特表 2022-527329 神経疾患を処置するために有用なレトロマー安定化剤としてのアミノグアニジンヒドラゾン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-01

(54)【発明の名称】神経疾患を処置するために有用なレトロマー安定化剤としてのアミノグアニジンヒドラゾン

(51)【国際特許分類】

   C07C 281/18 20060101AFI20220525BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220525BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220525BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220525BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220525BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/155 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/167 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/235 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/495 20060101ALI20220525BHJP

   C07D 295/185 20060101ALI20220525BHJP

   C07D 295/215 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/4168 20060101ALI20220525BHJP

   C07D 233/88 20060101ALI20220525BHJP

   C07D 235/30 20060101ALI20220525BHJP

   A61K 31/4184 20060101ALI20220525BHJP

【ＦＩ】

C07C281/18 CSP

A61P43/00 111

A61P25/00

A61P21/00

A61P25/28

A61P25/16

A61K31/155

A61K31/167

A61K31/18

A61K31/235

A61K31/495

C07D295/185

C07D295/215

A61K31/40

A61K31/4168

C07D233/88

C07D235/30 A

A61K31/4184

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021558741

(86)(22)【出願日】2020-04-01

(85)【翻訳文提出日】2021-11-29

(86)【国際出願番号】 EP2020059207

(87)【国際公開番号】W WO2020201326

(87)【国際公開日】2020-10-08

(31)【優先権主張番号】19166534.8

(32)【優先日】2019-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517423431

【氏名又は名称】オスペダーレ・サン・ラッファエーレ・エッセエッレエッレ

(74)【代理人】

【識別番号】100060759

【弁理士】

【氏名又は名称】竹沢 荘一

(74)【代理人】

【識別番号】100083389

【弁理士】

【氏名又は名称】竹ノ内 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100198317

【弁理士】

【氏名又は名称】横堀 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】ジャンヴィト マルティーノ

(72)【発明者】

【氏名】ルカ ムーツィオ

(72)【発明者】

【氏名】ニーロ リーヴァ

(72)【発明者】

【氏名】ダヴィデ ゴルナーティ

(72)【発明者】

【氏名】ぺエルファウスト セネシ

(72)【発明者】

【氏名】シモーナ カルメン エレウテーリオ

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086AA04

4C086BC07

4C086BC38

4C086BC50

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA02

4C086ZA16

4C086ZA94

4C086ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA03

4C206AA04

4C206HA31

4C206JA14

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA01

4C206ZA02

4C206ZA16

4C206ZA94

4C206ZC41

4H006AA01

4H006AA02

4H006AA03

4H006AB20

4H006AB21

4H006AC59

4H006BA66

4H006BB14

(57)【要約】

本発明は、レトロマー安定化剤として有効であり、神経保護薬として有用である、式（Ｉ）の新規のアミノグアニジンヒドラゾン－誘導体に関する。本発明はまた、化合物を含む医薬組成物ならびに治療および診断でのそれらの使用にも関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）

【化1】

(I)
（式中、
Ｒ_１は、水素およびハロから選択され；
Ｒ_２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシおよびアルキルから選択され；
Ｒ_３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシおよびアルキル、アラルキル、アリール、－ＣＯＯＲ_８、－ＮＨＣＯＲ_８、－ＮＨＳＯ_２Ｒ_８、－ＣＯＲ_９、－ＮＯ_２およびアミノグアニジル－ヒドラゾンから選択され；
Ｒ_４は、水素およびアルキルから選択され；
Ｒ_５は、水素およびアルキルから選択され；
Ｒ_６は、水素、アルキル、アリールおよびアリールアルキルから選択され；
Ｒ_７は、水素およびアルキルから選択され；
または
Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する２つの窒素原子と共に、イミダゾリノ、テトラヒドロピリミジノおよびベンズイミダゾリノから選択される環を形成し；
または
Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノまたはピペリジノ基を形成し；
Ｒ_８は、水素、置換アルキルおよびアリールから選択され；
Ｒ_９は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）および（ＩＩＩｅ）

【化2】

［式中、アスタリスク（^＊）は、連結する結合を示す］
の基から選択される）
の化合物ならびにその塩および溶媒和物。

【請求項2】

Ｒ_１は、水素および臭素から選択され；
Ｒ_２は、水素、臭素、ヒドロキシ、メトキシ、メチル、ｎ－ブチルおよびｎ－ブチルオキシから選択され；
Ｒ_３は、水素、臭素、メトキシ、－ＮＯ_２、フェニル、－ＮＨＣＯＣＨ_３、ＮＨＣＯ－ｐ－トリル、－ＮＨＳＯ_２ＣＨ_３、－ＮＨＳＯ_２－ｐ－トリル、ＣＯＯＣＨ_３、－ＣＯ－Ｒ_９およびアミノグアニジル－ヒドラゾンから選択され；
Ｒ_４は、水素およびメチルから選択され；
Ｒ_５は、水素であり；
Ｒ_６は、水素、メチル、ｎ－ブチルおよびベンジルから選択され；
Ｒ_７は、水素であり、
または
Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する２つの窒素原子と共に、イミダゾリノ、テトラヒドロピリミジノおよびベンズイミダゾリノから選択される環を形成し；
または
Ｒ_６およびＲ_７は、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノ基を形成し；
Ｒ_９は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）および（ＩＩＩｅ）

【化3】

［式中、アスタリスク（^＊）は、連結する結合を示す］
の基から選択されることを特徴とする請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の１つ。

【請求項3】

式中：
－ Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ａ）
－ Ｒ_１は臭素であり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｂ）
－ Ｒ_２は臭素であり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｃ）
－ Ｒ_２はヒドロキシルであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｄ）
－ Ｒ_２はメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｅ）
－ Ｒ_２はｎ－ブチルオキシであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｆ）
－ Ｒ_３はメチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｇ）
－ Ｒ_３は臭素であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｈ）
－ Ｒ_３はメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｉ）
－ Ｒ_３はニトロであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｊ）
－ Ｒ_３はフェニルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｋ）
－ Ｒ_３はアセトアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｌ）
－ Ｒ_３はｐ－トリルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｍ）
－ Ｒ_３はメシルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｎ）
－ Ｒ_３はｐ－トシルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｏ）
－ Ｒ_３はカルボメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｐ）
－ Ｒ_３は１－（４’－フェニルピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｑ）
－ Ｒ_３はアミノグアニジルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｒ）
－ Ｒ_６はｎ－ブチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｔ）
－ Ｒ_６はベンジルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｕ）
－ Ｒ_６およびＲ_７は、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５は全て水素である（化合物２ｖ）
－ Ｒ_３はトシルアミドであり、Ｒ_６はｎ－ブチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｗ）
－ Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、イミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｘ）
－ Ｒ_４はメチルであり、Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、イミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｙ）
－ Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、ベンズイミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｚ）、
式（Ｉ）の化合物から選択される請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物の１つ。

【請求項4】

化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｉ、２ｌ、２ｖおよび２ｚから選択される、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項5】

その塩の１つの形態であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の少なくとも１つ、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項7】

治療および／または診断でのその使用のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項8】

レトロマー安定化剤としてのその使用のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項9】

神経保護剤としてのその使用のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項10】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびレトロマー安定化活性が有益である他の神経疾患を含む神経疾患の処置および／または予防のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の１つの調製のための方法であって、
式（ＩＶ）

【化4】

(IV)
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は上記に定義した通りである）
の化合物を、
式（Ｖ）

【化5】

(V)
（式中、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_３は上記に定義した通りである）
の化合物またはその塩と好適な溶媒中で反応させるステップ、ならびに
そのようにして得られた式（Ｉ）の化合物を単離するステップ、
任意選択で精製するステップ、および／または
任意選択でそれをその塩もしくは溶媒和物に変換するステップ
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レトロマー安定化剤として有効であり、神経保護薬として有用である新規のアミノグアニジンヒドラゾン誘導体に関する。本発明はまた、それらを含む医薬組成物ならびに治療および診断におけるそれらの使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

エンドサイトーシス経路（Ｈｕｏｔａｒｉ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ２０１１）は、原形質膜受容体およびリガンドの優勢なリサイクル回路、（巨大）分子および外因性大粒子の消化のための分解系、ならびに前の回路から後の回路への非選別流および膜成分の輸送のための後期エンドソーム（ＬＥ）媒介供給経路を含む。神経細胞における機能障害性エンドサイトーシス膜移動は、神経変性疾患（ＮＤＤ）に共通しており、機能障害性タンパク質およびオルガネラの蓄積、神経脆弱性および細胞死をもたらす（Ｓｃｈｒｅｉｊ，Ｆｏｎら ２０１６）。

【0003】

レトロマー複合体（Ｓｅａｍａｎ ２００５）は、エンドソームからの積荷の回収およびトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）へのそれらの輸送（Ｓｅａｍａｎ ２００４）；ならびにエンドソームから細胞表面へと戻す積荷のリサイクリング（Ｔｅｍｋｉｎ，Ｌａｕｆｆｅｒら ２０１１）に関与するマルチモジュラータンパク質アセンブリーである。その三量体の積荷認識コア（ＣＲＣ）（Ｈｉｅｒｒｏ，Ｒｏｊａｓら ２００７）は、膜貫通タンパク質に結合し、輸送される。ＣＲＣは、ＶＰＳ３５骨格上でアセンブルする液胞タンパク質選別関連タンパク質２６（ＶＰＳ２６）およびＶＰＳ２９によって作成される。

【0004】

ＮＤＤにおけるレトロマー機能障害は、積荷の神経毒性断片への異常なプロセシング（Ｂｈａｌｌａ，Ｖｅｔａｎｏｖｅｔｚら ２０１２）、エンドソーム－リソソーム系におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集物のプロテアーゼ駆動分解の減少（Ｆｕｔｅｒｍａｎ ａｎｄ ｖａｎ Ｍｅｅｒ ２００４）、オートファゴソーム形成および機能性の障害（Ｚａｖｏｄｓｚｋｙ，Ｓｅａｍａｎら ２０１４）、細胞内神経毒性凝集物の播種および細胞間拡散の増加（Ｗａｌｋｅｒ，Ｄｉａｍｏｎｄら ２０１３）、ならびにミクログリア食作用受容体の減少（Ｌｕｃｉｎ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎら ２０１３）を引き起こし得る。

【0005】

レトロマーレベルの増加は、細胞における積荷の移動および輸送を増強する（Ｓｍａｌｌ，Ｋｅｎｔら ２００５）。ＣＲＣタンパク質間の強化された相互作用は、レトロマーを安定化し（Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｓｈａｗら ２０１１）、その機能性を増加させるはずである。近年、インシリコスクリーニングは、ＶＰＳ３５とＶＰＳ２９の間の界面におけるレトロマー安定化剤（Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｂｅｒｍａｎら ２０１４）結合を標的化した。チオフェン－連結ビス－イソチオウレアＲ５５（１）は、ＶＰＳ３５－ＶＰＳ２９界面で結合することができる薬理学的シャペロンとして同定された（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｏ，Ｄａｓら ２０１６）。Ｒ５５は、インビトロでＣＭＣを安定化し（ＣＭＣの変性温度のおよそ１０℃増加）、神経細胞培養におけるＶＰＳ３５レベル（およそ１８０％）およびＶＰＳ２６レベル（およそ１５０％）を増加し、５０μＭまで毒性ではない（Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｂｅｒｍａｎら ２０１４）。Ｒ５５は、野生型およびＡＰＰ変異海馬神経細胞においてＡβ４０（４４％まで）およびＡβ４２（３９％まで）のレベルを減少させる（Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｂｅｒｍａｎら ２０１４）。

【化1】

1 (R55)

【0006】

例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー（Ａｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）など、いくつかの神経疾患の処置および予防において有効であり、有用であり得る新規のレトロマー安定化剤の必要性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、レトロマー安定化剤として有効な新規の化合物を提供することである。

【0008】

本発明のさらなる目的は、診断および治療における、特に、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー（Ａｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）などの神経疾患の処置における、本発明の新規の化合物の使用を提供することである。

【0009】

本発明のさらなる目的は、本発明の新規の化合物を含む医薬組成物を提供することである。

【0010】

本発明の別の目的は、本発明の新規の化合物の調製のための方法を提供することである。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５へのＲ５５の生化学的効果を示す図である。ヒストグラムは、平均（±ｓ．ｄ．）値（各群につきｎ＝３）を示す。スチューデントのｔ検定を使用して決定した^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図2】図２は、Ｇ９３ＡマウスにおけるＶＰＳ３５、ＶＰＳ２９およびＶＰＳ２６レベルを示す図である。Ａは、ＷＴおよびＧ９３Ａマウスからの腰部ＳＣ腹側角におけるＶＰＳ３５^＋ＮｅｕＮ^＋推定の運動神経細胞（ＭＮ）の共焦点スタックの最大投影を示す（３０、６０および９０日、ｎ＝４／時点）。ＶＰＳ２６およびＮｅｕＮを標識した隣接切片をＢに示す（３０、６０および９０日、ｎ＝４／時点）。パネルＣは、２０、６０および１００日でのＷＴおよびＧ９３Ａマウスからの腰部ＳＣ抽出物におけるＶＰＳ３５およびβアクチンのＷＢを示す（ｎ＝４／時点）。ノーマライズしたＶＰＳ３５レベルの定量（平均±ｓ．ｄ．）（ＷＴに対する比）をパネルＣのヒストグラムに示す。Ｄは、１００日目のＷＴおよびＧ９３ＡマウスからのＳＣにおけるＶＰＳ２６ｂおよびβ－チューブリンの代表的なＷＢを示す。ノーマライズしたＶＰＳ２６ｂレベルの定量（平均±ｓ．ｄ．）（ＷＴに対する比）をパネルのヒストグラムに示す（ｎ＝５ ＷＴおよびｎ＝６ Ｇ９３Ａ）。Ｅは、１００日目のＷＴおよびＧ９３ＡマウスからのＳＣにおけるＶＰＳ２９レベルのＷＢを示す。ノーマライズしたＶＰＳ２９ｂレベルの定量（平均±ｓ．ｄ．）（ＷＴに対する比）をパネルのヒストグラムに示す（各群につきｎ＝６）。パネルＦは、ＷＴ（６０日目にサンプリングした、ｎ＝４）およびＧ９３Ａマウス（３０、６０および９０日、ｎ＝３／時点）からの腰部ＳＣにおけるリアルタイムＰＣＲによるＶｐｓ３５、Ｖｐｓ２６およびＶｐｓ２９ｍＲＮＡの定量を示す（ＷＴ対する比）。二元配置分散分析（ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）後にボンフェローニの多重比較検定を使用してパネルＣのデータを解析した。両側スチューデントのｔ検定を使用して、パネルＤおよびＥの統計的優位性を決定した。一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）後にテューキーの多重比較検定を使用してパネルＦのデータを解析した。^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。パネルＢのスケールバー、８０μｍ。

【図3】図３は、非トランスフェクト－；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（１μｇ／ウェル）－ｐＣＡＡＧ－ＧＦＰ（０．２μｇ／ウェル）－；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（１μｇ／ウェル）－ｐＣＡＡＧ－ＧＦＰ（０．２μｇ／ウェル）＋２ａ（１０μＭ）－およびｐＣＡＡＧ－ＧＦＰ（１．２μｇ／ウェル）－トランスフェクトＮｅｕｒｏ２ａ（４×１０^４個の細胞／ウェル）における、ＧＦＰとＧｏｌｇｉｎ９７のマージした共焦点スタックを示す図である。正常、中間体または断片化ゴルジの形態学的解析は、非トランスフェクト細胞（ｎ＝８３）、Ｇ９３Ａ－ＧＦＰ（ｎ＝８８）、Ｇ９３Ａ－ＧＦＰ＋２ａ（ｎ＝８４）およびＧＦＰ（ｎ＝１０９）で行った。パネルＡのヒストグラムは、４回の独立した実験からの、条件当たりのゴルジ構築物の総数のパーセント（平均±ｓ．ｄ．）として表されるゴルジサブクラスを示す。未処置のＮｅｕｒｏ２ａ細胞（３×１０^５個の細胞／ウェル）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（２μｇ／ウェル）－ｐＣＡＡＧ－ＧＦＰ（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）またはｐＣＡＡＧ－ＧＦＰ（２μｇ／ウェル）によってトランスフェクトした細胞からの等量の細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、Ｇｏｌｇｉｎ９７およびβアクチンに対する抗体によって免疫ブロットした。定量（未処置細胞に対する平均変化倍率±ｓ．ｄ．）を、左側のパネルに示す（ｎ＝３／群）。Ｂは、ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ（１．２５μｇ／ウェル、ｎ＝１９ウェル）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（１．２５μｇ／ウェル、ｎ＝１９ウェル）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（１．２５μｇ／ウェル）＋２ａ（１０μＭ、ｎ＝２４ウェル）、および化合物２ａ（１０μＭ、ｎ＝１７ウェル）、（４×１０^４個の細胞／ウェル）によって処置した細胞の、非トランスフェクトＮｅｕｒｏ２ａ細胞（ｎ＝１９ウェル）と比較した平均比として表される細胞生存率を示す。陽性対照は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をＨ_２Ｏ_２（２００μＭ、１６ウェル、４×１０^４個の細胞／ウェル）で処置することによって得られる。データ（平均±ｓ．ｄ．）は、３回の独立した実験に由来する。パネルＣは、ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ＋ｐｃＣＤＮＡ３．１－ＶＰＳ３５（１μｇ／ウェル＋０．２５μｇ／ウェル）；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ＋ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ（１μｇ／ウェル＋０．２５μｇ／ウェル）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ＋ｐｃＣＤＮＡ３．１（＋）ＶＰＳ３５（１μｇ／ウェル＋０．２５μｇ／ウェル）、（４×１０^４個の細胞／ウェル）によってトランスフェクトした細胞の細胞生存率（未処置のＮｅｕｒｏ２ａに対する比）を示す。ヒストグラムは、３回の独立した実験（ｎ＝１７／群）由来する平均（±ｓ．ｄ．）を示す。パネルＤは、以下の状態を受ける細胞の細胞生存率（未処置のＮｅｕｒｏ２ａに対する比）を示す：ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ（１μｇ／ウェル）とスクランブルまたはＳｈ５６プラスミド（それぞれ０．２５μｇ／ウェル）；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（１μｇ／ウェル）とスクランブルまたはＳｈ５６プラスミド（０．２５μｇ／ウェル）およびリード２ａ（１０μＭ）ありまたはなし；（３回の独立した実験からｎ＝２０／群、４×１０^４個の細胞／ウェル）。パネルＥは、パネルＤでプロットした実験のように処置および条件を受けるＮｅｕｒｏ２ａ（４×１０^４個の細胞／ウェル）におけるＬＤＨアッセイを示す。細胞毒性（平均±ｓ．ｄ．）は、上澄み液に放出されたＬＤＨの量を測定することによって算出した（３回の独立した実験からｎ≧９ウェル／群）。二元配置分散分析後にボンフェローニの多重比較検定を使用してパネルＡのデータを解析した。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してパネルＢ～Ｅのデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．は有意ではない。Ａのスケールバー、１０μｍ。

【図4】図４は、ＶＰＳ３５の低分子干渉プラスミドによってトランスフェクトした細胞におけるＶＰＳ３５レベルを示す図である。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（３×１０^５個の細胞／ウェル）を、スクランブルまたは市販のＶＰＳ３５ ＲＮＡｉプラスミド（Ｓｈ５６、Ｓｈ５８およびＳｈ５９、２μｇ／ウェル）によってトランスフェクトした。ノックダウンは、トランスフェクションの４８時間後にサンプリングしたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析によって評価した。Ａのヒストグラムは、未処置の細胞に対する比として報告したノーマライズしたＶｐｓ３５ ｍＲＮＡレベル（平均±ｓ．ｄ．）を示す（ｎ＝３／群）。ＷＢを行い、スクランブルまたはＶＰＳ３５ ＲＮＡｉプラスミドを受ける細胞におけるＶＰＳ３５のノックダウンを確かめた。パネルＢの黒い境界線は、同じフィルターから切り取ったレーンを示す。未処置の細胞に対する比として報告したノーマライズしたＶＰＳ３５タンパク質レベル（平均±ｓ．ｄ．）の定量をＣに示す（ｎ＝３／群）。平行培養（３×１０^５個の細胞／ウェル）は、スクランブル（Ｄ）またはＳｈ５６（Ｅ）プラスミドと一緒に、ｐＣＡＡＧ－ＧＦＰプラスミドによってトランスエフェクトし、ＧＦＰおよびＶＰＳ３５を標識した。Ｅの矢印は、Ｓｈ５６プラスミドを受けるＧＦＰ^＋細胞におけるＶＰＳ３５免疫反応性を示す。Ｅの矢印は、正常レベルでＶＰＳ３５を発現する同じ視野からのＧＦＰ^－を示す（ｎ＝３／群）。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図5】図５は、化合物２ａがＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５レベルを安定化することを示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（３×１０^５個の細胞／ウェル）におけるＶＰＳ３５の分解の速度を決定するために実施したシクロヘキシミド（ＣＨＸ）追跡アッセイを示す。細胞は、２４時間、ビヒクルまたは２ａ（１０μＭ）によって処置し、次いで２、４および８時間、ＣＨＸ（１０μｇ／ｍＬ）によって追跡した。Ａは、ビヒクルおよび化合物２ａ処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５およびβアクチンレベルの代表的なＷＢを示す。ノーマライズしたＶＰＳ３５レベルの定量（０時間で確立した、平均のノーマライズした比±ｓ．ｅ．ｍ．）をパネルＢに示す（各群につきｎ＝８）。Ｃは、化合物２ａを受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶｐｓ３５、Ｖｐｓ２６およびＶｐｓ２９ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（３回の独立した実験から各群につきｎ＝８、１０μＭ ４８時間、３×１０^５個の細胞／ウェル）を示し、ヒストグラムは、ビヒクル処置細胞に対する比を報告した。二元配置分散分析後にボンフェローニの多重比較検定を使用してパネルＢにプロットしたデータを解析した。両側スチューデントのｔ検定を使用して、Ｃの統計的優位性を決定した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図6】図６は、中枢神経系における２ａの透過性を示す図である。パネルＡは、１０ｍｇ／ｋｇの２ａを毎日注射し、１、７、１５および３０日目にサンプリングした（各時点についてｎ＝４）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける脳への取り込みのタイムコースを示す。データは平均（±ｓ．ｄ．）として表す。Ｂは、ビヒクル、Ｒ５５／１および２ａを毎日注射した（７日間、１０ｍｇ／ｋｇ）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからのＳＣ抽出物におけるＶＰＳ３５およびβアクチンの代表的なＷＢを示す。黒い境界線は、平行フィルターから切り取ったレーンをマークする。ノーマライズしたＶＰＳ３５レベルの定量（ビヒクル処置したマウスに対する比）は、ヒストグラムのパネルに示す（各ドットは、個々のマウスを表す）。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してデータを解析した。

【図7】Ａは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞および一次神経細胞培養における２ａの毒性を示す。細胞生存の非線形フィッティング解析は、化合物２ａの２５７．９μＭのＬＤ_５０を示す。データ（平均±ｓ．ｄ．）は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞が４８時間、漸増量の２ａを受ける３回の独立した実験からのｎ＝２４ウェル／群に由来する。陽性対照、Ｈ_２Ｏ_２によるＮｅｕｒｏ２ａ細胞の確立された処置（４８時間、２００μＭ、４×１０^４個の細胞／ウェル、３回の独立した実験からｎ＝２４ウェル）をパネルのヒストグラムに示す。パネルＢおよびＣは、１μＭ（Ｂ）および１００μＭ（Ｃ）の濃度で、２ａによって処置した一次皮質神経細胞（３×１０^５個の皮質神経細胞／チップ、ｎ＝４チップ）をプレートした代表的な微小電極アレイバイオチップの同じ電極からの神経細胞活性の記録を示す。神経細胞は、漸増量の２ａ（１、３、１０、３０および１００μＭ）を受け、５分ごとに記録した。Ｄは、低濃度の２ａ（１μＭ）に曝露された神経細胞において測定したスパイク数の変化倍率（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）として報告されたファイアリング活性の定量を示す。パネルＥは、リード化合物がＨ_２Ｏ_２誘導細胞死を回復しないことを示す。パネルのヒストグラムは、化合物：２ａ、２ｃ、２ｄおよび２ｇ（１０μＭ）ありまたはなしで、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）を受けるＮｅｕｒｏ２ａにおいて確立された細胞生存の定量（未処置に対する変化倍率、平均値±ｓ．ｄ．）を示す。４８時間で、細胞を回収し、細胞生存を確立した（それぞれ６回反復からなるｎ＝３の独立した実験）。Ｈ_２Ｏ_２を受ける細胞とＨ_２Ｏ_２＋リードを受ける細胞の間の差は、有意ではない。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してデータを解析した。

【図8】図８は、Ｇ９３Ａマウスにおける運動神経変性に対抗する２ａの能力を示す図である。パネルＡは、ビヒクル処置したＷＴマウス（ｎ＝１０）；ビヒクル処置したＧ９３Ａマウス（ｎ＝１５）；２ａ処置したＷＴマウス（ｎ＝１０）および２ａ処置したＧ９３Ａマウス（ｎ＝１６）、（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日）において、３日ごとに測定した体重曲線を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。Ｂは、ビヒクルおよびリード２ａ処置したＷＴマウス（各群についてｎ＝１０）において、ロータロッド装置の回転棒を落下するまでの時間を示す。Ｃは、ビヒクルおよびリード２ａ処置したＧ９３Ａマウス（各群につきｎ＝１５）における落下までの時間を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として報告する。Ｄでは、ビヒクル処置したＷＴマウス、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスおよびリード２ａ処置したＧ９３Ａマウスからの腰部ＳＣ切片（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日目にサンプリングした）は、ＮｅｕＮを標識した。定量は、推定の運動神経細胞をスコアリングするＳＣ腹側角で行った（点は、個々の動物を表し；線は平均およびｓ．ｅ．ｍ．を示す）。Ｅは、腰部ＳＣ切片のＣｈＡＴのＩＨＣを示す。ＳＣの腹側角におけるＣｈＡＴ^＋／切片の定量は、パネルＥのヒストグラムに示す（各点は１匹の動物を表し；線は平均およびｓ．ｅ．ｍ．を示す。）。両側スチューデントのｔ検定を使用して、パネルＡにプロットしたデータの統計的優位性を決定した。二元配置分散分析後にボンフェローニの多重比較検定を使用してパネルＢおよびＣのデータを解析した。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してパネルＤおよびＥのデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．は有意ではない。スケールバー、５０μｍ。

【図9】図９は、２ａが神経変性からＧ９３Ａマウスを保護することを示す図である。パネルＡは、ビヒクルを受けるＷＴマウスにおいて正常な線維を示す代表的な横断面半薄坐骨切片を示す（低倍率を左に示し、高倍率を右に示す）。パネルＢは、ビヒクルを受ける代表的なＧ９３Ａマウスからの画像を示す（高倍率写真の矢印は、変性線維を示す）。パネルＣは、線維変性の著しい現象を示す化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けるＧ９３ａマウスからの代表的な画像を示す。変性線維の定量は、パネルＤのヒストグラムにプロットした。各シンボルは、１匹の動物を表すが、ヒストグラムは平均値±ｓ．ｄ．を示す（一元配置分散分析後にテューキーの多重比較を使用して決定した^＊Ｐ＜０．０５）。

【図10】図１０は、２ａ処置したＧ９３Ａマウスに由来する神経における脱髄の減少を示す図である。パネルＡ～Ｃは、１００日目にサンプリングした（処置レジメン：毎日１０ｍｇ／ｋｇ）ビヒクル処置したＷＴ（Ａ）、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウス（Ｂ）および２ａ処置したＧ９３Ａマウス（Ｃ）からの坐骨神経の矢状切片のＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ（ＬＦＢ）染色を示す。ＬＦＢカバー領域の定量（平均±ｓ．ｄ．）は、ビヒクル処置したＷＴマウスの比として報告し、パネルＤに示す（各点は個々の動物を表す）。ＮＦ－ＭおよびＭＢＰを標識した平行切片をパネルＥに示す（各群につき≧５）。ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスの矢印は、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスからの線維において損傷したミエリンを示す。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してパネルＤのデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー５０μｍ。

【図11】パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦは、ＶＰＳ３５／ＮｅｕＮ（Ａ）、ＶＰＳ２６／ＮｅｕＮ（Ｂ）、ＣＩ－ＭＰＲ／ＮｅｕＮ（Ｃ）、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ／ＮｅｕＮ（Ｄ）およびＣＴＳＤ／ＮｅｕＮ（Ｆ）を標識した、ビヒクル処置したＷＴ、ビヒクル処置したＧ９３Ａおよび２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日）処置したＧ９３Ａマウス（ｎ＝３／群）の腰部ＳＣ（腹側角）からの共焦点スタックの最大投影を示す。ＶＰＳ３５（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８）の、ゲートしたＮｅｕＮ^＋ＭＮ（点線は代表的な細胞を示す、ｎ≧３８／群）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ａにおいて平均の任意単位（ａ．ｕ．±ｓ．ｅ．ｍ．）として報告する。落射蛍光スケールをパネルに示す。ゲートしたＮｅｕＮ^＋ＭＮ（点線は代表的な細胞を示す、ｎ≧４０／群）で定量したＶＰＳ２６（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８）の平均ＭＦＩ（ａ．ｕ．±ｓ．ｅ．ｍ．）をＢに示す。落射蛍光スケールをパネルに示す。ＮｅｕＮ＋ＭＮ（ｎ≧３５個の細胞／群）におけるＣＩ－ＭＰＲ ＭＦＩの平均ＭＦＩ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、ａ．ｕ．±ｓ．ｅ．ｍ．）をＣに示す。落射蛍光スケールをパネルに示す。ゲートしたＮｅｕＮ^＋ＭＮ（点線は代表的な細胞を示す、ｎ≧３２／群）において定量した平均Ｓｏｒｔｉｌｉｎ ＭＦＩレベル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、ａ．ｕ．±ｓ．ｅ．ｍ．）をＤに示す。落射蛍光スケールをパネルに示す。Ｅは、ＣＴＳＤ（重鎖（４６～５０ｋＤａ）および軽鎖（２８～３０ｋＤａ））の代表的なＷＢを示す。タンパク質負荷のノーマライゼーションは、βアクチンによって行った。Ｅのヒストグラムは定量を示し、点は個々のマウスを示す（線は平均＋ｓ．ｅ．ｍ．を示す）。ゲートしたＮｅｕＮ^＋ＭＮ（点線は代表的な細胞を示す）の平均ＣＴＳＤ ＭＦＩレベル（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、ａ．ｕ．±ｓ．ｅ．ｍ．）は、Ｆに示す。落射蛍光スケールをパネルに示す。ＮｅｕＮ^＋ＭＮの面積でノーマライズしたＣＴＳＤ点の数は、Ｆのヒストグラムに示す（点は１匹の動物を示す、ｎ≧１６個の細胞／群）。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用して、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦのデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。Ａ、Ｂ、ＤおよびＦのスケールバー３０μｍ；Ｃのスケールバー２５μｍ。

【図12】Ａは、ビヒクル処置したＷＴマウス、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスおよび２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日でサンプリング）処置したＧ９３Ａマウス（ｎ＝６／群）からのＳＣにおけるＶＰＳ３５およびβアクチンの代表的なＷＢを示す。ビヒクル処置したＷＴに対する比（平均±ｓ．ｄ．）として報告したノーマライズしたＶＰＳ３５レベルの定量をパネルＢに示す。Ｃは、ビヒクル処置したＷＴマウス、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスおよび２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日でサンプリング）処置したＧ９３Ａマウスから得たＳＣライセートにおけるＶＰＳ２６ｂおよびβアクチンの代表的なＷＢを示す。ビヒクル処置したＷＴに対する比（平均±ｓ．ｄ．）として報告したノーマライズしたＶＰＳ２６ｂレベルの定量をパネルＤに示す（ｎ＝６／群）。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してこれらのデータを解析した。

【図13】パネルＡは、シャムおよびボルテゾミブ（１０ｎＭ、ＢＴＺ）処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞（３×１０^５個の細胞／ウェル）によって表される実験対照ならびにビヒクル処置したＷＴマウス、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスおよび２ａ処置したＧ９３Ａマウス（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日）からの腰部ＳＣ抽出物におけるポリユビキチン化タンパク質の代表的なＷＢを示す。タンパク質負荷のノーマライゼーションは、βアクチンによって行った。パネルＡの黒い境界線は、独立したフィルターから切り取ったレーンを示す。Ｂでは、βアクチンでノーマライズしたレーンの集合密度を定量のために使用した（平均±ｓ．ｄ．、点は個々の動物を表し、データは独立したフィルターからサンプリングした）。Ｃは、ユビキチン（Ｕｂｉ）およびＮｅｕＮ（ｎ＝３／群）を標識したビヒクル処置したＷＴ、ビヒクル処置したＧ９３Ａおよび化合物２ａ処置したＧ９３Ａマウス（１０ｍｇ／ｋｇ、１００日でサンプリング）の腰部ＳＣからの共焦点スタックの最大投影を示す。Ｕｂｉ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８）の、ゲートしたＮｅｕｎ^＋ＭＮの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｄに報告する（矢印は代表的な細胞を示す、ｎ≧３０／群）。落射蛍光スケールを右側のパネルＤに示す。Ｅは、ＮｅｕＮおよびＧＭ１３０を標識した腹部ＭＮの共焦点スタックの最大投影を示す（共焦点顕微鏡での獲得ステップ：０．４μｍ）。各パネルの矢印は、挿入に高倍率で示した領域を示す。ＧＭ１３０領域および分布の定量をパネルＥに示す（ｎ＝４／群、≧３０個の細胞／群）。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用して、パネルＢ、ＤおよびＥのデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃのスケールバー５０μｍ、Ｅのスケールバー２０μｍ。

【図14】パネルＡは、ビヒクルおよび２ａ処置したＧ９３Ａマウスの落下までの時間を示す（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６／群、８３日目から１０３日目まで処置した）。データは、平均±ｓ．ｄ．として報告する。ビヒクルおよびリード２ａ処置したマウスからの腰部ＳＣ抽出物を負荷したブルーネイティブポリアクリルアミドゲルの代表的な免疫ブロットをＢに示す。メンブレンを酢酸中でインキュベートしてタンパク質を固定し、抗ｈｕＳＯＤ１抗体によってプローブした。等量のタンパク質抽出物を平行ＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷し、ニトロセルロースフィルターにブロットし、抗βアクチン抗体によってプローブした。黒い境界線は、異なるフィルターから切り取ったレーンをマークする。Ｃは、シャムまたは化合物２ａによって処置したマウスからのＳＯＤ１の変異形態の定量を示す（各点は個々の動物を示す）。パネルＤのヒストグラムは、安定なＮｅｕｒｏ２ａクローン（クローン７Ｂ１１）で測定した、ノーマライズしたｐＨｆｌｕｏｒｉｎ－ＬＣ３を示す。細胞は、４８時間、漸増濃度の化合物２ａ（０．１～１００μＭ）によって処置したが、対照はバフィロマイシンＡ１（２００ｎＭ）およびＴｏｒｉｎ－１（２５０ｎＭ）を使用して確立した。細胞は、フローサイトメトリーによってアッセイし、ｐＨｆｌｕｏｒｉｎ ＬＣ３変化倍率は、未処置の細胞に対して算出した（各群につきｎ＝４、点は単一のウェルを示す）。両側スチューデントのｔ検定を使用してＡの統計的優位性を決定した；マン・ホイットニーのＵ検定を使用してＣの統計的優位性を決定した。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定を使用してＤの統計的優位性を決定した。

【図15】Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（４×１０^４個の細胞／ウェル）は、トランスフェクトした細胞を同定するためにＧＦＰをコードするプラスミド（０．１μｇ／ウェル）と共に、スクランブルプラスミド（０．５μｇ／ウェル、Ａ）またはＶＰＳ３５ ＲＮＡｉプラスミド（Ｓｈ５６、０．５μｇ／ウェル、Ｂ）によってトランスフェクトした。増殖培地は２４時間後に交換して飢餓を誘導し、細胞はＦＢＳフリーの培地中でさらに２４時間維持した。細胞は、画像化の前に３０分間リソトラッカー（７５ｎＭ）とインキュベートした。個々のＧＦＰ^＋細胞におけるリソトラッカーカバー領域の定量（平均パーセンテージ±ｓ．ｄ．）はマージした共焦点画像で行い、データをＣに示す（ｎ＝１５個の細胞／群、３回の独立した実験）。スクランブルまたはＳｈ５６プラスミド（２μｇ／ウェル、４８時間）を受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞（３×１０５個の細胞／ウェル）からのタンパク質ライセートを、トランスフェクションの４８時間後にブロットし、ユビキチンおよびβアクチンを標識した（Ｄ）。各Ｕｂｉタンパク質レーンの集合密度はβアクチンレベルに対して表し、平均値±ｓ．ｄ．をパネルＥのヒストグラムにプロットした（ｎ＝３／群）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（４×１０^４個の細胞／ウェル）は、ＧＦＰ（０．６μｇ／ウェル）をコードするプラスミドまたはＧＦＰ（０．１μｇ／ウェル）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（０．５μｇ／ウェル）を含有するプラスミドのカクテルによってトランスフェクトした。トランスフェクション細胞は２ａ（１０μＭ）またはビヒクルを受け、２４時間後、それらを飢餓させ、さらに２４時間、２ａを含むまたは含まないＦＢＳフリー培地中で維持した。細胞は、画像化の前に３０分間リソトラッカー（７５ｎＭ）とインキュベートした。Ｆは、ＧＦＰおよびリソトラッカーを標識した細胞の代表的なマージした共焦点画像を示す。各群におけるリソトラッカーカバー領域の定量（平均パーセンテージ±ｓ．ｄ．）をパネルＧに示す（ｎ≧１５個の細胞、３回の独立した実験）。両側スチューデントのｔ検定を使用してパネルＣおよびＥの統計的優位性を決定した。一元配置分散分析後にテューキーの多重比較試験を使用してパネルＧにプロットしたデータを解析した。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー１０μｍ。

【図16】図１６は、ＣＮＩ－１４９４がＶＰＳ３５を調節しないことを示す図である。パネルＡは、ＣＮＩ－１４９３の分子構造を示す。パネルＢは、４８時間、ＣＮＩ－１４９３またはＤＧ００４（それぞれ１０μＭ）で処置したＮｅｕｒｏ２ａにおいて測定したＶＰＳ３５の変化倍率を示す。Ｃでは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を受ける１時間前に、Ｒａｗ２６４．７細胞をＣＮＩ－１４９３または２ａ（１０μＭ）で処置する。上澄み液をＬＰＡ送達の４時間後に回収し、標準的なＥＬＩＳＡを使用して放出されたＴＮＦαを検出した。化合物２ａは、ＴＮＦα放出を阻害しなかった。逆に、ＣＮＩ－１４９３は、ＴＮＦα発現を著しく鈍化した。データは、平均値（±ｓ．ｄ．）として表す（各実験につきｎ＝３）。独立した実験から、一元配置分散分析後にテューキーの多重比較検定により解析した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図17】パネルＡおよびＢは、対照（Ａ）およびＡＬＳ（Ｂ）からのＳＣ生検の腹側角からの代表的な切片におけるアルファ－ＭＮでのＶＰＳ３５免疫反応性を示す。ＣおよびＤは、対照（Ｃ）およびＡＬＳ患者（Ｄ）からの隣接する切片におけるアルファ－ＭＮのＶＰＳ２６を示す。両ＣＲＣタンパク質の免疫組織化学を、５人のＡＬＳ患者および４人の非神経学的対照由来の生検で行った。パネルＥは、健常なボランティア（＃８）およびＡＬＳ患者（＃１３、ＳＯＤ１Ｌｅｕ１４４Ｐｈｅ変異を持つ）からのｉＰＳＣ由来ＭＮの代表的な培養におけるＶＰＳ３５およびＩＳＬＥＴ１の共焦点スタックの最大投影を示す。ｉＰＳＣ由来ＭＮ培養（＃８ ＳＯＤ１Ａｓｎ６５Ｓｅｒ、＃１３ ＳＯＤ１Ｌｅｕ１４４Ｐｈｅ、＃２７ ＳＯＤ１Ａｓｐ９７Ａｓｎならびに年齢および性別が適合する健常ボランティア＃２、＃４および＃８）からのＶＰＳ３５およびβアクチンのＷＢをＦに示す。パネルＧは、リード２ａ（１０μＭ ６日間）ありまたはなしでの、健常ボランティア（＃８）およびＡＬＳ患者（＃２７ ＳＯＤ１Ａｓｐ９７Ａｓｎ）から培養したｉＰＳＣ由来ＭＮにおいて確立されたＶＰＳ３５およびＩＳＬＥＴ１の共焦点スタックからの代表的な横断面を示す。パネルＨは、ビヒクルまたは２ａ（１０μＭ ６日間）で処置したｉＰＳＣ由来ＭＮにおけるＶＰＳ３５およびβアクチンのウェスタンブロットを示す。各レーンは、独立したウェルを表し、定量はパネルのヒストグラムにプロットした。両側スチューデントのｔ検定を使用して、パネルＬおよびＮの統計的優位性を決定した。^＊＊ｐ＜０．０１。スケールバー：Ｈでは１５０μｍ、Ｈ’では２５μｍ、Ｊでは１５μｍ、Ｋでは１０μｍ、Ｍでは２０μｍ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、その態様の１つによれば、式（Ｉ）

【化2】

(I)
（式中、
Ｒ_１は、水素およびハロから選択され；
Ｒ_２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシおよびアルキルから選択され；
Ｒ_３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシおよびアルキル、アラルキル、アリール、－ＣＯＯＲ_８、－ＮＨＣＯＲ_８、－ＮＨＳＯ_２Ｒ_８、－ＣＯＲ_９、－ＮＯ_２およびアミノグアニジル－ヒドラゾンから選択され；
Ｒ_４は、水素およびアルキルから選択され；
Ｒ_５は、水素およびアルキルから選択され；
Ｒ_６は、水素、アルキル、アリールおよびアリールアルキルから選択され；
Ｒ_７は、水素およびアルキルから選択され；
または
Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する２つの窒素原子と共に、イミダゾリノ、テトラヒドロピリミジノおよびベンズイミダゾリノから選択される環を形成し；
または
Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノまたはピペリジノ基を形成し；
Ｒ_８は、水素、置換アルキルおよびアリールから選択され；
Ｒ_９は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）および（ＩＩＩｅ）

【化3】

［式中、アスタリスク（^＊）は、連結する結合を示す］
の基、ならびにその塩および溶媒和物から選択される）
の新規化合物およびその塩に関する。

【0013】

用語「ハロ」は、本明細書では、任意のハロゲン原子、好ましくは塩素および臭素、有利には臭素を示す。

【0014】

用語「アルキル」は、本明細書では、直鎖または分岐鎖で飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピルおよびｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルおよびｔｅｒｔ－ブチルを示す。アルキル基は、好ましくはハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシまたはアミノ基により、任意選択で置換されてもよい。

【0015】

用語「アルコキシ」は、本明細書では、直鎖または分岐鎖で飽和のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびブトキシ基を示す。

【0016】

用語「アリール」は、本明細書では、任意選択で置換されたアリール基、好ましくは、任意選択で置換された単環アリールを示し、ハロゲン原子、直鎖または分岐鎖Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシまたはアミノ基によって任意選択で置換され；前記の任意選択で置換されたアリール基は、好ましくは、フェニルおよびｐ－トリルなどのトリルから選択される。

【0017】

用語「アリールアルキル」は、本明細書では、アルキル残基、好ましくはメチレンにより式（Ｉ）に結合する、任意選択で置換されたアリール、好ましくは任意選択で置換された単環アリール基を指し；好ましいアリールアルキル基はベンジルである。

【0018】

好ましい実施形態により、式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ_１は、水素および臭素から選択され；
Ｒ_２は、水素、臭素、ヒドロキシ、メトキシ、メチル、ｎ－ブチルおよびｎ－ブチルオキシから選択され；
Ｒ_３は、水素、臭素、メトキシ、－ＮＯ_２、フェニル、－ＮＨＣＯＣＨ_３、－ＮＨＣＯ－ｐ－トリル、－ＮＨＳＯ_２ＣＨ_３、－ＮＨＳＯ_２－ｐ－トリル、ＣＯＯＣＨ_３、－ＣＯ－Ｒ_９およびアミノグアニジル－ヒドラゾンから選択され；
Ｒ_４は、水素およびメチルから選択され；
Ｒ_５は、水素であり；
Ｒ_６は、水素、メチル、ｎ－ブチルおよびベンジルから選択され；
Ｒ_７は、水素であり、
または
Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する２つの窒素原子と共に、イミダゾリノ、テトラヒドロピリミジノおよびベンズイミダゾリノから選択される環を形成し；
または
Ｒ_６およびＲ_７は、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノまたはピペリジノ基を形成し；
Ｒ_９は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）および（ＩＩＩｅ）

【化4】

［式中、アスタリスク（^＊）は、連結する結合を示す］
の基から選択される。

【0019】

本発明による好ましい化合物は、
式中：
－ Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ａ）
－ Ｒ_１は臭素であり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｂ）
－ Ｒ_２は臭素であり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｃ）
－ Ｒ_２はヒドロキシルであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｄ）
－ Ｒ_２はメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｅ）
－ Ｒ_２はｎ－ブチルオキシであり、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｆ）
－ Ｒ_３はメチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｇ）
－ Ｒ_３は臭素であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｈ）
－ Ｒ_３はメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｉ）
－ Ｒ_３はニトロであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｊ）
－ Ｒ_３はフェニルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｋ）
－ Ｒ_３はアセトアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｌ）
－ Ｒ_３はｐ－トリルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｍ）
－ Ｒ_３はメシルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｎ）
－ Ｒ_３はｐ－トシルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｏ）
－ Ｒ_３はカルボメトキシであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｐ）
－ Ｒ_３は１－（４’－フェニルピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｑ）
－ Ｒ_３はアミノグアニジルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｒ）
－ Ｒ_６はｎ－ブチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｔ）
－ Ｒ_６はベンジルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｕ）
－ Ｒ_６およびＲ_７は、それらが結合する窒素原子と共に、ピロリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５は全て水素である（化合物２ｖ）
－ Ｒ_３はトシルアミドであり、Ｒ_６はｎ－ブチルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｗ）
－ Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、イミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｘ）
－ Ｒ_４はメチルであり、Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、イミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｙ）
－ Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、ベンズイミダゾリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｚ）、
式（Ｉ）の化合物である。

【0020】

本発明によるさらなる好ましい化合物は、
式中：
－ Ｒ_３はベンジルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ａａ）
－ Ｒ_３は２’－アミノエチルアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｂｂ）
－ Ｒ_３はｐ－メトキシベンズアミドであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｃｃ）
－ Ｒ_３はカルボ（２－アミノエチルオキシ）であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｄｄ）
－ Ｒ_３はカルボ（２－（４’－モルホリニル）エチルオキシ）であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｅｅ）
－ Ｒ_３はＮ，Ｎ－ジエチルアミノカルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｆｆ）
－ Ｒ_３はＮ－モルホリルカルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｇｇ）
－ Ｒ_３は１－（４’－メチルピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｈｈ）
－ Ｒ_３は１－（４’－（３”－ニトロフェニル）ピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｉｉ）
－ Ｒ_３は１－（４’－（４”－メトキシフェニル）ピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｊｊ）
－ Ｒ_３は１－（４’－（４”－クロロフェニル）ピペラジニル）カルボニル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｋｋ）
－ Ｒ_５およびＲ_６は、それらが結合する窒素原子と共に、テトラヒドロピリミジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_７は全て水素である（化合物２ｌｌ）
－ Ｒ_６およびＲ_７は、それらが結合する窒素原子と共に、ピペリジノ基を形成し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５は全て水素である（化合物２ｍｍ）、
式（Ｉ）の化合物である。

【0021】

最も好ましい化合物は、化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｉ、２ｌ、２ｖおよび２ｚである。

【0022】

あらゆるタイプの式（Ｉ）の化合物の塩が、例えば合成ステップにおいてまたは精製上の理由から、調製することができ、全ての塩は本発明の保護の範囲内に含まれる。

【0023】

好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物の塩は、好ましくは薬学的に許容される塩である。

【0024】

式（Ｉ）の化合物は、様々な有機および無機酸により塩を形成することができる。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、メタンスルホン酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸およびその他（例えば、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩等）によって形成されるものを含む。そのような塩は、当業者に公知の通りに形成することができる。

【0025】

好ましい塩は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸および酢酸塩である。

【0026】

式（Ｉ）の化合物は、任意の好適な合成方法によって調製することができる。

【0027】

本開示では、明確に示さない場合でも常に、式（Ｉ）の化合物は、その塩および／または溶解和物の１つの形態であり得る。

【0028】

式（Ｉ）の化合物の任意の可能な立体異性体および可能な結晶形態ならびにそれらの塩または溶媒和物が、本発明の範囲に含まれる。

【0029】

その態様の１つによれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の調製のための方法であって、
式（ＩＶ）

【化5】

(IV)
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は上記に定義した通りである）
の化合物を、
式（Ｖ）

【化6】

(V)
（式中、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_３は上記に定義した通りである）
の化合物またはその塩と好適な溶媒中で反応させるステップ、ならびに
そのようにして得られた式（Ｉ）の化合物を単離するステップ、
任意選択で精製するステップ、および／または
任意選択でそれをその塩もしくは溶媒和物に変換するステップ
を含む、方法に関する。

【0030】

式（ＩＶ）および（Ｖ）の出発化合物は公知の化合物であるか、または当技術分野で公知の方法によって調製されてもよい。

【0031】

それらの調製の例は、以下のスキームおよび実験の節で示す。

【0032】

式（Ｖ）の化合物は、式（ＩＶ）の化合物の少なくとも２倍の量であるモル量で使用される。

【0033】

好ましい実施形態によれば、式（Ｖ）の化合物は、塩化形態、例えば臭化水素酸塩、塩酸塩またはヨウ化水素酸塩の形態で使用される。

【0034】

上記の反応は、４０℃から反応混合物の還流温度の範囲の温度、好ましくは６０℃から反応混合物の還流温度、有利には約８０℃で行われてよい。

【0035】

溶媒は、好ましくは低級アルコール、好ましくはエタノールである。しかしながら、他の溶媒も本発明の方法において使用してよい。

【0036】

好ましくは、触媒量の酸、好ましくは塩酸または酢酸を上記の反応で使用してよい。

【0037】

反応は、数時間、例えば１～１２時間で完了する。当業者は、従来の方法、例えばクロマトグラフ技術、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、反応の発生を完全にチェックすることができる。

【0038】

式（Ｉ）の化合物は、一般的な技術、例えば濾過または反応混合物からの適切な溶媒による抽出によって単離することができる。

【0039】

必要または所望であれば、式（Ｉ）の化合物は、従来の技術、例えばクロマトグラフィー、結晶化等により精製することができる。

【0040】

Ｒ_３がアミノグアニジル－ヒドラゾン基である式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）の化合物の代わりに、式（ＶＩ）

【化7】

(VI)
の化合物を、先に開示した同じ反応条件で、上記のように式（Ｖ）の化合物と反応させることによっても調製することができる。

【0041】

比較例として、
式（ＶＩＩ）

【化8】

(VII)
の化合物を、式（ＶＩＩＩ）

【化9】

(VIII)
の化合物を上記に定義した通りの式（Ｖ）の化合物と上記に開示したのと同じ反応条件で反応させることによって調製した。化合物（ＶＩＩＩ）は、炎症モジュレーターとしてＷＯ９５／１９７６７に開示されている。

【0042】

以下の合成スキームでは、点線は２つの塩化窒素間の電荷の非局在化を示す。

【0043】

合成の試薬および条件は、本明細書の実験の節で示す。
スキーム1

【化10】

試薬および条件：触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、２時間、８９％。
スキーム2

【化11】

試薬および条件：（ａ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、２時間、８９％。
スキーム3

【化12】

試薬および条件：（ａ）ＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３、乾燥ＴＨＦ、Ｎ２、０℃～室温、４８時間、８６％；（ｂ）ＭｎＯ_２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、８６％；（ｃ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４時間、８８％。
スキーム4

【化13】

試薬および条件：（ａ１）ＭｅＩ、Ｋ_２ＣＯ_３、乾燥ＤＭＦ、Ｎ_２、室温、２４時間、６０％；（ａ２）ｎ－ＢｕＢｒ、Ｋ_２ＣＯ_３、乾燥ＤＭＦ、Ｎ２、８５℃、２４時間、７５％；（ｂ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、２時間、７７％（２ｄ）、７９％（２ｅ）または８０％（２ｆ）。
スキーム5

【化14】

試薬および条件：（ａ）ＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３、乾燥ＴＨＦ、Ｎ_２、０℃～室温、４８時間、８０～８８％；（ｂ）ＭｎＯ_２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、７７～９２％；（ｃ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、２～８時間、７７（２ｇ）、８８％（２ｈ）、８１％（２ｉ）または８０％（２ｊ）。

【0044】

化合物２ａａ（Ｒ＝ＣＨ_２Ｐｈ）は、相当する５－ベンジル－フェニル１，３－ジカルボン酸９ａａから出発して、スキーム３に示すように調製することができる。
スキーム6

【化15】

試薬および条件：（ａ）ＰｈＢ（ＯＨ）２、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、２Ｎ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液、ジオキサン、１０５℃、６時間、８２％；（ｂ）ＭｎＯ_２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、８１％；（ｃ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、８時間、７９。
スキーム7

【化16】

試薬および条件：（ａ）ＴＢＤＭＳ－Ｃｌ、１Ｈ－イミダゾール、ＣＨ_２Ｃｌ_２、０℃～室温、３時間；（ｂ）触媒１０％ Ｐｄ／Ｃ、Ｈ_２、ＥｔＯＨ、室温、２４時間、７８％（２ステップ）；（ｃ）アシル化剤、ＴＥＡ、ＤＭＡＰ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、０℃～室温、１～２時間、８９％（１０ｌ）または８０％（１０ｍ）；（ｄ）ＡｃＣｌ、乾燥ＭｅＯＨ、Ｎ_２、０℃、３０分、９４％（８ｌ）または８４％（８ｍ）；（ｅ）ＭｎＯ_２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、８８％（７ｌ）または８３％（７ｍ）；（ｆ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４～６時間、８５％（２ｌ、２ｍ）。

【0045】

化合物２ｂｂ（Ｒ＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）および２ｃｃ（Ｒ＝ｐ－ＯＭｅＰｈ）は、ステップｃにおいて相当するアシル化剤を使用してそれぞれ１０ｂｂおよび１０ｃｃを得て、スキーム７に示すように調製することができる。
スキーム8

【化17】

試薬および条件：（ａ）スルホニル化剤、ピリジン、ＤＭＡＰ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、０℃～室温、１６時間、８５％（２ｏ）；（ｂ）ＡｃＣｌ、乾燥ＭｅＯＨ、Ｎ_２、０℃、３０分、８１％（２ｏ）；（ｃ）ＭｎＯ_２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、６８％（２ｎ、３ステップ）または９０％（２ｏ）；（ｄ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４時間、８３％（２ｌ）または７９％（２ｏ）。
スキーム9

【化18】

試薬および条件：（ａ）１．８Ｍ ＮａＯＨ水溶液、ＭｅＯＨ、室温、２４時間；（ｂ）ＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３、乾燥ＴＨＦ、Ｎ_２、０℃～室温、２４時間、５４％（２ステップ）；（ｃ）ＭｎＯ２、ＣＨＣｌ_３、７０℃、１６時間、８５％；（ｄ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４時間、７１％。

【0046】

化合物２ｄｄ（ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２エステル）および２ｅｅ（Ｒ＝２－モルホリニルエチルエステル）は、化合物７ｐを加水分解し、それをＮ－保護エタノールアミンによってまたはＮ－ヒドロキシエチルモルホリンによってエステル化することにより、スキーム９に示すように調製することができる。
スキーム10

【化19】

試薬および条件：（ａ）ＮａＯＨ、水／ＴＨＦ、室温、２４時間；（ｂ）４－Ｐｈ－ピペラジン、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＴＥＡ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎ２、室温、２４時間、３０％（２ステップ）；（ｃ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４時間、７２％。

【0047】

化合物２ｆｆ（ジエチルアミド）、２ｇｇ（モルホリノアミド）、２ｈｈ（４’－メチルピペラジニルアミド）、２ｉｉ（４’－（３”－ニトロフェニル）ピペラジニルアミド）、２ｊｊ（４’（４”－メトキシフェニル）ピペラジニルアミド）および２ｋｋ（４’－（４”－クロロフェニル）ピペラジニルアミド））は、Ｎ－フェニルピペラジンを適切なアミド化剤で置換することにより、スキーム１０に示すように調製することができる。
スキーム11

【化20】

試薬および条件：（ａ）触媒ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、８０℃、４時間、７８％
スキーム12

【化21】

試薬および条件：（ａ）ｎ－ＢｕＮＨ_２（１４ｔ）、ＢｎＮＨ２（１４ｕ）またはピロリジン（１４ｖ）、ＭｅＯＨ、室温、７２時間、８０％（１４ｔ）、６０％（１４ｕ）または８９％（１４ｖ）；（ｂ）ＥｔＯＨ、８０℃、１６時間、５３％（２ｓ）、７０％（２ｕ）または８０％（２ｔ）。

【0048】

化合物２ｌｌ（ＲＸ＝－ＣＨ_２）_５－）は、ステップａにおいてアミド化剤としてピペリジンを使用して１４ｌｌを産生することにより、スキーム１２に示すように調製することができる。
スキーム13

【化22】

試薬および条件：（ａ）ＥｔＯＨ、８０℃、１６時間、７０％。
スキーム14

【化23】

試薬および条件：（ａ）ＥｔＯＨ、８０℃、１６時間、８２％（２ｘ、２ｙ）。

【0049】

化合物２ｍｍ（ＲＸ＝－（ＣＨ_２）_５－）は、ステップａにおいてアミノグアニジル化剤としてテトラヒドロピリミジン含有アミノグアニジンを使用して２ｍｍを産生することにより、スキーム１４に示すように調製することができる。
スキーム15

【化24】

試薬および条件：（ａ）触媒ＡｃＯＨ、ＥｔＯＨ、８０℃、２時間、６６％。

【0050】

治療および診断における、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩の使用は、本発明のさらなる主題である。

【0051】

式（Ｉ）の化合物、特に上記の好ましい化合物は、興味深いレトロマー安定化剤活性を示し、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびその他の神経疾患など、レトロマー安定化活性が有益であるいくつかの神経疾患の処置および予防において有用である。

【0052】

治療におけるそれらの使用のため、式（Ｉ）の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の１つは、好ましくは医薬組成物の形態で投与される。

【0053】

本発明は、その態様の１つによれば、式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の１つを、好ましくは少なくとも１つの薬学的に許容される担体および／または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物に関する。

【0054】

本発明の組成物は、本発明の化合物がその意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる全ての組成物を含む。各個人のニーズは多様であるが、各成分当たりの有効量の最適範囲を決定することは、当業者に公知である。したがって、投与量は、レシピエントの年齢、健康および体重、処置のタイプ、処置の頻度、および所望の効果の性質による。

【0055】

典型的には、化合物は、処置される哺乳動物の体重１ｋｇあたり１～１００ｍｇ、またはその薬学的に許容される塩の１つのその等量の用量で、哺乳動物、特にヒトに、毎日、経口投与することができる。好ましくは、約１～１００ｍｇ／ｋｇが毎日投与される。筋肉内投与では、用量は通常、経口用量の半分である。例えば、許容される筋肉内用量は、約０．５～５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．１～１０ｍｇ／ｋｇである。

【0056】

好ましくは、組成物は、経口および非経口経路によって投与することができ、当業者に公知のものであり、例えばそれらは、錠剤、糖衣錠、持効性放出ピルおよびカプセル、うがい薬、ゲル、液体懸濁液、染毛剤、整髪用ジェル、シャンプー、ならびに座薬などの直腸に投与することができる他の製剤であり、非経口、局所または経口投与のための許容される溶液の形態であり、約０．０１～９９％、好ましくは０．２５～７５％の活性成分を含有する。

【0057】

医薬組成物は、所望の目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、バッカル、髄腔内、頭骸内、鼻腔内または経口であってよい。

【0058】

本発明の医薬製剤は、例えば、従来の混合、顆粒化、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスによって、当業者に公知のようにして産生される。したがって、経口使用のための医薬製剤は、活性成分を固体賦形剤と組み合わせることにより、また任意選択で、所望および必要であれば錠剤または糖衣錠のコアを得るために好適な賦形剤を添加した後、生じた混合物を粉砕し顆粒混合物を処理することにより、得ることができる。

【0059】

特に、好適な賦形剤は、糖、セルロースおよびリン酸カルシウムなどの希釈剤および充填剤、ならびに例えばデンプン、ゼラチン、セルロースおよびポリビニルピロリドンなどの結合剤である。所望であれば、脱凝集剤は、上述のデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガーおよびアルギン酸、ならびにその塩として添加することができる。他の有用な賦形剤は、流動性剤および滑剤、例えばシリカ、滑石、ステアリン酸およびその塩、ならびにポリエチレングリコールである。ピルおよび錠剤のコアは、所望であれば、消化液に耐性である好適なコーティングを有することができる。消化液に耐性のコーティングを産生するため、当業者に周知のように好適なポリマーを使用することが可能である。

【0060】

経口で使用することができる他の医薬組成物は、ゼラチンで作られた硬カプセル剤のほか、ゼラチンおよび例えばグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた密封された軟カプセル剤を含む。硬カプセル剤は、希釈剤、結合剤および／または滑剤ならびに任意選択で安定化剤と混合することができる顆粒の形態の活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性成分は、好ましくは好適な液体、例えば脂肪油または液体パラフィン中に溶解または懸濁される。さらに、安定化剤を添加することができる。

【0061】

直腸に使用することができる見込みのある医薬組成物は、例えば、１つまたは複数の活性成分と、好適な賦形剤との組合せからなる座薬を含む。そのような好適な賦形剤は、例えば天然もしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン系炭化水素である。

【0062】

非経口投与に好適な製剤は、可溶な形態の、好ましくは水に可溶な形態の活性成分の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液、例えば、好適な注射可能油の懸濁液を投与することができる。好適な親油性溶媒または担体は、脂肪油または合成脂肪酸のエステルを含む。水溶液注入は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばソルビトールまたはデキストランを含有することができる。任意選択で、懸濁液は、安定化剤を含有することもできる。

【0063】

医薬組成物で投与されるのに加えて、上記の式（Ｉ）の化合物は、純粋な化合物としても投与することができる。

【0064】

本発明は、別のその態様によれば、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびその他の神経疾患など、レトロマー安定化活性が有益であるいくつかの神経疾患の処置および／または予防における、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の１つの使用に関する。

【0065】

本発明は、別のその態様によれば、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー（Ａｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびその他の神経疾患など、レトロマー安定化活性が有益であるいくつかの神経疾患の処置および／または予防における、本発明の医薬組成物の使用に関する。

【0066】

本発明は、別のその態様によれば、レトロマー安定化剤としておよび神経保護薬としてのその使用のための、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

【0067】

本発明は、別のその態様によれば、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびその他の神経疾患など、レトロマー安定化活性が有益であるいくつかの神経疾患の処置および／または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の１つ、または本発明に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。

【0068】

治療、特に上記に開示したものなどの神経疾患の処置および／または予防において、式（Ｉ）の化合物は、単独で、または、式（Ｉ）の別の化合物ならびに／または前記処置および／もしくは予防において有用な別の治療剤と組み合わせて、投与することができる。

【0069】

本発明は、別のその態様によれば、診断における式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の１つの使用に関する。

【0070】

本発明は、別のその態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の１つを含む診断ツールに関する。

【0071】

限定ではなく例示する目的で、本発明を以下の実験節でさらに開示する。

【0072】

実験節
アミノグアニジンヒドラゾンの生化学的検討
いくつかの実験的証拠は、特に加齢性の神経変性障害において、レトロマーが神経保護的な役割を有することを示す。例えば、この老齢の多量体の崩壊は、パーキンソン病（ＰＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）を含む多くの疾患で観察された（Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｐｅｔｓｋｏ ２０１５）。ＰＤでは、ＶＰＳ３５（Ｄ６２０Ｎ）の変異は、疾患の遅発性形態で優勢である（Ｖｉｌａｒｉｎｏ－Ｇｕｅｌｌ，Ｗｉｄｅｒら ２０１１）。さらに、ＶＰＳ３５レベルは、ＡＤに対して選択的に弱い脳領域において著しく減少する（Ｓｍａｌｌ，Ｋｅｎｔら ２００５）。

【0073】

したがって、ＶＰＳ３５のレベル、その結果レトロマー複合体を著しく増加することができる本発明に従って合成された新規の薬理学的シャペロンは、それらの神経保護効果を試験するのに有望な化合物である。本発明の大半の合成アミノグアニジンヒドラゾンを機能的にスクリーニングし、レトロマー複合体へのそれらの効果を決定するため、本発明者らはＮｅｕｒｏ２ａ細胞を１０μＭの濃度で各合成分子とインキュベートした。インキュベーションの４８時間後にＶＰＳ３５レベルを効果的に、および用量依存的に増加した標準化合物Ｒ５５（Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｂｅｒｍａｎら ２０１４）を使用して各実験に対照を含めた（図１Ａ、Ｂ）。

【0074】

試験は、本発明の各試験化合物につき３回実行し、細胞ライセートを４８時間のインキュベーション後に確立し、ＶＰＳ３５のレベルをウェスタンブロットによりハウスキーピング遺伝子βアクチンでノーマライズした。本発明者らは、化合物中に予備的ＳＡＲを観察した。

【0075】

本発明のほとんどの試験化合物は、ＶＰＳ３５のレベルを増加することができたが、一定の変異性を伴う。特に、化合物２ａは、複製中にわずかな変動でＶＰＳ３５レベルを一貫して増加することができた（表１）。

【0076】

表１は、４８時間、１０μＭで各化合物を受ける独立した培養（ｎ＝３）からの平均変化倍率±ｓ．ｄ．を示す。変化倍率は、ビヒクル処置した細胞で測定されたノーマライズしたＶＰＳ３５レベルで算出される。

【表1】

x:単回実験、標準偏差なし

【0077】

比較として、化合物（ＶＩＩＩ）も上記と同じ条件で試験した。試験の結果を表２に報告する。

【表2】

x:単回実験、標準偏差なし

【0078】

筋萎縮性側索硬化症におけるレトロマーレベル
レトロマーの役割は、いくつかの神経変性疾患で評価されるが（Ｓｍａｌｌ，Ｋｅｎｔら ２００５；Ｖｉｌａｒｉｎｏ－Ｇｕｅｌｌ，Ｗｉｄｅｒら ２０１１）、ＡＬＳではいずれの推定される役割についても公知ではない。ミスフォールドした凝集タンパク質は、運動神経（ＭＮ）細胞死をもたらす発症機序に関係すると考えられる（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ １９９９）。例えば、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）は、多くの孤発性ＡＬＳ患者においてユビキチン化含有物のコア成分として同定される（Ａｒａｉ，Ｈａｓｅｇａｗａら ２００６）。レトロマーは、患者の脳におけるアミロイドベータプラークおよびＡβタンパク質の凝集を特色とするＡＤに関与し、ならびにＶＰＳ３５における変異は、常染色体優性のＰＤ患者において同定される（ＭａｃＬｅｏｄ，Ｒｈｉｎｎら ２０１３）。

【0079】

本発明者らは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａを持つマウス（マウス株Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ、以降Ｇ９３Ａ）およびそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔（Ｇｕｒｎｅｙ，Ｐｕら １９９４）のＭＮにおけるＶＰＳ３５レベルを決定した。本発明者らは、前臨床のＧ９３Ａ（３０日、６０日および９０日）マウスの腰髄（ＳＣ）におけるＶＰＳ３５免疫反応性をスコア化した。切片をマーカーＮｅｕＮによって二重標識し、ＭＮを同定した（図２Ａ）。ＶＰＳ３５は、層ＩＶ－Ｖの皮質興奮性神経細胞において優先的に発現されるが、抑制性神経細胞は、このタンパク質を低レベルで発現する（Ｗｅｎ，Ｔａｎｇら ２０１１）。同様に、ＷＴ脊髄において、本発明者らは、真に良質な腹部ＭＮにおけるＶＰＳ３５免疫反応性を観察した。興味深いことに、ＶＰＳ３５発現レベルは、Ｇ９３Ａ ＭＮにおいて大幅に減少した（図２Ａ）。３０日および６０日目に、Ｇ９３Ａマウスは無症状であり（Ｇｏｗｉｎｇ，Ｐｈｉｌｉｐｓら ２００８）、ＭＮは本発明者らが神経細胞マーカーＮｅｕＮを使用して示したようにまだ退化しない。したがって、ＶＰＳ３５の欠損は、ＭＮの一般的な欠損に寄与しなかった。本発明者らは、次いで、レトロマーのＣＲＣメンバーが、Ｇ９３ＡマウスのＶＰＳ２６およびＮｅｕＮを二重標識した平行切片において低減されることを確認した（図２Ｂ）。興味深いことに、ＶＰＳ３５およびＶＰＳ２６タンパク質レベルの減少は、それらのｍＲＮＡレベルの減少に由来しなかった（図２Ｆ）。本発明者らは、次に、前臨床および臨床Ｇ９９３Ａマウスの腰髄からの総タンパク質抽出物のウェスタンブロッティングにより、本発明者らの観察を確証した。また、この実験において、本発明者らは、ＶＰＳ３５レベルがＧ９３Ａの遺伝的背景で著しく減少したことに気が付いた（図２Ｃ）。同様に、ＶＰＳ２６ｂならびにＶＰＳ２９のレベルは、１００日目にサンプリングしたＧ９３Ａの腰部ＳＣからのタンパク質抽出物において著しく減少した（図２ＤおよびＥ）。

【0080】

レトロマー安定化は、Ｇ９３Ａトランスフェクト細胞の細胞生存を増加する。
ゴルジ装置の病理学的変更、例えばその断片化は、ＡＬＳを含む多くの神経変性障害で記載されている。ＳＯＤ１のＧ９３Ａ変異型形態をコードするプラスミドによってトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２ａ細胞は、ゴルジ輸送の変更を示す（Ｓｏｏ，Ｈａｌｌｏｒａｎら ２０１５）。同じように、ゴルジ断片化は、ＡＬＳマウスにおいて神経筋の神経除去および軸索後退を進行する（ｖａｎ Ｄｉｓ，Ｋｕｉｊｐｅｒｓら ２０１４）。本発明者らは、化合物２ａ（１０μＭ）の存在下または不在下で、ヒトＳＯＤ１遺伝子のＧ９３Ａ変異形態（以降Ｇ９３Ａ）をコードするプラスミドによってＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトした。４８時間後に細胞を回収し、Ｇｏｌｇｉｎ－９７で標識し、トランス－ゴルジの分布をスコア化した。未処置の細胞およびＧＦＰをコードする対照のプラスミドを受ける細胞は、Ｇｏｌｇｉｎ－９７のコンパクトな分布を示したが、ゴルジ複合体の部分的または完全な断片化を示す細胞のパーセンテージはＧ９３Ａプラスミドによってトランスフェクトした細胞において大きく増加した。しかしながら、化合物２ａの投与は、これらのパーセンテージを著しく低下させ、対照細胞において観察されるＧｏｌｇｉｎ－９７分布を再構成する（図３Ａ）。注目すべきことに、Ｇ９３Ａプラスミドを受ける細胞におけるゴルジの断片化は、Ｇｏｌｇｉｎ９７発現レベルによらなかった（図３Ａ）。本発明者らは、ゴルジ断片化が、この細胞株において細胞死を悪化させ得ると考察した。したがって、本発明者らは、Ｇ９３ＡプラスミドによってトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２ａの細胞生存をアッセイした。したがって、Ｇ９３Ａプラスミドによって、またはＬａｃＺをコードする対照プラスミドによって細胞をトランスフェクトした。本発明者らはまた、１０μＭの化合物２ａが細胞において毒性効果を引き起こさなかったことをアッセイした。細胞生存率は、未処置の細胞と比較した場合、対照間－すなわちＬａｃＺプラスミドまたは化合物２ａを受ける細胞で類似していた。一方、Ｇ９３Ａプラスミドの過剰発現はＮｅｕｒｏ２ａ細胞の生存に影響した。化合物２ａの投与は、この表現型を著しく回復した（図３Ｂ）。次に、本発明者らは、化合物２ａを受ける細胞において本発明者らが観察した細胞生存のレスキューがレトロマーの機能性により得るかどうか調べた。本発明者らは、さらなる実験を実施し、本発明者らは、レトロマーの安定化を促進するために化合物２ａを使用する代わりに、ＶＰＳ３５をコードするプラスミドによって細胞をトランスフェクトした。本発明者らは、ＶＰＳ３５をコードするプラスミドありまたはなしでＧ９３ＡプラスミドによってＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトした。予測した通り、細胞生存率は、Ｇ９３Ａプラスミドを受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞では減少したが、Ｇ９３ＡプラスミドとＶＰＳ３５プラスミドの両方によってトランスフェクトした細胞は細胞生存率が著しく増加した。

【0081】

次に、本発明者らは、Ｇ９３Ａプラスミドも受けた細胞におけるＶＰＳ３５レベルを減少させる最終目的で、さらなるプラスミドを使用して、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５低分子干渉を実施した。本発明者らは、まず、ＶＰＳ３５発現を阻害するプラスミドの有効性を確立した。本発明者らは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞においてＶｐｓ３５ ｍＲＮＡを干渉するように設計された３つの異なる市販のプラスミドをトランスフェクトした。それら全てがＶＰＳ３５レベルを減少させることができるが、Ｓｈ５６プラスミドはＶＰＳ３５ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの６０％減少をもたらした（図４Ａ～Ｃ）。さらに、ＶＰＳ３５の免疫蛍光は、Ｓｈ５６－ＲＮＡｉプラスミドによってトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５免疫反応性の大幅な減少を示した（図４Ｅ）。

【0082】

次に、本発明者らは、Ｓｈ５６またはスクランブルプラスミドと一緒にＧ９３ＡによってＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトした。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５レベルの単純な減少は、それらの生存に影響しなかった。予想した通り、細胞生存は、Ｇ９３Ａプラスミドを受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞で減少した（図３Ｄ）。興味深いことに、Ｇ９３Ａトランスフェクト細胞においてＳｈ５６によりＶＰＳ３５レベルを低下させることは、細胞生存をさらに低下させ、とりわけ化合物２ａのこの表現型を回復する能力に大幅に影響した（図３Ｄ）。

【0083】

次に、本発明者らは、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイにより、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出を測定することにより細胞毒性をアッセイした。細胞を、化合物２ａありまたはなしで、Ｇ９３ＡおよびＳｈ５６－ＲＮＡｉ配列をコードするプラスミドによって処置したが、上澄み液を使用してＬＤＨ含量を測定した。ＬａｃＺコードプラスミドまたはＬａｃＺ＋Ｓｈ５６プラスミドによってトランスフェクトした細胞と比較した場合、Ｇ９３Ａの過剰発現は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞によるＬＤＨの放出を増加した（図３Ｅ）。化合物２ａは、Ｇ９３Ａプラスミドによってトランスフェクトした細胞においてＬＤＨ放出を著しく減少させた。一方、細胞がＳｈ５６プラスミドと一緒にＧ９３Ａプラスミドを受けた場合、ＬＤＨ放出が増加した。興味深いことに、ＬＤＨの高い放出は、Ｇ９３ＡプラスミドおよびＳｈ５６プラスミドによってトランスフェクトし、化合物２ａによって処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞において観察され、レトロマー複合体を標的化することにより２ａがＳＯＤ１^Ｇ９３Ａ－媒介細胞毒性に対抗することをさらに確認した（図３Ｅ）。

【0084】

化合物２ａは、インビトロでレトロマー複合体の安定性を増加する。本発明者らは、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）追跡アッセイによりＶＰＳ３５の分解速度を測定することによりこの概念をさらに立証した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、２４時間、ビヒクルまたはリード２ａ（１０μＭ）を受け、次いでＣＨＸを培地に添加し、ウェスタンブロットによりＶＰＳ３５レベルを測定した。本発明者らは、ビヒクル処置した細胞が、ＣＨＸ処置の８時間後にＶＰＳ３５レベルの低下（～４０％）を示したことを観察した。逆に、リード２ａによって前処置した細胞は、ＶＰＳ３５を分解から保護した（図５Ａ、Ｂ）。Ｒ５５（Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｂｅｒｍａｎら ２０１４）と同様に、化合物２ａは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＣＲＣ遺伝子の転写レベルに影響しない。したがって、Ｖｐｓ３５、Ｖｐｓ２６およびＶｐｓ２９のｍＲＮＡレベルは、４８時間２ａ（１０μＭ）によって処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞において変化しなかった（図５Ｃ）。

【0085】

次に、本発明者らは、化合物２ａが脳の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるかどうか調べた。本発明者らは、化合物２ａの腹腔内注射を毎日受けたＣ５７ＢＬ６Ｊマウスにおいて薬物動態アッセイを実施した（１０ｍｇ／Ｋｇ／日）。マウスは、１、７、１５および３０日後に屠殺され、マススペクトロメトリーによる化合物２ａレベルの決定のために使用した血液循環および脳に含有される化合物のＣＮＳ夾雑を避けるために生理食塩水灌流した。本発明者らは、脳において著しい量の化合物２ａを検出し、化合物２ａのＣＮＳを通過する能力を確認した（図６Ａ）。次に、本発明者らは、レトロマー安定化が化合物２ａ処置に応答して生じるかどうかインビトロで調べた。本発明者らは、上記のように成体Ｃ５７ＢＬ６ｊマウスにＲ５５および化合物２ａを腹腔内に注射した。１週間後、マウスを屠殺し、タンパク質抽出物をウェスタンブロットによってアッセイした。Ｒ５５による処置は、ＳＣ抽出物におけるＶＰＳ３５レベルを増加させなかったが、化合物２ａはそのようなレベルを著しく増加させ（およそ１．７、図６Ｂ）、レトロマー複合体を安定化する化合物２ａの能力をさらに確認した。

【0086】

これら全ての実験において、本発明者らは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における細胞毒性、ならびに化合物２ａを注射したマウスにおけるいずれの有害事象も観察しなかった。にもかかわらず、本発明者らは、化合物２ａの細胞毒性を評価し、漸増濃度の２ａに曝露したＮｅｕｒｏ２ａ細胞の細胞生存を測定した。算出したＬＤ_５０は、～２６０μＭであり（図７Ａ）、本発明者らのインビトロ実験においてレトロマーを安定化するのに必要な濃度よりもずっと高い値であった。本発明者らのアプローチの最終目的は、ＡＬＳ ＭＮにおいて、または一般に、レトロマー発現が大幅に低下した神経細胞において、レトロマーを安定化することである。したがって、本発明者らは、Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＭＥＡ）装置と併せて、一次神経細胞培養を使用することにより神経細胞における化合物２ａ毒性を調べた。マウスＥ１６．５大脳皮質からの神経細胞をＭＥＡにプレートし、１４日間培養で維持し、自然発火活性の発生を可能にした。本発明者らは、漸増濃度の２ａを受ける神経細胞においてスパイクを記録した（１～１００μＭ、図７Ｂ、Ｃ）。低濃度の化合物２ａは、神経細胞発火を変更しなかったが、神経細胞が最高濃度の２ａとインキュベートされた場合、本発明者らは、わずかに、顕著ではないスパイクの減少を観察した（図７Ｄ）。これらの結果を合わせると、ＶＰＳ３５レベルを増加するのにインビトロで必要な低μＭレトロマー影響濃度を考慮して、リード２ａの広い治療濃度域を示す。

【0087】

本発明者らは、ＤＮＡ断片化および細胞死をもたらすＨ_２Ｏ_２誘導性染色体切断に基づくアッセイで、化合物２ａの特異性を試験した。原理的には、そのようなＤＮＡ損傷は、レトロマーによって影響されないプロセスによる細胞死の原因である。したがって、本発明者らのリードは、Ｈ_２Ｏ_２を受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞の細胞生存率を調節できないはずである。本発明者らは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、化合物２ａ、２ｃ、２ｄおよび２ｇ（１０μＭ）と共に２００μＭのＨ２Ｏ２とインキュベートした。本発明者らの化合物ありまたはなしでＨ_２Ｏ_２を受ける細胞間での細胞生存の比較は、いずれの顕著な差も生じず（図７Ｅ）、本発明者らのリードがレトロマーを操作し、当然、ＤＮＡ断片化によって引き起こされる細胞死を防止しないという考えをさらに確証する。これらの結果を合わせると、ゴルジのＧ９３Ａ媒介性の変更ならびにＮｅｕｒｏ２ａ細胞で観察される細胞死亡率の増加は、レトロマー複合体に特異的に作用する薬理的なシャペロン２ａにより対抗されることを示す。最後に、本発明者らはまた、化合物２ａがマウスのＢＢＢを通過することができることを実証した。

【0088】

化合物２ａは、Ｇ９３Ａマウスにおける臨床機能障害およびＭＮ細胞死を弱める。
化合物２ａがＢＢＢを通過することが確立されたため、本発明者らは、ＳＯＤ１のＧ９３Ａ変異形態を持つマウスの処置を開始した。３０日から開始して、Ｇ９３ＡマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔に、化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを毎日注射した。２ａを受けるマウスは、ビヒクル処置を受けるマウスと比較した場合、わずかな体重減少を示したが、そのような減少は統計的優位性には達しなかった（図８Ａ）。しかしながら、２ａを受けるＧ９３Ａは、加速するロータロッド試験における落下するまでの時間の増加により表される運動パフォーマンスの大幅な改善を示した。実際、８０日から開始して、落下するまでの時間は、ビヒクル処置したＧ９３Ａでは次第に低下した。実際、本発明者らは、５０日で記録した値と比較した場合、１００日でこのパラメーターの３０％減少を記録した（図８Ｃ）。２ａを受けるＧ９３Ａマウスは、時間に沿って非常に一定であり、ＷＴマウスで測定した値と重なる運動パフォーマンスを示し、レトロマー複合体の安定化はインビボでの保護効果を促進できることを示す（図８Ｂ、Ｃ）。

【0089】

マウスを１００日目に屠殺し、腰部ＳＣをＭＮ細胞形態学および数についてアッセイした。本発明者らは、まず、ＳＣの腹側角においてＮｅｕＮ^＋神経細胞をスコア化し、真に良質な運動神経細胞をモニターした。化合物２ａを受けるマウスは、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスよりも著しく多くの運動神経細胞を示した（図８Ｄ）。したがって、平行切片におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ^＋（ＣｈＡＴ）運動神経細胞の数をスコア化する類似の結果を観察した（図８Ｅ）。

【0090】

次に、本発明者らは、ＷＴ対照および化合物２ａまたはビヒクルを受けるＧ９３Ａマウスからの坐骨神経の病理組織学的解析を実施した。疾患の進行期と一致して、１００日目のＧ９３Ａマウスは、それらのＷＴ同腹仔と比較した場合、坐骨神経において軸索変性を示した（図９Ａ、Ｂ）。一方、２ａによって処置したＧ９３Ａマウスは、変性を起こしている線維の減少によって表される末梢神経線維の大幅な保護を示した（図９Ｃ、Ｄ）。ミエリン鞘のリポタンパク質に結合するルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）染色を使用して、本発明者らはこれらの神経の矢状切片におけるミエリン形成を解析した。本発明者らは、化合物２ａを受けるＧ９３Ａマウスが、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスと比較した場合、脱髄プロセスの大幅な減衰を示したことを観察した（図１０Ａ～Ｄ）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびミディアムニューロフィラメント（ＮＦ－Ｍ）を標識した平行切片は、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスにおいて異常なミエリンを示したが、化合物２ａの投与は、Ｇ９３Ａマウスのミエリンの完全性を維持した（図１０Ｅ）。したがって、本発明者らは、化合物２ａによって処置したＧ９３Ａマウスの坐骨神経において、線維変性および脱髄の減少を観察した。

【0091】

次に、本発明者らは、ＶＰＳ３５およびＮｅｕＮについて、１００日目に屠殺したマウスのレトロマータンパク質標識切片をアッセイした。腰部腹側角の共焦点スタックの解析は、ＶＰＳ３５の蛍光強度レベル（ＭＦＩとして測定された）が、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスで測定された強度と比較した場合、化合物２ａを受けるＧ９３Ａマウスで大幅に増加したことを明らかにした（図１１Ａ）。同様に、本発明者らはＶＰＳ２６レベルが、化合物２ａを受けるＧ９３Ａマウスで増加したことを観察した（図１１Ｂ）。本発明者らは、化合物２ａがレトロマーの機能性を増加したことを観察する本発明者らの実験的発見をさらに確証した。カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）は、ＶＰＳ２６ノックアウト細胞（Ｓｅａｍａｎ ２００４）で不安定なレトロマー複合体の積荷（Ａｒｉｇｈｉら、２００４）である。本発明者らは、ＷＴ同腹仔と比較した場合、ビヒクル処置したＧ９３ＡマウスのＭＮにおけるＣＩ－ＭＰＲ ＭＦＩレベルの大幅な減少を観察した（図１１Ｃ）。しかしながら、ＭＦＩレベルは、リード２ａによって処置したマウスのＧ９３Ａ ＭＮで大幅に増加した（図１１Ｃ）。ＳｏｒｔｉｌｉｎはＶｐｓ１０ファミリーに属する受容体をコードし、それは前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に関与した（Ｌａｎｅ，２０１２）。Ｓｏｒｔｉｌｉｎは、ＭＰＲと機能的相同性を共有し、脳抽出物においてＶＰＳ３５と免疫共沈降し（Ｍｕｈａｍｍａｄ ２００８）、ＶＰＳ３５ノックアウト細胞において下方制御される（Ｐａｎ ２０１７）、別の重要なレトロマー積荷（Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００１）である。Ｓｏｒｔｉｌｉｎ ＭＦＩレベルは、ビヒクル処置したＧ９３ＡマウスのＭＮにおいて大幅に減少し、したがって、本発明者らが先に観察したＣＩ－ＭＰＲの減少を表す。しかしながら、リード２ａによる処置は、Ｇ９３Ａ ＭＮにおけるＳｏｒｔｉｌｉｎレベルを大幅に増加させた（図１１Ｄ）。

【0092】

次に、本発明者らは、Ｇ９３ＡマウスにおけるカテプシンＤ（ＣＴＳＤ）発現および分布を、このリソソーム酵素の輸送がレトロマー複合体を含むことが公知であるため調べた（Ｓｅａｍａｎ ２００４）。ヒトでは、ＣＴＳＤの成熟は、小胞体においてｐｒｏ－ＣＴＳＤ（５２ｋＤａ）へと変換されるｐｒｅ－ｐｒｏ－ＣＴＳＤから開始する。ｐｒｏ－ＣＴＳＤのリサイクリング、およびその下流の酸性コンパートメントへの異動は、ＣＩ－ＭＰＲおよびレトロマー経路を含む。後期エンドソームでは、ｐｒｏ－ＣＴＳＤは中間形態（４８ｋＤａ）にさらにプロセスされ、最終的にリソソームにおいて成熟ＣＴＳＤ（３４ｋＤａ）に変換される（Ｌａｕｒｅｎｔ－Ｍａｔｈａ ２００６）。ＶＰＳ３５の不活性化またはＶＰＳ２６ノックダウンは、ＣＴＳＤの成熟に影響する。本発明者らは、ビヒクル処置したＷＴ、ビヒクルを受けるＧ９３Ａマウス、およびリード２ａによって処置したＧ９３Ａから得た等量の腰部ＳＣ抽出物におけるＣＴＳＤレベルをスコア化した。本発明者らは、成熟ＣＴＳＤ／ｐｒｏ－ＣＴＳＤ比が、ＷＴ同腹仔と比較した場合、わずかにだが、顕著ではなく、ビヒクル処置したＧ９３ＡマウスのＳＣ抽出物において減少したことを観察した。あるいは、１００日目に、Ｇ９３Ａマウスのグリア細胞が高量の成熟ＣＴＳＤを発現するため、本発明者らは、総タンパク質ライセートにおける成熟ＣＴＳＤの減少を見ることができなかった（図１１Ｅ）。しかしながら、成熟ＣＴＳＤのレベルは、リード２ａ処置したＧ９３Ａマウスにおいて大幅に増加した（図１１Ｅ）。次に、本発明者らは、共焦点顕微鏡によりＭＮにおけるＣＴＳＤレベルを解析した。本発明者らは、ビヒクル処置したＧ９３ＡのＭＮにおけるこのプロテアーゼの著しい減少を観察したが、そのレベルは化合物２ａによって処置したＧ９３Ａマウスにおいて増加した（図１１Ｆ）。同様に、腰部ＮｅｕＮ^＋ＭＮにおけるＣＴＳＤ^＋点の数は、ビヒクル処置したＧ９３Ａ ＭＮで減少したが、それらは化合物２ａ処置したマウスにおいて増加した（図１１Ｆ）。これらのデータは、リード２ａによって媒介されるレトロマー複合体の安定化が、ＳｏｒｔｉｌｉｎおよびＣＩ－ＭＰＲ発現レベルを回復し、ＣＴＳＤの成熟を改善し、したがって、ＡＬＳマウスにおけるリソソームの健康を回復することを示す。

【0093】

最終的に、化合物２ａがレトロマー複合体の安定化を増加できることを証明するため、本発明者らは、ＶＰＳ３５およびＶＰＳ２６についてＳＣ抽出物をプローブした。これらの実験は、Ｇ９３ＡマウスにおけるＶＰＳ３５およびＶＰＳ２６ｂレベルを増加する２ａの能力をさらに確認した（図１２Ａ～Ｄ）。

【0094】

ユビキチン化含有物は、ｓＡＬＳおよびｆＡＬＳ患者のＭＮ、およびＡＬＳマウスの腰部ＳＣに蓄積する（Ｋａｂａｓｈｉ ２００１）。高レベルのユビキチン化タンパク質は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に対するＭＮの対応不可能な応答、ならびにリソソーム機能性の減少を示し得る。本発明者らは、１０％変性ＰＡＧＥにより腰部ＳＣタンパク質抽出物におけるポリユビキチン化タンパク質を特徴付けた。本発明者らは、ポリユビキチン化を増加することができるプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（ＢＴＺ）によって処置したＮｅｕｒｏ２ａ細胞からのタンパク質抽出物を、実験対照として本発明者らの実験に含めた（図１３Ａ）。これらのブロットの濃度測定解析は、ビヒクル処置したＧ９３Ａマウスが豊富なポリユビキチン化タンパク質を表したことを示した。しかしながら、ポリユビキチン化は、化合物２ａによって処置したマウスにおいて大幅に減少した（図１３Ａ、Ｂ）。次に、本発明者らは、Ｇ９２Ａマウスの腹側角ＭＮにおけるユビキチンＭＦＩレベルをスコア化した。ウェスタンブロットによって得られたデータにより、ビヒクル処置したＧ９３Ａ ＭＮにおけるユビキチン蛍光のＭＦＩレベルは、化合物２ａ処置したＧ９３Ａマウスにおいてスコア化されたレベルよりも高く、本発明者らの、および他の結果（Ｓａｘｅｓａ ２００９）をさらに確認した（図１３ＣおよびＤ）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞において先に観察されたように、Ｇ９３Ａプラスミドの過剰発現はゴルジ装置に影響し、したがって本発明者らは、腰部切片のｃｉｓ－ゴルジマトリックスタンパク質ＧＭ１３０を標識することによって、Ｇ９３Ａマウスにおいて同様の変更が生じ得るかどうか調べた。本発明者らは、ビヒクル処置したＧ９３ＡマウスからのＭＮの大部分がＧＭ１３０カバー領域の減少を示し、このオルガネラの断片化を示す可能性があることを観察した（図１３Ｅ）。しかしながら、この現象は、化合物２ａ処置したＧ９３ＡマウスのＭＮにおいて大幅に回復した（図１３Ｅ）。

【0095】

ＳＯＤ１変異は、このタンパク質の細胞内で凝集する傾向を増加した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ２０００）。本発明者らは、化合物２ａがインビボでＧ９３Ａ凝集物の蓄積を減少できたかどうか調べた。出生後８３日で開始し、本発明者らは、化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）を毎日Ｇ９３ＡマウスおよびＷＴ同腹仔に注射した。本発明者らは、１０３日まで、ビヒクルおよび化合物２ａ処置したＧ９３Ａマウスの両方で運動パフォーマンスをスコア化した。化合物２ａを受けるマウスは、本発明者らの先の観察を確認する、運動障害の全体的な減衰を示した（図１４Ａ）。１０３日目に、本発明者らは、ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＳＣタンパク質抽出物を分離し、これらのゲルを抗ＳＯＤ１抗体によってプローブし、本発明者らは、ＷＴ同腹仔では完全に存在しなかった高分子量のスメアをＧ９３Ａマウスにおいて観察した。これらの高分子量の実体の強度は、リード２ａによって処置したマウスでは低かった（図１４Ｂ、Ｃ）。合わせると、化合物２ａによるレトロマー安定化は、インビトロおよびインビボでのリソソームの恒常性を増加させ、タンパク質のポリユビキチン化を減少させ、したがってＧ９３Ａ凝集のレベルを低下させた。

【0096】

これらの結果は、ユビキチン化タンパク質（図１３Ａ、Ｂ）および高分子量ＳＯＤ１凝集物（図１４Ｂ、Ｃ）が両方とも、化合物２ａ処置したマウスにおいて減少することを示す。リソソームの機能性を増加する他に、本発明者らは、化合物２ａがオートファジーシステムも増強できると仮定した。したがって、本発明者らはｐＨｆｌｕｏｒｉｎ－ＬＣ３ベースのアッセイを使用して、生きたＮｅｕｒｏ２ａ細胞においてオートファジープロセスをモニターした。本発明者らは、本研究所において、ｐｈ感受性ＧＦＰ／ｐｈｌｏｕｒｉｎと結合した微小管結合タンパク質１Ａ／１Ｂ－軽鎖３（ＬＣ３）を発現するＮｅｕｒｏ２ａ安定細胞クローン（７Ｂ１１）を確立した。このアッセイは、フローサイトメトリーに基づき、周知のオートファジー阻害剤（バフィロマイシンＡ１）および活性剤（Ｔｏｒｉｎ－１）を使用して確認し、アッセイ活性の上境界および下境界の確立を可能にした（示さない）。さらに、本発明者らは、バフィロマイシンＡ１およびＴｏｒｉｎ－１（示さない）を使用して、Ｚ因子および厳密に標準化された平均差（ＳＳＭＤ）パラメーターを算出する本発明者らのアッセイの質を評価した。

【0097】

Ｎｅｕｒｏ２ａ－７Ｂ１１細胞を、漸増濃度の化合物２ａ（０．１～１００μＭ）ならびに対照分子であるバフィロマイシンＡ１およびＴｏｒｉｎ－１とインキュベートした。４８時間後、ｐｈ感受性であるＧＦＰ／ｐｈｌｕｏｒｉｎシグナルをフローサイトメトリーによって測定し、変化倍率を未処置の細胞に対して算出した。予測通り、本発明者らは、バフィロマイシンＡ１処置により、リソソームによるオートファゴソームの融合をブロッキングする増強した蛍光を観察した。一方、蛍光シグナルは、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤であるＴｏｒｉｎ－１によって著しく弱められた（図１４Ｄ）。ＧＦＰ／ｐｈｌｕｏｒｉｎシグナルは、０．１および１μＭの化合物２ａを受ける細胞において変化しなかったが、本発明者らは、１０および１００μＭで処置した細胞では蛍光レベルの著しい減少を観察した（図１４Ｄ）。１００μＭの化合物２ａを受けた細胞において本発明者らが記録した蛍光のレベルは、０．２５μＭのＴｏｒｉｎ－１によって処置した細胞において測定されたレベルと異ならなかった。したがって、本発明者らは、化合物２ａ処置したマウスにおいて本発明者らが観察したユビキチン化タンパク質の分解の一部は、オートファジーシステムの直接／間接増強を含み得ることを証明した。

【0098】

次に、本発明者らは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＶＰＳ３５レベルの減少が、リソソームの恒常性に影響したかどうか、ＡＬＳマウスモデルにおいて本発明者らおよびその他の発明者らが観察したものを模倣して決定した（Ｃｈｅｎｇ ２０１８）。本発明者らは、Ｓｈ５６ ＲＮＡｉをコードするプラスミドによってＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトし、ＶＰＳ３５を下方制御した。飢餓の２４時間後、本発明者らは、リソトラッカーを使用してリソソームを解析した。本発明者らは、Ｓｈ５６によりＶＰＳ３５干渉した細胞におけるリソソームの拡大した、異常な分布を観察した（図１５Ａ～Ｃ）。次に、本発明者らは、ＶＰＳ３５標的化ＲＮＡｉを受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞においてポリユビキチン化タンパク質レベルが２倍であることを評価し、レトロマーの機能性の欠損がリソソームの恒常性、したがって、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を変えることをさらに示す（図１５Ｄ、Ｅ）。本発明者らは、Ｇ９３Ａプラスミドが、類似のリソソームの変更ももたらすかどうか調べた。本発明者らは、化合物２ａ（１０μＭ）ありまたはなしで、Ｇ９３ＡをコードするプラスミドによってＮｅｕｒｏ２ａ細胞をトランスフェクトした。飢餓の２４時間後、本発明者らは、リソトラッカーによりそのような細胞におけるリソソームをモニターした。Ｇ９３Ａプラスミドのみを受ける細胞は拡大したリソソームを示したが、化合物２ａによる処置は、この表現型を著しく回復した（図１５Ｆ、Ｇ）。

【0099】

本発明者らは、化合物２ａを特徴付ける分子構造が、特許化合物ＣＮＩ－１４９３（Ｎ、Ｎ’－ビス［３，５－ビス［１（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミドテトラヒドロクロリド（ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．１６４３０１－５１－３））によく似ていることを観察した（図１６Ａ）。ＣＮＩ－１４９３は、多発性硬化症の動物モデルにおけるマクロファージ活性化を阻害し、これらのマウスの臨床および病理学的転帰の全般的な改善を生じる（Ｍａｒｔｉｎｅｙ，Ｒａｊａｎら １９９８）。さらに、Ｇ９３ＡマウスへのＣＮＩ－１４９３の投与は、疾患の発症を遅延させ、マウスの寿命を増加させた（Ｄｅｗｉｌ，ｄｅｌａ Ｃｒｕｚら ２００７）。ＣＮＩ－１４９３は、いくつかの障害において神経変性プロセスを伴う有害なシグナルの過多に属する炎症性サイトカインの産生を抑制する。特に、ＣＮＩ－１４９３は、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６ならびにマクロファージ炎症性タンパク質１αおよび１βの発現を阻害する（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｂｌｏｏｍら １９９６）。明らかに、レトロマーを調節するこの化合物の能力はアッセイされていない。本発明者らはまず、ＣＮＩ－１４９３が、１０μＭの濃度で４８時間この化合物によって処置するＮｅｕｒｏ２ａ細胞においてＶＰＳ３５レベルを増加できるかどうか試験した。しかしながら、ＶＰＳ３５レベルはＣＮＩ－１４９３処置細胞において増加しなかったが、そのレベルは化合物２ａによって増加した（図１６Ｂ）。次に、本発明者らは、マウスマクロファージ様細胞株Ｒａｗ２６４．７におけるＬＰＳ媒介ＴＮＦα発現を阻害する化合物２ａの能力をアッセイした。本発明者らは、このサイトカインの産生を鈍らせるＣＮＩ－１４９３の能力を記載するＢｉａｎｃｈｉと同僚によって出版された実験手順に従った（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｂｌｏｏｍら １９９６）。細胞は、ＣＮＩ－１４９３（１０μＭ）とまたは化合物２ａ（１０μＭ）と１時間インキュベートし、次いで本発明者らはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。次に、本発明者らは、ＴＮＦαレベルの評価のために細胞から上澄み液を回収した（ＬＰＳ刺激の４時間後）。ＬＰＳを受けるＲａｗ細胞は効果的にＴＮＦαを誘導したが、ＣＮＩ－１４９３はこのサイトカインの発現を著しく阻害した（図１６Ｃ）。一方、化合物２ａを受けるｒａｗ細胞は、ＴＮＦαのいずれの減少も示さず、２ａがＣＮＩ－１４９３の同じ分子経路を操作しないことを示している。

【0100】

死後のＡＳＬ試料および家族性ＡＬＳ線維芽細胞からのｉＰＳＣ由来ＭＮにおけるＶＰＳ３５発現の欠損
次に、本発明者らは、ヒトＳＣの腹側角に局在する死後の大脳のアルファ－ＭＮにおけるＶＰＳ３５を調べた（図１７Ａ）。ＶＰＳ３５の免疫反応性は、ＡＬＳ検体由来のＭＮにおいて大幅に減少し、Ｇ９３Ａマウスに行われた本発明者らの初期の観察を確認した（図１７Ｂ）。ＶＰＳ２６をプローブした平行切片は、ＡＬＳ試料におけるこのタンパク質の大幅な減少を明らかにした（図１７Ｃ、Ｄ）。

【0101】

次に、本発明者らは、３つのＳＯＤ１遺伝子バリアント（ＡＬＳ８：ｐ．Ａｓｎ６５Ｓｅｒ；ＡＬＳ １３：ｐ．Ｌｅｕ１４４Ｐｈｅ；ＡＬＳ ２７：ｐ．Ａｓｐ９７Ａｓｎ）を持つｆＡＬＳ患者から、ならびに３人の年齢および性別が適合した健常ボランティアからｉＰＳＣ株を生成した。ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－６０およびＳＳＥＡ４の培養を標識して、効率的なリプログラミングを評価した（示さない）。出版されたプロトコールに従って、本発明者らは、ＯＬＩＧ２^＋ＰＡＸ６^－を発現する尾部の神経上皮前駆細胞の表現型を獲得するためにｉＰＳＣ株を誘導した（Ｄｕ ２０１５）。本発明者らは、これらの前駆細胞を分化させ、ＯＬＩＧ２^－ＩＳＬＥＴ１^＋細胞表現型を獲得させた。本発明者らは、核の総数におけるＩＳＬＥＴ１^＋のパーセンテージをスコア化し、本発明者らは、対照およびＡＬＳ試料の間で細胞分化の類似の率を観察した（対照：８１．６％±９；ＡＬＳ：８１．８±１２）。免疫蛍光法およびＷＢを使用して、本発明者らは、３３日目に、ＡＬＳ患者由来のＩＳＬＥＴ１^＋ＭＮにおけるＶＰＳ３５レベルの大幅な減少を観察した（図１７Ｅ、Ｆ）。次に、本発明者らは、１つの対照細胞株（＃８）および１つのＡＬＳ細胞株（ＡＬＳ２７）を選択し、本発明者らの化合物２ａを適用した。本発明者らがＯＬＩＧ２^＋ＰＡＸ６^－前駆細胞を確立すると、本発明者らは、培養培地中にリード２ａ（１０μＭ、６日）を含むこれらの細胞の分化を開始させた。細胞は、ＩＳＬＥＴ１およびＶＰＳ３５を標識し、共焦点顕微鏡により、本発明者らは、化合物２ａありまたはなしでＶＰＳ３５^＋点をスコア化した。ＡＬＳ２７細胞は、対照より少ないＶＰＳ３５^＋点を示したが、リード２ａによって処置した場合、対照とＡＬＳの両方がこの数を著しく増加させた（図１７Ｇ）。次に、本発明者らは、ＷＢにより、ＶＰＳ３５タンパク質レベルを増加する化合物２ａの能力を確かめた（図１７Ｈ）。これらの結果は、２ａがＶＰＳ３５レベルを増加し、したがってヒトレトロマー複合体を安定化するために使用できることを示す。

【0102】

結論
レトロマー複合体は、真核生物で高度に保存され、ＰＤおよびＡＤを含むいくつかの神経変性障害に関連するが、ＡＬＳでは調べられていない。Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスを使用して、本発明者らは、ＣＲＣタンパク質レベルがＡＬＳ運動神経細胞において大幅に減少することを観察した。興味深いことに、そのような減少は疾患の任意の兆候の出現前、とりわけ運動神経細胞変性前に生じる。ＡＬＳ患者からの死後のＳＣで実施した平行実験は、真に良質な運動神経細胞の腹側角におけるＶＰＳ３５およびＶＰＳ２６レベルの減少をさらに示す。これらの結果は、レトロマーの失敗はこれらの細胞の変性を予期することができることを示唆し、したがって、レトロマーの安定化を育成する戦略はＡＬＳにおいて神経保護性であり得る。化合物２ａは、ＶＰＳ３５レベル、結果としてレトロマー機能性を著しく増加することができる。そのような化合物は、インビトロおよびインビボでゴルジ断片化をレスキューし、とりわけＧ９３Ａプラスミドを受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞株における細胞死の率を減少した。本発明者らが化合物２ａをＧ９３Ａマウスに注射する前臨床実験では、本発明者らは、インビボでレトロマー機能性を育成することにより、本発明者らがＭＮ変性、脱髄および末梢線維喪失を減少することができることを観察した。結果として、化合物２ａを受けるＧ９３Ａマウスは、運動パフォーマンスの増加を示す。さらに、運動パフォーマンスの増加は、本発明者らがＭＮにおいてスコア化したＶＰＳ３５およびＶＰＳ２６のレベルの増加により、ならびに２つのレトロマーの積荷、すなわちＣＩ－ＭＰＲおよびＳｏｒｔｉｌｉｎのレベルの増加により表された。本発明者らは、化合物２ａによって処置したＧ９３Ａの脊髄における成熟ＣＴＳＤの大幅な増加も観察した。ＣＴＳＤおよびおそらく他のリソソーム酵素の一般的な増加は、ＡＬＳの病理学的特徴である、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を減少させた。興味深いことに、本発明者らは、これらのマウスにおいて凝集したＳＯＤ１の減少も観察した。これらの知見は、ＡＬＳの処置の新しい道を開く。

【0103】

合成方法
基本手順。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚで、溶媒としてＣＤＣｌ_３、ＣＤ_３ＯＤまたはＤ_２Ｏ中で、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ装置で記録した。^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、１０１ＭＨｚで溶媒としてＣＤＣｌ_３、ＣＤ_３ＯＤまたはＤ_２Ｏ中で記録した。結合定数はＨｅｒｔｚで与えられ、０．１Ｈｚに四捨五入される。ＬＣ－ＭＳデータは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（商標） ＨＳＳ Ｔ３カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．８μｍ）およびＳＱＤ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標） Ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣで回収した。精製は、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌの、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（粒子サイズ６０μｍ、２３０～４００メッシュ）により、またはＢｉｏｔａｇｅ（商標）フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅカラム Ｓｉ－２５－Ｍ（１５０×２５ｍｍ；シリカゲル（４０～６３μｍ）、流速２５ｍＬ／分）］により、またはＢｉｏｔａｇｅ（商標）Ｃ_１８逆相クロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅカラム Ｃ_１８ＨＳ（１５０×２５ｍｍ；ＫＰ－Ｃ_１８－ＨＳ（３５～７０μｍ）、流速２５ｍＬ／分）］により行われた。一部の最終化合物は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅカラム（１９ｍｍ×１５．０ｃｍ。５μｍ）を使用するＣ_１８逆相セミ分取ＨＰＬＣによって精製した。融点は、Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＭＰ３融点装置によって決定した。溶媒は、標準手順に従って蒸留および乾燥させ、無水条件を必要とする反応は、窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。

【0104】

置換イソフタル酸、アルコールへの還元、基本手順Ａ（８ｃ、８ｇ－ｊ、８ｐ）。無水ＴＨＦ（およそ１ｍＬ／ｍｍｏｌ）中の置換イソフタル酸（２．４～３．３ｍｍｏｌ、１当量）の懸濁液を、強く攪拌し、窒素雰囲気過下で０℃に冷却した。ＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ３の溶液（９．６～１３．２ｍＬ、４当量）を、１時間滴下により添加した。反応混合物を室温までゆっくりと温め、さらに４８時間攪拌した。ＭｅＯＨ（７～１０ｍＬ）を反応混合物に滴下により添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。ＭｅＯＨの添加と蒸発を繰り返した（７～１０ｍＬ×３回）。次いで、粗生成物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３（２×２０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）によって洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。生じた固体は、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（溶離液混合物：ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、相当する純粋な置換１，３－ビス－ベンジルアルコールを産出した。

【0105】

置換１，３－ビス－ベンジルアルコール、アルデヒドへの酸化、基本手順Ｂ（７ｃ、７ｇ－ｊ、７ｋ－ｐ）。二酸化マンガン（２．５～１０ｍｍｏｌ、５当量）を、クロロホルム（およそ５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中の置換１，３－ビス－ベンジルアルコール（０．５～２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に強い攪拌下で添加し、反応混合物を還流で加熱した。終夜の還流／攪拌後、反応混合物を室温に冷却し、セライトパッドを通して濾過した。パッドを、ＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）によって徹底的に洗浄し、結合した有機相を真空下で濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（溶離液混合物：ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、相当する純粋な置換イソフタルアルデヒドを産出した。

【0106】

置換イソフタルアルデヒド、アミノグアニジンによる凝縮、基本手順Ｃ（２ａ－ｚ）。アミノグアニジン塩酸塩（１～２ｍｍｏｌ、１当量）および１Ｎ ＨＣｌ水溶液（３～５滴、触媒）を、強く攪拌した無水ＥｔＯＨ（およそ１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）中置換イソフタルアルデヒド（０．５～１ｍｍｏｌ、１当量）の温かい溶液に順に添加した。ＴＬＣモニタリング（８：２ ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ ＡｃＯＨ数滴を含む）しながら、反応混合物を２～８時間還流した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、固体産物を濾過し、冷ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）、Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥し、二塩酸塩として相当する純粋なＮ－非置換１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラジンを産生した。

【0107】

置換イソフタルアルデヒド、Ｎ－置換アミノグアニジンによる凝縮、基本手順Ｄ（２ａ－ｚ）。Ｎ－置換アミノグアニジン塩（０．６～１．８ｍｍｏｌ、１当量）を、強く攪拌した無水ＥｔＯＨ（およそ７．５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中置換イソフタルアルデヒド（０．３～０．９ｍｍｏｌ、１当量）の温かい溶液に添加した。ＴＬＣモニタリング（８：２ ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ ＡｃＯＨ数滴を含む）しながら、反応混合物を８時間還流した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、固体産物を濾過し、冷ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）、Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥し、二塩酸塩として相当する純粋なＮ－非置換１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラジンを産生した（特定の場合では、分取ＨＰＬＣ分離を必要とする）。

【0108】

１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ａ）。表題の化合物（２８０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、８８％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（１０ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（１３４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（２２１ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.26 (bs, 2H, NH), 8.32 (s, 1H, H2), 8.22 (s, 2H, H1', H3'), 8.15-7.58 (bs, 6H, NH), 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 2H, H4), 7.53 (t, J = 7.6 Hz, 1H, H5). ¹³C_NMR (100 MHz, D₂O): δ(ppm) 154.7, 147.3, 133.2, 129.2, 126.6. MS (ESI⁺): m/z 247.30 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₄N₈: 246.28.

【0109】

２－ブロモ－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｂ）。表題の化合物（２８０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、８８％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（９ｍＬ）中の２－ブロモイソフタルアルデヒド（１９７ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（２０５ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.22 (bs, 2H, NH), 8.65 (s, 2H, H1', H3'), 8.38 (d, J = 7.7 Hz, 2H, H4), 8.30-7.60 (bs, 6H, NH), 7.51 (t, J = 7.7 Hz, 1H, H5). ¹³C_NMR (100 MHz, D₂O): δ(ppm) 155.6, 146.7, 132.9, 130.0, 126.9. MS (ESI⁺): m/z 325.29および327.29 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₃BrN₈: 324.18および326.18.

【0110】

１，３－ビス－（ヒドロキシメチル）－４－ブロモベンゼン（８ｃ）。表題の化合物（４５５ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ、８６％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の４－ブロモイソフタル酸（５９０ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（１０ｍＬ、１０．００ｍｍｏｌ、およそ４当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 7.39 (m, 3H, H2, H5, H6), 5.39 (t, J = 5.6 Hz, 2H, OH), 4.52 (d, J 5.6 Hz, 4H, H1', H3'). MS (ESI⁺): m/z 218.12 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₉BrO₂: 217.04.

【0111】

４－ブロモイソフタルアルデヒド（７ｃ）。表題の化合物（１０８ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、８７％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（３ｍＬ）中の８ｃ（１２８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（２５７ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ、５．０当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 10.40 (s, 1H, H1'), 10.06 (s, 1H, H3'), 8.42 (d, J = 2.09 Hz, 1H, H2), 7.98 (dd, J = 2.09 Hz, J = 7.88 Hz, 1H, H6), 7.72 (d, J = 7.88 Hz, 1H, H5). MS (ESI⁺): m/z 214.16 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₅BrO₂: 213.01.

【0112】

４－ブロモ－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｃ）。表題の化合物（１７８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、８８％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の４－ブロモイソフタルアルデヒド（１０８ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１１２ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.40 (bs, 2H, NH), 8.58 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H2), 8.54 (s, 1H, H1'), 8.20 (s, 1H, H3'), 8.20-7.60 (bs, 6H, NH), 7.98 (dd, J = 2.0 Hz, J = 8.4 Hz, H6), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H5). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 157.0, 156.8, 146.3, 145.8, 134.8, 134.7, 133.8, 131.1, 128.5, 126.5. MS (ESI⁺): m/z 315.33および317.33 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₃BrN₈: 324.18および326.18.

【0113】

１－ヒドロキシ－２，４－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｄ）。表題の化合物（２２４ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、７７％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（８ｍＬ）中の７ｄ（１３２ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１９３ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.05 (bs, 2H, NH), 10.95 (bs, 1H, OH), 8.52 (s, 1H, H, H1'), 8.48 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H2), 8.12 (s, 1H, H3'), 8.20-7.40 (bs, 6H, NH), 7.95 (dd, J = 8.6 Hz, J = 1.8 Hz, 1H, H6), 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H5). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 158.8, 155.7, 155.4, 148.4, 147.4, 131.6, 129.4, 126.1, 119.3, 117.7. MS (ESI⁺): m/z 263.37 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₄N₈O: 262.28.

【0114】

４－メトキシイソフタルアルデヒド（７ｅ）。ＭｅＩ（０．１３ｍＬ、２ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４－ヒドロキシイソフタルアルデヒド７ｄ（１５０ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、１．５当量）の攪拌混合物に添加した。反応混合物は、２４時間室温で攪拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＯＨ水溶液（３×２０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下で濾過および濃縮した。４－メトキシイソフタルアルデヒド７ｅ（１０５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、６０％収率）を、さらなる精製をせずに使用するのに十分な純度の白色固体として得た。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.50 (s, 1H, H1'), 10.01 (s, 1H, H3'), 8.35 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H2), 8.12 (dd, J = 2.0 Hz, J = 9.1 Hz, 1H, H6), 7.15 (d, J = 9.1 Hz, 1H, H5), 4.00 (s, 3H, OMe). MS (ESI⁺): m/z 179.21 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₈NO₃: 178.17.

【0115】

１－メトキシ－２，４－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｅ）。表題の化合物（１２６ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、７９％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（４．５ｍＬ）中の４－メトキシイソフタルアルデヒド（７５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１０１ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.12 (bs, 2H, NH), 8.51 (s, 1H, H1'), 8.49 (s, 1H, H2), 8.19 (s, 1H, H3'), 8.20-7.40 (m, 6H, NH), 8.00 (d, J = 6.6 Hz, 1H, H6), 7.12 (d, J = 6.6 Hz, 1H, H5), 3.92 (s, 3H, OMe). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 160.1, 156.9, 147.2, 142.7, 132.2, 127.4, 127.0, 123.0, 114.2, 56.2. MS (ESI⁺): m/z 277.44 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₁H₁₆N₈O: 276.31.

【0116】

４－（ｎ－ブトキシ）イソフタルアルデヒド（７ｆ）。ｎ＝ＢｕＢｒ（０．２２ｍＬ、２ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の７ｄ（１５０ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、１．５当量）の攪拌混合物に添加した。反応混合物は、８５℃に加熱し、２４時間攪拌し、次いで室温に冷却した。溶媒を減圧下で除去した後、粗生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＯＨ水溶液（３×２０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下で濾過および濃縮した。４－（ｎ－ブトキシ）イソフタルアルデヒド７ｆ（１５５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、７５％収率）を、さらなる精製をせずに使用するのに十分な純度の白色固体として得た。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.50 (s, 1H, H'), 10.00 (s, 1H, H3'), 8.35 (d, J = 2.0Hz, 1H, H2), 8.12 (dd, J = 2.0 Hz, J = 9.1 Hz, 1H, H6), 7.15 (d, J = 9.1 Hz, 1H, H5), 4.23 (t, J = 2.4 Hz, 2H, H4'), 1.91 (m, 2H, H4''), 1.56 (m, 2H, H4'''), 1.04 (t, J = 7.8 Hz, 3H, H4''''). MS (ESI⁺): m/z 221.35 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₂H₁₄NO₃: 220.23.

【0117】

１－（ｎ－ブトキシ）－２，４－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｆ）。表題の化合物（１６６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、８０％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の７ｆ（１１０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１１８ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.12 (bs, 2H, NH), 8.51 (s, 2H, H1', H1), 8.16 (s, 1H, H3'), 8.20-7.40 (bs, 6H, NH), 8.00 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H6), 7.12 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H5), 4.15 (t, J = 2.4 Hz, 2H, H4'), 1.80 (m, 2H, H4''), 1.52 (m, 2H, H4'''), 0.99 (t, J = 7.8 Hz, 3H, H4''''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 160.1, 156.9, 147.2, 142.7, 132.2, 127.4, 127.0, 123.0, 114.2, 69.1, 31.3, 19.3, 14.3. MS (ESI⁺): m/z 319.66 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₄H₂₂N₈O: 318.38.

【0118】

１，３－ビス－（ヒドロキシメチル）－５－メチルベンゼン（８ｇ）。表題の化合物（４１０ｍｇ、２．７０ｍｍｏｌ、８１％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の５－メチルイソフタル酸（６００ｍｇ、３．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（１３．３ｍＬ、１３．３ｍｍｏｌ、４当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 6.96 (s, 1H, H2), 6.80 (s, 2H, H4), 4.62 (s, 4H, H1', H3'), 3.81 (s, 3H, Me), 2.11 (s, 2H, OH). MS (ESI⁺): m/z 153.21 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₁₂O₂: 152.19.

【0119】

５－メチルイソフタルアルデヒド（７ｇ）。表題の化合物（１５１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、７７％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（６．５ｍＬ）中の８ｇ（２００ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（５７５ｍｇ、６．６０ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.15 (s, 2H, CHO), 8.25 (s, 1H, H2), 8.00 (s, 2H, H4), 2.53 (s, 3H, Me). MS (ESI⁺): m/z 149.29 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₈O₂: 148.16.

【0120】

５－メチル－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｇ）。表題の化合物（１７９ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、７７％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（７ｍＬ）中の７ｇ（１０４ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１５５ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.25 (bs, 2H, NH), 8.21 (s, 2H, H1', H3'), 8.10 (s, 1H, H2), 8.00-7.50 (bs, 6H, NH), 7.82 (s, 2H, H4), 2.41 (s, 3H, Me). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 156.9, 147.4, 139.9, 135.2, 130.9, 125.5, 21.4. MS (ESI⁺): m/z 261.45 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₁H₁₆N₈: 260.28.

【0121】

１，３－ビス－（ヒドロキシメチル）－５－ブロモベンゼン（８ｈ）。表題の化合物（４７５ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、８８％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の５－ブロモイソフタル酸（６１０ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、およそ４当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 7.43 (s, 2H, H4), 7.28 (s,1H, H2), 4.67 (s, 4H, H1', H3'), 1.79 (s, 2H, OH). MS (ESI⁺): m/z 217.20および219.20 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₉BrO₂: 216.15および218.15.

【0122】

５－ブロモイソフタルアルデヒド（７ｈ）。表題の化合物（９７ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、７６％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（３ｍＬ）中の８ｈ（１２８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（２５７ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.06 (s, 2H, CHO), 8.30 (t, J = 1.4 Hz, 1H, H2), 8.26 (d, J = 1.4 Hz, 2H, H4). MS (ESI⁺): m/z 213.24および215.24 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₅BrO₂: 212.12および214.12.

【0123】

５－ブロモ－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｈ）。表題の化合物（１３３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、９１％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３．５ｍＬ）中の７ｈ（７５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（７８ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.31 (bs, 2H, NH), 8.27 (d, J = 1.2 Hz, 2H, H4), 8.22 (t, J = 1.2 Hz, 1H, H2), 8.17 (s, 2H, H1', H3'), 8.20-7.60 (bs, 6H, NH). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 156.9, 145.8, 137.5, 132.0, 127.8, 124.1. MS (ESI⁺): m/z 327.45および329.45 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₃BrN₈: 324.25および326.25.

【0124】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－メトキシベンゼン（８ｉ）。表題の化合物（３７７ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ、８０％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（２．８ｍＬ）中の５－メトキシイソフタル酸（５５０ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（１１．２ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ、４当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 6.96 (s, 1H, H2), 6.80 (s, 2H, H4), 4.62 (s, 4H, H1', H3'), 3.81 (s, 3H, Me), 2.11 (s, 2H, OH). MS (ESI⁺): m/z 169.21 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₁₂O₃: 168.19.

【0125】

５－メトキシイソフタルアルデヒド（７ｉ）。表題の化合物（２９７ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ、９２％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（１０ｍＬ）中の８ｉ（３３０ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（８２５ｍｇ、９．９５ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.30 (s, 2H, H1', H3'), 7.96 (s, 1H, H2), 7.61 (s, 2H, H4), 3.99 (s, 3H, Me). MS (ESI⁺): m/z 165.29 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₈O₃: 164.16.

【0126】

１－メトキシ－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｉ）。表題の化合物（１６１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、８１％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（６ｍＬ）中の７ｉ（９３ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１２５ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.25 (bs, 2H, NH), 8.22-7.61 (bs, 6H, NH), 8.17 (s, 2H, H1', H3'), 7.83 (t, J = 1.08 Hz, 1H, H2), 7.59 (d, J = 1.08 Hz, 2H, H4), 3.82 (s, 3H, OMe). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 160.3, 155.9, 146.3, 135.7, 120.6, 114.7, 56.2. MS (ESI⁺): m/z 277.47 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₁H₁₆N₈O: 276.30.

【0127】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－ニトロベンゼン（８ｊ）。表題の化合物（５０４ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ、８３％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の５－ニトロイソフタル酸（７００ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（１３．２ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ、４当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 8.16 (s, 2H, H4), 7.72 (s, 1H, H2), 4.83 (s, 4H, H1', H3'). MS (ESI⁺): m/z 184.24 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₉NO₄: 183.17.

【0128】

５－ニトロイソフタルアルデヒド（７ｊ）。表題の化合物（９４ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、７８％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（４ｍＬ）中の８ｊ（１２３ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（２９１ｍｇ、３．３９５ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.21 (s, 2H, H1', H3'), 8.96 (s, 2H, H4), 8.72 (s, 1H, H2). MS (ESI⁺): m/z 180.29 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₅NO₄: 179.14.

【0129】

１－ニトロ－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｊ）。表題の化合物（１５４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、８０％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の７ｊ（９４ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１１７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.44 (bs, 2H, NH), 8.80 (d, J = 1.6 Hz, 2H, H4), 8.75 (t, J = 1.6 Hz, 1H, H2), 8.34 (s, 2H, H1', H3'), 8.25-7.75 (bs, 6H, NH). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 156.0, 149.4, 144.5, 136.3, 132.7, 123.2. MS (ESI⁺): m/z 292.47 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₃N₉O₂: 291.29.

【0130】

１，３－ビス－（ヒドロキシメチル）－５－フェニルベンゼン（８ｋ）。２ＭのＮａ_２ＣＯ_３水溶液（１．８６ｍＬ、３．７２ｍｍｏｌ、３当量）を、窒素雰囲気下において室温で強く攪拌しながら、１，４－ジオキサン（８ｍＬ）中の８ｈ（２７０ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ、１当量）、フェニルボロン酸（１７７ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（１４３ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ、０．１当量）の混合物に添加した。混合物は、加熱還流し、６時間攪拌した。室温に冷却後、次いで反応混合物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）およびブライン（１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：７５：２５ ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、白色固体として純粋な１，３－ビス－（ヒドロキシメチル）－５－フェニルベンゼン８ｋ（２２０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、８６％収率）を生成した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 7.62 (d, J = 7.2 Hz, 2H, H2''), 7.54 (s, 2H, H4), 7.46 (t, J = 7.2 Hz, 2H, H3''), 7.38 (m, 2H, H2, H4''), 4.79 (s, 4H, H1', H3'), 1.86 (bs, 2H, OH). MS (ESI⁺): m/z 215.43 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₄H₁₄O₂: 214.26.

【0131】

５－フェニルイソフタルアルデヒド（７ｋ）。表題の化合物（１３５ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、８１％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（４ｍＬ）中の８ｋ（１７０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（３４３ｍｇ、３．９５ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.21 (s, 2H, H1', H3'), 8.39 (dd, J = 1.5 Hz, 2H, H4), 8.37 (t, J = 1.5 Hz, 1H, H2), 7.71 (dd, J = 8.6 Hz, J = 1.5 Hz, 2H, H2''), 7.54 (dt, J = 8.6 Hz, J = 7.3 Hz, 2H, H3''), 7.48 (dt, J = 7.3 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, H4''). MS (ESI⁺): m/z 211.31 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₄H₁₀O₂: 210.23.

【0132】

５－フェニル－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｋ）。表題の化合物（１９０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、７９％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（６ｍＬ）中の７ｋ（１２７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１３４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.35 (bs, 2H, NH), 8.30-8.25 (m, 5H, H2, H4, H1', H3'), 8.20-7.60 (bs, 6H, NH), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H2''), 7.53 (t, J = 8.4 Hz, 2H, H3''), 7.44 (t, J = 8.4 Hz, 1H, H4''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 156.0, 146.4, 1411.7, 139.3, 135.1, 129.4, 128.5, 127.5, 126.4. MS (ESI⁺): m/z 323.53 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₆H₁₈N₈: 322.38.

【0133】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－ニトロベンゼン（１０ｊ）。１Ｈ－イミダゾール（５００ｍｇ、７．３５ｍｍｏｌ、１．５当量）および８ｊ（４５０ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ、１当量）を、攪拌しながら室温でＣＨ_２Ｃｌ_２（１２ｍＬ）に溶解した。次いで、溶液を０℃に冷却し、ｔ－ブチルジメチルシリルクロリド（９３０ｍｇ、６．１２ｍｍｏｌ、１．２５当量）を単回で添加した。反応混合物を室温までゆっくりと温め、さらに３時間攪拌した。次いで、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（１５ｍＬ）、５％ＮａＯＨ水溶液（１５ｍＬ）およびブライン（１５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。粗製の３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－ニトロベンゼン１０ｊ（９００ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を、黄色油状物として得て、次の反応ステップでさらなる精製をせずに使用した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 8.00 (s, 2H, H4), 7.62 (s, 1H, H2), 4.81 (s, 4H, H1', H3'), 0.98 (s, 18H, t-Bu), 0.1 (s, 12H, Me). MS (ESI⁺): m/z 412.84 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₀H₃₇Si₂NO₄: 411.69.

【0134】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－アミノベンゼン（１１）。１０％ Ｐｄ／Ｃ（８０ｍｇ、触媒）を、無水ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の１０ｊ（７９７ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加し、反応混合物は、２４時間水素雰囲気下において室温で強く攪拌した。次いで、反応混合物は、繰返しの洗浄のため、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を使用してセライトの経路を通して濾過した。減圧下での濃縮後、粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液混合物：ニートのＣＨ_２Ｃｌ_２から９５：５ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ）、淡黄色油状物として、純粋な３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－アミノベンゼン１１（５９１ｍｇ、１．５５９ｍｍｏｌ、２段階で７８％収率）を産出した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 6.68 (s, 1H, H2), 6.59 (s, 2H, H4), 4.65 (s, 4H, H1', H3'), 4.00 (bs, 2H, NH), 0.98 (s, 18H, t-Bu), 0.1 (s, 12H, Me). MS (ESI⁺): m/z 382.82 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₀H₃₉Si₂NO₂: 381.70.

【0135】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－アセトアミドベンゼン（１０ｌ）。ＴＥＡ（０．５５ｍＬ、４ｍｍｏｌ、およそ５当量）および１１（３００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中に攪拌しながら溶解した。次いで、無水酢酸（０．２２ｍＬ、２．３６ｍｍｏｌ、３当量）およびジメチルアミノピリジン（ヘラ先、触媒）を添加し、溶液をさらに２時間室温で攪拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）による希釈後、溶液は５％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－アセトアミドベンゼン１０ｌを、粗製の黄色油状物（３５０ｍｇ）として得て、次の反応ステップでそのまま使用した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 7.33 (s, 2H, H4), 7.28 (bs, 1H, NH), 7.08 (s, 1H, H2), 4.74 (s, 4H, H1', H3'), 2.22 (s, 3H, CO-Me), 0.98 (s, 18H, t-Bu), 0.1 (s, 12H, Si-Me). MS (ESI⁺): m/z 446.88 [M+Na⁺]. 計算値MS, C₂₂H₄₁Si₂NO₃: 423.74.

【0136】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－アセトアミドベンゼン（８ｌ）。化合物１０ｌ（３５０ｍｇ、理論０．７９ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＭｅＯＨ（８ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、塩化アセチル（３０μＬ、０．３９ｍｍｏｌ、およそ０．５当量）を攪拌しながら添加した。反応混合物を、さらに３０分、０℃で攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をアセトン（１０ｍＬ）中で粉砕し、濾過した。固体を冷アセトン（３×８ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、白色固体として純粋な３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－アセトアミドベンゼン８ｌ（１４３ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、２ステップで８４％収率）を生成した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 9.92 (s, 1H, NH), 7.45 (s, 2H, H4), 6.90 (s, 1H, H2), 5.18 (bs, 2H, OH), 4.41 (s, 4H, H1', H3'), 2.00 (s, 3H, CO-Me). MS (ESI⁺): m/z 196.31 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₃NO₃: 195.22.

【0137】

５－アセトアミドイソフタルアルデヒド（７ｌ）。表題の化合物（１０４ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、８８％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（１０ｍＬ）中の８ｌ（１２０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（２６８ｍｇ、３．１０ｍｍｏｌ、５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CD₃CN): δ(ppm) 10.01 (s, 2H, H1', H3'), 8.65 (bs, 1H, NH), 8.72 (s, 2H, H4), 8.02 (s, 1H, H2), 2.09 (s, 3H, CO-Me). MS (ESI⁺): m/z 192.23 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₉NO₃: 191.19.

【0138】

１－アセトアミド－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｌ）。表題の化合物（１６３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、８５％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の７ｌ（９７ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１１３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.18 (bs, 2H, NH), 10.22 (s, 1H, NH), 8.19 (s, 2H, H1', H3'), 8.17 (s, 1H, H2), 8.00-7.75 (m, 6H, NH), 7.94 (s, 2H, H4), 2.08 (s, 3H, CO-Me). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 170.2, 156.8, 147.6, 141.2, 135.6, 122.1, 121.4, 24.4. MS (ESI⁺): m/z 326.40 [M+Na⁺]. 計算値MS, C₁₂H₁₇N₉O: 303.33.

【0139】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－ｐ－トリルアミドベンゼン（１０ｍ）。ＴＥＡ（０．２３ｍＬ、１．６３ｍｍｏｌ、２当量）および１１（３１０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中に０℃で攪拌しながら溶解した。次いで、４－メチルベンゾイルクロリド（０．１４ｍＬ、１．０６ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、溶液をさらに１時間０℃で攪拌した。ＭｅＯＨ（１ｍＭ）によるクエンチングおよびＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）による希釈後、溶液は５％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液混合物：ニートのＣＨ_２Ｃｌ_２から９５：５ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ）、淡黄色の油状物として純粋な３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－アミノ（ｐ－メチルベンゾイル）ベンゼン１０ｍ（２６５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、６７％収率）を産出した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 9.29 (bs, 1H, NH), 7.75 (d, J = 8.2Hz, 2H, H7) 7.59 (s, 2H, H2), 7.18 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H8), 7.01 (s, 1H, H1), 4.64 (s, 4H, H3), 2.27 (s, 3H, H6), 0.82 (s, 18H, H5), 0.00 (s, 12H, H4). MS (ESI⁺): m/z 523.06 [M+Na⁺]. 計算値MS, C₂₈H₄₅Si₂NO₃: 499.84.

【0140】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－ｐ－トリルアミドベンゼン（８ｍ）。化合物１０ｍ（２６０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、塩化アセチル（２０μＬ、０．２６ｍｍｏｌ、およそ０．５当量）を攪拌しながら添加した。反応混合物を、さらに３０分、０℃で攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、粗製の３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－ｐ－トリルアミドベンゼン８ｍ（１４０ｍｇ）を生成し、次のステップでさらなる精製をせずに使用した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 9.40 (bs, 1H, NH), 7.95 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2'') 7.75 (s, 2H, H4), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H3''), 7.12 (s, 1H, H2), 4.64 (s, 4H, H1', H3'), 2.42 (s, 3H, H4''). MS (ESI⁺): m/z 272.48 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₆H₁₇NO₃: 271.32.

【0141】

５－ｐ－トリルアミドイソフタルアルデヒド（７ｍ）。表題の化合物（１１３ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、８３％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（１０ｍＬ）中の８ｍ（１４０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（３４０ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ、１０当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, CDCl₃): δ(ppm) 10.18 (s, 2H, H1', H3'), 9.96 (bs, 1H, NH), 8.73 (d, J = 4.1 Hz, 2H, H4), 8.22 (t, J = 4.1 Hz, 1H, H2), 8.00 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H3''), 2.44 (s, 3H, H4''). MS (ESI⁺): m/z 268.38 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₆H₁₃NO₃: 267.29.

【0142】

１－ｐ－トリルアミド－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｍ）。表題の化合物（６９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、８３％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（４ｍＬ）中の７ｍ（４７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（４１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.15 (bs, 2H, NH), 10.43 (bs, 1H, NH), 8.23 (s, 2H, H1', H3'), 8.20 (s, 1H, H2), 8.17 (s, 2H, H4), 7.95 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.83 (bs, 6H, NH), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H3''), 2.41 (s, 3H, H4''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 165.9, 155.9, 146.6, 142.4, 140.3, 134.8, 131.9, 129.5, 128.2, 122.9, 121.6, 21.5. MS (ESI⁺): m/z 380.50 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₈H₂₁N₉O: 379.43.

【0143】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－メチルスルホンアミドベンゼン（１０ｎ）。ピリジン（０．７２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ、２当量）および１１（１６６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）中に０℃で攪拌しながら溶解した。次いで、４－メチルスルホニルクロリド（５０μＬ、０．６５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、溶液を１時間０℃で、および１５時間室温で攪拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）による希釈後、溶液は水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。粗生成物をシリカゲルで素早く溶出し（溶離液混合物：９８：２ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ）、淡黄色の油状物として粗製の３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－メチルスルホンアミドベンゼン１０ｎ（２００ｍｇ）を産出し、次のステップでさらなる精製をせずに使用した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 8.44 (bs, 1H, NH), 7.12 (s, 2H, H4), 7.01 (s, 1H, H2), 4.64 (s, 4H, H1', H3'), 2.84 (s, 3H, SO₂-Me), 0.83 (s, 18H, t-Bu), 0.00 (s, 12H, Si-Me). MS (ESI⁺): m/z 460.94 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₁H₄₁Si₂NO₄S: 459.80.

【0144】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－メチルスルホンアミドベンゼン（８ｎ）。化合物１０ｎ（２００ｍｇ、理論０．４３ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＭｅＯＨ（８ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、塩化アセチル（２０μＬ、０．２６ｍｍｏｌ、およそ０．７当量）を攪拌しながら添加した。反応混合物を、さらに３０分、０℃で攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、淡い茶色固体として粗製の３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－メチルスルホンアミドベンゼン８ｎ（１００ｍｇ）を生成し、次のステップでさらなる精製をせずに使用した。MS (ESI⁺): m/z 232.41 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₁₃NO₄S: 231.27.

【0145】

５－メチルスルホンアミドイソフタルアルデヒド（７ｎ）。表題の化合物（６５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、３ステップで６８％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（６ｍＬ）中の８ｎ（１００ｍｇ、理論０．４３ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（３００ｍｇ、４．３３ｍｍｏｌ、およそ１０当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 10.02 (s, 2H, H1', H3'), 9.02 (bs, 1H, NH), 8.09 (s, 1H, H2), 8.01 (s, 2H, H4), 3.01 (s, 3H, SO₂-Me). MS (ESI⁺): m/z 228.30 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₉NO₄S: 227.24.

【0146】

１－メチルスルホンアミド－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｎ）。表題の化合物（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、８３％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３．５ｍＬ）中の７ｎ（６５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（６３ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.25 (bs, 2H, NH), 10.01 (s, 1H, NH), 8.24 (s, 1H, H2), 8.21 (s, 2H, H1', H3'), 7.86 (bs, 6H, NH), 7.60 (s, 2H, H4), 3.10 (s, 3H, SO₂-Me). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 155.9, 146.3, 149.6, 135.4, 122.1, 121.4, 39.98. MS (ESI⁺): m/z 340.50 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₁H₁₇N₉O₂S: 339.37.

【0147】

３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－メチルスルホンアミドベンゼン（１０ｏ）。ピリジン（０．７２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ、２当量）および１１（１６６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、１当量）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中に０℃で攪拌しながら溶解した。次いで、ｐ－トシルスルホニルクロリド（１２５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、溶液を１時間０℃で、および６時間室温で攪拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）による希釈後、溶液は飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって脱水し、減圧下で濾過および蒸発させた。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液混合物：ニートのＣＨ_２Ｃｌ_２から９５：５ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ）、白色固体として純粋な３，５－ビス－（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル）－１－ｐ－トリルスルホンアミドベンゼン１０ｏ（１９５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、８６％収率）を産出した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 8.87 (bs, 1H, NH), 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.22 (d, J = 8.2Hz, 2H, H3''), 7.06 (s, 2H, H4), 6.93 (s, 1H, H2), 4.60 (s, 4H, H1', H3'), 2.28 (s, 3H, Ar-Me), 0.85 (s, 18H, t-Bu), 0.00 (s, 12H, Si-Me). MS (ESI⁺): m/z 536.94 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₇H₄₅Si₂NO₄S: 535.89.

【0148】

３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－ｐ－トリルスルホンアミドベンゼン（８ｏ）。化合物１０ｏ（１９５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下で乾燥ＭｅＯＨ（８ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却し、塩化アセチル（１０μＬ、０．１３ｍｍｏｌ、およそ０．４当量）を攪拌しながら添加した。反応混合物を、さらに２時間、０℃で攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルのクロマトグラフにかけ（溶出液混合物：７：３ ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、白色固体として純粋な３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－１－ｐ－トリルスルホンアミドベンゼン８ｏ（９０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、８１％収率）を生成した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 8.72 (bs, 1H, NH), 7.57 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.18 (d, J = 8.2Hz, 2H, H3''), 7.00 (s, 2H, H4), 6.89 (s, 1H, H2), 4.39 (s, 4H, H1', H3'), 4.03 (s, 2H, OH), 2.22 (s, 3H, Me). MS (ESI⁺): m/z 330.41 [M+Na⁺]. 計算値MS, C₁₅H₁₇NO₄S: 307.36.

【0149】

５－ｐ－トリルスルホンアミドイソフタルアルデヒド（７ｏ）。表題の化合物（７９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、３ステップで９０％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（６ｍＬ）中の８ｏ（９０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（２００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ、１０当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 9.95 (s, 2H, H1', H3'), 8.02 (s, 1H, H2), 7.90 (s, 2H, H4), 7.63 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.22 (d, J = 8.2Hz, 2H, H3''), 2.22 (s, 3H, Me). MS (ESI⁺): m/z 304.39 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₅H₁₃NO₄S: 303.33.

【0150】

１－ｐ－トリルスルホンアミド－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｏ）。表題の化合物（８０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、７６％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３ｍＬ）中の７ｏ（６４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（４６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.15 (bs, 2H, NH), 10.56 (s, 1H, NH), 8.17 (s, 1H, H2), 8.12 (s, 2H, H1', H3'), 7.82 (bs, 6H, NH), 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.46 (s, 2H, H4), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H3''), 2.34 (s, 3H, Me). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 155.4, 145.8, 143.5, 138.8, 136.6, 134.9, 129.8, 126.8, 121.2, 120.7, 21.0. MS (ESI⁺): m/z 416.56 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₇H₂₁N₉O₂S: 415.47.

【0151】

１，３，５－ベンゼントリカルボン酸モノメチルエステル（９ｐ）。１．８Ｍ ＮａＯＨ水溶液（９．１ｍＬ、１６．４ｍｍｏｌ、およそ２当量）を、室温で、ＭｅＯＨ（６４ｍＬ）中の強く攪拌した１，３，５－ベンゼントリカルボン酸トリメチルエステル（２．０ｇ、８．０ｍｍｏｌ、１当量）に滴下により添加した。室温での攪拌は５時間続けられ、透明な溶液を得た。減圧下での溶媒の蒸発後、水（２５ｍＬ）を添加し、６Ｎ ＨＣｌ水溶液の滴下添加によりｐＨを２．０にした。生じた懸濁液をＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）で抽出した。水（２×１０ｍＬ）およびブライン（２×１０ｍＬ）による洗浄後、結合した有機相を減圧下で濃縮した。粗製の１，３，５－ベンゼントリカルボン酸モノメチルエステル９ｐ（１．５ｇ）は、さらなる精製をせずに次の反応ステップで使用した。MS (ESI⁺): m/z 225.22 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₈O₆: 224.17.

【0152】

メチル３，５－ビス－（ヒドロキシメチル）－ベンゼンカルボン酸塩（８ｐ）。表題の化合物（７７５ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ、２ステップで５４％収率）は、基本手順Ａの実験プロトコールに従って、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の９ｐ（１．５ｇ、理論６．７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＦ中１Ｍ ＢＨ_３（３３ｍＬ、３３ｍｍｏｌ、およそ５当量）から調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 7.80 (s, 2H, H4), 7.49 (s, 1H, H2), 4.58 (s, 4H, H1', H3'), 3.45 (s, 2H, OH). MS (ESI⁺): m/z 197.27 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₁₂O₄: 196.20.

【0153】

５－カルボメトキシイソフタルアルデヒド（７ｐ）。表題の化合物（６４５ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ、８５％収率）は、基本手順Ｂの実験プロトコールに従って、クロロホルム（２０ｍＬ）中の８ｐ（７７５ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ、１．０当量）および二酸化マンガン（１．９ｍｇ、１９．５ｍｍｏｌ、およそ５当量）から調製した。MS (ESI⁺): m/z 193.26 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₀H₈O₄: 192.17.

【0154】

１－カルボメトキシ－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｐ）。表題の化合物（１０９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、７１％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（４ｍＬ）中の７ｐ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（９０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.30 (bs, 2H, NH), 8.64 (s, 1H, H2), 8.44 (s, 2H, H1', H3'), 8.30 (s, 2H, H4), 7.91 (bs, 6H, NH), 3.92 (s, 3H, OMe). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 166.1, 156.0, 145.7, 135.1, 131.5, 130.7, 130.0, 53.0. MS (ESI⁺): m/z 305.33 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₂H₁₆N₈O₂: 304.26.

【0155】

５－カルボキシイソフタルアルデヒド（１２）。２Ｍ ＮａＯＨ水溶液（０．４７ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、室温で強く攪拌しながら、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の７ｐ（１７４ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１当量）の懸濁液に添加した。生じた懸濁液は２４時間室温で攪拌した。２４時間後、溶媒を減圧下で除去し、粗製の５－カルボキシイソフタルアルデヒド（１６０ｍｇ）をさらなる精製をせずに次のステップで使用した。MS (ESI⁺): m/z 169.21 [M+H⁺]. 計算値MS, C₉H₆O₄: 168.14.

【0156】

５－（Ｎ_４－フェニルピペラジニル）カルボキサミドイソフタルアルデヒド（７ｑ）。ＨＯＢｔ（１６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．２５当量）およびＥＤＣ（２３０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．２５当量）を、窒素雰囲気下において室温で強く攪拌しながら乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）中の粗製の１２（１６０ｍｇ、理論０．９０ｍｍｏｌ）の懸濁液に順に添加した。生じた混合物を１５分間室温で攪拌し、次いで４－フェニル－１－ピペラジン（１９５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．２５当量）およびＴＥＡ（０．２８ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、２当量）を順に添加した。生じた溶液を２４時間室温で攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に吸収し、５％クエン酸溶液（５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）によって洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水後、合わせた有機相を減圧下で濾過および濃縮した。純粋な５－（Ｎ_４－フェニルピペラジニル）カルボキサミドイソフタルアルデヒド７ｑ（９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、２ステップで３０％収率）が、クロマトグラフ精製（溶出液混合物：４：６ ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＋１％ ＴＥＡ）後に得られた。¹H NMR (400 MHz, アセトン-d₆): δ: 10.15 (s, 2H, H1', H3'), 8.46 (s, 1H, H2), 8.23 (s, 2H, H4), 7.32 (m, 2H, H3'''), 6.94 (m, 3H, H2''', H4'''), 3.99 (bs, 3H, H2''), 3.61 (bs, 1H, H2''), 3.30 (bs, 3H, H3''), 3.18 (bs, 1H, H3''). MS (ESI⁺): m/z 323.46 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₉H₁₈N₂O₃: 322.36.

【0157】

５－（Ｎ_４－フェニルピペラジニル）カルボキサミド－３，５－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（２ｑ）。表題の化合物（１１０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、７２％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の７ｑ（９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（６２ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.32 (bs, 2H, NH), 8.35 (s, 1H, H2), 8.25 (s, 2H, H1', H3'), 8.09 (s, 2H, H4), 7.85 (bs, 6H, NH), 7.32 (m, 2H, H3'''), 7.21 (m, 2H, H2'''), 6.98 (m, 1H, H4'''), 3.92 (bs, 1H, H2''), 3.57 (bs, 1H, H2''), 3.28 (bs, 1H, H3''), 3.17 (bs, 1H, H3''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 168.5, 156.0, 145.7, 137.3, 134.9, 129.7, 128.2, 127.4, 121.2. MS (ESI⁺): m/z 435.63 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₁H₂₆N₁₀O: 434.58.

【0158】

１，３，５－トリス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、三塩酸塩（２ｒ）。表題の化合物（１０５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、７８％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（５ｍＬ）中の１，３，５－ベンゼントリカルボキシアルデヒド（５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（１０５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、１当量）から三塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, D₂O): δ(ppm) 7.57 (s, 3H, H1'), 7.30 (s, 3H, H2). ¹³C_NMR (100 MHz, D₂O): δ(ppm) 154.5, 146.3, 133.4, 127.6. MS (ESI⁺): m/z 331.53 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₂H₁₈N₁₂: 330.36.

【0159】

Ｎ_１－ｎ－ブチルアミノグアニジンヨウ化水素酸塩（１４ｔ）。Ｓ－メチルイソチオセミカルバジド二ヨウ化水素酸塩１３（５１０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、ｎ－ブチルアミン（３２５μＬ、３．２８ｍｍｏｌ、１当量）を室温で攪拌しながら添加した。反応混合物を、７２時間後に減圧下で濃縮した。粗製のＮ_１－ｎ－ブチルアミノグアニジンヨウ化水素酸塩１４ｔを、精製をせずに次のステップで使用される赤色油状物（５６５ｍｇ）として得た。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 8.46 (bs, 1H, NH), 7.25 (bs, 3H, NH), 4.69 (bs, 2H, NH), 3.13 (s, 2H, H1), 1.48 (m, 2H, J = 7 Hz, H2) 1.28 (m, 4H, J = 7 Hz, H3), 0.92 (m, 3H, J = 7 Hz, H4).MS (ESI⁺): m/z 131.26 [M+H⁺]. 計算値MS, C₅H₁₄N₄: 130.19.

【0160】

１，３－ビス－（Ｎ_３－ｎ－ブチルアミノ）グアニジンフェニルヒドラゾン、二ヨウ化水素酸塩（２ｔ）。表題の化合物（２６５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、５３％収率、≧９５％純度、淡黄色固体は）、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、および分取ＨＰＬＣ分離（溶離液混合物：ニート水からニートＣＨ_３ＣＮ）により、無水エタノール（５ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（１１０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１．０当量）および１４ｔ（４９０ｍｇ、理論１．９０ｍｍｏｌ、１．１５当量）から二ヨウ化水素酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.44 (bs, 2H, NH), 8.25 (m, 3H, H1', H3', H2), 8.21-7.90 (bs, 4H, NH), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H4), 7.57 (t, J=8 Hz, 1H, H5), 3.37 (m, 4H, H6), 1.54 (m, 4H, H7), 1.35 (m, 4H, H8), 0.94 (t, J = 7.12 Hz, 6H, H9). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 154.4, 146.5, 134.5, 129.6, 127.5, 41.3, 31.1, 19.7, 14.1.MS (ESI⁺): m/z 359.69 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₈H₃₀N₈: 358.51.

【0161】

Ｎ_１－ベンジルアミノグアニジンヨウ化水素酸塩（１４ｕ）。Ｓ－メチルイソチオセミカルバジドヨウ化水素酸塩１３（９９５ｍｇ、４．２８ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（８ｍＬ）に溶解し、ベンジルアミン（４７０μＬ、４．２８ｍｍｏｌ、１当量）を室温で攪拌しながら添加した。反応混合物を、７２時間後に減圧下で濃縮した。Ｎ_１－ベンジルアミノグアニジンヨウ化水素酸塩１４ｕは、オレンジ色固体としてＥｔＯＨ／ジエチルエーテルから再結晶後に得た（４２５ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、３４％収率）。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 8.69 (bs, 1H, NH), 7.46-7.20 (m, 8H, NH, H2, H3, H4), 4.76 (s, 2H, NH₂), 4.42 (s, 2H, H1'). MS (ESI⁺): m/z 165.27 [M+H⁺]. 計算値MS, C₈H₁₂N₄: 164.21.

【0162】

１，３－ビス－（Ｎ_３－ベンジルアミノ）グアニジンフェニルヒドラゾン、二ヨウ化水素酸塩（２ｕ）。表題の化合物（１７７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、７０％収率、≧９５％純度、淡黄色固体）は、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、および分取ＨＰＬＣ分離（溶離液混合物：ニート水からニートＣＨ_３ＣＮ）により、無水エタノール（５ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）および１４ｕ（２５０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ、１．３当量）から二ヨウ化水素酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.60 (bs, 2H, NH), 8.57 (m, 2H, H4), 8.27 (m, 3H, H2, H1', H3'), 8.05 (bs, 4H, NH), 7.55 (t, J = 7.8 Hz, 1H, H5), 7.35 (m, 10H, H2'', H3'', H4''), 4.60 (d, J = 5.4 Hz, 4H, H1''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 154.7, 146.9, 137.5, 134.5, 129.6, 129.0,1128.0, 127.7, 127, 5, 44.5.MS (ESI⁺): m/z 449.69 [M+Na⁺]. 計算値MS, C₂₄H₂₆N₈: 426.53.

【0163】

Ｎ_１－ピロリジニルグアニジンヨウ化水素酸塩（１４ｖ）。Ｓ－メチルイソチオセミカルバジドヨウ化水素酸塩１３（１．２１ｇ、５．２１ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、ピロリジン（６５０μＬ、７．８１ｍｍｏｌ、１．５当量）を室温で攪拌しながら添加した。反応混合物を、７２時間後に減圧下で濃縮した。粗製のＮ_１－ピロリジニルグアニジンヨウ化水素酸塩１４ｖは、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）による摩砕、減圧下での溶媒濃縮、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）による摩砕、ジエチルエーテル（３×５ｍＬ）による濾過および洗浄から得た。粗製の１４ｖ（１．２２ｇ、ピンク固体）は、次の反応ステップでそのまま使用した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 8.74 (bs, 1H, NH), 7.22 (bs, 3H, NH), 4.78 (bs, 2H, NH₂), 3.30 (t, 4H, J = 6.4, H1), 1.90 (m, 4H, J = 6.4, H2). MS (ESI⁺): m/z 129.22 [M+H⁺]. 計算値MS, C₅H₁₂N₄: 128.18.

【0164】

１，３－ビス－（Ｎ_３－ピロリジニル）グアニジンフェニルヒドラゾン、二ヨウ化水素酸塩（２ｖ）。表題の化合物（１２８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、７０％収率、≧９５％純度、淡黄色固体）は、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（４０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．０当量）および１４ｖ（１６８ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１．１当量）から二ヨウ化水素酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.31 (bs, 2H, NH), 8.43 (s, 2H, H1', H3'), 8.28 (s, 1H, H2), 8.06 (d, J = 7.84 Hz, 2H, H4), 7.97 (bs, 4H, NH), 7.57 (t, J = 7.84 Hz, 1H, H5), 3.50 (t, J = 6.4 Hz, 8H, H1''), 2.00 (t, J = 6.4 Hz, 8H, H2''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 152.3, 147.1, 134.5, 129.8, 129.7, 127.4, 48.1, 25.1.MS (ESI⁺): m/z 355.58 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₈H₂₆N₈: 354.46.

【0165】

１－ｐ－トリルアミド－３，５－ビス－（Ｎ_３－ｎ－ブチルアミノ）グアニジンフェニルヒドラゾン、二ギ酸塩（２ｗ）。表題の化合物（１７０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、６９％収率、≧９５％純度、淡ピンク固体）は、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、および分取ＨＰＬＣ分離（溶離液混合物：ニート水からニートＭｅＯＨ＋０．３％ギ酸）により、無水エタノール（７ｍＬ）中の７ｍ（１１０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０当量）および１４ｔ（２５４ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、１．２当量）から二ギ酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 10.32 (bs, 1H, NH), 8.64 (bs, 2H, NH), 8.31 (s, 2H, NH), 8.13 (s, 2H, H1', H3'), 8.08 (s, 1H, H2), 8.05 (s, 2H, H4), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H2''), 7.83 (bs, 4H, NH), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H3''), 3.24 (bs, 4H, H1'''), 2.40 (s, 3H, H4''), 1.53 (m, 4H, H2'''), 1.36 (m, 4H, H3'''), 0.92 (t, J = 8.3 Hz, 6H, H4'''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 166.2, 165.9, 144.9, 142.3, 140.1, 132.1, 129.4, 128.2, 122.1, 121.8, 40.4, 31.3, 21.5, 19.9, 14.1. MS (ESI⁺): m/z 492.70 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₆H₃₇N₉O: 491.64.

【0166】

１，３－ビス－（Ｎ_２Ｎ_３－イミダゾリジニル）グアニジンフェニルヒドラゾン、二臭化水素酸塩（２ｘ）。表題の化合物（１９６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、８２％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３．５ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（７０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびイミダゾリジンアミノグアニジン臭化水素酸（１９８ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１．０５当量）から二臭化水素酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 12.42 (bs, 2H, NH), 8.75 (bs, 4H, NH), 8.27 (s, 2H, H1', H3'), 8.22 (s, 1H, H2), 7.99 (d, J = 7.79 Hz, 2H, H4), 7.59 (t, J = 7.79 Hz, 1H, H5), 3.77 (s, 8H, H1''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) δ 157.9, 148.1, 132.9, 130.0, 129.6, 128.0, 43.0. MS (ESI⁺): m/z 295.47 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₄H₁₈N₈: 294.35.

【0167】

１，３－ビス－（Ｎ_１－メチル－Ｎ_２Ｎ_３－イミダゾリジニル）グアニジンフェニルヒドラゾン、二臭化水素酸塩（２ｙ）。表題の化合物（２０５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、８０％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｄの実験プロトコールに従って、無水エタノール（３．５ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（７０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ_３－メチルイミダゾリジンアミノグアニジン臭化水素酸（２１３ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１．０５当量）から二臭化水素酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6/D₂O混合物): δ(ppm) 8.38 (s, 1H, H2), 8.19 (s, 2H, H1', H3'), 8.05 (d, J = 7.75 Hz, 2H, H4), 7.60 (t, J = 7.75 Hz, 1H, H5), 3.81 (s, 6H, N-Me), 3.75 (s, 8H, H1''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 159.5, 144.4, 134.5, 130.0, 129.7, 128.3, 43.6, 22.2. MS (ESI⁺): m/z 327.49 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₆H₂₂N₈: 326.41.

【0168】

１，３－ビス－（Ｎ_２Ｎ_３－ベンズイミダゾリジニル）グアニジンフェニルヒドラゾン、二酢酸塩（２ｚ）。Ｎ，Ｎ’－ベンズイミダゾリルアミジノグアニジン（１１０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＡｃＯＨ（５０μＬ）を、無水ＥｔＯＨ（５ｍＬ）中のイソフタルアルデヒド（４６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、室温で攪拌しながら添加した。反応混合物は、２時間加熱還流した。室温まで冷却し、濾過後、固体沈殿物を回収し、水（２×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥して、黄色固体として純粋な１，３－ビス－Ｎ_２Ｎ_３－ベンズイミダゾリルグアニジンフェニルヒドラゾン、二酢酸塩２ｚ（８７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、６６％収率）を産出した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.68 (bs, 4H, NH), 8.36 (s, 1H, H2), 8.15 (s, 2H, H1', H3'), 7.75 (d, J = 7.7 Hz, 2H, H4), 7.59 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H5), 7.33 (m, 4H, H1''), 7.05 (m, 4H, H2''). ¹³C_NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 149.8, 146.4, 134.8, 131.6, 129.7, 128.9, 127.4, 123.6, 112.6. MS (ESI⁺): m/z 395.55 [M+H⁺]. 計算値MS, C₂₂H₁₈N₈: 394.44.

【0169】

参照例
１’，３’－ジメチル－１，３－ビス－アミノグアニジンフェニルヒドラゾン、二塩酸塩（化合物（ＶＩＩＩ））。表題の化合物（２７４ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ、７０％収率、≧９５％純度、白色固体）は、基本手順Ｃの実験プロトコールに従って、無水エタノール（１０ｍＬ）中の１，３－ジアセチルベンゼン（１７０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）およびアミノグアニジン塩酸塩（２３２ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ、１当量）から二塩酸塩として調製した。¹H_NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm) 11.40 (bs, 2H, NH), 8.35 (s, 1H, H2), 8.06 (d, J = 9.2 Hz, 2H, H4), 8.15-7.60 (bs, 6H, NH), 7.50 (t, J = 9.2 Hz, 1H, H5), 2.41 (s, 6H, Me). ¹³C_NMR (100 MHz, D₂O): δ(ppm) 155.3, 152.7, 136.0, 128.6, 127.6, 124.0, 13.3. MS (ESI⁺): m/z 275.45 [M+H⁺]. 計算値MS, C₁₂H₁₈N₈: 274.33.

【0170】

生物学
細胞培養
マウスアルビノ神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、標準培地（ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））中で維持した。サブコンフルエントな培養（７０～８０％）を１：３～１：８に分け、すなわち４×１００００個の細胞／ｃｍ^２で播種し、５％ ＣＯ_２；３７℃に維持した。トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。以下のプラスミドを使用した：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ、ｐＣＡＧＧ ＧＦＰ、ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ、ＣＭＶ－ＶＰＳ３５、Ｓｉｇｍａ Ｍｉｓｓｉｏｎ ｓｈＲＮＡ：ＴＲＣＮ００００１１５５６（Ｓｈ５６）、ＴＲＣＮ００００１１５５９（Ｓｈ５９）、ＴＲＣＮ００００１１５５８（Ｓｈ５８）、スクランブル。

【0171】

細胞生存実験は、製造業者の推奨に従って、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ８）生存キット（９６９９２－Ｓｉｇｍａ）を使用して９６ウェルプレートで実施した。化合物２ａの細胞毒性は、４８時間漸増量の化合物２ａ（１、１０、５０、１００、２００、５００および１０００μＭ）を受けるＮｅｕｒｏ２ａ細胞で試験した。

【0172】

ＬＤＨの細胞毒性は、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して９６ウェルプレートで実施した。簡潔に述べると、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、ＶＰＳ３５低分子干渉プラスミド（Ｓｈ５６）または化合物２ａ（１０μＭ）ありまたはなしで、ｐＣＭＶ－ＬａｃＺ；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａをコードするプラスミドによってトランスフェクトした。製造業者の推奨に従って、４８時間後、５μｌの上澄み液をＬＤＨ保存緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ２００ｍＭ、１０％グリセロール、１％ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１００倍に希釈し、ＬＤＨを決定するために使用した。最大ＬＤＨ放出対照は、２μＬの１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって未処置のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を溶解して得た。各実験では、本発明者らは、％細胞毒性＝（Ｅｘｐ．ＬＤＨ Ｒｅｌｅａｓｅ－Ｍｅｄｉｕｍ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）／（Ｍａｘ ＬＤＨ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｍｅｄｉｕｍ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を算出し、本発明者らは、平行して２００μＭ Ｈ_２Ｏ_２による陽性対照処置細胞を実行した。

【0173】

６ウェルプレートに播種したＮｅｕｒｏ２ａ細胞にシクロヘキシミド（ＣＨＸ）アッセイを行い、２４時間化合物２ａ（１０μＭ）またはビヒクルとインキュベートした。次に、本発明者らはＣＨＸ（Ｓｉｇｍａ）を１０μｇ／ｍＬで添加し、ＶＰＳ３５レベルの経時的アッセイの０、２、４および８時間で細胞を回収した。

【0174】

オートファジーアッセイは、ｐＨｌｕｏｒｉｎ－ｍＫａｔｅ２－タグ付きヒトＬＣ３プラスミドを発現する安定なＮｅｕｒｏ２ａ細胞クローンを使用して行い、本発明者らの発表した方法（Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ ２０１６）に従って細胞クローンを生成した。トランスフェクション時に、細胞は４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８ 二硫酸塩溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって選択し、限界希釈によりさらにクローニングした。候補細胞クローンをフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ－Ｓ）によって評価し、クローン７Ｂ１１を選択した。アッセイの品質管理は、バフィロマイシンＡ１（２００ｎＭ）およびＴｏｒｉｎ－１（２５０ｎＭ）処置したＮｅｕｒｏ２ａ ７Ｂ１１細胞におけるＺ因子（＞０．５）およびＳＳＭＤ（バフィロマイシンＡ１では＞４．７、Ｔｏｒｉｎ－１では＜４．７）値を算出して行った（７回の独立した実験）。Ｎｅｕｒｏ２ａ ７Ｂ１１細胞は、４８時間化合物２ａ（０．１～１００μＭ）によって処置し、次いでｐＨｆｌｕｏｒｉｎのＭＦＩレベルはフローサイトメトリーにより生細胞で測定した。

【0175】

Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるアミノグアニジンヒドラゾン２ａ－２ｍｍのライブラリーのスクリーニング。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、１０００００個の細胞／ウェルの濃度で１２ウェルのマルチウェルに播種した。細胞は、標準Ｒ５５を含む各化合物と１０μＭで４８時間インキュベートした。次いで細胞を、ＰＢＳ１×で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）１×と、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８、ＥＤＴＡ １ｍＭ ｐＨ８、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＮＰ４０ １％を含有する緩衝液で溶解した。細胞スクレーパーを使用して、各ウェルから全ライセートを回収し、ＢＣＡで定量した（ＢＣＡタンパク質アッセイ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。５μｇをプレキャスト１０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）で分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、以下の抗体を使用してウェスタンブロットを実施した：ヤギαＶＰＳ３５（１：１０００）、マウスα－βアクチン（１：１００００）。タンパク質の検出は、化学発光検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって得られた。

【0176】

免疫ブロッティング
腰髄は、生理食塩水で灌流したマウスから解剖し、以下の溶解緩衝液中で素早くホモジナイズした：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８、ＥＤＴＡ ｐＨ８ １ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＮＰ４０ １％およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）。タンパク質抽出物は、タイトフィットガラスＰｏｔｔｅｒ組織粉砕機（１ｍｌ；Ｗｈｅａｔｏｎ）を使用して得られ、次いで２０ｋＨｚ（１０回～１秒）の頻度で超音波処理した。細胞培養からのタンパク質ライセートは、ＰＢＳ１×洗浄を受けるプレートから得られ、続いて溶解緩衝液を超音波処理した。タンパク質濃度は、製造業者の推奨に従って、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって測定した。１０μｇのタンパク質抽出物を、ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のため１０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストゲルにロードした。ゲル電気泳動は、２時間１００Ｖで実施した。ゲルは、製造業者の説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）－Ｐ ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロットは、シェイカー上で、４℃で終夜、一次抗体：ヤギα－ＶＰＳ３５ １：８００（ａｂ１００９９、Ａｂｃａｍ）；ウサギα－ＶＰＳ２６ｂ １：１０００（１５９１５－１－ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）；ウサギα－ＶＰＳ２９ １：１０００（ａｂ２３６７９６ Ａｂｃａｍ）；マウスα－βアクチン １：２５０００（Ｓｉｇｍａ）；マウスα－Ｇｏｌｇｉｎ９７ １：１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；マウスα－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ １：５００（Ｍｅｒｋ）を結合させる前に１時間、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ）中の５％ ＢＳＡでブロックした。ＴＢＳ－Ｔ １×で数回洗浄後、ブロットは室温で１時間、適当なＨＲＰ－標識二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とインキュベートした。タンパク質バンドの可視化は、製造業者の説明書に従って、ＣｌａｒｉｔｙＭａｘ－ＥＣＬ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して得られ、画像はＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で獲得した。定量は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ６．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。

【0177】

ブルーネイティブゲル電気泳動
Ｇ９３ＡマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔は、ビヒクルまたは化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、８３日から１０３日）を毎日注射した。生理食塩水灌流したマウスから解剖した腰髄を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ８、ＥＤＴＡ １ｍＭ ｐＨ８、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＮＰ４０ １％およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）中に溶解した。抽出物は、タイトフィットガラスＰｏｔｔｅｒ組織粉砕機（１ｍｌ；Ｗｈｅａｔｏｎ）を使用して得た。本発明者らは、２５０μｌの各抽出物を１００ｍＭ ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。試料は、４×Ｓａｍｐｌｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）試料緩衝液およびＧ－２５０添加剤（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と混合し、タンパク質は、１５０Ｖでゲルの長さの１／３まで、Ｄａｒｋ Ｂｌｕｅ Ｃａｔｈｏｄｅ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によりネイティブ４～１５％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で分解した。本発明者らは、ランニング緩衝液をＬｉｇｈｔ Ｂｌｕｅ Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒと置き換え、ランを完了した。電気泳動の終了時に、ゲルを１５分間５ｍＭ ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、次いでタンパク質をニトロセルロースに移し、１５分間８％酢酸によってメンブレン上に固定した。ウサギα－ＳＯＤ１（１：２０００、Ｇｅｎｅｔｅｘ）は、上記のように終夜インキュベートした。タンパク質の可視化は、製造業者の説明書に従って、ＣｌａｒｉｔｙＭａｘ－ＥＣＬ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して実施し、画像はＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で獲得した。

【0178】

免疫組織化学、免疫蛍光および形態計測解析
パラフィン包埋したＳＣはＴａｒｇｅｔ ＡＬＳ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ ＣｏｒｅからのＡＬＳ患者および非神経対照から得た。切片はＩＮＳＰＥ組織Ｂａｎｋで保存した。切片は、脱水および抗原回復（スライドを、水浴によりＴＲＩＳ ＥＤＴＡ ｐＨ＝９中で９７℃に温めた）後に、ポリクローナルＶＰＳ３５抗体（１：４００ Ａｂｃａｍ ａｂ９７５４５）およびポリクローナルＶＰＳ２６抗体（ａｂ２３８９２ Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。ペルオキシダーゼ－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）反応は、一次抗体、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００ Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびアビジン－ビオチン複合体（ＡＢＣ １：１００ Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を検出するために使用した。続いて、疾患状態および人口統計データを盲検にしたオペレーターがこれらの切片を評価した。

【0179】

マウスからの切片（凍結乾燥切片）または細胞を含有するガラスカバーを、ＰＢＳ １×（Ｌｏｎｚａ、各５分）で３回洗浄し、以下のブロッキング混合物：ＰＢＳ １×／ＦＢＳ １０％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ０．１％（Ｓｉｇｍａ）中で、室温で１時間インキュベートした。製造業者の説明書に従って、抗体をブロッキング混合物で希釈し、＋４℃で終夜インキュベートした。次の日、切片をＰＢＳでリンスし、ブロッキング混合物中で希釈した蛍光二次抗体－すなわち、一次抗体が由来する種に由来しない－（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒコンジュゲート）を、製造業者の説明書に従って使用した。スライドは、核の対比染色のためＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。必要であれば、本発明者らは、試料を５分間１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）中でボイルすることにより抗原回復を実施した。以下の抗体および作用濃度を使用した：ウサギα－ＶＰＳ３５ １：１０００（ａｂ９７５４５ Ａｂｃａｍ）；ウサギα－ＶＰＳ２６ １：１０００（ａｂ２３８９２ Ａｂｃａｍ）；ウサギα－Ｓｏｒｔｉｌｉｎ １：１０００（ａｂ１６６４０ Ａｂｃａｍ）；マウスα－ＣＩ－ＭＰＲ １：１００（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏ．ＮＢ－３００－５１４）、マウスα－ＮｅｕＮ １：８００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ３７７）；マウスα－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ １：５００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ１５１０）；マウスαＧｏｌｇｉｎ９７ １：７００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ａ２１２７０）；ウサギα－ＩＳＬＥＴ １：１０００（ａｂ２０６７０ Ａｂｃａｍ）；ヤギα－ＣｈＡＴ １：２００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ａｂ１４４ｐ）；トリα－ＧＦＰ １：１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；トリα－Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ－ｍｅｄｉｕｍ １：５００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＰＣＫ－５９３Ｐ）；ラットα－ＭＢＰ １：１００（Ｄｒ．Ａ．Ｂｏｌｉｎｏのご厚意により提供された）；マウスα－ＧＭ１３０ １：１００（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０８２３）；ラットα－ＣＴＳＤ １：１００（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ＭＡＢ１０２９）。適当であれば、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、単一のおよび二重の免疫蛍光における蛍光強度を改善した。

【0180】

画像化
本発明者らは、以下のカメラ：Ｌｅｉｃａ ＣＣＤ顕微鏡ＤＦＣ３０００ ＧおよびＤＭＣ２９００を搭載した以下の対物レンズ：Ｘ２０、Ｘ４０およびＸ６３を備えたＯｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５１を使用して、１６ビットの光および蛍光画像（１２９６×９６６ピクセル）を得た。蛍光画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）ＣＳ４またはＮＨＩ－ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を使用してマージした。本発明者らは、Ｘ４０およびＸ６４対物レンズを備え、高感度ＨｙＤ検出器を搭載したＬｅｉｃａ ＳＰ８を使用して、共焦点画像を得た。本発明者らは、方形の８ビット画像（１０２４×１０２４ピクセル）として各蛍光シグナルを記録した。画像は、Ｌａｓ－Ｘソフトウェアを使用して後処理し、Ｚ－ｓｔａｃｋの最大射影（０．４～０．８μｍステップで獲得）およびＺ－ｓｔａｃｋの横断面プロファイル（０．３μｍステップで獲得）および疑似カラーを作成した。

【0181】

ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｒａｗ２６４．７細胞（１０^５個／ウェル）は、１時間、化合物２ａ、ＣＮＩ－１４９３またはビヒクルによって処置し、次いで本発明者らはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を適用し、上澄み液を４時間後に回収した。本発明者らは、製造業者の説明書に従って、マウスＴＮＦα（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の検出のためのＯｐｔＥＩＡ（商標）セットにより、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）手順を使用した。ＴＮＦαの濃度を、標準曲線に従って算出し、マイクロリットル当たりナノグラムとして表した。サイトカインの濃度が検知閾値以下である場合、それらは０ｎｇ／μｌと仮定した。

【0182】

組織ＭＮにおけるＭＦＩレベルの定量
ＶＰＳ３５、ＶＰＳ２６、ＣＩ－ＭＰＲ、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ、ＣＴＳＤおよびＵｂｉｑｕｉｔｉｎの蛍光強度レベルは、以下のプロトコールに従って、ＮＨＩ－ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を使用して算出した：共焦点画像のスタックを使用して、最大射影（Ｌａｓ－Ｘ）を生成し、次いでＮＨＩ－ＩｍａｇｅＪにより事後処理し、脊髄腹側角からの単一のＮｅｕＮ^＋ＭＮを得た。次に、本発明者らは、ＮＨＩ－ＩｍａｇｅＪ平均値フィルター（半径２．０ピクセル）を適用して個々のＭＮにおいて平均ＮｅｕＮ蛍光レベルを算出する前に、各チャネルの背景（二次抗体のみを受けた隣接する切片で算出）除去を実施した。このアプローチを使用して、本発明者らは、単一のＭＮをゲートする目的の領域（ＲＯＩ）を確立した。この選択されたＲＯＩでは、本発明者らは、各タンパク質の平均蛍光レベル（ＭＦＩ）を算出した。

【0183】

Ｎｅｕｒｏ２ａにおけるゴルジ装置の形態学的評価
ゴルジ形態は、公開された方法（Ｓｔａｆａ ２０１２）に従って、化合物２ａ（１０μＭ）ありまたはなしで、Ｇ９３Ａプラスミドを受ける対照またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞において評価した。各実験では、本発明者らは、さらなる対照としてＧＦＰトランスフェクト細胞を含めた。本発明者らは、Ｇｏｌｇｉｎ９７免疫蛍光を使用して、トランスゴルジネットワークメンブレンを標識した。本発明者らはゴルジ形態を以下のように分類した：正常（分極したネットワーク）、中間体（部分的に断片化）または断片化（細胞質全体に散乱したゴルジ層板によりひどく断片化）（Ｓｔａｆａ ２０１２）。各実験では、細胞は３つのカバースリップから無作為にサンプリングされた。ゴルジサブクラスは、各実験条件でスコア化したゴルジ体の総数のパーセントとして表した。

【0184】

微小電極アレイ（ＭＥＡ）記録
一次神経細胞培養は、Ｅ１６．５ Ｃ５７ＢＬ６Ｊ胚の大脳皮質から確立した。解剖時に、細胞をＭＥＡバイオチップ（６０電極ＭＥＡバイオチップ、２００μｍ電極間隔および３０μｍ電極直径を有し、内部参照電極を有する、Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＧｍｂＨ）に３×１０^５個の細胞／ＭＥＡの密度でプレートし、１４日間、Ｂ２７を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で維持した。１４日目に、神経細胞培養を、Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ－Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ＫＲＨ、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．６％グルコース、１％グルタミン、Ｓｉｇｍａ）中で漸増濃度のリード２ａ（１、３、１０、３０および１００μＭ）に曝露した。発火活性は、前増幅段階（ＭＥＡ－１０６０－Ｉｎｖ－ＢＣ－標準、ゲイン：５５、バンド幅：３００Ｈｚ～８ｋＨｚ、ＭＣＳ ＧｍｂＨ）、増幅および濾過段階（ＦＡ６４Ｓ、ゲイン２０、バンド幅：１０Ｈｚ～６ｋＨｚ、ＭＣＳ ＧｍｂＨ）ならびにデータ獲得装置（サンプリング頻度：２５ｋＨｚ）を使用して記録した。次いで、オフラインシグナル処理を実施し、生データをＭＣ－Ｒａｃｋ ソフトウェア（ＭＣＳ ＧｍｂＨ）により解析した。

【0185】

リアルタイムＰＣＲ
生理食塩水で灌流したマウスから解剖した腰髄またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞を溶解し、製造業者の推奨に従って、ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）消化を含む、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。本発明者らは、製造業者の説明書に従って、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を、リアルタイムＰＣＲ実験に使用した。ノーマライゼーションは、ハウスキーピング遺伝子Ｈｉｓｔｏｎ Ｈ３（Ｈ３ Ｆ：５’－ＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣ－３’ Ｈ３ Ｒ：５’－ＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＴＡＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣ－３’）を使用して得た。以下の特異的プライマーを遺伝子発現解析に使用した：
ＶＰＳ３５Ｆ：５’－ＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧ－３’
ＶＰＳ３５Ｒ：５’－ＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣ－３’
ＶＰＳ２６ＡＦ：５’－ＧＣＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣ－３’
ＶＰＳ２６ＡＲ：５’－ＣＴＴＧＴＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＧ－３’
ＶＰＳ２９Ｆ：５’－ＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣ－３’
ＶＰＳ２９Ｒ：５’－ＣＣＡＣＧＧＡＡＴＡＡＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧ－３’

【0186】

薬理学－インビボ
マウスから単離した脳および血液試料における化合物２ａの検出
健康なマウスは、ビヒクルまたは化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）を毎日注射し、１、７、１５、および３０日後に屠殺した。生理食塩水による灌流時に、脳を頭蓋骨から分離し、注意深く計量し、すぐにドライアイス中で保存した。次いで、脳（～４００ｍｇ）の化合物２ａの存在を調べた。抽出は、Ｙｕａｎら、２０１２で報告されたプロトコールに従ってＭｅＯＨにより実施した。抽出後、各生物試料を６０μｌのＬＣ／ＭＳグレード水中に再懸濁し、５μＬを、ポジティブモードでＴｒｉｐｌｅ ＴＯＦ５６００＋マススペクトロメーター（ＳＣＩＥＸ）と組み合わせたＵＰＬＣ１２９０（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって解析した。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ＨＩＬＩＣカラム（２．１×１０ｍｍ、１．７μｍ）を、溶媒Ａ（ＡＣＮ＋０．１％ ＦＡ）および溶媒Ｂ（Ｈ_２Ｏ＋０．１％ ＦＡ）の勾配を通すクロマトグラフィーによる分離に使用した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ２．１ソフトウェア（ＳＣＩＥＸ）を使用して、ピーク領域対相当する濃度をプロットすることにより、検量線を構築した。

【0187】

ヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からＭＮの生成
Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌでのインフォームフォコンセント後に、ＡＬＳ患者および健常ボランティアからの皮膚生検を局所麻酔下で実施した。プロトコールは、地元の倫理委員会によって認可された。一次線維芽細胞は、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）で増殖させた。ヒトｉＰＳ細胞株は、インテグレートしないセンダイウイルスを使用して生成し、胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でフィーダー細胞を含まない条件で維持した。ＭＮは、最小限に改変したＤｕおよび同僚によって公表されたプロトコールに従って生成した（Ｄｕら、２０１５）。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣがコンフルエンスに達すると、それらはＥＤＴＡを使用して剥がし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＥＳコートしたディッシュの、ＲＯＣＫ阻害剤（ＳｔｅｍＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補足したｍＴｅＳＲ１中に、１：４でプレートした。次の日、培地を既知組成のｎｅｕｒａｌ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 １：１比、１％ Ｂ２７、０．５％ Ｎ２（全てＧｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）および０．１ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）によって置き換えた。ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＤＭＨ１（２μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）およびＳＢ４３１５４２（２μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を培地に添加した。６日目まで、１日おきに培地を交換した。７日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）によって分離し、１：４に分け、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ ＤＭＨ１、２μＭ ＳＢ４３１５４２、ＲＡ（レチノイン酸、０．１μＭ、Ｓｉｇｍａ）およびＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ、０．５μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補足した上記のｂａｓａｌ ｎｅｕｒａｌ培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ増殖因子低減（ＭａＧＲ）で６日間維持した。１３日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）によって分離し、１：４に分け、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ ＤＭＨ１、２μＭ ＳＢ４３１５４２、０．１μＭ ＲＡ、０．５μＭ ＳＡＧおよび０．５ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ Ａｃｉｄ（ＶＰＡ、Ｔｏｃｒｉｓ）を補足したｎｅｕｒａｌ培地中で６日間維持した。ＭＮ分化を誘導するため、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）によって分離し、０．５μＭ ＲＡおよび０．１μＭ ＳＡＧを含むｎｅｕｒａｌ培地中、懸濁液で６日間培養した。２５日目に、細胞をＡｃｃｕｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）によって単一細胞へと分離し、ＭａＧＲコートしたプレートの、０．５μＭ ＲＡ、０．１μＭ ＳＡＧ、０．１μＭ 化合物Ｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むｎｅｕｒａｌ培地中に、３５日目までプレートした。通常、培地の半分を１日おきに交換した。

【0188】

動物
マウスは、Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌマウス施設（Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）の病原体フリー条件下で維持した。１９８６年１１月２４日のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）により、苦しむ動物を最小限にし、使用するマウスの数を減らす全ての努力がなされた。全ての動物実験プロトコールは、イタリア保健省の動物実験倫理委審査委員会によって認可された。手順は、Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物実験委員会のガイドラインに従って実施した（プロトコール番号６９３／２０１５ＰＲ）。ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａアリールを持つトランスジェニック変異ＳＯＤ１マウス（株Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から購入したが、繁殖および実験目的で使用したＣ５７ＢＬ６ＪはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（イタリア）から購入した。化合物２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、処置および遺伝子型を知らないオペレーターによって、毎日腹腔内に注射された。屠殺時、マウスに過剰量の麻酔薬を与え、生理食塩水により、続いて８０／１００ｍｌのＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド、ｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ）により経心的に灌流した。脊髄は、～６ｍｍの厚さで冠状にスライスし、＋４℃で１２時間、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．２で後固定した。組織は、ＰＢＳ／３０％ スクロース（Ｓｉｇｍａ）中で凍害保護し、ＯＣＴ包含培地中に包埋し、プロセシングの前に－８０℃に保存した。腰髄は１２μＭの切片にし、標識し、デジタル画像を２．５ｍｍの脊髄を包含する領域で３５０μｍごとに獲得した。動物コホート数は、予備調査結果に基づき、電力解析によって決定した。

【0189】

坐骨神経の比較研究は、生理食塩水による灌流の際に除去され、すぐに０．１２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液中の２％グルタルアルデヒドで固定し、１％四酸化オスミウムで後固定し、Ｅｐｏｎ（Ｆｌｕｋａ）に包埋した組織で行った。半薄切片（１μｍ厚）はトルイジンブルーによって染色し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１）によって調べた。相当するレベルの坐骨神経からのデジタル化したオーバーラップしない半薄切片画像を、４０×対物レンズを使用してデジタルカメラ（Ｌｅｉｃａ ＤＦＣ３００Ｆ）によって得た。定量は、各マウスからの少なくとも５個の獲得した画像で行った。変性している神経線維の数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した（国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）。

【0190】

運動機能
Ｇ９３Ａマウスの運動活性は、ロータロッドより評価した。マウスは、静止ローター上で１分間、一定のスピード（４ｒｐｍ）で１分間を２回で慣らし、次いで３連続日（１日１回）に実施した３回の試験での運動機能を試験した。各試験は、１５分間隔のセッションによる、３回の試験セッションからなる。各セッションでは、５匹のマウスを加速するローター（４～４０ｒｐｍ）に置き、落下までの時間を記録し、個々の動物の最大限度を９００秒に設定した。

【0191】

統計
本発明者らは、独立した実験の平均値（±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）または±標準偏差（ｓ．ｄ．））としてデータを表した。本発明者らは、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定（Ｐ値はＤａｌｌａｓ－Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ－Ｌｉｌｌｅによる）またはＤ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎオムニバス正規性検定のいずれかを適用してデータの正規性を評価した。比較は以下の検定を使用して行った：独立ｔ検定、一元配置または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後のテューキーの多重比較検定またはボンフェローニ多重比較検定。統計解析は、ＰＲＩＳＭ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。０．０５より低い値は、統計的に有意であると考えた。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】