特表 2022-527087 タウオパチーを診断するためのｐＳ３９６アッセイの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-30

(54)【発明の名称】タウオパチーを診断するためのｐＳ３９６アッセイの使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20220523BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20220523BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20220523BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 D

G01N33/53 U

G01N33/543 541A

C07K16/18 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557487

(86)(22)【出願日】2020-03-24

(85)【翻訳文提出日】2021-11-25

(86)【国際出願番号】 EP2020058062

(87)【国際公開番号】W WO2020193500

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】PA201900377

(32)【優先日】2019-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591143065

【氏名又は名称】ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100141195

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 恵美子

(72)【発明者】

【氏名】ペダーセン，ジャン，トルレイフ

(72)【発明者】

【氏名】カリカリ，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ホグラン，キナ

(72)【発明者】

【氏名】ブレンナウ，カイ

(72)【発明者】

【氏名】ハルンダール，ミッケル ノーズ

(72)【発明者】

【氏名】ゼターバーグ，ヘンリク

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA50

(57)【要約】

本発明は、サンプル中のリン酸化タウを測定するためのインビトロアッセイであって、ｉ）タウ上のｐＳ３９６に特異的な捕捉抗体と、ｉｉ）捕捉抗体と異なるエピトープ上のタウに結合する検出抗体との２つの抗体の使用を含むアッセイに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中のリン酸化タウを測定するためのインビトロアッセイであって、ｉ）タウ上のｐＳ３９６に特異的な捕捉抗体と、ｉｉ）前記捕捉抗体と異なるエピトープ上のタウに結合する検出抗体との２つの抗体の使用を含む、アッセイ。

【請求項2】

前記検出抗体が、タウ上のアミノ酸１～２０（例えば６～１８）以内、タウ上のアミノ酸１４０～１７０（例えば１５９～１６８）以内、又はタウ上の４００～４４１（例えば４０４～４２１）以内のエピトープに結合している、請求項１に記載のアッセイ。

【請求項3】

前記検出抗体が、ビオチン化される、請求項１～２に記載のアッセイ。

【請求項4】

前記捕捉抗体が、常磁性ビーズの表面に付着される、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。

【請求項5】

β－ガラクトシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンが使用され、シグナル読み取り値が生成される、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。

【請求項6】

前記サンプルが、哺乳動物からのＣＳＦ、血漿又は他の生体液サンプルである、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。

【請求項7】

前記サンプルが、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺又は球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを患っているヒトからのＣＳＦ又は血漿サンプルである、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。

【請求項8】

前記ＣＳＦサンプルが、例えばスピン濾過カラム及びサイズ排除クロマトグラフィーの使用により、タウに対して濃縮されている、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイ。

【請求項9】

アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺又は球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを診断するための、先行請求項のいずれか一項に記載のアッセイの使用。

【請求項10】

サンプル中のリン酸化タウを測定するための方法であって、
ａ．常磁性ビーズに付着されたｐＳ３９６に特異的な捕捉抗体をビオチン化検出抗体及びサンプルと混合するステップと、
ｂ．前記混合物を、前記抗体の前記サンプル中のタウへの結合を可能にするのに十分な時間でインキュベートするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｃ．任意選択的に、インキュベーション後、ステップｂ）における前記混合物を洗浄するステップと、
ｄ．ストレプトアビジンコンジュゲートβ－ガラクトシダーゼを添加し、前記ストレプトアビジンコンジュゲート及び前記ビオチン化検出器抗体が反応することを可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｅ．任意選択的に、ステップｄ）後に前記得られた混合物を洗浄するステップと、
ｆ．レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドをステップｄ）又はｅ）における前記混合物に添加し、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドの加水分解を可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｇ．蛍光シグナルを読み取り、前記シグナルを標準と比較するステップと、
を含む、方法

【請求項11】

前記捕捉抗体が常磁性ビーズに付着され、及び少なくとも１０００個の前記常磁性ビーズ、例えば少なくとも１００００個、１００，０００個又はそれ以上のビーズが、前記サンプルに添加される、請求項１０に記載の方法、

【請求項12】

前記検出抗体が、タウ上のアミノ酸１～２０（例えば６～１８）以内、タウ上のアミノ酸１４０～１７０（例えば１５９～１６８）以内、又はタウ上の４００～４４１（例えば４０４～４２１）以内のエピトープに結合している、請求項１０に記載の方法

【請求項13】

前記サンプルが、哺乳動物からのＣＳＦ、血漿又は生体液サンプルである、請求項１０～１２に記載の方法。

【請求項14】

前記サンプルが、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺又は球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを患っているヒトからのＣＳＦ又は血漿サンプルである、請求項１０～１３に記載の方法。

【請求項15】

前記サンプルが、例えばスピン濾過カラム及びサイズ排除クロマトグラフィーの使用により、タウに対して濃縮されている、請求項１０～１４に記載の方法。

【請求項16】

アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺又は球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを診断するための、請求項１０～１５に記載の方法の使用。

【請求項17】

アルツハイマー病又はピック病を診断するため、前記検出器抗体が、タウ上のアミノ酸４００～４４１（例えば４０４～４２１）以内のエピトープに結合している、請求項１０～１７に記載の方法の使用

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、異なるタウ病理におけるタウ種を鑑別するためのアッセイにおける抗タウ抗体の使用に関する。本発明に従うアッセイは、即ち、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺及び球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを有する患者を診断するために使用可能である。

【背景技術】

【0002】

タウオパチーという用語は、微小管結合タンパク質タウの沈着によって特徴づけられる病理学的疾患のグループを定義する。沈着したタウは、異常にリン酸化され、細胞内封入体として蓄積する。いくつかの特定のタウオパチーが存在し、それらの各々は、タンパク質含有封入体の分布及び形態学的外観、並びにニューロン及びニューロンプロセス対グリア及びグリアプロセスに影響する病理の相対的負荷により変化する（Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。最も一般的なタウオパチーは、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、及び球状グリア性タウオパチー（ｔａｕｐｈａｔｈｙ）（ＧＧＴ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）である。ピック病以外の全ては、一般に運動障害に関連する（Ｋｅｉｔｈ Ａ．Ｊｏｓｅｐｈｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＸ，ｉｎ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１５）。タウオパチーはまた、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を意味する。ＦＴＤの大部分の症例が、ＭＡＰＴ（タウ）又はＧＲＮ（グラニュリン）における遺伝子突然変異に関連する。ＦＴＤは、タウタンパク質の蓄積に関連する。

【0003】

これらの患者に対する正しい治療を診断し、発見するため、これらの患者を診断し、各疾患に特徴的であるタウ病理を鑑別することが可能な方法を有することは重要である。本発明の発明者は、これらの疾患の診断に役立ち得るいくつかのアッセイを提供している。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、サンプル中のリン酸化タウを測定するためのインビトロアッセイであって、ｉ）タウ上のリン酸化（ｐ）セリン（Ｓ）残基３９６（ｐＳ３９６）に特異的な捕捉抗体と、ｉｉ）捕捉抗体と異なるエピトープ上のタウに結合する検出抗体との２つの抗体の使用を含む、アッセイに関する。検出器抗体は、本明細書でさらに開示される通り、タウ上の非リン酸化残基に結合してもよい。

【0005】

第２の態様では、本発明は、サンプル中のリン酸化タウを測定するための方法であって、
ａ．常磁性ビーズに付着されたｐＳ３９６に特異的な捕捉抗体をビオチン化検出抗体及びサンプルと混合するステップと、
ｂ．混合物を、抗体のサンプル中のタウへの結合を可能にするのに十分な時間でインキュベートするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｃ．任意選択的に、インキュベーション後、ステップｂ）における混合物を洗浄するステップと、
ｄ．ストレプトアビジンコンジュゲートβ－ガラクトシダーゼを添加し、前記ストレプトアビジンコンジュゲート及びビオチン化検出器抗体が反応することを可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｅ．任意選択的に、ステップｄ）における得られた混合物を洗浄するステップと、
ｆ．レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドをステップｄ）又はｅ）における混合物に添加し、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドの加水分解を可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｇ．蛍光シグナルを読み取り、シグナルを標準と比較するステップと、
を含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ｐＳ３９６タウアッセイの略図。（Ａ）完全長ｐＳ３９６（又はＦＬ ｐＳ３９６）アッセイとしても知られる、Ｔａｕ１２－ｐＳ３９６アッセイでは、捕捉抗体として抗ｐＳ３９６抗体、且つ検出抗体としてＴａｕ１２（アミノ酸６～１８のエピトープ）が使用される。（Ｂ）ＨＴ７－ｐＳ３９６（中央領域ｐＳ３９６又はＭＲ ｐＳ３９６）アッセイでは、中央領域（エピトープ１５９～１６８）から広がるタウ種上のｐＳ３９６が測定される。このアッセイでは、捕捉抗体としてｐＳ３９６抗体、且つ検出抗体としてＨＴ７が使用される。（Ｃ）捕捉抗体として抗ｐＳ３９６抗体、且つ検出抗体としてＴａｕ４６（エピトープ４０４～４４１）が使用される、ｐＳ３９６－Ｔａｕ４６（Ｃ末端ｐＳ３９６又はＣＴ ｐＳ３９６）アッセイは、最末端のＣ末端領域（アミノ酸４０４～４４１）を有するｐＳ３９６リン酸化タウに特異的である。

【図2-1】図２ ｐＳ３９６リン酸化タウ種により、タウ病理を伴う神経変性疾患が鑑別される。臨床的に確認されたタウオパチーを有する個体からの前頭灰白質脳（ｆｒｏｎｔａｌ ｇｒｅｙ ｍａｔｔｅｒ ｂｒａｉｎ）単離物のＴＢＳ可溶性画分が、ＦＬ、ＭＲ及びＣＴ ｐＳ３９６アッセイで試験された。アッセイ希釈剤で調製された、各検体（全体でｎ＝２４）の等モル濃度（０．４６ｍｇ／ｍｌ）の５００倍希釈物が、各ｐＳ３９６アッセイで分析された。希釈補正されたデータ（平均±平均値の標準誤差［ＳＥＭ］）がここに示されている。サンプルは、アルツハイマー病（ＡＤ，ｎ＝５）、ピック病（ＰｉＤ，ｎ＝５）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ，ｎ＝５）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ，ｎ＝５）、球状グリア性タウオパチー（ＧＧＴ，ｎ＝２）、及び健常対照（Ｃｔｒｌ，ｎ＝２［ＭＲアッセイにおいてはｎ＝１］）から構成された。 （Ａ）タウオパチー脳サンプルにおけるＦＬ ｐＳ３９６の濃度。平均濃度±ＳＥＭ：ＡＤ＝５７６９±６２１ｐｇ／ｍｌ、ＰｉＤ＝４７３７±９６０ｐｇ／ｍｌ、ＣＢＤ＝１０７１６±２４５２ｐｇ／ｍｌ、ＰＳＰ＝８８８８±１００２ｐｇ／ｍｌ、ＧＧＴ＝１０１２２±３９５５ｐｇ／ｍｌ、Ｃｔｒｌ＝３３２６±７３ｐｇ／ｍｌ。群間で統計学的有意差は記録されなかった（クラスカル・ウォリス検定、続いてダンの多重比較検定）。 （Ｂ）異なるタウオパチーからの脳検体におけるＭＲ ｐＳ３９６濃度。平均レベル±ＳＥＭ：ＡＤ＝２３４３２±４７７３ｐｇ／ｍｌ、ＰｉＤ＝２９９４９±６９３８ｐｇ／ｍｌ、ＣＢＤ＝１７４３４±９３５９ｐｇ／ｍｌ、ＰＳＰ＝５５６３±１０４７ｐｇ／ｍｌ、ＧＧＴ＝９８３０±３９３３ｐｇ／ｍｌ、Ｃｔｒｌ＝１８６２ｐｇ／ｍｌ。群間で統計学的有意差は記録されなかった（一元配置分散分析［ＡＮＯＶＡ］）。 （Ｃ）対照と比較しての５つの異なるタウオパチー群からの脳サンプル中のＣＴ ｐＳ３９６のレベル。平均濃度±ＳＥＭ：ＡＤ＝１７６９２±２０６０ｐｇ／ｍｌ、ＰｉＤ＝１２５４９±１７０１ｐｇ／ｍｌ、ＣＢＤ＝１１２０３±５６９８ｐｇ／ｍｌ、ＰＳＰ＝４７６６±７０６ｐｇ／ｍｌ、ＧＧＴ＝７８５７±３０９７ｐｇ／ｍｌ、Ｃｔｒｌ＝３９７±５４ｐｇ／ｍｌ。ＡＤにおけるＣＴ ｐＳ３９６濃度は、ＰＳＰ（ｐ＜０．０５）及びＣｔｒｌ（ｐ＜０．０１）における場合と比較して有意により高かった。同様に、ＰｉＤにおけるＣＴ ｐＳ３９６レベルは、対照（Ｃｔｒｌ）における場合よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５；クラスカル・ウォリス検定、続いてダンの多重比較検定）。 （Ｄ）ＭＲ／ＦＬ ｐＳ３９６レベルの比により、異なるタウオパチーが有意に分離された。ＡＤにおけるＭＲ／ＦＬ比は、ＰｉＤ、ＣＢＤ、ＰＳＰ、ＧＧＴ及び対照における場合と比較して有意に異なった（各々、ｐ＜０．０１）。さらに、ＰｉＤ患者におけるＭＲ／ＦＬの比は、ＣＢＤ、ＰＳＰ、ＧＧＴ及び対照とは有意に異なった（各々、ｐ＝０．０００１；一元配置分散分析、続いてダネット多重比較検定）。 （Ｅ）疾患群におけるＣＴ／ＦＬ ｐＳ３９６濃度の比における有意差。ＣＴ／ＦＬ ｐＳ３９６レベルは、ＡＤにおいて、ＣＢＤ、ＰＳＰ、ＧＧＴ及び対照と比較して有意に異なり（各々、ｐ＜０．０１）、またＰｉＤにおいて、ＣＢＤ、ＰＳＰ、ＧＧＴ及び対照と比較して有意に異なった（各々、ｐ＜０．０１；一元配置分散分析、続いてダネット多重比較検定）。３つ全てのアッセイでは、ヒトタウオパチー脳サンプル中のタウｐＳ３９６が測定される。結果によると、異なるタウオパチーにおけるｐＳ３９６タウの集団が、存在するタウ種に対して有意に変化することが示され、ｐＳ３９６及びタウ断片化の組み合わせ測定が、これらの疾患間を区別するための有望な手法であることが示唆される。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図3】アルツハイマー病のｒＴｇ４５１０トランスジェニックタウマウスモデルにおける高レベルのｐＳ３９６－Ｔａｕ４６（ＣＴ ｐＳ３９６）。（Ａ）異なる動物からのＣＳＦサンプルが、５０倍又は７５倍希釈時にＣＴ ｐＳ３９６アッセイで分析された。測定され、希釈調整された濃度の双方が示される。（Ｂ）ＣＴ ｐＳ３９６のＣＳＦレベルが（Ａ）で示される場合を含む、６つの異なる動物からの血漿サンプルの１０倍又は２０倍希釈物中のＣＴ ｐＳ３９６濃度。アッセイの検出限界＝１．５０ｐｇ／ｍｌ。ＣＴ ｐＳ３９６は、ｒＴｇ４５１０トランスジェニックタウマウス動物のＣＳＦ及び血漿中に存在する。ＣＴ ｐＳ３９６アッセイは、このモデルにおけるＣＴ ｐＳ３９６の処理における分子変化を試験するため、また薬剤有効性の前臨床評価のための重要なツールである。

【図4-1】図４ ヒトＣＳＦにおけるＣＴ ｐＳ３９６の測定。１５ｍｌのヒトＣＳＦにおけるＣＴ ｐＳ３９６シグナルが、スピン濾過（Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）－ＹＭ３装置を使用；表１に示される条件）、続いて５０ｍＭトリス ｐＨ７．５、１０％グリセロールのランニングバッファーにおけるＳ２００ １０／３００ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により濃縮された。溶出画分は、Ｓｉｍｏａ ＣＴ ｐＳ３９６で直接的に分析された。 （Ａ）水平軸に溶出体積及び垂直軸にＵＶ吸光度を示す、スピン濾過されたヒトＣＳＦのリテンテートの溶出特性。グリッド線は、分子量マーカーの溶出体積：青色デキストラン（空隙容量、２０００ｋＤａ；７．７６ｍｌ）、アルブミン（６６ｋＤａ；１３．４５ｍｌ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ；１６．２８ｍｌ）、チトクロム（１２．４ｋＤａ；２０．３９ｍｌ）、アプロチニン（６．５ｋＤａ；２４．３６ｍｌ）を示す。 （Ｂ）水平軸に溶出画分ＩＤ及び垂直軸にＵＶ吸光度を示す、スピン濃縮されたヒトＣＳＦのクロマトグラム。グリッド線は、（Ａ）で示される同じ分子量マーカーを指す。 （Ｃ）生の（未処理の）ＣＳＦ、スピン濾過されたＣＳＦ（リテンテート）、及び溶出されたＳＥＣ画分におけるＣＴ ｐＳ３９６の濃度。生のＣＳＦにおいてＣＴ ｐＳ３９６シグナルは検出されなかったが、シグナルを濃縮するため、前処理が必要であることが明らかである。ＣＴ ｐＳ３９６は、濾過生成物においても検出されなかった。しかし、ＣＴ ｐＳ３９６は、濾過生成物のＳＥＣ分画後、測定することができた。１２．０～１３．５ｍｌの溶出体積及び約６６ｋＤａの分子量に対応する画分Ｃ１、Ｃ２及びＣ３において、ＣＴ ｐＳ３９６の最高濃度が見出された（このサンプル中、各々、６．１、９．９、及び６．１ｐｇ／ｍｌ）。これらの特性は、１２．０～１３．５ｍｌで溶出する画分が、ｐＳ３９６及びＴａｕ４６エピトープ双方を含有するタウ単量体中で濃縮されることを示唆する。 ＣＴ ｐＳ３９６は、未処置のヒトＣＳＦ中で測定可能でない。しかし、スピン濾過及びＳＥＣによる前分析処理により、ＣＴ ｐＳ３９６シグナルが濃縮され、１２．０～１３．５ｍｌの最高濃度で溶出される。一貫した結果が、異なる性能及びモデル（表１）のスピンフィルターを使用し、ＣＳＦ開始体積を変更することにより（表１）、また１画分あたりの収集されたＳＥＣ溶出体積を変更することにより記録されている。 スピン濾過、それに続くＳＥＣ分画によるＣＳＦサンプルの逐次処理が、いずれかのステップの省略が大幅に低下した又は検出不能な量をもたらすことから、ＣＴ ｐＳ３９６シグナルの濃縮にとって必要である。

【図4-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0007】

サンプル中の異なる種類の分子を分析する際、伝統的なＥＬＩＳＡが長年にわたり使用されている。本発明は、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、球状グリア性タウオパチー及び慢性外傷性脳症などのタウオパチーと診断された患者からのサンプル中のタウ種を検出するための単一分子アレイアッセイ（Ｓｉｍｏａ）ＥＬＩＳＡ技術の使用を対象とする。

【0008】

本発明において、タウは、メチオニンが番号１である以下の配列のヒトタウである。

【化1】

【0009】

単一分子イムノアッセイの第１のステップでは、捕捉抗体が、サンプル中のタウ分子の希薄溶液を濃縮するために使用されることになる常磁性ビーズ（約２．７ｕｍの直径）の表面に付着される。ビオチン化検出抗体が混合物に添加され、捕捉及び検出器抗体は、サンプル中のタウに反応することが可能になる。非特異的なタンパク質結合を除去するため、混合物は洗浄されてもよい。その後、β－ガラクトシダーゼ標識ストレプトアビジンが添加され、それに任意選択的な洗浄ステップが続き、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ｂｅｔａ－Ｄ－ｇａｌｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）が添加される。反応混合物は、反応し、適切な装置で読み取り及び分析されてもよい蛍光生成物を生成することが可能になる。

【0010】

本発明の発明者によって開発されたアッセイは、捕捉抗体及びビオチン化検出器抗体といった２つの抗体に基づく。捕捉抗体は、実施例１に記載のような常磁性ビーズにコンジュゲートされる。これらは、タウのリン酸化（ｐ）Ｓ３９６に特異的である。かかる抗体の産生は、例えば国際公開第２０１７／００９３０８号パンフレットに開示されており、これらの抗体は、下の表１にさらに記載される。本発明の実施例では、使用されるｐＳ３９６特異抗体は、特許の国際公開第２０１８／０１１０７３号パンフレットからの「Ｃ１０－２ヒト化」と名付けられ、下の表２に記載される抗体である。

【0011】

【表1-1】

【0012】

【表1-2】

【0013】

【表1-3】

【0014】

【表1-4】

【0015】

【表2-1】

【0016】

【表2-2】

【0017】

【表2-3】

【0018】

【表2-4】

【0019】

【表2-5】

【0020】

【表2-6】

【0021】

【表2-7】

【0022】

【表2-8】

【0023】

【表2-9】

【0024】

【表2-10】

【0025】

【表2-11】

【0026】

【表2-12】

【0027】

【表2-13】

【0028】

使用される検出／又は検出器（本明細書で互換可能に用いられる）抗体は、実施例２に記載のようにビオチン化されており、タウのＣ末端、中央又はＮ末端領域にｐＳ３９６残基と異なる部位で結合してもよい。検出器抗体は、非リン酸化残基に結合してもよい。特に、タウ上のＣ末端のエピトープは、アミノ酸１～２０（例えば６～１８）であり、タウの中央領域は、アミノ酸１４０～１７０（例えば１５９～１６８）であり、且つタウのＮ末端は、４００～４４１（例えば４０４～４２１）である。実施例において、以下の抗体が使用される：
Ｔａｕ１２（＃８０６５０２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が使用され、タウのアミノ酸６～１８に結合し、検出抗体は、ＨＴ７（＃ＭＮ１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、中央領域１５９～１６８アミノ酸に結合し、且つＴａｕ４６（＃８０６６０１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、Ｃ末端領域アミノ酸４０４～４４１に結合する。

【0029】

異なるタウ種に対してｐＳ３９６を測定する３つのアッセイが開発されており（図１）；各々、抗ｐＳ３９６捕捉抗体が使用され、検出抗体を除いて他の全ての実験条件が共有されることは、以下に説明されている。
１．完全長ｐＳ３９６（ＦＬアッセイ）：このアッセイでは、Ｎ末端領域から広がるｐＳ３９６リン酸化タウ種が測定される。検出抗体のモノクローナルＴａｕ１２（＃８０６５０２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、タウのアミノ酸６～１８に結合する。
２．中央領域ｐＳ３９６（ＭＲアッセイ）：このアッセイでは、２つのエピトープ：ｐＳ３９６リン酸化及び中央領域の１５９～１６８アミノ酸を同時に保有しているタウ形態が測定される。検出抗体は、ＨＴ７（＃ＭＮ１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
３．Ｃ末端ｐＳ３９６（ＣＴアッセイ）：該アッセイは、最末端のカルボキシル末端領域（アミノ酸４０４～４４１）を有するｐＳ３９６リン酸化タウに特異的である。検出抗体は、Ｔａｕ４６（＃８０６６０１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）である。

【0030】

方法は、実施例４に記載の通り、
ａ．常磁性ビーズに付着されたｐＳ３９６に特異的な捕捉抗体をビオチン化検出抗体及びサンプルと混合するステップと、
ｂ．混合物を、抗体のサンプル中のタウへの結合を可能にするのに十分な時間でインキュベートするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｃ．任意選択的に、インキュベーション後、ステップｂ）における混合物を洗浄するステップと、
ｄ．ストレプトアビジンコンジュゲートβ－ガラクトシダーゼを添加し、前記ストレプトアビジンコンジュゲート及びビオチン化検出器抗体が反応することを可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｅ．任意選択的に、ステップｄ）後に得られた混合物を洗浄するステップと、
ｆ．レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドをステップｄ）又はｅ）における混合物に添加し、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシドの加水分解を可能にするステップと（例えば、１分、２分、３分若しくは５分又はそれ以上）、
ｇ．蛍光シグナルを読み取り、シグナルを標準と比較するステップと、
を含む。

【0031】

使用されるｐＳ３９６コンジュゲート抗体ビーズの量は通常、少なくとも１０００個のビーズ、例えば少なくとも１０，０００個、１００，０００個又はそれ以上のビーズである。サンプルは、哺乳動物からのＣＳＦ、血漿又は生体液サンプル、例えば、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺又は球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを患っているヒトからのヒトＣＳＦサンプルであってもよい。タウに関連するサンプルを、例えば実施例３に示されるようなスピン濾過カラム及びサイズ排除クロマトグラフィーの使用により濃縮することが有利な場合がある。

【0032】

個別に又は組み合わせて使用されるアッセイの結果は、実施例４に示される通り、アルツハイマー病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺及び球状グリア性タウオパチーなどのタウオパチーを診断又は鑑別するため、使用することが可能である。例えば、アルツハイマー病及びピック病を診断するため、ＣＴアッセイを使用することが可能である。アルツハイマー病を他のタウオパチー及び対照に対して鑑別するため、ＭＲ／ＦＬ比を比較することによりそれを使用可能であり、さらにピック病は、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、球状グリア性タウオパチー及び対照とは有意に異なった。アルツハイマー病は、他のタウオパチー及び対照に対して鑑別するため、ＣＴ／ＦＬ比を使用することにより使用可能であり、ピック病は、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺及び球状グリア性タウオパチー及び対照と比較して異なった。

【実施例】

【0033】

実験の詳細
実施例１：捕捉抗体（ｐＳ３９６）の常磁性ビーズへのコンジュゲーション
ｐＳ３９６抗体について、Ｕｌｔｒａｃｅｌ ５０Ｋスピン濾過カラム（＃ＵＦＣ５０５０９６，Ａｍｉｃｏｎ）を使用し、ビーズコンジュゲーションバッファー（ＢＣＢ；５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．２）に緩衝液交換した。フィルターを最初に、１４０００×ｇ、室温（ＲＴ）で５分間遠心分離し、フロースルーを廃棄することにより、４５０ｕｌのＢＣＢですすいだ。その後、１．６ｇ／Ｌの抗体を、１４０００×ｇ、ＲＴで５分間遠心分離することによりＢＣＢに緩衝液交換した。フロースルーを廃棄し、フィルターを収集管に戻した。ＢＣＢをリテンテートに添加し、体積を４５０ｕｌにし、同じ条件下で再遠心分離した。フロースルーを廃棄後、このステップを１回繰り返した。その後、フィルターを４０ｕｌのＢＣＢですすぎ、新しい収集管内に反転し、１０００×ｇ、ＲＴで２分間遠心分離することにより抗体を回収した。抗体の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ Ｌｉｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で評価し、使用まで４℃で貯蔵した。

【0034】

常磁性カルボキシル化シングルプレックスビーズ（＃１０３２０７，Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）をビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ；１×ＰＢＳ＋１％ツイーン２０）で３回、次いでＢＣＢで２回、磁気セパレーターを使用し、洗浄した。１．４×１０６個のビーズ／μＬの濃度のビーズを、０．３ｇ／Ｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（＃Ａ３５３９１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより活性化し、４℃で３０分間インキュベートした。その後、活性化されたビーズを氷冷ＢＣＢで１回洗浄し、上清を廃棄した。抗体（０．２ｇ／Ｌ）をビーズに添加し、混合物を振盪しながらＲＴで２時間インキュベートし、抗体のビーズへの結合を可能にした。振盪は常に、ＨｕｌａＭｉｘｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｍｉｘｅｒ（＃１５９２０Ｄ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、各ステップが５秒続く、軌道＝５ｒｐｍ、往復＝９０°、振動／休止＝５°という条件下で実施した。その後、上清を除去し、抗体コンジュゲートビーズをＢＷＢで２回洗浄した。反応を、ビーズブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）で、振盪しながらＲＴで１時間ブロッキングした。最後に、ビーズをＢＷＢで２回、次いでビーズ希釈剤（ＢＤ；５０ｍＭトリス ｐＨ７．８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０）で１回洗浄した。磁気セパレーターで上清を除去後、ビーズをＢＤに再懸濁し、使用まで４℃で貯蔵した。

【0035】

実施例２：検出抗体へのビオチンコンジュゲーション
検出抗体について、Ｕｌｔｒａｃｅｌ ５０Ｋスピン濾過カラム（＃ＵＦＣ５０５０９６，Ａｍｉｃｏｎ）で、ビオチン化反応緩衝液（ＢＲＢ；１００ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。４５０ｕｌのＢＲＢを１４０００×ｇ、ＲＴで５分間遠心分離することによりカラムを洗浄後、フロースルーを廃棄し、抗体をフィルターに移した。ＢＲＢを添加し、体積を４５０ｕｌにし、１４０００×ｇ、ＲＴで５分間遠心分離した。緩衝液交換はさらに２回繰り返し、各段階で、抗体体積をＢＲＢで４５０ｕｌにし、１４０００×ｇ、ＲＴで５分間遠心分離した。フィルターを４０ｕｌのＢＲＢですすぎ、新しい収集管内に反転し、１０００×ｇ、ＲＴで２分間遠心分離することにより抗体を回収した。抗体の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ Ｌｉｔｅを用いて評価した。４０倍過剰なＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（＃２１３２９，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体に添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ビオチン標識化前に実施の緩衝液交換プロセスを繰り返すことにより、遊離ビオチンを除去した。ビオチンコンジュゲート抗体を、使用まで４℃で貯蔵した。

【0036】

実施例３：サンプル及びキャリブレーターの解析前処理
適切な濃度のアッセイキャリブレーター（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（＃ＴＯ８－５０ＦＮ，ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）によりインビトロでリン酸化された組換えタウ４４１）を、分析前にストック濃度をアッセイ希釈剤（Ｔａｕ２．０希釈剤，＃１０１５５６，Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で希釈することにより調製した。品質管理サンプルは、アッセイ希釈剤で５００倍及び５０００倍に希釈したＴＢＳ可溶性ヒトアルツハイマー病脳抽出物を含む。

【0037】

トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）可溶性ヒト脳抽出物、ｒＴｇ４５１０トランスジェニックマウスＣＳＦ及び血漿サンプルを、Ｔａｕ２．０希釈剤で、図２及び図３並びにそれらのレジェンドに表される所望される濃度に希釈した。

【0038】

サンプルをスピン濾過カラムで濃縮し、Ｅｔｈａｎ ＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で稼動するＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラム（＃１７－５１７５－０１，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりリテンテートを分画することによって、ヒトＣＳＦ中のｐＳ３９６タウのレベルを濃縮した。ランニングバッファーは、５０ｍＭトリス ｐＨ７．５＋１０％グリセロールであった。Ｓｉｍｏａ ｐＳ３９６アッセイを用いて、収集画分を直接的に分析した。この方法は、異なる性能及び特性のスピン濾過カラムを使用して検証された（表１）。

【0039】

【表3】

【0040】

実施例４：単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）アッセイ
各ｐＳ３９６アッセイでは、Ｓｉｍｏａ ＨＤ－１機器（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で２ステッププロトコルを使用する。このアッセイ構成では、ｐＳ３９６抗体コーティングビーズ及びヘルパービーズ（＃１０３２０８，Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）の各々、１０００ビーズ／ｕｌからなる１００ｕｌのビーズ混合物を反応キュベット内に吸引する。その後、２０ｕｌのビオチン化検出抗体（２ｕｇ／ｍｌ）及び１００ｕｌの目的の分析物を添加し、反応混合物を４７ケイデンス（１ケイデンス＝４５秒）間インキュベートし、分析物と捕捉及び検出抗体との反応を可能にした。その後、ビーズを洗浄し、１００ｕｌの４５０ｐＭストレプトアビジンコンジュゲートβ－ガラクトシダーゼ（ＳＢＧ；＃１００４３９，Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を添加した。７ケイデンス間のさらなるインキュベーションとそれに続く洗浄の後、２５μｌのレゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ；＃１０３１５９，Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を添加した。ＲＧＰの加水分解をＳＢＧにより触媒し、蛍光生成物レゾルフィンを生成した。ビーズを２００，０００ウェルのディスク上に移し、各々は１個のビーズを収容するのに十分に大きい程度に過ぎなかった。余分なビーズを除去し、ディスク表面を密封し、イメージングを行った。蛍光シグナルをビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）に変換し、サンプル濃度を、既知のタンパク質濃度を用いて作成した４パラメーターロジスティック較正曲線から外挿した。

【0041】

アッセイのセットアップ
異なるタウ種に対してのｐＳ３９６を測定する３つのアッセイが開発されており（図１）；各々は、抗ｐＳ３９６捕捉抗体を使用し、以下に説明する、検出抗体を除く他の全ての実験条件を共有している。
１．完全長ｐＳ３９６（ＦＬアッセイ）：このアッセイでは、Ｎ末端領域から広がるｐＳ３９６リン酸化タウ種が測定される。検出抗体のモノクローナルＴａｕ１２（＃８０６５０２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、タウのアミノ酸６～１８に結合する。
２．中央領域ｐＳ３９６（ＭＲアッセイ）：このアッセイでは、２つのエピトープ：ｐＳ３９６リン酸化及び中央領域の１５９～１６８アミノ酸を同時に保有しているタウ形態が測定される。検出抗体は、ＨＴ７（＃ＭＮ１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
３．Ｃ末端ｐＳ３９６（ＣＴアッセイ）：該アッセイは、最末端のカルボキシル末端領域（アミノ酸４０４～４４１）を有するｐＳ３９６リン酸化タウに特異的である。検出抗体は、Ｔａｕ４６（＃８０６６０１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）である。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【配列表】

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【国際調査報告】