、これによってＴ細胞に腫瘍細胞を認識させ、有害分子を注入することで腫瘍細胞を撃退することができる。例えば、分子の腫瘍に結合するアームを変更して、異なる種類の癌を標的とする、異なるＢｉＴＥ抗体コンストラクトを生成することができる。
二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）分子とは、共に連結された２つの抗体結合ドメイン（又は標的領域）を含む、二重特異性抗体コンストラクト又は二重特異性融合タンパク質のことである。分子の一方のアームは細胞傷害性Ｔ細胞の表面に見られるタンパク質と結合するように改変され、もう一方のアームは、主に腫瘍細胞に見られる特定のタンパク質と結合するように設計されている。ＢｉＴＥ分子は、両標的に結合すると、細胞障害性Ｔ細胞と腫瘍細胞の間に架橋を形成し、これによってＴ細胞に腫瘍細胞を認識させ、有害分子を注入することで腫瘍細胞を撃退することができる。例えば、分子の腫瘍に結合するアームを変更して、異なる種類の癌を標的とする、異なるＢｉＴＥ抗体コンストラクトを生成することができる。
【0049】
ＢｉＴＥ分子に関する「結合ドメイン」という用語は、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを意味する。第１の結合ドメインの構造及び機能（標的細胞の抗原を認識する）、また、好ましくは第２の結合ドメインの構造及び／又は機能（細胞障害性Ｔ細胞を認識する）は、抗体、例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づく。
【0050】
「エピトープ」とは、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体若しくはフラグメントなどの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を意味する。「エピトープ」は抗原性であり、したがって、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義するものと理解される。
【0051】
例えば、ＢｉＴＥ分子は、３つの軽鎖「相補性決定領域」（ＣＤＲ）（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、並びに３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる、第１の結合ドメインを含む。また、第２の結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含むことが好ましい。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を足場に移植する以外に、ファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。
【0052】
結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み得るが、両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。（修飾された）抗原結合抗体フラグメントの例としては、（１）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメント；（２）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）及び（７）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、好ましいのは後者（例えばｓｃＦｖ－ライブラリ由来）である。
【0053】
ＢｉＴＥ分子に関する「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）向けられる」及び「（特異的に）反応する」という用語は、結合ドメインが、標的タンパク質又は抗原上に位置するエピトープの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ及び最も好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。
【0054】
「可変」という用語は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を意味する。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対がともに単一の抗原結合部位を形成する。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、ＣＨ１と称される。各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じた１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。
【0055】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれ、三次元空間において６つのＣＤＲに足場を提供し、抗原結合表面を形成する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート構造をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して一体に保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、例えば、抗体依存性の細胞媒介傷害及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。
【0056】
軽鎖のＣＤＲ３と、特に重鎖のＣＤＲ３とは、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子となり得る。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は、典型的には抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基程度の短いもの、又は２６個超のアミノ酸であり得る。
【0057】
構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を意味する。この配列は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成により生成され得る。或いは、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。或いは、この配列の一部又はすべては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得てもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含み得るか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。
【0058】
本明細書で使用する場合、「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを意味し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含んでおり、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的に結合する。したがって、ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を備える。本発明の「二重特異性抗体コンストラクト」という用語は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。
【0059】
ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも又は含まなくてもよい。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの極めて重要な技術的特徴は、前記ペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。
【0060】
リンカーが使用される場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列からなることが好ましい。ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、ここでは、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」に関連して特に好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、上記のペプチドリンカーは、単一アミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここで、ｘは、１以上の整数である。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、並びにＲａａｇ及びＷｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）に記載されている。いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合されて作動可能に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
【0061】
本開示のＢｉＴＥ分子は、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂからなる群から選択される構成の抗体コンストラクト、上述の構成のいずれかのダイアボディー及びオリゴマーを含み得る。
【0062】
特に好ましい実施形態によれば、且つ添付の実施例において記述される通り、ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトは、「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、これらは、組換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする合成リンカーにより結合することができる。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られた従来技術を用いて得られ、且つそのフラグメントは、完全又は全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常約１０～約２５アミノ酸、好ましくは約１５～２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシン、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【0063】
二重特異性単鎖分子は、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７，Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３，Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６に記載されている。単鎖抗体の作製に関して記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照されたい）を、選出された標的を特異的に認識する単鎖抗体コンストラクトを作製するように適合することができる。
【0064】
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性単鎖可変フラグメント（（ｓｃＦｖ）２構成を有するｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を連結することによって改変することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。この連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性としては、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎる（例えば約５アミノ酸の）リンカーペプチドを使用してｓｃＦｖ分子を作製し、このｓｃＦｖを二量体化させることである。このタイプは、ダイアボディーとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８を参照されたい）。
【0065】
単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に、特異抗原に選択的に結合可能である１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から改変されたものであり、これらはＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類もまた重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的な手法は、例えば、ヒト又はげっ歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点では重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディーも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディー又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【0066】
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される、（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、ペプチドリンカーの形態であることが好ましい。同様に、「ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ」は、上記に記載した少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、上記に記載した１つのｓｃＦｖ分子とで構成されたモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合もやはり、リンカーは、ペプチドリンカーの形態であることが好ましい。
【0067】
例示的なＢｉＴＥ分子としては、抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＦＬＴ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（ブリナツモマブ）、並びにソリトマブが挙げられる。
【0068】
医薬組成物製剤及び成分
許容可能な医薬成分は、使用される投与量及び濃度において患者に無毒であることが好ましい。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透性を変更、維持又は保護するための作用物質を含み得る。
許容可能な医薬成分は、使用される投与量及び濃度において患者に無毒であることが好ましい。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透性を変更、維持又は保護するための作用物質を含み得る。
【0069】
一般に、賦形剤は、それにより様々な化学的及び物理的ストレスに対してタンパク質を安定化させる機序に基づいて分類され得る。一部の賦形剤は、特定のストレスの影響を緩和するか、又は特異的ポリペプチドの特定の感受性を調節する。その他の賦形剤は、タンパク質の物理的安定性及び共有結合安定性に対してより一般的な効果を有する。液体及び凍結乾燥タンパク質製剤の一般的な賦形剤を表Ｂに示す（Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ ＴＪ，Ｅｓｆａｎｄｉａｒｙ Ｒ，Ｊｏｓｈｉ ＳＢ，Ｍｉｄｄａｕｇｈ ＣＲ，Ｖｏｌｋｉｎ ＤＢ．２０１１．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６３：１１１８－５９も参照されたい）。
【0070】
【表B-1】
【0071】
【表B-2】
【0072】
上記に記載したように、パルスプロファイルを変更することにより、驚くべきことに、様々なＮＭＲ領域のシグナル対雑音比に大幅な影響を与えることができるということが見出された。例えば、反転パルスを伴う特定のパルスプロファイルを使用して、スクロースに由来するような１３Ｃ賦形剤シグナルを抑制しながら、治療用分子に由来する１３Ｃメチルシグナルを励起することができる。これらのシグナルは、より短い勾配パルスによって増強することができる。シグナル増強及びシグナル抑制に影響を及ぼすこれらの各種要因は、さらに下記の実施形態において主張される。
【0073】
関連する実施形態によれば、ＮＭＲを使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。この方法では、シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、シグナル処理工程のサイクルを適用することを含む。このサイクルは、高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、水抑制技術（ＷＥＴ）を適用することとを含む。この方法では、第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、１３Ｃメチルシグナルの定義されたｐｐｍ範囲近傍のＮＭＲスペクトルの領域に位置する。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0074】
本実施形態及び関連する実施形態では、ＮＭＲスペクトルの領域には、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲ１３Ｃスペクトルウィンドウが含まれる。ＮＭＲスペクトルの領域には、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、又は約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウが含まれる。さらに、例えば、酸化したｍｅｔを使用した場合、ＮＭＲスペクトルウィンドウは約７ｐｐｍ～約４０ｐｐｍとなり得る。
【0075】
ＲＦパルスは、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルスの組み合わせ、並びに非対称断熱パルスのうち少なくとも１つを含む。Ｒｅｂｕｒｐパルスの場合、このパルスにより第１のＮＭＲシグナルが励起する。ＢＩＰの場合、ＢＩＰにより広範囲のＮＭＲシグナルが励起され、Ｇ３反転パルスにより第２のＮＭＲシグナルが抑制される。非対称断熱パルスの場合、このパルスにより第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら第１のＮＭＲシグナルが励起される。
【0076】
第１のＮＭＲシグナルは、治療用分子の１３Ｃメチルに関連するＮＭＲシグナルであり、第２のＮＭＲシグナルは、１３Ｃスクロースに関連するシグナルであり、第３のＮＭＲシグナルは、１Ｈアセテート又は他の１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲシグナルに少なくとも関連するシグナルである。
【0077】
ＮＭＲを使用するための例示的な方法は、現在商業的に利用可能な約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚ、例えば１２００ＭＨｚの周波数範囲で実行することができる。
【0078】
Ｒｅｂｕｒｐパルスは、約５００μｓ～約１０００μｓのパルス長を有する。Ｒｅｂｕｒｐパルスは、約６００μｓ～約９００μｓ、又は約６００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する。
【0079】
ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約２００μｓ～約２５００μｓの総パルス長を有する。ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約２００μｓ～約２０００μｓ、約２００μｓ～約１５００μｓ、約２５０μｓ～約１０００μｓ、又は約２５０μｓ～約７５０μｓのパルス長を有する。ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約６２０μｓのパルス長を有する。ＢＩＰは、約１２０μｓのパルス長を有し、Ｇ３反転パルスは、約５００μｓのパルス長を有する。
【0080】
非対称断熱パルスは、約５０μｓ～約２５００μｓ、約５０μｓ～約２０００μｓ、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、又は約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する。
【0081】
勾配パルスは、約１５００μｓ以下、又は約１０００μｓ以下のパルス長を有する。勾配パルスは、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１２００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する。
【0082】
勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く。
【0083】
少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する別の勾配パルスが続く。
【0084】
ＮＭＲを使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする別の例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、シグナル処理工程のサイクルを適用することを含む。サイクルは、高周波（ＲＦ）パルスを印加することと、勾配パルスを印加することとを含む。この方法では、第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウの領域に位置する。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて、特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0085】
サイクルは、水抑制技術（ＷＥＴ）シーケンスを適用することをさらに含む。
【0086】
ＮＭＲスペクトルの領域には、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、又は約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウが含まれる。
【0087】
ＲＦパルスは、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス（ＢＩＰ）及びガウシアン（Ｇ３）反転パルスの組み合わせ、又は非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む。
【0088】
Ｒｅｂｕｒｐパルスの場合、このパルスにより第１のＮＭＲシグナルが励起する。広帯域反転パルスは、広範囲のＮＭＲシグナルを励起し、Ｇ３反転パルスは、第２のＮＭＲシグナルを抑制する。非対称断熱パルスは、第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら第１のＮＭＲシグナルを励起する。
【0089】
第１のＮＭＲシグナルは、治療用分子の１３Ｃメチルに関連するＮＭＲシグナルであり、第２のＮＭＲシグナルは、１３Ｃスクロースに関連するシグナルであり、第３のＮＭＲシグナルは、１Ｈアセテート又は他の１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲシグナルに少なくとも関連するシグナルである。
【0090】
ＮＭＲを使用するための例示的な方法は、約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚ、例えば１２００ＭＨｚなどの周波数範囲で実行することができる。
【0091】
Ｒｅｂｕｒｐパルスは、約３００μｓ～約１０００μｓ、約６００μｓ～約９００μｓ、又は約６００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する。
【0092】
ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約２００μｓ～約２５００μｓ、約２００μｓ～約２０００μｓ、約２００μｓ～約１５００μｓ、約２５０μｓ～約１０００μｓ、又は約２５０μｓ～約７５０μｓの総パルス長を有する。ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約６２０μｓ～６６０μｓのパルス長を有する。ＢＩＰは、約１２０μｓ～１６０μｓのパルス長を有し、Ｇ３反転パルスは、約５００μｓのパルス長を有する。
【0093】
非対称断熱パルスは、約５０μｓ～約２５００μｓ、約５０μｓ～約２０００μｓ、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、又は約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する。
【0094】
勾配パルスは、１０００μｓ以下のパルス長を有する。いくつかの実装形態では、勾配パルスは、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する。
【0095】
いくつかの実装形態では、勾配パルスの後に、１０００μｓ以下のパルス長を有する、少なくとも１つの反転勾配パルスが続く。勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く。
【0096】
少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、１０００μｓ以下のパルス長を有する、別の勾配パルスが続く。少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する別の勾配パルスが続く。
【0097】
ＮＭＲを使用して、組成物中の特定の分子をフィンガープリントする別の例示的な方法が、本明細書に記載される。方法は、第１のＮＭＲシグナルを有する第１の分子と、第２のＮＭＲシグナルを有する第２の分子と、第３のＮＭＲシグナルを有する第３の分子とを少なくとも有する組成物を提供することを含む。この方法では、シグナルの各々は、０ではない核スピンを有するそれぞれの分子の各々から生じる。方法は、第２のＮＭＲシグナルを抑制しながら第１のＮＭＲシグナルを励起するために、高周波（ＲＦ）パルスを組成物に印加することを含む。ＲＦパルスは、Ｒｅｂｕｒｐパルス、広帯域反転パルス及びガウシアン反転パルスの組み合わせ、又は非対称断熱パルスのうちの少なくとも１つを含む。方法はまた、１０００μｓ以下のパルス長を有する勾配パルスを印加することと、第３のＮＭＲシグナルを抑制するために水抑制技術（ＷＥＴ）シーケンスを適用することとを含む。方法はまた、増強された組成物のシグナルを取得するために、サイクルを少なくとも３回繰り返すことを含む。方法は、増強された組成物のシグナルに基づいて特定の分子をフィンガープリントすることをさらに含む。
【0098】
第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、１３Ｃメチルシグナルの近傍のＮＭＲスペクトルの領域に位置する。
【0099】
第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、約５ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウに位置する。様々な実装形態では、第１のＮＭＲシグナル、第２のＮＭＲシグナル、及び第３のＮＭＲシグナルは、約５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍ、約５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、又は約７ｐｐｍ～約３５ｐｐｍのＮＭＲスペクトルウィンドウに位置する。
【0100】
ＮＭＲを使用するための例示的な方法は、現在商業的に利用可能な約１００ＭＨｚ～約２０００ＭＨｚ、例えば１２００ＭＨｚの周波数範囲で実行することができる。
【0101】
Ｒｅｂｕｒｐパルスは、約３００μｓ～約１０００μｓ、約６００μｓ～約９００μｓ又は約６００μｓ～約８００μｓパルス長を有する。
【0102】
ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約２００μｓ～約２５００μｓ、約２００μｓ～約２０００μｓ、約２００μｓ～約１５００μｓ、約２５０μｓ～約１０００μｓ、又は約２５０μｓ～約７５０μｓの総パルス長を有する。
【0103】
ＢＩＰ及びＧ３反転パルスの組み合わせは、約６２０μｓ～６６０μｓのパルス長を有する。ＢＩＰは、約１２０μｓ～１６０μｓのパルス長を有し、Ｇ３反転パルスは、約５００μｓのパルス長を有する。
【0104】
非対称断熱パルスは、約５０μｓ～約２５００μｓ、約５０μｓ～約２０００μｓ、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、又は約１００μｓ～約８００μｓのパルス長を有する。
【0105】
勾配パルスは、約５０μｓ～約１５００μｓ、約５０μｓ～約１２００μｓ、約５０μｓ～約１０００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する。
【0106】
勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する少なくとも１つの反転勾配パルスが続く。
【0107】
少なくとも１つの反転勾配パルスの後に、約５０μｓ～約９９０μｓ、約５０μｓ～約９００μｓ、約５０μｓ～約８００μｓ、約５０μｓ～約７００μｓ、約５０μｓ～約６００μｓ、約５０μｓ～約５００μｓ、約５０μｓ～約４００μｓ、約５０μｓ～約３００μｓ、約５０μｓ～約２５０μｓ、約５０μｓ～約２００μｓ、約５０μｓ～約１５０μｓ、又は約５０μｓ～約１００μｓのパルス長を有する別の勾配パルスが続く。
【0108】
様々な実装形態では、ＲＦパルス、勾配パルス、及びＷＥＴシーケンスを印加することは、シグナル処理工程のサイクルを構成するものであり、方法は、このサイクルを少なくとも３回繰り返すことをさらに含む。
【0109】
方法は、サイクルを、１０２４回未満、５１２回未満、５００回未満、４００回未満、３００回未満、２５６回未満、２５０回未満、２００回未満、１５０回未満、１２８回未満、１００回未満、９６回未満、８０回未満、７０回未満、６４回未満、６０回未満、５０回未満、４８回未満、４０回未満、３６回未満、３０回未満、２５回未満、２０回未満、又は１６回未満繰り返すことを含む。
【0110】
他の賦形剤は、当技術分野において知られている（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ＭＦ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ，Ｂａｌｏｉａｎ Ｌ．１９９８．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１を参照されたい）。当業者は、生物薬剤の安定性の保持を促進する生物薬剤組成物を得るために、どのような量又は範囲の賦形剤を任意の特定の製剤に含めてよいかを決定することができる。例えば、生物薬剤組成物に含めるべき塩の量及び種類は、最終溶液の所望のオスモル濃度（すなわち、等張性、低張性又は高張性）並びに製剤に含めるべきその他の成分の量及びオスモル濃度に基づいて選択され得る。
【0111】
【表C】
【実施例】
【0112】
実験結果、材料及び方法
実施例１
実施例１の測定を実施するために、５ｍｍ ＣＰＴＣＩクライオプローブ１Ｈ｛１９Ｆ｝－１３Ｃ／１５Ｎ／Ｄ－ＺＧＲＤ ｚグラジエントを装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（１００４００４３）を使用して、３１０Ｋ（３７℃）にてＮＭＲデータを取得した。分光計ソフトウェア（ＴｏｐＳｐｉｎ，Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及びＭＮｏｖａソフトウェア（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓ．Ｌ．（ＵＳＡ）；Ｅｓｃｏｎｄｉｄｏ，ＣＡ）を使用してデータ処理を実行した。
実施例１
実施例１の測定を実施するために、５ｍｍ ＣＰＴＣＩクライオプローブ１Ｈ｛１９Ｆ｝－１３Ｃ／１５Ｎ／Ｄ－ＺＧＲＤ ｚグラジエントを装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（１００４００４３）を使用して、３１０Ｋ（３７℃）にてＮＭＲデータを取得した。分光計ソフトウェア（ＴｏｐＳｐｉｎ，Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及びＭＮｏｖａソフトウェア（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓ．Ｌ．（ＵＳＡ）；Ｅｓｃｏｎｄｉｄｏ，ＣＡ）を使用してデータ処理を実行した。
【0113】
開示されたＮＭＲ法を評価するために、下記のサンプルを使用した。
【0114】
サンプル１：５％Ｄ２Ｏと混合した、５０ｍＭのアセテート、５％スクロース、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ＝５を含む、４２アミノ酸を有する、Ｍ．Ｗ．４６５１．３８Ｄａ、３０ｍｇ／ｍｌ、６ｍＭのペプチド。ＮＭＲ分析用の４ｍｍの株式会社シゲミ社製チューブに、約２００μｌの溶液を入れた。
【0115】
サンプル２：３％Ｄ２Ｏと混合した、ｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ＝５．２。ＮＭＲ分析用の５ｍｍのＷｉｌｍａｄ社製チューブに、約６００μｌの溶液を入れた。
【0116】
サンプル３：約１ｍＬのＤ２Ｏ、９９．９％Ｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解させた、プロリン、３２．２２ｍｇ（約２８０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、スクロース、８７．９２ｍｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＮＭＲ分析用の５ｍｍのＷｉｌｍａｄ社製チューブに、約６００μｌの溶液を入れた。
【0117】
サンプル４：Ｄ２Ｏ中０．１ｍｇ／ｍｌのＧｄＣｌ３を含む１％の水。
【0118】
実施例２
実施例２の測定を実施するために、５ｍｍ ＣＰＴＣＩクライオプローブ１Ｈ｛１９Ｆ｝－１３Ｃ／１５Ｎ／Ｄ－ＺＧＲＤ ｚグラジエント（Ｓ／Ｎ Ｚ１２８７４４／０００１）を装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（Ｓ／Ｎ １００４００４３）を使用して、サンプル１及び２では３１０Ｋ（３７℃）、並びにサンプル３では３００Ｋ（２７℃）にてＮＭＲデータを取得した。
実施例２の測定を実施するために、５ｍｍ ＣＰＴＣＩクライオプローブ１Ｈ｛１９Ｆ｝－１３Ｃ／１５Ｎ／Ｄ－ＺＧＲＤ ｚグラジエント（Ｓ／Ｎ Ｚ１２８７４４／０００１）を装備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（Ｓ／Ｎ １００４００４３）を使用して、サンプル１及び２では３１０Ｋ（３７℃）、並びにサンプル３では３００Ｋ（２７℃）にてＮＭＲデータを取得した。
【0119】
本実施例では、（１）１０ｍＭのグルタメート、又は（２）２００ｍＭのプロリンを添加した、Ａ５２Ｓｕバッファ（１０ｍＭのアセテート、９％スクロース、ｐＨ：５．２）中のｍＡｂ１サンプル、及びＧ４２Ｓｕバッファ（１５ｍＭのグルタメート、９％スクロース、ｐＨ：４．２）中の「タンパク質１」（標準的なＢｉＴＥ分子構造を有する抗原結合タンパク質）の賦形剤シグナルを抑制するために、２Ｄメチルフィンガープリントパルスシーケンスを印加する。
【0120】
スクロース及びアセテートからのシグナルの抑制に加えて、グルタメート及びプロリンからのシグナルを抑制するＮＭＲパルスシーケンスの能力を試験するために、次の３つのサンプルを作製した。
【0121】
サンプル１：１０ｍＭのグルタメート及び５％Ｄ２Ｏを添加した、ｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート。
【0122】
サンプル２：２００ｍＭのプロリン及び５％Ｄ２Ｏを添加した、ｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート。
【0123】
サンプル３：タンパク質１、１０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１５ｍＭのグルタメート及び５％Ｄ２Ｏ。
【0124】
ここで、図７を参照すると、スクロースからの賦形剤シグナルを抑制するための、１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づく例示的なＮＭＲシグナル増強パルスシーケンス７００が示されている。図７に示されるように、パルスシーケンスのＷＥＴ部分を使用してアセテートのプロトンシグナルを抑制する一方で、ＨＳＱＣ実験の途中で新規に形成されたパルスを使用して、治療用タンパク質のメチル領域からの炭素シグナルを励起しながらスクロースからの炭素シグナルを抑制する。本実施例では、シーケンスのＷＥＴ部分で使用されるパルスを、グルタメート及びプロリンによって例示される、他の賦形剤からのシグナルを抑制するように再設計する。シーケンスのＷＥＴ部分のパルスは、どのような賦形剤からのシグナルを抑制する必要があるのかに応じて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐｓｐｉｎソフトウェアを使用して生成することができる。
【0125】
図８は、実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態（８０２）、及び抑制した状態（８０４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトル８００を示している。ＷＥＴパルスは、特に、グルタメート及びアセテートからのシグナルを抑制するように設計した。２．４１８ｐｐｍにおけるピーク強度は、ベースラインレベルまで減少している。２．１４４ｐｐｍ及び２．０８０ｐｐｍのピーク強度が約５０％減少したにもかかわらず、これらのピークは、メチル領域のピークとだいたい同じ強度を有している。
【0126】
図９Ａは、実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトル９００ａの２Ｄメチル領域を示している。図９Ｂは、実施例２のサンプル１中の１０ｍＭのグルタメート及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトル９００ｂの２Ｄメチル領域を示している。これらのスペクトルは、図８に示されるように、賦形剤からのシグナル強度をメチルピークからのシグナル強度と比較することが可能である場合、これらのシグナルによって炭素次元に沿ったストリップが生じず、又は２Ｄスペクトルの位相合わせの問題が引き起こされる可能性がないということを立証するものである。ストリップ及び位置合わせの問題に由来するアーチファクトは、アーチファクト近傍のメチルピークのデータ解析と干渉する可能性がある。
【0127】
図１０は、実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制していない状態（１００２）、及び抑制した状態（１００４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトル１０００を示す。グルタメートからのピークは、ＷＥＴシーケンスを使用することによって効率的に抑制されている。
【0128】
図１１Ａは、実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトル１１００ａの２Ｄメチル領域を示している。図１１Ｂは、実施例２のサンプル３中の１５ｍＭのグルタメートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトル１１００ｂの２Ｄメチル領域を示している。これらのスペクトルは、賦形剤からのシグナル強度がメチルピークからのシグナル強度よりもはるかに高い場合、これらのシグナルが炭素次元にストリップを生じさせ、これによってメチル領域のストリップ近傍のピークの分析と干渉する可能性があるということを明らかにするものである。
【0129】
図１２は、実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態（１２０２）、及び抑制した状態（１２０４）のＨＳＱＣデータの第１の増分からのスペクトル１２００を示す。２００ｍＭのプロリンからの強度は、メチル領域のピークからの強度よりはるかに大きい。
【0130】
図１３は、様々な実施形態による、ダブルＷＥＴスキームに基づく、別の例示的なＮＭＲシグナル増強パルスシーケンス１３００を示している。図１３に示されるダブルＷＥＴスキームを使用して、プロリンシグナルをベースラインレベルまで抑制した。ダブルＷＥＴスキームは単一のＷＥＴスキームよりも効率的であり、図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、炭素次元のストリップをもたらすことなくプロリンからのピークを効果的に抑制することが示された。それでもなお、メチル領域のピークの強度は、ダブルＷＥＴスキームを使用した場合、単一のＷＥＴスキームから得られる強度と比較して約１５％下落した。
【0131】
図１４Ａは、実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制していない状態のＨＳＱＣスペクトル１４００ａの２Ｄメチル領域を示している。図１４Ｂは、実施例２のサンプル２中の２００ｍＭのプロリン及び１０ｍＭのアセテートからのシグナルを抑制した状態のＨＳＱＣスペクトル１４００ｂの２Ｄメチル領域を示している。プロリンからのピークを抑制していない状態では、図１４Ａに示されるように、炭素次元及びプロトン次元に沿ったストリップが存在する。ダブルＷＥＴシーケンスを使用してプロリンシグナルを抑制する場合、図１４Ｂの２Ｄスペクトルは、メチル領域のピークの分析に好適である。
【0132】
実施例３
本明細書に記載されるように、異なる磁場強度を有するＮＭＲ分光計においてこれらのパルスを印加する場合、パルスをパルス長において調整することができるか、又はトランスミッターオフセットを別に配置することができる。この実施例の結果は、８００ＭＨｚでのそのような印加を立証するものである。特に、実施例３は、次のパラメータを使用して実施した：３％Ｄ２Ｏに混合した、ｐＨ＝５．２でｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート、０．０１％ポリソルベート（ＰＳ）８０における８００ＭＨｚのＮＭＲデータ。
本明細書に記載されるように、異なる磁場強度を有するＮＭＲ分光計においてこれらのパルスを印加する場合、パルスをパルス長において調整することができるか、又はトランスミッターオフセットを別に配置することができる。この実施例の結果は、８００ＭＨｚでのそのような印加を立証するものである。特に、実施例３は、次のパラメータを使用して実施した：３％Ｄ２Ｏに混合した、ｐＨ＝５．２でｍＡｂ１、５０ｍｇ／ｍｌ、９％スクロース、１０ｍＭのアセテート、０．０１％ポリソルベート（ＰＳ）８０における８００ＭＨｚのＮＭＲデータ。
【0133】
実験に同じ種類のプローブを使用する場合、８００ＭＨｚのＮＭＲシステムは、６００ＭＨｚのＮＭＲシステムと比較して、より高いスペクトル感度とより良好なスペクトル解像度とを有する。すなわち、例えば、炭素次元の１ｐｐｍは、８００ＭＨｚ及び６００ＭＨｚのＮＭＲシステムでそれぞれ２００Ｈｚ及び１５０Ｈｚである。したがって、８００ＭＨｚのＮＭＲシステムによるスペクトルでは、ピークがさらに広がる可能性がある。
【0134】
図１５Ａ～１５Ｅは、１３Ｃスクロースシグナルを抑制するために８００ＭＨｚで印加され得る、異なる形状を有するパルスの例示的な励起プロファイルを示している。図１５Ａは、スクロースシグナル領域の１３Ｃシグナルのパルスプロファイル１５００ａを示している。図１５Ｂは、６００ＭＨｚでの７５０μｓのＲｅｂｕｒｐパルスと同一の励起プロファイルを保持するように５７５μｓへと調整された、Ｒｅｂｕｒｐプロファイルのパルスプロファイル１５００ｂを示している。図１５Ｃは、パルスプロファイル１５００ｃを示している。Ｈｚでの炭素スペクトル幅が８００ＭＨｚにおいて大きいため、図１５Ｃに示されるように類似した励起プロファイルを保持するため、６００ＭＨｚで２ｐｐｍのトランスミッターオフセットの代わりに、８００ＭＨｚでパルス長が３７５μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４０、０．１Ｔｐ］に対してトランスミッターオフセットを１６ｐｐｍに配置する。図１５Ｄは、トランスミッターオフセット１８ｐｐｍ、パルス長７５０μｓのパラメータ［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝７０、０．１Ｔｐ］を有するパルスプロファイル１５００ｄを示している。図１５Ｅは、トランスミッターオフセット２７ｐｐｍ、パルス長１５００μｓのパラメータ［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４００、０．１Ｔｐ］を有するパルスプロファイル１５００ｅを示している。このプロファイル１５００ｄ及び１５００ｅを使用して、４０ｐｐｍを超過するＣβ炭素シグナルを抑制する。
【0135】
図１６Ａ及び１６Ｂは、８００ＭＨｚのＮＭＲ分光計で得られた特定のＮＭＲ増強方法の有効性を比較するための、異なる１３Ｃ ２Ｄメチルフィンガープリントのプロット１６００ａ及び１６００ｂを示している。図１６Ａは、リフォーカシング要素として、トランスミッターオフセット１６ｐｐｍ、パルス長３７５μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝５０、０．１Ｔｐ］、及び１Ｈアセテートシグナルを抑制するためのＷＥＴシーケンスを使用することによって得られた、はっきりとしたメチル領域を示している。図１６Ｂは、トランスミッターオフセット１８ｐｐｍ、パルス長７５０μｓの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝７０、０．１Ｔｐ］を使用することによって、Ｃβ領域を抑制することができることを示している。
【0136】
図１７は、８００ＭＨｚのＮＭＲシステムを使用して得られた、例示的なＨＳＱＣ実験において異なるＲＦパルスを使用した１Ｈ－１３Ｃ感度増強ＨＳＱＣ実験スキームに基づいて、メチルピークのシグナル強度１７００を図で比較したものを示している。パルス長７５０μｓ、トランスミッターオフセット１８ｐｐｍの形成パルス［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝７０、０．１Ｔｐ］と、パルス長１５００μｓ、トランスミッターオフセット２７ｐｐｍの［ＨＳ１／２、Ｒ＝１０、０．９Ｔｐ；ｔａｎｈ／ｔａｎ、Ｒ＝１４００、０．１Ｔｐ］とを使用した場合、３ｐｐｍ近辺のＨβシグナルが消失するということに留意されたい。図１７の－０．５～２ｐｐｍのピーク面積を積分することによる、相対的なメチル強度を表２に示す。表２の値を表１の値と比較するために、Ｒｅｂｕｒｐパルスを使用することによるメチルピーク面積の強度を０．８８に正規化した。６００ＭＨｚと８００ＭＨｚとで得られた相対的なメチル強度は類似している。
【0137】
【表2】
【0138】
本明細書は、多くの特定の実装形態の詳細を含むが、これらは、いかなる発明の範囲、又は請求され得るものに対する限定として解釈すべきではなく、むしろ、特定の発明の特定の実装形態に特有の特徴についての説明として解釈されるべきである。また、別個の実装形態との関連で本明細書で説明されるいくつかの特徴は、単一の実装形態において組み合わせで実装され得る。逆に、単一の実装形態との関連で説明される様々な特徴は、複数の実装形態において別個に、或いは任意の好適なサブコンビネーションにおいても実装され得る。さらに、特徴は、いくつかの組み合わせで機能するものとして上記で説明され、初めにそのように請求されることさえあるが、請求される組み合わせからの１つ以上の特徴は、場合によってはその組み合わせから削除され得、請求される組み合わせは、サブコンビネーション、又はサブコンビネーションの変形形態を対象とし得る。
【0139】
同様に、動作を特定の順序で図面に示すが、このことは、望ましい結果を達成するために、そのような動作を示された特定の順序若しくは連続した順序で実施することを、又はすべての図示された動作を実施することを要求するものとして理解されるべきではない。
【0140】
「又は」に対する言及は、「又は」を使用して説明される任意の用語が、説明される用語の１つ、２つ以上、及びそのすべてのいずれかを示し得るように、包括的なものとして解釈され得る。「第１の」、「第２の」、「第３の」などの標記は、必ずしも順序を示すことを意味するものではなく、同類又は類似の品目又は要素間を単に区別するために一般に使用される。
【0141】
本開示で説明する実装形態への様々な変更は、当業者には容易に明らかであり得、本明細書で定義した一般原理は、本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく他の実装形態に適用され得る。したがって、特許請求の範囲は、本明細書で示した実装形態に限定されることを意図するものではないが、本開示と、本明細書で開示する原理及び新規な特徴に一致する、最も広い範囲を与えられるべきである。
【0142】
許可された権限内で引用された参照文献はすべて、本明細書に参考として組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3A-3F】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A-15E】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】