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特表2022-527565ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を使用するがんの治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-02
(54)【発明の名称】ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を使用するがんの治療
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20220526BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220526BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20220526BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220526BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220526BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220526BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220526BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20220526BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220526BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C07K16/30
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K45/00
A61K39/395 U
C12N15/62
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559412
(86)(22)【出願日】2020-04-09
(85)【翻訳文提出日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 EP2020060114
(87)【国際公開番号】W WO2020208124
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】19168811.8
(32)【優先日】2019-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】306021192
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ガーリンガー， マルコ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス－エクスポジト， レイエス
(72)【発明者】
【氏名】セミアニコワ， マリア
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC202
4C084ZC412
4C084ZC751
4C084ZC752
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC23
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、がんの治療、特に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を使用するがんの治療に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
個体におけるがんの治療における使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体であって、治療がＷｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項2】
個体におけるがんの治療のための医薬の製造におけるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の使用であって、治療がＷｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、使用。
【請求項3】
個体にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を投与することを含む、個体におけるがんを治療するための方法。
【請求項4】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む第１の医薬と、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を含む第２の医薬とを含み、場合によっては、個体におけるがんを治療するための第１の医薬と第２の医薬を組み合わせた投与のための指示書を含む添付文書をさらに含む、キット。
【請求項5】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）（ｉ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分と、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項6】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分及び／又は第１のサブユニットと第２のサブユニットとから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項7】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体が、（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）（ｉ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれがＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、
請求項１から６のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項8】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の第１の抗原結合部分が、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含み、且つ／又はＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の第２及び（存在する場合）第３の抗原結合部分が、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含むか、又は（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項9】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体のＦｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含み、且つ／又はＦｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項10】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体がシビサタマブである、請求項１から９のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項11】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤が、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項12】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（ＤＶＬ）、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ、タンキラーゼ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ－３β）からなる群より選択される、Ｗｎｔシグナル伝達経路、特にＷｎｔ／β－カテニン経路の構成要素を標的とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項13】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤がタンキラーゼ阻害剤である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項14】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤が化合物２１である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項15】
治療が、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブの投与をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項16】
がんがＣＥＡ陽性がんである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項17】
がんが、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び胃がん、特に結腸直腸がんからなる群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の、使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、使用、方法、又はキット。
【請求項18】
上に記載するような発明。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がんの治療、特に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を使用するがんの治療に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞を関与させるように設計された新しいクラスのがん治療薬である。このような抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３と腫瘍細胞に発現する抗原に同時に結合すると、腫瘍細胞とＴ細胞との間に一時的な相互作用が生じ、Ｔ細胞の活性化とそれに続く腫瘍細胞の溶解が引き起こされる。
【0003】
Ｔ細胞二重特異性抗体シビサタマブ（ＲＧ７８０２、ＲＯ６９５８６８８、ＣＥＡ－ＴＣＢ）は、Ｔ細胞受容体の特異性とは無関係に細胞表面でＣＥＡ糖タンパク質を発現する腫瘍細胞にＴ細胞をリダイレクトする、腫瘍細胞上の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）とＴ細胞上のＣＤ３とを標的とする新規のＴ細胞活性化二重特異性抗体である（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５（８）：１-３０）。Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗体の主な利点は、それらが新生抗原の負荷とは無関係にＴ細胞によるがん細胞の認識を媒介することである。ＣＥＡは多くの結腸直腸がん（ＣＲＣ）の細胞表面で過剰発現しているため、シビサタマブは非超変異マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）ＣＲＣの有望な免疫療法剤である。
【0004】
シビサタマブは、Ｔ細胞上のＣＤ３イプシロン鎖に対する単一の結合部位と、中程度から高いＣＥＡ細胞表面発現を伴うがん細胞への結合力を調整する２つのＣＥＡ結合部位とを有する（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（１３）：３２８６-９７）。これにより、一部の組織に生理学的に存在する、ＣＥＡ発現レベルが低い健康な上皮細胞を標的とすることが回避される。がん細胞表面上のＣＥＡ及びＴ細胞上のＣＤ３へのシビサタマブの結合は、Ｔ細胞の活性化、サイトカイン分泌、及び細胞傷害性顆粒の放出を引き起こす。少なくとも２つの以前の化学療法レジメンに失敗したＣＥＡ発現転移性ＣＲＣを有する患者におけるシビサタマブの第Ｉ相試験では、単剤療法で又はＰＤ－Ｌ１阻害抗体と組み合わせて治療された患者のそれぞれ１％（４／３６）及び５０％（５／１０）において放射線収縮を伴う抗腫瘍活性を示した（Ａｒｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｎ １；２８（ｓｕｐｐｌ＿３）：ｍｄｘ３０２．００３－ｍｄｘ３０２．００３；Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｍａｙ ２０；３５（１５＿ｓｕｐｐｌ）：３００２）。これらの結果に基づき、ＣＥＡは、ＭＳＳ ＣＲＣにおける免疫療法に最も有望な標的抗原である。この用量漸増試験の一部の患者は、最終推奨用量よりも低い用量で治療されたが、それにもかかわらず、奏効率は、腫瘍のサブグループが治療に耐性があることを示している。
【0005】
よって、シビサタマブ及び他のＣＥＡ標的免疫療法剤、特にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体に対する奏効率及び／又はそれらの治療効果を高めることが望ましい。
【発明の概要】
【0006】
シビサタマブ活性の分子機構は、末梢血単核細胞を用いた殺傷アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＣ細胞株において調査されてきた（Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（１３）：３２８６-９７）。中程度から高いＣＥＡレベルを発現する細胞株のみがＴ細胞媒介性殺傷に感受性であったため、これはＣＥＡ発現をシビサタマブ感受性の主要な決定因子として同定した。
【0007】
患者由来の結腸直腸がんオルガノイド（ＰＤＯ）を使用して、本発明の発明者は、がん細胞上のＣＥＡ発現がＷｎｔシグナル伝達阻害剤を用いた治療により増加される場合があり、よって、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせることによって、シビサタマブなどのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体に対する奏効率及び／又はその治療効果が高められる場合があることを発見した。
【0008】
したがって、第１の態様では、本発明は、個体におけるがんの治療における使用のためのＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体であって、治療がＷｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【0009】
さらなる態様では、本発明は、個体におけるがんの治療のための医薬の製造におけるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の使用であって、治療がＷｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせたＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与を含む、使用を提供する。
【0010】
またさらなる態様では、本発明は、個体にＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を投与することを含む、個体におけるがんを治療するための方法を提供する。
【0011】
一態様では、本発明は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む第１の医薬と、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を第２の医薬とを含み、場合によっては、個体におけるがんを治療するための第１の医薬と第２の医薬を組み合わせた投与のための指示書を含む添付文書をさらに含む、キットも提供する。
【0012】
上記又は本明細書に記載のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットは、以下に記載する特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる（文脈で別段の指示がない限り）。
【0013】
本明細書に記載のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３とＣＥＡとに特異的に結合する二重特異性抗体である。特に有用なＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１３１７１２号及び同第２０１７／０５５３８９号に記載されている（それぞれは参照によりその全文が本明細書に援用される）。
【0014】
「二重特異性」との用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【0015】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。
【0016】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞に結合する部分（例えば、第２の抗原結合部分）に指向することができる。別の態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書にさらに定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、当該技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。
【0017】
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、および従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係なタンパク質に対する抗原結合部分の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、またはこの抗原結合部分を含む抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0018】
「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの結合対Ｙに対する分子Ｘの親和性は概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0019】
「ＣＤ３」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の、未処理ＣＤ３、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号３４も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号３５も参照のこと。
【0020】
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原」又は「ＣＥＡ」という用語は、別途記載のない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＥＡを指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＥＡ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＣＥＡの任意の形態を包含する。この用語は、ＣＥＡの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＣＥＡはヒトＣＥＡである。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０６７３１、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３５４．２に示されている。一態様では、ＣＥＡは膜結合ＣＥＡである。一態様では、ＣＥＡは、細胞、例えばがん細胞の表面に発現したＣＥＡである。
【0021】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子などに関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、二重特異性抗体の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
【0022】
「価数」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗体内の抗原に特異的な１つの（且つ１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
【0023】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、さまざまな抗体構造を包含する。
【0024】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
【0025】
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及びシングルドメイン抗体が挙げられる。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、第２６９～３１５頁（１９９４年）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の態様では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、さまざまな技術によって作製することができる。
【0026】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，第９１頁（２００７）を参照のこと。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載される番号付けシステムを指す。
【0027】
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０ページを参照）を、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３ページを参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と言及することによってさらに明確にしている。
【0028】
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗体は、６つのＣＤＲを含み、ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；及び
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））
が挙げられる。
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；及び
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））
が挙げられる。
【0029】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
【0030】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
【0031】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分かれてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0032】
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
【0033】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換された（すなわち、互いに置き換えられた）Ｆａｂ分子を意味する。すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
【0034】
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、を含む。
【0035】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのさらなるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的になる。
【0036】
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよく、又は完全長重鎖の開裂した多様体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照）に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
【0037】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）のそれぞれに対し、別個の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合するさらなる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【0038】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化。
【0039】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性率を達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、またはその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に入手可能である。あるいは、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用し、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
【0040】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
【0041】
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性のゼロ（または分析方法の検出限界を下回る）までの低減、すなわち、相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合の増加」は、個々の相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
【0042】
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介してのいずれかにより結合されていることである。
【0043】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する第２の抗原結合部分とを含む。
【0044】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【0045】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【0046】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む第２の抗原結合部分と、
を含む。
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む第２の抗原結合部分と、
を含む。
【0047】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0048】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列と、配列番号８の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0049】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含むか、又は、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0050】
一態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域配列と、配列番号１６の軽鎖可変領域配列を含むか、又は（ｉｉ）配列番号２３の重鎖可変領域配列と、配列番号２４の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0051】
いくつかの態様では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。いくつかの態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。そのような態様では、第２の抗原結合部分は、好ましくは、従来のＦａｂ分子である。
【0052】
二重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に、第１の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているいくつかの態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0053】
二重特異性抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬが置き換わっている抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっていない（すなわち、置き換わらないままである）。
【0054】
より具体的な態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0055】
１つのこのような態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0056】
さらなる態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0057】
特定の態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0058】
より具体的な態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0059】
さらに特定の態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0060】
特定の態様では、上の態様に係るアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
【0061】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、場合によってはペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。
【0062】
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれかである。
【0063】
いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
【0064】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する単一の抗原結合部分と、ＣＥＡに特異的に結合する２つの抗原結合部分とを含む。よって、いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する第３の抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分と同一である（例えば、第３の抗原結合分子は、Ｆａｂ分子でもあり、同じアミノ酸配列を含む）。
【0065】
特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらに具体的な態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。特定の好ましい態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号３３で与えられる。
【0066】
第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び、存在する場合、第３の抗原結合部分が、それぞれＦａｂ分子であるいくつかの態様では、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているかのいずれか一方であり、且つ、（ｂ）存在する場合、第３の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0067】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＣＨ３ドメインの中にある。したがって、一態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
【0068】
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
【0069】
したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置可能な第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。
【0070】
具体的なこのような態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によっては、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。好ましい態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
【0071】
いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、且つ／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。
【0072】
特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。
【0073】
典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸置換が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一態様において、一又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する。一態様において、一又は複数のアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。
【0074】
一態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一部の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様において、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0075】
好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号９の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0076】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0077】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列と、配列番号８の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0078】
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0079】
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号１５の重鎖可変領域配列と、配列番号１６の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0080】
上記の態様によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上に記載される特徴のすべてを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
【0081】
一態様では、抗原結合部分及びＦｃ領域は、ペプチドリンカー、特に、配列番号２７及び配列番号２８にあるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）と、配列番号２６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号２７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号２８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドとを含む。
【0082】
特に好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２５の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）と、配列番号２６の配列を含むポリペプチドと、配列番号２７の配列を含むポリペプチドと、配列番号２８の配列を含むポリペプチドとを含む。
【0083】
特に好ましい態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体はシビサタマブである（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ８０，２０１８，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３，ｐ．４３８）。
【0084】
一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれか、特に可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）ＣＥＡに特異的に結合し、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、第２及び第３の抗原結合部分であって、それぞれＦａｂ分子、特に従来のＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
を含み、
第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
【0085】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【0086】
一態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変領域配列と、配列番号８の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0087】
一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、配列番号２３の重鎖可変領域配列と、配列番号２４の軽鎖可変領域配列とを含む。
【0088】
上記の態様によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上に記載される特徴のすべてを単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
【0089】
一態様では、抗原結合部分及びＦｃ領域は、ペプチドリンカー、特に、配列番号３０及び配列番号３１にあるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。
【0090】
一態様では、（ｉｉ）の第２及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（ｉｉ）の第２及び第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
【0091】
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号２９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号３０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号３１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチドと、配列番号３２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
【0092】
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号２９の配列を含むポリペプチドと、配列番号３０の配列を含むポリペプチドと、配列番号３１の配列を含むポリペプチドと、配列番号３２の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）とを含む。
【0093】
当業者に知られるであろう他のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体も、本発明における使用が検討されている。
【0094】
一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＥＤＩ５６５（ＡＭＧ２１１、ＭＴ１１１）である。
【0095】
本明細書中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と組み合わせて使用される。
【0096】
「Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤」という用語は、Ｗｎｔ経路、特にＷｎｔ／β－カテニン経路（標準Ｗｎｔ経路とも呼ばれる）を通じたシグナル伝達を阻害する分子を指す。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路によって、細胞質でβ－カテニンが蓄積し、最終的に核に移動してＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞因子／リンパ増強因子）ファミリーに属する転写因子の転写共役因子として作用する。
【0097】
Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、結腸直腸がんを含む多くの腫瘍型の発生に関連してきた。
【0098】
β－カテニン核転座を介して細胞内シグナル伝達を開始するには、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）受容体およびＬＲＰ５／６共受容体（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６）に結合するＷｎｔリガンドが必要である。β－カテニンは非常に不安定なタンパク質であり、細胞質の存在が厳密に制御されている。Ｗｎｔリガンドが存在しない場合、細胞質β－カテニンは、いわゆる分解複合体によって標的とされる。この複合体は、腫瘍抑制因子大腸腺腫症（ＡＰＣ）と、足場タンパク質ＡＸＩＮと、２つのキナーゼＣＫ１α（カゼインキナーゼ１α）及びＧＳＫ－３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）とから構成される。これらの最後の２つの成分は、Ｎ末端のいくつかのセリンおよびトレオニン残基のβ－カテニンをリン酸化することができる。リン酸化されたβ－カテニンは、その後、ユビキチンリガーゼ複合体の一部であるβ－トランスデューシンによって認識され、β－カテニンのポリユビキチン化及びプロテアソーム分解につながる。ＬＲＰ５／６に関連するＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合するＷｎｔリガンドは、乱れた（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＶＬ））リン酸化を誘導する。続いて、Ａｘｉｎを補充し、それによって分解複合体を分解し、β－カテニンの安定化とそれに続く核転座を達成する。核内では、β－カテニンは転写因子のＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞因子／リンパ球エンハンサー因子）ファミリーのメンバーに結合し、転写Ｋａｔ３コアクチベーターｐ３００及び／又はＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）を補充して、Ｗｎｔ標的遺伝子を転写すること及びとクロマチン修飾を引き起こすことができる（Ｄｕｃｈａｒｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１６，９９，１４１－１４９、全文が本明細書に援用される）。
【0099】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達に関与する一又は複数のタンパク質を標的とし、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活動を、例えば、このようなタンパク質とＷｎｔシグナル伝達経路の他の構成要素との間の相互作用を阻害すること、このようなタンパク質の分解を促進すること、又はこのようなタンパク質の機能（例えば、酵素機能）を阻害することにより、阻害する分子であり得る。例示的な阻害部位には、限定されないが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＤＶＬタンパク質、β－カテニン分解複合体（例えばＧＳＫ－３βを含む）、核β－カテニン、並びに酵素ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ及びタンキラーゼが含まれる。
【0100】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤は、例えば、Ｄｕｃｈａｒｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１６，９９，１４１－１４９、又はＴｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７，２６，６５０－６６１において総説される（その全文が参照により本明細書に援用される）。
【0101】
一態様では、本明細書のＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達阻害剤である。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ヒトＷｎｔシグナル伝達経路、特にヒトＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤である。
【0102】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に関与する二つ以上のタンパク質の相互作用を阻害する。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に関与する一又は複数のタンパク質の分解を促進する。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達に関与する一又は複数のタンパク質の機能を阻害する。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（ＤＶＬ）、ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ、タンキラーゼ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ－３β）からなる群より選択されるＷｎｔシグナル伝達経路、特にＷｎｔ／β－カテニン経路の構成要素を標的とする（例えば、それに特異的に結合する）。
【0103】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、タンキラーゼ阻害剤である。タンキラーゼ１及び２（それぞれ、ＴＮＫＳ／ＡＲＴＤ５及びＴＮＫＳ２／ＡＲＴＤ５）は、Ｗｎｔシグナル伝達を含む細胞機能の範囲に含まれるＰＡＲＰ（ポリ－ＡＤＰ－リボースポリメラーゼ）タンパク質である。ＴＮＫＳ及びＴＮＫＳ２は通常、破壊複合体のうちの２つの構成要素、ＡＸＩＮ１及びＡＸＩＮ２をＰＡＲ化し、それにより、それらのユビキチン化、プロテアソーム分解、活性β－カテニンの総量を最小限に抑える事象を促進する。ＴＮＫＳ／ＴＮＫＳ２の阻害は、ＡＸＩＮの分解を最小限に抑え、破壊複合体を安定化し、Ｗｎｔシグナル伝達を抑制する（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．２０１５，６，１６８７－１６９２、参照によりその全文が本明細書に援用される）。
【0104】
具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．２０１５，６，１６８７－１６９２に記載されるようなタンキラーゼ阻害剤、特に本明細書に記載されるような化合物２１である。化合物２１の構造は以下：
［式中、Ｒ１はＭｅであり、Ｒ２はＣＨ２－Ｎ－（４－ＮＭｅ２）－ピペラジンである］に示される。
【0105】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００９，４６１，６１４－６２０（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなタンキラーゼ阻害剤、特にＸＡＶ－９３９（ＣＡＳ番号２８４０２８－８９－３）である。
【0106】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５（２），１００－１０７（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなタンキラーゼ阻害剤、特にＩＷＲ－１である。ＩＷＲ－１の構造を以下：
に示す。
【0107】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５，６，４１３０７－４１３２３（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなタンキラーゼ阻害剤、特にＥ７４４９（ＣＡＳ番号１１４０９６４－９９－３）である。
【0108】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗａａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２，７２，２８２２－２８３２（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなタンキラーゼ阻害剤、特にＪＷ５５（ＣＡＳ番号６６４９９３－５３－７）である。
【0109】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤である。ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、膜結合Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）ファミリーのメンバーであり、Ｗｎｔの脂質修飾及び分泌を担っている（Ｄｕｃｈａｒｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１６，９９，１４１－１４９）。
【0110】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤ＬＧＫ９７４（ＣＡＳ番号１２４３２４４－１４－５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３，１１０，２０２２４－２０２２９、参照によりその全文が本明細書に援用される）。ＬＧＫ９７４の構造を以下：
に示す。
【0111】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｍａｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１６，３５，２１９７－２２０７（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤、特にＥＴＣ－１９２２１５９（ＥＴＣ－１５９；ＣＡＳ番号１６３８２５０－９６－０）である。
【0112】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｍａｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｎｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２０１６，８９，１０６２－１０７４（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤、特にＷｎｔ－Ｃ５９（ＣＡＳ番号１２４３２４３－８９－１）である。
【0113】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１３，５６，２７００－２７０４（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤、特にＩＷＰ－Ｌ６（ＣＡＳ番号１４２７７８２－８９－５）又はＩＷＰ－２（ＣＡＳ番号６８６７７０－６１－６）である。
【0114】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ＤＶＬ（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ）阻害剤、特にＤＶＬのＰＤＺドメインの阻害剤である。ＤＶＬのＰＤＺドメインは、ＤＶＬ－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体相互作用とＷｎｔシグナルの細胞内形質導入とに不可欠な役割を果たす。
【0115】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，４４，１５４９５－１５５０３（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなＤＶＬ阻害剤、特にＮＳＣ６６８０３６（ＣＡＳ番号１４４６７８－６３－７）である。
【0116】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００９，２８４，１６２５６－１６２６３（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなＤＶＬ阻害剤、特に３２８９－８６２５（ＣＡＳ番号２９４８９１－８１－９）である。
【0117】
さらに別の態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ２０１２，７９，３７６－３８３（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなＤＶＬ阻害剤、特にＪ０１－０１７ａである。
【0118】
別の具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１６，２４，３２５９－３２６６（参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されるようなＤＶＬ阻害剤、特にＢＭＤ４７０２（ＣＡＳ番号３３５２０６－５４－７）である。
【0119】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ阻害剤である。Ｗｎｔシグナル伝達は、分泌されたＷｎｔ分子のその受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄへの結合によって開始される。
【0120】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、一又は複数のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に特異的に結合する抗体、特にモノクローナル抗体である。具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤はバンチクツマブ（ＯＭＰ－１８Ｒ５）である。
【0121】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のリガンド結合ドメインを含む。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ ８受容体の細胞外リガンド結合ドメイン及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合プロテインである。具体的な態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤はイパフリセプト（ＯＭＰ－５４Ｆ２８）である。
【0122】
当業者に知られるであろう他のＷｎｔシグナル伝達阻害剤も、本発明における使用が検討されている。
【0123】
「がん」という用語は、制御されていない細胞増殖を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指す。がんの例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。かかるがんのより具体的な例には、扁平上皮細胞がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、並びに肺の非扁平上皮癌及び扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管がんを含む）、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん（局所進行性、再発性または転移性のＨＥＲ－２陰性乳がん、および局所再発性または転移性のＨＥＲ２陽性乳がん）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓がん（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、及びさまざまな種類の頭頸部がん、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍と関連するものなど）、及びメグス症候群と関連する異常な血管増殖が含まれる。
【0124】
本発明のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、及びキットのいくつかの態様では、がんは、固形腫瘍がんである。「固形腫瘍がん」とは、（例えば、一般的には固形腫瘍を形成しない白血病などの血液がんとは対照的に）肉腫又は癌腫などの患者の体の特定の位置に位置する別個の腫瘍塊（腫瘍転移も含む）を形成する悪性腫瘍を意味する。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、扁平細胞癌腫、骨がん、肝臓がん及び腎臓がんが含まれる。本発明の文脈で企図される他の固形腫瘍がんには、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、筋肉、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。
【0125】
いくつかの態様では、がんは、ＣＥＡ陽性がんである。「ＣＥＡ陽性がん」又は「ＣＥＡ発現がん」とは、がん細胞でのＣＥＡの発現又は過剰発現により特徴づけられるがんを意味する。ＣＥＡの発現は、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はフローサイトメトリー法によって決定され得る。一態様では、がんはＣＥＡを発現する。一態様では、がんは、ＣＥＡに特異的な抗体を使用する免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定されるように、腫瘍細胞の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％又は少なくとも８０％でＣＥＡを発現する。
【0126】
いくつかの態様では、患者におけるがん細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ＩＨＣ又はフローサイトメトリー法によって決定され得る。
【0127】
いくつかの態様では、がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、前立腺がん、または本明細書に記載の他のがんである。
【0128】
特定の態様では、がんは、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び胃がんからなる群より選択されるがんである。好ましい態様では、がんは、結腸直腸がん（ＣＲＣ）である。一態様では、結腸直腸がんは、転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）である。一態様では、結腸直腸がんは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）結腸直腸がんである。一態様では、結腸直腸がんは、マイクロサテライト安定性転移性結腸直腸がん（ＭＳＳ ｍＣＲＣ）である。
【0129】
本明細書中の「患者」、「対象」、又は「個体」は、がんの一又は複数の徴候、症状、又は他の指標を経験している、又は経験した、治療に適格な任意の単一のヒト対象である。いくつかの態様では、患者は、がんを有するか、又はがんを有すると診断されている。いくつかの態様では、患者は、局所進行若しくは転移性がんを有するか、又は局所進行若しくは転移性がんを有すると診断されている。患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体又は別の薬物で以前に治療されていても、治療されていなくてもよい。特定の態様では、患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体で以前に治療されていない。患者は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体療法が開始される前に、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体以外の一又は複数の薬物を含む療法で治療されていてもよい。
【0130】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）すること」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行率を低下させること、病状の寛解または緩和、および回復または改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、有効量で投与される。
【0132】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
【0133】
一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、特にがんの部位（例えば、固形腫瘍がん内）で、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の活性化をもたらす。前記活性化は、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の分化、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌、Ｔ細胞からの細胞傷害性エフェクター分子放出、Ｔ細胞の細胞傷害性活動、及びＴ細胞による活性化マーカーの発現を含み得る。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、がんの部位（例えば、固形腫瘍がん内）で、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の数の増加をもたらす。
【0134】
一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤の投与は、がんによるＣＥＡ発現の増加をもたらす。一態様では、前記増加は、がん細胞上でのＣＥＡ発現レベル（細胞毎に発現されるＣＥＡ分子の数）の増加である。一態様では、前記増加は、ＣＥＡを発現するがん細胞の数（又は割合）の増加である。ＣＥＡの発現は、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）若しくはフローサイトメトリー法によって、又はＣＥＡ ｍＲＮＡの定量化（例えば、ＲＴ－ＰＣＲによる）によって、決定され得る。
【0135】
上記又は本明細書中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットのいくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔ阻害剤の治療又は投与は、個体における応答をもたらし得る。いくつかの態様では、応答は、完全奏功であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後の持続的応答であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後に持続される完全奏功であり得る。他の態様では、応答は、部分奏功であり得る。いくつかの態様では、応答は、治療の中止後に持続される部分応答であり得る。いくつかの態様では、応答は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤不使用）の治療又は投与と比較して改善され得る。
【0136】
いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔ阻害剤の治療及び投与は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体単独（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤不使用）で治療された対応する患者集団と比較して、患者集団の奏効率を増加させ得る。
【0137】
本発明の併用療法は、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤の投与を含む。
【0138】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ（併用）」（及びその文法的変化形、例えば「組み合わせる」又は「組み合わせること」）は、本発明によるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体とＷｎｔシグナル伝達阻害剤の組み合わせを包含し、ここで、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤が同時に体内で生物学的効果を発揮することができることを条件として、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、同じ又は異なる容器に入っており、同じ又は異なる薬学的調合物に入っており、一緒に又は別々に投与され、同時に又は連続して、任意の順序で投与され、同じ又は異なる経路によって投与される。例えば、本発明によるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体とＷｎｔシグナル伝達阻害剤を「組み合わせること」は、特定の薬学的調合物中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を初めに投与し、続いて、別の薬学的調合物中のＷｎｔシグナル伝達阻害剤を投与すること、又はその逆を意味し得る。
【0139】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、当該技術分野で知られる任意の適切なやり方で投与され得る。一態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、連続して（異なる時間に）投与される。別の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、同時に（同じ時間に）投与される。理論に縛られることを望むものではないが、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤をＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体より前に及び／又はそれと同時に投与することが有利であり得る。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とは別個の組成物に入っている。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と同じ組成物に入っている。
【0140】
ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、任意の適切な経路で投与されてよく、同じ投与経路によって又は異なる投与経路によって投与されてもよい。いくつかの態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内で投与される。特定の態様では、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体は、静脈内で投与される。いくつかの態様では、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内で投与される。有効量のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤が、疾患の予防又は治療のために投与され得る。治療される疾患の種類、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤の種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床状態、個体の病歴及び治療への応答、並びに主治医の裁量に基づいて、ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及び／又はＷｎｔシグナル伝達阻害剤の適切な投与経路又は投与量が決定され得る。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【0141】
本発明の組み合わせは、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の組み合わせは、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。ある態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、化学療法剤、腫瘍細胞増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーターである。特定の態様では、追加の治療剤は、アテゾリズマブなどのＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストである。
【0142】
上記又は本明細書中のＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、方法、使用、又はキットのいくつかの態様では、治療は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブの投与をさらに含む。
【0143】
本発明の組み合わせは、放射線療法と組み合わせることもできる。
【0144】
本明細書で提供されるキットは、典型的には、一又は複数の容器と、容器上若しくは容器に関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、それ自体で、又は、状態を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられる組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は、本発明の組み合わせに使用されるＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体である。別の活性剤は、本発明の組み合わせに使用されるＷｎｔシグナル伝達阻害剤であり、これは、二重特異性抗体のように同じ組成物及び容器に入っていてもよく、又は異なる組成物及び容器で提供されていてもよい。ラベル又は添付文書は、本組成物ががん等の選択された状態を治療するために使用されることを示す。
【0145】
一態様では、本発明は、同じ又は別個の容器に（ａ）ＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体、及び（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を含み、場合によっては（ｃ）がんを治療するための方法としての組み合わせ治療の使用を指示する印刷された指示書を含む添付文書をさらに含む、がんの治療を目的とするキットを提供する。さらに、キットは、（ａ）中に組成物が含有されている第１の容器であって、組成物がＣＥＡ ＣＤ３二重特異性抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が含有されている第２の容器であって、組成物がＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含む、第２の容器と、場合によっては、（ｃ）中に組成物が含有されている第３の容器であって、組成物が細胞傷害性薬剤あるいは治療剤をさらに含む、第３の容器とを含み得る。一態様では、さらなる治療剤は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、特にアテゾリズマブである。本発明のこれらの態様におけるキットは、組成物ががんを治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的又は追加的に、本キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第３（又は第４）の容器をさらに含んでもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0146】
【図1】１０日間の共培養の間にシビサタマブ又は非標的コントロール抗体で治療された８人の患者由来の、さまざまな細胞表面ＣＥＡ発現レベルを有する、結腸直腸がんオルガノイド（ＰＤＯ）株の成長曲線。各ＰＤＯは、２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で３人の異なる同種異系ドナーからのＴ細胞で培養された。平均を示す。
【図2B】すべてのＰＤＯの増殖低下とＣＥＡｈｉ細胞の割合の相関分析。線形回帰直線と、有意差検定のピアソン相関係数及びｐ値が示されている。
【図3】タンキラーゼ阻害剤での治療あり及び治療なしの２つの結腸直腸がんオルガノイド株の細胞表面ＣＥＡ発現。
【図4】ＣＤ８ Ｔ細胞とシビサタマブ又は標的コントロール抗体の存在下、２μＭタンキラーゼ阻害剤あり又はなしで培養されたときの７日間にわたる結腸直腸がんオルガノイド株の増殖（前治療又は継続治療のいずれかとして提供）。
【図5】ＣＤ８ Ｔ細胞とシビサタマブ又は標的コントロール抗体の存在下、１０μＭタンキラーゼ阻害剤あり又はなしで培養されたときの７日間にわたる結腸直腸がんオルガノイド株の増殖（前治療として提供）。
【実施例】
【0147】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されてもよいことが理解される。
【0148】
実施例１．同種異系Ｔ細胞共培養アッセイにおけるＰＤＯのシビサタマブ感受性
最近開発されたプロトコールは、ＣＲＣ生検からのいわゆる患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）としてのがん細胞の拡大と長期増殖を可能にする（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２-７２）。ＰＤＯは、数十年前に確立され、プラスチック上での長期培養中に変化を遂げたがん細胞株よりも、患者の腫瘍の生物学的特性をよりよく表すことが示唆されてきた。患者からモデル系を迅速に生成する機能により、病期と以前の治療歴を、新薬が臨床試験されている患者のものと照合することができる。
最近開発されたプロトコールは、ＣＲＣ生検からのいわゆる患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）としてのがん細胞の拡大と長期増殖を可能にする（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２-７２）。ＰＤＯは、数十年前に確立され、プラスチック上での長期培養中に変化を遂げたがん細胞株よりも、患者の腫瘍の生物学的特性をよりよく表すことが示唆されてきた。患者からモデル系を迅速に生成する機能により、病期と以前の治療歴を、新薬が臨床試験されている患者のものと照合することができる。
【0149】
患者由来の結腸直腸がんオルガノイド（ＰＤＯ）のシビサタマブ免疫療法に対する感受性を評価するために、さまざまな細胞表面ＣＥＡ発現レベルを有する、８人の患者由来の結腸直腸がんオルガノイド株を生成し、同種異系ＣＤ８ Ｔ細胞との１０日間の共培養中にシビサタマブ（２０ｎＭ）又は非標的コントロール抗体（２０ｎＭ）で治療した。磁気ビーズ選別によってＣＤ８ Ｔ細胞を同種異系の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＩＬ２及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで、７－１４日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大した。その後、ＧＦＰタグ付けＣＲＣ ＰＤＯ細胞を９６ウェルプレートに播種し、Ｔ細胞細胞を翌日に添加し、共培養物を２－３日毎に自動化９６ウェルプレート蛍光顕微鏡で画像化した。２：１及び５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を試験し、２：１のＥ：Ｔは、ＣＥＡｈｉ ＰＤＯ ＣＲＣ－０１の増殖を効果的に抑制し、ネガティブコントロールとして使用された非標的抗体（ＤＰ４７－ＴＣＢ）の存在下では活性を示さなかったため、それを後続の実験のために選択した。あらゆる抗体を伴わないＣＤ８ Ｔ細胞との共培養物が、アロ反応性ドナーＴ細胞の同定を可能にするためのさらなるコントロールとして含まれた。Ｔ細胞がアロ反応性を示す（１０回の実験に１回未満で観察された）共培養物を分析から除外し、各ＰＤＯ株が３人の独立した同種異系ドナーからのＣＤ８ Ｔ細胞で試験されるまでアッセイを繰り返した。
【0150】
８つのＰＤＯ株：３つのＣＥＡｈｉＰＤＯ（すなわち、主にＣＥＡｈｉ細胞を含有する；ＣＲＣ－０１、ＣＲＣ－０５、ＣＲＣ－０７）、混合ＣＥＡ発現を有する４つのＰＤＯ（すなわち、ＣＥＡｈｉ及びＣＥＡｌｏ細胞両方の大きな亜集団を含有する；ＣＲＣ－０２、ＣＲＣ－０３、ＣＲＣ－０４、ＣＲＣ－０８）、及び１つのＣＥＡｌｏＰＤＯ（すなわち、主にＣＥＡｌｏ細胞を含有する；ＣＲＣ－０６）を試験した。
【0151】
３つのＣＥＡｈｉＰＤＯのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞及びシビサタマブを用いた治療に非常に感受性であったのに対して、ＣＥＡｌｏＰＤＯ ＣＲＣ－０６の大部分は、予想通り、これらの実験条件下で耐性を示した（図１）。当社のアッセイは、７－１０日間の期間にわたるシビサタマブの影響を評価し、ＣＥＡｈｉＰＤＯにおいて８９－１００％の増殖阻害を示した。このことは、このアッセイでＴ細胞を抗原陽性細胞にリダイレクトするシビサタマブの高い有効性を裏付ける。
【0152】
我々は、次に、混合ＣＥＡ発現を有する４つのＰＤＯを試験した。これらのそれぞれは、シビサタマブ及びＴ細胞を用いて治療したにも関わらず、コントロールと比較してがん細胞増殖速度が穏やかに低下しただけで、継続して増殖した（図１及び図２Ａ）。よって、混合ＣＥＡ発現を有するＰＤＯは、このＣＥＡ標的免疫療法に対して部分的奏功を示しただけであった。達成された増殖低下と各ＰＤＯのＣＥＡｈｉがん細胞の割合とのピアソン相関分析は、オルガノイド株内で高いＣＥＡ発現を示す細胞の割合とそのシビサタマブに対する感受性との強力で有意な相関関係を示した（ｒ＝０．９１５２、９５％ ＣＩ：０．５９３から０．９８４８；ｐ＝０．００１４；図２Ｂ）。
【0153】
これは、細胞表面上に高レベルのＣＥＡを均一に発現するオルガノイドがシビサタマブに対して感受性であり、主にＣＥＡ低細胞を有するオルガノイドは耐性があり、二峰性／混合ＣＥＡ発現を有するオルガノイドは限られた感受性しか示さないことを実証している。
【0154】
実施例２．Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤での治療あり及び治療なしの２つの結腸直腸がんオルガノイド株の細胞表面ＣＥＡ発現。
我々は３つのＰＤＯからＣＥＡｈｉ細胞及びＣＥＡｌｏ細胞をフローソートし、ＲＮＡ発現分析を実施して、ＣＥＡ発現を調節し、不均一性をもたらすメカニズムを調査した。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５／０９／３０．２００５ Ｏｃｔ ２５；１０２（４３）：１５５４５-５０）を適用して、ＣＥＡ遺伝子発現レベルに関連する潜在的な分子経路を特定した。ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達は、多重検定の修正後に有意に濃縮されたシグネチャであり、ＣＥＡｌｏ集団で上方制御された（データは示さず）。ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達経路は、ＣＲＣの大部分で遺伝的に活性化され、最も頻繁にはＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子の変異及びヘテロ接合性の喪失を通して、まれにＲＮＦ４３又はβ－カテニン／ＣＴＮＮＢ１自体などのＷＮＴシグナル伝達の他の調節因子の変異を通して活性化される（Ｎｅｔｗｏｒｋ ＣＧＡ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｊｕｌ １８；４８７（７４０７）：３３０－７；Ｇｉａｎｎａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｄｅｃ；４６（１２）：１２６４-６）。ＷＮＴ／β－カテニン経路の高い活性及びＣＥＡ発現の不存在は、腸幹細胞が存在する腸陰窩底部の特徴である（Ｊｏｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９３ Ｊｕｌ；１４３（１）：２５０－７；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ １１；１５：１９）。さらに、ＷＮＴ／β－カテニン経路の高い活性は、結腸がん幹細胞の特徴でもある（ｄｅ Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｆｅｂ １５；１７（４）：６４７ ＬＰ－６５３）。
我々は３つのＰＤＯからＣＥＡｈｉ細胞及びＣＥＡｌｏ細胞をフローソートし、ＲＮＡ発現分析を実施して、ＣＥＡ発現を調節し、不均一性をもたらすメカニズムを調査した。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５／０９／３０．２００５ Ｏｃｔ ２５；１０２（４３）：１５５４５-５０）を適用して、ＣＥＡ遺伝子発現レベルに関連する潜在的な分子経路を特定した。ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達は、多重検定の修正後に有意に濃縮されたシグネチャであり、ＣＥＡｌｏ集団で上方制御された（データは示さず）。ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達経路は、ＣＲＣの大部分で遺伝的に活性化され、最も頻繁にはＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子の変異及びヘテロ接合性の喪失を通して、まれにＲＮＦ４３又はβ－カテニン／ＣＴＮＮＢ１自体などのＷＮＴシグナル伝達の他の調節因子の変異を通して活性化される（Ｎｅｔｗｏｒｋ ＣＧＡ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｊｕｌ １８；４８７（７４０７）：３３０－７；Ｇｉａｎｎａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｄｅｃ；４６（１２）：１２６４-６）。ＷＮＴ／β－カテニン経路の高い活性及びＣＥＡ発現の不存在は、腸幹細胞が存在する腸陰窩底部の特徴である（Ｊｏｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９３ Ｊｕｌ；１４３（１）：２５０－７；Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ １１；１５：１９）。さらに、ＷＮＴ／β－カテニン経路の高い活性は、結腸がん幹細胞の特徴でもある（ｄｅ Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｆｅｂ １５；１７（４）：６４７ ＬＰ－６５３）。
【0155】
我々は、ＷＮＴ／β－カテニン経路の薬理学的阻害がこれらのデータによる予測通りにＣＥＡ発現を強化するかどうかを調査した。混合ＣＥＡ発現を有する２つのＰＤＯ株を、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤：β－カテニン破壊複合体を安定化することにより下流のＷＮＴ／β－カテニン経路を阻害するタンキラーゼ阻害剤化合物２１で治療した（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．２０１５；６（９）：１６８７-９２；Ｍａｒｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７；１７４（２４）：４６１１－３６）。Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、両方のＰＤＯのＣＥＡ発現及びＣＥＡｈｉ亜集団を増加させた（図３）。
【0156】
ＣＥＡ発現及び混合ＣＥＡ発現を有するＰＤＯのＣＥＡｈｉ亜集団の増加は、別のシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴリガンド分泌を防止し、したがってオートクリン及びパラクリンＷＮＴ受容体の活性化を防止するｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤ＬＧＫ－９７４でも見られた（結果は示さず）。
【0157】
これらの結果は、ＣＲＣ ＰＤＯにおけるＣＥＡ発現の調節因子としてのＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達の役割を裏付けた。
【0158】
実施例３．シビサタマブとタンキラーゼ阻害剤の併用療法
我々は、シビサタマブとタンキラーゼ阻害剤化合物２１の組み合わせで治療されたときの、混合ＣＥＡ発現を有する２つのＰＤＯ株（上記実験１と比較した長期培養後のＣＲＣ－０８及びＣＲＣ－０６）の増殖を調査した。
我々は、シビサタマブとタンキラーゼ阻害剤化合物２１の組み合わせで治療されたときの、混合ＣＥＡ発現を有する２つのＰＤＯ株（上記実験１と比較した長期培養後のＣＲＣ－０８及びＣＲＣ－０６）の増殖を調査した。
【0159】
ＣＤ８ Ｔ細胞と２０ｎＭのシビサタマブ又は非標的コントロール抗体（ＤＰ４７－ＴＣＢ）の存在下、７日間にわたってＰＤＯを培養した。共培養は、ａ）タンキラーゼ阻害剤を用いず、又はｂ）Ｔ細胞が添加されたときに除去されたタンキラーゼ阻害剤を用いた前治療の４８時間後、又はｃ）タンキラーゼ阻害剤の継続的な曝露のためにＴ細胞が添加されたときに補充されたタンキラーゼ阻害剤を用いた前治療の４８時間後、のいずれかで実施した。図４は、タンキラーゼ阻害剤の２μＭ濃度の結果を示し、図５は、タンキラーゼ阻害剤の１０μＭ濃度の結果の結果を示す（アッセイ期間全体にわたる１０μＭタンキラーゼ阻害剤の継続的な投与はがん細胞に毒性であり、データは示していない）。ＧＦＰ標識結腸直腸がんオルガノイド培養物のコンフルエンスを７日間顕微鏡で追跡し、その後Ｔ細胞及び抗体を添加した。非標的コントロールの存在下での播種密度から７日目までの増殖を１００％と定義した。末梢血単核細胞を抽出し、続いてＩＬ－２及びＣＤ３ビーズで刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することによって、ＣＤ８ Ｔ細胞を同種異系の健康なドナーから生成した。実験を３回実施した。示される結果は平均である。エラーバーは１つの標準偏差を表す。これらのデータは、タンキラーゼ阻害剤治療が、用量及び時間に依存してシビサタマブに対する結腸直腸がんスフェロイド培養物の感受性を増加させることを実証している。
【0160】
実施例４．材料及び方法
ヒトサンプル及び細胞株
少なくとも２つの化学療法の前のラインで治療された転移性結腸直腸がんからの画像誘導コア生検は、Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｃ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｒ試験（主任研究員：Ｄ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号：それぞれ、１２／ＬＯ／０９１４及び１４／ＬＯ／１８１２）から得られた。ＦＯｒＭＡＴ試験から未治療の原発性結腸直腸がんからの１つの内視鏡生検を得た（主任研究員：Ｎ． Ｓｔａｒｌｉｎｇ，ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号１３／ＬＯ／１２７４）。試験をＲｏｙａｌ Ｍａｒｓｄｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌで実行し、すべての患者に試験への参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。健康なドナーからの匿名のバフィーコートを、地元の血液バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号０６／Ｑ１２０６／１０６）から、又はＢａｒｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（主任研究員：Ｔ． Ｐｏｗｌｅｓ、ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号：１３／ＥＭ／０３２７）のＩｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒバイオバンキングプロトコールを通じて、書面によるインフォームドコンセントを提供する個人から入手した。ＤＬＤ－１及びＭＫＮ－４５細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。
ヒトサンプル及び細胞株
少なくとも２つの化学療法の前のラインで治療された転移性結腸直腸がんからの画像誘導コア生検は、Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｃ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｒ試験（主任研究員：Ｄ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号：それぞれ、１２／ＬＯ／０９１４及び１４／ＬＯ／１８１２）から得られた。ＦＯｒＭＡＴ試験から未治療の原発性結腸直腸がんからの１つの内視鏡生検を得た（主任研究員：Ｎ． Ｓｔａｒｌｉｎｇ，ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号１３／ＬＯ／１２７４）。試験をＲｏｙａｌ Ｍａｒｓｄｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌで実行し、すべての患者に試験への参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。健康なドナーからの匿名のバフィーコートを、地元の血液バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号０６／Ｑ１２０６／１０６）から、又はＢａｒｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（主任研究員：Ｔ． Ｐｏｗｌｅｓ、ＵＫ ｎａｔｉｏｎａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認番号：１３／ＥＭ／０３２７）のＩｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒバイオバンキングプロトコールを通じて、書面によるインフォームドコンセントを提供する個人から入手した。ＤＬＤ－１及びＭＫＮ－４５細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。
【0161】
患者由来オルガノイドの生成
ＣＲＣ－０１、ＣＲＣ－０２、及びＣＲＣ－０６からのＰＤＯ培養物を、粗い切断とそれに続く成長因子還元マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）への包埋によってコア生検から直接確立した。ＣＲＣ－０３、ＣＲＣ－０４、ＣＲＣ－０５、ＣＲＣ－０７、及びＣＲＣ－０８から非常に小さい生検断片が入手可能であった。これらを初めに、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｕｍｏｕｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｕｎｉｔ（Ｈｏｍｅ ｏｆｆｉｃｅ ｌｉｃｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ ＰＤ４９８ＦＦ８Ｄ）によって、メスＣＤ１ヌードマウスの皮下又は腎臓被膜下に移植した。腫瘍が成長し、腫瘍が除去され、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｕｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｇｅｎｔｌｅＭＡＸ Ｏｃｔｏ解離器で解離されたら、マウスを淘汰した。Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してマウス細胞を磁気的に除去し、精製したヒト腫瘍細胞を成長因子還元マトリゲル中に包埋した。１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ Ｎ－アセチル システイン、１０ｍＭ ニコチンアミド、１０μＭ ＳＢ２０２１９０、１０ｎＭ ガストリン、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ プロスタグランジン Ｅ２、５００ｎＭ Ａ－８３－０１、１００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｍｅｒｃｋ）、１μｇ／ｍｌ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、及び１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、ＰＤＯを記載されるようにマトリゲル中で拡大させた（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２-７２）。マトリゲルマトリックス中で少なくとも２ケ月継続的に成長させた後（最低１２継代）、ＰＤＯを初めにｅＧＦＰタグ付けし（以下を参照）、その後、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、２％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有する１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で成長するように適合させた。ＰＤＯ培養物を、これらの条件で維持し、Ｔ細胞共培養アッセイ及びＦＡＣＳ分析の必要に応じて使用した。各ＰＤＯ株で結腸がんドライバー遺伝子の遺伝子分析を実施し、これらは、一致した腫瘍生検で同定された変異と同一であった。
ＣＲＣ－０１、ＣＲＣ－０２、及びＣＲＣ－０６からのＰＤＯ培養物を、粗い切断とそれに続く成長因子還元マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）への包埋によってコア生検から直接確立した。ＣＲＣ－０３、ＣＲＣ－０４、ＣＲＣ－０５、ＣＲＣ－０７、及びＣＲＣ－０８から非常に小さい生検断片が入手可能であった。これらを初めに、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｕｍｏｕｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｕｎｉｔ（Ｈｏｍｅ ｏｆｆｉｃｅ ｌｉｃｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ ＰＤ４９８ＦＦ８Ｄ）によって、メスＣＤ１ヌードマウスの皮下又は腎臓被膜下に移植した。腫瘍が成長し、腫瘍が除去され、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｕｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｇｅｎｔｌｅＭＡＸ Ｏｃｔｏ解離器で解離されたら、マウスを淘汰した。Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してマウス細胞を磁気的に除去し、精製したヒト腫瘍細胞を成長因子還元マトリゲル中に包埋した。１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ Ｎ－アセチル システイン、１０ｍＭ ニコチンアミド、１０μＭ ＳＢ２０２１９０、１０ｎＭ ガストリン、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ プロスタグランジン Ｅ２、５００ｎＭ Ａ－８３－０１、１００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｍｅｒｃｋ）、１μｇ／ｍｌ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、及び１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、ＰＤＯを記載されるようにマトリゲル中で拡大させた（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１；１４１（５）：１７６２-７２）。マトリゲルマトリックス中で少なくとも２ケ月継続的に成長させた後（最低１２継代）、ＰＤＯを初めにｅＧＦＰタグ付けし（以下を参照）、その後、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、２％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有する１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で成長するように適合させた。ＰＤＯ培養物を、これらの条件で維持し、Ｔ細胞共培養アッセイ及びＦＡＣＳ分析の必要に応じて使用した。各ＰＤＯ株で結腸がんドライバー遺伝子の遺伝子分析を実施し、これらは、一致した腫瘍生検で同定された変異と同一であった。
【0162】
核ｅＧＦＰでのＰＤＯの標識
ｅＧＦＰタグ付けヒストン２Ｂコンストラクト（ｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）（Ｂｅｒｏｎｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｌ；１６（７）：８２１－７）を導入することによりＰＤＯの核を標識し、自動顕微鏡による細胞の定量化を可能にした。ウイルス生成のために、１０％ＦＢＳ、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ中でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を培養した。ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、９μｇのｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ、２．２５μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２６０；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２６０から贈与）、及び０．７５ｕｇのｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２５９；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５９；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２５９から贈与）を含有するプラスミド混合物を一晩トランスフェクションすることにより、レンチウイルス粒子を生成した。翌日、細胞の培地を交換し、２４時間後にウイルスを採取し、使用前に０．４５ｕＭフィルタに通した。レンチウイルス導入のために、マトリゲル中の培養物からＰＤＯを採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一の細胞に解離し、ペレット成形した。ウイルス及び１ｎＭ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地にペレットを再懸濁し、３００ｇで１時間遠心分離した。培地を交換する前に、サンプルを再懸濁し、６時間から一晩の間、培養液に播種した。回収及び拡大の後、ｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによってソートし、使用前にさらに拡大させた。
ｅＧＦＰタグ付けヒストン２Ｂコンストラクト（ｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ）（Ｂｅｒｏｎｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｌ；１６（７）：８２１－７）を導入することによりＰＤＯの核を標識し、自動顕微鏡による細胞の定量化を可能にした。ウイルス生成のために、１０％ＦＢＳ、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ中でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を培養した。ＴｒａｎｓＩＴ－２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、９μｇのｐＬＫＯ．１－ＬＶ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ、２．２５μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２６０；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２６０；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２６０から贈与）、及び０．７５ｕｇのｐＭＤ２．Ｇエンベローププラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２５９；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５９；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２５９から贈与）を含有するプラスミド混合物を一晩トランスフェクションすることにより、レンチウイルス粒子を生成した。翌日、細胞の培地を交換し、２４時間後にウイルスを採取し、使用前に０．４５ｕＭフィルタに通した。レンチウイルス導入のために、マトリゲル中の培養物からＰＤＯを採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一の細胞に解離し、ペレット成形した。ウイルス及び１ｎＭ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地にペレットを再懸濁し、３００ｇで１時間遠心分離した。培地を交換する前に、サンプルを再懸濁し、６時間から一晩の間、培養液に播種した。回収及び拡大の後、ｅＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによってソートし、使用前にさらに拡大させた。
【0163】
フローサイトメトリーによる表面ＣＥＡ発現分析
酵素非含有のＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して細胞株を採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＰＤＯを採取した。２ｘ１０５細胞を、２０ｎＭのヒト抗ヒトＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｒｏｃｈｅ）及び２５ｕｇ／ｍｌのＲ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎコンジュゲート二次抗体ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｓｔｒａｔｅｃｈ）で染色した。死細胞の排除のためにＤＲＡＱ７（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ）染色を含めた。Ｓｏｎｙ ＳＨ８００フローサイトメーターでＣＥＡ発現を分析した。混合ＣＥＡ発現を伴うＰＤＯの高ＣＥＡ集団と低ＣＥＡ集団の間のトラフにゲート境界を設定し、すべてのサンプルで同一のゲートを使用した。ＣＥＡｈｉ集団とＣＥＡｌｏ集団の割合、及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各ＰＤＯについて計算した。
酵素非含有のＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して細胞株を採取し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＰＤＯを採取した。２ｘ１０５細胞を、２０ｎＭのヒト抗ヒトＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（Ｒｏｃｈｅ）及び２５ｕｇ／ｍｌのＲ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎコンジュゲート二次抗体ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｓｔｒａｔｅｃｈ）で染色した。死細胞の排除のためにＤＲＡＱ７（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ）染色を含めた。Ｓｏｎｙ ＳＨ８００フローサイトメーターでＣＥＡ発現を分析した。混合ＣＥＡ発現を伴うＰＤＯの高ＣＥＡ集団と低ＣＥＡ集団の間のトラフにゲート境界を設定し、すべてのサンプルで同一のゲートを使用した。ＣＥＡｈｉ集団とＣＥＡｌｏ集団の割合、及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各ＰＤＯについて計算した。
【0164】
末梢血単核細胞からのＣＤ８ Ｔ細胞の拡大
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコールに従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いてバフィーコートから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＦｌｏｗＣｏｍｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＭＣから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＣＤ８、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって評価し、製造業者のプロトコールに従って、１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位のペニシリン／ストレプトマイシン、及び３０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０でのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による拡大には、少なくとも９０％のＣＤ８陽性細胞を含む集団のみを使用した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のプロトコールに従って（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いてバフィーコートから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＦｌｏｗＣｏｍｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＭＣから単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＣＤ８、Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって評価し、製造業者のプロトコールに従って、１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００単位のペニシリン／ストレプトマイシン、及び３０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０でのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）による拡大には、少なくとも９０％のＣＤ８陽性細胞を含む集団のみを使用した。
【0165】
ＰＤＯとＣＤ８ Ｔ細胞の共培養
ＴｒｙｐＬＥ ＥｘｐｒｅｓｓでＰＤＯを採取し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で中和した。細胞を７０μｍフィルタを通して濾過し、カウントし、１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位のペニシリン－ストレプトマイシンが補充されたフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。第０日に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の１ウェルにつき５０００個の腫瘍細胞を播種した。２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的ネガティブコントロール抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（どちらもＲｏｃｈｅにより提供）を用いて、示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＣＤ８ Ｔ細胞を第１日に添加した。ＣＤ８ Ｔ細胞を含まない腫瘍細胞及び抗体を含まない腫瘍細胞も、コントロールとして含めた。すべての条件を３回播種し、８つのＰＤＯのそれぞれについて少なくとも３人の異なる健康なドナーを試験した。
ＴｒｙｐＬＥ ＥｘｐｒｅｓｓでＰＤＯを採取し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で中和した。細胞を７０μｍフィルタを通して濾過し、カウントし、１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、及び１００単位のペニシリン－ストレプトマイシンが補充されたフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。第０日に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）の１ウェルにつき５０００個の腫瘍細胞を播種した。２０ｎＭのシビサタマブ又は２０ｎＭの非標的ネガティブコントロール抗体ＤＰ４７－ＴＣＢ（どちらもＲｏｃｈｅにより提供）を用いて、示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＣＤ８ Ｔ細胞を第１日に添加した。ＣＤ８ Ｔ細胞を含まない腫瘍細胞及び抗体を含まない腫瘍細胞も、コントロールとして含めた。すべての条件を３回播種し、８つのＰＤＯのそれぞれについて少なくとも３人の異なる健康なドナーを試験した。
【0166】
免疫蛍光顕微鏡法によるがん細胞増殖の評価
Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＧＦＰコンフルエンスアプリケーションを使用して、１０日間の期間にわたってＧＦＰコンフルエンスを４８時間－７２時間毎に定量化した。ＧＦＰコンフルエンス分析は、共培養物中のＴ細胞を誤ってカウントすることなく、複数の時点にわたって、ＧＦＰ陽性ＰＤＯ細胞の増殖を追跡することが可能であった。コンフルエンス分析は、さらに、ＰＤＯ中心などのがん細胞密度の高い領域において不正確な結果をもたらした細胞核をカウントすることよりも優れていた。スフェロイド直径の測定に対するコンフルエンス分析の主な利点は、非常に変化しやすい形状を示すＰＤＯの増殖でさえも追跡する能力である。３人の異なる健康なドナーからのＣＤ８ Ｔ細胞を用いて成長曲線を生成した。ＰＤＯがおそらく増殖培地の枯渇が原因である増殖遅延を示す前に、第７日から第９日の間に取られた測定値から増殖低下の割合を計算した。増殖低下の割合を計算するために、第１日のコンフルエンスを差し引き、エンドポイントのＤＰ４７－ＴＣＢコントロール抗体で処置されたウェルのコンフルエンスを１００％に設定した。
Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＧＦＰコンフルエンスアプリケーションを使用して、１０日間の期間にわたってＧＦＰコンフルエンスを４８時間－７２時間毎に定量化した。ＧＦＰコンフルエンス分析は、共培養物中のＴ細胞を誤ってカウントすることなく、複数の時点にわたって、ＧＦＰ陽性ＰＤＯ細胞の増殖を追跡することが可能であった。コンフルエンス分析は、さらに、ＰＤＯ中心などのがん細胞密度の高い領域において不正確な結果をもたらした細胞核をカウントすることよりも優れていた。スフェロイド直径の測定に対するコンフルエンス分析の主な利点は、非常に変化しやすい形状を示すＰＤＯの増殖でさえも追跡する能力である。３人の異なる健康なドナーからのＣＤ８ Ｔ細胞を用いて成長曲線を生成した。ＰＤＯがおそらく増殖培地の枯渇が原因である増殖遅延を示す前に、第７日から第９日の間に取られた測定値から増殖低下の割合を計算した。増殖低下の割合を計算するために、第１日のコンフルエンスを差し引き、エンドポイントのＤＰ４７－ＴＣＢコントロール抗体で処置されたウェルのコンフルエンスを１００％に設定した。
【0167】
Ｗｎｔ／β－カテニン経路阻害アッセイ
１０５ ＰＤＯ細胞／ウェルを１２ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。培地を交換し、ＤＭＳＯコントロール又は１０μＭ タンキラーゼ阻害剤（化合物２１）（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．２０１５；６（９）：１６８７-９２）又は１０μＭ ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤（ＬＧＫ－９７４、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）で３日間処置した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して細胞を採取し、ＣＥＡに関してＣＨ１Ａ１Ａ一次抗体及びＲ－フィコエリスリンコンジュゲート二次抗体で染色し、上記のようにＦＡＣＳによって分析した。
１０５ ＰＤＯ細胞／ウェルを１２ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。培地を交換し、ＤＭＳＯコントロール又は１０μＭ タンキラーゼ阻害剤（化合物２１）（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍ．２０１５；６（９）：１６８７-９２）又は１０μＭ ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤（ＬＧＫ－９７４、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）で３日間処置した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して細胞を採取し、ＣＥＡに関してＣＨ１Ａ１Ａ一次抗体及びＲ－フィコエリスリンコンジュゲート二次抗体で染色し、上記のようにＦＡＣＳによって分析した。
【0168】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してピアソン相関分析及び対応ｔ検定を実施した。すべてのｐ値は両側にあった。５０００の遺伝子セット置換を使用するＧＳＥＡソフトウェアＶ３．０及びＨａｌｌｍａｒｋｓ Ｖ６．２遺伝子セットコレクションを用いて遺伝子セット濃縮分析を実施した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５／０９／３０．２００５ Ｏｃｔ ２５；１０２（４３）：１５５４５-５０）。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してピアソン相関分析及び対応ｔ検定を実施した。すべてのｐ値は両側にあった。５０００の遺伝子セット置換を使用するＧＳＥＡソフトウェアＶ３．０及びＨａｌｌｍａｒｋｓ Ｖ６．２遺伝子セットコレクションを用いて遺伝子セット濃縮分析を実施した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５／０９／３０．２００５ Ｏｃｔ ２５；１０２（４３）：１５５４５-５０）。
【0169】
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明および実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許および科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】