特表 2022-527082 コラーゲン７組成物を産生するための系および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-30

(54)【発明の名称】コラーゲン７組成物を産生するための系および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20220523BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220523BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20220523BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220523BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20220523BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20220523BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20220523BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220523BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220523BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20220523BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220523BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20220523BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12P21/02 C ZNA

C07K14/78

C12N15/12

C12N15/53

C12N5/071

A61K38/39

A61P17/00

A61K9/08

A61P17/02

C12N15/85 Z

C12N9/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557380

(86)(22)【出願日】2020-03-27

(85)【翻訳文提出日】2021-11-17

(86)【国際出願番号】 US2020025129

(87)【国際公開番号】W WO2020198556

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/824,671

(32)【優先日】2019-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518220545

【氏名又は名称】フェニックス ティシュー リペア インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＨＯＥＮＩＸ ＴＩＳＳＵＥ ＲＥＰＡＩＲ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】デソーザ、マーク

(72)【発明者】

【氏名】ビスワナサン、マリニ

(72)【発明者】

【氏名】ジロー、ピエール－アラン

(72)【発明者】

【氏名】レガメ、アレクサンドル

(72)【発明者】

【氏名】ル フルン、ヴァレリー

(72)【発明者】

【氏名】カラブレーゼ、ダヴィド

(72)【発明者】

【氏名】ギル、ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ゴットリーブ、メーガン

(72)【発明者】

【氏名】ルンドクヴィスト、エイミー

(72)【発明者】

【氏名】チョウダコワ、アンナ

(72)【発明者】

【氏名】エンリケス、ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】チェリカニ、ラーフル

(72)【発明者】

【氏名】ガリアルディ、トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ライビンズ、タチアナ

(72)【発明者】

【氏名】ユアン、ハン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD11

4B050LL01

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA11

4C076BB13

4C076CC18

4C076CC19

4C076FF11

4C084AA02

4C084AA06

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA40

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA89

4H045BA10

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、組換えヒトコラーゲン７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を産生するための産生系ならびに宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ｒＣｏｌ７およびその機能的変異体を安定発現するように遺伝的に操作されている。コラーゲン７組成物は、それを必要とする対象のコラーゲン７レベルを回復するために、ならびに皮膚状態、例えば、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）に関連付けられる皮膚創傷を予防、その進行を予防、緩和、およびその発症を遅延させるために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト組換えコラーゲン７（ｒＣｏｌ７）および／またはその機能的変異体を発現するように改変された宿主細胞を含む、コラーゲン７組成物を産生するための産生系であって、
前記宿主細胞は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドおよび／またはその機能的変異体、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体、ならびに
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体
を発現するように改変されており、
前記コラーゲン７組成物は、ヒトｒＣｏｌ７、ヒトコラーゲン７の機能的変異体、またはそれらの組合せを含む、産生系。

【請求項2】

前記宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
を含むように改変されている、請求項１に記載の産生系。

【請求項3】

前記宿主細胞は、
（ｄ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドもしくはその機能的変異体をコードする第１の外因性ポリヌクレオチドの核酸配列と同じ核酸配列、または
（ｉｉ）前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドもしくはその機能的変異体をコードする第１の外因性ポリヌクレオチドの核酸配列とは異なる核酸配列
を含む第２の外因性ポリヌクレオチドを含むようにさらに改変されている、請求項２に記載の産生系。

【請求項4】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第２の外因性ポリヌクレオチドは、異なる選択マーカーを含む、請求項３に記載の産生系。

【請求項5】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２５の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２８の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３０の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのべータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２５の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項３に記載の産生系。

【請求項6】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２６の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２９の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３１の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのべータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２７の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項３に記載の産生系。

【請求項7】

前記改変された宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第１のベクター、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター
を含むように改変されている、請求項１に記載の産生系。

【請求項8】

前記宿主細胞は、
（ｄ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第２のベクター、
を含むようにさらに改変されている、請求項７に記載の産生系。

【請求項9】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２６の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第１のベクター、
（ｂ）配列番号２９の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｃ）配列番号３１の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのべータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、および
（ｄ）配列番号２７の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第２のベクター
を含むように改変されている、請求項８に記載の産生系。

【請求項10】

プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドは、アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、請求項１に記載の産生系。

【請求項11】

プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドは、前記アルファ－１ポリペプチドである、請求項１０に記載の産生系。

【請求項12】

前記宿主細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＭＤＣＫ細胞、またはそれらの子孫からなる群から選択される哺乳動物細胞である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の産生系。

【請求項13】

前記改変された宿主細胞は、無血清培地で培養される、請求項１２に記載の産生系。

【請求項14】

ヒト組換えコラーゲン７（ｒＣｏｌ７）および／またはその機能的変異体を発現するように改変された宿主細胞を含む、コラーゲン７組成物を産生するための産生系であって、
前記宿主細胞は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドおよび／またはその機能的変異体、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体、ならびに
（ｄ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
を発現するように改変されており、
前記コラーゲン７組成物は、ヒトｒＣｏｌ７、ヒトコラーゲン７の機能変異体、またはそれらの組合せを含む、産生系。

【請求項15】

前記宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項１４に記載の産生系。

【請求項16】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２５の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２８の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３０の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのべータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号３２の核酸配列を含む、前記熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項１５に記載の産生系。

【請求項17】

前記改変された宿主細胞は、
（ａ）前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記ベータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、および
（ｄ）前記熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体を発現するためのベクター
を含むように改変されている、請求項１４に記載の産生系。

【請求項18】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２６または配列番号２７の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｂ）配列番号２９の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｃ）配列番号３１の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記ベータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、および
（ｄ）配列番号３２の核酸配列を含む、前記熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体を発現するためのベクター
を含むように改変されている、請求項１７に記載の産生系。

【請求項19】

ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を産生するための改変された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｂ）アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体
を発現するように形質転換されている、改変された宿主細胞。

【請求項20】

プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドは、アルファ－１ポリペプチドまたはその機能的変異体である、請求項１９に記載の改変された宿主細胞。

【請求項21】

前記宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７またはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ－１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項２０に記載の改変された宿主細胞。

【請求項22】

（ｄ）組換えヒトコラーゲン７またはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記組換えヒトコラーゲン７もしくはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）前記組換えヒトコラーゲン７もしくはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列
を含む第２の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２１に記載の改変された宿主細胞。

【請求項23】

前記第１の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第２の外因性ポリヌクレオチドは、異なる選択マーカーを含む、請求項２２に記載の改変された宿主細胞。

【請求項24】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２６の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２９の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３１の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのべータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２７の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項２２に記載の改変された宿主細胞。

【請求項25】

前記宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第１のベクター、
（ｂ）アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドを発現するためのベクター、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター
を含み、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼは、組換えヒトコラーゲン７の発現を増加させる、請求項１９に記載の改変された宿主細胞。

【請求項26】

プロリル４－ヒドロキシラーゼの前記アルファポリペプチドは、アルファ－１ポリペプチドまたはその機能的変異体である、請求項２５に記載の改変された宿主細胞。

【請求項27】

前記宿主細胞は、
（ｄ）組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第２のベクター、
をさらに含む、請求項２６に記載の改変された宿主細胞。

【請求項28】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２６の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第１のベクター、
（ｂ）配列番号２９の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、
（ｃ）配列番号３１の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するためのベクター、および
（ｄ）配列番号２７の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を発現するための第２のベクター
を含む、請求項２７に記載の改変された宿主細胞。

【請求項29】

前記宿主細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＭＤＣＫ細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞またはその子孫である、請求項１９乃至２８のいずれか１項に記載の改変された宿主細胞。

【請求項30】

前記細胞は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の子孫である、請求項２９に記載の改変された宿主細胞。

【請求項31】

ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を産生するための改変された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｂ）アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその変異体、
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその変異体、および
（ｄ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
を発現するように形質転換されている、改変された宿主細胞。

【請求項32】

前記宿主細胞は、
（ａ）組換えヒトコラーゲン７またはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ－１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）熱ショックタンパク質４７をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項３１に記載の改変された宿主細胞。

【請求項33】

前記宿主細胞は、
（ａ）配列番号２５の核酸配列を含む、前記組換えヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２８の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号３０の核酸配列を含む、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号３２の核酸配列を含む、前記熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含むように改変されている、請求項３２に記載の改変された宿主細胞。

【請求項34】

（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｂ）アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体
を発現するための改変された宿主細胞を含む産生系により産生され、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼは、前記宿主細胞におけるコラーゲン７発現を増加させる、ヒトコラーゲン７組成物。

【請求項35】

前記改変された宿主細胞は、
（ｄ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
をさらに発現する、請求項３４のコラーゲン７組成物。

【請求項36】

ヒトコラーゲン７組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記コラーゲン７組成物は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｂ）アルファ－１、アルファ－２、またはアルファ－３ポリペプチドである、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドまたはその機能的変異体、および
（ｃ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体
を発現するための改変された宿主細胞を含む、産生系により産生されるヒトｒＣｏｌ７を含み、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼは、前記宿主細胞においてコラーゲン７発現を増加させる、医薬組成物。

【請求項37】

前記改変された宿主細胞は、
（ｄ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
をさらに発現する、請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

ヒトコラーゲン７組成物を産生するための方法であって、
（ａ）宿主細胞を無血清培地で培養する工程であって、前記宿主細胞は、
（ｉ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
（ｉｉ）アルファプロリル４－ヒドロキシラーゼポリペプチドおよびベータプロリル４－ヒドロキシラーゼポリペプチドを含むプロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体、ならびに
（ｉｉｉ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
を発現するように改変されている、工程；
（ｂ）培養培地を収集する工程；ならびに
（ｃ）前記ヒトコラーゲン７組成物を精製する工程
を含む方法。

【請求項39】

対象の皮膚状態を予防、その進行を予防、緩和、および／またはその発症を遅延させるための方法であって、前記対象にヒトｒＣｏｌ７を含む医薬組成物を投与する工程を含み、
ｒＣｏｌ７は、（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドおよび／またはその機能的変異体、ならびにプロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体を発現するように遺伝子操作されている細胞により産生され；前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼは、アルファヒドロキシラーゼポリペプチドおよびベータヒドロキシラーゼポリペプチドで構成されている、方法。

【請求項40】

ｒＣｏｌ７は、
（ａ）ヒトコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドおよび／またはその機能的変異体、
（ｂ）アルファヒドロキシラーゼポリペプチドおよびベータヒドロキシラーゼポリペプチドで構成されるプロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体、ならびに
（ｃ）熱ショックタンパク質４７またはその機能的変異体
を発現するように遺伝子操作されている細胞により産生される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記対象は、栄養障害型表皮水疱症を有すると診断されている、請求項３９または４０に記載の方法。

【請求項42】

ＤＥＢを有すると診断された前記対象の皮膚状態は、薄く乾燥した皮膚、開放皮膚創傷、慢性および非治癒性創傷、水疱形成（軽度または重度）、瘢痕、および慢性創傷により引き起こされる皮膚感染症を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記投与は、静脈内注射によるものである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記投与は、皮膚創傷の部位への外用適用によるものである、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、組換えヒトコラーゲン７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を産生するための産生系、遺伝子操作宿主細胞、および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

コラーゲン７（コラーゲンＶＩＩ型）は、皮膚の表皮層と下層真皮層との間に位置する２層膜である表皮基底膜帯（ＢＭＺ）に見出される皮膚の重要な成分である。コラーゲン７で構成される係留細線維は、表皮基底膜を乳頭真皮と接続させ、皮膚の表皮層および真皮層を一緒に保持して、構造および安定性を提供する。

【0003】

コラーゲン７は、３つの同一のアルファ鎖ポリペプチドからなるホモ三量体である。コラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子によりコードされ、主にケラチノサイトおよび線維芽細胞により発現および合成される。コラーゲン７における変化は、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、尋常性天疱瘡、小児慢性水疱性疾患（ＣＢＤＣ）、および全身性硬化症などの、表皮水疱症（ＥＢ）およびコラーゲン７タンパク質に対する自己抗体により引き起こされる自己免疫疾患などの、幾つかの皮膚障害に関係付けられている。

【0004】

ＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異は、極めて脆弱で不治性の水疱形成皮膚、手足奇形、食道狭窄、数多くの他の併存症、および早期死亡を呈する希な小児科疾患である栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）として知られているＥＢの一形態をもたらす場合がある。ＤＥＢは遺伝型パターンに基づき、常染色体優性ＤＥＢ（ＤＤＥＢ）または劣性ＤＥＢ（ＲＤＥＢ）に分類することができ、後者は最も重度な形態のＤＥＢをもたらす。米国では、全タイプのＤＥＢの発生率は新生児１００万人当たり６．５人と推定されているが、より重度の常染色体劣性型は新生児１００万人当たり約１人に影響を及ぼす。

【0005】

コラーゲン７の欠乏に関連付けられる皮膚疾患の他の一般的な症状としては、皮膚のじんま疹様発疹（ハイブス（ｈｉｖｅｓ））、皮膚の水ぶくれ（水疱形成）（表皮および表皮下の水疱形性を両方とも含む）、慢性皮膚創傷、口腔または直腸粘膜、結膜、鼻咽頭（ｎａｓｏｈａｒｙｎｘ）、喉頭、および食道を含む粘膜の重度でびらん性の病変、ならびに皮膚の疼痛および瘢痕が挙げられる。

【0006】

こうした重度の皮膚状態および障害（例えば、ＤＥＢ）の治療戦略は、機能性コラーゲン７の回復に焦点を当てている。例示的な戦略としては、コラーゲン７の外用および／または局所投与、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を標的とする遺伝子療法、コラーゲン７を発現させるための線維芽細胞の移植などの細胞療法、ならびにコラーゲン７タンパク質の全身性投与などによるコラーゲン７補充療法が挙げられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示は、対象の機能的コラーゲン７を回復させるためのコラーゲン７組成物を産生するための産生系、遺伝子操作宿主細胞、および方法を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン７組成物は、皮膚の基底膜帯（ＢＭＺ）におけるコラーゲン７欠乏および／または他の欠陥により引き起こされるものなどの皮膚状態を治療するために使用することができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、ヒト組換えコラーゲン７（ｒＣｏｌ７）および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を産生するための産生系であって、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するように改変された宿主細胞を含む産生系を提供する。好ましくは、産生系の遺伝子操作宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体、ならびにプロリダーゼ（プロリンヒドロラーゼとしても知られている）、アルファポリペプチド（サブユニットＡ）およびベータポリペプチド（サブユニットＢ）からなるプロリル４－ヒドロキシラーゼ、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（ＣＯＭＳＣ）、および／または熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ４７）を含む、宿主細胞においてｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体の発現を増加させることができる少なくとも１つのタンパク質を発現するように形質転換されている。好ましくは、宿主細胞は、アルファおよびベータポリペプチド（例えば、ｈＰ４ＨＡ１およびｈＰ４ＨＢ）を両方とも含むヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼを単独でまたはＨＳＰ４７との組合せで発現して、ｒＣｏｌ７の発現を増加させるように遺伝子操作されている。

【0009】

一部の実施形態では、産生系は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を発現する単一細胞クローンに由来する複数の均質な遺伝子操作宿主細胞を含んでいてもよい。他の実施形態では、産生系は、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現する１つよりも多くの細胞クローンに由来する複数の不均質な遺伝子操作宿主細胞を含んでいてもよい。

【0010】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、ならびにプロリダーゼ（ＰＥＰＤ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（ＣＯＭＳＣ）、および熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）など、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体の発現を増加させることができるタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。ｒＣｏｌ７およびその機能的変異体をコードする第１および第２のポリヌクレオチドは、同一の核酸配列または異なる核酸配列のいずれを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｒＣｏｌ７をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化された核酸配列を含む。

【0011】

１つの好ましい実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４ＨＡ）のアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４ＨＢ）のベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。任意選択で、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。一部の例では、第１のｒＣｏｌ７コードポリヌクレオチドおよび第２のｒＣｏｌ７コードポリヌクレオチドは、同じ核酸配列を有してもよい。他の例では、２つのｒＣｏｌ７コードポリヌクレオチドは、異なる核酸配列を有する。

【0012】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする１つの第１のおよび１つ第２の外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、ならびにＨＳＰ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0013】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびｒＣｏｌ７またはその機能的変異体の発現を増加させることができるタンパク質であって、プロリダーゼ（ＰＥＰＤ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（ＣＯＭＳＣ）、または熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）であってもよい、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターで形質転換されている。

【0014】

１つの好ましい実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されている。任意選択で、遺伝子操作宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでさらに形質転換されている。一部の例では、そのような遺伝子操作宿主細胞は、ＨＳＰ４７をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターでさらに形質転換されている。

【0015】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されており、同じ発現ベクターは、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0016】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されており、同じ発現ベクターは、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードするポリヌクレオチドおよびＨＳＰ４７をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0017】

一部の実施形態では、遺伝子操作宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、またはチャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）である。１つの好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞株に由来する哺乳動物細胞である。

【0018】

遺伝子操作宿主細胞は、無血清であるタンパク質産生条件下で培養してもよい。タンパク質産生条件は、栄養素および／または選択可能な作用剤などの１つまたは複数の作用剤を添加することを含んでいてもよい。

【0019】

本開示の別の態様では、コラーゲン７組成物を産生するための方法であって、（１）哺乳動物細胞に、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入する工程；（２）選択剤の存在下で成長させる場合に自らの生存を可能にするのに十分なレベルの選択可能なマーカーを発現する形質転換体を単離することにより、上記哺乳動物細胞の安定単クローン性形質転換体を選択する工程；（３）形質転換体を、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体および他のポリペプチドの発現を可能にする成長条件下で培養して、タンパク質組成物を産生させる工程；ならびに（４）細胞培養培地を回収し、タンパク質組成物を精製する工程を含む方法が提供される。

【0020】

一部の実施形態では、この方法は、工程（１）の哺乳動物細胞に、ＨＳＰ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入する工程をさらに含む。
一部の実施形態では、成長条件は、無血清であり、栄養素および／または選択可能な作用剤などの、１つまたは複数の作用剤を添加することを含む。

【0021】

本開示の別の態様は、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物、ならびにコラーゲン７組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物またはそれらの製剤に関する。一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、それを必要とする対象への全身性投与に好適である。対象は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子の欠乏を被っていてもよい。一部の例では、対象は、ＲＤＥＢであると診断されていてもよい。

【0022】

一部の実施形態では、本産生系により産生されるコラーゲン７組成物は、配列番号１のポリペプチドを含む天然に存在するヒトコラーゲン７タンパク質、その機能的変異体、または天然に存在するコラーゲン７タンパク質およびその機能的変異体の組合せを含んでいてもよい。

【0023】

一部の実施形態では、本産生系、宿主細胞、および方法により産生されるコラーゲン７組成物を使用して、それを必要とする対象においてコラーゲン７を機能レベルまで回復させることができる。

【0024】

さらに別の態様では、本開示は、対象の皮膚状態の進行を予防、緩和、および阻害するための方法であって、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、状態は、ＲＤＥＢなど、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異に関連付けられる皮膚状態である。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】Ｂ１ＳＴＢＳＴｂ細胞クローン第１ラウンド候補の培養６日目（３２℃にて）の細胞のウエスタンブロットのゲル画像を示す図。

【図2A】３２℃における第２ラウンド選択の細胞クローンの培養６日目の細胞のウエスタンブロットのゲル画像を示す図。

【図2B】３７℃における第２ラウンド選択の細胞クローンの培養６日目の細胞のウエスタンブロットのゲル画像を示す図。

【図3】３２℃および３７℃におけるＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１３およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１５細胞クローンの培養５日目の細胞のウエスタンブロットのゲル画像を示す図。

【図4】同一性を確認するための、細胞クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３（マスター細胞バンク（ＭＣＢ））に由来するｒＣｏｌ７のサザンブロット分析の代表的な画像を示す図。ｒＣｏｌ７ ＭＣＢ（レーン２）および未トランスフェクトＣＨＯ細胞（レーン３）に由来するゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ酵素で消化し、ｒＣｏｌ７コード配列ハイブリダイゼーションプローブを使用したサザンブロットにより分析した。ハイブリダイズバンドの予想サイズは８．９ｋｂである。レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカー。

【図5】参照コラーゲン７（レーン２）およびＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物（レーン３）のウエスタンブロット分析の画像を示す図。レーン１：分子量ラダー。

【図6】参照コラーゲン７ならびに幾つかのＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物中のＹ１０３３の画分パーセンテージに対するラミニン－３３２結合Ｋｄのプロットを示す図。分析は、ｒＣｏｌ７Ｙ１０３３含有量に対するラミニン３３２結合応答に相関性が欠如していることを示す。

【図7】参照コラーゲン７およびＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物による、ケラチノサイトを使用した創傷治癒アッセイを示す図。分析にはＢＳＡ対照試料も含まれている。

【図8】両クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０１（１３－０１）およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０３（１３－０３）に存在するインタクトな導入遺伝子転写物を実証する図。転写物は、コラーゲン７のＮＣ１およびＴＨ３領域に特異的なプローブを使用してブロッティングした。

【図9】クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０３におけるコラーゲン７の細胞内染色を描写する図。

【図10】細胞クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０３のＨＣＰ定量化を実証する図。

【図11】細胞クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０１（レーン８）およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－ｃｐ０３（レーン７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥによるｒＣｏｌ７組成同一性を実証する図。レーン１はＭＷ標準物質であり、レーン２～６はアッセイ対照である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、下記の添付の説明に記述されている。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の物質および方法を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい物質および方法がこれ以降に記載される。本開示の他の特徴、目的、および利点は、こうした説明から明白になるだろう。こうした説明では、単数形は、状況が明らかに別様に指示しない限り複数形も含む。別様の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が優先されるものとする。

【0027】

本開示は、コラーゲン７組成物を産生するための産生系、遺伝子操作宿主細胞、および方法に関する。コラーゲン７組成物は、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含んでいてもよい。好ましくは、産生系は、ヒト組換えコラーゲン７（ｒＣｏｌ７）および／またはその機能的変異体を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞を含む。宿主細胞は、組換えコラーゲン７および／またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されていてもよい。宿主細胞は、組換えコラーゲン７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の発現ベクターで形質転換されていてもよい。本開示によると、宿主細胞は、宿主細胞でのｒＣｏｌ７発現を増加させることができる１つまたは複数のタンパク質を発現するようにさらに形質転換されている。そのようなタンパク質としては、プロリル４－ヒドロキシラーゼ、プロリダーゼ、シャペロンタンパク質、および／または熱ショックタンパク質、例えばＨＳＰ４７を挙げることができる。

【0028】

本開示は、本開示の産生系および宿主細胞により産生することができる、ｒＣｏｌ７（例えば、ヒトｒＣｏｌ７）およびその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を提供する。さらに、本開示のコラーゲン７組成物を含む医薬組成物および／または製剤が提供される。

【0029】

本開示は、コラーゲン７組成物を産生するための細胞発現系を生成するためのベクターおよび方法をさらに提供する。本開示の別の態様では、ｒＣｏｌ７およびその機能的変異体を含む医薬組成物および／または製剤を用いて、それを必要とする対象の皮膚状態の進行を阻害、緩和、または予防するための方法が提供される。

【0030】

定義
便宜をはかるために、本明細書、例、および特許請求の範囲で使用されるある特定の用語がここに集められている。別様の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語および語句は、ここで定義されている意味を有することが意図されている。

【0031】

本明細書で使用される場合、「コラーゲン７」（Ｃ７、Ｃｏｌ７、ＶＩＩ型コラーゲン、およびコラーゲンＶＩＩとも呼ばれる）は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子によりコードされる３つの同一のアルファ鎖ポリペプチドで構成されているコラーゲンタンパク質を指す。各アルファ鎖ポリペプチドは、大型グローバル（ｇｌｏｂａｌ）アミノ末端非コラーゲン性ＮＣ１ドメイン（残基１７～１２５３）およびより小型カルボキシル末端非コラーゲン性ＮＣ２ドメイン（残基２７８４～２９４４）によりフランキングされている、中央コラーゲン性トリプルヘリックスセグメント（ＴＨ）（成熟ペプチドの残基１２５４～２７８３）を含む２，９４４個アミノ酸からなる。ヒトコラーゲン７の全長アルファ鎖ポリペプチドは、配列番号２（参照番号ＮＭ＿００００９４）の核酸配列によりコードされる、配列番号１（参照番号ＮＰ＿００００８５）のアミノ酸配列を含む。

【0032】

コラーゲン７は、係留細線維の主成分であり、皮膚、口腔粘膜、および子宮頸部を含む幾つかの組織の上皮と間葉層との界面にて付着複合体としての役目を果たす（チュンら（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．，２０１０，２８（１）：９３－１０５）。皮膚の係留細線維は、真皮－表皮基底膜帯（ＢＭＺ）の基底膜の下に位置し、表皮ＢＭＺと真皮との会合を確保し、皮膚の完全性に貢献する（バーキら（Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ２００７，４４：１８１－１９２）。コラーゲン７タンパク質は、ジスルフィド結合で安定化された二量体凝集体の非ねじれ型アレイを形成する（ブルゲンソンら（Ｂｕｒｇｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ），Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，１９８５，４６０：４７－５７）。「コラーゲン７」という用語は、本明細書で使用される場合、明示的な論述がない場合でさえ、その機能的変異体を包含することが留意されるべきである。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して互いに連結されているアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者であれば、この用語が非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して互いに連結されている２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するだろう。当業者に公知である通り、ポリペプチドは、プロセシングおよび／または修飾されていてもよい。「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、別個の単位として機能する１つまたは複数のポリペプチドを指す。一部の状況では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、同義的に使用することができる。「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質およびポリペプチド、またはそれらのアミノ酸の類似体もしくは誘導体の形成に通常使用される２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを指す。「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、単離された核酸分子または組換え核酸分子を使用して発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。「単離された」タンパク質または核酸分子は、その自然環境から取り出されているタンパク質を指す。単離されたタンパク質または核酸分子は、目的のタンパク質または核酸分子が、重量比に基づき、少なくとも５％、１０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である場合、「少なくとも」ある程度純粋であり得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「変異体」または「機能的変異体」という用語は、野生型コラーゲン７の生物学的機能または活性を本質的に維持する野生型コラーゲン７タンパク質の任意の誘導体を意味する。

【0035】

コラーゲン７の機能的変異体としては、ヒト皮膚の表皮層と真皮層との間に係留細線維を形成する能力など、コラーゲン７の生物学的機能を維持するポリペプチドを挙げることができる。コラーゲン７変異体は、野生型コラーゲン７と実質的な同一性を有してもよい。コラーゲン７変異体としては、これらに限定されないが、野生型コラーゲン７に対して化学的に修飾されているか、および／または野生型コラーゲン７に対して１つもしくは複数のアミノ酸変更を含むかいずれでもよいコラーゲン７ポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、コラーゲン７の変異体は、ヒトコラーゲン７（野生型）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。非限定的な例として、コラーゲン７変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。

【0036】

また、コラーゲン７タンパク質の変異体は、野生型コラーゲン７のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、または保存的置換などの置換）および／またはアミノ酸残基の他の化学修飾を有するポリペプチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、コラーゲン７の変異体は、ヒトコラーゲン７と、約１～５０アミノ酸残基、または約１～３０アミノ酸残基、または約１～２０アミノ酸残基、または約１～１０アミノ酸残基が異なる。コラーゲン７の変異体は、ヒトコラーゲン７と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸残基が異なっていてもよい。非限定的な例として、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸残基が異なっていてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。こうしたファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。アミノ酸残基の化学修飾としては、これらに限定されないが、グリコシル化、リン酸化、アミド化、ミリストイル化、ヒドロキシル化、ホスホパンテテイン付着、メチル化、およびプレニル化が挙げられる。

【0037】

また、本開示によると、コラーゲン７の機能的変異体は、コラーゲン７の「機能的断片」を含んでいてもよく、これは、全長タンパク質よりも短いポリペプチドであるが、ヒト皮膚の表皮層と真皮層の間に係留細線維を形成する能力、ならびにコラーゲン４およびラミニン－３３２に結合する能力など、その生物学的機能を維持するヒトコラーゲン７ポリペプチドの部分を指す。ヒトコラーゲン７の機能的断片は、コラーゲン７の２，９４４アミノ酸残基の全体を含んでいなくてもよい。例えば、機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１ドメインおよび／またはＮＣ２ドメインのすべてまたは部分を含んでいてもよく、例えば、機能的断片は、中央コラーゲン性ヘリックスドメインのすべてまたは部分を有していないコラーゲン７であってもよい。

【0038】

本明細書で使用される場合、「コラーゲン７組成物」という用語は、複数の組換えコラーゲン７アルファポリペプチド、複数のコラーゲン７等価ポリペプチド、またはそれらの複数の機能的変異体および断片を含む組成物を指す。その代わりに、コラーゲン７組成物は、複数の組換えコラーゲン７アルファポリペプチド、複数のコラーゲン７等価ポリペプチド、ならびにそれらの複数の機能的変異体および断片の混合物を含んでいてもよい。一部の例では、コラーゲン７組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を有するコラーゲン７アルファポリペプチドを含む。コラーゲン７組成物は、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するように遺伝子操作されている本発現系および宿主細胞により産生することができる。コラーゲン７組成物は、宿主細胞の培養培地から精製することができる。

【0039】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は同義的に使用され、５’炭素原子と３’炭素原子との間のホスホジエステル連結により互いに接合されているヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、ＲＮＡ（リボ核酸分子）（例えば、ｍＲＮＡ）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸分子）（例えば、真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列）を挙げることができる。また、この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの既知塩基類似体のいずれかを含む配列を捕捉する。「組換え」という用語は、核酸分子を説明するために本明細書で使用される場合、その由来または操作のため、（１）それが自然界で会合するポリヌクレオチドのすべてもしくは部分と会合しない、および／または（２）それが自然界で連結されているもの以外のポリヌクレオチドに連結されているゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成由来のポリヌクレオチドを意味する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。本開示によると、コラーゲン７をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を含んでいてもよい。配列は、コドン最適化核酸配列であってもよく、一実施形態では、このコドン最適化は、グリシン含有量を増加させる役目を果たしてもよい。

【0040】

「実質的に同一の」という用語は、例えば、下記に記載の方法を使用して最適にアラインした場合、第２の核酸またはアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を共有する核酸またはアミノ酸配列を指す。「実質的な同一性」は、全長配列、機能的ドメイン、コードおよび／または調節配列、エクソン、イントロン、プロモーター、およびゲノム配列などの、種々のタイプおよび長さの配列を指すために使用することができる。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の配列同一性パーセントは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（アルトシュル，Ｓ．Ｆ．、Ｗ．ギッシュら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３－１０）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内にある種々の方法で決定される。加えて、当業者であれば、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。配列同一性を決定する目的でＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較する場合、チミンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと等価であることが理解される。保存的置換としては、典型的には、以下の群のうちの１つでの置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。

【0041】

ポリヌクレオチドは、約３０～約２００，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００、２，０００～１００，０００、５，０００～１５，０００、および５，０００～２０，０００ヌクレオチド）を含んでいてもよい。

【0042】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的に修飾されていてもよい。本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、ヌクレオシド塩基の任意の化学的修飾を含むことができる。ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシド、シチジン修飾、グアノシン修飾、および／またはチミジン修飾を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多くの化学的に修飾されたヌクレオシドを含んでいてもよい。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、別の核酸分子、例えば組換えコラーゲン７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを運搬することが可能な、ウイルス性または非ウイルス性の、原核生物性または真核生物性のデオキシリボ核酸、リボ核酸、または核酸類似体を意味する。ベクターは、核酸分子のすべてまたは部分が転写または発現されるように「宿主細胞」と呼ばれる細胞内へと核酸分子を運搬することができる。ベクターは、様々なウイルス、細菌、または哺乳動物遺伝子に由来するエレメントの複合体としてアセンブリされることが多い。ベクターは、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、細菌での増殖を促進する配列、またはある特定の細胞タイプでのみ発現する１つもしくは複数の転写ユニットなど、種々のコードおよび非コード配列を含む。例えば、哺乳動物発現ベクターは、細菌でのベクターの増殖を促進する原核生物配列、および真核細胞でのみ発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットを両方とも含むことが多い。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存する場合があることを理解するだろう。また、本明細書で使用するために好適なベクターは、宿主細胞が特定の条件下で成長および生存するために必要な産物をコードし、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を支援する選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。典型的な選択遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質、薬物、または毒素（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシンなど）に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。発現ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物ウイルス、またはアデノウイルス、レトロウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、または当技術分野で公知の任意の他のビヒクルであってもよい。適切なベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。

【0044】

当業者に公知である標準的な方法を使用して、本明細書に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクターを構築することができる。そうした方法としては、これらに限定されないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。方法の選択は、特定のヌクレオチド断片の性質に依存し、当業者であれば決定することができる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」という用語は、当技術分野で公知である多数の技法による細胞内への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する。形質転換およびトランスフェクション技法としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性トランスフェクションが挙げられる。当業者であれば、宿主細胞／ベクターの組合せに基づき、好適な形質転換およびトランスフェクション法の知識を有するであろう。組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、組換えタンパク質の安定発現が好ましい場合がある。組換えタンパク質を安定的に発現する宿主細胞を遺伝子操作することができる。一部の例では、「スーパートランスフェクション」という用語は、２、３、４、５つ、またはそれよりも多くの外因性ポリヌクレオチドおよびベクターなどの、複数の外因性ポリヌクレオチドおよびベクターによる細胞トランスフェクションを指すために使用される。

【0046】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、発現ベクターによりコードされるタンパク質などの外因性タンパク質を発現することが可能な任意の生細胞を指す。宿主細胞は、組換え発現ベクターを導入することができる原核細胞または真核細胞であってもよい。「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、特定の対象細胞の子孫または潜在的子孫も指す。突然変異または環境影響のいずれかのため、ある特定の修飾が後の世代で生じる可能性があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される場合は、依然としてこの用語の範囲内に含まれる。例示的な宿主細胞は、酵母、真菌、昆虫、または哺乳動物系に由来してもよいが、この選択に限定されない。好適な宿主細胞としては、これらに限定されないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｃ１２７、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫなどを含む、初代または形質転換細胞株を挙げることができる。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。宿主細胞は、ベクターに含まれるコード配列を含む形質転換核酸配列の発現をモジュレートすることができてもよく、ベクター配列にコードされている遺伝子産物を特定の様式で修飾およびプロセシングすることができてもよい。タンパク質産物のグリコシル化、リン酸化、およびプロセシングを含むがそれらに限定されない修飾は、タンパク質の機能にとって重要になり得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「産生系」または「発現系」という用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質を産生することができる系を指す。産生系は、目的のポリペプチドまたはタンパク質、例えばコラーゲン７を発現することができる細胞を含んでいてもよい。本開示の状況では、産生系は、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するように遺伝子操作されている宿主細胞を含む。産生系は、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するように遺伝子操作されている宿主細胞の成長に好適なリアクターをさらに備えていてもよい。本明細書で使用される産生リアクターは、目的のポリペプチドまたはタンパク質、つまりｒＣｏｌ７の産生に使用される最終バイオリアクターを指す。リアクターは任意のサイズであってもよい。非限定的な例として、リアクターは、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットルであってもよく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００リットル、もしくはそれよりも多くの容積、またはその間の任意の容積であってもよい。ラージスケール細胞培養産生リアクターの容積は、典型的には、少なくとも２０リットル、もしくは少なくとも５０リットル、もしくは少なくとも１００リットル、もしくは少なくとも２００リットル、もしくは少なくとも３００リットル、もしくは少なくとも４００リットル、もしくは少なくとも５００リットルであり、あるいは１０００、２５００、３，０００、４，０００、５０００、６，０００、７，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル、もしくはそれよりも多く容積、またはその間の任意の容積であってもよい。リアクターは、ガラス、プラスチック、または金属を含む、培地に懸濁されている細胞培養物を本開示の培養条件下で保持するのに好適な任意の材料で構成されていてもよい。生産リアクターの条件は、典型的には、細胞密度および生存率を確保するために、細胞培養期間中に制御される。そうした条件としては、これらに限定されないが、ｐＨ、温度、湿度、およびＣＯ２供給が挙げられる。本明細書で使用される場合、「細胞密度」という用語は、所与の容積の培地中に存在する細胞の数を指す。「細胞生存率」という用語は、本明細書で使用される場合、培養中の細胞が、所与のセットの培養条件下または実験的変動下で生存する能力を指す。また、この用語は、本明細書で使用される場合、その時点における培養中の細胞（生または死）の総数に対する、特定の時点で生存している細胞の割合を指す。

【0048】

本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」という用語は、コラーゲン７組成物を発現するように宿主細胞を培養するためのリアクターを指すために使用される。バイオリアクターは、従来の使い捨てではないリアクターであってもよく、または使い捨てバイオリアクターであってもよい。

【0049】

本明細書で使用される場合、治療しようとする「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のいずれを意味してもよい。本開示の状況では、「患者」または「対象」という用語は、表皮水疱症（例えば、栄養障害型表皮水疱症）などの皮膚障害を罹患している任意の対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。

【0050】

本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」という用語は、自己免疫欠陥、遺伝的欠陥、または環境ストレスなどの種々の原因に起因し、兆候または症状の識別可能な群により特徴付けられる、生物の一部、器官、または系の病的状態を指す。「皮膚疾患」または「皮膚障害」は、対象の皮膚に影響を及ぼす状態、例えば、水ぶくれ障害、炎症性皮膚状態、または皮膚がんなどの皮膚の臨床状態を意味する。水ぶくれ（水疱形成）障害は、主に皮膚および粘膜に存在する、盛り上がっており液体で満たされている水疱形成性病変（水ぶくれ）により特徴付けられる不均質な障害の群である。水ぶくれはサイズが様々であってもよく、水疱形成疾患の特定の症状および重症度は、同じ障害を有する個体間でさえ、個人により様々である。例示的な水疱形成障害としては、これらに限定されないが、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）および栄養障害型ＥＢなどの先天性表皮水疱症（ＥＢ）が挙げられる。ＥＢとしては、遺伝的欠陥に起因する皮膚および粘膜における水疱を引き起こす遺伝性結合組織疾患の群が挙げられる。栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）は、主に、コラーゲン７タンパク質をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子内の突然変異により引き起こされる。現在まで、ＣＯＬ７Ａ１には約４００個の突然変異が報告されている（ファンデンアッカーら（ｖａｎ ｄｅｎ Ａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２０１１，３２（１０）：１１００－１１０７）。ＤＥＢは、２つの遺伝型パターン：常染色体優性（ＤＤＥＢ）および常染色体劣性（ＲＤＥＢ）を有する。ＤＤＥＢは、一般に、コラーゲンアルファ_１（ＶＩＩ）鎖のコラーゲン性ドメイン内のグリシン置換により引き起こされるコラーゲン７発現の低下を伴う。ＲＤＥＢは、通常は重度であり、主にＣＯＬ７Ａ１遺伝子の早期終止コドン（ＰＴＣ）のためコラーゲン７発現が存在しないことまたは著しく低減されることにより引き起こされる。

【0051】

本明細書で使用される場合、患者を「治療すること」または「治療」または「治療する」は、疾患の少なくとも１つの症状が反転、治癒、緩和、または減少するように、医薬組成物を対象に投与することを指す。対象のＥＢ、例えばＤＥＢ（ＤＤＥＢおよびＲＲＥＢ）を「治療すること」、またはＥＢの治療、またはＥＢを治療するは、ＥＢを有する対象に、ＥＢ疾患の少なくとも１つの症状が反転、治癒、緩和、または減少するように、医薬組成物、例えばｒＣｏｌ７およびその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を投与することを指す。治療の標的となり得るＥＢ疾患の症状としては、これらに限定されないが、水疱形成；病変（例えば、直腸、肛門、尿道病変、および／または粘膜病変、および／または扁平上皮組織の病変）；胃腸管の病変；拘縮、例えば屈曲拘縮（例えば、四肢の）；手または足の偽性合指症（ｐｓｅｕｄｏｓｙｎｄａｃｔｙｌｙ）；癌腫（例えば、扁平上皮癌）；水ぶくれ形成；爪および／または歯の奇形；食道狭窄；眼障害、貧血、栄養失調；二次皮膚感染症；敗血症；嗄声；尿道狭窄；包茎；角膜瘢痕；吸収不良；ならびに発育障害を挙げることができる。

【0052】

本明細書で使用される場合、「予防すること」または「予防する」または「予防」という用語は、例えば、望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）が臨床的に顕在化する前に、望ましくない状態の発症から、例えば疾患の少なくとも１つの症状から宿主が保護されるように、組成物を投与することを意味する。疾患を「予防すること」は、「予防措置」または「予防措置的治療」と呼ばれる場合もある。本開示の状況では、ＥＢに関連付けられる１つまたは複数の症状、例えば瘢痕を予防することができる。ＥＢを有する対象の瘢痕は、以下の症状：拘縮、例えば屈曲拘縮（例えば、四肢の）；手または足の偽性合指症；癌腫（例えば、扁平上皮癌）；直腸病変；粘膜病変；水ぶくれ形成；手外傷後の水ぶくれ形成；爪または歯の奇形；食道狭窄；眼障害、貧血、栄養失調；二次皮膚感染症；敗血症；嗄声；尿道狭窄；包茎；角膜瘢痕；吸収不良；および発育障害の１つまたは複数をもたらす場合がある。

【0053】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間において効果的な量を指す。組成物の治療有効量は、病状、または対象の年齢、性別、および体重などの要因に応じて様々であってもよい。また、治療有効量は、治療有益効果が、組成物の任意の毒性または有害効果を上回る量である。本開示の状況では、有効量のｒＣｏｌ７は、任意の規定治療レジメンの一部として投与されると、合併症に関連付けられる少なくとも１つの臨床パラメーターにより明らかにされるような、統計的に測定可能な結果の向上をもたらす。

【0054】

本開示の組成物は、別の作用剤または療法と組み合わせて投与することができる。本明細書で使用される場合、「組合せ」という用語は、同じ患者を治療するための２つまたはそれよりも多くの作用剤または療法の使用であって、作用剤または療法の使用または作用は時間的に重複する、使用を指す。本開示の状況では、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を含む医薬組成物は、ＤＥＢなどの皮膚障害を予防および治療する１つまたは複数の作用剤と組み合わせて使用することができる。作用剤または療法は、同時に（例えば、患者に投与される単一の製剤として、または同時的に投与される２つの別々の製剤として）、または任意の順序で連続して投与することができる。一部の実施形態では、１つの作用剤または療法の送達は、第２の送達が始まる時点で依然として生じている最中であり、投与の点で重複が存在する。これは、本明細書では「同時」または「同時的送達」と呼ばれることもある。他の実施形態では、一方の作用剤または療法の送達は、他方の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態では、治療は、併用投与のため、より効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、より少ない第２の治療で等価な効果が見られるか、または第２の治療は、第２の治療が第１の治療の非存在下で投与された場合に見られるものまたは類似の状況が第１の治療で見られるものよりも症状を大幅に低減する。一部の実施形態では、送達は、症状の低減、または障害に関する他のパラメーターが、他方の非存在下で送達された一方の治療で観察されるものよりも大きい。２つの治療の効果は、部分的に相加的であってもよく、完全に相加的であってもよく、または相加的であることを上回ってもよい。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達される際に依然として検出可能であってもよい。

【0055】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないことを指す。
コラーゲン７組成物を産生するための産生系および方法
本開示の一態様では、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物を調製するための産生系であって、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するための宿主細胞を含む産生系が提供される。宿主細胞は、ｒＣｏｌ７を発現するように遺伝子改変されており、一部の実施形態では、宿主細胞でのｒＣｏｌ７発現を増加させることができる少なくとも１つのタンパク質を発現するようにさらに遺伝的に操作されている。タンパク質としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：プロリダーゼ（ペプチダーゼＤ、プロリンジペプチダーゼ、およびＬ－プロリンヒドロラーゼ、ＰＥＰＤとしても知られている）またはその機能的変異体、プロリル４－ヒドロキシラーゼ（プロコラーゲン－プロリン、および２－オキソグルタル酸４－ジオキシゲナーゼ、Ｐ４Ｈ）またはその機能的変異体、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（コア１ベータ３－ガラクトシルトランスフェラーゼ特異的分子シャペロン、ベータ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ２、およびＣＯＳＭＣとしても知られる）またはその機能的変異体、リシルヒドロキシラーゼ（ＬＨ）またはその機能的変異体、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）またはその機能的変異体、および熱ショックタンパク質またはその機能的変異体（例えば、ＨＳＰ４７）。好ましくは、宿主細胞におけるｒＣｏｌ７の発現を増加させるために使用されるタンパク質は、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）（例えば、ｈＰ４ＨＡ１）またはその機能的変異体およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）（つまりｈＰ４ＨＢ）またはその機能的変異体を含む、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ（ｈＰ４Ｈ）、ならびにＨＳＰ４７またはその機能的変異体である。

【0056】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ｒＣｏｌ７アルファ鎖ポリペプチド、およびプロリダーゼ（ＰＥＰＤ）、プロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、リシルヒドロキシラーゼ（ＬＨ）、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（ＣＯＳＭＣ）、またはヘッドショックタンパク質（ｈｅａｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＨＳＰ４７、またはそれらの機能的変異体から選択される、宿主細胞においてｒＣｏｌ７発現を増加させることができる、少なくとも１つのタンパク質を発現するように形質転換またはトランスフェクトされている。好ましくは、宿主細胞は、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）（例えば、ｈＰ４ＨＡ１）およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）（つまり、ｈＰ４ＨＢ）を含むヒトＰ４Ｈ、ならびに／またはＨＳＰ４７で形質転換されている。

【0057】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を産生するように遺伝的に操作されている。ヒトｒＣｏｌ７は、配列番号１により表されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。また、ｒＣｏｌ７は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。ヒトコラーゲン７の機能的変異体は、配列番号１として示されている配列と、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くのアミノ酸差異を有してもよい。ヒトコラーゲン７の機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の部分を有する断片を含んでいてもよい。

【0058】

一部の実施形態では、ｒＣｏｌ７は、配列番号２により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。一部の実施形態では、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。

【0059】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、プロリダーゼ（ＰＥＰＤ）をさらに発現するように遺伝的に操作されていてもよい。プロリダーゼは、Ｃ末端プロリン残基またはヒドロキシプロリン残基を有するジペプチドまたはトリペプチドを加水分解することができる、ＰＥＰＤ遺伝子によりコードされる細胞質イミドジペプチダーゼである。この酵素は、コラーゲンおよび他のプロリン含有タンパク質の再合成のために、主にコラーゲンの分解産物に由来するイミドジペプチドからプロリンを再利用することにおいて重要な役割を果たす。この酵素は、一部の宿主細胞において組換えコラーゲンタンパク質の合成を促進することができる。一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、プロリダーゼまたはその機能的変異体を発現するように改変されていてもよい。プロリダーゼは、哺乳動物プロリダーゼまたはその機能的変異体、例えば、ヒトプロリダーゼ、マウスプロリダーゼ、ラットプロリダーゼ、またはハムスタープロリダーゼであってもよい。非限定的な例として、プロリダーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトプロリダーゼである。プロリダーゼの機能的変異体は、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0060】

一部の実施形態では、プロリダーゼは、配列番号４により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。プロリダーゼまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。

【0061】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、プロリル４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をさらに発現するように遺伝的に操作されていてもよい。プロリル４－ヒドロキシラーゼは、プロコラーゲンを成熟コラーゲンタンパク質へとプロセシングするための重要な工程である、プレプロコラーゲンのプロリル残基のヒドロキシル化に関与する酵素である。一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、プロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体を発現するように改変されていてもよい。プロリル４－ヒドロキシラーゼは、哺乳動物プロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体、例えば、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ、マウスプロリル４－ヒドロキシラーゼ、ラットプロリル４－ヒドロキシラーゼ、またはハムスタープロリル４－ヒドロキシラーゼであってもよい。

【0062】

哺乳動物プロリル４－ヒドロキシラーゼは、２つの同一のアルファ（α）ポリペプチド（サブユニットＡ）および２つのベータ（β）ポリペプチド（サブユニットＢ）で構成されているα２β２テトラマーである。アルファポリペプチド（Ｐ４ＨαまたはＰ４ＨＡ）は、ペプチド－基質結合ドメインおよび酵素活性部位を含む。アルファポリペプチドは、アルファポリペプチドＩ（アルファ－１、Ｐ４Ｈα（Ｉ）、サブユニットＡ１、もしくはＰ４ＨＡ１）もしくはそのアイソフォーム、アルファポリペプチドＩＩ（アルファ－２、Ｐ４Ｈα（ＩＩ）、サブユニットＡ２、もしくはＰ４ＨＡ２）もしくはそのアイソフォーム、またはアルファポリペプチドＩＩＩ（アルファ－３、Ｐ４Ｈα（ＩＩＩ）、サブユニットＡ３、もしくはＰ４ＨＡ３）もしくはそのアイソフォームであってもよい。

【0063】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、２つのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）および２つのベータポリペプチド（サブユニットＢ）またはそれらの機能的変異体を含むヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼを発現するように遺伝子操作されている。ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチドは、アルファポリペプチド１、アルファポリペプチド２、もしくはアルファポリペプチド３、またはそれらのアイソフォームもしくは機能的変異体であってもよい。アルファポリペプチド１（アルファ－１）は、配列番号５、７、および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。アルファポリペプチド２（アルファ－２）は、配列番号１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。アルファポリペプチド３（アルファ－３）は、配列番号１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。ベータポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アルファポリペプチド１は、配列番号６、８、および１０からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。アルファポリペプチド２は、配列番号１２および１４からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。アルファポリペプチド３は、配列番号１６および１８からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。ベータポリペプチドは、配列番号２０により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。

【0064】

プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ－１ポリペプチド（サブユニットＡ１）の機能的変異体は、配列番号５、７、および９として与えられているアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）の機能的変異体は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0065】

非限定的な例として、本産生系の宿主細胞は、各々が配列番号５、７、および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む２つのアルファ－１ポリペプチド（サブユニットＡ１）ならびに各々が配列番号１９のアミノ酸配列を含む２つのベータポリペプチド（サブユニットＢ）からなるヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼを発現するように遺伝子操作されている。

【0066】

一部の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ－１ポリペプチド（サブユニットＡ１）は、配列番号６、８、および１０からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。一部の実施形態では、アルファ－１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６、８、または１０として与えられている核酸配列のいずれかと、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）は、配列番号２０により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。一部の実施形態では、ベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０の核酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。

【0067】

Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１（ＣＯＭＳＣ）は、コラーゲンのフォールディング、安定性、および活性のための分子シャペロンとして作用する。一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１またはその機能的変異体を発現するように改変されていてもよい。Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１は、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、またはハムスターなどの哺乳動物由来のものであってもよい。非限定的な例として、宿主細胞は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むヒトＣ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１を発現するように改変されている。Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１の機能的変異体は、配列番号２１のアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0068】

一部の実施形態では、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１ポリペプチドは、配列番号２２により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。一部の実施形態では、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２の核酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。

【0069】

熱ショックタンパク質４７（別名セルピンＨ１、およびｃｏｌｌｉｇｉｎ）は、コラーゲンタンパク質のフォールディング、アセンブリ、および細胞内輸送を容易にするためにコラーゲン性ペプチドと特異的に結合する、独特なコラーゲン特異的分子シャペロンである（ナガタら（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．，１９９６，２１：２２－２６により概説されている）。一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ＨＳＰ４７またはその機能的変異体を発現するように改変されていてもよい。ＨＳＰ４７は、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、またはハムスターなどの哺乳動物由来のものであってもよい。非限定的な例として、宿主細胞は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むヒトＨＳＰ４７を発現するように改変されている。ＨＳＰ４７の機能的変異体は、配列番号２３のアミノ酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0070】

一部の実施形態では、ＨＳＰ４７ポリペプチドは、配列番号２４により表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。一部の実施形態では、ＨＳＰ４７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４の核酸配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。上述の配列は、下記の表１に要約されている。

【0071】

【表1】

【0072】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７、ならびにｒＣｏｌ７の発現を増加させることができるｈＰ４Ｈのアルファおよびベータポリペプチドを発現するように改変されており、アルファポリペプチド（Ｐ４ＨＡ）は、アルファポリペプチドＩ、アルファポリペプチドＩＩ、もしくはアルファポリペプチドＩＩＩ、またはそれらのアイソフォームであってもよい。

【0073】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７、ｈＰ４Ｈのアルファおよびベータポリペプチド、ならびにヒトＨＳＰ４７を発現するように改変されている。
一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ｒＣｏｌ７をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリペプチド、および宿主細胞においてｒＣｏｌ７の発現を増加させることができるタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリペプチドを含むように遺伝子改変されており、そうしたタンパク質としては、これらに限定されないが、プロリダーゼ、アルファポリペプチド（サブユニットＡ）およびベータポリペプチド（サブユニットＢ）を含むプロリル４－ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１、ヘッドショックタンパク質、例えば、ＨＳＰ４７、ならびにそれらの機能的変異体を挙げることができる。任意選択で、宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを含むようにさらに改変されていてもよい。

【0074】

一部の実施形態では、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする外因性ポリヌクレオチドは、コドン最適化などの少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｒＣｏｌ７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列中に最適化されたグリシンコドンを含んでいてもよい。

【0075】

１つの好ましい実施形態では、産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝的に操作されている。アルファポリペプチドは、アルファポリペプチドＩ（アルファ－１／サブユニットＡ１）もしくはそのアイソフォーム、またはアルファポリペプチドＩＩ（アルファ－２、サブユニットＡ２）もしくはそのアイソフォーム、アルファポリペプチドＩＩＩ（アルファ－３、サブユニットＡ３）もしくはそのアイソフォームであってもよい。１つの好ましい例では、アルファポリペプチドは、アルファポリペプチドＩ（アルファ－１／サブユニットＡ１）またはそのアイソフォームもしくは機能的変異体である。

【0076】

一部の実施形態では、産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードする少なくとも１つの第１の外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドをコードする（サブユニットＢ）外因性ポリヌクレオチド、ならびにＨＳＰ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝的に操作されている。

【0077】

任意選択で、宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。一部の例では、ｒＣｏｌ７をコードする第１のポリヌクレオチドおよびｒＣｏｌ７をコードする第２のポリヌクレオチドは、同じ核酸配列を有してもよい。他の例では、ｒＣｏｌ７をコードする２つのポリヌクレオチドは、異なる核酸配列を有してもよい。

【0078】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードし、配列番号２５の核酸配列を有する第１の外因性ポリヌクレオチド、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１をコードし、配列番号２８の核酸配列を有する外因性ポリヌクレオチド、およびプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドをコードし、配列番号３０の核酸配列を有する外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝的に操作されている。１つの好ましい実施形態では、ｒＣｏｌ７を発現するための第１の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２６の核酸配列を含み、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２９の核酸配列を含み、プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号３１の核酸配列を含む。

【0079】

一部の実施形態では、産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードし、配列番号２５の核酸配列を有する第２の外因性ポリヌクレオチドでさらに改変されている。ｒＣｏｌ７を発現するための第２の外因性ポリヌクレオチドは、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を発現するための第１の外因性ポリヌクレオチドと同じ核酸配列を含んでいてもよく、または異なる核酸配列を含んでいてもよい。一例では、ｒＣｏｌ７を発現するための第２の外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２７の核酸配列を含む。

【0080】

一部の実施形態では、宿主細胞は、ｒＣｏｌ７をコードする２つのポリヌクレオチドで改変されており、２つのポリヌクレオチドは、配列番号２６および配列番号２７の核酸配列を有する。

【0081】

一部の実施形態では、宿主細胞は、ヒトＨＳＰ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むようにさらに遺伝的に操作されており、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３２の核酸配列を含む。

【0082】

本開示の宿主細胞は、プロリダーゼを発現するための外因性ポリヌクレオチド、またはＣ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１を発現するための外因性ポリヌクレオチドを含むようにさらに遺伝子改変されていてもよい。

【0083】

他の実施形態では、産生系の宿主細胞は、各々がｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされていてもよい。

【0084】

一部の実施形態では、産生系の宿主細胞は、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびプロリダーゼ、プロリル４－ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃ１ＧＡＬＴ１特異的シャペロン１、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ４７）、またはそれらの機能的変異体などの、宿主細胞においてｒＣｏｌ７発現を増加させることができるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターを含むように遺伝子改変されている。

【0085】

１つの好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むように遺伝的に操作されている。任意選択で、宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターを含むようにさらに改変されている。ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする２つのポリヌクレオチドは、同じコード核酸配列を含んでいてもよい。その代わりに、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする２つのポリヌクレオチドは、異なるコード核酸配列を含んでいてもよい。第１および第２のｒＣｏｌ７発現ベクターは、異なる選択マーカー遺伝子、例えば２つの異なる抗生物質耐性マーカーを含んでいてもよい。選択抗生物質としては、これらに限定されないが、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールを挙げることができる。

【0086】

他の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにｈＰ４Ｈのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびｈＰ４Ｈのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの機能的変異体を含む発現ベクターを含むように遺伝子改変されていてもよい。

【0087】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにｈＰ４Ｈのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドおよびｈＰ４Ｈのベータポリペプチド（サブユニットＢ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにヒトＨＳＰ４７をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むように遺伝子改変されていてもよい。

【0088】

非限定的な例として、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードし、配列番号２５の核酸配列を有する第１の発現ベクター、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１（サブユニットＡ１）をコードし、配列番号２８の核酸配列を有するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）をコードし、配列番号３０の核酸配列を有するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびＨＳＰ４７をコードし、配列番号２４の核酸配列を有するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むように遺伝的に操作されていてもよい。

【0089】

宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７をコードし、配列番号２５の核酸配列を有するポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターをさらに含んでいてもよい。
１つの好ましい実施形態では、本産生系の宿主細胞は、配列番号２６のポリヌクレオチド配列を含む第１のコラーゲン７発現ベクター、配列番号２７のポリヌクレオチド配列を含む第２のコラーゲン７発現ベクター、配列番号２９のポリヌクレオチド配列を含む、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ－１ポリペプチドを発現するための発現ベクター、および配列番号３１のポリヌクレオチド配列を含む、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドを発現するための発現ベクターを含む。遺伝子操作細胞は、配列番号３２のポリヌクレオチド配列を含むＨＳＰ４７を発現するための発現ベクターをさらに含んでいてもよい。

【0090】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むように遺伝子操作されていてもよく、同じ発現ベクターは、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド（サブユニットＡ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドおよびヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の例では、同じ発現ベクターは、ヒトＨＳＰ４７をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

【0091】

一部の実施形態では、産生系は、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を発現する単一細胞クローンに由来する複数の均質な遺伝子操作宿主細胞を含んでいてもよい。他の実施形態では、産生系は、ヒトｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現する１つよりも多くの細胞クローンに由来する複数の不均質な遺伝子操作宿主細胞を含んでいてもよい。

【0092】

本産生系の宿主細胞は、目的の外因性ポリペプチドまたはタンパク質、例えばｒＣｏｌ７を発現することが可能な任意の細胞であってもよい。本開示の宿主細胞は、無脊椎動物（昆虫）細胞、または脊椎動物細胞、例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、または哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、線維芽細胞、Ｃ１２７、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、および／またはこうした哺乳動物宿主細胞に由来する任意の細胞を含む哺乳動物細胞である。宿主細胞は、初代細胞または形質転換細胞株であってもよい。一実施形態では、コラーゲン７組成物を産生するための発現系は、哺乳動物ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞に由来する細胞を含む。

【0093】

【表2】

【0094】

宿主細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により改変することができる。一実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、試薬媒介法（例えば、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、活性化デンドリマー、および磁気ビーズ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、レーザーファクション（ｌａｓｅｒ ｆａｃｔｉｏｎ）、およびウイルス媒介法を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクションするための既知方法により改変されている。形質転換宿主細胞は、数ラウンドの選択プロセスにより選択された安定細胞クローンであってもよい。

【0095】

一部の実施形態では、本開示の産生系は、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を発現するための宿主細胞培養の成長に好適な任意の容器であってもよい産生リアクターをさらに備える。

【0096】

一部の実施形態では、本開示の産生系は、バイオ医薬品として使用するための組換えコラーゲン７タンパク質を産生することができる。特に、宿主細胞は、ｒＣｏｌ７および／またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物の産生が安定している。例えば、コラーゲン７組成物は、培養１リットル当たり０．５ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり１ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり５ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり１０ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり２０ｍｇよりも多くの、または培養物１リットル当たり５０ｍｇよりも多くの量で、遺伝子操作宿主細胞から産生される。「培養」、「細胞培養」、および「哺乳動物細胞培養」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞集団の生存および／または成長に好適な条件下で培地に懸濁されている哺乳動物細胞集団を指す。

【0097】

産生リアクターは、任意のサイズであってもよい。ラージスケール細胞培養産生リアクターの容積は、典型的には、少なくとも５０リットル、もしくは少なくとも１００リットル、もしくは少なくとも２００リットル、もしくは少なくとも３００リットル、もしくは少なくとも４００リットル、もしくは少なくとも５００リットルであり、あるいは１，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００リットル、もしくはそれよりも多く容積、またはその間の任意の容積であってもよい。培養容量は、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットルであってもよく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００リットル、もしくはそれよりも多くの容積、またはその間の任意の容積であってもよい。産生リアクターの条件は、適切な細胞密度および生存率を確保するために、細胞培養期間中に制御することができる。こうした条件としては、これらに限定されないが、ｐＨ、温度、湿度、およびＣＯ２供給が挙げられる。

【0098】

一部の実施形態では、本開示の産生系は、コラーゲン７組成物を、例えば、培養１リットル当たり１ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり５ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり１０ｍｇよりも多くの、培養１リットル当たり２０ｍｇよりも多くの、または培養１リットル当たり５０ｍｇよりも多くの量で精製することができるような十分に高いレベルで産生することができる。

【0099】

コラーゲン７組成物を産生するための産生系の宿主細胞は、当業者に公知の標準的な細胞培養手順および物質を使用して培養することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、無血清培地で培養される。例えば、無血清培地は、動物由来物質を含まないＳＦＭ２培地であってもよい。一部の実施形態では、培養培地は、Ｌ－グルタミン、チミジン、およびヒポキサンチン；脂質、アミノ酸、ビタミン、および／または成長因子などの他の栄養素を含む少なくとも１つの栄養補助剤（例えば、ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により提供されるＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５栄養補助剤）をさらに含んでいてもよい。

【0100】

一部の実施形態では、本産生系の宿主細胞を培養するためのプロセスは、宿主細胞の生存率を維持するための方法を含んでいてもよい。最大細胞生存率が所望である。こうした方法は、生存細胞密度の減少を最小限に抑え、および／または高い細胞生存率を維持する役目を果たすことができる。

【0101】

一部の実施形態では、細胞培養プロセスは、組換えコラーゲン７および／またはその機能的変異体の発現が陽性である細胞を二重選択することを含む。
本開示の別の態様では、コラーゲン７組成物を産生するための方法であって、ｉ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを準備する工程；ｉｉ）プロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体のアルファポリペプチド１をコードするポリヌクレオチドおよびベータポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを準備する工程；ｉｉｉ）熱ショックタンパク質４７をコードするポリヌクレオチドを準備する工程；ｉｖ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１およびベータポリペプチドまたはそれらの機能的変異体、およびＨＳＰ４７を産生するための宿主細胞を含む細胞発現系を準備する工程；ｖ）（ｉｖ）の細胞発現系の宿主細胞において、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドを共発現することによりコラーゲン７組成物を産生する工程；ならびにｖｉ）産生されたコラーゲン７組成物を収集および精製する工程を含む方法が提供される。

【0102】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物を産生するための方法は、ｉ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を発現するためのベクターであって、ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを準備する工程；ｉｉ）プロリル４－ヒドロキシラーゼまたはその機能的変異体のアルファポリペプチド１（サブユニットＡ１）を発現するためのベクターであって、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを準備する工程；ｉｉｉ）プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチド（サブユニットＢ）またはその機能的変異体を発現するためのベクターであって、プロリル４－ヒドロキシラーゼのベータポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを準備する工程；ｉｖ）ＨＳＰ４７を発現するためのベクターであって、ＨＳＰ４７またはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを準備する工程；ｖ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファポリペプチド１およびベータポリペプチドまたはそれらの機能的変異体、ならびにＨＳＰ４７またはその機能的変異体を産生するための宿主細胞を含む細胞発現系を準備する工程；ｖｉ）（ｖ）の細胞発現系の宿主細胞において、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のベクターを共発現させることによりコラーゲン７組成物を産生する工程；ならびにｖｉｉ）産生されたコラーゲン７組成物を収集および精製する工程を含んでいてもよい。

【0103】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物を調製するための本発明の方法は、ｉ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を発現するように遺伝子改変された宿主細胞を無血清培地で培養する工程；およびｉｉ）ｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を宿主細胞培養から回収する工程をさらに含む。

【0104】

組換え的に産生されたコラーゲン７組成物は、これらに限定されないが、宿主細胞を遠心分離または濾過により培地から分離すること、ウイルスを不活化すること、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清または濾液のタンパク質性成分を沈殿させること、および宿主細胞核酸内容物を除去することを含む、当技術分野で公知の任意の方法により培養培地から回収することができる。任意選択で、コラーゲン７組成物をさらに精製してもよい。精製は、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、またはプロテインＧクロマトグラフィーなどを含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して達成することができる。

【0105】

一部の実施形態では、下流精製プロセスは、十分に効果的なウイルスクリアランスを提供するように設計することができる。一部の例では、プロセスは、ウイルス不活化または除去に特化した複数のユニット操作を含んでいてもよい。こうしたユニット操作は、一貫しており効果的であり得る。一方で、こうしたユニット操作は、製品品質にいかなる悪影響も及ぼさず、著しい収率損失も引き起こさない。下流精製では、特化したウイルスクリアランスユニット操作で添加されるものなど、プロセスに導入されるあらゆる化学物質を除去することができる。

【0106】

また、下流プロセスは、最終的な限外濾過およびダイアフィルトレーション工程が組み込まれていてもよい濃縮工程を含んでいてもよい。限外濾過（ＵＦ）は、極めて小さな粒子および溶解した分子を流体から分離するプロセスである。限外濾過は、典型的には、緩衝液交換、脱塩、または濃縮のための緩衝剤成分からタンパク質を分離し、糖、非水性溶媒、および低分子量の物質を除去するために使用される。ＵＦ／ＤＦ工程は、ポリエーテルスルホン限外濾過膜などの高性能膜限外濾過を使用して形成することができる。

【0107】

本開示の別の態様では、本産生系、宿主細胞、および方法により産生されるコラーゲン７組成物が提供される。本系を使用して調製されるコラーゲン７組成物は、正しく修飾されており、天然に存在するコラーゲン７タンパク質と機能的に区別がつかない。例えば、本産生系により調製されるコラーゲン７組成物は、皮膚の表皮と真皮との間の基底膜帯（ＢＭＺ）内の係留細線維に組み込むことができる。本産生系により調製されるコラーゲン７組成物は、ラミニン－３３２および他のコラーゲン７結合パートナーに結合することができる。コラーゲン７組成物は、野生型ヒトコラーゲン７タンパク質の機能および／または活性の２０～１００％、５０～１００％、５０～９０％、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、８５％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％を維持することができる。

【0108】

一実施形態では、コラーゲン７組成物は、本明細書の他所に記載の通りの、ｒＣｏｌ７または機能的変異体を産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞発現系を含む方法により得ることができる。

【0109】

コラーゲン７組成物は、複数の組換え的に発現されたコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチド、またはコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドの複数の機能的変異体、または複数の機能的に等価なコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチド、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。非限定的な例として、本細胞発現系により調製されるコラーゲン７組成物は、野生型コラーゲン７ポリペプチドおよび複数の機能的に等価なコラーゲン７アルファ鎖ペプチド、例えば１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Ｄ１０３３Ｙ）を含むポリペプチドを含む、複数の組換え的に発現されたコラーゲン７アルファ鎖ポリペプチドの混合物を含んでいてもよい。

【0110】

医薬組成物および製剤
本開示の一態様では、本発現系および宿主細胞により産生される、ヒトｒＣｏｌ７またはその機能的変異体を含むコラーゲン７組成物は、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。医薬製剤および組成物は、ＤＥＢに関連付けられる皮膚症状、例えば皮膚創傷などの皮膚状態の症状を予防、緩和、および／または低減するために、治療有効量の本開示のコラーゲン７組成物を対象に投与するためのものであると解釈される。医薬組成物は、意図されている投与様式および治療適用に好適な任意の許容可能な医薬製剤の形態をとることができる。

【0111】

医薬組成物は、非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁物として製剤化することができる。医薬組成物は、注射に好適なように製剤化することができる。これらに限定されないが、滅菌水性溶液または分散物、および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む注射用製剤は、滅菌されていてもよい。医薬組成物は、経口投与用に製剤化することができ、錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、および散剤などの形態であってもよい。医薬組成物は、クリームおよびヒドロゲルなど、外用投与用に製剤化することができる。

【0112】

他の製剤形態としては、これらに限定されないが、液体、半固体または固体投薬形態、ヒドロゲル、クリーム、液体溶液（例えば、注射用液体溶液）、分散物または懸濁物、粉末、およびリポソームが挙げられる。

【0113】

医薬製剤は、製造および保管の条件下で安定しており、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されることになる。微生物汚染の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどにより達成することができる。

【0114】

一部の実施形態では、医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の、組換えコラーゲン７および／またはその機能的変異体および／またはそれらの混合物を含む活性薬物成分を含む。一実施形態では、本開示の製剤に含まれるコラーゲン７組成物は、例えば、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約１７５ｍｇ／ｍＬの、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの、または約２００ｍｇ／ｍＬよりも高い、もしくは約３００ｍｇ／ｍＬよりも高い、もしくは約４００ｍｇ／ｍＬよりも高い、もしくは約５００ｍｇ／ｍＬよりも高い濃度を含む、所与の濃度を有する。

【0115】

医薬組成物は、保管時に物理的および／もしくは化学的安定性ならびに／または生物学的活性を本質的に維持するコラーゲン７組成物を含んでいてもよい。タンパク質の安定性は、当技術分野で利用可能な任意の分析技法を使用してアッセイすることができる。例えば、コラーゲン７の安定性は、分解された（例えば、断片化された）および／または凝集したタンパク質のパーセンテージが低い場合、溶液中のモノマータンパク質のパーセンテージにより決定することができる。例えば、安定コラーゲン７タンパク質を含む医薬組成物は、約６０％～９９％のモノマータンパク質、または約７０％～８０％のモノマータンパク質を含んでいてもよい。一部の例では、安定コラーゲン７タンパク質を含む医薬組成物は、少なくとも９５％のモノマータンパク質、または少なくとも９０％のモノマータンパク質、または少なくとも８５％のモノマータンパク質、または少なくとも８０％のモノマータンパク質、または少なくとも７５％のモノマータンパク質、または少なくとも７０％モノマータンパク質、または少なくとも６５％モノマータンパク質を含んでいてもよい。その代わりに、本開示の医薬組成物は、５％以下の凝集体および／または分解タンパク質を含んでいてもよい。

【0116】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物は、天然に存在するコラーゲン７およびその少なくとも１つの機能的変異体の混合物を含む。一部の実施形態では、コラーゲン７組成物は、組換えコラーゲン７および／またはその機能的変異体を発現するように遺伝的に操作された宿主細胞を含む本産生系を使用して産生および精製される。

【0117】

一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、界面活性剤、緩衝系、コラーゲン７組成物を安定させる安定化剤、張度調整剤、抗酸化剤、凍結保護剤、充填剤、リロプロテクタント（ｌｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、および塩基性成分または酸性成分を含む。

【0118】

本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の稠性を提供するために、安定性および溶解性を向上させるために、ならびに／または浸透圧を調整するために、ならびに／または医薬組成物の使用目的に適合する他の特徴を調整するために医薬製剤に添加することができる作用剤を指す。一般的に使用される賦形剤の例としては、これらに限定されないが、糖、ポリオール、アミノ酸、界面活性剤、およびポリマーが挙げられる。一部の例では、賦形剤は、イオン性賦形剤であってもよくまたは非イオン性賦形剤であってもよい。イオン性賦形剤は、ｐＨなどのある特定の製剤条件下で正味電荷を有する。イオン性賦形剤の例としては、これらに限定されないが、ヒスチジン、アルギニン、および塩化ナトリウムが挙げられる。非イオン性賦形剤は、ｐＨなどのある特定の製剤条件下では正味電荷を有しない。非イオン性賦形剤の例としては、これらに限定されないが、糖（例えば、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）が挙げられる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「安定化剤」という用語は、安定性を向上させるか、またはそうでなければ増強させる賦形剤を指す。安定化剤としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：α－リポ酸、α－トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ビオチン、亜硫酸水素塩、ホウ素、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸およびそのエステル、カロテノイド、クエン酸カルシウム、アセチル－Ｌ－カミチン、キレート剤、コンドロイチン、クロム、クエン酸、コエンザイムＱ－１０、システイン、システイン塩酸塩、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸；エデト酸二ナトリウム）、硫酸第一鉄、葉酸、フマル酸、没食子酸アルキル、ガーリック、グルコサミン、ブドウ種子抽出物、グッグル（ｇｕｇｕｌ）、マグネシウム、リンゴ酸、メタ重亜硫酸塩、Ｎ－アセチルシステイン、ナイアシン、ニコチノミド、イラクサ根、オルニチン、没食子酸プロピル、ピクノジェノール、ノコギリヤシ、セレン、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、酒石酸、チオ硫酸塩、チオグリセロール、チオソルビトール、トコフェロールおよびそれらのエステル、例えば、酢酸トコフェロール、コハク酸トコフェロール、トコトリエナール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎａｌ）、ｄ－α－酢酸トコフェロール、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥ、およびそれらのエステル、例えば、酢酸ビタミンＥ、亜鉛、ならびにそれらの組合せ。

【0120】

本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、コラーゲン７タンパク質を、任意の界面誘導性ストレスから保護することができる作用剤を指すことができる。界面活性剤の例としては、これらに限定されないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、またはポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７などのポロキサマーを挙げることができる。コラーゲン７組成物を保護することができる他の化合物としては、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース、およびラクトースなどの糖；デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、およびポリエチレングリコールなどのポリマー；ならびにグリシン、アルギニン（例えば、Ｌ－アルギニン）、ロイシン、およびセリンなどのアミノ酸を挙げることができる。

【0121】

一部の実施形態では、医薬組成物は、緩衝液系、酸性成分、または塩基性成分をさらに含んでいてもよい。緩衝液は、これらに限定されないが、リン酸緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、酢酸緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液であってもよい。酸性成分の例としては、リン酸、塩酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、グリコール酸、およびフマル酸が挙げられる。塩基性成分の例としては、水酸化カリウム（ＫＯＨ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が挙げられる。酸性成分および塩基性成分は、製剤のｐＨを調整するために使用される。

【0122】

本明細書で使用される場合、「抗酸化剤」という用語は、酸化を阻害し、したがって酸化プロセスによる調製物の劣化を防止するために使用される作用剤を指す。抗酸化剤の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：アセトン、硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ヒドロ亜リン酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ａｃｉｄ）、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、メチオニン、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシレートナトリウム、チオグリコール酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ（エデテート）、ペンテテート、および当業者に公知の他のもの。

【0123】

また、本明細書に記載のコラーゲン７製剤には、製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさない限り、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ジェンナロ編（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．）、リッピンコットウイリアムス＆ウィルキンス社（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）（２０００）に記載されているものなどの、他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれていてもよい。

【0124】

一部の実施形態では、医薬組成物は、皮膚治療のための１つまたは複数の活性作用剤をさらに含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、免疫原性が減少されている。

【0125】

本開示の一態様では、コラーゲン７組成物を含む医薬組成物は、液体溶液として、例えば、水性液体溶液として製剤化することができる。「水性」という用語は、本明細書で使用される場合、水ベースのタンパク質製剤を指すが、任意選択で、追加の溶媒、例えば、少量の水混和性溶媒を含んでいてもよい。非限定的な例として、医薬組成物は安定液体溶液である。

【0126】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物を含む医薬製剤は、注射用である。本方法における注射用コラーゲン７組成物は、必要に応じて、希釈剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、硫黄含有還元剤、抗酸化剤、または保存剤などをさらに含んでいてもよい。本注射用組成物に使用される緩衝剤は、リン酸、酢酸、塩酸、フタル酸、ホウ酸、クエン酸、炭酸、コハク酸、およびそれらの塩、好ましくはリン酸緩衝剤（リン酸一水素ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム系）および／またはクエン酸緩衝剤および／または酢酸緩衝剤などの、注射液の緩衝剤として一般的に使用される酸およびそれらの塩または塩基もしくはその塩との混合溶液を含んでいてもよい。注射用コラーゲン７組成物に使用される緩衝剤の濃度は、注射用組成物の総量に基づき、０～３００ｍＭ、または０～１００ｍＭ、または１０～２００ｍＭ、または３０～２５０ｍＭ、好ましくは０～１００ｍＭであってもよい。本製剤および注射用組成物のｐＨは、６．５～７．４、好ましくは６．８～７．２であってもよい。

【0127】

一部の実施形態では、本開示の製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏなど、任意の使用に好適である。製剤は、これらに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、吸入投与、皮内投与、経皮投与、腹腔内投与、および筋肉内投与を含む、任意の投与様式による対象への投与に適切であってもよい。本開示の製剤は、対象の皮膚疾患（例えば、ＲＤＥＢ）を治療するために使用することができる。

【0128】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物を含む医薬製剤は、単一用量製剤または複数用量製剤に特に良好に好適である。複数用量製剤は、治療用コラーゲン７組成物の１つよりも多くの用量を有する製剤である。医療提供者および／または患者は、複数用量製剤の単一用量を投与し、製剤の残りを１つまたは複数のその後の用量の将来の投与のために保管することができる。本明細書に開示の複数用量製剤の用量の数は、約２～約５０回分、好ましくは約２～約４０回分、より好ましくは約２～約２５回分であってもよい。また、少なくとも５回分、少なくとも１０回分、および少なくとも２０回分の用量が企図される。特定の用量としては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０回分の用量の製剤が挙げられる。

【0129】

投与および投薬
本開示によると、本産生系により産生されるコラーゲン７組成物を含む医薬組成物および製剤は、これらに限定されないが、以下のものを含む、当技術分野で公知の任意の適切な経路により、それを必要とする対象に投与することができる：経口、非経口（動脈内、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内）注射または注入、気道（エアロゾル）、鼻、直腸、気管内、例えば、噴霧吸入器によることを含む、粉末またはエアゾルの吸入または吹送による肺、例えば、埋め込みデバイスを介した皮下、頭蓋内（例えば、実質内）、表皮、外用（皮膚、経皮、経粘膜、頬側、舌下、および眼内を含む）、膣、経粘膜、気管支、および眼投与。本開示の医薬組成物および／または製剤は、局所的または全身性治療が所望であるか、および／または治療しようとする皮膚区域に応じて、１つよりも多くの経路により投与することができる。必要に応じて、１つよりも多くの経路を同時的に使用してもよい。

【0130】

一部の実施形態では、投与経路は、皮膚または眼の局所区域など、局所的であってもよい。他の実施形態では、投与経路は、全身性、例えば、注射または注入であってもよい。
本開示による医薬組成物は、典型的には、投与が容易であり、投薬量が均一になるため、単位剤形に製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定され得ることが理解されるだろう。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の健康全般および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、ある特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼす場合があることを理解するだろう。さらに、治療有効量の組成物による対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含んでいてもよい。本開示に包含される個々の医薬組成物の有効投薬量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の推定は、従来の方法論を使用して、または適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいてなすことができる。例えば、一部の実施形態では、適切な用量または量は、疾患重症度指数スコアを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％、またはそれよりも大きく低減するのに十分な用量または量である。

【0131】

本明細書に記載の製剤および投薬量は、疾患および障害の治療における臨床有効性を最大化すると同時に、有害副作用を減少または最小化するように設計されている。
一部の実施形態では、本組成物は、治療有効量で、および／または特定の所望の転帰（例えば、表皮水疱症の予防および／または治療）と相関する投薬レジメンに従って投与される。例えば、一部の実施形態では、コラーゲン７組成物の治療有効投薬量は、対象の体重１キログラム当たり、０．１ｍｇ～１，０００ｍｇ（例えば、約１ｍｇ～１，０００ｍｇ、１０ｍｇ～１，０００ｍｇ、２０ｍｇ～１，０００ｍｇ、３０ｍｇ～１，０００ｍｇ、４０ｍｇ～１，０００ｍｇ、５０ｍｇ～１，０００ｍｇ、６０ｍｇ～１，０００ｍｇ、７０ｍｇ～１，０００ｍｇ、８０ｍｇ～１，０００ｍｇ、９０ｍｇ～１，０００ｍｇ、１００ｍｇ～１，０００ｍｇ、２００ｍｇ～１，０００ｍｇ、１０ｍｇ～９００ｍｇ、１０ｍｇ～８００ｍｇ、１０ｍｇ～７００ｍｇ、１０ｍｇ～６００ｍｇ、１０ｍｇ～５００ｍｇ、１００ｍｇ～１，０００ｍｇ、１００ｍｇ～９００ｍｇ、１００ｍｇ～８００ｍｇ、１００ｍｇ～７００ｍｇ、１００ｍｇ～６００ｍｇ、１００ｍｇ～５００ｍｇ、１００ｍｇ～４００ｍｇ、１００ｍｇ～３００ｍｇ、２００ｍｇ～９００ｍｇ）の範囲の量であってもよい。他の実施形態では、治療有効投薬量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～９０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～８０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～７０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～６０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。

【0132】

総投薬量は、単一用量で、複数用量で、反復用量で、連続用量として、またはそれらの組合せで投与することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１日１回の用量で投与してもよく、または総１日投薬量は、１日２、３、または４回の分割用量で投与してもよい。

【0133】

任意の特定の表現型または症状に対する単一用量の効果は、長期持続性であってもよく、その後の用量は、３、４、もしくは５日以内の間隔で、または１、２、３、もしくは４週間以内の間隔で、または１、２、３、もしくは４か月以内の間隔で投与される。

【0134】

一部の実施形態では、本産生系により産生されるコラーゲン７組成物を含む医薬組成物および製剤は、それを必要とする患者に、患者の残りの生涯にわたって投与してもよい。投与のタイミング間隔および各投与の投薬量は、患者の状態（例えば、皮膚状態）に応じて調整することができる。一例では、医薬組成物および製剤は、長期的に投与してもよい。慢性投与は、ある期間にわたって、例えば対象の生涯期間にわたって、１用量よりも多くの用量の作用剤を投与することを含んでいてもよい。コラーゲン７組成物の濃度は、治療の経過を通して療法的にまたは予防的に有効なレベルに維持することができる。

【0135】

一部の実施形態では、慢性投与の期間としては、これらに限定されないが、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも１０年間、少なくとも１５年間、少なくとも２０年間、少なくとも２５年間、少なくとも３０年間、少なくとも３５年間、少なくとも４０年間、少なくとも４５年間、少なくとも５０年間、少なくとも５５年間、少なくとも６０年間、少なくとも６５年間、少なくとも７０年間、少なくとも７５年間、少なくとも８０年間、少なくとも８５年間、少なくとも９０年間、もしくは少なくとも１００年間、または１か月間と１００年間との間の任意の期間を挙げることができる。

【0136】

例えば、投薬タイミングとしては、１日１回、または週１回、または隔週１回、または月１回、または隔月１回、または３か月毎に１回、または６か月毎に１回、または１２か月毎に１回、または１８か月毎に１回、２４か月毎に１回、２年毎に１回、または５年毎に１回を挙げることができる。医薬組成物は、週２回、月２回、または隔月２回、または３か月毎に２回、または６か月毎に２回、または１２か月毎に２回、または１８か月毎に２回、または２４か月毎に２回投与してもよい。

【0137】

非限定的な例として、慢性投与は、ＥＢ、特にＤＥＢ（例えば、ＤＤＥＢおよびＲＲＥＢ）に関連付けられる少なくとも１つの症状を緩和するための有効量を一緒に提供する一連の用量を含んでいてもよい。慢性投与は、ＥＢ、特に、ＤＤＥＢまたはＲＤＥＢなどのＤＥＢを治療、予防、その進行を予防、またはその発症を遅延させるための有効量を、組合せで提供する一連の用量を含んでいてもよい。投薬タイミングは、ＤＥＢ、ＤＤＥＢ、またはＲＤＥＢなどのＥＢのタイプ、ＥＢ関連症状の存在、患者の年齢、体重、健康全般、性別、および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定の組成物の排泄速度；治療継続期間；コラーゲン７組成物と組み合わせてまたは同時的に使用される薬物；ならびに当技術分野で周知の類似要因などの、幾つかの要因に応じて、対象に合わせて調整することができる。

【0138】

ｒＣｏｌ７組成物の適用
本開示によると、本発明の産生系により産生されるコラーゲン７組成物およびその医薬組成物または製剤は、対象の、特に対象の皮膚のコラーゲン７物質を補充するために使用することができる。コラーゲン７は、その後、皮膚のＢＭＺに局在化し、係留細線維を形成することができる。

【0139】

コラーゲン７レベルの回復
本開示の一態様では、本開示の宿主細胞および産生系により産生されるコラーゲン７組成物、ならびにそれらの医薬組成物および製剤を使用して、コラーゲン７機能を、対象の野生型コラーゲン７の正常機能レベルの２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、８０％～１００％、９０％～１００％、３０％～９０％、４０％～９０％、５０～９０％、６０～９０％、または７０％～９０％の範囲内に回復させることにより、それを必要とする対象のコラーゲン７を機能レベルまで回復させることができる。

【0140】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物は、皮膚の表皮層および真皮層を一緒に保持する、皮膚の係留細線維を回復させることができる。
療法使用
本開示の一態様では、コラーゲン７組成物を含む医薬組成物および製剤は、皮膚状態、例えば、表皮水疱症（ＥＢ）に関連付けられる皮膚症状の治療に使用することができる。皮膚障害を有する対象を治療するための方法は、皮膚障害を有する対象に、コラーゲン７組成物を含む医薬製剤を投与する工程を含み、組成物は、対象に全身性投与される（例えば、注射または注入）。コラーゲン７組成物は、障害の皮膚症状、例えば、皮膚創傷、水疱形成、および瘢痕などを予防、阻害、緩和、またはその進行を阻害することができる。

【0141】

皮膚障害は、遺伝子突然変異により引き起こされる表皮水疱症（ＥＢ）などの遺伝性障害であってもよい。表皮水疱症は、皮膚の表皮層と真皮層とを一緒に保持する係留タンパク質が欠如しているため、皮膚が非常に脆弱であり、水疱が容易に生じ得る遺伝性の遺伝子状態の群である。水疱および皮膚びらんは、こすったり、引っ掻いたり、またはささいな外傷など、軽傷または摩擦に応答して自然に形成される。さらに、慢性的皮膚損傷の合併症として、ＥＢを罹患する患者は、皮膚の悪性腫瘍（がん）のリスクが高くなる。ＥＢ疾患では、係留タンパク質に３００個を上回る突然変異が識別されている。ＥＢ疾患としては、これらに限定されないが、単純表皮水疱症、接合部型表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症（致死性棘融解症）、および後天性表皮水疱症を挙げることができる。ＶＩＩ型コラーゲン（コラーゲン７）をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異により引き起こされる栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）（優性または劣性ＤＥＢ）は、表皮水疱症の最も一般的な形態の１つである。この状態の症状は、罹患個体間で大きく異なる。軽度の場合、水疱形成は、主に手、足、膝、およびひじに影響を及ぼす可能性がある。この状態の重度症例は、視力喪失、美観損失、および他の重度の医学的問題に結び付く可能性のある広範囲の水疱形成および瘢痕を伴う。

【0142】

一部の実施形態では、コラーゲン７組成物を含む医薬組成物および製剤は、優性ＤＥＢ（ＤＤＥＢ）および劣性ＤＥＢ（ＲＤＥＢ）を含む、ＤＥＢに関連付けられる１つまたは複数の症状を予防、その進行を予防、またはその発症を遅延させるために使用することができる。ＥＢに関連付けられる症状としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：薄く乾燥した皮膚、開放創傷（例えば、慢性および非治癒性創傷）、水疱形成（軽度または重度）、瘢痕、慢性創傷（二次皮膚感染症）または皮膚がん（例えば、扁平上皮癌）により引き起こされる感染症などの皮膚状態；食道の慢性瘢痕、水かき形成、および閉塞などの食道狭窄；屈曲拘縮（例えば、四肢の）などの拘縮；手または足の偽性合指症；尿道病変（例えば、尿道狭窄）；粘膜病変；扁平上皮組織の病変；直腸病変または肛門病変などの胃腸管病変；手外傷後の水ぶくれ形成などの水ぶくれ形成；爪または歯の奇形；眼瞼炎および角膜瘢痕などの眼障害；貧血、栄養失調；敗血症；嗄声；包茎；吸収不良；アレルギーおよび免疫不全症（例えば、喘息、アレルギー、湿疹、または鼻炎症状の頻度増加）；ならびに発育障害。

【0143】

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物による治療は、未治療の患者と比較して、２０％～１００％、または３０％～１００％、または３５％～１００％、または４０％～１００％、または４５％～１００％、または４５％～１００％、または５０％～１００％、または５５％～１００％、または６０％～１００％、または６５％～１００％、または７０％～１００％、または７５％～１００％、または８０％～１００％、または８５％～１００％、または９０％～１００％の範囲の、ＤＥＢに関連付けられる１つまたは複数の症状の緩和をもたらすことができる。

【0144】

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物および製剤は、これらに限定されないが、非治癒性創傷、皮膚がんに起因する皮膚創傷、ＩＩ型糖尿病などの糖尿病に由来する皮膚創傷、高齢個体の慢性皮膚創傷、開放創傷、アレルギー反応に由来する皮膚創傷、外科的創傷、傷害により引き起こされる創傷、対象の可動性が制限されることによる創傷、臓器移植ならびに日光、風、熱、および寒さへの曝露などの他の損傷に関連付けられる創傷を含む、他の皮膚疾患を治療するために使用することができる。

【0145】

皮膚がんとしては、これらに限定されないが、光線角化症、非定型ほくろ、基底細胞癌、黒色腫（例えば、表在性拡大黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫）、メルケル細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、皮膚リンパ腫、および非定型線維黄色腫を挙げることができる。

【0146】

高齢個体の創傷は、慢性的および非治癒性であってもよい。加齢関連障害としては、皮膚がんおよび糖尿病などを挙げることができる。
アレルギー反応は、軽度から重度までの範囲の著しい皮膚反応を引き起こす場合がある。長期アレルギー反応による一般的な症状としては、湿疹を挙げることができる。

【0147】

併用療法
一部の実施形態では、本開示は、併用療法の一部として、１つまたは複数の追加の作用剤と一緒に、コラーゲン７組成物を含む医薬組成物を投与することを包含する。本開示のコラーゲン７組成物は、１つまたは複数の追加の療法の前に、同時的に、または後に投与することができる。一実施形態では、表皮水疱症の治療またはＥＢに関連付けられる臨床状態の緩和のための任意の公知の療法または療法薬を、本コラーゲン７組成物と共に使用することができることが企図される。

【0148】

例示的な追加の作用剤および療法としては、これらに限定されないが、抗生物質、鎮痛剤、オピオイド、抗ウイルス剤、抗炎症剤、経口ステロイド、栄養補助剤、または疼痛およびかゆみの管理に役立つ外用クリームを挙げることができる。

【0149】

抗生物質としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：アクニロックス（Ａｋｎｉｌｏｘ）、アムビゾーム、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン、アベロックス、アジスロマイシン、バクトロバン、ベータダイン、ベトノベート、ブレフアミド（Ｂｌｅｐｈａｍｉｄ）、カンサイダス、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフェピム、セフィックス（Ｃｅｆｉｘ）、セフィキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフロキシム、セフジル（Ｃｅｆｚｉｌ）、セファレキシン、セファゾリン、セプタズ、クロラムフェニコール、クロルヘキシジン、クロロマイセチン、クロルシグ（Ｃｈｌｏｒｓｉｇ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダゲル（Ｃｌｉｎｄａｇｅｌ）、クリンダマイシン、クリンダテック（Ｃｌｉｎｄａｔｅｃｈ）、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ジクロシル（Ｄｉｃｌｏｃｉｌ）、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、デュリセフ（Ｄｕｒｉｃｅｆ）、エリスロマイシン、フラジールアルコール、フラジールドーセージ（Ｆｌａｇｙｌ ｄｏｓａｇｅ）、フラジールプレグナンシー（Ｆｌａｇｙｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、フラジールサイドエフェクト（Ｆｌａｇｙｌ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ）、フラジールトリートメント（Ｆｌａｇｙｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、フラマジン、フロキシン、フラマイセチン、フシジン、フラダンチン、フシジック（Ｆｕｓｉｄｉｃ）、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲミフロキサシン、アイロゾン（Ｉｌｏｓｏｎｅ）、ヨウ素、レバキン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、レボフロキサシン、ロセリル（ｌｏｃｅｒｙｌ）、ロメフロキサシン、マキサキン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、メホキシン（Ｍｅｆｏｘｉｎ）、メロネム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ミアムブトール（Ｍｙａｍｂｕｔｏｌ）、マイコスタチン、ネオスポリン、ネトロマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、ノリレット（Ｎｏｒｉｌｅｔ）、オフロキサシン、オムニセフ（Ｏｍｎｉｃｅｆ）、オスパモックス（Ｏｓｐａｍｏｘ）、オキシテトラサイクリン、パラキシン（Ｐａｒａｘｉｎ）、ペニシリン、ニューモバックス、ポリファックス（Ｐｏｌｙｆａｘ）、ポビドン、リファジン、リファンピン、リファキシミン、リフィナー（Ｒｉｆｉｎａｈ）、リマクタン、ロセフィン、ロキシスロマイシン、セロマイシン、ソフラマイシン（Ｓｏｆｒａｍｙｃｉｎ）、スパルフロキサシン、スタフレックス（Ｓｔａｐｈｌｅｘ）、タゴシッド、テトラサイクリン、テトラドックス（Ｔｅｔｒａｄｏｘ）、テトラリサル（Ｔｅｔｒａｌｙｓａｌ）、トブラマイシン、トブラマイシン、トレカトール（Ｔｒｅｃａｔｏｒ）、タイガシル、バンコシン、ベロセフ（Ｖｅｌｏｓｅｆ）、ビブラマイシン、キシファキサン（Ｘｉｆａｘａｎ）、ザガム（Ｚａｇａｍ）、ジトロテック（Ｚｉｔｒｏｔｅｋ）、ゾデルム（Ｚｏｄｅｒｍ）、ジマー（Ｚｙｍａｒ）、およびザイボックス。

【0150】

抗ウイルス剤としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：アバカビル、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ（Ａｔｒｉｐｌａ）、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（Ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル（Ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ－２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害薬、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（Ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、スタブジン、ティーツリー油、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジン。

【0151】

抗炎症剤としては、これらに限定されないが、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、ケトプロフェン、ピロキシカム、メロキシカム、スリンダク、およびステロイドを挙げることができる。

【0152】

栄養補助剤としては、これらに限定されないが、鉄、カルシウム、ビタミンＤ、セレン、カルニチン、および亜鉛を挙げることができる。
他の併用療法としては、これらに限定されないが、異常な動きを矯正するための手術、例えば、指またはつま先の癒着または関節の異常な屈曲を矯正するための手術、摂食能力を向上させるための食道の外科的拡張、皮膚移植、遺伝子療法、細胞ベースの療法（例えば、コラーゲン７または機能的変異体を発現するように遺伝子操作された線維芽細胞の移植）、骨髄移植、他のタンパク質補充療法、および／またはそれらの組合せを挙げることができる。

【0153】

均等物および範囲
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載の開示による特定の実施形態に対する多数の均等物を認識することになるかまたは確認することができるだろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることが意図されておらず、むしろ添付の請求項に記述されている通りである。

【0154】

請求項では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、矛盾することが示されてない限り、または状況から別様であることが明らかでない限り、１つまたは１つよりも多くを意味する場合がある。群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、矛盾することが示されてない限り、または状況から別様であることが明らかでない限り、群メンバーの１つ、１つよりも多く、またはすべてが、所与の産物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関係する場合、満たされるとみなされる。本開示は、群のまさに１つのメンバーが、所与の産物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関係する実施形態を含む。本開示は、１つよりも多くの群メンバーまたは群メンバー全部が、所与の産物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはそれでなければ関係する実施形態を含む。

【0155】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非制限的であり、追加の要素または工程を含むことを許容するが必要とはしないことにも留意されたい。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含および開示されている。

【0156】

範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、別様に示されていない限り、または文脈および当業者の理解から別様であることが明らかでない限り、範囲として表現されている値は、状況が明らかに別様の指定をしない限り、本開示の異なる実施形態において表明されている範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができる。

【0157】

加えて、先行技術の範囲内に入る、本開示の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つまたは複数から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に公知であるとみなされるため、除外されることが本明細書に明示的に記述されていない場合であっても、それらは除外することができる。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療用成分または活性成分、任意の産生方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関係するか否かに関わらず、任意の理由で任意の１つまたは複数の請求項から除外することができる。

【0158】

使用されている文言は、限定ではなくむしろ説明のための文言であり、その幅広い態様における本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の請求項の範囲内で変更をなすことができることが理解されるべきである。

【0159】

本開示は、幾つかの記載されている実施形態に関してある程度の長さである程度詳細に説明されているが、任意のそのような詳細または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきではないことが意図されており、先行技術に照らしてそのような請求項の最も幅広い考え得る解釈を提供するように、したがって本開示の意図されている範囲を効果的に包含するように、添付の請求項を参照して解釈してされるべきである。

【実施例】

【0160】

実施例１：ポリペプチド発現構築物
コラーゲン７アルファ鎖ポリペプチド、および細胞においてコラーゲン７の発現を増加させる他のポリペプチドを発現するために使用されるプラスミド構築物を、標準的分子技法に従って構築した。こうした発現構築物を生成するための詳細な方法を下記で説明する。

【0161】

コラーゲン７発現構築物
ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ－）（ｐＳＶｐｕｒｏ－Ｃ＋＿ＥＦ１ａｌｐｈａ（ＫＯＺＡＫ－ｅｘｔ９）ＥＧＦＰ＿ＢＧＨｐＡ＞ＸＳ^＊２９）またはハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏ－）（ｐＳＶｈｙｇｒｏ－Ｃ＋＿ＥＦ１ａｌｐｈａ（ＫＯＺＡＫ－ｅｘｔ９）ＥＧＦＰ＿ＢＧＨｐＡ＞Ｘ＿２９）のいずれかを有するＧＦＰ発現プラスミドを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌで消化した。次いで、得られた２つのＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、各構築物に由来するベクター断片をゲルから切り出し、１．５ｍＬマイクロチューブに移し、標準的技法を使用して精製した。９１１４ｂｐのＰｕｒｏ－ベクターバンドおよび９５５２ｂｐのＨｙｇｒｏ－ベクターバンドを、それぞれｐｕｒｏ－構築物およびｈｙｇｒｏ－構築物から回収した。

【0162】

ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌでプラスミドを切断することにより、コラーゲン７アルファ鎖（コラーゲン７Ａ）をコードするポリヌクレオチドを、ＧｅｎｅＡｒｔプラスミド１１ＡＡＥＲ３Ｐ＿Ｃｏｌｌａｇｅｎ７Ａ＿ｐＭＡから切除した。得られた２つのＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、コラーゲン７アルファ鎖（配列番号２５）に対応する８８７０ｂｐのバンドを回収し、標準的技法を使用して精製した。

【0163】

精製した８８７０ｂｐのコラーゲン７Ａ断片を、９１１４ｂｐのベクター断片にアセンブリして、Ｐｕｒｏ＿ＢＴ＋＿ＳＬＸ－３６３１＿Ｃｏｌｌａｇｅｎ７Ａ（配列番号２６）を作出するか、または９５５２ｂｐのベクター断片にアセンブリして、Ｈｙｇｒｏ＿ＢＴ＋＿ＳＬＸ－３６３１＿Ｃｏｌｌａｇｅｎ７Ａ（配列番号２７）を作出した。構築物は、製造業者の説明書に従い室温にて５分間にわたって１０μＬの最終容量のＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡライゲーションシステム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、カタログ番号：Ｍ８２２１）を使用して、精製したベクター断片（９１１４ｂｐのＰｕｒｏベクター断片または９５５２ｂｐのＨｙｇｒｏベクター断片）を、８８７０ｂｐのコラーゲン７Ａ断片とライゲーションすることにより調製した。次いで、ライゲーション混合物を使用し、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１８２６５－０１７）を製造業者の説明書に従って形質転換した。

【0164】

コラーゲン７Ａ発現プラスミドの完全性および構造を制限分析で確認した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを有する１５０ｍＬのＬＢ培地で１つの細菌クローンを拡大増殖させ、タンパク質を抽出した。ＰｖｕＩ－ＨＦ（ＮＥＢ社、カタログ番号Ｒ３１５０Ｌ）を使用してコラーゲン７Ａ構築物を３７℃で一晩線状化し、制限酵素で消化した。消化したＤＮＡを、電気泳動で定量化および分離した。構築物Ｐｕｒｏ＿ＢＴ＋＿ＳＬＸ－３６３１＿Ｃｏｌｌａｇｅｎ７Ａ（配列番号２６）の場合、３つのバンド（１５４２６ｂｐ、１５１２ｂｐ、および１０４６ｂｐ）が予想通りに存在し、構築物Ｈｙｇｒｏ＿ＢＴ＋＿ＳＬＸ－３６３１＿Ｃｏｌｌａｇｅｎ７Ａ（配列番号２７）の場合、３つのバンド（１５８６４ｂｐ、１５１２ｂｐ、および１０４６ｂｐ）が予想通りに存在した。

【0165】

プロリル４－ヒドロキシラーゼ発現構築物
ｈＰ４ＨＡ１構築物を作出するため、ＧＦＰ発現プラスミドｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＧＦＰ配列を切除した。消化したＤＮＡを上記のように精製した。ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、精製したＤＮＡを充填し、標準的な技法を使用して精製し、次いでＦｓｅｌで消化した。

【0166】

ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｆｓｅｌ二重消化に由来する２つのＤＮＡバンドを、電気泳動で分離した。ベクターに対応する８５８４ｂｐのバンドを回収し、標準的な技法を使用して精製した。

【0167】

フォワードプライマーｈＰ４ＨＡ１＿Ｆｗ＿ＨｉｎｄＩＩＩｆｉｌｌｅｄ（ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＡＴＡＴＡ ＴＴＡＡＴＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴ；配列番号３３）、リバースプライマーｈＰ４ＨＡ１＿Ｒｖ＿Ｆｓｅｌ（ＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡ；配列番号３４）、および鋳型としてのヒト正常組織のｃＤＮＡ（バイオチェインインスティチュート社（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、番号Ｂ１１０１７９）を使用して、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ、アルファポリペプチドＩ（ｈＰ４ＨＡｌ＿ＮＭ＿０００９１７）をＰＣＲで増幅した。ヒトＰ４ＨＡ１に対応する１６３８ｂｐバンドを回収し、標準的な技法を使用して精製した。精製した１６３８ｂｐのＰＣＲ産物をＦｓｅｌで消化し、さらに精製した。

【0168】

１６３２ｂｐのｈＰ４ＨＡ１断片（配列番号２８）を、８５８４ｂｐのベクター断片にアセンブリして、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ｈＰ４ＨＡｌ＿Ｘ２９＿ＩＴＲ（配列番号２９）を作出した。精製したｈＰ４ＨＡ１およびベクター断片をライゲートした。ライゲーション混合物を全部使用して、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞を製造業者の説明書に従って形質転換した。新しく作出されたプラスミドの完全性および構造を、上記に記載の通り制限分析で点検した。

【0169】

ｈＰ４ＨＡ１構築物ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ｈＰ４ＨＡｌ＿Ｘ２９＿ＩＴＲの試料をＰｖｕＩ－ＨＦで線状化し、ＸｂｏｌおよびＸｂａｌで消化することよりさらに検証した。消化したＤＮＡを、電気泳動で定量化および分離した。予想通り、２つの断片（８７８０ｂｐおよび１４４０ｂｐ）が存在した。

【0170】

ｈＰ４ＨＢ構築物を作出するため、ＧＦＰ発現プラスミドｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌで消化した。ベクターに対応する８６０３ｂｐの断片を回収し、上記の通りに精製した。

【0171】

フォワードプライマーｈＰ４ＨＢ＿Ｆｗ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴＣＣＣＭＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＴ；配列番号３５）、リバースプライマーｈＰ４ＨＢ＿Ｒｖ＿Ｘｂａｌ（ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡ；配列番号３６）、および鋳型としてのヒト正常組織のｃＤＮＡを使用して、ヒトプロリル４－ヒドロキシラーゼ、ベータポリペプチド（ｈＰ４ＨＢ＿ＮＭ＿０００９１８）をＰＣＲで増幅した。１５５９ｂｐのＰＣＲ断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌで消化した。

【0172】

得られた１５４５ｂｐのｈＰ４ＨＢ断片（配列番号３０）を８６０３ｂｐのベクター断片にアセンブリして、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ｈＰ４ＨＢ＿Ｘ２９＿ＩＴＲ（配列番号３１）を作出した。精製したｈＰ４ＨＢおよびベクター断片をライゲートし、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞を形質転換するために使用した。新しく作出されたプラスミドの完全性および構造を、上記に記載の通り制限分析で点検した。

【0173】

ｈＰ４ＨＢ構築物ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＣＧＡＰＤ＿ｈＰ４ＨＢ＿Ｘ２９＿ＩＴＲの試料をＰｖｕＩ－ＨＦで線状化し、ＸｂａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦで消化することにより検証した。消化したＤＮＡを、電気泳動で定量化および分離した。予想通り、２つの断片（８６０３ｂｐおよび１５４５ｂｐ）が存在した。

【0174】

ＨＳＰ４７、ｈＰＥＰＤ、およびＣＯＭＳＣ発現構築物
同様の方法を使用して、ＨＳＰ４７を発現する構築物を生成した。ＧＦＰ発現プラスミドｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲを消化した。ベクターに対応する断片を、標準的な技法を使用して回収および精製した。ヒトＨＳＰ４７をコードする核酸配列（配列番号３２）をベクター断片に挿入して、ＨＳＰ４７発現構築物（ｐＢＳＫ ＩＴＲ ＢＴ＋ＳＨＳＰ４７ Ｘ２９ ＩＴ）を生成した。プラスミドの完全性および構造を、以前に記載の通り制限分析により点検し、最後にプラスミドを定量化した。

【0175】

フォワードプライマーｈＰＥＰＤ＿Ｆｗ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡ；配列番号３７）、リバースプライマーｈＰＥＰＤ＿Ｒｖ＿Ｘｂａｌ（ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＴ；配列番号３８）、および鋳型としてのヒト正常組織のｃＤＮＡを使用して、ヒトプロリダーゼコード配列ｈＰＥＰＤ（ＮＭ＿０００２８５）をＰＣＲで増幅した。１５１４ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌで消化した。回収した１５００ｂｐのｈＰＥＰＤ断片を、８９３０ｂｐのベクター断片にアセンブリして、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ｈＰＥＰＤ＿Ｘ２９＿ＩＴＲを作出した。精製したｈＰＥＰＤおよびベクター断片を一緒にライゲートし、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞を形質転換するために使用した。新しく作出されたプラスミドの完全性および構造を、以前に記載の通り制限分析により点検し、最後にプラスミドを定量化した。

【0176】

ヒトＣＩＧＡＬＴ１特異的シャペロン１コード配列（ＮＭ＿００１０１１５５１）を、フォワードプライマーＣＯＳＭＣ＿Ｆｗ＿ＨｉｎｄＩＩＩｆｉｌｌｅｄ（ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴ；配列番号３９）、リバースプライマーＣＯＳＭＣ＿Ｒｖ＿Ｘｂａｌ（ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴ；配列番号４０）を使用してＰＣＲで増幅し、ヒト正常組織のｃＤＮＡは鋳型を有する。９７７ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、Ｘｂａｌで消化した。回収した９６８ｂｐのｈＣＯＳＭＣ断片を、８９３０ｂｐのベクター断片（ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ＥＧＦＰ＿Ｘ２９＿ＩＴＲプラスミドから切断した）にアセンブリして、ｐＢＳＫ＿ＩＴＲ＿ＢＴ＋＿ｈＣＯＳＭＣ＿Ｘ２９＿ＩＴＲを作出した。精製したｈＣＯＳＭＣおよびベクター断片を１０μＬの最終容積中でライゲートし、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞を形質転換するために使用した。新しく作出されたプラスミドの完全性および構造を、以前に記載の通り制限分析で点検した。

【0177】

実施例２：組換えコラーゲン７宿主細胞株を産生するための細胞株の生成
宿主細胞株および細胞培養
野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－６１）に由来する無血清培養細胞バンク（作業用細胞バンク、ＷＣＢ）を、８ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＰＡＡ社、カタログ番号Ｍ４１１－００４）および１×ＨＴ栄養補助剤（ヒポキサンチン／チミジン栄養補助剤）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号４１０６５）で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ハイクローン社（ＨｙＣｌｏｎｅ）、カタログ番号ＳＨ３０５４８）中にて、無血清条件下で培養および維持した。ＷＣＢの培地に対して５％ＣＢ５（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（商標）栄養補助剤（ハイクローン社（ＨｙＣｌｏｎｅ）、カタログ番号ＳＨ３０８６５）を添加することにより、トランスフェクション用の研究用細胞バンク（ＲＣＢ）を生成した。細胞を、規定通りに２×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種した。トランスフェクション性および単一細胞プレーティング能を試験し、承認した。トランスフェクションの準備ができたこうした無血清浮遊細胞培養を、ＣＨＯ－Ｍ細胞と呼ぶ。

【0178】

ＣＨＯ－Ｍ宿主細胞を、規定通りに、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ栄養補助剤、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で培養した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で撹拌（１２０ｒｐｍ、２５ｍｍストローク）しながら維持した。トランスフェクション前に、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地の２ｍＬを、６ウェルプレートの１つのウェルにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートすることにより予め加温した。

【0179】

発現構築物／プラスミド調製
実施例１に詳細に記載されている通りに構築物を製作した。プラスミドをすべて定量化し、配列決定によりさらに検証した。

【0180】

トランスフェクション（プール＃Ｂ１）
ＳＧＥ Ｔｅｃｈ １トランスフェクション系を細胞トランスフェクションのために使用した（セレキシスインコーポレイテッド社（ＳＥＬＥＸＩＳ Ｉｎｃ．）、米国）。コラージュ（ｃｏｌｌａｇｅ）７発現プラスミド（ピューロマイシン耐性カセットを保有する）ならびにプロリル－４－ヒドロキシラーゼサブユニットＡ１およびＢ（Ｐ４ＨＡ１およびＰ４ＨＢ）の２つのプラスミドを、以下の通り、ＣＨＯ－Ｍ細胞に共トランスフェクトした（表３）。ＧＦＰ発現プラスミドを対照として使用した。

【0181】

【表3】

【0182】

ＣＨＯ－Ｍ細胞は、細胞生存率（９６．０％生存率）およびトランスフェクション効率を最大化するため、トランスフェクション手順の直前に調製した。細胞（１マイクロポレーション当たり５．１×１０^５細胞）を遠心分離し（４００×ｇ、５分間、室温）、滅菌１×ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを、再懸濁緩衝液Ｒ（ＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒキット、ＭＰＫ－１０９６）に穏やかに再懸濁して、１．７×１０^７ｃ／ｍＬの濃度にした。１００μＬ容積の細胞懸濁物（１マイクロポレーション当たり）を、直ちにＤＮＡチューブに移し、注意深く混合した。細胞－ＤＮＡ混合物を、ＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒピペット（ナノエンテックインコーポレーテッド社（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ Ｉｎｃ．）、韓国）で吸引し、ピペットステーション内に配置した。マイクロポレーション後（１１３０Ｖ、２０ｍｓ、および３回パルス）、細胞を、以前に準備した６ウェルプレートに移し、３７℃および５％ＣＯ_２の静置加湿インキュベーターで一晩インキュベートした。ＧＦＰ発現ベクターを並行して使用することによりトランスフェクション効率を制御した（翌日に実施した顕微鏡検査は、５０～７０％の通常トランスフェクション効率を示した）。

【0183】

ＳＧＥｔｅｃｈＩトランスフェクションの６日後、細胞をスピンチューブに移し、抗生物質含有培地（８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５、および５μｇ／ｍＬピューロマイシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ－９６２０）を有するＳＦＭ４ＣＨＯ培地）中で選択した。８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５、および２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを有するＳＦＭ４ＣＨＯ培地を使用してトランスフェクト細胞を培養および継代した。トランスフェクト細胞の１つのプール（プール＃Ｂ１）を、次のトランスフェクションに使用した。

【0184】

プール＃Ｂ１のスーパートランスフェクション
次いで、ＳＧＥｔｅｃｈＩトランスフェクションに由来するプール＃Ｂ１の細胞を、表４に示されているプラスミドでさらにトランスフェクトした（スーパートランスフェクションとして）。スーパートランスフェクションには、ハイグロマイシン耐性を保有するベクターを使用した。細胞（５．１×１０^５細胞／トランスフェクション）を、滅菌反応チューブ内で４．５μｇの線状化ＤＮＡ試料と一緒にした。同じトランスフェクションプロトコールを使用した（１１３０Ｖ、２０ｍｓ、および３回パルス）。ＧＦＰ発現ベクターを使用することによりトランスフェクション効率を制御した（５０～７０％の通常トランスフェクション効率）。

【0185】

【表4】

【0186】

スーパートランスフェクション後、細胞を５ｍＬスピンチューブに入れて拡大増殖させた。２．５ｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、ｌ×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で１０日間培養した後、２５０μｇ／ｍＬのヒグロマイシン（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、カタログ番号ａｎｔ－ｈｍ－５）を培地に添加することにより二重選択を開始した。６回のその後の継代を実施してから、バンク化した。トランスフェクト細胞の１つのプール（プール＃Ｂ１ＳＴＢ）を、次のトランスフェクションに使用した。

【0187】

プール＃Ｂ１ＳＴＢのスーパートランスフェクション
プール＃Ｂ１ＳＴＢの細胞を、プロリル４－ヒドロキシラーゼＡおよびＢサブユニットを発現するベクター（表５）ならびに哺乳類発現ベクターＵ５－ＰＢで再度トランスフェクトした。各マイクロポレーションについて、ＧＦＰ対照と並行して、３．４×１０^５細胞および３μｇ線状化ＤＮＡを滅菌反応チューブ中で調製した。同じトランスフェクションプロトコールを使用した（１１３０Ｖ、２０ｍｓ、および３回パルス）。

【0188】

【表5】

【0189】

スーパートランスフェクションＩＩの１３日後、５ｍＬスピンチューブに入れて、抗生物質を有していない、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で細胞を拡大増殖させた。１４日目に、２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンおよび２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを培養培地に添加した。

【0190】

１４回のその後の継代後、トランスフェクト細胞を凍結保存した。トランスフェクト細胞の１つのプール（プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂ）を、別のスーパートランスフェクションのために、２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンおよび２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＳＦＭ４ＣＨＯ培地中でさらに８回さらに継代培養した。

【0191】

プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂのスーパートランスフェクション
プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂに由来する細胞を、ｈＨＳＰ４７の発現ベクターでさらにトランスフェクトした（表６）。各マイクロポレーションについて、ＧＦＰ対照と並行して、３．４×１０^５細胞および３μｇ線状化ＤＮＡ試料を滅菌反応チューブ中で調製した。同じトランスフェクションプロトコールを使用した（１１３０Ｖ、２０ｍｓ、および３回パルス）。

【0192】

【表6】

【0193】

スーパートランスフェクションＩＩＩの９日後に、培地交換を実施し、２００μｇ／ｍＬの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号４９７５２）を、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ５で既に補完されているが、抗生物質を含んでいないＳＦＭ４ＣＨＯ培養培地に添加した。５日後、細胞を５ｍＬスピンチューブに入れ、２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンおよび２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で拡大増殖させた。さらなる分析のため、２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンおよび２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地中で７回のその後の継代を実施した。

【0194】

トランスフェクト細胞の１つのプール（プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２）をさらに培養し、拡大増殖させた。
実施例３：単クローン性細胞株のスクリーニング
３．１ プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂのスクリーニング
プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂの細胞を、１００細胞／ｍＬの濃度で半固体培地（８ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉ×ＨＴ、および５％ＣＢ５を含む２×ＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびメチルセルロース（ＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘ（商標）、ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｘ）、カタログ番号Ｋ８５１０））中で１１日間培養した。１１１個の候補を選び、９６ウェルプレートに移し、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地に入れた。７日以内に、ドットブロットにより候補をスクリーニングした。１８個のスーパートランスフェクト候補をさらに選び、２４ウェルプレートに移した。さらに７日以内に、２４ウェルの上清をドットブロットで分析し、１２個のスーパートランスフェクト候補を６ウェルプレートに移した。

【0195】

発現が最も高い１２個の候補すべてを（ドットブロットに基づく）、７日後にスピンチューブ（５ｍＬ作業容量）中で拡大増殖させて懸濁培養にし、５回のその後の継代後、振とうフラスコ（作業容量２０ｍＬ）中の、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地に入れた。こうした拡大増殖はすべて、選択用の抗生物質を添加せずに実施した。

【0196】

候補をバンク化し、各候補の性能を、３２℃でのバッチ培養で比較した。細胞数および生存率が表７に示されている。タンパク質発現をウエスタンブロットで試験した。図１は、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂ第１ラウンド候補の６日目培養物のウエスタンブロットのゲル画像を示す。

【0197】

【表7】

【0198】

候補クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂ－ｃｐ０３をさらに培養し、同じプロセスに従って選択し、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂ－ｃｐ０３に由来する５つのクローンを選択した（表８）。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ３２℃および３７℃における第２ラウンド選択に由来するクローンの６日目培養物のウエスタンブロットのゲル画像を示す。

【0199】

【表8】

【0200】

３．２ プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２のスクリーニング
プール＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２の細胞を、１００細胞／ｍＬの濃度で半固体培地（８ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉ×ＨＴ、および５％ＣＢ５を含む２×ＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびメチルセルロース）中で培養した。２９個のスーパートランスフェクト候補クローンを選び、９６ウェルプレートに移し、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、ＩｘＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されているが抗生物質を有していないＳＦＭ４ＣＨＯ培地に入れた。

【0201】

３日以内に、２９個の成長中のスーパートランスフェクト候補すべてを、６ウェルプレートに移した（１ｍＬの細胞懸濁物＋２ｍＬの新鮮な成長培地）。５日後、６ウェルの上清をウエスタンブロットで分析し、最も高い発現を示す３つのスーパートランスフェクト候補をスピンチューブ（５ｍＬ作業容量）中で拡大増殖させて懸濁培養にした。８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中での、選択を行わない５回のその後の継代後（４回目の継代では、２００μｇ／ｍＬの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸を加えた）、細胞を、スピンチューブ上清（５ｍＬ作業用溶液）をウエスタンブロットすることによりスクリーニングした。次いで、最も高い発現を実証する２つのスーパートランスフェクト候補を、振とうフラスコ（作業容量２０ｍＬ）中の、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、および５％ＣＢ％で補完されているが抗生物質を有していないＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で費やして懸濁培養にした。

【0202】

２つの候補、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２－ｃｐ１３およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２－ｃｐ１５をバンク化し、３２℃および３７℃でのバッチ培養で性能を比較した。細胞数および生存率が表８に示されている。図３は、３２℃および３７℃におけるＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１３およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１５の５日目培養物のウエスタンブロットのゲル画像である。

【0203】

【表9】

【0204】

候補クローンであるＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１３およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１５をさらに培養し、半固体培地（８ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉ×ＨＴ、および５％ＣＢ５を含む２×ＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびメチルセルロース（抗生物質選択無し））中でスクリーニングした。プレーティングしたコロニーを、１２日後に、ＣｌｏｎｅＰｉｘ細胞コロニーピッカー系を使用してスクリーニングした。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１３から３２個のクローンおよびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１５から３０個のクローンを選び、９６ウェルプレートに移し、その後、６ウェルプレート中の、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５で補完されているが抗生物質を有していないＳＦＭ４ＣＨＯ培地に移した。選んだすべての細胞クローンを拡大増殖させ、３日後にスピンチューブ（５ｍＬの作業容量）に入れた。ウエスタンブロットによるスピンチューブ上清の分析に基づき、最大発現を示す、ＢｌＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１３から３つのクローンおよびＢｌＳＴＢＳＴｂＳＴｈ２ｃｐ１５から４つのクローンを選択し、振とうフラスコ（作業容量２０ｍＬ）中の、８ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉ×ＨＴ、および５％ＣＢ５で補完された（選択用の抗生物質を有していない）ＳＦＭ４ＣＨＯ培地で拡大増殖させた。

【0205】

すべての細胞株（表１０に列挙されている）をバンク化し、こうした細胞の性能を３２℃および３７℃でのバッチ培養で比較した。細胞数および生存率が表１０に示されている。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ３２℃および３７℃における第２ラウンド選択の６日目培養物のウエスタンブロットのゲル画像を示す。

【0206】

【表10】

【0207】

細胞株はすべて、１０％ＤＭＳＯ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｄ－２６５０）、４５％馴化培地、ならびに８ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＨＴ、５％ＣＢ５で補完された４５％新鮮ＳＦＭ４ＣＨＯ培地を使用して、６×１０^６細胞／バイアルで凍結保存した。バイアルを、－８０°Ｃで２４時間クライオボックス（ヌンク社（Ｎｕｎｃ））に保管した後、アクセスが制限された液体窒素系に移した。

【0208】

凍結細胞を試験し、Ｖｅｎｏ（登録商標）Ｇｅｍマイコプラズマ検出キット（ミネルババイオラボ社（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｌａｂｓ）、カタログ番号１１－１１００）を使用してマイコプラズマが存在しないことを、製造業者のプロトコールに従って（ヘイファ社（Ｈｅｉｐｈａ）、Ｃａｓｏ－Ｂｏｕｉｌｌｏｎ ＴＳＢ、番号３０８０ｒ）無菌性を確認した。

【0209】

解凍時の生存率、細胞成長、およびｃＤＮＡ配列決定を含む細胞の安定性、ならびに解凍後の機能試験を、指定された時間間隔でモニターする。
実施例４：ｒＣｏｌ７産生のための細胞クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３（ＭＣＢ）の検証
細胞クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３（ＭＣＢ細胞とも呼ばれる）により産生されたコラーゲン７を、ＩＣＨ（医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議）の安全性ガイドラインに従って広範に試験した。ＭＣＢに由来するｒＣｏｌ７の同一性を、サザンブロットおよびｒＣｏｌ７ ｃＤＮＡ配列決定により分析した。ＭＣＢには、予想される８．９ｋｂのｒＣｏｌ７断片が存在するが、宿主ＣＨＯ細胞には存在せず、ＭＣＢにはｒＣｏｌ７コード領域が存在することが確認される（図４）。ｒＣｏｌ７ ＭＣＢから単離されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列分析によりｒＣｏｌ７をコードすることが確認された。

【0210】

配列決定結果は、ＭＣＢに由来するｒＣｏｌ７のヌクレオチド３０９７位（ＡＴＧ開始コドンから数えて）に配列不均質性があることを示した。３０９７位のヌクレオチド残基は、天然Ｇヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００００９４；配列番号２のように）およびこの位置で観察された優勢ヌクレオチドだったＴヌクレオチドの混合（２０．２％Ｇおよび７９．８％Ｔ）であり、コラーゲン７ポリペプチドのコドン１０３３位にアミノ酸残基アスパラギン酸（Ｄ）（ＧＡＣによりコードされる）およびチロシン（Ｙ）（ＴＡＣによりコードされる）を有する不均質なｒＣｏｌ７ポリペプチドがもたらされる。２つのｒＣｏｌ７発現構築物（Ｐｕｒｏ＿ＢＴ＋ＳＬＸ３６３１＿Ｃｏｌ７ＡおよびＨｙｇｒｏ＿ＢＴ＋ＳＬＸ３６３１＿Ｃｏｌ７Ａ）のヌクレオチド配列は、１０３３位にアスパラギン酸（Ｄ）を正しくコードすることが確認されたため、観察された不均質性は、ＭＣＢの生成に結び付く細胞株発生プロセス中に導入されたと結論付けられる。

【0211】

こうした結果は、ＭＣＢが、二クローン性であるか、またはＧ３０９７もしくはＴ３０９７組換えコラーゲン７配列のいずれかを保有する２つの関連クローンの混合物であることを示す。Ｇ：Ｔ配列の比、結果的には２つのクローンの比は、およそ１：４である。核酸配列が不均質性であるため、ｒＣｏｌ７ ＭＣＢにより産生される組換えヒトコラーゲン７組成物も不均質であり、Ｄ１０３３およびＹ１０３３の混合物を含み、Ｙ１０３３変異体は、この物質のおよそ８０％～９０％を占める。

【0212】

ＭＣＢにより産生されるｒＣｏｌ７物質の機能性を試験するために、さらなる評価を実施した。ｒＣｏｌ７の構造および機能に対するＤ１０３３Ｙ不均質性の潜在的な影響を、分子モデリング技法の組合せにより評価した。結果は、物理化学的特性（例えば、分子量、プロリンヒドロキシル化、一次および二次構造）が予想通りであることを確認した。確立されている相同性モデル（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）によると、１０３３位の不均質性は、コラーゲンＶＩＩのフィブロネクチンＩＩＩ型リピート９（ＦＮＩＩＩドメインＦＮＩＩＩ Ｒ９）のβサンドイッチフォールディングに影響を与えない可能性が高い。

【0213】

１０３３位の不均質性がコラーゲン７の機能性に及ぼす影響を評価するため、ＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物（ＭＣＢ ｒＣｏｌ７など）の幾つかの重要な属性を測定し、参照コラーゲン７（ヒト線維芽細胞由来）と比較した。こうした分析には、還元条件でのウエスタンブロットによる同一性評価、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）による多量体化状態の評価、ペプチドマッピングＬＣ／ＭＳによるヒドロキシプロリン占有率、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるドメイン完全性の生物物理学的評価、ラミニン－３３２結合アッセイによる結合パートナー親和性評価、およびＩｎｃｕＣｙｔｅ創傷治癒法による創傷治癒の評価が含まれていた。

【0214】

ＤＳＣ（示差走査熱量測定）を使用して、ＭＣＢ ｒＣＯＬ７のドメイン完全性を評価した。ＤＳＣ分析では、参照コラーゲン７および現行のＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成で同等の結果が得られ、非常に類似したドメイン／サブドメイン熱遷移が観察された。コラーゲン７のコラーゲン性ドメインは、両物質ともおよそ４５℃で最も早い熱遷移（Ｔｍ）を起こし、非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）融解遷移は、およそ６８℃の温度で生じる。両物質内の中間熱遷移は、コラーゲン性ドメインのサブドメインによるものであると考えられ、両物質とも４９℃～５０℃で同様の遷移を示す。

【0215】

ウエスタンブロット分析は、ｒＣｏｌ７産物同一性が、観察された一次結合パターンの点では、参照コラーゲン７と現行のＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物との間で同等であることを示した（図５）。

【0216】

ＭＣＢ ｒＣｏｌ７試料を変性させ、還元し、ヨード酢酸を使用することによりシステインをアルキル化し、次いで３７℃にて１４時間トリプシンで消化した。消化したタンパク質をＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化した。ペプチドマッピングＬＣ／ＭＳを使用してペプチド混合物を分析した。結果は、ｒＣｏｌ７一次配列の完全性を示した。ＭＣＢ ｒＣｏｌ７のヒドロキシプロリンのレベルは、Ｔ７２４インジケーターペプチド（ＶＶＧＡＰＧＶＰＧＡＰＧＥＲ）内で観察されたヒドロキシプロリンのパーセンテージにより推定した（ブレイドら（Ｂｕｌｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．１６（２２）：６６９４－６７０１）。ペプチドマッピングＬＣ／ＭＳの結果は、Ｔ２７４インジケーターペプチド内のヒドロキシプロリン占有率が同様のレベルであることを示す。

【0217】

残基１０３３は、ラミニン－３３２結合部位内にマッピングされている、コラーゲン７の９番目のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピートに位置する（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．），Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９９，Ｖｏｌ．１１２（２）：１７７－１８３）。ラミニン－３３２結合親和性とＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７のＹ１０３３変異体のパーセンテージとの間の潜在的相関性を決定するための評価は、参照コラーゲン７およびＭＣＢ ｒＣｏｌ７の最大結合レベルおよび解離定数（Ｋｄ）などの結合特徴が同様だったことを示す（図６）。したがって、アミノ酸１０３３位に存在する不均質性は、ＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物のラミニン－３３２結合に影響を及ぼさないと考えられる。

【0218】

また、ＢＭＺに存在しない、コラーゲン７の追加結合パートナーであるフィブロネクチンで結合評価を実施した。
参照コラーゲン７およびＭＣＢ ｒＣｏｌ７のｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒バイオアッセイを実施した。試験結果はこれら物質間で類似していた。これは、１０３３位に存在する不均質性が、このアッセイにより測定される生物学的機能に悪影響を及ぼさないことを示す（図７）。

【0219】

まとめると、参照コラーゲン７およびＭＣＢ由来ｒＣｏｌ７組成物の物理化学的および機能的試験は、多数の重要な属性にわたって類似性を実証した。これは、コラーゲン７の１０３３位がアスパラギン酸の代わりにチロシンであっても著しい影響は存在しないことを示す。

【0220】

実施例５：クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１および＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３の検証
細胞クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３は、単クローン性（つまり、単一細胞由来）の可能性が高いことを保証するための業界標準を満たす２ラウンドのクローニングに由来した。両クローンから単離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）およびｃＤＮＡのＤＮＡ配列分析により、野生型コラーゲン７配列と一致する単一の核酸配列の存在が確認された。この結果により、両細胞クローンは単クローン性であり（つまり、単一細胞祖先に由来する）、ｒＣｏｌ７導入遺伝子は、両クローンとも、参照配列（ヒトコラーゲン７、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００００９４；配列番号２）に規定されている通りの天然コラーゲン７をコードすることが確認される。サウスブロット分析により、ｒＣｏｌ７の８．９Ｋｂ断片の存在が確認された。これは、ｒＣｏｌ７コード配列が両クローンでインタクトであることを示す（図８）。１年後の細胞バンクの培養細胞は、参照Ｃｏｌ７配列との不一致を示さない。インタクトな導入遺伝子配列および転写物（ｍＲＮＡ）が、両クローンに存在する。

【0221】

以下の安定性試験で示されている通り、両クローンに由来する細胞は安定している。細胞を、選択の非存在下または存在下で少なくとも３０世代にわたって培養した。コラーゲン７産生を、コラーゲン７の細胞内染色およびＥＬＩＳＡ試験により試験した（表１１および図９）。選択の非存在下では、生産性が低下するが（表１１）、選択の存在下では、少なくとも３０世代にわたって生産性が維持される（表１１）。コラーゲン７の細胞内染色により、追加の部分集団が観察されないことが確認される。これは両細胞株が安定していることを示す（図９）。

【0222】

【表11】

【0223】

Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３に由来するｒＣｏｌ７組成物には検出可能な突然変異ペプチドが見出されなかったことが、配列決定によりさらに決定された。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３に由来するｒＣｏｌ７物質の生物物理学的特徴は、ＤＳＣマッピングによるアンフォールディング温度プロファイル（３５℃～５５℃）が同じであることを示す。

【0224】

実施例６：プロセススケールアップの細胞培養条件および生産性
プロセススケールアップの成功は、重要なスケール非依存性プロセスパラメーターを決定し、測定し、およびモニターし、次いで、ラージスケールにてそうした同じパラメーターを提供するように設備を適切に設計および操作することに依存する。細胞拡大増殖用の細胞培養培地を含むバイオリアクター条件を、プロセススケールアップのために最適化した。ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５、１００×ＨＴ、およびアスコルビン酸を有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を基本細胞培養培地に使用した。細胞成長を、１０リットルのＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地ベースの培養中で３０Ｅ６ｖｃ／ｍＬに維持した。クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１の生存率は、２５日間の培養にわたって一貫して８５％を上回っていた。ＥＬＩＳＡによるクローンスクリーニングデータは、両クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３の生産性が、クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３よりも高いことを示す（表１２）。また、クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３のＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）量は、ＭＣＢクローンの量よりも高い（図１０）。

【0225】

【表12】

【0226】

３つの候補クローンを、ラージスケール化可能性課題について試験した。プロセススケールアップのために、細胞を４００ＳＷバイオリアクターで培養した。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１の酸素アップデート速度（ＯＵＲ、ｏｘｙｇｅｎ ｕｐｄａｔｅ ｒａｔｅ）は、それぞれ１．５９Ｅ－１０（ｍｍｏｌ Ｏ２／ｈｒ^＊ｖｃおよび３．０９Ｅ－１０（ｍｍｏｌ Ｏ２／ｈｒ^＊ｖｃ）だった。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３クローンは、生物量が２０％少なく、Ｏ２流速が２０％大きい。入口でパッキング（Ｐａｃｋｉｎｇ）が観察され、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１クローンおよびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３クローンの両方は、ピーク時では同様のパッキング細胞容積（ｐａｃｋｅｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ）を示す（２０～２５％）。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３細胞は、均一なパッキングプロファイルおよび約２０％のパックキング容積（ピーク）を示す。予備データは、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１が、プロセススケールアップに好ましいことを支持する。

【0227】

実施例７：評価用のプロセススケールダウンを使用した下流精製プロセス
迅速で効率的であり信頼性の高い産生プロセスを実現するため、スケールダウン実験室モデルを使用して、下流精製プロセスを試験した。組換え治療用コラーゲン７タンパク質の精製において、タンパク質の純度および収率を増加させるために、下流プロセスを評価および最適化した。プロセスは、以下の工程を含む。

【0228】

１．細胞培養物質（ＵＰＢ）を回収する工程。この研究では、各クローンの混合およびプール培養物質を使用した。
２．ＵＶ－Ｃおよび化学薬品（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ）を使用して、細胞培養物質（ＵＰＢ）中のウイルスを不活化する工程。

【0229】

３．処理したＵＰＢをＣａｐｔｏ（商標）コアフロークロマトグラフィーおよびセファロースクロマトグラフィーで濾過する工程。
４．ウイルス濾過の工程。

【0230】

５．膜材料を使用して、最終ＵＦ（限外濾過）およびＤＦ（ダイアルフィルトレーション（Ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程を実施する工程。この試験研究では、２段階１００ＫＤ ＵＦ／ＤＦ（例えば、１００ＫＤ ＣふるいＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜）を使用した。その代わりに、１段階ＵＦ／ＤＦ（例えば、３０ＫＤ ＡふるいＰＥＳ膜）を使用した。

【0231】

６．最終産物を０．２μｍ膜で濾過する工程。

【0232】

【表13】

【0233】

クローンＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３に由来するＵＰＢは、ＥＮＧ（８８，０００ｎｇ／ｍＬ）およびＧＭＰ（表１３）と比較して著しくより高い力価（クローン１３－０１では２０８，０００ｎｇ／ｍＬおよびクローン１３－０３では１３４，０００ｎｇ／ｍＬ）を有する。同様に、細胞クローンに由来するＨＣＰは、ＥＮＧおよびＧＭＰと比較して著しくより高い。各クローンの薬物物質におけるＨＣＰレベルは同等であり、仕様を下回っている。

【0234】

１段階３０ＫＤ ＵＦ／ＤＦプロセスまたは２段階１００ＫＤ ＵＦ／ＤＦプロセスを使用した試験下流精製収率は同等である。現行の下流プロセスは、３つのクローンすべてで同等の収率を示すが、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂｃｐ０３は、より高い最終ＵＦ／ＤＦ収率を示す（表１３）。

【0235】

スケールダウンプロセスに由来する薬物物質品質属性を、表１４に示されている通りに評価した。細胞クローンに由来する薬物物質の外観、バイオバーデン、エンドトキシン、浸透圧、およびＰｈなどの他の属性は、参照標準物質と同等である。スケール変更実験および４００ＳＷバイオリアクターの分析結果は類似している（データ非表示）。

【0236】

【表14】

【0237】

両クローン＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３では、バイオリアクターおよびＵＰＢに由来する総ＨＣＰがより高いことが、ＥＬＩＳＡにより測定された。ＥＬＩＳＡ法による薬物物質中のＨＣＰ含有量は、３つの細胞クローンのスケールダウン実験間で同等であるが（表１４）、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１細胞株およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３細胞株に由来する薬物物質では、ＣＨＯ Ｃ７含有量の増加がＭＳ法より測定された（表１５）。

【0238】

【表15】

【0239】

こうした結果は、＃Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１の生産性が＞２０ｍｇ／Ｌ／日であり得ることを示唆する。細胞クローンから産生されたｒＣｏｌ７は天然コラーゲン７を含んでいる（図１１）。組換えタンパク質の配列決定によると、Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１およびＢ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０３に由来するｒＣｏｌ７から検出可能な変異ポリペプチドは見出されなかった。細胞株は安定しており、スケールアップ細胞培養に好適である。全体的な下流精製収率および薬物物質属性は、標準参照物質と同等である。Ｂ１ＳＴＢＳＴｂＳＴｈｃｐ１３－０１細胞株に由来する薬物物質の他の機能（例えば、ＩｎｃｕＣｙｔｅ創傷治癒アッセイおよびフィブロネクチン結合による効力）は、参照標準物質と同等である（表１４）。詳細な結果は、以下の例で考察されている。

【0240】

実施例８：選択した単クローン性宿主細胞に由来するｒＣｏｌ７の配列検証
全ＲＮＡ内容物を、遺伝子操作組換え宿主細胞クローンから抽出し、標準的手順に従って定量化した。ＲＮＡ抽出物の品質も分析した。標的転写産物（配列検証に供される配列）を、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写酵素媒介性ＰＣＲ）およびＲＡＣＥ－ＰＣＲ（ｃＤＮＡ末端迅速増幅ＰＣＲ、Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ－ＰＣＲ）を使用して富化した。

【0241】

増幅産物（アンプリコン）を、各アンプリコンのＤＮＡライブラリーが生成されるように構築した。各ＤＮＡライブラリーは、試料採取追跡および識別のために一意にバーコード化されていた。各ＤＮＡライブラリーのＤＮＡ断片長の平均を、ＤＮＡライブラリー構築の完了時に評価した（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ高感度ＤＮＡキット）。

【0242】

ＳＹＢＲ－ＱＰＣＲ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎベースの定量的ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して最終ＤＮＡライブラリーを定量化し、分析してＤＮＡ濃度を決定した。最終ＤＮＡライブラリーを、変性させ、希釈し、一緒に組み合わせて、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ（登録商標）ＮＧＳプラットフォーム）により配列決定した。

【0243】

配列データを、ＲＴ－ＰＣＴおよびＲＡＣＥ－ＰＣＲデータセットを、参照ｒＣｏｌ７配列（配列番号２５；ｒＣｏｌ７構築物におけるコラーゲン７挿入）に対してマッピングおよびアラインメントすることにより分析した。

【0244】

予備的なＲＡＣＥ－ＰＣＲマッピングデータは、読取り集団のおよそ８０％が参照ゲノムにマッピングされ、アラインメントは、１００％類似性で１００％参照カバー率をもたらし、報告可能な変異体は検出されなかったことを示した。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】