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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-01
(54)【発明の名称】がんを処置するための方法及び材料
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20220525BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220525BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220525BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220525BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220525BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220525BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
C12N15/867 Z ZNA
C12N15/12
A61P35/00
A61K31/7088
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021557370
(86)(22)【出願日】2020-03-26
(85)【翻訳文提出日】2021-10-26
(86)【国際出願番号】 US2020024976
(87)【国際公開番号】W WO2020198485
(87)【国際公開日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】62/823,702
(32)【優先日】2019-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】398071440
【氏名又は名称】ザ・ペン・ステイト・リサーチ・ファウンデイション
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ゴン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，シン
(72)【発明者】
【氏名】ペイ，ジーフェイ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA59
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA65
4C086NA14
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA59
4C087MA65
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、がんを有する哺乳動物を処置するための方法及び材料に関する。例えば、がんを有する哺乳動物に存在する１つ以上のがん細胞を非がん性細胞に変換するための方法及び材料を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんを有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記方法が、１つ以上の転写因子をコードする核酸を、前記哺乳動物内のがん細胞に投与することを含み、前記１つ以上の転写因子が、前記がん細胞によって発現され、前記１つ以上の転写因子が、前記がん細胞を前記哺乳動物内の非がん性細胞に変換し、それにより前記哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる、前記方法。
【請求項2】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんが神経膠腫である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上の転写因子が１つ以上の神経細胞転写因子である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ以上の神経細胞転写因子が、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチド、及びａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記１つ以上の神経細胞転写因子が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドを含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記非がん性細胞が神経細胞である、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記神経細胞がＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記がんが肝臓癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項10】
前記肝臓癌が肝細胞癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記１つ以上の転写因子が肝臓転写因子である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記１つ以上の肝臓転写因子が、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチド、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチド、及びＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記１つ以上の肝臓転写因子が、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
前記非がん性細胞が肝細胞である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記肝細胞が、肝酵素を分泌する肝細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記肝酵素がアルブミンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記１つ以上の転写因子をコードする前記核酸が、ウイルスベクターの形態で前記がん細胞に投与される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記１つ以上の転写因子の各々をコードする前記核酸が、プロモーター配列に作用可能に連結している、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記１つ以上の転写因子をコードする前記核酸の前記投与が、前記哺乳動物の腫瘍への直接注射を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記１つ以上の転写因子をコードする前記核酸の前記投与が、腹腔内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内、実質内、腫瘍内、鼻腔内、または経口投与を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、前記投与ステップの前に、前記哺乳動物を、前記がんを有するものと識別することを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法に従ってがんを処置するための、１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む組成物の使用。
【請求項25】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法に従ってがんを処置するための、１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む組成物。
【請求項26】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法に従ってがんを処置するための医薬品の製造における、１つ以上の転写因子をコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２６日に出願された米国特許出願第６２／８２３，７０２号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（及び参照により組み込まれる）。
本出願は、２０１９年３月２６日に出願された米国特許出願第６２／８２３，７０２号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（及び参照により組み込まれる）。
【0002】
本文書は、がんを有する哺乳動物を処置するための方法及び材料に関する。例えば、本文書は、がんを有する哺乳動物に存在する１つ以上のがん細胞を非がん性細胞に変換するための方法及び材料を提供する。
【背景技術】
【0003】
がんは公衆衛生上の大きな問題である。米国だけで、２０１９年に１７０万を超える新規症例が診断された（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，「Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔ Ｆａｃｔｓ：Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ Ａｎｙ Ｓｉｔｅ」、「ｈｔｔｐｓ」コロン「ｓｅｅｒ」ドット「ｃａｎｃｅｒ」ドット「ｇｏｖ／ｓｔａｔｆａｃｔｓ／ｈｔｍｌ／ａｌｌ．ｈｔｍｌ」にて）。
【0004】
神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、膠細胞の抑制されない増殖から生じる腫瘍の一種であり、悪性脳腫瘍症例の半分を占め、５年相対生存率は３．６パーセントである（Ｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．；１７：ｉｖ１－ｉｖ６２（２０１５）、及びＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．；３６（４）：２３０－２３９（２０１１））。化学療法、放射線療法、及び手術などの従来の療法は、ＧＢＭでは、活性細胞増殖、侵襲的性質、ならびにゲノム及びエピジェネティック異質性を理由に失敗することが多い（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．；１５５（２）：４６２（２０１３）、及びＭｃＬｅｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．；４５５（７２１６）：１０６１－１０６８（２００８））。
【0005】
世界的に、肝臓癌（または肝細胞癌腫（ＨＣＣ））は、がん関連死において３位、発生率において６位である（Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．；１４２：１２６４－７３（２０１２））。肝臓癌の治療は、典型的には、手術及び切除を含むが、進行期または末期患者の場合、そのような治療は効果がないことが多い。
【発明の概要】
【0006】
本文書は、がんを有する哺乳動物を、哺乳動物内のがん細胞を非がん性細胞に変換することにより処置するための方法及び材料を提供する。例えば、転写因子（例えば、神経細胞転写因子または肝臓転写因子）をコードする１つ以上の核酸を使用して、哺乳動物内で１つ以上のがん細胞を非がん性細胞に変換することができる。
【0007】
多くのがんの特質は、脱分化したがん細胞の存在である。本明細書に記載されるように、転写因子（例えば、神経細胞転写因子または肝臓転写因子）を発現するように設計された核酸を哺乳動物内の細胞に送達することで、哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞（例えば、末端分化非分裂細胞）に変換することができる。本明細書で実証されるように、神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（例えば、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチドを発現するように設計された核酸、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチドを発現するように設計された核酸、またはａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドを発現するように設計された核酸）をヒトＧＢＭ細胞に送達することで、ヒトＧＢＭ細胞を非がん性神経細胞に変換することができる。変換神経細胞は、神経細胞特異的マーカーを発現することができ、機能性シナプスネットワークを有することができ、活性電気生理学的特性を有することができる。変換神経細胞はまた、（例えば、変換前のＧＢＭ細胞と比較して）がんの進行に関する下方調節されたシグナル伝達経路を呈し得る。ＧＢＭ細胞の神経細胞へのインビボ変換により、がん細胞の増殖を減少させることができ、かつ／またはアストログリオーシスの速度を低下させることができる。また本明細書で実証されるように、肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（例えば、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチドを発現するように設計された核酸、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチドを発現するように設計された核酸、及び／またはＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドを発現するように設計された核酸）をヒト肝臓癌細胞に送達することで、ヒト肝臓癌細胞を非がん性肝臓細胞（肝細胞）に変換することができる。変換された肝細胞は、増殖の減少を有することができ、肝臓癌マーカーであるアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）の発現の減少を有することができ、かつ／または上皮細胞表面分子Ｅ－カドヘリンなどの上皮特異的マーカーを発現することができる。
【0008】
本明細書に記載の方法及び材料を使用して、生存哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞に変換する能力を有することで、がんを処置するための有効なアプローチが臨床医及び患者（例えば、がん患者）にもたらされる。例えば、がん細胞の非がん性細胞へのインビボ変換を使用して、従来のがん療法がない状況でがん細胞の増殖を制御することができる。そのような場合、がん患者は、従来のがん療法により生じる一般的な副作用を回避することができる。
【0009】
概して、本文書の一態様は、がんを有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。本方法は、１つ以上の転写因子をコードする核酸を、哺乳動物内のがん細胞に投与することを含み（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなり）、１つ以上の転写因子は、がん細胞によって発現され、１つ以上の転写因子は、哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞に変換し、それにより哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる。哺乳動物はヒトであり得る。がんは神経膠腫であり得る。１つ以上の転写因子は１つ以上の神経細胞転写因子であり得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチド、及びａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は神経細胞であり得る。神経細胞はＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞であり得る。がんは肝臓癌であり得る。肝臓癌は肝細胞癌であり得る。１つ以上の転写因子は肝臓転写因子であり得る。１つ以上の肝臓転写因子は、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチド、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチド、及びＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の肝臓転写因子は、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は肝細胞であり得る。肝細胞は、肝酵素を分泌する肝細胞であり得る。肝酵素はアルブミンであり得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクターの形態でがん細胞に投与され得る。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。１つ以上の転写因子の各々をコードする核酸は、プロモーター配列に作用可能に連結し得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、哺乳動物の腫瘍への直接注射を含み得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、腹腔内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内、実質内、腫瘍内、鼻腔内、または経口投与を含み得る。本方法は、投与ステップの前に、がんを有する哺乳動物を特定することを含み得る。
【0010】
別の態様では、本文書は、１つ以上の転写因子をコードする核酸を哺乳動物内のがん細胞に投与することを含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）方法に従ってがんを処置するための、１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）組成物の使用を特徴とし、１つ以上の転写因子は、がん細胞によって発現され、１つ以上の転写因子は、哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞に変換し、それにより哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる。哺乳動物はヒトであり得る。がんは神経膠腫であり得る。１つ以上の転写因子は１つ以上の神経細胞転写因子であり得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチド、及びａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は神経細胞であり得る。神経細胞はＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞であり得る。がんは肝臓癌であり得る。肝臓癌は肝細胞癌であり得る。１つ以上の転写因子は肝臓転写因子であり得る。１つ以上の肝臓転写因子は、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチド、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチド、及びＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の肝臓転写因子は、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は肝細胞であり得る。肝細胞は、肝酵素を分泌する肝細胞であり得る。肝酵素はアルブミンであり得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクターの形態でがん細胞に投与され得る。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。１つ以上の転写因子の各々をコードする核酸は、プロモーター配列に作用可能に連結し得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、哺乳動物の腫瘍への直接注射を含み得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、腹腔内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内、実質内、腫瘍内、鼻腔内、または経口投与を含み得る。本方法は、投与ステップの前に、がんを有する哺乳動物を特定することを含み得る。
【0011】
別の態様では、本文書は、１つ以上の転写因子をコードする核酸を哺乳動物内のがん細胞に投与することを含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）方法に従ってがんを処置するための、１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）組成物を特徴とし、１つ以上の転写因子は、がん細胞によって発現され、１つ以上の転写因子は、哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞に変換し、それにより哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる。哺乳動物はヒトであり得る。がんは神経膠腫であり得る。１つ以上の転写因子は１つ以上の神経細胞転写因子であり得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチド、及びａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は神経細胞であり得る。神経細胞はＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞であり得る。がんは肝臓癌であり得る。肝臓癌は肝細胞癌であり得る。１つ以上の転写因子は肝臓転写因子であり得る。１つ以上の肝臓転写因子は、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチド、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチド、及びＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の肝臓転写因子は、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は肝細胞であり得る。肝細胞は、肝酵素を分泌する肝細胞であり得る。肝酵素はアルブミンであり得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクターの形態でがん細胞に投与され得る。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。１つ以上の転写因子の各々をコードする核酸は、プロモーター配列に作用可能に連結し得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、哺乳動物の腫瘍への直接注射を含み得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、腹腔内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内、実質内、腫瘍内、鼻腔内、または経口投与を含み得る。本方法は、投与ステップの前に、がんを有する哺乳動物を特定することを含み得る。
【0012】
別の態様では、本文書は、１つ以上の転写因子をコードする核酸を哺乳動物内のがん細胞に投与することを含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）方法に従ってがんを処置するための医薬品の製造における１つ以上の転写因子をコードする核酸の使用を特徴とし、１つ以上の転写因子は、がん細胞によって発現され、１つ以上の転写因子は、哺乳動物内でがん細胞を非がん性細胞に変換し、それにより哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる。哺乳動物はヒトであり得る。がんは神経膠腫であり得る。１つ以上の転写因子は１つ以上の神経細胞転写因子であり得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、神経原性分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、ニューロゲニン－２（Ｎｅｕｒｏｇ２）ポリペプチド、及びａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（Ａｓｃｌ１）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の神経細胞転写因子は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は神経細胞であり得る。神経細胞はＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞であり得る。がんは肝臓癌であり得る。肝臓癌は肝細胞癌であり得る。１つ以上の転写因子は肝臓転写因子であり得る。１つ以上の肝臓転写因子は、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）ポリペプチド、フォークヘッドボックスタンパク質（Ｆｏｘａ２）ポリペプチド、及びＧＡＴＡ結合タンパク質（ＧＡＴＡ４）ポリペプチドからなる群より選択され得る。１つ以上の肝臓転写因子は、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドを含み得る。非がん性細胞は肝細胞であり得る。肝細胞は、肝酵素を分泌する肝細胞であり得る。肝酵素はアルブミンであり得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクターの形態でがん細胞に投与され得る。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。１つ以上の転写因子の各々をコードする核酸は、プロモーター配列に作用可能に連結し得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、哺乳動物の腫瘍への直接注射を含み得る。１つ以上の転写因子をコードする核酸の投与は、腹腔内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内、実質内、腫瘍内、鼻腔内、または経口投与を含み得る。本方法は、投与ステップの前に、がんを有する哺乳動物を特定することを含み得る。
【0013】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、様々な技術固有の辞書に例示されるように、本発明が関連する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料を使用して本発明を実施することはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、及び例は、例示でしかなく、制限することを意図するものではない。
【0014】
本発明の１つ以上の態様の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ヒト膠芽腫細胞株の特性評価である。Ｕ２５１及びＵ１１８ヒト膠芽腫細胞を特性評価するための一連のマーカー（赤色で染色）の代表的な画像である。赤いボックス（＊でマーク）は、高レベルの免疫陽性マーカーを示す。スケールバーは５０μｍである。ＧＦＡＰ及びＳ１００βは星状膠細胞マーカー、Ｔｕｊ１及びＤＣＸは未成熟神経細胞マーカー、Ｓｏｘ２及びネスチンは神経前駆細胞マーカー、Ｏｌｉｇ２は乏突起膠細胞マーカー、Ｋｉ６７は細胞増殖マーカー、ＥＧＦＲはがんマーカーである。
【図2】ヒト膠芽腫細胞における神経転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現の確認である。Ａは、免疫染色をとおしたＵ２５１ヒト膠芽腫細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現を示す代表的な画像である。スケールバーは２０μｍである。Ｂは、Ｕ２５１ ＧＢＭ細胞における異なる神経転写因子の転写変化を示すリアルタイムｑＰＣＲ分析の階層的クラスタリング及びヒートマップである。Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１によるウイルス感染後のＵ２５１ ＧＢＭ細胞におけるｍＲＮＡレベルの大幅な増加に留意されたい。データを、ＧＦＰ対照ウイルス感染Ｕ２５１細胞に対して正規化し、平均値として表した。感染後（ｄｐｉ）２０日目に試料を収集した。ｎ＝３バッチの培養物。
【図3】Ｎｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１による、ヒト膠芽腫細胞からの神経細胞様細胞の迅速な誘導である。Ａは、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ、ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ、またはＡｓｃｌ１－ＧＦＰレトロウイルスに感染させたＵ２５１ヒトＧＢＭ細胞における未成熟神経細胞マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ、赤色）及びβ３－チューブリン（Ｔｕｊ１、赤紫色）の６ｄｐｉでの免疫染色である。スケールバーは５０μｍである。Ｂ～Ｃは、６ｄｐｉでの神経細胞変換の定量分析である。Ｎｅｕｒｏｇ２は、ＤＣＸ＋細胞（ＧＦＰ、０；Ｎｅｕｒｏｇ２、１２．６％±２．０％；ＮｅｕｒｏＤ１、１．６％±０．４％；Ａｓｃｌ１、０；Ｂ）、及びＴｕｊ１＋細胞（ＧＦＰ、０；Ｎｅｕｒｏｇ２、４６．１％±３．２％；ＮｅｕｒｏＤ１、２０．５％±４．９％；Ａｓｃｌ１、２．６％±０．７％；Ｃ）、続いてウイルス感染の初期段階でのＮｅｕｒｏＤ１の割合の有意な増加を示したことに留意されたい。Ａｓｃｌ１変換効率は、試験した３つの神経転写因子の中で最も低い。データは、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析、続いてダネット検定により分析した。＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１であり、ｎは三連培養からの２００個超の細胞である。
【図4A】単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１は、ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する。Ａ～Ｂでは、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ、ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ、またはＡｓｃｌ１－ＧＦＰのレトロウイルス発現が、ＧＦＰのみ（上段）と比較して、多数の神経細胞をもたらした。Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１変換細胞は、感染後（ｄｐｉ）２０日目に未成熟神経細胞マーカー（Ａ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１）に対して、及び３０ｄｐｉに成熟神経細胞マーカー（Ｂ、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ）に対して免疫陽性であった。スケールバーは５０μｍである。
【図4B】単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１は、ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する。Ａ～Ｂでは、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ、ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ、またはＡｓｃｌ１－ＧＦＰのレトロウイルス発現が、ＧＦＰのみ（上段）と比較して、多数の神経細胞をもたらした。Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１変換細胞は、感染後（ｄｐｉ）２０日目に未成熟神経細胞マーカー（Ａ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１）に対して、及び３０ｄｐｉに成熟神経細胞マーカー（Ｂ、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ）に対して免疫陽性であった。スケールバーは５０μｍである。
【図4C】単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１は、ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する。Ｃ～Ｄは、２０ｄｐｉ（Ｃ）及び３０ｄｐｉ（Ｄ）での変換効率の定量分析である。＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１であり、一元配置分散分析の後でダネット検定、ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図4D】単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１は、ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する。Ｃ～Ｄは、２０ｄｐｉ（Ｃ）及び３０ｄｐｉ（Ｄ）での変換効率の定量分析である。＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１であり、一元配置分散分析の後でダネット検定、ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図4E】単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１は、ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する。Ｅは、リアルタイムｑＰＣＲによって明らかになった、Ｕ２５１細胞中のＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現によるＤＣＸ転写活性化の時間経過である。データを、ＧＦＰ対照に対して正規化し、平均±ＳＥＭとして表した。ｎ＝３バッチ。
【図5】Ｎｅｕｒｏｇ２過剰発現と小分子処理との組み合わせによる、Ｕ１１８ヒト膠芽腫細胞中の神経細胞様細胞の誘導である。Ａ～Ｄでは、Ｕ１１８細胞は、小分子処理と一緒にＮｅｕｒｏｇ２が過剰発現されるときに神経細胞様細胞（青緑色で染色したＤＣＸ）に変換された（コア：５μＭのＤＡＰＴ、１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５μＭのＳＢ４３１５４２、０．２５μＭのＬＤＮ１９３１８９）。１２日間の薬物治療で１８ｄｐｉに試料を収集した。
【図6A】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ａ～Ｄは、神経細胞サブタイプマーカーの免疫染色を示す代表的な画像である。ほとんどのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＡのＤＣＸ、及びＢのＭＡＰ２）は、海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（Ａ）及び前脳神経細胞マーカーＦｏｘＧ１（Ｂ）に対して免疫陽性であった。さらに、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＣのＤＣＸ）は、主にＶＧｌｕＴ１＋（Ｃ）であったが、Ａｓｃｌ１変換神経細胞（ＤのＤＣＸ）の一部もＧＡＢＡ＋（Ｄ）であった。
【図6B】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ａ～Ｄは、神経細胞サブタイプマーカーの免疫染色を示す代表的な画像である。ほとんどのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＡのＤＣＸ、及びＢのＭＡＰ２）は、海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（Ａ）及び前脳神経細胞マーカーＦｏｘＧ１（Ｂ）に対して免疫陽性であった。さらに、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＣのＤＣＸ）は、主にＶＧｌｕＴ１＋（Ｃ）であったが、Ａｓｃｌ１変換神経細胞（ＤのＤＣＸ）の一部もＧＡＢＡ＋（Ｄ）であった。
【図6C】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ａ～Ｄは、神経細胞サブタイプマーカーの免疫染色を示す代表的な画像である。ほとんどのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＡのＤＣＸ、及びＢのＭＡＰ２）は、海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（Ａ）及び前脳神経細胞マーカーＦｏｘＧ１（Ｂ）に対して免疫陽性であった。さらに、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＣのＤＣＸ）は、主にＶＧｌｕＴ１＋（Ｃ）であったが、Ａｓｃｌ１変換神経細胞（ＤのＤＣＸ）の一部もＧＡＢＡ＋（Ｄ）であった。
【図6D】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ａ～Ｄは、神経細胞サブタイプマーカーの免疫染色を示す代表的な画像である。ほとんどのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＡのＤＣＸ、及びＢのＭＡＰ２）は、海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（Ａ）及び前脳神経細胞マーカーＦｏｘＧ１（Ｂ）に対して免疫陽性であった。さらに、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞（ＣのＤＣＸ）は、主にＶＧｌｕＴ１＋（Ｃ）であったが、Ａｓｃｌ１変換神経細胞（ＤのＤＣＸ）の一部もＧＡＢＡ＋（Ｄ）であった。
【図6E】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ｅ～Ｈは、ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の定量分析である。試料は２０ｄｐｉのものであった。スケールバーは５０μｍである。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図6F】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ｅ～Ｈは、ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の定量分析である。試料は２０ｄｐｉのものであった。スケールバーは５０μｍである。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図6G】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ｅ～Ｈは、ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の定量分析である。試料は２０ｄｐｉのものであった。スケールバーは５０μｍである。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図6H】ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の特性評価である。Ｅ～Ｈは、ヒトＧＢＭ細胞からの変換神経細胞の定量分析である。試料は２０ｄｐｉのものであった。スケールバーは５０μｍである。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図7】ヒトＧＢＭ細胞変換神経細胞間の神経細胞同一性のさらなる特性評価である。Ａ～Ｂは、２０ｄｐｉでの、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞間のＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１によるウイルス感染後の皮質神経細胞マーカーであるＣｔｉｐ２（Ａ）またはＴｂｒ１（Ｂ）の免疫染色シグナルを示す代表的な画像である。スケールバーは５０μｍである。
【図8】Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１による感染後のヒト星状膠細胞変換神経細胞との比較である。Ａは、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１によって誘導されたヒト星状膠細胞変換神経細胞の大部分が、海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１及び前脳マーカーであるＦｏｘＧ１について免疫陽性であったことを示す。はるかに少ないＡｓｃｌ１変換神経細胞がＣｔｉｐ２＋であった。スケールバーは２０μｍである。Ｂは、ヒト皮質星状膠細胞（ＨＡ１８００細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）製のＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換神経細胞の定量分析である。Ｐｒｏｘ１＋／ＭＡＰ２＋：Ｎｅｕｒｏｇ２、８５．４％±３．４％；ＮｅｕｒｏＤ１、８９．２％±３．３％；Ａｓｃｌ１、８５．０％±３．７％．ＦｏｘＧ１＋／ＭＡＰ２＋：Ｎｅｕｒｏｇ２、９２．６％±３．８％；ＮｅｕｒｏＤ１、８５．１％±２．７％；Ａｓｃｌ１、８５．７％±４．８％．Ｃｔｉｐ２＋／ＭＡＰ２＋：Ｎｅｕｒｏｇ２、４６．６％±５．１％；ＮｅｕｒｏＤ１、６１．１％±２．８％；Ａｓｃｌ１、１４．０％±５．４％．試料は３０ｄｐｉのものであった。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎは三連培養からの５０個超の細胞である。
【図9A】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ａは、ＧＦＰのみを発現する対照Ｕ２５１膠芽腫細胞（上段）と比較した、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞（下段）における星状膠細胞マーカーであるビメンチン及びＧＦＡＰの下方調節である。試料は２０ｄｐｉのものであった。
【図9B】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｂ～Ｃは、ＧＦＰ単独（上段）またはＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ（下段）を過剰発現するＵ２５１ ＧＢＭ細胞間のギャップ接合部（コネキシン４３）を示す代表的な画像である。定量データ（Ｃ）は、対照ＧＦＰ群と比較して、Ｎｅｕｒｏｇ２群中でコネキシン４３の強度が有意に低下したことを示す。試料は２０ｄｐｉのものであった。ｎは三連培養からの６０個以上である。
【図9C】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｂ～Ｃは、ＧＦＰ単独（上段）またはＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ（下段）を過剰発現するＵ２５１ ＧＢＭ細胞間のギャップ接合部（コネキシン４３）を示す代表的な画像である。定量データ（Ｃ）は、対照ＧＦＰ群と比較して、Ｎｅｕｒｏｇ２群中でコネキシン４３の強度が有意に低下したことを示す。試料は２０ｄｐｉのものであった。ｎは三連培養からの６０個以上である。
【図9D】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｄは、６ｄｐｉでのＮｅｕｒｏｇ２を過剰発現するＵ２５１細胞中のＧＡＰ４３及びファロイジンによって示される成長円錐を図示する代表的な画像である。
【図9E】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｅ～Ｈは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のミトコンドリア（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）及びゴルジ装置（ＧＭ１３０）の分布及び形態変化である。定量データは、３０ｄｐｉでのＮｅｕｒｏｇ２発現後のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度（Ｆ）及びＧＭ１３０被覆面積により反映されるゴルジ装置サイズ（Ｈ）の変化を示す。ｎは三連培養からの１５０個以上である。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｄ）で２０μｍ、（Ｅ）及び（Ｇ）で１０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図9F】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｅ～Ｈは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のミトコンドリア（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）及びゴルジ装置（ＧＭ１３０）の分布及び形態変化である。定量データは、３０ｄｐｉでのＮｅｕｒｏｇ２発現後のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度（Ｆ）及びＧＭ１３０被覆面積により反映されるゴルジ装置サイズ（Ｈ）の変化を示す。ｎは三連培養からの１５０個以上である。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｄ）で２０μｍ、（Ｅ）及び（Ｇ）で１０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図9G】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｅ～Ｈは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のミトコンドリア（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）及びゴルジ装置（ＧＭ１３０）の分布及び形態変化である。定量データは、３０ｄｐｉでのＮｅｕｒｏｇ２発現後のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度（Ｆ）及びＧＭ１３０被覆面積により反映されるゴルジ装置サイズ（Ｈ）の変化を示す。ｎは三連培養からの１５０個以上である。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｄ）で２０μｍ、（Ｅ）及び（Ｇ）で１０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図9H】Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化である。Ｅ～Ｈは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のミトコンドリア（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）及びゴルジ装置（ＧＭ１３０）の分布及び形態変化である。定量データは、３０ｄｐｉでのＮｅｕｒｏｇ２発現後のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ強度（Ｆ）及びＧＭ１３０被覆面積により反映されるゴルジ装置サイズ（Ｈ）の変化を示す。ｎは三連培養からの１５０個以上である。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｄ）で２０μｍ、（Ｅ）及び（Ｇ）で１０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図10A】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ａは、ＧＦＰ、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ、ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ、またはＡｓｃｌ１－ＧＦＰを発現するＵ２５１ヒト膠芽腫細胞におけるＢｒｄＵ免疫染色をとおして細胞増殖を調べる代表的な画像である。細胞培養物を１０ｍＭのＢｒｄＵ中で２４時間インキュベートした後、７ｄｐｉで免疫染色した。スケールバーは５０μｍである。
【図10B】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ｂは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中の増殖細胞（ＢｒｄＵ＋細胞／全感染細胞）の定量分析である。データは、一元配置分散分析、続いてダネット検定により分析した。＊＊＊はｐ＜０．００１であり、ｎは三連培養からの２００個以上の細胞である。
【図10C】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ｃ～Ｄは、ＧＦＰのみまたはＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰを過剰発現するＵ２５１ ＧＢＭ細胞におけるウエスタンブロットによって調べたＧＳＫ３β発現レベルである。データを、ＧＦＰ対照（Ｄ）に対して正規化した。試料を２０ｄｐｉで収集した。ｎは３バッチである。
【図10D】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ｃ～Ｄは、ＧＦＰのみまたはＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰを過剰発現するＵ２５１ ＧＢＭ細胞におけるウエスタンブロットによって調べたＧＳＫ３β発現レベルである。データを、ＧＦＰ対照（Ｄ）に対して正規化した。試料を２０ｄｐｉで収集した。ｎは３バッチである。
【図10E】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ｅは、２０ｄｐｉでのＧＦＰまたはＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ過剰発現（ＧＦＰ）時のＵ２５１ ＧＢＭ細胞におけるＧＳＫ３β免疫染色である。Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞におけるＧＳＫ３βシグナルの有意な増加に留意されたい。スケールバーは５０μｍである。
【図10F】ヒト膠芽腫細胞の神経細胞変換により増殖が阻害される。Ｆは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のＧＳＫ３β免疫染色強度の定量分析である。試料を２０ｄｐｉで収集した。データは、スチューデントｔ検定により分析した。＊＊＊はｐ＜０．００１であり、ｎは６バッチである。データを平均±ＳＥＭとして表す。
【図11】ヒトＧＢＭ細胞の神経細胞変換中の自食作用／リソソームの検査。Ａは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中の自食作用／リソソーム（ＡＴＧ５、赤色で染色）の分布及び形態変化を図示する代表的な画像である。Ｂ～Ｃは、３０ｄｐｉでの感染Ｕ２５１細胞におけるＡＴＧ５領域（Ｂ）及び強度（Ｃ）の定量データである。ｎは三連培養からの１５０個以上の細胞である。スケールバーは１０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図12】ヒト膠芽腫細胞変換神経細胞の機能分析。Ａでは、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞において、樹状突起（ＭＡＰ２、青緑色）に沿って堅牢なシナプス点（ＳＶ２）が検出された。スケールバーは２０μｍである。Ｂ～Ｃは、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞から記録されたＮａ＋及びＫ＋電流を示す代表的なトレース図（Ｂ）であり、定量分析は（Ｃ）に示す。Ｄ～Ｅでは、全細胞パッチクランプ記録により、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞（Ｄ）から発射される活動電位を明らかにし、円グラフは、単一（暗灰色、Ｅ）、反復性（明灰色、Ｅ）、または活動電位なし（黒色、Ｅ）を発射する細胞の割合を示す。試料は３０ｄｐｉのものであった。ｎは三連培養からの２０個以上である。
【図13】ＧＳＫ３βの阻害により、ヒトＧＢＭ細胞の神経細胞変換が受ける影響である。Ａは、２０ｄｐｉでのＵ２５１ヒトＧＢＭ細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞（ＤＣＸ、赤色で染色）中のＧＳＫ３β（赤紫色で染色）の免疫染色である。スケールバーは５０μｍである。Ｂ～Ｃ、ＧＳＫ３βをＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ）またはＴＷＳ１１９（１０μＭ）により２０日間阻害した後のＧＳＫ３β強度（Ｂ）及び神経細胞変換効率（Ｃ）の定量分析である。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。ｎは３以上の反復である。
【図14】ヒト膠芽腫細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞におけるがんメーカーの調査。Ａ～Ｂは、２０ｄｐｉでのＵ２５１ヒト膠芽腫細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞中のＩＬ１３Ｒａ２（赤色で染色、Ａ）の免疫染色である。パネル（Ｂ）で定量化する。スケールバーは５０μｍである。Ｃ～Ｄは、Ｕ２５１細胞の神経細胞変換中のＥＧＦＲ（赤色で染色、Ｃ）の免疫染色である。試料を２０ｄｐｉで収集した。スケールバーは２０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析した。ｎは三連培養からの４０個以上の細胞である。
【図15】異種移植マウスモデルにおけるヒト膠芽腫細胞のインビボ神経細胞変換である。Ａ、移植から１か月後のＲａｇ１－／－免疫不全マウスの脳内に移植されたヒトＵ２５１ ＧＢＭ細胞（Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰレトロウイルスと混合）を図示する代表的な画像である。Ｕ２５１細胞は高レベルのビメンチンを発現し、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ感染Ｕ２５１細胞は、未成熟神経細胞マーカーであるＤＣＸについて免疫陽性であったことに留意されたい。Ｂは、移植から１か月後の変換効率の定量分析である。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊＊＊はｐ＜０．００１であり、ｎは３動物である。インビボ変換効率も非常に高かった（約９０％）ことに留意されたい。Ｃは、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰ（下段）レトロウイルスに感染した移植Ｕ２５１細胞（ビメンチン）の大部分が、移植から１週間後に神経細胞（ＤＣＸ）に変換されたことを示す、高倍率画像である。Ｄ～Ｅは、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞（ビメンチン及びヒト核と表示）の移植から１か月後の神経細胞マーカーであるＴｕｊ１及び海馬神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１によって示されるインビボでのＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞のさらなる特性評価である。スケールバーは、（Ａ）で２００μｍ、（Ｃ）～（Ｅ）で２０μｍである。
【図16】膠芽腫細胞のインビボでの神経細胞変換後の細胞増殖の阻害及びアストログリオーシスの減少である。Ａ～Ｂは、移植から７日後の増殖するＵ２５１ ＧＢＭ細胞（Ｋｉ６７＋）の代表的な画像（Ａ）及び定量分析（Ｂ）である。Ｎｅｕｒｏｇ２群における細胞増殖の有意な減少に留意されたい。ｎは４動物である。Ｃ～Ｄは、対側ＧＦＰ感染領域（Ｃ）と比較した、Ｎｅｕｒｏｇ２感染領域（Ｄ）における反応性星状膠細胞（ＬＣＮ２と表示）の減少である。試料は移植から３週間後のものであった。Ｅは、Ｕ２５１細胞移植から３週間後のＬＣＮ２被覆面積（Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたはＧＦＰレトロウイルスに感染）の定量分析である。ｎは５動物である。スケールバーは５０μｍである。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図17】膠芽腫細胞のインビボの神経細胞変換中の常在ミクログリア及び血管分布である。Ａ～Ｂは、Ｎｅｕｒｏｇ２またはＧＦＰ対照ウイルス感染によるＵ２５１ ＧＢＭ細胞移植から３週間後の常在ミクログリア（Ｉｂａ１、赤色）の検査である。パネル（Ｂ）におけるＩｂａ１の平均強度の定量分析。ｎは３動物である。スケールバーは１００μｍである。Ｃ～Ｄは、Ｎｅｕｒｏｇ２またはＧＦＰ対照ウイルス感染によるＵ２５１ ＧＢＭ細胞移植から３週間後の血管分布（Ｌｙ６ｃ、赤色で染色）を示す代表的な画像である。パネル（Ｃ）におけるＬｙ６ｃ被覆面積の定量分析。データは、平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定により分析する。ｎは５動物である。スケールバーは１００μｍである。
【図18】肝臓転写因子であるＦｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４による肝臓腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２の形質導入である。Ａでは、ガラスカバースリップ上で増殖させた形質導入細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ニワトリ抗ＧＦＰ及びヤギ抗Ｆｏｘａ２またはニワトリ抗ＧＦＰ及びヤギ抗ＨＮＦ４Ａまたはニワトリ抗ＧＦＰ及びヤギ抗ＧＡＴＡ４抗体の混合物と結合させた。検出には、二次抗体であるニワトリ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８及びヤギ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４を使用した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡により蛍光を可視化した。Ｂでは、１２ウェルプレートで増殖させた形質導入細胞を採取し、細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に処理し、マウスモノクローナル抗ＧＦＰ抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した。Ｃ、Ｄ、Ｅでは、細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、それぞれ、ヤギポリクローナル抗Ｆｏｘａ２、ヤギポリクローナル抗ＨＮＦ４Ａ、またはヤギポリクローナル抗ＧＡＴＡ４抗体を用いて免疫ブロット用に処理した。
【図19】ＧＡＴＡ４の形質導入により、内因性Ｆｏｘａ２発現レベルが増加する。Ａでは、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、またはＧＦＰ形質導入ＨｅｐＧ２細胞を採取し、細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ヤギポリクローナル抗Ｆｏｘａ２抗体とマウスモノクローナル抗ＨＮＦ４Ａ抗体との混合物を用いて免疫ブロットにより分析した。ウサギＧＡＰＤＨポリクローナル抗体を、内部負荷対照として使用した。Ｂでは、上記の細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ヤギポリクローナル抗ＧＡＴＡ４抗体とウサギポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体との混合物を用いて免疫ブロットにより分析した。
【図20】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株のインビトロ及びインビボでの細胞増殖である。Ａは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株のインビトロでの増殖曲線である。等量のＦｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞を１２ウェルプレートに播種した。異なる時点で、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。染色したクリスタルバイオレットを酢酸により抽出し、各抽出物の光学密度をマイクロプレートリーダーで読み取った。光学密度の体積は、各ウェル中で増殖させた細胞数を表す。各値は、３つの個別の実験を表す。Ｂは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株の腫瘍増殖曲線である。Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株を、ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍を、キャリパーを使用して腫瘍サイズを測定することにより４日ごとにモニタリングした。腫瘍体積を、次式：Ｖ＝幅×長さ×長さ×０．５により計算した。
【図21】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞からのアルブミンの発現及び分泌である。Ａは、ガラスカバースリップ上で増殖させた形質導入細胞を、ニワトリ抗ＧＦＰとヤギ抗アルブミン抗体との混合物と結合させた。検出には、二次抗体であるニワトリ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８及びヤギ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４を使用した。図１８Ａについて記載したように、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡により蛍光を可視化した。Ｂでは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞で発現されたアルブミンを、ヤギポリクローナル抗アルブミン抗体を用いてウエスタンブロットにより検出した。ウサギポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用して、内部負荷対照を示した。Ｃでは、相対アルブミン産生を、ＧＦＰ形質導入細胞で得られたアルブミンの量に対して正規化した、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、またはＨＮＦ４Ａ形質導入細胞で検出されたアルブミンの量として計算した。結果は、３つの独立した実験に由来した。Ｄは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の培養培地に分泌されたアルブミン濃度である。Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞で産生されたアルブミンを、培養培地に分泌させた。培養培地中のアルブミンの濃度を、ＥＬＩＳＡにより、ＥＬＩＳＡキットの説明書に従って測定した。アルブミン濃度を、キットで提供される標準曲線と比較して得た。
【図22A】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞中の肝臓癌マーカーアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）発現である。Ａでは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞を、カバースリップ上で増殖させ、固定し、ニワトリ抗ＧＦＰとウサギ抗ＡＦＰとの混合物で染色した。検出には、ニワトリ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８とウサギ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４との二次抗体混合物を使用した。図１８Ａについて記載したように、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡により蛍光を可視化した。
【図22B】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞中の肝臓癌マーカーアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）発現である。Ｂでは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより溶解させて分画し、免疫ブロット分析のためにウサギポリクローナル抗ＡＦＰでプローブした。ウサギＧＡＰＤＨポリクローナル抗体を、内部負荷対照として使用した。相対ＡＦＰレベルを、ＧＦＰ形質導入細胞で得られたＡＦＰの量に対して正規化した、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、またはＨＮＦ４Ａ形質導入細胞で検出されたＡＦＰの量として計算した。結果は、３つの独立した実験に由来した。
【図22C】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞中の肝臓癌マーカーアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）発現である。Ｃは、ＧＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＡＴＡ４形質導入細胞によって形成された腫瘍におけるＡＦＰレベルである。腫瘍切片を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、続いて、一次抗体であるニワトリ抗ＧＦＰ及びウサギ抗ＡＦＰとともにインキュベーションした。検出には、ニワトリ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８とウサギ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４との二次抗体混合物を使用した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡により蛍光を可視化した。
【図22D】Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞中の肝臓癌マーカーアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）発現である。Ｄでは、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株の異種移植腫瘍を新たに収集し、溶解させた。溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより分離させ、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、及びＧＦＰ抗体でプローブした。アクチンを内部負荷対照として示した。相対ＡＦＰレベルを、パネルＢについて記載したように、ＧＦＰ形質導入細胞で得られたＡＦＰの量に対して正規化した、ＧＡＴＡ４またはＨＮＦ４Ａ形質導入細胞で検出されたＡＦＰの量として計算した。結果は３つの独立した実験に由来した。
【図23A】ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａの過剰発現は、膜性Ｅ－カドヘリンの増加をもたらす。Ａでは、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞を、ニワトリ抗ＧＦＰとウサギ抗Ｅ－カドヘリンとの混合物で染色した。検出には、ニワトリ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８とウサギ特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４との二次抗体混合物を使用した。図１８Ａについて記載したように、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡により蛍光を可視化した。
【図23B】ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａの過剰発現は、膜性Ｅ－カドヘリンの増加をもたらす。Ｂでは、溶解させたＦｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分画し、ウエスタンブロット分析のためにウサギポリクローナル抗Ｅ－カドヘリンでプローブした。ウサギＧＡＰＤＨポリクローナル抗体を、内部負荷対照として使用した。相対ＡＦＰレベルを、ＧＦＰ形質導入細胞で得られたＥ－カドヘリンの量に対して正規化した、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、またはＨＮＦ４Ａ形質導入細胞で検出されたＥ－カドヘリンの量として計算した。結果は、３つの独立した実験に由来した。
【図23C】ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａの過剰発現は、膜性Ｅ－カドヘリンの増加をもたらす。Ｃは、ＧＡＴＡ４またはＨＮＦ４Ａ形質導入細胞中の増加したＥ－カドヘリンがＧＦＰ腫瘍と比較して腫瘍を形成したことを示すＥ－カドヘリンの免疫蛍光画像である。
【図23D】ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａの過剰発現は、膜性Ｅ－カドヘリンの増加をもたらす。Ｄでは、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の腫瘍試料を、抗Ｅ－カドヘリン抗体を用いてウエスタンブロットにより定量的に分析した。Ｅ－カドヘリンは、ＧＡＴＡ４で示されるように、ＧＦＰ発現腫瘍細胞と比較して、測定可能な２倍高い強度でより強く発現した。
【図24A】ＧＡＴＡ４過剰発現細胞株におけるベータ－カテニンの発現及び再分布である。Ａでは、ＧＡＴＡ４またはＧＦＰ形質導入細胞をウサギ抗ベータ－カテニン抗体で染色し、ベータ－カテニンの免疫蛍光画像を顕微鏡で可視化した。ＧＡＴＡ４細胞中のベータ－カテニンを細胞表面に分布させた。
【図24B】ＧＡＴＡ４過剰発現細胞株におけるベータ－カテニンの発現及び再分布である。Ｂは、ベータ－カテニン抗体を用いたＦｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞のウエスタンブロット分析、及びＦｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞中で検出された相対的ベータ－カテニンレベルである。結果は、３つの独立した実験に由来した。
【図24C】ＧＡＴＡ４過剰発現細胞株におけるベータ－カテニンの発現及び再分布である。Ｃは、ＧＡＴＡ４形質導入細胞中の増加したベータ－カテニンがＧＦＰ腫瘍と比較して腫瘍を形成したことを示すベータ－カテニンの免疫蛍光画像である。
【図24D】ＧＡＴＡ４過剰発現細胞株におけるベータ－カテニンの発現及び再分布である。Ｄでは、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の腫瘍試料を、抗ベータ－カテニン抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の腫瘍中で発現されたベータ－カテニンを計算した。
【図25】ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ形質導入細胞の腫瘍におけるビメンチン発現である。抗ビメンチン抗体を用いたＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の腫瘍中で発現されたビメンチンのウエスタンブロット分析により、ＧＡＴＡ４形質導入細胞中のビメンチンレベルが低下し、ＧＦＰ腫瘍と比較して腫瘍が形成されたことが明らかになった。ビメンチンの減少を、ＧＦＰ形質導入細胞で得られたビメンチンの量に対して正規化した、ＧＡＴＡ４形質導入細胞で検出されたビメンチンの量の比較により計算した。
【図26】代表的なＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）である。
【図27】代表的なＮｅｕｒｏｇ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図28】代表的なＡｓｃｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）である。
【図29】代表的なＨＮＦ４Ａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図30】代表的なＦｏｘａ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）である。
【図31】代表的なＧＡＴＡ４ポリペプチド（配列６）のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途示さない限り、複数の参照を含む。
【0017】
本文書は、がんを有する哺乳動物を処置するための方法及び材料を提供する。例えば、１つ以上の転写因子をコードする核酸、または１つ以上の転写因子自体は、がんを有する哺乳動物を処置するために使用され得る。いくつかの場合、本明細書に記載されるがんを有する哺乳動物を処置することは、哺乳動物内のがん細胞を、哺乳動物内の非がん性細胞（例えば、機能細胞またはほぼ正常な細胞）に変換することを含み得る。いくつかの場合、本明細書に記載されるがんを有する哺乳動物を処置することは、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上の変換有効性を有し得る。いくつかの場合、本明細書に記載されるがんを有する哺乳動物を処置することは、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセントの変換有効性を有し得る。例えば、本明細書に記載されるがんを有する哺乳動物を処置することは、例えば、哺乳動物内のがん細胞の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上を非がん性細胞（例えば、機能細胞またはほぼ正常な細胞）に変換するのに有効であり得る。いくつかの場合、本明細書記載されるがんを有する哺乳動物を処置することは、哺乳動物内のがん細胞を、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント、非がん性細胞に変換するのに有効であり得る。
【0018】
いくつかの場合、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与して、哺乳動物におけるがんのサイズを減少させる（例えば、哺乳動物におけるがん細胞の数及び／または哺乳動物における１つ以上の腫瘍の体積を減少させる）ことができる。例えば、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、脳腫瘍のサイズを、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上減少させることができる。別の例では、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、肝臓癌のサイズを、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上減少させることができる。いくつかの場合、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、肝臓癌のサイズを、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント減少させることができる。
【0019】
いくつかの場合、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与して、哺乳動物の生存率を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはそれ以上、増加させる（例えば、哺乳動物の５年相対生存率を増加させる）ことができる。いくつかの場合、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与して、哺乳動物の生存率を、１～１０年、例えば、１～１．５年、１～２年、１～２．５年、１．５～２年、１．５～２．５年、１．５～３年、２～２．５年、２～３年、２～３．５年、２．５～３年、２．５～３．５年、２．５～４年、３～３．５年、３～４年、３～４．５年、３．５～４年、３．５～４．５年、３．５～５年、４～４．５年、４～５年、４～５．５年、４．５～５年、４．５～５．５年、４．５～６年、５～５．５年、５～６年、５～６．５年、５．５～６年、５．５～６．５年、５．５～７年、６～６．５年、６～７年、６～７．５年、６．５～７年、６．５～７．５年、６．５～８年、７～７．５年、７～８年、７～８．５年、７．５～８年、７．５～８．５年、７．５～９年、８～８．５年、８～９年、８～９．５年、８．５～９年、８．５～９．５年、８．５～１０年、９～９．５年、９～１０年、または９．５～１０年、増加させることができる。
【0020】
例えば、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物の生存率を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上増加させることができる。いくつかの場合、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物の生存率を、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント増加させることができる。別の例では、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物（例えば、ヒト）の生存率を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上増加させることができる。いくつかの場合、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物の生存率を、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント増加させることができる。
【0021】
いくつかの場合、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に投与して、哺乳動物内のがん細胞を分化させること（例えば、がん細胞を、哺乳動物内の末端分化細胞及び／または非分裂細胞に変換すること）ができる。例えば、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、例えば、哺乳動物の脳腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞）の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９パーセント、またはそれ以上を、生存哺乳動物の脳内の非がん性神経細胞（例えば、生存哺乳動物の脳に組み込まれ得る機能性神経細胞）に分化させることができる。いくつかの場合、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント分化させることができる。例えば、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、例えば、哺乳動物の肝臓癌細胞の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９パーセント、またはそれ以上を、生存哺乳動物の肝臓内の非がん性肝細胞（例えば、生存哺乳動物の肝臓に組み込まれ得る機能性肝細胞）に分化させることができる。いくつかの場合、１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の肝臓転写因子自体）を、本明細書に記載される肝臓癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物の肝臓癌細胞の１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセントを、生存哺乳動物の肝臓内の非がん性肝細胞（例えば、生存哺乳動物の肝臓に組み込まれ得る機能性肝細胞）に分化させることができる。
【0022】
いくつかの場合、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、それを必要とする哺乳動物（例えば、脳腫瘍を有する哺乳動物）に投与して、哺乳動物のアストログリオーシスを減少させることができる。例えば、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物のアストログリオーシスを、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上減少させることができる。いくつかの場合、１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の神経細胞転写因子自体）を、本明細書に記載される脳腫瘍を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物のアストログリオーシスを、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント減少させることができる。
【0023】
いずれの適当な哺乳動物も、本明細書に記載されるように処置することができる。がんを有し得、本明細書に記載されるように処置することができる哺乳動物の例としては、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、フェレット、及びヒツジが挙げられる。いくつかの場合、がんを有するヒトを本明細書に記載されるように治療して、ヒト内のがん細胞の数を、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、またはそれ以上減少させることができる。いくつかの場合、がんを有するヒトを本明細書に記載されるように治療して、ヒト内のがん細胞の数を、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセント減少させることができる。
【0024】
本明細書に記載されるがんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）を処置する場合、がんは、いずれの種類のがんであってもよい。本明細書で使用される場合、哺乳動物は、哺乳綱に分類される任意の生物を指す。本明細書で使用される場合、ヒトは、ホモ・サピエンス種を指す。いくつかの場合、がんは血液がんであり得る。いくつかの場合、がんは、１つ以上の固形腫瘍を含み得る。いくつかの場合、がんは管腔がんであり得る。いくつかの場合、がんはがん腫であり得る。いくつかの場合、がんは非上皮性がんであり得る。いくつかの場合、がんは骨髄腫がんであり得る。いくつかの場合、がんは白血病がんであり得る。いくつかの場合、がんはリンパ腫がんであり得る。いくつかの場合、がんは混合型がんであり得る。いくつかの場合、がんは原発性がんであり得る。いくつかの場合、がんは続発性がんであり得る。いくつかの場合、がんは転移性がんであり得る。いくつかの場合、がんは０期がんであり得る。いくつかの場合、がんはＩ期がんであり得る。いくつかの場合、がんはＩＩ期がんであり得る。いくつかの場合、がんはＩＶ期がんであり得る。本明細書に記載されるように処置することができるがんの例としては、非限定的に、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、膵臓癌、子宮癌、子宮癌、胆嚢癌、膀胱癌、食道癌、皮膚癌、腎臓癌、卵巣癌、及び白血病が挙げられる。
【0025】
いくつかの場合、本明細書に記載の方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）を、がんを有するものとして識別することを含み得る。任意の適当な方法を使用して、哺乳動物を、がんを有するものとして識別することができる。例えば、撮像技法、生検技法、細胞診技法、顕微鏡検査技法、組織化学染色技法、免疫組織化学染色技法、フローサイトメトリー技法、画像サイトメトリー技法、及び／または遺伝子検査技法を使用して、がんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）を識別することができる。いくつかの場合、撮像技法は、Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、超音波、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴスキャン）、及びソノグラムであり得る。いくつかの場合、生検技法は、細針吸引生検、コア針生検、真空補助生検、切除生検、薄片生検、パンチ生検、内視鏡生検、腹腔鏡生検、及び骨髄吸引生検であり得る。いくつかの場合、細胞診技法は、スクレープまたはブラシ細胞診技法であり得る。いくつかの場合、顕微鏡検査技法は、光顕微鏡法、電子顕微鏡法、レーザー顕微鏡法、及び／または光学顕微鏡法であり得る。いくつかの場合、組織染色技術は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、アルシアンブルー染色、アルデヒドフクシン染色、アルカリホスファターゼ染色、ビルショウスキー染色、コンゴレッド染色、クリスタルバイオレット染色、フォンタナ－マッソン染色、ギムザ染色、ルナ染色、ニッスル染色、過ヨウ素酸シッフ染色、オイルレッドＯ染色、レチクリン染色、ズダンブラックＢ染色、トルイジンブルー染色、及び／またはファン・ギーソン染色であり得る。いくつかの場合、遺伝子検査技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子発現マイクロアレイ技法、ＲＮＡ配列決定、及び／またはＤＮＡ配列決定であり得る。
【0026】
特定の種類のがん（例えば、脳腫瘍、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌）を有すると識別されると、そのがん細胞型に適当な１つ以上の転写因子を、本明細書に記載される使用のために選択することができる。例えば、ＧＢＭなどの脳腫瘍の場合、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、及び／またはＡｓｃｌ１などの転写因子を、脳腫瘍細胞を非がん性細胞に変換するために選択し使用することができる。肝臓癌細胞については、ＨＮＦ４Ａ、Ｆｏｘａ２、及び／またはＧＡＴＡ４などの転写因子を、肝臓癌細胞を非がん性細胞に変換するために選択し使用することができる。特定のがん細胞型に対して選択して、それらの特定のがん細胞を非がん性細胞に変換することができる転写因子の他の例を表１に示す。
【0027】
【表1】
【0028】
本明細書に記載されるように、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）は、哺乳動物の脳（例えば、線条体）内で１つ以上の神経細胞転写因子を発現するように設計された核酸を、脳腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞）による哺乳動物の脳（例えば、線条体）内での非がん性神経細胞（例えば、機能性神経細胞、ほぼ正常な神経細胞、及び／または統合神経細胞）の形成を誘発する様式で、投与することによって処置することができる。神経細胞転写因子の例としては、非限定的に、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及びＡｓｃｌ１ポリペプチドが挙げられる。ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００２４９１（ＧＩ番号１２１１１４３０６）もしくはＱ１３５６２．３または配列番号１（図２６）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２５００（ＧＩ番号３２３４６２１７４）に示される核酸配列によってコードされ得る。Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿０７６９２４．１、ＥＡＸ０６２７８．１、もしくはＡＡＨ３６８４７．１、または配列番号２（図２７）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０２４０１９．４に示される核酸配列によってコードされ得る。Ａｓｃｌ１ポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００４３０７．２または配列番号３（図２８）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。Ａｓｃｌ１ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００４３１６．４に示される核酸配列によってコードされ得る。
【0029】
本明細書に記載されるように、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）は、哺乳動物の肝臓内で１つ以上の肝臓転写因子を発現するように設計された核酸を、肝臓癌細胞による哺乳動物の肝臓内での非がん性肝細胞（例えば、機能性肝細胞、ほぼ正常な肝細胞、及び／または統合肝細胞）の形成を誘発する様式で、投与することによって処置することができる。肝臓転写因子の例としては、非限定的に、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及びＧＡＴＡ４ポリペプチドが挙げられる。ＨＮＦ４Ａポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＸＰ＿００５２６０４６４．１、ＮＰ＿０００４４８．３、ＮＰ＿００１２７４１１３．１、ＮＰ＿００１２７４１１２．１、ＮＰ＿００１２７４１１１．１、ＮＰ＿００１２４５２８４．１、ＮＰ＿００１０２５１７４．１、ＮＰ＿７８７１１０．２、ＮＰ＿００１０２５１７５．１、ＮＰ＿８４９１８１．１、もしくはＮＰ＿８４９１８０．１、または配列番号４（図２９）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ＨＮＦ４Ａポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿１７８８４９．３に示される核酸配列によってコードされ得る。Ｆｏｘａ２ポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＨ１１７８０．１もしくはＡＣＡ０６１１１．１、または配列番号５（図３０）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。Ｆｏｘａ２ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０２１７８４．５に示される核酸配列によってコードされ得る。ＧＡＴＡ４ポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ４３４８０．１、ＮＰ＿００１２９５０２２．１、ＮＰ＿００２０４３．２、ＮＰ＿００１２９５０２３．１、もしくはＮＰ＿００１３６１２０３．１、または配列６（図３１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ＧＡＴＡ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１３０８０９３．３に示される核酸配列によってコードされ得る。
【0030】
任意の適当な方法を使用して、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に送達することができる。例えば、転写因子をコードする核酸は、ウイルスベクターなどの１つ以上のベクターを使用して哺乳動物に投与することができる。転写因子を発現するように設計された２つ以上の核酸が生存哺乳動物内の細胞に送達されるいくつかの場合では、別個のベクター（例えば、第１の転写因子をコードする核酸のための１つのベクター、及び第２の転写因子をコードする核酸のための１つのベクター）を使用して、核酸を細胞に送達することができる。転写因子を発現するように設計された２つ以上の核酸が生存哺乳動物内の細胞に送達されるいくつかの場合では、第１の転写因子をコードする核酸と第２の転写因子をコードする核酸との両方を含む単個のベクターを使用して、核酸を細胞に送達することができる。
【0031】
核酸（例えば、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸）を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に投与するためのベクターを使用して、核酸を任意の適当な細胞に投与することができる。いくつかの場合、ベクターを使用して、転写因子をコードする核酸を分裂細胞に投与することができる。いくつかの場合、ベクターを使用して、転写因子をコードする核酸を非分裂細胞に投与することができる。いくつかの場合、ベクターを使用して、転写因子をコードする核酸をがん細胞に投与することができる。
【0032】
いくつかの場合、核酸（例えば、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸）を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に投与するためのベクターは、転写因子（複数可）の一過性の発現に使用することができる。
【0033】
いくつかの場合、核酸（例えば、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸）を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に投与するためのベクターは、転写因子（複数可）の安定した発現に使用することができる。核酸を投与するためのベクターを１つ以上の転写因子の安定した発現のために使用することができる場合、ベクターは、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸を細胞のゲノムに組み込むように操作することができる。いくつかの場合、核酸を細胞のゲノムに組み込むようにベクターを操作するとき、任意の適当な方法を使用して、その核酸を細胞のゲノムに組み込むことができる。例えば、遺伝子療法技法を使用して、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸を細胞のゲノムに組み込むことができる。
【0034】
核酸（例えば、１つ以上の転写因子をコードする核酸）を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に投与するためのベクターは、標準的な物質（例えば、パッケージング細胞株、ヘルパーウイルス、及びベクター構築物）を使用して調製することができる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）、及びＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｕｒｔｉｓ Ａ．Ｍａｃｈｉｄａ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３）を参照されたい。１つ以上の転写因子をコードする核酸を細胞（例えば、生存哺乳動物内の細胞）に投与するために設計されたベクターは適当なベクターであることができ、これには、非限定的に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスベクターと、ウイルスベクターを模倣するナノ粒子などの非ウイルスベクターとが含まれる。いくつかの場合、１つ以上の転写因子をコードする核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ血清型２ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型５ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型９ウイルスベクター、またはＡＡＶ血清型２／５ウイルスベクターなどの組換えＡＡＶ血清型ウイルスベクター）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腫瘍溶解性ベクター、またはウイルスベクターを模倣するナノ粒子などの非ウイルスベクターを使用して、細胞に送達され得る。例えば、１つ以上の神経細胞転写因子をコードする核酸（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチドをコードする核酸、及び／またはＡｓｃｌ１ポリペプチドをコードする核酸）を、１つ以上のレトロウイルスベクターを使用して膠細胞（例えば、がん性膠細胞）に送達することができる。例えば、１つ以上の肝臓転写因子をコードする核酸（例えば、ＨＮＦ４Ａポリペプチドをコードする核酸、Ｆｏｘａ２ポリペプチドをコードする核酸、及び／またはＧＡＴＡ４ポリペプチドをコードする核酸）を、１つ以上のレンチウイルスベクターを使用して肝細胞に送達することができる。
【0035】
１つ以上の転写因子をコードする核酸に加えて、ウイルスベクターは、転写因子をコードする核酸に作用可能に連結した調節エレメントを含み得る。このような調節エレメントには、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、シグナルペプチド、内部リボソームエントリー配列、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、または核酸の発現（例えば、転写または翻訳）を調節する誘導エレメントが含まれ得る。ウイルスベクターに含まれ得るエレメント（複数可）の選択は、誘導性、標的指向性、及び所望の発現レベルを含むがこれらに限定されないいくつかの要因に依存する。例えば、プロモーターをウイルスベクターに含めて、転写因子をコードする核酸の転写を促進することができる。プロモーターは、構成的または誘導的であり得（例えば、テトラサイクリンの存在下で）、一般的または組織特異的な様式でポリペプチドをコードする核酸の発現に影響を及ぼし得る。膠細胞（例えば、がん性膠細胞）における神経転写因子の発現を駆動するために使用され得る組織特異的プロモーターの例としては、非限定的に、ＧＦＡＰ、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、ＣＡＧ、ＥＦ１ａ、Ａｌｄｈ１Ｌ１、ＣＭＶ、及びユビキチンプロモーターが挙げられる。肝細胞における肝臓転写因子の発現を駆動するために使用され得る組織特異的プロモーターの例としては、非限定的に、α１－アンチトリプシン、アルブミン、ＡＦＰ、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、及びユビキチンプロモーターが挙げられる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「作用可能に連結した」は、コードされたポリペプチドの発現を可能にするまたは促進するような形での核酸に対するベクター内の調節エレメントの位置決めを指す。例えば、ウイルスベクターは、神経転写因子をコードする核酸に作用可能に連結した神経膠特異的プロモーターを含むことができ、その結果、それが膠細胞（例えば、がん性膠細胞）内の転写を駆動するようになる。例えば、ウイルスベクターは、肝臓転写因子をコードする核酸に作用可能に連結した肝臓特異的プロモーターを含むことができ、その結果、それが肝細胞（例えば、がん性肝細胞）内の転写を駆動するようになる。
【0037】
１つ以上の転写因子をコードする核酸は、非ウイルスベクターを使用して哺乳動物に投与され得る。核酸送達のために非ウイルスベクターを使用する方法は、他に記載されている。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）を参照されたい。例えば、１つ以上の転写因子をコードする核酸は、１つ以上の転写因子をコードする核酸を含む核酸分子（例えば、プラスミド）を直接注入することによって、または脂質、ポリマー、もしくはナノスフェアと複合体形成した核酸分子を投与することによって、哺乳動物に投与することができる。いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集などのゲノム編集技法を使用して、内因性転写因子発現を活性化することができる。
【0038】
転写因子をコードする核酸は、一般的な分子クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、化学核酸合成技法、及びそのような技法の組み合わせを非限定的に含む技法によって産生され得る。例えば、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲは、転写因子をコードする核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーとともに使用することができる。
【0039】
いくつかの場合、１つ以上の転写因子を、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸に加えて、またはその代わりに投与することができる。例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド、Ｎｅｕｒｏｇ２ポリペプチド、及び／またはＡｓｃｌ１ポリペプチドを哺乳動物に投与して、脳内の脳腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞）の、生存哺乳動物の脳内の非がん性神経細胞（例えば、生存哺乳動物の脳に組み込まれ得る機能性神経細胞）への変換（例えば、分化）を誘発することができる。別の例では、ＨＮＦ４Ａポリペプチド、Ｆｏｘａ２ポリペプチド、及び／またはＧＡＴＡ４ポリペプチドを哺乳動物に投与して、肝臓内の肝臓癌細胞の、生存哺乳動物の肝臓内の非がん性肝細胞（例えば、生存哺乳動物の肝臓に組み込まれ得る機能性肝細胞）への変換（例えば、分化）を誘発することができる。
【0040】
本明細書に記載されるように、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、がんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。いくつかの場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸（または配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び／または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を、本明細書に記載されるように、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。例えば、単個のレトロウイルスベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計することができ、その設計されたウイルスベクターを、脳腫瘍を有するヒトに投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0041】
いくつかの場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0042】
いくつかの場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0043】
いくつかの場合、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号３に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、脳腫瘍（例えば、ＧＢＭなどの神経膠腫）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0044】
別の例では、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、哺乳動物の脳腫瘍（例えば、ＧＢＭ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0045】
いくつかの場合、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸（または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び／または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を、本明細書に記載されるように、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。例えば、単個のレンチウイルスベクターは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計することができ、その設計されたウイルスベクターを、肝臓癌を有するヒトに投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0046】
いくつかの場合、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号４に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0047】
いくつかの場合、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号５に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0048】
いくつかの場合、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、アミノ酸配列が１～１０個（例えば、１０個、１～９個、２～９個、１～８個、２～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個）のアミノ酸付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むことを除いて、配列番号６に示されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを使用することができる。いくつかの場合、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％～９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0049】
別の例では、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９．０％）であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するように設計された核酸を設計し、哺乳動物の肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与して、哺乳動物を処置することができる。
【0050】
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号（例えば、配列番号１または配列番号２）によって参照される配列との間の配列同一性パーセントは、以下のように決定することができる。まず、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４及びＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンからのＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して、特定の配列識別番号に示される配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンは、ワールドワイドウェブドット「ｆｒ」ドット「ｃｏｍ／ｂｌａｓｔ」にて、またはワールドワイドウェブドット「ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ」ドット「ｇｏｖ」にてオンラインで入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法についての説明は、ＢＬＡＳＴＺに付属のｒｅａｄｍｅファイルに見出することができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に使用され、一方でＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に使用される。２つの核酸配列を比較するために、オプションを以下のように設定する：－ｉを、比較される第１の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定し、－ｊを、比較される第２の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）を含むファイルに設定し、－ｐをｂｌａｓｔｎに設定し、－ｏを任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定し、－ｑを－１に設定し、－ｒを２に設定し、他のすべてのオプションはそれらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ－ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ－ｐ ｂｌａｓｔｎ－ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ－ｑ－１－ｒ ２．２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションを以下のように設定する：－ｉを、比較される第１のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定し、－ｊを、比較される第２のアミノ配列を含むファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）を含むファイルに設定し、－ｐをｂｌａｓｔｐに設定し、－ｏを任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定し、他のすべてのオプションはそれらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを使用して、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ－ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ－ｐ ｂｌａｓｔｐ－ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ．比較した２つの配列が相同性を共有する場合には、指定された出力ファイルは、それらの相同性領域をアラインメントされた配列として提示する。比較した２つの配列が相同性を共有しない場合には、指定された出力ファイルは、アラインメントされた配列として提示しない。
【0051】
アラインメントされると、一致の数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列において提示される位置の数を計数することによって決定される。配列同一性パーセントは、一致の数を、識別された配列（例えば、配列番号１）に示される配列の長さで除し、続いて、得られた値に１００を乗じることにより決定される。例えば、配列番号１に示される配列とアラインメントしたときに３４０個の一致を有するアミノ酸配列は、配列番号１に示される配列と９５．５パーセント同一である（すなわち、３４０÷３５６×１００＝９５．５０５６）。配列同一性パーセント値は小数第２位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は、７５．１に切り捨てされ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は、７５．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることに留意されたい。
【0052】
本明細書に記載されるように（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、及び／もしくはＡｓｃｌ１などの１つ以上の神経細胞転写因子をコードする核酸、または１つ以上の神経細胞転写因子自体を投与することによって）脳腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞）を、脳腫瘍を有する生存哺乳動物（例えば、ヒト）の脳内の非がん性神経細胞に変換する場合、変換神経細胞は、任意の適当な種類の神経細胞であり得る。いくつかの場合、変換神経細胞は、ＤＡＲＰＰ３２陽性であり得る。いくつかの場合、変換神経細胞は、ＦｏｘＧ１陽性前脳神経細胞であり得る。いくつかの場合、変換神経細胞は、機能性神経細胞であり得る（例えば、機能性シナプスネットワークを有し得る）。例えば、機能性神経細胞は、グルタミン酸作動性神経細胞またはＧＡＢＡ作動性神経細胞であり得る。いくつかの場合、変換神経細胞は、活性な電気生理学的特性を有し得る。いくつかの場合、変換神経細胞は、生存哺乳動物の脳に組み込まれ得る（例えば、線条体から延びる軸索投射を含み得る）。いくつかの場合、変換神経細胞は、（例えば、変換前の脳腫瘍細胞と比較して）がんの進行に関する下方調節されたシグナル伝達経路を呈し得る。
【0053】
本明細書に記載されるように（例えば、１つ以上の肝臓転写因子をコードする核酸（例えば、ＨＮＦ４Ａ、Ｆｏｘａ２、及び／もしくはＧＡＴＡ４をコードする核酸、または１つ以上の肝臓転写因子自体を投与することによって）肝臓癌細胞を、肝臓癌を有する生存哺乳動物（例えば、ヒト）の肝臓内の非がん性肝細胞に変換する場合、変換された肝細胞は、任意の適当な種類の肝細胞であり得る。いくつかの場合、変換された肝細胞は、機能性肝細胞であり得る（例えば、コレステロール、胆汁酸、及び／またはアルブミンなどの１つ以上の肝臓酵素を産生し得る）。いくつかの場合、変換された肝細胞は、生存哺乳動物の肝臓に組み込まれ得る（例えば、生存哺乳動物の肝臓における肝細胞との密接な接合及び／またはアドヘリン接合を形成し得る）。いくつかの場合、変換された肝細胞は、（例えば、変換前の肝臓癌細胞と比較して）増殖が減少し得る。いくつかの場合、増殖の減少は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上であり得る。いくつかの場合、増殖の減少は、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセントであり得る。いくつかの場合、変換された肝細胞は、（例えば、変換前の肝臓癌細胞と比較して）１つ以上の肝臓癌マーカーの発現が減少し得る。いくつかの場合、１つ以上の肝臓癌マーカーの発現の減少は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上であり得る。いくつかの場合、１つ以上の肝臓癌細胞マーカーの発現の減少は、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセントであり得る。肝臓癌マーカーの例としては、非限定的に、ＡＦＰが挙げられる。いくつかの場合、変換された肝細胞は、（例えば、変換前の肝臓癌細胞と比較して）１つ以上の上皮特異的マーカーの発現が増加し得る。いくつかの場合、１つ以上の上皮特異的マーカーの発現の増加は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント、またはそれ以上であり得る。いくつかの場合、１つ以上の上皮特異的マーカーの発現の増加は、１０～１００パーセント、例えば、１０～１５パーセント、１０～２０パーセント、１０～２５パーセント、１５～２０パーセント、１５～２５パーセント、１５～３０パーセント、２０～２５パーセント、２０～３０パーセント、２０～３５パーセント、２５～３０パーセント、２５～３５パーセント、２５～４０パーセント、３０～３５パーセント、３０～４０パーセント、３５～４５パーセント、３５～５０パーセント、４０～４５パーセント、４０～５０パーセント、４０～５５パーセント、４５～５０パーセント、４５～５５パーセント、４５～６０パーセント、５０～５５パーセント、５０～６０パーセント、５０～６５パーセント、５５～６０パーセント、５５～６５パーセント、５５～７０パーセント、６０～６５パーセント、６０～７０パーセント、６０～７５パーセント、６５～７０パーセント、６５～７５パーセント、６５～８０パーセント、７０～７５パーセント、７０～８０パーセント、７０～８５パーセント、７５～８０パーセント、７５～８５パーセント、７５～９０パーセント、８０～８５パーセント、８０～９０パーセント、８０～９５パーセント、８５～９０パーセント、８５～９５パーセント、８５～１００パーセント、９０～９５パーセント、９０～１００パーセント、または９５～１００パーセントであり得る。上皮特異的マーカーの例としては、非限定的に、Ｅ－カドヘリン、クローディン、及びベータ－カテニンが挙げられる。
【0054】
１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）は、がんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）に任意の適当な経路により投与することができる。いくつかの場合、投与は局所投与であり得る。いくつかの場合、投与は全身投与であり得る。投与経路の例としては、非限定的に、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳内、実質内、皮下、経口、鼻腔内、吸入、経皮、非経口、腫瘍内、後尿管、被膜下、膣、及び直腸投与が挙げられる。複数の治療ラウンドが施される場合、第１の治療ラウンドは、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を第１の経路（例えば、静脈内）によって哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含み得、第２の治療ラウンドは、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を第２の経路（例えば、腫瘍内）によって哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含み得る。
【0055】
いくつかの場合、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を、哺乳動物（例えば、がんを有するか、またはがんを有するリスクがある哺乳動物）に投与するための組成物（例えば、薬学的組成物）に製剤化することができる。例えば、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）は、がんを有する哺乳動物に投与するための薬学的に許容される組成物に製剤化することができる。いくつかの場合、１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／または希釈剤と一緒に製剤化され得る。薬学的組成物は、滅菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、ウエハー、及び顆粒剤を非限定的に含む、固体または液体形態での投与のために製剤化され得る。本明細書に記載の医薬組成物に使用されてもよい薬学的に許容される担体、充填剤、及びビヒクルとしては、非限定的に、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸、水、塩、または電解質の部分グリセリド混合物、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が挙げられる。
【0056】
いくつかの場合、本明細書に記載の方法には、哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に、がんを処置するために使用される１つ以上の追加の薬剤を投与することが含まれ得る。がんを処置するために使用される１つ以上の追加の薬剤には、任意の適当ながん治療が含まれ得る。いくつかの場合、がん治療には、手術及び／または放射線療法が含まれ得る。いくつかの場合、がん治療には、化学療法、ホルモン療法、標的療法、及び／または細胞傷害療法などの薬物療法の投与が含まれ得る。例えば、がんを有する哺乳動物に、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を投与し、がんの治療に使用される１つ以上の追加の薬剤を投与することができる。がんを有する哺乳動物が、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）で治療され、がんを処置するために使用される１つ以上の追加の薬剤で治療される場合、がんを処置するために使用される追加の薬剤は、同時に投与することも独立して投与することもできる。例えば、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）と、がんを処置するために使用される１つ以上の追加の薬剤とを一緒に製剤化して、単一の組成物を形成することができる。いくつかの場合、本明細書に記載の１つ以上の転写因子を発現するように設計された核酸（または１つ以上の転写因子自体）を最初に投与し、がんを処置するために使用される１つ以上の追加の薬剤を第２に投与することができ、またその逆も同様である。
【0057】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明し、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0058】
実施例１：ヒト膠芽腫細胞を神経細胞に変換する
ＧＢＭは、中枢神経系（ＣＮＳ）において最も一般的かつ侵襲的な成人原発性がんである。現在の標準的なＧＢＭ療法は、手術、続いて放射線療法または化学療法であるが、ＧＢＭの異質性及び高度に侵襲的な性質に起因して、治療の進歩はわずかである。
ＧＢＭは、中枢神経系（ＣＮＳ）において最も一般的かつ侵襲的な成人原発性がんである。現在の標準的なＧＢＭ療法は、手術、続いて放射線療法または化学療法であるが、ＧＢＭの異質性及び高度に侵襲的な性質に起因して、治療の進歩はわずかである。
【0059】
本実施例では、悪性ＧＢＭ細胞の非増殖性神経細胞への転写因子リプログラミング（例えば、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／またはＡｓｃｌ１リプログラミング）をとおしてＧＢＭを処置するための代替的アプローチが提供される。
【0060】
細胞培養
ヒトＧＢＭ細胞株を、Ｓｉｇｍａ（Ｕ２５１）またはＡＴＣＣ（Ｕ１１８）から購入した。Ｕ２５１細胞を、ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ＧＩＢＣＯ）、及び１倍ＧｌｕｔＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）を含むＧＢＭ培地で培養した。Ｕ１１８細胞を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地で培養した。
ヒトＧＢＭ細胞株を、Ｓｉｇｍａ（Ｕ２５１）またはＡＴＣＣ（Ｕ１１８）から購入した。Ｕ２５１細胞を、ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ＧＩＢＣＯ）、及び１倍ＧｌｕｔＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）を含むＧＢＭ培地で培養した。Ｕ１１８細胞を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地で培養した。
【0061】
ヒト星状膠細胞をＳｃｉｅｎＣｅｌｌ（ＨＡ１８００、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から購入した。ヒト星状膠細胞を、Ｂ２７（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２（ＧＩＢＣＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）、及び１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＦＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、１０％ ＦＢＳ、３．５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）、及び０．２％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むヒト星状膠細胞培地で培養した。
【0062】
継代培養については、細胞を０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）またはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってトリプシン化し、５分間８００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させ、分割比が約１：４の対応する培地にプレーティングした。細胞を、５％ＣＯ２で加湿した空気中、３７℃で維持した。
【0063】
ヒトＧＢＭ細胞の神経細胞へのリプログラミング
Ｕ２５１細胞を、カバースリップあたり１０，０００細胞の密度で、ウイルス感染の少なくとも１２時間前に、２４ウェルプレート中のポリ－Ｄ－リジンをコーティングしたカバースリップに播種した。ＧＦＰ、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１レトロウイルスを、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒にＧＢＭ細胞に加えた。神経細胞の分化及び成熟を助けるため、培地を翌日には完全に神経細胞分化培地（ＮＤＭ）に置き換えた。ＮＤＭには、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、０．４％Ｂ２７補充物（ＧＩＢＣＯ）、０．８％Ｎ２補充物（ＧＩＢＣＯ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５％ＦＢＳ、ビタミンＣ（５μｇ／ｍＬ、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｙ２７６３２（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＮＴ３（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれた。細胞を、５％ＣＯ２で加湿した空気中、３７℃で維持した。
Ｕ２５１細胞を、カバースリップあたり１０，０００細胞の密度で、ウイルス感染の少なくとも１２時間前に、２４ウェルプレート中のポリ－Ｄ－リジンをコーティングしたカバースリップに播種した。ＧＦＰ、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１レトロウイルスを、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒にＧＢＭ細胞に加えた。神経細胞の分化及び成熟を助けるため、培地を翌日には完全に神経細胞分化培地（ＮＤＭ）に置き換えた。ＮＤＭには、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、０．４％Ｂ２７補充物（ＧＩＢＣＯ）、０．８％Ｎ２補充物（ＧＩＢＣＯ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５％ＦＢＳ、ビタミンＣ（５μｇ／ｍＬ、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｙ２７６３２（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＮＴ３（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれた。細胞を、５％ＣＯ２で加湿した空気中、３７℃で維持した。
【0064】
小分子によるヒト膠芽腫細胞の処理
Ｕ２５１細胞を、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたはＧＦＰのみを発現するレトロウイルスに感染させ、翌日、培養培地を、小分子を有する神経細胞分化培地（ＮＤＭ）、または対照用の０．２２％ＤＭＳＯで完全に置き換えた。感染させた膠芽腫細胞を、５μＭのＤＡＰＴ、１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５μＭのＳＢ４３１５４２、０．２５μＭのＬＤＮ１９３１８９、１μＭのＳＡＧ、及び１μＭのプルモルファミンで処理した。小分子含有培地を３～４日ごとにリフレッシュした。細胞を、まず小分子で１２日間処理し、次いで、免疫染色の前に、所望の期間、ＮＤＭに変更した。
Ｕ２５１細胞を、Ｎｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたはＧＦＰのみを発現するレトロウイルスに感染させ、翌日、培養培地を、小分子を有する神経細胞分化培地（ＮＤＭ）、または対照用の０．２２％ＤＭＳＯで完全に置き換えた。感染させた膠芽腫細胞を、５μＭのＤＡＰＴ、１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５μＭのＳＢ４３１５４２、０．２５μＭのＬＤＮ１９３１８９、１μＭのＳＡＧ、及び１μＭのプルモルファミンで処理した。小分子含有培地を３～４日ごとにリフレッシュした。細胞を、まず小分子で１２日間処理し、次いで、免疫染色の前に、所望の期間、ＮＤＭに変更した。
【0065】
ヒト膠芽腫細胞のインビボ神経細胞変換
ヒト膠芽腫細胞のインビボ神経細胞変換を、Ｒａｇ１ ＫＯ免疫不全マウス（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００２２１６）を使用して実施した。５０万（５×１０５）個のＵ２５１ヒト膠芽腫細胞を、定位固定装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用してＲａｇ１ ＫＯマウス脳の線条体に移植した。力価が同様のＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたはＧＦＰのみを発現するレトロウイルスを、同時に及び同じ位置で頭蓋内注入した。マウスの脳を採取し、注射の１、２、４、及び８週間後にスライスした。脳スライス切片の免疫染色は、培養細胞と同じであった。
ヒト膠芽腫細胞のインビボ神経細胞変換を、Ｒａｇ１ ＫＯ免疫不全マウス（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００２２１６）を使用して実施した。５０万（５×１０５）個のＵ２５１ヒト膠芽腫細胞を、定位固定装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用してＲａｇ１ ＫＯマウス脳の線条体に移植した。力価が同様のＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたはＧＦＰのみを発現するレトロウイルスを、同時に及び同じ位置で頭蓋内注入した。マウスの脳を採取し、注射の１、２、４、及び８週間後にスライスした。脳スライス切片の免疫染色は、培養細胞と同じであった。
【0066】
データ及び統計分析
細胞計数及び蛍光強度を、ランダムに選択した写真のランダムに選択したフィールドを用いて単盲検法で行い、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析した。データを平均±ＳＥＭとして表す。二元配置分散分析、続いてダネット検定を用いて、複数群の比較を行った。スチューデントｔ検定を用いて２つの群比較を行った。
細胞計数及び蛍光強度を、ランダムに選択した写真のランダムに選択したフィールドを用いて単盲検法で行い、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析した。データを平均±ＳＥＭとして表す。二元配置分散分析、続いてダネット検定を用いて、複数群の比較を行った。スチューデントｔ検定を用いて２つの群比較を行った。
【0067】
単一の神経細胞転写因子Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１によるヒトＧＢＭ細胞の効率的な神経細胞変換
この試験では、２つの異なるヒトＧＢＭ細胞株（Ｕ２５１、Ｓｉｇｍａ；Ｕ１１８、ＡＴＣＣ）を使用した（図１）。神経細胞転写因子がヒト悪性膠芽腫細胞を神経細胞に変換できるかどうかを決定するために、転写因子であるＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、及びＡｓｃｌ１を試験した。ＡＡＶが高い効率で培養膠細胞または膠芽腫細胞に感染しないことを考慮して、レトロウイルスを使用して、Ｎｅｕｒｏｇ２（ＣＡＧ：：Ｎｅｕｒｏｇ２－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、ＮｅｕｒｏＤ１（ＣＡＧ：：ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、またはＡｓｃｌ１（ＣＡＧ：：Ａｓｃｌ１－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）を過剰発現させ、増殖が速い膠芽腫細胞における高い感染効率を得た。ウイルスで１２時間インキュベーションした後、膠芽腫培養培地を神経細胞分化培地に変更し、神経細胞の成熟を助けた。Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）（図２Ａ）及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）（図２Ｂ）によって確認した。形質導入の数日後、Ｕ２５１膠芽腫細胞は、神経細胞転写因子を発現した後に神経形態をとり始めた（図２Ａ）が、ＧＦＰのみを発現する対照細胞はとらなかった（図２Ａ、上段）。一連の汎神経細胞マーカーを、ヒト膠芽腫細胞からの神経細胞変換の可能性について調べた。未成熟神経細胞ＤＣＸ及びＴｕｊ１を、ウイルス感染の６日後に早くも検出した（図３Ａ～Ｃ）。感染の３０日後までに、成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２及びＮｅｕＮの両方を検出した（図４Ｂ）。変換効率は、３つすべて因子、特にＮｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１について高かった（図４Ａ、定量化は図４Ｃ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９８．２％±０．３％、ＮｅｕｒｏＤ１、８８．７％±５．２％、Ａｓｃｌ１、２４．６％±４．０％、ＤＣＸ＋神経細胞／感染から２０日後の全感染細胞；図４Ｂ、定量化は図４Ｄ：Ｎｅｒｕｏｇ２、９３．２％±１．２％、ＮｅｕｒｏＤ１、９１．２％±１．１％、Ａｓｃｌ１、６２．１％±５．９％、ＭＡＰ２＋神経細胞／感染から３０日後の合計感染細胞）。神経細胞変換をＲＴ－ｑＰＣＲによっても確認し、このＲＴ－ｑＰＣＲでは、ＤＣＸの転写活性化を、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現後に検出した（図４Ｅ）。神経細胞変換がＵ２５１細胞に限定されるかどうかを試験するために、別のヒトＧＢＭ細胞株Ｕ１１８を同様のプロトコルに従って調べた。変換効率は低かったものの、神経細胞変換が、神経細胞転写因子と小分子（例えば、ＤＡＰＴ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ４３１５４２、及びＬＤＮ１９３１８９）との組み合わせを介してＵ１１８細胞において達成され得ることを見出した（図５Ａ～Ｄ）。１２日間の小分子処理によるＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰウイルス感染から１８日後に、いくつかのＵ１１８細胞が神経細胞マーカーであるＤＣＸの発現を始めた（図５Ｄ）。しかしながら、小分子処理のみまたはＮｅｕｒｏｇ２のみでは、Ｕ１１８細胞は神経細胞様細胞に変換されなかった（図５Ｂ及び５Ｃ）。
この試験では、２つの異なるヒトＧＢＭ細胞株（Ｕ２５１、Ｓｉｇｍａ；Ｕ１１８、ＡＴＣＣ）を使用した（図１）。神経細胞転写因子がヒト悪性膠芽腫細胞を神経細胞に変換できるかどうかを決定するために、転写因子であるＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、及びＡｓｃｌ１を試験した。ＡＡＶが高い効率で培養膠細胞または膠芽腫細胞に感染しないことを考慮して、レトロウイルスを使用して、Ｎｅｕｒｏｇ２（ＣＡＧ：：Ｎｅｕｒｏｇ２－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、ＮｅｕｒｏＤ１（ＣＡＧ：：ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）、またはＡｓｃｌ１（ＣＡＧ：：Ａｓｃｌ１－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰ）を過剰発現させ、増殖が速い膠芽腫細胞における高い感染効率を得た。ウイルスで１２時間インキュベーションした後、膠芽腫培養培地を神経細胞分化培地に変更し、神経細胞の成熟を助けた。Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）（図２Ａ）及びリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）（図２Ｂ）によって確認した。形質導入の数日後、Ｕ２５１膠芽腫細胞は、神経細胞転写因子を発現した後に神経形態をとり始めた（図２Ａ）が、ＧＦＰのみを発現する対照細胞はとらなかった（図２Ａ、上段）。一連の汎神経細胞マーカーを、ヒト膠芽腫細胞からの神経細胞変換の可能性について調べた。未成熟神経細胞ＤＣＸ及びＴｕｊ１を、ウイルス感染の６日後に早くも検出した（図３Ａ～Ｃ）。感染の３０日後までに、成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２及びＮｅｕＮの両方を検出した（図４Ｂ）。変換効率は、３つすべて因子、特にＮｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１について高かった（図４Ａ、定量化は図４Ｃ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９８．２％±０．３％、ＮｅｕｒｏＤ１、８８．７％±５．２％、Ａｓｃｌ１、２４．６％±４．０％、ＤＣＸ＋神経細胞／感染から２０日後の全感染細胞；図４Ｂ、定量化は図４Ｄ：Ｎｅｒｕｏｇ２、９３．２％±１．２％、ＮｅｕｒｏＤ１、９１．２％±１．１％、Ａｓｃｌ１、６２．１％±５．９％、ＭＡＰ２＋神経細胞／感染から３０日後の合計感染細胞）。神経細胞変換をＲＴ－ｑＰＣＲによっても確認し、このＲＴ－ｑＰＣＲでは、ＤＣＸの転写活性化を、Ｎｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１の過剰発現後に検出した（図４Ｅ）。神経細胞変換がＵ２５１細胞に限定されるかどうかを試験するために、別のヒトＧＢＭ細胞株Ｕ１１８を同様のプロトコルに従って調べた。変換効率は低かったものの、神経細胞変換が、神経細胞転写因子と小分子（例えば、ＤＡＰＴ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ４３１５４２、及びＬＤＮ１９３１８９）との組み合わせを介してＵ１１８細胞において達成され得ることを見出した（図５Ａ～Ｄ）。１２日間の小分子処理によるＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰウイルス感染から１８日後に、いくつかのＵ１１８細胞が神経細胞マーカーであるＤＣＸの発現を始めた（図５Ｄ）。しかしながら、小分子処理のみまたはＮｅｕｒｏｇ２のみでは、Ｕ１１８細胞は神経細胞様細胞に変換されなかった（図５Ｂ及び５Ｃ）。
【0068】
ヒト膠芽腫細胞からの変換神経細胞の特性評価
異なる脳領域で発現された神経細胞マーカーを有するＵ２５１ヒト膠芽腫細胞から変換された神経細胞を特性評価した。変換された細胞の大部分が、海馬顆粒神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（図６Ａ；定量化は図６Ｅ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９０．４％±１．９％；ＮｅｕｒｏＤ１、８９．９％±１．２％；Ａｓｃｌ１、８３．０％±１．４％；Ｐｒｏｘ１＋／ＤＣＸ＋細胞）、及び前脳マーカーであるＦｏｘＧ１（図６Ｂ；定量化は図６Ｆ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９９．２％±０．８％；ＮｅｕｒｏＤ１、８７．９％±４．８％；Ａｓｃｌ１、８１．３％±３．６％；ＦｏｘＧ１＋／ＭＡＰ２＋細胞）について免疫陽性であったことを見出した。ＧＢＭ細胞から変換された少数の神経細胞が皮質神経細胞マーカーであるＣｔｉｐ２またはＴｂｒ１を発現した（図７Ａ及び７Ｂ）。これらの結果により、ヒト膠芽腫細胞の内在性インプリンティングが星状膠細胞とは異なり得、細胞変換の結果に影響を及ぼし得るあることが示唆される。ヒト星状膠細胞から変換された神経細胞（ＨＡ１８００、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて、対照比較を行った。ヒト星状膠細胞からのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１変換神経細胞の大部分は、ＦｏｘＧ１及びＰｒｏｘ１について陽性であり、相当な割合がＣｔｉｐ２について免疫陽性であった（図８Ａ及び８Ｂ）。したがって、ＧＢＭ細胞から変換された神経細胞は、星状膠細胞から変換された神経細胞といくつかの共通の特性を共有したが、特定の神経細胞サブタイプにおいて異なった。
異なる脳領域で発現された神経細胞マーカーを有するＵ２５１ヒト膠芽腫細胞から変換された神経細胞を特性評価した。変換された細胞の大部分が、海馬顆粒神経細胞マーカーであるＰｒｏｘ１（図６Ａ；定量化は図６Ｅ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９０．４％±１．９％；ＮｅｕｒｏＤ１、８９．９％±１．２％；Ａｓｃｌ１、８３．０％±１．４％；Ｐｒｏｘ１＋／ＤＣＸ＋細胞）、及び前脳マーカーであるＦｏｘＧ１（図６Ｂ；定量化は図６Ｆ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９９．２％±０．８％；ＮｅｕｒｏＤ１、８７．９％±４．８％；Ａｓｃｌ１、８１．３％±３．６％；ＦｏｘＧ１＋／ＭＡＰ２＋細胞）について免疫陽性であったことを見出した。ＧＢＭ細胞から変換された少数の神経細胞が皮質神経細胞マーカーであるＣｔｉｐ２またはＴｂｒ１を発現した（図７Ａ及び７Ｂ）。これらの結果により、ヒト膠芽腫細胞の内在性インプリンティングが星状膠細胞とは異なり得、細胞変換の結果に影響を及ぼし得るあることが示唆される。ヒト星状膠細胞から変換された神経細胞（ＨＡ１８００、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて、対照比較を行った。ヒト星状膠細胞からのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１変換神経細胞の大部分は、ＦｏｘＧ１及びＰｒｏｘ１について陽性であり、相当な割合がＣｔｉｐ２について免疫陽性であった（図８Ａ及び８Ｂ）。したがって、ＧＢＭ細胞から変換された神経細胞は、星状膠細胞から変換された神経細胞といくつかの共通の特性を共有したが、特定の神経細胞サブタイプにおいて異なった。
【0069】
次に、変換神経細胞サブタイプを、放出された神経伝達物質、特に、それぞれ脳内の主要な興奮性及び抑制性神経細胞であるグルタミン酸作動性及びＧＡＢＡ作動性神経細胞に従って特性評価した。大部分のＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＡｓｃｌ１変換細胞は、グルタミン酸作動性神経細胞マーカーであるＶＧｌｕＴ１について免疫陽性であった（図６Ｃ；定量は図６Ｇ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９２．８％±０．７％；ＮｅｕｒＤ１、８６．９％±２．７％；Ａｓｃｌ１、８０．６％±２．１％；ＶＧｌｕＴ１＋／ＤＣＸ＋細胞）。Ｎｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１変換細胞の大部分は、ＧＡＢＡについて免疫陰性であった（図６Ｄ；定量化は図６Ｈ：Ｎｅｕｒｏｇ２、１１．１％±３．８％；ＮｅｕｒｏＤ１、８．６％±２．５％；ＧＡＢＡ＋／ＤＣＸ＋細胞）。Ａｓｃｌ１変換細胞のおよそ半分は、ＧＡＢＡ陽性神経細胞であり（図６Ｄ；定量化は図６Ｈ：Ａｓｃｌ１、４９．３％±６．４％、ＧＡＢＡ＋／ＤＣＸ＋細胞）、異なる神経細胞変換因子間の差異を反映していた。
【0070】
要約すると、Ｕ２５１ ＧＢＭ細胞からのＮｅｕｒｏｇ２、ＮｅｕｒｏＤ１、またはＡｓｃｌ１変換神経細胞の大部分は、前脳グルタミン酸作動性神経細胞であったが、Ａｓｃｌ１は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞生成の傾向を呈した。これらの結果により、内在ＧＢＭ細胞系統及び異所的に発現された転写因子が、変換神経細胞サブタイプに有意な影響を及ぼすことが示唆される。
【0071】
Ｎｅｕｒｏｇ２の過剰発現によって誘導される膠芽腫細胞から神経細胞への結果の運命の変化
Ｎｅｕｒｏｇ２に誘導された変換プロセスを調査した。星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰ及び上皮間葉移行（ＥＭＴ）マーカーであるビメンチンは、いずれもヒトＵ２５１細胞中で高度に発現された。２０日にわたるＮｅｕｒｏｇ２の過剰発現後、ＧＦＡＰ及びビメンチンの両方が、対照と比較して下方調節された（図９Ａ）。これにより、膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化がさらに確認された。加えて、Ｎｅｕｒｏｇ２過剰発現を伴うＵ２５１膠芽腫細胞において、ギャップ接合マーカーであるコネキシン４３が下方調節され（図９Ｂ；コネキシン４３強度の定量化は図９Ｃ：Ｎｅｕｒｏｇ２、１９．４±０．７ａ．ｕ．；ＧＦＰ対照、１１．６±０．８ａ．ｕ．；感染から２０日後）、神経細胞のギャップ接合部は膠細胞と比較して少ないという事実と一致する。典型的な軸索成長円錐構造は、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞のうちのいくつかに見出され（図９Ｄ）、線維状アクチン（Ｆ－アクチン）プローブファロイジン及び成長円錐マーカーＧＡＰ４３によって標識された指状糸状仮足を有する（図９Ｄ）。
Ｎｅｕｒｏｇ２に誘導された変換プロセスを調査した。星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰ及び上皮間葉移行（ＥＭＴ）マーカーであるビメンチンは、いずれもヒトＵ２５１細胞中で高度に発現された。２０日にわたるＮｅｕｒｏｇ２の過剰発現後、ＧＦＡＰ及びビメンチンの両方が、対照と比較して下方調節された（図９Ａ）。これにより、膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化がさらに確認された。加えて、Ｎｅｕｒｏｇ２過剰発現を伴うＵ２５１膠芽腫細胞において、ギャップ接合マーカーであるコネキシン４３が下方調節され（図９Ｂ；コネキシン４３強度の定量化は図９Ｃ：Ｎｅｕｒｏｇ２、１９．４±０．７ａ．ｕ．；ＧＦＰ対照、１１．６±０．８ａ．ｕ．；感染から２０日後）、神経細胞のギャップ接合部は膠細胞と比較して少ないという事実と一致する。典型的な軸索成長円錐構造は、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞のうちのいくつかに見出され（図９Ｄ）、線維状アクチン（Ｆ－アクチン）プローブファロイジン及び成長円錐マーカーＧＡＰ４３によって標識された指状糸状仮足を有する（図９Ｄ）。
【0072】
Ｕ２５１膠芽腫細胞のＮｅｕｒｏｇ２誘導性神経細胞変換中の細胞内変化を調査した。ミトコンドリア及びゴルジ装置は、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ標識アッセイ（図１０Ｅ～Ｆ）及びゴルジ装置マーカーＧＭ１３０免疫染色（図１０Ｇ～Ｈ）によって示される対照ＧＢＭ細胞に対して、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞において明確な分布パターンを呈した。ミトコンドリアは、エネルギー需要の高い領域に位置することが知られている。対照Ｕ２５１細胞では、ミトコンドリアは、明らかな分極なく細胞質内に分布した。Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞では、ミトコンドリアは、体細胞と神経突起との両方で見出され、体細胞では分極分布パターンを有した（図１０Ｅ）。加えて、変換神経細胞におけるミトコンドリアの平均強度は、感染から３０日後に対照と比較して増加し、これは、構造的活性変化と代謝活性変化との両方を反映している可能性がある（図１０Ｆ）。ゴルジ装置の分布は、Ｎｅｕｒｏｇ２変換神経細胞と対照ＧＢＭ細胞との間でも明確であった（図１０Ｇ）。ゴルジ装置の面積は、対照と比較して、Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞においてはるかに小さく（図１０Ｈ）、神経細胞変換プロセス中のタンパク質輸送の変化の可能性が示唆された。一方で、自己貪食活性（自己貪食調節因子ＡＴＧ５の免疫染色によって示される）は、Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞と対照細胞とで同等であることが見出され（図１１Ａ～Ｃ）、タンパク質分解が変換プロセスによって有意に影響を受けなかったことが示唆された。
【0073】
すべての点で、変換神経細胞と対照膠芽腫細胞との間の明確な細胞及び細胞下パターンにより、ヒト膠芽腫細胞から神経細胞への運命の変化がさらに実証された。
【0074】
ヒト膠芽腫細胞変換神経細胞の機能分析
シナプスを形成するＮｅｕｒｏｇ２変換細胞の能力を、シナプス小胞マーカーＳＶ２のための免疫染色を行うことで調査した。感染から３０日後、ヒトＧＢＭ細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞内のＭＡＰ２で標識した樹状突起に沿って集中シナプス点を検出した（図１２Ａ）。パッチクランプ記録により、感染から３０日後に、変換細胞中で顕著なナトリウム及びカリウム電流が示された（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞の大部分は、単一の活動電位を発射し（２３個中１４個）、変換神経細胞のサブセット（２３個中８個）は、複数の活動電位を発射した（図１２Ｄ及び１２Ｅ）。しかしながら、感染から３０日後では、Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞に自発的なシナプス事象は記録されておらず、変換神経細胞がまだ未成熟であるか、またはおそらく周囲の神経膠腫細胞がシナプス放出に阻害効果を発揮し得ることが示唆された。要約すると、これらの結果により、ヒトＧＢＭ細胞が、神経細胞転写因子によって部分的に機能性の神経細胞様細胞にリプログラミングされ得ることが示される。
シナプスを形成するＮｅｕｒｏｇ２変換細胞の能力を、シナプス小胞マーカーＳＶ２のための免疫染色を行うことで調査した。感染から３０日後、ヒトＧＢＭ細胞由来のＮｅｕｒｏｇ２変換神経細胞内のＭＡＰ２で標識した樹状突起に沿って集中シナプス点を検出した（図１２Ａ）。パッチクランプ記録により、感染から３０日後に、変換細胞中で顕著なナトリウム及びカリウム電流が示された（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞の大部分は、単一の活動電位を発射し（２３個中１４個）、変換神経細胞のサブセット（２３個中８個）は、複数の活動電位を発射した（図１２Ｄ及び１２Ｅ）。しかしながら、感染から３０日後では、Ｎｅｕｒｏｇ２変換細胞に自発的なシナプス事象は記録されておらず、変換神経細胞がまだ未成熟であるか、またはおそらく周囲の神経膠腫細胞がシナプス放出に阻害効果を発揮し得ることが示唆された。要約すると、これらの結果により、ヒトＧＢＭ細胞が、神経細胞転写因子によって部分的に機能性の神経細胞様細胞にリプログラミングされ得ることが示される。
【0075】
神経細胞転写因子はＧＢＭ細胞増殖を阻害する
神経細胞は末端分化した非増殖細胞である。したがって、神経細胞の分化転換は、がん細胞の増殖を制御するための有望な戦略であり得る。細胞増殖を変換の初期段階で調べた。Ｕ２５１細胞を１０ｍＭのＢｒｄＵとともに２４時間インキュベートして、増殖細胞を、ウイルス感染から７日後、固定及び染色の前にトレースした（図１０Ａ）。ＢｒｄＵ陽性細胞のパーセンテージの定量化により、Ｎｅｕｒｏｇ２感染細胞及びＮｅｕｒｏＤ１感染細胞の増殖がＧＦＰ対照と比較して有意に減少したことが示された（図１０Ｂ：ＧＦＰ、６４．８％±４．１％；Ｎｅｕｒｏｇ２、１１．９％±２．９％；ＮｅｕｒｏＤ１、２４．５％±２．４％）。Ａｓｃｌ１変換細胞の増殖は、感染から７日後に活性を維持し（図１０Ａ；定量化は図１０Ｂ：Ａｓｃｌ１、５４．６％±１．２％）、これはおそらくＧＢＭ細胞中のＡｓｃｌ１の作用が遅いことに起因する（図４Ａ～Ｄ、３Ａ～Ｃ）。ＧＢＭ細胞の増殖速度は、Ｎｅｕｒｏｇ２またはＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現とともに顕著に低下し、これはＧＢＭ細胞に感染した後のＮｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１による速い変換速度と一致した。これらの結果により、神経細胞変換に加えて、神経細胞転写因子の異所的発現も、ＧＢＭの特徴であり、かつＧＢＭ治療の主要な標的であるＧＢＭ細胞増殖を制御するための有望な方法であり得ることが示唆される。
神経細胞は末端分化した非増殖細胞である。したがって、神経細胞の分化転換は、がん細胞の増殖を制御するための有望な戦略であり得る。細胞増殖を変換の初期段階で調べた。Ｕ２５１細胞を１０ｍＭのＢｒｄＵとともに２４時間インキュベートして、増殖細胞を、ウイルス感染から７日後、固定及び染色の前にトレースした（図１０Ａ）。ＢｒｄＵ陽性細胞のパーセンテージの定量化により、Ｎｅｕｒｏｇ２感染細胞及びＮｅｕｒｏＤ１感染細胞の増殖がＧＦＰ対照と比較して有意に減少したことが示された（図１０Ｂ：ＧＦＰ、６４．８％±４．１％；Ｎｅｕｒｏｇ２、１１．９％±２．９％；ＮｅｕｒｏＤ１、２４．５％±２．４％）。Ａｓｃｌ１変換細胞の増殖は、感染から７日後に活性を維持し（図１０Ａ；定量化は図１０Ｂ：Ａｓｃｌ１、５４．６％±１．２％）、これはおそらくＧＢＭ細胞中のＡｓｃｌ１の作用が遅いことに起因する（図４Ａ～Ｄ、３Ａ～Ｃ）。ＧＢＭ細胞の増殖速度は、Ｎｅｕｒｏｇ２またはＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現とともに顕著に低下し、これはＧＢＭ細胞に感染した後のＮｅｕｒｏｇ２及びＮｅｕｒｏＤ１による速い変換速度と一致した。これらの結果により、神経細胞変換に加えて、神経細胞転写因子の異所的発現も、ＧＢＭの特徴であり、かつＧＢＭ治療の主要な標的であるＧＢＭ細胞増殖を制御するための有望な方法であり得ることが示唆される。
【0076】
神経細胞変換が、膠芽腫の進行に関連するシグナル伝達経路またはバイオマーカーのいずれかの変化を引き起こすかどうかも試験した。ウエスタンブロット分析下で、総ＧＳＫ３βの発現レベルが、対照Ｕ２５１細胞と比較して、Ｎｅｕｒｏｇ２ウイルス感染から２０日後に上方調節されたことが見出された（図１０Ｃ；定量化したＧＳＫ３β強度倍率変化は図１０Ｄ：Ｎｅｕｒｏｇ２、３．０±０．５）。これを、免疫染色分析を使用してさらに確認した（図１０Ｅ～Ｆ）。これらの結果により、ＧＳＫ３βがＵ２５１膠芽腫細胞の神経細胞変換に関与していることが実証される。Ｎｅｕｒｏｇ２感染Ｕ２５１ ＧＢＭ細胞をＧＳＫ３β拮抗剤ＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ）またはＴＷＳ１１９（１０μＭ）で処理し、ＧＳＫ３βの阻害によりＵ２５１細胞の神経細胞変換効率が低下したことを見出した（図１３Ａ～Ｃ）。加えて、２つの神経膠腫マーカーＥＧＦＲ及びＩＬ１３Ｒａ２ ３９－４５は、Ｎｅｕｒｏｇ２感染から２０日後の神経細胞変換の後に安定した発現を有することが見出され（図１４Ａ～Ｄ）、少なくとも変換後のある期間、ＧＢＭ細胞変換神経細胞が、依然として、がん細胞のある特定のインプリントを保有し得ることが示唆された。
【0077】
異種移植マウスモデルを使用したヒト膠芽腫細胞のインビボ神経細胞変換
インビトロ細胞培養結果が脳内部のインビボ環境にも適用されることを確認するために、ヒト膠芽腫細胞の変換能力をインビボでマウス脳において試験した。免疫拒絶からの合併症を軽減するために、ヒトＵ２５１ ＧＢＭ細胞（５×１０５個のＵ２５１細胞）をＲａｇ１－／－免疫不全マウスの両側の線条体に頭蓋内移植した（図１５Ａ）。同体積（２μＬ）及び力価（２×１０５個のｐｆｕ／ｍＬ）を有するＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたは対照ＧＦＰレトロウイルスを、移植したＧＢＭ細胞と一緒に線条体の各側に注入した。移植したＵ２５１ヒトＧＢＭ細胞を、ビメンチン（図１５Ａ）またはヒト核染色（図１５Ｄ）によって識別した。移植したヒト膠芽腫細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２の過剰発現（図１５Ａ）により、未成熟神経細胞マーカーＤＣＸによって示される、効率的な神経細胞変換が生じた（図１５Ａ～Ｃ、定量化は１５Ｂ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９２．８％±１．２％、ＤＣＸ＋神経細胞／移植後３週目の全感染細胞）。Ｔｕｊ１及びＰｒｏｘ１などの他の神経細胞マーカーも、移植から１か月後のＮｅｕｒｏｇ２変換細胞で検出された（図１５Ｄ及び１５Ｅ）。インビトロでの変換の結果と一致して、移植した神経膠腫細胞の増殖速度は、ＧＦＰ対照と比較してＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰウイルス感染を有するもので有意に低下した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。ＧＢＭ細胞を移植した脳領域では多くのＬＣＮ２陽性反応性星状膠細胞が観察されたが、反応性星状膠細胞の数は、Ｎｅｕｒｏｇ２過剰発現のある移植部位では対照側と比較して有意に減少した（図１６Ｃ～Ｅ）。加えて、血管または常在ミクログリア分布などの他の可能性のある局所環境因子もこのインビボモデルで調べた。いずれも、Ｎｅｕｒｏｇ２誘導性神経細胞変換による影響を有意には受けなかったことを見出した（図１７Ａ～Ｄ）。
インビトロ細胞培養結果が脳内部のインビボ環境にも適用されることを確認するために、ヒト膠芽腫細胞の変換能力をインビボでマウス脳において試験した。免疫拒絶からの合併症を軽減するために、ヒトＵ２５１ ＧＢＭ細胞（５×１０５個のＵ２５１細胞）をＲａｇ１－／－免疫不全マウスの両側の線条体に頭蓋内移植した（図１５Ａ）。同体積（２μＬ）及び力価（２×１０５個のｐｆｕ／ｍＬ）を有するＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰまたは対照ＧＦＰレトロウイルスを、移植したＧＢＭ細胞と一緒に線条体の各側に注入した。移植したＵ２５１ヒトＧＢＭ細胞を、ビメンチン（図１５Ａ）またはヒト核染色（図１５Ｄ）によって識別した。移植したヒト膠芽腫細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２の過剰発現（図１５Ａ）により、未成熟神経細胞マーカーＤＣＸによって示される、効率的な神経細胞変換が生じた（図１５Ａ～Ｃ、定量化は１５Ｂ：Ｎｅｕｒｏｇ２、９２．８％±１．２％、ＤＣＸ＋神経細胞／移植後３週目の全感染細胞）。Ｔｕｊ１及びＰｒｏｘ１などの他の神経細胞マーカーも、移植から１か月後のＮｅｕｒｏｇ２変換細胞で検出された（図１５Ｄ及び１５Ｅ）。インビトロでの変換の結果と一致して、移植した神経膠腫細胞の増殖速度は、ＧＦＰ対照と比較してＮｅｕｒｏｇ２－ＧＦＰウイルス感染を有するもので有意に低下した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。ＧＢＭ細胞を移植した脳領域では多くのＬＣＮ２陽性反応性星状膠細胞が観察されたが、反応性星状膠細胞の数は、Ｎｅｕｒｏｇ２過剰発現のある移植部位では対照側と比較して有意に減少した（図１６Ｃ～Ｅ）。加えて、血管または常在ミクログリア分布などの他の可能性のある局所環境因子もこのインビボモデルで調べた。いずれも、Ｎｅｕｒｏｇ２誘導性神経細胞変換による影響を有意には受けなかったことを見出した（図１７Ａ～Ｄ）。
【0078】
要約すると、Ｎｅｕｒｏｇ２は、代表的なリプログラミング因子として、異種移植マウスモデルにおいて、ヒト膠芽腫細胞をインビボで神経細胞様細胞に効率的にリプログラミングする。さらに、このリプログラミングアプローチにより、神経膠腫細胞の増殖が顕著に阻害され、反応性アストログリオーシスが低減する。総合すると、これらの結果により、がん細胞（例えば、ＧＢＭ細胞）が、インビトロとインビボとの両方で異なるサブタイプの神経細胞にリプログラミングされ、がん（例えば、脳腫瘍）を処置するための代替的な治療アプローチをもたらし得ることが実証される。
【0079】
実施例２：肝臓癌細胞の非がん性肝細胞への変換
本実施例は、肝臓転写因子（例えば、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、及び／またはＨＮＦ４Ａ）を使用して、腫瘍細胞のリプログラミングを媒介し、腫瘍細胞を正常様細胞に変換し、肝臓癌または他の種類のがんの治療のための新規戦略を確立できることを実証する。
本実施例は、肝臓転写因子（例えば、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、及び／またはＨＮＦ４Ａ）を使用して、腫瘍細胞のリプログラミングを媒介し、腫瘍細胞を正常様細胞に変換し、肝臓癌または他の種類のがんの治療のための新規戦略を確立できることを実証する。
【0080】
細胞株
ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣから入手）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。すべての細胞株をＭｙｃｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（商標）（ＡＫＲＯＮ）で規定どおりに処理して、マイコプラズマ汚染を検出した。
ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣから入手）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。すべての細胞株をＭｙｃｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（商標）（ＡＫＲＯＮ）で規定どおりに処理して、マイコプラズマ汚染を検出した。
【0081】
抗体
ＧＦＰに特異的なニワトリポリクローナルまたはマウスモノクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した。ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、及びＨＮＦ４Ａタンパク質に対するヤギポリクローナル抗体を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。マウスベータアクチンモノクローナル抗体及びヤギアルブミンポリクローナル抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから、ウサギＧＡＰＤＨポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから入手した。ＡＦＰタンパク質及びＥ－カドヘリンに特異的なウサギモノクローナル抗体、ならびにＨＮＦ４Ａタンパク質に特異的なマウスモノクローナル抗体を、Ａｂｃａｍから購入した。ウサギ抗Ｂ－カテニンポリクローナル抗体及びヤギ抗ビメンチンポリクローナル抗体を、それぞれＡｂｃａｍ及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ、ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ、ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ二次抗体を、ＬＩ－ＣＯＲから購入した。
ＧＦＰに特異的なニワトリポリクローナルまたはマウスモノクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した。ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、及びＨＮＦ４Ａタンパク質に対するヤギポリクローナル抗体を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。マウスベータアクチンモノクローナル抗体及びヤギアルブミンポリクローナル抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから、ウサギＧＡＰＤＨポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから入手した。ＡＦＰタンパク質及びＥ－カドヘリンに特異的なウサギモノクローナル抗体、ならびにＨＮＦ４Ａタンパク質に特異的なマウスモノクローナル抗体を、Ａｂｃａｍから購入した。ウサギ抗Ｂ－カテニンポリクローナル抗体及びヤギ抗ビメンチンポリクローナル抗体を、それぞれＡｂｃａｍ及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ、ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ、ＩＲＤｙｅ ６８０ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ、ＩＲＤｙｅ ８００ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ二次抗体を、ＬＩ－ＣＯＲから購入した。
【0082】
動物
４～５週齢の雄免疫不全無胸腺ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。
４～５週齢の雄免疫不全無胸腺ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。
【0083】
レンチウイルス発現プラスミド及びウイルスの生成
ＧＡＴＡ４（またはＦｏｘａ２またはＨＮＦ４Ａ）－Ｐ２Ａ－ＧＦＰのＡｇｅＩ／ＥｃｏｒＩ断片を、既存の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列に置き換えて、第３世代レンチウイルスベクターｐＬＪＭ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたベクタープラスミドを使用して、レンチウイルスを生成した。レンチウイルスは、ＰＥＩトランスフェクション法を使用して生成した。簡潔には、１５ｃｍ培養皿上で増殖させた２９３Ｔ細胞の８０％のコンフルエントを、レンチウイルスベクターをコードする１２μｇのＧＡＴＡ４（またはＦｏｘａ２またはＨＮＦ４Ａ）－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇをコードする２．４μｇのエンベロープププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、及び１２μｇの包装プラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ）でトランスフェクトした。ウイルス含有培地を、トランスフェクションから７２時間後に採取し、濾過して細胞または細胞残屑を除去し、超遠心分離により濃縮した。ウイルス力価を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染により決定し、ＧＦＰ陽性細胞を、ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）の計算のために計数した。
ＧＡＴＡ４（またはＦｏｘａ２またはＨＮＦ４Ａ）－Ｐ２Ａ－ＧＦＰのＡｇｅＩ／ＥｃｏｒＩ断片を、既存の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列に置き換えて、第３世代レンチウイルスベクターｐＬＪＭ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたベクタープラスミドを使用して、レンチウイルスを生成した。レンチウイルスは、ＰＥＩトランスフェクション法を使用して生成した。簡潔には、１５ｃｍ培養皿上で増殖させた２９３Ｔ細胞の８０％のコンフルエントを、レンチウイルスベクターをコードする１２μｇのＧＡＴＡ４（またはＦｏｘａ２またはＨＮＦ４Ａ）－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇをコードする２．４μｇのエンベロープププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、及び１２μｇの包装プラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ）でトランスフェクトした。ウイルス含有培地を、トランスフェクションから７２時間後に採取し、濾過して細胞または細胞残屑を除去し、超遠心分離により濃縮した。ウイルス力価を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染により決定し、ＧＦＰ陽性細胞を、ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）の計算のために計数した。
【0084】
細胞増殖アッセイ
ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の細胞増殖アッセイを、１２ウェルプレート当たり１５，０００個の細胞で開始した。細胞を、６、２４、４８、及び７２時間で計数した。各時点で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を各ウェルに１５分間加えた。次に、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。染色したクリスタルバイオレットを１０％酢酸により抽出し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）による５９０ｎｍでの光学密度測定のために９６ウェルプレートに移した。
ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞の細胞増殖アッセイを、１２ウェルプレート当たり１５，０００個の細胞で開始した。細胞を、６、２４、４８、及び７２時間で計数した。各時点で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を各ウェルに１５分間加えた。次に、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。染色したクリスタルバイオレットを１０％酢酸により抽出し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）による５９０ｎｍでの光学密度測定のために９６ウェルプレートに移した。
【0085】
マウス腫瘍モデル
マウスに移植する前に、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２細胞株を８０％コンフルエンスまで増殖させ、計数し、ＰＢＳに懸濁させた。各マウスの右脇腹に、１．０×１０６個の腫瘍細胞を皮下注射した。動物を検査し、実験をとおして３～４日ごとに腫瘍増殖をモニタリングした。腫瘍をノギスで測定し、腫瘍体積を式：０．５×ａｂ２（ａが長軸、ｂが短軸）。マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖し、４℃の４％ＰＦＡ中でインキュベートした。腫瘍をスライスし、免疫蛍光染色により分析した。
マウスに移植する前に、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２細胞株を８０％コンフルエンスまで増殖させ、計数し、ＰＢＳに懸濁させた。各マウスの右脇腹に、１．０×１０６個の腫瘍細胞を皮下注射した。動物を検査し、実験をとおして３～４日ごとに腫瘍増殖をモニタリングした。腫瘍をノギスで測定し、腫瘍体積を式：０．５×ａｂ２（ａが長軸、ｂが短軸）。マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖し、４℃の４％ＰＦＡ中でインキュベートした。腫瘍をスライスし、免疫蛍光染色により分析した。
【0086】
肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２のレンチウイルス形質導入
レンチウイルス形質導入のため、ヒト肝臓癌ＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５細胞の密度で６ｃｍの培養皿にプレーティングし、一晩インキュベートして、細胞を付着させた。ＨｅｐＧ２細胞を、２％ＦＢＳを補充した新鮮な２ｍＬのＤＭＥＭ中、１のＭＯＩでレンチウイルスに感染させた。培養物を３７℃で２日間インキュベートした。
レンチウイルス形質導入のため、ヒト肝臓癌ＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５細胞の密度で６ｃｍの培養皿にプレーティングし、一晩インキュベートして、細胞を付着させた。ＨｅｐＧ２細胞を、２％ＦＢＳを補充した新鮮な２ｍＬのＤＭＥＭ中、１のＭＯＩでレンチウイルスに感染させた。培養物を３７℃で２日間インキュベートした。
【0087】
培養培地を、１０％ＦＢＳ及び２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭで置き換えた。ピューロマイシン耐性細胞を、１０％ＦＢＳ及び２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持した。
【0088】
ウエスタンブロット分析
１倍ＰＢＳに再懸濁させた培養細胞を、等体積の２倍ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。新鮮な腫瘍試料を５体積の１倍ＲＩＰＡ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ＢＥＡＤ ＲＵＰＴＯＲホモジナイザー（ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）により最高速度で４５秒間均質化した。等体積の２倍ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを溶解させた腫瘍試料に加えた。
１倍ＰＢＳに再懸濁させた培養細胞を、等体積の２倍ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。新鮮な腫瘍試料を５体積の１倍ＲＩＰＡ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ＢＥＡＤ ＲＵＰＴＯＲホモジナイザー（ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）により最高速度で４５秒間均質化した。等体積の２倍ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを溶解させた腫瘍試料に加えた。
【0089】
タンパク質試料を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移した。膜を５％の脱脂粉乳中で遮断し、一次抗体、続いて適当な二次抗体とともにインキュベートした。タンパク質バンド検出を、ＬＩ－ＣＯＲ ＯＤＹＳＳＥＹ ＣＬｘスキャナを使用して実行した。タンパク質バンドをＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｅｒ ３．１ソフトウェアにより定量化し、ソフトウェアの説明書に従って各タンパク質の相対量を得た。
【0090】
免疫蛍光染色及び顕微鏡法
カバースリップ上で増殖させた細胞培養物を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定した。ＰＦＡをＰＢＳで洗い流し、細胞を、ＰＢＳ中の２．５％ＮＤＳ（Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍ）、２．５％ＮＧＳ（Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ）、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する遮断溶液中で３０分間インキュベートした。細胞を、遮断溶液中に混合した一次抗体とともに、一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の混合物とともに１時間インキュベートした。非結合二次抗体をＰＢＳで洗い流し、核をＤＡＰＩで染色した。細胞を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）で可視化した。
カバースリップ上で増殖させた細胞培養物を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定した。ＰＦＡをＰＢＳで洗い流し、細胞を、ＰＢＳ中の２．５％ＮＤＳ（Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍ）、２．５％ＮＧＳ（Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ）、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する遮断溶液中で３０分間インキュベートした。細胞を、遮断溶液中に混合した一次抗体とともに、一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の混合物とともに１時間インキュベートした。非結合二次抗体をＰＢＳで洗い流し、核をＤＡＰＩで染色した。細胞を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）で可視化した。
【0091】
腫瘍切片を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ中で１時間透過処理し、続いて、ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む遮断溶液中で１時間インキュベーションした。腫瘍切片を、遮断溶液中に混合した一次抗体とともに一晩４℃でインキュベートした。結合していない一次抗体をＰＢＳで洗い流した後、腫瘍切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｓｅａｃｈ）の混合物とともに１時間室温でインキュベートし、結合していない二次抗体をＰＢＳで洗い流し、核をＤＡＰＩで染色した。腫瘍切片を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）で可視化した。
【0092】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２細胞株を、１２ウェルプレートに播種し、６時間インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。培養培地を無血清ＤＭＥＭで置き換え、１６時間インキュベーションを続けた。各細胞株からの培養培地を収集し、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）をキットの説明書に従って用いて、アルブミン量を測定した。
ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２細胞株を、１２ウェルプレートに播種し、６時間インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。培養培地を無血清ＤＭＥＭで置き換え、１６時間インキュベーションを続けた。各細胞株からの培養培地を収集し、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）をキットの説明書に従って用いて、アルブミン量を測定した。
【0093】
肝臓転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４を用いた肝臓腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２の形質導入
Ｆｏｘａ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＨＮＦ４Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＧＡＴＡ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、またはＧＦＰを担持するｐＬＪＭ１レンチウイルスベクターを使用して、ＨｅｐＧ２細胞に感染させた。４８時間後、ピューロマイシンを培地に添加して、未感染の細胞を排除した。ピューロマイシン耐性細胞を規定どおりに増殖させ、細胞内の転写因子またはＧＦＰの発現を免疫染色またはウエスタンブロットにより評価した。Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＧＦＰの発現及び局在化を調べるために、ＨｅｐＧ２－Ｆｏｘａ２（Ｆｏｘａ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、ＨｅｐＧ２－ＨＮＦ４Ａ（ＨＮＦ４Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、ＨｅｐＧ２－ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、またはＨｅｐＧ２－ＧＦＰ（ＧＦＰ形質導入）細胞株を蛍光顕微鏡法に供した。Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＧＦＰはすべて、各細胞株において高度に発現され、転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４は、核に局在し、一方でＧＦＰは、細胞体全体に分布した（図１８Ａ）。各形質導入株中の全細胞が、形質導入ベクターを発現した。転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４の発現を、ウエスタンブロットによりさらに検証した（図１８Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）。
Ｆｏｘａ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＨＮＦ４Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ＧＡＴＡ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、またはＧＦＰを担持するｐＬＪＭ１レンチウイルスベクターを使用して、ＨｅｐＧ２細胞に感染させた。４８時間後、ピューロマイシンを培地に添加して、未感染の細胞を排除した。ピューロマイシン耐性細胞を規定どおりに増殖させ、細胞内の転写因子またはＧＦＰの発現を免疫染色またはウエスタンブロットにより評価した。Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＧＦＰの発現及び局在化を調べるために、ＨｅｐＧ２－Ｆｏｘａ２（Ｆｏｘａ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、ＨｅｐＧ２－ＨＮＦ４Ａ（ＨＮＦ４Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、ＨｅｐＧ２－ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ形質導入）、またはＨｅｐＧ２－ＧＦＰ（ＧＦＰ形質導入）細胞株を蛍光顕微鏡法に供した。Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＧＦＰはすべて、各細胞株において高度に発現され、転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４は、核に局在し、一方でＧＦＰは、細胞体全体に分布した（図１８Ａ）。各形質導入株中の全細胞が、形質導入ベクターを発現した。転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４の発現を、ウエスタンブロットによりさらに検証した（図１８Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）。
【0094】
ＧＡＴＡ４は内因性Ｆｏｘａ２ポリペプチドレベルを上昇させる
肝臓転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４を使用して、個々にＨｅｐＧ２細胞を形質導入した。ウエスタンブロット分析は、ＧＡＴＡ４過剰発現により内因性Ｆｏｘａ２発現が増加し、ＨＮＦ４Ａ過剰発現によりＦｏｘａ２発現が減したことを示した（図１９Ａ）。内因性ＧＡＴＡ４発現はＨＮＦ４Ａ及びＦｏｘａ２両方の過剰発現の影響を受けないことが観察された（図１９Ｂ）。
肝臓転写因子Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４を使用して、個々にＨｅｐＧ２細胞を形質導入した。ウエスタンブロット分析は、ＧＡＴＡ４過剰発現により内因性Ｆｏｘａ２発現が増加し、ＨＮＦ４Ａ過剰発現によりＦｏｘａ２発現が減したことを示した（図１９Ａ）。内因性ＧＡＴＡ４発現はＨＮＦ４Ａ及びＦｏｘａ２両方の過剰発現の影響を受けないことが観察された（図１９Ｂ）。
【0095】
リプログラミングしたＨｅｐＧ２細胞における増殖
肝臓腫瘍細胞ＨｅｐＧ２増殖のための肝臓転写因子発現の機能的関連性を調べるために、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株を１２ウェルの皿の中で培養した。６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で、各細胞株からの細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。染色したクリスタルバイオレットを１０％酢酸により抽出し、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株の相対増殖速度を分光光度測定により比較した。図２０Ａに示すように、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａで形質導入した細胞株は、ＧＦＰで形質導入した対照細胞株と比較して低下した増殖速度を呈した。さらに、Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４媒介細胞株は、はるかに低い細胞増殖率を達成した。
肝臓腫瘍細胞ＨｅｐＧ２増殖のための肝臓転写因子発現の機能的関連性を調べるために、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株を１２ウェルの皿の中で培養した。６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で、各細胞株からの細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。染色したクリスタルバイオレットを１０％酢酸により抽出し、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株の相対増殖速度を分光光度測定により比較した。図２０Ａに示すように、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、またはＨＮＦ４Ａで形質導入した細胞株は、ＧＦＰで形質導入した対照細胞株と比較して低下した増殖速度を呈した。さらに、Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４媒介細胞株は、はるかに低い細胞増殖率を達成した。
【0096】
インビボでの増殖速度を調べるために、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株をヌードマウスモデルに皮下異種移植した。ヌードマウスを６匹／群で４群にランダムに割り当て、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰで形質導入した１×１０６個の細胞をヌードマウスの脇腹に移植した。４日後、ＧＦＰ及びＨＮＦ４Ａ形質導入細胞株は、腫瘍を形成し始めた。Ｆｏｘａ２形質導入細胞株は、目に見えるいかなる腫瘍も形成しなかった。ＧＡＴＡ４形質導入細胞株は、より後の時点で小さな腫瘍増殖を示した。結果は、リプログラミングされたＨｅｐＧ２細胞内のＦｏｘａ２またはＧＡＴＡ４により、細胞増殖が減少したことを明らかにした（図２０Ｂ）。
【0097】
リプログラミングしたＨｅｐＧ２細胞の機能
Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入ＨｅｐＧ２細胞を抗アルブミン抗体で染色して、細胞株におけるアルブミン産生を調べた。図２１Ａに示すように、Ｆｏｘａ２とＧＡＴＡ４形質導入細胞株との両方は、免疫染色により試験したＨＮＦ４Ａ及びＧＦＰ形質導入細胞株と比較して、増加したアルブミンを産生した。この結果は、図２１Ｂに示すように、ウエスタンブロット分析により確認された。Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４形質導入細胞株におけるアルブミンの増加量は、２倍超であった（図２１Ｃ）。Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４形質導入細胞株におけるアルブミンは、細胞の外側に分泌することができた。ＧＦＰ形質導入細胞株と比較して、Ｆｏｘａ２またはＧＡＴＡ４形質導入細胞株からのアルブミンの分泌は、ＥＬＩＳＡによって検出して４倍超増加した（図２１Ｄ）。このため、Ｆｏｘａ２またはＧＡＴＡ４の形質導入及び過剰発現により、形質導入細胞株による正常な肝臓細胞の生理学的特性の提示が促進された。
Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入ＨｅｐＧ２細胞を抗アルブミン抗体で染色して、細胞株におけるアルブミン産生を調べた。図２１Ａに示すように、Ｆｏｘａ２とＧＡＴＡ４形質導入細胞株との両方は、免疫染色により試験したＨＮＦ４Ａ及びＧＦＰ形質導入細胞株と比較して、増加したアルブミンを産生した。この結果は、図２１Ｂに示すように、ウエスタンブロット分析により確認された。Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４形質導入細胞株におけるアルブミンの増加量は、２倍超であった（図２１Ｃ）。Ｆｏｘａ２及びＧＡＴＡ４形質導入細胞株におけるアルブミンは、細胞の外側に分泌することができた。ＧＦＰ形質導入細胞株と比較して、Ｆｏｘａ２またはＧＡＴＡ４形質導入細胞株からのアルブミンの分泌は、ＥＬＩＳＡによって検出して４倍超増加した（図２１Ｄ）。このため、Ｆｏｘａ２またはＧＡＴＡ４の形質導入及び過剰発現により、形質導入細胞株による正常な肝臓細胞の生理学的特性の提示が促進された。
【0098】
リプログラミングしたＨｅｐＧ２細胞における肝臓癌マーカー
免疫染色により示されるように、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株で発現されたＡＦＰは、細胞質内に局在した（図２２Ａ）。ＧＡＴＡ４及びＦｏｘａ２形質導入細胞株では、ＡＦＰ発現が低下した。ウエスタンブロット検査により、ＧＡＴＡ４細胞株におけるＡＦＰ発現量は、ＧＦＰ形質導入細胞株と比較して６０パーセント多く減少した（図２２Ｂ）。インビボ試験のため、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株を皮下異種移植したヌードマウス中でＨｅｐＧ２腫瘍を発生させ、腫瘍試料を収集した。Ｆｏｘａ２形質導入細胞株は、腫瘍形成の能力を喪失した。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株で形成された腫瘍をＰＦＡに固定し、切断し、免疫蛍光により分析した。図２２Ｃに示すように、ＧＡＴＡ４細胞株で産生されたＡＦＰは減少し、ＨＮＦ４Ａ細胞株で産生されたＡＦＰは軽度に減少した。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株で発生させ新鮮なＨｅｐＧ２腫瘍試料もウエスタンブロット分析に供した。ＧＡＴＡ４は、ＧＡＴＡ４細胞株から形成された腫瘍において過剰発現され、ＡＦＰ発現レベルは低下した（図２２Ｄ）。ＧＡＴＡ４細胞株を使用したインビボ試験とインビトロ試験との両方で、ＡＦＰ発現の減少を観察した。
免疫染色により示されるように、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株で発現されたＡＦＰは、細胞質内に局在した（図２２Ａ）。ＧＡＴＡ４及びＦｏｘａ２形質導入細胞株では、ＡＦＰ発現が低下した。ウエスタンブロット検査により、ＧＡＴＡ４細胞株におけるＡＦＰ発現量は、ＧＦＰ形質導入細胞株と比較して６０パーセント多く減少した（図２２Ｂ）。インビボ試験のため、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株を皮下異種移植したヌードマウス中でＨｅｐＧ２腫瘍を発生させ、腫瘍試料を収集した。Ｆｏｘａ２形質導入細胞株は、腫瘍形成の能力を喪失した。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株で形成された腫瘍をＰＦＡに固定し、切断し、免疫蛍光により分析した。図２２Ｃに示すように、ＧＡＴＡ４細胞株で産生されたＡＦＰは減少し、ＨＮＦ４Ａ細胞株で産生されたＡＦＰは軽度に減少した。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ細胞株で発生させ新鮮なＨｅｐＧ２腫瘍試料もウエスタンブロット分析に供した。ＧＡＴＡ４は、ＧＡＴＡ４細胞株から形成された腫瘍において過剰発現され、ＡＦＰ発現レベルは低下した（図２２Ｄ）。ＧＡＴＡ４細胞株を使用したインビボ試験とインビトロ試験との両方で、ＡＦＰ発現の減少を観察した。
【0099】
リプログラミングしたＨｅｐＧ２細胞における肝臓細胞マーカー
Ｅ－カドヘリン発現が、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ形質導入細胞株において、インビトロ及びインビボで観察された。ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ形質導入細胞株をカバースリップ上で増殖させ、抗Ｅ－カドヘリン抗体で染色した。免疫蛍光分析により、Ｅ－カドヘリンが、ＧＦＰ発現細胞と比較して、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４形質導入細胞中でより強く発現されることが示された。Ｅ－カドヘリンは細胞膜に局在した（図２３Ａ）。ＧＡＴＡ４発現によりＥ－カドヘリン発現が救済されるかどうかを調べるために、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰを発現する細胞株を採取し、溶解させ、ウエスタンブロットにより分析した。Ｅ－カドヘリンはＧＡＴＡ４発現株において２倍超救済され（図２３Ｂ）、免疫蛍光分析及びウエスタンブロットにより得られた結果を反映した（図２３Ａ）。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ過剰発現腫瘍におけるＥ－カドヘリン発現レベルを決定するために、インビボ実験を行った。図２３Ｃ及び図２３Ｄに示されるように、ＧＡＴＡ４過剰発現を有する腫瘍は、免疫蛍光分析またはウエスタンブロットのいずれかにより試験したとき、Ｅ－カドヘリンのレベルが２倍超高い。Ｅ－カドヘリン発現は、ＨＮＦ４Ａ過剰発現細胞株において増加したが、腫瘍増殖率はＧＦＰ対照細胞株と比較して低下しなかった。これらのデータは、Ｅ－カドヘリンレベルの上昇が、リプログラミングされた腫瘍細胞の機能改善の指標として使用され得ることを示す。
Ｅ－カドヘリン発現が、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ形質導入細胞株において、インビトロ及びインビボで観察された。ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ形質導入細胞株をカバースリップ上で増殖させ、抗Ｅ－カドヘリン抗体で染色した。免疫蛍光分析により、Ｅ－カドヘリンが、ＧＦＰ発現細胞と比較して、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＡＴＡ４形質導入細胞中でより強く発現されることが示された。Ｅ－カドヘリンは細胞膜に局在した（図２３Ａ）。ＧＡＴＡ４発現によりＥ－カドヘリン発現が救済されるかどうかを調べるために、ＧＡＴＡ４、Ｆｏｘａ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰを発現する細胞株を採取し、溶解させ、ウエスタンブロットにより分析した。Ｅ－カドヘリンはＧＡＴＡ４発現株において２倍超救済され（図２３Ｂ）、免疫蛍光分析及びウエスタンブロットにより得られた結果を反映した（図２３Ａ）。ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、及びＧＦＰ過剰発現腫瘍におけるＥ－カドヘリン発現レベルを決定するために、インビボ実験を行った。図２３Ｃ及び図２３Ｄに示されるように、ＧＡＴＡ４過剰発現を有する腫瘍は、免疫蛍光分析またはウエスタンブロットのいずれかにより試験したとき、Ｅ－カドヘリンのレベルが２倍超高い。Ｅ－カドヘリン発現は、ＨＮＦ４Ａ過剰発現細胞株において増加したが、腫瘍増殖率はＧＦＰ対照細胞株と比較して低下しなかった。これらのデータは、Ｅ－カドヘリンレベルの上昇が、リプログラミングされた腫瘍細胞の機能改善の指標として使用され得ることを示す。
【0100】
これらの知見は、転写因子ＧＡＴＡ４がＥ－カドヘリン発現を促進したことを示す。ＧＡＴＡ４過剰発現がベータ－カテニンに影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＧＡＴＡ４形質導入細胞株及びＧＦＰ形質導入細胞株の両方に免疫蛍光分析を行った。ＧＡＴＡ４形質導入細胞株は、ＧＦＰ過剰発現細胞と比較して、ベータ－カテニン発現を増加させた（図２４Ａ）。これらの結果により、ＧＦＰ細胞内のベータ－カテニンが核周辺領域に分布し、核分布への優先傾向がわずかにあるのに対し、ＧＡＴＡ４形質導入細胞株中のベータ－カテニンは細胞表面に分布したことも示された。ウエスタンブロットを使用して、ＧＡＴＡ４形質導入細胞株中のベータ－カテニン発現を分析した。ＧＡＴＡ４形質導入細胞株は、ベータ－カテニン発現を増加させた（図２４Ｂ）。ＨＮＦ４Ａ形質導入細胞も、ベータ－カテニン発現の増加を示した。
【0101】
ＧＡＴＡ４形質導入細胞株またはＧＦＰ形質導入細胞株からインビボで形成された腫瘍に由来する腫瘍試料をベータ－カテニンについて染色すると、ＧＡＴＡ４腫瘍中のベータ－カテニン発現がＧＦＰ腫瘍よりも高かったことが免疫蛍光分析により示された。腫瘍中の細胞の混雑した微小な細胞質空間を理由に、これら２種類の腫瘍間のベータ－カテニン分布の差は決定できなかった（図２４Ｃ）。ＧＡＴＡ４腫瘍におけるベータ－カテニンの増加量は、ウエスタンブロットによって評価して、ＧＦＰ腫瘍よりも３倍高かった（図２４Ｄ）。
【0102】
ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ、またはＧＦＰ形質導入細胞株からインビボで形成された腫瘍に由来する腫瘍試料も、ウエスタンブロットによりビメンチンについて分析した。図２５に示されるように、ビメンチン発現は、ＧＦＰ腫瘍と比較してＧＡＴＡ４過剰発現腫瘍中で低下した。ＧＡＴＡ４腫瘍中のビメンチン発現レベルを定量化すると、ＧＡＴＡ４腫瘍中のビメンチンの減少は、ＧＦＰ腫瘍と比較して２倍超であった。
【0103】
これらの知見は、ＨＣＣ腫瘍細胞の運命が転写因子の過剰発現をとおして変化したことを示す。機序の変化は、上皮から間葉への転換（ＥＭＴ）の逆のプロセスである間葉から上皮への転換（ＭＥＴ）と関連付けることができる。総合すると、これらの結果により、がん細胞（例えば、肝臓癌細胞）がインビトロとインビボとの両方で正常様細胞（例えば、正常様肝臓細胞）にリプログラミングされることで、がん（例えば、肝臓癌）を処置するための代替的な治療アプローチがもたらされ得ることが示される。
【0104】
その他の態様
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、それを限定することは意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、それを限定することは意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図23D】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】