特表 2022-527196 生物流体からのタンパク質コロナ分析のための組成物、方法およびシステム、ならびにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-31

(54)【発明の名称】生物流体からのタンパク質コロナ分析のための組成物、方法およびシステム、ならびにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20220524BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021558505

(86)(22)【出願日】2020-03-24

(85)【翻訳文提出日】2021-11-18

(86)【国際出願番号】 US2020024426

(87)【国際公開番号】W WO2020198209

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/824,279

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/824,284

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521436957

【氏名又は名称】シアー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ， シャオヤン

(72)【発明者】

【氏名】マニング， ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ブルーム， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ヘスターバーグ， リンダル

(72)【発明者】

【氏名】トロイアーノ， グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】フィガ， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】リオウ， ホープ

(72)【発明者】

【氏名】ロシュディフェルドシ， シャディ

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045BB11

2G045DA36

2G045FB06

(57)【要約】

本開示は、生物流体の生体分子コロナ分析のための方法および組成物を提供する。生物流体は、生体分子コロナを形成するためにナノ粒子と接触させられ得、得られたコロナの組成が分析され得る。逐次的問い合わせによるコロナ分析のために生物流体を調製する方法もまた提供される。一部の態様では、第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップの際に、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料を逐次的に問い合わせる方法であって、
ａ）前記試料を第１の粒子タイプに接触させ、前記第１の粒子タイプを前記試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップであって、前記第１の生体分子コロナが、前記第１の粒子タイプと前記試料とのインキュベーションの際に形成し、前記第１の生体分子コロナがタンパク質を含む、ステップ；
ｂ）前記第１の生体分子コロナを構成する前記第１の粒子タイプを、前記試料から分離するステップ；
ｃ）前記試料を第２の粒子タイプに接触させ、前記第２の粒子タイプを前記試料と共にインキュベートして第２の生体分子コロナを形成するステップであって、前記第２の生体分子コロナが、前記第２の粒子タイプと前記試料とのインキュベーションの際に形成し、前記第２の生体分子コロナがタンパク質を含み、さらに、（ｉ）前記第１の粒子タイプおよび前記第２の粒子タイプが同じ粒子タイプである、または（ｉｉ）前記第１の粒子タイプおよび前記第２の粒子タイプが異なる、ステップ；
ｄ）前記第２の生体分子コロナを構成する前記第２の粒子タイプを、前記試料から分離するステップ；
ｅ）前記第１の生体分子コロナおよび前記第２の生体分子コロナをアッセイして、アッセイされた前記第１の生体分子コロナおよび前記第２の生体分子コロナに基づいて、前記試料中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記第１の粒子タイプを前記試料と共にインキュベートして前記第１の生体分子コロナを形成する前記ステップの際に、前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、
ａ）前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；および
ｂ）前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル
の第１の比である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第１の比である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第１の比である、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第１の比である、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対前記試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第１の比である、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

前記試料中の前記同じタンパク質の前記既知の濃度が、データベースから得られる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記試料中の複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、
ａ）総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；および
ｂ）総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル
の第２の比である、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記試料中の前記複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第２の比である、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記試料中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第２の比である、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記試料中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第２の比である、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記試料中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対前記試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第２の比である、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記試料中の前記同じタンパク質の前記既知の濃度が、データベースから得られる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ダイナミックレンジを圧縮させることが、前記第２の比と比較して減少した第１の比を含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記減少した第１の比が、前記第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の組成および濃度を決定する前記ステップまたは前記第２の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の組成および濃度を決定する前記ステップが、質量分析を実施するステップを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

ステップａ）、ｂ）およびｅ）を、１つまたは複数のさらなる粒子タイプを用いて反復して、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、前記第１の粒子タイプまたは前記第２の粒子タイプと同じである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、前記第１の粒子タイプとも、前記第２の粒子タイプとも、それらの組合せとも異なる、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナが、前記試料由来のタンパク質を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記第１の生体分子コロナ、前記第２の生体分子コロナ、前記１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、少なくとも１００種の別個のタンパク質を含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記第１の生体分子コロナ、前記第２の生体分子コロナ、前記１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１の生体分子コロナ、前記第２の生体分子コロナ、前記１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、異なる組成のタンパク質、異なる濃度のタンパク質サブセット、またはそれらの組合せを含む、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプを前記試料と共にインキュベートして１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップの際に、前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合の前記試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、
ａ）前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；および
ｂ）前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル
のさらなる比である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記１つまたは複数の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対するさらなる比である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記１つまたは複数の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対するさらなる比である、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記１つまたは複数の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含むさらなる比である、請求項２６に記載の方法。

【請求項31】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の前記ダイナミックレンジが、前記１つまたは複数の生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対前記試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含むさらなる比である、請求項２６に記載の方法。

【請求項32】

前記試料中の前記同じタンパク質の前記既知の濃度が、データベースから得られる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ダイナミックレンジを圧縮させることが、前記第２の比と比較して減少したさらなる比を含む、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記減少した第１の比が、前記第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記総タンパク質分析方法が、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによる前記試料中の前記複数のタンパク質の直接的定量化を含む、請求項２から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記試料が、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下の試料体積を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記試料が生体試料を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記生体試料が生物流体を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記生物流体が、血漿または血清である、請求項３８から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記生物流体が脳脊髄液である、請求項３８から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記第１の粒子タイプ、前記第２の粒子タイプ、前記１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、表１から選択される、請求項１９から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ステップａ）の前に前記試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を前記試料から除去するステップを含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記１つまたは複数のさらなる生体分子コロナがタンパク質を含む、請求項１９から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記第１の生体分子コロナ、前記第２の生体分子コロナ、前記１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１９から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記第１の粒子タイプ、前記第２の粒子タイプ、または前記１つもしくは複数のさらなる粒子タイプが、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なる、請求項１９から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記第１の粒子タイプおよび前記第２の粒子タイプが、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なり、前記第１の生体分子コロナが、前記第２の生体分子コロナと比較して、別個であるが重複するセットのタンパク質を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記複数のタンパク質の組成および前記複数のタンパク質のタンパク質の濃度が、前記第１の生体分子コロナおよび前記第２の生体分子コロナ中の前記別個であるが重複するセットのタンパク質に基づいて決定される、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記第１の粒子タイプ、前記第２の粒子タイプ、前記１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１９から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記第１の粒子タイプ、前記第２の粒子タイプ、前記１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、超常磁性粒子である、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記第１の粒子タイプ、前記第２の粒子タイプ、前記１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、表１から選択される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記第１の粒子タイプおよび前記第２の粒子タイプが同じ粒子タイプであり、前記第１の生体分子コロナおよび前記第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が同じである、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記第１の粒子タイプおよび前記第２の粒子タイプが異なり、前記第１の生体分子コロナおよび前記第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の７０％以下、８０％以下、９０％以下または９５％以下が同じである、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

複数の生物流体を分析するハイスループット方法であって、
ａ）前記複数の生物流体の第１の生物流体および第２の生物流体を、粒子タイプと接触させるステップ；
ｂ）第１の体積において、前記粒子タイプを、前記複数の生物流体の第１の生物流体から分離し、前記粒子タイプに対応する第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ；および
ｃ）第２の体積において、前記粒子タイプを、前記複数の生物流体の第２の生物流体から分離し、前記粒子タイプに対応する第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ
を含み、前記第１の生物流体および前記第２の生物流体が、異なる生物流体である、方法。

【請求項55】

前記複数の生物流体の生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記生物流体が、血漿または血清である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記生物流体が脳脊髄液である、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記粒子タイプを前記試料と接触させるステップの際に生体分子コロナが形成し、前記第１の生体分子コロナがタンパク質を含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記生体分子コロナが、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

ステップａ）の前に前記試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を前記試料から除去するステップを含む、請求項５４から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記粒子タイプが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５４から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記粒子タイプが超常磁性粒子である、請求項５４から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記粒子タイプが、表１から選択される、請求項５４から６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記分離するステップが、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

生物学的状態を同定するための訓練済みアルゴリズムを使用して、前記生体分子コロナ中の前記複数のタンパク質の組成および濃度を処理する、前記生物流体の生物学的状態を同定するステップをさらに含む、請求項３８から５３または５５から６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記生物流体が、対象から単離される、請求項３８から５３または５５から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記対象がヒトである、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が非ヒト動物である、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

前記対象が状態を有する、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記状態が疾患状態である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記疾患状態ががんである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記がんが、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がんまたは乳がんである、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記疾患状態がアルツハイマー病である、請求項７１に記載の方法。

【請求項75】

前記分離するステップが、磁気分離、カラムベースの分離、濾過、スピンカラムベースの分離、遠心分離、超遠心分離、密度もしくは勾配ベースの遠心分離、重力分離、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

生物流体を分析する方法であって、
ａ）生物流体収集管中で生物流体を粒子タイプと接触させるステップであって、前記血液収集管が、安定化試薬を含み、前記安定化試薬が、前記生物流体中の無細胞核酸分子を安定化する、ステップ；および
ｂ）前記生物流体および前記粒子タイプを前記生物流体収集管中でインキュベートするステップであって、前記粒子タイプへの前記生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、前記粒子タイプに結合したタンパク質を含む生体分子コロナを形成する、ステップ
を含み、
前記生体分子コロナが、前記粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した前記生物流体中でインキュベートして対照生体分子コロナを形成させた場合にも検出されるタンパク質の集団を含み；かつ
前記生物流体および前記粒子タイプが、約２０℃～約３５℃で前記生物流体収集管中でインキュベートされ、前記生体分子コロナのタンパク質の集団の５０％またはそれよりも多くが、前記対照生体分子コロナ中でも検出可能である
方法。

【請求項77】

前記生体分子コロナのタンパク質の前記集団の６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、または９０％もしくはそれよりも多くが、前記対照生体分子コロナ中でも検出可能である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

タンパク質の前記集団の少なくともサブセットが、前記粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した前記生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、請求項７６から７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

タンパク質の前記集団の少なくとも５％が、前記粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した前記生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

タンパク質の前記集団の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、前記粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した前記生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した前記生物流体中でインキュベートした場合よりもより低い検出限界で、前記生体分子コロナ中の前記タンパク質をアッセイするステップをさらに含む、請求項７６から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記インキュベートするステップが、室温でインキュベートすることを含む、請求項７６から８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記インキュベートするステップが、最大で１４日間、最大で１３日間、最大で１２日間、最大で１１日間、最大で１０日間、最大で９日間、最大で８日間、最大で７日間、最大で６日間、最大で５日間、最大で４日間または最大で３日間にわたってインキュベートすることを含む、請求項７６から８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記インキュベートするステップが、最大で１４日間にわたってインキュベートすることを含む、請求項７６から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記生体分子コロナが、前記対照生体分子コロナには存在しない独自のタンパク質を含む、請求項７６から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記生体分子コロナが、少なくとも１００種の別個のタンパク質、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む、請求項７６から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記粒子タイプが、１００種またはそれよりも多くの別個のタンパク質に結合する、請求項７６から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料を含む、請求項８６から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料である、請求項８６から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記粒子タイプを前記生物流体から分離するステップをさらに含む、請求項７６から８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

分離するステップが、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、請求項７６から９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記対照生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、請求項７６から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

タンパク質の組成および濃度を決定する前記ステップが、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーを含む、請求項７６から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記安定化試薬が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、防腐剤、またはそれらの組合せを含む、請求項７６から９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記代謝阻害剤が、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、１，３－ビスホスホグリセレート、３－ホスホグリセレート、２－ホスホグリセレート、ホスホエノールピルベート、ピルベートおよびグリセレートジヒドロキシアセテート、フッ化ナトリウム、またはＫ_２Ｃ_２Ｏ_４を含む、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記プロテアーゼ阻害剤が、アンチパイン、アプロチニン、キモスタチン、エラスタチナール、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＡＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、ダイズトリプシン阻害剤、インドール酢酸（ＩＡＡ）、Ｅ－６４、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、ＶｄＬＰＦＦＶｄＬ、１，１０－フェナントロリン、ホスホラミドン、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡ、ジプロチンＢ、アルファ－２－マクログロブリン、ライマメトリプシン阻害剤、膵プロテアーゼ阻害剤または卵白オボスタチン、卵白シスタチンを含む、請求項９５または請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記ホスファターゼ阻害剤が、カリクリンＡ、ノジュラリン、ＮＩＰＰ－１、ミクロシスチンＬＲ、トートマイシン、オカダ酸、カンタリジン、ミクロシスチンＬＲ、オカダ酸、フォストリエシン、トートマイシン、カンタリジン、エンドサール、ノジュラリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６／イムノフィリン複合体、シペルメトリン、デルタメトリン、フェンバレレート、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、デフォスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）ＤＭＨＶまたはオルトバナジン酸ナトリウムを含む、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記ヌクレアーゼ阻害剤が、ジエチルピロカーボネート、エタノール、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ホルムアミド、バナジル－リボヌクレオシド複合体、マカロイド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、プロテイナーゼＫ、ヘパリン、ヒドロキシルアミン－酸素－第二銅イオン、ベントナイト、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ－メルカプトエタノール、システイン、ジチオエリトリトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、またはＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｚｎ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｃａ^＋２もしくはＣｕ^＋２などの二価カチオンを含む、請求項９５から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記防腐剤が、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール－５，５－ジメチルヒダントイン、ジメチロール尿素、２－ブロモ－２－ニトロプロパン－１，３－ジオール、オキサゾリジン、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、５－ヒドロキシメトキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシポリ［メチレンオキシ］メチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタンまたは第４級アダマンタンを含む、請求項９５から９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記生物流体収集管が血液収集管である、請求項７６から１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記粒子タイプが、ナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項７６から１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記粒子タイプが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項７６から１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記粒子タイプが、表１から選択される、請求項７６から１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させるステップ、前記生物流体を前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプと共にインキュベートして、前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプへの前記生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプに結合したタンパク質を含む１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む、請求項７６から１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、前記粒子タイプの前記生体分子タンパク質中のタンパク質の前記集団と別個であるが重複するタンパク質の集団に結合する、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記生物流体を前記１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させる前記ステップが、前記生物流体を前記粒子タイプと接触させる前記ステップの後に行われる、請求項１０５から１０６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年３月２６日出願の６２／８２４，２７９号、表題「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＲＯＮＡ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＦＲＯＭ ＢＩＯＦＬＵＩＤＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」（代理人事件整理番号５３３４４－７１１．１０１）、および２０１９年３月２６日出願の６２／８２４，２８４号、表題「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＲＯＮＡ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」（代理人事件整理番号５３３４４－７１２．１０１）の利益を主張し、これらの出願の各々は、全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
生物流体は、その存在および濃度が対象の健康状態を示し得る多種多様なタンパク質を含む。高い存在量のタンパク質および他のタンパク質は、アッセイのシグナルを埋没させる可能性がある。タンパク質コロナは、タンパク質を含む生物学的流体にそれらが曝露された場合に、粒子上に形成し得る。タンパク質コロナについてのほとんどの研究は、血流由来の流体（血漿または血清）に対して実施されてきた。多様な生物流体と粒子との相互作用は、ほとんど未知である。

【0003】

分画は、生物学的流体をアッセイする場合に高い存在量のタンパク質のシグナルを低減させるために使用され得る。現在、タンパク質の単離および抽出を促進する種々の分画方法が存在する。これらの方法は、アッセイにおいてタンパク質の異なるプロファイルが検出されるのを可能にする。しかし、より多様なプロテオミクスの分析が、いまだ所望されている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
種々の態様では、本開示は、試料を逐次的に問い合わせる方法であって、ａ）試料を第１の粒子タイプに接触させ、第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップであって、第１の生体分子コロナが、第１の粒子タイプと試料とのインキュベーションの際に形成し、第１の生体分子コロナがタンパク質を含む、ステップ；ｂ）第１の生体分子コロナを構成する第１の粒子タイプを、試料から分離するステップ；ｃ）試料を第２の粒子タイプに接触させ、第２の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第２の生体分子コロナを形成するステップであって、第２の生体分子コロナが、第２の粒子タイプと試料とのインキュベーションの際に形成し、第２の生体分子コロナがタンパク質を含み、さらに、（ｉ）第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが同じ粒子タイプである、または（ｉｉ）第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが異なる、ステップ；ｄ）第２の生体分子コロナを構成する第２の粒子タイプを、試料から分離するステップ；ｅ）第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナをアッセイして、アッセイされた第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナに基づいて、試料中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップを含む、方法を提供する。

【0005】

一部の態様では、第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップの際に、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される。

【0006】

一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、ａ）第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル、の第１の比である。一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第１の比である。一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第１の比である。一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第１の比である。一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第１の比である。

【0007】

一部の態様では、試料中の同じタンパク質の既知の濃度は、データベースから得られる。一部の態様では、試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、ａ）総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル、の第２の比である。一部の態様では、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、試料中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第２の比である。一部の態様では、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第２の比である。

【0008】

一部の態様では、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第２の比である。一部の態様では、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第２の比である。一部の態様では、試料中の同じタンパク質の既知の濃度は、データベースから得られる。一部の態様では、ダイナミックレンジを圧縮させることは、第２の比と比較して減少した第１の比を含む。さらなる態様では、減少した第１の比は、第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である。

【0009】

一部の態様では、この方法は、第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む。一部の態様では、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップまたは第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップは、質量分析を実施するステップを含む。一部の態様では、この方法は、ステップａ）、ｂ）およびｅ）を、１つまたは複数のさらなる粒子タイプを用いて反復して、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる粒子タイプは、第１の粒子タイプまたは第２の粒子タイプと同じである。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる粒子タイプは、第１の粒子タイプとも、第２の粒子タイプとも、それらの組合せとも異なる。

【0010】

一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナは、試料由来のタンパク質を含む。一部の態様では、第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１００種の別個のタンパク質を含む。一部の態様では、第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む。

【0011】

一部の態様では、第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せは、異なる組成のタンパク質、異なる濃度のタンパク質サブセット、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる粒子タイプを試料と共にインキュベートして１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップの際に、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、総タンパク質分析方法によって測定した場合の試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される。

【0012】

一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、ａ）１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル、のさらなる比である。

【0013】

一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対するさらなる比である。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対するさらなる比である。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含むさらなる比である。

【0014】

一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジは、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含むさらなる比である。一部の態様では、試料中の同じタンパク質の既知の濃度は、データベースから得られる。一部の態様では、ダイナミックレンジを圧縮させることは、第２の比と比較して減少したさらなる比を含む。さらなる態様では、減少した第１の比は、第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である。

【0015】

一部の態様では、総タンパク質分析方法は、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによる試料中の複数のタンパク質の直接的定量化を含む。一部の態様では、試料は、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下の試料体積を含む。

【0016】

一部の態様では、試料は、生体試料を含む。一部の態様では、生体試料は、生物流体を含む。一部の態様では、生物流体は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄（ｄｕｃｔａｌ ｌａｖａｇｅ）、膣液、鼻液（ｎａｓａｌ ｆｌｕｉｄ）、耳液（ｅａｒ ｆｌｕｉｄ）、胃液、膵液、線維柱帯液（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液（ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液（aspirant）、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される。一部の態様では、生物流体は、血漿または血清である。一部の態様では、生物流体は、脳脊髄液である。一部の態様では、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せは、表１から選択される。

【0017】

一部の態様では、この方法は、ステップａ）の前に試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を試料から除去するステップをさらに含む。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナは、タンパク質を含む。一部の態様では、第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せは、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0018】

一部の態様では、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、または１つもしくは複数のさらなる粒子タイプは、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なる。一部の態様では、第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプは、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なり、第１の生体分子コロナは、第２の生体分子コロナと比較して、別個であるが重複するセットのタンパク質を含む。一部の態様では、複数のタンパク質の組成および複数のタンパク質のタンパク質の濃度は、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中の別個であるが重複するセットのタンパク質に基づいて決定される。

【0019】

一部の態様では、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様では、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せは、超常磁性粒子である。

【0020】

一部の態様では、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せは、表１から選択される。一部の態様では、第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプは同じ粒子タイプであり、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％は同じである。一部の態様では、第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプは異なり、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の７０％以下、８０％以下、９０％以下または９５％以下は同じである。

【0021】

種々の態様では、本開示は、複数の生物流体を分析するハイスループット方法であって、ａ）複数の生物流体の第１の生物流体および第２の生物流体を、粒子タイプと接触させるステップ；ｂ）第１の体積において、粒子タイプを、複数の生物流体の第１の生物流体から分離し、粒子タイプに対応する第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ；およびｃ）第２の体積において、粒子タイプを、複数の生物流体の第２の生物流体から分離し、粒子タイプに対応する第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ、を含み、第１の生物流体および第２の生物流体が、異なる生物流体である、方法を提供する。

【0022】

一部の態様では、複数の生物流体の生物流体は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される。さらなる態様では、生物流体は、血漿または血清である。他の態様では、生物流体は、脳脊髄液である。

【0023】

一部の態様では、粒子タイプを試料と接触させるステップの際に生体分子コロナが形成し、第１の生体分子コロナはタンパク質を含む。一部の態様では、生体分子コロナは、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、この方法は、ステップａ）の前に試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を試料から除去するステップをさらに含む。

【0024】

一部の態様では、粒子タイプは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様では、粒子タイプは、超常磁性粒子である。一部の態様では、粒子タイプは、表１から選択される。一部の態様では、分離するステップは、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む。一部の態様では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の態様では、この方法は、生物学的状態を同定する訓練済みアルゴリズムを使用して、生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を処理する、生物流体の生物学的状態を同定するステップをさらに含む。

【0025】

一部の態様では、生物流体は、対象から単離される。さらなる態様では、対象は、ヒトである。他の態様では、対象は、非ヒト動物である。一部の態様では、対象は、状態を有する。さらなる態様では、状態は、疾患状態である。なおさらなる態様では、疾患状態は、がんである。なおさらなる態様では、がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がんまたは乳がんである。他の態様では、疾患状態は、アルツハイマー病である。一部の態様では、分離するステップは、磁気分離、カラムベースの分離、濾過、スピンカラムベースの分離、遠心分離、超遠心分離、密度もしくは勾配ベースの遠心分離、重力分離、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0026】

種々の態様では、本開示は、生物流体を分析する方法であって、ａ）生物流体収集管中で生物流体を粒子タイプと接触させるステップであって、血液収集管が、安定化試薬を含み、安定化試薬が、生物流体中の無細胞核酸分子を安定化する、ステップ；およびｂ）生物流体および粒子タイプを生物流体収集管中でインキュベートして、粒子タイプへの生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、粒子タイプに結合したタンパク質を含む生体分子コロナを形成する、ステップ、を含み、生体分子コロナが、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートして対照生体分子コロナを形成させた場合にも検出されるタンパク質の集団を含み；かつ生物流体および粒子タイプが、約２０℃～約３５℃で生物流体収集管中でインキュベートされ、生体分子コロナのタンパク質の集団の５０％またはそれよりも多くが、対照生体分子コロナ中でも検出可能である、方法を提供する。

【0027】

一部の態様では、生体分子コロナのタンパク質の集団の６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多くまたは９０％もしくはそれよりも多くは、対照生体分子コロナ中でも検出可能である。一部の態様では、タンパク質の集団の少なくともサブセットは、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される。一部の態様では、タンパク質の集団の少なくとも５％は、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される。一部の態様では、タンパク質の集団の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％は、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される。

【0028】

一部の態様では、この方法は、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりもより低い検出限界で、生体分子コロナ中のタンパク質をアッセイするステップをさらに含む。一部の態様では、インキュベートするステップは、室温でインキュベートするステップを含む。一部の態様では、インキュベートするステップは、最大で１４日間、最大で１３日間、最大で１２日間、最大で１１日間、最大で１０日間、最大で９日間、最大で８日間、最大で７日間、最大で６日間、最大で５日間、最大で４日間または最大で３日間にわたってインキュベートするステップを含む。一部の態様では、インキュベートするステップは、最大で１４日間にわたってインキュベートするステップを含む。一部の態様では、生体分子コロナは、対照生体分子コロナには存在しない独自のタンパク質を含む。一部の態様では、生体分子コロナは、少なくとも１００種の別個のタンパク質、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む。一部の態様では、粒子タイプは、１００種またはそれよりも多くの別個のタンパク質に結合する。

【0029】

さらなる態様では、生物流体は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料を含む。さらなる態様では、生物流体は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料である。

【0030】

一部の態様では、この方法は、粒子タイプを生物流体から分離するステップをさらに含む。一部の態様では、分離するステップは、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む。一部の態様では、この方法は、生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む。一部の態様では、この方法は、対照生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む。一部の態様では、タンパク質の組成および濃度を決定するステップは、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーを含む。

【0031】

一部の態様では、安定化試薬は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、防腐剤、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、代謝阻害剤は、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、１，３－ビスホスホグリセレート、３－ホスホグリセレート、２－ホスホグリセレート、ホスホエノールピルベート、ピルベートおよびグリセレートジヒドロキシアセテート、フッ化ナトリウム、またはＫ_２Ｃ_２Ｏ_４を含む。一部の態様では、プロテアーゼ阻害剤は、アンチパイン、アプロチニン、キモスタチン、エラスタチナール、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＡＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、ダイズトリプシン阻害剤、インドール酢酸（ＩＡＡ）、Ｅ－６４、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、ＶｄＬＰＦＦＶｄＬ、１，１０－フェナントロリン、ホスホラミドン（phosphoramodon）、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡ、ジプロチンＢ、アルファ－２－マクログロブリン、ライマメトリプシン阻害剤、膵プロテアーゼ阻害剤または卵白オボスタチン（ｏｖｏｓｔａｔｉｎ）、卵白シスタチンを含む。

【0032】

一部の態様では、ホスファターゼ阻害剤は、カリクリンＡ、ノジュラリン、ＮＩＰＰ－１、ミクロシスチンＬＲ、トートマイシン、オカダ酸、カンタリジン、ミクロシスチンＬＲ、オカダ酸、フォストリエシン、トートマイシン、カンタリジン、エンドサール（ｅｎｄｏｔｈａｌｌ）、ノジュラリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６／イムノフィリン複合体、シペルメトリン、デルタメトリン、フェンバレレート、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、デフォスタチン（ｄｅｐｈｏｓｔａｔｉｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）ＤＭＨＶまたはオルトバナジン酸ナトリウムを含む。一部の態様では、ヌクレアーゼ阻害剤は、ジエチルピロカーボネート、エタノール、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ホルムアミド、バナジル－リボヌクレオシド複合体、マカロイド（ｍａｃａｌｏｉｄ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、プロテイナーゼＫ、ヘパリン、ヒドロキシルアミン－酸素－第二銅イオン、ベントナイト、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ－メルカプトエタノール、システイン、ジチオエリトリトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（phosphene）塩酸塩、またはＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｚｎ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｃａ^＋２もしくはＣｕ^＋２などの二価カチオンを含む。

【0033】

一部の態様では、防腐剤は、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール（dimethoylol）－５，５－ジメチルヒダントイン、ジメチロール尿素、２－ブロモ－２－ニトロプロパン－１，３－ジオール、オキサゾリジン、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、５－ヒドロキシメトキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン（5-hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octane）、５－ヒドロキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン（5-hydroxymethyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octane）、５－ヒドロキシポリ［メチレンオキシ］メチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン（5-hydroxypoly[methyleneoxy]methyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octane）または第４級アダマンタン（adamantine）を含む。一部の態様では、生物流体収集管は、血液収集管である。一部の態様では、粒子タイプは、ナノ粒子またはマイクロ粒子である。

【0034】

一部の態様では、粒子タイプは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様では、粒子タイプは、表１から選択される。

【0035】

一部の態様では、この方法は、生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させるステップ、生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと共にインキュベートして、１つまたは複数のさらなる粒子タイプへの生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、１つまたは複数のさらなる粒子タイプに結合したタンパク質を含む１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む。一部の態様では、１つまたは複数のさらなる粒子タイプは、粒子タイプの生体分子タンパク質中のタンパク質の集団と別個であるが重複するタンパク質の集団に結合する。一部の態様では、生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させるステップは、生物流体を粒子タイプと接触させるステップの後に行われる。

【0036】

本開示は、ナノ粒子と、ＣＳＦ、尿、涙および唾液などの多様な流体との相互作用からのタンパク質コロナを分析する。ＣＳＦ、尿、涙および唾液を含む種々の生物流体は、ナノ粒子と共にインキュベートするために使用される。得られたタンパク質コロナが分離され、質量分析を用いて分析された。本開示は、多様な生物流体由来のタンパク質がどのようにナノ粒子と相互作用するかを提供する。これらのタンパク質コロナから同定されたタンパク質（またはバイオマーカー）は、進歩した診断ツールならびに治療標的の発見において使用され得る。

【0037】

一部の態様では、本開示は、複数の生物流体を分析する方法であって、（ａ）複数の生物流体の各生物流体を別々にナノ粒子と接触させるステップ；（ｂ）第１のナノ粒子を単離し、複数の生物流体の第１の生物流体に対応する第１のタンパク質コロナを分析するステップ；および（ｃ）第２のナノ粒子を単離し、複数の生物流体の第２の生物流体に対応する第２のタンパク質コロナを分析するステップ、を含み、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）が同時に行われる、方法を提供する。

【0038】

一部の実施形態では、この方法は、複数の生物流体を第３のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、複数の生物流体を第４のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、複数の生物流体を第５のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１のナノ粒子および第２のナノ粒子は同じである。

【0039】

一部の実施形態では、この方法は、複数の生物流体を最大で１０の異なるナノ粒子と接触させるステップをさらに含む。

【0040】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質、ポリマー、金属、またはそれらの任意の組合せから選択される材料で作製される。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＳ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡまたはＰＶＰを含む。一部の実施形態では、脂質は、ＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＧまたはＤＰＰＧを含む。一部の実施形態では、金属は、酸化鉄、金または銀を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、正の表面電荷を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、負の表面電荷を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、中性の表面電荷を含む。

【0041】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、１～４００ｎｍのサイズを含む。

【0042】

一部の実施形態では、生物流体は、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙または唾液を含む。

【0043】

一部の実施形態では、この方法は、第１のタンパク質コロナを、第１の生物流体を第１のナノ粒子と接触させることによって同定された第１の対照タンパク質コロナと比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、第２のタンパク質コロナを、第２の生物流体を第２のナノ粒子と接触させることによって同定された第２の対照タンパク質コロナと比較するステップをさらに含む。

【0044】

一部の実施形態では、この方法は、第１のタンパク質コロナを第１の生物学的状態に相関させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、第２のタンパク質コロナを第２の生物学的状態に相関させるステップをさらに含む。

【0045】

本開示は、多様なプロテオミクスを分析するための方法およびシステムを提供する。本明細書で開示されるように、豊富なタンパク質は、分画またはナノ粒子枯渇によって最初に除去され、それにより、枯渇された試料を生成する。次いで、枯渇された試料は、ナノ粒子と共にインキュベートされ、これが、高親和性の低い豊富さのタンパク質とのタンパク質コロナの形成をもたらす。本明細書で開示される方法およびシステムは、進歩した診断ツールならびに治療標的の発見において使用され得る、多様なタンパク質コロナプロファイルを提供した。

【0046】

一部の態様では、本開示は、対象の試料の生物学的状態を同定する方法であって、試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートし、それにより、枯渇された試料を生成するステップ；枯渇された試料を第１のナノ粒子と共にインキュベートして、タンパク質コロナを生成するステップ；第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナ中のタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップ；および訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップを含む、方法を提供する。

【0047】

一部の実施形態では、試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートするステップは、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約３０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から抽出するステップを含む。一部の実施形態では、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約３０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から抽出するステップは、高い存在量のタンパク質の少なくとも約８０％を試料から除去する。

【0048】

一部の実施形態では、この方法は、枯渇ナノ粒子に関連したタンパク質コロナを分析するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートするステップは、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約６０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から少なくとも２回抽出するステップを含む。一部の実施形態では、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約６０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から少なくとも２回除去するステップは、高い存在量のタンパク質の９９％を除去する。

【0049】

一部の実施形態では、枯渇ナノ粒子は、第１のナノ粒子と比較して、少なくとも１つの異なる物理化学的特性を含む。異なる物理化学的特性は、サイズ、表面電荷または化学的部分を含み得る。

【0050】

一部の実施形態では、タンパク質データを処理するステップは、タンパク質コロナを分析するステップ、枯渇前に試料を分析するステップ、または枯渇された試料を分析するステップを含む。

【0051】

一部の態様では、本開示は、対象由来のタンパク質試料の生物学的状態を同定する方法であって、タンパク質試料を分画し、それにより、タンパク質試料中のタンパク質サブセットを含む分画された試料を生成するステップ；枯渇された試料を第１のナノ粒子と共にインキュベートして、タンパク質コロナを生成するステップ；第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナのタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップ；および訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップを含み、試料を分画するステップが、コーン法、カラムクロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、濾過、限外濾過および低温沈殿（ｃｒｙｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）からなる群から選択される方法を用いて高い存在量のタンパク質を分離するステップを含む、方法を提供する。

【0052】

一部の実施形態では、タンパク質データを処理するステップは、タンパク質コロナを分析するステップ、分画前にタンパク質試料を分析するステップ、または分画された試料を分析するステップを含む。

【0053】

本明細書で開示される方法についての一部の実施形態では、枯渇された試料中の第１のナノ粒子の濃度は、１～５０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナ中のタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップは、タンパク質コロナ中の各独自のタンパク質の濃度を決定するステップおよびタンパク質コロナ中の各独自のタンパク質の濃度を生物学的状態に相関させるステップを含む。一部の実施形態では、訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップは、生物学的状態を生体分子フィンガープリントに関連させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、血漿または血清である。

【0054】

一部の態様では、本開示は、生体試料をアッセイするための方法であって、（ａ）タンパク質を含む複数の生体分子を含む生体試料を得るステップ；（ｂ）サイズ、電荷、疎水性、構造および親和性からなる群から選択される１つまたは複数の特色に基づいて前記生体試料を富化して、処理された生体試料を得るステップ；（ｃ）１つまたは複数のナノ粒子の助けにより、少なくとも生体分子の第１のサブセットおよび生体分子の第２のサブセットを、（ｂ）の前記処理された生体試料から生成するステップであって、生体分子の前記第１のサブセットが前記１つまたは複数のナノ粒子に関連し、生体分子の前記第２のサブセットが前記１つまたは複数のナノ粒子に関連しない、ステップ；ならびに（ｄ）少なくとも生体分子の前記第１のサブセットまたは生体分子の前記第２のサブセットに対して、１つまたは複数のアッセイを別々に実施するステップを含む、方法を提供する。

【0055】

一部の実施形態では、この方法は、（ｅ）生体分子の前記第１のサブセットを生体分子の前記第２のサブセットから単離するステップをさらに含む。

【0056】

一部の実施形態では、１つまたは複数のアッセイは、質量分析および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアッセイは、質量分析を含む。

【0057】

一部の実施形態では、前記生体試料を富化するステップは、前記処理された生体試料を得るための分画を含む。一部の実施形態では、分画は、コーン法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、濾過、限外濾過および低温沈殿からなる群から選択される方法を用いて高い存在量のタンパク質を分離するステップを含む。一部の実施形態では、前記生体試料を富化して、前記処理された生体試料を得るステップは、１種または複数のタンパク質を枯渇させるステップを含む。

【0058】

一部の実施形態では、（ｂ）において、１つまたは複数の枯渇ナノ粒子が、前記処理された生体試料を得るために使用される。一部の実施形態では、（ｂ）の１つまたは複数の枯渇ナノ粒子は、（ｃ）の前記１つまたは複数のナノ粒子とは異なる。

【0059】

一部の実施形態では、１つまたは複数のアッセイが、前記第１のサブセットに対して実施され、このアッセイはＥＬＩＳＡである。

【0060】

一部の実施形態では、生体試料は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙、唾液、全血、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝周囲滲出液（ｐｅｒｉｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、精液、前立腺液、痰、滑液、糞便物質、線維柱帯液、気管支洗浄、スワビングからの流体、および気管支吸引液からなる群から選択される生物流体である。

【0061】

一部の実施形態では、１つまたは複数のアッセイは、プロテオミクスデータを生じ、前記プロテオミクスデータを処理して生物学的状態を予測するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記プロテオミクスデータを処理するステップは、訓練済みアルゴリズムの使用を含み、この訓練済みアルゴリズムは、生体試料の独立したセットを使用して訓練済みである。

【0062】

一部の実施形態では、生体分子の第１のサブセットは、前記１つまたは複数のナノ粒子とのインキュベーションの際に、前記１つまたは複数のナノ粒子に関連して、タンパク質コロナを形成する。

【0063】

一部の実施形態では、生体試料は、（ａ）の前に枯渇される。

【0064】

一部の実施形態では、生体分子の第１のサブセットおよび生体分子の前記第２のサブセットは、タンパク質を含む。
参照による組み込み

【0065】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照によって組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0066】

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を伴うこの特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の納付により、特許庁によって提供される。本開示の新規特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本開示の特色および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0067】

【図1】図１は、異なる脳脊髄液（「ＣＳＦ」）試料中の同定されたタンパク質の総数を示す。１０個の個々のＣＳＦ試料のセットを、Ｐ３９と接触させて、質量分析的分析について１０個のタンパク質コロナを創出した。同定された独自のタンパク質の総数を、各試料について計数した。

【0068】

【図2-1】図２Ａおよび図２Ｂは、ＣＳＦタンパク質コロナおよび血漿／血清タンパク質コロナのヒートマップクラスタリングが、２つのタイプの試料の良好な分離を実証し、ＣＳＦおよび血漿／血清について別々のプロファイルが観察されたことを示す。血清または血漿タンパク質コロナの４つの試料を、ヒートマップの左の４つのノード上にクラスタリングした。全てのＣＳＦタンパク質コロナを、ヒートマップの右側にクラスタリングした。

【図2-2】同上。

【0069】

【図3】図３は、ＣＳＦタンパク質コロナおよび血漿タンパク質コロナに関連するスペクトル計数を示す。示されるタンパク質は、神経学的疾患との公知の関連を有する。血漿タンパク質コロナについてのスペクトル計数は、列挙された多くのタンパク質について、ｘ軸に沿って下落する（中抜きの赤丸で示される）。ＣＳＦ血漿タンパク質コロナについてのスペクトル計数は、塗りつぶした黒点で示される。

【0070】

【図4】図４は、異なる粒子に由来するＣＳＦタンパク質コロナ中の同定されたタンパク質の総数を示す。プールされたＣＳＦ試料を、全ての粒子に使用した。１０００種よりも多くの独自のタンパク質が、全ての粒子を用いて同定された。

【0071】

【図5】図５は、異なる尿試料中の同定されたタンパク質の総数を示す。１０個の個々の尿試料（Ｕ１～Ｕ１０）および１つの対照血漿試料（ＰＣ）のセットを、Ｐ３９粒子と相互作用させて、質量分析的分析から１１個のタンパク質プロファイルを創出した。各尿試料において、尿中の同定されたタンパク質の総数は、血漿試料中の同定されたタンパク質の総数よりも大きかった。

【0072】

【図6】図６Ａおよび図６Ｂは、粒子Ｐ３９、ＨＸ４２およびＨＸ５６に由来するタンパク質コロナの多重化測定から同定されたタンパク質を示す。ＴＥ緩衝液で５×希釈したプールされた血漿試料を、粒子および粒子組合せについて、この実験で使用した。図６Ａは、異なる条件を用いて同定されたタンパク質の総数を示す。単一粒子タンパク質コロナ（Ｐ３９、ＨＸ４２およびＨＸ５６）を用いて、２３４、３０３および３５３種の独自のタンパク質が、３つの粒子についてそれぞれ同定され得る。全ての粒子を別々に実行した場合、「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６」でラベルされる柱に示されるように、合計４１１種の独自のタンパク質が同定された。より高い濃度（「３ＮＰ＿８」、８ｍｇ／ｍＬの最終総ＮＰ濃度）およびより低い濃度（「３ＮＰ＿３」、３ｍｇ／ｍＬの最終総ＮＰ濃度）での粒子混合を用いて、３０５および２８４種の独自のタンパク質が同定された。３つ全てのタンパク質コロナの消化後混合（「３ＮＰ＿ＰＭ」）を用いて、３０３種の独自のタンパク質が同定された。図６Ｂは、別々に実行した粒子（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６」）、粒子混合（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６ ＮＰ混合」）および消化後混合（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６消化後混合」）の間でのタンパク質の重複を示す。

【0073】

【図7-1】図７Ａは、生物流体中の広範なプロテオームを示す。これは、広い問い合わせが困難でありかつ遅いことを示す。タンパク質を、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるGeyer, et al. Mol Syst Biol 13, 942-15 (2017)に記載されるように、Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから抽出した血漿または血清から同定されたタンパク質の濃度に基づいてランク付けする。図７Ｂは、本開示の粒子バイオセンサー（図７ＢのＸ軸ラベル上および右側の注釈中に列挙される）が、深度、幅および効率を伴ってプロテオームを問い合わせることができることを示す。各点は、対応する粒子のコロナ中の同定されたタンパク質、および文献中に見出されるそのタンパク質の血漿濃度を示す。タンパク質は、いくつかの異なる粒子タイプのタンパク質コロナ中で、広範な濃度で同定され得る。粒子バイオセンサーは、その広いダイナミックレンジにわたって、プロテオームを迅速に問い合わせる（例えば、約０．００１ｕｇ／ｍｌ～ほとんど１０^５μｇ／ｍｌの濃度で存在するタンパク質をアッセイすることによって）。

【図7-2】同上。

【0074】

【図8-1】図８Ａ～図８Ｇは、本明細書で開示される枯渇方法のための種々のワークフローを例示する。図８Ａは、粒子を用いた試料の逐次的問い合わせのためのワークフローを例示する。試料は、同じまたは異なる粒子タイプを使用して、反復して問い合わせされ得る。図８Ｂは、第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。図８Ｃは、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプおよび第３の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。図８Ｄは、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、第３の粒子タイプおよび第４の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。図８Ｅは、１回目および２回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。図８Ｆは、１回目、２回目および３回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。図８Ｇは、１回目、２回目、３回目および４回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【図8-4】同上。

【図8-5】同上。

【図8-6】同上。

【図8-7】同上。

【0075】

【図9】図９は、粒子を用いて逐次的に問い合わせされた血漿試料のゲルを示す。試料を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９コロナ１）。上清を、２回目および３回目に、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を毎回抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９コロナ２およびＰ３９コロナ３）。次いで、上清を、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９およびＨＸ－４２コロナ４）。それとは別に、試料を、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２コロナ１）。上清を、２回目および３回目に、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を毎回抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２コロナ２およびＨＸ－４２コロナ３）。次いで、上清を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２およびＰ３９コロナ４）。分離された粒子を、８Ｍ尿素で処理してタンパク質を粒子から放出させ、ゲル上で泳動した。８Ｍ尿素で変性させた血漿（ＨＰ１尿素）を、対照として泳動した。

【0076】

【図10】図１０は、ゲル画像に基づいて、未枯渇のおよび枯渇された血漿に由来するタンパク質コロナが、粒子に結合した異なるタンパク質を有したことを示す。未枯渇のまたは枯渇された血漿試料を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、タンパク質コロナをアッセイした。赤の矢印は、未枯渇の血漿試料対枯渇された血漿試料に由来するタンパク質コロナ中で異なるタンパク質（バンドによって示される）を示す。粒子を８Ｍ尿素で処理してタンパク質を粒子から放出させ、ゲル上で泳動した。

【0077】

【図11】図１１は、９つの異なる粒子でアッセイした単一の滑液（ＳＦ）試料からのコロナ分析実験結果を示す。具体的な粒子処理は、ｘ軸上に示される。コロナ分析（「プロテオグラフ（Ｐｒｏｔｅｏｇｒａｐｈ）」）アッセイを、対照として、粒子と接触させていない滑液（「ニート（ｎｅａｔ）ＳＦ」）を用いても実行した。９つ全ての粒子によって同定された独自のタンパク質の数もまたプロットした（「全てのＮＰ」）。

【0078】

【図12】図１２は、粒子を用いてアッセイした２つのタイプの試料についてのコロナ分析実験結果を示す。細針吸引（ＦＮＡ）試料を、２５Ｇ針を備えた１ｍＬシリンジを使用して調製した。ＦＮＡ試料を、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍ－ＰＥＲ）を用いて溶解させ、コロナ分析前にＴＥ緩衝液へと緩衝液交換した。ＦＮＡによって提供される小さい質量に起因して、単一の粒子（Ｐ－０３９）を使用してＦＮＡ－コロナを評価した。組織試料もまたＭ－ＰＥＲを用いて溶解させ、コロナ分析前にＴＥ緩衝液へと緩衝液交換した。１００μＬの組織試料を、１００μＬの粒子と共にインキュベートして、組織－粒子コロナを形成した。ペプチドを、１時間の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）勾配を用いて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓ機器上で流した。コロナ分析を、対照として、粒子と接触させていないニート組織試料（「組織ニート」）に対しても実施した。

【0079】

【図13】図１３は、粒子を用いてアッセイした血漿および血清試料の一致したペアからのコロナ分析実験結果を示す。５×希釈の血漿および血清の両方（それぞれ、「血漿５×」および「血清５×」）ならびに未希釈の血漿および血清（それぞれ、「未希釈の血漿」および「未希釈の血清」）を試験した。各粒子処理についての棒は、左から右に、血漿５×、血漿ニート、血清５×、血清ニートおよび枯渇された血漿に対応する。さらに、血漿試料のアリコートを、ＩｇＹ１４およびＳｕｐｅｒｍｉｘカラムを用いて徹底的に枯渇させ、ニート試料および希釈された試料を用いて試験した。各試料を、別々のウェル中で、７つの粒子の各々に対してアッセイした。粒子なしの試料のセット（「ＮＰなし」）もまた対照として試験した。

【0080】

【図14】図１４は、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血液試料（「ＥＤＴＡ」）をＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料（「ＳＴＲＥＣＫ」）と比較する実験の結果を示す。Ｓｔｒｅｃｋ試料処理を、周囲温度での試料の一晩出荷をシミュレートするように設計した。回収されたペプチド質量の分析を、３人の患者から収集した血液試料（＃１、＃２および＃３）に対して実施した。各試料を、粒子を用いてアッセイし（「Ｐ３９コロナ」）、粒子を用いずにアッセイした（「ニート血漿」）。棒の高さは、各試料中の回収された平均タンパク質質量を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、ペプチド収量における差異は観察されなかった。

【0081】

【図15】図１５は、図１４でアッセイした試料に対して実施したコロナ分析実験によって同定されたタンパク質の平均数を示す。棒の高さは、各試料中の同定されたタンパク質の平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、同定されたタンパク質の数における差異は観察されなかった。

【0082】

【図16】図１６は、図１４～図１５でアッセイした試料に対して実施したコロナ分析実験によって検出されたペプチドの平均数を示す。棒の高さは、各試料中の検出されたペプチドの平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、同定されたペプチドの数における差異は観察されなかった。

【0083】

【図17】図１７は、図１４～図１６でアッセイした試料に対して実施したコロナ分析実験によって同定された特色の平均数を示す。棒の高さは、各試料中の同定された特色の平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、特色の数における差異は観察されなかった。

【0084】

【図18】図１８は、図１４～図１７に示される実験結果の概要を示す。円は、示された条件下で各試料において同定されたタンパク質を示す。円の重複する領域は、対応するＥＤＴＡ試料およびＳｔｒｅｃｋ試料の両方において同定されたタンパク質を示す。円の重複しない領域は、対応する条件下でアッセイしたＥＤＴＡ試料のみまたはＳｔｒｅｃｋ試料のみにおいて同定されたタンパク質を示す。各対中の左側に位置する円は、ＥＤＴＡ試料を示し、各対中の右側に位置する円は、Ｓｔｒｅｃｋ試料を示す。

【0085】

【図19】図１９は、図１４～図１８でアッセイした各患者試料中のコロナ分析によって同定された選択されたタンパク質タイプの個々のタンパク質の数を示す。粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料のみ（「Ｓｔｒｅｃｋ」）または粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料のみ（「ＥＤＴＡ」）において３つの患者試料の各々中の同定された選択タンパク質タイプのタンパク質の数がプロットされる。粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料および粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料の両方（「重複」）において３つの患者試料の各々中の同定された選択されたタンパク質タイプのタンパク質の数もまたプロットされる。

【0086】

【図20】図２０は、図１４～図１９でアッセイした各試料についてのタンパク質群強度の分布を示す。

【0087】

【図21】図２１は、図１４～図２０でアッセイした各試料についてのタンパク質群強度のパーセント変動係数（％ＣＶ）を示す。

【0088】

【図22】図２２Ａおよび図２２Ｂは、図１４～図２１で粒子の存在下でアッセイした各試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示す。各円の重複する領域中の数字は、重複する円によって示される各試料中の同定されたタンパク質を示す。図２２Ａは、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した各患者試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示し、図２２Ｂは、Ｓｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した各患者試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示す。

【0089】

【図23】図２３は、図１４～図２２でアッセイした各試料についての、図２１でプロットしたようなタンパク質群強度の変動係数（ＣＶ）を示す。

【0090】

【図24】図２４は、図１４～図２３においてＳｔｒｅｃｋ血液収集管およびＥＤＴＡ血液収集管の両方中に収集した試料中の同定された共通するタンパク質群の強度のプロットを示す。Ｓｔｒｅｃｋ試料のタンパク質群強度が、ｘ軸上にプロットされる。ＥＤＴＡ試料のタンパク質群強度が、ｙ軸上にプロットされる。患者試料＃１（上のプロット）、＃２（中央のプロット）および＃３（下のプロット）についてのタンパク質群強度が、粒子の存在下（左のプロット、「タイプ＝Ｐ３９コロナ」）または非存在下（右のプロット、「タイプ＝ニート血漿」）でアッセイしたいずれかの試料についてプロットされる。線形フィットのＲ^２値（「Ｒｓｑ」）が、各プロットの右下隅に提供される。

【0091】

【図25】図２５Ａおよび図２５Ｂは、図１４～図２４においてＳｔｒｅｃｋ血液収集管およびＥＤＴＡ血液収集管の両方中に収集した試料中の同定されたタンパク質群の数を示す。図２５Ａは、各試料中で同定された少なくとも１つの血漿タンパク質を含むタンパク質群の数を示す。図２５Ｂは、各試料中で同定された少なくとも１つの血漿タンパク質を含まない、各試料中の同定されたタンパク質群の数を示す。血漿タンパク質としてのタンパク質の分類は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKeshishian et al. (Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015))によって同定された５，３０４種の血漿タンパク質のセットに基づいた。

【0092】

【図26】図２６は、ＥＤＴＡ試料収集管（「ＥＤＴＡ」）またはＳｔｒｅｃｋ試料収集管（「Ｓｔｒｅｃｋ」）中に収集した生体試料中の実験的に同定されたタンパク質の重複を示す。

【0093】

【図27】図２７は、ＥＤＴＡ試料収集管中に収集した試料およびＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した試料中の同定されたタンパク質の平均タンパク質群強度を示す。タンパク質群強度を、Ｃａｒｒ血漿プロテオームデータベース中に存在し、ＥＤＴＡ試料収集管中に収集した試料（ｙ軸）およびＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した試料（ｘ軸）において分析したものの両方において同定されたタンパク質についてプロットした。

【0094】

【図28】図２８Ａおよび図２８Ｂは、図２７で同定された１１５個のタンパク質群間のＳｐｅａｒｍａｎ（図２８Ａ）およびＰｅａｒｓｏｎ（図２８Ｂ）相関係数を示す。

【0095】

【図29】図２９は、本明細書で提供される方法を実装するようにプログラムされたまたは他の方法で構成されたコンピュータシステムを示す。

【0096】

【図30】図３０Ａ～図３０Ｃは、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血漿試料（ｘ軸）とＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した血漿試料（ｙ軸）との間の、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した３つのタンパク質濃度の相関を示す。図３０Ａは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の相関を示す。図３０Ｂは、カルグラニュリンＡおよびＢヘテロダイマー（「Ｓ１００」）の相関を示す。図３０Ｃは、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５（「ＣＡ１２５」）の相関を示す。

【0097】

【図31】図３１は、ＥＤＴＡ血液収集管またはＳｔｒｅｃｋ血液収集管のいずれか中に収集した血漿試料中のＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質濃度の、ＣＲＰ（左の２つの箱ひげ）、Ｓ１００（中央の２つの箱ひげ）およびＣＡ１２５（右の２つの箱ひげ）のパーセント変動係数（％ＣＶ）を示す。

【0098】

【図32】図３２は、ＣＲＰ（左のプロット）、Ｓ１００（中央のプロット）およびＣＡ１２５（右のプロット）について、ＥＤＴＡ血液収集管またはＳｔｒｅｃｋ血液収集管のいずれか中に収集した試料中のＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質濃度における一致したペアの差異を示す。

【0099】

【図33】図３３は、ＥＤＴＡ試料収集管（左）または核酸安定化剤を含む試料収集管（右）中に収集した生体試料を処理する方法の例を例示する。

【0100】

【図34】図３４は、粒子コロナタンパク質および血漿タンパク質の最大強度の、同じタンパク質の公開された濃度との相関を示す。青でプロットした線は、データに対する線形回帰モデルであり、影付きの領域は、モデルフィットの標準誤差を示す。粒子（「Ｓ－００３」、「Ｓ－００７」および「Ｓ－０１１」）を用いてアッセイした試料のダイナミックレンジは、線形フィットの傾きにおける減少によって示されるように、粒子を用いてアッセイしなかった血漿試料（「血漿」）と比較して、圧縮されたダイナミックレンジを示した。各プロットの傾きは、それぞれ、粒子を用いない血漿、Ｓ－００３粒子を用いた血漿、Ｓ－００７粒子を用いた血漿およびＳ－０１１粒子を用いた血漿について、０．４７、０．１９、０．２２および０．１８である。

【0101】

【図35】図３５は、粒子コロナ形成なしの質量分析と比較した、質量分析を用いたタンパク質コロナ分析アッセイのダイナミックレンジ圧縮を示す。図３４でアッセイした血漿試料中の粒子コロナ中の同定された共通するタンパク質のタンパク質強度（「ナノ粒子ＭＳ ｌｎ強度」）が、粒子を用いない血漿の質量分析によって同定されたタンパク質強度（「血漿ＭＳ ｌｎ強度」）に対してプロットされる。色が最も薄い点線は、１の傾きを示し、粒子を用いない質量分析のダイナミックレンジを示す。タンパク質強度に対する線形フィットの傾きは、それぞれ、Ｓ－００３、Ｓ－００７およびＳ－０１１粒子について、０．１２、０．３６および０．０９３であった。灰色のエリアは、回帰フィットの標準誤差領域を示す。

【発明を実施するための形態】

【0102】

詳細な説明
種々の生体試料と共にインキュベートされ得る粒子の組成物が、本明細書で提供される。種々の粒子タイプが、単独で、または組み合わせて、タンパク質コロナを形成する粒子表面への結合に基づいて前記生体試料中に存在するタンパク質を分析するために、広範な生体試料と共にインキュベートされ得る。単一の粒子タイプが、特定の生体試料中のタンパク質をアッセイするために使用され得、または多数の粒子タイプが、生体試料中のタンパク質を一緒にアッセイするために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、生体試料を複数の粒子と接触させ、生体試料を複数の粒子と共にインキュベートしてタンパク質コロナを形成し、粒子を生体試料から分離し、タンパク質コロナを分析してタンパク質コロナの組成を決定することによって、生体試料（例えば、生物流体）に対して実施され得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナを分析することは、質量分析を使用して実施される。複数の粒子を用いた試料の問い合わせと、その後の、複数の粒子上に形成されたタンパク質コロナの分析とは、本明細書で「タンパク質コロナ分析」と呼ばれ得る。生体試料は、１つまたは複数の粒子タイプを用いて問い合わせされ得る。各粒子タイプのタンパク質コロナは、別々に分析され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の粒子タイプのタンパク質コロナが、組み合わせて分析され得る。

【0103】

本開示は、本明細書で開示される粒子および本明細書で提供される方法を使用してアッセイされ得るいくつかの生体試料を提供する。例えば、生体試料は、生物流体試料、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液（ＳＦ）、尿、血漿、血清、涙、歯肉溝滲出液、精液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、汗または唾液であり得る。生物流体は、流動化固体、例えば、組織ホモジネート、または生体試料から抽出された流体であり得る。生体試料は、例えば、組織試料または細針吸引（ＦＮＡ）試料であり得る。一部の実施形態では、生体試料は、細胞培養物試料であり得る。一部の実施形態では、生物流体は、流動化された生体試料である。例えば、生物流体は、流動化された細胞培養抽出物であり得る。

【0104】

高度に豊富なタンパク質を試料から枯渇させる方法およびそれを行うための組成物もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、枯渇は、１つまたは複数の粒子を使用して、高度に豊富なタンパク質を生体試料（例えば、生物流体）から枯渇させるステップを含み得る。粒子を用いた試料の枯渇は、１つまたは複数の粒子タイプ（例えば、独自の材料組成を有する粒子）を用いた、試料の１または複数ラウンドの枯渇を含み得る。他の場合には、血漿枯渇キット、カラム、クロマトグラフィー、遠心分離または他のシステムが、高度に豊富なタンパク質を生体試料から枯渇させるために使用され得る。枯渇のこれらの方法のいずれかの後には、本明細書で開示されるように、本明細書で開示される種々の粒子タイプを使用する試料の逐次的問い合わせおよび前記種々の粒子タイプのコロナ分析が続き得る。

【0105】

本開示のワークフロー例は、図８Ａ～図８Ｇに例示される。図８Ａは、粒子を用いた試料の逐次的問い合わせのためのワークフローを例示する。試料（例えば、生体試料）は、同じまたは異なる粒子タイプを使用して、反復して問い合わせされ得る。必要に応じて、試料は、逐次的問い合わせの前に、枯渇または分画され得る。同じ粒子タイプまたは異なる粒子タイプを用いた試料の問い合わせは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回またはそれよりも多く反復され得る。一部の実施形態では、任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くの粒子タイプは、同じ粒子タイプであり得る。一部の実施形態では、任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くの粒子タイプは、異なる粒子タイプであり得る。試料は、試料を粒子と共にインキュベートして、粒子上に生体分子コロナを形成することによって、粒子タイプを用いて問い合わせされ得る。粒子タイプを用いた試料の問い合わせ後、生体分子コロナを構成する粒子は、（例えば、磁気分離、遠心分離、濾過または重力分離を使用して）試料から分離され得る。分離された粒子上の生体分子コロナは、（例えば、質量分析、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、分光法またはイムノアッセイによって）分析され得る。生体分子コロナのタンパク質コロナ分析は、総タンパク質分析方法と比較して、分析のダイナミックレンジを圧縮し得る。

【0106】

ワークフローの第１の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｂは、第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。第１の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第２の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。必要に応じて、試料は、問い合わせ前に枯渇または分画される。

【0107】

ワークフローの第２の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｃは、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプおよび第３の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。第１の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第２の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第３の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。必要に応じて、試料は、問い合わせ前に枯渇または分画される。

【0108】

ワークフローの第３の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｄは、第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、第３の粒子タイプおよび第４の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。第１の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第２の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第３の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。第４の粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。各粒子タイプのコロナは、問い合わせ後に分析される。必要に応じて、試料は、問い合わせ前に枯渇または分画される。

【0109】

ワークフローの第４の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｅは、１回目および２回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。必要に応じて、試料は、問い合わせ前に枯渇または分画される。

【0110】

ワークフローの第５の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｆは、１回目、２回目および３回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。必要に応じて、試料は、問い合わせ前に枯渇または分画される。

【0111】

ワークフローの第６の例は、図８Ｂに提供される。図８Ｇは、１回目、２回目、３回目および４回目に１つの粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせを含むワークフローを例示する。粒子タイプは、表１から選択される粒子であり得る。粒子タイプのコロナは、各問い合わせ後に分析される。

【0112】

ワークフローの例は、図８Ｂ～図８Ｇに提供されるが、試料の逐次的問い合わせは、任意の数またはタイプの粒子タイプを用いて任意の回数実施され得る。逐次的問い合わせは、任意の順序での同じ粒子タイプおよび異なる粒子タイプの組合せを用いて実施され得る。

【0113】

本開示は、生物流体などの生体試料を分画するための方法および組成物もまた提供する。生物流体は、流体または流体の上清を異なるタイプの粒子と順次接触させることによって、画分へと分離され得る。生物流体は、第１の粒子タイプと接触させられ得、第１の粒子タイプは、第１の粒子タイプに結合した任意の生物学的分子（例えば、タンパク質）と共に、（例えば、遠心分離または磁気分離によって）生体試料から分離され得る。分離された第１の粒子タイプおよび結合した生物学的分子は、第１の画分を構成し得る。残りの生物流体（例えば、上清）は、第２の粒子タイプと接触させられ得、第２の粒子タイプは、第２の粒子タイプに結合した任意の生物学的分子と共に、生体試料から分離され得る。このプロセスは、さらなる粒子タイプを用いて反復され得、それにより、生物流体を分画する。一部の実施形態では、生体試料は、クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿、電気泳動、または生化学的分離の任意の他の方法を使用して分画され得る。試料を分画した後、試料は、本明細書で開示されるように、種々の粒子タイプを用いた逐次的問い合わせの方法を使用して、タンパク質についてアッセイされ得る。

【0114】

本明細書で開示される粒子、組成物および方法は、種々の試料収集および安定化の方法および組成物と適合性である。本明細書で提供されるタンパク質コロナ分析方法は、安定化された生体試料に対して実施され得る。安定化された生体試料は、安定化試薬（例えば、防腐薬）で処理された生体試料（例えば、生物流体）を含み得る。一部の実施形態では、生体試料は、細胞の抗原発現を維持する液体防腐薬で処理され得る。安定化試薬は、試料収集コンテナ（例えば、血液収集管）内に含まれ得る。安定化された生体試料は、本明細書で開示される粒子、組成物または方法のいずれかを使用するタンパク質コロナ分析によって分析され得る。一部の実施形態では、安定化された生体試料は、タンパク質コロナ分析前に未冷蔵で貯蔵され得る。
粒子タイプ

【0115】

本明細書で開示される方法と合致する粒子タイプは、種々の材料から作製され得る。例えば、本開示と合致する粒子材料には、金属、ポリマー、磁気材料および脂質が含まれる。磁気粒子は、酸化鉄粒子であり得る。金属材料の例には、金、銀、銅、ニッケル、コバルト、パラジウム、白金、イリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、レニウム、バナジウム、クロム、マンガン、ニオブ、モリブデン、タングステン、タンタル、鉄およびカドミウム、または米国特許第７７４９２９９号に記載される任意の他の材料のうちいずれか１つまたはそれらの任意の組合せが含まれる。一部の実施形態では、粒子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）であり得る。

【0116】

ポリマーの例には、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピレンフマレート（polypropylfumerate）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレンもしくはポリアミン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸またはポリカプロラクトン）、または２つもしくはそれよりも多くのポリマーのコポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）およびポリエステル（例えば、ＰＬＧＡ）のコポリマーのうちいずれか１つまたはそれらの任意の組合せが含まれる。一部の実施形態では、ポリマーは、脂質で終結するポリアルキレングリコールおよびポリエステル、または米国特許第９５４９９０１号に開示される任意の他の材料である。

【0117】

本開示の粒子を形成するために使用され得る脂質の例には、カチオン性脂質、アニオン性脂質および中性に荷電した脂質が含まれる。例えば、粒子は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－サクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（palmitoyloleyolphosphatidylglycerol）（ＰＯＰＧ）、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（palmitoyloleyolphosphatidylglycerol）（ＰＯＰＧ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ならびにコレステロール、またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９４４５９９４号に列挙される任意の他の材料のうちいずれか１つまたはそれらの任意の組合せで作製され得る。

【0118】

本開示の粒子の例は、表１に提供される。

【表1-1】

【表1-2】

【0119】

本開示の粒子は、合成され得る、または本開示の粒子は、供給業者から購入され得る。例えば、本開示と合致する粒子は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ、Ｎａｎｏｐａｒｔｚ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈおよび他の供給業者を含む供給業者から購入され得る。一部の実施形態では、本開示の粒子は、供給業者から購入され得、さらに改変、コーティングまたは官能化され得る。

【0120】

本開示と合致する粒子は、広範なサイズで、作製され得、生物流体中でのインキュベーション後にタンパク質コロナを形成する方法において使用され得る。一部の実施形態では、本開示の粒子は、ナノ粒子であり得る。一部の実施形態では、本開示のナノ粒子は、直径が約１０ｎｍ～約１０００ｎｍであり得る。例えば、本明細書で開示されるナノ粒子は、直径が少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、１０ｎｍ～５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、４００ｎｍ～４５０ｎｍ、４５０ｎｍ～５００ｎｍ、５００ｎｍ～５５０ｎｍ、５５０ｎｍ～６００ｎｍ、６００ｎｍ～６５０ｎｍ、６５０ｎｍ～７００ｎｍ、７００ｎｍ～７５０ｎｍ、７５０ｎｍ～８００ｎｍ、８００ｎｍ～８５０ｎｍ、８５０ｎｍ～９００ｎｍ、１００ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～３５０ｎｍ、２００ｎｍ～４００ｎｍ、２５０ｎｍ～４５０ｎｍ、３００ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～５５０ｎｍ、４００ｎｍ～６００ｎｍ、４５０ｎｍ～６５０ｎｍ、５００ｎｍ～７００ｎｍ、５５０ｎｍ～７５０ｎｍ、６００ｎｍ～８００ｎｍ、６５０ｎｍ～８５０ｎｍ、７００ｎｍ～９００ｎｍまたは１０ｎｍ～９００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、直径が１０００ｎｍ未満であり得る。

【0121】

一部の実施形態では、本開示の粒子は、マイクロ粒子であり得る。マイクロ粒子は、直径が約１μｍ～約１０００μｍの粒子であり得る。例えば、本明細書で開示されるマイクロ粒子は、直径が少なくとも１μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍ、１０μｍ～５０μｍ、５０μｍ～１００μｍ、１００μｍ～１５０μｍ、１５０μｍ～２００μｍ、２００μｍ～２５０μｍ、２５０μｍ～３００μｍ、３００μｍ～３５０μｍ、３５０μｍ～４００μｍ、４００μｍ～４５０μｍ、４５０μｍ～５００μｍ、５００μｍ～５５０μｍ、５５０μｍ～６００μｍ、６００μｍ～６５０μｍ、６５０μｍ～７００μｍ、７００μｍ～７５０μｍ、７５０μｍ～８００μｍ、８００μｍ～８５０μｍ、８５０μｍ～９００μｍ、１００μｍ～３００μｍ、１５０μｍ～３５０μｍ、２００μｍ～４００μｍ、２５０μｍ～４５０μｍ、３００μｍ～５００μｍ、３５０μｍ～５５０μｍ、４００μｍ～６００μｍ、４５０μｍ～６５０μｍ、５００μｍ～７００μｍ、５５０μｍ～７５０μｍ、６００μｍ～８００μｍ、６５０μｍ～８５０μｍ、７００μｍ～９００μｍまたは１０μｍ～９００μｍであり得る。一部の実施形態では、マイクロ粒子は、直径が１０００μｍ未満であり得る。

【0122】

本開示の粒子は、生体分子コロナを形成するために、生体試料（例えば、生物流体）と接触させられ得る。粒子および生体分子コロナは、例えば、遠心分離、磁気分離、濾過または重力分離によって、生体試料から分離され得る。粒子タイプおよび生体分子コロナは、いくつかの分離技法を使用して、生体試料から分離され得る。分離技法の非限定的な例には、磁気分離、カラムベースの分離、濾過、スピンカラムベースの分離、遠心分離、超遠心分離、密度もしくは勾配ベースの遠心分離、重力分離、またはそれらの任意の組合せが含まれる。タンパク質コロナ分析は、分離された粒子および生体分子コロナに対して実施され得る。タンパク質コロナ分析は、例えば、質量分析によって、生体分子コロナ中の１つまたは複数のタンパク質を同定することを含み得る。一部の実施形態では、単一の粒子タイプ（例えば、表１に列挙されたタイプの粒子）が、生体試料と接触させられ得る。一部の実施形態では、複数の粒子タイプ（例えば、表１に提供される複数の粒子タイプ）が、生体試料と接触させられ得る。複数の粒子タイプは、単一の試料体積中で、生体試料と合わされ得、接触させられ得る。複数の粒子タイプは、生体試料と順次接触させられ得、引き続く粒子タイプを生体試料と接触させる前に、生体試料から分離され得る。生体分子コロナのタンパク質コロナ分析は、総タンパク質分析方法と比較して、分析のダイナミックレンジを圧縮し得る。

【0123】

本開示の粒子は、第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして、第１の粒子タイプ上に生体分子コロナを形成し、第１の粒子タイプを分離し、第２の粒子タイプを試料と共にインキュベートして、第２の粒子タイプ上に生体分子コロナを形成し、第２の粒子タイプを分離し、任意の数の粒子タイプについて、問い合わせ（試料とのインキュベーションによる）および分離を反復することによって、試料を逐次的に問い合わせるために使用され得る。一部の実施形態では、試料の逐次的問い合わせに使用される各粒子タイプ上の生体分子コロナは、タンパク質コロナ分析によって分析され得る。一部の実施形態では、上清の生体分子内容が、１つまたは複数の粒子タイプを用いた逐次的問い合わせの後に分析され得る。

【0124】

一部の実施形態では、本開示の粒子タイプは、試料を逐次的に問い合わせ、その後、粒子タイプと試料とのインキュベーションの際に形成するタンパク質コロナ中のタンパク質をコロナ分析するために使用され得る。逐次的問い合わせは、ラウンド毎の様式で２つの粒子タイプを用いて実施され得る。逐次的問い合わせは、さらなる粒子タイプを用いた引き続く問い合わせもまた含み得る。一部の実施形態では、本開示の粒子は、逐次的問い合わせの上記方法の前に試料を枯渇させるために使用され得る。粒子タイプは、粒子タイプの表面上に生体分子コロナを形成するために試料と接触させられ得、粒子は、試料から分離され得、それにより、試料を枯渇させる。この戦略は、１つまたは複数のタンパク質（例えば、１つまたは複数の高い存在量のタンパク質）を試料から枯渇させるために使用され得る。一部の実施形態では、枯渇された試料の上清の生体分子内容が分析され得る。一部の実施形態では、枯渇された試料の上清は、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析方法のいずれかにおいて使用され得る。

【0125】

本開示の粒子タイプの例は、カルボキシレート（シトレート）超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）、フェノール－ホルムアルデヒドコーティングされたＳＰＩＯＮ、シリカコーティングされたＳＰＩＯＮ、ポリスチレンコーティングされたＳＰＩＯＮ、カルボキシル化ポリ（スチレン－コ－メタクリル酸）コーティングされたＳＰＩＯＮ、Ｎ－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンコーティングされたＳＰＩＯＮ、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングされたＳＰＩＯＮ、１，２，４，５－ベンゼンテトラカルボン酸コーティングされたＳＰＩＯＮ、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）（ＰＶＢＴＭＡＣ）コーティングされたＳＰＩＯＮ、カルボキシレート，ＰＡＡコーティングされたＳＰＩＯＮ、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングされたＳＰＩＯＮ、カルボキシレートマイクロ粒子、ポリスチレンカルボキシル官能化粒子、カルボン酸コーティングされた粒子、シリカ粒子、直径が約１５０ｎｍのカルボン酸粒子、直径が約０．４～０．６μｍのアミノ表面マイクロ粒子、直径が約０．１～０．３９μｍのシリカアミノ官能化マイクロ粒子、直径が約０．１～０．３９μｍのＪｅｆｆａｍｉｎｅ表面粒子、直径が約２．０～２．９μｍのポリスチレンマイクロ粒子、シリカ粒子、直径が約５０ｎｍの、オリジナルコーティングを有するカルボキシル化粒子、直径が約０．１３μｍの、デキストランベースのコーティングでコーティングされた粒子、または低酸性度を有するシリカシラノールコーティングされた粒子であり得る。
試料収集および抽出方法

【0126】

種々の試料が、本開示の方法および組成物に従ってアッセイされ得る。本明細書で開示される試料は、種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせた後に、タンパク質コロナ分析によって分析され得る。一部の実施形態では、試料は、タンパク質コロナ分析前に分画され得る。一部の実施形態では、試料は、タンパク質コロナ分析前に枯渇され得る。一部の実施形態では、本開示の方法は、試料を１つまたは複数の粒子タイプと接触させるステップおよび試料に対してタンパク質コロナ分析を実施するステップを含み得る。

【0127】

試料は、生体試料であり得る。例えば、生体試料は、生物流体試料、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液（ＳＦ）、尿、血漿、血清、涙、歯肉溝滲出液、精液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、汗または唾液であり得る。生物流体は、流動化固体、例えば、組織ホモジネート、または生体試料から抽出された流体であり得る。生体試料は、例えば、組織試料または細針吸引（ＦＮＡ）試料であり得る。一部の実施形態では、生体試料は、細胞培養物試料であり得る。例えば、本明細書で開示される方法において使用され得る試料は、細胞培養物中で成長した細胞を含み得る、または細胞培養物から採取された無細胞性材料を含み得る。一部の実施形態では、生物流体は、流動化された生体試料である。例えば、生物流体は、流動化された細胞培養抽出物であり得る。一部の実施形態では、試料は、流体試料から抽出され得、または試料は、固体試料から抽出され得る。例えば、試料は、流動化固体から抽出されたガス状分子（例えば、揮発性有機化合物）を含み得る。

【0128】

本明細書で記載されるタンパク質コロナ分析方法は、広いダイナミックレンジにわたって、本開示の試料中のタンパク質をアッセイするステップを含み得る。試料中のアッセイされたタンパク質のダイナミックレンジは、試料内に含まれるタンパク質についてのアッセイ方法（例えば、質量分析、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、分光法またはイムノアッセイ）によって測定される、タンパク質存在量の一定範囲の測定されたシグナルであり得る。例えば、広いダイナミックレンジにわたってタンパク質を検出することが可能なアッセイは、非常に低い存在量のタンパク質から非常に高い存在量のタンパク質までを検出することが可能であり得る。アッセイのダイナミックレンジは、タンパク質存在量の関数としてのアッセイシグナル強度の傾きに直接関連し得る。例えば、低いダイナミックレンジを有するアッセイは、タンパク質存在量の関数としてのアッセイシグナル強度の低い（ただし正の）傾きを有し得、例えば、高い存在量のタンパク質について検出されたシグナルの、低い存在量のタンパク質について検出されたシグナルに対する比は、高いダイナミックレンジを有するアッセイよりも、低いダイナミックレンジを有するアッセイについて、より低い可能性がある。本明細書で記載されるタンパク質コロナ分析方法は、アッセイのダイナミックレンジを圧縮し得る。アッセイのダイナミックレンジは、タンパク質存在量の関数としてのアッセイシグナル強度の傾きが、他のアッセイのものよりも低い場合、別のアッセイと比較して圧縮され得る。例えば、質量分析と共にタンパク質コロナ分析を使用してアッセイされた血漿試料は、試料に対して直接的な質量分析単独を使用してアッセイされた血漿試料と比較して、または図３４および図３５に示されるように、データベース（例えば、Keshishian et al., Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015)中に提供されるデータベース、本明細書で、「Ｃａｒｒデータベース」とも呼ぶ）中の血漿タンパク質について提供された存在量値と比較して、圧縮されたダイナミックレンジを有し得る。圧縮されたダイナミックレンジは、質量分析単独を使用する場合よりも、質量分析と共にタンパク質コロナ分析を使用した場合に、血漿試料中のより低い存在量のタンパク質の検出を可能にし得る。

【0129】

アッセイのダイナミックレンジの圧縮は、本明細書で開示される方法（例えば、粒子を用いた逐次的問い合わせと、その後の、タンパク質存在量を定量するためのアッセイ、例えば質量分析）を使用した、低い存在量のタンパク質の検出を可能にし得る。例えば、アッセイ（例えば、質量分析）は、３オーダーの大きさのダイナミックレンジを検出することが可能であり得る。それぞれ１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１，０００ｎｇ／ｍＬおよび１０，０００ｎｇ／ｍＬの存在量で５種のタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを含む試料では、アッセイ（例えば、質量分析）は、タンパク質Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを検出し得る。しかし、試料を粒子と共にインキュベートする本明細書で開示される方法を使用すると、タンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、粒子表面に対する異なる親和性を有し得、試料中に存在する場合とは異なる存在度で粒子の表面に吸着して、生体分子コロナを形成し得る。例えば、タンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ、２３１ｎｇ／ｍＬ、４６３ｎｇ／ｍＬ、６９４ｎｇ／ｍＬおよび９２６ｎｇ／ｍＬの存在度で、生体分子コロナ中に存在し得る。したがって、試料を問い合わせる方法において本明細書で開示される粒子を使用すると、２オーダーの大きさへのダイナミックレンジの圧縮が生じ、得られたアッセイ（例えば、質量分析）は、５種全てのタンパク質を検出することができる。

【0130】

多数の生物流体が、本開示の方法および組成物を使用して並行して処理され得る。タンパク質コロナ分析は、タンパク質コロナ分析アッセイの各ステップを多数の生体試料に対して同時期に実施することによって、多数の生体試料に対して並行して実施され得る。例えば、タンパク質コロナ分析は、タンパク質コロナ分析アッセイの第１のステップを多数の生体試料に対して同時に実施し、タンパク質コロナ分析アッセイの第２のステップを多数の生体試料に対して同時に実施し、タンパク質コロナ分析アッセイの第３のステップを多数の生体試料に対して同時に実施することによって、多数の生体試料に対して並行して実施され得る。多数の生体試料に対するタンパク質コロナ分析の各ステップの同時の実施は、タンパク質コロナ分析アッセイの全てのステップが多数の生体試料に対して実施されるまで、反復され得る。一部の例では、多数の生体試料は、同じ対象から得られ得る。これらの試料は、対象から得られた試料の部分（例えば、血漿試料の多数のアリコート）であり得る。これらの試料は、同じ対象から収集された異なる生物流体であり得る。

【0131】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、タンパク質コロナ分析アッセイの第１のステップを複数の生体試料の各試料に対して順次実施し、タンパク質コロナ分析アッセイの第２のステップを複数の生体試料の各試料に対して順次実施し、タンパク質コロナ分析アッセイの第３のステップを複数の生体試料の各試料に対して順次実施することによって、多数の生体試料に対して並行して実施され得る。複数の生体試料の各試料に対して実施され得るタンパク質コロナ分析の各ステップの順次実施は、タンパク質コロナ分析アッセイの全てのステップが複数の生体試料の各生体試料に対して実施されるまで、反復され得る。

【0132】

目的のタンパク質（例えば、低い存在量のタンパク質）は、未処理の試料（例えば、粒子を使用してアッセイされていない試料）と比較して、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、富化のレベルは、未処理の試料と比較した、生体分子コロナ中の総タンパク質濃度と比較した目的のタンパク質の濃度におけるパーセント増加または増加倍率であり得る。目的のタンパク質は、生体分子コロナ中の目的のタンパク質の濃度を、粒子と接触させていない試料と比較して増加させることによって、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、生体分子コロナ中の高い存在量のタンパク質の濃度を、粒子と接触させていない試料と比較して減少させることによって、富化され得る。タンパク質コロナ分析アッセイは、生体試料（例えば、生物流体）中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、生体試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、生体試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、生体試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、生体試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0133】

生体試料は、安定化試薬を含む試料収集管中に収集され得る。安定化試薬は、生物流体試料中の有核細胞または生物流体試料中の他の生体分子、例えば、タンパク質または核酸（例えば、無細胞ＲＮＡまたはＤＮＡを含むＲＮＡまたはＤＮＡ）を安定化し得る。一部の実施形態では、試料収集管は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、防腐剤、ポリアミド、またはそれらの組合せを含み得る。代謝阻害剤は、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、１，３－ビスホスホグリセレート、３－ホスホグリセレート、２－ホスホグリセレート、ホスホエノールピルベート、ピルベートおよびグリセレートジヒドロキシアセテート、フッ化ナトリウム、またはＫ_２Ｃ_２Ｏ_４を含み得る。プロテアーゼ阻害剤は、アンチパイン、アプロチニン、キモスタチン、エラスタチナール、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＡＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、ダイズトリプシン阻害剤、インドール酢酸（ＩＡＡ）、Ｅ－６４、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、ＶｄＬＰＦＦＶｄＬ、１，１０－フェナントロリン、ホスホラミドン、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡ、ジプロチンＢ、アルファ－２－マクログロブリン、ライマメトリプシン阻害剤、膵プロテアーゼ阻害剤または卵白オボスタチン、卵白シスタチンを含み得る。ホスファターゼ阻害剤は、カリクリンＡ、ノジュラリン、ＮＩＰＰ－１、ミクロシスチンＬＲ、トートマイシン、オカダ酸、カンタリジン、ミクロシスチンＬＲ、オカダ酸、フォストリエシン、トートマイシン、カンタリジン、エンドサール、ノジュラリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６／イムノフィリン複合体、シペルメトリン、デルタメトリン、フェンバレレート、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、デフォスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）ＤＭＨＶまたはオルトバナジン酸ナトリウムを含み得る。ヌクレアーゼ阻害剤は、ジエチルピロカーボネート、エタノール、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ホルムアミド、バナジル－リボヌクレオシド複合体、マカロイド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、プロテイナーゼＫ、ヘパリン、ヒドロキシルアミン－酸素－第二銅イオン、ベントナイト、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ－メルカプトエタノール、システイン、ジチオエリトリトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、またはＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｚｎ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｃａ^＋２もしくはＣｕ^＋２などの二価カチオンを含み得る。防腐剤は、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール－５，５－ジメチルヒダントイン、ジメチロール尿素、２－ブロモ－２－ニトロプロパン－１，３－ジオール、オキサゾリジン、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、５－ヒドロキシメトキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシポリ［メチレンオキシ］メチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタンまたは第４級アダマンタンを含み得る。試料収集管は、その各々のその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，３０４，１８７号、同第８，５８６，３０６号、同第９，６５７，２２７号、同第９，９２６，５９０号、同第１０，１４４，９５５号および同第１０，２９４，５１３号、ならびに米国特許出願第１６／３７７，３４４号、ならびに他のタンパク質分離技法において開示される安定化剤を含み得る。

【0134】

脳脊髄液（ＣＳＦ）試料。本開示は、本明細書で開示される粒子のうち１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子のうち１つまたは複数）を使用して、脳脊髄液試料中のタンパク質についてアッセイする方法を提供する。ＣＳＦ中のタンパク質の比較的低い存在量は、従来の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー）を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、低いタンパク質濃度を有する試料中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、約１．０ｍｇ／ｍＬ以下、約０．９ｍｇ／ｍＬ以下、約０．８ｍｇ／ｍＬ以下、約０．７ｍｇ／ｍＬ以下、約０．６ｍｇ／ｍＬ以下、約０．５ｍｇ／ｍＬ以下、約０．４ｍｇ／ｍＬ以下、約０．３ｍｇ／ｍＬ以下、約０．２ｍｇ／ｍＬ以下または約０．１ｍｇ／ｍＬ以下の総タンパク質濃度を有する試料中のタンパク質を検出することが可能であり得る。

【0135】

ＣＳＦの試料収集体積は小さく、約１ｍＬ～約１０ｍＬの範囲であり得、各試料を用いて実施され得るアッセイの数を制限する。本明細書で開示される方法および組成物は、小さい試料体積中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下の試料体積中のタンパク質を検出することが可能であり得る。

【0136】

タンパク質コロナ分析アッセイは、ＣＳＦ試料中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、ＣＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約４．５時間以内、約５時間以内、約５．５時間以内、約６時間以内、約６．５時間以内、約７時間以内、約７．５時間以内、約８時間以内、約８．５時間以内、約９時間以内、約９．５時間以内または約１０時間以内に、ＣＳＦ試料中の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0137】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、ＣＳＦ試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＣＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、ＣＳＦ試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＣＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、ＣＳＦ試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＣＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、ＣＳＦ試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0138】

本明細書で開示される方法は、ＣＳＦ中のタンパク質についてアッセイする他の方法よりも優れており、短い期間での広いダイナミックレンジにわたる、ＣＳＦ中のタンパク質のサンプリングを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＣＳＦ試料中のタンパク質を迅速に富化するために、１つまたは複数の粒子を利用する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子タイプのうち１つまたは複数は、ＣＳＦ試料中の目的のタンパク質（高い存在量のタンパク質、中間の存在量のタンパク質または低い存在量のタンパク質）についてアッセイする方法において使用され得、この方法は、ＣＳＦ試料中で前記１つまたは複数の粒子タイプをインキュベートして、粒子上での生体分子コロナの形成およびＣＳＦ試料中のタンパク質の富化を可能にするステップ、粒子をＣＳＦ試料中の未結合の生体分子から（例えば、磁気分離によって）分離するステップ、ならびにトリプシン処理を行い、目的のタンパク質についてコロナ中の生体分子を分析するステップを含む。さらに、前記方法を使用することで、粒子タイプの周囲に形成された生体分子コロナ中の目的のタンパク質の効率的な富化が可能になる。目的のタンパク質は、粒子と接触させていないＣＳＦ試料と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、粒子と接触させていないＣＳＦ試料と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子のうちいずれか１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子タイプのうちいずれか１つまたは複数）は、ＣＳＦ試料からの、少なくとも約５００種、少なくとも約６００種、少なくとも約６５０種、少なくとも約７００種、少なくとも約７５０種、少なくとも約８００種、少なくとも約８５０種、少なくとも約９００種、少なくとも約９５０種、少なくとも約１０００種のタンパク質、少なくとも約１０５０種のタンパク質、少なくとも約１１００種のタンパク質、少なくとも約１１５０種のタンパク質または少なくとも約１２００種の別個のタンパク質の捕捉を生じ得る。

【0139】

滑液試料。本開示は、本明細書で開示される粒子のうち１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子のうち１つまたは複数）を使用して、滑液試料中のタンパク質についてアッセイする方法を提供する。ＳＦ中の総タンパク質と比較した高い存在量のタンパク質（例えば、アルブミン）の比較的高い濃度は、従来の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー）を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、高い濃度の高い存在量のタンパク質を有する試料中の低い存在量のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、総タンパク質計数に対して少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％または少なくとも約７０重量％の高い存在量のタンパク質を有する試料中の低い存在量のタンパク質を検出することが可能であり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、さらなる分画ステップも枯渇ステップも必要とせずに、比較的高い濃度の高い存在量のタンパク質を含む試料に対して実施され得る。

【0140】

ＳＦの試料収集体積は小さく、約２ｍＬ～約２０ｍＬの範囲であり得、各試料を用いて実施され得るアッセイの数を制限する。本明細書で開示される方法および組成物は、小さい試料体積中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下または約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下の試料体積中のタンパク質を検出することが可能であり得る。

【0141】

タンパク質コロナ分析アッセイは、ＳＦ試料中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、ＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約４．５時間以内、約５時間以内、約５．５時間以内、約６時間以内、約６．５時間以内、約７時間以内、約７．５時間以内、約８時間以内、約８．５時間以内、約９時間以内、約９．５時間以内または約１０時間以内に、ＳＦ試料中の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0142】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、ＳＦ試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、ＳＦ試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、ＳＦ試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、ＳＦ試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、ＳＦ試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0143】

本明細書で開示される方法は、滑液中のタンパク質についてアッセイする他の方法よりも優れており、短い期間での広いダイナミックレンジにわたる、滑液中のタンパク質のサンプリングを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、滑液試料中のタンパク質を迅速に富化するために、１つまたは複数の粒子を利用する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子タイプのうち１つまたは複数は、滑液試料中の目的のタンパク質（高い存在量のタンパク質、中間の存在量のタンパク質または低い存在量のタンパク質）についてアッセイする方法において使用され得、この方法は、滑液試料中で前記１つまたは複数の粒子タイプをインキュベートして、粒子上での生体分子コロナの形成および滑液試料中のタンパク質の富化を可能にするステップ、粒子を滑液試料中の未結合の生体分子から（例えば、磁気分離によって）分離するステップ、ならびにトリプシン処理を行い、目的のタンパク質についてコロナ中の生体分子を分析するステップを含む。さらに、前記方法を使用することで、粒子タイプの周囲に形成された生体分子コロナ中の目的のタンパク質の効率的な富化が可能になる。目的のタンパク質は、粒子と接触させていないＳＦ試料と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、粒子と接触させていないＳＦ試料と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子のうちいずれか１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子タイプのうちいずれか１つまたは複数）は、滑液試料からの、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２７５０、少なくとも約３０００、少なくとも約３２５０、少なくとも約３５００、少なくとも約３７５０または少なくとも約４０００の富化を生じ得る。

【0144】

尿試料。本開示は、本明細書で開示される粒子のうち１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子のうち１つまたは複数）を使用して、尿試料中のタンパク質についてアッセイする方法を提供する。尿中のタンパク質の比較的低い存在量は、従来の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー）を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、低いタンパク質濃度を有する試料中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、約１０ｍｇ／ｍＬ以下、約５．０ｍｇ／ｍＬ以下、約４．０ｍｇ／ｍＬ以下、約３．０ｍｇ／ｍＬ以下、約２．０ｍｇ／ｍＬ以下、約１．０ｍｇ／ｍＬ以下、約０．９ｍｇ／ｍＬ以下、約０．８ｍｇ／ｍＬ以下、約０．７ｍｇ／ｍＬ以下、約０．６ｍｇ／ｍＬ以下、約０．５ｍｇ／ｍＬ以下、約０．４ｍｇ／ｍＬ以下、約０．３ｍｇ／ｍＬ以下、約０．２ｍｇ／ｍＬ以下、約０．１ｍｇ／ｍＬ以下、約０．０５ｍｇ／ｍＬ以下または約０．０２ｍｇ／ｍＬ以下の総タンパク質濃度を有する試料中のタンパク質を検出することが可能であり得る。

【0145】

尿中の総タンパク質と比較した高い存在量のタンパク質（例えば、アルブミン）の比較的高い濃度は、従来の手段を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、高い濃度の高い存在量のタンパク質を有する試料中の低い存在量のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、総タンパク質計数に対して少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約５５重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％または少なくとも約９５重量％の高い存在量のタンパク質を有する試料中の低い存在量のタンパク質を検出することが可能であり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、さらなる分画ステップも枯渇ステップも必要とせずに、比較的高い濃度の高い存在量のタンパク質を含む試料に対して実施され得る。

【0146】

タンパク質コロナ分析アッセイは、尿試料中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、尿試料を粒子と接触させる最初のステップから約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約４．５時間以内、約５時間以内、約５．５時間以内、約６時間以内、約６．５時間以内、約７時間以内、約７．５時間以内、約８時間以内、約８．５時間以内、約９時間以内、約９．５時間以内または約１０時間以内に、尿試料中の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0147】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、尿試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、尿試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、尿試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、尿試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、尿試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、尿試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、尿試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0148】

本明細書で開示される方法は、尿中のタンパク質についてアッセイする他の方法よりも優れており、短い期間での広いダイナミックレンジにわたる、尿中のタンパク質のサンプリングを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、尿試料中のタンパク質を迅速に富化するために、１つまたは複数の粒子を利用する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子タイプのうち１つまたは複数は、尿試料中の目的のタンパク質（高い存在量のタンパク質、中間の存在量のタンパク質または低い存在量のタンパク質）についてアッセイする方法において使用され得、この方法は、尿試料中で前記１つまたは複数の粒子タイプをインキュベートして、粒子上での生体分子コロナの形成および尿試料中のタンパク質の富化を可能にするステップ、粒子を尿試料中の未結合の生体分子から（例えば、磁気分離によって）分離するステップ、ならびにトリプシン処理を行い、目的のタンパク質についてコロナ中の生体分子を分析するステップを含む。さらに、前記方法を使用することで、粒子タイプの周囲に形成された生体分子コロナ中の目的のタンパク質の効率的な富化が可能になる。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない尿試料と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない尿試料と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子のうちいずれか１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子タイプのうちいずれか１つまたは複数）は、尿試料からの、少なくとも約２９１、少なくとも約２９４、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約４７０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６１８、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７０９、少なくとも約７１８、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８３８、少なくとも約８４０、少なくとも約８４７、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約９８４、少なくとも約１０００、少なくとも約１０５０、少なくとも約１１００、少なくとも約１１５０または少なくとも約１２００の富化を生じ得る。

【0149】

流動化固体試料。本開示は、本明細書で開示される粒子のうち１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子のうち１つまたは複数）を使用して、流動化固体試料中のタンパク質についてアッセイする方法を提供する。流動化固体（例えば、組織ホモジネート）は、不均質性を含み得、これは、従来の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー）を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、不均一な試料中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、さらなる精製ステップも分画ステップも枯渇ステップも必要とせずに、流動化固体に対して実施され得る。

【0150】

本明細書で開示される方法は、流動化固体中のタンパク質についてアッセイする他の方法よりも優れており、短い期間での広いダイナミックレンジにわたる、流動化固体中のタンパク質のサンプリングを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、流動化固体試料中のタンパク質を迅速に富化するために、１つまたは複数の粒子を利用する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子タイプのうち１つまたは複数は、流動化固体試料中の目的のタンパク質（高い存在量のタンパク質、中間の存在量のタンパク質または低い存在量のタンパク質）についてアッセイする方法において使用され得、この方法は、流動化固体試料中で前記１つまたは複数の粒子タイプをインキュベートして、粒子上での生体分子コロナの形成および流動化固体試料中のタンパク質の富化を可能にするステップ、粒子を流動化固体試料中の未結合の生体分子から（例えば、磁気分離によって）分離するステップ、ならびにトリプシン処理を行い、目的のタンパク質についてコロナ中の生体分子を分析するステップを含む。さらに、前記方法を使用することで、粒子タイプの周囲に形成された生体分子コロナ中の目的のタンパク質の効率的な富化が可能になる。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない流動化固体試料と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない流動化固体試料と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子のうちいずれか１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子タイプのうちいずれか１つまたは複数）は、流動化固体試料からの、少なくとも約２９１、少なくとも約２９４、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約４７０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６１８、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７０９、少なくとも約７１８、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８３８、少なくとも約８４０、少なくとも約８４７、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約９８４、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２７５０、少なくとも約３０００、少なくとも約３２５０、少なくとも約３５００、少なくとも約３７５０または少なくとも約４０００の富化を生じ得る。

【0151】

タンパク質コロナ分析アッセイは、流動化固体試料中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、流動化固体試料を粒子と接触させる最初のステップから約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約４．５時間以内、約５時間以内、約５．５時間以内、約６時間以内、約６．５時間以内、約７時間以内、約７．５時間以内、約８時間以内、約８．５時間以内、約９時間以内、約９．５時間以内または約１０時間以内に、流動化固体試料中の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0152】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、流動化固体試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、流動化固体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、流動化固体試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、流動化固体試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、流動化固体試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、流動化固体試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、流動化固体試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0153】

細胞培養物試料。本開示は、本明細書で開示される粒子のうち１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子のうち１つまたは複数）を使用して、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中のタンパク質についてアッセイする方法を提供する。細胞培養物試料は、不均質性を含み得、これは、従来の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー）を使用したタンパク質検出を混乱させ得る。本明細書で開示される方法および組成物は、不均一な試料中のタンパク質を検出するために十分に適し得る。例えば、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、さらなる精製ステップも分画ステップも枯渇ステップも必要とせずに、細胞培養物試料に対して実施され得る。

【0154】

本明細書で開示される方法は、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中のタンパク質についてアッセイする他の方法よりも優れており、短い期間での広いダイナミックレンジにわたる、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中のタンパク質のサンプリングを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中のタンパク質を迅速に富化するために、１つまたは複数の粒子を利用する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子タイプのうち１つまたは複数は、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中の目的のタンパク質（高い存在量のタンパク質、中間の存在量のタンパク質または低い存在量のタンパク質）についてアッセイする方法において使用され得、この方法は、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中で前記１つまたは複数の粒子タイプをインキュベートして、粒子上での生体分子コロナの形成および細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中のタンパク質の富化を可能にするステップ、粒子を細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）中の未結合の生体分子から（例えば、磁気分離によって）分離するステップ、ならびにトリプシン処理を行い、目的のタンパク質についてコロナ中の生体分子を分析するステップを含む。さらに、前記方法を使用することで、粒子タイプの周囲に形成された生体分子コロナ中の目的のタンパク質の効率的な富化が可能になる。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない細胞培養物試料と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％、生体分子コロナ中で富化され得る。目的のタンパク質は、粒子と接触させていない細胞培養物試料と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍、生体分子コロナ中で富化され得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子のうちいずれか１つまたは複数（例えば、表１に開示される粒子タイプのうちいずれか１つまたは複数）は、細胞培養物試料とのインキュベーションの際に粒子タイプの表面上に形成するコロナ中の、細胞培養物試料（細胞性試料、細胞透過試料または細胞外試料）からの、少なくとも約１００種、少なくとも約２００種、少なくとも約３００種、少なくとも約３５０種、少なくとも約４００種、少なくとも約４５０種、少なくとも約４７０種、少なくとも約５００種、少なくとも約５５０種、少なくとも約６００種、少なくとも約６１８種、少なくとも約６５０種、少なくとも約７００種、少なくとも約７０９種、少なくとも約７１８種、少なくとも約７５０種、少なくとも約８００種、少なくとも約８３８種、少なくとも約８４０種、少なくとも約８４７種、少なくとも約８５０種、少なくとも約９００種、少なくとも約９５０種、少なくとも約９８４種、少なくとも約１０００種、少なくとも約１１００種、少なくとも約１２００種、少なくとも約１３００種、少なくとも約１４００種、少なくとも約１５００種、少なくとも約１６００種、少なくとも約１７００種、少なくとも約１８００種、少なくとも約１９００種、少なくとも約２０００種、少なくとも約２１００種、少なくとも約２２００種、少なくとも約２３００種、少なくとも約２４００種、少なくとも約２５００種、少なくとも約２７５０種、少なくとも約３０００種、少なくとも約３２５０種、少なくとも約３５００種、少なくとも約３７５０種または少なくとも約４０００種のタンパク質の捕捉を生じ得る。

【0155】

タンパク質コロナ分析アッセイは、細胞培養物試料中の低い存在量のタンパク質を迅速に同定するために使用され得る。タンパク質コロナ分析は、細胞培養物試料を粒子と接触させる最初のステップから約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約４．５時間以内、約５時間以内、約５．５時間以内、約６時間以内、約６．５時間以内、約７時間以内、約７．５時間以内、約８時間以内、約８．５時間以内、約９時間以内、約９．５時間以内または約１０時間以内に、細胞培養物試料中の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0156】

一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、生体試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、細胞培養物試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、細胞培養物試料を粒子と接触させる最初のステップから約８時間以内に、細胞培養物試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、細胞培養物試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、細胞培養物試料中の少なくとも約５００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。一部の実施形態では、タンパク質コロナ分析は、細胞培養物試料を粒子と接触させる最初のステップから約４時間以内に、細胞培養物試料中の少なくとも約１０００種の低い存在量のタンパク質を同定し得る。

【0157】

本開示の生体試料は、多くの異なる技法によって収集され得る。組織試料は、生検、切開、細針吸引または外科的切除を介して収集され得る。組織試料は、例えば、均質化または遠心分離によって流動化され得る。流体試料（例えば、血液、血清、血漿、尿または精液）は、試料収集管中に収集され得る。市販の収集管が、流体試料の収集に使用され得る。例えば、本開示の試料を収集するために使用され得る市販の収集管には、ＥＤＴＡ収集管、核酸安定化剤を含む収集管（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ管）、血清分離管（ＳＳＴ）、クエン酸ナトリウム収集管、シトレート、テオフィリン、アデノシンおよびジピリダモール（ＣＴＡＤ）収集管、ヘパリンリチウム／ナトリウム収集管、フッ化ナトリウム収集管、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）収集管またはポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）収集管が含まれる。

【0158】

一部の実施形態では、生物流体は、安定化試薬（例えば、防腐薬、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤または架橋剤）を含む試料収集管中に収集され得る。安定化試薬は、未凍結で貯蔵される生物流体を安定化し得る。生物流体は、周囲温度、室温、または０℃～３７℃の任意の温度で貯蔵され得る。例えば、安定化試薬を含む試料収集管中に収集された生物流体は、最大で１、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３または最大で１４日間にわたって、未凍結（例えば、０℃～３７℃の温度）で貯蔵され得る。室温での貯蔵後、生物流体は、（例えば、コロナ分析を介して）分析され得、または後の使用のために凍結され得る。例えば、生物流体試料は、核酸安定化剤を含む収集管（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ管）中に収集されて、室温で一晩貯蔵され得、または生物流体試料は、核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集されて、氷もドライアイスもなしに出荷され得る。未凍結の生物流体は、試料が収集された場所とは別の施設で処理され得る。

【0159】

収集管中に収集され未凍結で貯蔵された生物流体は、タンパク質コロナ分析による分析に適し得る。０℃～３７℃の温度での貯蔵後、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも３００種、少なくとも４００種、少なくとも５００種、少なくとも６００種、少なくとも７００種、少なくとも８００種、少なくとも９００種、少なくとも１０００種、少なくとも１１００種、少なくとも１２００種、少なくとも１３００種、少なくとも１４００種または少なくとも１５００種のタンパク質が、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。一部の実施形態では、０℃～３７℃の温度での貯蔵後、少なくとも１０００種、少なくとも１１００種、少なくとも１２００種、少なくとも１３００種、少なくとも１４００種、少なくとも１５００種、少なくとも１６００種、少なくとも１７００種、少なくとも１８００種、少なくとも１９００種、少なくとも２０００種、少なくとも２５００種、少なくとも３０００種、少なくとも３５００種、少なくとも４０００種、少なくとも４５００種または少なくとも５０００種のペプチドが、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。一部の実施形態では、０℃～３７℃の温度での貯蔵後、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも７１００、少なくとも７２００、少なくとも７３００、少なくとも７４００、少なくとも７５００、少なくとも７６００、少なくとも７７００、少なくとも７８００、少なくとも７９００、少なくとも８０００、少なくとも８５００または少なくとも９０００のタンパク質特色が、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。凍結された生物流体は、氷上で、ドライアイス上で、または液体窒素と共に出荷され得る。凍結された生物流体は、試料が収集された場所とは別の施設で、解凍および処理され得る。例えば、生物流体は、医療施設において核酸安定化剤を含む管（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ管）中に収集され得、周囲条件下で、コロナ分析のために研究施設に出荷され得る。

【0160】

一部の実施形態では、生物流体は、試料収集管中に収集され得、凍結され得る。生物流体は、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約６０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間または約６時間以内に凍結され得る。試料収集管中に収集され凍結された生物流体は、タンパク質コロナ分析による分析に適し得る。凍結貯蔵（例えば、０℃を下回る温度での貯蔵）後、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも３００種、少なくとも４００種、少なくとも５００種、少なくとも６００種、少なくとも７００種、少なくとも８００種、少なくとも９００種、少なくとも１０００種、少なくとも１１００種、少なくとも１２００種、少なくとも１３００種、少なくとも１４００種または少なくとも１５００種のタンパク質が、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。一部の実施形態では、０℃を下回る温度での貯蔵後、少なくとも１０００種、少なくとも１１００種、少なくとも１２００種、少なくとも１３００種、少なくとも１４００種、少なくとも１５００種、少なくとも１６００種、少なくとも１７００種、少なくとも１８００種、少なくとも１９００種、少なくとも２０００種、少なくとも２５００種、少なくとも３０００種、少なくとも３５００種、少なくとも４０００種、少なくとも４５００種または少なくとも５０００種のペプチドが、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。一部の実施形態では、０℃を下回る温度での貯蔵後、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも７１００、少なくとも７２００、少なくとも７３００、少なくとも７４００、少なくとも７５００、少なくとも７６００、少なくとも７７００、少なくとも７８００、少なくとも７９００、少なくとも８０００、少なくとも８５００または少なくとも９０００のタンパク質特色が、コロナ分析を使用して生物流体中で検出され得る。

【0161】

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、Ｓｔｒｅｃｋ血液収集管中での生物流体の取集、コロナを形成するための粒子とのインキュベーション、および後の時点（例えば、室温におけるＳｔｒｅｃｋ血液収集管中での前記試料のインキュベーションの最大で１４日後）でのコロナ中のタンパク質の引き続く分析を提供する。
生体試料におけるタンパク質コロナ分析

【0162】

本明細書で開示される粒子およびその使用の方法は、生体試料（例えば、生物流体）中の多数の独自のタンパク質に結合し得る。本明細書で記載されるタンパク質コロナ分析方法を使用して分析され得る生体試料の非限定的な例には、生物流体試料（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液（ＳＦ）、尿、血漿、血清、涙、精液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、汗または唾液）、流動化固体（例えば、組織ホモジネート）、または細胞培養物に由来する試料が含まれる。例えば、本明細書で開示される粒子は、少なくとも１００種の独自のタンパク質、少なくとも１２０種の独自のタンパク質、少なくとも１４０種の独自のタンパク質、少なくとも１６０種の独自のタンパク質、少なくとも１８０種の独自のタンパク質、少なくとも２００種の独自のタンパク質、少なくとも２２０種の独自のタンパク質、少なくとも２４０種の独自のタンパク質、少なくとも２６０種の独自のタンパク質、少なくとも２８０種の独自のタンパク質、少なくとも３００種の独自のタンパク質、少なくとも３２０種の独自のタンパク質、少なくとも３４０種の独自のタンパク質、少なくとも３６０種の独自のタンパク質、少なくとも３８０種の独自のタンパク質、少なくとも４００種の独自のタンパク質、少なくとも４２０種の独自のタンパク質、少なくとも４４０種の独自のタンパク質、少なくとも４６０種の独自のタンパク質、少なくとも４８０種の独自のタンパク質、少なくとも５００種の独自のタンパク質、少なくとも５２０種の独自のタンパク質、少なくとも５４０種の独自のタンパク質、少なくとも５６０種の独自のタンパク質、少なくとも５８０種の独自のタンパク質、少なくとも６００種の独自のタンパク質、少なくとも６２０種の独自のタンパク質、少なくとも６４０種の独自のタンパク質、少なくとも６６０種の独自のタンパク質、少なくとも６８０種の独自のタンパク質、少なくとも７００種の独自のタンパク質、少なくとも７２０種の独自のタンパク質、少なくとも７４０種の独自のタンパク質、少なくとも７６０種の独自のタンパク質、少なくとも７８０種の独自のタンパク質、少なくとも８００種の独自のタンパク質、少なくとも８２０種の独自のタンパク質、少なくとも８４０種の独自のタンパク質、少なくとも８６０種の独自のタンパク質、少なくとも８８０種の独自のタンパク質、少なくとも９００種の独自のタンパク質、少なくとも９２０種の独自のタンパク質、少なくとも９４０種の独自のタンパク質、少なくとも９６０種の独自のタンパク質、少なくとも９８０種の独自のタンパク質、少なくとも１０００種の独自のタンパク質、１００～１０００種の独自のタンパク質、１５０～９５０種の独自のタンパク質、２００～９００種の独自のタンパク質、２５０～８５０種の独自のタンパク質、３００～８００種の独自のタンパク質、３５０～７５０種の独自のタンパク質、４００～７００種の独自のタンパク質、４５０～６５０種の独自のタンパク質、５００～６００種の独自のタンパク質、２００～２５０種の独自のタンパク質、２５０～３００種の独自のタンパク質、３００～３５０種の独自のタンパク質、３５０～４００種の独自のタンパク質、４００～４５０種の独自のタンパク質、４５０～５００種の独自のタンパク質、５００～５５０種の独自のタンパク質、５５０～６００種の独自のタンパク質、６００～６５０種の独自のタンパク質、６５０～７００種の独自のタンパク質、７００～７５０種の独自のタンパク質、７５０～８００種の独自のタンパク質、８００～８５０種の独自のタンパク質、８５０～９００種の独自のタンパク質、９００～９５０種の独自のタンパク質、９５０～１０００種の独自のタンパク質を含むタンパク質コロナを形成するために、本明細書で開示される任意の生体試料と共にインキュベートされ得る。一部の実施形態では、いくつかの異なるタイプの粒子が、特定の生体試料中の多数のタンパク質を同定するために、別々にまたは組み合わせて使用され得る。言い換えると、粒子は、生体試料中の多数のタンパク質に結合しそれを同定するために、多重化され得る。生体分子コロナのタンパク質コロナ分析は、総タンパク質分析方法と比較して、分析のダイナミックレンジを圧縮し得る。

【0163】

本明細書で開示される組成物および方法は、特定の生体試料中の種々の生物学的状態を同定するために使用され得る。例えば、生物学的状態は、上昇したまたは低いレベルの特定のタンパク質またはタンパク質のセットを指し得る。他の例では、生物学的状態は、がんなどの疾患の同定を指し得る。１つまたは複数の粒子タイプは、ＣＳＦと共にインキュベートされて、タンパク質コロナの形成を可能にし得る。次いで、前記タンパク質コロナは、タンパク質のパターンを同定するために、ゲル電気泳動または質量分析によって分析され得る。タンパク質コロナの（例えば、質量分析またはゲル電気泳動による）分析は、コロナ分析と呼ばれ得る。タンパク質のパターンは、対照試料に対して実施された同じ方法と比較され得る。タンパク質のパターンの比較の際に、第１のＣＳＦ試料が、特定のタイプの脳がんに対応するマーカーの上昇したレベルを含むことが同定され得る。したがって、粒子およびその使用の方法は、特定の疾患状態を診断するために使用され得る。
逐次的問い合わせによるコロナ分析

【0164】

高い存在量のタンパク質と比較して低い存在量のタンパク質の検出を促進するために、プロテオミクス分析アッセイのダイナミックレンジを圧縮するためのいくつかの方法が、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、語句「ダイナミックレンジ」は、試料中の分子の最も高い濃度の、試料中の分子の最も低い濃度に対する比である。ダイナミックレンジは、試料中の分子の最も高い濃度の、試料中の分子の最も低い濃度に対する比を評価することと合致するいくつかの方法によって定量化され得る。例えば、ダイナミックレンジは、試料中のタンパク質の上位十分位群の、試料中の下位十分位群に対する比として定量化され得る。ダイナミックレンジは、試料中の検出可能な最も高い濃度の、試料中の検出可能な最も低い濃度に対する濃度の比によって定量化され得る。ダイナミックレンジは、試料中のタンパク質の四分位範囲（７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルの比）のスパンとして定量化され得る。ダイナミックレンジは、前記タンパク質の公開された濃度（例えば、血漿タンパク質のＣａｒｒデータベースを使用する）に対する、試料中の（例えば、本明細書で開示される方法、例えば、粒子を用いた逐次的問い合わせを使用して）検出されたタンパク質の全ての濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを測定することによって定量化され得る。ダイナミックレンジは、前記タンパク質の公開された濃度（例えば、血漿タンパク質のＣａｒｒデータベースを使用する）に対する、試料中の（例えば、本明細書で開示される方法、例えば、粒子を用いた逐次的問い合わせを使用して）検出されたタンパク質濃度のプロット中の任意の２点間の傾きを測定することによって定量化され得る。したがって、ダイナミックレンジは、分子が試料中で検出可能である濃度の範囲、または大きさのオーダーを捕捉する。例えば、「ダイナミックレンジ」は、試料中のタンパク質の最も高い検出可能な濃度の、試料中の別のタンパク質の最も低い検出可能な濃度に対する比を指し得る。したがって、この例では、ダイナミックレンジは、タンパク質が試料中で検出可能である濃度の範囲、または大きさのオーダーを捕捉する。本明細書で使用される場合、語句「ダイナミックレンジを圧縮する」または「ダイナミックレンジの圧縮」は、試料中の分子の最も高い濃度の、試料中の分子の最も低い濃度に対する比における減少を指す。したがって、ダイナミックレンジは、分子が試料中で検出可能である濃度の範囲、または大きさのオーダーが減少される場合、圧縮される。例えば、本開示の粒子タイプは、試料を逐次的に問い合わせるために使用され得る。試料中での粒子タイプのインキュベーションの際に、生体分子コロナが、粒子タイプの表面上に形成する。例えば試料の直接的質量分析的分析によって、タンパク質が前記粒子タイプの使用なしに試料中で直接検出される場合、ダイナミックレンジは、タンパク質が粒子タイプの表面上に指向される場合よりも、より広い範囲の濃度またはより大きい大きさのオーダーにわたり得る。したがって、本明細書で開示される粒子タイプを使用することで、試料中のタンパク質のダイナミックレンジが圧縮される。理論によって制限されないが、この効果は、粒子タイプの生体分子コロナ中のより高い親和性のより低い存在量のタンパク質のより多い捕捉、および粒子タイプの生体分子コロナ中のより低い親和性のより高い存在量のタンパク質のより少ない捕捉に起因して、観察され得る。プロテオミクス分析アッセイのダイナミックレンジは、試料中のタンパク質の総存在量の関数としての、プロテオミクス分析アッセイによって測定されるタンパク質シグナルのプロットの傾きであり得る。ダイナミックレンジを圧縮することは、試料中のタンパク質の総存在量の関数としての、第２のプロテオミクス分析アッセイによって測定されるタンパク質シグナルのプロットの傾きと比較して、試料中のタンパク質の総存在量の関数としての、プロテオミクス分析アッセイによって測定されるタンパク質シグナルのプロットの傾きを減少させることを含み得る。本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、総タンパク質分析方法（例えば、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィー）のダイナミックレンジと比較して、ダイナミックレンジを圧縮し得る。

【0165】

一部の実施形態では、プロテオミクス分析アッセイのダイナミックレンジは、最も高い存在量のタンパク質（例えば、存在量で上位１０％のタンパク質）によって生成されるシグナルの、最も低い存在量のタンパク質（例えば、存在量で下位１０％のタンパク質）によって生成されるシグナルに対する比であり得る。プロテオミクス分析のダイナミックレンジを圧縮することは、第２のプロテオミクス分析アッセイのものと比較して、第１のプロテオミクス分析アッセイについて、最も高い存在量のタンパク質によって生成されたシグナルの、最も低い存在量のタンパク質によって生成されたシグナルに対する比を減少させることを含み得る。本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析アッセイは、総タンパク質分析方法（例えば、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィー）のダイナミックレンジと比較して、ダイナミックレンジを圧縮し得る。

【0166】

プロテオミクス分析のダイナミックレンジを圧縮することは、逐次的問い合わせによって達成され得る。プロテオミクス分析のダイナミックレンジを圧縮するための方法は、試料（例えば、生体試料）を粒子を用いて逐次的に問い合わせるステップ、および粒子によって捕捉されたプロテオミクスデータのタンパク質コロナ分析を実施するステップを含み得る。一部の実施形態では、プロテオミクス分析のダイナミックレンジを圧縮するための方法は、高い存在量のタンパク質を試料から枯渇させるまたは試料中の低い存在量のタンパク質を富化するステップ、単一の粒子タイプを用いて多数回または種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせるステップ、および粒子のタンパク質コロナ分析を実施するステップを含み得る。一部の実施形態では、プロテオミクス分析のダイナミックレンジを圧縮するための方法は、本明細書で開示されるように、試料を分画するステップ、および種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせる方法を使用して、低い存在量のタンパク質が富化されたまたは高い存在量のタンパク質が枯渇された画分を問い合わせるステップを含み得る。一部の実施形態では、試料の逐次的問い合わせは、試料分画もしくは試料枯渇の前に、その後に、またはその代わりに実施され得る。

【0167】

本明細書で開示される逐次的問い合わせ方法は、タンパク質コロナ分析による低い存在量のタンパク質の検出を増加させ得る。例えば、逐次的問い合わせ方法は、低い存在量のタンパク質についてアッセイする能力に影響する高い存在量のタンパク質を試料から枯渇させるステップを含み得る。本明細書で開示される逐次的問い合わせ方法は、タンパク質コロナ分析による低い存在量のタンパク質の検出を増加させ得るが、それは、タンパク質コロナ中に捕捉されたタンパク質の圧縮されたダイナミックレンジが、混乱させる高い存在量のタンパク質が存在する試料中の前記低い存在量のタンパク質について直接サンプリングする代わりに、低い存在量のタンパク質を粒子表面上に局所的に濃縮することを可能にするからである。別の例では、逐次的問い合わせ方法は、粒子上に形成された生体分子コロナ中の低い存在量のタンパク質を富化するステップを含み得る。種々の試料タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせるための本明細書で開示される方法には、枯渇または分画が先行し得る。枯渇のこれらの方法は、枯渇キットを使用した枯渇を含み得る。枯渇のこれらの方法は、本明細書で開示される新規粒子（例えば、表１中の粒子のいずれか１つ）を用いた枯渇もまた含み得る。

【0168】

種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせた後のコロナ分析は、コロナ分析前に枯渇された生体試料に対して実施され得る。種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせた後のコロナ分析は、分画された生体試料の個々の画分に対して実施され得る。種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせた後のコロナ分析は、逐次的に問い合わせされた試料から分離された粒子タイプのうち１つまたは複数に対して実施され得る。分画は、試料を枯渇させるために使用され得、種々の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせおよびコロナ分析は、分画された試料に対して実施され得る。コロナ分析前の生体試料の分画または枯渇は、コロナ分析の感度、精度または特異度を増加させ得る。一部の実施形態では、コロナ分析前の生体試料の逐次的問い合わせ、分画または枯渇は、（例えば、ゲル分析または質量分析によって）総タンパク質計数について直接アッセイされる試料中では検出できなかった１つまたは複数の生物学的分子の検出を可能にし得る。種々の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせおよび分画された試料の個々の画分のコロナ分析は、生物学的分子の所望のサブセットの検出を可能にし得る。試料は、枯渇され得、次いで、種々の粒子タイプを用いて逐次的に問い合わせされ得、次いでこれは、タンパク質コロナ分析によって分析される。別の例では、試料は、分画され得、１つまたは複数の画分は、種々の粒子タイプを用いて逐次的に問い合わせされ得、次いでこれは、タンパク質コロナ分析によって分析される。

【0169】

逐次的問い合わせ。試料（例えば、生体試料）は、本開示の１つまたは複数の粒子タイプを用いて逐次的に問い合わせされ得る。粒子タイプは試料から分離され得、タンパク質コロナ分析が実施され得る。逐次的問い合わせは、試料を粒子タイプと接触させて、粒子上にタンパク質コロナを形成するステップ、粒子タイプを分離するステップ、ならびに同じ粒子タイプ、異なる粒子タイプ、またはそれらの組合せを用いて、同じ試料に対して１または複数回、接触させるステップおよび分離するステップを反復するステップを含み得る。タンパク質コロナ分析は、分離された粒子タイプのうち１つまたは複数に対して実施され得る。試料の逐次的問い合わせは、小さい試料サイズに十分に適し得る。例えば、粒子タイプのパネル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの粒子タイプのパネル）を使用するタンパク質コロナ分析は、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下または約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下ほどの低い試料体積を使用して実施され得る。これは、１つまたは複数の粒子タイプと接触させるステップの前に試料を分割するステップを含む他のタンパク質コロナ分析方法を超えた利点を提供し得る。試料の逐次的問い合わせは、単一の粒子タイプを用いた試料の問い合わせと比較して、タンパク質コロナ分析によって同定され得るタンパク質の数を増加させ得る。

【0170】

試料の生体分子組成は、逐次的問い合わせの間に実質的に変化しない場合がある。例えば、試料を第１の粒子タイプと接触させるステップの前の試料の生体分子組成は、試料からの第１の粒子タイプの分離後の試料の生体分子組成と実質的に同じであり得る。一部の実施形態では、試料を第１の粒子タイプと接触させるステップの前の試料の生体分子組成は、試料からの第２の粒子タイプ、第３の粒子タイプ、第４の粒子タイプ、第５の粒子タイプまたはそれよりも多くの粒子タイプの分離後の試料の生体分子組成と実質的に同じであり得る。試料の生体分子組成は、総生体分子質量が約１質量％以下、約２質量％以下、約３質量％以下、約４質量％以下、約５質量％以下、約６質量％以下、約７質量％以下、約８質量％以下、約９質量％以下、約１０質量％以下、約１１質量％以下、約１２質量％以下、約１３質量％以下、約１４質量％以下または約１５質量％以下変化する場合、実質的に同じであり得る。一部の実施形態では、試料の総生体分子質量は、約１質量％未満変化し得る。試料の生体分子組成は、生体分子のサブセットの質量が約１質量％以下、約２質量％以下、約３質量％以下、約４質量％以下、約５質量％以下、約６質量％以下、約７質量％以下、約８質量％以下、約９質量％以下、約１０質量％以下、約１１質量％以下、約１２質量％以下、約１３質量％以下、約１４質量％以下または約１５質量％以下変化する場合、実質的に同じであり得る。一部の実施形態では、生体分子のサブセットは、中間の存在量のタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、生体分子のサブセットは、低い存在量のタンパク質を含み得る。

【0171】

一部の実施形態では、逐次的問い合わせは、試料を第１の粒子タイプと接触させ、生物学的分子を第１の粒子タイプに結合させ、第１の粒子タイプを、結合した生物学的分子と共に生物流体から分離することによって実施され得る。例えば、粒子は、遠心分離または磁気分離を使用して生物流体から分離され得る。生物流体は、流体を第２の粒子タイプと接触させ、生物学的分子を第２の粒子タイプに結合させ、第２の粒子タイプを、結合した生物学的分子と共に生物流体から分離することによって、さらに問い合わせされ得る。一部の実施形態では、逐次的問い合わせは、生体試料を同じまたは異なる粒子タイプと順次接触させ、生物学的分子を粒子タイプに結合させ、次の粒子タイプを添加する前に各粒子タイプおよび結合した生物学的分子を分離することによって実施され得る。各分離された粒子タイプおよび結合した生物学的分子が、画分を構成し得る。一部の実施形態では、逐次的問い合わせは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の粒子タイプを用いて実施され得る。一部の実施形態では、粒子タイプを用いた逐次的問い合わせは、試料粒子タイプを使用して反復され得る。一部の実施形態では、コロナ分析は、逐次的に問い合わせされた生体試料の画分に対して実施され得る。一部の実施形態では、コロナ分析は、逐次的問い合わせ後の生体試料の残りの上清に対して実施され得る。

【0172】

枯渇。高度に豊富なタンパク質を試料から枯渇させる方法およびそれを行うための組成物が、本明細書で提供される。高い存在量のタンパク質を試料から枯渇させるこれらの方法は、種々の粒子タイプを用いて試料を逐次的に問い合わせる本明細書で記載される方法の前に実施され得、これは次いで、本明細書で開示されるタンパク質コロナ分析方法を使用して分析される。一部の実施形態では、１つまたは複数のナノ粒子は、高度に豊富なタンパク質を生体試料から枯渇させるために使用され得る。粒子を用いた試料の枯渇は、試料のラウンド毎の枯渇を含み得、各ラウンド内で、異なるタイプの粒子（例えば、独自の材料組成を有する粒子）が、枯渇のために使用され得る。他の場合には、血漿枯渇キット、カラム、クロマトグラフィーまたは他のシステムが、高度に豊富なタンパク質を生体試料から枯渇させるために使用され得る。枯渇と、その後の種々の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせおよびタンパク質コロナ分析とは、未枯渇の試料において同じ方法を実施することと比較して、同定され得るタンパク質の数を増加させ得る。しかし、枯渇は必要ない場合があり、種々の粒子タイプを用いた試料の逐次的問い合わせおよびタンパク質コロナ分析は、試料を最初に枯渇させた場合よりも短いアッセイ時間で種々のタンパク質を同定するために使用され得る。

【0173】

試料枯渇は、生物流体試料中の少なくとも１つの生物学的分子（例えば、タンパク質）のレベルを低減させることを含み得る。例えば、試料枯渇は、試料中の高度に豊富なタンパク質のレベルを低減させることを含み得る。高度に豊富なタンパク質は、アルブミン、ＩｇＧまたはリボソームタンパク質であり得る。一部の実施形態では、試料枯渇は、生物流体を第１の粒子タイプと接触させ、生物学的分子を第１の粒子タイプに結合させ、第１の粒子タイプを、結合した生物学的分子と共に生物流体から分離することによって実施され得る。例えば、粒子は、遠心分離または磁気分離を使用して、生物流体から分離され得る。生物流体は、流体を第２の粒子タイプと接触させ、生物学的分子を第２の粒子タイプに結合させ、第２の粒子タイプを、結合した生物学的分子と共に生物流体から分離することによって、さらに枯渇され得る。枯渇は、生物流体を異なる粒子タイプと接触させ、生物流体を次の粒子タイプと接触させる前に各粒子タイプを分離することによって、ラウンド毎の様式で、生物流体に対して実施され得る。一部の実施形態では、枯渇は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の粒子タイプを用いて実施され得る。一部の実施形態では、試料枯渇は、クロマトグラフィーまたは電気泳動を使用して実施され得る。

【0174】

一部の実施形態では、試料枯渇は、市販のキットを使用して試料を枯渇させることを含み得る。試料を枯渇させるために使用され得るキットは、スピンカラムベースの枯渇キット、アルブミン枯渇キット、免疫枯渇キットまたは豊富なタンパク質枯渇キットであり得る。試料枯渇に使用され得るキットの非限定的な例には、ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ（商標）Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ／Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｓｅｐｐｒｏ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｔｏｐ １２ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）またはＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｕｒｉｆｙ（商標）Ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。これらのキットは例として列挙されるが、当業者は、試料枯渇に使用され得る幾多の他のキットを想起することができる。

【0175】

本開示のキットは、試料を逐次的に問い合わせるための粒子タイプを含み得る。キットは、個別のアリコートで事前包装され得る。別の例では、キットは、試料を逐次的に問い合わせるために使用され得る複数の異なる粒子タイプを含み得る。複数の粒子タイプは、事前包装され得、このとき、その複数のものの各粒子タイプは別々に包装される。あるいは、複数の粒子タイプは、単一の包装中に粒子タイプの組合せを含むように一緒に包装され得る。

【0176】

試料を枯渇させることは、成分を試料から沈殿させることを含み得る。一部の実施形態では、試料を枯渇させることは、所望されない成分（例えば、高い存在量のタンパク質）を沈殿させることを含み得る。所望されない成分は沈殿され得、上清は、（例えば、タンパク質コロナ分析、逐次的問い合わせ、分画または枯渇によって）さらに処理され得る。一部の実施形態では、沈殿した所望されない成分は、濾過、遠心分離、超遠心分離または重力分離によって上清から除去され得る。所望されない成分を沈殿させる方法は、低温沈殿または化学的沈殿（例えば、コーンプロセスまたはエタノール沈殿）を含み得る。一部の実施形態では、試料を枯渇させることは、所望の成分（例えば、低い存在量のタンパク質）を沈殿させることを含み得る。所望の成分は沈殿され得、上清は廃棄され得、沈殿物はさらなる処理（例えば、種々の粒子タイプを用いた逐次的問い合わせ、これは次いで、タンパク質コロナ分析、分画または枯渇によってアッセイされる）のために再懸濁され得る。一部の実施形態では、沈殿した所望の成分は、濾過、遠心分離、超遠心分離または重力分離によって上清から分離され得る。所望の成分を沈殿させる方法は、低温沈殿または化学的沈殿（例えば、コーンプロセスまたはエタノール沈殿）を含み得る。一部の実施形態では、未処理の試料は、所望されない沈殿物を含み得る。所望されない沈殿物は、濾過、遠心分離、超遠心分離または重力分離によって上清から除去され得る。

【0177】

試料を枯渇させることは、所望されない成分を所望の成分から分離すること（例えば、高い存在量のタンパク質を低い存在量のタンパク質から分離すること）を含み得る。一部の実施形態では、成分は、生化学的特性（例えば、結合親和性、電荷またはサイズ）に基づいて分離され得る。一部の実施形態では、枯渇は、クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を使用して実施され得る。一部の実施形態では、試料は、生化学的特性に基づいて、２つまたはそれよりも多くの画分へと分離され得る。第１の画分は、所望の成分を含み得、第２の画分は、所望されない成分を含み得る。所望の成分を含む画分は、（例えば、種々の粒子タイプを用いた逐次的問い合わせおよびコロナ分析、さらなる分画または枯渇によって）さらに処理され得る。所望されない成分を含む画分は、廃棄され得る。枯渇方法の非限定的な例には、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または逆相クロマトグラフィーが含まれ得る。これらの方法は例として列挙されるが、当業者は、試料枯渇に使用され得る幾多の他の方法を想起することができる。

【0178】

本明細書で開示される組成物および方法を使用すると、枯渇は、生体試料からの、高い存在量のタンパク質の少なくとも５０％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％、５％～２０％、５％～１００％、１０％～９５％、１５％～９０％、２０％～８５％、２５％～８０％、３０％～７５％、３５％～７０％、４０％～６５％、４５％～６０％、５０％～５５％、６０％～７０％、６０％～８０％または５０％～９０％の除去を生じ得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される枯渇の方法および試料を枯渇させるために使用される組成物は、高度に豊富なタンパク質の全て、即ち１００％を除去することができる。コロナ分析は、枯渇された生体試料に対して実施され得る。

【0179】

分画。試料（例えば、生体試料）の成分を画分へと分離する方法が、本明細書で提供される。第１の画分は、第２の画分とは生体分子組成が異なり得る。例えば、未分画の試料と比較して、第１の画分は、高い存在量のタンパク質が富化され得、第２の画分は、低い存在量のタンパク質が富化され得る。画分は、本明細書で開示される方法および組成物を使用してさらに問い合わせされ得る（例えば、試料を逐次的に問い合わせることと、その後の、逐次的問い合わせにおいて使用される各粒子タイプのタンパク質コロナ分析）。一部の実施形態では、分画は、高い存在量のタンパク質を低い存在量のタンパク質から分離し、それにより、低い存在量のタンパク質の検出を増加させることによって、タンパク質コロナ分析を促進し得る。一部の実施形態では、分画は、特定の粒子タイプに十分に適した画分へと試料を分離することによって、タンパク質コロナ分析を促進し得る。例えば、第１の画分は、第１の粒子タイプを用いて問い合わせされ得、第２の画分は、第２の粒子タイプを用いて問い合わせされ得る。分画とその後のタンパク質コロナ分析とは、未分画の試料のタンパク質コロナ分析と比較して、同定され得るタンパク質の数を増加させ得る。

【0180】

試料分画は、生体試料の成分を分離することを含み得る。一部の実施形態では、成分は、生化学的特性（例えば、結合親和性、電荷またはサイズ）に基づいて分離され得る。一部の実施形態では、分画は、クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動を使用して実施され得る。１つまたは複数の画分は、（例えば、試料を逐次的に問い合わせることと、その後の、逐次的問い合わせにおいて使用される各粒子タイプのタンパク質コロナ分析、さらなる分画または枯渇によって）さらに処理され得る。分画方法の非限定的な例には、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または逆相クロマトグラフィーが含まれ得る。これらの方法は例として列挙されるが、当業者は、試料分画に使用され得る幾多の他の方法を想起することができる。
タンパク質コロナ分析方法

【0181】

本明細書で開示される方法は、１つまたは複数の粒子タイプを１つまたは１つよりも多くの試料（例えば、生体試料または逐次的に問い合わせされた試料）から単離するステップを含む。粒子タイプは、磁気を使用して試料から迅速に単離または分離され得る。さらに、空間的に単離された多数の試料が、並行して処理され得る。したがって、本明細書で開示される方法は、粒子タイプを、試料中の未結合のタンパク質から単離または分離することを提供する。粒子タイプは、磁気分離、遠心分離、濾過または重力分離が含まれるがこれらに限定されない種々の手段によって分離され得る。一部の実施形態では、粒子パネルが、複数の空間的に単離された試料と共にインキュベートされ得、このとき、各空間的に単離された試料は、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）のウェル中にある。一部の実施形態では、インキュベーション後、ウェルプレートのウェルの各々中の粒子タイプは、プレート全体を磁石上に置くことによって、空間的に単離された試料中に存在する未結合のタンパク質から分離され得る。これは、粒子パネル中の超常磁性粒子を同時にプルダウンする。各試料中の上清は、未結合のタンパク質を除去するために除去され得る。これらのステップ（インキュベート、プルダウン）は、粒子を効果的に洗浄するために反復され得、そうして、試料中に存在し得る残留する未結合の背景タンパク質を除去する。これは一例であるが、当業者は、超常磁性粒子が１つまたは１つよりも多くの空間的に単離された試料から同時期に迅速に単離される幾多の他のシナリオを想起することができる。

【0182】

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、粒子の表面上に形成されたコロナの消化を介したプロテオミクスデータの処理による、生体試料中の特定のタンパク質の同定および測定を提供する。同定および測定され得るタンパク質の例には、高度に豊富なタンパク質、中間の存在量のタンパク質、および低い存在量のタンパク質が含まれる。低い存在量のタンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬまたはそれを下回る濃度で、試料中に存在し得る。高い存在量のタンパク質は、約１０μｇ／ｍＬまたはそれを上回る濃度で、試料中に存在し得る。中程度の存在量のタンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬと約１０μｇ／ｍＬとの間の濃度で、試料中に存在し得る。高度に豊富なタンパク質であるタンパク質の例には、アルブミン、ＩｇＧ、および血漿中の質量の９５％を与える存在量の上位１４のタンパク質が含まれる。さらに、従来の枯渇カラムを使用して精製され得る任意のタンパク質が、本明細書で開示される粒子パネルを使用して試料中で直接検出され得る。タンパク質の例は、Keshishian et al. (Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi:10.1074/mcp.M114.046813. Epub 2015 Feb 27.)、Farr et al. (J Proteome Res. 2014Jan 3;13(1):60-75. doi: 10.1021/pr4010037. Epub 2013 Dec 6.)またはPernemalm et al.(Expert Rev Proteomics. 2014 Aug;11(4):431-48. doi:10.1586/14789450.2014.901157. Epub 2014 Mar 24.)などの公開されたデータベース中に列挙された任意のタンパク質であり得る。

【0183】

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物を使用して測定および同定され得るタンパク質の例には、アルブミン、ＩｇＧ、リゾチーム、ＣＥＡ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、膀胱腫瘍抗原、サイログロブリン、アルファ－フェトプロテイン、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＣＡ１５．３、レプチン、プロラクチン、オステオポンチン、ＩＧＦ－ＩＩ、ＣＤ９８、ファスシン、ｓＰｉｇＲ、１４－３－３エータ、トロポニンＩ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ＢＲＣＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、ＩＬ－６、フィブリノゲン．ＥＧＦＲ、ガストリン、ＰＨ、Ｇ－ＣＳＦ、デスミン．ＮＳＥ、ＦＳＨ、ＶＥＧＦ、Ｐ２１、ＰＣＮＡ、カルシトニン、ＰＲ、ＣＡ１２５、ＬＨ、ソマトスタチン．Ｓ１００、インスリン．アルファ－プロラクチン、ＡＣＴＨ、Ｂｃｌ－２、ＥＲアルファ、Ｋｉ－６７、ｐ５３、カテプシンＤ、ベータカテニン．ＶＷＦ、ＣＤ１５、ｋ－ｒａｓ、カスパーゼ３、ＥＰＮ、ＣＤ１０、ＦＡＳ、ＢＲＣＡ２．ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＧＡ、ＣＲＰ、プロトロンビン、ＣＤ４４、ＡＰＥＸ、トランスフェリン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｅ－カドヘリン、ＩＬ－２、Ｂａｘ、ＩＦＮ－ガンマ、ベータ－２－ＭＧ、ＴＮＦアルファ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、トリプシン、サイクリンＤ１、ＭＧ Ｂ、ＸＢＰ－１、ＨＧ－１、ＹＫＬ－４０、Ｓ－ガンマ、ＮＥＳＰ－５５、ネトリン－１、ジェミニン、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＣＤＫ－６、ＣＣＬ２１、ＢｒＭＳ１、１７ベータＨＤＩ、ＰＤＧＦＲＡ、Ｐｃａｆ、ＣＣＬ５、ＭＭＰ３、クローディン－４およびクローディン－３が含まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子パネルを使用して測定および同定され得るタンパク質の他の例は、目的の特定の疾患適応症（例えば、前立腺がん、肺がんまたはアルツハイマー病）についてｏｐｅｎ ｔａｒｇｅｔｓデータベース中に列挙された任意のタンパク質またはタンパク質群である。

【0184】

生体試料のプロテオミクスデータは、いくつかの異なる分析技法を使用して同定、測定および定量化され得る。例えば、プロテオミクスデータは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは任意のゲルベースの分離技法を使用して分析され得る。ペプチドおよびタンパク質は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを使用しても、同定、測定および定量化され得る。あるいは、プロテオミクスデータは、質量分析、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、エドマン分解、免疫親和性技法、その各々のその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＥＰ３５４８６５２、ＷＯ２０１９０８３８５６、ＷＯ２０１９１３３８９２に開示される方法、および他のタンパク質分離技法を使用して、同定、測定および定量化され得る。
コンピュータ制御システム

【0185】

本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図２９は、本明細書で提供される方法を実装するようにプログラムされたまたは他の方法で構成されたコンピュータシステムを示す。コンピュータシステム９０１は、自動化されることが可能な本明細書で開示されるアッセイの種々の態様（例えば、基板上での本明細書で開示される試薬のいずれかの動き）を調節できる。コンピュータシステム９０１は、ユーザーの電子デバイス、またはその電子デバイスに関して遠隔に位置するコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。

【0186】

コンピュータシステム９０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサー、または並行処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」とも）９０５を含む。コンピュータシステム９０１は、メモリまたはメモリロケーション９１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット９１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース９２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびに周辺デバイス９２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプターもまた含む。メモリ９１０、記憶ユニット９１５、インターフェース９２０および周辺デバイス９２５は、マザーボードなど、通信バス（実線）を介してＣＰＵ９０５と通信する。記憶ユニット９１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム９０１は、通信インターフェース９２０の助けにより、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）９３０に動作可能に連結され得る。ネットワーク９３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク９３０は、一部の場合には、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク９３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つまたは複数のコンピュータサーバーを含み得る。ネットワーク９３０は、一部の場合には、コンピュータシステム９０１の助けにより、コンピュータシステム９０１に連結されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして挙動できるようにし得るピアツーピアネットワークを実装し得る。

【0187】

ＣＰＵ９０５は、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る機械可読命令のシーケンスを実行できる。命令は、メモリ９１０などのメモリロケーション中に記憶され得る。命令は、ＣＰＵ９０５に方向付けられ得、これは、本開示の方法を実装するように、ＣＰＵ９０５を引き続いてプログラムまたは他の方法で構成することができる。ＣＰＵ９０５によって実施される動作の例には、フェッチ、デコード、実行およびライトバックが含まれ得る。

【0188】

ＣＰＵ９０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム９０１の１つまたは複数の他のコンポーネントが、回路中に含められ得る。一部の場合には、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

【0189】

記憶ユニット９１５は、ファイル、例えば、ドライバー、ライブラリーおよび保存されたプログラムを記憶できる。記憶ユニット９１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー選好およびユーザープログラムを記憶できる。コンピュータシステム９０１は、一部の場合には、コンピュータシステム９０１に対して外部の、例えば、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム９０１と通信する遠隔サーバー上に位置する、１つまたは複数のさらなるデータ記憶ユニットを含み得る。

【0190】

コンピュータシステム９０１は、ネットワーク９３０を介して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信できる。例えば、コンピュータシステム９０１は、ユーザーの遠隔コンピュータシステムと通信できる。遠隔コンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）使用可能デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが含まれる。ユーザーは、ネットワーク９３０を介してコンピュータシステム９０１にアクセスできる。

【0191】

本明細書で記載される方法は、コンピュータシステム９０１の電子記憶ロケーション上、例えば、メモリ９１０または電子記憶ユニット９１５上などに記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能なコードによって実装され得る。機械実行可能なコードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用の間、コードは、プロセッサー９０５によって実行され得る。一部の場合には、コードは、記憶ユニット９１５から検索され得、プロセッサー９０５による即座のアクセスのためにメモリ９１０上に記憶され得る。一部の状況では、電子記憶ユニット９１５は除外され得、機械実行可能命令はメモリ９１０上に記憶される。

【0192】

コードは、コードを実行するために適応されたプロセッサーを有する機械との使用のために事前コンパイルおよび構成され得、またはランタイムの間にコンパイルされ得る。コードは、事前コンパイルされたまたはアズコンパイルされた（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式でのコードの実行を可能にするために選択され得るプログラミング言語で提供され得る。

【0193】

本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様、例えば、コンピュータシステム９０１は、プログラミングで具体化され得る。技術の種々の態様は、典型的には、ある型の機械可読媒体上で運搬されるまたはそれで具体化される機械（またはプロセッサー）実行可能なコードおよび／または関連のデータの形態の、「製品」または「製造品」と考えられ得る。機械実行可能なコードは、電子記憶ユニット、例えば、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク上に記憶され得る。「記憶」型媒体には、ソフトウェアプログラミングのための非一時的記憶をいつでも提供し得る、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリのいずれかもしくは全て、またはそれらの関連モジュール、例えば、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが含まれ得る。ソフトウェアの全てまたは部分は、時折、インターネットまたは種々の他の遠隔通信ネットワークを介して通信され得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサー中への、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォーム中への、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを保有し得る別の型の媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線および固定電話回線光ネットワークを介して、ならびに種々のエアーリンク（ａｉｒ－ｌｉｎｋ）を通じて使用されるような光波、電波および電磁波が含まれる。かかる波を運搬する物理的エレメント、例えば、有線または無線リンク、光リンクなどもまた、ソフトウェアを保有する媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。

【0194】

したがって、機械可読媒体、例えば、コンピュータ実行可能なコードは、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体が含まれるがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。非揮発性記憶媒体には、例えば、図面中に示される、データベースを実装するために使用され得るものなどの、例えば、光または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（複数可）中の記憶デバイスのいずれかなどが含まれる。揮発性記憶媒体には、ダイナミックメモリ、例えば、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリが含まれる。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む銅ワイヤおよび光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気シグナルもしくは電磁シグナル、または音波もしくは光波、例えば、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の間に生成されるものの形態をとり得る。したがって、一般的な形態のコンピュータ可読媒体には、例えば、以下が含まれる：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを用いた任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、かかる搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがそこからプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み得る任意の他の媒体。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを、実行のためにプロセッサーに運搬することに関与し得る。

【0195】

コンピュータシステム９０１は、例えば、本明細書で開示される方法を使用して同定されたタンパク質の読み出しを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）９４０を含む電子ディスプレイ９３５を含み得る、またはそれと通信し得る。ＵＩの例には、限定なしに、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースが含まれる。

【0196】

本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実装され得る。アルゴリズムは、中央処理ユニット９０５による実行の際に、ソフトウェアによって実装され得る。

【0197】

決定、分析または統計的分類は、例えば、多種多様な教師ありおよび教師なしデータ分析およびクラスタリングアプローチ、例えば、とりわけ、階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）、機械学習（ランダムフォレストとしても公知）、ロジスティック回帰、ディシジョンツリー、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法、単純ベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰用ＳＶＭ、Ｋ平均クラスタリングおよび隠れマルコフモデルが含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の方法によって実行される。コンピュータシステムは、本開示のタンパク質セットまたはタンパク質コロナを分析する、例えば、生物学的状態に関連するタンパク質セットを決定するためにどのパターンが個々の生体分子コロナ間で共通するかを統計的有意性を伴って決定するためにいくつかの試料の生体分子コロナを比較／分析するなどの、種々の態様を実施できる。コンピュータシステムは、異なるタンパク質セットまたはタンパク質コロナ（例えば、タンパク質コロナの組成の特徴）を検出および判別するための分類器を開発するために使用され得る。本明細書で開示されるセンサーアレイから収集されたデータは、機械学習アルゴリズム、具体的には、患者からのアレイ測定値を受け取り、各患者からの具体的な生体分子コロナ組成を出力するアルゴリズムを訓練するために使用され得る。アルゴリズムを訓練する前に、アレイからの生データは、個々の変数における変動性を低減させるために最初にノイズ除去され得る。

【0198】

機械学習は、学習データセットを経験した後に、新たな見たことのない例／タスクを学習機械が正確に実施する能力として一般化され得る。機械学習には、以下の概念および方法が含まれ得る。教師あり学習概念には、以下が含まれ得る：ＡＯＤＥ；人工ニューラルネットワーク、例えば、誤差逆伝播法、オートエンコーダ、ホップフィールドネットワーク、ボルツマンマシン、制限付きボルツマンマシンおよびスパイキングニューラルネットワーク；ベイズ統計学、例えば、ベイジアンネットワークおよびベイジアン知識ベース；事例ベース推論；ガウス過程回帰；遺伝子発現プログラミング；グループデータ処理法（Ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄａｔａ ｈａｎｄｌｉｎｇ）（ＧＭＤＨ）；帰納論理プログラミング；事例ベース学習；怠惰学習；学習オートマトン；学習ベクトル量子化；ロジスティックモデルツリー；最小メッセージ長（ディシジョンツリー、決定グラフなど）、例えば、最近傍アルゴリズムおよび類推モデリング（Ａｎａｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）；確率的で近似的に正しい学習（ＰＡＣ）学習；リップルダウンルール、知識獲得方法論；シンボリック機械学習アルゴリズム；サポートベクターマシン；ランダムフォレスト；分類器のアンサンブル、例えば、ブートストラップアグリゲーティング（バギング）およびブースティング（メタ－アルゴリズム）；順序分類；情報ファジィネットワーク（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｕｚｚｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）（ＩＦＮ）；条件付き確率場；ＡＮＯＶＡ；線形分類器、例えば、フィッシャーの線形判別、線形回帰、ロジスティック回帰、多項式ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、サポートベクターマシン；二次分類器；ｋ近傍法；ブースティング；ディシジョンツリー、例えば、Ｃ４．５、ランダムフォレスト、ＩＤ３、ＣＡＲＴ、ＳＬＩＱ ＳＰＲＩＮＴ；ベイジアンネットワーク、例えば、単純ベイズ；ならびに隠れマルコフモデル。教師なし学習概念には、以下が含まれ得る：期待値最大化アルゴリズム；ベクトル量子化；生成地形図（Ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ ｍａｐ）；情報ボトルネック法；人工ニューラルネットワーク、例えば、自己組織化マップ；相関ルール学習、例えば、Ａｐｒｉｏｒｉアルゴリズム、ＥｃｌａｔアルゴリズムおよびＦＰｇｒｏｗｔｈアルゴリズム；階層的クラスタリング、例えば、単連結（Ｓｉｎｇｌｅｌｉｎｋａｇｅ）クラスタリングおよび概念クラスタリング；クラスター分析、例えば、Ｋ平均アルゴリズム、ファジィクラスタリング、ＤＢＳＣＡＮおよびＯＰＴＩＣＳアルゴリズム；ならびに外れ値検出、例えば、局所外れ値因子法。半教師あり学習概念には、以下が含まれ得る：生成モデル；低密度分離；グラフベース法；および共訓練。強化学習概念には、以下が含まれ得る：時間的差分学習；Ｑ－学習；学習オートマトン；およびＳＡＲＳＡ。深層学習概念には、以下が含まれ得る：ディーブビリーフネットワーク（Ｄｅｅｐ ｂｅｌｉｅｆ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）；ディープボルツマンマシン；深層畳み込みニューラルネットワーク；深層回帰型ニューラルネットワーク（Ｄｅｅｐ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）；および階層的時間メモリ。コンピュータシステムは、本明細書で記載される方法を実装するために適応され得る。システムは、本明細書で記載される方法を実装するようにプログラムされた中央コンピュータサーバーを含む。サーバーは、シングルコアプロセッサー、マルチコアプロセッサー、または並行処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理ユニット（ＣＰＵ、「プロセッサー」とも）を含む。サーバーは、メモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）；電子記憶ユニット（例えば、ハードディスク）；１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース（例えば、ネットワークアダプター）；ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプターが含まれ得る周辺デバイスもまた含む。メモリ、記憶ユニット、インターフェースおよび周辺デバイスは、マザーボードなど、通信バス（実線）を介してプロセッサーと通信する。記憶ユニットは、データを記憶するためのデータ記憶ユニットであり得る。サーバーは、通信インターフェースの助けにより、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能に連結される。ネットワークは、インターネット、イントラネットおよび／またはエクストラネット、インターネット、遠隔通信またはデータネットワークと通信するイントラネットおよび／またはエクストラネットであり得る。ネットワークは、一部の場合には、サーバーの助けにより、サーバーに連結されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして挙動できるようにし得るピアツーピアネットワークを実装し得る。

【0199】

記憶ユニットは、ファイル、例えば、対象レポート、および／または個体についてのデータもしくは本開示に関連するデータの任意の態様との通信を記憶し得る。

【0200】

コンピュータサーバーは、ネットワークを介して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信し得る。１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォンまたはパーソナルデジタルアシスタントであり得る。

【0201】

一部の適用では、コンピュータシステムは、単一のサーバーを含む。他の状況では、システムは、イントラネット、エクストラネットおよび／またはインターネットを介して互いに通信する多数のサーバーを含む。

【0202】

サーバーは、本明細書で提供される測定データもしくはデータベース、対象からの患者情報、例えば、病歴、家族歴、人口動態データおよび／または特定の適用と潜在的な関連がある他の臨床情報もしくは個人情報などを記憶するために適応され得る。かかる情報は、記憶ユニットまたはサーバー上に記憶され得、かかるデータは、ネットワークを介して伝送され得る。

【0203】

本明細書で記載される方法は、サーバーの電子記憶ロケーション上、例えば、メモリまたは電子記憶ユニット上などに記憶された機械（またはコンピュータプロセッサー）実行可能なコード（またはソフトウェア）によって実装され得る。使用の間、コードは、プロセッサーによって実行され得る。一部の場合には、コードは、記憶ユニットから検索され得、プロセッサーによる即座のアクセスのためにメモリ上に記憶され得る。一部の状況では、電子記憶ユニットは除外され得、機械実行可能命令はメモリ上に記憶される。あるいは、コードは、第２のコンピュータシステム上で実行され得る。

【0204】

本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様、例えば、サーバーは、プログラミングで具体化され得る。技術の種々の態様は、典型的には、ある型の機械可読媒体上で運搬されるまたはそれで具体化される機械（またはプロセッサー）実行可能なコードおよび／または関連のデータの形態の、「製品」または「製造品」と考えられ得る。機械実行可能なコードは、電子記憶ユニット、例えば、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク上に記憶され得る。「記憶」型媒体には、ソフトウェアプログラミングのための非一時的記憶をいつでも提供し得る、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリのいずれかもしくは全て、またはそれらの関連モジュール、例えば、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが含まれ得る。ソフトウェアの全てまたは部分は、時折、インターネットまたは種々の他の遠隔通信ネットワークを介して通信され得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサー中への、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォーム中への、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを保有し得る別の型の媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線および固定電話回線光ネットワークを介して、ならびに種々のエアーリンクを通じて使用されるような光波、電波および電磁波が含まれる。かかる波を運搬する物理的エレメント、例えば、有線または無線リンク、光リンクなどもまた、ソフトウェアを保有する媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーに命令を提供することに関与する任意の媒体を指し得る。

【0205】

本明細書で記載されるコンピュータシステムは、本明細書で記載されるアルゴリズムまたはアルゴリズムベースの方法のいずれかを実施するためのコンピュータ実行可能なコードを含み得る。一部の適用では、本明細書で記載されるアルゴリズムは、少なくとも１つのデータベースから構成されるメモリユニットを使用する。

【0206】

本開示に関するデータは、受け取り手による受け取りおよび／または再検討のためにネットワークまたは接続を通じて伝送され得る。受け取り手は、レポートが関係する対象；またはその介護人、例えば、医療提供者、管理者、他の医療専門家もしくは他の介護者；分析を実施および／もしくは注文した人もしくは実体であり得るが、これらに限定されない。受け取り手はまた、かかるレポートを記憶するためのローカルまたは遠隔システム（例えば、サーバー、または「クラウドコンピューティング」アーキテクチャの他のシステム）であり得る。一実施形態では、コンピュータ可読媒体には、本明細書で記載される方法を使用した生体試料の分析の結果の伝送に適切な媒体が含まれる。

【0207】

本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具体化され得る。技術の種々の態様は、典型的には、ある型の機械可読媒体上で運搬されるまたはそれで具体化される機械（またはプロセッサー）実行可能なコードおよび／または関連のデータの形態の、「製品」または「製造品」と考えられ得る。機械実行可能なコードは、電子記憶ユニット、例えば、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク上に記憶され得る。「記憶」型媒体には、ソフトウェアプログラミングのための非一時的記憶をいつでも提供し得る、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリのいずれかもしくは全て、またはそれらの関連モジュール、例えば、種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが含まれ得る。ソフトウェアの全てまたは部分は、時折、インターネットまたは種々の他の遠隔通信ネットワークを介して通信され得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサー中への、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォーム中への、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを保有し得る別の型の媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線および固定電話回線光ネットワークを介して、ならびに種々のエアーリンクを通じて使用されるような光波、電波および電磁波が含まれる。かかる波を運搬する物理的エレメント、例えば、有線または無線リンク、光リンクなどもまた、ソフトウェアを保有する媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。

【0208】

したがって、機械可読媒体、例えば、コンピュータ実行可能なコードは、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体が含まれるがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。非揮発性記憶媒体には、例えば、図面中に示される、データベースを実装するために使用され得るものなどの、例えば、光または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（複数可）中の記憶デバイスのいずれかなどが含まれる。揮発性記憶媒体には、ダイナミックメモリ、例えば、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリが含まれる。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む銅ワイヤおよび光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気シグナルもしくは電磁シグナル、または音波もしくは光波、例えば、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の間に生成されるものの形態をとり得る。したがって、一般的な形態のコンピュータ可読媒体には、例えば、以下が含まれる：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを用いた任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、かかる搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがそこからプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み得る任意の他の媒体。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを、実行のためにプロセッサーに運搬することに関与し得る。
機械学習を使用したタンパク質コロナの分類

【0209】

疾患もしくは障害および／または疾患状態に関連するタンパク質のセットを決定する方法は、少なくとも２つの試料のコロナの分析を含む。この決定、分析または統計的分類は、例えば、とりわけ、階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、ディシジョンツリー、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法、単純ベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰用ＳＶＭ、Ｋ平均クラスタリングおよび隠れマルコフモデルが含まれる多種多様な教師ありおよび教師なしデータ分析、機械学習、深層学習およびクラスタリングアプローチが含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の方法によって実行される。言い換えると、各試料のコロナ中のタンパク質は、疾患もしくは障害または疾患状態に関連するタンパク質のセットを決定するためにどのパターンが個々のコロナ間で共通するかを統計的有意性を伴って決定するために、互いに比較／分析される。

【0210】

一般に、機械学習アルゴリズムは、例を記述する入力特色に基づいてクラスラベルを例に正確に割り当てるモデルを構築するために使用され得る。一部の場合には、本明細書で記載される方法のために機械学習および／または深層学習アプローチを使用することが有利であり得る。例えば、機械学習は、タンパク質コロナを種々の疾患状態（例えば、疾患なし、疾患の前駆体、初期または後期の疾患を有する、など）に関連付けるために使用され得る。例えば、一部の場合には、１つまたは複数の機械学習アルゴリズムが、タンパク質コロナおよびそれに由来するタンパク質のセットによって検出され得られるデータを分析するために、本発明の方法と併せて使用される。例えば、一実施形態では、機械学習は、対象がプレステージのがん、がんを有するか、またはがんを有さないかもしくは発達させないかを決定するためだけでなく、がんのタイプを区別するためにも、本明細書で記載されるセンサーアレイとカップリングされ得る。

【0211】

他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の参照を含む。本明細書の「または」に対する任意の言及は、特記しない限り、「および／または」を包含する意図である。

【0212】

用語「少なくとも」、「～よりも大きい」または「～よりも大きいまたはそれと等しい」が、一連の２つもしくはそれよりも多くの数値中の最初の数値に先行する場合はいつでも、用語「少なくとも」、「～よりも大きい」または「～よりも大きいまたはそれと等しい」は、その一連の数値中の数値の各々に適用される。例えば、１、２または３よりも大きいまたはそれと等しいは、１よりも大きいもしくはそれと等しい、２よりも大きいもしくはそれと等しい、または３よりも大きいもしくはそれと等しい、と等価である。

【0213】

用語「～以下」、「～未満」、「～未満またはそれと等しい」または「多くても」が、一連の２つもしくはそれよりも多くの数値中の最初の数値に先行する場合はいつでも、用語「～以下」、「～未満」または「～未満またはそれと等しい」または「多くても」は、その一連の数値中の数値の各々に適用される。例えば、３、２または１未満またはそれと等しいは、３未満もしくはそれと等しい、２未満もしくはそれと等しい、または１未満もしくはそれと等しい、と等価である。

【0214】

値が範囲として記載される場合、かかる開示は、具体的な数値または具体的な下位範囲が明示的に提示されているかどうかにかかわらず、かかる範囲内の全ての可能な下位範囲ならびにかかる範囲内に入る具体的な数値の開示を含むと理解される。
番号付き実施形態

【0215】

以下の実施形態は、本明細書で開示される特色の組合せの非限定的な並び替えを列挙する。特色の組合せの他の並び替えもまた企図される。特に、これらの番号付き実施形態の各々は、それらが列挙された順序にかかわらず、全ての以前のまたは引き続く番号付き実施形態に従属するまたはそれに関連すると企図される。１．試料を逐次的に問い合わせる方法であって、ａ）試料を第１の粒子タイプに接触させ、第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップであって、第１の生体分子コロナが、第１の粒子タイプと試料とのインキュベーションの際に形成し、第１の生体分子コロナがタンパク質を含む、ステップ；ｂ）第１の生体分子コロナを構成する第１の粒子タイプを、試料から分離するステップ；ｃ）試料を第２の粒子タイプに接触させ、第２の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第２の生体分子コロナを形成するステップであって、第２の生体分子コロナが、第２の粒子タイプと試料とのインキュベーションの際に形成し、第２の生体分子コロナがタンパク質を含み、さらに、（ｉ）第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが同じ粒子タイプである、または（ｉｉ）第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが異なる、ステップ；ｄ）第２の生体分子コロナを構成する第２の粒子タイプを、試料から分離するステップ；ｅ）第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナをアッセイして、アッセイされた第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナに基づいて、試料中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップを含む、方法。２．第１の粒子タイプを試料と共にインキュベートして第１の生体分子コロナを形成するステップの際に、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される、実施形態１に記載の方法。３．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、ａ）第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナルの第１の比である、実施形態２に記載の方法。４．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第１の比である、実施形態２に記載の方法。５．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第１の比である、実施形態２に記載の方法。６．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第１の比である、実施形態２に記載の方法。７．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第１の比である、実施形態２に記載の方法。８．試料中の同じタンパク質の既知の濃度が、データベースから得られる、実施形態７に記載の方法。９．試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、ａ）総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナルの第２の比である、実施形態２から８のいずれか一項に記載の方法。１０．試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対する第２の比である、実施形態２から８のいずれか一項に記載の方法。１１．試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対する第２の比である、実施形態２から８のいずれか一項に記載の方法。１２．試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含む第２の比である、実施形態２から８のいずれか一項に記載の方法。１３．試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含む第２の比である、実施形態２から８のいずれか一項に記載の方法。１４．試料中の同じタンパク質の既知の濃度が、データベースから得られる、実施形態１３に記載の方法。１５．ダイナミックレンジを圧縮させることが、第２の比と比較して減少した第１の比を含む、実施形態９から１４のいずれか一項に記載の方法。１６．減少した第１の比が、第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である、実施形態１５に記載の方法。１７．第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、実施形態１から１６のいずれか一項に記載の方法。１８．第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップまたは第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップが、質量分析を実施するステップを含む、実施形態１から１７のいずれか一項に記載の方法。１９．ステップａ）、ｂ）およびｅ）を、１つまたは複数のさらなる粒子タイプを用いて反復して、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む、実施形態１から１８のいずれか一項に記載の方法。２０．１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、第１の粒子タイプまたは第２の粒子タイプと同じである、実施形態１９に記載の方法。２１．１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、第１の粒子タイプとも、第２の粒子タイプとも、それらの組合せとも異なる、実施形態１９に記載の方法。２２．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナが、試料由来のタンパク質を含む、実施形態１９から２１のいずれか一項に記載の方法。２３．第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、少なくとも１００種の別個のタンパク質を含む、実施形態１９から２２のいずれか一項に記載の方法。２４．第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む、実施形態１９から２３のいずれか一項に記載の方法。２５．第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、異なる組成のタンパク質、異なる濃度のタンパク質サブセット、またはそれらの組合せを含む、実施形態１９から２４のいずれか一項に記載の方法。２６．１つまたは複数のさらなる粒子タイプを試料と共にインキュベートして１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップの際に、１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、総タンパク質分析方法によって測定した場合、試料中の複数のタンパク質のダイナミックレンジと比較して圧縮される、実施形態１９から２５のいずれか一項に記載の方法。２７．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、ａ）１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより高い存在量のタンパク質によって生成されるシグナル；およびｂ）１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のより低い存在量のタンパク質によって生成されるシグナルのさらなる比である、実施形態２６に記載の方法。２８．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中の最も高い存在量のタンパク質の濃度の、最も低い存在量のタンパク質の濃度に対するさらなる比である、実施形態２６に記載の方法。２９．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の上位十分位群の、タンパク質の下位十分位群に対するさらなる比である、実施形態２６に記載の方法。３０．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の四分位範囲のスパンを含むさらなる比である、実施形態２６に記載の方法。３１．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナ中の複数のタンパク質のダイナミックレンジが、１つまたは複数の生体分子コロナ中の複数のタンパク質中のタンパク質の全ての濃度対試料中の同じタンパク質の既知の濃度のプロット中のフィットされたデータの傾きを含むさらなる比である、実施形態２６に記載の方法。３２．試料中の同じタンパク質の既知の濃度が、データベースから得られる、実施形態３１に記載の方法。３３．ダイナミックレンジを圧縮させることが、第２の比と比較して減少したさらなる比を含む、実施形態２７から３２のいずれか一項に記載の方法。３４．減少した第１の比が、第２の比の、多くて１．１分の１、多くて１．２分の１、多くて１．３分の１、多くて１．４分の１、多くて１．５分の１、多くて２分の１、多くて２．５分の１、多くて３分の１、多くて３．５分の１、多くて４分の１、多くて５分の１または多くて１０分の１である、実施形態３３に記載の方法。３５．総タンパク質分析方法が、質量分析、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによる試料中の複数のタンパク質の直接的定量化を含む、実施形態２から３４のいずれか一項に記載の方法。３６．試料が、約１０００μＬ以下、約９００μＬ以下、約８００μＬ以下、約７００μＬ以下、約６００μＬ以下、約５００μＬ以下、約４００μＬ以下、約３００μＬ以下、約２００μＬ以下、約１００μＬ以下、約５０μＬ以下、約２０μＬ以下、約１０μＬ以下、約５μＬ以下、約２μＬ以下または約１μＬ以下の試料体積を含む、実施形態１から３５のいずれか一項に記載の方法。３７．試料が生体試料を含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載の方法。３８．生体試料が生物流体を含む、実施形態３７に記載の方法。３９．生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される、実施形態３８に記載の方法。４０．生物流体が、血漿または血清である、実施形態３８から３９のいずれか一項に記載の方法。４１．生物流体が脳脊髄液である、実施形態３８から３９のいずれか一項に記載の方法。４２．第



１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、表１から選択される、実施形態１９から４１のいずれか一項に記載の方法。４３．ステップａ）の前に試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を試料から除去するステップを含む、実施形態１から４２のいずれか一項に記載の方法。４４．１つまたは複数のさらなる生体分子コロナがタンパク質を含む、実施形態１９から４３のいずれか一項に記載の方法。４５．第１の生体分子コロナ、第２の生体分子コロナ、１つもしくは複数のさらなる生体分子コロナ、またはそれらの任意の組合せが、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１９から４４のいずれか一項に記載の方法。４６．第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、または１つもしくは複数のさらなる粒子タイプが、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なる、実施形態１９から４５のいずれか一項に記載の方法。４７．第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが、少なくとも１つの物理化学的特性によって異なり、第１の生体分子コロナが、第２の生体分子コロナと比較して、別個であるが重複するセットのタンパク質を含む、実施形態１から４６のいずれか一項に記載の方法。４８．複数のタンパク質の組成および複数のタンパク質のタンパク質の濃度が、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中の別個であるが重複するセットのタンパク質に基づいて決定される、実施形態１から４７のいずれか一項に記載の方法。４９．第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１９から４８のいずれか一項に記載の方法。５０．第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、超常磁性粒子である、実施形態１から４９のいずれか一項に記載の方法。５１．第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプ、１つもしくは複数のさらなる粒子タイプ、またはそれらの任意の組合せが、表１から選択される、実施形態１から５０のいずれか一項に記載の方法。５２．第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが同じ粒子タイプであり、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が同じである、実施形態１から５１のいずれか一項に記載の方法。５３．第１の粒子タイプおよび第２の粒子タイプが異なり、第１の生体分子コロナおよび第２の生体分子コロナ中のアッセイされたタンパク質の７０％以下、８０％以下、９０％以下または９５％以下が同じである、実施形態１から５２のいずれか一項に記載の方法。５４．複数の生物流体を分析するハイスループット方法であって、ａ）複数の生物流体の第１の生物流体および第２の生物流体を、粒子タイプと接触させるステップ；ｂ）第１の体積において、粒子タイプを、複数の生物流体の第１の生物流体から分離し、粒子タイプに対応する第１の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップ；およびｃ）第２の体積において、粒子タイプを、複数の生物流体の第２の生物流体から分離し、粒子タイプに対応する第２の生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を決定するステップを含み、第１の生物流体および第２の生物流体が、異なる生物流体である、方法。５５．複数の生物流体の生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートおよび細胞培養物試料からなる群から選択される、実施形態５４に記載の方法。５６．生物流体が、血漿または血清である、実施形態５５に記載の方法。５７．生物流体が脳脊髄液である、実施形態５５に記載の方法。５８．粒子タイプを試料と接触させるステップの際に生体分子コロナが形成し、第１の生体分子コロナがタンパク質を含む、実施形態５４から５７のいずれか一項に記載の方法。５９．生体分子コロナが、脂質、核酸、多糖、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態５８に記載の方法。６０．ステップａ）の前に試料を枯渇させるまたは分画することによって、高い存在量のタンパク質を試料から除去するステップを含む、実施形態５４から５９のいずれか一項に記載の方法。６１．粒子タイプが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態５４から６０のいずれか一項に記載の方法。６２．粒子タイプが超常磁性粒子である、実施形態５４から６１のいずれか一項に記載の方法。６３．粒子タイプが、表１から選択される、実施形態５４から６２のいずれか一項に記載の方法。６４．分離するステップが、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む、実施形態１から６３のいずれか一項に記載の方法。６５．接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態１から６４のいずれか一項に記載の方法。６６．生物学的状態を同定する訓練済みアルゴリズムを使用して、生体分子コロナ中の複数のタンパク質の組成および濃度を処理する、生物流体の生物学的状態を同定するステップをさらに含む、実施形態３８から５３または５５から６５のいずれか一項に記載の方法。６７．生物流体が、対象から単離される、実施形態３８から５３または５５から６６のいずれか一項に記載の方法。６８．対象がヒトである、実施形態６７に記載の方法。６９．対象が非ヒト動物である、実施形態６７に記載の方法。７０．対象が状態を有する、実施形態６７から６９のいずれか一項に記載の方法。７１．状態が疾患状態である、実施形態７０に記載の方法。７２．疾患状態ががんである、実施形態７１に記載の方法。７３．がんが、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がんまたは乳がんである、実施形態７２に記載の方法。７４．疾患状態がアルツハイマー病である、実施形態７１に記載の方法。７５．分離するステップが、磁気分離、カラムベースの分離、濾過、スピンカラムベースの分離、遠心分離、超遠心分離、密度もしくは勾配ベースの遠心分離、重力分離、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１から７４のいずれか一項に記載の方法。７６．生物流体を分析する方法であって、ａ）生物流体収集管中で生物流体を粒子タイプと接触させるステップであって、血液収集管が、安定化試薬を含み、安定化試薬が、生物流体中の無細胞核酸分子を安定化する、ステップ；およびｂ）生物流体および粒子タイプを生物流体収集管中でインキュベートして、粒子タイプへの生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、粒子タイプに結合したタンパク質を含む生体分子コロナを形成する、ステップを含み、生体分子コロナが、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートして対照生体分子コロナを形成させた場合にも検出されるタンパク質の集団を含み；かつ生物流体および粒子タイプが、約２０℃～約３５℃で生物流体収集管中でインキュベートされ、生体分子コロナのタンパク質の集団の５０％またはそれよりも多くが、対照生体分子コロナ中でも検出可能である、方法。７７．生体分子コロナのタンパク質の集団の６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、または９０％もしくはそれよりも多くが、対照生体分子コロナ中でも検出可能である、実施形態７６に記載の方法。７８．タンパク質の集団の少なくともサブセットが、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、実施形態７６から７７のいずれか一項に記載の方法。７９．タンパク質の集団の少なくとも５％が、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、実施形態７６から７８のいずれか一項に記載の方法。８０．タンパク質の集団の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりも高い存在量で検出される、実施形態７６から７９のいずれか一項に記載の方法。８１．粒子タイプをＥＤＴＡ中で貯蔵した生物流体中でインキュベートした場合よりもより低い検出限界で、生体分子コロナ中のタンパク質をアッセイするステップをさらに含む、実施形態７６から８０のいずれか一項に記載の方法。８２．インキュベートするステップが、室温でインキュベートするステップを含む、実施形態７６から８１のいずれか一項に記載の方法。８３．インキュベートするステップが、最大で１４日間、最大で１３日間、最大で１２日間、最大で１１日間、最大で１０日間、最大で９日間、最大で８日間、最大で７日間、最大で６日間、最大で５日間、最大で４日間または最大で３日間にわたってインキュベートするステップを含む、実施形態７６から８２のいずれか一項に記載の方法。８４．インキュベートするステップが、最大で１４日間にわたってインキュベートするステップを含む、実施形態７６から８３のいずれか一項に記載の方法。８５．生体分子コロナが、対照生体分子コロナには存在しない独自のタンパク質を含む、実施形態７６から８４のいずれか一項に記載の方法。８６．生体分子コロナが、少なくとも１００種の別個のタンパク質、少なくとも２００種の別個のタンパク質、少なくとも３００種の別個のタンパク質、少なくとも４００種の別個のタンパク質、少なくとも５００種の別個のタンパク質、少なくとも１０００種の別個のタンパク質、少なくとも２０００種の別個のタンパク質または少なくとも５０００種の別個のタンパク質を含む、実施形態７６から８５のいずれか一項に記載の方法。８７．粒子タイプが、１００種またはそれよりも多くの別個のタンパク質に結合する、実施形態７６から８６のいずれか一項に記載の方法。８８．生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料を含む、実施形態８６から８７のいずれか一項に記載の方法。８９．生物流体が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、滑液、涙、唾液、全血、乳汁、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝滲出液、精液、前立腺液、痰、糞便物質、気管支洗浄、スワビングからの流体、気管支吸引液、流動化固体、細針吸引試料、組織ホモジネートまたは細胞培養物試料である、実施形態８６から８８のいずれか一項に記載の方法。９０．粒子タイプを生物流体から分離するステップをさらに含む、実施形態７６から８９のいずれか一項に記載の方法。９１．分離するステップが、磁気分離、濾過、重力分離または遠心分離を含む、実施形態９０に記載の方法。９２．生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、実施形態７６から９１のいずれか一項に記載の方法。９３．対照生体分子コロナ中のタンパク質の組成および濃度を決定するステップをさらに含む、実施形態７６から９２のいずれか一項に記載の方法。９４．タンパク質の組成および濃度を決定するステップが、質量分析、ゲル電気泳動または液



体クロマトグラフィーを含む、実施形態７６から９３のいずれか一項に記載の方法。９５．安定化試薬が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、防腐剤、またはそれらの組合せを含む、実施形態７６から９４のいずれか一項に記載の方法。９６．代謝阻害剤が、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、１，３－ビスホスホグリセレート、３－ホスホグリセレート、２－ホスホグリセレート、ホスホエノールピルベート、ピルベートおよびグリセレートジヒドロキシアセテート、フッ化ナトリウム、またはＫ２Ｃ２Ｏ４を含む、実施形態９５に記載の方法。９７．プロテアーゼ阻害剤が、アンチパイン、アプロチニン、キモスタチン、エラスタチナール、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＡＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、ダイズトリプシン阻害剤、インドール酢酸（ＩＡＡ）、Ｅ－６４、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、ＶｄＬＰＦＦＶｄＬ、１，１０－フェナントロリン、ホスホラミドン、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡ、ジプロチンＢ、アルファ－２－マクログロブリン、ライマメトリプシン阻害剤、膵プロテアーゼ阻害剤または卵白オボスタチン、卵白シスタチンを含む、実施形態９５または実施形態９６に記載の方法。９８．ホスファターゼ阻害剤が、カリクリンＡ、ノジュラリン、ＮＩＰＰ－１、ミクロシスチンＬＲ、トートマイシン、オカダ酸、カンタリジン、ミクロシスチンＬＲ、オカダ酸、フォストリエシン、トートマイシン、カンタリジン、エンドサール、ノジュラリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６／イムノフィリン複合体、シペルメトリン、デルタメトリン、フェンバレレート、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、デフォスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）ＤＭＨＶまたはオルトバナジン酸ナトリウムを含む、実施形態９５から９７のいずれか一項に記載の方法。９９．ヌクレアーゼ阻害剤が、ジエチルピロカーボネート、エタノール、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、ホルムアミド、バナジル－リボヌクレオシド複合体、マカロイド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、プロテイナーゼＫ、ヘパリン、ヒドロキシルアミン－酸素－第二銅イオン、ベントナイト、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ－メルカプトエタノール、システイン、ジチオエリトリトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、またはＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｚｎ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｃａ^＋２もしくはＣｕ^＋２などの二価カチオンを含む、実施形態９５から９８のいずれか一項に記載の方法。１００．防腐剤が、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール－５，５－ジメチルヒダントイン、ジメチロール尿素、２－ブロモ－２－ニトロプロパン－１，３－ジオール、オキサゾリジン、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、５－ヒドロキシメトキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシメチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５－ヒドロキシポリ［メチレンオキシ］メチル－１－アザ－３，７－ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタンまたは第４級アダマンタンを含む、実施形態９５から９９のいずれか一項に記載の方法。１０１．生物流体収集管が血液収集管である、実施形態７６から１００のいずれか一項に記載の方法。１０２．粒子タイプが、ナノ粒子またはマイクロ粒子である、実施形態７６から１０１のいずれか一項に記載の方法。１０３．粒子タイプが、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄粒子、グラフェン粒子、シリカ粒子、タンパク質ベースの粒子、ポリスチレン粒子、銀粒子、金粒子、金属粒子、量子ドット、超常磁性粒子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態７６から１０２のいずれか一項に記載の方法。１０４．粒子タイプが、表１から選択される、実施形態７６から１０３のいずれか一項に記載の方法。１０５．生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させるステップ、生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと共にインキュベートして、１つまたは複数のさらなる粒子タイプへの生物流体のタンパク質の結合を可能にし、それにより、１つまたは複数のさらなる粒子タイプに結合したタンパク質を含む１つまたは複数のさらなる生体分子コロナを形成するステップをさらに含む、実施形態７６から１０４のいずれか一項に記載の方法。１０６．１つまたは複数のさらなる粒子タイプが、粒子タイプの生体分子タンパク質中のタンパク質の集団と別個であるが重複するタンパク質の集団に結合する、実施形態１０５に記載の方法。１０７．生物流体を１つまたは複数のさらなる粒子タイプと接触させるステップが、生物流体を粒子タイプと接触させるステップの後に行われる、実施形態１０５から１０６のいずれか一項に記載の方法。１．複数の生物流体を分析する方法であって、（ａ）複数の生物流体の各生物流体を別々にナノ粒子と接触させるステップ、（ｂ）第１のナノ粒子を単離し、複数の生物流体の第１の生物流体に対応する第１のタンパク質コロナを分析するステップ；および（ｃ）第２のナノ粒子を単離し、複数の生物流体の第２の生物流体に対応する第２のタンパク質コロナを分析するステップ、を含み、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）が同時に行われる、方法。２．複数の生物流体を第３のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。３．複数の生物流体を第４のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載の方法。４．複数の生物流体を第５のナノ粒子と接触させるステップをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。５．第１のナノ粒子および第２のナノ粒子が同じである、実施形態１に記載の方法。６．複数の生物流体を最大で１０の異なるナノ粒子と接触させるステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。７．ナノ粒子が、脂質、ポリマー、金属、またはそれらの任意の組合せから選択される材料で作製される、実施形態１に記載の方法。８．ポリマーが、ＰＳ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡまたはＰＶＰを含む、実施形態７に記載の方法。９．脂質が、ＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＧまたはＤＰＰＧを含む、実施形態７に記載の方法。１０．金属が、酸化鉄、金または銀を含む、実施形態７に記載の方法。１１．ナノ粒子が、正の表面電荷を含む、実施形態１に記載の方法。１２．ナノ粒子が、負の表面電荷を含む、実施形態１に記載の方法。１３．ナノ粒子が、中性の表面電荷を含む、実施形態１に記載の方法。１４．ナノ粒子が、１～４００ｎｍのサイズを含む、実施形態１に記載の方法。１５．生物流体が、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙または唾液を含む、実施形態１に記載の方法。１６．第１のタンパク質コロナを、第１の生物流体を第１のナノ粒子と接触させることによって同定された第１の対照タンパク質コロナと比較するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。１７．第２のタンパク質コロナを、第２の生物流体を第２のナノ粒子と接触させることによって同定された第２の対照タンパク質コロナと比較するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。１８．第１のタンパク質コロナを第１の生物学的状態に相関させるステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。１９．第２のタンパク質コロナを第２の生物学的状態に相関させるステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。１．対象の試料の生物学的状態を同定する方法であって、試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートし、それにより、枯渇された試料を生成するステップ；枯渇された試料を第１のナノ粒子と共にインキュベートして、タンパク質コロナを生成するステップ；第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナ中のタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップ；および訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップを含む、方法。２．対象由来のタンパク質試料の生物学的状態を同定する方法であって、タンパク質試料を分画し、それにより、タンパク質試料中のタンパク質サブセットを含む分画された試料を生成するステップ；枯渇された試料を第１のナノ粒子と共にインキュベートして、タンパク質コロナを生成するステップ；第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナのタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップ；および訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップを含み、試料を分画するステップが、コーン法、カラムクロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、濾過、限外濾過および低温沈殿からなる群から選択される方法を用いて高い存在量のタンパク質を分離するステップを含む、方法。３．試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートするステップが、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約３０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から抽出するステップを含む、実施形態１に記載の方法。４．試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約３０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から抽出するステップが、高い存在量のタンパク質の少なくとも約８０％を試料から除去する、実施形態３に記載の方法。５．枯渇ナノ粒子に関連したタンパク質コロナを分析するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。６．試料を枯渇ナノ粒子と共にインキュベートするステップが、試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約６０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から少なくとも２回抽出するステップを含む、実施形態１に記載の方法。７．試料を枯渇ナノ粒子と共に少なくとも約６０分間にわたってインキュベートするステップおよび枯渇ナノ粒子を試料から少なくとも２回除去するステップが、高い存在量のタンパク質の９９％を除去する、実施形態６に記載の方法。８．枯渇された試料中の第１のナノ粒子の濃度が、１～５０ｍｇ／ｍＬである、実施形態１または２に記載の方法。９．枯渇された試料中の第１のナノ粒子の濃度が、２．５～１０ｍｇ／ｍＬである、実施形態１または２に記載の方法。１０．枯渇ナノ粒子が、第１のナノ粒子と比較して、少なくとも１つの異なる物理化学的特性を含む、実施形態１に記載の方法。１１．異なる物理化学的特性が、サイズ、表面電荷または化学的部分を含む、実施形態１０に記載の方法。１２．第１のナノ粒子に関連したタンパク質コロナ中のタンパク質に対応するタンパク質データを生成するステップが、タンパク質コロナ中の各独自のタンパク質の濃度を決定するステップおよびタンパク質コロナ中の各独自のタンパク質の濃度を生物学的状態に相関させるステップを含む、実施形態１または２に記載の方法。１３．訓練済みアルゴリズムを使用してタンパク質データを処理して、対象の生物学的状態を同定するステップが、生物学的状態を生体分子フィンガープリントに関連させるステップを含む、実施形態１または２に記載の方法。１４．試料が、血漿または血清である、実施形態１または２に記載の方法。１５．タンパク質データを処理するステップが、タンパク質コロナを分析するステップ、枯渇前に試料を分析するステップ、または枯渇された試料を分析するステップを含む、実施形態１に記載の方法。１６．タンパク質データを処理するステップが、タンパク質コロナを分析するステップ、分画前にタンパク質試料を分析するステップ、または分画された試料を分析するステップを含む、実施形態２に記載の方法。１７．生体試料をアッセイするための方法であって、（ａ）タンパク質を含む複数の生体分子を含む生体試料を得るステップ；（ｂ）サイズ、電荷、疎水性、構造および親和性からなる群から選択される１つまたは複数の特色に基づいて前記生体試料を富化して、処理された生体試料を得るステップ；（ｃ）１つまたは複数のナノ粒子の助けにより、少なくとも生体分子の第



１のサブセットおよび生体分子の第２のサブセットを、（ｂ）の前記処理された生体試料から生成するステップであって、生体分子の前記第１のサブセットが前記１つまたは複数のナノ粒子に関連し、生体分子の前記第２のサブセットが前記１つまたは複数のナノ粒子に関連しない、ステップ；ならびに（ｄ）少なくとも生体分子の前記第１のサブセットまたは生体分子の前記第２のサブセットに対して、１つまたは複数のアッセイを別々に実施するステップを含む、方法。１８．（ｅ）生体分子の前記第１のサブセットを生体分子の前記第２のサブセットから単離するステップをさらに含む、実施形態１７に記載の方法。１９．前記１つまたは複数のアッセイが、質量分析および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）からなる群から選択されるアッセイを含む、実施形態１７に記載の方法。２０．前記１つまたは複数のアッセイが、質量分析を含む、実施形態１７に記載の方法。２１．前記生体試料を富化するステップが、前記処理された生体試料を得るための分画を含む、実施形態１７に記載の方法。２２．分画が、コーン法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、濾過、限外濾過および低温沈殿からなる群から選択される方法を用いて高い存在量のタンパク質を分離するステップを含む、実施形態２１に記載の方法。２３．前記生体試料を富化して、前記処理された生体試料を得るステップが、１種または複数のタンパク質を枯渇させるステップを含む、実施形態１７に記載の方法。２４．（ｂ）において、１つまたは複数の枯渇ナノ粒子が、前記処理された生体試料を得るために使用される、実施形態１７に記載の方法。２５．（ｂ）の前記１つまたは複数の枯渇ナノ粒子が、（ｃ）の前記１つまたは複数のナノ粒子とは異なる、実施形態２４に記載の方法。２６．前記１つまたは複数のアッセイが、前記第１のサブセットに対して実施され、このアッセイがＥＬＩＳＡである、実施形態１７に記載の方法。２７．前記生体試料が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙、唾液、全血、乳頭吸引物、乳管洗浄、膣液、鼻液、耳液、胃液、膵液、線維柱帯液、肺洗浄、汗、歯肉溝周囲滲出液、精液、前立腺液、痰、滑液、糞便物質、線維柱帯液、気管支洗浄、スワビングからの流体、および気管支吸引液からなる群から選択される生物流体である、実施形態１７に記載の方法。２８．前記１つまたは複数のアッセイが、プロテオミクスデータを生じる方法であって、前記プロテオミクスデータを処理して生物学的状態を予測するステップをさらに含む、実施形態１７に記載の方法。２９．前記プロテオミクスデータを処理する前記ステップが、訓練済みアルゴリズムの使用を含み、この訓練済みアルゴリズムが、生体試料の独立したセットを使用して訓練済みである、実施形態２８に記載の方法。３０．生体分子の前記第１のサブセットが、前記１つまたは複数のナノ粒子とのインキュベーションの際に、前記１つまたは複数のナノ粒子に関連して、タンパク質コロナを形成する、実施形態１７に記載の方法。３１．前記生体試料が、（ａ）の前に枯渇される、実施形態１７に記載の方法。３２．生体分子の前記第１のサブセットおよび生体分子の前記第２のサブセットがタンパク質を含む、実施形態１７に記載の方法。

【実施例】

【0216】

以下の実際例は、本明細書で記載されるデバイス、方法、システムおよびキットの範囲に対して、例示的かつ非限定的である。
（実施例１）
脳脊髄液（ＣＳＦ）タンパク質コロナ中のタンパク質の同定

【0217】

この実施例は、脳脊髄液（ＣＳＦ）タンパク質コロナ中のタンパク質の同定を記載する。

【0218】

脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からタンパク質コロナを産生するために、約１００μＬのＰ３９粒子を、マイクロタイタープレート中で約１００μＬのニートＣＳＦと混合した。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら約３７℃で約１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、磁気収集の上に約５分間置いて、粒子をペレット化して落とした。生体試料中の未結合のタンパク質をピペッティングして除去した。タンパク質コロナを、磁気分離を用いて約２００μＬのＰＢＳで３回、さらに洗浄した。

【0219】

粒子上に結合したタンパク質を消化するために、トリプシン消化キット（ｉＳＴ ９６Ｘ、ＰｒｅＯｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、提供されたプロトコールに従って使用した。簡潔に述べると、最後のラウンドの洗浄緩衝液をプレートからピペッティングして除去した後、約５０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加し、試料を、攪拌しながら約９５℃で約１０分間加熱した。プレートを室温に冷却した後、トリプシン消化緩衝液を添加し、プレートを、振盪しながら約３７℃で約３時間インキュベートした。消化プロセスを、停止緩衝液を用いて停止させた。上清を、磁気収集器によって粒子から分離し、キット中に含まれるペプチド浄化カートリッジによってさらに浄化した。ペプチドを、約７５μＬの溶出緩衝液で２回溶出し、合わせた。ペプチド濃度を、Ｐｉｅｒｃｅの定量的比色分析ペプチドアッセイキットによって測定した。

【0220】

ペプチド溶出物を凍結乾燥し、約０．１％のＴＦＡ中で再構成した。約２μｇのアリコート（提出されたタンパク質定量値に基づく）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓにインターフェース接続したＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いるナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチドを、捕獲カラム上にロードし、７５μｍの分析カラム上で３５０ｎＬ／分で溶出した；両方のカラムに、Ｌｕｎａ Ｃ１８樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。１時間の勾配も用いて獲得した試料３３２９５を除く全ての場合において、２時間の勾配を使用した。質量分析器を、データ依存的モードで動作させ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを、それぞれ、６０，０００のＦＷＨＭ分解能および１５，０００のＦＷＨＭ分解能でＯｒｂｉｔｒａｐにおいて実施した。ＡＰＤをオンにした。機器を、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳについて３秒サイクルで実行した。質量分析データを、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアｖ１．６．０．１６を介して処理した。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔを使用して、１％のタンパク質およびペプチド偽陽性率（ＦＤＲ）でタンパク質同定を検索した。ピーク面積を、検出されたペプチドについて計算した。ＭａｘＱｕａｎｔ結果を、視覚化のためにＳｃａｆｆｏｌｄソフトウェア中にパースした。

【0221】

図１は、異なるＣＳＦ試料中の同定されたタンパク質の総数を示す。１０個の個々のＣＳＦ試料のセットを、Ｐ３９と相互作用させて、質量分析的分析について１０個のタンパク質コロナを創出した。同定されたタンパク質の総数を、各試料について計数した：ＣＳＦ１について － 約７１０種のタンパク質；ＣＳＦ２について － 約８５０種のタンパク質；ＣＳＦ３について － 約６２０種のタンパク質；ＣＳＦ４について － 約７６０種のタンパク質；ＣＳＦ５について － 約７００種のタンパク質；ＣＳＦ６について － 約６２０種のタンパク質；ＣＳＦ７について － 約６９０種のタンパク質；ＣＳＦ８について － 約７６０種のタンパク質；ＣＳＦ９について － 約７１０種のタンパク質；およびＣＳＦ１０について － 約６４０種のタンパク質。データは、血漿中で同じ粒子を用いて得られたタンパク質よりも有意に高い数のタンパク質を示す。ＣＳＦタンパク質は、それらの大部分が血漿中で測定不能であるので、一緒にクラスタリングする。

【0222】

図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、ＣＳＦおよび血漿／血清タンパク質コロナは、２つのタイプの試料の良好な分離を実証した。血清または血漿タンパク質コロナの４つの試料を、ヒートマップの左の４つのノード上にクラスタリングした。全てのＣＳＦタンパク質コロナを、ヒートマップの右側にクラスタリングした。また、図３は、ＣＳＦタンパク質コロナおよび血漿タンパク質コロナに関連するスペクトル計数を示す。

【0223】

図４は、異なる粒子に由来するＣＳＦタンパク質コロナ中の同定されたタンパク質の総数を示す。プールされたＣＳＦ試料を、全ての粒子に使用した。１０００種よりも多くの独自のタンパク質が、全ての粒子を用いて同定された。
（実施例２）
尿タンパク質コロナ中のタンパク質の同定

【0224】

この実施例は、尿タンパク質コロナ中のタンパク質の同定を記載する。

【0225】

尿試料からタンパク質コロナを産生するために、約１００μＬのＰ３９粒子を、マイクロタイタープレート中で１００μＬのニート尿試料と混合した。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。アッセイの残りは、実施例１に記載した、ＣＳＦタンパク質コロナと同じ方法によって実施した。

【0226】

図５に示されるように、かなりの数のタンパク質が、各尿試料中で同定された。図５中、１０個の個々の尿試料（Ｕ１～Ｕ１０）および１つの対照血漿試料（ＰＣ）のセットを、Ｐ３９と相互作用させて、質量分析的分析について１１個のタンパク質コロナを創出した。各尿試料中で同定された同定されたタンパク質の総数は、試験した全ての尿試料について、血漿中の同定されたタンパク質の数よりも高かった。
（実施例３）
ペプチドコロナの同定のための試料調製

【0227】

この実施例は、ペプチドコロナの同定のための試料調製を記載する。

【0228】

ペプチドコロナからプロテオミクスデータを生成するために、血漿試料を、トリプシンでの消化前に、最初に変性させ還元した。得られたペプチドを、マイクロタイタープレート中で約１００μＬの常磁性粒子と共にインキュベートした。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら約３７℃で約１時間インキュベートした。ペプチドコロナを、磁気分離を用いてＴＥ緩衝液で３回洗浄した。結合したペプチドを、５０％のアセトニトリル中１％のＴＦＡで溶出した。ペプチド溶出物を凍結乾燥し、０．１％のＴＦＡ中で再構成し、その後、質量分析的分析のために提出した。
（実施例４）
タンパク質コロナの測定を多重化する

【0229】

この実施例は、タンパク質コロナの測定を多重化することを記載する。

【0230】

タンパク質コロナは、２つの異なる方法で多重化され得る：粒子混合および消化後混合。

【0231】

粒子混合を用いて、粒子を、ほぼ等しい濃度で調製し、事前混合し、その後、マイクロタイタープレートに約１００μＬでプレートした。生体試料を、通常通り調製し、混合物を少なくとも約１０回ピペッティングで上下させて、粒子と完全に混合した。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら約３７℃で約１時間インキュベートした。アッセイの残りは、実施例１に記載した、ＣＳＦタンパク質コロナと同じ方法によって実施した。

【0232】

消化後混合を用いて、タンパク質コロナアッセイを、上記した、ＣＳＦタンパク質コロナと同じ方法によって実施した。消化されたペプチドを溶出した後、異なる粒子に由来するペプチドを合わせ、混合し、その後凍結乾燥させた。ペプチド溶出物を凍結乾燥し、０．１％のＴＦＡ中で再構成し、その後、質量分析的分析のために提出した。

【0233】

図６Ａおよび図６Ｂは、粒子Ｐ３９、ＨＸ４２およびＨＸ５６に由来するタンパク質コロナの多重化測定から同定されたタンパク質を示す。ＴＥ緩衝液で５×希釈したプールされた血漿試料を、粒子および粒子組合せについて、この実験で使用した。図６Ａは、異なる条件を用いて同定されたタンパク質の総数を示す。単一粒子タンパク質コロナ（Ｐ３９、ＨＸ４２およびＨＸ５６）を用いて、２３４、３０３および３５３種の独自のタンパク質が、３つの粒子についてそれぞれ同定され得る。全ての粒子を別々に実行した場合、「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６」でラベルされる柱に示されるように、合計４１１種の独自のタンパク質が同定された。より高い濃度（「３ＮＰ＿８」、８ｍｇ／ｍＬの最終総ＮＰ濃度）およびより低い濃度（「３ＮＰ＿３」、３ｍｇ／ｍＬの最終総ＮＰ濃度）での粒子混合を用いて、３０５および２８４種の独自のタンパク質が同定された。３つ全てのタンパク質コロナの消化後混合（「３ＮＰ＿ＰＭ」）を用いて、３０３種の独自のタンパク質が同定された。図６Ｂは、別々に実行した粒子（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６」）、粒子混合（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６ ＮＰ混合」）および消化後混合（「Ｐ３９＋ＨＸ４２＋ＨＸ５６消化後混合」）の間でのタンパク質の重複を示す。
（実施例５）
粒子タンパク質コロナ中の種々のタンパク質の同定

【0234】

この実施例は、粒子タンパク質コロナ中の種々のタンパク質の同定を記載する。

【0235】

２３の異なる粒子タイプのコロナ中の同定されたタンパク質を、同定されたタンパク質の細胞濃度と比較した。

【0236】

図７Ａは、生物流体中の広範なプロテオームを示す。これは、広い問い合わせが困難でありかつ遅いことを示す。タンパク質を、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるGeyer, et al. Mol Syst Biol 13, 942-15 (2017)に記載されるように、Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから抽出した血漿または血清から同定されたタンパク質の濃度に基づいてランク付けする。図７Ｂは、本開示の粒子バイオセンサー（図７ＢのＸ軸ラベル上および右側の注釈中に列挙される）が、深度、幅および効率を伴ってプロテオームを問い合わせることができることを示す。各点は、対応する粒子のコロナ中の同定されたタンパク質、および文献中に見出されるそのタンパク質の血漿濃度を示す。タンパク質は、いくつかの異なる粒子タイプのタンパク質コロナ中で、広範な濃度で同定され得る。粒子バイオセンサーは、その広いダイナミックレンジにわたって、プロテオームを迅速に問い合わせる（例えば、約０．００１ｕｇ／ｍｌ～ほとんど１０^５μｇ／ｍｌの濃度で存在するタンパク質をアッセイすることによって）。
（実施例６）
粒子ベースの逐次的問い合わせのための手順

【0237】

この実施例は、粒子ベースの逐次的問い合わせのための手順を記載する。

【0238】

血漿を、第１のステップにおいて種々の粒子を用いて問い合わせし、新たなまたは同じ粒子を用いて逐次的に問い合わせして、タンパク質－粒子および／またはタンパク質－タンパク質相互作用の微妙な変化をさらに調べた。かかる逐次的問い合わせのためのワークフローの例は、表２に提供される。粒子タイプは、実験設計に依存して変化させることができる。

【表2】

【0239】

図９は、粒子を用いて逐次的に問い合わせされた血漿試料のゲルを示す。試料を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９コロナ１）。上清を、２回目および３回目に、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を毎回抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９コロナ２およびＰ３９コロナ３）。次いで、上清を、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（Ｐ３９およびＨＸ－４２コロナ４）。それとは別に、試料を、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２コロナ１）。上清を、２回目および３回目に、ＨＸ－４２粒子を用いて問い合わせ、粒子を毎回抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２コロナ２およびＨＸ－４２コロナ３）。次いで、上清を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、粒子を抽出し、得られたコロナをゲル上で泳動した（ＨＸ－４２およびＰ３９コロナ４）。分離された粒子を、８Ｍ尿素で処理してタンパク質を粒子から放出させ、ゲル上で泳動した。８Ｍ尿素で変性させた血漿（ＨＰ１尿素）を、対照として泳動した。

【0240】

図９に示されるように、豊富なタンパク質が最初に除去されると、多数のステップにより、より多様なタンパク質の分析が可能になる。異なるコロナを、逐次的問い合わせの間に創出した。タンパク質コロナ上のタンパク質存在量の変化が、血漿試料中の高い存在量のタンパク質であっても観察された。
（実施例７）
枯渇および逐次的問い合わせアッセイ

【0241】

この実施例は、枯渇アッセイと、その後の粒子を用いた逐次的インキュベーションおよびアッセイを記載する。

【0242】

枯渇のために、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳｉｇｍａのＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ（商標）Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ／Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔを使用した。ビーズの元の緩衝液を除去し、ビーズをＴＥで２回洗浄し、４×希釈された血漿を添加し、ボルテックスした。次いで、ビーズおよび血漿を、回転させながら約室温で約１時間インキュベートした。上清を除去した。

【0243】

第２のアッセイにおいて、血漿試料を、アルブミンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）に対する磁気ビーズを使用して枯渇させた。枯渇された血漿を、（１）ほとんどの豊富なタンパク質を枯渇させるため、および（２）中程度の存在量のタンパク質を枯渇させるために、一連の２つのＨＰＬＣカラムを使用して枯渇させた。枯渇されたおよび未枯渇の試料を、粒子を用いて問い合わせして、タンパク質コロナを形成した。

【0244】

図１０は、ゲル画像に基づいて、未枯渇のおよび枯渇された血漿に由来するタンパク質コロナが、粒子に結合した異なるタンパク質を有したことを示す。未枯渇のまたは枯渇された血漿試料を、Ｐ３９粒子を用いて問い合わせ、タンパク質コロナをアッセイした。赤の矢印は、未枯渇の血漿試料対枯渇された血漿試料に由来するタンパク質コロナ中で異なるタンパク質（バンドによって示される）を示す。粒子を８Ｍ尿素で処理してタンパク質を粒子から放出させ、ゲル上で泳動した。
（実施例８）
スピンカラムを用いた枯渇の手順

【0245】

この実施例は、スピンカラムを用いた枯渇の手順を記載する。

【0246】

スピンカラムを用いた枯渇のために、枯渇スピンカラムを約室温に平衡化し、１００μＬの試料を、カラム中の樹脂スラリーに直接添加し、混合物を、約室温で約１０分間穏やかに転倒混合しながらカラム中でインキュベートし、次いで、混合物を１，０００×ｇで約２分間遠心分離する。次いで、フロースルーを収集する。
（実施例９）
滑液試料のタンパク質枯渇およびコロナ分析

【0247】

この実施例は、滑液試料のタンパク質枯渇およびコロナ分析を記載する。

【0248】

滑液（ＳＦ）試料を、粒子と共にインキュベートして、粒子タンパク質コロナを形成した。１００μＬの試料を、１００μＬの粒子と共に１時間インキュベートした。インキュベーション後、粒子を、磁石を使用してペレット化した。上清を、ピペットを使用して除去した。ペレットを３回、ＰＢＳで洗浄し、再ペレット化した。粒子に結合したタンパク質を、トリプシン消化キット（ｉＳＴ ９６Ｘ、ＰｒｅＯｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、キット中に提供され、実施例１で要約したプロトコールに従って消化した。ペプチド濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの定量的比色分析ペプチドアッセイキットによって測定した。質量分析を、実施例１に記載した方法に従って、溶出したペプチドに対して実施した。

【0249】

図１１は、９つの異なる粒子でアッセイした単一の滑液（ＳＦ）試料からのコロナ分析実験結果を示す。具体的な粒子処理は、ｘ軸上に示される。コロナ分析（「プロテオグラフ」）アッセイを、対照として、粒子と接触させていない滑液（「ニートＳＦ」）を用いても実行した。９つ全ての粒子によって同定された独自のタンパク質の数もまたプロットした（「全てのＮＰ」）。

【0250】

棒の高さによって示されるように、１０００種よりも多くの同定されたタンパク質が、各粒子含有コロナ試料について検出された。対照的に、３３４種の同定されたタンパク質しか、ニートＳＦ陰性対照において検出されなかった。９つの粒子の各々からのコロナ分析結果を合わせたところ、３５００種を超えるタンパク質が検出された（「全てのＮＰ」）。
（実施例１０）
組織および細針吸引試料のタンパク質枯渇およびコロナ分析

【0251】

この実施例は、組織および細針吸引試料のタンパク質枯渇およびコロナ分析を記載する。タンパク質コロナを、滑液試料に関して実施例９に記載したように、組織試料および細針吸引（ＦＮＡ）試料について調製し分析した。

【0252】

図１２は、粒子を用いてアッセイした２つのタイプの試料についてのコロナ分析実験結果を示す。細針吸引（ＦＮＡ）試料を、２５Ｇ針を備えた１ｍＬシリンジを使用して調製した。ＦＮＡ試料を、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍ－ＰＥＲ）を用いて溶解させ、コロナ分析前にＴＥ緩衝液へと緩衝液交換した。ＦＮＡによって提供される小さい質量に起因して、単一の粒子（Ｐ－０３９）を使用してＦＮＡ－コロナを評価した。組織試料もまたＭ－ＰＥＲを用いて溶解させ、コロナ分析前にＴＥ緩衝液へと緩衝液交換した。１００μＬの組織試料を、１００μＬの粒子と共にインキュベートして、組織－粒子コロナを形成した。ペプチドを、１時間の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）勾配を用いて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓ機器上で流した。コロナ分析を、対照として、粒子と接触させていないニート組織試料（「組織ニート」）に対しても実施した。
（実施例１１）
タンパク質コロナ分析およびタンパク質枯渇

【0253】

この実施例は、タンパク質コロナ分析およびタンパク質枯渇を記載する。タンパク質コロナを、滑液試料に関して実施例９に記載したように、一致した血漿試料および血清試料について調製し分析した。枯渇された血漿を、（１）ほとんどの豊富なタンパク質を枯渇させるため、および（２）中程度の存在量のタンパク質を枯渇させるために、一連の２つのＨＰＬＣカラムを使用して枯渇させた。

【0254】

図１３は、粒子を用いてアッセイした血漿および血清試料の一致したペアからのコロナ分析実験結果を示す。５×希釈の血漿および血清の両方（それぞれ、「血漿５×」および「血清５×」）ならびに未希釈の血漿および血清（それぞれ、「未希釈の血漿」および「未希釈の血清」）を試験した。各粒子処理についての棒は、左から右に、血漿５×、血漿ニート、血清５×、血清ニートおよび枯渇された血漿に対応する。さらに、血漿試料のアリコートを、ＩｇＹ１４およびＳｕｐｅｒｍｉｘカラムを用いて徹底的に枯渇させ、ニート試料および希釈された試料を用いて試験した。各試料を、別々のウェル中で、７つの粒子の各々に対してアッセイした。粒子なしの試料のセット（「ＮＰなし」）もまた対照として試験した。

【0255】

実験により、最も大きい数のタンパク質が、ほとんどの粒子処理について、枯渇された血漿試料中で同定されたことが実証された。
（実施例１２）
核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した試料のタンパク質コロナ分析

【0256】

この実施例は、核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した試料のタンパク質コロナ分析を記載する。

【0257】

３人の患者由来の血液試料（＃１、＃２および＃３）を、ＥＤＴＡ血液収集管（ＢＣＴ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製品番号３６６６４３）中に収集し、試料収集の１時間以内に、遠心分離し凍結した。同じ３人の患者由来の血液試料を、Ｓｔｒｅｃｋ ＢＣＴ中にも収集し、穏やかに揺らしながら室温で一晩貯蔵し、その後、血漿を処理し凍結した。Ｓｔｒｅｃｋ試料処理を、周囲温度での試料の一晩出荷をシミュレートするように設計した。図３３は、ＥＤＴＡ試料収集管（左）またはＳｔｒｅｃｋ試料収集管（右）中に収集した生体試料を処理する方法を要約する。

【0258】

図１４は、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血液試料（「ＥＤＴＡ」）をＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料（「ＳＴＲＥＣＫ」）と比較する実験の結果を示す。回収されたペプチド質量の分析を、３人の患者から収集した血液試料（＃１、＃２および＃３）に対して実施した。各試料を、粒子を用いてアッセイし（「Ｐ３９コロナ」）、粒子を用いずにアッセイした（「ニート血漿」）。棒の高さは、各試料中の回収された平均タンパク質質量を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、ペプチド収量における差異は観察されなかった。粒子と接触させていないＥＤＴＡおよびＳｔｒｅｃｋ血漿試料は共に、類似のペプチド質量を生じた。粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ血漿試料はまた、観察されたペプチド定量化の典型的な変動係数（約１０％～１５％）を考慮すると、粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ血漿試料と類似のペプチド質量を生じた。

【0259】

次いで、ＥＤＴＡ ＢＣＴまたはＳｔｒｅｃｋ ＢＣＴのいずれか中に収集した試料の各々中に存在するタンパク質、ペプチドおよび特色の数を、タンパク質コロナ分析アッセイを使用して決定した。図１５は、試料に対して実施したコロナ分析実験によって同定されたタンパク質の平均数を示す。棒の高さは、各試料中の同定されたタンパク質の平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、同定されたタンパク質の数における差異は観察されなかった。類似の数のタンパク質が、粒子と接触させていないＥＤＴＡおよびＳｔｒｅｃｋ血漿試料の両方において同定された。より多くのタンパク質が、粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ血漿試料と比較して、粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ血漿試料において同定された。

【0260】

図１６は、試料に対して実施したコロナ分析実験によって検出されたペプチドの平均数を示す。棒の高さは、各試料中の検出されたペプチドの平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、同定されたペプチドの数における差異は観察されなかった。より多くのペプチドが、粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ血漿試料と比較して、粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ血漿試料において検出された。

【0261】

図１７は、試料に対して実施したコロナ分析実験によって同定された特色の平均数を示す。棒の高さは、各試料中の同定された特色の平均数を示す。ＥＤＴＡとＳＴＲＥＣＫ血漿コロナとの間で、特色の数における差異は観察されなかった。類似の数の特色が、粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ血漿試料と比較して、粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ血漿試料において検出された。

【0262】

図１８は、図１４～図１７に示される実験結果の概要を示す。円は、示された条件下で各試料において同定されたタンパク質を示す。円の重複する領域は、対応するＥＤＴＡ試料およびＳｔｒｅｃｋ試料の両方において同定されたタンパク質を示す。円の重複しない領域は、対応する条件下でアッセイしたＥＤＴＡ試料のみまたはＳｔｒｅｃｋ試料のみにおいて同定されたタンパク質を示す。各対中の左側に位置する円は、ＥＤＴＡ試料を示し、各対中の右側に位置する円は、Ｓｔｒｅｃｋ試料を示す。各患者試料（＃１、＃２および＃３）は、類似の数の、粒子の非存在下でアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料と粒子の非存在下でアッセイしたＥＤＴＡ試料との間で共通するタンパク質を生じた。類似の数の、粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料と粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料との間で共通するタンパク質が、各患者試料において同定されたが、より多くの独自のタンパク質が、粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料よりも、粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料において同定された。

【0263】

図１９は、各患者試料中のコロナ分析によって同定された選択されたタンパク質タイプの個々のタンパク質の数を示す。粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料のみ（「Ｓｔｒｅｃｋ」）または粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料のみ（「ＥＤＴＡ」）において３つの患者試料の各々中の同定された選択タンパク質タイプのタンパク質の数がプロットされる。粒子を用いてアッセイしたＳｔｒｅｃｋ試料および粒子を用いてアッセイしたＥＤＴＡ試料の両方（「重複」）において３つの患者試料の各々中の同定された選択されたタンパク質タイプのタンパク質の数もまたプロットされる。同定された糖タンパク質、核関連タンパク質、ＤＮＡ関連タンパク質およびＲＮＡ関連タンパク質の数は、「重複」データにおいて最も高く、Ｓｔｒｅｃｋ試料およびＥＤＴＡ試料によって共有される共通するタンパク質を実証した。

【0264】

図２０は、図１４～図１９でプロットした試料についてのタンパク質群強度の分布を示す。ＥＤＴＡおよびＳＴＲＥＣＫ血漿試料は、それらを粒子を用いてまたは用いずにアッセイした場合、類似のペプチド収量、タンパク質計数、ペプチド計数、特色計数およびタンパク質カテゴリーを示し、これは、タンパク質コロナ分析アッセイにおける、核酸安定化剤を含む試料収集管中に収集した試料の適切さを示している。

【0265】

図２１は、図１４～図２０でプロットした試料についてのタンパク質群強度のパーセント変動係数（％ＣＶ）を示す。ＥＤＴＡおよびＳＴＲＥＣＫ血漿試料は、それらを粒子を用いてまたは用いずにアッセイした場合、類似の再現性を示し、これは、タンパク質コロナ分析アッセイにおける、核酸安定化剤を含む試料収集管中に収集した試料の適切さを示している。

【0266】

図２２Ａおよび図２２Ｂは、粒子の存在下でアッセイした図１４～図２１でプロットした試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示す。各円の重複する領域中の数字は、重複する円によって示される各試料中の同定されたタンパク質を示す。図２２Ａは、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した各患者試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示し、図２２Ｂは、Ｓｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した各患者試料中の同定された共通するおよび独自のタンパク質の数を示す。Ｓｔｒｅｃｋ血液収集管およびＥＤＴＡ血液収集管中に収集した試料は、再現試料の間で、類似の一貫性を実証した。

【0267】

図２３は、図１４～図２２でプロットした試料についてのタンパク質群強度の変動係数（ＣＶ）を示す。

【0268】

図２４は、図１４～図２３でプロットした、Ｓｔｒｅｃｋ血液収集管（ＳＴＲＥＣＫ製品番号２１８９６２）およびＥＤＴＡ血液収集管の両方中に収集した試料中の同定された共通するタンパク質群の強度のプロットを示す。Ｓｔｒｅｃｋ試料のタンパク質群強度が、ｘ軸上にプロットされる。ＥＤＴＡ試料のタンパク質群強度が、ｙ軸上にプロットされる。患者試料＃１（上のプロット）、＃２（中央のプロット）および＃３（下のプロット）についてのタンパク質群強度が、粒子の存在下（左のプロット、「タイプ＝Ｐ３９コロナ」）または非存在下（右のプロット、「タイプ＝ニート血漿」）でアッセイしたいずれかの試料についてプロットされる。線形フィットのＲ^２値（「Ｒｓｑ」）が、各プロットの右下隅に提供される。これらの結果は、タンパク質群強度が、試験した全ての条件下で、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した試料とＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料との間で十分に相関することを示した。

【0269】

図２５Ａおよび図２５Ｂは、図１４～図２４においてＳｔｒｅｃｋ血液収集管およびＥＤＴＡ血液収集管の両方中に収集した試料中の同定されたタンパク質群の数を示す。図２５Ａは、各試料中で同定された少なくとも１つの血漿タンパク質を含むタンパク質群の数を示す。図２５Ｂは、各試料中で同定された少なくとも１つの血漿タンパク質を含まない、各試料中の同定されたタンパク質群の数を示す。血漿タンパク質としてのタンパク質の分類は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKeshishian et al. (Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015))によって同定された５，３０４種の血漿タンパク質のセットに基づいた。

【0270】

これらのアッセイは、タンパク質カバレッジが、核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した血漿およびＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血漿に由来するコロナにおいて、実質的に類似であったことを示した。タンパク質のある特定の群、例えば、糖タンパク質、核関連タンパク質、ＤＮＡ関連タンパク質およびＲＮＡ関連タンパク質由来のタンパク質は、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血漿よりも、核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した血漿において、より頻繁に同定された。これらの結果を合わせると、核酸安定化剤を含む管（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ管）中に収集した試料が、タンパク質コロナ分析に適切であることが示された。
（実施例１３）
核酸安定化剤を含む管中に収集した肺がん試料のタンパク質コロナ分析

【0271】

この実施例は、核酸安定化剤を含む管中に収集した肺がん試料のタンパク質コロナ分析を記載する。

【0272】

試料を、肺がん研究に参加している対象から収集した。各対象由来の試料を、ＥＤＴＡ血漿収集管およびＳｔｒｅｃｋ血漿収集管中に収集した。収集した試料を、タンパク質コロナ分析のために処理した。ＥＤＴＡ試料収集管中に収集した試料を、現地で分析した。Ｓｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した試料を、一晩出荷し、遠隔施設において分析した。２０人の対象由来の試料を、単一の粒子タイプを用いて分析した。各試料を３連でアッセイした。ＭＳ分析を、１時間のデータ依存型獲得（ＤＤＡ）実行でＴＦ Ｌｕｍｏｓを使用して、各試料および再現に対して実施した。

【0273】

図２６は、ＥＤＴＡ試料収集管（「ＥＤＴＡ」）またはＳｔｒｅｃｋ試料収集管（「Ｓｔｒｅｃｋ」）中に収集した生体試料中の実験的に同定されたタンパク質の重複を示す。より多くのタンパク質が、ＥＤＴＡ管中に収集した試料において同定されたが、Ｓｔｒｅｃｋ管中に収集した試料において同定されたタンパク質は、ＥＤＴＡ管中に収集した試料において同定されたタンパク質と、ほぼ完全に重複した。

【0274】

図２７は、ＥＤＴＡ試料収集管中に収集した試料およびＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した試料中の同定されたタンパク質の平均タンパク質群強度を示す。タンパク質群強度を、Ｃａｒｒ血漿プロテオームデータベース中に存在し、ＥＤＴＡ試料収集管中に収集した試料（ｙ軸）およびＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した試料（ｘ軸）において分析したものの両方において同定されたタンパク質についてプロットした。

【0275】

図２８Ａおよび図２８Ｂは、図２７で同定された１１５個のタンパク質群間のＳｐｅａｒｍａｎ（図２８Ａ）およびＰｅａｒｓｏｎ（図２８Ｂ）相関係数を示す。ＳｐｅａｒｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ相関係数は共に、ＥＤＴＡ管中に収集した試料とＳｔｒｅｃｋ管中に収集した試料との間で、タンパク質群強度における強い正の相関を示す。これらの結果を合わせると、Ｓｔｒｅｃｋ管中での生体試料の収集が、粒子試料調製方法を使用した大規模プロテオミクスプロファイリングに適切であることが示された。
（実施例１４）
脳脊髄液試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析

【0276】

この実施例は、脳脊髄液試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析を記載する。脳脊髄液試料を対象から収集する。表１に提供される粒子から選択した第１の粒子タイプを、１００μＬの脳脊髄液試料に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。第１の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、脳脊髄液試料から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第２の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第２の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第２の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第３の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第３の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第３の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。上清を、表１に提供される粒子から選択した最大で１０の粒子タイプを用いて再問い合わせし、各粒子タイプ上に形成したタンパク質コロナを、質量分析によって分析する。タンパク質を、最大で１０の粒子タイプの各々上に形成したタンパク質コロナの質量分析的分析から同定する。
（実施例１５）
滑液試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析

【0277】

この実施例は、滑液試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析を記載する。滑液試料を対象から収集する。表１に提供される粒子から選択した第１の粒子タイプを、１００μＬの滑液試料に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。第１の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、滑液試料から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第２の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第２の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第２の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第３の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第３の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第３の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。上清を、表１に提供される粒子から選択した最大で１０の粒子タイプを用いて再問い合わせし、各粒子タイプ上に形成したタンパク質コロナを、質量分析によって分析する。タンパク質を、最大で１０の粒子タイプの各々上に形成したタンパク質コロナの質量分析的分析から同定する。
（実施例１６）
均質化した組織試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析

【0278】

この実施例は、均質化した組織試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析を記載する。均質化した組織試料を対象から収集する。表１に提供される粒子から選択した第１の粒子タイプを、１００μＬの均質化した組織試料に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。第１の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、均質化した組織試料から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第２の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第２の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第２の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第３の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第３の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第３の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。上清を、表１に提供される粒子から選択した最大で１０の粒子タイプを用いて再問い合わせし、各粒子タイプ上に形成したタンパク質コロナを、質量分析によって分析する。タンパク質を、最大で１０の粒子タイプの各々上に形成したタンパク質コロナの質量分析的分析から同定する。
（実施例１７）
血漿試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析

【0279】

この実施例は、血漿試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析を記載する。血漿試料を対象から収集する。表１に提供される粒子から選択した第１の粒子タイプを、１００μＬの血漿試料に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。第１の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、血漿試料から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第２の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第２の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第２の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第３の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第３の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第３の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。上清を、表１に提供される粒子から選択した最大で１０の粒子タイプを用いて再問い合わせし、各粒子タイプ上に形成したタンパク質コロナを、質量分析によって分析する。タンパク質を、最大で１０の粒子タイプの各々上に形成したタンパク質コロナの質量分析的分析から同定する。
（実施例１８）
尿試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析

【0280】

この実施例は、尿試料の逐次的問い合わせを介したコロナ分析を記載する。尿試料を対象から収集する。表１に提供される粒子から選択した第１の粒子タイプを、１００μＬの尿試料に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。第１の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、尿試料から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第２の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第２の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第２の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。表１に提供される粒子から選択した第３の粒子タイプを上清に添加し、インキュベートして、タンパク質コロナを形成する。必要に応じて、第３の粒子タイプは、第１の粒子タイプと同じである。第３の粒子タイプを、遠心分離または磁気プルダウンによって、上清から分離する。上清を収集する。粒子を含むペレットを、洗浄および再懸濁し、コロナを質量分析によって分析する。上清を、表１に提供される粒子から選択した最大で１０の粒子タイプを用いて再問い合わせし、各粒子タイプ上に形成したタンパク質コロナを、質量分析によって分析する。タンパク質を、最大で１０の粒子タイプの各々上に形成したタンパク質コロナの質量分析的分析から同定する。
（実施例１９）
ＥＤＴＡ中または核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した血漿試料におけるＥＬＩＳＡによるタンパク質検出

【0281】

この実施例は、ＥＤＴＡ中または核酸安定化剤を含む血液収集管中に収集した血漿試料におけるＥＬＩＳＡによるタンパク質検出を記載する。血漿試料を、ＥＤＴＡ血液収集管またはＳｔｒｅｃｋ血液収集管のいずれか中に、ヒト対象から収集した。ペアになったＥＤＴＡおよびＳＴＲＥＣＫ試料を、比較のために、２０人の患者の各々から収集した。３つの高い重要性のタンパク質、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルグラニュリンＡおよびＢ（「Ｓ１００」）およびＭＵＣ１６／ＣＡ１２５（「ＣＡ１２５」）の濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって各試料において測定した。ＣＲＰは、血漿中で見出されるペンタマータンパク質であり、その循環濃度は、炎症に応答して上昇する。ＣＲＰの上昇したレベルは、任意の型のがん、肺がん、およびおそらくは結腸直腸がんの、増加した将来のリスクに関連する。カルグラニュリンＡおよびＢは、活性化された免疫細胞、例えば、単球、顆粒細胞および好中球によって、ヘテロダイマー形態で分泌されるカルシウム結合タンパク質であり、炎症性疾患、例えば関節リウマチ、および一部のタイプのがんにおいて大量に発現される。ＣＡ１２５は、眼表面、気道および女性の生殖器系の成分であり、いくつかの異なる機序によって腫瘍形成および腫瘍増殖を進行させる際に役割を果たすことが示されている。

【0282】

タンパク質濃度を、各タンパク質に特異的な市販のキットを使用して測定した。ＣＲＰは、Ｈｕｍａｎ Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＣＲＰ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して検出し、Ｓ１００は、Ｈｕｍａｎ Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して検出し、ＣＡ１２５は、Ｈｕｍａｎ ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して検出した。図３０Ａ～図３０Ｃは、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した血漿試料（ｘ軸）とＳｔｒｅｃｋ試料収集管中に収集した血漿試料（ｙ軸）との間の、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した３つのタンパク質濃度の相関を示す。図３０Ａは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の相関を示す。図３０Ｂは、カルグラニュリンＡおよびＢヘテロダイマー（「Ｓ１００」）の相関を示す。図３０Ｃは、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５（「ＣＡ１２５」）の相関を示す。各試料中のタンパク質濃度を、２連で測定し、２つの反復間で平均した。ＣＲＰ、Ｓ１００およびＣＡ１２５の濃度は、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した試料とＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料との間で、十分に相関した。図３１は、ＥＤＴＡ血液収集管またはＳｔｒｅｃｋ血液収集管のいずれか中に収集した血漿試料中のＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質濃度の、ＣＲＰ（左の２つの箱ひげ）、Ｓ１００（中央の２つの箱ひげ）およびＣＡ１２５（右の２つの箱ひげ）のパーセント変動係数（％ＣＶ）を示す。タンパク質濃度のパーセント変動係数は、ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した試料とＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料との間で一貫していた。図３２は、ＣＲＰ（左のプロット）、Ｓ１００（中央のプロット）およびＣＡ１２５（右のプロット）について、ＥＤＴＡ血液収集管またはＳｔｒｅｃｋ血液収集管のいずれか中に収集した試料中のＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質濃度における一致したペアの差異を示す。ＥＤＴＡ血液収集管中に収集した試料およびＳｔｒｅｃｋ血液収集管中に収集した試料中のタンパク質濃度における差異は、低かった。
（実施例２０）
タンパク質コロナ分析を使用した血漿のダイナミックレンジ圧縮

【0283】

この実施例は、タンパク質コロナ分析を使用した血漿のダイナミックレンジ圧縮を記載する。

【0284】

測定されたダイナミックレンジを圧縮する粒子の能力を評価するために、測定および同定されたタンパク質特色強度を、同じタンパク質の濃度についての公開された値と比較した。最初に、各タンパク質についての得られたペプチド特色を、（モノアイソトピックピーク値を抽出するためにＯｐｅｎＭＳ ＭＳデータ処理ツールを使用して）タンパク質についての全ての可能な特色の最大ＭＳ決定強度を用いて選択し、次いで、強度を、同じタンパク質についての公開された存在量レベルに対してモデル化した。図３４は、粒子コロナタンパク質および血漿タンパク質の最大強度の、同じタンパク質の公開された濃度との相関を示す。青でプロットした線は、データに対する線形回帰モデルであり、影付きの領域は、モデルフィットの標準誤差を示す。粒子（「Ｓ－００３」、「Ｓ－００７」および「Ｓ－０１１」）を用いてアッセイした試料のダイナミックレンジは、線形フィットの傾きにおける減少によって示されるように、粒子を用いてアッセイしなかった血漿試料（「血漿」）と比較して、圧縮されたダイナミックレンジを示した。各プロットの傾きは、それぞれ、粒子を用いない血漿、Ｓ－００３粒子を用いた血漿、Ｓ－００７粒子を用いた血漿およびＳ－０１１粒子を用いた血漿について、０．４７、０．１９、０．２２および０．１８である。図３５は、粒子コロナ形成なしの質量分析と比較した、質量分析を用いたタンパク質コロナ分析アッセイのダイナミックレンジ圧縮を示す。図３４でアッセイした血漿試料中の粒子コロナ中の同定された共通するタンパク質のタンパク質強度（「ナノ粒子ＭＳ ｌｎ強度」）が、粒子を用いない血漿の質量分析によって同定されたタンパク質強度（「血漿ＭＳ ｌｎ強度」）に対してプロットされる。色が最も薄い点線は、１の傾きを示し、粒子を用いない質量分析のダイナミックレンジを示す。タンパク質強度に対する線形フィットの傾きは、それぞれ、Ｓ－００３、Ｓ－００７およびＳ－０１１粒子について、０．１２、０．３６および０．０９３であった。灰色のエリアは、回帰フィットの標準誤差領域を示す。

【0285】

測定されたデータの回帰モデル傾きおよび強度スパンを比較することによって、粒子コロナは、血漿よりも（測定されたまたは報告された）低い存在量で、より多くのタンパク質を含む。測定された値のダイナミックレンジは、血漿測定と比較して、粒子測定について圧縮された（回帰モデルの傾きが低減される）。これは、粒子が、血漿における元のダイナミックレンジと比較して、得られたコロナ中の存在量についての測定されたダイナミックレンジを効果的に圧縮できるという、タンパク質の絶対濃度、粒子へのその結合親和性、および隣接するタンパク質とのその相互作用の組合せに帰せられ得る以前の観察と合致していた。これらの結果は、タンパク質コロナ戦略が、広いスペクトルの血漿タンパク質、特に、従来のプロテオミクス技法によっては迅速な検出が難しい低い存在量のものの同定を促進したことを示した。
（実施例２１）
試料の並行問い合わせと比較した逐次的問い合わせ

【0286】

この実施例は、粒子を用いた試料の並行問い合わせと比較した、粒子を用いた試料の逐次的問い合わせを記載する。

【0287】

１０μＬの低い試料体積を有する第１の試料を、２つまたはそれよりも多くの粒子タイプを用いて逐次的に問い合わせする。第１の粒子タイプを、第１の試料と接触させ、第１の試料および第１の粒子タイプをインキュベートして、第１の粒子タイプ上での第１の生体分子コロナの形成を可能にし、第１の粒子タイプを第１の試料から分離する。第１の試料の残りを第２の粒子タイプと接触させ、第１の試料の残りおよび第２の粒子タイプをインキュベートして、第１の粒子タイプ上での第２の生体分子コロナの形成を可能にし、第２の粒子タイプを第１の試料の残りから分離する。接触するステップ、インキュベートするステップおよび分離するステップを、さらなる粒子タイプを用いて必要に応じて反復する。第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプおよび任意のさらなる粒子タイプ上の生体分子コロナを、例えば質量分析によって、コロナ中のタンパク質についてアッセイすることによって分析する。

【0288】

第１の試料と同じ供給源由来の第２の試料を、２つまたはそれよりも多くの粒子タイプを用いた並行問い合わせのために、１０μＬの多数のアリコートに分割する。試料を、タンパク質についてアッセイする方法において使用される粒子タイプの数よりも大きいまたはそれと等しいいくつかのアリコートに分割する。第１の粒子タイプを、第１のアリコートと接触させ、第１のアリコートおよび第１の粒子タイプをインキュベートして、第１の粒子タイプ上での第１の生体分子コロナの形成を可能にし、第１の粒子タイプを第１のアリコートから分離する。並行して、第２の粒子タイプを、第２のアリコートと接触させ、第２のアリコートおよび第２の粒子タイプをインキュベートして、第２の粒子タイプ上での第２の生体分子コロナの形成を可能にし、第２の粒子タイプを第２のアリコートから分離する。接触するステップ、インキュベートするステップおよび分離するステップを、さらなるアリコートにおいてさらなる粒子タイプを用いて実施する。第１の粒子タイプ、第２の粒子タイプおよび任意のさらなる粒子タイプ上の生体分子コロナを、例えば質量分析によって、コロナ中のタンパク質についてアッセイすることによって分析する。

【0289】

第１の試料の２つまたはそれよりも多くの粒子タイプを用いた逐次的問い合わせは、アッセイされる粒子タイプ１つ当たり１０μＬの試料を使用する第２の試料の並行問い合わせよりも、タンパク質コロナ分析のためにより小さい試料体積（合計１０μＬ）を使用する。より少ない総試料を使用していても、第１の試料の逐次的問い合わせは、並行問い合わせによって検出される範囲と匹敵するまたはそれよりも広い、タンパク質の範囲の検出を可能にする。図９に示されるように、粒子（例えば、ＨＸ－４２）上に形成した生体分子コロナは、別の粒子タイプを用いた３ラウンドの逐次的問い合わせ後に試料と接触させた場合（「Ｐ３９およびＨＸ－４２コロナ４」）よりも、第１の試料と接触させた場合（「ＨＸ－４２コロナ１」）、タンパク質の異なる集団を含み得る。第１の試料の逐次的問い合わせは、並行問い合わせによって検出される範囲と匹敵するまたはそれよりも広い、低い存在量のタンパク質の範囲の検出を可能にする。例えば、第１の試料の逐次的問い合わせは、問い合わせの後のラウンドにおいて使用される粒子タイプの生体分子コロナ中への低い存在量の低親和性タンパク質の吸着を可能にする、問い合わせの初期ラウンドにおける低い存在量の高親和性タンパク質の枯渇を生じ得る。

【0290】

本開示の好ましい実施形態が、本明細書で示され記載されてきたが、かかる実施形態が例のみとして提供されていることは、当業者に明らかである。幾多のバリエーション、変化および置換は、本開示から逸脱することなしに、当業者が直ちに想起する。本明細書で記載される本開示の実施形態に対する種々の代替法が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることが意図される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図8-6】

【図8-7】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【国際調査報告】