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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-01
(54)【発明の名称】抗体を分類するためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
G16B 20/20 20190101AFI20220525BHJP
G16B 40/20 20190101ALI20220525BHJP
【ＦＩ】
G16B20/20
G16B40/20
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559527
(86)(22)【出願日】2020-04-08
(85)【翻訳文提出日】2021-11-24
(86)【国際出願番号】 IB2020053370
(87)【国際公開番号】W WO2020208555
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/831,663
(32)【優先日】2019-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＪＡＶＡＳＣＲＩＰＴ
３．ＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣ
４．ＴＥＮＳＯＲＦＬＯＷ
(71)【出願人】
【識別番号】519146639
【氏名又は名称】エーテーハー チューリッヒ
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ ＺＵＲＩＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】メイソン デレク
(72)【発明者】
【氏名】フリーデンソーン サイモン
(72)【発明者】
【氏名】ウェーバー セドリック
(72)【発明者】
【氏名】レディ サイ
(57)【要約】
本開示は、抗体などの結合タンパク質の１つ以上の特性、例えば、抗原に対する抗体親和性または特異性を分類する予測を行うためのシステムおよび方法を説明する。システムは、アミノ酸配列と機能との間の複雑な関係を推測し得る１つ以上の機械学習モデルを含み得る。システムは、２段階の単一部位およびコンビナトリアル深層突然変異走査アプローチを通じて生成された高品質の訓練データで訓練され得る。次いで、訓練済みモデルにより、インシリコ生成された新規の変異体配列について予測を行うことができる。本開示は、提供されたシステムおよび方法によって生成されたアミノ酸配列、ならびに治療および診断用のタンパク質を生成するための生成された配列の使用を説明する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合分子の抗原結合部分を表す入力アミノ酸配列を提供する工程と、第１の複数の変異体配列を含む第１の訓練データセットを生成する工程であって、前記第１の複数の変異体配列の各々が、前記抗原結合分子の前記入力アミノ酸配列における単一部位突然変異を含む、工程と、
第２の複数の配列を含む第２の訓練データセットを生成する工程であって、前記第２の複数の配列の各々が、前記第１の複数の変異体配列を含む前記第１の訓練データセットの濃縮スコアに基づく位置に複数の変異体を含む、工程と、
第１の機械学習モデルについての複数の重みおよびバイアスを生成するために、前記第２の訓練データセットを、前記第１の機械学習モデルを含む分類エンジンに提供する工程と、
前記第１の機械学習モデルについての前記複数の重みおよびバイアスに基づいて、前記分類エンジンによって、提案されたアミノ酸配列についての抗原に対する第１の親和性結合スコアを決定する工程と、
閾値を満たす前記第１の親和性結合スコアに基づいて、発現のための前記提案されたアミノ酸配列を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記抗原結合分子が、抗体、またはその抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記抗原結合分子が、キメラ抗原受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記分類エンジンによって、前記分類エンジンの第２の機械学習モデルを使用して、前記提案されたアミノ酸配列についての第２の親和性結合スコアを決定する工程と、前記閾値を満たす前記第１の親和性結合スコアおよび前記第２の親和性結合スコアに基づいて、発現のための前記提案されたアミノ酸配列を選択する工程と
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記分類エンジンによって、複数の提案されたアミノ酸配列の各々についての親和性結合スコアを決定する工程と、候補選択エンジンによって、前記複数の提案されたアミノ酸配列の各々について１つ以上のパラメータを決定する工程と、
前記候補選択エンジンによって、前記複数の提案されたアミノ酸配列の各々についての前記親和性結合スコアおよび前記１つ以上のパラメータに基づいて、前記複数の提案されたアミノ酸配列から候補変異体を選択する工程と
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記候補選択エンジンが、所定の信頼度または確率レベルで分類された前記変異体のみを選択する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記所定の信頼度または確率レベルが、０．５より大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記候補選択エンジンが、１つ以上の追加パラメータのうちの少なくとも１つについての閾値を満たす前記提案されたアミノ酸配列に基づいて変異体を選択する、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記候補選択エンジンが、前記１つ以上の追加パラメータの各々についての閾値を満たす前記提案されたアミノ酸配列に基づいて変異体を選択する、請求項５に記載の方法。
【請求項10】
前記閾値のうちの１つ以上が、値の閾値である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記閾値のうちの１つ以上が、可変閾値または相対閾値である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記追加パラメータのうちの１つ以上についての前記閾値が、上位５％または上位１０％におけるパラメータ値である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記追加パラメータのうちの１つ以上についての前記閾値が、前記１つ以上のパラメータについての平均を上回る標準偏差の数に基づく、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記１つ以上のパラメータが、粘度値、溶解度値、安定性値、薬物動態値、および／または免疫原性値を含む、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記１つ以上のパラメータが、レーベンシュタイン距離値を含む、請求項５～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記１つ以上のパラメータが、電荷値を含む、請求項５～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記電荷値が、可変断片（Ｆｖ）電荷値である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｆｖ電荷値が、約０～約６．２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記電荷値が、可変断片電荷対称パラメータ（ＦｖＣＳＰ）値である、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記ＦｖＣＳＰ値が、０より大きい、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記１つ以上のパラメータが、疎水性指数値を含む、請求項５～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記疎水性指数合計値が、４．０未満である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記１つ以上のパラメータが、タンパク質溶解度スコアを含む、請求項５～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記タンパク質溶解度スコアが、ＣａｍＳｏｌスコアである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記タンパク質溶解度スコアが、０．５より大きい、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記タンパク質溶解度スコアが、１より大きい、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記１つ以上のパラメータが、最小親和性ランクを含む、請求項５～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記１つ以上のパラメータが、平均親和性ランクを含む、請求項５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記１つ以上のパラメータが、製造責任に関連する配列モチーフを含む、請求項５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記１つ以上のパラメータが、ｎ－グリコシル化部位を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記１つ以上のパラメータが、脱アミド化部位を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項32】
前記１つ以上のパラメータが、異性化部位を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記１つ以上のパラメータが、ｎ－グリコシル化メチオニン酸化部位を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記１つ以上のパラメータが、トリプトファン酸化部位を含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記１つ以上のパラメータが、対合または非対合システイン残基を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記１つ以上のパラメータが、タンパク質構造化ベースのメトリックを含む、請求項５～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記１つ以上のパラメータが、溶媒アクセス可能表面積（ＳＡＳＡ）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記１つ以上のパラメータが、パッチ正電荷（ＰＰＣ）を含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＰＰＣ値が、１未満である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記１つ以上のパラメータが、パッチ負電荷（ＰＮＣ）を含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記ＰＮＣ値が、１．５未満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記１つ以上のパラメータが、パッチ表面疎水性（ＰＳＨ）を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＰＳＨ値が、約１００～約１５０である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記１つ以上のパラメータが、表面Ｆｖ電荷対称パラメータ（ＳＦｖＣＳＰ）を含む、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記ＳＦｖＣＳＰ値が、０より大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記候補選択エンジンが、前記候補変異体のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合についての親和性結合スコアを計算する、請求項５～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＭＨＣクラスＩＩアイソタイプＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、およびＨＬＡ－ＤＱを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記候補変異体のＭＨＣ ＩＩ分子への結合に対する前記親和性結合ランクが、ＮｅｔＮＨＣＩＩ％ランクである、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項49】
前記ＮｅｔＭＨＣＩＩ％ランクが、１０％より大きい閾値を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記第１の機械学習モデルが、再帰ニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記第１の機械学習モデルが、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記第１の機械学習モデルが、標準人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記第１の機械学習モデルが、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記第１の機械学習モデルが、ランダムフォレストアンサンブル（ＲＦ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記第１の機械学習モデルが、ロジスティック回帰モデル（ＬＲ）を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部である、請求項２および４～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ１配列を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項59】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ２配列を含む、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ１配列を含む、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ２配列を含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ３配列を含む、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体のフレームワークドメイン、または前記フレームワークドメイン内の領域を含む、請求項２および４～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体の定常ドメイン、または定常ドメインを有する領域を含む、請求項２および４～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体の全長重鎖配列を含む、請求項２および４～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記入力アミノ酸配列が、前記抗体の全長軽鎖配列を含む、請求項２および４～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記抗体が、治療抗体である、請求項２および４～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記治療抗体が、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ，Ａｍｊｅｖｉｔａ）、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）、ベズロトキシマブ（Ｚｉｎｐｌａｖａ）、カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ，Ｚｉｎｂｒｙｔａ）、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ，Ｘｇｅｖａ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ，Ｓｉｍｐｏｎｉ Ａｒｉａ）、インフレクトラ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、オララツマブ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ）、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ）、およびウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ）から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記第１の訓練データセットが、深層突然変異走査によって生成される、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
深層突然変異走査が、変異体配列の第１のライブラリを生成することを含み、各変異体配列が、前記入力アミノ酸配列に対して単一のアミノ酸位置で修飾される、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記第１のライブラリが、前記入力アミノ酸配列の各アミノ酸位置を表す変異体配列を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記第１のライブラリが、前記入力アミノ酸配列の各位置で、全ての２０個の標準アミノ酸を表す変異体配列を含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項74】
前記変異体配列の第１のライブラリが、前記入力アミノ酸配列をコードする核酸の突然変異誘発によって生成される、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記変異体配列の第１のライブラリが、哺乳類細胞における高スループット突然変異誘発によって生成される、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記高スループット突然変異誘発が、エラーが生じやすいＰＣＲ、組換え突然変異誘発、アラニンスキャニング突然変異誘発、構造誘導突然変異誘発、または相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記変異体配列の第１のライブラリが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生成される、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
深層突然変異走査が、前記変異体配列の第１のライブラリを含む複数の抗体を生成することを含む、請求項７０～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
深層突然変異走査が、抗原に結合するための前記変異体配列の第１のライブラリを含む前記複数の抗体をスクリーニングすること、および、
前記抗原に結合するために選択された変異体の配列を決定し、それによって前記第１の訓練データセットを取得すること
をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記第２の訓練データセットが、深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成される、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発が、変異体配列の第２のライブラリを生成することを含み、各変異体配列が、前記第１の訓練データセットに基づいて、２つ以上のアミノ酸位置で修飾される、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記変異体配列の第２のライブラリが、入力アミノ酸配列の前記第１の訓練データをエンコードする核酸の突然変異誘発によって生成される、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記変異体配列の第２のライブラリが、哺乳類細胞における高スループット突然変異誘発によって生成される、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項84】
前記変異体配列の第２のライブラリが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生成される、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発が、前記変異体配列の第２のライブラリを含む複数の抗体を生成することを含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
コンビナトリアル深層突然変異走査が、前記抗原に結合するための前記変異体配列の第２のライブラリを含む前記複数の抗体をスクリーニングすること、および、
前記抗原に結合するために選択された変異体の前記配列を決定し、それによって前記第２の訓練データセットを取得すること
をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記候補変異体が、前記入力アミノ酸配列以上の１つ以上のパラメータ値を有する、請求項５～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
１つ以上のプロセッサと、プロセッサ実行可能命令を格納するメモリとを含むシステムであって、前記１つ以上のプロセッサが、前記プロセッサ実行可能命令を実行して、
抗体の抗原結合部分を表す入力アミノ酸配列を受信することと、
第１の複数の変異体配列を含む第１の訓練データセットを受信することであって、前記第１の複数の変異体配列の各々が、前記抗体の前記入力アミノ酸配列における単一部位突然変異を含む、受信することと、
第２の複数の配列を含む第２の訓練データセットを受信することであって、前記第２の複数の配列の各々が、前記第１の複数の変異体配列を含む前記第１の訓練データセットの濃縮スコアに基づく位置に複数の変異体を含む、受信することと、
第１の機械学習モデルについての複数の重みおよびバイアスを生成するために、前記第２の訓練データセットを、前記第１の機械学習モデルを含む分類エンジンに提供することと、
前記第１の機械学習モデルについての前記複数の重みおよびバイアスに基づいて、提案されたアミノ酸配列についての抗原に対する第１の親和性結合スコアを決定することと、
閾値を満たす前記第１の親和性結合スコアに基づいて、発現のための前記提案されたアミノ酸配列を選択することと
を行う、システム。
【請求項89】
タンパク質またはペプチドであって、前記タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列が、請求項１～８７のいずれか一項に記載の方法、または請求項８８に記載のシステムによって生成される、タンパク質またはペプチド。
【請求項90】
前記タンパク質またはペプチドが、抗原に結合する、請求項８９に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項91】
前記タンパク質またはペプチドが、キメラ抗原受容体である、請求項９０に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項92】
前記アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ３配列を含む、請求項８９または９０に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項93】
前記タンパク質またはペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項８９、９０または９２に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項94】
前記タンパク質またはペプチドが、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である、請求項９３に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項95】
前記タンパク質またはペプチドが、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質を含む、請求項８９～９４のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項96】
前記抗原が、疾患または状態に関連付けられている、請求項９０～９５のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項97】
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項９６に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項98】
前記抗原が、抗炎症性抗原である、請求項９６に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項99】
前記抗原が、寄生虫の抗原である、請求項９６に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項100】
前記タンパク質またはペプチドが、前記入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、１つ以上の改善された特性を有する、請求項８９～９９のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項101】
前記タンパク質またはペプチドが、前記入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、製造のための改善された生物物理学的特性を有する、請求項８９～１００のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項102】
前記タンパク質またはペプチドが、前記入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、抗原に対する改善された親和性を有する、請求項８９～１０１のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項103】
前記タンパク質またはペプチドが、前記入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、免疫原性リスクが低下している、請求項８９～１０２のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項104】
図１５Ａ～図１５Ｄまたは図２３Ａ～図２３Ｏに示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質またはペプチド。
【請求項105】
前記タンパク質またはペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０４に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項106】
前記タンパク質またはペプチドが、全長抗体を含む、請求項１０５に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項107】
前記タンパク質またはペプチドが、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質を含む、請求項１０４または１０５に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項108】
前記タンパク質またはペプチドが、キメラ抗原受容体を含む、請求項１０４に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項109】
前記タンパク質またはペプチドが、融合タンパク質である、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項110】
前記タンパク質またはペプチドが、ＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子受容体２）に結合する、請求項８９～１０９のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項111】
前記タンパク質またはペプチドが、前記トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体と比較して、ＨＥＲ２抗原に対する改善された親和性を有する、請求項１１０に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項112】
請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチドを含む、細胞。
【請求項113】
請求項８９～１１２のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む、細胞。
【請求項114】
前記細胞が、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または真核細胞である、請求項１１２または１１３に記載の細胞。
【請求項115】
前記細胞が、免疫細胞である、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項116】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１１５に記載の細胞。
【請求項117】
前記Ｔ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項１１６に記載の細胞。
【請求項118】
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するために対象に投与される、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、または請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項119】
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、ＨＥＲ２陽性癌を治療するために対象に投与される、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、または請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項120】
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するための薬剤の製造のために使用される、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、または請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項121】
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、ＨＥＲ２陽性癌を治療するための薬剤の製造のために使用される、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、または請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項122】
生体サンプル中の抗原を検出するための、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチドの使用。
【請求項123】
対象における抗原をインビボで検出するための、請求項８９～１１１のいずれか一項に記載のタンパク質またはペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月９日に出願された米国特許出願第６２／８３１，６６３号の優先権を主張しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年４月９日に出願された米国特許出願第６２／８３１，６６３号の優先権を主張しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
開示の背景
抗体薬物の探索において、ファージまたは酵母ディスプレイライブラリのスクリーニングは、治療用抗体を識別するための標準的な慣行であり、典型的には、複数の潜在的なリード変異体候補を得ることができる。しかし、リード候補の最適化にかかる時間およびコストは、薬剤の前臨床探索および開発サイクルの大半を占めることが多い。これは、抗体分子のリード最適化が、発現レベル、粘度、薬物動態、溶解度、および免疫原性を含む複数のパラメータを並行して検討することが多いことに起因している。リード候補が見つかった後、追加のエンジニアリングが必要になることがある。ほとんど全ての治療抗体が全長ＩｇＧとして哺乳類細胞内での発現を必要とするという事実は、残りの開発および最適化工程がこの状況下で行われなければならないことを意味している。哺乳類細胞はプラスミドを安定して複製する能力を欠いており、約１０３個の抗体分子の最大範囲のライブラリをスクリーニングするために精緻なクローニング、トランスフェクション、および精製ストラテジを実施しなければならないため、この最後の開発段階は、低スループットで行われる。これにより、わずかな変化（例えば、単一点突然変異）しかスクリーニングできない場合がある。また、かかるタンパク質配列空間のわずかな部分を調べることは、１つの開発問題に対処することで、しばしば別の問題を引き起こすか、または抗原結合を完全に減少させ、マルチパラメータ最適化を困難にし得ることを意味している。
抗体薬物の探索において、ファージまたは酵母ディスプレイライブラリのスクリーニングは、治療用抗体を識別するための標準的な慣行であり、典型的には、複数の潜在的なリード変異体候補を得ることができる。しかし、リード候補の最適化にかかる時間およびコストは、薬剤の前臨床探索および開発サイクルの大半を占めることが多い。これは、抗体分子のリード最適化が、発現レベル、粘度、薬物動態、溶解度、および免疫原性を含む複数のパラメータを並行して検討することが多いことに起因している。リード候補が見つかった後、追加のエンジニアリングが必要になることがある。ほとんど全ての治療抗体が全長ＩｇＧとして哺乳類細胞内での発現を必要とするという事実は、残りの開発および最適化工程がこの状況下で行われなければならないことを意味している。哺乳類細胞はプラスミドを安定して複製する能力を欠いており、約１０３個の抗体分子の最大範囲のライブラリをスクリーニングするために精緻なクローニング、トランスフェクション、および精製ストラテジを実施しなければならないため、この最後の開発段階は、低スループットで行われる。これにより、わずかな変化（例えば、単一点突然変異）しかスクリーニングできない場合がある。また、かかるタンパク質配列空間のわずかな部分を調べることは、１つの開発問題に対処することで、しばしば別の問題を引き起こすか、または抗原結合を完全に減少させ、マルチパラメータ最適化を困難にし得ることを意味している。
【発明の概要】
【0003】
開示の概要
例えば、抗原に結合する抗体、またはリガンドに結合する受容体を含む、結合タンパク質のアミノ酸配列の分類のためのシステムおよび方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法により、指向性進化および機械学習が組み合わせられ、入力アミノ酸配列に基づいて新しいタンパク質が開発される。一部の実施形態では、提供する方法は、結合タンパク質の１つ以上の特性、例えば、１つの抗原、または２つ以上の（例えば、多重特異性）抗原に結合する抗体の親和性もしくは特異性の増加を改善するアミノ酸配列を識別することができる。
例えば、抗原に結合する抗体、またはリガンドに結合する受容体を含む、結合タンパク質のアミノ酸配列の分類のためのシステムおよび方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法により、指向性進化および機械学習が組み合わせられ、入力アミノ酸配列に基づいて新しいタンパク質が開発される。一部の実施形態では、提供する方法は、結合タンパク質の１つ以上の特性、例えば、１つの抗原、または２つ以上の（例えば、多重特異性）抗原に結合する抗体の親和性もしくは特異性の増加を改善するアミノ酸配列を識別することができる。
【0004】
本開示の少なくとも１つの態様によれば、方法は、結合タンパク質の一部を表す入力アミノ酸配列を提供することを含み得る。一部の実施形態では、部分は、抗体の抗原結合部分である。一部の実施形態では、部分は、結合タンパク質の１つ以上の特性（例えば、抗原結合親和性）に影響を与える。方法は、第１の複数の変異体配列を含む第１の訓練データセットを生成することを含み得る。第１の複数の配列の各々は、結合タンパク質（例えば、抗体）の入力アミノ酸配列における単一部位突然変異を含み得る。方法は、第２の複数の配列を含む第２の訓練データセットを生成することを含み得る。第２の複数の配列の各々は、第１の複数の配列を含む第１の訓練データセットの濃縮スコアに基づく位置に複数の変異体を含み得る。方法は、第１の機械学習モデルについての複数のパラメータを生成するために、第２の訓練データセットを、第１の機械学習モデルを含む分類エンジンに提供することを含み得る。方法は、第１の機械学習モデルの複数のパラメータに基づいて、分類エンジンによって、提案されたアミノ酸配列についての抗原に対する第１の親和性結合スコアを決定することを含み得る。一部の実施形態では、パラメータは、第１の学習モデルの重みおよびバイアスを含む。方法は、閾値を満たす第１の親和性結合スコアに基づいて、さらなる分析、検証、および／または発現のために提案されたアミノ酸配列を選択することを含み得る。一部の実施形態では、提案されたアミノ酸配列のさらなる分析および検証は、提案されたアミノ酸配列の開発可能性および／または治療可能性に関連するもう１つのパラメータに基づく。
【0005】
方法は、分類エンジンによって、分類エンジンの第２の機械学習モデルを使用して、提案されたアミノ酸配列についての第２の親和性結合スコアを決定することを含み得る。方法は、閾値を満たす第１の親和性結合スコアおよび第２の親和性結合スコアに基づいて、発現のために提案されたアミノ酸配列を選択することを含み得る。方法は、分類エンジンによって、複数の提案されたアミノ酸配列の各々についての親和性結合スコアを決定することを含み得る。方法は、候補選択エンジンによって、複数の提案されたアミノ酸配列の各々について１つ以上のパラメータを決定することを含み得る。方法は、候補選択エンジンによって、複数の提案されたアミノ酸配列の各々についての親和性結合スコアおよび１つ以上のパラメータに基づいて、複数の提案されたアミノ酸配列から候補変異体を選択することを含み得る。１つ以上のパラメータは、タンパク質配列に基づくメトリック、例えば、レーベンシュタイン距離値、電荷値、疎水性指数値、ＣａｍＳｏｌスコア、最小親和性ランク、または平均親和性ランキングを含み得る。タンパク質配列ベースのメトリックはまた、ｎ－グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位、メチオニン酸化、トリプトファン酸化、および対合または非対合システイン残基などの製造責任と関連付けられた配列モチーフを含み得る。１つ以上のパラメータはまた、溶媒アクセス可能表面積（ＳＡＳＡ）、パッチ正電荷（ＰＰＣ）、パッチ負電荷（ＰＮＣ）、パッチ表面疎水性（ＰＳＨ）、および表面Ｆｖ電荷対称パラメータ（ＳＦｖＣＳＰ）などのタンパク質構造化ベースのメトリックを含み得る。
【0006】
第１の機械学習モデルは、再帰ニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、標準人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレストアンサンブル（ＲＦ）またはロジスティック回帰（ＬＲ）モデルを含み得る。入力アミノ酸配列は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であり得る。入力アミノ酸配列は、抗体の１つ以上の特性の改善が望まれるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、抗体のフレームワークドメイン内の領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）、もしくは抗体の定常ドメイン内の領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。入力アミノ酸配列は、全長重鎖または全長軽鎖であり得る。入力アミノ酸配列は、抗体の１つ以上の部分を含む組換え配列であり得る。抗体は、治療用抗体であり得る。第１の訓練データセットは、深層突然変異走査によって生成され得る。深層突然変異走査は、各変異体配列が、入力アミノ酸配列に対して単一のアミノ酸位置で修飾される、変異体配列の第１のライブラリを生成することを含み得る。第１のライブラリは、入力アミノ酸配列の各アミノ酸位置を表す変異体配列を含み得る。
【0007】
第１のライブラリは、入力アミノ酸配列の各位置で全ての２０個のアミノ酸を表す変異体配列を含み得る。変異体配列の第１のライブラリは、入力アミノ酸配列をコードする核酸配列の突然変異誘発によって生成され得る。変異体配列の第１のライブラリは、突然変異誘発および突然変異体配列の好適な発現系への導入によって生成され得る。突然変異誘発方法は、エラーが生じやすいＰＣＲ、組換え突然変異誘発、アラニンスキャニング突然変異誘発、構造誘導突然変異誘発、または相同組換え修復（ＨＤＲ）などの任意の好適な方法を含み得る。発現系は、例えば、哺乳類、酵母、細菌、またはファージ発現系であり得る。変異体配列の第１のライブラリは、哺乳類細胞における高スループット突然変異誘発によって生成され得る。変異体配列の第１のライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生成され得る。深層突然変異走査は、変異体配列の第１のライブラリを含み得る複数の抗体を生成することを含み得る。深層突然変異走査は、抗原に結合するための複数の抗体および変異体配列の第１のライブラリをスクリーニングし、抗原に結合するために選択される変異体の配列および頻度を決定し、それによって第１の訓練データセットを取得することを含み得る。
【0008】
第２の訓練データセットは、深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成され得る。深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発は、変異体配列の第２のライブラリを生成することを含み得、各変異体配列は、第１の訓練データセットに基づいて、２つ以上のアミノ酸位置で修飾される。変異体配列の第２のライブラリは、哺乳類細胞における高スループット突然変異誘発によって生成され得る。変異体配列の第２のライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生成される。深層突然変異走査誘導型のコンビナトリアル突然変異誘発は、変異体配列の第２のライブラリを含む複数の抗体を生成することを含み得る。コンビナトリアル深層突然変異走査は、抗原に結合するための変異体配列の第２のライブラリを含み得る複数の抗体をスクリーニングし、抗原に結合するために選択される変異体の配列を決定し、それによって第２の訓練データセットを取得することを含み得る。
【0009】
本明細書で提供される方法によって生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドもまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、生成されたアミノ酸配列は、ＣＤＲＨ３である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、全長抗体である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、炎症性抗原、病原性抗原（例えば、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫）である。一部の実施形態では、本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、１つ以上の改善された特性を有する。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、抗原に対する改善された親和性を有する。一部の実施形態では、本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、製造のための改善された生物物理学的特性を有する。一部の実施形態では、本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、免疫原性リスクが低減されている。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するために投与され得る。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、および免疫障害を治療するための薬剤の製造に使用することができる。本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むもう１つのタンパク質またはペプチドを含む細胞もまた、本明細書に提供される。細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、または本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはペプチドを発現することができる任意の細胞であり得る。細胞は、免疫細胞、例えばＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法で使用される細胞）であり得る。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを使用して、生体サンプル中の抗原を検出することができる。
【0010】
本明細書では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドも提供される。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列は、ＣＤＲＨ３である。一部の実施形態において、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、全長抗体である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、ＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子受容体２）抗原に結合する。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体と比較して１つ以上の改善された特性を有する。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体と比較して、ＨＥＲ２抗原に対する改善された親和性を有する。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを投与して、ＨＥＲ２陽性癌を治療することができる。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを投与して、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療することができる。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するための薬剤の製造に使用することができる。一部の実施形態では、ＨＥＲ２陽性癌は、転移性癌である。本明細書では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、もう１つのタンパク質またはペプチドを含む細胞も提供される。細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、または図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを発現し得る任意の細胞であり得る。細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）などの免疫細胞であり得る。一部の実施形態では、図１５Ａ～図１５Ｄ、図２３Ａ～図２３Ｏのいずれかを示すアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを使用して、生体サンプル中のＨＥＲ２抗原を検出することができる。
【0011】
前述の概要および図面の以下の発明を実施するための形態および発明を実施するための形態は、例示的および説明的であり、特許請求される発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規の特徴は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明から、当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
添付の図面は、縮尺に合わせて描画されることを意図しない。種々の図面における同様の参照番号および指定は、同様の要素を示している。明確にするために、全ての構成要素が全ての図面にラベル付けされているわけではない。
【0013】
【図1】抗体候補を選択するためのシステム例のブロック図を示す。
【図2B】例示的な受信者操作特性を示す図である。
【図3B】例示的な受信者操作特性を示す図である。
【図5A】（Ａ）トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＣＤＲＨ３変異体配列、および（Ｂ）相同組換え突然変異誘発によるタイル化突然変異の組み込み後のフローサイトメトリプロファイルを示す。
【図5B】３ラウンドの濃縮を行った抗原特異的変異体を示しており、（Ｃ）事前選別された（Ａｂ＋）集団および事後選別された（Ａｇ＋）集団の配列分析後の対応するヒートマップである。黒丸は野生型アミノ酸を示す。（Ｄ）得られた配列ロゴプロットは、位置ごとに正に濃縮された突然変異によって生成されている。
【図5C】（Ｅ）標的抗原であるＨＥＲ２と複合体を形成したトラスツズマブの３Ｄタンパク質構造を示す（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２４）：７５６－６０）。表面に露出したアミノ酸位置１０２Ｄ、１０３Ｇ、１０４Ｆ、および１０５Ｙの位置が提供されている。
【図6A】（Ａ）配列ロゴプロットおよび（Ｂ）合理的に設計されたライブラリのトランスフェクションから生じるフローサイトメトリプロットを示す。２ラウンドの濃縮を行い、抗原特異的変異体のライブラリが作製された。
【図6B】（Ｃ、Ｄ）ライブラリ（Ａｂ＋）、非結合変異体（Ａｇ－）、および１および２ラウンドの濃縮後の結合変異体（Ａｇ＋１、Ａｇ＋２）で次世代配列決定がどのように実行されたかを示しており、（Ｃ）抗原結合変異体および（Ｄ）非結合変異体のアミノ酸頻度プロットは、全ての位置でほぼ区別不能なアミノ酸使用量を示している。
【図7A】図７Ａ～図７Ｅは、図１に示すシステム例で使用できるフィルタリングポリシーの例を示す。ヒストグラムは、フィルタリングの異なる段階における全ての予測された変異体のパラメータ分布を示す。図７Ａは、（Ａ）野生型トラスツズマブからのレーベンシュタイン距離、および（Ｂ）ＶＨドメインの実効電荷を示す。図７Ｂは、（Ｃ）ＣＤＲＨ３疎水性指数、および（Ｄ）ＣａｍＳｏｌ固有溶解度スコアを示す。図７Ｃは、（Ｅ）全ての可能な１５量体にわたる最小ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ％ランク、および（Ｆ）全ての可能な１５量体にわたる平均ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ％ランクを示す。図７Ｄは、（Ｇ）種々の平均ｎｅｔＭＨＣスコアを有する配列のカウント数、および（Ｈ）実験的および予測される結合剤の全体的な開発可能性スコアを示す。図７Ｅは、（Ｉ）フィルタリングパラメータおよびフィルタリングの対応する段階における配列の数を示す。
【図9A】図９Ａ～図９Ｂは、ｇＲＮＡのみ（左下のパネル）、ｇＲＮＡ＋ＤＭＳ ｓｓＯＤＮライブラリ（中央下のパネル）、またはｇＲＮＡ＋ＤＭＳ－コンビナトリアル突然変異誘発ライブラリ（右下のパネル）のいずれかを用いてハイブリドーマ細胞をトランスフェクションした後の、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＣＤＲＨ３変異体およびＣＤＲＨ３配列およびフローサイトメトリデータを示す。上部中央パネルは、トランスフェクション前のトラスツズマブＣＤＲＨ３変異体の代表的なフローサイトメトリプロットである。
【図10】トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＣＤＲＨ３深層突然変異走査のための例示的なフローサイトメトリデータを示す。（Ａ）抗体発現（Ａｂ＋）細胞および抗原特異的（Ａｇ＋）細胞についてのＦＡＣＳに続くフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロット。（Ｂ）抗原特異的（Ａｇ＋２）細胞の第２のラウンドの濃縮後のフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロットであり、抗原濃度の低下を、フローサイトメトリ標識に使用している。（Ｃ）抗原特異的（Ａｇ＋３）細胞のための第３のラウンドの濃縮後のフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロットであり、代替的にコンジュゲートされたフルオロフォア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）を含有する抗原で実施されるフローサイトメトリのために標識されている。全ての濃縮比（ＥＲ）は、それぞれのＡｇ＋集団に見出される突然変異体の頻度を、Ａｂ＋集団に見出される突然変異体の頻度で除算することによって計算されている。
【図11】哺乳類細胞における抗原特異的ライブラリを生成するための例示的なワークフローおよびフローサイトメトリデータを示す。合理的に設計されたライブラリを含有するｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮドナーテンプレートをトランスフェクションすることによって、ライブラリが生成される。抗体発現細胞（Ａｂ＋）は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって濃縮される。次いで、Ａｂ＋細胞は、抗原特異的変異体のための複数ラウンドの濃縮を受けることができる。抗原特異的ライブラリは、ＤＭＳ研究中の抗原濃縮の連続ラウンドに続いて計算された濃縮比から設計される。（Ａ）１ラウンドの抗原濃縮（Ａｇ＋、図１０Ａ）後にＤＭＳデータから設計したライブラリ。（Ｂ）２ラウンドの抗原濃縮（Ａｇ＋２、図１０Ｂ）後にＤＭＳデータから設計したライブラリ。（Ｃ）３ラウンドの抗原濃縮（Ａｇ＋３、図１０Ｃ）後にＤＭＳデータから設計したライブラリ。
【図12】ライブラリ（Ａｂ＋）、非結合変異体（Ａｇ－）ならびに１および２ラウンドの濃縮（Ａｇ＋１、Ａｇ＋２）後に結合変異体上で実施したＮＧＳについて検出された固有配列の配列リード、アラインメント、および数の例示的な次世代配列決定結果を示す。
【図13A】図１３Ａおよび図１３Ｂは、コンビナトリアル突然変異誘発ライブラリ上で行われたＮＧＳについて検出された配列リード、アラインメント、および固有配列の数に関する例示的な次世代配列決定結果を示す。
【図14A】図１４Ａおよび図１４Ｂは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＣＤＲＨ３ ＤＭＳベースのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリの例示的なフローサイトメトリデータを示す。ＤＭＳベースのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリのトランスフェクションおよび組み込み後、抗原特異的変異体の頻度を使用して、モデル性能および評価を補助することができる。提供される例において、抗体変異体の約１０％は、抗原特異的である。
【図16A】図１６Ａ～図１６Ｄは、開示された方法に従って予測される抗体配列についての実験的検証データを示す。図１６Ａは、トラスツズマブの発現レベルと比較した種々の予測された抗体配列のタンパク質発現レベルを示す（最も右側）。図１６Ｂは、予測される抗体配列の結合動態を示す。トラスツズマブの結合動態は、ナノモル範囲で示される。図１６Ｃは、トラスツズマブ（最も右側）の熱安定性と比較した、予測された抗体配列の熱安定性を示す。図１６Ｄは、トラスツズマブと比較した２つの予測配列（ＣおよびＦ）の免疫原性リスクを示す。
【図17A】図１７Ａ～図２１Ｂは、未知のテストデータ上の結合剤および非結合剤の分類のためのモデル性能曲線を示す。初期データセットの３０％を２つのテストデータセット（各１５％）に分割した。１つのテストデータセットには、訓練データセット（テストセットＡ）に存在する結合配列と非結合配列の同じ比率が含まれ、他のテストデータセットには、図１４Ａ～図１４Ｂに示したデータで観察される生理学的頻度に類似する１０／９０の結合配列および非結合配列（テストセットＢ）の近似比率が含まれる。（上部パネル）ＲＯＣ（受信者操作特性）曲線およびＰＲ（適合率－再現率）曲線は、テストセットＡにおける配列の分類で観察される。（下部パネル）ＲＯＣ曲線およびＰＲ曲線は、テストセットＢにおける配列の分類で観察される。（Ａ）ＬＳＴＭ－ＲＮＮ（長期短期記憶再帰ニューラルネットワーク）ＲＯＣ曲線（左パネル）、ＬＳＴＭ－ＲＮＮ ＰＲ曲線（右パネル）であり、（Ｂ）ＣＮＮ（畳み込みニューラルネットワーク）ＲＯＣ曲線（左パネル）、ＣＮＮ ＰＲ（右パネル）である。
【図24A】深層突然変異走査研究のフローサイトメトリ標識条件の表を示す。
【図24B】ＤＭＳ誘導コンビナトリアル突然変異誘発ライブラリのフローサイトメトリ標識条件を示す。
【図25】トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＣＤＲＬ３深層突然変異走査のための例示的なフローサイトメトリデータを示す。（Ａ）抗体発現（Ａｂ＋）細胞および抗原特異的（Ａｇ＋）細胞についてのＦＡＣＳに続くフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロット。（Ｂ）抗原特異的（Ａｇ＋２）細胞の第２のラウンドの濃縮後のフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロットであり、抗原濃度の低下を、フローサイトメトリ標識に使用している。（Ｃ）抗原特異的（Ａｇ＋３）細胞のための第３のラウンドの濃縮後のフローサイトメトリプロット、ヒートマップ、および配列ロゴプロットであり、代替的にコンジュゲートされたフルオロフォア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）を含有する抗原で実施されるフローサイトメトリのために標識されている。全ての濃縮比（ＥＲ）は、それぞれのＡｇ＋集団に見出される突然変異体の頻度を、Ａｂ＋集団に見出される突然変異体の頻度で除算することによって計算される。
【図26】ＣＤＲＬ３ライブラリ（Ａｂ＋）ならびに１および２ラウンドの濃縮（Ａｇ＋１、Ａｇ＋２）後に結合変異体上で実施したＮＧＳについて検出された固有配列の配列リード、アラインメント、および数の例示的な次世代配列決定結果を示す。
【図27】抗体に沿った複数の位置（例えば、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３）で哺乳類細胞において抗原特異的ライブラリを生成するための例示的なワークフローおよびフローサイトメトリデータを示す。初期ライブラリは、第１の領域について合理的に設計されたライブラリを含有するｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮドナーテンプレートをトランスフェクションすることによって生成される。抗体発現細胞（Ａｂ＋）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって濃縮される。次に、第２の領域におけるライブラリは、第２の領域について合理的に設計されたライブラリを含有するｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮドナーテンプレートをトランスフェクションすることによって生成される。抗体発現細胞（Ａｂ＋）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって濃縮される。次いで、Ａｂ＋細胞は、抗原特異的変異体のための複数ラウンドの濃縮を受けることができる。抗原特異的ライブラリは、ＤＭＳ研究中の抗原濃縮の連続ラウンドに続いて計算された濃縮比から設計される。（Ａ）２ラウンドの抗原濃縮（Ａｇ＋２、図２５Ｃ）後にＤＭＳデータから設計したＣＤＲＬ３ライブラリ。（Ｂ）２ラウンドの抗原濃縮（Ａｇ＋３、図１０Ｃ）後のＤＭＳデータから設計したＣＤＲＨ３ライブラリ。（Ｃ～Ｄ）両方の領域に導入された遺伝的多様性を検証する最終的なＣＤＲＬ３＋ＣＤＲＨ３突然変異誘発ライブラリに由来するサンガー配列決定実験の実験結果。（Ｅ）は、抗原特異的ライブラリを最初にＣＤＲＬ３で、次いでＣＤＲＨ３で生成するための例示的なワークフローおよびフローサイトメトリデータを示す。
【図28】アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）ＣＤＲＨ３深層突然変異走査の例示的なデータを示す。抗体発現（Ａｂ＋）細胞および抗原特異的（Ａｇ＋）細胞についてのＦＡＣＳ後のライブラリの深層配列決定から生成されたヒートマップおよび配列ロゴプロットであり、代替的にコンジュゲートされたフルオロフォア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）を含有する抗原を用いて実施されるフローサイトメトリのために標識されている。
【図29】アダリムマブＣＤＲＨ３ライブラリ（Ａｂ＋）ならびに１および２ラウンドの濃縮（Ａｇ＋１、Ａｇ＋２）後に結合変異体上で実施したＮＧＳについて検出された固有配列の配列リード、アラインメント、および数の例示的な次世代配列決定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
詳細な説明
上記で紹介し、以下でさらに詳しく説明する様々な概念は、特定の実装形態に限定されないため、数多くの方法の実装形態のいずれかで実施することができる。特定の実装形態および用途の例は、主に例示的な目的のために提供される。
上記で紹介し、以下でさらに詳しく説明する様々な概念は、特定の実装形態に限定されないため、数多くの方法の実装形態のいずれかで実施することができる。特定の実装形態および用途の例は、主に例示的な目的のために提供される。
【0015】
ファージおよび酵母ディスプレイスクリーニングは、大型の突然変異誘発ライブラリの高スループットスクリーニング（＞１０９）に有用であるが、それらは主に標的抗原に対する親和性または特異性の増加にのみ使用される。ほとんど全ての治療抗体は、全長ＩｇＧとして哺乳類細胞内での発現を必要とし得、これは、初期選択に続く開発および最適化工程がこの状況下で行われなければならないことを意味する。哺乳類細胞は、プラスミドを安定して複製する能力を欠いており、最大１０３個の抗体の範囲のライブラリをスクリーニングするために精緻なクローニング、トランスフェクション、および精製ストラテジを実施しなければならないため、この最後の開発段階は、非常に低いスループットで行われる。したがって、この段階では、わずかな変化（例えば、点突然変異）しかスクリーニングされず、典型的には、少数の最適化されたリードのみが得られる。また、かかるタンパク質配列空間のわずかな部分を調べることは、１つの開発問題に対処することで、しばしば別の問題を引き起こし、または抗原結合を完全に減少させ、マルチパラメータ最適化を非常に困難にし得ることを意味する。
【0016】
本明細書に記載される方法は、合理的に設計された突然変異誘発ライブラリから機械学習への指向性進化の効果的な組み合わせを用いる、改善された治療用抗体開発プロセスを含む。深層学習モデルを用いて、抗体配列空間の巨大な多様性から抗原特異性を調べ、予測することで、数千の最適化されたリード候補の生成が可能となる。
【0017】
一部の態様では、哺乳類ディスプレイプラットフォームが使用されており、ここでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）などの哺乳類の発現のための高スループット突然変異誘発システムを使用して、合理的に設計された部位特異的突然変異誘発ライブラリが導入される。本発明者らは、記載された方法に基づいて生成された比較的小さなライブラリ（例えば、約１０４）のスクリーニングおよび深層配列決定により、抗体配列に基づいて抗原結合を予測する深層ニューラルネットワークを８０％超の適合率で訓練し得る高品質のデータが得られることを見出した。
【0018】
本明細書に記載の方法に従って訓練されると、機械学習モデルを使用して、インシリコ生成された極めて大きなライブラリ変異体（例えば、トラスツズマブを入力アミノ酸配列として使用した場合、本明細書に記載の方法によって、約１０８個の変異体が生成された）から、数百万の抗原結合剤を予測することができる。これらの変異体は、複数の開発可能性フィルタに供され得、結果として、数万の最適化されたリード候補が得られる。本明細書の実施例で記載されるように、本方法を、例示的な抗体である治療抗体トラスツズマブの重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）に適用したところ、発現され、抗原結合についてアッセイされた、わずか３０個の最適化されたリード候補の小さなサブセットのうち、２９個が抗原特異的であることが観察された。したがって、テストのために選択されたほとんど全ての最適化されたリード候補は、予測された特性を有していた。そのスケーラブルなスループットおよび広大なタンパク質配列空間を調べる能力により、本明細書に記載される方法は、抗体および他のタンパク質ベースの治療薬のエンジニアリングおよび最適化を伴う多種多様な用途に適用され得る。
【0019】
本開示は、タンパク質配列－表現型の関係性の予測を行うためのシステムおよび方法を説明するものであり、抗原特異性または親和性などの１つ以上の所望のパラメータを有する治療抗体の識別に用いることができる。システムは、タンパク質配列と機能との間の複雑な関係を推測し得る１つ以上の機械学習モデルを含み得る。一部の態様では、これらのモデルは、単一部位突然変異誘発スキャン、続いてコンビナトリアル深層突然変異走査アプローチを組み合わせる、２段階の指向性進化アプローチを通じて生成された高品質の訓練データ上で訓練され得る。本明細書に記載される訓練済みモデルは、次いで、インシリコで生成された新しい抗体配列に関する予測を行うことができる。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、ファージまたは細菌ディスプレイなどの標準的な発現系で物理的に可能なものよりもはるかに大きな配列空間の調査を可能にする。例えば、１０個のアミノ酸からなる短いストレッチでは、コンビナトリアル配列の多様性は１０１３個にまで増大し、実験的に調べることはほぼ不可能である。一部の態様では、本明細書に記載されるシステムは、マルチパラメータ最適化を実行して、抗原結合剤としてモデルによって分類される変異体から、抗原特異性を示す可能性が最も高い抗原結合剤に分類される変異体を識別することもできる。
【0020】
図１は、抗体リード候補を選択する例示的なシステム１００のブロック図を示している。候補識別システム１０２は、１つ以上のプロセッサ１０４および１つ以上のメモリ１０６を含み得る。プロセッサ１０４は、本明細書に記載される機能を実行するためにプロセッサ実行可能命令を実行することができる。プロセッサ１０４は、分類エンジン１０８および候補選択エンジン１１０を実行することができる。メモリ１０６は、プロセッサ実行可能命令を格納し、データを生成し、収集されたデータを格納することができる。メモリ１０６は、１つ以上の分類器重み１１２およびフィルタリングパラメータ１１４を格納することができる。メモリ１０６はまた、分類データ１１６、訓練データ１１８、および候補データ１２０を格納することができる。
【0021】
システム１００は、１つ以上の候補識別システム１０２を含み得る。候補識別システム１０２は、プロセッサ１０４などの少なくとも１つの論理デバイスを含み得る。候補識別システム１０２は、データおよびプロセッサ実行可能命令を格納し得る少なくとも１つのメモリ要素１０６を含み得る。候補識別システム１０２は、少なくとも１つのデータセンター内に位置する複数のコンピューティングリソースまたはサーバを含み得る。候補識別システム１０２は、複数の論理的にグループ化されたサーバを含み、分散コンピューティング技術を容易にし得る。サーバの論理グループは、データセンター、サーバファーム、またはマシンファームと称され得る。サーバは地理的に分散させることもできる。候補識別システム１０２は、任意のコンピューティングデバイスであり得る。例えば、候補識別システム１０２は、１つ以上のラップトップ、デスクトップ、タブレット、スマートフォン、ポータブルコンピュータ、またはそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。
【0022】
候補識別システム１０２は、１つ以上のプロセッサ１０４を含み得る。プロセッサ１０４は、候補識別システム１０２に情報処理能力を提供することができる。プロセッサ１０４は、デジタルプロセッサ、アナログプロセッサ、情報を処理するデジタル回路、情報を処理するように設計されたアナログ回路、状態機械、および／または情報を電子的に処理するための他の機構のうちの１つ以上を含み得る。各プロセッサ１０４は、複数の処理ユニットまたは処理コアを含み得る。プロセッサ１０４は、メモリ１０６と電気的に結合することができ、分類エンジン１０８および候補選択エンジン１１０を実行することができる。
【0023】
プロセッサ１０４は、１つ以上のマイクロプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。プロセッサ１０４は、アナログプロセッサであり得、１つ以上の抵抗ネットワークを含み得る。抵抗ネットワークは、複数の入力および複数の出力を含み得る。複数の入力の各々、および複数の出力の各々は、ナノワイヤと結合され得る。入力のナノワイヤは、メモリ要素を介して出力のナノワイヤと結合され得る。メモリ要素は、ＲｅＲＡＭ、メモリスタ、またはＰＣＭを含み得る。プロセッサ１０４は、アナログプロセッサとして、アナログ信号を使用して行列ベクトル乗算を実行することができる。
【0024】
候補識別システム１０２は、１つ以上の分類エンジン１０８を含み得る。分類エンジン１０８は、データから特徴量を抽出し、抽出された特徴量に基づいてデータを分類するように構成された１つ以上の機械学習アルゴリズムを含み得る。例えば、分類エンジン１０８として、１つ以上の再帰ニューラルネットワーク（例えば、ノード間の結合が時間的動的挙動を可能にするために時間的配列に沿って指向性グラフを形成するフィードフォワードニューラルネットワークから派生したタイプの人工ニューラルネットワーク）、畳み込みニューラルネットワーク（例えば、互いに結合され、少なくとも１つの層で畳み込みを使用するノードの層を持つニューラルネットワーク）、標準的な人工ニューラルネットワーク（例えば、例または訓練データに基づいてタスクを実行することを学習するように構成された、結合されたユニットまたはノードの集合に基づくコンピューティングシステム）、サポートベクターマシン（例えば、分類および回帰分析に使用されるデータを分析する関連する学習関数を備えた教師あり学習モデル）、ランダムフォレストアンサンブル（例えば、訓練時に多数の決定木を構築し、クラスを出力することによって動作する分類、回帰、およびその他のタスクのためのコンピューティングシステム学習方法は、クラスのモードまたは個々のツリーの平均予測である）、またはロジスティック回帰モデル（例えば、ロジスティック関数を使用して、バイナリ従属変数などの特定のクラスまたはイベントが存在する確率をモデル化できる統計手法）が挙げられる。
【0025】
例えば、分類エンジン１０８は、人工ニューラルネットワークを含み得る。ニューラルネットワークは、入力層、複数の隠れ層、および出力層を含み得る。ニューラルネットワークは、多層ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、または長期短期記憶（ＬＳＴＭ）ニューラルネットワークを含む再帰ニューラルネットワークであり得る。分類エンジン１０８は、複数のニューラルネットワークまたは分類モデルを含み得る。例えば、分類エンジン１０８は、分類データ１１６を、第１の分類モデル（例えば、畳み込みニューラルネットワーク）および第２の分類モデル（例えば、ＬＳＴＭニューラルネットワーク）で処理することができる。候補選択エンジン１１０に関して以下に説明するように、候補選択エンジン１１０は、第１および第２の分類モデルによって識別された抗体として候補抗体を選択することができる。
【0026】
訓練段階の間、分類エンジン１０８は、訓練データ１１８を処理して、１つ以上の分類エンジンの機械学習モデルに対する重みおよびバイアスを生成することができる。訓練されると、分類エンジン１０８は、重みおよびバイアスを分類器重み１１２としてメモリ１０６に格納することができる。訓練データの生成および分類エンジン１０８の訓練は、以下に、メモリ１０６、訓練データ１１８、および例に関連してさらに説明される。
【0027】
分類エンジン１０８は、訓練データ１１８をニューラルネットワークに入力し、結果として生じる分類を（入力データのラベルによって定義されるように）予想される分類と比較することによって、重みおよびバイアスを生成することができる。例えば、それぞれが異なる分類に対応する１０個の出力ニューロンを含む例示的なシステムにおいて、分類エンジン１０８は、バックプロパゲーションおよび勾配降下を使用して、予想される結果と分類エンジン１０８によって決定される結果との間のコストまたは誤差を最小限に抑えることができる。分類エンジン１０８がそのニューラルネットワークを訓練すると、分類エンジン１０８は、重みおよびバイアスを分類器重み１１２としてメモリ１０６に格納することができる。分類エンジン１０８のモデル（例えば、畳み込みニューラルネットワークおよびＬＳＴＭニューラルネットワーク）は、特に、図２および３に関連してさらに説明される。
【0028】
候補識別システム１０２は、候補選択エンジン１１０を含み得る。所与のタンパク質配列空間（例えば、全ての可能なタンパク質配列変異体）について、分類エンジン１０８は、多数の変異体を抗原結合剤として分類することができる。候補選択エンジン１１０は、さらなるテストまたは研究のために、抗原結合剤として分類される変異体から候補変異体を選択することができる。候補選択エンジン１１０は、１つ以上のフィルタリングポリシーを抗原結合剤分類変異体に適用することによって候補変異体を選択することができる。フィルタリングポリシーは、それぞれが関連付けられた閾値または他の制約を有する１つ以上のフィルタリングパラメータ１１４を含み得る。抗原結合剤分類変異体が、例えば、それぞれのフィルタリングパラメータ１１４の閾値を満たす場合、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体を候補変異体として選択することができる。
【0029】
候補選択エンジン１１０は、分類エンジン１０８の２つ以上のモデルが変異体を抗原結合剤として分類する場合、抗原結合剤分類変異体を候補変異体として選択することができる。例えば、分類エンジン１０８は、畳み込みニューラルネットワークおよびＬＳＴＭニューラルネットワークを含み得る。分類エンジン１０８は、畳み込みニューラルネットワークおよびＬＳＴＭニューラルネットワークを用いて変異体空間内の変異体の各々を分類し、各変異体について２つの分類（例えば、畳み込みニューラルネットワークによる１つの分類およびＬＳＴＭニューラルネットワークによる第２の分類）を生成することができる。分類エンジン１０８が複数のモデルを用いて分類を実行し、各変異体について複数の分類を生成する場合、モデル間のコンセンサスは、フィルタリングパラメータ１１４のうちの１つであり得る。例えば、畳み込みニューラルネットワークおよびＬＳＴＭニューラルネットワークの両方によって分類される抗原結合剤変異体として分類されない変異体は、さらなる処理から破棄され得る。候補データ１２０は、畳み込みニューラルネットワークおよびＬＳＴＭニューラルネットワークの両方によって抗原結合剤分類された変異体として分類される変異体を含み得る。
【0030】
フィルタリングパラメータ１１４は、既知の野生型抗体配列との類似性メトリック要件を含み得る。例えば、候補選択エンジン１１０は、変異体空間内の各変異体と既知の野生型配列との間のレーベンシュタイン距離を計算して、それぞれの変異体と野生型配列との間の類似性を決定することができる。フィルタリングポリシーは、各候補変異体が野生型配列との類似性閾値を満たす必要があることを示し得る。例えば、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体が、例えば、５未満のレーベンシュタイン距離を有する場合、候補データ１２０に格納するための候補変異体として、抗原結合剤分類変異体を選択することができる。候補選択エンジン１１０は、一部の例では、５より大きいレーベンシュタイン距離を有する抗原結合剤分類変異体を選択することができる。
【0031】
フィルタリングパラメータ１１４は、ヒト抗体レパートリー配列との類似性メトリックを含み得る。例えば、候補選択エンジン１１０は、変異体空間内の各変異体と（例えば、患者Ｂ細胞からの）ヒト抗体配列の集合との間のレーベンシュタイン距離を計算して、それぞれの変異体とヒトレパートリーとの間の類似性を決定することができる。フィルタリングポリシーに基づいて、候補選択エンジン１１０は、ヒトレパートリー配列との類似性閾値を満たす候補変異体を選択することができる。
【0032】
フィルタリングパラメータ１１４は、タンパク質の任意の開発可能性属性を含み得、これには、例えば、実効電荷、疎水性指数、粘度、クリアランス閾値、溶解度、親和性、化学的安定性、熱安定性、発現性、特異性、交差反応性、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。候補選択エンジン１１０は、各抗原結合剤分類変異体について、抗原結合剤分類変異体の実効的な変化および疎水性を計算することができる。実効電荷および疎水性に基づいて、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体の粘度値およびクリアランス値を計算することができる。例えば、粘度は、可変断片（Ｆｖ）実効電荷の増加、およびＦｖ電荷対称パラメータ（ＦｖＣＳＰ）の増加に伴って減少し得る。フィルタリングパラメータ１１４は、ＣＤＲＬ１＋ＣＤＲＬ３＋ＣＤＲＨ３の疎水性指数合計が４．０未満で、約０～約６．２の可変断片（Ｆｖ）電荷に基づくクリアランス値を含み得る。候補選択エンジン１１０は、ｎ－グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位、メチオニン酸化、トリプトファン酸化、および対合または非対合システイン残基などの製造責任と関連付けられた配列モチーフを識別することができる。例えば、候補選択エンジン１１０は、製造責任に関連するゼロ配列モチーフを有する抗原結合剤分類変異体を選択することができる。候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体の各々のタンパク質溶解度を予測するためのタンパク質溶解度予測因子を含み得る。例えば、候補選択エンジン１１０は、１より大きい溶解度を有する抗原結合剤分類変異体を候補変異体として選択することができる。一部の実装形態では、候補選択エンジン１１０は、閾値を上回る溶解度または他の開発可能性属性を有する抗原結合剤分類変異体を選択することができる。閾値は、値の閾値であり得る。閾値は、変数または相対閾値であり得る。例えば、閾値は、抗原結合剤分類変異体の上位５％、１０％、または他の割合であり得る。別の例では、候補選択エンジン１１０は、平均を上回る複数の標準偏差を上回る抗原結合剤分類変異体を選択することができる。
【0033】
候補選択エンジン１１０は、免疫原性であり得る候補ペプチドを除去するために、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合剤分類変異体の各々についての親和性結合スコアを計算することができる。例えば、候補選択エンジン１１０は、３つのヒトＭＨＣクラスＩＩアイソタイプＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰおよびＨＬＡ－ＤＱへのペプチドの結合を予測するＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎなどのツールを利用することによって、変異体配列のＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合親和性を予測することができる。ＣＤＲＨ３配列は、５’および３’末端上の１０個のアミノ酸でパディングすることができ、次いで、考え得る全ての１５量体をＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎを介して実行することができる。候補選択エンジン１１０は、２０万個のランダムな天然ペプチドのセットと比較して、ＭＨＣクラスＩＩに対する抗原結合剤分類変異体のパーセンテージランク予測親和性を決定することができる。候補選択エンジン１１０は、約２０％、１５％、１０％、５％、または２％未満のパーセンテージランクを有する抗原結合剤分類変異体を除去することができる。パーセンテージランクが低いほど、ＭＨＣクラスＩＩに対する抗原結合剤分類変異体の予測される親和性が高い。一部の態様では、１５量体のいずれかが％ランク＜１５を含有する場合、配列をフィルタリングすることができる。残りの配列の全ての１５量体全体にわたる平均％ランクをさらに計算し、平均％ランク＜７０のものをフィルタリングすることができる。予測される結合親和性の平均値および中央値は、さらに、１５量体の各々の全てのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子全体にわたって計算することができ、平均値および／または中央値が定義された閾値よりも大きいそれらの配列をフィルタリングすることができる。フィルタリングポリシーは、抗原結合剤分類変異体が、候補変異体として選択され、候補データ１２０として格納されるために、フィルタリングパラメータ１１４のうちの１つ以上を満たす必要があることを示し得る。
【0034】
候補識別システム１０２は、１つ以上のメモリ１０６を含み得る。メモリ１０６は、メモリ要素であり得るか、またはメモリ要素を含み得る。メモリ１０６は、プロセッサ１０４によって実行されたときに、プロセッサ１０４に、本明細書に記載された動作のうちの１つ以上を実行させ得る機械命令を格納することができる。メモリ１０６は、プロセッサ１０４に命令を提供し得る電子的、光学的、磁気的、または任意の他の記憶装置を含むことができるが、これらに限定されない。メモリ１０６は、フロッピーディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、光学媒体、またはプロセッサ１０４が命令を読み取ることができる任意の他の好適なメモリを含み得る。命令は、限定されないが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、Ｐｅｒｌ、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、Ｐｙｔｈｏｎ、およびＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃなどの任意の好適なコンピュータプログラミング言語からのコードを含み得る。
【0035】
候補識別システム１０２は、分類器重み１１２をメモリ１０６に格納することができる。分類器重み１１２は、分類エンジン１０８のニューラルネットワークを定義する重みおよびバイアスを含むデータ構造であり得る。訓練されると、分類エンジン１０８は、分類データ１１６を分類する際に後で検索および使用するために、分類器重み１１２をメモリ１０６に格納することができる。
【0036】
候補データ１２０は、フィルタリングパラメータ１１４をメモリ１０６に格納することができる。上述のように、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体から候補変異体を選択するためのフィルタリングポリシーを取得することができる。候補選択エンジン１１０は、フィルタリングポリシーを適用して、所与の抗原に対して比較的高い親和性を有する可能性が高い抗原結合剤分類変異体を識別することができる。フィルタリングパラメータ１１４はそれぞれ、それぞれのフィルタリングパラメータ１１４の閾値を示すデータ構造であり得る。例えば、フィルタリングパラメータは、所与の抗原結合剤分類変異体についての抗体が、約０～約６の間のＦｖ実効電荷を有し得ることを示し得る。各フィルタリングパラメータ１１４は、特定のパラメータおよび所定の閾値（例えば、２を上回る）、所定の範囲（例えば、０～６の間）、適応閾値（例えば、抗原結合剤分類変異体の上位５％内の予測された親和性を有する）、または適応範囲（例えば、抗原結合剤分類変異体の予測された親和性の上位１％～５％の間）を示し得る。
【0037】
候補識別システム１０２は、分類データ１１６をメモリ１０６に格納することができる。分類データ１１６は、分類エンジン１０８によって分類される複数の変異体であり得る。分類データ１１６は、所与の配列についての変異体空間内の各変異体を含み得る。例えば、候補識別システム１０２は、所定の抗体から開始し、抗体の全ての可能な変異体を計算することができる。変異体の各々は、分類データ１１６としてメモリ１０６に格納され得る。
【0038】
候補識別システム１０２は、訓練データ１１８をメモリ１０６に格納することができる。訓練データ１１８は、複数の変異体の表示を含むデータ構造を含み得る。訓練データ１１８の各変異体は、別個に（例えば、単一の文字列またはベクトルとして）または集合的に（例えば、各列または行が異なる変異体に対応する行列として）格納され得る。訓練データは、それぞれの変異体が結合変異体であるか非結合変異体であるかを示すために、訓練データ１１８とラベル付けされ得る。例えば、各変異体は、変異体の配列をエンコードするバイナリファイルとして格納され得る。バイナリファイルには、変異体が結合変異体であることを示すために設定する（例えば、１に設定する）ことができるか、または変異体が非結合変異体であることを示すために設定する（例えば、０に設定する）ことができる、先頭（または末尾（ｔｒａｉｌｉｎｇ））ビットが含まれ得る。
【0039】
訓練データ１１８は、選択されたパラメータ（例えば、抗原結合）に基づいて合理的に設計された変異体のライブラリの物理的スクリーニングによって選択される変異体の集合であり得る。例えば、一部の実施形態では、訓練データは、数値を含む。一部の実施形態では、数値は、変異体の集合の結合動態値に対応する。一部の実施形態では、数値は、生物物理学的アッセイの数値結果（例えば、熱安定性のための融解温度、または溶解性のためのＡＣ－ＳＩＮＳ）に対応する。訓練データを生成するための例示的な方法がさらに詳細に説明される（例えば、図４Ａを参照されたい）。
【0040】
分類エンジン１０８は、訓練データ１１８を使用して訓練することができる。分類エンジン１０８は、この例において、標的抗原に対する特異性を予測するように訓練され得る。以下にさらに説明するように、図２および図３に関連して、（分類データ１１６のような）訓練データ１１８は、分類エンジン１０８に入力するためにワンホットエンコーディングされ得る。訓練データ１１８は、訓練データおよびテストデータに分割することができる。例えば、訓練データを使用して分類エンジン１０８を訓練することができ、テストデータを予約して、分類エンジン１０８の訓練の代わりに、訓練済み分類エンジン１０８の精度および適合率をテストすることができる。テストデータは、分類エンジン１０８が、テストデータの変異体が適切に分類されたかどうかを判定することを可能にするようにラベル付けされ得る。一例では、訓練データ１１８の７０％を訓練のために確保することができ、３０％を分類エンジン１０８のテストまたは評価のために使用することができる。テストデータは、結合剤と非結合剤の変異体の所定の割合を含むように分割され得る。例えば、テストデータは、生理学的頻度に類似するように、約１０／９０の結合剤／非結合剤に分割することができる。
【0041】
候補選択エンジン１１０は、候補変異体を候補データ１２０としてメモリ１０６に格納することができる。候補データ１２０は、フィルタリングポリシーのパラメータを満たす抗原結合剤分類変異体の各々を示し得るデータ構造であり得る。候補データ１２０は、抗原結合剤分類変異体をフィルタリングポリシーで処理する前に、または処理せずに、抗原結合剤として分類された各変異体を示し得るデータ構造であり得る。データ構造は、テキストベースのファイルまたは変異体の配列を示すバイナリファイルであり得る。例えば、配列は、テキストベースのファイルに文字列として格納することができる。データ構造（またはファイル）は、どの位置が野生型に関して突然変異したか、および突然変異の性質などのメタデータを含み得る。メタデータは、分類エンジン１０８が抗原結合剤分類変異体を抗原結合剤分類変異体として分類した確実性を示す分類スコアを含み得る。
【0042】
図２は、例示的なニューラルネットワーク２００を図示する。ニューラルネットワーク２００は、ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００であり得る。図２Ａを参照されたい。ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００は、ニューロン２０２とも称され得る複数のノード２０２を含み得る。ノード２０２は、層状に配置され得る。例えば、ノード２０２は、ノード２０２の入力層、ノード２０２の１つ以上の隠れ層、およびノード２０２の出力層を含み得る。各層は、１つ以上のノード２０２を含み得る。例えば、入力層は、１０個のノード２０２を含み得（例えば、入力層内のノード２０２の数は、入力ベクトル２０４の長さに等しい）、出力層は、１つのノード２０２を含み得る。出力層のノード２０２は、入力ベクトル２０４が抗原結合剤分類変異体に対応する確率を示し得る。ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００は、２つの出力ノード２０２を含み得、１つのノード２０２は、変異体が抗原結合剤分類変異体である可能性を提供し、第２のノード２０２は、変異体が非抗原結合剤分類変異体である可能性を提供する。
【0043】
ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００は、約２～約１０、約２～約８、約２～約６、約２～約４、または約２～約３層を含み得る。各層は、同じ数のノード２０２または異なる数のノード２０２を含み得る。入力層は、ワンホットエンコーディング行列入力上の各値についてのノード２０２を含み得る。例えば、１０×２０のワンホットエンコーディング行列について、入力層は、２００個のノード２０２を含み得る。入力層内のノード２０２の数は、入力配列内の値の数（例えば、配列内のアミノ酸の数）に各値の可能な値の数を乗算したものに基づき得る。例えば、位置当たり２０個の可能なアミノ酸を有する長さ１０の配列について、入力層は、１０×２０＝２００のノード２０２を含み得る。ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００は、複数の隠れ層を含み得る。隠れ層の各々は、同一のまたは異なる数のノード２０２を含み得る。隠れ層は、入力層よりも少ないノード２０２を含み得る。例えば、隠れ層は、各々４０のノード２０２を含み得る。
【0044】
層内の各ノード２０２は、後続の層内の各ノード２０２にリンクされ得る。各ノード２０２は、それが結合されるノード２０２に、ノードの入力の加重和を出力する。ノード２０２は、出力をバイアスするために、加重和にバイアスを追加することができる。ノード２０２は、ノード２０２が加重和に基づいて信号をいつ「発火」または出力するかを判定する活性化関数（例えば、シグモイド関数、正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）、または漏れ正規化線形ユニット）を含み得る。各リンクの重みおよび各ノード２０２のバイアスは、訓練段階中に設定され、分類器重み１１２として格納され得る。ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００は、再帰ニューラルネットワークであり得、各ノード２０２は、それ自体にフィードバック（または入力）を提供し得る。再帰ニューラルネットワークは、時間的挙動を示す内部状態を作成することができる。
【0045】
変異体を分類するために、分類エンジン１０８は、変異体の配列を入力ベクトル２０４に変換し、この入力ベクトル２０４の各値は、配列の各アミノ酸に対応する。入力ベクトル２０４は、入力配列の長さに等しい長さを有する。分類エンジン１０８は、入力ベクトル２０４をワンホットエンコードして、行列２０６を生成することができる。入力ベクトル２０４は、変異体配列の他の特徴量を含み得る。例えば、変異体配列の生物物理学的特性を入力ベクトル２０４にエンコードすることができる。行列２０６の各行は、入力ベクトル２０４のそれぞれの値（例えば、位置）に対応する。行列２０６の各列は、異なる可能性のあるアミノ酸に対応しており、これにより、入力ベクトル２０４のそれぞれの値を満たすことができる。この例では、２０個のアミノ酸が存在するので、行列２０６は、２０個の列を含む。行列２０６の各行には、入力ベクトル２０４のそれぞれの値に存在するアミノ酸に対応する列に１が含まれる。行列２０６は、ベクトルに平滑化され得、ベクトルからの各値は、入力層のノード２０２のうちの１つに提供され得る。行列２０６は、入力層のノード２０２に順次提供され得る。例えば、入力層は、１０個の入力ノード２０２を含み得、行列２０６の列（例えば、各列の１０個の値）は、入力ノード２０２に順次提供され得る。
【0046】
変異体を分類するために、分類エンジン１０８は、変異体の配列を入力ベクトル２０４に変換することができ、この入力ベクトル２０４の各値は、配列の各アミノ酸に対応する。入力ベクトル２０４は、入力配列の長さに等しい長さを有する。各個々のアミノ酸が物理的特性（例えば、電荷、疎水性、体積）の集合で表されるため、入力ベクトルのエンコーディングは、タンパク質の物理的特性に基づいて行うこともできる。
【0047】
図２Ｂは、テストデータセット上のＬＳＴＭニューラルネットワーク２００の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線２０８およびＬＳＴＭニューラルネットワーク２００の適合率－再現率（ＰＲ）曲線２１０を示している。ＲＯＣ曲線２０８およびＰＲ曲線２１０は、ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００の精度を示している。曲線２０８および２１０は、ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００に、非結合剤への結合剤の５０／５０分割における未知の変異体のテストデータセットを提供することによって生成された。
【0048】
図３は、例示的なニューラルネットワーク３００を示している。ニューラルネットワーク３００は、畳み込みニューラルネットワーク３００であり得る。図３Ａを参照すると、畳み込みニューラルネットワーク３００は、複数のノード２０２を含み得る。畳み込みニューラルネットワーク３００は、複数の層３０２を含み得る。ニューラルネットワーク２００とは異なり、畳み込みニューラルネットワーク３００内の層３０２の各々は、完全に結合されなくてもよい。例えば、所与の層３０２のノード２０２は、後続の層３０２内の各ノード２０２に結合されていなくてもよい。畳み込みニューラルネットワーク３００は、複数のフィルタを含み得る。畳み込みニューラルネットワーク３００は、複数のフィルタの各々と行列２０６とを畳み込み、複数の特徴量マップを生成することができる。各フィルタは、行列２０６内の所定のパターンを検出するように構成され得る。フィルタは、拡張率が１、ストライドサイズが１で、カーネルサイズが３である１Ｄ畳み込みフィルタであってもよく、これは、サイズ２０×３のフィルタをもたらし得る。畳み込みニューラルネットワーク３００は、約１００～約４００個のフィルタを含み得る。フィルタの数は、交差検証、またはデータを訓練／検証／テストセットに分割し、ランダム／グリッドサーチを介して最適な構成を選択することによって選択できる。畳み込みニューラルネットワーク３００は、特徴量マップの空間サイズを減少させるために１つ以上の最大プーリング層を含み得る。畳み込みニューラルネットワーク３００は、平坦化層を含み得、平坦化層は、ノードの全結合層についての入力ベクトルに最大プーリング層を平坦化する。平坦化層における各値は、高密度（または全結合）層におけるノード２０２の各々への入力として機能することができる。畳み込みニューラルネットワーク３００は、高密度層内に５０個のノード２０２を含み得る。ノードの数は、限定された交差検証／グリッドサーチ手順に基づいて選択することができる。ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００と同様に、高密度層の各ノード２０２は、出力ノード２０２への入力として機能することができる。
【0049】
図３Ｂは、テストデータセット上の畳み込みニューラルネットワーク３００のＲＯＣ曲線３０８および畳み込みニューラルネットワーク３００のＰＲ曲線３１０を図示する。ＲＯＣ曲線３０８およびＰＲ曲線３１０は、畳み込みニューラルネットワーク３００の精度を示している。曲線３０８および３１０は、畳み込みニューラルネットワーク３００に、非結合剤と結合剤との５０／５０分割で未知の変異体を提供することによって生成された。
【0050】
特に、図２および図３を参照すると、ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００および畳み込みニューラルネットワーク３００アーキテクチャおよびハイパーパラメータは、様々なパラメータにわたってグリッドサーチを実行することによって選択された。例えば、ＬＳＴＭニューラルネットワーク２００では、グリッドサーチを実行して、層ごとのノード２０２、バッチサイズ、エポック数、および最適化機能を決定した。畳み込みニューラルネットワーク３００のために、分類エンジン１０８は、データセットのｋ分割交差検証に基づいて、高密度層ノード内のフィルタの数、カーネルサイズ、ドロップアウト率、ノードの数２０２を決定する。
【0051】
図４Ａは、訓練データ１１８を生成するためのフロープロセス４００を示している。訓練データ１１８は、選択されたパラメータ（例えば、抗原結合）に基づいて合理的に設計された変異体のライブラリの物理的スクリーニングによって選択される変異体の集合であり得る。フロープロセス４００は、例えば、相同組換え突然変異誘発（ＨＤＭ）または任意の他の好適な突然変異誘発方法を使用して、点突然変異ライブラリを生成することを含み得る。一部の態様では、変異体の集合は、単一部位（すなわち、点突然変異）およびコンビナトリアル深層突然変異走査（ＤＭＳ）プロセスを含む２段階のスクリーニングプロセスにおいて選択され、その一例がフロープロセス４００に示されている。抗体の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）のアミノ酸配列は、抗原特異性の重要な決定因子である。したがって、この選択領域（例えば、ＣＤＲＨ３の１０個のアミノ酸）に対して２段階のＤＭＳプロセスを実行して、アミノ酸位置を決定する特異性を解明することができる。一部の態様では、抗体がもはやその抗原に結合しないような変異体ＣＤＲＨ３配列（例えば、突然変異ＣＤＲＨ３配列）を有する突然変異体全長抗体を、開始配列として使用することができる。突然変異体非結合変異体から開始することで、元の配列からのバックグラウンドを減少させることによって、ライブラリからの結合剤の選択の際に利点が得られる。一部の代替的な実装形態では、プロセスは、その抗原に依然として結合する変異体から開始することができる。
【0052】
図４Ａは、抗体のＣＤＲＨ３のための訓練データを例示しているが、本明細書に記載される方法はそのように限定されるものではなく、抗体またはリガンドに結合する受容体などの他の結合タンパク質における１つ以上の関心領域の変異体の集合に適用され得る。例えば、変異体の集合は、抗体の１つ以上の特性の改善が望まれる抗体の他のＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、２つ以上のＣＤＲ領域の組み合わせ、抗体のフレームワークドメイン内の領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）、または抗体の定常ドメイン内の領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を表すことができる。一部の態様では、変異体は、全長抗体である。一部の態様では、変異体は、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質などの抗原結合ドメインを含む、組換え抗体の抗体の断片である。一部の態様では、訓練データは、リガンドに結合する受容体などの結合タンパク質の変異体に由来する。
【0053】
例示的なフロープロセス４００の第１の工程では、突然変異誘発方法をＣＤＲＨ３配列に適用し、ＣＤＲＨ３配列の各位置に単一部位としての変異体のライブラリが生成される（本明細書では、単一部位ＤＭＳと称する）。単一点突然変異を生成する任意の好適な方法を用いることができる。一部の態様では、全長抗体変異体配列を発現するハイブリドーマ細胞株が使用される。変異体抗体配列のライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性相同組換え突然変異誘発（ＨＤＭ）によって生成することができる（例えば、参照によりその全体が組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２０１７／１７４３２９号を参照されたい）。例えば、ＣＤＲＨ３のＣａｓ９標的化のためのｇＲＮＡ、およびＣＤＲＨ３全体の単一アミノ酸位置にＮＮＫ縮合コドンを含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）形態の相同性テンプレートのプールを使用して、抗体のＣＤＲＨ３内の単一部位に点突然変異を導入することができる。あるいは、任意の好適な突然変異誘発方法を使用して、変異体、例えば、エラーが生じやすいＰＣＲ、組換え突然変異誘発、アラニンスキャニング突然変異誘発、構造誘導突然変異誘発を生成することができる。一部の態様では、突然変異誘発は、インビトロ技術（例えば、ＰＣＲ）を使用して、対象のアミノ酸配列をコードする核酸配列上で、次いで、哺乳類細胞に導入された変異体核酸上で（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＨＤＲによって）行われ得る。
【0054】
次いで、変異体全長抗体を発現する細胞のライブラリを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などにより、抗原結合を検出するための好適な方法によってスクリーニングすることができる。スクリーニングプロセスの第１の工程の例示的なＦＡＣＳ結果を、プロセス４００の第１の工程に示している。次いで、抗体を発現し、結合または非結合抗原のために選択された細胞の集団を、深層配列決定に供して、選択された細胞によって発現される抗体配列を決定することができる。
【0055】
フロープロセス４００は、深層突然変異走査を含んでおり、アッセイされた各アミノ酸位置の濃縮スコアを決定し、どの位置が変異を突然変異を受け入れるのに適しているか、または適していないかを判定することができる。例えば、変異体ライブラリをＦＡＣＳによってスクリーニングし、抗体を発現し、抗原に結合するか、または結合しない集団を、深層配列決定に供した。一部の態様では、２つ以上の抗原（例えば、交差反応性または多重特異性抗体）に結合する細胞集団が選択される。濃縮比（ＥＲ）と称され得る濃縮スコアは、ＦＡＣＳ、ｆｉ、Ａｇ＋によって抗原特異性を濃縮した変異体のクローン頻度と、元のライブラリ、ｆｉ、Ａｂ＋に存在する変異体のクローン頻度との比であり得る。より具体的には、以下のようになる。
【0056】
一部の実装形態では、ｌｏｇ［ＥＲ］値が－２以下の変異体に最小値の－２が指定され、データセットに存在しない変異体は計算から除外された。ＣＤＲＨ３の特定のアミノ酸配列に基づいて、クローンを定義した。次いで、ヒートマップおよびそれらの対応する配列ロゴプロットは、スクリーニングプロセスの第１の工程からの濃縮スコアに基づいて生成することができる。次いで、ヒートマップおよび配列ロゴプロットを使用して、スクリーニングのためのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリを合理的に設計することができる。縮重コドンは、ＤＭＳデータの分析に見出される濃縮度または濃縮スコアに最もよく似たそれらのアミノ酸頻度に基づく位置ごとに選択することができる。例えば、合理的なライブラリ設計のためのコドン選択は、以下の式に基づき得る。正の濃縮スコア（例えば、ＥＲ＞１、またはｌｏｇ［ＥＲ］＞０）を有するＤＭＳ分析で特定されたアミノ酸位置を、それらの濃縮比に従って正規化し、理論頻度に変換した。次いで、縮重コドンスキームが選択された。これは、縮重コドンと標的頻度との間の平均二乗誤差によって計算されるこれらの頻度を最もよく反映するものである。
【0057】
例えば、ヒートマップおよび配列ロゴプロットから、１０３位（図５）は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基の受容度が高く、アラニン（Ａ）の受容度は低いことがわかる。これらの残基の濃縮スコアは、約６６％のＧ、２５％のＳ、および９％のＡの正規化された頻度に対応する。これらの頻度は、次いで、上記の最適コドン式（例えば、式２）への入力値であり、全ての３，３７５個の可能な縮重コドンスキームと比較される。この例では、正規化濃縮スコアによって定義される標的頻度に最も近い頻度（５０％のＧ、５０％のＳ）を有する縮重コドンスキームを表すので、縮重コドンスキーム「ＲＧＹ」が選択された。複数の位置にわたって縮重コドンを組み合わせると、巨大な理論的タンパク質空間が生成される。一例として、全ての位置にわたる１位置あたりの全ての潜在的なアミノ酸の積をとることにより、本明細書に提供される実施例に記載されるトラスツズマブ抗体のために生成されるコンビナトリアルライブラリは、６．６７×１０８の理論的なタンパク質配列空間を有することとなり、これは、２００の単一部位ＤＭＳライブラリ多様性よりもはるかに大きい。次いで、ＣＤＲＨ３変異体を含有するコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリを、例えば、ＨＤＭを介してハイブリドーマ細胞内で物理的に生成することができる。次いで、抗原結合細胞を、ＦＡＣＳによる１ラウンド以上の濃縮によって単離し、結合集団または非結合集団を深層配列決定に供することができる。次いで、この第２の工程からの結合または非結合集団を表す配列決定データを、機械学習モデルの訓練セットとして使用することができる。
【0058】
図４Ｂは、候補変異体を選択するためのプロセスフロー４５０を示している。プロセスフロー４５０は、プロセスフロー４００中に生成された訓練済みデータを用いて本明細書に記載されるモデルを訓練することを含み得る。訓練データが生成され、分類エンジン１０８が訓練されると、突然変異の完全な配列空間をインシリコで生成することができる。完全な配列空間には、各可能な突然変異が含まれ得る。完全な配列空間内の変異体の数は、分類エンジン１０８が訓練済み変異体の数よりも大きい数のオーダーであり得る。分類エンジン１０８は、全配列空間の変異体を処理して、変異体を抗原結合剤分類変異体または非抗原結合剤分類変異体として分類することができる。プロセスフロー４５０は、候補選択エンジン１１０が、抗原結合剤分類変異体をマルチパラメータ最適化を用いてフィルタリングして、１つ以上の候補変異体を選択することを含み得る。候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体がフィルタリングポリシーを満たすかどうかを判定することによって、抗原結合剤分類変異体をフィルタリングすることができる。フィルタリングポリシーは、モデルコンセンサス（例えば、ＬＳＴＭニューラルネットワークおよび畳み込みニューラルネットワークの各々が、変異体を抗原結合剤分類変異体として分類したもの）、粘度値、溶解度値、安定性値、薬物動態値、および免疫原性値などのパラメータ要件を含み得る。
【0059】
【0060】
図７は、フィルタリングポリシー７００および複数のパラメータのプロットを示している。上述のように、抗原結合剤分類変異体の各々について、候補選択エンジン１１０は、パラメータ値を計算することができる。システム１００は、例えば、レーベンシュタイン距離値、電荷値、疎水性指数値、ＣａｍＳｏｌスコア、最小親和性ランク、および各抗原結合剤分類変異体の平均親和性ランキングを計算することができる。システム１００はまた、ｎ－グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位、メチオニン酸化、トリプトファン酸化、および対合または非対合システイン残基などの、製造責任に関連する抗原結合剤分類変異体配列モチーフの各々内で識別することができる。
【0061】
フィルタリングポリシー７００は、複数のパラメータ要件を含み得る。候補選択エンジン１１０は、パラメータ要件を並行して適用することができる。例えば、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体の各々のパラメータ値の各々を計算し、抗原結合剤分類変異体がフィルタリングポリシー７００のパラメータ要件を満たすかどうかを判定することができる。候補選択エンジン１１０は、パラメータ要件を直列に適用することができる。例えば、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体のパラメータを順次計算し、抗原結合剤分類変異体が所与のパラメータに必要なパラメータを満たすかどうかを判定することができる。次いで、システム１００は、第１のパラメータ要件を満たした抗原結合剤分類変異体の次のパラメータ値のみを計算し得る。抗原結合剤分類変異体がパラメータ要件を満たさない場合、候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体の残りのパラメータ値を計算しなくてもよい。これにより、抗原結合剤分類変異体をフィルタリングするのに必要な計算リソースを減少させることができる。これは、パラメータ値が、フィルタリングプロセスによって一旦除去されると、抗原結合剤分類変異体について計算されないためである。したがって、パラメータ要件を満たさない抗原結合剤分類変異体のパラメータ値を計算しないことを決定することによって、本技術解決策は、最適な変異体を識別しながら、計算リソース消費（例えば、プロセッサ利用率、メモリ利用率、またはネットワーク帯域幅利用率）を削減することができる。
【0062】
さらに図７を参照すると、候補選択エンジン１１０は、まず、再帰ニューラルネットワーク（ＲＮＮ）および畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）によって出力される抗原結合剤分類変異体を決定することができる。候補選択エンジン１１０は、それぞれのニューラルネットワークによって所定の信頼度で分類変異体のみを選択することができる。例えば、図７に示すように、候補選択エンジン１１０は、再帰ニューラルネットワークによって識別された４，３１５，３２３個の抗原結合剤分類変異体、および０．７５より大きい信頼度または確率を有する畳み込みニューラルネットワークによって識別された５，２１８，７０６個の抗原結合剤分類変異体を識別することができる。フィルタリングポリシー７００の次のフィルタは、畳み込みニューラルネットワークおよび再帰ニューラルネットワークの両方によって識別される抗原結合剤分類変異体を識別することを含み得る。候補選択エンジン１１０は、畳み込みニューラルネットワークおよび再帰ニューラルネットワークの両方によって識別される３，１５９，３７３個の抗原結合剤分類変異体を、０．７５より大きい確率で識別することができる。次いで、候補選択エンジン１１０は、６．６１より大きい電荷対称パラメータ、６．２未満の実効電荷、および４未満の疎水性指数を有する抗原結合剤分類変異体を識別し、４０２，６３３個の抗原結合剤分類変異体を返すことができる。次いで、候補選択エンジン１１０は、０．５より大きい溶解度スコアを有する抗原結合剤分類変異体を識別し、１４，１２５個の抗原結合剤分類変異体を返すことができる。次いで、候補選択エンジン１１０は、５．５％より大きいＮｅｔＭＨＣＩＩ最小親和性ランクと６０．６％より大きい平均親和性ランクとを有する抗原結合剤分類変異体を識別し、４，８８１個の抗原結合剤分類変異体を返すことができる。本例における残りの全ての抗原結合剤分類変異体は、トラスツズマブの開始候補配列のパラメータと同等またはそれ以上の値を含有する。次いで、候補選択エンジン１１０は、全てのパラメータにわたって最高の全体的な開発可能性を有する抗原結合剤分類変異体を識別することができ、これにより、あらかじめ定義されたパーセンテージに従って、残りの候補変異体の上位パーセンテージ内の抗原結合剤分類変異体が返される。システム１００は、さらに、５未満のレーベンシュタイン距離を有する抗原結合剤分類変異体を識別することができる。
【0063】
図８は、抗原親和性を有する抗体を識別する例示的な方法８００のブロック図を示している。方法８００は、訓練データを生成することを含み得る（動作８０２）。方法８００は、分類モデルを訓練することを含み得る（動作８０４）。方法８００は、変異体を分類することを含み得る（動作８０６）。方法８００は、変異体をフィルタリングすることを含み得る（動作８０８）。方法８００は、変異体を選択することを含み得る（動作８１０）。
【0064】
上述のように、方法８００は、訓練データを生成することを含み得る（動作８０２）。また、図１を参照すると、分類エンジン１０８は、訓練のために訓練データ１１８を使用して、未知の変異体を分類するための分類器重み１１２を決定することができる。訓練データ１１８は、単一部位突然変異プロセス、続いてＤＭＳベースのコンビナトリアルプロセスを含む２段階のプロセスを使用して生成され得る。
【0065】
方法８００は、分類モデルを訓練することを含み得る（動作８０４）。上述のように、分類エンジン１０８は、１つ以上の分類モデルを含み得る。例えば、分類エンジン１０８は、再帰ニューラルネットワークまたは畳み込みニューラルネットワークを含み得る。分類エンジン１０８は、再帰ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、標準人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレストアンサンブル（ＲＦ）またはロジスティック回帰（ＬＲ）モデルを含み得る。訓練データ１１８は、ワンホットエンコーディング行列としてラベル付けされ、ニューラルネットワークに渡され得る。分類エンジン１０８は、バックプロパゲーションおよび勾配降下を使用して、予想される結果と分類エンジン１０８によって決定される結果との間のコストまたは誤差を最小限に抑えることができる。分類エンジン１０８がそのニューラルネットワークを訓練すると、分類エンジン１０８は、重みおよびバイアスを分類器重み１１２としてメモリ１０６に保存することができる。
【0066】
方法８００は、変異体を分類することを含み得る（動作８０６）。一部の実施態様では、所与の抗体について、候補識別システム１０２は、インシリコで抗体の変異体の完全な配列空間を生成することができる。例えば、候補識別システム１０２は、所与の抗体またはその一部に関する全ての可能な配列変異を生成することができる。分類エンジン１０８は、分類器重み１１２をロードすることができる。分類エンジン１０８は、完全な配列空間の変異体の各々を、畳み込みニューラルネットワークおよび再帰ニューラルネットワークの入力層に渡すことができる。例えば、各変異体において、分類エンジン１０８は、変異体が抗原結合剤分類変異体である可能性を判定することができる。分類エンジン１０８は、閾値を超える確率で抗原結合剤分類変異体をメモリ１０６内の抗原結合剤分類変異体として格納することができる。
【0067】
方法８００は、抗原結合剤分類変異体をフィルタリングすることを含み得る（動作８０８）。候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体をフィルタリングして候補変異体を識別することができる。候補変異体は、生存抗体を産生する可能性が最も高い抗原結合剤分類変異体であり得る。候補選択エンジン１１０は、メモリ１０６からフィルタリングポリシーを取り出すことができる。フィルタリングポリシーは、抗原結合剤分類変異体が候補変異体として選択されるために満たす必要がある複数のパラメータを含み得る。候補選択エンジン１１０は、抗原結合剤分類変異体のパラメータを計算し、それぞれの抗原結合剤分類変異体の各々がフィルタリングポリシーのパラメータ要件を満たすかどうかを判定することができる。
【0068】
方法８００は、変異体を選択することを含み得る（動作８１０）。候補変異体（例えば、フィルタリングポリシーのパラメータを満たす抗原結合剤分類変異体）は、さらなる組換え発現のために選択されて、変異体が抗原特異的結合を有する抗体を産生することをテストすることができる。一部の実装形態では、候補変異体のサブ部分は、組換え発現およびテストのためにランダムに選択され得る。
【0069】
動作が特定の順序で図面に示されているが、かかる動作は、示されている特定の順序または順番で実行される必要はなく、例示されている動作は全て実行される必要はない。本明細書に記載される作用は、異なる順序で実行され得る。
【0070】
種々のシステム構成要素の分離は、全ての実装形態において分離を必要とせず、説明されたプログラム構成要素は、単一のハードウェアまたはソフトウェア製品に含めることができる。
【実施例】
【0071】
Ｉ．実施例
本実施例は、本明細書に記載されるシステムおよび方法の、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体のＣＤＲＨ３への例示的に適用し、対応する標的ＨＥＲ２抗原への抗体結合を分類することを説明するものである。
本実施例は、本明細書に記載されるシステムおよび方法の、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体のＣＤＲＨ３への例示的に適用し、対応する標的ＨＥＲ２抗原への抗体結合を分類することを説明するものである。
【0072】
Ａ．結果
１）抗原特異的配列のランドスケープを決定し、合理的な抗体ライブラリ設計をガイドする深層突然変異走査
抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は、抗原特異性の重要な決定因子であるため、この領域に対して深層突然変異走査（ＤＭＳ）を行い、特異性決定残基を解明した。最初に、ＨＥＲ２抗原（突然変異ＣＤＲＨ３配列）に結合することができなかったトラスツズマブ変異体を発現するハイブリドーマ細胞株を使用した（図９）。ライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性相同組換え突然変異誘発（ＨＤＭ）（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９）によって生成された。これは、ＣＤＲＨ３のＣａｓ９標的化にｇＲＮＡを利用し、ＣＤＲＨ３全体にタイル化された単一部位にＮＮＫ縮重コドンを含む一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形の相同性テンプレートのプールを利用していた（図５Ａ）。次いで、ライブラリを蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングし、抗体および結合または結合しない抗原を発現する集団を深層配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）に供した（図１０）。次いで、深層配列決定データを使用して、調査した１０個の位置の濃縮スコアを計算した。これにより、広範囲の突然変異に十分に適応できる６つの位置と、定義された突然変異をわずかに受け入れていた追加の３つの位置が明らかとなった（図５Ｂおよび図５Ｃ）。残基１０３１０２Ｄ、１０３Ｇ、１０４Ｆ、１０５Ｙは、ＣＤＲＨ３ループのＨＥＲ２との一次接触アミノ酸と思われるが（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｎ８Ｚ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２４）：７５６－６０、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３４（２１）：３７５５－５８）、１０５Ｙは完全に固定された唯一の残基である（図５Ｄ）。
１）抗原特異的配列のランドスケープを決定し、合理的な抗体ライブラリ設計をガイドする深層突然変異走査
抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は、抗原特異性の重要な決定因子であるため、この領域に対して深層突然変異走査（ＤＭＳ）を行い、特異性決定残基を解明した。最初に、ＨＥＲ２抗原（突然変異ＣＤＲＨ３配列）に結合することができなかったトラスツズマブ変異体を発現するハイブリドーマ細胞株を使用した（図９）。ライブラリは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性相同組換え突然変異誘発（ＨＤＭ）（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９）によって生成された。これは、ＣＤＲＨ３のＣａｓ９標的化にｇＲＮＡを利用し、ＣＤＲＨ３全体にタイル化された単一部位にＮＮＫ縮重コドンを含む一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形の相同性テンプレートのプールを利用していた（図５Ａ）。次いで、ライブラリを蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングし、抗体および結合または結合しない抗原を発現する集団を深層配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）に供した（図１０）。次いで、深層配列決定データを使用して、調査した１０個の位置の濃縮スコアを計算した。これにより、広範囲の突然変異に十分に適応できる６つの位置と、定義された突然変異をわずかに受け入れていた追加の３つの位置が明らかとなった（図５Ｂおよび図５Ｃ）。残基１０３１０２Ｄ、１０３Ｇ、１０４Ｆ、１０５Ｙは、ＣＤＲＨ３ループのＨＥＲ２との一次接触アミノ酸と思われるが（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｎ８Ｚ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２４）：７５６－６０、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３４（２１）：３７５５－５８）、１０５Ｙは完全に固定された唯一の残基である（図５Ｄ）。
【0073】
ＤＭＳによって生成されたヒートマップおよびそれらの対応する配列ロゴプロットを使用して、全ての位置（１０５Ｙを除く）にわたって縮重コドンからなるコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリの合理的な設計を導いた（図１１）。縮重コドンを、ＤＭＳデータに見出される濃縮度に最もよく似たそれらのアミノ酸頻度に基づく位置ごとに選択した（図５Ｃ、式２）。このコンビナトリアルライブラリは、６．６７×１０８個の理論的なタンパク質配列空間を有し、２００の単一部位ＤＭＳライブラリ多様性よりもはるかに大きい。理論的多様性は、全ての位置にわたる１位置あたりの全ての可能なアミノ酸の積をとることによって計算することができる（例えば、全ての位置に存在する全ての２０個のアミノ酸では、２０＾Ｘとなる。ここで、Ｘは位置の数である）。一部の実装形態では、ＤＭＳ誘導コンビナトリアル突然変異誘発ライブラリは、位置ごとにアミノ酸のサブセットが減少し、その結果、理論的多様性が減少する。ＣＤＲＨ３変異体を含有するライブラリを、前述の同じ非結合トラスツズマブクローン（図６Ａ）においてＨＤＭを通してハイブリドーマ細胞内で再び生成した。抗原結合細胞を、ＦＡＣＳによる２ラウンドの濃縮によって単離し、結合／非結合集団を深層配列決定に供した。配列決定データにより、それぞれ、１１，３００個および２７，５３９個の固有の結合剤および非結合剤が識別された（ＮＧＳ統計、図１３）。これらの配列変異体は、コンビナトリアル突然変異誘発ライブラリの理論的タンパク質配列空間のわずか０．００５８％を表したにすぎない。位置ごとのアミノ酸使用量は、結合集団と非結合集団との間で比較的類似しているため（図６Ｂ）、結合配列を識別するための任意の種類のヒューリスティックルールまたは観察可能なパターンを開発することは困難であった。
【0074】
２）抗体配列に基づいて抗原特異性を分類するための深層ニューラルネットワークの訓練
結合および非結合ＣＤＲＨ３変異体に関する深層配列決定データを収集した後、標的抗原ＨＥＲ２に対する特異性を予測し得る深層学習モデルを開発し、訓練した。アミノ酸配列を、ワンホットエンコーディングによって入力行列に変換した。ここで、ワンホットエンコーディングとは、各列が特定の残基を表し、各行が配列内の位置に対応するアプローチであり、１０個のアミノ酸ＣＤＲＨ３配列の場合、１０×２０行列となる。各行には、その位置にある残基に対応した列に単一の「１」が含まれる。それによって他の全ての列／行に「０」が入る。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮ。ＬＳＴＭ－ＲＮＮとＣＮＮはいずれも、学習可能な重みおよびバイアスを含むニューロンに沿って情報が伝達される標準的なニューラルネットワークに由来するが、情報の処理方法には根本的な違いがある。ＬＳＴＭ－ＲＮＮ層は、ループを含んでおり、情報をある工程から次の工程に保持することを可能にし、モデルが所与の出力と順序を効率的に相関させることを可能にする。一方、ＣＮＮは、学習可能なフィルタを入力データに適用し、それが所与の出力に関連付けられた空間依存性を効率的に認識することを可能にする。モデルアーキテクチャおよびハイパーパラメータは、データセットのｋ分割交差検証を使用して、様々なパラメータ（ＬＳＴＭ－ＲＮＮ：層ごとのノード、バッチサイズ、エポック数、および最適化関数、ＣＮＮ：フィルタの数、カーネルサイズ、ドロップアウト率、高密度層ノード）にわたってグリッドサーチを実行することによって選択された（図７）。全てのモデルは、利用可能な配列決定データから結合剤および非結合剤を分類するそれらの精度および適合率を評価するために構築された。元のデータセットの７０％は、モデルを訓練するために使用され、残りの３０％は、モデル評価のために使用される２つのテストデータセットに分割された。一方のテストデータセットは、モデルを訓練するために使用される配列の同じクラス分割を含んでおり、もう一方は、約１０／９０の結合剤／非結合剤のクラス分割を含んでおり、生理学的頻度と類似していた（図６Ａおよび１４）。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮの性能は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線および未知のテストデータセットの予測から導出された適合率－再現率（ＰＲ）曲線を構築することによって評価した。従来の訓練分類モデルへのアプローチに基づいて、データセットは、訓練中に結合剤および非結合剤の５０／５０分割を可能にするように調整された。これらの訓練条件下で、ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮは、未知のテストデータを正確に分類することができた（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ：０．９±０．０、平均適合率：０．９±０．０、図１７）。
結合および非結合ＣＤＲＨ３変異体に関する深層配列決定データを収集した後、標的抗原ＨＥＲ２に対する特異性を予測し得る深層学習モデルを開発し、訓練した。アミノ酸配列を、ワンホットエンコーディングによって入力行列に変換した。ここで、ワンホットエンコーディングとは、各列が特定の残基を表し、各行が配列内の位置に対応するアプローチであり、１０個のアミノ酸ＣＤＲＨ３配列の場合、１０×２０行列となる。各行には、その位置にある残基に対応した列に単一の「１」が含まれる。それによって他の全ての列／行に「０」が入る。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮ。ＬＳＴＭ－ＲＮＮとＣＮＮはいずれも、学習可能な重みおよびバイアスを含むニューロンに沿って情報が伝達される標準的なニューラルネットワークに由来するが、情報の処理方法には根本的な違いがある。ＬＳＴＭ－ＲＮＮ層は、ループを含んでおり、情報をある工程から次の工程に保持することを可能にし、モデルが所与の出力と順序を効率的に相関させることを可能にする。一方、ＣＮＮは、学習可能なフィルタを入力データに適用し、それが所与の出力に関連付けられた空間依存性を効率的に認識することを可能にする。モデルアーキテクチャおよびハイパーパラメータは、データセットのｋ分割交差検証を使用して、様々なパラメータ（ＬＳＴＭ－ＲＮＮ：層ごとのノード、バッチサイズ、エポック数、および最適化関数、ＣＮＮ：フィルタの数、カーネルサイズ、ドロップアウト率、高密度層ノード）にわたってグリッドサーチを実行することによって選択された（図７）。全てのモデルは、利用可能な配列決定データから結合剤および非結合剤を分類するそれらの精度および適合率を評価するために構築された。元のデータセットの７０％は、モデルを訓練するために使用され、残りの３０％は、モデル評価のために使用される２つのテストデータセットに分割された。一方のテストデータセットは、モデルを訓練するために使用される配列の同じクラス分割を含んでおり、もう一方は、約１０／９０の結合剤／非結合剤のクラス分割を含んでおり、生理学的頻度と類似していた（図６Ａおよび１４）。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮの性能は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線および未知のテストデータセットの予測から導出された適合率－再現率（ＰＲ）曲線を構築することによって評価した。従来の訓練分類モデルへのアプローチに基づいて、データセットは、訓練中に結合剤および非結合剤の５０／５０分割を可能にするように調整された。これらの訓練条件下で、ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮは、未知のテストデータを正確に分類することができた（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ：０．９±０．０、平均適合率：０．９±０．０、図１７）。
【0075】
次に、訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルを使用して、潜在的なコンビナトリアル多様性空間からの１×１０５個の配列のランダムサンプルを分類した。しかしながら、予想外に陽性の分類の出現率が高い（２５，３１８±１，６４３個の配列、または２５．３±１．６％、図２１）ことがわかった。結合剤の生理学的頻度がおよそ１０～１５％であるはずであるという知見に基づき、モデルが一部の未知の分類バイアスに供されているという仮説のもと、訓練データの分類分割を調整した。次いで、追加のモデルを、２０／８０、および１０／９０の結合剤／非結合剤の両方の分類分割、ならびに利用可能な全てのデータ（約３０／７０の結合剤／非結合剤）との分類分割について訓練した。配列分類の非均衡化は、結合剤として分類される配列のパーセンテージが大幅な低下したが、未知のテストデータに対するモデル性能も低下した（図２１）。１）結合剤として予測される配列の割合がこの生理学的頻度を反映していること、２）このデータセットは、モデルが見る情報を最大化していること、および３）テストデータに対するモデルの性能から、この分析を通じて、モデルを訓練するための最適なデータセットは、全ての既知のＣＤＲＨ３配列を含むセットであると結論付けた。最終モデルのアーキテクチャ、パラメータ、および評価を図２に示している。
【0076】
３）抗体配列空間のインシリコスクリーニングによる開発可能性のためのマルチパラメータ最適化
次に、完全な３．１×１０６個の深層学習予測抗原特異的配列を複数のパラメータで特徴付けて、元のトラスツズマブ配列と比較して、高度に開発可能な候補を特定した。予備的メトリックとして、それらの配列と元のトラスツズマブ配列との類似性を、ＬＤを計算することによって調査した。配列の大部分は、ＬＤ＞４の編集距離を示した（図７Ａ）。フィルタリングの最初の工程は、分子の粘度およびクリアランスを推定するために、実効電荷および疎水性指数を計算することであった。Ｓｈａｒｍａらによれば、粘度は、可変断片（Ｆｖ）実効電荷の増加およびＦｖ電荷対称パラメータ（ＦｖＣＳＰ）の増加に伴って低下するが、ＣＤＲＬ１＋ＣＤＲＬ３＋ＣＤＲＨ３疎水性指数合計（ＨＩ合計）が＜４で、薬物クリアランスに関して最適なＦｖ実効電荷は、０～６．２である。３．１×１０６個の予測変異体（図７Ｂ、図７Ｃ）におけるこれらのパラメータの広範な値に基づいて、ＦｖＣＳＰ＜６．６１（トラスツズマブＦｖＣＳＰ）を有するか、またはそれらがＦｖ実効電荷＞６．２、およびＨＩ合計が＞４、＜０を含む場合の任意の配列をフィルタリングした。このフィルタリング基準により、配列空間は４．０２×１０５個の変異体に大幅に減少した。次に、ＣＤＲＨ３配列を５’および３’末端上の１０個のアミノ酸でパディングし、次いで、これらの配列を、Ｓｏｒｍａｎｎｉらによって開発されたタンパク質溶解度予測因子であるＣａｍＳｏｌを通して実行し、それらの理論的溶解度に基づいて配列変異体を推定し、ランク付けした。残りの変異体は、広範囲のタンパク質溶解度スコアを生成し（図７Ｄ）、スコアが０．５未満の配列（トラスツズマブスコア）をフィルタリングし、さらなる分析のための１４，１２５個の候補を残した。インシリコスクリーニングプロセスの最後の工程として、Ｊｅｎｓｅｎらによって過去に開発されたモデルであるＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎを利用して、変異体配列のＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチド結合親和性を予測することにより、免疫原性を低下させることを目指した。モデルからの出力の１つは、２０万個のランダムな天然ペプチドの集合と比較した、所与のペプチドの予測親和性％ランクである。典型的には、％ランク＜２の分子は強い結合剤と見なされ、％ランク＜１０の分子は、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子に対する弱い結合剤と見なされる。パディングされたＣＤＲＨ３配列からの全ての可能な１５量体を、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎを通して実行した。全集団３２の９８％超をカバーすると判定された２６個のＨＬＡ対立遺伝子の集合に対する親和性を予測した後、１５量体のいずれかが％ランク＜５．５（トラスツズマブ最小％ランク）を含む場合に、配列をフィルタリングした（図７Ｅ）。残りの配列について、１０％未満のランクを有する１５量体の数、および全ての１５量体にわたる平均％ランクも計算した。％ランク＜１０の３つ以上の１５量体を有する配列（図７Ｆ）、および平均％ランク＜６０．５６の配列（トラスツズマブ平均％ランク）もフィルタリングした（図７Ｇ）。残りの全ての４，８８１個の変異体は、元のトラスツズマブ配列のパラメータ以上の値を含む。（訓練／テストデータから得られた）１１，３００個の実験的に決定された結合配列にこの同じフィルタリングスキームを適用した場合、残りの変異体は９個のみであった。最後に、最適な開発可能配列を決定するために、関連する各パラメータの正規化された値の平均に基づいて、全体的な開発可能性の改善スコアを計算した（材料および方法を参照されたい）。ここで、トラスツズマブの開発可能性改善スコアは０となる。残りの４，８８１個の予測される結合配列のうち、２９３個の変異体は、９個の実験的に決定された結合配列の最大開発可能性スコアと比較して、より高い開発可能性スコアを有することを特定した（図７Ｈ）。インシリコライブラリの各工程におけるフィルタリングパラメータおよび残存変異体の数を図７Ｉに示している。
次に、完全な３．１×１０６個の深層学習予測抗原特異的配列を複数のパラメータで特徴付けて、元のトラスツズマブ配列と比較して、高度に開発可能な候補を特定した。予備的メトリックとして、それらの配列と元のトラスツズマブ配列との類似性を、ＬＤを計算することによって調査した。配列の大部分は、ＬＤ＞４の編集距離を示した（図７Ａ）。フィルタリングの最初の工程は、分子の粘度およびクリアランスを推定するために、実効電荷および疎水性指数を計算することであった。Ｓｈａｒｍａらによれば、粘度は、可変断片（Ｆｖ）実効電荷の増加およびＦｖ電荷対称パラメータ（ＦｖＣＳＰ）の増加に伴って低下するが、ＣＤＲＬ１＋ＣＤＲＬ３＋ＣＤＲＨ３疎水性指数合計（ＨＩ合計）が＜４で、薬物クリアランスに関して最適なＦｖ実効電荷は、０～６．２である。３．１×１０６個の予測変異体（図７Ｂ、図７Ｃ）におけるこれらのパラメータの広範な値に基づいて、ＦｖＣＳＰ＜６．６１（トラスツズマブＦｖＣＳＰ）を有するか、またはそれらがＦｖ実効電荷＞６．２、およびＨＩ合計が＞４、＜０を含む場合の任意の配列をフィルタリングした。このフィルタリング基準により、配列空間は４．０２×１０５個の変異体に大幅に減少した。次に、ＣＤＲＨ３配列を５’および３’末端上の１０個のアミノ酸でパディングし、次いで、これらの配列を、Ｓｏｒｍａｎｎｉらによって開発されたタンパク質溶解度予測因子であるＣａｍＳｏｌを通して実行し、それらの理論的溶解度に基づいて配列変異体を推定し、ランク付けした。残りの変異体は、広範囲のタンパク質溶解度スコアを生成し（図７Ｄ）、スコアが０．５未満の配列（トラスツズマブスコア）をフィルタリングし、さらなる分析のための１４，１２５個の候補を残した。インシリコスクリーニングプロセスの最後の工程として、Ｊｅｎｓｅｎらによって過去に開発されたモデルであるＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎを利用して、変異体配列のＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチド結合親和性を予測することにより、免疫原性を低下させることを目指した。モデルからの出力の１つは、２０万個のランダムな天然ペプチドの集合と比較した、所与のペプチドの予測親和性％ランクである。典型的には、％ランク＜２の分子は強い結合剤と見なされ、％ランク＜１０の分子は、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子に対する弱い結合剤と見なされる。パディングされたＣＤＲＨ３配列からの全ての可能な１５量体を、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎを通して実行した。全集団３２の９８％超をカバーすると判定された２６個のＨＬＡ対立遺伝子の集合に対する親和性を予測した後、１５量体のいずれかが％ランク＜５．５（トラスツズマブ最小％ランク）を含む場合に、配列をフィルタリングした（図７Ｅ）。残りの配列について、１０％未満のランクを有する１５量体の数、および全ての１５量体にわたる平均％ランクも計算した。％ランク＜１０の３つ以上の１５量体を有する配列（図７Ｆ）、および平均％ランク＜６０．５６の配列（トラスツズマブ平均％ランク）もフィルタリングした（図７Ｇ）。残りの全ての４，８８１個の変異体は、元のトラスツズマブ配列のパラメータ以上の値を含む。（訓練／テストデータから得られた）１１，３００個の実験的に決定された結合配列にこの同じフィルタリングスキームを適用した場合、残りの変異体は９個のみであった。最後に、最適な開発可能配列を決定するために、関連する各パラメータの正規化された値の平均に基づいて、全体的な開発可能性の改善スコアを計算した（材料および方法を参照されたい）。ここで、トラスツズマブの開発可能性改善スコアは０となる。残りの４，８８１個の予測される結合配列のうち、２９３個の変異体は、９個の実験的に決定された結合配列の最大開発可能性スコアと比較して、より高い開発可能性スコアを有することを特定した（図７Ｈ）。インシリコライブラリの各工程におけるフィルタリングパラメータおよび残存変異体の数を図７Ｉに示している。
【0077】
４）選択された抗体配列は、組換え発現であり、抗原特異的である
完全に訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルの適合率を検証するために、抗原特異的であり、複数の開発可能性パラメータにわたって最適化されると予測される３０個のＣＤＲＨ３配列のサブセットをランダムに選択した。新規の配列変異体を識別するための深層学習の能力をさらに実証するために、選択した変異体の最小レーベンシュタイン編集距離がトラスツズマブの元のＣＤＲＨ３配列から５であるという基準も追加された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ＨＤＲを使用して、異なる配列変異体を発現する哺乳類ディスプレイ細胞株を生成した。フローサイトメトリを実施し、３０個の変異体のうちの２９個（９６．６７％）が抗原特異的であることを明らかにした（図２３Ａ～図２３Ｏ）。さらに、抗原結合変異体の１０４個に対して分析を行い、バイオ層干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ）を介して結合動態をより正確に定量化した（図１５、図１６Ｂ、図２３Ａ～図２３Ｇ）。元のトラスツズマブ配列は、ＨＥＲ２に対する親和性が４．０×１０－１０Ｍ（平衡解離定数、Ｋｄ）であると測定された。テストした変異体の大部分は、親和性がわずかに低下したが、７５％（７８／１０４）は依然として１桁のナノモル範囲にあり、１６％（１７／１０４）はサブナノモルのままであり、６個の変異体（５％）は、トラスツズマブ（Ｋｄ＝１．４×１０－１０Ｍ）と比較して、親和性の増加を示した。
完全に訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルの適合率を検証するために、抗原特異的であり、複数の開発可能性パラメータにわたって最適化されると予測される３０個のＣＤＲＨ３配列のサブセットをランダムに選択した。新規の配列変異体を識別するための深層学習の能力をさらに実証するために、選択した変異体の最小レーベンシュタイン編集距離がトラスツズマブの元のＣＤＲＨ３配列から５であるという基準も追加された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ＨＤＲを使用して、異なる配列変異体を発現する哺乳類ディスプレイ細胞株を生成した。フローサイトメトリを実施し、３０個の変異体のうちの２９個（９６．６７％）が抗原特異的であることを明らかにした（図２３Ａ～図２３Ｏ）。さらに、抗原結合変異体の１０４個に対して分析を行い、バイオ層干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ）を介して結合動態をより正確に定量化した（図１５、図１６Ｂ、図２３Ａ～図２３Ｇ）。元のトラスツズマブ配列は、ＨＥＲ２に対する親和性が４．０×１０－１０Ｍ（平衡解離定数、Ｋｄ）であると測定された。テストした変異体の大部分は、親和性がわずかに低下したが、７５％（７８／１０４）は依然として１桁のナノモル範囲にあり、１６％（１７／１０４）はサブナノモルのままであり、６個の変異体（５％）は、トラスツズマブ（Ｋｄ＝１．４×１０－１０Ｍ）と比較して、親和性の増加を示した。
【0078】
選択した変異体の開発可能性パラメータも実験的に検証した。特に、選択された変異体の発現レベルを、トラスツズマブの発現レベルと比較した（図１６Ａ）。さらに、選択された変異体の熱安定性を、トラスツズマブのものと比較した（図１６Ｃ）。免疫原性リスクをトラスツズマブと比較し、各テスト変異体（変異体ＣおよびＦ）およびトラスツズマブをそれぞれ２回テストした（図１６Ｄ）。
【0079】
Ｂ．考察
哺乳類細胞における抗体最適化の限界に対処し、抗原特異的配列を高適合率で識別することを可能にする深層学習に基づくアプローチが開発されている。臨床的に承認された抗体トラスツズマブを使用して、単一部位ＤＭＳを行い、続いてコンビナトリアル突然変異誘発を行い、ＣＤＲＨ３の抗原結合ランドスケープを決定した。このＤＭＳベースの突然変異誘発ストラテジは、抗原結合変異体で濃縮された高品質の訓練データを得るために重要であり、この場合、生成されたライブラリの１０％近くであった（図１４）。対照的に、完全にランダム化されたコンビナトリアル突然変異誘発ストラテジが用いられた場合（すなわち、ＮＮＫ縮重コドン）、抗原結合変異体の任意の有意な割合を生成する可能性は低い。
哺乳類細胞における抗体最適化の限界に対処し、抗原特異的配列を高適合率で識別することを可能にする深層学習に基づくアプローチが開発されている。臨床的に承認された抗体トラスツズマブを使用して、単一部位ＤＭＳを行い、続いてコンビナトリアル突然変異誘発を行い、ＣＤＲＨ３の抗原結合ランドスケープを決定した。このＤＭＳベースの突然変異誘発ストラテジは、抗原結合変異体で濃縮された高品質の訓練データを得るために重要であり、この場合、生成されたライブラリの１０％近くであった（図１４）。対照的に、完全にランダム化されたコンビナトリアル突然変異誘発ストラテジが用いられた場合（すなわち、ＮＮＫ縮重コドン）、抗原結合変異体の任意の有意な割合を生成する可能性は低い。
【0080】
この研究における顕著な発見は、ＤＭＳベースのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリの全配列多様性（６．６７×１０８）のごく一部（０．０００５％）を反映した、わずか５×１０４個の変異体のみのライブラリを実験的スクリーニングすることで、正確なニューラルネットワークを訓練できたことである。これは、哺乳類発現系（またはファージディスプレイおよび酵母ディスプレイなどの他の発現系）の物理ライブラリサイズの制限および深層配列決定のリード深度が、深層学習誘導タンパク質工学における制限として機能しないことを示唆している。別の重要な結果は、抗原結合集団および非結合集団の深層配列決定が、それらの位置的なアミノ酸の使用において観察可能な差異をほとんど示さなかったことであり（図６）、ニューラルネットワークが高次元パターンを効果的に捕捉していることを示唆している。
【0081】
今回の研究では、深層学習における２つの最先端のアプローチを表すＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮを、分類モデルの基礎として選択した。ｋ近傍、ランダムフォレスト、およびサポートベクターマシンなどの他の機械学習アプローチもまた、限られた入力データから複雑なパターンを識別するのに適している。さらに、変分オートエンコーダなどの深層生成モデリング方法を使用して、指向性進化から突然変異誘発配列空間を探索することもできる。
【0082】
ＤＭＳベースのコンビナトリアル多様性から約１０８個のＣＤＲＨ３変異体をインシリコで生成し、完全に訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルを使用して、各配列を結合剤または非結合剤として分類した。約１０８個の配列変異体は、潜在的な配列空間のサブセットのみを含み、計算労力を最小限に抑えるために選択されたものであるが、それでも哺乳類細胞において実験的に達成可能なものよりも数桁大きいライブラリサイズとなる。スクリプトの最適化および高性能クラスタによる並列計算を採用することで、スクリーニング能力を向上させることができる。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮは、分類された全ての変異体のうち、約１２～１３％が標的抗原と結合すると予測し、フローサイトメトリで実験的に観測された頻度と非常によく一致した（図１４）。ＤＭＳによって決定される重要な残基を除いて、予測される結合剤の大部分は、元のトラスツズマブ配列から実質的に離れており、配列の８０％は、少なくとも６個の残基の編集距離を有していた。この高い配列可変性は、広範囲の生体分子特性の可能性を示している。
【0083】
抗体の標的抗原に対する親和性が、有効な生物学的修飾のための望ましい範囲内にある場合、他の生体分子特性に対処することが抗体開発の焦点となる。最近の計算予測の進歩により、粘度、クリアランス、安定性、特異性、溶解性、および免疫原性を含むこれらの特性の多くは、配列情報のみから近似することができる。改善された特徴を有する抗体を選択することを目的として、予測された結合剤のライブラリを、開発可能性のためのランキング構造およびフィルタリングストラテジを提供するために、これらのインシリコアプローチの幾つかに供した（図７）。これらの方法を実施して、粘度、クリアランス、または溶解度が低い可能性が高い変異体、および高い免疫原性電位を有する変異体を除去した後、約５，０００個のマルチパラメータ最適化された抗体変異体が残った。より厳密なまたは追加のフィルタを適用して、他の開発可能性パラメータ（例えば、安定性、特異性、ヒト化）に対処して、高度に開発可能な治療用分子の配列空間をさらに減少させることもできる。
【0084】
最後に、抗原特異性を予測するためのニューラルネットワークの精度を実験的に検証するために、発明者らは、最適化された配列のライブラリから、トラスツズマブとの最小編集距離が５の変異体３０個をランダムに選択して発現させた。ＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルの適合率は、テストデータセットでの予測から、それぞれ約８５％（Ｐ＞０．７５）と推定された。しかし、モデル間のコンセンサスを取ることによって、抗原予測（および開発可能性をフィルタリングした）配列の９６％超（２９／３０）が実際に結合剤であることが実験的に検証された。これは、開始トラスツズマブ配列とは実質的に異なる、潜在的に数千の最適化されたリード候補が、治療的関連性の範囲内で結合親和性を維持することを示唆している。
【0085】
本明細書で提供される方法は、予測確率と親和性との間の相関のスクリーニングまたは調査中の選択の厳密性を増加させるようにさらに改良することができる。これは、高い標的親和性を保持するのに役立つ。これらの方法はまた、ｐＨ依存性抗体リサイクルまたはｐＨ依存性抗原結合などの、治療抗体の他の機能的特性の最適化を可能にし得る。加えて、このアプローチを可変軽鎖および重鎖遺伝子、すなわち他のＣＤＲにわたって他の領域に拡張することで、抗体とその標的抗原との間の長距離の複雑な関係を捕捉し得る深層ニューラルネットワークが得られる。加えて、説明されたニューラルネットワーク予測は、タンパク質構造モデリング予測と比較することができる。
【0086】
Ｃ．方法
１）哺乳類細胞培養およびトランスフェクション
ハイブリドーマ細胞は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９によって記述されたプロトコルに従って培養および維持された。ハイブリドーマ細胞を、プログラムＣＱ－１０４を有するＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－ヌクレオフェクター（登録商標）Ｘ Ｋｉｔ ＬまたはＸ Ｋｉｔ Ｓ（ロンザ社製、Ｖ４ＸＣ－２０２４、Ｖ４ＸＣ－２０３２）を使用して、４Ｄ－ヌクレオフェクター（商標）システム（ロンザ社製）でエレクトロポレーションした。細胞を単離し、１２５×Ｇで１０分間遠心分離し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３１９８５－０６２）で洗浄し、同じパラメータで再度遠心分離することで、細胞を調製した。細胞をＳＦ緩衝液（キット製造業者ガイドラインごと）に再懸濁し、その後、Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡ（ＩＤＴ社製）およびｓｓＯＤＮドナー（ＩＤＴ社製）を添加した。実施される全ての実験は、化膿レンサ球菌（ＳｐＣａｓ９）からのＣａｓ９の構成的発現を利用している。１×１０６個および１×１０７個の細胞のトランスフェクションを、それぞれ０．５７５または２．８８ｎｍｏｌ Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡおよび０．５または２．５ｎｍｏｌ ｓｓＯＤＮドナーを有する１００μｌの単一のＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅｓ（商標）で行った。２×１０５個の細胞のトランスフェクションを、１１５ｐｍｏｌ Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡおよび１００ｐｍｏｌ ｓｓＯＤＮドナーを用いて、１６ウェル、２０ｕｌ Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）スティップで行った。
１）哺乳類細胞培養およびトランスフェクション
ハイブリドーマ細胞は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９によって記述されたプロトコルに従って培養および維持された。ハイブリドーマ細胞を、プログラムＣＱ－１０４を有するＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－ヌクレオフェクター（登録商標）Ｘ Ｋｉｔ ＬまたはＸ Ｋｉｔ Ｓ（ロンザ社製、Ｖ４ＸＣ－２０２４、Ｖ４ＸＣ－２０３２）を使用して、４Ｄ－ヌクレオフェクター（商標）システム（ロンザ社製）でエレクトロポレーションした。細胞を単離し、１２５×Ｇで１０分間遠心分離し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３１９８５－０６２）で洗浄し、同じパラメータで再度遠心分離することで、細胞を調製した。細胞をＳＦ緩衝液（キット製造業者ガイドラインごと）に再懸濁し、その後、Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡ（ＩＤＴ社製）およびｓｓＯＤＮドナー（ＩＤＴ社製）を添加した。実施される全ての実験は、化膿レンサ球菌（ＳｐＣａｓ９）からのＣａｓ９の構成的発現を利用している。１×１０６個および１×１０７個の細胞のトランスフェクションを、それぞれ０．５７５または２．８８ｎｍｏｌ Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡおよび０．５または２．５ｎｍｏｌ ｓｓＯＤＮドナーを有する１００μｌの単一のＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅｓ（商標）で行った。２×１０５個の細胞のトランスフェクションを、１１５ｐｍｏｌ Ａｌｔ－Ｒ ｇＲＮＡおよび１００ｐｍｏｌ ｓｓＯＤＮドナーを用いて、１６ウェル、２０ｕｌ Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）スティップで行った。
【0087】
２）フローサイトメトリ分析および選別
フローサイトメトリベースの分析および細胞単離を、それぞれＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）（ＢＤバイオサイエンス社製）およびＳｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ（Ｓｏｎｙ社製）を使用して行った。蛍光コンジュゲート抗原または抗ＩｇＧ抗体で標識する場合、細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、標識抗体および／または抗原と共に氷上で３０分間インキュベートし、光から保護し、再びＰＢＳで洗浄し、次いで分析または選別した。標識試薬および作業濃度は、図２３Ａおよび図２３Ｂに記載されている。１０６とは異なる細胞数については、抗体／抗原量とインキュベーション量を比例的に調整した。
フローサイトメトリベースの分析および細胞単離を、それぞれＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）（ＢＤバイオサイエンス社製）およびＳｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ（Ｓｏｎｙ社製）を使用して行った。蛍光コンジュゲート抗原または抗ＩｇＧ抗体で標識する場合、細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、標識抗体および／または抗原と共に氷上で３０分間インキュベートし、光から保護し、再びＰＢＳで洗浄し、次いで分析または選別した。標識試薬および作業濃度は、図２３Ａおよび図２３Ｂに記載されている。１０６とは異なる細胞数については、抗体／抗原量とインキュベーション量を比例的に調整した。
【0088】
３）深層配列決定のためのサンプル調製
深層配列決定のためのサンプル調製は、前述のプライマー伸長方法の抗体ライブラリ生成プロトコルと同様に行った（Ｍｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ９（５）：ｅ９６７２７）。Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ゲノムＤＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ｋ１８２００１）を使用して、１～５×１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出された全てのゲノムＤＮＡを、第１のＰＣＲ工程に供した。増幅は、ＶＨフレームワーク領域の開始部に結合したフォワードプライマー、およびＪセグメントのすぐ３’にあるイントロン領域に特異的なリバースプライマーを用いて行った。ＰＣＲは、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０４９１Ｌ）を５０ｍｌの平行反応体積で、９８℃で３０秒、９８℃で１０秒、７０℃で２０秒、７２℃で３０秒の１６サイクル、最終伸張７２℃で１分、４℃で保管というサイクル条件で行った。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡクリーンおよび濃縮器（Ｚｙｍｏ社製、Ｄ４０１３）、続いて０．８Ｘ ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、Ｂ２２３１８）の左側サイズ選択を使用して濃縮した。総ＰＣＲ１産物をＰＣＲ２工程で増幅し、伸長特異的全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を増幅ライブラリに添加した。個々のサンプルを、２０種の異なるインデックスリバースプライマーから選択することによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックスを行った。サイクル条件は、９８℃で３０秒と、９８℃で１０秒、４０℃で２０秒、７２℃で１分の２サイクルと、９８℃で１０秒、６５℃で２０秒、７２℃で１分の６サイクルと、７２℃で５分間と、４℃の保管と、の条件であった。ＰＣＲ２産物を、ＤＮＡクリーンおよび濃縮器で再び濃縮し、１％アガロースゲル上で実行した。適切なサイズ（約５５０ｂｐ）のバンドを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ社製、Ｄ４００８）を使用してゲル精製した。精製したライブラリの濃度を、ナノドロップ２０００ｃ分光光度計によって決定し、最適なリードリターンを目的とした濃度でプーリングした。最終配列決定プールの品質を、ＤＮＦ－４７３標準感度ＮＧＳ断片分析キットを使用して断片分析装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で検証した。品質管理に合格した全てのサンプルを配列決定した。抗体ライブラリプールを、１０％のＰｈｉＸ対照ライブラリを有する試薬キットｖ３（２×３００サイクル、ペアエンド）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム上で配列決定した。全てのサンプルのベースコールの質は、３４の平均Ｐｈｒｅｄスコアの範囲内であった。
深層配列決定のためのサンプル調製は、前述のプライマー伸長方法の抗体ライブラリ生成プロトコルと同様に行った（Ｍｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ９（５）：ｅ９６７２７）。Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ゲノムＤＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ｋ１８２００１）を使用して、１～５×１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出された全てのゲノムＤＮＡを、第１のＰＣＲ工程に供した。増幅は、ＶＨフレームワーク領域の開始部に結合したフォワードプライマー、およびＪセグメントのすぐ３’にあるイントロン領域に特異的なリバースプライマーを用いて行った。ＰＣＲは、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０４９１Ｌ）を５０ｍｌの平行反応体積で、９８℃で３０秒、９８℃で１０秒、７０℃で２０秒、７２℃で３０秒の１６サイクル、最終伸張７２℃で１分、４℃で保管というサイクル条件で行った。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡクリーンおよび濃縮器（Ｚｙｍｏ社製、Ｄ４０１３）、続いて０．８Ｘ ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、Ｂ２２３１８）の左側サイズ選択を使用して濃縮した。総ＰＣＲ１産物をＰＣＲ２工程で増幅し、伸長特異的全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を増幅ライブラリに添加した。個々のサンプルを、２０種の異なるインデックスリバースプライマーから選択することによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックスを行った。サイクル条件は、９８℃で３０秒と、９８℃で１０秒、４０℃で２０秒、７２℃で１分の２サイクルと、９８℃で１０秒、６５℃で２０秒、７２℃で１分の６サイクルと、７２℃で５分間と、４℃の保管と、の条件であった。ＰＣＲ２産物を、ＤＮＡクリーンおよび濃縮器で再び濃縮し、１％アガロースゲル上で実行した。適切なサイズ（約５５０ｂｐ）のバンドを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ社製、Ｄ４００８）を使用してゲル精製した。精製したライブラリの濃度を、ナノドロップ２０００ｃ分光光度計によって決定し、最適なリードリターンを目的とした濃度でプーリングした。最終配列決定プールの品質を、ＤＮＦ－４７３標準感度ＮＧＳ断片分析キットを使用して断片分析装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で検証した。品質管理に合格した全てのサンプルを配列決定した。抗体ライブラリプールを、１０％のＰｈｉＸ対照ライブラリを有する試薬キットｖ３（２×３００サイクル、ペアエンド）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム上で配列決定した。全てのサンプルのベースコールの質は、３４の平均Ｐｈｒｅｄスコアの範囲内であった。
【0089】
４）バイオインフォマティクス分析とグラフィックス
ＭｉＸＣＲ ｖ２．０．３プログラムを使用して、生のＦＡＳＴＱファイルのデータ前処理を実行した（Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（５）：３８０－８１）。配列を、トラスツズマブ抗体遺伝子の可変重鎖についてのＶ遺伝子およびＪ遺伝子領域の既知の配列情報を含むカスタム生殖系列遺伝子参照データベースにアラインメントさせた。ＣＤＲＨ３によるクロノタイプ形成および誤り訂正は、Ｂｏｌｏｔｉｎらの記載に従って行った。１）ＭｉＸＣＲ未補正ＰＣＲエラーから生じる重複ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、または２）１に等しいクローン数の場合、機能的なクロノタイプは破棄した。下流解析は、Ｒ ｖ３．２．２（Ｃｉｔｅ Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２００８））およびＰｙｔｈｏｎ ｖ３．６．５（Ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ Ｐｙｔｈｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｔｈｅｏｒｙ）を使用して行った。グラフィックは、Ｒパッケージｇｇｐｌｏｔ２（「ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１５４１－０４２０．２０１１．０１６１６．ｘ．」で見られるＷｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０１１）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ）、ＲＣｏｌｏｒＢｒｅｗｅｒ（「ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５５９／１５２３０４００３１０００１０９２９」で見られるＢｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびｇｇｓｅｑｌｏｇｏ（Ｗａｇｉｈ（２０１７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３（２２）：３６４５－４７）を使用して生成した。
ＭｉＸＣＲ ｖ２．０．３プログラムを使用して、生のＦＡＳＴＱファイルのデータ前処理を実行した（Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（５）：３８０－８１）。配列を、トラスツズマブ抗体遺伝子の可変重鎖についてのＶ遺伝子およびＪ遺伝子領域の既知の配列情報を含むカスタム生殖系列遺伝子参照データベースにアラインメントさせた。ＣＤＲＨ３によるクロノタイプ形成および誤り訂正は、Ｂｏｌｏｔｉｎらの記載に従って行った。１）ＭｉＸＣＲ未補正ＰＣＲエラーから生じる重複ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、または２）１に等しいクローン数の場合、機能的なクロノタイプは破棄した。下流解析は、Ｒ ｖ３．２．２（Ｃｉｔｅ Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２００８））およびＰｙｔｈｏｎ ｖ３．６．５（Ｖａｎ Ｒｏｓｓｕｍｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ Ｐｙｔｈｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｔｈｅｏｒｙ）を使用して行った。グラフィックは、Ｒパッケージｇｇｐｌｏｔ２（「ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１５４１－０４２０．２０１１．０１６１６．ｘ．」で見られるＷｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０１１）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ）、ＲＣｏｌｏｒＢｒｅｗｅｒ（「ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５５９／１５２３０４００３１０００１０９２９」で見られるＢｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびｇｇｓｅｑｌｏｇｏ（Ｗａｇｉｈ（２０１７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３（２２）：３６４５－４７）を使用して生成した。
【0090】
５）ＤＭＳにおける濃縮比（ＥＲ）の算出
所与の変異体のＥＲは、従来の方法（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（９）：７４１－４６）に従って計算された。ＦＡＣＳ、ｆｉ，Ａｇ＋によって抗原特異性を濃縮した変異体のクローン頻度を、上記の式１に従って、元のライブラリ、ｆｉ，Ａｂ＋に存在する変異体のクローン頻度で除算した。
所与の変異体のＥＲは、従来の方法（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（９）：７４１－４６）に従って計算された。ＦＡＣＳ、ｆｉ，Ａｇ＋によって抗原特異性を濃縮した変異体のクローン頻度を、上記の式１に従って、元のライブラリ、ｆｉ，Ａｂ＋に存在する変異体のクローン頻度で除算した。
【0091】
ｌｏｇ［ＥＲ］値が－２以下の変異体には最小値－２を指定し、データセットに存在しない変異体は計算において無視した。ＣＤＲＨ３の正確なアミノ酸配列に基づいて、クローンを定義した。
【0092】
６）配列の多様性のためのロゼッタにおけるトラスツズマブの再設計
Ｒｏｓｅｔｔａプログラム（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ ｅｔ ａｌ．）を使用して、ＨＥＲ２（ＰＤＢ ｉｄ：１Ｎ８Ｚ）（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．）の細胞外ドメインと複合体を形成したトラスツズマブ抗体を再設計した。トラスツズマブのＣＤＲＨ３ループ内の１０個の残基（重鎖の残基９８～１０８）を、任意の天然アミノ酸に変異させ、他の全ての残基を、ロタメリック立体配座を変化させた。ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔは、確率論的モンテカルロアルゴリズムであるＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒを呼び出して、Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数に従ってＣＤＲＨ３に対する抗体の配列を最適化し、その後バックボーンを最小化した。エネルギーは、ＲｏｓｅｔｔａのｄｄＧフィルタを使用して計算した。Ｒｏｓｅｔｔａを実行して、５０００個の配列を確率的に生成し、これにより、４８個の配列が得られた。Ｒｏｓｅｔｔａの出力ファイルは、ＲＳ－Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して処理された（Ｂｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１９））。
Ｒｏｓｅｔｔａプログラム（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ ｅｔ ａｌ．）を使用して、ＨＥＲ２（ＰＤＢ ｉｄ：１Ｎ８Ｚ）（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．）の細胞外ドメインと複合体を形成したトラスツズマブ抗体を再設計した。トラスツズマブのＣＤＲＨ３ループ内の１０個の残基（重鎖の残基９８～１０８）を、任意の天然アミノ酸に変異させ、他の全ての残基を、ロタメリック立体配座を変化させた。ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔは、確率論的モンテカルロアルゴリズムであるＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒを呼び出して、Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数に従ってＣＤＲＨ３に対する抗体の配列を最適化し、その後バックボーンを最小化した。エネルギーは、ＲｏｓｅｔｔａのｄｄＧフィルタを使用して計算した。Ｒｏｓｅｔｔａを実行して、５０００個の配列を確率的に生成し、これにより、４８個の配列が得られた。Ｒｏｓｅｔｔａの出力ファイルは、ＲＳ－Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して処理された（Ｂｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１９））。
【0093】
７）Ｒｏｓｅｔｔａにおける実験的に決定された配列の分類
コンビナトリアルライブラリからの１１，３００個の結合配列および２７，５３９個の非結合配列の各々を、Ｒｏｓｅｔｔａにおいてモデル化した。実験的に決定された結合配列または非結合配列ごとに、ＨＥＲ２：トラスツズマブ複合体の構造を入力として使用し、ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓのＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．）を使用して野生型から分岐した残基を変異させた。配列を最適化された鎖内および鎖間接触にモデル化した後、骨格および側鎖をＲｏｓｅｔｔａのＭｉｎＭｏｖｅｒで最小化した。Ｒｏｓｅｔｔａの予測界面スコア（ｄｄＧ）を相対分類スコアとして使用した。
コンビナトリアルライブラリからの１１，３００個の結合配列および２７，５３９個の非結合配列の各々を、Ｒｏｓｅｔｔａにおいてモデル化した。実験的に決定された結合配列または非結合配列ごとに、ＨＥＲ２：トラスツズマブ複合体の構造を入力として使用し、ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓのＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．）を使用して野生型から分岐した残基を変異させた。配列を最適化された鎖内および鎖間接触にモデル化した後、骨格および側鎖をＲｏｓｅｔｔａのＭｉｎＭｏｖｅｒで最小化した。Ｒｏｓｅｔｔａの予測界面スコア（ｄｄＧ）を相対分類スコアとして使用した。
【0094】
８）合理的なライブラリ設計のためのコドン選択
合理的なライブラリ設計のためのコドン選択は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９（式２）によって提供された式に基づいていた。正の濃縮スコア（ＥＲ＞１、またはｌｏｇ［ＥＲ］＞０）を有するＤＭＳ分析で特定された残基を、それらの濃縮比に従って正規化し、理論頻度に変換した。次いで、縮重コドンスキームが選択された。これは、縮重コドンと標的頻度との間の平均二乗誤差によって計算されるこれらの頻度を最もよく反映するものである。
合理的なライブラリ設計のためのコドン選択は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６（１４）：７４３６－４９（式２）によって提供された式に基づいていた。正の濃縮スコア（ＥＲ＞１、またはｌｏｇ［ＥＲ］＞０）を有するＤＭＳ分析で特定された残基を、それらの濃縮比に従って正規化し、理論頻度に変換した。次いで、縮重コドンスキームが選択された。これは、縮重コドンと標的頻度との間の平均二乗誤差によって計算されるこれらの頻度を最もよく反映するものである。
【0095】
特定の事例では、選択された縮重コドンが所望のアミノ酸頻度を表さないか、または所望でないアミノ酸を含まない場合、縮重コドンの混合物を選択し、機能配列空間のより良いカバレッジを達成するために一緒にプーリングした。
【0096】
９）機械学習モデルの構築
機械学習モデルはＰｙｔｈｏｎ ｖ３．６．５で構築された。ｋ近傍モデルおよびサポートベクターマシンモデルは、サイキット－ラーン（Ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ）ライブラリを使用して構築された。人工ニューラルネットワーク、ＬＳＴＭ－ＲＮＮ、およびＣＮＮは、ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗのラッパーとしてＫｅｒａｓ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌモデルを使用して構築された。モデルアーキテクチャおよびハイパーパラメータは、与えられたモデルの関連変数のグリッドサーチを実行することによって最適化された。これらの変数には、層ごとのノード、活性化関数、オプティマイザ、損失関数、ドロップアウト率、バッチサイズ、エポック数、フィルタ数、カーネルサイズ、ストライド長、およびプールサイズが含まれる。グリッドサーチは、データセットのｋ分割交差検証を実施することによって実施した。
機械学習モデルはＰｙｔｈｏｎ ｖ３．６．５で構築された。ｋ近傍モデルおよびサポートベクターマシンモデルは、サイキット－ラーン（Ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ）ライブラリを使用して構築された。人工ニューラルネットワーク、ＬＳＴＭ－ＲＮＮ、およびＣＮＮは、ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗのラッパーとしてＫｅｒａｓ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌモデルを使用して構築された。モデルアーキテクチャおよびハイパーパラメータは、与えられたモデルの関連変数のグリッドサーチを実行することによって最適化された。これらの変数には、層ごとのノード、活性化関数、オプティマイザ、損失関数、ドロップアウト率、バッチサイズ、エポック数、フィルタ数、カーネルサイズ、ストライド長、およびプールサイズが含まれる。グリッドサーチは、データセットのｋ分割交差検証を実施することによって実施した。
【0097】
１０）機械学習モデルの訓練およびテスト
抗体発現、非結合、および結合配列（配列決定統計：図１２および図１３）のデータセットを集約して、単一の結合／非結合データセットを形成した。抗体発現配列は、結合配列間でも識別されない限り、非結合物質として分類された。１ラウンドの抗原濃縮からの配列を、訓練データセットから除外した。次いで、完全な集約データセットをランダムに配置し、適切なクラス標識配列を除去して、結合剤対非結合剤の所望の分類比率（５０／５０、２０／８０、１０／９０、および非調整）を達成した。クラス調整されたデータセットは、さらに訓練セット（７０％）と２つのテストセット（各１５％）とに分割された。ここで、一方のテストセットは、訓練のために観察された分類比を反映し、もう一方のテストセットは、結合剤の生理学的予想頻度に似た約１０／９０の分類比を反映していた。
抗体発現、非結合、および結合配列（配列決定統計：図１２および図１３）のデータセットを集約して、単一の結合／非結合データセットを形成した。抗体発現配列は、結合配列間でも識別されない限り、非結合物質として分類された。１ラウンドの抗原濃縮からの配列を、訓練データセットから除外した。次いで、完全な集約データセットをランダムに配置し、適切なクラス標識配列を除去して、結合剤対非結合剤の所望の分類比率（５０／５０、２０／８０、１０／９０、および非調整）を達成した。クラス調整されたデータセットは、さらに訓練セット（７０％）と２つのテストセット（各１５％）とに分割された。ここで、一方のテストセットは、訓練のために観察された分類比を反映し、もう一方のテストセットは、結合剤の生理学的予想頻度に似た約１０／９０の分類比を反映していた。
【0098】
１１）予測変異体の配列類似性およびモデル帰属分析
レーベンシュタイン距離１～６について、抗原陽性および抗原陰性であると予測される配列の配列類似性ネットワークを構築し、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージｖ１．２．４（Ｃｓａｒｄｉ ａｎｄ Ｎｅｐｕｓｚ（２００６））を使用して構築した。得られたネットワークを、それらの全体的な結合性、それらの最大クラスタの構成、およびクラス間の全体的な度合い分布に関して分析した。
レーベンシュタイン距離１～６について、抗原陽性および抗原陰性であると予測される配列の配列類似性ネットワークを構築し、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージｖ１．２．４（Ｃｓａｒｄｉ ａｎｄ Ｎｅｐｕｓｚ（２００６））を使用して構築した。得られたネットワークを、それらの全体的な結合性、それらの最大クラスタの構成、およびクラス間の全体的な度合い分布に関して分析した。
【0099】
積分勾配技術（Ｓｕｎｄａｒａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７））を使用して、所与の入力配列の各特徴量の最終予測スコアに対する相対的な帰属を評価した。まず、入力ベクトルをゼロ化することによりベースラインを得、次いで、ベースラインから入力ベクトルへの勾配の経路積分を工程サイズ１００で近似した。統合された勾配を配列ロゴとして可視化した。配列ロゴは、ＰｙｔｈｏｎモジュールＬｏｇｏｍａｋｅｒ（Ｔａｒｅｅｎ ａｎｄ Ｋｉｎｎｅｙ（２０１９））によって作成された。
【0100】
１２）インシリコ配列分類および配列パラメータ
ＤＭＳベースのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリに存在するアミノ酸の全ての可能な組み合わせを使用して、７．１７×１０８個の理論的な配列空間の合計を計算した。７．２×１０７個の配列変異体を、抗原結合変異体について３ラウンドの濃縮後にＤＭＳデータから設計されたコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリ内の位置ごとに使用されるアミノ酸の全ての可能な組み合わせを取得することによって、インシリコで生成した。アラニンもまた、１０３位に含まれるように選択した。次いで、全てのインシリコ配列を、訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルによって結合剤または非結合剤として分類した。予測確率（Ｐ）が０．７５より大きい両方のモデルで分類された場合、配列をさらなる分析のために選択した。
ＤＭＳベースのコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリに存在するアミノ酸の全ての可能な組み合わせを使用して、７．１７×１０８個の理論的な配列空間の合計を計算した。７．２×１０７個の配列変異体を、抗原結合変異体について３ラウンドの濃縮後にＤＭＳデータから設計されたコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリ内の位置ごとに使用されるアミノ酸の全ての可能な組み合わせを取得することによって、インシリコで生成した。アラニンもまた、１０３位に含まれるように選択した。次いで、全てのインシリコ配列を、訓練済みのＬＳＴＭ－ＲＮＮおよびＣＮＮモデルによって結合剤または非結合剤として分類した。予測確率（Ｐ）が０．７５より大きい両方のモデルで分類された場合、配列をさらなる分析のために選択した。
【0101】
Ｆｖ実効電荷およびＦｖ電荷対称パラメータ（ＦｖＣＳＰ）は、Ｓｈａｒｍａらの説明に従って計算された。簡単に説明すると、実効電荷は、まず、既知のアミノ酸ｐＫａを用いて、指定されたｐＨ（ここでは５．５）で各残基のヘンダーソン－ハッセルバルッチ式を解くことによって決定した。次いで、ＶＬおよびＶＨの両方の全ての残基全体の合計を、Ｆｖ実効電荷として計算した。ＦｖＣＳＰは、ＶＬおよびＶＨ実効電荷の積をとることによって計算した。疎水性指数（ＨＩ）もまた、以下の式に従って、Ｓｈａｒｍａらによって説明されるように計算した。
Ｅは、アミノ酸のアイゼンバーグ値を表し、ｎは、アミノ酸の数であり、ｉおよびｊは、それぞれ疎水性および親水性残基である。
【0102】
タンパク質溶解度スコアは、ｐＨ７．０のＣａｍＳｏｌ法により、５’末端と３’末端（３５ａ．ａ．）との両方に１０個のアミノ酸が埋め込まれた全長ＣＤＲＨ３配列（１５ａ．ａ．）ごとに決定した。
【0103】
２６個のＨＬＡ対立遺伝子の基準集合に対する結合親和性を、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ３．２によって、１０個のアミノ酸パディングされたＣＤＲＨ３配列（３５ａ．ａ．）内に含まれる１５量体ごとに決定した。出力により、１５量体ごとに、ｎＭでの予測された親和性、および１セットのランダムな天然ペプチドと比較した１５量体の親和性を反映する％ランクが提供される。％ランク測定値は、特定の分子の強いまたは弱い親和性に対するバイアスの影響を受けず、指定されたＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する弱いまたは強い結合剤としてペプチドを分類するために使用される。最小の％ランク、１０未満の％ランク（弱い結合剤の分類）を有する１５量体の数、および平均％ランクは、全ての２６のＨＬＡ対立遺伝子にわたる単一のＣＤＲＨ３配列のための２１の１５量体全てにわたって計算された。
【0104】
抗体配列の全体的な開発可能性の改善は、最初に、フィルタリング後の残りの配列で観察される値の範囲に従って、ＦｖＣＳＰ、ＣａｍＳｏｌスコア、および平均ＮｅｔＭＨＣＩＩ％ランクを正規化することによって決定された。次に、正規化されたＣａｍＳｏｌタンパク質溶解度スコアを、開発可能性を決定する上での重要性について２倍に重み付けした。最後に、これらの３つのパラメータにわたる平均を採用して、全体的な開発可能性改善スコアを作成した。配列はトラスツズマブの計算値でフィルタリングされたため、トラスツズマブの全体的な開発可能性の改善は０に等しくなる。
【0105】
１３）バイオ層干渉法による発現および親和性測定
個々の変異体のモノクローナル集団を、単一細胞選別を行うことによって単離した。膨張後、全ての変異体の上清を収集し、０．２０μｍフィルタ（ザルトリウス社製、１６５３４－Ｋ）を通してフィルタリングした。次いで、親和性測定を、以下のパラメータを用いてＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）上で行った。抗ヒト捕捉センサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製、１８－５０６０）を、動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製、１８－１１０５）で１対２に希釈した馴化培地中で少なくとも１０分間水和した後、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５２）中で１０秒のインキュベーション、および動態緩衝液中で１０秒のインキュベーションからなる４サイクルの再生を通して条件付けた。次いで、コンディショニングされたセンサに０μｇ／ｍＬ（参照センサ）、１０μｇ／ｍＬトラスツズマブ（参照サンプル）、または２分の１で動態緩衝液で希釈したハイブリドーマ上清（約２０μｇ／ｍＬ）でロードした後、動態緩衝液中で５０μｇ／ｍＬでマウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、０１０－０１０２）でブロックした。ブロック後、装填したセンサを動態緩衝液中で平衡化し、５ｎＭまたは２５ｎＭのＨＥＲ２タンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＳＲＰ６４０５－５０ＵＧ）のいずれかでインキュベートした。最後に、センサを緩衝液動態でインキュベートし、抗原解離を可能にした。抗体発現および動態解析は、解析ソフトウェアＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ ｖ１１．０．０．５０で実施した。
個々の変異体のモノクローナル集団を、単一細胞選別を行うことによって単離した。膨張後、全ての変異体の上清を収集し、０．２０μｍフィルタ（ザルトリウス社製、１６５３４－Ｋ）を通してフィルタリングした。次いで、親和性測定を、以下のパラメータを用いてＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）上で行った。抗ヒト捕捉センサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製、１８－５０６０）を、動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製、１８－１１０５）で１対２に希釈した馴化培地中で少なくとも１０分間水和した後、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５２）中で１０秒のインキュベーション、および動態緩衝液中で１０秒のインキュベーションからなる４サイクルの再生を通して条件付けた。次いで、コンディショニングされたセンサに０μｇ／ｍＬ（参照センサ）、１０μｇ／ｍＬトラスツズマブ（参照サンプル）、または２分の１で動態緩衝液で希釈したハイブリドーマ上清（約２０μｇ／ｍＬ）でロードした後、動態緩衝液中で５０μｇ／ｍＬでマウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、０１０－０１０２）でブロックした。ブロック後、装填したセンサを動態緩衝液中で平衡化し、５ｎＭまたは２５ｎＭのＨＥＲ２タンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＳＲＰ６４０５－５０ＵＧ）のいずれかでインキュベートした。最後に、センサを緩衝液動態でインキュベートし、抗原解離を可能にした。抗体発現および動態解析は、解析ソフトウェアＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ ｖ１１．０．０．５０で実施した。
【0106】
１４）蛍光による熱安定性測定
個々の変異体のモノクローナル抗体を、それぞれのモノクローナル細胞株の上清からのプロテインＡカラムクロマトグラフィによって精製し、２００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ２．５に溶出した。下流解析の前に、タンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証した。精製した抗体をＵｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂ社のＵＮｃｌｅ機器に装填し、静的光散乱（ＳＬＳ）および蛍光測定を行いながら、抗体を２０℃～９５℃の熱ランプに毎分０．５℃の速度で曝露した。融解温度（Ｔｍ）は、温度の関数として、重心平均（ＢＣＭ）の第１の導関数の収束点として識別される。
個々の変異体のモノクローナル抗体を、それぞれのモノクローナル細胞株の上清からのプロテインＡカラムクロマトグラフィによって精製し、２００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ２．５に溶出した。下流解析の前に、タンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証した。精製した抗体をＵｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂ社のＵＮｃｌｅ機器に装填し、静的光散乱（ＳＬＳ）および蛍光測定を行いながら、抗体を２０℃～９５℃の熱ランプに毎分０．５℃の速度で曝露した。融解温度（Ｔｍ）は、温度の関数として、重心平均（ＢＣＭ）の第１の導関数の収束点として識別される。
【0107】
１５）Ｔ細胞増殖アッセイによる免疫原性リスク評価
免疫原性リスクを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社のＰｒｏＭａｐ（登録商標）Ｔ細胞増殖アッセイによって評価した。簡潔に述べると、特定の変異体配列の１５量体ペプチドを合成し、潜在的な抗原性のインビトロ評価に使用した。各１５量体のペプチドをドナー抗原提示細胞にパルスし、ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養する。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリによって測定する。アッセイは、２０個の健康なドナー細胞サンプルに対してペプチドをテストすることによって実施した。分析からＣＤ８＋応答を除去するために、ドナー細胞サンプルを使用前にＣＤ８を枯渇させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の検出は、細胞をＣＦＳＥで標識し、抗ヒトＣＤ４抗体で共染色することによって行った。
免疫原性リスクを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社のＰｒｏＭａｐ（登録商標）Ｔ細胞増殖アッセイによって評価した。簡潔に述べると、特定の変異体配列の１５量体ペプチドを合成し、潜在的な抗原性のインビトロ評価に使用した。各１５量体のペプチドをドナー抗原提示細胞にパルスし、ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養する。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリによって測定する。アッセイは、２０個の健康なドナー細胞サンプルに対してペプチドをテストすることによって実施した。分析からＣＤ８＋応答を除去するために、ドナー細胞サンプルを使用前にＣＤ８を枯渇させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の検出は、細胞をＣＦＳＥで標識し、抗ヒトＣＤ４抗体で共染色することによって行った。
【0108】
図面、詳細な説明、または任意の特許請求の範囲の技術的特徴の後に参照符号が続く場合、参照符号は、図面、詳細な説明、および特許請求の範囲の明瞭性を高めるために含まれている。したがって、参照符号があってもなくても、いかなる特許請求の範囲の要素の範囲に対していかなる制限効果も有しない。
【0109】
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、その特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。前述の実装形態は、記載されたシステムおよび方法を限定するのではなく、例示的である。したがって、本明細書に記載されるシステムおよび方法の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および同等性の範囲内に入る変更が、そこに包含される。
【0110】
一部の例示的な実装形態をここで説明した後、上記は例示的であり、限定的ではないことが明らかであり、例として提示されている。特に、本明細書に提示される多くの例は、方法行為またはシステム要素の特定の組み合わせを含むが、それらの行為およびそれらの要素は、同じ目的を達成するために他の方法で組み合わせられ得る。１つの実装形態に関連して議論される行為、要素、および特徴は、他の実装形態または実装形態における類似の役割から除外されることを意図しない。
【0111】
本明細書で使用される用語および用語は、記載の目的のためであり、制限するものと見なされるべきではない。本明細書における「その」およびその変形形態によって「特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈａｔ）」ことを「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」ことの使用は、その後に列挙される項目、その等価物、および追加の項目、およびその後に列挙される項目のみからなる代替の実装形態を包含することを意味する。１つの実装形態では、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、記載される要素、作用、または構成要素のうちの１つ、２つ以上の組み合わせ、または全てからなる。
【0112】
本明細書で使用される場合、「約」および「実質的に」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。使用される文脈において当業者には明らかでない用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【0113】
単数形で本明細書で言及されるシステムおよび方法の実装形態または要素または行為への任意の参照は、複数のこれらの要素を含む実装形態を包含し得、複数形で本明細書の任意の実装形態または要素または行為への任意の参照は、単一の要素のみを含む実装形態を包含し得る。単数形または複数形での参照は、本明細書で開示されているシステムまたは方法、それらの構成要素、作用、または要素を単数形または複数形の構成に限定することを意図しない。任意の情報、行為、または要素に基づいている任意の行為または要素への言及は、行為または要素が任意の情報、行為、または要素に少なくとも部分的に基づいている実装形態を含み得る。
【0114】
本明細書に開示される任意の実装形態は、任意の他の実装形態または実施形態と組み合わせられてもよく、「実装形態」、「一部の実装形態」、「１つの実装形態」などへの言及は、必ずしも互いに排他的ではなく、実装形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特徴が少なくとも１つの実装形態または実施形態に含まれ得ることを示すことが意図される。本明細書で使用される場合、かかる用語は、必ずしも全て同じ実装形態を指すものではない。任意の実装形態は、本明細書に開示される態様および実装形態と一致する任意の方法で、包括的または排他的に任意の他の実装形態と組み合わせてもよい。
【0115】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、明確にそれに反して示されない限り、不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0116】
「または」への言及は、「または」を使用して記載された任意の用語が、記載された用語の単一、２つ以上、および全てのいずれかを示すことができるように、包括的であると解釈されてもよい。例えば、「『Ａ』および『Ｂ』のうちの少なくとも１つ」への言及は、『Ａ』のみ、『Ｂ』のみ、ならびに『Ａ』および『Ｂ』の両方を含み得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または他のオープンな用語と併せて使用されるかかる参照は、追加の項目を含み得る。
【0117】
本明細書の記載で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本発明を制限することを意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図23D】
【図23E】
【図23F】
【図23G】
【図23H】
【図23I】
【図23J】
【図23K】
【図23L】
【図23M】
【図23N】
【図23O】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】