(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-02
(54)【発明の名称】合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20220526BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220526BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220526BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N15/63 Z ZNA
C12Q1/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560224
(86)(22)【出願日】2020-04-04
(85)【翻訳文提出日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 US2020026758
(87)【国際公開番号】W WO2020206385
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】62/830,279
(32)【優先日】2019-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/955,925
(32)【優先日】2019-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521439235
【氏名又は名称】アーリー・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】シューイ，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】エスカルペ，ポール
(72)【発明者】
【氏名】ローディング，スィリアック
(72)【発明者】
【氏名】リン，ジャスティン
(72)【発明者】
【氏名】ハーウィッグ，アレックス
(72)【発明者】
【氏名】ルディナ，シーリーン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS02
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、病変細胞の検出に有用な遺伝的要素を含む核酸の実施形態を包含する。一部の態様において、本開示は、（ａ）組成物を対象者に投与し、当該組成物が、前記対象者での非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に、病変細胞における前記バイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなること；（ｂ）前記バイオマーカーを検出すること；及び（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が少なくとも７０％の精度で前記病変細胞を有することを決定することを含む方法を提供する。
【選択図】図33A
【選択図】図33A
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）組成物を対象者に投与し、当該組成物が、前記対象者での非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に、病変細胞における前記バイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなること；（ｂ）前記バイオマーカーを検出すること；及び
（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が少なくとも７０％の精度で前記病変細胞を有することを決定することを含む方法。
【請求項2】
前記相対比が濃度比である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記バイオマーカーを前記対象者からの生体サンプルで検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記生体サンプルが前記対象者からの体液である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記生体サンプルが、前記対象者からの血液又は血液ベースのサンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記生体サンプルが前記対象者からのガス状サンプルである、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記ガス状サンプルが前記対象者からの呼気である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記対象者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記対象者がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記対象者が動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記生体サンプルが、ヒト又は動物の体内でイン・サイツで測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項12】
前記組成物が核酸ベクターを含む、請求項１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記ベクターが、ナノプラスミド、プラスミド、ミニサークル、組換えウィルスベクター、又はＣＥＬｉＤからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記組成物がミニサークルを含み、前記ミニサークルが自己複製ミニサークルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記自己複製ミニサークルがＳ／ＭＡＲ要素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記組成物が、前記バイオマーカーをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記プロモーターが、前記対象者における複数の異なる種類の病変細胞における発現を駆動する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記プロモーターが、前記対象者での前記非病変細胞における前記バイオマーカーの発現より優先的に前記複数の異なる種類の病変細胞における前記バイオマーカーの発現を駆動する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記バイオマーカーが、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
前記定量可能な核酸バイオマーカーが操作されたｍｉＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記バイオマーカーの検出が、前記病変細胞の位置を決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記バイオマーカーが、非侵襲的イメージング又はそれらの組み合わせによって、前記対象者の身体サンプルにおいて検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記バイオマーカーが、血液ベースのアッセイを用いて検出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記トランスフェクション剤が、直鎖若しくは分岐ポリエチレンイミン、ナノ粒子、親油性粒子、固体ナノ粒子、ペプチド、ミセル、デンドリマー、ポリマー組成物、ヒドロゲル、合成若しくは天然由来のエキソソーム、ウィルス様粒子、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記薬学的に許容される担体が、水、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素、デキストロース水溶液、グリセロール溶液、グルコース、乳糖、ショ糖、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム溶液、プロピレン、グリコール、ココアバター、又はエタノールからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療する方法であって、当該対象者での非病変細胞による前記治療上有効な薬剤の発現より優先的に当該疾患に関連する病変細胞による治療上有効な薬剤の発現を誘発する組成物を当該対象者に投与することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞によって発現される治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０よりも大きくなることを含み、前記治療上有効な薬剤が、前記病変細胞の細胞集団の減少によって決定される少なくとも１０％の治療効力で当該対象者を治療する方法。
【請求項30】
前記組成物がベクターを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記組成物が、治療上有効な薬剤をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記治療上有効な薬剤が、治療上有効なポリペプチド、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はポリペプチドと前記核酸の組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記治療上有効な薬剤が、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ＤＴジアホラーゼ、ニトロレダクターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホルホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、フォリルポリグルタミルシンテターゼ、カルボキシペプチダーゼＡｌ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ－４５０からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、該組成物が細胞内にある場合には、前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、当該細胞への前記第１及び前記第２の核酸の送達を反映する量で発現され、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物。
【請求項35】
（ｉ）当該細胞が、非病変細胞での前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞での前記第１の核酸配列の発現を誘発し、前記発現された第１のポリペプチド又は核酸が検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく前記第２の核酸配列の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、前記検出可能なバイオマーカーや前記治療薬ではない前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーを生じ、それによって前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの発現のレベルが、当該細胞での前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記組成物において、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸配列及び前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸配列を含む前記配列が、独立の遺伝子構築物上にある、請求項３５に記載の組成物。
【請求項37】
前記第１のポリペプチドが前記検出可能なバイオマーカー及び前記治療薬である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項38】
前記細胞が病変細胞である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項39】
前記組成物が、前記第１及び前記第２の核酸を含むベクターをさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項40】
前記ベクターが、（ａ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、前記プロモーターが、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び
（ｂ）病変細胞及び非病変細胞において等しく発現を誘発し、前記第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列
を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
前記ベクターが非ウィルスベクターである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項42】
前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
前記ベクターがナノプラスミドベクターである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項44】
前記第１及び第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、非侵襲的イメージング又はそれらの組み合わせによって、前記対象者の身体サンプルにおいて検出可能である、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本願は、２０１９年４月５日出願の発明の名称が「合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物（ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ）」である米国暫定出願第６２／８３０，２７９号及び２０１９年１２月３１日出願の発明の名称が「合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物（ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ）」である米国暫定出願第６２／９５５，９２５号の恩恵を主張するものであり、これら出願はそれぞれ、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本願は、２０１９年４月５日出願の発明の名称が「合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物（ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ）」である米国暫定出願第６２／８３０，２７９号及び２０１９年１２月３１日出願の発明の名称が「合成バイオマーカーのための改良された方法及び組成物（ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ）」である米国暫定出願第６２／９５５，９２５号の恩恵を主張するものであり、これら出願はそれぞれ、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
がんは、巨大な世界的健康問題である。世界保健機関は、２０１８年だけで推定１，８１０万人が新たにがんと診断され、９６０万人ががんによって死亡したと推計している。早期に検出された場合は、現在の治療がより効果的となる可能性が高いことから、最初のがん診断の前と腫瘍再発時の両方で、がんが検出される時間は、患者の転帰に影響を与える最も重要な因子の一つである。残念ながら、がんの大部分は比較的遅く検出され、高い死亡率につながっている。より効果的な検出戦略と治療が開発されない限り、これらの率は２０３０年までに２倍になると予想される。この恐ろしい疾患による途方もない人命の損失を食い止めるために、がんをその最も早期の段階で検出することができる広く適用可能な手段が緊急に必要とされている。
【0003】
がん検出を改善するための二つの現在のパラダイムは、血流に流入又は放出される内因性がんバイオマーカー（例えば、タンパク質、マイクロＲＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞など）を検出する血液に基づくアッセイ、並びにバイオマーカー標的イメージングプローブを利用して、従来の解剖学的イメージングでは検出できない腫瘍をより良好に視覚化する分子イメージングアッセイの開発を含むものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
血液アッセイは、手頃な価格のがんスクリーニングプログラムを容易にすることから非常に魅力的であるが、血液バイオマーカー濃度が低く（Ｎａｇｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４５０：１２３５－１２３９）、急速なイン・ビボ及びエクス・ビボバイオマーカー分解（Ｈａｕｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１１）Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ． ３：７１ｒａ１６）、及び非悪性組織における非常に変動の大きいバックグラウンド発現（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅ Ｐ （２０１０） Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． １０２：１４６２－１４６７）のために感度及び特異性の問題に苦しむ場合が多い。現在の臨床バイオマーカーアッセイを使用して、内因性血液バイオマーカー量が疾患を示すのに十分なレベルに達する前に、腫瘍は１０～１２年間増殖し、球径が２．５ｃｍを超え得ると推定されている（Ｈｏｒｉ ＆ Ｇａｍｂｈｉｒ （２０１１） Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ． ３：１０９ｒａ１１６）。報告された数千の潜在的な血液バイオマーカーのうち、診療所で使用されるのは１％未満であり（７）、検証された特異性及び診断価値がないため、新しい血液バイオマーカーの臨床現場への導入は減少しつつある（Ｈａｕｎ ｅｔａｌ．， （２０１１） Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ． ３：７１ｒａ１６；Ｋｅｒｎ ＳＥ （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７２：６０９７－６１０１）。全体として、内因性のがん血液バイオマーカーを検出するためのツールの開発に多大な努力が注がれてきたが、成功はほとんどなかった。したがって、高感度で特異的ながん検出を行うことができる新たな戦略及び手段が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
一部の態様において、本開示は、（ａ）組成物を対象者に投与し、当該組成物が、対象者での非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に、病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発することで、非病変細胞に対する病変細胞で発現されるバイオマーカーの相対比が１．０より大きくなること；（ｂ）バイオマーカーを検出すること；（ｃ）（ｂ）で検出されたバイオマーカーを用いて、対象者が少なくとも７０％の精度で病変細胞を有することを決定することを含む方法を提供する。
【0006】
一部の態様において、本開示は、疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療する方法であって、当該対象者での非病変細胞による治療上有効な薬剤の発現より優先的に当該疾患に関連する病変細胞による治療上有効な薬剤の発現を誘発する組成物を当該対象者に投与することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞によって発現される治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０よりも大きくなることを含み、前記治療上有効な薬剤が、前記病変細胞の細胞集団の減少によって決定される少なくとも１０％の治療効力で当該対象者を治療する方法を提供する。
【0007】
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、その組成物が細胞内にある場合には、前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、当該細胞への前記第１及び前記第２の核酸の送達を反映する量で発現され、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物を提供する。
【0008】
一部の態様において、本開示は、対象者における病変細胞を検出する方法であって、組成物を当該対象者に投与することを含み、前記組成物が、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列を含み；前記組成物が、その組成物が細胞内にある場合、（ｉ）当該細胞が、非病変細胞での第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞での第１の核酸配列の発現を誘発するように構成されており、前記第１のポリペプチドが検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく第２の核酸配列の同等の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、検出可能なバイオマーカーや治療薬ではない前記第２のポリペプチドを生じ、それによって前記第２のポリペプチドの発現のレベルが、当該細胞での前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する方法を提供する。
【0009】
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む組成物であって、当該組成物が、その組成物が細胞内にあるとき、（ｉ）当該細胞が前記第１の核酸配列を発現して前記第１のポリペプチドを生じ；（ｉｉ）前記細胞が第２の核酸配列を発現して前記第２のポリペプチドを生じ；（ｉｉｉ）前記細胞によって発現される前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成するように構成されている組成物を提供する。
【0010】
一部の態様において、本開示は、病変細胞を検出又は治療する方法であって、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む上記の組成物を投与することを含み、前記第１及び前記第２のポリペプチドが、前記病変細胞において選択的に転写又は翻訳される方法を提供する。
【0011】
一部の態様において、本開示は、ポリペプチド又は核酸配列をコードする配列を含む非天然組換え遺伝子構築物を含む組成物であって、当該配列が、エクス・ビボで細胞に形質導入された場合に対象者から単離される複数の異なる種類の細胞における前記ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む組成物を提供する。
【0012】
一部の態様において、本開示は、エクス・ビボで病変細胞若しくは障害細胞検出するための方法であって、エクス・ビボで非天然組換え遺伝子構築物を対象者から単離された細胞の集団に送達することを含み、前記非天然組換え遺伝子構築物が、ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列をコードする配列を含み、当該配列が、前記細胞に形質導入された場合に、対象者から単離された複数の異なる種類の細胞において前記ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む方法を提供する。
【0013】
一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物であって、前記ベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、前記各プロモーターが、前記複数の核酸の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記複数の核酸配列の個々のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列のレベルが、細胞又はその細胞が起源とする組織の疾患の段階を示すものである組成物を提供する。
【0014】
一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物を対象者に投与することを含む、疾患の段階を検出するための方法であって、前記ベクターが、複数の異なる核酸に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、前記各プロモーターが細胞内の前記複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記複数の核酸配列の個々のポリペプチドのレベルが、前記細胞又は前記細胞が起源とする組織の疾患の段階を示す方法を提供する。
【0015】
一部の態様において、本開示は、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むレポーター遺伝子を含む組換え核酸と比較した場合に、病変細胞と比べて正常細胞において約１０％以下の発現を示す発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸を含む組成物を提供する。
【0016】
一部の態様において、本開示は、上記の発現可能なレポーター遺伝子をコードする前記遺伝子操作核酸を含む組成物を対象者に投与することを含む方法を提供する。
【0017】
一部の態様において、本開示は、病変細胞と比べて正常細胞において約１０％以下の発現を示し、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域に１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物を提供する。
【0018】
一部の態様において、本開示は、上記の病変細胞と比べて正常細胞において約１０％以下の発現を示す組成物を対象者に投与することを含む、病変細胞を検出する方法を提供する。
【0019】
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡに対して、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖がそれらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されており、それによって、前記プロモーターが、非病変細胞に対する病変細胞で発現される合成バイオマーカーの相対濃度が１．０を超える組成物を提供する。
【0020】
一部の態様において、本開示は、上記のプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡに対して合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物を対象者に投与すること、及び前記合成バイオマーカーを検出することを含む病変細胞の確認方法であって、前記合成バイオマーカーが、対象者の非病変細胞における合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞で発現され、それによって、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなる方法を提供する。
【0021】
一部の態様において、本開示は、治療上有効な薬剤をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡに対して、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、前記二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖がそれらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されており、前記プロモーターが、非病変細胞での合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞での治療上有効な薬剤の発現を誘発し、それによって、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０より大きくなる組成物を提供する。
【0022】
一部の態様において、本開示は、対象者に上記の組成物を投与すること及び合成バイオマーカーを検出することを含む病変細胞の治療方法であって、前記合成バイオマーカーが前記対象者での非病変細胞における前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞で発現され、それによって、前記非病変細胞より病変細胞で発現される合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなる方法を提供する。
【0023】
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーを発現する非ウイルスベクターを含む組成物であって、前記合成バイオマーカーが、病変細胞と比べて正常臓器細胞で約１０％以下の発現を示す組成物を提供する。
【0024】
一部の態様において、本開示は、非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発するを含み、それによって、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子であって、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現されるバイオマーカーの相対濃度比が１．０より大きくなる操作粒子を提供する。
【0025】
一部の態様において、本開示は、少なくとも一つのベクターであって、前記少なくとも一つのベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、前記プロモーターが、細胞における複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記プロモーターが、対象者の非病変細胞において前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に、病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の相対比が１．０より大きくなるベクターを提供する。
【0026】
一部の態様において、本開示は、対象者における疾患の検出方法であって、上記の複数の異なる核酸に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含む少なくとも一つのベクターを含む組成物を対象者に投与すること；前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出して、発現プロファイルを取得すること；及び病変細胞に基づく発現プロファイルを検出することで当該疾患を検出することを含む方法を提供する。
【0027】
一部の態様において、本開示は、対象者の疾患の有無を検出する方法であって、対象者の１以上の細胞をエクス・ビボで遺伝子構築物と接触させ、前記遺伝子構築物が、バーコード分子に作動可能に連結された疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患による影響を受けた細胞における前記バーコード分子の発現を駆動すること；前記バーコード分子の発現レベルを定量すること；及び前記発現レベルに基づいて、前記疾患の有無を検出することを含む方法を提供する。
【0028】
より大きなグループ内の特有のメンバーに専用ラベルを帰属させることにより、バーコードは、より大きな及び多くのメンバーのより複雑な混合物（例えば、同じ細胞内で発現される複数のプロモーター－レポーター構築物）の文脈内でそのメンバーを同定及び定量する機会を提供し（例えば、特定のがん特異的プロモーターの制御下でのレポーターの発現）、前記複雑な混合物から単一メンバーを単離する機会を提供する。例えば、核酸に基づくバーコードの場合、塩基対の相補性に基づくバーコードのハイブリダイゼーションを用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、他の形で混合物の複雑さを低減することができる。ペプチドに基づくバーコードの場合、免疫捕捉又はリガンド及び受容体の相互作用を含む特有の特徴を用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、他の形で複雑さを低減することができる。
【0029】
一部の態様において、本開示は、対象者の疾患のプロファイルを生成する方法であって、前記対象者の１以上の細胞を複数の遺伝子構築物と接触させ、前記複数の遺伝子構築物が、複数のバーコード分子にそれぞれ作動可能に連結された複数の疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患に冒された細胞における前記対応するバーコード分子の発現を駆動すること；及び前記複数のバーコード分子の発現レベルを定量して前記プロファイルを生成することを含む方法を提供する。
【0030】
本開示の追加の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明される以下の詳細な説明から本技術分野の当業者には容易に明らかになる。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、それのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱しない限りにおいて、各種の明白な点で改変が可能である。したがって、図面及び説明は、本来例示的なものと見なされるべきであり、限定的なものとして見なされるべきではない。
【0031】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたものと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が明細書に含まれる開示と矛盾する場合、明細書が、そのような矛盾する資料に優先し、及び／又は優越するものである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたものと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が明細書に含まれる開示と矛盾する場合、明細書が、そのような矛盾する資料に優先し、及び／又は優越するものである。
【図面の簡単な説明】
【0032】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面（「図（ＦＩＧＵＲＥ）又は「図（ＦＩＧ）」で示される）を参照することによって得られる。
【図1】図１は、がん検出のための血液ベースの腫瘍活性化可能ミニサークル（ＭＣ）アプローチを模式的に説明する図である。（Ａ）腫瘍特異的プロモーターによって駆動され、分泌可能なレポータータンパク質をコードする腫瘍活性化可能ＭＣは、非標的化トランスフェクション剤（ＴＡ）と複合体化する。これらのナノ複合体は、全身的に（尾静脈を介して）送達される。（Ｂ）ＭＣは多くの組織をトランスフェクトするが、レポータータンパク質産生は、ほぼ専ら腫瘍細胞内で起こり、発現されたレポーターは血流（ＢＳ）中に分泌される。最小タンパク質発現が、プロモーターの漏出のために腫瘍のない対象者で発生するはずである。（Ｃ）採血及び血漿中の分泌されたレポーターの検出により、腫瘍を有する（レポーター陽性）対象者と腫瘍のない（レポーター陰性）対象者を区別することができる。
【図2】図２Ａ～２Ｂは、腫瘍活性化可能ベクターの設計及び構築を示す図である。図２Ａは、スルビビンプロモーター（ｐＳｕｒｖ）駆動の親プラスミド（ＰＰ；上）及びＭＣ（下）の両方のベクターマップを示している。これらの構築物は、レポータータンパク質分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードしていた。ＰＰ及びＭＣは同一の転写ユニット（ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ－ポリＡ）を有するが、ＭＣは原核生物バックボーン（薄い灰色）を持たない。ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウィルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）。図２Ｂは、ＰＰ（７．９ｋｂ）及びＭＣ（４．１ｋｂ）の両方を生成する能力を確認するアガロースゲル電気泳動を示している。
【図7】図７は、腫瘍特異的ＳＥＡＰミニサークルの全身投与後の血液ベースのがん検出のためのＳＥＡＰアッセイ標準曲線である。ＳＥＡＰアッセイの標準曲線分析により、約１０４を超えるＲＬＵ値は、血漿中の検出可能なＳＥＡＰレベルの直線領域内にあることが明らかになった。
【図8】図８は、腫瘍活性化可能なＭＣの腫瘍内投与が検出可能な血液レポーター活性をもたらすことを示すグラフである。皮下ヒト黒色腫異種移植片を有するヌードマウスに、ＳＥＡＰ（ｎ＝４；ＭＣ Ｉ．Ｔ．）又は５％グルコース（ｎ＝３；Ｍｏｃｋ）を発現する腫瘍活性化可能なＭＣを腫瘍内（Ｉ．Ｔ．）投与した。対照マウスの群にはまた、ＭＣの筋肉（Ｉ．Ｍ．）注射を行った（ｎ＝３；ＭＣ Ｉ．Ｍ．）。ＭＣ投与前及び投与最大２週間後の血漿ＳＥＡＰ測定により、ＭＣ Ｉ．Ｔ．マウスのみで、３日目～１４日目までＳＥＡＰレベルが上昇していたことがわかった（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＤとして表されている。
【図10】図１０は、腫瘍特異的ＳＥＡＰミニサークルの全身投与後の血液ベースのがん検出を示すグラフである。ｐスルビビン－ＳＥＡＰ ＭＣの注射後３日から１４日まで、腫瘍を有するマウスからの血液サンプルで、対照マウスよりも有意に高いＳＥＡＰ活性が検出された（ｐ＜０．０５）。ＭＣ又は５％グルコースを投与された対照マウス間で有意差は認められなかった。エラーバーはＳＤを表す。
【図15】図１５は、培養がん細胞における本開示の構築物のトランスフェクションの比較を示すグラフである。等体積のトランスフェクション剤を使用した等質量のＭＣ（ｎ＝３）及びＰＰ（ｎ＝３）のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞へのトランスフェクションは、ＭＣを含む培地で３日目から８日目まで有意に高いＳＥＡＰ濃度をもたらす（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＤとして表される。
【図16】図１６Ａ～１６Ｄは、腫瘍を有する対象者の確認を可能にする腫瘍活性化可能なＭＣの全身送達を示す。図１６Ａ～１６Ｃは、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いてモニタリングされたヌードマウス（ｎ＝７）における静脈細胞投与後のヒト黒色腫腫瘍の発生を示している（左の画像）。代表的なＢＬＩ画像は、主に肺内での腫瘍増殖を示し、個々のマウスは、ＭＣ投与前の３日以内に広範囲の腫瘍負荷を有することを示した。図１６Ａ及び１６ＢにおけるＢＬＩスケールは同じであるが、図１６Ｃのものは１桁低い。腫瘍活性化可能なＭＣを全身投与し、ＳＥＡＰレベルを投与前（０日目）及び最長投与後１４日まで測定した（右のグラフ）。１４日間にわたり、腫瘍を有するマウスで、多様なＳＥＡＰ濃度が検出された。図１６Ｄは、ＭＣ（対照＋ＭＣ；ｎ＝７）又は５％グルコース担体のみ（対照－ＭＣ；ｎ＝５）のいずれかの投与を受けた健常（腫瘍のない）マウスを示している。これら二つの群間で血漿ＳＥＡＰレベルに統計的有意差は検出されなかった。重要な点として、腫瘍量に関係なく全てのマウスで、両方の対照群と比較して、３日から１４日の間にＭＣを投与された腫瘍を有するマウスで有意に高い血漿ＳＥＡＰ濃度が検出された（＃＊ｐ＜０．０５；＃＃＊＊ｐ＜０．０１）。データは平均±ＳＥＭとして表されている。
【図17】図１７Ａ～１７Ｃは、腫瘍活性化可能なＭＣが、腫瘍を有する対象者を確実に識別し、腫瘍量を測定できることを示している。図１７Ａ：２週間にわたる血漿ＳＥＡＰ測定の曲線下面積（ＡＵＣ）分析により、ＭＣ（ｎ＝７）又は５％グルコース（ｎ＝５）を投与された両方の健常マウスと比較して、ＭＣを投与された腫瘍を有するマウス（ｎ＝７）の間に有意差が明らかになった（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。データはＳＤを意味するものとして表される。図１７Ｂ：ＲＯＣ（受信者動作特性曲線）分析により、血漿ＳＥＡＰ ＡＵＣを測定及び計算することにより、腫瘍活性化可能なＭＣシステムが、腫瘍を有する対象者を健常対象者から区別する顕著な能力が明らかになった。図１７Ｃ：ＳＥＡＰ ＡＵＣ測定値と肺腫瘍負荷の相関分析（ＢＬＩ肺平均放射輝度によって測定）。６匹のマウス間で、これら２つの測定値の間に有意な正の相関が認められ、腫瘍がある箇所にある場合に、本発明者らのツールが腫瘍量を評価する能力を示している。このマウスは肺の両方に腫瘍があり、肺の外側に複数の転移巣があったため、マウス１匹を解析から除外した（ＢＬＩ測定値は肺のすぐ内側から得たものであり、このマウスにおける全体的な低いＢＬＩ信号を説明している。）。このマウスは、肺腫瘍負荷に基づいて予想されるよりも高いＳＥＡＰ ＡＵＣレベルを有していた。
【図18】図１８Ａ～１８Ｄは、健常（腫瘍のない）マウスにおけるイン・ビボでのプロモーター活性の比較を示している。マウスに、ｐＣＭＶ（ｎ＝３）、ｐＳｕｒｖ（ｎ＝５）、又はｐＰＥＧ（ｎ＝３）によって駆動される生体発光イメージング（ＢＬＩ）レポーター遺伝子コドン至適化ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）を発現するプラスミド（３０μｇ；ＰＧＬ４．２バックボーン；ＰＥＩと複合体化（Ｎ／Ｐ＝６））を全身投与した。Ｍｏｃｋ注射したマウスには、５％グルコースを投与した（ｎ＝３）。各マウスには、トランスフェクション効率を評価するために、ｐＣＭＶによって駆動されるＢＬＩレポーター遺伝子ヒト化ウミシイタケシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）を発現するプラスミドも同時注射した（３μｇ；Ｌｕｃ２プラスミド質量の１０分の１）。図１８Ａは、注射の４８時間後の代表的なＢＬＩ画像を示している。ｐＣＭＶマウスの画像スケールは、他の全てのマウスより２桁高くなっている。主として肺でのＢＬＩシグナルが、Ｌｕｃ２プラスミドを投与された全てのマウスで見られた。図１８Ｂは、ＢＬＩ画像について実行されたマウス全体にわたる対照領域分析を示しており、それによって他の全てのマウスと比較して、ｐＣＭＶ－Ｌｕｃ２プラスミドを投与されたマウスにおいて有意に高い（＊ｐ＜０．０５；約１００倍）ＢＬＩシグナルが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）。有意に高い（＊ｐ＜０．０５）ＢＬＩシグナルが、ｍｏｃｋ注射マウスと比較して、ｐＰＥＧマウスにおいても観察された。質的により高いＢＬＩシグナルが、ｍｏｃｋ注射されたマウスと比較してｐＳｕｒｖマウスで顕著であったが、定量的測定では、より高いＢＬＩ信号に向かう傾向（ｐ＝０．１６）が明らかなっただけであった。したがって、このマウス系統では、正常組織でのＬｕｃ２発現は、腫瘍特異的ｐＳｕｒｖで最も低かった。図１８Ｃは、プラスミド注射の４８時間後、多数の組織にわたるＬｕｃ２活性のエクス・ビボ分析によって、他の全ての群と比較してｐＣＭＶで有意に高い（＊ｐ＜０．０５）発現が明らかになったことを示している。ｐＰＥＧでは、ｍｏｃｋ注射動物と比較して、心臓、肺及び脾臓で有意に高い（＊ｐ＜０．０５）Ｌｕｃ２活性が認められた。ｐＳｕｒｖでは、脾臓における有意に高い（＊ｐ＜０．０５）Ｌｕｃ２活性及び肺におけるより高い活性に向かう傾向（ｐ＝０．１３）があった。図１８Ｄは、バックグラウンドよりも高いｈＲｌｕｃ活性を示す唯一の組織が肺であったことを示している（提示された値を、ｍｏｃｋ注射マウスからの平均バックグラウンド値に正規化している。）。このため、イメージング（図１８Ｂ）及びエクス・ビボ組織分析（図１８Ｃ）の両方から求められたＬｕｃ２値は、ｈＲｌｕｃ値によって正規化されていない。肺内のｈＲｌｕｃ値に、三つのプロモーターマウス群間で有意差は見られなかった。したがって、３群間のＬｕｃ２測定値の違いは、トランスフェクション効率の違いに関係している可能性は低く、プロモーター活性の違いに関係している可能性がある。データは平均±ＳＤとして表される。
【図19】図１９Ａ～１９Ｃは、初代ヒト線維芽細胞及びヒトがん細胞系系における腫瘍特異的プロモーター活性の比較を示している。初代ヒト線維芽細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ヒト乳がん）及びＭｅＷｏ細胞（ヒト黒色腫）に、Ｌｕｃ２を発現するｐＰＥＧ又はｐＳｕｒｖ駆動プラスミド（１μｇ）をトランスフェクトし、ｈＲｌｕｃを発現する無プロモータープラスミド（５０ｎｇ）で共トランスフェクトして、トランスフェクション効率を正規化した。３つの細胞種のいずれにおいても、Ｒｌｕｃトランスフェクション効率に差は見られなかった。ｐＰＥＧ駆動プラスミドは、線維芽細胞においてｐＳｕｒｖより有意に高いＬｕｃ２活性をもたらした（＊ｐ＜０．０５）。ｐＳｕｒｖ駆動型プラスミドは、ＭｅＷｏ細胞で有意に高いＬｕｃ２活性をもたらし（＊＊＊ｐ＜０．００１）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で同等の活性をもたらした。データは平均±ＳＤとして表している。
【図20】図２０は、培養ＳＫ－ＭＥＬ－２８黒色腫細胞における腫瘍活性化可能なＰＰ及びＭＣの比較を示している。ＳＫ－ＭＥＬ－２８ヒト黒色腫細胞を、等質量の腫瘍活性化可能なＭＣ（ｎ＝３）及びＰＰ（ｎ＝３）並びに等容量のトランスフェクション剤ＰＥＩでトランスフェクトした。第２日目から７日目までＭＣをトランスフェクトした細胞の培地で有意に高いＳＥＡＰ活性が観察された（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＤとして表している。
【図21】図２１Ａ及び２１Ｂは、健常（腫瘍のない）マウスにおける強力な構成的プロモーターによって駆動されるＭＣとＰＰとの間のトランス遺伝子発現の比較を示している。図２１Ａは、ＰＥＩとの複合体形成後に強力な構成的ＥＦ１プロモーターによって駆動されるｈＲｌｕｃを発現するＭＣ（ｎ＝４）又はＰＰ（ｎ＝５）（４０μｇ；Ｎ／Ｐ＝８）のいずれかの全身投与を受けたマウスを示している。基質セレンテラジンを用いて第１、２、３、５及び７日にＢＬＩイメージングを行った。代表的な画像は、調べた全ての時点で、ＭＣ投与マウスでより高いＢＬＩシグナルを示している。比較のために、５％ブドウ糖注射を受けたマウスからのシグナルを示している（肝臓でのシグナルは、酸化されたセレンテラジンからのものである。）。図２１Ｂは、肺領域にわたる対象領域分析を示しており、第１、２及び５日のＭＣ対ＰＰマウスにおいて有意に高いＢＬＩシグナルを示している（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。データは平均±ＳＤとして表している。
【図22】図２２Ａは、血漿ＳＥＡＰアッセイの標準曲線分析を示している。三連のサンプルを、２５ＩＡの血漿中のＳＥＡＰの１０倍希釈で測定した。ＳＥＡＰ活性は、５桁にわたって直線であり、血漿２５μＬで約３×１０－７μｇ（０．３ｐｇ）の検出限界を示した。図２２Ｂは、変動係数（％ＣＶ）測定値４％未満で再現可能であった、直線範囲全体にわたるＳＥＡＰ測定値を示している。
【図23】図２３は、ＭＣ投与前後の腫瘍負荷を示している。ＭＣ投与前と２週間後の２匹の代表的なマウス（上及び下）の生物発光（ＢＬＩ）画像（左）と屠殺時（ＭＣ投与後２週間）の肺の対応するエクス・ビボ画像（右）。各ＢＬＩ画像の下の値は、肺に描かれた対象領域の平均放射輝度を表す。２匹のマウスの画像スケールには違いがある。継続的な腫瘍増殖を示しながら、両方のマウスとも、ＭＣ投与後の２週間にわたってＢＬＩシグナルの約４．５倍増加を示した。屠殺時に、肺内の腫瘍はメラニン性であり、肺全体に複数の腫瘍病巣が両方のマウスで観察された（白矢印）。ＢＬＩシグナル変化に基づくと、ＭＣ投与時（屠殺の２週間前）の総腫瘍量は、ここで提供したエクス・ビボ画像で見られるものの約１／４．５であった。
【図24】図２４は、実施例１１の実験の結果を示しており、ＦＬｕｃ発現細胞を正常ＰＢＭＣにドープし、そのような検出方法の検出限界が、正常ＰＢＭＣ５００万個当たり少なくとも３～１０個の病変細胞であることを示している。
【図25】図２５は、実施例１２の実験の結果を示すものであり、がん活性化ＤＮＡ構築物は、腫瘍を有するマウスと健常マウスを区別しており：生存ＳＥＡＰＤＮＡナノプラスミドの静脈投与後、全血を顎下腺放血によって採取し、処理して血漿とした。ＳＥＡＰアッセイは、小分けサンプル２０μＬで実施した。コホートサイズはｎ＝５である。
【図26】図２６Ａ～２６Ｆは、ポリマー／ＤＮＡ複合体のイン・ビボ効力及びイン・ビトロ細胞毒性を示している。図２６Ａは、ＣＭＶ－ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ４０μｇをポリマー製剤に製剤するか、ＪｅｔＰＥＩと複合体化され、続いてＢａｌｂ／Ｃマウスに静脈内投与され、その後、トランスフェクションの４日後にＤ－ルシフェリンを動物に注射し、その後に動物を屠殺し、エクス・ビボＢＬＩ分析のために肺を採取した実験を示す。細胞毒性評価（図２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｅ、及び２６Ｆ）のため、ＣＭＶ－ＬｕｃＤＮＡ ２５０ｎｇを含むポリプレックスを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、トランスフェクションの前日にウェル当たり１０，０００個の細胞を蒔いた。各製剤を、３連で調べた。４８時間後、細胞の形態を顕微鏡で記録し、ＭＴＴアッセイ時に細胞の生存率を測定した。図２６Ｂはブランク細胞を示す図である。図２６Ｃは、ＪｅｔＰＥＩを用いた構築物のイン・ビボ送達を示す図である。図２６Ｄは、高分子量アミン末端ポリ（β－アミノエステル）Ｃ３２－１２２を用いたＤＮＡの送達を示す図である。図２６Ｅは、高分子量アミン末端ポリ（β－アミノエステル）Ｃ３２－１４５を用いたＤＮＡの送達を示す図である。図２６Ｆは、ＭＴＴアッセイによる細胞生存率の結果を示す図である。
【図27】図２７は、プロタミンがＤＮＡポリプレックスサイズを凝縮することを示している。ＤＮＡ ６２．５μｇを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）中で、プロタミン１３０μｇと１：１（体積比）で完全に混合することによって濃縮した。次に、ＤＮＡ／プロタミン複合体を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）で１．５ｍＬに希釈した。総流量１２ｍＬ／分で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）で、プロタミン：ＤＮＡ ＬＮＰをアセンブルした。調製したままの粒子を、少なくとも１８時間にわたり、１×ＰＢＳに対して透析し、その後、ゼータサイザーによってサイズを決定した。
【図28】図２８は、送達製剤の生体内分布を決定するためにルシフェラーゼ使用の例を示している。Ａ）ＪｅｔＰＥＩで製剤されたＣＭＶルシフェラーゼベクター４０ｍｇを尾静脈注射したマウスのイン・ビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）。投与の４日後、マウスに麻酔を施し、Ｄ－ルシフェリン基質を投与し、ＡＭＩ－ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）で撮像した。Ｂ）イン・ビボイメージング後、マウスを屠殺し、エクス・ビボＢＬＩのために臓器を採取した。
【図29】図２９Ａ及び２９Ｂは、イヌＰＢＭＣ及びイヌの腫瘍に由来する細胞におけるエクス・ビボアッセイでのＡｄ－スルビビン－ＦＬｕｃの感度及び特異性を示している。骨肉腫、黒色腫及び血管肉腫などのイヌ悪性腫瘍の各種サブタイプに由来する未感作非形質導入細胞を、５ｅ５イヌＰＢＭＣにスパイクし、０．３ ＭＯＩのＡｄ－スルビビン－ＦＬｕｃで形質導入した。Ａ）分析は、Ａ１７骨肉腫細胞の単一細胞検出、又はＢ）複数の腫瘍タイプに由来する細胞全体での検出の堅牢性を示している。
【図30】図３０Ａ～Ｃは、エクス・ビボアッセイにおけるＡｄ－スルビビン－ＦＬｕｃの感度及び特異性を示している。Ａ）ホタルルシフェラーゼタンパク質を構成的に発現するよう操作されたＨ１２９９細胞を、５ｅ６ヒト正常ＰＢＭＣにスパイクし、サンプル全体を処理してルシフェラーゼ発現について分析した。Ｂ）形質導入されていない未感作Ｈ１２９９細胞をヒトＰＢＭＣにスパイクし、次にホタルルシフェラーゼの発現を駆動するヒトスルビビンプロモーターの発現カセットを有する組換えアデノウィルス（Ａｄ－スルビビン－ＦＬｕｃ）で形質導入した。４８時間増殖させた後、サンプルを処理し、ルシフェラーゼ発現について分析した。Ｃ）強力な構成的プロモーターの制御下で、Ａｄ－スルビビン－ＦＬｕｃ又はＡｄ－ＣＭＶ－ＦＬｕｃ、後者、のいずれかで形質導入されたヒトＰＢＭＣのみを有するサンプル。２日間のインキュベーション後、発光アッセイを用いてＦＬｕｃ発現を定量した。
【図31】図３１は、Ａｄ－スルビビン－ＦＬｕｃがヒトＰＢＭＣについてのエクス・ビボアッセイでがんと正常を区別することを示している。正常な健常志願者及びがん患者からのヒトＰＢＭＣの市販サンプルを数え、次に同数の細胞をＡｄ－スルビビン－Ｆｌｕｃと一貫したＭＯＩで形質導入し、次にサンプルを三連に分割した。３日間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を分析した。データは、三連サンプル測定の平均及び標準偏差として計算される。Ｐ値を、正常ＰＢＭＣと比較したステュデントｔ検定によって計算した。
【図32】図３２Ａ及び３２Ｂは、識別力のある健常イヌ個体及びイヌリンパ腫がん患者におけるスルビビン活性化ルシフェラーゼ発現の診断性能を示す図である。（Ａ）健常イヌ個体（ｎ＝３１）及びイヌリンパ腫がん患者（ｎ＝１７）の発光発現の倍率変化の比較。（Ｂ）スルビビン活性化ルシフェラーゼ活性のイヌリンパ腫がんの対象者及び健常イヌ対象者を区別する診断予測能力。
【図33】図３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、及び３３Ｆは、各種組織起源の特定の細胞系における各種プロモーター－レポーター構築物の活性化を示す図であり、遺伝子ラベルは、構築物で使用されるプロモーターの供給源を示している。図３３Ａは、肝臓起源の細胞系（例えば、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）における様々なプロモーター－レポーター構築物を示す図であり、ＣＸＣＲ４、ＴＲＩＰ１３、ＭＣＭ１０、ＣＯＬ１０Ａ１、ＢＩＲＣ５、及びＢＩＲＣ５－５０１が肝臓がんにおいて特に活性化されることを示している。図３３Ｂは、卵巣起源の不死化細胞系（例えば、ＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲ）における各種プロモーター－レポーター構築物の活性化を示す図であり、ＣＯＬ１０Ａ１、ＭＭＰ１３、ＵＢＥ２Ｃ、ＭＵＣ１、ＣＥＰ５５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＩＦ２０Ａ、ＦＡＭ１１１Ｂ、及びＣＳＴ１が卵巣がんにおいて特に活性化されることを示している。図３３Ｃは、膵臓起源の不死化細胞系（例えば、ＡＳＰＣ１、ＢＸＰＣ３、及びＰＡＮＣ１）における各種プロモーター－レポーター構築物の活性化を示す図であり、ＢＩＲＣ５、ＡＢＣＣ４、ＭＭＰ１３、ＣＸＣＲ４、ＵＢＥ２Ｃ、ＭＵＣ１、ＣＤＫＮ３、ＭＣＭ１０、ＣＤＣ２０、ＣＥＰ５５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＳＴ１、及びＦＡＭ１１１Ｂは、特に膵臓がんで活性化される。図３３Ｄは、乳房由来の細胞系（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１など）における各種プロモーター－レポーター構築物の活性化を示す図であり、ＢＩＲＣ５、ＭＣＭ１０、ＭＭＰ１、ＤＴＬ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ４Ａ、ＲＧＳ１３、ＫＩＦ２０Ａ、ＵＢＥ２Ｔ、ＣＥＮＰＦ、ＣＳＴ１、ＴＯＰ２Ａ、ＦＡＭ１１１Ｂ及びＭＭＰ１３が乳がんで特に活性化されることを示している。図３３Ｅは、肺起源の細胞系（例えば、Ａ５４９、Ｈ４６０、及びＨ１２９９）における各種プロモーター－レポーター構築物の活性化を示す図であり、ＭＣＭ１０、ＡＦＰ、ＭＭＰ１、ＣＥＰ５５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＲＧＳ１３、ＫＩＦ２０Ａ、ＣＳＴ１、ＦＡＭ１１１Ｂ、及びＭＭＰ１３が肺がんで特に活性化されることを示している。図３３Ｆは、非形質転換乳がん系である以外は３３Ｅと同じプロモーター－レポーター構築物の比較を示す図であり、３３Ｅで活性化されていることが示されているＭＭＰ１以外の遺伝子が、乳がんと正常組織を区別するのに特に役立つ可能性があることを示している。
【図34】図３４Ａ、３４Ｂ、及び３４Ｃは、黒色腫、骨肉腫、及び血管肉腫のがん細胞系におけるプロモーター－レポーター構築物のパネルの活性化を示す図であり、遺伝子ラベルは、構築物で使用されるプロモーターを示している。図３４Ａは、黒色腫起源の細胞系（例えば、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、及びＣＭＧＤ）におけるパネルのメンバーの活性化を示す図であり、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ５－５０１、ＣＸＣＲ４、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＲＩＰ１３、ＣＤＫＮ３、ＭＣＭ１０、ＣＤＣ２０、ＴＲＯＡＰ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２０Ａ、及びｃＢＩＲＣ５は、黒色腫がんで特に活性化される。図３４Ｂは、骨肉腫起源の細胞系（例えば、ＯＳ１７、ＯＳ２９、ＯＳ４０、及びＯＳ４８４）におけるパネルのメンバーの活性化を示す図であり、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ５－５０１、ＣＸＣＲ４、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＲＩＰ１３、ＣＤＫＮ３、ＭＣＭ１０、ＣＤＣ２０、ＴＲＯＡＰ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２０Ａ及びｃＢＩＲＣ５は骨肉腫で特に活性化される。図３４Ｃは、血管肉腫起源の細胞系におけるパネルのメンバーの活性化を示す図であり、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ５－５０１、ＭＭＰ１３、ＣＸＣＲ４、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＲＩＰ１３、ＣＤＫＮ３、ＭＣＭ１０、ＣＤＣ２０、ＴＲＯＡＰ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２０Ａ、及びｃＢＩＲＣ５が血管肉腫がんにおいて特に活性化されることを示している。
【図35】図３５Ａ、３５Ｂ、及び３５Ｃは、複数の異なるがん特異的プロモーター及びリンクされたバーコードを使用する多重検出アッセイの設計を示す図である。図３５Ａは、多重構築物の設計を示す図であり、各種がん特異的プロモーター（非記述的にＰｘ、Ｐｙ、及びＰｚとして指定される）を用いて、構築物を駆動するのに使用されるプロモーターに固有の介在する核酸バーコード配列（プロモーターＰｘ、Ｐｙ、及びＰｚのそれぞれのバーコードＡ、Ｂ、及びＣ）を有するルシフェラーゼへのシグナルペプチドの融合によって作成された直交レポーターの発現を駆動する。図３５Ｂは、等モル量でＨ１２９９細胞に個別にトランスフェクトされた場合の各プロモーター構築物の相対的発現を示す図であり、図３５Ｃは、等モル量でＨ１２９９細胞に組み合わせてトランスフェクトされた場合の各プロモーター構築物の相対的発現を示す図であり、同じ細胞への複数のレポーター－プロモーター構築物の同時トランスフェクションが、所与の細胞系における所与のプロモーターの発現パターンを感知できるほど変化させないことを示しており、多重フォーマットが、単一細胞タイプにおけるプロモーター活性化の「プロファイル」を生成するための実行可能なフォーマットであることを示している。
【図36】図３６Ａ、３６Ｂ、及び３６Ｃは、別々のプロモーターから駆動されるレポーターを検出するために複数の異なるペプチドエピトープを使用する多重検出アッセイの設計を示す図である。図３６Ａは、ＣＭＶプロモーターの異なるコピーが、構築物を駆動するのに使用されるプロモーターに固有の介在するエピトープペプチド（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｖ５、又はＨＳＶペプチドエピトープ）バーコードを有するルシフェラーゼへのシグナルペプチドの融合によって作成された直交レポーターの発現を駆動する、多重構築物の設計を示す図である（３６Ａは、使用されるＣＭＶプロモーターを示しているが、最終的には、図３５のＰｘ、Ｐｙ、Ｐｚなどの複数のはっきり異なるプロモーターが想定される）。図３６Ｂは、複数のエピトープバーコードをエピトープに特異的な捕捉抗体（例えば、抗ＦＬＡＧ、抗ＨＡ、抗Ｖ５、又は抗ＨＳＶ）と共に用いて、分泌されたレポーター構築物を分離し、各プロモーターについて活性の独立の測定値を取得する方法を示す図である。図３６Ｃは、細胞に同時トランスフェクトされたＦＬＡＧ／ＨＡ／Ｖ５／ＨＳＶバーコード化ルシフェラーゼ構築物を使用する例を示す図であり、各ペプチドエピトープでタグ付けされたルシフェラーゼ構築物を分離し、同じ細胞におけるプロモーター活性化を独立に読み取るのに使用できることを示している。
【図37】図３７Ａ、３７Ｂ、及び３７Ｃは、対応するパフォーマンスデータとともに、がん細胞系におけるプロモーター－レポーター構築物の活性化を検出するために、既製の側方流動アッセイ（例えば、妊娠ｈＣＧ側方流動イムノアッセイ）を使用するように設計されたレポーター－プロモーター構築物の設計を示す図である。この設計では、がん特異的プロモーター（Ｐｘ、この場合はスルビビンプロモーターで表される）を用いて、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エピトープにも融合した分泌シグナル修飾ルシフェラーゼの発現を駆動する。図３７Ｂは、Ｈ１２９９細胞への様々な関連構築物のトランスフェクションを介して、ｈＣＧタグがスルビビンプロモーターからのルシフェラーゼの発現を感知できるほどには妨害しないことを示している。図３７Ｃは、トランスフェクトされた細胞の上清をｈＣＧ用の市販の側方流動イムノアッセイストリップに負荷できること、及び側方流動イムノアッセイがｈＣＧタグ付きルシフェラーゼを検出できることを示す図であり、レポーターが、高信頼性の既製のアッセイを有するエピトープでタグ付けされているプロモーター－レポーター構築物の発現を読み取るのに既存のエピトープイムノアッセイを使用することの有用性を示している。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明の各種実施形態を本明細書において示し、説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更及び置換が、本発明から逸脱しない限りにおいて当業者では行い得る。理解すべき点として、本明細書に記載の本発明の実施形態の各種代替形態を使用できる。
【0034】
本開示についてより詳細に説明する前に、理解しておくべき点として、本開示が記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら、変わり得るものである。さらに理解すべき点として、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図しない。
【0035】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限及び下限の間の各中間値、及びその記載された範囲中の他の値若しくは中間値が本開示に包含されることは理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、そのより小さな範囲に独立に含まれ得るものであり、記載された範囲において具体的に除外される制限に従いつつ、本開示にやはり含まれる。記載された範囲が一方又は両方の限度を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除外する範囲も開示に含まれる。
【0036】
別断の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は均等の任意の方法及び材料もまた、本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで説明する。
【0037】
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、関連で刊行物が引用されている方法及び／又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、出願日より前の開示のためのものであり、本開示が事前開示のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、独立に確認する必要がある実際の公開日とは異なる場合があり得る。
【0038】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び図示された個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲又は精神から逸脱することのない限り、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。列挙された事象の順序で、又は論理的に可能ないずれか他の順序で、いずれか引用された方法を行うことができる。
【0039】
本開示の実施形態は、別断の断りがない限り、当業界の技術の範囲内である医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学、毒物学などの技術を使用するものである。そのような技術は、文献で完全に説明されている。
【0040】
留意すべき点として、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「支持体」への言及は、複数の支持体を含む。本明細書及び以下の特許請求の範囲では、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義される多くの用語に言及することになる。
【0041】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の断りがない限り、それらに帰する意味を有する。本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。本開示によって包含される方法及び組成物に適用される場合、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、本明細書に開示されているような組成物を指すが、追加の構造基、組成物成分又は方法段階（又は上記の類似物又は誘発体）を含み得る。しかしながら、そのような追加の構造基、組成物成分又は方法段階などは、本明細書で開示された対応する組成物又は方法のものと比較して、組成物又は方法の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない。
【0042】
各種実施形態を説明する前に、以下の定義が提供され、他に示されない限り、それらを使用するべきである。
【0043】
定義
「対象者」という用語は、ヒト又は非ヒト動物を含むことができる。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヒト疾患及び動物疾患と動物モデルの両方に適用可能である。好ましい対象者は、「患者」、すなわち、疾患又は状態の医療を受けている生存ヒトである。これには、病気の兆候について調査されている明確な病気のない人が含まれる。また、明確な病気を有する、又はそのリスクがあることが疑われる人も含まれる。
「対象者」という用語は、ヒト又は非ヒト動物を含むことができる。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヒト疾患及び動物疾患と動物モデルの両方に適用可能である。好ましい対象者は、「患者」、すなわち、疾患又は状態の医療を受けている生存ヒトである。これには、病気の兆候について調査されている明確な病気のない人が含まれる。また、明確な病気を有する、又はそのリスクがあることが疑われる人も含まれる。
【0044】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、遺伝的機能を有する単一の遺伝単位に隣接して関連する全ての調節及びコード配列を指す。遺伝子は、ポリアデニル化、転写調節、ＤＮＡコンホメーション、クロマチンコンホメーション、塩基メチル化の範囲と位置、及びこれら全てを制御するタンパク質の結合部位を指定するものを含む（これらに限定されるものではない）遺伝的機能を調節する非コード配列を含むことができる。タンパク質をコードする遺伝子は「エクソン」（コード配列）で構成されており、それは「イントロン」（非コード配列）によって中断されている場合がある。場合によっては、複数のタンパク質又は核酸その他の分子の複合体、あるいは上記のいずれか二つの複合体が、遺伝子の機能のために要求される場合がある。他方、遺伝子の遺伝的機能は、ＲＮＡ発現又はタンパク質産生のみを必要とし得るか、関連する発現なしにタンパク質及び／又は核酸の結合のみを必要とし得る。一定の場合で、互いに隣接する遺伝子が、一方の遺伝子が他方の遺伝子と重複するように配列を共有する場合がある。遺伝子は、生物のゲノム内、人工染色体、プラスミド、いずれか他の種類のベクター、又は別個の単離された実体として認められ得る。
【0045】
本明細書で使用される「エピソーム複製ベクター」又は「エピソームベクター」という用語は、代表的には宿主細胞のゲノムに組み込まれていないが、並行して存在するベクターを指す。エピソーム複製ベクターは細胞周期中に複製される可能性があり、この複製の過程で、ベクターコピーは、細胞分裂の前後に存在するコピーの数に応じて、得られる細胞に統計的に分布している。複製は宿主細胞の核内で起こり得るものであり、好ましくは細胞周期のＳ期中に複製する。さらに、エピソーム複製ベクターは、細胞周期のＳ期の間に宿主細胞の核内で少なくとも１回、すなわち１回又は複数回複製することができる。
【0046】
「サンプル」という用語は、本明細書に記載の分析的又は実験的方法で試験される任意の材料として定義される。サンプルは代表的には、本明細書に記載されている対象者から得られる。サンプルには、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか、身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は対象者からの呼気などがあるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態では、サンプルは、非侵襲的方法を介して得られる（例えば、非侵襲サンプルである）。例示的な非侵襲的方法には、体液の受動的収集、又は外部環境（例えば、表皮又は口）にアクセス可能な組織の傷を付けない掻き取りなどがあるが、これらに限定されない。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、粘液、汗、尿、便、精液、頸膣部分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、又は頬上皮綿棒採取物などがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、サンプルは、低侵襲的方法を介して得られる。例示的な低侵襲的方法には、毛細血管採取、静脈穿刺、胸腔穿刺、羊水穿刺、針吸引、又は胃洗浄などがあるが、これらに限定されない。例示的な低侵襲性サンプルには、血液又は血液画分（例えば、血漿又はＰＢＭＣ標本）、間質液、胆汁、胃液、及び羊水などがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、サンプルは生検によって得られる。例示的な生検サンプルには、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などがあるが、これらに限定されない。
【0047】
本明細書で使用される「複製起点」という用語は、複製起点を含むプラスミドの複製をもたらす複製開始因子又はＤＮＡレプリカーゼによって認識されるＤＮＡ配列を指す。「複製開始因子によって認識される」という表現は、複製開始因子が複製起点配列の全部又は一部と物理的に相互作用し、それによって最終的に、複製起点を含むＤＮＡ分子の全て若しくは一部を複製させる分子機序を引き起こしたり刺激することができることを意味するものである。したがって、複製起点は代表的には、機能的に必要な要素を含む。このような機能的に必要な要素の一例は、ＥＢＶ複製起点（ＯｒｉＰ）のリピートファミリー（ＦＲ）要素又は二回転対称（ＤＳ）要素である。機能的に必要な要素を含むさらなる複製起点は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２００１） ＧｅｎｅＴｈｅｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６：３３－４６に記載されている。本開示の親核酸プラスミドベクターは、好ましくは、少なくとも一つの複製起点を含む。
【0048】
「ベクター」は、他の動作可能に連結された異種又は組換え核酸配列を標的細胞に移すことができる核酸配列である。一部の例では、ベクターは、ミニサークル、プラスミド、ナノプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、ファージミド、バクテリオファージゲノム、又はバキュロウィルスゲノムである。適切なベクターには、バクテリオファージ又は植物、無脊椎動物若しくは動物（ヒトを含む）ウィルスに由来するベクター、例えばＣＥＬｉＤベクター、アデノ随伴ウィルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ－ＤＪ、又はＡＡＶ－ＤＪ８などのそれらのシュード型組み合わせ）、レトロウィルスベクター（例えば、ＭＬＶ又はその自己不活化若しくはＳＩＮバージョン、又はそれらのシュードバージョン）、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ－又はＥＢＶ系）、レンチウィルスベクター（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、又はＥＩＡＶ系、又はそれらのシュード型バージョン）、又はアデノウィルスベクター（例えば、複製欠損、複製能、又はヘルパー依存バージョンなどのＡｄ５系）がある。一部の実施形態において、ベクターは、複製能力のあるウィルス由来ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、複製能のないウィルス由来ベクターである。一部の場合において、ベクターは、足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）などの１以上の標的細胞型での複製を容易にするためのエピソーム維持要素を含み得る。Ｓ／ＭＡＲ要素は、ミニサークルなどの「裸の」核酸ベクターの文脈で複製を容易にするのに特に有用である。例示的な好適なＳ／ＭＡＲ要素には、免疫グロブリン重鎖遺伝子座からのＥμＭＡＲ、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座からのａｐｏＢ ＭＡＲ、ニワトリリゾチーム遺伝子座からのＣｈ－ＬｙｓＭＡＲ、及びヒトＩＦＮβ遺伝子座からのｈｕＩＦＮβ ＭＡＲなどがあるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、標的細胞で発現することができるコード配列を含み得る。したがって、本明細書で使用される場合、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」という用語は、対象遺伝子の発現を指示することができ、対象遺伝子を標的細胞に導入するのに有用な任意の核酸構築物を指すことができる。本明細書に記載のベクターはさらに、それからのｍＲＮＡの発現を安定化又は改善するための１以上のシス作用要素をさらに含み得る。そのようなシス作用要素には、例えば、Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． （５）１２：１０８０－１０８９（ｄｏｉ：１０． １００２／ｊｇｍ．４４４）又はＶｌａｓｏｖａ－Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ及びＳａｇａｒｓｋｙ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＩＳ－Ａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ （ｄｏｉ：１０． ５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ． ７２１２４）に記載されている要素のいずれかなどがあるが、これらに限定されない。
【0049】
ベクターの形態の一つとして、本明細書で使用される「ミニサークル」という用語は、ベクター上に存在する対象配列の持続的で高レベルの発現を提供する、小さな二本鎖環状ＤＮＡ分子を指し、その対象配列は、ポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードし得る。対象配列は、ミニサークルベクター上に存在する調節配列に作動可能に連結されており、前記調節配列はそれの発現を制御している。そのようなミニサークルベクターは、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる公開された米国特許出願第２００４０２４１３２９号に記載されている。異なる形態のベクターとして、「ナノプラスミド」は、最小化された細菌ＣｏｌＥ１又はＲ６Ｋ複製起点（細菌の宿主株において複製可能であるようなナノプラスミドを提供する）、細菌ＲＮＡ選択可能マーカー、及び真核生物遺伝子領域を含むことができるベクターを指す。そのようなナノプラスミドは、配列番号３のミニＲ６Ｋ起点及び／又は配列番号４のＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーを含むことができる。そのような要素（ナノプラスミド起点及びＲＮＡ－ＵＴ選択可能マーカー）のさらなる例は、例えば、ナノプラスミド配列要素を説明する目的で本明細書に参照により組み込まれるＵＳ９７３７６２０Ｂ２に記載されている。
【0050】
ミニサークルベクターの全長は、下記に記載される所望の要素を含むのに十分であるが、例えばその細胞を含む宿主への系投与を介した細胞との接触時にベクターが標的細胞に入る能力を許容できないレベルまで防止又は実質的に阻害するほど長いものではない。したがって、ミニサークルベクターは、一般に、少なくとも約０．３ｋｂの長さ、多くの場合少なくとも約１．０ｋｂの長さであり得るが、親ベクターは、６ｋｂ、１０ｋｂ、又はそれ以上の長さであることができる。
【0051】
ミニサークルベクターは、複製起点を欠くか、自然の複製起点を欠く（例えば、最小化された合成細菌複製起点を含み得る）、及び細菌プラスミドに共通に見られる選択マーカー、例えばｐ－ラクタマーゼ、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）、カナマイシン耐性（ｋａｎ）、又は他の抗生物質選択マーカーを欠くという点で、細菌プラスミドベクターとは異なる。その結果、ミニサークルのサイズが小さくなり、より効率的な送達が可能になる。ミニサークルは、ミニサークルベクターが切り出される親プラスミドのベクターバックボーン核酸配列に関連する導入遺伝子発現サイレンシング効果を欠いている。ミニサークルは、リコンビナーゼハイブリッド産物配列、及び対象配列、すなわち、発現に必要な転写配列及び調節配列以外のベクター配列を実質的に含まなくてもよい。
【0052】
本明細書で使用される「ナノプラスミド」という用語は、最小化された細菌ＣｏｌＥ１又はＲ６Ｋ複製起点（細菌宿主株において複製可能であるそのようなナノプラスミドを提供する）、細菌ＲＮＡ選択可能マーカー、及び真核生物の遺伝子領域を含むことができるベクターを指す。ナノプラスミドの一部の実施形態は、例えば、ＵＳ２０１５０２７５２２１Ａ１に記載されている。一部の実施形態において、ナノプラスミドは、融合細菌－ＲＮＡ選択可能マーカー／最小化された複製起点を含み得る。一部の実施形態において、融合細菌－ＲＮＡ選択可能マーカー／最小化された複製起点は、ナノプラスミドの真核生物遺伝子領域内に位置する合成イントロン内に位置し得る。
【0053】
ＲＮＡ選択可能マーカーは、染色体的に発現される標的遺伝子を調節してベクターの選択を提供する、ベクター媒介性の発現される非翻訳ＲＮＡである。これは、参照により本明細書に含まれるＣｒｏｕｚｅｔ Ｊ ａｎｄ Ｓｏｕｂｒｉｅｒ Ｆ ２００５ 米国特許第６，９７７，１７４号に記載されている、ナンセンス抑制可能な選択可能な染色体標的を調節するプラスミド由来のナンセンス抑制ｔＲＮＡであり得る。これはまた、プラスミド媒介アンチセンスリプレッサーＲＮＡ、ＲＮＡ－ＩＮ調節標的を抑制するＲＮＡ－ＯＵＴ遺伝子、ＲＮＡＩＩ調節標的を抑制するｐＭＢ１プラスミド起源コードＲＮＡＩ、ＲＮＡＩＩ調節標的を抑制するＩｎｃＢプラスミドｐＭＵ７２０起源コードＲＮＡＩ、Ｈｏｋ調節標的を抑制するプラスミドＲＩのＰａｒＢ遺伝子座Ｓｏｋ、ｆｌｍＡ調節標的を抑制するＦプラスミドのＦｌｍ遺伝子座ＦｌｍＢ、例えば、Ｗａｇｎｅｒ ＥＧＨ， Ａｌｔｕｖｉａ Ｓ， Ｒｏｍｂｙ Ｐ． ２００２． Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ ４６：３６１及びＦｒａｎｃｈ Ｔ， ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ Ｋ． ２０００． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：１５９に記載のものなどの別の天然アンチセンスリプレッサーＲＮＡ、又はＰａｒｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３１， ｐｐ．１７０－１７４ （２０１３）に記載されているＳｇｒＳ、ＭｉｃＣ又はＭｉｃＦ骨格のような小合成小ＲＮＡなどの操作リプレッサーＲＮＡであることもできる。
【0054】
本開示による細胞をトランスフェクトするための多くの好適な方法が利用可能である。「トランスフェクトされた」とは、外来核酸、通常はＤＮＡの取り込みに起因する細胞の変化を意味する。「トランスフェクション」という用語の使用は、外来核酸の導入を特定の方法に限定することを意図するものではない。したがって、適切な方法には、ウィルス感染／形質導入、接合、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどがある。方法の選択は、トランスフェクトされる細胞の種類とトランスフェクションが行われている状況（すなわち、イン・ビトロ、エクス・ビボ、又はイン・ビボ）によって決まる。これらの方法についての一般的な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， １９９５にあり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【0055】
「トランスフェクション剤」という用語は、宿主細胞、例えば、リポソームへのＤＮＡ又はＲＮＡの取り込みを媒介する任意の化合物を包含し得る。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ， １９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５、及び他の実験マニュアル（これらは参照により本明細書に組み込まれる。）にある。適切なトランスフェクション剤の例には、直鎖又は分岐ポリエチレンイミン、ナノ粒子、リポソーム、親油性粒子、固体ナノ粒子、両親媒性ペプチド、ミセル、デンドリマー、ポリマー組成物、ヒドロゲル、合成若しくは天然由来のエキソソーム、ウィルス様粒子、又はこれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【0056】
本明細書で使用される「ＥＸＯモチーフ」という用語は、エクソソームへのｍｉＲＮＡの負荷を制御するＲＮＡ配列を指す。一部の実施形態において、ＥＸＯモチーフは、エクソソームへのｍｉＲＮＡの負荷を制御すると記載されている、異種リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）へのｍｉＲＮＡの結合に介在し得る。そのような配列には、５’－ＧＧＡＧ－３’及び５’－ＣＣＣＵ－３’などがあるが、これらに限定されない。
【0057】
本明細書で使用される「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類縁体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、そして既知又は未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖短若しくは長ＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーなどがある。核酸分子は、直鎖又は環状であり得る。
【0058】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチドの転写を指示するＤＮＡ配列である。代表的には、プロモーターは、転写されるポリヌクレオチドの５′領域に位置し、そのようなポリヌクレオチドの転写開始部位の近位であることができる。より代表的には、プロモーターは第１のエクソンの上流の領域と；より代表的には、複数の転写開始部位の第１の上流の領域と定義される。非常に多くの場合、プロモーターは、そのプロモーターに対して３′である相補的ＤＮＡ鎖のそれぞれの上に位置する遺伝子の転写を指示することができる。別の言い方をすれば、多くのプロモーターは双方向性を示し、いずれかの方向（すなわち、遺伝子のコード領域に対して５′から３′又は３′から５′）に存在する場合、下流の遺伝子の転写を指示することができる。さらに、プロモーターはまた、上流要素などの少なくとも一つの制御要素を含み得る。そのような要素には、上流の活性化因子領域（ＵＡＲ）、及び任意に、合成上流要素などのポリヌクレオチドの転写に影響を与える他のＤＮＡ配列などがある。
【0059】
本明細書のポリペプチドに関して使用される場合の「コード配列」及び「コードする」という用語は、例えば、核酸が生細胞に存在し（イン・ビボ）、適切な調節配列（又は「制御要素」）の制御下に置かれる場合、ポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子を指す。コード配列の境界は、代表的には、５′（アミノ）末端の開始コドンと３′（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、ウィルス、原核生物若しくは真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウィルス、真核生物若しくは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列などがあり得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、所望に応じてエンハンサー、イントロン、ポリアデニル化部位などの追加の制御配列とともにコード配列に対して３′に位置し、プロモーターはコード配列に対して５′に位置し得るものである。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択された細胞が好むコドンを用いることで選択された細胞での発現に至適化して、所望のポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーを代表することができる。
【0060】
本明細書で使用される「バーコード」又は「バーコード分子」という用語は、一般に、バーコード／バーコード分子が結合している分子に関する情報を伝達する、又は伝達することができるラベル又は識別子を指す。バーコード／バーコード分子は固有のものであることができる。バーコード／バーコード分子には、各種の異なるフォーマットがあり得る。例えば、バーコード／バーコード分子は、ポリヌクレオチドバーコード；ランダム核酸及び／又はアミノ酸配列；及び合成核酸及び／又はアミノ酸配列を含むことができる。バーコード／バーコード分子は、可逆的又は不可逆的に分子に結合させることができる。バーコードは、例えば、サンプルの配列決定の前、最中、及び／又は後に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）サンプルの断片に加えることができる。バーコードは、個々の配列決定－読み取りの識別及び／又は定量化を可能にする。
【0061】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成されている要素の配置を指す。したがって、コード配列（例えば、レポーター発現カセット）に作動可能に連結されている所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にコード配列の発現を生じさせることができる。プロモーター又は他の制御要素は、それらがその発現を指示するように機能する限りにおいて、コード配列と隣接している必要はない。例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。
【0062】
本明細書で使用される「発現カセット」という用語は、対象の遺伝子／コード配列、並びにｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡを含む任意のＲＮＡ転写物の発現を指示することができる任意の核酸構築物を指す。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞に移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、又は「遺伝子移入ベクター」に構築することができる。したがって、この用語には、クローニング及び発現ビヒクル、並びにウィルスベクターが含まれる。
【0063】
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、遺伝子改変が望まれる細胞を指す。標的細胞は、単離することができるか（例えば、培養液中）、多細胞生物（例えば、胚盤胞、胎児、出産後動物など）にあることができる。
【0064】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、本開示のプローブが投与され、動物、より詳細にはヒトでの使用について連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されているか、米国薬局方その他の一般に認識されている薬局方に列記されている希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、液体、例えば水及びオイル、例えば動物、植物若しくは合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであることができる。医薬担体は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであることができる。患者に投与される場合、プローブ及び薬学的に許容される担体は無菌であることができる。プローブを静脈投与する場合、水は有用な担体である。生理食塩水及びデキストロース及びグリセロール水溶液も、特に注射用液剤用に、液体担体として使用することができる。適切な医薬担体には、グルコース、乳糖、ショ糖、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も含まれる。本組成物は、必要に応じて、少量の湿展剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。本組成物は、有利には、溶液、乳濁液、徐放性製剤、又は使用に適した任意の他の形態を取ることができる。
【0065】
「検出可能」という用語は、バックグラウンドシグナルよりもシグナルを検出する能力を指す。検出可能なシグナルは、前臨床使用に利用できる装置を用いて許容可能な画像を生成するのに十分な量と定義される。検出可能なシグナルは、本開示のプローブの１以上の投与によって発生させることができる。投与量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別及び体重、個体の特異体質反応、線量測定などの要因に応じて変動し得る。投与量は、機器やデジタル処理関連の要因によっても異なる。
【0066】
本明細書で使用される「イン・ビボイメージング」という用語は、生命を終わらせる犠牲を必要とせずに、生物の構造的、機能的、又は生理的状態を調べることができる方法又はプロセスを指す。
【0067】
本明細書で使用される「非侵襲的イン・ビボイメージング」という用語は、存在の構造的、機能的又は生理的状態が、身体の外側（皮膚）又は内側（アクセス可能な開口部）表面の物理的完全性を破壊する必要なく、遠隔物理的プロービングによって調べることができる方法又はプロセスを指す。
【0068】
「イメージング部分」は、対象者のヒト又は非ヒト動物の身体の外部で、又は血管内放射線又は内視鏡などの光検出器などのイン・ビボで使用するように設計された検出器、又は術中使用用に設計された放射線検出器の使用を介して検出することができる。イメージング部分は、好ましくは、イン・ビボ光学イメージングに適したレポーターであるが、これに限定されない。
【0069】
本明細書で使用される「生物発光」という用語は、生体分子、特にタンパク質による一種の化学発光を指す。生物発光の必須条件は、オキシゲナーゼの存在下で結合又は遊離した分子状酸素、基質に作用するルシフェラーゼ、分子酸素の存在下でのルシフェリンであり、基質を励起状態に変換し、それは、より低いエネルギーレベルに戻る時に、光の形でエネルギーを放出する。
【0070】
本明細書で使用される「ルシフェラーゼ」という用語は、発光反応を触媒するオキシゲナーゼを指す。例えば、細菌のルシフェラーゼは、フラビンモノヌクレオチドと脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、その反応によって光が生成される。海洋節足動物に見られる別の種類のルシフェラーゼは、ウミホタルルシフェリンの酸化を触媒し、別の種類のルシフェラーゼは、甲虫類のルシフェリンの酸化を触媒する。したがって、「ルシフェラーゼ」は、生物発光反応を触媒する酵素又は発光タンパク質を指す。ホタルやウミシイタケシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、触媒的に作用する酵素であり、生物発光生成反応時に変化しない。ルシフェリンが非共有結合的に結合しているエクオリンやオベリン発光タンパク質などのルシフェラーゼ発光タンパク質は、生物発光生成反応時にルシフェリンの放出によって変化する。ルシフェラーゼは、生物又はそれの変異体若しくは突然変異体、例えば、天然タンパク質とは異なる、熱又はｐＨ安定性などの１以上の特性を有する突然変異誘発によって産生される変異体に天然に存在するタンパク質である。ルシフェラーゼ及びそれの修飾突然変異体又は変異型が公知である。例えば、「ウミシイタケシフェラーゼ」への言及は、ウミシイタケ属の構成員から単離された酵素、又は他の花虫類などの他の供給源から得られた、又は合成的に製造された等価な分子を意味する。
【0071】
「生物発光タンパク質」は、生物発光開始剤分子基質に作用して生物発光を生成又は放出することができるタンパク質を指す。
【0072】
「生物発光開始剤分子」は、生物発光ドナータンパク質と反応して生物発光を生成することができる分子である。生物発光開始剤分子には、セレンテラジン、その類縁体、及びそれらの機能性誘導体などがあるが、これらに限定されない。セレンテラジンの誘導体には、セレンテラジン４００ａ、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｎ、セレンテラジン０、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｉｃｐ、セレンテラジン２－メチル、ベンジル－セレンテラジンビスデオキシセレンテラジン、及びディープブルーセレンテラジン（ＤＢＣ）（米国特許第６，０２０，１９２号、同５，９６８，７５０号及び同５，８７４，３０４号により詳細に記載されている。）などがあるが、これらに限定されない。
【0073】
一般に、セレンテラジンは、多種多様な生物発光タンパク質、具体的にはルシフェラーゼによって作用されると発光することが知られている。有用であるが非限定的なセレンテラジンが、２００１年１１月２日出願の米国特許出願第１０／０５３，４８２号（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。セレンテラジン類は、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びオレゴン州ユージーンのモレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社から入手可能である。セレンテラジン類はまた、例えばＳｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６１： ９１３－９２０； Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２３３： ３４９－３５３， １９９７； ａｎｄ Ｔｅｒａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４９： ３７－４３に記載の方法に従って合成することもできる。
【0074】
本明細書で使用される「スルビビン」という用語は、バキュロウィルスアポトーシスリピート阻害剤含有５すなわちＢＩＲＣ５とも呼ばれるタンパク質を指し、ヒトでは、ＢＩＲＣＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＧ０２９０６９．１）。スルビビンはアポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）ファミリーの構成員である。スルビビンタンパク質はカスパーゼ活性化を阻害することで、アポトーシス又はプログラムされた細胞死の負の調節をもたらす。これは、アポトーシスの増加と腫瘍増殖の減少につながるスルビビン誘発経路の破壊によって明らかにされている。スルビビンタンパク質は、ほとんどのヒト腫瘍及び胎児組織で高度に発現されるが、最終分化細胞では全く存在しない。スルビビンの発現も細胞周期によって高度に調節されており、Ｇ２－Ｍ期でのみ発現される。スルビビンが、有糸分裂中のチューブリンとの相互作用によって紡錘体に局在し、有糸分裂の調節に寄与する役割を果たす可能性があることが知られている。スルビビンの調節はｐ５３タンパク質に関連しているように思われる。それはまた、Ｗｎｔ経路の直接の標的遺伝子であり、β－カテニンによって上昇する。
【0075】
しかしながら、本開示のミニサークルは、標的細胞で発現されることが望まれるレポーター又は他の異種核酸配列に作動可能に連結された任意の腫瘍特異的プロモーターを利用し得ることが想到される。例えば、限定することを意図するものではないが、当技術分野で公知の好適なプロモーターには、黒色腫において腫瘍特異的なＣＸＣＲ４プロモーター；肺がんにおいて腫瘍特異的なヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター；ＴＲＰＭ４（一過性受容体電位－メラスタチン４）プロモーターは、前立腺がんで優先的に活性である；ストロメリシン３プロモーターは乳がん細胞に特異的である（Ｂａｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６９９）；非小細胞肺がん細胞に特異的なサーファクタントタンパク質Ａプロモーター（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：２９－３５）；ＳＬＰＩ発現性癌腫に特異的な分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）プロモーター（Ｇａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：４６－５０）；黒色腫細胞に特異的なチロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：３０７）；線維肉腫／腫瘍形成細胞に特異的なストレス誘発性ｇｒｐ７８ ／ ＢｉＰプロモーター（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： １６６０）；多形性膠芽腫細胞に特異的なインターロイキン－１０プロモーター（Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６４９：１２２）；脳腫瘍細胞に特異的なａ－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター（Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５５： ７６０）；扁平上皮がん、神経膠腫、及び乳房腫瘍細胞に特異的な上皮成長因子受容体プロモーター（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ２８２）；乳癌細胞に特異的なムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ２８２）；転移性腫瘍に特異的なｍｔｓ１プロモーター（Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ９１４６）；小細胞肺がん細胞に特異的なＮＳＥプロモーター（Ｆｏｒｓｓ－Ｐｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎｅｕｒｏｎ ５：１８７）；小細胞肺がん細胞に特異的なソマトスタチン受容体プロモーター（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ：１８４； Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６０：８４３）；ｃ－ｅｒｂＢ－３及びｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーターは乳がん細胞に特異的である（Ｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：２４７）；乳がん及び胃がん細胞に特異的なｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター（Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅｎｄｓ ２９：３）；甲状腺がん細胞に特異的なチログロブリンプロモーター（Ｍａｒｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ８０：４６８）；肝細胞がん細胞に特異的なα－フェトプロテインプロモーター（Ｚｕｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓ． １６２：３６）；胃がん細胞に特異的なビリンプロモーター（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． Ａ． Ｐａｔｈｏｌ． Ａｎａｔ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ． ４１３：３０３）；及び肝細胞がん細胞に特異的なアルブミンプロモーター（Ｈｕｂｅｒ， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：８０９９）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。）などがある。プロモーターの他の例は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、それらの機能性断片、又はそれらの任意の組み合わせである。
【0076】
さらなる定義は、以下の文脈で提供される。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、分子生物学の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は均等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が本明細書で記載されている。
【0077】
略語
ＳＥＡＰ、分泌胚性アルカリホスファターゼ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＳＰＥＣＴ、単光子放出コンピュータ断層撮影；ＭＣ、ミニサークル；ＰＰ、親プラスミド；ＷＰＲＥ、ウッドチャック肝炎ウィルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＲＯＩ、対象領域；ＡＵＣ、曲線下面積；ＲＧ、レポーター遺伝子；ＴＳ、腫瘍特異的；Ｆｌｕｃ（ＦＬＵＣ）、ホタルルシフェラーゼ、ＲＯＣ（受信者動作特性）。
ＳＥＡＰ、分泌胚性アルカリホスファターゼ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＳＰＥＣＴ、単光子放出コンピュータ断層撮影；ＭＣ、ミニサークル；ＰＰ、親プラスミド；ＷＰＲＥ、ウッドチャック肝炎ウィルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＲＯＩ、対象領域；ＡＵＣ、曲線下面積；ＲＧ、レポーター遺伝子；ＴＳ、腫瘍特異的；Ｆｌｕｃ（ＦＬＵＣ）、ホタルルシフェラーゼ、ＲＯＣ（受信者動作特性）。
【0078】
緒言
がんの早期発見は、利用可能な治療戦略の有効性を劇的に改善することができる。しかし、血液ベースのバイオマーカーがん検出に関する数十年の努力にもかかわらず、多くの有望な内因性バイオマーカーは、非悪性組織からの高変動性のバックグラウンド発現などの解決困難な問題のために臨床的に不首尾であった。がん診断改善のための戦略は、伝統的に、分子イメージング又は血液ベースのアッセイのいずれかを介して、がん細胞で過剰発現される内因性分子の測定に依存するものであった。これらの戦略の課題は、多くの場合、非がん性組織内での有意な発現であり、それによって高バックグラウンドレベル及び混乱を生じるような結果につながる。別途戦略は、腫瘍内で厳密に固有のレポーター遺伝子（ＲＧ）の発現を促進するために、外因的に送達された遺伝子ベクターで腫瘍特異的（ＴＳ）タンパク質のプロモーターを利用するというものである。この戦略を実現するためには、安全性、特異性及び感度が最大限重要である。ウィルスベクターより安全ではあるが、非ウィルスベクターの二つの欠点は、遺伝子導入率が低いこと及び一過性の発現プロファイルであった。ミニサークル（ＭＣ）は、細菌バックボーンを欠くプラスミドであり、上記の重要な問題を克服する上で有利である。
がんの早期発見は、利用可能な治療戦略の有効性を劇的に改善することができる。しかし、血液ベースのバイオマーカーがん検出に関する数十年の努力にもかかわらず、多くの有望な内因性バイオマーカーは、非悪性組織からの高変動性のバックグラウンド発現などの解決困難な問題のために臨床的に不首尾であった。がん診断改善のための戦略は、伝統的に、分子イメージング又は血液ベースのアッセイのいずれかを介して、がん細胞で過剰発現される内因性分子の測定に依存するものであった。これらの戦略の課題は、多くの場合、非がん性組織内での有意な発現であり、それによって高バックグラウンドレベル及び混乱を生じるような結果につながる。別途戦略は、腫瘍内で厳密に固有のレポーター遺伝子（ＲＧ）の発現を促進するために、外因的に送達された遺伝子ベクターで腫瘍特異的（ＴＳ）タンパク質のプロモーターを利用するというものである。この戦略を実現するためには、安全性、特異性及び感度が最大限重要である。ウィルスベクターより安全ではあるが、非ウィルスベクターの二つの欠点は、遺伝子導入率が低いこと及び一過性の発現プロファイルであった。ミニサークル（ＭＣ）は、細菌バックボーンを欠くプラスミドであり、上記の重要な問題を克服する上で有利である。
【0079】
本開示は、ほぼ専ら腫瘍を有する対象者において血液中で検出され得る分泌可能なレポーター遺伝子の発現を駆動するために汎腫瘍特異的スルビビンプロモーターを利用する、安全で腫瘍活性化可能なミニサークルの全身投与に基づく代替の有利な検出戦略の実施形態を提供する。全身投与後、単に血液レポーターレベルを測定することで、最長２週間にわたり、実験的ヒト黒色腫転移を有するマウスを、腫瘍のない対象者から区別する強力な能力が示された。レポーターレベルの累積変化によっても腫瘍を有する対象者が確認され、受信者動作特性曲線分析は、０．９１８±０．０８４のＡＵＣで、この試験の成績を強調するものであった。肺腫瘍量は、累積レポーターレベルと相関し（ｒ２＝０．７１４；ｐ＜０．０５）、疾患の程度の決定が可能であることを示していた。本発明者らのシステムの継続的な開発は、腫瘍における時間的に制御された高いレポーター発現により腫瘍の検出可能性を劇的に改善する可能性があり、健常組織からのバックグラウンドがほぼゼロになる可能性がある。
【0080】
分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又はホタルルシフェラーゼ（ＦＬＵＣ）のいずれかの発現を駆動する腫瘍特異的ナノプラスミドベクターが開発され、血液及び／又は画像ベースのアッセイを用いて全身投与後の腫瘍を検出することのそれらの有用性が検証された。がんスクリーニングの目的で使用される遺伝子ベクターの場合、課題には、効率的な腫瘍送達、最大感度のための強力な発現の達成、腫瘍特異性を達成するための発現の厳密な制御、及び安全性上の懸念の最小化などがある。腫瘍特異的ミニサークルベクターはこれら全ての課題を克服することができ、全身投与された腫瘍特異的ミニサークルベクターを血清及び非侵襲的イメージングを介してアッセイして、腫瘍を有する対象者を正常対象者から区別して識別することができることが明らかになっている。重要な点として、スルビビンプロモーターが多くの異なる腫瘍型の腫瘍細胞にわたって発現を駆動することから、本開示の腫瘍特異的ミニサークルベクターは、多くの患者集団において有利に幅広い適用性を有する。本開示の腫瘍特異的ミニサークルベクターは、初期血液ベースのアッセイを介した腫瘍検出、分子遺伝学的イメージングを介した腫瘍位置確認、及びセラノスティック腫瘍特異的ミニサークルベクターを使用する腫瘍治療が関与する、新規ながん管理パラダイムを提供する。
【0081】
本開示は、腫瘍細胞の検出に最も有利な核酸ナノプラスミドベクターの実施形態を包含する。特に、本開示のミニサークルは、腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団を含む組織において選択的に発現されることが望まれるヌクレオチド配列に作動可能に連結された腫瘍特異的プロモーターを組み込んでいる。本開示の一部の実施形態において、ミニサークルベクターは、レポーターとして有用なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された腫瘍特異的プロモーターを含む。したがって、レシピエント腫瘍細胞によって発現される場合、レポーターは検出可能であり得て、それにより、腫瘍細胞の視覚的画像及び／又は対象者であるヒト又は非ヒト動物の組織におけるその位置などの情報を提供する。
【0082】
一部の実施形態において、本開示によるナノプラスミドベクターは、発現可能なレポーター遺伝子を腫瘍細胞に有利に送達することができる。レポーター遺伝子が、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、発光イメージングなどの非侵襲的検出方法によって検出可能であることは、本開示の範囲内である。例えば、限定することを意図したものではないが、ＭＲＩレポーター遺伝子はクレアチンキナーゼ；チロシナーゼ；トランスフェリン受容体；フェリチン；Ｍａｇ Ａをコードする。ＰＥＴイメージングレポーター遺伝子には、単純ヘルペスウィルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ；Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ；ドーパミン２受容体（Ｄ２Ｒ、突然変異体Ｄ２ＲＡ８０など）；ソマトスタチン受容体；エストロゲン受容体（ｈＥＲＬ）；ドーパミン輸送体；ヨウ化ナトリウム共輸送体；カテコールアミン輸送体；１３－ガラクトシダーゼなどがあるが、これらに限定されるものではない。ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージングレポーター遺伝子には、単純ヘルペスウィルス１型チミジンキナーゼ及びＨＳＶ１－ｓｒ３９ｔｋなどの複数の最適化された変異体；ドーパミン２型受容体；ヨウ化ナトリウム共輸送体；ソマトスタチン２型受容体；ヒトノルエピネフリン輸送体；ヒトエストロゲン受容体ａ；ヒトデオキシシチジンキナーゼの変異体；及び組換えがん胎児性抗原などがあるが、これらに限定されない。生物発光レポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ（ｆｌ）；合成ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈｒｌ）；強化された緑色蛍光タンパク質（ｅｇｆｐ）；赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）；単量体赤色蛍光タンパク質（ｍｒｆｐ １）などがあるが、これらに限定されるものではない。本開示のミニサークルに組み込むのに適したレポーター遺伝子が、イメージングのマルチモダリティ方法を提供することがさらに可能である。例えば、限定することを意図するものではないが、光音響、ＭＲＩ及びＰＥＴイメージングに適したレポーター遺伝子は、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１３）， Ｓｃｉ． Ｒｐｔｓ． ３：Ａｒｔ．Ｎｏ．：１４９０（全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に記載のヒトチロシナーゼをコードする遺伝子である。
【0083】
レシピエント腫瘍細胞を選択的に検出するための本開示のナノプラスミドの有利な使用に加えて、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、対象者であるヒト又は非ヒト動物から標的腫瘍細胞を低減又は排除することを目的としたレシピエント腫瘍細胞の増殖又は代謝活性を調節するのに有用なポリペプチドをコードすることができる。
【0084】
例えば、限定することを意図するものではないが、腫瘍細胞を標的化し、治療的に攻撃するのに有利な治療的に有効なポリペプチドには、ＨＳＶｔｋ；シトシンデアミナーゼ；ＤＴジアホラーゼ；ニトロレダクターゼ；グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ；チミジンホルホリラーゼ；カルボキシルエステラーゼ；フォリルポリグルタミルシンテターゼ；カルボキシペプチダーゼＡｌ；カルボキシペプチダーゼＧ２；シトクロムＰ－４５０（ＣＹＰ２Ｂ１）などがある。プロドラッグを効果的な治療用組成物に変換するためのこれらのポリペプチドの活性は、例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：１４８－１６９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【0085】
本開示のさらなる実施形態において、ミニサークルから腫瘍特異的に発現されるヌクレオチド配列は、異種ポリペプチドに翻訳され得るのではなく、むしろ、やはりレシピエント腫瘍細胞の増殖又は代謝活性を調節する、レシピエント腫瘍細胞の少なくとも一つの遺伝子調節要素と相互作用することができる短い干渉リボヌクレオチド配列（ｓｉＲＮＡ）として発現され得ることが想到される。あるいは、ヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ配列（ｍｉＲＮＡ）として、又は既知の内因性配列に対応せず、核酸ハイブリダイゼーション又は増幅に基づく技術（核酸バイオマーカー）によって検出可能な薬剤であるという目的のみを果たす合成ＲＮＡ配列として発現され得ることが想到される。
【0086】
したがって、イン・ビトロで、又は最も有利には、イン・ビボで培養された腫瘍細胞を選択的に標的化して、対象者におけるがん性細胞又は腫瘍細胞の集団を確認及び／又は位置特定する検出可能なシグナルものを得るの有用な、並びに標的腫瘍細胞に治療薬（ペプチド、ポリペプチド、核酸）を送達するのに有用な核酸ミニサークルベクター（及びその親プラスミド）の実施形態を提供することが本開示の範囲内であることが想到される。
【0087】
本開示は、標的化された腫瘍細胞又は複数の細胞（腫瘍組織を含む）の存在を検出する目的で、対象者のヒト又は非ヒト動物に投与するのに有用な核酸ミニサークルベクターを提供する。例えば、図３に示され、図１３に示された配列番号１のヌクレオチド配列を有するミニサークル構築物ＭＣ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡは、腫瘍特異的プロモーターｐスルビビンに作動可能に連結された検出可能なポリペプチド分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする核酸断片を含む。
【0088】
培養黒色腫細胞、皮下黒色腫異種移植片、又は腫瘍が発生した動物に静脈送達される場合、本開示のミニサークルベクターは、血清分泌アルカリホスファターゼポリペプチドとして、又は図４に示されるように（及び図１４に示されるような配列番号２のヌクレオチド配列を有する）、ＳＥＡＰがルシフェラーゼレポーターによって置き換えられたミニサークルベクター構築物での生物発光シグナルとして検出可能なシグナルを提供する。したがって、本開示のミニサークル構築物は、レシピエント動物又はヒトにおいて、転移性腫瘍細胞又は限局性腫瘍の両方を確認できることが実証されている。
【0089】
本開示はさらに、ミニサークル核酸を前記腫瘍細胞に送達することによって、標的腫瘍細胞の生理学又は増殖を調節し、標的細胞が腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結された核酸配列からヌクレオチド配列を発現することを可能とし、発現された産物が標的細胞と相互作用することを可能とし、それにより、細胞又は複数の細胞の生理学的状態を改変する方法を提供する。
【0090】
第１の例において、本開示は、腫瘍特異的プロモーターがスルビビンプロモーター（これに限定されない）などである核酸ミニサークルの実施形態を提供する。
【0091】
したがって、内因性バイオマーカー検出の限界を克服するために、本開示は、腫瘍駆動型バイオマーカーを産生する、外因的に送達された遺伝的にコードされたレポーターの血液ベースの検出を使用する腫瘍を有する個体の確認に基づく戦略の実施形態を提供する。この戦略の主な利点は、専ら特定の表現型の細胞（つまり腫瘍細胞）でバイオマーカー発現を調整して、非悪性組織からのタンパク質産生による偽陽性の数を減らすことができることである。したがって、分泌可能なレポーター遺伝子をコードする腫瘍活性化可能ベクターの全身投与を用いて、腫瘍を有する対象者を確認することができるが、ただし、図１に示したように、腫瘍特異的プロモーター（腫瘍にのみ存在するタンパク質を発現する遺伝子のプロモーター）を用いて、トランス遺伝子発現をがん細胞に転写的に標的化した。この戦略を臨床に翻訳するには、安全性、特異性、感度、及び幅広い適用性が重要であり、本開示のシステムの各構成要素は、最大の翻訳の可能性を提供するように選択した。具体的には、本開示は、スルビビンプロモーター（ｐＳｕｒｖ）など（これに限定されない）の腫瘍特異的プロモーターの使用を通じて腫瘍特異性を獲得するヒト分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（これに限定されない）を含むレポーター遺伝子をコードする非ウィルス性腫瘍活性化可能ミニサークル（ＭＣ）を提供する。
【0092】
ウィルスベクターより安全であるが、従来の非ウィルスベクター（すなわち、プラスミド）の二つの欠点は、低い遺伝子導入速度及び一過性の発現プロファイルである。ＭＣは本質的に、細菌の増殖にのみ必要な原核生物のバックボーンを欠くプラスミドである。ＭＣは、サイズが比較的小さく、プロモーターのサイレンシングが少ないため、プラスミド対応物と比較して、発現プロファイルの改善（非分裂細胞の月数、分裂細胞の週数）を示すことが何度も明らかにされている（Ｄａｒｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４： １３４１－１３４９； Ｄａｒｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６： ２０９－２１８； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８： ４９５－５００； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１： ８５６－８６４）。ＭＣは、抗生物質耐性遺伝子を含む構築物よりもヒトへの投与が安全であることが知られている規制上の「抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミド」（ｐＦＡＲ）の原則（Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． １２： ３２３－３３２）にも準拠している。さらに、ＭＣの生産は伝統的に非常に労働集約的で時間のかかるものであったが、ＭＣ生産スキームのより最近の進歩により、比較的簡単かつ低コストで短期間に大量生産が可能になった（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１０ ）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２８：１２８７－１２８９）。最後に、統合は多くの遺伝子（特にウィルス）ベクターの安全上の懸念事項であるが、直接局所注射やエレクトロポレーションなどの効果的なイン・ビボ送達方法でも、非ウィルスベクターの統合速度は、自発的な遺伝子不活化突然変異の速度の約１～３桁低い（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１： ７１１－７２１； Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２： ３０－３９； Ｌｅｄｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ １０４： ３３－４３； Ｌｅｄｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， （２０００）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３： ２５８－２７２）。したがって、ＭＣは、翻訳の可能性、効力、及び安全性の観点から、最も有用な非ウィルスベクタープラットフォームの一つになっている。
【0093】
ＳＥＡＰは、一般的に使用される分泌可能なレポータータンパク質であり、多くの理想的な特徴を有する。これは、胚発生時にのみ発現される、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）の人工的なＣ末端切断分泌型である。したがって、これは通常は血液中には見られないユニークなレポーターであり、バックグラウンドはほぼゼロでなければならない（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６６：１－１０）。ＰＬＡＰと比較して、ＳＥＡＰは非常に熱安定性がある。したがって、サンプルを６５℃に加熱することにより、ＳＥＡＰを特異的にアッセイすることができる（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１７２－１７４， ７６－１７７）。市販のＳＥＡＰ検出アッセイは、少なくとも４対数位数の濃度範囲で非常に感度が高く、検出限界はピコグラム／ｍＬの範囲である。ＳＥＡＰは、臨床への翻訳に有利なタンパク質ベースのレポーターでもあり、その理由は、１）それが、マウス及び大型動物における非ウィルス遺伝子導入の効果的な縦断的モニタリングを示している（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２３：２１５－２２４）；２）それのヒト起源は、免疫応答性マウスにおけるマウスＳＥＡＰ（ｍｕ－ＳＥＡＰ）で示されたものと同様の患者における低下若しくはゼロ免疫原性可能性を有し得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｇｅｎｅ ２７９：９９－１０８）；３）ＳＥＡＰが、臨床で、ＨＰＶ１６／１８ＡＳ０４アジュバントワクチンの投与後の抗体レベルを監視するために使用されている（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．， （２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：３６０８－３６１６）からである。
【0094】
本開示のシステムは、ＳＥＡＰの発現を駆動するのにｐＳｕｒｖを利用する。スルビビンはアポトーシス阻害剤ファミリーのメンバーであり、有糸分裂の進行を制御し、細胞死を防ぐのに役立ち、黒色腫、肝臓、肺、乳房、結腸、卵巣などの多くのがんで過剰発現されるが、健常成人組織では過剰発現しない（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１： １０８０－１０８５； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１： ７４０－７４７； Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： ３３０－３３８）。したがって、ｐＳｕｒｖは、肺がん、黒色腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、及び肝臓がんのモデルで実証されているように、腫瘍の転写標的化に有利である（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： ３３０－３３８； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ８： １２３２－１２４２； ｖａｎ Ｈｏｕｄｔ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ １０４： ５８３－５９２； Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８： ６０６－６１２； Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６： １８４８－８５６）。したがって、本開示の腫瘍特異的プロモーター駆動腫瘍活性化可能ＭＣは、多数の腫瘍タイプ及び患者集団にわたる効果的ながんスクリーニングのための幅広い適用性を提供するものである。
【0095】
したがって、診断用腫瘍活性化可能ＭＣが、遺伝的にコードされたがんバイオマーカーの血中レベルを測定することによって、ＭＣの全身投与後に腫瘍を有する対象者を健常対象者から区別する能力について開発及び試験されてきた。送達については、ＭＣを、免疫原性を全く持たないこと（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， （２００８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． ２５：２９７２－２９８２）、動物に繰り返し投与する能力を有し、全身（尾静脈）投与後のマウスでの原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両方を効率的にトランスフェクトする能力（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ１１０：１４７１７－１４７２２； Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１）） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７：１２３－１２９）を有することが示されている非標的トランスフェクション剤と比較した。結果は、腫瘍活性化可能なＭＣの使用が、安全で効果的ながんスクリーニングのための有利な有望なプラットフォーム技術であることを示している。このシステムは、腫瘍再発のリスクが高い患者をモニタリングした後、腫瘍診断の前にリスクの高い集団をスクリーニングするのに役立ち、一般集団のスクリーニングに有利であり得る。
【0096】
本開示による外因的に送達された遺伝子コード化がん血液バイオマーカーベクター戦略は、健常組織における高いバックグラウンド発現及び経時的なバイオマーカー発現における不規則な変動などの内因性がん血液バイオマーカーを標的とするがんスクリーニングの固有の制限のいくつかを克服することができる。本開示は、単純で比較的安価な血液ベースのアッセイを用いて腫瘍を有する対象者を確認するために全身投与することができる腫瘍活性化可能なＭＣシステムの実施形態を提供する。このアッセイは、信頼性の高い検出能力と疾患範囲の評価を示し、非常に堅牢で安全ながんスクリーニングシステムとしての腫瘍活性化可能なＭＣの実現可能性を示している。
【0097】
がん遺伝子療法の研究は、非標的細胞又は正常細胞における望ましくない効果を回避するために、特に腫瘍内で治療用導入遺伝子を発現させる方法を探し求めてきた。この目標を達成するために、腫瘍特異的プロモーターを使用した腫瘍の転写標的化（Ａｉｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：６０６－６１２； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｓ． ３０７：７５９－７６４； Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． １４：４７－５５）、内因性ｍｉＲＮＡ調節を使用した健常組織における転写サイレンシング又は抑制（Ｃａｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， （２００９） ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ５： ｅ １ ０００４４０； Ｒｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：１００６－１０１３）、ウィルス（転写ターゲティング）及び非ウィルスベクターの両方の腫瘍指向性の増強（Ｃｈｉｓｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６９： ２６５５－２６６２； Ｂａｃｈｔａｒｚｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ５：１２３１－１２４０）、又はこれらの戦略の組み合わせ（Ｔｓｕｒｕｔａ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｃｌｉｎ． ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． １４：３５８２－３５８８； Ｓｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｃｌｉｎ． ＣａｎｃｅｒＲｅｓ １７：２８０７－２８１８）を含むいくつかの戦略が検討されてきた。本開示のシステムは、がん検出の目的で分泌可能なレポーター遺伝子を発現する手段を提供する。遺伝子ベクターのこの適用により、潜在的なスクリーニングツールとして、がんの明確な肉眼でわかる証拠がなくてもベクターを患者に使用できるため、増大した安全性の懸念を克服するという追加の課題が生じる。したがって、このタイプのシステムの全ての構成要素は、送達ビヒクル（必要な場合）、ＤＮＡベクター自体、及び導入遺伝子（発現される場合）を含めて安全である必要がある。
【0098】
多くの送達製剤が当技術分野で知られており、本開示のＭＣシステムと共に使用することが想到されるが、望ましい安全性プロファイルを有し（すなわち、免疫刺激なし）（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． ２５：２９７２－２９８２）、Ｉ／ＩＩ相臨床試験中（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３５４１６）であるイン・ビボトランスフェクション剤が特に好まれた。さらに、非ウィルスベクターはウィルスベクターよりはるかに安全であるが（すなわち、低い／ほぼゼロの統合率、低い免疫原性可能性）、従来のプラスミドのバックボーンにおける免疫刺激性原核生物のＣｐＧモチーフに関する懸念が依然としてある。これらのベクターが原核生物のバックボーンを欠いているか、細菌領域のサイズが小さい（５００ｂｐ未満）ため、ＭＣ及び／又はナノプラスミドでは、この懸念は軽減される。ＳＥＡＰはヒト由来であるため、免疫原性反応を引き起こさないはずであるし（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００１）Ｇｅｎｅ ２７９：９９－１０８）、臨床ですでに有望であることが示されている（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：３６０８－３６１６）ことから、ＳＥＡＰを選択した。
【0099】
以前は、ウィルス感染を用いて、ウィルスのＯｒｉＰプロモーター／複製起点を使ってエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）に感染した鼻咽頭がん（ＮＰＣ）でインターフェロン－γの発現を駆動するＭＣ－ＯｒｉＰ－ＩＦＮγ（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１９４０７）などのがん特異的遺伝子構築物を駆動していた。対照的に、本開示のＭＣシステムは、ウィルス感染細胞を超えて多くの異なる腫瘍タイプに広く適用可能である可能性がある。本開示の非ウィルスＭＣベクターは、血液ベースのアッセイを使用するがんスクリーニングで使用するために開発された。
【0100】
がん検出のための腫瘍活性化可能なレポーター遺伝子発現ベクターが開発されているが（Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７： １２３－１２９； Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ＆ Ｔｒｅａｔ． ２： １７１－１８０； Ｗａｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｍｏｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ． １３： ４５２－４６１； Ｗａｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９： ５４５－５５２； Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６： ｅ１９５３０）、しかしながら、これらの場合に使用されるベクターシステム（アデノウィルス、単純ヘルペスウィルス、及びプラスミド）は、臨床翻訳を妨げる安全性の問題を有する。ウィルスは免疫原性が高く、ヒトにおける既存のウィルス免疫は広範囲にわたる問題である（Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６： ｅ１９５３０； Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４： ７１７９－７１８５； Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ １６： １６０９－１６１６）。プラスミドは、原核生物のバックボーン（プラスミド産生にのみ必要）におけるメチル化されていないＣｐＧ配列があるため免疫原性であることができ（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０： ２１５３－２１６１）、代表的には、内因性細菌叢に対するコードされた抗生物質耐性遺伝子を有する（Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． １２： ３２３－３３２）。したがって、本開示の腫瘍活性化可能ＭＣは、これらの他のベクターに勝る利点を有し、主に（ウィルスと比較して）より容易な製造実務及びより望ましいプロファイルのために翻訳の可能性を提供するものである。
【0101】
本開示のＭＣ及び／又はナノプラスミドシステムは、二つの機序：１）ＭＣ投与前にＳＥＡＰが全く検出できないので、血液中のバイオマーカーの独自性；及び２）腫瘍内で厳密に発現を駆動することによる、健常な腫瘍のない対象者のシグナルを軽減する能力を通じて改善された特異性を提供することができる。ＭＣを投与されている腫瘍のないマウスからのわずかなＳＥＡＰシグナルは、ｐＳｕｒｖの漏出による可能性がある。しかしながら、本開示のＭＣシステムは、この特定のプロモーターに限定されるものではなく、別の腫瘍活性化可能プロモーター、例えばＩｄｌ又はｈＴＥＲＴプロモーター（Ｗａｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｍｏｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ． １３： ４５２－４６１； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８２： １１５４－１１６１）などが本開示のＭＣにおいて有用であることが想定される。また、内因性バイオマーカーを使用した感度は、腫瘍によって産生されるバイオマーカーの量によって本質的に制限される（Ｈｏｒｉ ＆ Ｇａｍｂｈｉｒ （２０１１） Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ． ３：１０９ｒａ１１６）。対照的に、本開示のＭＣシステムの感度は変更することができる。
【0102】
内因性血液バイオマーカーの利点の一つは、それらを用いて、人がどのタイプのがんを抱えている可能性があるかを決定できることである（例えば、高いＰＳＡレベルは、前立腺がんを示し得る）。しかしながら、本開示によって提供されるＭＣシステムはまた、特定の腫瘍タイプではなく、全てのがんについてスクリーニングを行うのに有利である。さらに、前立腺がんの前立腺特異抗原エンハンサー／プロモーターの変異体など、特定のがんのリスクが高い患者をスクリーニングするのに有用な代替プロモーター（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． １４：４７－５５； Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ １０：５４５－５５２； Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１２５－１３２）又は乳がんのムチン－１プロモーター（Ｈｕｙｎ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １５：３１２６－３１３４）などを本開示のＭＣシステムに組み込むことができることが想到される。
【0103】
外因性バイオマーカー（すなわち、レポーター）の別の制限は、バイオマーカーが由来する体内の部位を位置決定できないことである。ＳＥＡＰをイメージングレポーター遺伝子（例えば、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ ＳＳ（２００６） Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． １（６）：３０６９－７５に記載されている、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用の単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ１）で置き換えるか、それと共発現させることにより、本開示のシステムはまた、腫瘍の位置を視覚化することを可能にすることができる。バン（Ｂｈａｎｇ）らは最近、適切なイメージングレポーター遺伝子を発現する腫瘍活性化可能プラスミドの全身投与後、ＢＬＩと単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）の両方を用いて腫瘍をイメージングする能力について記載した（Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７：１２３－１２９）。この戦略は、蛍光立体顕微鏡を使用したがんの可視化のためにこれらのベクターが蛍光タンパク質を共発現したため、これまでに記載されたＳＥＡＰ発現ウィルスベクターでも追求された（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ＆ Ｔｒｅａｔ． ２： １７１－１８０； Ｗａｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｍｏｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ． １３： ４５２－４６１； Ｗａｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９： ５４５－５５２）。さらに、二つのレポーターを発現する一つのベクトルシステムではなく。特定の用途のために設計された二つの異なるベクターを送達することが可能であることが想到され、一つは分泌可能なレポーターを発現するがんスクリーニング用で、もう一つはイメージングレポーターを発現する腫瘍の位置決定用である。
【0104】
したがって、本開示の１態様は、腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む組換え核酸ミニサークルベクターの実施形態を包含し、非腫瘍細胞によるより、レシピエント腫瘍細胞による方がより高いレベルでの発現を生じる。
【0105】
本開示のこの態様の実施形態において、腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターは、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
【0106】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、ポリペプチドとして発現され得る。
【0107】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、レポーターポリペプチドをコードすることができる。
【0108】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、レポーターポリペプチドは、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター；ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【0109】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）であることができる。
【0110】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、組換え核酸ミニサークルベクターは、配列番号１による核酸配列を有することができる。
【0111】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、生物発光レポーターであることができる。
【0112】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、組換え核酸ミニサークルベクターは、配列番号２による核酸配列を有することができる。
【0113】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は治療上有効なポリペプチドとして発現され得る。
【0114】
本開示の別の態様は、腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターに作動可能に連結され、非腫瘍細胞によるよりレシピエント腫瘍細胞によってより高いレベルで発現可能なヌクレオチド配列を含む組換え核酸ミニサークルベクター、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物であって、（ｉ）腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができ、及び（ｉｉ）腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列が、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、又はそれらの任意の組み合わせをコードするポリペプチドとして発現され得る組成物の実施形態を包含する。
【0115】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、組換え核酸ミニサークルベクターは、配列番号１又は配列番号２による核酸配列を有することができる。
【0116】
本開示のさらに別の態様は、ヒト又は非ヒト対象者において腫瘍細胞を検出する方法であって、次の段階：（ｉ）第１の対象者であるヒト又は非ヒト動物に、腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターに作動可能に連結され、非腫瘍細胞よりもレシピエント腫瘍細胞によってより高いレベルで発現可能なヌクレオチド配列及び薬学的に許容される担体を含む組換え核酸ミニサークルベクターを含む薬学的に許容される組成物であって、ａ）腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができ、（ｂ）腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列が、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、又はそれらの任意の組み合わせをコードするポリペプチドとして発現され得る組成物を送達する段階、並びに（ｉｉ）第１の対象者における発現産物を検出する段階であって、前記発現産物が、ミニサークルベクターの腫瘍特異的遺伝子発現プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列から生成され、前記発現産物の検出が、第１の対象者の腫瘍細胞の存在を示す段階を含む方法の実施形態を包含する。
【0117】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、発現産物は血清ポリペプチドであることができ、段階（ｉｉ）は、第１の対象者から血清サンプルを取得すること、及びミニサークルベクターから生成された発現産物の血清レベルを決定することを含み得る。
【0118】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、検出される発現産物は、分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）であることができる。
【0119】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ミニサークルベクターは、配列番号１による核酸配列を有することができる。
【0120】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、発現産物は生物発光ポリペプチドであることができ、段階（ｉｉ）は、発現産物に由来する検出可能なシグナルを生成すること、ミニサークルベクターから生成された検出可能なシグナルのレベルを測定すること、及び第１の対象者からのシグナルのレベルを、ミニサークルベクターを投与されていない第２の対象者から得られたものと比較することを含むことができ、第２の対象者から得られたレベルと比較した第１の対象者からの高レベルシグナルは、第１の対象者が腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団を含むことを示す。
【0121】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、段階（ｉｉ）は、検出可能なシグナルを非侵襲的に検出すること、前記シグナルを画像に変換すること、前記画像を第１の対象者の画像と重ね合わせること、及び第１の対象者に対して検出可能なシグナルを位置決めすることで、第１の対象者における腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の位置を決定することをさらに含むことができる。
【0122】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、発現産物はルシフェラーゼであることができる。
【0123】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ミニサークルベクターは、配列番号２による核酸配列を有することができる。
【0124】
疾患の診断、検出、及びモニタリングのための改善された合成バイオマーカー
一部の態様において、本開示は、
（ａ）組成物を対象者に投与することであって、当該組成物が、対象者における非病変細胞でのバイオマーカーの発現より優先的に病変細胞での合成バイオマーカーの発現を誘発し、それによって、病変細胞で発現されるバイオマーカーの非病変細胞に対する相対濃度比が約１．０より大きくなること；（ｂ）合成バイオマーカーを検出すること；及び（ｃ）（ｂ）で検出された合成バイオマーカーを用いて、対象者が病変細胞を有することを検出することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記検出は、少なくとも９０％の精度を有する。
一部の態様において、本開示は、
（ａ）組成物を対象者に投与することであって、当該組成物が、対象者における非病変細胞でのバイオマーカーの発現より優先的に病変細胞での合成バイオマーカーの発現を誘発し、それによって、病変細胞で発現されるバイオマーカーの非病変細胞に対する相対濃度比が約１．０より大きくなること；（ｂ）合成バイオマーカーを検出すること；及び（ｃ）（ｂ）で検出された合成バイオマーカーを用いて、対象者が病変細胞を有することを検出することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記検出は、少なくとも９０％の精度を有する。
【0125】
場合により、組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与される。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与される。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0126】
場合によっては、病変細胞の検出は、少なくとも約５０％、少なくとも約５３％、少なくとも約５５％、少なくとも約５７％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％６３％、少なくとも約６５％、少なくとも約６７％、少なくとも約７０％、少なくとも約７２％、少なくとも約７５％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、８３％、少なくとも約８４％、８５％、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の精度を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約５３％、５５％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の精度を有し得る。
【0127】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の感度を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の感度を有することができる。
【0128】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の特異性を有し得る。場合によっては、病変細胞の検出は、最大で約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の特異性を有し得る。
【0129】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．２％、９５．５％、９５．７％、９６％、９６．２％、９６．５％、９６．７％、９７％、９７．２％、９７．５％、９７．７％、９８％、９８．２％、９８．５％、９８．７％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．７％、又は９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の負の予測値（ＮＰＶ）を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．２％、９５．５％、９５．７％、９６％、９６．２％、９６．５％、９６．７％、９７％、９７．２％、９７．５％、９７．７％、９８％、９８．２％、９８．５％、９８．７％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．７％、又は９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲のＮＰＶを有し得る。
【0130】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３ ％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の陽性予測値（ＰＰＶ）を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、６０ ％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲のＰＰＶを有し得る。
【0131】
一部の実施形態において、組成物は、合成バイオマーカーをコードするベクターを含み得る。好適なベクターには、ミニサークル、プラスミド、ナノプラスミド、ミニイントロニックプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、及びバキュロウィルスなど（これらに限定されるものではない）の、イン・ビボでの細胞への投与に適したベクターなどがある。好適なベクターには、バクテリオファージ又は植物、無脊椎動物若しくはＣＥＬｉＤベクターなどの動物（ヒトを含む）ウィルスに由来するベクター、例えばアデノ随伴ウィルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ－ＤＪ、又はＡＡＶ－ＤＪ８などのそれらのシュード型組み合わせ）、レトロウィルスベクター（例えば、ＭＬＶ又はその自己不活化若しくはＳＩＮバージョン、又はそれらのシュードバージョン）、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ－又はＥＢＶ系）、レンチウィルスベクター（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、又はＥＩＡＶ系、又はそれらのシュード型バージョン）、又はアデノウィルスベクター（例えば、複製欠損、複製能、又はヘルパー依存バージョンなどのＡｄ５系）もある。一部の場合において、ベクターは、足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）などの１以上の標的細胞型での複製を容易にするためのエピソーム維持要素を含み得る。Ｓ／ＭＡＲ要素は、ミニサークルなどの「裸の」核酸ベクターの文脈で複製を容易にするのに特に有用である。例示的な好適なＳ／ＭＡＲ要素には、免疫グロブリン重鎖遺伝子座からのＥμＭＡＲ、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座からのａｐｏＢ ＭＡＲ、ニワトリリゾチーム遺伝子座からのＣｈ－ＬｙｓＭＡＲ、及びヒトＩＦＮβ遺伝子座からのｈｕＩＦＮβ ＭＡＲなどがあるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態では、ベクターは非ウィルスベクターであることができる。
【0132】
場合により、組成物は、プロモーターに作動可能に連結された合成バイオマーカーをコードする配列を含むベクターを含み得る。好適なプロモーターには、天然の汎腫瘍特異的プロモーター、天然の組織特異的プロモーター、天然の疾患特異的／疾患活性化プロモーター、天然の構成的プロモーター、及びそれらの任意の複合体などがある。プロモーターは、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。
【0133】
場合により、合成バイオマーカーは、ポリペプチド又は核酸バイオマーカーであり得る。ポリペプチドには、本明細書に記載のレポーターポリペプチドのいずれかが含まれる。核酸には、天然又は操作されたｍｉＲＮＡ、ＲＮＡヘアピン、及びＲＮＡアプタマー又はそれらのバーコード化バージョンなどがある。核酸がｍｉＲＮＡである場合、ｍｉＲＮＡは、例えば縮重プライマーに基づくアニーリング及びライゲーション、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ標識とそれに続くＲＴ若しくはライゲーション、又はｑ－ＰＣＲ、配列決定若しくは電気泳動検出法と組み合わせた連続アダプターライゲーションなどの標準ライブラリー生成技術によって検出することができる。バイオマーカーがポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0134】
比較的大きいグループ内の特有の構成員に専用ラベルを帰属させることにより、バーコードは、多くの構成員のより大きな及びより複雑な混合物（例えば、同じ細胞内で発現される複数のプロモーター－レポーター構築物）の文脈内でその構成員を識別及び定量する機会（例えば、特定のがん特異的プロモーターの制御下でのレポーターの発現）を与え、そして複雑な混合物から単一の構成員を単離する機会を提供する。例えば、核酸に基づくバーコードの場合、塩基対の相補性に基づくバーコードのハイブリダイゼーションを用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。ペプチドに基づくバーコードの場合、免疫捕捉又はリガンドと受容体の相互作用を含む特有の特徴を用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。
【0135】
核酸が操作されたｍｉＲＮＡである場合、その核酸は、ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ ＯＮ Ｅ １１（７）：ｅ０１５９３６９）らに記載されているＳｅｃ－ｍｉＲ又はｍｉＲ－ｎｅｇ構築物であることができる。このような構築物は、（ａ）内因的に発現されず、既知の脊椎動物標的を持たないコード配列（例えば、Ｓｅｃ－ｍｉＲ ５′－ＡＡＡＵＧＵＡＣＵＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＡＣ－３′）；（ｂ）前記コード配列に隣接する成熟ｍｉＲＮＡへのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのプロセシングを提供するｍｉＲバックボーン配列（例えば、ｍｉＲ－１５５又はｍｉＲ－１３０バックボーン配列）；（ｃ）エクソソーム（例：ＧＧＡＧ）へのローディングを強化するＥＸＯモチーフを含む。そのようなｍｉＲＮＡ構築物は、例えば、レポーターポリペプチドをコードする遺伝子の３′－ＵＴＲで、又は適切に非毒性のタンパク質（例えば、アクチンやチューブリンなどの内因性構造タンパク質、又はユビキチンなどの高度に発現されるタンパク質）をコードする遺伝子の３′－ＵＴＲから発現させることができる。一部の実施形態において、操作ｍｉＲＮＡの複数のコピー（例えば、少なくとも２つ、少なくとも４つ）は、タンデムで提供され得る。
【0136】
場合により、合成バイオマーカーは、対象者に対して実施される非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドバイオマーカーであり得る、及び／又はその方法は、非侵襲的イメージングによって合成バイオマーカーを検出することを含む。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがある。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、 ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３ ／ Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ ／ Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、合成バイオマーカーは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。合成バイオマーカーは、対象者の体内でイン・サイツで測定することができる。
【0137】
合成バイオマーカーが非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドバイオマーカーである場合、病変細胞における合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物を対象者に投与することが関与する方法は、（ｄ）対象者の体内で病変細胞の位置決めを行うことをさらに含み得る。位置決めは、特定の解像度、例えば１０ｍｍ～１０ｃｍ、少なくとも１０ｍｍ、又は最大１０ｃｍに関連付けることができる。位置決めは、特定の最小検出可能腫瘍サイズ、例えば、３ｍｍ３～５ｃｍ３の腫瘍サイズに関連し得る。場合により、特定の最小範囲は、１ｃｍ３～５ｃｍ３、又は９００ｍｍ３～１ｃｍ３、又は８００ｍｍ３～９００ｍｍ３、又は７００ｍｍ３～８００ｍｍ３、又は６００ｍｍ３～７００ｍｍ３、又は５００ｍｍ３～６００ｍｍ３、又は４００ｍｍ３～５００ｍｍ３、又は３００ｍｍ３～４００ｍｍ３、又は２００ｍｍ３～３００ｍｍ３、又は１００ｍｍ３～２００ｍｍ３、又は５０ｍｍ３～１００ｍｍ３、又は１０ｍｍ３～５０ｍｍ３、又は３ｍｍ３～１０ｍｍ３のサイズであり得る。場合により、非侵襲的イメージングスキャン（ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴなど）で位置決めが行われる。場合により、イン・サイツでの外科的介入時に、例えば、視覚検査の使用（視界吸収レポーターの場合）又は蛍光励起と組み合わせた視覚検査の使用によって、位置決めが行われる。
【0138】
場合により、上記の追加の位置決め段階の後に、検出された及び／又は位置決めされた病変細胞を除去するための外科的段階を行うことがある。外科的段階は、バイオマーカーをコードする組成物を投与する、及び／又は病変細胞を位置決めする関係者と同じ又は異なる関係者によって実施され得る。外科的段階は、病変細胞又は病変細胞に関連する腫瘍の外科的切除であることができる。外科的又は非外科的除去段階には、放射線手術（ガンマナイフ、Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ、ＣｙｂｅｒＫｎｉｆｅ、及び標的電離放射線を用いて病変細胞を殺す関連技術などがあるが、これらに限定されない）などの低侵襲殺滅技術が関与し得る。
【0139】
場合により、合成バイオマーカーは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物が投与された対象者からの生体サンプルで検出することができる。場合により、合成バイオマーカーがイン・ビボで検出され、病変細胞の位置を決定する。
【0140】
場合により、対象者に投与される組成物は、トランスフェクション剤を含み得る。適切なトランスフェクション剤には、直鎖若しくは分岐ポリエチレンイミン、ナノ粒子、親油性粒子、ペプチド、ミセル、デンドリマー、ヒドロゲル、合成若しくは天然由来のエキソソーム、ポリマー組成物、ウィルス様粒子、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【0141】
場合により、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。例示的な薬学的に許容される担体には、水、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、デキストロース水溶液、グリセロール溶液、グルコース、乳糖、ショ糖、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム溶液、プロピレン、グリコール若しくはエタノール、又はそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【0142】
生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであることができる。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、頸膣分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮綿棒採取物などがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって収集されたサンプルであることができる。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。
【0143】
場合により、生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与から一定期間後に得ることができる。生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月にわたり得ることができる。生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日、最大約４日、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１か月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、又は最大で約６ヶ月にわたり取得することができる。一部の実施形態では、生体サンプルを取得することができ、任意のバイオマーカー検出プロトコルを、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与後に複数回実行することができる（例えば、合成バイオマーカーレベルを経時的にモニタリングするため）。生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回得ることができる。生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与後、週１回又は月１回得ることができる。
【0144】
場合により、病変細胞は、がん性細胞、自己免疫疾患を示す細胞（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、神経変性疾患を示す細胞（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）、又は細胞が得られる対象者が疾患を患っているか、その疾患に罹患しようとしているために変化した遺伝子発現プロファイルを有している可能性がある細胞であることができる。変化した遺伝子発現プロファイルを有する細胞を含む細胞集団は、転写変化細胞（ＴＡＣ）と記述することができる。場合により、病変細胞はがん性細胞であり得る。例示的ながんには、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び腺腫などがあるが、これらに限定されない。癌腫は、肺、乳房、結腸などの身体の内部及び外部を覆う細胞から発生する可能性がある。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、結合組織、筋肉、及び他の支持組織にある細胞から発生する可能性がある。リンパ腫は、リンパ節や免疫系組織で発生する可能性がある。白血病は骨髄で発生し、血流に蓄積する可能性がある。腺腫は、甲状腺、下垂体、副腎、及び他の腺組織で発生する可能性がある。がんの種類の具体的な例示的な例には、本開示による方法による検出に適したものが含まれ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、付属器がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、表皮腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルシノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポシ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞及び小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、潜在性原発を伴う転移性扁平頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び傍鼻洞がん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、栄養芽細胞性腫瘍（妊娠中）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍などがある。
【0145】
場合により、病変細胞はウィルス感染細胞であり得る。例示的なウィルスには、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタインバーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型などがあるが、これらに限定されない。
【0146】
場合により、病変細胞は、自己免疫疾患を示し得る。例示的な自己免疫疾患には、アカラシア、アディソン病、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、アレタ脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経神経障害（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜気腫、良性気腫、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、チャガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ－ストラウス症候群（ＣＳＳ）又は好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素性疾患、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ヘルペス性皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、エッセンシャル混合クリオグロブリン血症動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹又は妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性嚢胞炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランベンルト－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、ムーレン潰瘍、ムチャハーバーマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）又はＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重力性筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児狼瘡、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼の瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、パリンドローム性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、毛様体扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、パーソネージ－ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、末梢性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発性筋痛、多巣性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆道肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、ササック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨大細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサハント症候群（ＴＨＳ）、横脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、硝子体炎、及びフォークト・小柳・原田病などがあるが、これらに限定されない。
【0147】
場合により、病変細胞は、神経変性疾患を示し得る。神経変性疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、又はヘルペスウィルス科、ポリオーマウィルス科、ボルナウィルス科、オルトミクソウィルス科、パラミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、ピルコナウィルス科、又はレトロウィルス科のウィルスによる感染による神経変性などがあるが、これらに限定されるものではない（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ Ｊ． ２０１３；１０：１７２を参照）。
【0148】
病変細胞のための遺伝子／ＤＮＡに基づく治療剤
一部の態様において、本開示は、疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療する方法であって、対象者において非病変細胞による治療上有効な薬剤の発現より優先的に疾患関連の病変細胞による治療上有効な薬剤の発現を誘発することで、非病変細胞より病変細胞によって発現される治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０より高くなり、それによって治療上有効な薬剤が病変細胞の細胞集合での減少によって決定される少なくとも１０％の治療効力で対象者を治療する組成物を対象者に投与することを含む方法を提供する。
一部の態様において、本開示は、疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療する方法であって、対象者において非病変細胞による治療上有効な薬剤の発現より優先的に疾患関連の病変細胞による治療上有効な薬剤の発現を誘発することで、非病変細胞より病変細胞によって発現される治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０より高くなり、それによって治療上有効な薬剤が病変細胞の細胞集合での減少によって決定される少なくとも１０％の治療効力で対象者を治療する組成物を対象者に投与することを含む方法を提供する。
【0149】
場合により、組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与される。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与される。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0150】
場合により、疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療するために投与される組成物は、治療上有効な薬剤をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターは、がん特異的プロモーターであり得る。好適なプロモーターには、天然の汎腫瘍特異的プロモーター、天然の組織特異的プロモーター、天然の疾患特異的／疾患活性化プロモーター、天然の構成的プロモーター、及びそれらの任意の複合体などがある。当該プロモーターは、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。
【0151】
場合により、治療上有効な薬剤をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、対象者に投与される組成物の成分であり得るベクター上に存在し得る。好適なベクターには、ミニサークル、プラスミド、ナノプラスミド、ミニイントロニックプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、及びバキュロウィルスなど（これらに限定されるものではない）の、イン・ビボでの細胞への投与に適したベクターなどがある。好適なベクターには、バクテリオファージ又は植物、無脊椎動物若しくは動物（ヒトを含む）ウィルスに由来するベクター、例えばＣＥＬｉＤベクター、アデノ随伴ウィルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ－ＤＪ、又はＡＡＶ－ＤＪ８などのそれらのシュード型組み合わせ）、レトロウィルスベクター（例えば、ＭＬＶ又はその自己不活化若しくはＳＩＮバージョン、又はそれらのシュードバージョン）、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ－又はＥＢＶ系）、レンチウィルスベクター（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、又はＥＩＡＶ系、又はそれらのシュード型バージョン）、又はアデノウィルスベクター（例えば、複製欠損、複製能、又はヘルパー依存バージョンなどのＡｄ５系）などもある。一部の場合において、ベクターは、足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）などの１以上の標的細胞型での複製を容易にするためのエピソーム維持要素を含み得る。Ｓ／ＭＡＲ要素は、ミニサークルなどの「裸の」核酸ベクターの文脈で複製を容易にするのに特に有用である。例示的な好適なＳ／ＭＡＲ要素には、免疫グロブリン重鎖遺伝子座からのＥμＭＡＲ、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座からのａｐｏＢ ＭＡＲ、ニワトリリゾチーム遺伝子座からのＣｈ－ＬｙｓＭＡＲ、及びヒトＩＦＮβ遺伝子座からのｈｕＩＦＮβ ＭＡＲなどがあるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態では、ベクターは非ウィルスベクターであることができる。
【0152】
場合により、治療上有効な薬剤は、特定の種類の治療薬を含み得る。本開示の方法による使用に適した治療薬の例示的な種類には、治療上有効なポリペプチド（例えば、治療用抗体、断片、又はそれの誘導体；サイトカイン；成長因子；操作された又は置換された代謝／異化酵素、操作された短いペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト、又はプロドラッグ活性化酵素）、小さい活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。場合により、治療上有効な薬剤は、プロドラッグ活性化酵素であり得る。例示的なプロドラッグ活性化酵素には、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ＤＴジアホラーゼ、ニトロレダクターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、フォリルポリグルタミルシンセターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＧ２、及びシトクロムＰ－４５０などがあるが、これらに限定されない。治療上有効な薬剤がプロドラッグ活性化酵素である場合、その方法は、本明細書に記載の経路のいずれかによる薬物の追加投与を含み得る。治療上有効な薬剤がポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0153】
改良された合成バイオマーカー構築物及び個々の対象者のトランスフェクション率を正規化するための方法
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列と、第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、組成物が細胞内にある場合に、第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーが、少なくとも第１及び第２の核酸の細胞への送達を反映する量で発現され、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物を提供する。場合により、（ｉ）細胞は、病変細胞における第１の核酸配列の発現を、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に誘発し、第１のポリペプチドは、検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；及び（ｉｉ）細胞は、病変細胞及び非病変細胞で同等に第２の核酸配列の発現を誘発し、第２の核酸配列は、検出可能なバイオマーカー又は治療薬ではない第２のポリペプチドを生じることで、第２のポリペプチドの発現レベルが、細胞における核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する。場合により、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、組成物において、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、ベクターは（ａ）第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、当該プロモーターが、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に、病変細胞における第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び（ｂ）病変細胞及び非病変細胞で同等に発現を誘発し、第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列を含む。
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列と、第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、組成物が細胞内にある場合に、第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーが、少なくとも第１及び第２の核酸の細胞への送達を反映する量で発現され、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物を提供する。場合により、（ｉ）細胞は、病変細胞における第１の核酸配列の発現を、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に誘発し、第１のポリペプチドは、検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；及び（ｉｉ）細胞は、病変細胞及び非病変細胞で同等に第２の核酸配列の発現を誘発し、第２の核酸配列は、検出可能なバイオマーカー又は治療薬ではない第２のポリペプチドを生じることで、第２のポリペプチドの発現レベルが、細胞における核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する。場合により、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、組成物において、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、ベクターは（ａ）第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、当該プロモーターが、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に、病変細胞における第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び（ｂ）病変細胞及び非病変細胞で同等に発現を誘発し、第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列を含む。
【0154】
場合により、第１のポリペプチドは、検出可能なバイオマーカー及び治療薬の両方であり得る。場合により、最初のポリペプチドは、治療用抗体、治療用抗体断片又は誘導体、又はプロドラッグ活性化酵素である。例示的なプロドラッグ活性化酵素には、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ＤＴジアホラーゼ、ニトロレダクターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、フォリルポリグルタミルシンセターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＧ２、及びシトクロムＰ－４５０などがあるが、これらに限定されない。そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0155】
場合により、第１及び／又は第２の核酸がベクター上にあり得る。好適なベクターには、ミニサークル、プラスミド、ナノプラスミド、ミニイントロニックプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、及びバキュロウィルスなど（これらに限定されるものではない）の、イン・ビボでの細胞への投与に適したベクターなどがある。好適なベクターには、バクテリオファージ又は植物、無脊椎動物若しくはＣＥＬｉＤベクターなどの動物（ヒトを含む）ウィルスに由来するベクター、例えばアデノ随伴ウィルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ－ＤＪ、又はＡＡＶ－ＤＪ８などのそれらのシュード型組み合わせ）、レトロウィルスベクター（例えば、ＭＬＶ又はその自己不活化若しくはＳＩＮバージョン、又はそれらのシュードバージョン）、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ－又はＥＢＶ系）、レンチウィルスベクター（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、又はＥＩＡＶ系、又はそれらのシュード型バージョン）、又はアデノウィルスベクター（例えば、複製欠損、複製能、又はヘルパー依存バージョンなどのＡｄ５系）もある。一部の場合において、ベクターは、足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）などの１以上の標的細胞型での複製を容易にするためのエピソーム維持要素を含み得る。Ｓ／ＭＡＲ要素は、ミニサークルなどの「裸の」核酸ベクターの文脈で複製を容易にするのに特に有用である。例示的な好適なＳ／ＭＡＲ要素には、免疫グロブリン重鎖遺伝子座からのＥμＭＡＲ、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子座からのａｐｏＢ ＭＡＲ、ニワトリリゾチーム遺伝子座からのＣｈ－ＬｙｓＭＡＲ、及びヒトＩＦＮβ遺伝子座からのｈｕＩＦＮβ ＭＡＲなどがあるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態では、ベクターは非ウィルスベクターであることができる。
【0156】
場合により、第１及び第２の核酸が送達される細胞は、病変細胞であり得る。場合により、病変細胞は、がん性細胞、自己免疫疾患を示す細胞（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、ＴＡＣ、又は神経変性疾患を示す細胞（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）であり得る。そのような細胞が示し得る例示的ながん、自己免疫疾患、及び神経変性疾患には、本明細書に記載のがん、自己免疫疾患、及び神経変性疾患のいずれかが含まれる。場合により、病変細胞はウィルス感染した細胞であり得る。例示的なウィルスには、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタインバーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型などがあるが、これらに限定されない。
【0157】
場合により、第１又は第２の核酸は、検出可能な核酸バイオマーカーであり得る。例示的な検出可能な核酸には、天然又は操作されたｍｉＲＮＡ、ＲＮＡヘアピン、及びＲＮＡアプタマー又はそれらのバーコードバージョンなどがあるが、これらに限定されない。核酸がｍｉＲＮＡである場合、ｍｉＲＮＡは、例えば縮重プライマーに基づくアニーリング及びライゲーション、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ標識とそれに続くＲＴ若しくはライゲーション、又はｑ－ＰＣＲ、配列決定若しくは電気泳動検出法と組み合わせた連続アダプターライゲーションなどの標準ライブラリー生成技術によって検出することができる。バイオマーカーがポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0158】
核酸が操作されたｍｉＲＮＡである場合、その核酸は、ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ ＯＮ Ｅ １１（７）：ｅ０１５９３６９）らに記載されているＳｅｃ－ｍｉＲ又はｍｉＲ－ｎｅｇ構築物であることができる。このような構築物は、（ａ）内因的に発現されず、既知の脊椎動物標的を持たないコード配列（例えば、Ｓｅｃ－ｍｉＲ ５′－ＡＡＡＵＧＵＡＣＵＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＡＣ－３′）；（ｂ）前記コード配列に隣接する成熟ｍｉＲＮＡへのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのプロセシングを提供するｍｉＲバックボーン配列（例えば、ｍｉＲ－１５５又はｍｉＲ－１３０バックボーン配列）；（ｃ）エクソソーム（例：ＧＧＡＧ）へのローディングを強化するＥＸＯモチーフを含む。そのようなｍｉＲＮＡ構築物は、例えば、レポーターポリペプチドをコードする遺伝子の３′－ＵＴＲで、又は適切に非毒性のタンパク質（例えば、アクチンやチューブリンなどの内因性構造タンパク質、又はユビキチンなどの高度に発現されるタンパク質）をコードする遺伝子の３′－ＵＴＲから発現させることができる。一部の実施形態において、操作ｍｉＲＮＡの複数のコピー（例えば、少なくとも２つ、少なくとも４つ）は、タンデムで提供され得る。
【0159】
場合により、第２のポリペプチド又は第１のポリペプチドは、対象者に対して実施される非侵襲的イメージング法によって検出可能である。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがある。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、 ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３ ／ Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ ／ Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、合成バイオマーカーは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。合成バイオマーカーは、対象者の体内でイン・サイツで測定することができる。
【0160】
場合により、本開示は、組成物を対象者に投与することを含む、対象者における病変細胞を検出する方法であって、当該組成物が、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列を含み、当該組成物が細胞内にある場合に、第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーが、少なくとも第１及び第２の核酸の細胞への送達を反映する量で発現されるように当該組成物が構成され、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、病変細胞と非病変細胞とで異なって発現される方法を提供する。場合により、（ｉ）細胞は、病変細胞における第１の核酸配列の発現を、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に誘発し、第１のポリペプチドは、検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；及び（ｉｉ）細胞は、病変細胞及び非病変細胞で同等に第２の核酸配列の発現を誘発し、第２の核酸配列は、検出可能なバイオマーカー又は治療薬ではない第２のポリペプチドを生じることで、第２のポリペプチドの発現レベルが、細胞における核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する。場合により、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、組成物において、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む配列は、独立した遺伝子構築物上にあり得る。場合により、ベクターは（ａ）第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、当該プロモーターが、非病変細胞における第１の核酸配列の発現より優先的に、病変細胞における第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び（ｂ）病変細胞及び非病変細胞で同等に発現を誘発し、第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列を含む。場合により、当該方法は、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカー及び／又は第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーを検出することを含み得る。場合により、そのような方法は、対象者に対して実行される非侵襲的イメージング方法である。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。
【0161】
合成バイオマーカーが非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドバイオマーカーである場合、当該方法は、対象者の体内で病変細胞の位置決めを行うことをさらに含み得る。位置決めは、特定の解像度、例えば１０ｍｍ～１０ｃｍ、少なくとも１０ｍｍ、又は最大１０ｃｍに関連付けることができる。位置決めは、特定の最小検出可能腫瘍サイズ、例えば、３ｍｍ３～１０ｃｍ３の間の腫瘍サイズに関連し得る。場合により、特定の最小範囲は、１ｃｍ３～１０ｃｍ３、又は９００ｍｍ３～１ｃｍ３、又は８００ｍｍ３～９００ｍｍ３、又は７００ｍｍ３～８００ｍｍ３、又は６００ｍｍ３～７００ｍｍ３、又は５００ｍｍ３～６００ｍｍ３、又は４００ｍｍ３～５００ｍｍ３、又は３００ｍｍ３～４００ｍｍ３、又は２００ｍｍ３～３００ｍｍ３、又は１００ｍｍ３～２００ｍｍ３、又は５０ｍｍ３～１００ｍｍ３、又は１０ｍｍ３～５０ｍｍ３、又は３ｍｍ３～１０ｍｍ３のサイズであり得る。場合により、非侵襲的イメージングスキャン（ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴなど）で位置決めが行われる。場合により、イン・サイツでの外科的介入時に、例えば、視覚検査の使用（視覚範囲吸収レポーターの場合）又は蛍光励起と組み合わせた視覚検査の使用によって、位置決めが行われる。
【0162】
場合により、上記の追加の位置決め段階の後に、検出された及び／又は位置決めされた病変細胞を除去するための外科的段階を行うことがある。外科的段階は、バイオマーカーをコードする組成物を投与する、及び／又は病変細胞を位置決めする関係者と同じ又は部分的に異なる関係者によって実施され得る。外科的段階は、病変細胞又は病変細胞に関連する腫瘍の外科的切除であることができる。外科的又は非外科的除去段階には、放射線外科（ガンマナイフ、Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ、サイバーナイフ、及び標的電離放射線を用いて病変細胞を殺す関連技術などがあるが、これらに限定されない）などの低侵襲殺滅技術が関与し得る。
【0163】
場合により、非侵襲的イメージング法は、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与から一定期間後に実行され得る。当該非侵襲的イメージング法は、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、又は少なくとも約１年で実行することができる。当該非侵襲的イメージング法は、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大で約３６時間、最大で約４８時間、最大で約３日、最大で約４日、最大で約５日、最大で約６日、最大で約７日、最大で約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１ヶ月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、最大で約６ヶ月、又は最大で約１年で実行することができる。一部の実施形態において、非侵襲的イメージング法は、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後に複数回実行することができる（例えば、合成バイオマーカーレベルを経時的にモニタリングするため）。当該非侵襲的イメージング法は、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回実施することができる。当該非侵襲的イメージング法は、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後に週１回又は月１回実施することができる。
【0164】
場合により、第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカー及び／又は第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーは、対象者からの生体サンプルにおいて検出することができる。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであることができる。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、頸膣分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮綿棒採取物などがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって収集されたサンプルであることができる。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。場合により、生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与から一定期間後に得ることができる。生体サンプルは、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月で得ることができる。生体サンプルは、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日、最大約４日、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１か月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、又は最大で約６ヶ月で取得することができる。一部の実施形態では、生体サンプルを取得することができ、任意のバイオマーカー検出プロトコルを、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後に複数回実行することができる（例えば、合成バイオマーカーレベルを経時的にモニタリングするため）。生体サンプルは、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回得ることができる。生体サンプルは、第１及び第２の核酸を含む組成物の投与後、週１回又は月１回得ることができる。
【0165】
場合により、当該方法は、特定の核酸検出方法によって第１又は第２の核酸バイオマーカーを検出することを含み得る。第１又は第２の核酸バイオマーカーは、配列決定によって検出され得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0166】
場合により、第１又は第２の核酸バイオマーカーは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法によって検出され得る（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0167】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0168】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0169】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0170】
ＲＮＡレベルはまた、例えば、ＰａｎｏｍｉｃｓのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）試薬システムなどの分岐核酸プローブを用いて、プローブへのハイブリダイゼーションによって増幅せずに測定することができる。
【0171】
ヘテロ二量体に基づく合成バイオマーカー設計
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む組成物であって、当該組成物は、組成物が細胞内にあるとき、（ｉ）細胞が第１の核酸配列を発現して第１のポリペプチドを生成し；（ｉｉ）細胞が第２の核酸配列を発現して第２のポリペプチドを生成し；及び（ｉｉｉ）細胞によって発現される第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成するように構成される組成物を提供する。場合により、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、独立の遺伝子構築物上にあり得る。場合により、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、独立の遺伝子構築物上にあり得る。
一部の態様において、本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む組成物であって、当該組成物は、組成物が細胞内にあるとき、（ｉ）細胞が第１の核酸配列を発現して第１のポリペプチドを生成し；（ｉｉ）細胞が第２の核酸配列を発現して第２のポリペプチドを生成し；及び（ｉｉｉ）細胞によって発現される第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成するように構成される組成物を提供する。場合により、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、独立の遺伝子構築物上にあり得る。場合により、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、独立の遺伝子構築物上にあり得る。
【0172】
場合により、ヘテロ二量体タンパク質は、天然ヘテロ二量体の誘導体、又は二つの相補的なポリペプチドの半分に分割された天然の酵素又は自家蛍光タンパク質であり得る。そのようなシステムの例には、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロ二量体、スプリットルシフェラーゼタンパク質、又はスプリットＧＦＰタンパク質などがあるが、これらに限定されない。
【0173】
ヘテロ二量体タンパク質が天然ヘテロ二量体の誘導体である可能性がある場合（例えば、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ペア）、ヘテロ二量体タンパク質の各半分は、酵素又は検出ペアの相補的な半分に連結され、それにより、ヘテロ二量体の二量化が酵素を活性化するか、検出ペアの検出を可能にする。場合により、ヘテロ二量体タンパク質の各半分は、それの活性がヘテロ二量体の二量化によって再構成される場合に、別の要素の発現を活性化し得るＣｒｅリコンビナーゼ（例えば、合成バイオマーカー又は治療剤分子）などのスプリットリコンビナーゼに連結されている可能性がある。場合により、ヘテロ二量体タンパク質の各半分が、ＦＲＥＴペアを形成する二つの自家蛍光タンパク質のうちの一つに連結されていることができ、それによって、ヘテロ二量体が形成されたときにＦＲＥＴが検出され得る。
【0174】
場合により、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、第１の遺伝子要素及び第２の遺伝子要素に作動可能に連結されていることができ、第１の遺伝子要素及び第２の遺伝子要素の両方が選択的に活性化されて、同じ病変細胞型における第１及び第２のポリペプチド発現し得る。第１又は第２の遺伝子要素は、プロモーター、エンハンサー、又はｍｉＲＮＡ結合部位であり得る。例示的なプロモーターには、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。例示的なｍｉＲＮＡ結合部位には、少なくとも一つのｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２２又はｍｉＲ－３４結合配列などがあるが、これらに限定されない。
【0175】
場合により、第１及び第２のポリペプチドがコードされる遺伝子構築物は、ベクターであり得る。例示的なベクターには、本明細書に記載のベクターのいずれかが含まれる。
【0176】
一部の態様において、本開示は、組成物を投与することを含む病変細胞を検出又は治療する方法であって、当該組成物が、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含み、当該組成物が、その組成物が細胞内にあるとき、（ｉ）当該細胞が前記第１の核酸配列を発現して前記第１のポリペプチドを生じ；（ｉｉ）前記細胞が第２の核酸配列を発現して前記第２のポリペプチドを生じ；（ｉｉｉ）前記細胞によって発現される前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成するように構成されている方法を提供する。場合により、組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与される。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与される。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。場合により、当該方法は、ヘテロ二量体タンパク質を検出することをさらに含み得る。
【0177】
場合により、検出は、対象者に対して実行される非侵襲的検出方法を含む。例示的な非侵襲的検出方法（例えば、自家蛍光又は発光タンパク質の場合）には、ＳＰＥＣＴイメージング及び生物発光イメージングなどがあるが、これらに限定されない。当該イメージング法は、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、又は少なくとも約１年で実行することができる。当該イメージング法は、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大で約３６時間、最大で約４８時間、最大で約３日、最大で約４日、最大で約５日、最大で約６日、最大で約７日、最大で約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１ヶ月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、最大で約６ヶ月、又は最大で約１年で実行することができる。一部の実施形態において、当該イメージング法は、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後に複数回実行することができる（例えば、合成バイオマーカーレベルを経時的にモニタリングするため）。当該イメージング法は、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回実施することができる。当該イメージング法は、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後に週１回又は月１回実施することができる。
【0178】
場合により、検出は、対象者からの生体サンプルからヘテロ二量体タンパク質を検出することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、頸膣分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮綿棒採取物などがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって収集されたサンプルであることができる。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。
【0179】
場合により、生体サンプルは、合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物の投与から一定期間後に得ることができる。生体サンプルは、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月で得ることができる。生体サンプルは、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日、最大約４日、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１か月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、又は最大で約６ヶ月で取得することができる。一部の実施形態では、生体サンプルを取得することができ、任意のバイオマーカー検出プロトコルを、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後に複数回実行することができる。生体サンプルは、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回得ることができる。生体サンプルは、ヘテロ二量体タンパク質をコードする組成物の投与後、週１回又は月１回得ることができる。生体サンプル中のヘテロ二量体タンパク質は、蛍光アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ、又は発光アッセイによって検出することができる。
【0180】
あるいは又は追加的に、ヘテロ二量体タンパク質は、ヘテロ二量体特異的免疫検出アッセイで検出され得る。例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているようなイムノアッセイを含むタンパク質のレベルを測定するいくつかの方法及び装置が公知である。これらのアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成するための、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイ、又はそれらの任意の組み合わせを利用することができる。
【0181】
疾患の検出、モニタリング、又は診断に使用する合成バイオマーカーのエクス・ビボ構築物及び方法
一部の態様において、本開示は、ポリペプチド又は核酸配列をコードする配列を含む非天然組換え遺伝子構築物を含む組成物であって、当該配列が、エクス・ビボで細胞に形質導入された場合に対象者から単離された複数の異なる種類の病変細胞におけるポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む組成物を提供する。
一部の態様において、本開示は、ポリペプチド又は核酸配列をコードする配列を含む非天然組換え遺伝子構築物を含む組成物であって、当該配列が、エクス・ビボで細胞に形質導入された場合に対象者から単離された複数の異なる種類の病変細胞におけるポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む組成物を提供する。
【0182】
場合により、当該組成物は、組換え遺伝子構築物で形質導入された細胞を含み得る。場合により、複数の異なる種類の細胞は、病変細胞又は障害細胞である。場合により、細胞は、血球、リンパ球、白血球、上皮細胞、胃腸細胞、胎盤細胞、羊膜細胞、肺上皮細胞、尿管上皮細胞、又は腎臓細胞である。
【0183】
場合により、病変細胞又は障害細胞は、がん性細胞、自己免疫疾患を示す細胞（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、ＴＡＣ、又は神経変性疾患を示す細胞（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）であり得る。例示的ながん、自己免疫疾患、及び神経変性疾患には、本明細書に記載の疾患のいずれかが含まれる。場合により、病変細胞又は障害細胞はウィルス感染した細胞であり得る。例示的なウィルス感染には、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタインバーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型によって引き起こされるものなどがあるが、これらに限定されない。
【0184】
場合により、第１のプロモーターは、細胞が罹患状態にあるときに細胞内で活性化されるプロモーターであり得る。第１のプロモーターは、汎腫瘍特異的プロモーターであり得る。場合により、最初のプロモーターはがん特異的プロモーターである。場合により、最初のプロモーターは、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせである。
【0185】
場合により、エクス・ビボで検出するための組換え遺伝子構築物は、レトロウィルス、レンチウィルス、又はアデノウィルスのパッケージング要素又は長い末端反復を含み得る。組換え遺伝子構築物はＣＥＬｉＤベクターであり得る。組換え遺伝子構築物は、バクテリオファージ若しくは植物、無脊椎動物、又は動物（ヒトなど）由来のベクター、例えばアデノ随伴ウィルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ－ＤＪ、又はＡＡＶ－ＤＪ８などのそれらのシュード型組み合わせ）、レトロウィルスベクター（例えば、ＭＬＶ又はその自己不活化若しくはＳＩＮバージョン、又はそれらのシュードバージョン）、ヘルペスウィルス（例えば、ＨＳＶ－又はＥＢＶ系）、レンチウィルスベクター（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、又はＥＩＡＶ系、又はそれらのシュード型バージョン）、又はアデノウィルスベクター（例えば、複製欠損、複製能、又はヘルパー依存バージョンなどのＡｄ５系）であることができる。組換え遺伝子構築物は、これらのウィルス系のいずれかと適合性のあるパッケージングベクターであることもできる。
【0186】
ベクターは、非ウィルスベクターであり得る。非ウィルスベクターはミニサークルベクターであり得る。ミニサークルは、自己複製ミニサークルであり得る。自己複製ミニサークルは、Ｓ／ＭＡＲ要素を含み得る。非ウィルスベクターは、ナノプラスミド又はミニイントロンプラスミド（ＭＩＰ）であり得る。ＭＩＰは、細菌の複製起点と選択可能なマーカーをイントロンとして導入遺伝子発現カセットに配置する。さらに、ＭＩＰは５′及び３′；ミニサークルでのような導入遺伝子発現カセットの末端の並置を維持することができる（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ａ ｍｉｎｉ－ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＩＰ）：ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｂｕｓｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１３ Ｍａｙ；２１（５）；９５４－９６３を参照）。
【0187】
場合により、エクス・ビボに形質導入されたときに選択的に発現されるポリペプチド又は核酸配列は、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。自家蛍光レポーターには、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体などがある。比色レポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせ）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素などがある。生物発光、化学発光又は発光レポーターには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンなど）などのルシフェラーゼ類（例えば、本明細書に記載のセレンテラジン類の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングで検出可能なレポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体など）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘導体）、バクテリオフィトクローム系の近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的光スイッチ可能タンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、及びＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。定量可能な核酸は、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコードバージョン、又は他の種類の定量可能ＲＮＡであることができる。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な固有の配列を含み得る。ポリペプチド又は核酸がポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0188】
場合により、組成物は特定の診断効率を有することができ、その診断効率が、前記対象者における非病変細胞での前記バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞で測定され、それによって、前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの前記非病変細胞に対する相対比が約１．０より大きく；（ｂ）前記バイオマーカーを検出し；及び（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が前記病変細胞を有することを検出することを少なくとも９０％の精度で決定する。
【0189】
場合により、エクス・ビボで細胞に投与される組成物は、病変又は障害細胞の増殖を調節する第２のポリペプチド又は核酸を含み得る。第２のポリペプチドは、病変細胞又は障害細胞において第２のポリペプチド又は核酸の発現を選択的に駆動する第２のプロモーターの制御下にあり得る。第２のプロモーターは、汎がん特異的プロモーターであり得る。第２のプロモーターは、がん特異的プロモーターであり得る。そのプロモーターは、本明細書に記載の特異的プロモーターのいずれかであり得る。第２のポリペプチドは、形質転換剤又は成長因子を含み得る。形質転換剤は、テロメラーゼ又はＳＶ４０ラージＴ抗原を含み得る。成長因子は、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＨ、又はＩＧＦ－１であることができる。
【0190】
一部の態様において、本開示は、エクス・ビボで非天然組換え遺伝子構築物を対象者から単離された細胞の集団に送達することを含む、病変細胞若しくは障害細胞をエクス・ビボで検出するための方法であって、非天然組換え遺伝子構築物が、ポリペプチド又は核酸配列をコードする配列を含み、当該配列が、細胞に形質導入されたときに対象者から単離された複数の異なる種類の細胞においてポリペプチド又は核酸配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む方法を提供する。
【0191】
一部の態様において、本開示は、前記対象者の一つ以上の細胞をエクス・ビボで遺伝子構築物と接触させることを含む、対象者の疾患又はそれのないことを検出する方法であって、前記遺伝子構築物が、バーコード分子に作動可能に連結された疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患の影響を受けた細胞における前記バーコード分子の発現を駆動し；前記バーコード分子の発現レベルを定量し；前記発現レベルに基づいて、前記疾患又はそれのないことを検出する方法を提供する。
【0192】
場合により、病変細胞若しくは障害細胞をエクス・ビボで検出する方法は、正常細胞のバックグラウンドで特定数の病変細胞を検出することができる可能性がある。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約５００万個の正常細胞あたり約少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、又は少なくとも約５００個の病変細胞を検出することができる。一部の実施形態では、正常細胞は血球（例えば、ＰＢＭＣ）である。
【0193】
場合により、当該方法は、対象者からの細胞を含む生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであることができる。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮綿棒採取物などの外部からアクセス可能な組織の自然に放出された身体物質又は非破壊的掻き取り物からなるサンプルなどがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって収集されたサンプルであることができる。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル又はそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。
【0194】
場合により、当該方法は、組換え遺伝子構築物が細胞に送達された後、特定の期間にわたり細胞の集団を培養することを含み得る。その細胞の集団は、遺伝子構築物が細胞に送達されてから少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、又は少なくとも約１か月培養され得る。その細胞の集団は、遺伝子構築物が細胞に送達されてから最大約１５分、最大約３０分、最大約１時間、最大約２時間、最大約４時間、最大約８時間、最大約１６時間、最大約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日、最大約４日、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大約９日、最大約１０日、最大約１１日、最大約１２日、最大約１３日、最大約１４日、最大約１５日、又は最大約１か月で培養することができる。
【0195】
場合により、当該方法は、ポリペプチド又は核酸配列を検出することを含み得る。検出は、細胞集団を培養する前又は後に行うことができる。検出は、光音響、生物発光、蛍光レポーター、化学発光、発光、比色分析、又は核酸アッセイを含み得る。検出はまた、イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイには、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているものなどがある。イムノアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成する、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどを用いることができる。
【0196】
当該検出方法は、配列決定を含み得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0197】
検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法を含むことができる（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0198】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0199】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0200】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0201】
病期指定のための改善されたバイオマーカー、構築物設計、及び方法
一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物であって、当該ベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、各プロモーターが、細胞において前記複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記複数の核酸配列の個々のポリペプチド又は核酸バイオマーカーのレベルが細胞の疾患の段階を示すものである組成物を提供する。場合により、細胞の疾患の段階は、罹患しているか、罹患していないか、又は中間状態である。場合により、前記複数の異なるプロモーターが、同時に又は別々に投与される複数の独立した遺伝子構築物又はベクターに含まれ得る。一部の実施形態において、別々に投与される複数の独立した遺伝子構築物は、互いに８、１６、２４、３６、４８、６０、又は７２時間以内に投与される。一部の実施形態において、病期は、遠位組織への転移を介してそれらの起源の組織から離れたがん細胞の播種によって評価され得る。このような場合、複数の異なるプロモーターは、少なくとも、初期組織部位（例えば、乳がんが病期分類されているときの乳房）において高いがん特異性を有するプロモーター及び最初の部位とは異なる一般的な転移部位（例えば、肺、脾臓、肝臓）において高い特異性で活性なプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、少なくとも初期組織部位（例えば、乳がんが病期分類されているときの乳房）で高いがん特異性を有するプロモーター、及び複数の異なる転移部位（例えば、肺、脾臓、肝臓）で高い特異性で活性な複数のプロモーターを含み得る。したがって、そのようなシステムは、がんがその元の部位から転移部位に転移するときに、より明瞭なプロモーター（下流のそれらの作動可能に連結されたバイオマーカーによって読み取ることができる）の活性化を提供し、腫瘍がどれだけ広く転移したかの評価を提供することができる。一部の実施形態において、一般的な転移部位において高い特異性で活性なプロモーターの一つは、ＭＭＰ－２であり、これは、肺がんにおいて全ての段階で高い発現を提供するが、乳がんにおいては過剰発現されない。
一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物であって、当該ベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、各プロモーターが、細胞において前記複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記複数の核酸配列の個々のポリペプチド又は核酸バイオマーカーのレベルが細胞の疾患の段階を示すものである組成物を提供する。場合により、細胞の疾患の段階は、罹患しているか、罹患していないか、又は中間状態である。場合により、前記複数の異なるプロモーターが、同時に又は別々に投与される複数の独立した遺伝子構築物又はベクターに含まれ得る。一部の実施形態において、別々に投与される複数の独立した遺伝子構築物は、互いに８、１６、２４、３６、４８、６０、又は７２時間以内に投与される。一部の実施形態において、病期は、遠位組織への転移を介してそれらの起源の組織から離れたがん細胞の播種によって評価され得る。このような場合、複数の異なるプロモーターは、少なくとも、初期組織部位（例えば、乳がんが病期分類されているときの乳房）において高いがん特異性を有するプロモーター及び最初の部位とは異なる一般的な転移部位（例えば、肺、脾臓、肝臓）において高い特異性で活性なプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、少なくとも初期組織部位（例えば、乳がんが病期分類されているときの乳房）で高いがん特異性を有するプロモーター、及び複数の異なる転移部位（例えば、肺、脾臓、肝臓）で高い特異性で活性な複数のプロモーターを含み得る。したがって、そのようなシステムは、がんがその元の部位から転移部位に転移するときに、より明瞭なプロモーター（下流のそれらの作動可能に連結されたバイオマーカーによって読み取ることができる）の活性化を提供し、腫瘍がどれだけ広く転移したかの評価を提供することができる。一部の実施形態において、一般的な転移部位において高い特異性で活性なプロモーターの一つは、ＭＭＰ－２であり、これは、肺がんにおいて全ての段階で高い発現を提供するが、乳がんにおいては過剰発現されない。
【0202】
場合により、疾患は、がん、自己免疫疾患（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、又は神経変性疾患（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）であり得る。例示的ながんには、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び腺腫などがあるが、これらに限定されない。癌腫は、肺、乳房、結腸などの身体の内部及び外部を覆う細胞から発生する可能性がある。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、結合組織、筋肉、及び他の支持組織にある細胞から発生する可能性がある。リンパ腫は、リンパ節や免疫系組織で発生する可能性がある。白血病は骨髄で発生し、血流に蓄積する可能性がある。腺腫は、甲状腺、下垂体、副腎、及び他の腺組織で発生する可能性がある。がんの種類の具体的な例示的な例には、本開示による方法による検出に適したものが含まれ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、付属器がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、表皮腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルシノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポシ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞及び小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、潜在性原発を伴う転移性扁平頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び傍鼻洞がん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、栄養芽細胞性腫瘍（妊娠中）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍などがある。
【0203】
場合により、疾患はウィルス感染細胞であり得る。例示的なウィルス感染には、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタイン－バーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球指向性ウィルスＩＩＩ型によって引き起こされるものなどがあるが、これらに限定されない。
【0204】
場合により、疾患ががんである場合、複数の異なるプロモーターは、がんの初期段階で活性化される第１のプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、がんの中間段階で活性化される第２のプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、がんの後期段階で活性化される第３のプロモーターを含む。
【0205】
場合により、疾患は、自己免疫疾患であり得る。例示的な自己免疫疾患には、アカラシア、アディソン病、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、アレタ脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経神経障害（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜気腫、良性気腫、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、チャガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ－ストラウス症候群（ＣＳＳ）又は好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素性疾患、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ヘルペス性皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、エッセンシャル混合クリオグロブリン血症動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹又は妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性嚢胞炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランベンルト－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、ムーレン潰瘍、ムチャハーバーマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）又はＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重力性筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児狼瘡、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼の瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、パリンドローム性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、毛様体扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、パーソネージ－ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、末梢性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発性筋痛、多巣性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆道肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、ササック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨大細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサハント症候群（ＴＨＳ）、横脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、硝子体炎、及びフォークト・小柳・原田病などがあるが、これらに限定されない。
【0206】
場合により、疾患は、神経変性疾患であり得る。神経変性疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、又はヘルペスウィルス科、ポリオーマウィルス科、ボルナウィルス科、オルトミクソウィルス科、パラミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、ピルコナウィルス科、又はレトロウィルス科のウィルスによる感染による神経変性などがあるが、これらに限定されるものではない（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ Ｊ． ２０１３；１０：１７２を参照）。
【0207】
場合により、核酸バイオマーカーは、例えば、天然又は操作されたｍｉＲＮＡ、ＲＮＡヘアピン、ＲＮＡアプタマー、又はそれらのバーコードバージョンであることができる。
【0208】
場合により、疾患の段階を検出するために組成物で提供されるベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかであり得る。
【0209】
場合により、複数のポリペプチドのうちの少なくとも一つは、非侵襲的イメージングによって検出可能なポリペプチドを含み得る。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがあるが、これらに限定されるものではない。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、 ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３ ／ Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ ／ Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、合成バイオマーカーは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。合成バイオマーカーは、対象者の体内でイン・サイツで測定することができる。
【0210】
場合により、バーコード分子は、対象者からの生体サンプル中の検出可能なポリペプチド又は核酸であることができる。バーコード分子がポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。例示的なポリペプチドバイオマーカーには、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。自家蛍光レポーターには、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体などがある。比色レポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせ）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素などがある。生物発光、化学発光又は発光レポーターには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンなど）などのルシフェラーゼ類（例えば、本明細書に記載のセレンテラジン類の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングで検出可能なレポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体など）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘導体）、バクテリオフィトクローム系の近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的光スイッチ可能タンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、及びＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。バーコード分子が核酸配列である場合、検出可能な核酸配列は、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコードバージョン、又は他の種類の定量可能ＲＮＡを含むことができるが、これらに限定されるものではない。定量可能な核酸配列は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な固有の配列を含み得る。
【0211】
比較的大きいグループ内の特有の構成員に専用ラベルを帰属させることにより、バーコードは、多くの構成員のより大きな及びより複雑な混合物（例えば、同じ細胞内で発現される複数のプロモーター－レポーター構築物）の文脈内でその構成員を識別及び定量する機会（例えば、特定のがん特異的プロモーターの制御下でのレポーターの発現）を与え、そして複雑な混合物から単一の構成員を単離する機会を提供する。例えば、核酸に基づくバーコードの場合、塩基対の相補性に基づくバーコードのハイブリダイゼーションを用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。ペプチドに基づくバーコードの場合、免疫捕捉又はリガンドと受容体の相互作用を含む特有の特徴を用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。
【0212】
一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物を対象者に投与することを含む、疾患の段階の検出方法であって、前記ベクターが、複数の異なる核酸に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、各プロモーターが細胞内の複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は合成核酸配列を生成し、複数の核酸配列の個々のポリペプチドのレベルが、細胞の疾患の段階を示す方法を提供する。場合により、細胞の疾患の段階は、罹患、非罹患、又は中間状態であり得る。一部の態様において、本開示は、ベクターを含む組成物を対象者に投与することを含む、異なる種類のがんを検出する方法であって、前記ベクターが、細胞内の複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含むことで、複数のポリペプチド又は合成核酸配列を産生し、複数の核酸配列の個々のポリペプチドのレベルが、体内の異なる種類のがんを示す方法を提供する。場合により、体内で検出されるがんは、乳房、肝臓、結腸、脳、肺、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、血液、又は血液、骨、胃、目、内分泌若しくは神経内分泌組織、頭頸部、胃腸、筋骨格、皮膚、呼吸器、神経又は泌尿生殖器の成分の組織（これらに限定されるものではない）に由来し得るか、身体の他の部分に由来するがんであり得る。
【0213】
場合により、組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与される。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与される。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0214】
場合により、疾患ががんである場合、複数の異なるプロモーターは、がんの初期段階で活性化される第１のプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、がんの中間段階で活性化される第２のプロモーターを含み得る。場合により、複数の異なるプロモーターは、がんの後期段階で活性化される第３のプロモーターを含む。場合により、当該方法は、対象者の組織又は病変の塊を、性質上前がん性、良性、異形成性、又は転移性として識別することができる。
【0215】
場合により、当該方法は、対象者から生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、乳汁、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮スワブ掻き取り物など、外部からアクセス可能な組織の自然に放出された身体物質又は非破壊的掻き取り物からなるサンプルなどがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル又はそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。場合により、組成物を対象者に投与してから一定期間にわたり、生体サンプルを採取することができる。
【0216】
細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、又は少なくとも約１ヶ月培養され得る。細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大で約３６時間、最大で約４８時間、最大で約３日、最大で約４日、最大で約５日、最大で約６日、最大で約７日、最大で約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、又は最大で約１か月培養することができる。
【0217】
場合により、当該方法は、ポリペプチド又は核酸配列を検出することを含み得る。検出は、細胞集団を培養する前又は後に行うことができる。検出は、光音響、生物発光、蛍光レポーター、化学発光、発光、比色分析、又は核酸アッセイを含み得る。検出はまた、イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイには、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているものなどがある。イムノアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成する、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどを用いることができる。
【0218】
当該検出方法は、配列決定を含み得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0219】
検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法を含むことができる（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0220】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0221】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0222】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0223】
発現漏出低減のための改善された合成バイオマーカー設計及び方法
一部の態様において、本開示は、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むレポーター遺伝子を含む組換え核酸と比較した場合に、病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示す発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸を含む組成物を提供する。
一部の態様において、本開示は、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むレポーター遺伝子を含む組換え核酸と比較した場合に、病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示す発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸を含む組成物を提供する。
【0224】
場合により、遺伝子操作核酸は、発現可能なレポーター遺伝子に作動可能に連結された汎腫瘍特異的プロモーターを含み得る。場合により、汎腫瘍特異的プロモーターは、転写応答要素を含み得る。転写応答要素は、改変されたｐ５３応答要素を含み得る。改変されたｐ５３応答エレメント内の改変は、病変細胞と比較して正常細胞におけるプロモーター活性の低下をもたらし得る。改変されたｐ５３応答エレメント内の改変は、正常細胞と比較して病変細胞におけるプロモーター活性の上昇をもたらす可能性がある。
【0225】
場合により、発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸は、本明細書に記載のベクターのいずれかであり得る。
【0226】
場合により、レポーター遺伝子は、検出可能なポリペプチド又は検出可能な核酸をコードしていることができる。検出可能な核酸バイオマーカーは、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー又はそれらのバーコード化バージョン、又は他のタイプの定量可能なＲＮＡであり得る。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションに基づく技術によって検出可能な特有の配列を含み得る。
【0227】
レポーター遺伝子は、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、又はそれらの任意の組み合わせをコードしていることができる。自家蛍光レポーターには、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体などがある。比色レポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせ）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素などがある。生物発光、化学発光又は発光レポーターには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンなど）などのルシフェラーゼ類（例えば、本明細書に記載のセレンテラジン類の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングで検出可能なレポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体など）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘導体）、バクテリオフィトクローム系の近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的光スイッチ可能タンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、及びＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。検出可能な核酸バイオマーカーは、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコードバージョン、又は他の種類の定量可能ＲＮＡであることができる。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な固有の配列を含み得る。レポーター遺伝子は、非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドをコードしていることができる。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能なポリペプチドには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがある。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能なポリペプチドには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能なポリペプチドには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能なポリペプチドには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、ポリペプチドは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。
【0228】
場合により、病変細胞に影響を与える疾患はがんであり得る。例示的ながんには、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び腺腫などがあるが、これらに限定されない。癌腫は、肺、乳房、結腸などの身体の内部及び外部を覆う細胞から発生する可能性がある。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、結合組織、筋肉、及び他の支持組織にある細胞から発生する可能性がある。リンパ腫は、リンパ節や免疫系組織で発生する可能性がある。白血病は骨髄で発生し、血流に蓄積する可能性がある。腺腫は、甲状腺、下垂体、副腎、及び他の腺組織で発生する可能性がある。がんの種類の具体的な例示的な例には、本開示による方法による検出に適したものが含まれ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、付属器がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、表皮腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルシノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポシ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞及び小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、潜在性原発を伴う転移性扁平頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び傍鼻洞がん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、栄養芽細胞性腫瘍（妊娠中）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍などがある。
【0229】
一部の態様において、本開示は、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むレポーター遺伝子を含む組換え核酸と比較した場合に、疾患によって影響された細胞と比較して正常細胞で約１０％以下の発現を示す発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸を含む、対象者での疾患の検出方法を提供する。対象者は、がんを有することが疑われるものであっても良い。その疾患は、がん又は本明細書で言及のサブタイプのいずれかであり得る。
【0230】
場合により、操作核酸は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与することができる。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、操作核酸は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与され得る。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0231】
場合により、当該方法は、対象者から生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、乳汁、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮スワブ掻き取り物など、外部からアクセス可能な組織の自然に放出された身体物質又は非破壊的掻き取り物からなるサンプルなどがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル又はそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。場合により、組成物を対象者に投与してから一定期間にわたり、生体サンプルを採取することができる。
【0232】
細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、又は少なくとも約１ヶ月培養され得る。細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大で約３６時間、最大で約４８時間、最大で約３日、最大で約４日、最大で約５日、最大で約６日、最大で約７日、最大で約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、又は最大で約１か月培養することができる。
【0233】
場合により、当該方法は、ポリペプチド又は核酸配列を検出することを含み得る。検出は、光音響、生物発光、蛍光レポーター、化学発光、発光、比色分析、又は核酸アッセイを含み得る。検出はまた、イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイには、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているものなどがある。イムノアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成する、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどを用いることができる。
【0234】
当該検出方法は、配列決定を含み得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0235】
検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法を含むことができる（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0236】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0237】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0238】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0239】
マーカー発現を調整するのに用いられるｍｉＲＮＡ結合部位の利用する合成バイオマーカー設計及び方法
一部の態様において、本開示は、病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示し、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域における１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物を提供する。
一部の態様において、本開示は、病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示し、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域における１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物を提供する。
【0240】
場合により、１以上のｍｉＲＮＡ結合配列の少なくとも一つへの病変細胞で発現されるｍｉＲＮＡの結合又は結合の欠如は、レポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡの異なる翻訳又は半減期をもたらし得る。場合により、１以上のｍｉＲＮＡ結合配列の少なくとも一つへの病変細胞で発現されるｍｉＲＮＡの結合により、レポーター遺伝子の翻訳が減少したり、レポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡの半減期が減少したりし得る。場合により、レポーター遺伝子は、がん細胞で発現される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの低下により、がん細胞での発現の増加を示す。
【0241】
場合により、病変細胞は、がん性細胞、自己免疫疾患を示す細胞（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、又は神経変性疾患を示す細胞（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）であることができる。がん、神経変性疾患、及び自己免疫疾患には、本明細書に記載の疾患のいずれかなどがある。場合により、病変細胞は、ウィルス感染した細胞であり得る。例示的なウィルスには、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタイン－バーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型などがあるが、これらに限定されない。
【0242】
場合により、組成物は、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域中に複数のｍｉＲＮＡ結合配列を含み得る。当該組成物は、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域に少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列を含むことができ、二つのｍｉＲＮＡ結合配列は、同じｍｉＲＮＡに結合することができる実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。当該組成物は、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域に少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列を含むことができ、少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列は、異なるヌクレオチド配列を有し、その異なるヌクレオチド配列のそれぞれは、異なるｍｉＲＮＡに結合することができる。当該組成物は、同一のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの組み合わせに結合することができる少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０個のｍｉＲＮＡ結合配列を含み得る。
【0243】
場合により、組換え核酸はＤＮＡを含み得る。組換え核酸がＤＮＡを含む場合、その組換え核酸は、本明細書に記載のベクターのいずれかの一部であり得る。
【0244】
組換え核酸は、合成又はイン・ビトロ転写ｍＲＮＡであり得る。
【0245】
前記１以上のｍｉＲＮＡ結合配列は、少なくとも一つのｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２２又はｍｉＲ－３４結合配列を含み得る。
【0246】
場合により、レポーター遺伝子は、検出可能なポリペプチド又は検出可能な核酸をコードし得る。検出可能な核酸は、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー又はそれらのバーコード化バージョン、又は他のタイプの定量可能ＲＮＡであり得る。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションに基づく技術によって検出可能な特有の配列を含み得る。
【0247】
レポーター遺伝子は、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、又はそれらの任意の組み合わせをコードしていることができる。自家蛍光レポーターには、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体などがある。比色レポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせ）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素などがある。生物発光、化学発光又は発光レポーターには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンなど）などのルシフェラーゼ類（例えば、本明細書に記載のセレンテラジン類の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングで検出可能なレポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体など）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘導体）、バクテリオフィトクローム系の近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的光スイッチ可能タンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、及びＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。検出可能な核酸は、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコードバージョン、又は他の種類の定量可能ＲＮＡであることができる。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な固有の配列を含み得る。
【0248】
レポーター遺伝子は、非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドをコードしていることができる。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能なポリペプチドには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがある。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能なポリペプチドには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能なポリペプチドには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能なポリペプチドには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、ポリペプチドは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。
【0249】
一部の態様において、本開示は、病変細胞と比べて正常細胞において約１０％以下の発現を示し、レポーター遺伝子の３′非翻訳領域における１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物を対象者に投与することを含む、病変細胞を検出する方法を提供する。
【0250】
レポーター遺伝子が非侵襲的画像化法によって検出可能なポリペプチドバイオマーカーである場合、病変細胞における合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物を対象者に投与することが関与する方法はさらに、対象者の身体における病変細胞の位置決めを行うことを含み得る。その位置決めは、特定の解像度、例えば１０ｍｍ～１０ｃｍ、少なくとも１０ｍｍ、又は最大１０ｃｍに関連付けることができる。位置決めは、特定の最小検出可能腫瘍サイズ、例えば、３ｍｍ３～１０ｃｍ３の間の腫瘍サイズに関連し得る。場合により、特定の最小範囲は、１ｃｍ３～１０ｃｍ３、又は９００ｍｍ３～１ｃｍ３、又は８００ｍｍ３～９００ｍｍ３、又は７００ｍｍ３～８００ｍｍ３、又は６００ｍｍ３～７００ｍｍ３、又は５００ｍｍ３～６００ｍｍ３、又は４００ｍｍ３～５００ｍｍ３、又は３００ｍｍ３～４００ｍｍ３、又は２００ｍｍ３～３００ｍｍ３、又は１００ｍｍ３～２００ｍｍ３、又は５０ｍｍ３～１００ｍｍ３、又は１０ｍｍ３～５０ｍｍ３、又は３ｍｍ３～１０ｍｍ３サイズであり得る。場合により、非侵襲的イメージングスキャン（ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴなど）で位置決めを行う。場合により、イン・サイツでの外科的介入時に、例えば、目視検査の使用（可視範囲吸収レポーターの場合）により、又は蛍光励起と組み合わせた肉眼検査の使用によって、位置決めを行う。
【0251】
場合により、上記の追加の位置決め段階を行った後に、検出された及び／又は位置決めされた病変細胞を除去する外科的段階を行い得る。その外科的段階は、バイオマーカーをコードする組成物を投与する、及び／又は病変細胞を位置決めする者と同じ又は異なる当事者が実施することができる。外科的段階は、病変細胞又は病変細胞に関連する腫瘍の外科的切除であることができる。外科的又は非外科的除去段階には、放射線手術（ガンマナイフ、Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ、ＣｙｂｅｒＫｎｉｆｅ、及び標的電離放射線を用いて病変細胞を殺す関連技術などがあるが、これらに限定されない）などの低侵襲殺滅技術を含み得る。
【0252】
場合により、操作核酸は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与することができる。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、操作核酸は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与され得る。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0253】
場合により、当該方法は、対象者から生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、乳汁、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮スワブ掻き取り物など、外部からアクセス可能な組織の自然に放出された身体物質又は非破壊的掻き取り物からなるサンプルなどがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル又はそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。場合により、組成物を対象者に投与してから一定期間にわたり、生体サンプルを採取することができる。
【0254】
細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、又は少なくとも約１ヶ月培養され得る。細胞の集団は、遺伝子構築物を細胞に送達した後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大で約３６時間、最大で約４８時間、最大で約３日、最大で約４日、最大で約５日、最大で約６日、最大で約７日、最大で約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、又は最大で約１か月培養することができる。
【0255】
場合により、当該方法は、ポリペプチド又は核酸配列を検出することを含み得る。検出は、光音響、生物発光、蛍光レポーター、化学発光、発光、比色分析、又は核酸アッセイを含み得る。検出はまた、イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイには、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているものなどがある。イムノアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成する、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどを用いることができる。
【0256】
当該検出方法は、配列決定を含み得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0257】
検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法を含むことができる（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0258】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0259】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0260】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0261】
改善された安全性及び持続的な合成バイオマーカー発現のためのＣＥＬｉＤベースの設計及び方法
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡと比べて、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖がそれらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されており、前記プロモーターが、非病変細胞での合成バイオマーカー発現より優先的に病変細胞での合成バイオマーカー発現を誘発することで、非病変細胞と比べて病変細胞で発現される合成バイオマーカーの相対濃度が１．０を超える組成物を提供する。
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡと比べて、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖がそれらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されており、前記プロモーターが、非病変細胞での合成バイオマーカー発現より優先的に病変細胞での合成バイオマーカー発現を誘発することで、非病変細胞と比べて病変細胞で発現される合成バイオマーカーの相対濃度が１．０を超える組成物を提供する。
【0262】
場合により、疾患は、がん、自己免疫疾患（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、又は神経変性疾患（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）であることができる。例示的ながん、自己免疫疾患及び神経変性疾患には、本明細書に記載のもののいずれかなどがある。場合により、その疾患は、ウィルス感染であり得る。例示的なウィルス感染には、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタイン－バーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型によって引き起こされるものなどがあるが、これらに限定されない。
【0263】
場合により、直鎖ベクターは、合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み得るものであり、ＩＴＲは、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に由来する。場合により、ＡＡＶはＡＡＶ２であることができる。場合により、プロモーターは、対象者における複数の病変細胞において選択的に合成バイオマーカーの発現を駆動し得る。
【0264】
場合により、プロモーターは細胞型特異性を有し得る。場合により、プロモーターは汎がん特異的プロモーターである。場合により、プロモーターはがん特異的プロモーターであり得る。場合により、プロモーターは、本明細書に記載の特定のプロモーターのいずれかであり得る。
【0265】
場合により、合成バイオマーカーは、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー及びそれらの組み合わせ、並びにそれらの任意の組み合わせを含み得る。検出可能な核酸バイオマーカーは、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコード化バージョン、又は他のタイプの定量可能なＲＮＡであり得る。定量可能な核酸バイオマーカーは、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な特有の配列を含み得る。
【0266】
一部の態様において、本開示は、（ａ）合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡと比べて、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖がそれらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されている組成物を対象者に投与すること；及び（ｂ）合成バイオマーカーを検出することを含む病変細胞の確認方法であって、前記合成バイオマーカーが、対象者において非病変細胞での合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞で発現されることで、非病変細胞に対する病変細胞で発現される合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より高い方法を提供する。
【0267】
合成バイオマーカーが非侵襲的イメージング法によって検出可能なポリペプチドバイオマーカーである場合、病変細胞における合成バイオマーカーの発現を誘発する組成物を対象者に投与することが関与する方法は、（ｄ）対象者の体内で病変細胞を位置決めすることをさらに含み得る。位置決めは、特定の解像度、例えば１０ｍｍ～１０ｃｍ、少なくとも１０ｍｍ、又は最大１０ｃｍに関連付けることができる。位置決めは、特定の最小検出可能腫瘍サイズ、例えば、３ｍｍ３～１０ｃｍ３の腫瘍サイズに関連し得る。場合により、特定の最小範囲は、１ｃｍ３～１０ｃｍ３、又は９００ｍｍ３～１ｃｍ３、又は８００ｍｍ３～９００ｍｍ３、又は７００ｍｍ３～８００ｍｍ３、又は６００ｍｍ３～７００ｍｍ３、又は５００ｍｍ３～６００ｍｍ３、又は４００ｍｍ３～５００ｍｍ３、又は３００ｍｍ３～４００ｍｍ３、又は２００ｍｍ３～３００ｍｍ３、又は１００ｍｍ３～２００ｍｍ３、又は５０ｍｍ３～１００ｍｍ３、又は１０ｍｍ３～５０ｍｍ３、又は３ｍｍ３～１０ｍｍ３のサイズであり得る。場合により、非侵襲的イメージングスキャン（ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴなど）で位置決めが行われる。場合により、イン・サイツでの外科的介入時に、例えば、視覚検査の使用（視界吸収レポーターの場合）を用いることで、又は蛍光励起と組み合わせた視覚検査を用いることで位置決めが行われる。
【0268】
場合により、上記の追加の位置決め段階の後に、検出された及び／又は位置決めされた病変細胞を除去するための外科的段階を行うことがある。外科的段階は、バイオマーカーをコードする組成物を投与する、及び／又は病変細胞を位置決めする関係者と同じ又は異なる関係者によって実施され得る。外科的段階は、病変細胞又は病変細胞に関連する腫瘍の外科的切除であることができる。外科的又は非外科的除去段階には、放射線手術（ガンマナイフ、Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ、Ｃｙｂｅｒｋｎｉｆｅ、及び標的電離放射線を用いて病変細胞を殺す関連技術などがあるが、これらに限定されない）などの低侵襲殺滅技術が関与し得る。
【0269】
場合により、当該組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与される。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、当該組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与される。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0270】
場合によっては、病変細胞の検出は、少なくとも約５０％、少なくとも約５３％、少なくとも約５５％、少なくとも約５７％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％６３％、少なくとも約６５％、少なくとも約６７％、少なくとも約７０％、少なくとも約７２％、少なくとも約７５％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、８３％、少なくとも約８４％、８５％、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の精度を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約５３％、５５％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の精度を有し得る。
【0271】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の感度を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の感度を有することができる。
【0272】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の特異性を有し得る。場合によっては、病変細胞の検出は、最大で約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の特異性を有し得る。
【0273】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．２％、９５．５％、９５．７％、９６％、９６．２％、９６．５％、９６．７％、９７％、９７．２％、９７．５％、９７．７％、９８％、９８．２％、９８．５％、９８．７％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．７％、又は９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の負の予測値（ＮＰＶ）を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．２％、９５．５％、９５．７％、９６％、９６．２％、９６．５％、９６．７％、９７％、９７．２％、９７．５％、９７．７％、９８％、９８．２％、９８．５％、９８．７％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．７％、又は９９．９％、又はこれらの値の間の任意の範囲のＮＰＶを有し得る。
【0274】
場合により、病変細胞の検出は、少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、６０％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３ ％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲の陽性予測値（ＰＰＶ）を有し得る。場合により、病変細胞の検出は、最大で約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、６０ ％、６３％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれらの値の間の任意の範囲のＰＰＶを有し得る。
【0275】
場合により、病変細胞の検出には、対象者に対して実施される非侵襲的イメージング法を使用することが関与し得る。非侵襲的イメージング法は、光音響、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、又はＰＥＴイメージングであり得る。そのイメージング法は、対象者への組成物投与から少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、又は少なくとも約１年間行うことができる。そのイメージング法は、対象者への組成物投与から最大約１５分、最大約３０分、最大約１時間、最大約２時間、最大約４時間、最大約８時間、最大約１６時間、最大約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１ヶ月、最大約２ヶ月、最大約３ヶ月、最大約４ヶ月、最大約５ヶ月、最大約６ヶ月、又は最大約１年間行うことができる。一部の実施形態において、イメージング法は、対象者への組成物の投与後に複数回実行され得る（例えば、経時的な合成バイオマーカーレベルのモニタリングを行うため）。イメージング方法は、対象者に組成物を投与した後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回実行することができる。イメージング方法は、対象者に組成物を投与した後、週１回又は月１回実施することができる。
【0276】
場合により、病変細胞の検出には、対象者からの生体サンプルからの検出が関与し得る。場合により、当該方法は、対象者から生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な非侵襲サンプルには、唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、乳汁、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮スワブ掻き取り物など、外部からアクセス可能な組織の自然に放出された身体物質又は非破壊的掻き取り物からなるサンプルなどがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって採取されたサンプルであり得る。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル又はそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。
【0277】
場合により、検出は、組成物を対象者に投与してから一定期間行うことができる。その期間は、組成物を対象者に投与してから少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月であることができる。その期間は、組成物を対象者に投与してから、最大約１５分、最大約３０分、最大約１時間、最大約２時間、最大約４時間、最大約８時間、最大約１６時間、最大約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日間、最大約４日間、最大約５日間、最大約６日間、最大約７日間、最大約８日間、最大約９日間、最大約１０日間、最大約１１日間、最大約１２日間、最大約１３日間、最大約１４日間、最大約１５日間、最大約１ヶ月、最大約２ヶ月、最大約３ヶ月、最大約４ヶ月、最大約５ヶ月、又は最大約６ヶ月であることができる。一部の実施形態において、生体サンプルを取得することができ、組成物を対象者投与した後に複数回、バイオマーカー検出プロトコールを実行することができる（例えば、経時的な合成バイオマーカーレベルのモニタリングを行うため）。生体サンプルからの検出は、対象者に組成物を投与した後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回行うことができる。生体サンプルからの検出は、対象者に組成物を投与した後、週１回又は月１回行うことができる。
【0278】
正常な臓器組織からのバックグラウンドバイオマーカー発現を低減するための設計及び方法
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーを発現するベクターを含む組成物であって、当該合成バイオマーカーが、病変細胞と比べて正常な器官細胞において約１０％以下の発現を示す組成物を提供する。場合により、前記臓器は、肝臓、腎臓、脾臓、又はそれらの組み合わせであることができる。場合により、前記ベクターは、合成バイオマーカーに作動可能に連結されたプロモーターをコードする組換え核酸を含むことができる。
一部の態様において、本開示は、合成バイオマーカーを発現するベクターを含む組成物であって、当該合成バイオマーカーが、病変細胞と比べて正常な器官細胞において約１０％以下の発現を示す組成物を提供する。場合により、前記臓器は、肝臓、腎臓、脾臓、又はそれらの組み合わせであることができる。場合により、前記ベクターは、合成バイオマーカーに作動可能に連結されたプロモーターをコードする組換え核酸を含むことができる。
【0279】
プロモーターは、汎がん特異的プロモーター、がん特異的プロモーター、又は本明細書に記載の特異的プロモーターのいずれかを含み得る。
【0280】
合成バイオマーカーには、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。検出可能な核酸は、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコード化バージョン、又は他のタイプの定量可能なＲＮＡであり得る。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な特有の配列を含み得る。
【0281】
ベクターは、正常な肝臓、脾臓、又は腎臓細胞における核酸配列の転写又はｍＲＮＡ半減期をサイレンシング又は減衰させる調節要素を含み得る。調節要素は、組換え核酸の転写されているが非翻訳領域にある１以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。１以上のｍｉＲＮＡ標的配列の存在は、組換え核酸配列からの発現を阻害し得る。１以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも一つの組織特異的ｍｉＲＮＡに対する少なくとも一つのｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。少なくとも一つの組織特異的ｍｉＲＮＡは、正常な肝臓、腎臓、又は脾臓組織で豊富化された少なくとも一つのｍｉＲＮＡを含み得る。正常な肝組織で豊富化された少なくとも一つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－３３、ｍｉＲ－３３＊、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４８ａ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２９、又はそれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されるものではない。
【0282】
当該組成物は、本明細書に記載のトランスフェクション剤を含み得る。
【0283】
合成又は人工細胞の設計／合成バイオマーカーとともに使用する方法
一部の態様において、本開示は、非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発することで、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子を提供する。非病変細胞と比べて病変細胞で発現されるバイオマーカーの相対濃度比を１．０より大きくすることを含む、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子を提供する。
一部の態様において、本開示は、非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発することで、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子を提供する。非病変細胞と比べて病変細胞で発現されるバイオマーカーの相対濃度比を１．０より大きくすることを含む、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子を提供する。
【0284】
操作粒子は、人工細胞、最小細胞、又は脂質封入合成粒子であることができる。人工細胞の製造は、例えばＢａｓｔｉａａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ２０１７， ５０ （４）， ｐｐ ７６９－７７７（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。操作粒子は、生体膜、高分子膜、単純なポリマー、架橋タンパク質、脂質膜、又は精製された成分とともにイン・ビトロ又はイン・ビボでナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、エキソソーム、微小胞、アポトーシス小胞、輸送小胞、シナプス小胞、分泌小胞、又はマイクロカプセルに形成されたポリマー－脂質複合体を含み得る。操作粒子は、膜貫通キメラタンパク質、又は粒子内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結された粒子外特異的結合ドメインを含む天然タンパク質を含むことができ、粒子内シグナル伝達ドメインは、操作粒子内の少なくとも一つの酵素反応を活性化することができる。操作粒子は、合成バイオマーカーをコードする核酸配列を含むことができ、少なくとも一つの酵素反応により、操作粒子内で合成バイオマーカーが生成する。例示的な合成バイオマーカーには、本明細書に記載の任意のレポーターなどがある。粒子外特異的結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片を含み得る。操作粒子は、無傷の細胞から単離された細胞質及び他の成分を含み得る。操作粒子は、細胞タンパク質、ＤＮＡ、合成遺伝子回路、オルガネラ、ＡＴＰ、酵素、ＮＡＤＰ、転写因子、ヌクレオチド、又は無細胞転写翻訳抽出物などの、精製された組換え高分子成分又は高分子成分を含み得るが、これらに限定されない。
【0285】
疾患の検出及び／又は対象者の疾患のプロファイル生成のための多重組み合わせバイオマーカーを使用する合成バイオマーカー設計及び方法
一部の態様において、本開示は、少なくとも一つのベクターであって、当該少なくとも一つのベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、当該プロモーターが、細胞中の複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、当該プロモーターが、対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞における複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、非病変細胞と比べて病変細胞で発現される複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなるベクターを提供する。一部の実施形態において、前記プロモーターのそれぞれは、前記対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞と比べて前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなる。
一部の態様において、本開示は、少なくとも一つのベクターであって、当該少なくとも一つのベクターが、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、当該プロモーターが、細胞中の複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、当該プロモーターが、対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞における複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、非病変細胞と比べて病変細胞で発現される複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなるベクターを提供する。一部の実施形態において、前記プロモーターのそれぞれは、前記対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞と比べて前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなる。
【0286】
一部の態様において、本開示は、対象者の疾患のプロファイルを生成する方法を提供する。当該方法は、前記対象者の１以上の細胞を複数の遺伝子構築物と接触させることを含み、前記複数の遺伝子構築物は、それぞれ複数のバーコード分子に作動可能に連結された複数の疾患活性化プロモーターを含み、当該疾患活性化プロモーターは、疾患に影響を受けた細胞での対応するバーコード分子の発現を駆動する。さらに、当該方法は、プロファイルを生成するために複数のバーコード分子の発現レベルを定量することを含む。一部の実施形態では、当該方法は、疾患又はそれのないことを検出するために分類器（機械学習又は分類器アルゴリズム）を用いる前記複数の疾患活性化プロモーターに対応するバーコード分子の発現レベルを含む生成したプロファイルに基づいて疾患を検出することをさらに含む。
【0287】
比較的大きいグループ内の特有の構成員に専用ラベルを帰属させることにより、バーコードは、多くの構成員のより大きな及びより複雑な混合物（例えば、同じ細胞内で発現される複数のプロモーター－レポーター構築物）の文脈内でその構成員を識別及び定量する機会（例えば、特定のがん特異的プロモーターの制御下でのレポーターの発現）を与え、そして複雑な混合物から単一の構成員を単離する機会を提供する。例えば、核酸に基づくバーコードの場合、塩基対の相補性に基づくバーコードのハイブリダイゼーションを用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。ペプチドに基づくバーコードの場合、免疫捕捉又はリガンドと受容体の相互作用を含む特有の特徴を用いて、前記捕捉事象によって混合物を捕捉及び単離するか、さもなければ複雑さを低下させることができる。
【0288】
この方法は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のＡＵＣ（曲線下面積）値で前記疾患又はそれのないことを検出することをさらに含む。この方法はさらに、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の特異性で前記疾患又はそれのないことを検出することを含む。この方法はさらに、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の感度で前記疾患又はそれのないことを検出することを含む。
【0289】
第１ラウンドのスクリーニングにおいてバーコード分子レベルを定量し、特定の疾患、例えば特定のがん（すなわち、乳がん）、又は特定の組織起源内のがんを決定した後、前記特定のがん（すなわち、乳がん）活性化プロモーターをエクス・ビボ又はイン・ビボで用いて、第１ラウンドのスクリーニングを通過した同じ対象者の１以上の細胞をトランスフェクションすることができる。以降のラウンド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）は、次のラウンド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）は、疾患の識別（組織の起源の識別を含む）の精度を高めるのに役立ち得る。
【0290】
一部の実施形態では、１以上の細胞を接触させる方法は、エクス・ビボで実施することができる。一部の実施形態では、１以上の細胞を接触させる方法は、イン・ビボで実施することができる。
【0291】
一部の実施形態では、前記少なくとも一つのベクターは、上記の全ての要素を含む単一のベクターであり得る。一部の実施形態において、前記少なくとも一つのベクターは、それぞれが別個のプロモーターを含む複数のベクターであり得る。一部の実施形態において、それぞれが別個のプロモーターを含む前記複数のベクターのそれぞれはまた、別個のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を含む。前記少なくとも一つのベクターが、それぞれが別個のプロモーターを含む複数のベクターである場合、当該ベクターは、互いに少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５６時間、又は少なくとも７２時間内で投与され得る。前記最大で一つのベクターが、それぞれが別個のプロモーターを含む複数のベクターである場合、当該ベクターは、互いに最大で８時間、最大で１２時間、最大で１６時間、最大で２４時間、最大で３２時間、最大で４８時間、最大で５６時間、又は最大で７２時間内で投与され得る。
【0292】
一部の実施形態において、前記別個のプロモーターは、疾患活性化プロモーターである。一部の実施形態において、前記疾患活性化プロモーターは、本明細書で開示のがん活性化プロモーターである。一部の実施形態において、前記複数のがん活性化プロモーターは、異なる組織起源内の複数のがんにおいて活性化されるプロモーターを含む。例えば、前記複数のがん活性化プロモーターは、肺組織内の肺がんで活性化される第１のプロモーター、肝臓組織内の肝臓がんで活性化される第２のプロモーター、乳房組織内の乳がんで活性化される第３のプロモーター、膵臓組織内の膵臓がんで活性化される第４のプロモーターなどを含む。一部の実施形態では、前記複数のがん特異的プロモーターが、複数の（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２５以上、又は３０以上の）異なる組織起源で活性化される。
【0293】
一部の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、１以上の異なる種類のがんにおいて活性化された後、検出において強いシグナルを生じる第１のプロモーターを含む。例えば、プロモーターＭＭＰ１１は、ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＥ、ＣＨＯＬ、ＣＯＡＤ、ＥＳＣＡ、ＨＮＳＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＰＡＡＤ、ＯＶ、ＲＥＡＤ、ＳＴＡＤ、ＳＡＲＣなどのがんで活性化された後に検出で強いシグナルを生成する。実施形態では、前記複数のがん特異的プロモーターは、低いバックグラウンドシグナルを生成する第２のプロモーターを含む。例えば、プロモーターＭＭＰ１３は、ＭＭＰ１３が活性化されていないがんの種類の検出において、ほとんど存在しないシグナルを生成する。一部の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、高いシグナル／バックグラウンドシグナル比を有する第３のプロモーターを含む。例えば、プロモーターＭＭＰ１２は、ＭＭＰ１２が活性化され得る特定のがん種において活性化された後に検出において十分な量のシグナルを生成し、同時に、ＭＭＰ１２が活性化されるように設計されていない特定のがん種での検出において低いシグナルを生成する。ある種の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、本明細書に開示の３種類全てのプロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、検出において高いシグナルを有する１以上のプロモーター及び検出において低いバックグラウンドシグナルを有する１以上のプロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、検出において高いシグナルを有する１以上のプロモーター、及び高いシグナル／バックグラウンドシグナル比を有する１以上のプロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数のがん特異的プロモーターは、検出において低いバックグラウンドシグナルを有する１以上のプロモーター、及び高いシグナル／バックグラウンドシグナル比を有する１以上のプロモーターを含む。
【0294】
ある種の実施形態において、前記複数の疾患活性化プロモーターは、選択されたグループの組織起源に対して選択的であり、そこで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む。例えば、前記複数の疾患活性化プロモーターは、乳房、肺、肝臓などの複数の組織に対して選択的であり、そこで活性化される１以上のプロモーターを含む。一部の実施形態では、前記複数の疾患活性化プロモーターは、同じ組織起源に対して選択的であり、そこで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む。例えば、前記複数の疾患活性化プロモーターは、いくつかの異なるプロモーターを含み、それらのそれぞれは、乳房組織などの同じ組織に対して選択的であり、そこで活性化される。
【0295】
ある種の実施形態において、前記複数の疾患活性化プロモーターは、それぞれ同じ組織起源内のがんの複数の異なる分子サブタイプで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む。例えば、前記複数の疾患活性化プロモーターは、ルミナルＡ乳がん、ルミナルＢ乳がん、トリプルネガティブ／基底様乳がん、ＨＥＲ２豊富乳がん、及び／又は正常様乳がんにおいて活性化される複数の疾患特異的プロモーターを含む。前記複数の疾患活性化プロモーターは、ＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３、及び／又はＣＭＳ４結腸直腸がんにおいて活性化される複数の疾患特異的プロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数の疾患活性化プロモーターは、組織起源内のがんの一つの分子サブタイプで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む。例えば、前記複数の疾患活性化プロモーターは、ルミナルＡ乳がんで活性化される複数の異なるプロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数の疾患活性化プロモーターは、組織起源内のがんの一つのステージで活性化される２以上の異なるがん活性化プロモーターを含む。ある種の実施形態において、前記複数の疾患活性化プロモーターは、組織起源内の分子サブタイプを有するがんの異なるステージで活性化される疾患特異的プロモーターを含む。
【0296】
場合により、疾患は、がん、自己免疫疾患（例えば、自己指向性活性を有するＴ細胞又はリンパ球、又は自己免疫によって損傷を受けた正常細胞）、又は神経変性疾患（例えば、有毒なアミロイドを有する細胞又は有毒なアミロイドの近位にある細胞）である。例示的ながんには、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び腺腫などがあるが、これらに限定されない。癌腫は、肺、乳房、結腸などの身体の内部及び外部を覆う細胞から発生する可能性がある。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、結合組織、筋肉、及び他の支持組織にある細胞から発生する可能性がある。リンパ腫は、リンパ節や免疫系組織で発生する可能性がある。白血病は骨髄で発生し、血流に蓄積する可能性がある。腺腫は、甲状腺、下垂体、副腎、及び他の腺組織で発生する可能性がある。がんの種類の具体的な例示的な例には、本開示による方法による検出に適したものが含まれ、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、付属器がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、表皮腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルシノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポシ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞及び小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、潜在性原発を伴う転移性扁平頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び傍鼻洞がん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、栄養芽細胞性腫瘍（妊娠中）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路癌、乳管癌、乳腺小葉癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、腎臓嫌色素癌、腎臓明細胞癌、腎臓乳糖細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、傍神経節腫及び褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞がん、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体類内膜癌、ブドウ膜黒色腫、唇黒色腫、紡錘細胞癌、脂肪肉腫、鼻肉腫、乳腺癌、インスリン腫、骨肉腫、マスト細胞腫瘍、血管肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、辺縁リンパ腫、悪性黒色腫、又は慢性リンパ球性白血病などがある。
【0297】
場合により、当該疾患は、ウィルス感染であり得る。例示的なウィルス感染には、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタインバーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型によって引き起こされるものなどがあるが、これらに限定されない。
【0298】
場合により、当該疾患は、自己免疫疾患であり得る。例示的な自己免疫疾患には、アカラシア、アディソン病、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、アレタ脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経神経障害（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜気腫、良性気腫、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、チャガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ－ストラウス症候群（ＣＳＳ）又は好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素性疾患、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ヘルペス性皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、エッセンシャル混合クリオグロブリン血症動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹又は妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性嚢胞炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランベンルト－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、ムーレン潰瘍、ムチャハーバーマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）又はＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重力性筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児狼瘡、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼の瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、パリンドローム性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、毛様体扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、パーソネージ－ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、末梢性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発性筋痛、多巣性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆道肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、ササック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨大細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサハント症候群（ＴＨＳ）、横脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、硝子体炎、及びフォークト・小柳・原田病などがあるが、これらに限定されない。
【0299】
場合により、当該疾患は、神経変性疾患であり得る。神経変性疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、又はヘルペスウィルス科、ポリオーマウィルス科、ボルナウィルス科、オルトミクソウィルス科、パラミクソウィルス科、ラブドウィルス科、フラビウィルス科、ピルコナウィルス科、又はレトロウィルス科のウィルスによる感染による神経変性などがあるが、これらに限定されるものではない（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ Ｊ． ２０１３；１０：１７２を参照）。
【0300】
場合により、当該疾患は、ウィルス感染であり得る。例示的なウィルス感染には、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタインバーウィルス、サイトメガロウィルス、及びヒトＴリンパ球向性ウィルスＩＩＩ型によって引き起こされるものなどがあるが、これらに限定されない。
【0301】
場合により、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列のうちの少なくとも一つは、非侵襲的イメージングによって検出可能なポリペプチドの配列を含み得る。このような非侵襲的イメージング法には、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光音響イメージング、及び生物発光イメージングなどがある。ＭＲＩイメージングで検出可能な合成バイオマーカーポリペプチドには、フェリチン（又はパイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ）フェリチン変異体Ｌ５５Ｐ、Ｆ５７Ｓ、Ｆ１２３Ｓなどのそれの変異体）、又はランタニド結合タンパク質（又はＤａｕｇｈｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２， １３， ２５６７－２５７４に記載のＬＢＴ－ユビキチン融合物などのそれの操作融合物）などのポリペプチド造影剤などがある。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングで検出可能な合成バイオマーカーには、ヒトヨウ化ナトリウム共輸送体（例えば、ＰＥＴ活性ヨウ素／ヨウ化物同位体の投与と組み合わせて、例えばＰｅｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ；１２（１）：３３－４７を参照）、ＨＳＶ－ｔｋ又はＨＳＶ－ｓｒ３９ｔｋなどのそれの変異体（例えば、［１８Ｆ］ＦＨＢＧなどのポジトロン標識アシクログアノシン又はピリミジン類縁体ＰＥＴレポーターの投与と組み合わせて、Ｙａｇｈｏｕｂｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６；１（６）：３０６９－７５）、及びドーパミンＤ２受容体又はＤ２Ｒ８０Ａ又はＤ２Ｒ１９４Ａなどのそれの変異体（例えば、３－（２′－［１８Ｆ］－フルオロエチル）－スピペロンなどのポジトロン標識Ｄ２結合剤の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、β－ガラクトシダーゼ（例：Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はその誘発体）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘発体）、バクテリオフィトクロームに基づく近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、 ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３ ／ Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ ／ Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的に光スイッチ可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、ＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。生物発光イメージングによって検出可能な合成バイオマーカーには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケシフェラーゼ、及びフォチヌスルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンを含む）などのルシフェラーゼ（例えば、本明細書に記載のセレンテラジンの投与と組み合わせて）などがある。一部の実施形態において、合成バイオマーカーは、造影剤、検出可能な分子を産生する酵素、又は検出可能な分子の蓄積を駆動するトランスポーターであることができる。合成バイオマーカーは、対象者の体内でイン・サイツで測定することができる。合成バイオマーカーは、光音響レポーター、生物発光レポーター、自己蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、若しくは比色レポーター、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
【0302】
場合により、前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列は、対象者からの生体サンプル中の検出可能なポリペプチド又は核酸をコードすることができる。バイオマーカーがポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。例示的なポリペプチドバイオマーカーには、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。自家蛍光レポーターには、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体などがある。比色レポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせ）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素などがある。生物発光、化学発光又は発光レポーターには、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９６（２０１０）：２９０－２９７に記載の操作Ｐｐｙ ＲＥ８及びＲＥ９バージョンなど）などのルシフェラーゼ類（例えば、本明細書に記載のセレンテラジン類の投与と組み合わせて）などがある。光音響イメージングで検出可能なレポーターには、β－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌの投与と組み合わせて）及びチロシナーゼなどの色素産生酵素、自己蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はそれらの誘導体など）、非蛍光ＧＦＰ様色素タンパク質（例えば、ａｅＣＰ５９７及びｃｊＢｌｕｅ及びそれらの誘導体）、バクテリオフィトクローム系の近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４、Ｗｉ－Ｐｈｙ、ＩＦＰ１．４ｒｅｖ、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、ｉＲＦＰ７１３／Ｖ２５６Ｃ、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ６７０、ｍＩＦＰ、ｉＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ＧＡＦ－ＦＰ、ＢｐｈＰ１－ＦＰ／Ｃ２０Ｓ、又はＡｐｈＢバリアント）、及び可逆的光スイッチ可能タンパク質（Ｄｒｏｎｐａ、Ｄｒｏｎｐａ－Ｍ１５９Ｔ、及びＢｐｈＰ１又はそのバリアントなど）などがある。合成バイオマーカーは、対象者の身体内でイン・サイツで測定することができる。合成バイオマーカーは、光音響レポーター、生物発光レポーター、自己蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、若しくは比色レポーター、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
【0303】
場合により、核酸バイオマーカーは、例えば天然若しくは遺伝子操作ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡヘアピン、ＲＮＡアプタマー又はそれらのバーコード化バージョンである。前記検出可能な核酸バイオマーカーは、リボザイム、自己スプライシングイントロン、ＲＮＡヘアピン、マイクロＲＮＡ、又はそれらのバーコードバージョン、又は他の種類の定量可能ＲＮＡであることができる。定量可能な核酸は、定量的ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能な固有の配列を含み得る。核酸がｍｉＲＮＡである場合、ｍｉＲＮＡは、例えば縮重プライマーに基づくアニーリング及びライゲーション、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ標識とそれに続くＲＴ若しくはライゲーション、又はｑ－ＰＣＲ、配列決定若しくは電気泳動検出法と組み合わせた連続アダプターライゲーションなどの標準ライブラリー生成技術によって検出することができる。バイオマーカーがポリペプチドである場合、そのポリペプチドは、Ｎ末端分泌シグナル配列（例えば、ＣＤ３３又はＣＤ８ａからのＮ末端シグナルペプチド）を含み得る。
【0304】
核酸が操作されたｍｉＲＮＡである場合、その核酸は、ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ ＯＮ Ｅ １１（７）：ｅ０１５９３６９）らに記載されているＳｅｃ－ｍｉＲ又はｍｉＲ－ｎｅｇ構築物であることができる。このような構築物は、（ａ）内因的に発現されず、既知の脊椎動物標的を持たないコード配列（例えば、Ｓｅｃ－ｍｉＲ ５′－ＡＡＡＵＧＵＡＣＵＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＡＣ－３′）；（ｂ）前記コード配列に隣接する成熟ｍｉＲＮＡへのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのプロセシングを提供するｍｉＲバックボーン配列（例えば、ｍｉＲ－１５５又はｍｉＲ－１３０バックボーン配列）；（ｃ）エクソソーム（例：ＧＧＡＧ）へのローディングを強化するＥＸＯモチーフを含む。そのようなｍｉＲＮＡ構築物は、例えば、レポーターポリペプチドをコードする遺伝子の３′－ＵＴＲで、又は適切に非毒性のタンパク質（例えば、アクチンやチューブリンなどの内因性構造タンパク質、又はユビキチンなどの高度に発現されるタンパク質）をコードする遺伝子の３′－ＵＴＲから発現させることができる。一部の実施形態において、操作ｍｉＲＮＡの複数のコピー（例えば、少なくとも２つ、少なくとも４つ）は、タンデムで提供され得る。
【0305】
ある種の実施形態において、バーコード分子は、前記遺伝子構築物の疾患特異的プロモーターを一意的に識別することができる。バーコード分子は、ヌクレオチド配列又はペプチド配列を含み得る。ある種の実施形態において、バーコード分子は、固有のＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。バーコード分子がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡはｍｉＲＮＡ骨格から処理されたバーコードである。ある種の実施形態において、ｍｉＲＮＡ骨格は、前記ｍｉＲＮＡ骨格に由来する５′、３′、及びループ領域、並びに前記バーコードを含むステム領域を含む。ある種の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、本明細書に記載の操作されたｍｉＲＮＡであり得る。バーコードがペプチド配列を含む場合、バーコードは酵素レポーターを含む。ペプチド配列は、本明細書に記載のＮ末端分泌シグナル配列を含み得る。さらに、ペプチド配列は、本明細書に記載の非侵襲的イメージングによって検出可能であり得る。
【0306】
場合により、少なくとも一つのベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかであり得る。一部の実施形態において、遺伝子構築物は、非ウィルスベクターを含む。一部の実施形態において、非ウィルスベクターはナノプラスミドである。一部の実施形態において、遺伝子構築物は、複製能のない組換えビリオン又はそれに由来する単離された逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態において、ビリオンは、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、アデノウィルス、又はγ－レトロウィルスビリオンであり得る。一部の実施形態において、ビリオンは、感染した細胞内で主にエピソームゲノムを維持するウィルスに由来する。一部の実施形態において、複製能のないビリオンは、組換えアデノウィルスベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶは、血清型１、２、３、４、５、６、８、９、Ａｄ５、Ａｄ－ＲＧＤ、又はＡｄ－１９ａ／６４、又はそれらの疑似型変異体である。
【0307】
場合により、前記複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターは、少なくとも一つのプロモーターを含み得る。前記複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個のプロモーターを含み得る。前記複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターは、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、又は最大１５個のプロモーターを含み得る。
【0308】
場合により、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された前記複数の異なるプロモーターは、表２からの少なくとも一つのプロモーターを含み得る。複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された前記複数の異なるプロモーターは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個の表２からのプロモーターを含み得る。複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された前記複数の異なるプロモーターは、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大８、最大９、最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、又は最大１５個の表２からのプロモーターを含み得る。
【0309】
一部の態様において、本開示は、対象者における疾患の検出方法であって、（ａ）上記の少なくとも一つのベクターを含む組成物（例えば、複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、前記プロモーターが細胞内の前記複数の核酸配列の発現を駆動して複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、前記プロモーターが、対象者での非病変細胞における複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞における複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、非病変細胞と比べて病変細胞で発現される複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の相対比が１．０より大きくなる。）を対象者に投与すること；（ｂ）前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出することで、発現プロファイルを得ること；及び（ｃ）前記発現プロファイルに基づいて前記病変細胞を検出することで、前記疾患を検出することを含む方法を提供する。
【0310】
場合により、対象者における疾患の検出方法は、対象者からのサンプルから前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出することを含む。場合により、この方法は、対象者から生体サンプルを単離することを含み得る。生体サンプルは、対象者から非侵襲的方法によって採取されたサンプルであることができる。例示的な非侵襲サンプルには、自然に流れ出る身体物質又は体外的にアクセス可能な組織の非破壊的掻き取り物、例えば唾液、痰、汗、尿、便、精液、粘液、頸膣分泌物、母乳、粘膜分泌物、涙、及び頬上皮綿棒採取物などがあるが、これらに限定されない。生体サンプルは、対象者から低侵襲的方法によって収集されたサンプルであることができる。例示的な低侵襲性サンプルには、血液サンプル若しくはそれの画分（例えば、静脈穿刺又は毛細管によって得られる）、胸水サンプル（例えば、胸腔穿刺によって得られる）、羊水サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）、及び胃液サンプル（例えば、羊水穿刺によって得られる）などがあるが、これらに限定されない。例えば、胃洗浄によって得られる）。生体サンプルは、皮膚生検サンプル（例えば、パンチ生検、薄片生検、樋状掻爬生検、楔状生検、切開生検、又は切除生検によって得られる）、骨髄サンプル（例えば、吸引生検によって得られる）、リンパ節又は乳房生検（例えば、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は画像案内式生検によって得られる）、外科的生検サンプル（例えば、切除又は切開生検によって得られる内臓のもの）、又は口、消化管、肺、膀胱若しくは尿路の生検サンプル（例えば、内視鏡検査で得られるもの）などの生検によって得られるサンプルであることができる。
【0311】
場合により、生体サンプルは、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与から一定期間後に得ることができる。生体サンプルは、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与後、少なくとも約１５分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月にわたり得ることができる。生体サンプルは、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与後、最大で約１５分、最大で約３０分、最大で約１時間、最大で約２時間、最大で約４時間、最大で約８時間、最大で約１６時間、最大で約２４時間、最大約３６時間、最大約４８時間、最大約３日、最大約４日、最大約５日、最大約６日、最大約７日、最大約８日、最大で約９日、最大で約１０日、最大で約１１日、最大で約１２日、最大で約１３日、最大で約１４日、最大で約１５日、最大で約１か月、最大で約２ヶ月、最大で約３ヶ月、最大で約４ヶ月、最大で約５ヶ月、又は最大で約６ヶ月にわたり取得することができる。一部の実施形態では、生体サンプルを取得することができ、任意のバイオマーカー検出プロトコルを、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与後に複数回実行することができる（例えば、合成バイオマーカーレベルを経時的にモニタリングするため）。生体サンプルは、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５回得ることができる。生体サンプルは、少なくとも一つのベクターを含む組成物の投与後、週１回又は月１回得ることができる。
【0312】
場合により、少なくとも一つのベクターを含む組成物は、対象者に対して、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、又は腫瘍近位投与され得る。腫瘍近位的にとは、腫瘍の近位内の組織への投与、又はリンパ系を介して腫瘍にアクセス可能であると予測される領域（例えば、隣接するリンパ節）への投与を示し得る。腫瘍内又は腫瘍近位アプローチには、例えば、超音波内視鏡検査（例：Ｓｈｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． ２０１３；２０１３：２０７１２９を参照）又は気管支鏡（例：Ｒｏｊａｓ－Ｓｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｒｏｎｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｖ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ． ２０１８ Ｊｕｌ；２５（３）：１６８－１７５を参照）などの追加のイメージング技術の使用が関与し得る。一部の実施形態において、少なくとも一つのベクターを含む組成物は、頸部、滑車上顆、鎖骨上、頸部、腋窩、縦隔、滑車上、腸間膜、鼠径部、大腿部、又は膝窩リンパ節のうちの少なくとも一つに投与することができる。場合により、リンパ節に基づく投与は、組織領域への集中的な局所送達の方法として役立つ可能性がある。
【0313】
場合により、少なくとも一つのベクターを含む組成物は、本明細書に記載のトランスフェクション剤を含み得る。
【0314】
場合により、少なくとも一つのベクターを含む組成物は、本明細書に記載の薬学的に許容される担体を含み得る。
【0315】
場合により、対象者における疾患の検出方法は、機械学習又は分類器アルゴリズムを前記発現プロファイルに適用することを含むことができ、前記機械学習又は分類器アルゴリズムは、病変細胞を示す発現プロファイルを非病変細胞を示す発現プロファイルから区別するよう構成されている。
【0316】
機械学習又は分類器アルゴリズムは、一般に、コンピュータシステムによって実行される教師あり学習及び分類アプローチを指す。教師あり学習アプローチでは、２以上の群（例えば、罹患及び非罹患）からのサンプルの群を統計的分類方法で分析する。バイオマーカーの有／無／レベルデータを、２以上の群間を区別する分類器として使用できる。次に、新しいサンプルを分析して、分類器がその新しいサンプルを２以上の群の一つに関連付けることができるようにできる。一般的に使用される管理された分類器／分類器アルゴリズムには、ニューラルネットワーク（多層パーセプトロン）、サポートベクターマシン、ｋ最近傍、ガウス混合モデル、ガウス、ナイーブベイズ、決定木、動径基底関数（ＲＢＦ）分類器などがあるが、これらに限定されるものではない。線形分類法には、フィッシャーの線形判別、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）などがある。本発明で使用するための他の分類器／分類器アルゴリズムには、二次分類器、ｋ最近傍、ブースティング、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、パターン認識、ベイジアンネットワーク及び隠れマルコフモデルなどがある。
【0317】
教師あり法を使用する分類は、一般に、以下の方法論によって実行される。
【0318】
教師あり学習の所与の問題（例えば、手書きを認識することを学習）を解決するために、様々な段階を考慮しなければならない。
【0319】
１．トレーニングセットを集める。これらには、例えば、特定の微生物で汚染された又は汚染されていない食品又は環境からのサンプル、同じ微生物の異なる血清型で汚染されたサンプル、異なる種及び血清型の微生物の組み合わせで汚染された又は汚染されていないサンプルなどがあり得る。トレーニングサンプルは、分類器を「トレーニング」するのに用いられる。
【0320】
２．学習された関数の入力「特徴」表現を決定する。学習した関数の精度は、入力オブジェクトがどのように表現されるかによって決まる。代表的には、入力対象は、その対象を説明する多くの特徴を含む特徴ベクトルに変換される。次元の問題のため、特徴の数は多すぎてはならないが、出力を正確に予測するのに十分な大きさである必要がある。特徴は、本明細書に記載されるような由来の食品又は環境サンプル中に存在する一組の細菌種又は血清型を含むものと考えられる。
【0321】
３．学習された関数及び対応する学習アルゴリズムの構造を決定する。例えば、人工ニューラルネットワーク、決定木、ベイズ分類器、又はサポートベクターマシンなどの学習アルゴリズムを選択する。学習アルゴリズムは、分類器を構築するのに使用される。
【0322】
４．分類器（例えば、分類モデル）を構築する。学習アルゴリズムを、収集したトレーニングセットで実行する。学習アルゴリズムのパラメーターは、トレーニングセットのサブセット（バリデーションセットと称する）でパフォーマンスを最適化することによって、又は交差バリデーションを介して調節することができる。パラメータの調節及び学習の後、アルゴリズムのパフォーマンスは、トレーニングセットとは別の未感作サンプルの試験セットで測定することができる。
【0323】
機械学習分類器（例えば、分類モデル）が上記のように決定されると、それを用いて、サンプル、例えば、上記の少なくとも一つのベクトルを含む組成物の投与を受けた対象者からのサンプルを分類することができる。
【0324】
場合により、複数のベクターからのバイオマーカー又はバーコード分子発現の相対的パターンは、１以上の異なる種類のがんに対応する「固有フィンガープリント」を提供する。
【0325】
場合により、正確ながん検出のための複数のベクトルの予測シリーズを開発するために、人工知能及び機械学習をバイオマーカー発現のパターンに適用することができる方法。
【0326】
場合により、当該方法は、少なくとも一つのベクターによってコードされたポリペプチド又は核酸配列を検出することを含む。検出はまた、イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイには、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同６，１１３，８５５号；同６，０１９，９４４号；同５，９８５，５７９号；同５，９４７，１２４号；同５，９３９，２７２号；同５，９２２，６１５号；同５，８８５，５２７号；同５，８５１，７７６号；同５，８２４，７９９号；同５，６７９，５２６号；同５，５２５，５２４号；及び同５，４８０，７９２号に記載されているものなどがある。イムノアッセイには、対象のタンパク質分析物の存在又は量に関連するシグナルを生成する、各種のサンドイッチ、競合、又は非競合のアッセイ形式などがある。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、側方流動、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどを用いることができる。ポリペプチドがレポーターポリペプチドである場合、検出は、光音響アッセイ、生物発光アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、比色アッセイ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【0327】
当該検出方法は、配列決定を含み得る。配列決定方法には、次世代配列決定、ハイスループット配列決定、パイロ配列決定、従来のサンガー配列決定方法、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定機械（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、及びプライマーウォーキングなどがある。
【0328】
検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎとしても知られる「リアルタイム増幅」法を含むことができる（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄへの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらへの同５，５３８，８４８号、及びＨａａｌａｎｄへの同５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：９８６－９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５－１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７２７６－７２８０， （１９９１）；及びＬｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７－３６２（１９９５））。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法の基礎は、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、二つの異なる蛍光色素で標識された短い（約２０～２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５′末端は代表的にはレポーター色素に結合し、３′末端は消光色素に結合する。プローブは、標的ｍＲＮＡ又はそれから誘導される核酸上の部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計されている。遺伝子座の隣接領域に結合する上流及び下流のＰＣＲプライマーも反応混合物に加えられる。プローブが無傷の場合、二つのフルオロフォア間のエネルギー移動が発生し、消光剤がレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階では、プローブはＴａｑポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド消光剤からレポーターが放出され、レポーターの発光強度が高くなり、それは適切な検出器によって測定することができる。次に、記録された値を用いて、正規化されたレポーター発光強度の増加を連続的に計算し、最終的に増幅されるｍＲＮＡの量を定量することができる。
【0329】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出のために、ＲＴ－ＰＣＲ段階を最初に実行して、細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ＲＴ－ＰＣＲによるそのような増幅は、全般的（例えば、部分的／完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）又は標的化（例えば、後の段階で分析されるべき特定の遺伝子に対して指向されるオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅）のいずれかであり得る。
【0330】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎは、単離された細胞のｍＲＮＡに対して実行される逆転写酵素反応の直後に使用され得る。この多様性は、ｑＰＣＲ時の個々のｍＲＮＡのレベルを定量するのに役立つ。
【0331】
一部の実施形態において、ｑＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ検出又はＲＮＡ配列決定のために、「前増幅」段階は、最初に、細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡに対して行うことができる。これは、検出されるＲＮＡ／ｃＤＮＡの自然なレベルが非常に低い条件でシグナルを増加させる上で役立つ。前増幅のための適切な方法には、ＬＭ－ＰＣＲ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、ランダムヘキサマーＰＣＲ）、ポリＡ特異的プライマーを用いたＰＣＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。前増幅は、全般的であるか、上記の逆転写反応と同じ方法で標的化され得る。
【0332】
以下の具体的実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形であっても、開示の残りの部分を限定するものではない。さらなる詳細がなくとも、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書で引用されている全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0333】
以下の実施例は、当業者に、本明細書に開示及び特許請求される方法を実施する方法並びに組成物及び化合物を使用する方法についての完全な開示及び説明を提供するために提示されるものである。数値（量、温度など）に関して精度を確保するための努力がなしてきたが、いくつかの誤差や逸脱を考慮すべきである。別断の断りがない限り、部は重量部であり、温度は℃単位であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準の温度及び圧力は、２０℃及び１気圧として定義される。
【0334】
表１：本開示による方法及び組成物で有用な配列の例
【表1】
【0335】
【0336】
【0337】
【0338】
【0339】
【0340】
【0341】
実施例
実施例１．－プラスミド及びミニサークル構築
全てのプラスミドは、標準的なＰＣＲ及びクローニング技術を用いて構築し、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）が配列決定した。親プラスミド（ＰＰ）とＭＣの両方を生成するため、カイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：１２８７－１２８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が記載しているシステムを使用した（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）。９７７塩基対（ｂｐ）のスルビビンプロモーターをｐＳｕｒｖ－ＦＬ（Ｒａｙ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ： Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：１８４８－１８５６）から、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ及びウッドチャック肝炎ウィルス転写後エレメント（ＷＰＲＥ）を含むＭＮ－１００ＰＰバックボーン（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）にサブクローニングして、ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＷＰＲＥを生成した。次に、ｐＳＥＬＥＣＴ－ｚｅｏ－ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）からのＳＥＡＰ導入遺伝子をＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＷＰＲＥにサブクローニングして、ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥを生成した（図２Ａ－上）。ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ（ＰＰ）及びＭＣ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ（ＭＣ）（図２Ａ－下）の両方を、カイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８： １２８７－１２８９）が説明しているプロトコール及び供給者の説明書（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）に従って増幅及び精製した。
実施例１．－プラスミド及びミニサークル構築
全てのプラスミドは、標準的なＰＣＲ及びクローニング技術を用いて構築し、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）が配列決定した。親プラスミド（ＰＰ）とＭＣの両方を生成するため、カイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：１２８７－１２８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が記載しているシステムを使用した（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）。９７７塩基対（ｂｐ）のスルビビンプロモーターをｐＳｕｒｖ－ＦＬ（Ｒａｙ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ： Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：１８４８－１８５６）から、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ及びウッドチャック肝炎ウィルス転写後エレメント（ＷＰＲＥ）を含むＭＮ－１００ＰＰバックボーン（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）にサブクローニングして、ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＷＰＲＥを生成した。次に、ｐＳＥＬＥＣＴ－ｚｅｏ－ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）からのＳＥＡＰ導入遺伝子をＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＷＰＲＥにサブクローニングして、ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥを生成した（図２Ａ－上）。ＰＰ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ（ＰＰ）及びＭＣ－ｐＳｕｒｖ－ＳＥＡＰ－ＷＰＲＥ（ＭＣ）（図２Ａ－下）の両方を、カイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８： １２８７－１２８９）が説明しているプロトコール及び供給者の説明書（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）に従って増幅及び精製した。
【0342】
ＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＰＰで形質転換し、コロニーを取り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＴＢブロス中で終夜増殖させた。ＭＣを生成するために、等量の０．００１％Ｌ－アラビノース及びＮａＯＨ １６ｍＬを含むＬＢブロスを添加することにより、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの発現を介した部位特異的組換えを開始し、培養物を３０℃でさらに５．５時間増殖させた。ＰＰについては、細胞を、Ｌ－アラビノース補充していない同じ培地で増殖させた。エンドトキシンを含まないメガキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆ．）を用いて、ＰＰとＭＣの両方を精製した。
【0343】
実施例２．－細胞培養及びトランスフェクション
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．）、ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．）及びＳＫ－ＭＥＬ－２８ヒト黒色腫細胞系を、それぞれＭＥＭ及びＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）上で維持した。培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１×抗生物質－抗真菌剤溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充し、細胞を５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に維持した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．）、ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ．）及びＳＫ－ＭＥＬ－２８ヒト黒色腫細胞系を、それぞれＭＥＭ及びＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）上で維持した。培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１×抗生物質－抗真菌剤溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充し、細胞を５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に維持した。
【0344】
トランスフェクションの１日前に、細胞系を２４ウェルプレートに蒔いた（１．２５×１０５細胞／ウェル）。製造者説明書に従って、等質量のＰＰ又はＭＣ（１μｇ）及び直鎖ポリエチレンイミントランスフェクション剤（ｊｅｔＰＥＩ， Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）２μＬで、細胞をトランスフェクトした。培地を１日１回回収し、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、ＳＥＡＰ濃度を測定するまで上清を－２０℃で保存した。培地回収後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を加えた。したがって、ＳＥＡＰ測定値は２４時間かけてのタンパク質産生を反映している。
【0345】
実施例３．－皮下腫瘍モデル及びミニサークルの腫瘍内投与
ＭｅＷｏ細胞２×１０６個を雌ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の右脇腹に移植し、３週間にわたって腫瘍を発症させた（ｎ＝４）。ＭＣ（２０μｇ）を、Ｎ／Ｐ比６（Ｎ／Ｐは、核酸リン酸塩当たりのイン・ビボｊｅｔＰＥＩの窒素残留数である。）で直鎖ポリエチレンイミントランスフェクション剤（ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ， Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）と複合体形成させ、５％グルコース５０μＬに再懸濁させた。
ＭｅＷｏ細胞２×１０６個を雌ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の右脇腹に移植し、３週間にわたって腫瘍を発症させた（ｎ＝４）。ＭＣ（２０μｇ）を、Ｎ／Ｐ比６（Ｎ／Ｐは、核酸リン酸塩当たりのイン・ビボｊｅｔＰＥＩの窒素残留数である。）で直鎖ポリエチレンイミントランスフェクション剤（ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ， Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）と複合体形成させ、５％グルコース５０μＬに再懸濁させた。
【0346】
各腫瘍内の複数の遺伝子座でＤＮＡトランスフェクション剤複合体を注射することにより、腫瘍内（Ｉ．Ｔ．）注射を約２分間にわたって実施した。対照マウスの二つのコホートに、同じ用量でＭＣの筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射（ｎ＝３）又は５％ブドウ糖のみのＩ．Ｔ．注射（ｎ＝３）のいずれかで投与を行った。
【0347】
実施例４．－実験的黒色腫転移モデル、ＢＬＩ、及びミニサークルの全身投与
ＭＣの全身投与後の腫瘍を検出する能力を評価するために、既報の実験的転移モデル（Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７：１２３－１２９）を使用した。ＢＲＥＴ融合タンパク質（ＲＬｕｃ８．６－ＴｕｒｂｏＦＰ－ＢＲＥＴ６）を安定して発現するＭｅＷｏ細胞５×１０６個（Ｄｒａ－ｇｕｌｅｓｃｕ－Ａｎｄｒａｓｉ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０８：１２０６０－１２０６５）を、尾静脈を介して放射線照射（５Ｇｙ）雌ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ＰＢＳ総体積２００μＬ）に注射した。細胞注射後１週間間隔で、ＩＶＩＳ－２００イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、基質セレンテラジン（３５μｇ／マウス；ＰＢＳ １５０μＬで希釈）の静脈投与直後にＢＬＩで腫瘍の発生をモニタリングした。ソフトウェアパッケージＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．１を用いて、各画像中の肺の上に対象領域（ＲＯＩ）を描いて、腫瘍量を定量した。ＢＬＩデータは、光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンでの肺の平均放射輝度として表される。
ＭＣの全身投与後の腫瘍を検出する能力を評価するために、既報の実験的転移モデル（Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７：１２３－１２９）を使用した。ＢＲＥＴ融合タンパク質（ＲＬｕｃ８．６－ＴｕｒｂｏＦＰ－ＢＲＥＴ６）を安定して発現するＭｅＷｏ細胞５×１０６個（Ｄｒａ－ｇｕｌｅｓｃｕ－Ａｎｄｒａｓｉ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０８：１２０６０－１２０６５）を、尾静脈を介して放射線照射（５Ｇｙ）雌ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ＰＢＳ総体積２００μＬ）に注射した。細胞注射後１週間間隔で、ＩＶＩＳ－２００イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、基質セレンテラジン（３５μｇ／マウス；ＰＢＳ １５０μＬで希釈）の静脈投与直後にＢＬＩで腫瘍の発生をモニタリングした。ソフトウェアパッケージＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．１を用いて、各画像中の肺の上に対象領域（ＲＯＩ）を描いて、腫瘍量を定量した。ＢＬＩデータは、光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンでの肺の平均放射輝度として表される。
【0348】
担がんマウス（ｎ＝７）又は放射線照射対照マウス（ｎ＝７）に、直鎖ポリエチレンイミントランスフェクション剤（Ｎ／Ｐ比８；ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ， Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）と複合体化したＭＣ４０μｇを投与し、５％グルコース４００μＬに再懸濁させた。次に、マウスに、尾静脈を介して、２００μＬの注射を２回行い、１回目と２回目の注射の間に５分の間隔を設けた。放射線照射されたマウスの追加の対照群（ｎ＝５）には、５％グルコース単独４００μＬを投与した。
【0349】
実施例５．－血漿採取
ＭＣ注射の少なくとも１日前及び注射後２週間まで、顎下静脈を介して採血を行った。血液（約７５～１００ｍＬ）をリチウムヘパリンコートマイクロチューブ（ＢＤ）に採取し、処理前に氷上に保持した後、１０，０００×ｇで５分間にわたり４℃で遠心した。血漿を回収し、－８０℃で保存してから、ＳＥＡＰ測定を行った。
ＭＣ注射の少なくとも１日前及び注射後２週間まで、顎下静脈を介して採血を行った。血液（約７５～１００ｍＬ）をリチウムヘパリンコートマイクロチューブ（ＢＤ）に採取し、処理前に氷上に保持した後、１０，０００×ｇで５分間にわたり４℃で遠心した。血漿を回収し、－８０℃で保存してから、ＳＥＡＰ測定を行った。
【0350】
実施例６．－ＳＥＡＰアッセイ
培地及び血漿の両方におけるＳＥＡＰ濃度を測定するため、製造者説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅ ＳＥＡＰ化学発光アッセイキット２．０を使用した。すなわち、培地又は血漿２５μＬを１×希釈緩衝液に加え、内因性アルカリホスファターゼを６５℃で３０分間熱失活させた。サンプルを氷上に３分間置き、その後室温に戻した。ＳＥＡＰ基質１００μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートし、発光（相対光単位；ＲＬＵ）をＴＤ２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａｌｉｆ．）を用いて１０秒間かけて測定した。
培地及び血漿の両方におけるＳＥＡＰ濃度を測定するため、製造者説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅ ＳＥＡＰ化学発光アッセイキット２．０を使用した。すなわち、培地又は血漿２５μＬを１×希釈緩衝液に加え、内因性アルカリホスファターゼを６５℃で３０分間熱失活させた。サンプルを氷上に３分間置き、その後室温に戻した。ＳＥＡＰ基質１００μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートし、発光（相対光単位；ＲＬＵ）をＴＤ２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａｌｉｆ．）を用いて１０秒間かけて測定した。
【0351】
実施例７．－腫瘍活性化可能なミニサークルは、複数の黒色腫細胞系にわたってプラスミドより有利である。
【0352】
二つの腫瘍特異的プロモーターであるｐＳｕｒｙ及び進行上昇遺伝子－３プロモーター（ｐＰＥＧ）（Ｂｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １７： １２３－１２９）の転写活性を比較して、どのプロモーターが健常組織で最も低いバックグラウンドを与えると考えられるかを評価した。ｐＳｕｒｖ又はｐＰＥＧのいずれかによって駆動されるコドン最適化ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）を発現するプラスミドを構築し、健常雌Ｎｕ／Ｎｕマウスに全身送達した。２日後、ｐＳｕｒｖ駆動プラスミドは、特に心臓及び肺において、ｐＰＥＧ駆動構築物より有意に低いバックグラウンドＬｕｃ２発現を示した（図１８Ａ～１８Ｄ）。初代ヒト線維芽細胞と二つのヒト腫瘍細胞系の両方における腫瘍特異的プロモーター活性も比較した。やはり、ｐＳｕｒｖの方が、ヒト線維芽細胞でのバックグラウンド活性が低く、腫瘍細胞系での同等以上の発現を示した（図１９Ａ～１９Ｃ）。
【0353】
ＳＥＡＰ発現を駆動するｐＳｕｒｖを有する腫瘍活性化可能な親プラスミド（ＰＰ；約７．９ｋｂ）及びミニサークル（ＭＣ；約４．１ｋｂ）（図２Ａ－４）を開発した。これらの二つの構築物で得ることができるＳＥＡＰ濃度を比較するため、二つのヒト黒色腫細胞系（ＭｅＷｏ、図１５；及びＳＫ－ＭＥＬ－２８、図２０）を、等質量のＰＰ及びＭＣ並びに等体積の直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション剤でトランスフェクションした。ＭＣ使用の主な利点はそれのサイズが比較的小さく、イン・ビボでの非ウィルスＤＮＡベクターの主な用量制限は代表的には、ＤＮＡの量ではなくトランスフェクション剤の量であることから、等しい質量を比較した。トランスフェクション後、ＳＥＡＰ濃度を最長８日間にわたり毎日培地で測定した。各データ点は、過去２４時間のＳＥＡＰ累積を反映しており、複数日にわたる累積ＳＥＡＰ濃度を反映しなかった。ＭｅＷｏ細胞での第３日までに、ＭＣは、ＰＰと比較して培地中のＳＥＡＰ濃度が有意に高く、これらの差は実験最終日（第８日）まで維持された（図１５）。同様の結果がＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞でも得られた。唯一の有意差が第２日に認められた（図２０）。したがって、腫瘍活性化可能ｐＳｕｒｖによって駆動されるＭＣは、それの親プラスミド対応物と比較して、黒色腫がん細胞における改善された導入遺伝子発現プロファイルを有する。ＭＣがイン・ビボでＰＰに勝る利点を提供することを確実にするため、マウス（ＰＰについてはｎ＝５、ＭＣについてはｎ＝４）での全身投与後に強力な構成的伸長因子－１αプロモーター（ｐＥＦ１）によって駆動されるＰＰ及びＭＣによって達成される導入遺伝子発現レベルを比較し、送達後の複数の時点でＭＣと有意に高い（ｐ＜０．０５）肺発現が認められた（図２１Ａ及び２１Ｂ）。
【0354】
実施例８．－腫瘍活性化可能なＭＣの腫瘍内注射が、検出可能な血漿ＳＥＡＰ濃度をもたらす。
【0355】
ｐＳｕｒｖ転写活性は、ｐＣＭＶなどの強力なプロモーターと比べて比較的低いことから（図１８Ａ～１８Ｄ）、腫瘍活性化可能なＭＣの直接腫瘍内（Ｉ．Ｔ．）投与が、血液中の検出可能なＳＥＡＰシグナルをもたらすか否かを確認した。皮下ＭｅＷｏ異種移植片（約５０～８０ｍｍ３）を有するマウスに、ＰＥＩと複合体化したＭＣ（ｎ＝４）又はＰＢＳのみ（ｎ＝３）２０μｇのＭＣを投与し、注射の前及び注射後１、３、５、７、１１及び１４日にＳＥＡＰ濃度を測定した（図７）。標準曲線分析は、血漿中のＳＥＡＰ測定値が５桁を超えて再現可能であり、血漿２５μＬ中０．３ｎｇという低いＳＥＡＰ濃度が検出可能であることを示した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。第３日までに、対照マウスと比較して、ＭＣ投与を受けたマウスにおいて有意に（ｐ＜０．０１）増加した血漿ＳＥＡＰ濃度が検出された（図１５Ａ～１５Ｄ；ｐ＜０．０１）。さらに、これら二つの群間の有意差は、投与後２週間まで認められた。発現の腫瘍特異性は、あるマウス群（ｎ＝３）での筋肉（Ｉ．Ｍ．）ＭＣ注射を行うことによっても調べた。Ｉ．Ｔ．５％ブドウ糖（モック）注射を受けた腫瘍を有するマウス又はＩ．Ｍ．ＭＣ注射されたマウス間で有意差は認められなかった。したがって、十分なトランスフェクション効率が達成される場合、ｐＳｕｒｖ駆動の腫瘍活性化可能ＭＣは、投与後の複数の時点で血中で検出可能な程度に十分なレベルで腫瘍内にＳＥＡＰを産生する。
【0356】
実施例９．－腫瘍活性化可能なＭＣの全身注射は、腫瘍を有する対象者を確認し、腫瘍量を評価することができる。
【0357】
腫瘍を有する対象者を健常対象者から区別するための、腫瘍活性化可能なＭＣの全身投与後の血漿ＳＥＡＰ濃度の測定の能力を調べた。生物発光共鳴エネルギー伝達（ＢＲＥＴ）融合レポーターを安定して発現するＭｅＷｏ黒色腫細胞を、尾静脈を介して放射線照射ヌードマウス（ｎ＝７）に投与し、生物発光イメージング（ＢＬＩ）で腫瘍の発生を経時的にモニタリングし（図１５Ａ～１５Ｃ）、屠殺時に定性的に評価した（図２３）。ＭＣ投与の３日前に広範囲の腫瘍量を定性的に観察したが、全ての腫瘍は主に肺内に局在していた（図１５Ａ～１５Ｃ）。屠殺後、予想通り、肺全体に複数のメラニン性腫瘍病巣が認められた（図２３）。ＢＬＩシグナルにおける変化に基づくと、ＭＣ投与時（２週間前）に、腫瘍は約４．５分の１となっていたと考えられる。
【0358】
各マウスについて、ＭＣ ４０μｇの尾静脈投与の前（０日）及び１、３、７、１１及び１４日後に、血漿ＳＥＡＰ濃度を測定した（腫瘍＋ＭＣ）。対照群として、健常（腫瘍のない）マウスにも、ＭＣ（対照＋ＭＣ；ｎ＝６）又は５％グルコース（対照ＭＣ；ｎ＝５）のいずれかを投与した。図１６Ａ～１６Ｃに見られるように。個々の担がんマウスについて、血漿ＳＥＡＰ濃度がＭＣ注射後に上昇した。腫瘍量に関係なく、担がんマウスは、両方の対照群と比較して、投与後３～１４日の間で有意に（ｐ＜０．０５）高い血漿ＳＥＡＰ濃度プロファイルを示した（図１５）。ＭＣ投与を受けた一部の健常マウスは、わずかに陽性のＳＥＡＰシグナルを示し（図１８Ａ～１８ＤのｐＳｕｒｙでも示されるように、プロモーターの漏出を反映している可能性が最も高い）、全体として、二つの対照マウス群の間に有意差は認められなかった（図１６Ｄ）。したがって、腫瘍活性化可能なＭＣの全身投与後の血漿ＳＥＡＰレベルの測定は、腫瘍を有する対象者と健常対象者の間を区別することができ、腫瘍を有する対象者を確認するのに、広い機会（＞１週間）が利用可能であった。
【0359】
ＭＣ投与後の複数の時点でＳＥＡＰレベルが上昇したので、血漿へのＳＥＡＰの累積流出を、各マウスの血漿ＳＥＡＰ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって評価した。全マウスにわたるこの単一の測定基準の比較は、二つの対照群（対照＋／－ＭＣ）間に差がないことを明らかにしたが、担がんマウスと両方の対照群との間は有意に（ｐ＜０．０５）高い値を示した（図１７Ａ）。
【0360】
図１７Ｂに示すように、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を実施することによって腫瘍を有する対象者と健常対象者とを区別するアッセイの能力を評価した。これにより、０．９１８（±０．０８４ＳＥ）の有意な（ｐ＜０．０５）面積及び０．７５４～１．０８３の９５％信頼区間が明らかになった。したがって、記載されているＭＣ用量で使用されるこの第１世代ベクターでは、アッセイは担がん対象者を確認するのに信頼性があった。
【0361】
一部の担がん対象者は、ＭＣを投与された対照マウスの平均をわずかに上回るＡＵＣ値を有していた（図１７Ａ）。さらに、図１６Ａ～１６Ｃに示すように、血漿ＳＥＡＰ濃度の変化は、腫瘍量の程度に定性的に対応するように見えた。これらの二つの所見に基づくと、ＳＥＡＰ ＡＵＣが肺腫瘍量に相関するであろうと仮定された（ＭＣ投与前の３日以内のＢＬＩによる評価で）。腫瘍は主に肺内にあり、光学的ＢＬＩシグナルは組織の深さに依存するため、評価は肺腫瘍のみのマウスに限定した（ｎ＝６）。肺の外側に複数の転移巣を有する１匹のマウスは除外されたが、このマウスを含めると、０．０５６のｒ２及び有意差に近いｐ値が示された（ｐ＝０．０５４１）。予想通り、ＭＣ投与前の肺ＢＬＩシグナルのＲＯＩ分析により、広範囲の肺腫瘍サイズが明らかになった（図１７）。重要な点として、肺腫瘍量は、ＳＥＡＰ ＡＵＣ値と有意に相関していた（ｒ２＝０．７１４；ｐ＜０．０５）（図１６Ｃ）。したがって、本発明者らの腫瘍活性化可能なＭＣシステムは、腫瘍を有する対象者を識別する強固な能力を示すだけでなく、腫瘍量が一つの臓器に限定されている場合、疾患の程度を評価するのに使用することもできる。
【0362】
実施例１０．－統計分析
全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。細胞培養培地からのＳＥＡＰ測定値の比較は、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くシダックの多重比較検定を用いて行った。マウスからの縦断的血漿ＳＥＡＰ測定値を、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて比較した。マウスコホート全体でのＳＥＡＰ ＡＵＣ測定値の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて行った。ＲＯＣ分析は、ＭＣを受けている担がんマウスと健常マウスからのＳＥＡＰ ＡＵＣデータ間で実行した。最後に、ＳＥＡＰ ＡＵＣと肺腫瘍量測定値のピアソン相関分析を行った。全ての検定について、０．０５未満の公称ｐ値を有意であると見なした。
全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。細胞培養培地からのＳＥＡＰ測定値の比較は、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くシダックの多重比較検定を用いて行った。マウスからの縦断的血漿ＳＥＡＰ測定値を、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて比較した。マウスコホート全体でのＳＥＡＰ ＡＵＣ測定値の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて行った。ＲＯＣ分析は、ＭＣを受けている担がんマウスと健常マウスからのＳＥＡＰ ＡＵＣデータ間で実行した。最後に、ＳＥＡＰ ＡＵＣと肺腫瘍量測定値のピアソン相関分析を行った。全ての検定について、０．０５未満の公称ｐ値を有意であると見なした。
【0363】
実施例１１．－腫瘍検出のための新たなプロモーターの発見
スルビビン／ＢＩＲＣ５に代わる、又はそれに加えての、合成バイオマーカー構築物の一部として役立ち得る新たな内因性遺伝子（したがってプロモーター）を発見するために、公的に利用可能なデータベースを調べた。二つのデータソース：ペアを一致させた正常組織に対して３３種類のがんからの２０，０００を超える原発性がんサンプルを調べた（ｃｕｒａｔｅｄ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からの腫瘍サンプルの発現、及び正常組織での発現データに関する多様な情報を含む遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）データベースを利用した。組み合わせたデータセットにアルゴリズムを適用し、その標的の遺伝子発現の最低四分位数が、全ての対応する正常組織全体で遺伝子発現の最も高い四分位数より有意に高かった異なる腫瘍型の数によって標的遺伝子をランク付けするアルゴリズムを、合わせたデータセットに適用した（例えば、全ての正常組織で「バックグラウンド」レベルより高いいくつかの腫瘍型で発現される遺伝子を見出すため）。ＧＴＥｘからの正常組織発現データを、ＴＣＧＡデータベースでのがん患者からの条件を一致させた正常組織よりも健常正常組織の良好な指標として選択した。アルゴリズムを、ヒトゲノム内の１９，０００個の遺伝子全てからの発現データに対して実行し、そのアルゴリズムによって、全ての正常組織でのかなりの数の腫瘍型にわたる遺伝子の過剰発現が明らかになった。これらの遺伝子の多くを、以下の表２に示している。
スルビビン／ＢＩＲＣ５に代わる、又はそれに加えての、合成バイオマーカー構築物の一部として役立ち得る新たな内因性遺伝子（したがってプロモーター）を発見するために、公的に利用可能なデータベースを調べた。二つのデータソース：ペアを一致させた正常組織に対して３３種類のがんからの２０，０００を超える原発性がんサンプルを調べた（ｃｕｒａｔｅｄ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からの腫瘍サンプルの発現、及び正常組織での発現データに関する多様な情報を含む遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）データベースを利用した。組み合わせたデータセットにアルゴリズムを適用し、その標的の遺伝子発現の最低四分位数が、全ての対応する正常組織全体で遺伝子発現の最も高い四分位数より有意に高かった異なる腫瘍型の数によって標的遺伝子をランク付けするアルゴリズムを、合わせたデータセットに適用した（例えば、全ての正常組織で「バックグラウンド」レベルより高いいくつかの腫瘍型で発現される遺伝子を見出すため）。ＧＴＥｘからの正常組織発現データを、ＴＣＧＡデータベースでのがん患者からの条件を一致させた正常組織よりも健常正常組織の良好な指標として選択した。アルゴリズムを、ヒトゲノム内の１９，０００個の遺伝子全てからの発現データに対して実行し、そのアルゴリズムによって、全ての正常組織でのかなりの数の腫瘍型にわたる遺伝子の過剰発現が明らかになった。これらの遺伝子の多くを、以下の表２に示している。
【0364】
表２：腫瘍発現が全ての正常組織より有意に高い遺伝子
【表2】
【0365】
【0366】
【0367】
【0368】
【0369】
乳がんについてより詳細な分析を実施し、上記の１２０のリスト中の個々の遺伝子をスクリーニングして、どの遺伝子が、（ｉ）条件を一致させた正常組織と比較してがんで発現が上昇したか；及び（ｉｉ）サンプリングされた全ての正常組織にわたるバックグラウンド発現が低いというプロファイルを満足させたかを確認した（例えば、乳がんに特に効果的な「信頼性の高い」マーカーを見つけるため）。このサブ解析により、四つの候補が確認され、そのうち二つであるユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）及びコラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）が、正常組織と比較してＴＣＧＡでの乳がんにおける有意な量の発現及び低いバックグラウンド発現を示している。この分析が乳房以外の腫瘍型ごとに個別に完了したら、それによって、それぞれ腎臓（腎臓腎細胞癌及び腎臓腎明細胞がん）及び前立腺（前立腺腺がん）で特異的に高い発現を示す二つの追加の遺伝子であるカドヘリン６（ＣＤＨ６）及びＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）が明らかになった。
【0370】
実施例１１．－エクス・ビボプロモーターアプローチについての検出感度の分析
細胞が例えば採血を介して患者から単離し、細胞を合成バイオマーカーでトランスフェクトし、そのバイオマーカーの発現を評価して病変細胞の存在を決定するエクス・ビボプロモーターアプローチの感度の限界を決定するため、正常なヒトＰＢＭＣのバックグラウンドにドープされたＦＬｕｃを有するレンチウィルス形質導入未感作Ｈ１２９９細胞を投与して実験を行った。様々な数の形質導入細胞を５００万個の単離ヒトＰＢＭＣにドープし（８ｍＬ採血から得られた細胞のおおよその数の半分）、サンプルを処理し、ルシフェラーゼ発現について分析した。結果を図２４（図２４）に示しており、その図では、このアプローチを使用した合成バイオマーカーとしてＦＬｕｃを使用した検出の限界は、５００万個の正常細胞当たり３～１０個の「病変」レポーター活性細胞であると推定している。
細胞が例えば採血を介して患者から単離し、細胞を合成バイオマーカーでトランスフェクトし、そのバイオマーカーの発現を評価して病変細胞の存在を決定するエクス・ビボプロモーターアプローチの感度の限界を決定するため、正常なヒトＰＢＭＣのバックグラウンドにドープされたＦＬｕｃを有するレンチウィルス形質導入未感作Ｈ１２９９細胞を投与して実験を行った。様々な数の形質導入細胞を５００万個の単離ヒトＰＢＭＣにドープし（８ｍＬ採血から得られた細胞のおおよその数の半分）、サンプルを処理し、ルシフェラーゼ発現について分析した。結果を図２４（図２４）に示しており、その図では、このアプローチを使用した合成バイオマーカーとしてＦＬｕｃを使用した検出の限界は、５００万個の正常細胞当たり３～１０個の「病変」レポーター活性細胞であると推定している。
【0371】
実施例１２．－がん活性化ＤＮＡ構築物は、担がんマウスと健常マウスを区別する
スルビビン－ＳＥＡＰナノプラスミド（ｎＤＮＡ－スルビビン－ＳＥＡＰ）を、ＰｏＣ実験でも使用された直鎖ポリエチレンイミン誘導体であるイン・ビボＪｅｔＰＥＩ（図１６Ａ～１６Ｄ）と共に製剤した。ＤＮＡナノプラスミドは、ＤＮＡミニサークルのように、細菌のバックボーンと、成長を制限する非コードアンチセンスＲＮＡ配列を使用した形質転換選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子の必要性をなくす。増強された発現の同様の特性を共有し、複雑な組換え事象を使用せずにＤＮＡナノプラスミドが生成されるため、ＤＮＡナノプラスミドは強力な発現を達成でき、通常のＤＮＡプラスミドと同等の規模で製造することができる。イン・ビボでの適用の前に、製剤を最適化及び特徴付けるのに、かなりの努力が払われた。したがって、ナノプラスミド／ＪｅｔＰＥＩポリプレックス、及びＥａｒｌｉで使用される三元トランスフェクション複合体は、サイズ、電荷、及び多分散性によって特徴付けられる。最適化プロセスでは、キャプシド形成効率、血清安定性、及びヌクレアーゼからペイロードを保護する能力の特性も考慮した。まとめると、これらの最適化により、システムに、強化された感度及びトランスフェクション能力が提供される。
スルビビン－ＳＥＡＰナノプラスミド（ｎＤＮＡ－スルビビン－ＳＥＡＰ）を、ＰｏＣ実験でも使用された直鎖ポリエチレンイミン誘導体であるイン・ビボＪｅｔＰＥＩ（図１６Ａ～１６Ｄ）と共に製剤した。ＤＮＡナノプラスミドは、ＤＮＡミニサークルのように、細菌のバックボーンと、成長を制限する非コードアンチセンスＲＮＡ配列を使用した形質転換選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子の必要性をなくす。増強された発現の同様の特性を共有し、複雑な組換え事象を使用せずにＤＮＡナノプラスミドが生成されるため、ＤＮＡナノプラスミドは強力な発現を達成でき、通常のＤＮＡプラスミドと同等の規模で製造することができる。イン・ビボでの適用の前に、製剤を最適化及び特徴付けるのに、かなりの努力が払われた。したがって、ナノプラスミド／ＪｅｔＰＥＩポリプレックス、及びＥａｒｌｉで使用される三元トランスフェクション複合体は、サイズ、電荷、及び多分散性によって特徴付けられる。最適化プロセスでは、キャプシド形成効率、血清安定性、及びヌクレアーゼからペイロードを保護する能力の特性も考慮した。まとめると、これらの最適化により、システムに、強化された感度及びトランスフェクション能力が提供される。
【0372】
ＪｅｔＰＥＩを有するｎＤＮＡ－スルビビン－ＳＥＡＰ １５μｇの製剤が生成し、特徴決定し、わずかな腫瘍量を有する動物に静脈注射した。結果は、第４日の最も高い鑑別点で、同じレベルの製剤されたナノプラスミドを投与された非担がん動物よりＳＥＡＰレベルに３６倍の増加があったことを示している（図２６、ＪｅｔＰＥＩ送達を参照）。感度は劇的に高くなり、シグナル対ノイズ比における違いで評価されるように、特異性の全体的なレベルは１０倍以上に増加した。現在の研究の後半部分でのＳＥＡＰのがん活性化発現の低下は、細胞分裂及び核からのＤＮＡテンプレートの喪失が原因である可能性がある。複数の時点がＳＥＡＰレベルの上昇が示したことから、各マウスについてＡＵＣ分析を実行した。全ての日のＡＵＣは、ナノプラスミドを投与された非腫瘍形成性動物よりも１９倍の差を与えた。各コホートにおけるグループ内データの緊密性とＳＥＡＰレベルにおける明確な差異を考慮すると、ＲＯＣ解析が１００％感度及び１００％特異性をもたらしたことは驚くべきことではなかった。関連するポリ（β－アミノエステル）であるＣ３２－１２２及びＣ３２－１４５を使用したＤＮＡ送達（例えば、構造については、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００７ Ｊｕｌ；１５（７）：１３０６－１３１２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３００１３２を参照）も示され、このような送達剤は、ＪｅｔＰＥＩより送達効率がやや劣ったが（図２６Ａ）、毒性はやや低くなった（図２６Ｆ）。
【0373】
実施例１３．－異なる腫瘍モデルにおけるがん活性化ＤＮＡ構築物の評価
生物発光ベースの技術を使用する腫瘍サイズの評価に関連する複雑さを回避するために、皮下腫瘍を含むキャリパー測定を介して疾患負荷を決定できる腫瘍モデル、又は動物の外面近くに疾患負荷が存在するモデルを使用する。組織がキャリパーによる物理的測定にアクセスできる、少なくとも二つの同所性モデルを調べる。患者由来の異種移植片（ＣＤＸ）で使用される各細胞系の特性決定を、各モデルの確立前に実行する。イン・ビトロトランスフェクションによって追加のバリデーションを行って、がん活性化ＤＮＡ構築物からのＳＥＡＰ発現を確認する。可能な場合、免疫系が無傷の腫瘍形成モデルを用いる。
生物発光ベースの技術を使用する腫瘍サイズの評価に関連する複雑さを回避するために、皮下腫瘍を含むキャリパー測定を介して疾患負荷を決定できる腫瘍モデル、又は動物の外面近くに疾患負荷が存在するモデルを使用する。組織がキャリパーによる物理的測定にアクセスできる、少なくとも二つの同所性モデルを調べる。患者由来の異種移植片（ＣＤＸ）で使用される各細胞系の特性決定を、各モデルの確立前に実行する。イン・ビトロトランスフェクションによって追加のバリデーションを行って、がん活性化ＤＮＡ構築物からのＳＥＡＰ発現を確認する。可能な場合、免疫系が無傷の腫瘍形成モデルを用いる。
【0374】
１×１０６個の４Ｔ１細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの乳腺脂肪体に注入することによって確立された同系乳腺腫瘍モデルを用いるｎＤＮＡ－スルビビン－ＳＥＡＰからのバイオマーカー発現の活性を最初に特性決定する。製剤されたベクターを、腫瘍が２０ｍｍ３、５０ｍｍ３、１００ｍｍ３、又は２００ｍｍ３のいずれかのサイズに達したときに、担がん動物のコホートに静脈内注射によって投与する。血漿を、－２日（注射前）及び注射後２、６、９、１３日に顎下腺放血によって動物から採取し、ＳＥＡＰ定量並びに全てのイン・ビボ研究からのＡＵＣ及びＲＯＣ解析のために処理する。図２５のデータの精度に基づくと、各コホートは動物５匹からなる。コホート当たりの動物数を１０以上に増やして、ＳＥＡＰシグナルの精度及び区別の潜在的な損失を明らかにする。
【0375】
終末剖検において、高レベルのベクターを有するが低レベルの転写物を有する組織について、バイサルファイト配列決定を行って、それらの組織におけるナノプラスミドＤＮＡのメチル化状態を決定する。さらに、高レベルのベクターＤＮＡ又はＳＥＡＰ転写物を示す臓器を繰り返し実験で採取して、外部第三者の組織学検査（Ｈｉｓｔｏｗｉｚ， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ）を介して、肉眼的組織学的変化が存在するかどうかを判断する。まとめると、これらのデータは、ＩＮＤを可能にするＧＬＰ毒性学及び生体内分布研究に情報を提供するものである。
【0376】
実施例１４．－イン・ビトロトランスフェクション用の新たなＤＮＡ送達剤を開発する
全身性遺伝子送達の課題は、新たな製剤の開発のための指針を提供する。ヌクレアーゼ分解から貨物を保護するために、核酸を、ナノ粒子に効率的にカプセル化する必要があり。投与したら、ＤＮＡナノ粒子は、血流中の自然免疫又は適応免疫監視による検出と破壊を回避することができる。溢出として知られるプロセスによって、ナノ粒子はがん細胞などの組織に取り込まれ、ＤＮＡテンプレートが送達材料から放出され、核に輸送されて転写テンプレートとして機能する。最後に、ナノ粒子シェルの成分が代謝され、全身毒性を引き起こすことなく細胞から排除される。これらの課題は、非ウィルス性ＤＮＡ送達技術の開発を成功させるための努力を長い間混乱させてきたが、ＲＮＡの細胞質ゾル送達には大きな進歩があった。これは、ポリマー性及び脂質ベースの両方であり、優れた細胞取り込みとエンドソーム脱出プロファイルを有する新世代のイオン化可能なカチオン性材料によって可能となり、最初のＲＮＡｉ薬（Ａｌｎｙｌａｍ′ｓ Ｐａｔｉｓｉｒａｎ）の規制当局承認及び商業化に至らしめた。その開発戦略は、核酸複合体形成、粒子表面操作、及びエンドソーム脱出の改善を活用する一方で、核輸送を改善するための追加機能を付与することで、がん検出の診断的に適切な濃度で非ウィルスＤＮＡ送達を達成することである。
全身性遺伝子送達の課題は、新たな製剤の開発のための指針を提供する。ヌクレアーゼ分解から貨物を保護するために、核酸を、ナノ粒子に効率的にカプセル化する必要があり。投与したら、ＤＮＡナノ粒子は、血流中の自然免疫又は適応免疫監視による検出と破壊を回避することができる。溢出として知られるプロセスによって、ナノ粒子はがん細胞などの組織に取り込まれ、ＤＮＡテンプレートが送達材料から放出され、核に輸送されて転写テンプレートとして機能する。最後に、ナノ粒子シェルの成分が代謝され、全身毒性を引き起こすことなく細胞から排除される。これらの課題は、非ウィルス性ＤＮＡ送達技術の開発を成功させるための努力を長い間混乱させてきたが、ＲＮＡの細胞質ゾル送達には大きな進歩があった。これは、ポリマー性及び脂質ベースの両方であり、優れた細胞取り込みとエンドソーム脱出プロファイルを有する新世代のイオン化可能なカチオン性材料によって可能となり、最初のＲＮＡｉ薬（Ａｌｎｙｌａｍ′ｓ Ｐａｔｉｓｉｒａｎ）の規制当局承認及び商業化に至らしめた。その開発戦略は、核酸複合体形成、粒子表面操作、及びエンドソーム脱出の改善を活用する一方で、核輸送を改善するための追加機能を付与することで、がん検出の診断的に適切な濃度で非ウィルスＤＮＡ送達を達成することである。
【0377】
ＤＮＡナノ粒子用の新たな担体を開発するため、２方向アプローチを取る。第１のアプローチは、遺伝子療法用途での核酸の送達に使用されてきたイオン化可能なカチオン性脂質を用いて開発されてきた脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に変更を加えることに基づいている。ＬＮＰは、アニオン性ＤＮＡの凝縮で非常に効率的であり、高いカプセル化効率を示し、肝組織のトランスフェクションのために多種多様な運搬物に最も頻繁に適用されてきた。しかしながら、イオン化可能な脂質構造及び分解プロファイルを、他組織に分配するよう設計することができる。サイズと電荷の固有の特性は肝臓への溢出に適していることから、これらの粒子の表面をポリマーで修飾して、循環を延長する。
【0378】
第２のアプローチは、固有の生分解性特性を有する新規ポリマー組成物の使用を行うものである（ｐｒｏｎｇ）。加水分解可能な結合で設計されたポリ（β－アミノエステル（ＰＢＡＥ））と称されるポリマーは、多種多様な細胞をトランスフェクトする効率的な能力を示しており、運搬物が送達されたら細胞及び身体から簡単に排除される。ポリグルタミン酸でコーティングされたＰＢＡＥ複合体に製剤されたＤＮＡは、イン・ビボでＴ細胞を効率的に標的化及び形質導入することができた。新たなポリマーサブユニットを使用するＰＢＡＥ／ＤＮＡポリプレックスを製造した。これらの新たなＰＢＡＥは、ＪｅｔＰＥＩより有意に低い毒性を示した（図２６Ｂ～Ｆ）。電荷変更性可逆的輸送体（ｃｈａｒｇｅ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）などの他のクラスの分解性カチオン性ポリマーが研究されている。
【0379】
トール様受容体の活性化、肝臓クリアランス、マクロファージ取り込み、又は中和抗体を介した適応免疫応答の誘発を介した自然免疫による血流からのクリアランスが、イン・ビボ送達の問題点である。結果的に、製剤された粒子の表面電荷を遮蔽して持続性及び複合体の広く分布する能力を高める戦略が研究されている。各種比率の共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でナノ粒子をコーティングすることが、利用されている戦略である。静電相互作用を介してナノ粒子の表面にポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を吸収する方法も開発されている。しかし、これらのコーティングは、粒子サイズをかなり増加させるだけでなく、細胞の取り込みを減少させ得るものであり、これらはいずれも、トランスフェクション効率を損なわせ得る。その結果、経時的にステルスコーティングを劣化させ得る、又は低ｐＨ、低酸素症若しくは局所プロテアーゼなどの腫瘍微小環境の特性に応じてナノ粒子の遮蔽を解除し得るサブユニットに対して修飾が検討されている。
【0380】
ＤＮＡ圧縮を保持し、受動拡散若しくは指向的輸送によって核位置決めを強化することができる特異的核標的化部分を含めることによって、ＬＮＰ及びポリマーナノ粒子のＤＮＡ送達能力が高まる。そのような潜在的な核送達剤の一つはプロタミンであり、これは非特異的にＤＮＡに結合するアルギニン豊富配列で構成され、精子頭部凝縮時のＤＮＡの安定化のためのヒストン代替物として作用すると考えられている。プロタミンを添加することで、著しくよりコンパクトな送達複合体を生成することができる。図２７に見られるように、ＤＮＡのプロタミンとの前インキュベーションにより、適度に小さい脂質ナノ粒子複合体が産生された。比較的小さい粒子が強化された形質導入特性を有するかどうかはまだ決定されていない。微小管関連配列（ＭＴＡＳ）及び核位置決定シグナル（ＮＬＳ）を本明細書で開示の製剤に組み込むことも、核輸送を増強するのに使用され得る。
【0381】
動物モデルにおける生体内分布と効力を調べる前に、製剤の品質を評価するため、製剤のカプセル化効率、サイズ、電荷及び不均一性、並びに生理学的緩衝液を含む血清中での安定性を理解することなど、厳密な一連のイン・ビボ物理的特性決定を用いる。ポリプレックスのパラメータには、（１）７５ｎｍ～１５０ｎｍの範囲のサイズ、（２）正味中性電荷又はわずかに負の表面電荷、（３）０．１５未満の多分散度指数を有すること、（４）８５％以上のカプセル化効率を有すること、及び（５）３０分を超える血清安定性などがあり得る。
【0382】
強力な構成的ＣＭＶプロモーターを利用してホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＤＮＡナノプラスミドの製剤された複合体を用いて、生体内分布及びトランスフェクション強度についての最初のイン・ビボ試験を実施する（図２８）。実験ごとに約２０の異なる製剤のバッチを調べる。Ｂａｌｂ／ｃマウスのコホート（コホート当たりｎ＝３）に、ＤＮＡナノプラスミド２５μｇを含む製剤した複合体を注射する。中間時点で採取された血液サンプルを、包括的な臨床化学検査に使用し、他方で、最終の血液を血液検査及びサイトカイン分析に使用して、イン・ビボ又はエクス・ビボで高レベルの発光を生成するナノ粒子製剤の毒性プロファイルを決定する。さらに、発光レベルが相対的に高い動物は、ＤＮＡベクターのコピー数推定のためのＱＰＣＲによるより広範な生体内分布分析のために回収された追加の臓器を持っている。回収される追加の組織には、脳、性腺、注射部位、及び骨髄などがある。
【0383】
対照のＪｅｔＰＥＩ群によって提供されるレベルと同等又はそれを超える広い分布及び発光を有する製剤を、効力試験に移す。生体内分布及び安全性の研究と同様に、前記新たなポリプレックスは、ＪｅｔＰＥＩで製剤された同じナノプラスミドと同等又はそれよりも優れた効力を示す可能性がある。前記新たな製剤を使用することで、腫瘍を持たない動物でＳＥＡＰのバックグラウンドレベルと低くなり得る。
【0384】
実施例１５．－がん活性化されたナノプラスミドプラットフォームのより大きな動物モデルへの規模拡大
多くの腫瘍学ベースの薬物が、マウスモデルで確立された腫瘍異種移植片を調べる文脈で試験及びバリデーションされてきたが、これらのシステムには、次のもの：遺伝的多様性及び好適な腫瘍微小環境の欠如、強化された透過性及び保持（ＥＰＲ）に関する腫瘍型間の不均一性、及び著しく損なわれた免疫系を有するか免疫系が完全に欠如している動物で確立されるこれらのモデルの全てではないが多くのものの傾向の１以上の組み合わせを含む固有の制限がある。そのプラットフォームを、より大きい動物モデルで自然発生のがんに移動すると、これらの制限の多くが未然に防がれる。同様に、マウス異種移植モデルを使用する際の一つの問題は、体重が２０～３５グラムの若いマウス種と北米では６５ｋｇを超える成人の平均体重との間の大きなスケールの違いを考慮した場合に、安全かつ効果的な投薬の規模拡大を理解しようとすることである。本発明者らのプラットフォームをイヌのモデルに翻訳する際に、犬種に応じて、非常に多様な種類の自然発生型の腫瘍を、多様な範囲の動物サイズで評価することになる。
多くの腫瘍学ベースの薬物が、マウスモデルで確立された腫瘍異種移植片を調べる文脈で試験及びバリデーションされてきたが、これらのシステムには、次のもの：遺伝的多様性及び好適な腫瘍微小環境の欠如、強化された透過性及び保持（ＥＰＲ）に関する腫瘍型間の不均一性、及び著しく損なわれた免疫系を有するか免疫系が完全に欠如している動物で確立されるこれらのモデルの全てではないが多くのものの傾向の１以上の組み合わせを含む固有の制限がある。そのプラットフォームを、より大きい動物モデルで自然発生のがんに移動すると、これらの制限の多くが未然に防がれる。同様に、マウス異種移植モデルを使用する際の一つの問題は、体重が２０～３５グラムの若いマウス種と北米では６５ｋｇを超える成人の平均体重との間の大きなスケールの違いを考慮した場合に、安全かつ効果的な投薬の規模拡大を理解しようとすることである。本発明者らのプラットフォームをイヌのモデルに翻訳する際に、犬種に応じて、非常に多様な種類の自然発生型の腫瘍を、多様な範囲の動物サイズで評価することになる。
【0385】
試験品の性質に関して、初期試験を、ヒトＳＥＡＰタンパク質の発現を駆動するヒトスルビビンプロモーターからなる構築物を用いて実施する。ヒトとイヌのスルビビンプロモーターの配列間の同一性の程度は保存されている。イヌのがん由来の細胞へのｎＤＮＡ－スルビビン－ＳＥＡＰ構築物の一時的トランスフェクションは、当該プロモーターが多種多様なイヌ細胞において機能性であることを示している（図２９Ａ及び２９Ｂ）。
【0386】
イン・ビボ効力試験のため、悪性腫瘍を有する犬のみを登録する。イヌの年齢、大きさ、体重、犬種、及び現在の治療（ある場合）に関する情報を収集する。利用可能な場合、診療所が、現在の治療、腫瘍の病期分類、併用の放射線データに関する追加情報の提供も続ける。初期試験においては、既存の疾患負荷が高く、治療歴のない動物を登録するが、迅速な治療を望む場合は、後者の要件を緩和する必要があるかもしれない。コホート当たりｎ＝３匹のイヌを含む三つの投薬群に、静脈投与経路を介して製剤されたがん活性化ナノプラスミドを注射する。非がん性疾患で末期であり得る追加のイヌ３匹を、そのイヌを登録できるのであれば対照として使用することができるが、その動物が本当にがんを有さないことを確認するのは困難であるかもしれない。臨床化学検査及び血液検査をカバーする採血は、ＰＫデータについての投与の直前、及び投与の１、２、４、及び６時間後に行う。臨床化学検査についてのモニタリングを行い、血漿中のヒトＳＥＡＰの存在を検出するために、追加の血液サンプルを、投与の３、６、９、１２、及び１５日後に採取する。急性毒性試験の結果に基づいて、追加の血液パラメータを収集することができる。可能であれば、臨床医は、開示された試験品の投与後の腫瘍についてのその後の生検又は外科的切除からサンプルを採取し、次に材料を渡す。核酸の単離に続いて、ナノプラスミドＤＮＡ ＱＰＣＲの存在及びＲＴ－ＱＰＣＲによるＳＥＡＰ転写物の存在についてのサンプルを調べる。ＲＴ－ＱＰＣＲを用いて、腫瘍内のスルビビン転写物の相対レベルを評価する。
【0387】
実施例１６．－がん活性化合成バイオマーカー構築物の使用のためのエクス・ビボアプローチ
早期がんの大規模検出のための一般的なツールとして、エクス・ビボ設定でがん活性化合成バイオマーカー発現システムを使用する能力があれば、開発コストを大幅に削減することができ、タイムラインをかなり短縮することができると考えられる。生きている循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をエクス・ビボで単離及び増殖させ、それらの細胞に固有の生理機能を維持し、従って開示されたがん活性化合成バイオマーカープラットフォームをこれらの細胞に適用することを可能にすることを示す、多くの最近の報告が発表されている。血液中に放出されるこれらの細胞の数は少ないかもしれない。
早期がんの大規模検出のための一般的なツールとして、エクス・ビボ設定でがん活性化合成バイオマーカー発現システムを使用する能力があれば、開発コストを大幅に削減することができ、タイムラインをかなり短縮することができると考えられる。生きている循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をエクス・ビボで単離及び増殖させ、それらの細胞に固有の生理機能を維持し、従って開示されたがん活性化合成バイオマーカープラットフォームをこれらの細胞に適用することを可能にすることを示す、多くの最近の報告が発表されている。血液中に放出されるこれらの細胞の数は少ないかもしれない。
【0388】
がん活性化合成バイオマーカープラットフォームのエクス・ビボ適用は、ＣＴＣにおける調節不全の発現を利用しようとする試みに限定されなくとも良い。多くのグループが、乳がん患者から分離されたＰＢＭＣからの遺伝子発現プロファイルと、健常志願者血液又は肺がん患者の全血からの発現プロファイルを比較することにより、がんの血液ベースのバイオマーカーを特定している。さらに、腫瘍活性化可能な合成バイオマーカー発現システムで操作された活性化Ｍ２マクロファージ用の細胞ベースのイン・ビボセンサーが報告されている。まとめると、少なくとも一時的レベルでは、がん細胞と同じ環境にある非腫瘍形成性細胞は、開示のがん活性化生合成マーカープラットフォームを使用するエクス・ビボアプローチで利用され得る一時的に変化した転写プロファイルを有する可能性がある。まとめると、がんの結果として変化した遺伝子発現プロファイルを有する可能性がある、ＣＴＣなどの細胞集団は、略して「転写的に改変された細胞」又はＴＡＣと称することができる。
【0389】
全血の細胞部分、すなわち、存在するＰＢＭＣ及び他の細胞は、効率的な送達のために広い向性を有する組換えアデノウィルス又はレンチウィルスを使用することによって、開示されたがん活性化バイオマーカー構築物で調べることができる。多くの異なる細胞型が、組換えウィルスによる高効率の遺伝子導入の影響を受けやすい、細胞当たりでの各転写ユニットのコピーを数十又は数百も導入することができる。これらの転写ユニットのそれぞれは、ルシフェラーゼなどの分析物の発現を、容易に定量できる高感度レベルで駆動し得る。
【0390】
非常に感度の高いレポーターに加えて、効率的な形質導入によって、特異的サブタイプの細胞又はＥｐＣＡＭ陽性のＣＴＣなどの希な集団を豊富にする必要性がなくなることから、広範囲の細胞型を効率的に形質導入することができることで、シグナル出力増加によって測定されるように、感度が上昇するはずである。
【0391】
エクス・ビボアッセイの理論的感度を確認するため、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）タンパク質を構成的に発現するよう操作されたＨ１２９９細胞、すなわち標準的な採血８ｍＬからの大体の細胞数に、健常志願者からの５ｅ６ ＰＢＭＣをスパイクした。処理後、ルシフェラーゼ発現とスパイクされたＨ１２９９との直線関係が認められ、検出限界は細胞３～１０個であった（図２４）。本発明者らのウィルスベクターがヒトＰＢＭＣの複合混合物でがん細胞を形質導入できるかどうかを理解するために、ホタルルシフェラーゼ（Ａｄ－スルビビン－ＦＬｕｃ）の発現を促進するヒトスルビビンプロモーターを含む組換えアデノウィルスを用いて、健常志願者からの５ｅ６ ＰＢＭＣの文脈での未感作（操作されていない）Ｈ１２９９細胞数を増やす混合物を形質導入した。ヒト非小細胞肺がん細胞系に由来するＨ１２９９細胞は、高レベルのスルビビン発現を示していることから、本発明者らのベクターで形質導入した場合、強力なルシフェラーゼ発現を提供するはずである。２日間のインキュベーション期間の後、ルシフェラーゼ活性分析は、エクス・ビボアッセイの感度が、５ｅ６ヒトＰＢＭＣにスパイクされた未感作細胞わずか２個を検出できることを示しており（図３０Ａ及び３０Ｂ）、それは、複合体混合物のこのプラットフォームでがん性細胞を形質導入及び検出する能力を示している。特異性を確認するために、ＰＢＭＣのみを含むサンプルを、Ａｄ－ＣＭＶ－ＦＬｕｃで形質導入して（図３０Ｃ、青い列）、強力なルシフェラーゼ発現をもたらし、ＰＢＭＣ画分内の細胞がアデノウィルスによって形質導入できることを示している。Ａｄ－スルビビン－ＦＬｕｃで形質導入されたＰＢＭＣ（図３０Ｃ、赤い列）と形質導入されていないＰＢＭＣ（図３０Ｃ、灰色の列）からの測定可能なルシフェラーゼ活性の欠如は、ベクターが、図３１ＢにおけるＰＢＭＣにスパイクされたＨ１２９９細胞などの、調節不全のスルビビン発現を有する細胞の存在下に強力なシグナルのみを生成することを示している。
【0392】
同じＡｄ－スルビビン－Ｆｌｕｃベクターを用いて、イヌの腫瘍由来の未感作イヌがん細胞でスパイクした５×１０５個のイヌＰＢＭＣを含むサンプルを形質導入する同様の実験を行った。高レベルのイヌスルビビン発現は、骨肉腫などのイヌ腫瘍でも以前に報告されている。ベクターで使用されたスルビビンプロモーターはヒト起源であったが、二つの種からのプロモーター配列間の類似性により、ルシフェラーゼレポーターが強力に生成された。イヌ腫瘍細胞の検出の感度は、単一細胞レベルまで下がり（図２９Ａ）、複数のイヌ腫瘍型に由来する細胞を検出した（図２９Ｂ）。最後に、正常な健常志願者に由来する、そしてがん患者に由来するヒトＰＢＭＣの初期セットを、商業的供給元から取得した。Ａｄ－スルビビン－Ｆｌｕｃ構築物による形質導入に続いて、サンプルを７２時間インキュベートし、溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした（図３１）。健常ヒト志願者の正常なＰＢＭＣが基底線を設定したが、個々のがん由来の患者サンプルはルシフェラーゼレベルを上昇させた。驚くべきことに、統計的に有意なデータを持つサンプルのいくつかを、段階１と段階２の患者から収集した。この実験による結果は、概念研究の証拠として得られたものであり、検出の特異性及び率に影響を与えるための代替プロモーター又はプロモーターの組み合わせの使用など、至適化しなければならないパラメータがある。
【0393】
実施例１７－第１世代のｅｘ ｖｉｖｏアッセイを用いるイヌの試験が、８９％のリンパ腫検出率を示す。
【0394】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標名）単核細胞調製管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ３６２７５３）を用いて、イヌ全血から分離した。分離したＰＢＭＣを、熱不活化ウシ胎仔血清（ＶＷＲ、８９５１０－１８４）、ペニシリン－ストレプトマイシン抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１５１４０－１２２）、及びＬ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２５０３００８１）を補充したＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ、３０２００１）に再懸濁させた。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除（Ｇｉｂｃｏ、Ｔ１０２８２）によって決定した。エクス・ビボバイオアッセイを、次のようにして実施した。約３×１０６個のＰＢＭＣを、最終容量２００μＬで、９６ウェルプレート（ＶＷＲ、１０８６１）の単一のウェルに播種した。次に、ＢＩＲＣ５／スルビビンプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むように操作されたアデノウィルスベクターを用いて、ＭＯＩ ０．３で細胞を形質導入した。形質導入された細胞を、３７℃（５％ＣＯ２）で７２時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞をウェル内で受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９１０）２０μＬで溶解した。次に、溶解物を９６ウェル白色固体アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ３９１２）の単一のウェルに移し、続いてルシフェラーゼ基質緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ４５５０）１００μＬを加えた。Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｌｏＭａｘ Ｎａｖｉｇａｔｏｒマイクロプレートリーダーを用いて、０．３秒の積分時間で発光を測定した。全てのデータを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて収集及び分析した。図３２Ａは、健常イヌ個体（ｎ＝３１）及びイヌリンパ腫がん患者（ｎ＝１７）の発光発現の倍率変化の比較を示している。図３２Ｂは、イヌリンパ腫がん対象者及び健常イヌ対象者を区別するためのスルビビン活性化ルシフェラーゼ活性の診断予測能力を示している。
【0395】
実施例１８．－がん活性化プロモーターの組み合わせ検出を用いる組み合わせがん検出アプローチの開発
それらの調節不全遺伝子の発現を駆動する調節配列のカスケードを、がん活性化生合成マーカープラットフォームと組み合わせて、単に遺伝子産物のみ求めるだけでなく、高い精度でがん検出率を改善するために必要な特異性及び感度を高めることができる。
それらの調節不全遺伝子の発現を駆動する調節配列のカスケードを、がん活性化生合成マーカープラットフォームと組み合わせて、単に遺伝子産物のみ求めるだけでなく、高い精度でがん検出率を改善するために必要な特異性及び感度を高めることができる。
【0396】
悪性腫瘍における調節不全の遺伝子発現に関する以前に発表された文献を補完するためにバイオインフォマティクスアプローチを適用することにより、新たなプロモーターを確認した。前者の場合、ＴＣＧＡの分析を開始し、ペアが一致する正常組織に対する３３種類のがんから２０，０００を超える原発性がんサンプルを調べた。ＩＣＧＣやＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｔｕｍｏｒ Ａｎａｌｙｓｅｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＰＴＡＣ）など、非常に多様な他のデータベースも使用できる。
【0397】
ワークフローにより、スライダーバーを含む一連のフィルターを用いて、特定の腫瘍型及び条件を一致させた正常対照にわたるシグナル対雑音比のカスタムレベル及び閾値を選択することができる。初期段階のがんで発生する調節不全の遺伝子発現パターンを最初に調べることから、腫瘍の病期分類でフィルタリングする能力が非常に重要である。最後に、生体内分布フィルターが、本明細書に開示の異なる種類のトランスフェクション剤製剤の文脈での漏出性プロモーターの相対的寄与を予測するのに役立ち得る。
【0398】
ＴＣＧＡデータベースに対して独立してフィルターを適用し、公開された文献に対して標的出力を評価することによって、多くの段階の有効性及び理論的根拠を試験した。予備データでは、がんと条件を一致させた正常組織におけるシグナル対雑音比の閾値フィルターを適用し、ストリンジェンシーが徐々に増加した。正常組織発現データについては、遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）データベースデータを、ＴＣＧＡでの条件を一致させた正常組織データより健常組織の指標として選択した。この段階からの結果から、正常組織と比較してかなりの数の腫瘍型にわたって８８個の遺伝子の過剰発現が明らかになった。がん活性化プロモーター活性のバリデーションのために、新たに同定されたプロモーター標的のそれぞれからの調節配列を、（ａ）レポーターオープンリーディングフレーム（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）に作動可能に連結されるように、ナノプラスミド発現構築物にサブクローニングして、プロモーター－レポーター構築物を生成し；（ｂ）各種がん細胞系にトランスフェクトした。具体的には、個々のプロモーター配列のいくつかを、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子のクローニング配列の上流でサブクローニングし、各ベクターをがん由来の組織培養細胞系にトランスフェクトした後、ホタルルシフェラーゼバイオマーカーの発現を分析した。直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ウミシイタケシフェラーゼの発現を駆動するためにＣＭＶプロモーター（強力な構成的プロモーター）を利用する別の発現プラスミドを、内部対照として試験プラスミドの５０分の１の濃度でトランスフェクション混合物に添加した（同時トランスフェクトされたプラスミドから産生されたウミシイタケルシフェラーゼのレベルの評価により、異なる細胞系間のトランスフェクション効率の正規化が可能となった。）。
【0399】
トランスフェクションに利用される細胞系は、（ａ）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）からの発現データの指針で選択された不死化細胞系；（ｂ）異なる起源（例えば、肺、乳房及び膵臓組織）の腫瘍から確立された一次患者のヒト細胞系；（ｃ）多様な種類のイヌ／イヌのがんから単離されたイヌ細胞系を含んでいた。各細胞系のイン・ビトロトランスフェクションを、トランスフェクション剤としてリポフェクタミン３０００を用いて実施した（ただし、開示されたカセットはまた、アデノウィルスなどの組換えウィルスベクターにパッケージングするための組換え発現構築物に容易に移すことができる。）。ウミシイタケルシフェラーゼシグナルを使用したトランスフェクションの正規化後、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ活性の評価によって、各遺伝子の相対レベルを確認した。肝臓、卵巣及び膵臓のがん由来の細胞系における各レポーター構築物の活性をそれぞれ図３３Ａ、３３Ｂ及び３３Ｃに示し、各細胞系における各レポーター－プロモーター構築物の発現の相対強度を、色濃度によって描いている（特定の値は、各グラフの右側にある濃度の説明を参照して示されてる。）。同様に、乳房及び肺に由来する細胞系におけるレポーター－プロモーター構築物の活性を、それぞれ図３３Ｄ及び３３Ｅに示す。同じデータは、正常な肺組織に由来する形質転換されていない細胞系へのプロモーター－レポーター構築物のトランスフェクションによって同じデータが生成された。これらの非形質転換細胞における同じプロモーターの対応する低レベルの活性（図３３Ｆ）は、これらのがん活性化プロモーターの多くが腫瘍を非腫瘍組織から区別するのに有用である可能性があり得ることを示している（例えば、ＭＭＰ１２、ＣＥＰ５５、ＣＯＬ１０Ａ１、ＫＩＦ２０Ａ、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＣＳＴ１、ＡＦＰ、ＢＩＲＣ５、ＵＢＥ２Ｃ、ＭＣＭ１０）。最後に、構築物の活性を、イヌのがんに由来する細胞系で調べた（図３４）。プロモーター配列がヒト配列に由来しているにもかかわらず、構築物の多くはイヌ細胞系において強力な活性を生じた（例えば、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ５－５０１、ＣＸＣＲ４、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＲＩＰ１３、ＣＤＫＮ３、ＭＣＭ１０、ＣＤＣ２０、ＴＲＯＡＰ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２０Ａ、及びｃＢＩＲＣ５を参照する）。
【0400】
実施例１９．－がんの検出率を改善するためにがん活性化プロモーターを組み合わせた多重核酸／タンパク質バーコードアプローチの開発
活性の代理レポーターマーカーとして容易に定量可能な合成バーコードを使用することにより、複数の出力を分析する分析を単純化することができる（例えば、細胞系における複数のプロモーターの活性の同時分析）。複数の固有のプロモーターの同時使用（すなわち、多重化）が核酸又はタンパク質のバーコードの使用に適しているかどうかを評価するために、一連の個々のプロモーターを最初に、分泌ルシフェラーゼ分子の上流でクローニングした。ＩＬ－６タンパク質からの分泌ドメイン／シグナルペプチドはタンパク質の末端に含まれており、結果的にルシフェラーゼ（通常は細胞内局在に限定されている）が細胞から分泌される酵素に変換された。続いて、シグナルペプチドとルシフェラーゼをコードする配列の間に一連の固有の核酸バーコードが導入された複数のＤＮＡ構築物が生成した（図３５Ａ、シグナルペプチドとルシフェラーゼの間の色付きの挿入物を参照）。この場合、６ヌクレオチドのバーコードを使用した（検出のために最大４０９６の固有配列を提供可能）が、より長く伸びたヌクレオチド（例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０以上）が想定され、より大きなセットの組み合わせが提供される。異なるプロモーターのそれぞれが、発現されたタンパク質構築物に含まれるため対応する固有のバーコードに割り当てられることから、レポーター発現の代理マーカーとしてバーコードのレベルを定量することができるはずである。次に、これらのシグナルペプチド－バーコード－ルシフェラーゼ構築物を、ＡＢＣＣ４、ＢＩＲＣ５（別名スルビビン）、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＯＬ１０Ａ１、Ｅ２Ｆ、ＦＯＸＡ１、ＭＣＭ１０などのいくつかの候補レポーターの制御下でナノプラスミド構築物にサブクローニングし、発現分析のために細胞系にトランスフェクトした（例えば、図３６を参照。）。
活性の代理レポーターマーカーとして容易に定量可能な合成バーコードを使用することにより、複数の出力を分析する分析を単純化することができる（例えば、細胞系における複数のプロモーターの活性の同時分析）。複数の固有のプロモーターの同時使用（すなわち、多重化）が核酸又はタンパク質のバーコードの使用に適しているかどうかを評価するために、一連の個々のプロモーターを最初に、分泌ルシフェラーゼ分子の上流でクローニングした。ＩＬ－６タンパク質からの分泌ドメイン／シグナルペプチドはタンパク質の末端に含まれており、結果的にルシフェラーゼ（通常は細胞内局在に限定されている）が細胞から分泌される酵素に変換された。続いて、シグナルペプチドとルシフェラーゼをコードする配列の間に一連の固有の核酸バーコードが導入された複数のＤＮＡ構築物が生成した（図３５Ａ、シグナルペプチドとルシフェラーゼの間の色付きの挿入物を参照）。この場合、６ヌクレオチドのバーコードを使用した（検出のために最大４０９６の固有配列を提供可能）が、より長く伸びたヌクレオチド（例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０以上）が想定され、より大きなセットの組み合わせが提供される。異なるプロモーターのそれぞれが、発現されたタンパク質構築物に含まれるため対応する固有のバーコードに割り当てられることから、レポーター発現の代理マーカーとしてバーコードのレベルを定量することができるはずである。次に、これらのシグナルペプチド－バーコード－ルシフェラーゼ構築物を、ＡＢＣＣ４、ＢＩＲＣ５（別名スルビビン）、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＯＬ１０Ａ１、Ｅ２Ｆ、ＦＯＸＡ１、ＭＣＭ１０などのいくつかの候補レポーターの制御下でナノプラスミド構築物にサブクローニングし、発現分析のために細胞系にトランスフェクトした（例えば、図３６を参照。）。
【0401】
バーコード化された、がん活性化ルシフェラーゼレポーター構築物のそれぞれについて、Ｈ１２９９細胞の平行プレートをトランスフェクトすることによって個別に試験を行った。トランスフェクション効率の変動を制御するために、ＣＭＶ駆動のウミシイタケシフェラーゼ発現カセットを含むＤＮＡ構築物を各トランスフェクション混合物に含めた。トランスフェクション後さらに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、発光活性についてのアッセイを行った。図３５Ｂは、個別に試験を行った場合に、各プロモーターがＨ１２９９細胞内で識別可能なレベルのルシフェラーゼ活性を生成することを示している。さらに、各プロモーターの相対強度の違いにより、固有のパターンとなる。平行なセットのプレートにおいて、等モル比の各がん活性化レポーター構築物を含むバーコード構築物の混合物で、Ｈ１２９９細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを細胞から精製し、次世代配列決定によって分析して、細胞転写産物内に存在するバーコード配列の相対レベルを定量した。図３５Ｃは、多重混合物によるＨ１２９９細胞のトランスフェクションによって、核酸バーコードの量によって評価される、個々にトランスフェクトされた細胞とほぼ同一パターンの相対的発現パターンとなったことを示している。これらの組み合わせた実験からの結果は、プロモーター又はフィンガープリントからのこれらの固有のがん活性化発現パターンが、調べている特定の細胞に関連する分子特性を確認するのに有用であり得ることを示す証拠を提供する。さらに、バーコード化は、多重様式で相対的活性レベルを評価するための有用な代理を提供できる。
【0402】
実施例２０．－細胞におけるプロモーター－レポーター構築物の活性化を検出するための抗体捕捉フォーマットの使用
固有のプロモーター／レポーターの組み合わせを識別するのに使用されるバーコードの種類は、核酸配列として存在し得る（図３５Ａ）。あるいは、バーコードは、小タンパク質又はペプチド断片の使用などの他の形態を取ることができるが、それに限定されるものではない。この現在の実施例では、ルシフェラーゼレポータータンパク質の末端に融合されたペプチドバーコード断片により、分泌されたルシフェラーゼを、アッセイを行うのに使用される９６ウェルプレートの個々のウェルを最初に固有タンパク質タグの一つに対するアフィニティを有する特異的抗体でコーティングする酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ベースのアッセイで捕捉することができる。このようにして、プレートの各ウェルを用いて、個々のペプチドタグの存在について分泌培地の複合体混合物をパン（ｐａｎ）及び調査することができる。このアプローチの有用性を実証するために、操作された分泌型のルシフェラーゼタンパク質を、ＩＬ－６からのルシフェラーゼの分泌ドメイン／シグナルペプチドのＮ末端への融合によって生成した。さらに、一連のペプチドエピトープベースのバーコードを、シグナルペプチド及びルシフェラーゼをコードする配列の間に導入した（図３６Ａ）。概念実験の最初の証明のために含まれるエピトープタグは、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ（インフルエンザ血球凝集素タンパク質の断片）、Ｖ５（シミアンウィルス５として知られるパラミクソウィルスのＶ及びＰタンパク質上に存在するペプチドドメイン）及びＨＳＶ（単純ヘルペスウィルスによって発現されるタンパク質の断片）を含んでいた。同じＣＭＶプロモーターを用いて、固有タンパク質バーコードを有する四つの構築物を、個別に細胞にトランスフェクトした（例えば、図３６Ａを参照）。さらに２４時間インキュベーションした後、各トランスフェクション条件から培地の小分け量を回収し、９６ウェルプレートでパン（ｐａｎ）し、個々のウェルのそれぞれを、固有のエピトープのそれぞれに対する固有の捕捉抗体でコーティングした（図３６Ｂ）。非特異的結合を排除するための一連の緩衝液洗浄に続いて、各ウェルはルシフェラーゼ活性について展開（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）した。図３６Ｃに示したデータは、特定のタンパク質エピトープを含む構築物でトランスフェクトされたＨ１２９９細胞が、ルシフェラーゼ活性の大幅な増加によって示されるように、対応する抗体でコーティングされたウェルで捕捉できる可能性があることを示している。逆に、その同じ溶解物は、抗体でコーティングされていない対照ウェル（非特異的結合のためにブロックされている）又は他のエピトープに対する抗体でコーティングされたウェルで発光の増加をもたらさない。総合すると、これらのデータは、バーコードが相対的プロモーター活性の代理尺度を提供するのに加えて、物理的分離方法を提供できることを示している。
固有のプロモーター／レポーターの組み合わせを識別するのに使用されるバーコードの種類は、核酸配列として存在し得る（図３５Ａ）。あるいは、バーコードは、小タンパク質又はペプチド断片の使用などの他の形態を取ることができるが、それに限定されるものではない。この現在の実施例では、ルシフェラーゼレポータータンパク質の末端に融合されたペプチドバーコード断片により、分泌されたルシフェラーゼを、アッセイを行うのに使用される９６ウェルプレートの個々のウェルを最初に固有タンパク質タグの一つに対するアフィニティを有する特異的抗体でコーティングする酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ベースのアッセイで捕捉することができる。このようにして、プレートの各ウェルを用いて、個々のペプチドタグの存在について分泌培地の複合体混合物をパン（ｐａｎ）及び調査することができる。このアプローチの有用性を実証するために、操作された分泌型のルシフェラーゼタンパク質を、ＩＬ－６からのルシフェラーゼの分泌ドメイン／シグナルペプチドのＮ末端への融合によって生成した。さらに、一連のペプチドエピトープベースのバーコードを、シグナルペプチド及びルシフェラーゼをコードする配列の間に導入した（図３６Ａ）。概念実験の最初の証明のために含まれるエピトープタグは、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ（インフルエンザ血球凝集素タンパク質の断片）、Ｖ５（シミアンウィルス５として知られるパラミクソウィルスのＶ及びＰタンパク質上に存在するペプチドドメイン）及びＨＳＶ（単純ヘルペスウィルスによって発現されるタンパク質の断片）を含んでいた。同じＣＭＶプロモーターを用いて、固有タンパク質バーコードを有する四つの構築物を、個別に細胞にトランスフェクトした（例えば、図３６Ａを参照）。さらに２４時間インキュベーションした後、各トランスフェクション条件から培地の小分け量を回収し、９６ウェルプレートでパン（ｐａｎ）し、個々のウェルのそれぞれを、固有のエピトープのそれぞれに対する固有の捕捉抗体でコーティングした（図３６Ｂ）。非特異的結合を排除するための一連の緩衝液洗浄に続いて、各ウェルはルシフェラーゼ活性について展開（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）した。図３６Ｃに示したデータは、特定のタンパク質エピトープを含む構築物でトランスフェクトされたＨ１２９９細胞が、ルシフェラーゼ活性の大幅な増加によって示されるように、対応する抗体でコーティングされたウェルで捕捉できる可能性があることを示している。逆に、その同じ溶解物は、抗体でコーティングされていない対照ウェル（非特異的結合のためにブロックされている）又は他のエピトープに対する抗体でコーティングされたウェルで発光の増加をもたらさない。総合すると、これらのデータは、バーコードが相対的プロモーター活性の代理尺度を提供するのに加えて、物理的分離方法を提供できることを示している。
【0403】
バーコードとして使用されるペプチド断片は、ＥＬＩＳＡ形式以外の代替のスクリーニング及びパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）法のために設計することができる。代替のアッセイ形式は、特定の分析物を検出するための高速で高品質で安価な解決法を提供するのに有用であり得る。一例として、患者の尿を用いた側方流動クロマトグラフィーを使用した迅速検査が、ヒトの妊娠の検出に一般的に採用されてきた。がん活性化マーカーを検出するための代替アッセイ方式の能力を調べるために、本発明者らのルシフェラーゼの分泌変異体に挿入された核酸バーコードを、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）タンパク質からのβサブユニットに置き換えた。そのキメラタンパク質を、がん活性化ヒトスルビビンプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかの下流でクローニングした（図３７Ａ）。ｈＣＧバーコードが構築物の活性を変化させなかったことを確認するため、Ｈ１２９９細胞のプレートの平行セットを、組換えＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。ｈＣＧバーコードを欠く同一のＤＮＡ構築物を対照とした。トランスフェクション効率の変動を制御するために、ＣＭＶ駆動のウミシイタケシフェラーゼ発現カセットを含むＤＮＡ構築物を、各トランスフェクション混合物に含めた。トランスフェクション後さらに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、培地の小分け量について、発光活性のアッセイを行った。図３７Ｂに見られるように、ｈＣＧバーコードの存在は、ルシフェラーゼレポータータンパク質の発現をほとんど変えなかった。最後に、同じものの上清７００ｕＬを、地元の薬局で購入した市販の妊娠検査キットに入れた。図３７でわかるように、その妊娠検査キットは、レポーターのバーコード化されていないバリアントとｈＣＧバーコード化バリアントでトランスフェクトされた細胞を明瞭に区別できる。
【0404】
以上、本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される具体的な実施例によって限定されることは意図されていない。本発明について、前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。ここで、本発明から逸脱しない限り、多数の改変、変更、及び置換が、当業者には思い浮かぶであろう。さらに、理解すべき点として、本発明の全ての態様は、多様な条件及び可変要素によって決まる、本明細書に記載の具体的な描画、構成、又は相対的割合に限定されるものではない。理解すべき点として、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する各種代替形態が、本発明の実施において使用可能である。したがって、本発明は、そのような代替形態、変更、変形形態、又は均等物も網羅することが想到される。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、そしてこれらの特許請求の範囲に包含される方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって網羅されるものとする。
【0405】
実施形態
以下は、実施形態例であることを意図するものであり、いかなる形でも限定的なものではない。
以下は、実施形態例であることを意図するものであり、いかなる形でも限定的なものではない。
【0406】
１．（ａ）組成物を対象者に投与し、当該組成物が、前記対象者での非病変細胞におけるバイオマーカーの発現より優先的に、病変細胞における前記バイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなること；
（ｂ）前記バイオマーカーを検出すること；及び
（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が少なくとも７０％の精度で前記病変細胞を有することを決定することを含む方法。
（ｂ）前記バイオマーカーを検出すること；及び
（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が少なくとも７０％の精度で前記病変細胞を有することを決定することを含む方法。
【0407】
２．前記相対比が濃度比である、実施形態１の方法。
【0408】
３．前記バイオマーカーを前記対象者からの生体サンプルで検出する、実施形態１又は２の方法。
【0409】
４．前記生体サンプルが前記対象者からの体液である、実施形態３の方法。
【0410】
５．前記生体サンプルが、前記対象者からの血液又は血液ベースのサンプルである、実施形態４の方法。
【0411】
６．前記生体サンプルが前記対象者からのガス状サンプルである、実施形態３の方法。
【0412】
７．前記ガス状サンプルが前記対象者からの呼気である、実施形態６の方法。
【0413】
８．前記対象者が哺乳動物である、実施形態１～７のいずれか一つの方法。
【0414】
９．前記対象者がヒトである、実施形態８の方法。
【0415】
１０．前記対象者が動物である、実施形態８の方法。
【0416】
１１．前記生体サンプルが、ヒト又は動物の体内でイン・サイツで測定される、実施形態３の方法。
【0417】
１２．前記組成物が核酸ベクターを含む、実施形態１～１１のいずれか一つの方法。
【0418】
１３．前記ベクターが、ナノプラスミド、プラスミド、ミニサークル、組換えウィルスベクター、又はＣＥＬｉＤからなる群から選択される、実施形態１２の方法。
【0419】
１４．前記組成物がミニサークルを含み、前記ミニサークルが自己複製ミニサークルである、実施形態１３の方法。
【0420】
１５．前記自己複製ミニサークルがＳ／ＭＡＲ要素を含む、実施形態１４の方法。
【0421】
１６．前記組成物が、前記バイオマーカーをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態１～１５のいずれか一つの方法。
【0422】
１７．前記プロモーターが、前記対象者における複数の異なる種類の病変細胞における発現を駆動する、実施形態１６の方法。
【0423】
１８．前記プロモーターが、前記対象者での前記非病変細胞における前記バイオマーカーの発現より優先的に前記複数の異なる種類の病変細胞における前記バイオマーカーの発現を駆動する、実施形態１～１７のいずれか一つの方法。
【0424】
１９．プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される実施形態１７の方法。
【0425】
２０．前記バイオマーカーが、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一つの方法。
【0426】
２１．前記定量可能な核酸バイオマーカーが操作されたｍｉＲＮＡである、実施形態２０の方法。
【0427】
２２．前記バイオマーカーの検出が、前記病変細胞の位置を決定する、実施形態２０又は２１の方法。
【0428】
２３．前記バイオマーカーが、非侵襲的イメージング又はそれらの組み合わせによって、前記対象者の身体サンプルにおいて検出可能である、実施形態１～２２のいずれか一つの方法。
【0429】
２４．前記バイオマーカーが、血液ベースのアッセイを用いて検出される、実施形態２３の方法。
【0430】
２５．前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、実施形態１～２４のいずれか一つの方法。
【0431】
２６．前記トランスフェクション剤が、直鎖若しくは分岐ポリエチレンイミン、ナノ粒子、親油性粒子、固体ナノ粒子、ペプチド、ミセル、デンドリマー、ポリマー組成物、ヒドロゲル、合成若しくは天然由来のエキソソーム、ウィルス様粒子、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態２５の方法。
【0432】
２７．前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態１～２６のいずれか一つの方法。
【0433】
２８．前記薬学的に許容される担体が、水、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素、デキストロース水溶液、グリセロール溶液、グルコース、乳糖、ショ糖、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム溶液、プロピレン、グリコール、ココアバター、又はエタノールからなる群から選択される、実施形態２７の方法。
【0434】
２９．疾患を有するか疾患を有することが疑われる対象者を治療する方法であって、当該対象者での非病変細胞による前記治療上有効な薬剤の発現より優先的に当該疾患に関連する病変細胞による治療上有効な薬剤の発現を誘発する組成物を当該対象者に投与することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞によって発現される治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０よりも大きくなることを含み、前記治療上有効な薬剤が、前記病変細胞の細胞集団の減少によって決定される少なくとも１０％の治療効力で当該対象者を治療する方法。
【0435】
３０．前記組成物がベクターを含む、実施形態２９の方法。
【0436】
３１．前記組成物が、治療上有効な薬剤をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態２９又は３０の方法。
【0437】
３２．前記治療上有効な薬剤が、治療上有効なポリペプチド、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はポリペプチドと前記核酸の組み合わせからなる群から選択される、実施形態３１の方法。
【0438】
３３．前記治療上有効な薬剤が、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ＤＴジアホラーゼ、ニトロレダクターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホルホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、フォリルポリグルタミルシンテターゼ、カルボキシペプチダーゼＡｌ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ－４５０からなる群から選択される、実施形態３２の方法。
３４．第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、該組成物が細胞内にある場合には、前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、当該細胞への前記第１及び前記第２の核酸の送達を反映する量で発現され、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物。
３４．第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、当該組成物が、該組成物が細胞内にある場合には、前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、当該細胞への前記第１及び前記第２の核酸の送達を反映する量で発現され、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、病変細胞と非病変細胞で異なって発現される組成物。
【0439】
３５．（ｉ）当該細胞が、非病変細胞での前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞での前記第１の核酸配列の発現を誘発し、前記発現された第１のポリペプチド又は核酸が検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり；
（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく前記第２の核酸配列の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、前記検出可能なバイオマーカーや前記治療薬ではない前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーを生じ、それによって前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの発現のレベルが、当該細胞での前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する、実施形態３４の組成物。
（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく前記第２の核酸配列の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、前記検出可能なバイオマーカーや前記治療薬ではない前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーを生じ、それによって前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの発現のレベルが、当該細胞での前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供する、実施形態３４の組成物。
【0440】
３６．前記組成物において、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸配列及び前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸配列を含む前記配列が、独立の遺伝子構築物上にある、実施形態３４又は３５の組成物。
３７．前記第１のポリペプチドが前記検出可能なバイオマーカー及び前記治療薬である、実施形態３４～３６のいずれか一つの組成物。
３７．前記第１のポリペプチドが前記検出可能なバイオマーカー及び前記治療薬である、実施形態３４～３６のいずれか一つの組成物。
【0441】
３８．前記細胞が病変細胞である、実施形態３４～３７のいずれか一つの組成物。
【0442】
３９．前記組成物が、前記第１及び前記第２の核酸を含むベクターをさらに含む、実施形態３４～３８のいずれか一つの組成物。
【0443】
４０．前記ベクターが、
（ａ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、前記プロモーターが、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び
（ｂ）病変細胞及び非病変細胞において等しく発現を誘発し、前記第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列
を含む、実施形態３９の組成物。
（ａ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、前記プロモーターが、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び
（ｂ）病変細胞及び非病変細胞において等しく発現を誘発し、前記第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列
を含む、実施形態３９の組成物。
【0444】
４１．前記ベクターが非ウィルスベクターである、実施形態３９又は実施形態４０の組成物。
【0445】
４２．前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、実施形態４１の組成物。
【0446】
４３．前記ベクターがナノプラスミドベクターである、実施形態３９又は実施形態４０の組成物。
【0447】
４４．前記第１及び第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーが、非侵襲的イメージング又はそれらの組み合わせによって、前記対象者の身体サンプルにおいて検出可能である、実施形態３４～４２のいずれか一つの組成物。
【0448】
４５．組成物を前記対象者に投与することを含む、対象者における病変細胞を検出する方法であって、前記組成物が、
第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び
第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列
を含み、
前記組成物が、前記組成物が細胞中にある場合、
（ｉ）前記細胞が、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発し、前記第１のポリペプチドが検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり、
（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく前記第２の核酸配列の同等の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、前記検出可能なバイオマーカーや前記治療薬ではない前記第２のポリペプチドを生じることで、前記第２のポリペプチドの発現レベルが、前記細胞における前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供するように構成される方法。
４６．前記組成物において、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする前記第１の核酸配列及び前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする前記第２の核酸配列を含む前記配列が独立の構築物上にある、実施形態４５の方法。
第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする第１の核酸配列及び
第２のポリペプチド又は第２の核酸バイオマーカーをコードする第２の核酸配列
を含み、
前記組成物が、前記組成物が細胞中にある場合、
（ｉ）前記細胞が、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発し、前記第１のポリペプチドが検出可能なバイオマーカー又は治療薬であり、
（ｉｉ）前記細胞が、病変細胞及び非病変細胞において等しく前記第２の核酸配列の同等の発現を誘発し、前記第２の核酸配列が、前記検出可能なバイオマーカーや前記治療薬ではない前記第２のポリペプチドを生じることで、前記第２のポリペプチドの発現レベルが、前記細胞における前記核酸配列の相対レベルを評価するための対照を提供するように構成される方法。
４６．前記組成物において、前記第１のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする前記第１の核酸配列及び前記第２のポリペプチド又は核酸バイオマーカーをコードする前記第２の核酸配列を含む前記配列が独立の構築物上にある、実施形態４５の方法。
【0449】
４７．前記第１のポリペプチドが前記検出可能なバイオマーカー及び前記治療薬である、実施形態４５又は実施形態４６の方法。
【0450】
４８．前記細胞が病変細胞である、実施形態４５～４７のいずれか一つの方法。
【0451】
４９．前記組成物が、前記第１及び前記第２の核酸を含むベクターをさらに含む、実施形態４５～４８のいずれか一つの方法。
【0452】
５０．前記ベクターが、
（ａ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、前記プロモーターが、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び
（ｂ）病変細胞及び非病変細胞において等しく同等の発現を誘発し、前記第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列
を含む、実施形態４９の方法。
（ａ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、前記プロモーターが、非病変細胞における前記第１の核酸配列の発現より優先的に病変細胞における前記第１の核酸配列の発現を誘発する第１のプロモーター；及び
（ｂ）病変細胞及び非病変細胞において等しく同等の発現を誘発し、前記第２の核酸に作動可能に連結されている第２のプロモーター配列
を含む、実施形態４９の方法。
【0453】
５１．前記ベクターが非ウィルスベクターである、実施形態４９又は実施形態５０の方法。
【0454】
５２．前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、実施形態５１の方法。
【0455】
５３．前記ベクターがナノプラスミドベクターである、実施形態４９又は実施形態５０の方法。
【0456】
５４．前記第１及び第２のポリペプチドが、非侵襲的イメージング又はそれらの組み合わせによって、前記対象者の身体サンプルにおいて検出可能である、実施形態４５～５２のいずれか一つの方法。
【0457】
５５．
第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び
第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含む組成物であって、
前記組成物が、前記組成物が細胞内にある場合、
（ｉ）前記細胞が前記第１の核酸配列を発現して、前記第１のポリペプチドを生成し、
（ｉｉ）前記細胞が、前記第２の核酸配列を発現して、前記第２のポリペプチドを生成し、
（ｉｉｉ）前記細胞によって発現される前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成する
ように構成される組成物。
第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び
第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含む組成物であって、
前記組成物が、前記組成物が細胞内にある場合、
（ｉ）前記細胞が前記第１の核酸配列を発現して、前記第１のポリペプチドを生成し、
（ｉｉ）前記細胞が、前記第２の核酸配列を発現して、前記第２のポリペプチドを生成し、
（ｉｉｉ）前記細胞によって発現される前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、結合してヘテロ二量体タンパク質を形成する
ように構成される組成物。
【0458】
５６．前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、第１の遺伝子要素及び第２の遺伝子要素に作動可能に連結され、前記第１の遺伝子要素及び前記第２の遺伝子要素の両方が選択的に活性化されて、同じ病変細胞型における前記第１及び前記第２のポリペプチドを発現する、実施形態５５の組成物。
【0459】
５７．前記第１又は前記第２の遺伝子（ｇｅｎｅｒｉｃ）要素がプロモーター、エンハンサー、又はｍｉＲＮＡ結合部位である、実施形態５６の組成物。
【0460】
５８．前記ヘテロ二量体タンパク質が、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロ二量体、スプリットルシフェラーゼタンパク質、又はスプリットＧＦＰタンパク質である、実施形態５５～５７のいずれか一つの組成物。
【0461】
５９．前記ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロ二量体がＣｒｅリコンビナーゼの第１の半分及び第２の半分に連結されている、実施形態５８の組成物。
【0462】
６０．前記第１及び前記第２のポリペプチドが第１及び第２の自家蛍光タンパク質に連結され、前記第１及び前記第２の自家蛍光タンパク質がＦＲＥＴ対を形成する、実施形態５５～５９のいずれか一つの組成物。
６１．前記ヘテロ二量体タンパク質が、病変細胞の活性を調節するように構成される、実施形態５５～６０のいずれか一つの組成物。
６１．前記ヘテロ二量体タンパク質が、病変細胞の活性を調節するように構成される、実施形態５５～６０のいずれか一つの組成物。
【0463】
６２．前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが独立の遺伝子構築物上にある、実施形態５５～６１のいずれか一つの組成物。
【0464】
６３．実施形態５５～６２のいずれか一つによる組成物を対象者に投与することを含む病変細胞の検出又は治療方法であって、前記第１及び前記第２のポリペプチドが前記病変細胞において選択的に転写又は翻訳される方法。
【0465】
６４．前記ヘテロ二量体タンパク質を検出することを含む、実施形態６３の方法。
【0466】
６５．ポリペプチド又は核酸配列をコードする配列を含む非天然組換え遺伝子構築物を含む組成物であって、前記配列が、エクス・ビボで細胞中に形質導入された時に対象者から単離された複数の異なる種類の細胞において前記ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む組成物。
【0467】
６６．前記細胞を含む、実施形態６５の組成物。
６７．前記細胞が、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は呼気中で認められる細胞を含む、実施形態６５又は６６の組成物。
６７．前記細胞が、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は呼気中で認められる細胞を含む、実施形態６５又は６６の組成物。
【0468】
６８．前記複数の異なる種類の細胞が、病変細胞又は障害細胞である、実施形態６５～６７のいずれか一つの組成物。
【0469】
６９．前記病変細胞又は障害細胞が複数の異なる種類の腫瘍細胞である、実施形態６８の組成物。
【0470】
７０．前記第１のプロモーターが汎腫瘍特異的プロモーターである、実施形態６５～６９のいずれか一つの組成物。
【0471】
７１．前記第１のプロモーターががん特異的プロモーターである、実施形態６５～７０のいずれか一つの組成物。
【0472】
７２．前記第１のプロモーターが、前記細胞が罹患状態にあるときに活性化される前記細胞からの内因性プロモーターである、実施形態６５～７１のいずれか一つの組成物。
【0473】
７３．前記組換え遺伝子構築物が、レトロウィルス、レンチウィルス、又はアデノウィルスのパッケージング要素又は長い末端反復を含む、実施形態６５～７２のいずれか一つの組成物。
【0474】
７４．前記組換え遺伝子構築物が非ウィルスベクターである、実施形態６５～７３のいずれか一つの組成物。
【0475】
７５．前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、実施形態７４の組成物。
７６．前記組成物が一定の診断効率を有し、当該診断効率が、前記対象者における非病変細胞での前記バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞において測定されることで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの相対比率が１．０より大きく；
（ｂ）前記バイオマーカーを検出し；及び（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が前記病変細胞を持っていることを、少なくとも９０％の精度で決定する、実施形態６５～７５のいずれか一つの組成物。
７７．前記ポリペプチド又は核酸配列がレポーターポリペプチドであり、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、又は比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６５～７６のいずれか一つの組成物。
７６．前記組成物が一定の診断効率を有し、当該診断効率が、前記対象者における非病変細胞での前記バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞において測定されることで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの相対比率が１．０より大きく；
（ｂ）前記バイオマーカーを検出し；及び（ｃ）（ｂ）で検出された前記バイオマーカーを用いて、前記対象者が前記病変細胞を持っていることを、少なくとも９０％の精度で決定する、実施形態６５～７５のいずれか一つの組成物。
７７．前記ポリペプチド又は核酸配列がレポーターポリペプチドであり、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、又は比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６５～７６のいずれか一つの組成物。
【0476】
７８．前記レポーターポリペプチドが発光レポーターであり、前記発光レポーターがルシフェラーゼである、実施形態７７の組成物。
【0477】
７９．前記ポリペプチド又は核酸配列が核酸配列であり、リボザイム、自己スプライシングイントロン、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、又は別の種類の定量可能なＲＮＡバイオマーカーである、実施形態６５～７８のいずれか一つの方法。
【0478】
８０．前記核酸配列バイオマーカーが、定量的ＰＣＲ、配列決定、又はハイブリダイゼーションベースの技術によって検出可能である、実施形態７９の組成物。
【0479】
８１．前記細胞が病変細胞又は障害細胞であり、前記遺伝子構築物が、前記病変細胞若しくは障害細胞での前記第２のポリペプチドの発現を選択的に駆動する第２のプロモーターの制御下に前記病変細胞又は障害細胞の増殖を調節する第２のポリペプチドをさらにコードする、実施例６５～８０のいずれか一つの組成物。
８２．対象者から単離された細胞の集団にエクス・ビボで非天然組換え遺伝子構築物を送達することを含む、病変細胞若しくは障害細胞をエクス・ビボで検出するための方法であって、前記非天然組換え遺伝子構築物が、
ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列をコードする配列
を含み、
前記配列が、前記細胞に形質導入されたときに対象者から単離された複数の異なる種類の細胞において前記ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む方法。
８２．対象者から単離された細胞の集団にエクス・ビボで非天然組換え遺伝子構築物を送達することを含む、病変細胞若しくは障害細胞をエクス・ビボで検出するための方法であって、前記非天然組換え遺伝子構築物が、
ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列をコードする配列
を含み、
前記配列が、前記細胞に形質導入されたときに対象者から単離された複数の異なる種類の細胞において前記ポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を選択的に駆動する第１のプロモーターを含む方法。
【0480】
８３．前記細胞集団を単離することを含む、実施形態８２の方法。
【0481】
８４．非侵襲的方法を介して前記細胞を単離することを含む、実施形態８３の方法。
【0482】
８５．唾液、痰、汗、尿、便、精液、頸膣分泌物、乳汁、粘膜分泌物、涙、又は頬上皮によって細胞を取得することを含む、実施形態８４の方法。
【0483】
８６．低侵襲法を介して細胞を単離することを含む、実施形態８５の方法。
【0484】
８７．静脈穿刺、胸腔穿刺、羊水穿刺、又は胃洗浄によって細胞を取得することを含む、実施形態８６の方法。
【0485】
８８．生検によって前記細胞を単離することを含む、実施形態８７の方法。
【0486】
８９．前記細胞が、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に流れ出るか体から特異的に採取組織又は上皮細胞の生検（頬細胞の掻き取りなど）、体液、羊水、羊膜液、胸膜液又は呼気中で認められる細胞を含む、実施形態８２～８８のいずれか一つの方法。
【0487】
９０．前記ポリペプチド又は核酸配列を検出することを含む、実施形態８２～８９のいずれか一つの方法。
【0488】
９１．前記疾患が、がん、自己免疫疾患、又は神経変性疾患である、実施形態８２～９０のいずれか一つの方法。
【0489】
９２．前記プロモーターが汎がん特異的プロモーターである、実施形態８２～９１のいずれか一つの方法。
【0490】
９３．前記ベクターが、複数のバーコード分子に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、前記各プロモーターが、細胞内の前記複数のバーコード分子の発現を駆動し、前記複数のバーコードのレベルが前記細胞の疾患の段階を示している、ベクターを含む組成物。
【0491】
９４．前記細胞の前記疾患の前記段階が、罹患しているか、罹患していないか、又は中間状態である、実施形態９３の組成物。
【0492】
９５．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの初期段階で活性化される第１のプロモーターを含む、実施形態９３～９４のいずれか一つの組成物。
９６．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの中間段階で活性化される第２のプロモーターを含む、実施形態９３～９５のいずれか一つの組成物。
９７．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの後期段階で活性化される第３のプロモーターを含む、実施形態９３～９６のいずれか一つの組成物。
９８．前記ベクターが非ウィルスベクターである、実施形態９３～９７のいずれか一つの組成物。
９６．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの中間段階で活性化される第２のプロモーターを含む、実施形態９３～９５のいずれか一つの組成物。
９７．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの後期段階で活性化される第３のプロモーターを含む、実施形態９３～９６のいずれか一つの組成物。
９８．前記ベクターが非ウィルスベクターである、実施形態９３～９７のいずれか一つの組成物。
【0493】
９９．前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、実施形態９３～９８のいずれか一つの組成物。
【0494】
１００．前記ベクターがナノプラスミドベクターである、実施形態９３～９７のいずれか一つの組成物。
【0495】
１０１．前記複数のバーコード分子が複数のポリペプチドを含む場合、前記ポリペプチドのそれぞれが、非侵襲的イメージングによって検出可能である、実施形態９３～９９のいずれか一つの組成物。
【0496】
１０２．非侵襲的イメージングが光音響、ＭＲＩ、又はＰＥＴイメージングを含む、実施形態１０１の組成物。
【0497】
１０３．前記ポリペプチドのそれぞれが身体サンプルにおいて検出可能である、実施形態１０１のいずれか一つの組成物。
【0498】
１０４．前記身体サンプルが、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は呼気である、実施形態１０３の組成物。
【0499】
１０５．ベクターを含む組成物を対象者に投与することを含む、疾患の段階を検出する方法であって、前記ベクターが、
複数の異なるバーコード分子に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターでを含み、前記各プロモーターが、細胞内の前記複数のバーコード分子の発現を駆動し、
個々のバーコード分子のレベルが、前記細胞の疾患の段階を示している方法。
１０６．前記細胞の前記疾患の前記段階が、罹患しているか、罹患していないか、又は中間状態である、実施形態１０５の方法。
複数の異なるバーコード分子に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターでを含み、前記各プロモーターが、細胞内の前記複数のバーコード分子の発現を駆動し、
個々のバーコード分子のレベルが、前記細胞の疾患の段階を示している方法。
１０６．前記細胞の前記疾患の前記段階が、罹患しているか、罹患していないか、又は中間状態である、実施形態１０５の方法。
【0500】
１０７．前記方法が、前記対象者における結節、組織塊、又は病変を、本質的に前がん性、良性、異形成、又は転移性であると決定する、実施形態１０５又は１０６の方法。
【0501】
１０８．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの初期段階で活性化される第１のプロモーターを含む、実施形態１０５～１０７のいずれか一つの方法。
【0502】
１０９．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの中間段階で活性化される第２のプロモーターを含む、実施形態１０５～１０８のいずれか一つの方法。
【0503】
１１０．前記疾患ががんであり、前記複数の異なるプロモーターが、がんの後期段階で活性化される第３のプロモーターを含む、実施形態１０５～１０９のいずれか一つの方法。
【0504】
１１１．前記ベクターが非ウィルスベクターである、実施形態１０５～１１０のいずれか一つの方法。
【0505】
１１２．前記非ウィルスベクターがミニサークルベクターである、実施形態１０５～１１１のいずれか一つの方法。
【0506】
１１３．前記ベクターがナノプラスミドベクターである、実施形態１０５～１１０のいずれか一つの方法。
【0507】
１１４．前記複数のバーコード分子が複数のポリペプチドを含む場合、当該方法が、非侵襲的イメージングによって前記複数のポリペプチドのうちの少なくとも一つを検出することをさらに含む、実施形態１０５～１１２のいずれか一つの方法。
【0508】
１１５．非侵襲的イメージングが、光音響、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、又はＰＥＴイメージングを含む、実施形態１１４の方法。
【0509】
１１６．身体サンプル中の前記複数のバーコード分子のうちの少なくとも一つを検出することを含む、実施形態１０５～１１５のいずれか一つの方法。
【0510】
１１７．前記身体サンプルが、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は呼気で認められる、実施形態１１６の方法。
【0511】
１１８．前記組成物が、前記対象者において、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与、又はリンパ節投与される、実施形態１０５～１１７のいずれか一つの方法。
【0512】
１１９．配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むレポーター遺伝子を含む組換え核酸と比較した場合、病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示す発現可能なレポーター遺伝子をコードする遺伝子操作核酸を含む組成物。
【0513】
１２０．前記遺伝子操作核酸が汎腫瘍特異的プロモーターを含む、実施形態１１９の組成物。
【0514】
１２１．前記汎腫瘍特異的プロモーターが転写応答要素を含む、実施形態１２０の組成物。
【0515】
１２２．前記転写応答要素が、修飾されたｐ５３応答要素を含む、実施形態１２１の組成物。
【0516】
１２３．前記修飾ｐ５３応答要素内の修飾が、病変細胞と比較して正常細胞におけるプロモーター活性の低下をもたらす、実施形態１２２の組成物。
【0517】
１２４．前記修飾ｐ５３応答要素内の修飾が、正常細胞と比較して、病変細胞におけるプロモーター活性の増加をもたらす、実施形態１２２又は１２３の組成物。
【0518】
１２５．前記疾患ががんである、実施形態１１９～１２４のいずれか一つの組成物。
１２６．実施形態１１９～１２５のいずれか一つによる組成物を対象者に投与することを含む方法。
１２６．実施形態１１９～１２５のいずれか一つによる組成物を対象者に投与することを含む方法。
【0519】
１２７．前記対象者ががんを有することが疑われる、実施形態１２６の方法。
【0520】
１２８．前記組成物が、前記対象者において、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与、又はリンパ節投与される、実施形態１２５又は１２６の方法。
１２９．病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示し、前記レポーター遺伝子の３′非翻訳領域に１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物。
１２９．病変細胞と比べて正常細胞で約１０％以下の発現を示し、前記レポーター遺伝子の３′非翻訳領域に１以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むレポーター遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む組成物。
【0521】
１３０．前記病変細胞で発現されるｍｉＲＮＡの１以上のｍｉＲＮＡ結合配列のうちの少なくとも一つへの結合により、前記レポーター遺伝子の翻訳の減少又は前記レポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡの半減期の短縮が生じる、実施形態１２９の組成物。
１３１．前記病変細胞ががん細胞である、実施形態１２９又は１３０の組成物。
１３１．前記病変細胞ががん細胞である、実施形態１２９又は１３０の組成物。
【0522】
１３２．前記レポーター遺伝子が、前記がん細胞で発現される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの低下のゆえに、前記がん細胞で増加した発現を示す、実施形態１３１の組成物。
【0523】
１３３．前記組成物が、前記レポーター遺伝子の前記３′非翻訳領域に少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列を含み、二つのｍｉＲＮＡ結合配列が、同じｍｉＲＮＡに結合することができる実質的に同一のヌクレオチド配列を有する、実施形態１２９～１３２のいずれか一つの組成物。
【0524】
１３４．前記組成物が、前記レポーター遺伝子の前記３′非翻訳領域に少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列を含み、前記少なくとも二つのｍｉＲＮＡ結合配列が異なるヌクレオチド配列を有し、当該異なるヌクレオチド配列がそれぞれが前記異なるｍｉＲＮＡに結合することができる、実施形態１２９～１３３のいずれか一つの組成物。
【0525】
１３５．前記組換え核酸がＤＮＡを含む、実施形態１２９～１３４のいずれか一つの組成物。
【0526】
１３６．前記組換え核酸が合成又はイン・ビトロ転写ｍＲＮＡである、実施形態１２９～１３５のいずれか一つの組成物。
【0527】
１３７．前記１以上のｍｉＲＮＡ結合配列が少なくとも一つのｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２２又はｍｉＲ－３４結合配列を含む、実施形態１２９～１３６のいずれか一つの組成物。
１３８．実施形態１２９～１３７のいずれか一つによる組成物を対象者に投与することを含む、病変細胞の検出方法。
１３８．実施形態１２９～１３７のいずれか一つによる組成物を対象者に投与することを含む、病変細胞の検出方法。
【0528】
１３９．前記レポーター遺伝子を検出することを含む、実施形態１３８の方法。
【0529】
１４０．前記対象者ががんを有することが疑われる、実施形態１３８の方法。
【0530】
１４１．前記組成物が、前記対象者において、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与、又はリンパ節投与される、実施形態１３８～１４０のいずれか一つの方法。
【0531】
１４２．合成バイオマーカーをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含むプラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、又はナノプラスミドＤＮＡに対して、合成バイオマーカーの有意に長い発現を示す組成物であって、前記二本鎖核酸の順鎖及び逆鎖が、それらの末端のそれぞれで共有結合的に連結されており、前記プロモーターが、非病変細胞における前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞における前記合成バイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞において発現される前記合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなっている組成物。
【0532】
１４３．前記直鎖ベクターが、前記合成バイオマーカーをコードする前記ＤＮＡ配列に作動可能に連結された前記プロモーターに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、前記ＩＴＲがアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に由来する、実施形態１４２の組成物。
【0533】
１４４．前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、実施形態１４３の組成物。
【0534】
１４５．前記プロモーターが、対象者における複数の病変細胞において選択的に前記合成バイオマーカーの発現を駆動する、実施形態１４２～１４４のいずれか一つの組成物。
【0535】
１４６．前記プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１４５の組成物。
【0536】
１４７．前記が、ＭＲＩレポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、光音響レポーター、生物発光レポーター、蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、比色レポーター、定量可能な核酸バイオマーカー及びそれらの組み合わせ、及びそれらの任意の組み合わせである、実施形態１４２～１４６のいずれか一つの組成物。
１４８．前記バイオマーカーの検出が、前記病変細胞の位置を決定する、実施形態１４７の組成物。
１４８．前記バイオマーカーの検出が、前記病変細胞の位置を決定する、実施形態１４７の組成物。
【0537】
１４９．実施形態１４２～１４８のいずれか一つによる組成物を対象者に投与すること、及び前記合成バイオマーカーを検出することを含む、病変細胞を同定する方法であって、前記合成バイオマーカーが、前記対象者において前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞において発現されることで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなる方法。
【0538】
１５０．前記病変細胞ががん細胞である、実施形態１４９の方法。
【0539】
１５１．前記合成バイオマーカーを検出することにより、少なくとも９０％の精度で前記病変細胞を同定する、実施形態１４９～１５０のいずれか一つの方法。
【0540】
１５２．前記対象者に対して実施される非侵襲的イメージング法を用いて前記合成バイオマーカーを検出することを含む、実施形態１４９～１５１のいずれか一つの方法。
【0541】
１５３．非侵襲的イメージングが、光音響、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、又はＰＥＴイメージングを含む、実施形態のいずれか一つの方法。
【0542】
１５４．前記対象者からの身体サンプル中の前記合成バイオマーカーを検出することを含む、実施形態１４９～１５３のいずれか一つの方法。
【0543】
１５５．前記身体サンプルが、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、自然に排出されるか身体から特異的に収集される組織若しくは上皮細胞の生検（頬細胞の剥離物など）、水性粘液、羊水、胸膜液、又は呼気中で認められる、実施形態１５４の方法。
【0544】
１５６．前記サンプルが生検サンプルである、実施形態１５４の方法。
【0545】
１５７．前記バイオマーカーの検出が、前記病変細胞の位置を決定する、実施形態１５２又は１５３の方法。
【0546】
１５８．前記対象者ががんを有することが疑われる、実施形態１４９～１５７のいずれか一つの方法。
【0547】
１５９．前記組成物が、前記対象者において、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与、又はリンパ節投与される、実施形態１４９～１５８のいずれか一つの方法。
【0548】
１６０．治療上有効な薬剤をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む二本鎖核酸を含む直鎖ベクターを含む、プラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡに対して有意に長い合成バイオマーカーの発現を示す組成物であって、前記二本鎖核酸の各順鎖及び逆鎖がそれらの各末端で共有結合的に連結されており、前記プロモーターが、非病変細胞における前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞における前記治療上有効な薬剤の発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記治療上有効な薬剤の相対濃度が１．０より大きくなる組成物。
１６１．前記直鎖ベクターが、前記治療上有効な薬剤をコードする前記ＤＮＡ配列に作動可能に連結された前記プロモーターに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、前記ＩＴＲがアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に由来する、実施形態１６０の組成物。
１６１．前記直鎖ベクターが、前記治療上有効な薬剤をコードする前記ＤＮＡ配列に作動可能に連結された前記プロモーターに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、前記ＩＴＲがアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に由来する、実施形態１６０の組成物。
【0549】
１６２．前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、実施形態１６０又は１６１の組成物。
【0550】
１６３．前記プロモーターが、対象者における複数の病変細胞において選択的に前記治療上有効な薬剤の発現を駆動する、実施形態１６０～１６２のいずれか一つの組成物。
【0551】
１６４．前記プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１６３の組成物。
【0552】
１６５．前記治療上有効な薬剤が、治療上有効なポリペプチド、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は前記治療上有効なポリペプチド及び前記核酸の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１６０～１６４のいずれか一つの組成物。
【0553】
１６６．前記治療上有効な薬剤が、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ＤＴジアホラーゼ、ニトロレダクターゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、フォリルポリグルタミルシンテターゼ、カルボキシペプチダーゼＡｌ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ－４５０からなる群から選択される、実施形態１６５の組成物。
１６７．実施形態１６０～１６６のいずれか一つによる組成物を対象者に投与すること、及び前記合成バイオマーカーを検出することを含む、病変細胞の治療方法であって、前記合成バイオマーカーが、前記対象者における非病変細胞での前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞において発現されることで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなる方法。
１６７．実施形態１６０～１６６のいずれか一つによる組成物を対象者に投与すること、及び前記合成バイオマーカーを検出することを含む、病変細胞の治療方法であって、前記合成バイオマーカーが、前記対象者における非病変細胞での前記合成バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞において発現されることで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記合成バイオマーカーの相対濃度が１．０より大きくなる方法。
【0554】
１６８．前記病変細胞ががん細胞である、実施形態１６７の方法。
【0555】
１６９．前記対象者ががんを有することが疑われる、実施形態１６７～１６８のいずれか一つの方法。
【0556】
１７０．前記組成物が、前記対象者において、静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与、又はリンパ節投与される、実施形態１６７～１６９のいずれか一つの方法。
１７１．合成バイオマーカーを発現する非ウィルスベクターを含む組成物であって、前記合成バイオマーカーが、病変細胞と比べて正常な器官細胞での約１０％以下の発現を示す組成物。
１７１．合成バイオマーカーを発現する非ウィルスベクターを含む組成物であって、前記合成バイオマーカーが、病変細胞と比べて正常な器官細胞での約１０％以下の発現を示す組成物。
【0557】
１７２．前記器官が肝臓、腎臓、脾臓、又はそれらの組み合わせである、実施形態１７１の組成物。
１７３．前記非ウィルスベクターが、合成バイオマーカーに作動可能に連結されたプロモーターをコードする組換え核酸を含む、実施形態１７１の組成物。
１７３．前記非ウィルスベクターが、合成バイオマーカーに作動可能に連結されたプロモーターをコードする組換え核酸を含む、実施形態１７１の組成物。
【0558】
１７４．前記プロモーターが、スルビビンプロモーター（ＢＩＲＣ５）、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー４（ＡＢＣＣ４）プロモーター、前方勾配２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（ＡＧＲ２）プロモーター、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）プロモーター、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：βＧａｌ β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３（Ｂ３ＧＮＴ３）プロモーター、カドヘリン３（ＣＤＨ３）プロモーター、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰＦ）プロモーター、セントロソームタンパク質５５（ＣＥＰ５５）プロモーター、クラウディン３（ＣＬＤＮ３）プロモーター、クラウディン４（ＣＬＤＮ４）プロモーター、コラーゲンＸＩ型α１鎖（ＣＯＬ１１Ａ１）プロモーター、コラーゲンＩ型α１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）プロモーター、シスタチンＳＮ（ＣＳＴ１）プロモーター、デンティクルレス（ｄｅｎｔｉｃｌｅｌｅｓｓ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼホモログ（ＤＴＬ）プロモーター、配列類似性１１１メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）プロモーターを有するファミリー、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、ラミニンサブユニットγ２（ＬＡＭＣ２）プロモーター、有糸分裂紡錘体位置決め（ＭＩＳＰ）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ１）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１２（ＭＭＰ１２）プロモーター、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）プロモーター、メソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）プロモーター、ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＤ（ＰＬＡ２Ｇ２Ｄ）プロモーター、Ｇタンパク質シグナル伝達１３（ＲＧＳ１３）プロモーター、セクレトグロビンファミリー２Ａメンバー１（ＳＣＧＢ２Ａ１）プロモーター、トポイソメラーゼＩＩα（ＴＯＰ２Ａ）プロモーター、ユビキチンＤ（ＵＢＤ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）、ＵＳＨ１タンパク質ネットワークコンポーネントハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）プロモーターを含むＶセットドメイン、ヘキソキナーゼＩＩ型プロモーター、ＴＲＰＭ４プロモーター、ストロメリシン３プロモーター、サーファクタントプロテインＡプロモーター、分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤プロモーター、チロシナーゼプロモーター、ストレス誘発性ｇｒｐ７８／ＢｉＰを含むドメインプロモーター、インターロイキン－１０プロモーター、α－Ｂ－クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、上皮成長因子受容体プロモーター、ムチン様糖タンパク質プロモーター、ｍｔｓ１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ソマトスタチン受容体プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－３プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２プロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ４プロモーター、チログロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、ビリンプロモーター、アルブミンプロモーター、糖タンパク質Ａ３３プロモーター、Ｂ細胞特異的モロニー白血病ウィルス挿入部位１プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２プロモーター、線維芽細胞成長因子プロモーター；ヒト上皮成長受容体２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター；受容体プロモーターを含むキナーゼドメインインサート；ｒａｄ５１リコンビナーゼプロモーター；ＴＴＦ－１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）プロモーター、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＥＫ１）プロモーター、上皮細胞形質転換２プロモーター（ＥＣＴ２）、ＢＣＬ２様１２（ＢＣＬ２Ｌ１２）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｉ（ＣＥＮＰＩ）プロモーター、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）プロモーター、フラビンアデニンジヌクレオチドシンテターゼ１（ＦＬＡＤ１）プロモーター、タンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｇ（ＰＰＭ１Ｇ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｓ（ＵＢＥ２Ｓ）プロモーター、オーロラキナーゼＡ及びニネイン相互作用タンパク質（ＡＵＮＩＰ）プロモーター、細胞分裂周期６（ＣＤＣ６）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｌ（ＣＥＮＰＬ）プロモーター、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）プロモーター、ＤＳＮ１ホモログ、ＭＩＳ１２キネトコア複合体成分（ＤＳＮ１）プロモーター、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）プロモーター、神経突起伸長１（ＧＰＲＩＮ１）プロモーターのＧタンパク質調節誘導物質、ミトコンドリア分裂レギュレーター２（ＭＴＦＲ２）プロモーター、ＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ′（ＳＮＲＰＡ１）プロモーター、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有２（ＡＴＡＤ２）プロモーター、ＢＵＢ１有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ（ＢＵＢ１）プロモーター、カルサイクリン結合タンパク質（ＣＡＣＹＢＰ）プロモーター、細胞分裂周期関連３（ＣＤＣＡ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ｏ（ＣＥＮＰＯ）プロモーター、フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）プロモーター、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）プロモーター、細胞増殖レグタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＫＩＡＡ１５２４）プロモーター、キネシンファミリーメンバー２Ｃ（ＫＩＦ２Ｃ）プロモーター、カリオフェリンサブユニットα２（ＫＰＮＡ２）プロモーター、ＭＹＢ原癌遺伝子様２（ＭＹＢＬ２）プロモーター、ＮＩＭＡ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）プロモーター、ＲＡＮ結合タンパク質１（ＲＡＮＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＢ及びＢ１（ＳＮＲＰＢ）プロモーター、ＳＰＣ２４／ＮＤＣ８０キネトコア複合体成分（ＳＰＣ２４）プロモーター、形質転換酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）プロモーター、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３１（ＴＢＣ１Ｄ３１）プロモーター、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）プロモーター、亜鉛フィンガータンパク質６９５（ＺＮＦ６９５）プロモーター、オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）プロモーター、ＢＬＭ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ（ＢＬＭ）プロモーター、染色体１７オープンリーディングフレーム５３（Ｃ１７ｏｒｆ５３）プロモーター、クロモボックス３（ＣＢＸ３０）プロモーター、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）プロモーター、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）プロモーター、サイクリンＦ（ＣＣＮＦ）、細胞分裂周期２０（ＣＤＣ２０）プロモーター、細胞分裂周期４５（ＣＤＣ４５）プロモーター、細胞分裂周期関連５（ＣＤＣＡ５）プロモーター、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤３（ＣＤＫＮ３）プロモーター、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ ７パスＧ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）プロモーター、セントロメアタンパク質Ａ（ＣＥＮＰＡ）プロモーター、セントロソームタンパク質７２（ＣＥＰ７２）プロモーター、ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット２（ＣＫＳ２）プロモーター、コラーゲンＸ型α１鎖（ＣＯＬ１０Ａ１）プロモーター、染色体分離１様（ＣＳＥ１Ｌ）プロモーター、ＤＢＦ４亜鉛フィンガープロモーター、ＧＩＮＳ複合サブユニット１（ＧＩＮＳ１）プロモーター、Ｇタンパク質結合受容体１９（ＧＰＲ１９）プロモーター、キネシンファミリーメンバー１８Ａ（ＫＩＦ１８Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバー４Ａ（ＫＩＦ４Ａ）プロモーター、キネシンファミリーメンバーＣ１（ＫＩＦＣ１）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス１０複製開始因子（ＭＣＭ１０）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント２（ＭＣＭ２）プロモーター、ミニ染色体メンテナンス複合体コンポーネント７（ＭＣＭ７）プロモーター、ＭＲＧドメイン結合タンパク質（ＭＲＧＢＰ）プロモーター、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）プロモーター、非ＳＭＣコンデンシンＩ複合体サブユニットＨ（ＮＣＡＰＨ）プロモーター、ＮＤＣ８０、キネトコア複合体成分（ＮＤＣ８０）プロモーター、ヌディックス（ｎｕｄｉｘ）ヒドロラーゼ１（ＮＵＤＴ１）プロモーター、リボヌクレアーゼＨ２サブユニットＡ（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）プロモーター、ＲｕｖＢ様ＡＡＡ ＡＴＰａｓｅ １（ＲＵＶＢＬ１）プロモーター、血清学的に定義された乳がん抗原ＮＹ－ＢＲ－８５（ＳＧＯＬ１）プロモーター、ＳＨＣ結合及び紡錘体関連１（ＳＨＣＢＰ１）プロモーター、小核リボヌクレオプロテインポリペプチドＧ（ＳＮＲＰＧ）プロモーター、タイムレス（ｔｉｍｅｌｅｓｓ）サーカディアンレギュレータープロモーター、甲状腺ホルモン受容体相互作用体１３（ＴＲＩＰ１３）プロモーター、トロフィニン関連タンパク質（ＴＲＯＡＰ）プロモーター、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｃ（ＵＢＥ２Ｃ）プロモーター、ＷＤリピート及びＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１（ＷＤＨＤ１）プロモーター、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、それらの断片、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１７３の組成物。
【0559】
１７５．前記組換え核酸が、正常な肝細胞において前記核酸配列の転写又はｍＲＮＡ半減期をサイレンシング又は減衰させる調節要素を含む、実施形態１７３又は１７４の組成物。
１７６．前記調節要素が、前記組換え核酸の転写されたが非翻訳領域に１以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、実施形態１７５の組成物。
１７６．前記調節要素が、前記組換え核酸の転写されたが非翻訳領域に１以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、実施形態１７５の組成物。
【0560】
１７７．前記１以上のｍｉＲＮＡ標的配列の存在が、前記組換え核酸配列からの発現を阻害する、実施形態１７６の組成物。
【0561】
１７８．前記１以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも一つの組織特異的ｍｉＲＮＡについての少なくとも一つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、実施形態１７６～１７７のいずれか一つの組成物。
【0562】
１７９．前記少なくとも一つの組織特異的ｍｉＲＮＡが、正常肝組織で豊富化された少なくとも一つのｍｉＲＮＡを含む、実施形態１７８の組成物。
【0563】
１８０．正常な肝組織で豊富化された前記少なくとも一つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－３３、ｍｉＲ－３３＊、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４８ａ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２９、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１７９の組成物。
【0564】
１８１．前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、実施形態１７０～１８０のいずれか一つの組成物。
【0565】
１８２．前記トランスフェクション剤が、直鎖若しくは分岐ポリエチレンイミン、ナノ粒子、親油性粒子、固体ナノ粒子、ペプチド、ミセル、デンドリマー、ポリマー組成物、ヒドロゲル、合成若しくは天然由来のナノセル、エキソソーム、ウィルス様粒子、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１８１の組成物。
１８３．非病変細胞における前記バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの前記相対濃度比が１．０より大きくなる、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子。
１８３．非病変細胞における前記バイオマーカーの発現より優先的に病変細胞におけるバイオマーカーの発現を誘発することで、前記非病変細胞に対する前記病変細胞で発現される前記バイオマーカーの前記相対濃度比が１．０より大きくなる、生体細胞又はマクロファージの一つ又は多くの機能を模倣する操作粒子。
【0566】
１８４．前記操作粒子が、人工細胞、最小細胞、又は脂質封入合成粒子である、実施形態１８３の操作粒子。
【0567】
１８５．前記操作粒子が、生体膜、高分子膜、単純なポリマー、架橋タンパク質、脂質膜、又は精製された成分とともにイン・ビトロ又はイン・ビボでナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、エキソソーム、微小胞、アポトーシス小胞、輸送小胞、シナプス小胞、分泌小胞、又はマイクロカプセルに形成されたポリマー－脂質複合体を含む、実施形態１８３又は１８４の操作粒子。
【0568】
１８６．前記操作粒子が、膜貫通キメラタンパク質、又は粒子内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結された粒子外特異的結合ドメインを含む天然タンパク質を含み、前記粒子内シグナル伝達ドメインが、前記操作粒子内の少なくとも一つの酵素反応を活性化することができる、実施形態１８３～１８５のいずれか一つの操作粒子。
【0569】
１８７．前記操作粒子が、合成バイオマーカーをコードする核酸配列を含み、前記少なくとも一つの酵素反応により、前記操作粒子内で前記合成バイオマーカーが生成する、実施形態１８６の操作粒子。
【0570】
１８８．前記粒子外特異的結合ドメインが、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片を含む、実施形態１８６又は１８７の操作粒子。
【0571】
１８９．前記操作粒子が、無傷の細胞から単離された細胞質及び他の成分を含む、実施形態１８３～１８８のいずれか一つの操作粒子。
【0572】
１９０．前記操作粒子が、細胞タンパク質、ＤＮＡ、合成遺伝子回路、オルガネラ、ＡＴＰ、酵素、ＮＡＤＰ、転写因子、ヌクレオチド、又は無細胞転写翻訳抽出物など（これらに限定されるものではない）の、精製された組換え高分子成分又は高分子成分を含む、実施形態１８３～１７３のいずれか一つの操作粒子。
【0573】
１９１．少なくとも一つのベクターであって、当該少なくとも一つのベクターが、
複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、当該プロモーターが、細胞中の前記複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、
当該プロモーターが、対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞における前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞と比べて前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなるベクター。
複数の異なる核酸配列に作動可能に連結された複数の異なるプロモーターを含み、当該プロモーターが、細胞中の前記複数の核酸配列の発現を駆動して、複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を生成し、
当該プロモーターが、対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞における前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞と比べて前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなるベクター。
【0574】
１９２．前記プロモーターのそれぞれが、前記対象者における非病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現より優先的に病変細胞での前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列の発現を誘発することで、前記非病変細胞と比べて前記病変細胞で発現される前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカーの相対比が１．０より大きくなる、実施形態１９１のベクター。
１９３．前記複数の異なるプロモーターが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプロモーターを含む、実施形態１９１又は１９２のベクター。
１９３．前記複数の異なるプロモーターが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個のプロモーターを含む、実施形態１９１又は１９２のベクター。
【0575】
１９４．前記複数の異なるプロモーターが、最大で１２、最大で１３、最大で１４、又は最大で１５個のプロモーターを含む、実施形態１９１～１９３のいずれか一つのベクター。
【0576】
１９５．前記複数の異なるプロモーターのうちの少なくとも二つが表１から選択される、実施形態１９１～１９４のいずれか一つのベクター。
【0577】
１９６．前記ベクターがプラスミド、ナノプラスミド、ミニサークル、組換えウィルスベクター、又はＣＥＬｉＤである、実施形態１９１～１９５のいずれか一つのベクター。
【0578】
１９７．前記ミニサークルが自己複製ミニサークルである、実施形態１９６のベクター。
【0579】
１９８．前記自己複製ミニサークルがＳ／ＭＡＲ要素を含む、実施形態１９７のベクター。
【0580】
１９９．前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列が、光音響レポーター、生物発光レポーター、自家蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、又は比色レポーター、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのレポーターポリペプチドを含む、実施形態１９１～１９８のいずれか一つのベクター。
【0581】
２００．前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列が、Ｎ末端分泌シグナル配列を有する少なくとも一つのポリペプチドを含む、実施形態１９１～１９９のいずれか一つのベクター。
【0582】
２０１．前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列が、リボザイム、自己スプライシングイントロン、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、又は別のタイプの定量可能なＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも一つの核酸バイオマーカー配列を含む、実施形態１９１～２００のいずれか一つのベクター。
【0583】
２０２．前記疾患ががん、自己免疫疾患、又は神経変性疾患である、実施形態１９１～２０１のいずれか一つのベクター。
【0584】
２０３．対象者における疾患の検出方法であって、
実施形態１９１～２０１のいずれか一つによるベクターを含む組成物を対象者に投与すること；
前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出して、発現プロファイルを取得すること；並びに
前記発現プロファイルに基づいて前記病変細胞を検出することで、前記疾患を検出すること
を含む方法。
実施形態１９１～２０１のいずれか一つによるベクターを含む組成物を対象者に投与すること；
前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出して、発現プロファイルを取得すること；並びに
前記発現プロファイルに基づいて前記病変細胞を検出することで、前記疾患を検出すること
を含む方法。
【0585】
２０４．（ｂ）が、前記対象者からのサンプルから前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列を検出することを含む、実施形態２０３の方法。
【0586】
２０５．前記サンプルが前記対象者からの体液である、実施形態２０４の方法。
【0587】
２０６．前記生体サンプルが、前記対象者からの血液又は血液ベースのサンプルである、実施形態２０５の方法。
【0588】
２０７．前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列が少なくとも一つの核酸バイオマーカー配列を含み、（ｂ）が定量的ＰＣＲ、配列決定、又はハイブリダイゼーションベースの技術によって前記少なくとも一つの核酸バイオマーカー配列を検出することを含む、実施形態２０３～２０６のいずれか一つの方法。
【0589】
２０８．前記複数のポリペプチド又は核酸バイオマーカー配列が少なくとも一つのレポーターポリペプチドを含み、光音響アッセイ、生物発光アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、比色分析、又はそれらの任意の組み合わせによって前記少なくとも一つのレポーターポリペプチドを検出することを含む、実施形態２０３～２０７のいずれか一つの方法。
２０９．（ｃ）が、機械学習又は分類器アルゴリズムを前記発現プロファイルに適用することを含み、前記機械学習又は分類器アルゴリズムが、病変細胞を示す発現プロファイルを非病変細胞を示す発現プロファイルから区別するように構成される、実施形態２０３～２０８のいずれか一つの方法。
２０９．（ｃ）が、機械学習又は分類器アルゴリズムを前記発現プロファイルに適用することを含み、前記機械学習又は分類器アルゴリズムが、病変細胞を示す発現プロファイルを非病変細胞を示す発現プロファイルから区別するように構成される、実施形態２０３～２０８のいずれか一つの方法。
【0590】
２１０．前記組成物が、前記対象者において静脈投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、側脳室内投与、経皮投与、筋肉投与、経口投与、吸入、鼻腔内投与、直腸投与、腫瘍内投与、腫瘍近位投与又はリンパ節投与される、実施形態２０３～２０９のいずれか一つの方法。
【0591】
２１１．前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態２０３～２１０のいずれか一つの方法。
【0592】
２１２．前記組成物がトランスフェクション剤をさらに含む、実施形態２０３～２１１のいずれか一つの方法。
【0593】
２１３．対象者の疾患の有無を検出する方法であって、
（ａ）前記対象者の１以上の細胞をエクス・ビボで遺伝子構築物と接触させ、
前記遺伝子構築物が、バーコード分子に作動可能に連結された疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患による影響を受けた細胞における前記バーコード分子の発現を駆動すること；
（ｂ）前記バーコード分子の発現レベルを定量すること；及び
（ｃ）前記発現レベルに基づいて、前記疾患の有無を検出することを含む方法。
２１４．対象者の疾患のプロファイルを生成する方法であって、
（ａ）前記対象者の１以上の細胞を複数の遺伝子構築物と接触させ、
前記複数の遺伝子構築物が、複数のバーコード分子にそれぞれ作動可能に連結された複数の疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患に冒された細胞における前記対応するバーコード分子の発現を駆動すること；及び
（ｂ）前記複数のバーコード分子の発現レベルを定量して前記プロファイルを生成すること
を含む方法。
（ａ）前記対象者の１以上の細胞をエクス・ビボで遺伝子構築物と接触させ、
前記遺伝子構築物が、バーコード分子に作動可能に連結された疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患による影響を受けた細胞における前記バーコード分子の発現を駆動すること；
（ｂ）前記バーコード分子の発現レベルを定量すること；及び
（ｃ）前記発現レベルに基づいて、前記疾患の有無を検出することを含む方法。
２１４．対象者の疾患のプロファイルを生成する方法であって、
（ａ）前記対象者の１以上の細胞を複数の遺伝子構築物と接触させ、
前記複数の遺伝子構築物が、複数のバーコード分子にそれぞれ作動可能に連結された複数の疾患活性化プロモーターを含み、前記疾患活性化プロモーターが、前記疾患に冒された細胞における前記対応するバーコード分子の発現を駆動すること；及び
（ｂ）前記複数のバーコード分子の発現レベルを定量して前記プロファイルを生成すること
を含む方法。
【0594】
２１５．前記接触がエクス・ビボでのものである、実施形態２１４の方法。
【0595】
２１６．前記接触がイン・ビボでのものである、実施形態２１４の方法。
【0596】
２１７．前記対象者から前記１以上の細胞を単離することをさらに含む、実施形態２１３又は実施形態２１４の方法。
【0597】
２１８．前記疾患活性化プロモーターが、がん活性化プロモーターを含むか、前記複数の疾患活性化プロモーターが、複数のがん特異的プロモーターを含む、実施形態２１３又は実施形態２１４の方法。
２１９．前記がん活性化プロモーター又は複数のがん活性化プロモーターが、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路癌、乳管癌、乳腺小葉癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、腎臓嫌色素癌、腎臓明細胞癌、腎臓乳糖細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、傍神経節腫及び褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞がん、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体類内膜癌、ブドウ膜黒色腫、唇黒色腫、紡錘細胞癌、脂肪肉腫、鼻肉腫、乳腺癌、インスリン腫、骨肉腫、マスト細胞腫瘍、血管肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、辺縁リンパ腫、悪性黒色腫、又は慢性リンパ球性白血病で活性化される、実施形態２１８の方法。
２１９．前記がん活性化プロモーター又は複数のがん活性化プロモーターが、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路癌、乳管癌、乳腺小葉癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、腎臓嫌色素癌、腎臓明細胞癌、腎臓乳糖細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、傍神経節腫及び褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞がん、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体類内膜癌、ブドウ膜黒色腫、唇黒色腫、紡錘細胞癌、脂肪肉腫、鼻肉腫、乳腺癌、インスリン腫、骨肉腫、マスト細胞腫瘍、血管肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、辺縁リンパ腫、悪性黒色腫、又は慢性リンパ球性白血病で活性化される、実施形態２１８の方法。
【0598】
２２０．複数のがん活性化プロモーターを含み、当該複数のがん活性化プロモーターが、異なる組織起源内の複数のがんで活性化されるプロモーターを含む、実施形態２１８～２１９のいずれか一つの方法。
【0599】
２２１．前記複数のがん特異的プロモーターが、複数の（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２５以上、又は３０以上の）異なる組織起源で活性化される、実施形態２２０のうちの一つの方法。
【0600】
２２２．前記複数のがん特異的プロモーターが、強いシグナルを生成する第１のプロモーター、低いバックグラウンドシグナルを生成する第２のプロモーター、高いシグナル対バックグラウンドシグナル比を有する第３のプロモーター、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２２０～２２１のいずれか一つの方法。
【0601】
２２３．前記複数のがん特異的プロモーターが、少なくとも一つの前記第１のプロモーター、少なくとも一つの前記第２のプロモーター、及び少なくとも一つの前記第３のプロモーターを含む、実施形態２２２の方法。
【0602】
２２４．前記複数の疾患活性化プロモーターが、組織起源の選択された群に選択的であり、かつそこで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
【0603】
２２５．前記複数の疾患活性化プロモーターが、同じ組織起源に選択的であり、かつそこで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
【0604】
２２６．前記複数の疾患活性化プロモーターが、それぞれ同じ組織起源内のがんの複数の異なる分子サブタイプで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
【0605】
２２７．前記複数の疾患特異的プロモーターが、組織起源内のがんの一つの分子サブタイプで活性化される複数のがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
２２８．前記複数の遺伝子構築物が、組織起源内のがんの一つの段階で活性化される２つ以上の異なるがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
２２９．少なくとも一つの細胞を前記複数の遺伝子構築物又は前記遺伝子構築物と接触させることを含む、実施形態２１３～２２８のいずれかの方法。
２２８．前記複数の遺伝子構築物が、組織起源内のがんの一つの段階で活性化される２つ以上の異なるがん活性化プロモーターを含む、実施形態２１４の方法。
２２９．少なくとも一つの細胞を前記複数の遺伝子構築物又は前記遺伝子構築物と接触させることを含む、実施形態２１３～２２８のいずれかの方法。
【0606】
２３０．前記遺伝子構築物又は前記複数の遺伝子構築物が非ウィルスベクターを含む、実施形態２１３～２２９のいずれかの方法。
【0607】
２３１．前記非ウィルスベクターがナノプラスミドである、実施形態２３０の方法。
【0608】
２３２．前記遺伝子構築物又は前記複数の遺伝子構築物が、複製能のない組換えビリオン又はそれに由来する単離された逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、実施形態２１３～２９のいずれかの方法。
【0609】
２３３．前記ビリオンが、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、アデノウィルス、又はγ－レトロウィルスビリオンである、実施形態２３２の方法。
【0610】
２３４．前記ビリオンが、感染細胞内で主にエピソームゲノムを維持するウィルスに由来する、実施形態２３２の方法。
【0611】
２３５．前記複製能のないビリオンが組換えアデノウィルスベクターである、実施形態２３３の方法。
【0612】
２３６．前記ＡＡＶが血清型１、２、３、４、５、６、８、９、Ａｄ５、Ａｄ－ＲＧＤ、又はＡｄ－１９ａ／６４、又はそれらの疑似型変異体である、実施形態２３５の方法。
２３７．前記複製能のない組換えビリオンが、０．００１～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記対象者からの前記細胞と組み合わされる、実施形態２３２～２３６のいずれか一つの方法。
２３７．前記複製能のない組換えビリオンが、０．００１～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記対象者からの前記細胞と組み合わされる、実施形態２３２～２３６のいずれか一つの方法。
【0613】
２３８．前記対象者がヒト又はイヌである、実施形態２１３～２３７のいずれか一つの方法。
【0614】
２３９．前記対象者が以前にがんの外科治療、化学療法、放射線治療又は免疫療法治療を受けたことがある、実施形態２１３～２３８のいずれか一つの方法。
【0615】
２４０．前記対象者が、リ・フラウメニ症候群、リンチ症候群、家族性腺腫性ポリポーシス、フォンヒッペル・リンダウ病、非形成性貧血、骨髄異形成症候群、カウデン症候群、遺伝性乳がん及び卵巣がん症候群（ＨＢＯＣ）、又はＢＲＣＡ変異；現在の喫煙者、禁煙者、又は大量の間接喫煙にさらされていること；発がん物質、過度の日光、免疫抑制剤、Ｂ型若しくはＣ型肝炎などの感染性病原体、並びにヒトパピローマウィルスへの曝露；又は肥満であることなどの少なくとも一つのがんの危険因子を有する、実施形態２１３～２３９のいずれか一つの方法。
【0616】
２４１．前記対象者が、マンモグラム上の陽性シグナル又はがんスクリーニング診断検査からの陽性シグナル、不均衡な血球分布、体重減少、腫脹塊若しくは腫瘍した腺、寝汗、血尿、血便、乳首を含む身体からの予期しない出血又は排出、めまい、視力障害又はバランスの喪失、下痢、急性疼痛、微熱、便秘、食欲不振、しつこい咳又は嗄声、又は黄疸などの少なくとも一つのがんの症状を有する、実施形態２１３～２３９のいずれか一つの方法。
【0617】
２４２．（ｃ）前記プロファイルに基づいて前記疾患を検出することをさらに含む、実施形態２１４～２４１のいずれかの方法。
２４３．分類器を用いて、前記複数の疾患活性化プロモーターに対応する前記バーコード分子の発現レベルを含む前記プロファイルを処理することで前記疾患又はその欠如を検出することをさらに含む、実施形態２４２の方法。
２４３．分類器を用いて、前記複数の疾患活性化プロモーターに対応する前記バーコード分子の発現レベルを含む前記プロファイルを処理することで前記疾患又はその欠如を検出することをさらに含む、実施形態２４２の方法。
【0618】
２４４．前記疾患の有無を検出することは、組織起源を決定することをさらに含む、実施形態２４３の方法。
【0619】
２４５．少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のＡＵＣで前記疾患の有無を検出することを含む、実施形態２１３の方法。
【0620】
２４６．少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の感度で前記疾患の有無を検出することを含む、実施形態２１３の方法。
【0621】
２４７．少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の特異性で前記疾患の有無を検出することを含む、実施形態２１３の方法。
【0622】
２４８．（ｃ）に続いて、（ｃ）で検出された疾患に対応する１以上の疾患活性化プロモーターを用いて（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、（ｃ）で検出された前記疾患を確認し、及び／又は（ｃ）で検出された前記疾患のサブタイプを検出することをさらに含む、実施形態２４２の方法。
【0623】
２４９．（ｄ）を繰り返して、（ｃ）で検出された前記疾患を確認し、及び／又は（ｃ）で検出された前記疾患のサブタイプを検出することをさらに含む、実施形態２４８の方法。
【0624】
２５０．バーコード分子が、前記遺伝子構築物の疾患特異的プロモーターを一意的に識別する、実施形態２１３～２４９のいずれか一つの方法。
【0625】
２５１．前記バーコード分子がヌクレオチド配列又はペプチド配列を含む、実施形態２１３～２４９のいずれか一つの方法。
【0626】
２５２．前記バーコード分子がヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が固有のＤＮＡ又はＲＮＡを含む、実施形態２５１の方法。
【0627】
２５３．前記バーコード分子がＲＮＡを含み、前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡ骨格から処理されたバーコードである、実施形態２５２の方法。
【0628】
２５４．前記ｍｉＲＮＡ骨格が、当該ｍｉＲＮＡ骨格に由来する５′、３′、及びループ領域、並びに前記バーコードを含むステム領域を含む、実施形態２５３の方法。
【0629】
２５５．前記バーコード分子がペプチド配列を含み、前記ペプチド配列が酵素レポーターを含む、実施形態２５１の方法。
２５６．前記酵素レポーターが、ルシフェラーゼ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、又はβ－ガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬ）、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態２５１の方法。
２５７．前記バーコード分子が前記細胞から分泌可能又は流出可能である、実施形態２１３～２５６のいずれか一つの方法。
２５６．前記酵素レポーターが、ルシフェラーゼ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、又はβ－ガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬ）、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態２５１の方法。
２５７．前記バーコード分子が前記細胞から分泌可能又は流出可能である、実施形態２１３～２５６のいずれか一つの方法。
【0630】
２５８．前記バーコードの発現レベル又は前記細胞と接触している細胞外液中の前記バーコードの発現レベルを定量することを含む、実施形態２５７の方法。
【0631】
２５９．前記細胞との前記接触がイン・ビボであり、前記細胞外液が、血液又は血液画分、唾液、尿、便、脳脊髄液、精液、膣分泌物、痰、汗、乳汁、滑液、粘液（粘膜分泌物など）、涙、胆汁、胃液、間質液、水様液、羊膜液、又は胸膜液を含む、実施形態２５８の方法。
【0632】
２６０．前記バーコードの発現レベル又は細胞外液中の前記バーコードの発現レベルを、前記細胞との前記接触から少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間定量することを含む、実施形態２５７又は実施形態２５８の方法。
【0633】
２６１．前記定量が、前記バーコード分子又は複数のバーコード分子の配列決定を行うことを含む、実施形態２５２～２５４のいずれか一つの方法。
【0634】
２６２．前記定量が、前記酵素レポーター又は複数レポーターの活性を測定することを含む、実施形態２５５～２５７のいずれか一つの方法。
【0635】
２６３．前記酵素レポーター又は複数のレポーターの前記活性が、免疫化学反応、側方流動電気泳動、又は質量分析計によって測定される、実施形態２６２の方法。
【0636】
２６４．イントラネット又はインターネット上で前記プロファイルを送信することをさらに含む、実施形態２１４～２６５のいずれかの方法。
【0637】
２６５．前記疾患の有無又は前記プロファイルの前記検出に基づく治療的処置を提供することをさらに含む、実施形態２１３～２６４のいずれかの方法。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図13-1】
【図14】
【図14-1】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33A-C】
【図33D-F】
【図34A-C】
【図35A-C】
【図36A-C】
【図37A-C】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】