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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-01
(54)【発明の名称】組換えウイルスベクターの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20220525BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220525BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220525BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220525BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N7/01 ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560328
(86)(22)【出願日】2020-03-26
(85)【翻訳文提出日】2021-11-08
(86)【国際出願番号】 EP2020058527
(87)【国際公開番号】W WO2020193698
(87)【国際公開日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】19382220.2
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500031124
【氏名又は名称】エステベ ファーマシューティカルズ，ソシエダッド アノニマ
【氏名又は名称原語表記】ＥＳＴＥＶＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，Ｓ．Ａ．
【住所又は居所原語表記】Ｐａｓｓｅｉｇ ｄｅ ｌａ Ｚｏｎａ Ｆｒａｎｃａ，１０９，４ａ Ｐｌａｎｔａ，０８０３８ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ
(71)【出願人】
【識別番号】521440507
【氏名又は名称】ウニベルシタ アウトノマ デ バルセロナ
(74)【代理人】
【識別番号】110002310
【氏名又は名称】特許業務法人あい特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴディア－カサブランカス，フランセスク
(72)【発明者】
【氏名】ボス－トゥベルト，マリア－ファティマ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－マルティネス，ミゲル
(72)【発明者】
【氏名】セルベラ－グラシア，ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】レオン－マドレナス，シャビエル
(72)【発明者】
【氏名】モラス－ラプラナ，マリア
(72)【発明者】
【氏名】グティエレス－グラナドス，ソニア
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、高力価組換えウイルスベクターの産生方法に関し、より詳細には、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる組換えＡＡＶベクターの産生方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えウイルスベクターの産生方法であって、ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含む前記プラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生された前記ウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で前記細胞培養物中に前記細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載の前記プラスミドベクターでステップｃ）に記載の前記細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記組換えウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
組換えＡＡＶの産生方法であって、ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含む前記ベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生された前記ＡＡＶを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で前記細胞培養物中に前記細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載の前記プラスミドベクターでステップｃ）に記載の前記細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法。
【請求項4】
ステップｂ）において、ＡＡＶが前記細胞培養物の上清に分泌される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞培養物の細胞培地が、ステップｄ）の前に交換される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
細胞培地交換が灌流によって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）が、回収ステップｃ）の後に少なくとももう１回繰り返される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ステップｂ）が、撹拌液体培地の懸濁液中で前記細胞を培養することによって行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
ステップａ）において、以下の３つのプラスミドベクター：ｉ）第１プラスミドベクターであって、前記プラスミドの骨格サイズが５０００ｐｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであり、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、前記ＩＴＲの外側にあり、好ましくはＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列とを含み、前記スタッファー配列が長さ４４００ｐｂ～４８００ｐｂを有することを特徴とする第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、前記プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない第３プラスミドベクター、
が用いられる、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１プラスミドベクターが、前記骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まない、請求項８または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
組換えＡＡＶの産生方法であって、ａ）
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、前記プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない前記プラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生された前記ＡＡＶを回収するステップと、
を含む、方法。
【請求項12】
前記第１プラスミドベクターｉ）が、前記プラスミドの骨格サイズが５０００ｐｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであり、かつ前記ＩＴＲの外側にあり、好ましくはＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列を含み、前記スタッファー配列が長さ４４００ｐｂ～４８００ｐｂを有することを特徴とする、請求項１１に記載の組換えＡＡＶの産生方法。
【請求項13】
前記第１プラスミドベクターｉ）が、前記骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まない、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第２プラスミドベクター（ｉｉ）がＡＡＶ Ｒｅｐ２およびＡＡＶ Ｃａｐ９コード領域を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
プラスミドベクターであって、ａ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
ｂ）前記ＩＴＲの外側にあり、ＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列であって、前記プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであるように、前記スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有するスタッファーＤＮＡ配列と、
を含む前記プラスミドベクターにおいて、前記骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクター。
【請求項16】
アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６７を有する、配列番号２に記載のｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００である、請求項１５に記載のプラスミドベクター。
【請求項17】
ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含むプラスミドベクターであって、前記プラスミドが、Ｅ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない、プラスミドベクター。
【請求項18】
アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６５を有する、配列番号６に記載のｐＡｄＨｅｌｐｅｒ－８６１である、請求項１７に記載のプラスミドベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高力価組換えウイルスベクターの産生方法に関し、より詳細には、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる組換えＡＡＶベクターの産生方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子送達は、後天性疾患および遺伝性疾患の治療に有望な方法である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベース系を含む、遺伝子導入のための多くのウイルスベース系が記載されている。
【0003】
ＡＡＶは、遺伝子治療のベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。ＡＡＶは広範囲の細胞型に感染する。しかしながら、ＡＡＶは非形質転換性であり、ヒト疾患の病因に関与しない。レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入は、一般に、細胞の正常代謝を乱すことなくＤＮＡの長期間の持続と発現をもたらす。
【0004】
ＡＡＶ粒子は、ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含む約４．７ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡゲノムを取り囲む３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を有するタンパク質カプシドを含む。個々の粒子は、ただ１つのＤＮＡ分子鎖をパッケージするが、この分子鎖は、プラス鎖とマイナス鎖のどちらであってもよい。どちらの鎖を含む粒子も感染性であり、親感染一本鎖の二本鎖型への変換およびその後の増幅によって複製が行われ、それが子孫一本鎖に置き換えられ、カプシドにパッケージされる。
【0005】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムの内部部分を欠失させ、ＩＴＲ間に目的のＤＮＡ配列を挿入することによって、目的の異種ヌクレオチド配列（たとえば選択された遺伝子、アンチセンス核酸分子、リボザイムなど）を有するように操作することができる。ＩＴＲは、目的の異種ヌクレオチド配列を含むベクターゲノムの複製およびパッケージングのためにシスで必要な唯一の配列である。また、異種ヌクレオチド配列は、通常、特定の条件下で患者の標的細胞における遺伝子発現を駆動できるプロモーター配列に結合されている。ポリアデニル化部位などの終結シグナルは、通常、ベクターに含まれる。
【0006】
ｒｅｐおよびｃａｐ ＡＡＶ遺伝子産物は、それぞれ、ベクターゲノムの複製機能およびカプシド形成機能を提供するが、それらはトランスに存在することで十分である。
【0007】
ヒトの遺伝性疾患の治療法としての遺伝子治療の潜在的利益にもかかわらず、病院でのその広範な使用には重大な実用的限界が妨げになっている。この意味で、臨床的有効量を産生するために、大量のｒＡＡＶ粒子を産生することが必要とされている。現在の技術を用いる多数の粒子の産生には、多数の産生細胞を必要とする。実験室規模では、数千の組織培養フラスコが必要であろう。商業規模では、臨床応用に到達するためには、より効率的で集中的な産生プラットホームが必要である。産生細胞数および細胞あたりの粒子収量の両方を改善する利点は、商業生産の観点から大変重要である。
【0008】
したがって、遺伝子治療などに使用する組換えＡＡＶベクターの開発において、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる高力価のＡＡＶを得るための戦略が必要とされている。
【0009】
本開示は、これらの競合する目標を実現する方法を提供し、かつ組換えＡＡＶベクター調製物の大規模産生にこのような技術を用いることができることを明らかにする。
【発明の概要】
【0010】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、反復トランスフェクションを行うことによって、組換えウイルス産生、より詳細にはｒＡＡＶ産生を著しく改善することができることを見出した。以下の実施例で示すように、経時的な遺伝子発現レベルの持続は、単一のトランスフェクションラウンドを必要とする従来のアプローチとは対照的に、反復ラウンドのトランスフェクションを行うときに得られる。
【0011】
したがって、第１の側面において、本発明は、組換えウイルスベクターの産生方法であって、
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
【0012】
さらに、本発明者らは、トランスフェクションに最適化されたプラスミドの組み合わせが、ＡＡＶベクター産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高収量のｒＡＡＶをもたらすことを見出した。さらに、以下の実施例に示すように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明による最適化されたプラスミドの使用が、細菌配列の逆パッケージングの低下をもたらすことを見出した。
【0013】
したがって、組換えＡＡＶの産生方法であって、
ａ）
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）、Ａｄ ＩＴＲおよびプロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収するステップと、
を含む、方法は、本発明のさらなる側面である。
ａ）
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）、Ａｄ ＩＴＲおよびプロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収するステップと、
を含む、方法は、本発明のさらなる側面である。
【0014】
本発明者らは、驚くべきことに、トランスフェクションにおいて最適化されたプラスミドの組み合わせを用いることによって、逆パッケージングが大幅に低下し、高収量のベクターゲノムが得られることを見出した。
【0015】
したがって、他の側面において、本発明は、プラスミドベクターであって、
ａ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
ｂ）ＩＴＲの外側にあり、ＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列であって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであるようにスタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有するスタッファーＤＮＡ配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターに関する。
ａ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
ｂ）ＩＴＲの外側にあり、ＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列であって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであるようにスタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有するスタッファーＤＮＡ配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターに関する。
【0016】
他の側面において、本発明は、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含むプラスミドベクターであって、プラスミドが、Ｅ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない、プラスミドベクターに関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図3】図３は、最適化されたプラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００単独での、または他の最適化されたヘルパープラスミド（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９およびｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）と組み合わせての、ＡＡＶベクター収量（全ｖｇ）に対する効果を示す。
【図4】図４は、細菌配列の逆パッケージングを示しており、最適化された大きすぎるプラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００単独での、または他の最適化されたヘルパープラスミド（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９およびｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）と組み合わせての効果を示している。
【図5】図５は、細菌配列の逆パッケージングを示しており、最適化された大きすぎるプラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００と他の最適化されたヘルパープラスミド（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９およびｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）とを組み合わせた場合の効果を示している。
【発明を実施するための形態】
【0018】
微生物の寄託
プラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６５としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
プラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６５としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
【0019】
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－８２７は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６６としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
【0020】
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６７としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
【0021】
プラスミドｐｏｈｌＤＳ－８７４は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６８としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
【0022】
プラスミドｐＲｅｐＣａｐ９－８０９は、２０１８年１２月５日、アクセス番号ＤＳＭ ３２９６９としてＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ドイツ連邦共和国Ｄ－３８１２４ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ７Ｂ）に寄託された。
定義
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと結合した高分子または高分子の結合体であって、細胞へのそのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができるものを指す。例示的なベクターは、たとえば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルを含む。
定義
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと結合した高分子または高分子の結合体であって、細胞へのそのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができるものを指す。例示的なベクターは、たとえば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルを含む。
【0023】
用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」は、本明細書において同義語として用いられ、ＡＡＶの少なくとも１つのカプシドタンパク質（好ましくは特定のＡＡＶ血清型のすべてのカプシドタンパク質で構成される）と、ＡＡＶゲノムに相当する封入ポリヌクレオチドとで構成されるウイルス粒子を意味する。野生型ＡＡＶとは、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。野生型ＡＡＶゲノムは、長さ約４．７Ｋｂであり、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなり、プラス鎖またはマイナス鎖の場合がある。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含む。ＯＲＦ ｒｅｐは、ＡＡＶのライフサイクルに必要な４つのＲｅｐタンパク質をコードする。ＯＲＦ ｃａｐは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするヌクレオチド配列を含み、これらは相互作用して正二十面体対称のカプシドを形成する。最後に、Ｃａｐ ＯＲＦと重複するＡＡＰ ＯＲＦは、カプシドアセンブリを促進すると考えられるＡＡＰタンパク質をコードする。粒子がＡＡＶ ＩＴＲに隣接して異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド、たとえば哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、その粒子は一般的に「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」または「組換えＡＡＶベクター」として公知である。本発明は、ｄｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶまたは自己相補型ＡＡＶの使用も含む。
【0024】
本明細書で用いる場合、用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、ＡＡＶのゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する逆方向末端反復配列を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。これらの配列のもう一つの特性は、ヘアピンを形成するそれらの能力である。この特性は、第２ＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成を可能にするそれらのセルフプライミングに寄与する。ＩＴＲは、また、野生型ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込み（たとえばＡＡＶ血清型２のヒト第１９染色体への組み込み）およびそれからのレスキューと、完全に組み立てられたデオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶ粒子へのＡＡＶ ＤＮＡの効率的なカプシド形成との両方に必要であることが示された。ＩＴＲ配列は長さ約１４５ｂｐである。好ましくは、ＡＡＶウイルスベクターのゲノムにおいて、ＩＴＲの全配列が使用されるが、これらの配列のある程度の小さな改変は許容される。野生型ＩＴＲ配列は、そのＩＴＲがたとえば複製、ニッキング、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する限り、挿入、欠失または短縮によって改変されてもよい。これらのＩＴＲ配列を改変する方法は当該分野で周知である。ＩＴＲは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２または任意の他の公知のまたは後に見出されたＡＡＶを含むがこれらに限定されない任意の野生型ＡＡＶ由来であってもよい。ＡＡＶは２つのＩＴＲを含み、それら２つのＩＴＲは同一であってもよいし、または異なっていてもよい。さらに、２つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶカプシドと同じＡＡＶ血清型に由来する場合もあれば、異なる場合もある。好ましい実施形態において、５’および３’のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９に由来する。好ましくは、ＩＴＲはＡＡＶ２、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９由来であり、ＡＡＶ２由来が最も好ましい。一実施形態において、偽型ＡＡＶ（すなわち異なる血清型に由来するカプシドおよびＩＴＲを有するＡＡＶ）を作製するためにＡＡＶ２ＩＴＲが選択される。
【0025】
本明細書で用いる場合、「組換えウイルスゲノム」という表現は、少なくとも１つの外来ポリヌクレオチドが天然に存在するＡＡＶゲノムに挿入されたＡＡＶゲノムを指す。本発明によるＡＡＶゲノムは、通常、シス作用性５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および発現カセットを含む。本明細書で用いる場合、「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）であって、通常は細胞の遺伝的形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。
【0026】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは野生型ＡＡＶの全カプシドタンパク質による）および、カプシドに包まれたポリヌクレオチドで構成されるウイルス粒子を指す。その粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、通常「ｒＡＡＶベクター粒子」、または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。
【0027】
「パッケージング」は、カプシドタンパク質のアセンブリとベクターゲノムのカプシド形成とをもたらしてＡＡＶ粒子を形成する一連の細胞内事象を指す。
【0028】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。これらの遺伝子は、試験されたすべてのＡＡＶ血清型で見出されており、下記で記述され、かつ当該技術分野で記述されている。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書で用いる場合、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称する。
【0029】
用語「ＣＡＧプロモーター」は、サイトメガロウイルス初期エンハンサー領域、ニワトリβ－アクチンプロモーターおよび、ウサギβグロビン遺伝子由来の３’スプライス配列によって形成される組み合わせを指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ Ａら ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８年；９（２）：１－１１，Ｎｉｗａら Ｇｅｎｅ． １９９１年１２月１５日；１０８（２）：１９３－９参照）。
【0030】
用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログを含む任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーアセンブリの前または後に行ってもよい。本明細書で用いる場合、用語ポリヌクレオチドは、二本鎖分子と一本鎖分子とを互換的に指す。特に記載のない限りまたは特に求められた場合を除き、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖型および、その二本鎖型を構成することが公知のまたはそれが予測される２つの相補的一本鎖型のそれぞれのどちらも含む。
【0031】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、または少なくとも１つの非コードＲＮＡを含むポリヌクレオチドを指す。
【0032】
用語「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子を指す。核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の一部を含んでいてもよい。
【0033】
用語「コードする」は、ヌクレオチド配列がどのようにポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるかを決定する遺伝コードを指す。配列におけるヌクレオチドの順序が、ポリペプチドまたはタンパク質に沿ったアミノ酸の順序を決定する。
【0034】
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、そのポリヌクレオチドが、自然界に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす、クローニングステップ、制限ステップ、ライゲーションステップおよび他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。
【0035】
「制御因子」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能制御に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。制御は、そのプロセスの頻度、速度または特異性に影響を及ぼしてもよく、かつ、制御は本質的に促進または阻害するものであってもよい。当該技術分野で公知の制御因子は、たとえば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写制御配列を含む。プロモーターは、一定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常プロモーターの下流（３’方向）にあるコード領域の転写を開始させることができるＤＮＡ領域である。
【0036】
「操作可能に連結された」または「作動可能に連結された」は、それらの因子が、想定される方法でそれらを作動させることを可能にする関係にある遺伝因子の並置を指す。たとえば、あるプロモーターがコード配列の転写を開始するのに役立つ場合、そのプロモーターはコード領域に操作可能に連結されている。この機能的関係が維持される限りは、プロモーターとコード領域との間に介在残基があってもよい。
【0037】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドコード領域を含むベクターであり、対象とする標的細胞中でそのタンパク質の発現をもたらすために用いられる。発現ベクターは、その標的におけるタンパク質の発現を促進するためのコード領域に操作可能に連結されている制御因子も含む。制御因子と、発現のために制御因子が作動可能に連結された遺伝子（単数または複数）との組み合わせは「発現カセット」とも呼ばれる。それらの多くは公知であり、当該技術分野で利用可能であるか、または当該技術分野で利用可能な成分から容易に構築することができる。
【0038】
「異種」は、比較されている実体の残りの実体とは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。たとえば、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに遺伝子工学技術で導入されたポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その天然コード配列が取り除かれ、結合されていることが天然には見られないコード配列に操作可能に連結されているプロモーターは異種プロモーターである。特に、本明細書で用いる場合、用語「異種ヌクレオチド配列」は、コードヌクレオチド配列はもちろん、非コードヌクレオチド配列も含む。
【0039】
「遺伝子変異」は、有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に遺伝因子が導入されるプロセスを指す。その因子は細胞に対して異種であってもよいし、または、その因子は細胞にすでに存在する因子の追加のコピーもしくはその改良型であってもよい。遺伝子変異は、たとえば、当該技術分野で公知の任意のプロセス、たとえば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈着または、ポリヌクレオチドリポソーム複合体との接触を介して、組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることによって達成されてもよい。遺伝子変異は、たとえば、形質導入または、ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスまたはウイルスベクターによる感染によって達成されてもよい。好ましくは、遺伝因子は細胞内の染色体またはミニ染色体に導入される。しかし、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を改変させる任意の変化はこの用語に含まれる。
【0040】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で用いる場合、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために同義で使用される。これらの用語は、改変されたアミノ酸ポリマー、たとえば、ジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化または標識成分とのコンジュゲーションも含む。
【0041】
「分離された」プラスミド、ウイルスまたは他の物質は、その物質または類似の物質が天然に存在するか、またはもともとそれから調製された場合に同様に存在する可能性のある他の成分の少なくとも一部を欠いた物質の調製物を指す。したがって、たとえば、分離された物質は、ソース混合物からそれを濃縮するための精製技術を用いることによって調製してもよい。濃縮は、溶液量あたりの重量などの絶対基準に基づいて決定することもできるし、または、ソース混合物中に存在する第２の潜在的妨害物質に関連して決定することもできる。本発明の実施形態の濃縮を高めることはより一層好ましい。したがって、たとえば、２倍濃縮は好ましく、１０倍濃縮はより好ましく、１００倍濃縮はより好ましく、１０００倍濃縮はより一層好ましい。
【0042】
本発明によって治療される「個体」または「対象者」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指し、限定するものではないが、家畜動物、競技用動物および、ヒトを含む霊長類の動物を含む。
【0043】
個体または細胞の「治療」は、治療が開始される時点で個体または細胞の自然経過を変えるための任意のタイプの介入である。たとえば、個体の治療は、限定するものではないが、遺伝性もしくは誘発された遺伝的欠損、ウイルス、細菌もしくは寄生性生物による感染症、腫瘍性状態もしくは無形性状態または、自己免疫もしくは免疫抑制などの免疫系機能障害を含む任意の病的状態によって引き起こされる病状を緩和または抑制するために行われてもよい。治療は、限定するものではないが、医薬組成物などの組成物の投与および、組成物で処理された適合性細胞の投与を含む。治療は、予防的または治療的のいずれかで、すなわち、病理学的事象の開始または病原体との接触の前または後のいずれかで行われてもよい。
【0044】
用語「有効量」は、意図された目的を達成するために十分な量の物質を指す。たとえば、スルフアミダーゼ活性を増加させるための発現ベクターの有効量は、グリコサミノグリカンの蓄積を減少させるのに十分な量である。疾患または障害を治療するための発現ベクターの「治療的有効量」は、疾患の症状または障害を減少または除去させるために十分な発現ベクターの量である。所定の物質の有効量は、その物質の性質、投与経路、その物質が投与される動物のサイズおよび種ならびにその物質を投与する目的などの要因によって異なる。個々の症例における有効量は、当該技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定されてもよい。
【0045】
用語「遺伝子治療」は、遺伝性または後天性の疾患または状態を治療または予防するための、宿主への目的の遺伝物質（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入を指す。目的の遺伝物質は、ｉｎ ｖｉｖｏでの産生が所望される産物（たとえばタンパク質のポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードする。たとえば、目的の遺伝物質は、治療的価値のある酵素、ホルモン、受容体またはポリペプチドをコードすることができる。
発明の詳細な説明
組換えウイルスベクターの高力価調製物を生成する方法、特に、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の高力価調製物を生成する方法を提供することが本発明の目的である。
発明の詳細な説明
組換えウイルスベクターの高力価調製物を生成する方法、特に、遺伝子治療法の実用化に適した規模でその方法を効果的に使用することができる組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）の高力価調製物を生成する方法を提供することが本発明の目的である。
【0046】
本発明に添付された実施例で示されているように、本発明者らは、驚くべきことに、反復ラウンドのトランスフェクションを行うことによって、すなわち、プラスミドベクターを用いて三重または二重トランスフェクションを行う細胞培養物の再トランスフェクションによって、ｒＡＡＶ産生を著しく改善することができることを見出した。
【0047】
したがって、第１の側面において、本発明は、組換えウイルスベクターの産生方法であって、
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、異種ヌクレオチド配列と複製およびパッケージング遺伝子配列とを含むプラスミドベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ウイルスの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたウイルスベクターを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
【0048】
本発明の特定の実施形態において、組換えウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルスおよびピコルナウイルスからなる群から選択される。特定の実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターから選択される。
【0049】
好ましい実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【0050】
本発明に記載のＡＡＶは、ＡＡＶの公知の血清型のいずれかの血清型を含む。一般に、ＡＡＶの様々な血清型は、一連の同一の遺伝子機能を提供する高い相同性を持つゲノム配列を有し、物理的および機能的観点から本質的に同等なビリオンを産生し、実質的に同一の機構によって複製し、アセンブルする。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶおよび任意の他のＡＡＶに属していてもよい。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列の例は、文献または、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで見出してもよい。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照のこと。好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型のベクターである。好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは血清型９のベクターである。
【0051】
特定の実施形態において、本発明は、組換えＡＡＶの産生方法であって、
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含むベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
ａ）少なくとも２つのプラスミドベクターであって、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含むベクターで適切な細胞培養物を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を保持するステップと、
ｄ）ステップａ）に記載のプラスミドベクターでステップｃ）に記載の細胞を再トランスフェクトするステップと、
ｅ）ステップｂ）からステップｃ）まで繰り返すステップと、
を含む、方法に関する。
【0052】
当該技術分野で説明されているように、細胞に形質転換または形質導入する様々な手段のいずれかを用いて当該細胞に遺伝物質を導入することができる。例として、このような技術は、たとえば細菌のプラスミドでのトランスフェクションを含む。実際、本発明の方法のステップａ）に記載のプラスミドベクターは、様々なトランスフェクション技術を用いて細胞に導入することができる。このようなトランスフェクション法については当該技術分野で記載があり、たとえば、リン酸カルシウム共沈法、培養細胞への直接微量注入、電気穿孔法、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介トランスフェクションまたは、高速マイクロプロジェクタイルを用いる核酸送達を含む。他の適切なトランスフェクション媒体は、リン酸ストロンチウム、ポリカチオン性ポリマー（たとえば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン社（登録商標）））、リポソームおよびカチオン性ポリマー（たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ））を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法に記載のプラスミドベクターは、ＰＥＩを用いてトランスフェクトされる。この場合、細胞培養物へのその添加の前に、プラスミドＤＮＡにＰＥＩを添加することによってＰＥＩ／ＤＮＡ複合体が形成される。
【0053】
これらの技術のいずれかを用いて、適切な宿主細胞にベクター構築物などの１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入することができる。一般に、細胞の転写および複製機構を受けさせるために、外因性ＤＮＡは宿主細胞の細胞膜を横断する必要がある。
【0054】
生じる細胞は、外因性核酸分子で一過性にトランスフェクトされる場合がある。すなわち、その外因性ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞のゲノムには組み込まれず、代わりにエピソーム的に存在する。あるいは、生じる細胞は、安定的にトランスフェクトされる場合がある。すなわち、その核酸分子は宿主細胞ゲノムと共有結合するか、または子孫細胞に受け継ぐことができるエピソームユニット（たとえば、十分な速度の染色体外複製が可能な）として維持され、複製される。
【0055】
本発明の方法によれば、トランスフェクトされるプラスミドベクターは、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含む。
【0056】
異種ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドは、一般に、特定の表現型の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションなどの遺伝子治療の文脈において標的細胞に機能を提供する能力によって興味が持たれる。このような異種ポリヌクレオチドまたは「導入遺伝子」は、一般に、所望の機能またはコード配列を提供するための十分な長さを有する。
【0057】
対象とする標的細胞において異種ポリヌクレオチドの転写が所望される場合、当該技術分野で公知のように、たとえば、標的細胞内の所望のレベルおよび／または転写の特異性に応じて、異種ポリヌクレオチドは、それ自身のプロモーターまたは異種プロモーターに作動可能に連結させることができる。様々なタイプのプロモーターおよびエンハンサーが、この文脈で使用するのに適している。構成的プロモーターは、継続的なレベルの遺伝子の転写を提供し、治療用ポリヌクレオチドが継続的に発現されることが所望される場合に好ましい。誘導性プロモーターは、一般に、誘導因子の非存在下で低い活性を示し、誘導因子の存在下でアップレギュレートされる。誘導性プロモーターは、特定の時間または特定の部位でのみ発現が所望される場合か、または誘導剤を用いて発現レベルを決めることが望ましい場合に好ましい可能性がある。プロモーターおよびエンハンサーは、組織特異的であってもよい。すなわちそれらは、おそらくそれらの細胞内に固有に見られる遺伝子制御因子によって、特定の細胞型でのみそれらの活性を示す。
【0058】
プロモーターの例示的な例には、シミアンウイルス４０由来ＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体エンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来前初期プロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターおよび、ＬＴＲエレメントを含む様々なレトロウイルスプロモーターがある。誘導性プロモーターは、重金属イオン誘導性プロモーター（たとえばマウス乳癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは様々な成長ホルモンプロモーター）および、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来プロモーターを含む。例示として、組織特異的プロモーターの例は、様々なサーファクタントタンパク質プロモーター（肺での発現のための）、ミオシンプロモーター（筋肉での発現のための）およびアルブミンプロモーターまたはヒトα１アンチトリプシンｈＡＡＴ（肝臓での発現のための）を含む。様々な他のプロモーターが公知であり、当該技術分野で一般に使用でき、かつ、多くのこれらのプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの配列データベースで入手可能である。好ましい実施形態において、ＣＡＧプロモーターが用いられる。
【0059】
対象とする標的細胞内で翻訳も所望される場合、異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、翻訳を促進する制御因子（たとえばリボソーム結合部位すなわち「ＲＢＳ」および／またはポリアデニル化シグナル）も含む。したがって、異種ポリヌクレオチドは、一般に、適切なプロモーターに操作可能に連結されている少なくとも１つのコード領域を含んでおり、かつ、たとえば、操作可能に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部位および／またはポリＡシグナルを含んでいてもよい。異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域または、同一もしくは異なるプロモーターの制御下に有る２以上のコード領域を含んでいてもよい。制御因子とコード領域または非コード領域との組み合わせを含むユニット全体は、しばしば発現カセットと呼ばれる。特定の実施形態において、本発明の方法に記載の異種ポリヌクレオチドはポリＡシグナルを含む。
【0060】
異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によって、ＡＡＶゲノムコード領域に、または好ましくはその代わりに組み込まれ、かつ一般にＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域の両側に隣接する。あるいは、ただ１つのＩＴＲを有するベクター構築物を用いることもできる。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は２つのＩＴＲに隣接する。
【0061】
ＡＡＶ粒子のカプシド形成のサイズ制限を考慮すれば、このゲノムへの大きな異種ポリヌクレオチドの挿入には、ＡＡＶ配列の一部の除去を必要とする。１つ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、いずれにせよ、複製コンピテントＡＡＶ（「ＲＣＡ」）の生成の可能性を減少させるため望ましい。したがって、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはその両方のコード配列またはプロモーター配列は、これらの遺伝子によって提供される機能がトランスで提供される場合があるため、好ましくは除去される。
【0062】
一実施形態において、異種ヌクレオチド配列はＡＡＶ ＩＴＲに隣接し、トランスで提供されるＡＡＶパッケージング遺伝子は、別のベクタープラスミドで宿主細胞に導入される。
【0063】
ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーター、ｐ５およびｐ１９から発現され、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０と呼ばれる４つのタンパク質を産生する。ＡＡＶ二本鎖ＤＮＡ複製にはＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８のみが必要であるが、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、子孫である一本鎖ＤＮＡの蓄積に必要であると考えられる。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、ＡＡＶ ＩＴＲのヘアピン立体配座に特異的に結合し、ＡＡＶ末端で複製を決定するために必要ないくつかの酵素活性を有する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ＡＡＶ遺伝子の正の調節および負の調節、いくつかの異種プロモーターからの発現ならびに細胞増殖に対する阻害作用を含む多面的調節活性も示す。
【0064】
ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は共通の重複配列を共有するが、ＶＰ１およびＶＰ２は、別の開始コドンの使用によってｐ４０プロモーターから転写されたさらなるアミノ末端配列を含む。３つのタンパク質は、すべて、効率的なカプシド産生に必要である。
【0065】
ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングは、なお、ＡＡＶの適切なヘルパーウイルスの存在またはヘルパーウイルス機能の提供に依存している。本発明の方法によれば、ヘルパーウイルス機能遺伝子配列は、プラスミドベクターで提供される。ＡＡＶベクター調製物中のかなりの量の感染性ヘルパーウイルスの存在は、その調製物がヒトへの投与での使用であるという点で問題となる。
【0066】
本発明の方法の特定の実施形態において、トランスフェクションは２つのプラスミドベクターを用いて行われ、プラスミドベクターの１つはＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含み、プラスミドベクターのもう１つは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列ならびにアデノウイルスヘルパー機能配列を含む。好ましい実施形態において、第２プラスミドベクターは、５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む。
【0067】
本発明の方法の好ましい実施形態において、トランスフェクションは、３つのプラスミドベクターを用いて行われる。すなわち、宿主細胞は、目的の異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つのベクター、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする少なくとも１つのベクター、ならびにアデノウイルス補助機能をコードする少なくとも１つのベクターで三重トランスフェクトされる。
【0068】
適切に改変された細胞の選択は当該技術分野の任意の技術で行われてもよい。たとえば、細胞を改変するために用いられるポリヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の１つ以上の検出マーカーもしくは選択マーカーと同時に導入してもよいし、またはそれらに作動可能に連結して導入してもよい。例として、選択マーカーとして薬物耐性遺伝子を用いることができる。次いで、薬物耐性細胞を選択し、増殖させ、次いで所望の配列（すなわち、必要に応じて、パッケージング遺伝子産物または異種ポリヌクレオチド産物）の発現について試験することができる。導入されたポリヌクレオチドの取り込み、位置および／または維持についての試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（たとえば当該技術分野で公知のサザンブロット法および他の手順）を用いて行うことができる。発現試験は、遺伝子改変細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析または対応する遺伝子産物の間接免疫蛍光法によって容易に行うことができる。
【0069】
したがって、本発明の方法のステップｂ）によれば、トランスフェクトされた細胞は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングを可能にする条件で培養される。特定の実施形態において、細胞はｒＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で培養される。
【0070】
いくつかの基準が、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子の産生に使用するための細胞の選択に影響を及ぼす。より好ましい細胞および細胞株は、組換えＡＡＶベクター調製物の大規模産生を容易にするために培養下で容易に増殖させることができる細胞および細胞株である。大規模産生が所望される場合、産生方法の選択も、宿主細胞の選択に影響を及ぼす。たとえば、ある産生技術および培養容器または培養チャンバーは、接着細胞または付着細胞の増殖のために設計され、他のものは、懸濁液での細胞の増殖のために設計される。したがって、後者の場合、宿主細胞は、懸濁液での増殖に適合することまたは適合可能であることが好ましいであろう。本発明によれば、ｒＡＡＶの大規模産生が所望される。
【0071】
ｒＡＡＶの大規模産生に使用するために、様々な細胞株が企図される。特にｒＡＡＶの細胞培養に適しているものは、接着細胞か、または懸濁液での増殖のために選択された細胞のどちらかのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。ｒＡＡＶを産生するための他の適切な細胞株の例は、ベロ細胞株、ＨｅＬａ細胞株およびＣＨＯ細胞株を含む。本明細書で用いる場合、用語「細胞株」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの持続的または長期の増殖および分裂が可能な細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は単一の前駆細胞由来のクローン集団である。このようなクローン集団の貯蔵または導入時に核型の自発変化または誘発変化が生じる場合があることは、当該技術分野で公知である。そのため、言及した細胞株由来の細胞は、祖先細胞または祖先培養物と正確には同一でない可能性がある。しかしながら、用語「細胞株」はこのような変異株を含む。
【0072】
細胞株を選択したら、最適な細胞培養装置に、細胞培養を維持するのに適した密度で細胞を播種する。特定の装置に播種するのに使用する細胞密度は、その装置のサイズによって異なる。最適な培養装置中で細胞を増殖させるのに、様々な容量を使用してもよい。使用する培地の容量は、培養細胞を増殖させるために使用する培養装置のサイズによって異なる。浮遊培養などの大規模産生方法を用いてもよい。次いで、ＡＡＶ粒子を回収し、それを調製するために使用した細胞から分離する。
【0073】
細胞は、ＡＡＶの複製とｒＡＡＶベクターのパッケージングとを許容する条件下で培養する。培養時間は、好ましくはピーク産生レベルに対応するように調整される。好ましくは、１細胞あたり少なくとも１００ウイルス粒子が産生される。より好ましくは、１細胞あたり少なくとも約１０００ウイルス粒子が産生され、より一層好ましくは、１細胞あたり少なくとも約１０，０００ウイルス粒子が産生される。培養期間中、２×１０５細胞あたり、好ましくは、少なくとも０．５×１０６、より好ましくは少なくとも約１×１０６、より一層好ましくは少なくとも約２×１０６ＲＵ／ｍｌのＡＡＶベクターが産生される。
【0074】
大規模な細胞増殖およびＡＡＶ産生を達成するために、開示された本発明において様々な増殖培地を使用してもよい。増殖培地の選択は、培養される細胞のタイプに応じて変わる。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。好ましい実施形態において、細胞はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。より好ましくは、細胞は懸濁液中で増殖するのに適した細胞である。
【0075】
付着細胞の培養については、細胞接着に必要な表面を提供するために、ローラーボトル（所定の速度で回転する円筒組織培養フラスコ）が使用される。あるいは、接着細胞培養物を維持するために、マイクロキャリアも適切なシステムである。懸濁細胞の培養については、撹拌タンクバイオリアクターが最も望ましいシステムである。なぜなら、撹拌タンクバイオリアクターは、高細胞密度培養物に達せさせることができ、そして、精製後に大量のｒＡＡＶを提供することができるためである。
【0076】
本発明の特定の実施形態において、揺動運動型バイオリアクターが用いられる。他の特定の実施形態において、撹拌タンクバイオリアクターを用いることもできる。そのリアクター中の細胞培養物が所定のポイントに達すると、前述のように細胞のトランスフェクションが行われる。
【0077】
本発明の方法によれば、ステップｃ）は、ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収し、さらなる分裂と増殖を可能にする条件で細胞培養物中に細胞を維持することを含む。本方法の好ましい実施形態において、撹拌液体培地の懸濁液中で細胞を培養することによってステップｂ）が行われる。
【0078】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、ステップｂ）において、産生されるＡＡＶは細胞培養物の上清に分泌される。したがって、本発明の方法のステップｃ）によれば、ｒＡＡＶは上清から採取され、細胞は、さらなる分裂と増殖のために細胞培養物中に保持される。次いで、そのように産生されたｒＡＡＶとともに、使用済みの培地または上清が回収される。なぜなら、以下の実施例で示すように、ＡＡＶは、細胞溶解を必要とせずに細胞培養物の上清に分泌されるからである。
【0079】
特定の実施形態において、細胞培養物の細胞培地は、再トランスフェクションが行われる前に、すなわちステップｄ）の前に交換される。特定の実施形態において、細胞培地交換は遠心分離によって行われる。好ましい実施形態において、培地交換は灌流によって行われる。より好ましい実施形態において、灌流によって連続培地交換が行われる。より好ましくは、培地は、灌流システムによって自動的に交換される。このシステムによって、培養物に新鮮な培地が補充され、一方で、細胞保持装置を用いて無細胞上清が取り除かれる。このプロセスは、好ましくは、一定の採取流速で行われる。これに関して、好ましい実施形態において、さらなる分裂および増殖を可能にするために、保持した細胞に新たな新鮮培地が追加される。栄養素の一定の添加と毒性代謝物の除去によって、何週間もの間、灌流培養が、高い細胞密度に達し、それを維持することを可能にする。
【0080】
本発明者らは、驚くべきことに、ＡＡＶの産生を長期間行うことができるように、ステップａ）について前述のように、細胞培養物中に保持した細胞をプラスミドベクターで再トランスフェクトすることができることを見出した。この点で、さらなる分裂と増殖を可能にする細胞培養装置中に保持された細胞を用いることによって、より多くのｒＡＡＶが産生される。したがって、本発明者らは、反復ラウンドのトランスフェクションを行うことによって、同じ細胞培養物を用いて長期にわたってｒＡＡＶの産生を延長することができることを見出した。さらに、本発明に添付された実施例で見られるように、本発明者らは、これらの培地交換を行うことによって、細胞溶解を必要とせずに細胞培養物の上清にＡＡＶが分泌されること、および各再トランスフェクションラウンドの前に培地交換が行われるごとにＡＡＶを採取することができることを見出した。提案された方法論の他の利点は、ｒＡＡＶが上清から回収されることであり、これは、ＡＡＶを採取するために細胞を溶解する必要がなく、したがって宿主細胞ＤＮＡと宿主細胞タンパク質による汚染が少ないため、精製の観点から利点となる。
【0081】
したがって、本発明の方法は、ステップａ）に記載のプラスミドベクターで、ステップｃ）に記載の保持した細胞を再トランスフェクトするステップｄ）を含む。
【0082】
本発明の方法のステップｄ）によれば、培地交換なしで単一のトランスフェクションラウンドを必要とする従来の一過性の遺伝子発現（ＴＧＥ）アプローチとは対照的に、細胞培養物に再トランスフェクションまたは反復ラウンドのトランスフェクションが行われる。
【0083】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、同じ細胞培養物を用いて、２回以上の再トランスフェクションおよび回収ステップを繰り返すことができることを見出した。本発明の方法の特定の実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に少なくとももう１回繰り返される。他の特定の実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に少なくとも２回繰り返される。さらに特定の実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に少なくとも３回繰り返される。好ましい実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に少なくとも４回繰り返される。さらに特定の実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に１回から３回繰り返される。さらに特定の実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後に１回から２回繰り返される。好ましい実施形態において、本発明の方法は、回収ステップｃ）後にステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）の１回の繰り返しを含む。本発明の方法の好ましい実施形態において、ステップｄ）、ステップｂ）およびステップｃ）は、回収ステップｃ）後にもう１回繰り返される。
【0084】
前述のように、本発明の方法の特定の実施形態において、灌流によって連続培地交換が行われる。好ましい実施形態において、トランスフェクションが行われるごとに灌流を停止する。これによって、プラスミドベクターが細胞に侵入することを可能にする。より好ましい実施形態において、灌流は、少なくとも１．５時間、より好ましくは、少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも３時間、より一層好ましくは少なくとも４時間の時間間隔で停止する。好ましい実施形態において、各再トランスフェクションラウンドの間に最小の時間間隔が存在する。より好ましい実施形態において、再トランスフェクションは、少なくとも３６時間、より好ましくは少なくとも４８時間の時間間隔後に行われる。
【0085】
他の特定の実施形態において、方法は、全ラウンドの再トランスフェクションおよび回収の完了後に、上清中の細胞を溶解するさらなるステップを含む。
【0086】
細胞破壊または細胞溶解のために用いることができるいくつかの周知の最先端の技術がある。凍結融解および／または超音波処理は、細胞を破壊するために使用することができるが、これらの技術は、大規模調製物にはあまり適していない。したがって、これらの点で、機械的溶解技術が好ましい。溶解を媒介または促進するために、界面活性剤および他の化学薬剤を使用することもできる。ヌクレアーゼ（たとえばベンゾナーゼ）での溶解物の処理は、粘度を低下させ、濾過性を改善するために有益であることが見出されている。細胞残屑の少なくとも一部からベクターを分離するため、たとえば精密濾過による清澄化も、回収および精製を促進するために有益である。本発明の特定の実施形態において、本発明の方法による溶解ステップは、ヌクレアーゼの使用を含む。より好ましくは、ヌクレアーゼはベンゾナーゼである。
【0087】
本発明の方法の特定の実施形態において、前述のように本発明のｒＡＡＶを含む回収した上清は、ｒＡＡＶを精製するためにさらに処理される。この点で、他の特定の実施形態において、このプロセスは、リアクターシステム内に細胞が保持され、一方で細胞残屑のないきれいな上清中に膜によってＡＡＶが回収され、したがって精製がはるかに簡単になるように、細胞保持膜に接続されたバイオリアクター内で行われる。
【0088】
遺伝子治療のためのＡＡＶの産生に特に有用であるためには、その技術が「大規模に実現可能」なこと、すなわち大規模製造装置および方法と組み合わせて適用可能であることが最も望ましい。
【0089】
例として、ＡＡＶは、正に荷電した陰イオン交換カラム、たとえばＮ荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂（たとえばＰＯＲＯＳまたは任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、第三級もしくは第四級アミン、またはＰＥＩベース樹脂）または負に荷電した陽イオン交換カラム（たとえばＨＳ、ＳＰ、ＣＭまたは任意のスルホ、ホスホまたはカルボキシベースのカチオン樹脂）にロードすることができる。カラムは緩衝液で洗浄することができる。カラムは、ＮａＣｌ濃度の上昇勾配またはｐＨの下降勾配で溶出することができ、画分を回収し、ＡＡＶおよび／または混入物質の存在についてアッセイすることができる。
【0090】
当該技術分野で公知の、荷電以外の特徴によって媒介される分子間結合に基づいて、上記の陰イオンおよび陽イオン交換手順の代わりに、または好ましくはそれらに加えて、他の手順を用いることができる。このような他の手順は、リガンド－受容体対（たとえば抗体－抗原またはレクチン－炭水化物相互作用）に基づく分子間会合と、分子の他の属性に基づく分離、たとえばサイズおよび／または形状に基づく分子ふるいクロマトグラフィーとを含む。
【0091】
前述のようにカラムから溶出したＡＡＶ含有画分のプールは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、精製することができる。膜を介して調製物を濾過し、産物が保持される。保持された物質は、適切な緩衝液の連続洗浄によって膜を用いて透析濾過することができる。最終試料は、産物が高度に濃縮されており、使用のために濾過および保存することができる。
【0092】
ベクタープラスミドでのトランスフェクションは、細胞播種が行われる日に行うことができるが、細胞播種密度に応じて、細胞播種後、１日目、２日目、３日目、４日目または５日目に行ってもよい。
【0093】
本発明の一実施形態において、最適な宿主細胞は、目的の異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つのベクター、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする少なくとも１つのベクター、ならびにアデノウイルス補助機能をコードする少なくとも１つのベクターで三重トランスフェクトされる。特定の実施形態において、三重トランスフェクションはＰＥＩトランスフェクションを用いて行われる。
【0094】
一過性トランスフェクションによるｒＡＡＶ産生時のプラスミド骨格配列のパッケージング（逆パッケージング）は、当該分野で周知の一般的な問題点である。本明細書で用いる場合、用語「逆パッケージング」は、異種配列の代わりにＩＴＲ含有プラスミド骨格をカプシド形成することを指す。実際、ＡＡＶベクターにとって、パッケージされたＤＮＡ不純物の優勢種は、ＩＴＲからの逆パッケージングによって同様に生成される発現カセットに隣接するＩＴＲに隣接するプラスミド配列である。ｒＡＡＶストック中のこれらの粒子の存在は、臨床応用にとって、安全上の問題となる可能性がある。
【0095】
以下の実施例１に示すように、トランスフェクションのための最適化されたプラスミドの組み合わせは、ＡＡＶベクター産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高い収量と、細菌配列の逆パッケージングの低下とをもたらした。特に、本発明者らは、３つのプラスミドベクターであって、第１プラスミドベクターｉ）が、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ＩＴＲの外側にあるスタッファーＤＮＡ配列とを含み、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超になるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有し、第２プラスミドベクターｉｉ）が、５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含み、第３プラスミドベクターｉｉｉ）が、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含み、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲと、プロテアーゼ配列とを含まない、３つのプラスミドベクターで細胞がトランスフェクトされたとき、ｒＡＡＶ産生が著しく増加することを見出した。この点において、以下に示す結果によれば、標準プラスミドの組み合わせの代わりにこれらの３つの最適化されたプラスミドの組み合わせを用いるとき、ＡＡＶ収量は３倍増加する。さらに、当業者に周知の標準プラスミド、すなわち、異種ヌクレオチド配列、ｐＲｅｐＣａｐベクター（たとえばｐＲｅｐ２Ｃａｐ９ベクター）および、ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルス配列（ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４）を含むプラスミドを含む大きすぎないプラスミドを用いる三重トランスフェクションと比較して、逆パッケージングは著しく低下する。前述のように、本発明に用いる最適化されたヘルパープラスミドは、ＡＡＶ産生に必要なＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む。プラスミドは、Ｅ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲ配列を含む特定の配列を含まないように改変されている。
【0096】
図３に明確に示されているように、異種ヌクレオチド配列を含む最適化されたプラスミドであって、スタッファーＤＮＡ配列を含む大きすぎるプラスミドであるプラスミドは、最適化されていないプラスミド、すなわち三重トランスフェクションに用いられる標準ベクターと組み合わせて用いられる場合、ベクターゲノム収量を改善しない。したがって、最適化された大きすぎるプラスミド単独での使用は、三重トランスフェクションによるベクターゲノム収量の改善をもたらさない。
【0097】
しかしながら、この最適化された大きすぎるプラスミドと、アデノウイルスヘルパー機能を含む最適化されたプラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）またはＡＡＶ ｒｅｐコード領域およびＡＡＶ ｃａｐコード領域を含む最適化されたプラスミド（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９）との組み合わせは、ベクターゲノム収量を改善した（図３参照）。さらに、３つの最適化されたベクターを組み合わせるとき、ベクターゲノム収量は大きく向上する（図３参照）。
【0098】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、最適化された大きすぎるプラスミド（ｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００）と、最適化されたヘルパープラスミドである、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９および／またはｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１の１つまたは両方との同時トランスフェクションを行うとき、細菌配列の逆パッケージングが低下することを見出した（図４）。特に、これらの最適化されたプラスミドの三者併用は、逆パッケージングの大きな低下をもたらす（図４および図５）。実際、最適化されたヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）および／または（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９）の使用による細菌配列の割合の減少は、大きすぎる骨格を含む最適化されたプラスミド（ｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００）を同時トランスフェクトしたとき、より著しかった（図５）。
【0099】
本明細書で用いる場合、用語「大きすぎる骨格」は、ＡＡＶベクターのカプシド形成の制限を超える塩基対のサイズ（約４７００ｂｐ）を有するプラスミド骨格を指す。
【0100】
好ましい実施形態において、本発明の方法に用いられる第２プラスミドベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐ２およびＡＡＶ Ｃａｐ９コード領域を含む。好ましい実施形態において、プラスミドベクターは、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６９を有する、配列番号５に記載のｐＲｅｐＣａｐ－８０９である。
【0101】
したがって、本発明の方法の特定の実施形態において、ステップａ）において、以下の３つのプラスミドベクター：
ｉ）第１プラスミドベクターであって、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ＩＴＲの外側にあるスタッファーＤＮＡ配列とを含み、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超になるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有する第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ） ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない第３プラスミドベクター、
が用いられる。
ｉ）第１プラスミドベクターであって、ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ＩＴＲの外側にあるスタッファーＤＮＡ配列とを含み、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超になるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有する第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ） ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない第３プラスミドベクター、
が用いられる。
【0102】
特定の実施形態において、スタッファーＤＮＡ配列は、異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター中のＩＴＲの１つに隣接して配置される。
【0103】
他の特定の実施形態において、プラスミドの骨格サイズは７０００ｂｐ～７５００ｂｐである。さらに特定の実施形態において、プラスミドの骨格サイズは７０００ｂｐ～７２００ｂｐである。
【0104】
好ましい実施形態において、第１プラスミドベクターは、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まない。
【0105】
より好ましい実施形態において、第１プラスミドベクターは、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６７を有する、配列番号２に記載のｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００である。
【0106】
本発明の方法の他の実施形態によれば、前述のように、ＡＡＶの産生を長期間行うことができるように、細胞培養物中の残りの細胞を２つのプラスミドベクターで再トランスフェクトすることができる。
【0107】
したがって、本発明は、ステップａ）において、以下の２つのプラスミドベクター：
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ＩＴＲの外側にあり、好ましくはＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列とを含む第１プラスミドベクターであって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超であり、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであり、より好ましくは７０００ｂｐ～７２００ｂｐであるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有する第１プラスミドベクター、
ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列ならびに、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第２プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない第２プラスミドベクター、
が用いられる本発明の方法にも関する。
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、ＩＴＲの外側にあり、好ましくはＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列とを含む第１プラスミドベクターであって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超であり、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐであり、より好ましくは７０００ｂｐ～７２００ｂｐであるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂを有する第１プラスミドベクター、
ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列ならびに、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第２プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まない第２プラスミドベクター、
が用いられる本発明の方法にも関する。
【0108】
他の特定の実施形態において、第２プラスミドベクターは、５’から３’まで、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む。
【0109】
特定の実施形態において、第１プラスミドベクターは、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まない。
【0110】
他の特定の実施形態において、第２プラスミドベクターはＡＡＶ Ｒｅｐ２およびＡＡＶ Ｃａｐ９コード領域を含む。
【0111】
前述のように、トランスフェクションのための最適化されたプラスミドの組み合わせは、ＡＡＶベクター産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高い収量をもたらし、細菌配列の逆パッケージングを低下させる。
【0112】
以下の実施例において、ｒＡＡＶの産生が、ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター、ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター、ならびにｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含むプラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクターを用いて行われるとき、逆パッケージングは著しく低下し、さらに、三重トランスフェクションによるＡＡＶの産生に用いられる標準プラスミドと比較して、生産性が向上することが示されている。
【0113】
したがって、他の側面において、本発明は、
組換えＡＡＶの産生方法であって、
ａ）
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲ プロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収するステップと、
を含む、方法に関する。
組換えＡＡＶの産生方法であって、
ａ）
ｉ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列を含む第１プラスミドベクター、
ｉｉ）５’から３’まで、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域、ＡＡＶ ｃａｐコード領域および、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域を含むヌクレオチド配列を含む第２プラスミドベクター、
ｉｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ ｙ Ｅ４配列を含むアデノウイルスヘルパー機能を含む第３プラスミドベクターであって、プラスミドがＥ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲ プロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクター、
で適切な細胞を同時トランスフェクトするステップと、
ｂ）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件で細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で産生されたＡＡＶを回収するステップと、
を含む、方法に関する。
【0114】
好ましい実施形態において、第１プラスミドベクターｉ）は、プラスミドの骨格サイズが５０００ｐｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐ、より好ましくは、７０００ｂｐ～７２００ｂｐであり、かつＩＴＲの外側にあり、好ましくはＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列を含み、スタッファー配列が長さ４４００ｐｂ～４８００を有することを特徴とする。より好ましい実施形態において、第１プラスミドベクターｉ）は、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まない。本発明のより好ましい実施形態において、第１プラスミドは、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６７を有する、配列番号２に記載のｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００である。
【0115】
他の好ましい実施形態において、第２プラスミドベクターｉｉ）は、ＡＡＶ Ｒｅｐ２およびＡＡＶ Ｃａｐ９コード領域を含む。好ましい実施形態において、プラスミドベクターはアクセッション番号ＤＳＭ ３２９６９を有する、配列番号５に記載のｐＲｅｐＣａｐ－８０９である。
【0116】
他の好ましい実施形態において、第３プラスミドベクターｉｉｉ）は、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６５を有する、配列番号６に記載のｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１である。
【0117】
前述のように、本発明の他の特定の実施形態において、撹拌液体培地の懸濁液中で細胞を培養することによってステップｂ）が行われる。
【0118】
他の側面において、本発明は、プラスミドベクターであって、
ａ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
ｂ）ＩＴＲの外側にあり、ＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列であって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐ、より好ましくは、７０００ｂｐ～７２００ｂｐになるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂ、より好ましくは、４５００Ｋｂ～４７００Ｋｂ、より一層好ましくは、４６００Ｋｂ～４７００Ｋｂを有するスタッファーＤＮＡ配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターにも関する。本発明のより好ましい実施形態において、プラスミドは、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６７を有する、配列番号２に記載のｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００である。
ａ）ＩＴＲに隣接する異種ヌクレオチド配列と、
ｂ）ＩＴＲの外側にあり、ＩＴＲの１つに隣接するスタッファーＤＮＡ配列であって、プラスミドの骨格サイズが５Ｋｂ超、好ましくは７０００ｂｐ～７５００ｂｐ、より好ましくは、７０００ｂｐ～７２００ｂｐになるように、スタッファー配列が長さ４４００Ｋｂ～４８００Ｋｂ、より好ましくは、４５００Ｋｂ～４７００Ｋｂ、より一層好ましくは、４６００Ｋｂ～４７００Ｋｂを有するスタッファーＤＮＡ配列と、
を含むプラスミドベクターにおいて、骨格配列中にＦ１Ｏｒｉヌクレオチド配列を含まないプラスミドベクターにも関する。本発明のより好ましい実施形態において、プラスミドは、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６７を有する、配列番号２に記載のｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００である。
【0119】
他の特定の側面において、本発明は、アデノウイルス配列Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ－ＲＮＡを含むヘルパープラスミドベクターであって、Ｅ３、ｐＴＢ（Ｅ２Ｂ）およびＡｄ ＩＴＲプロテアーゼ配列を含まないプラスミドベクターに関する。より詳細には、このプラスミドは、ＶＡ遺伝子を含む７３１ｂｐの領域、Ｅ２Ａ遺伝子およびＥ４遺伝子を含む５３４６ｂｐ領域を含み、それらの調節領域は３１８１ｂｐフラグメントに含まれる。プラスミド骨格は、高コピー数の細菌の複製起点を含む。より好ましい実施形態において、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ ３２９６５として寄託されたｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１に相当する配列番号６のプラスミドベクターに関する。
遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用
本発明のｒＡＡＶウイルスベクターは、遺伝子治療の目的で個人への投与のために使用することができる。遺伝子治療のための適切な疾患は、限定するものではないが、ウイルス、細菌または寄生虫感染によって誘発される疾患、様々な悪性腫瘍および過剰増殖状態、自己免疫状態および先天性欠損を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法によって産生されるｒＡＡＶベクターは、ライソゾーム病（ＬＳＤ）の治療に使用される。より好ましくは、ベクターは、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の治療に有益である。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ＭＰＳの治療に有用な酵素をコードする配列である。特に、配列は、ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ、ヒトヘパランスルファミダーゼ、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ヒトα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヒトヘパラン－α－グルコサミニド、ヒトＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ヒトＮ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ヒトガラクトース６－硫酸スルファターゼ、ヒトβ－ガラクトシダーゼ、ヒトＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼからなる群から選択される。
遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用
本発明のｒＡＡＶウイルスベクターは、遺伝子治療の目的で個人への投与のために使用することができる。遺伝子治療のための適切な疾患は、限定するものではないが、ウイルス、細菌または寄生虫感染によって誘発される疾患、様々な悪性腫瘍および過剰増殖状態、自己免疫状態および先天性欠損を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法によって産生されるｒＡＡＶベクターは、ライソゾーム病（ＬＳＤ）の治療に使用される。より好ましくは、ベクターは、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の治療に有益である。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ＭＰＳの治療に有用な酵素をコードする配列である。特に、配列は、ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ、ヒトヘパランスルファミダーゼ、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ヒトα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヒトヘパラン－α－グルコサミニド、ヒトＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ヒトＮ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ヒトガラクトース６－硫酸スルファターゼ、ヒトβ－ガラクトシダーゼ、ヒトＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼからなる群から選択される。
【0120】
遺伝子治療は、細胞内での特定のタンパク質の発現レベルを高めるために行うこともできるし、または細胞によって分泌される特定のタンパク質の発現レベルを高めるために行うこともできる。本発明のベクターは、遺伝子標識、欠如遺伝子もしくは欠損遺伝子の置換または治療遺伝子の挿入のいずれかの目的で、細胞を遺伝子改変するために使用してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、発現レベルが低下した細胞に提供されてもよい。これは、望ましくない表現型、たとえば、悪性腫瘍の過程で増幅もしくは過剰発現された遺伝子、または微生物感染の過程で導入もしくは過剰発現された遺伝子の産物の抑制のために使用してもよい。発現レベルは、たとえば、標的遺伝子またはＲＮＡ転写産物のいずれかと安定なハイブリッドを形成することが可能な配列（アンチセンス療法）、関連性があるｍＲＮＡを切断するためのリボザイムとして作用することが可能な配列、または標的遺伝子の産物のデコイとして作用することが可能な配列を含む治療用ポリヌクレオチドを供給することによって抑制させてもよい。
【0121】
医薬組成物は、液体溶液もしくは懸濁液として、エマルションとして、または、使用前に液体中で溶出または懸濁するのに適した固形として供給することができる。担体は、たとえば、保存剤の有無にかかわらず、水または緩衝化された食塩液である。
【0122】
医薬組成物は、投与時に再懸濁するために凍結乾燥してもよいし、または溶液であってもよい。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は注射用懸濁液である。その場合、最終製品は、適切な緩衝液で製剤化し、バイアルに充填し、使用するまで保存する。
【0123】
必須ではないが、医薬組成物は、任意選択で、正確な量の投与に適した単位剤形で供給されてもよい。
【0124】
本発明を一般的に説明してきたが、例として提示されるものであって、本発明を何ら限定するものではない以下の実施例を参照することにより、本発明をより理解しやすくなるであろう。
実施例
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の従来技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。
実施例１：標準プラスミドベクターと比較した、最適化されたベクターを用いる三重トランスフェクション
１．１．プラスミドの説明
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－８２７（配列番号１）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする１５１２ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含むプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミドの骨格サイズは３１５６ｂｐ（標準骨格サイズ）であり、９６６ｂｐのアンピシリン耐性遺伝子、５１４ｂｐのバクテリオファージ複製起点および５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含む。
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００（配列番号２）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする１５１２ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含む大きすぎるプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミド骨格は７０７３ｂｐであり、１０４３ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子、５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに４６５７ｂｐのランダム配列を含む。
プラスミドｐｏｈｌＤＳ－８７４（配列番号３）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトイズロン酸－２－スルファターゼをコードする１６５３ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含む大きすぎるプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミド骨格は７０７３ｂｐであり、１０４３ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子、５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに４６５７ｂｐのランダム配列を含む。
プラスミドｐＲｅｐＣａｐ９－８０８（配列番号４）
その元の位置に、Ｐ５プロモーターとともにｒｅｐ２およびｃａｐ９タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子に相当する１８６６ｂｐのフラグメントと、それに続く、ＡＡＶ９Ｃａｐ遺伝子をコードする２２１１ｂｐの配列とを含む。１３０ｂｐのＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ遺伝子の上流のその元の位置に配置される。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドｐＲｅｐＣａｐ９－８０９（配列番号５）
Ｃａｐ９遺伝子の後のＰ５プロモーターとともにｒｅｐ２およびｃａｐ９タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子に相当する１８６６ｂｐのフラグメントと、それに続く、ＡＡＶ９Ｃａｐ遺伝子をコードする２２１１ｂｐの配列とを含む。ＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターに相当する１３０ｂｐの配列は、Ｃａｐ遺伝子の下流にある。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドｐＸＸ６
ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルス配列（Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ－ＲＮＡ）を含むプラスミド。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む（Ｘｉａｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９８年３月；７２（３）：２２２４－２２３２）。プラスミドｐＸＸ６－８０は、骨格のみが改変されたｐＸＸ６に由来する。ｐＸＸ６－８０の地図および配列は文献で詳細に説明されている。
プラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１（配列番号６）
ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルス配列（Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ－ＲＮＡ）を含むプラスミド。このプラスミドは、ＶＡ遺伝子を含む７３１ｂｐの領域、Ｅ２Ａ遺伝子およびＥ４遺伝子を含む５３４６ｂｐの領域を含み、それらの調節領域は３１８１ｂｐのフラグメントに含まれる。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子および高コピー数の細菌の複製起点を含む。
１．２．三重トランスフェクションによるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈベクターの産生
材料および方法
ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈベクターは、既述のように（Ａｙｕｓｏ Ｅら Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０年４月；１７（４）：５０３－１０）、トランスフェクション剤としてＰＥＩ－ＭＡＸを用いる一過性の三重トランスフェクションによって産生された。簡潔に言えば、集密状態のＨＥＫ ２９３付着細胞を、等モル量の３つのプラスミド：ｐｃｏｈＳｇｓｈ－８２７、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０８およびｐＸＸ６（標準プラスミド）またはｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９およびｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１（最適化されたプラスミド）、でトランスフェクトした。ＰＥＩ－ＭＡＸは、２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で用いた。トランスフェクション後７２時間で細胞を採取し、３サイクルの凍結融解によって溶解して、細胞内からｒＡＡＶベクターを放出させた（以下の実施例２参照）。ＨＥＫ ２９３懸濁細胞を用いるｒＡＡＶベクターの産生についても記述がある（Ｊｏｓｈｕａ Ｃ Ｇｒｉｅｇｅｒら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１６年２月；２４（２）：２８７－２９７）。
実施例
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の従来技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。
実施例１：標準プラスミドベクターと比較した、最適化されたベクターを用いる三重トランスフェクション
１．１．プラスミドの説明
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－８２７（配列番号１）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする１５１２ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含むプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミドの骨格サイズは３１５６ｂｐ（標準骨格サイズ）であり、９６６ｂｐのアンピシリン耐性遺伝子、５１４ｂｐのバクテリオファージ複製起点および５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含む。
プラスミドｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００（配列番号２）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする１５１２ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含む大きすぎるプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミド骨格は７０７３ｂｐであり、１０４３ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子、５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに４６５７ｂｐのランダム配列を含む。
プラスミドｐｏｈｌＤＳ－８７４（配列番号３）
１７５６ｂｐのＣＡＧプロモーターおよび、ウサギβ－グロビンｐＡに相当する５１９ｂｐのフラグメントの制御下にあるヒトイズロン酸－２－スルファターゼをコードする１６５３ｂｐのコドン最適化ｃＤＮＡを含む大きすぎるプラスミド。これらの３つの因子は、ＡＡＶの２つのＩＴＲ配列に隣接する。このプラスミド骨格は７０７３ｂｐであり、１０４３ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子、５８９ｂｐの高コピー数の細菌の複製起点を含み、さらに４６５７ｂｐのランダム配列を含む。
プラスミドｐＲｅｐＣａｐ９－８０８（配列番号４）
その元の位置に、Ｐ５プロモーターとともにｒｅｐ２およびｃａｐ９タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子に相当する１８６６ｂｐのフラグメントと、それに続く、ＡＡＶ９Ｃａｐ遺伝子をコードする２２１１ｂｐの配列とを含む。１３０ｂｐのＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ遺伝子の上流のその元の位置に配置される。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドｐＲｅｐＣａｐ９－８０９（配列番号５）
Ｃａｐ９遺伝子の後のＰ５プロモーターとともにｒｅｐ２およびｃａｐ９タンパク質をコードするプラスミド。このプラスミドは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子に相当する１８６６ｂｐのフラグメントと、それに続く、ＡＡＶ９Ｃａｐ遺伝子をコードする２２１１ｂｐの配列とを含む。ＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターに相当する１３０ｂｐの配列は、Ｃａｐ遺伝子の下流にある。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む。
プラスミドｐＸＸ６
ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルス配列（Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ－ＲＮＡ）を含むプラスミド。このプラスミド骨格は、アンピシリン耐性遺伝子と高コピー数の細菌の複製起点とを含む（Ｘｉａｏら Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９８年３月；７２（３）：２２２４－２２３２）。プラスミドｐＸＸ６－８０は、骨格のみが改変されたｐＸＸ６に由来する。ｐＸＸ６－８０の地図および配列は文献で詳細に説明されている。
プラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１（配列番号６）
ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルス配列（Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ－ＲＮＡ）を含むプラスミド。このプラスミドは、ＶＡ遺伝子を含む７３１ｂｐの領域、Ｅ２Ａ遺伝子およびＥ４遺伝子を含む５３４６ｂｐの領域を含み、それらの調節領域は３１８１ｂｐのフラグメントに含まれる。このプラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子および高コピー数の細菌の複製起点を含む。
１．２．三重トランスフェクションによるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈベクターの産生
材料および方法
ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈベクターは、既述のように（Ａｙｕｓｏ Ｅら Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０年４月；１７（４）：５０３－１０）、トランスフェクション剤としてＰＥＩ－ＭＡＸを用いる一過性の三重トランスフェクションによって産生された。簡潔に言えば、集密状態のＨＥＫ ２９３付着細胞を、等モル量の３つのプラスミド：ｐｃｏｈＳｇｓｈ－８２７、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０８およびｐＸＸ６（標準プラスミド）またはｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９およびｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１（最適化されたプラスミド）、でトランスフェクトした。ＰＥＩ－ＭＡＸは、２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で用いた。トランスフェクション後７２時間で細胞を採取し、３サイクルの凍結融解によって溶解して、細胞内からｒＡＡＶベクターを放出させた（以下の実施例２参照）。ＨＥＫ ２９３懸濁細胞を用いるｒＡＡＶベクターの産生についても記述がある（Ｊｏｓｈｕａ Ｃ Ｇｒｉｅｇｅｒら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１６年２月；２４（２）：２８７－２９７）。
【0125】
ベクターゲノムは、発現カセット中に存在するウサギβグロビンポリＡ配列に特異的なプライマーおよびプローブを用いて既述のように（Ａｙｕｓｏら 前出）、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって定量した。同様に、用いたすべてのプラスミド骨格に存在する抗生物質耐性プロモーターに特異的なプライマーおよびプローブを用いるＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって逆パッケージングを定量した。
【0126】
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００を用いて行った。
【0127】
【表1】
【0128】
結果
前述のように、最適化されたプラスミドを用いる三重トランスフェクションによる組換えＡＡＶ９ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈの産生は、ＡＡＶベクターの産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高収量をもたらす（図１）。
前述のように、最適化されたプラスミドを用いる三重トランスフェクションによる組換えＡＡＶ９ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈの産生は、ＡＡＶベクターの産生によく使用される標準プラスミドでの産生よりも高収量をもたらす（図１）。
【0129】
最適化されたプラスミドを用いる三重トランスフェクションによって産生されたＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｃｏｈＳｇｓｈベクターは、ＡＡＶ産生によく使用される標準プラスミドによって得られる細菌配列の逆パッケージングよりも低下した細菌配列の逆パッケージングをもたらす（図２）。
【0130】
プラスミドが、スタッファーＤＮＡ配列を含む大きすぎるプラスミド（ｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００）である、異種ヌクレオチド配列を含む最適化されたプラスミドの使用は、最適化されていないプラスミド、すなわち三重トランスフェクションに用いられる標準ベクターと組み合わせて三重トランスフェクションに用いられるとき、ベクターゲノム収量を改善しない。したがって、最適化された大きすぎるプラスミド単独での使用は、三重トランスフェクションによるベクターゲノム収量の改善をもたらさない（図３）。
【0131】
しかしながら、この最適化された大きすぎるプラスミドと、アデノウイルスヘルパー機能を含む最適化されたプラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）または、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域およびＡＡＶ ｃａｐコード領域を含む最適化されたプラスミド（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９）との組み合わせは、ベクターゲノム収量を改善した（図３参照）。さらに、３つの最適化されたベクターを組み合わせるとき、ベクターゲノム収量は大きく向上する（図３参照）。
【0132】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、最適化された大きすぎるプラスミド（ｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００）と、最適化されたヘルパープラスミドであるｐＲｅｐＣａｐ９－８０９および／またはｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１の１つまたは両方との同時トランスフェクションを行うとき、細菌配列の逆パッケージングが低下することを見出した（図４）。特に、これらの最適化されたプラスミドの三者併用は、逆パッケージングの大きな低下をもたらす（図４および図５）。実際、最適化されたヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ８６１）および／または（ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９）の使用による細菌配列の割合の減少は、大きすぎる骨格を含む最適化されたプラスミド（ｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００）を同時トランスフェクトしたとき、より著しかった（図５）。
実施例２：三重トランスフェクションおよび長期遺伝子発現（ＥＧＥ）
２．１．細胞株、培地および培養条件
用いた細胞株は、カナダ国立研究機構バイオテクノロジー研究所（カナダ、モントリオール）によって提供された無血清懸濁液適応ＨＥＫ ２９３細胞株（ＨＥＫ ２９３ＳＦ－３Ｆ６）である。細胞は、Ｇｌｕｔａｍａｘ（８ｍＭ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１（インビトロゲン社）（０．１％）およびＩＧＦ（０．０５ｎｇ／Ｌ）を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地（インビトロゲン社、カリフォルニア州カールスバッド）で培養する。細胞は、１２５ｍＬディスポーザブルポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ（コーニング社、ニューヨーク州スチューベン）中、２０ｍＬの培地で継続的に維持される。フラスコは、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃に維持したインキュベーター内に設置したオービタルシェーカー（キューナーシェーカー社、スイス）を用いて１３０ｒｐｍで振盪する。細胞数および生存率は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－３０００（ケモメテック社、デンマーク）を用いて測定した。
２．２．一過性トランスフェクション（ＴＧＥ）
ＨＥＫ ２９３懸濁細胞は、ＰＥＩＰｒｏ（ポリサイエンス社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いて一過性にトランスフェクトする。ＨＥＫ ２９３細胞を、１２５ｍＬディスポーザブルフラスコ中、０．５・１０６細胞／ｍＬで播種し、２・１０６細胞／ｍＬまで増殖させ、ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１を０．７６μｇ／培養物１ｍＬ、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９を０．７７μｇ／培養物１ｍＬおよび、ｐｏｈｌＤＳ－８７４を０．３８μｇ／培養物１ｍＬまたはｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００を０．３８μｇ／培養物１ｍＬで、ＤＮＡ対ＰＥＩ重量比１：２でトランスフェクトする。ＤＮＡにＰＥＩを迅速に添加し、両方とも新鮮培地で同じ容量に希釈することによって、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体が形成される（複合体混合物の容量は、トランスフェクトされる培養物の全量の５％である）。細胞培養物への添加の前に、混合物を室温で１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
２．３．ｃｏｈ－ＩＤＳ遺伝子の長期遺伝子発現方法論
長期遺伝子発現（ＥＧＥ）産生戦略は、経時的な遺伝子発現レベルの持続を達成するために、単一のトランスフェクションラウンドを必要とする従来のＴＧＥアプローチとは対照的に、反復ラウンドのトランスフェクションを行うことからなる。上記の２．２．で記述したものと同じプラスミドおよび条件を用いた最初のトランスフェクション後に、遠心分離（３００ｘｇ、５分間）によって完全培地交換を行った後、同じプラスミドおよびＰＥＩ濃度を用いて４８時間ごとに再トランスフェクションラウンドを行った。これらの培地交換を行うことによって、ＡＡＶは培養物の上清に分泌され、再トランスフェクションが行われる前に、培地交換ごとに採取することができる。
実施例２：三重トランスフェクションおよび長期遺伝子発現（ＥＧＥ）
２．１．細胞株、培地および培養条件
用いた細胞株は、カナダ国立研究機構バイオテクノロジー研究所（カナダ、モントリオール）によって提供された無血清懸濁液適応ＨＥＫ ２９３細胞株（ＨＥＫ ２９３ＳＦ－３Ｆ６）である。細胞は、Ｇｌｕｔａｍａｘ（８ｍＭ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１（インビトロゲン社）（０．１％）およびＩＧＦ（０．０５ｎｇ／Ｌ）を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地（インビトロゲン社、カリフォルニア州カールスバッド）で培養する。細胞は、１２５ｍＬディスポーザブルポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ（コーニング社、ニューヨーク州スチューベン）中、２０ｍＬの培地で継続的に維持される。フラスコは、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃に維持したインキュベーター内に設置したオービタルシェーカー（キューナーシェーカー社、スイス）を用いて１３０ｒｐｍで振盪する。細胞数および生存率は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－３０００（ケモメテック社、デンマーク）を用いて測定した。
２．２．一過性トランスフェクション（ＴＧＥ）
ＨＥＫ ２９３懸濁細胞は、ＰＥＩＰｒｏ（ポリサイエンス社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いて一過性にトランスフェクトする。ＨＥＫ ２９３細胞を、１２５ｍＬディスポーザブルフラスコ中、０．５・１０６細胞／ｍＬで播種し、２・１０６細胞／ｍＬまで増殖させ、ｐＡｄＨｅｌｐｅｒ８６１を０．７６μｇ／培養物１ｍＬ、ｐＲｅｐＣａｐ９－８０９を０．７７μｇ／培養物１ｍＬおよび、ｐｏｈｌＤＳ－８７４を０．３８μｇ／培養物１ｍＬまたはｐｃｏｈＳｇｓｈ－９００を０．３８μｇ／培養物１ｍＬで、ＤＮＡ対ＰＥＩ重量比１：２でトランスフェクトする。ＤＮＡにＰＥＩを迅速に添加し、両方とも新鮮培地で同じ容量に希釈することによって、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体が形成される（複合体混合物の容量は、トランスフェクトされる培養物の全量の５％である）。細胞培養物への添加の前に、混合物を室温で１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
２．３．ｃｏｈ－ＩＤＳ遺伝子の長期遺伝子発現方法論
長期遺伝子発現（ＥＧＥ）産生戦略は、経時的な遺伝子発現レベルの持続を達成するために、単一のトランスフェクションラウンドを必要とする従来のＴＧＥアプローチとは対照的に、反復ラウンドのトランスフェクションを行うことからなる。上記の２．２．で記述したものと同じプラスミドおよび条件を用いた最初のトランスフェクション後に、遠心分離（３００ｘｇ、５分間）によって完全培地交換を行った後、同じプラスミドおよびＰＥＩ濃度を用いて４８時間ごとに再トランスフェクションラウンドを行った。これらの培地交換を行うことによって、ＡＡＶは培養物の上清に分泌され、再トランスフェクションが行われる前に、培地交換ごとに採取することができる。
【0133】
その結果（図３参照）は、ＥＧＥ方法論が行われるとき、上清から３倍増の全ｖｇが採取されたことを示す。バッチ（単一のトランスフェクション）後の、回収された全ｖｇとして、細胞溶解後に８Ｅ１１ｖｇが得られた。ＥＧＥ戦略後の回収された全ｖｇは、上清から２．５Ｅ１２ｖｇであったが、ＡＡＶを採取するために細胞を溶解する必要がないため、このことは精製の観点から利点であり、したがって、宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質による汚染が少ないことが想定される。
２．４．ｃｏｈ－Ｓｇｓｈ遺伝子の長期遺伝子発現方法論
上記の２．３．で述べたように、遺伝子ｃｏｈ－Ｓｇｓｈについて、ＥＧＥ方法論も試験した。
２．４．ｃｏｈ－Ｓｇｓｈ遺伝子の長期遺伝子発現方法論
上記の２．３．で述べたように、遺伝子ｃｏｈ－Ｓｇｓｈについて、ＥＧＥ方法論も試験した。
【0134】
その結果（図４参照）は、ＥＧＥ方法論が行われるとき、上清から１．７倍増の全ｖｇが採取されたことを示す。バッチ（単一のトランスフェクション）後の回収された全ｖｇとして、細胞溶解後に１．９Ｅ１２ｖｇが得られた。ＥＧＥ戦略後の回収された全ｖｇは、上清から３．１８Ｅ１２ｖｇであった。ＡＡＶ産生は、ｐｈＩＤＳ（上記の２．３参照）の場合と同様なパターンとなった。したがって、このＥＧＥ戦略の一般適用性が支持された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】