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特表2022-527716腫瘍を処置するためのＥＰ４アンタゴニストと免疫チェックポイント阻害剤の配合医薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-03
(54)【発明の名称】腫瘍を処置するためのＥＰ４アンタゴニストと免疫チェックポイント阻害剤の配合医薬
(51)【国際特許分類】
A61K 31/438 20060101AFI20220527BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220527BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220527BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220527BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220527BHJP
C07D 221/20 20060101ALI20220527BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220527BHJP
【ＦＩ】
A61K31/438
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P43/00 111
C07D221/20 CSP
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560513
(86)(22)【出願日】2020-04-08
(85)【翻訳文提出日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 EP2020060054
(87)【国際公開番号】W WO2020208088
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】19168253.3
(32)【優先日】2019-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508343722
【氏名又は名称】ロッタファーム・バイオテック・エッセ・エッレ・エッレ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ロヴァティ、ルチオ クラウディオ
(72)【発明者】
【氏名】ジョルダーニ、アントーニオ
(72)【発明者】
【氏名】マガラチー、フィリッポ
(72)【発明者】
【氏名】カゼッリ、ジャンフランコ
(72)【発明者】
【氏名】ピエポリ、ティツィアナ
(72)【発明者】
【氏名】マッジオーニ、ダニエレ
(72)【発明者】
【氏名】ボナッツィ、アルビーノ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C084ZC752
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085CC23
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC27
4C086GA13
4C086GA15
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC42
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又はその薬学的に許容される塩のＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩を含む配合医薬を提供する。４．３、５．０、５．８、６．４、７．１、８．３、８．７、１２．８、１５．３、１５．９の角度２θ±０．２°の値にピークを有する粉末ＸＲＤスペクトルを特徴とする、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾアートのナトリウム塩の多形形態Ａも記載される。組み合わせ及び多形形態Ａは、腫瘍の処置に使用するために記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、配合医薬：下記式のＥＰ４アンタゴニスト、
（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、又は
その薬学的に許容される塩及び、
少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤。
【請求項2】
薬学的に許容される塩が、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩からなる群から選択される、請求項１に記載の配合医薬。
【請求項3】
ＥＰ４アンタゴニストが、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩である、請求項１又は２に記載の配合医薬。
【請求項4】
４．３、５．０、５．８、６．４、７．１、８．３、８．７、１２．８、１５．３、１５．９の角度２θ±０．２°の値にピークを有する粉末ＸＲＤスペクトルを特徴とする、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａ。
【請求項5】
医薬品として使用するための、請求項４に記載の多形形態Ａ。
【請求項6】
腫瘍の処置に使用するための、請求項４に記載の多形形態Ａ。
【請求項7】
請求項４に記載の（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬。
【請求項8】
前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死－リガンド１）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチン－３）、ＯＸ－４０及びそのリガンドＯＸ４０Ｌ、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子－３）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー）、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター）、Ａ２ＡＲ（アデノシン受容体Ａ２）、ＳＩＧＬＥＣ７（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）、ＮＯＸ－２（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤＰＨオキシダーゼアイソフォーム２）、アルギナーゼＩ、ＣＤ２７６（分化抗原群２７６、Ｂ７Ｈ４とも呼ばれる）、ＣＤ２７（分化抗原群２７）及びそのリガンドＣＤ２７（分化抗原群２７）、ＣＤ１６０（分化抗原群１６０）ならびにＣＤ３９（分化抗原群３９）からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の配合医薬。
【請求項9】
前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤が、中和抗体、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）、抗ＴＩＭ－３抗体（例えば、ＭＢＧ４５３）又は抗ＬＡＧ－３抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の配合医薬。
【請求項10】
腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又は薬学的に許容される塩から選択されるＥＰ４アンタゴニスト、及び少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、配合医薬。
【請求項11】
腫瘍の処置に使用するための、請求項４に記載の（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの多形形態ＡからなるＥＰ４アンタゴニスト、及び少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、配合医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍を処置するためのＥＰ４アンタゴニストと免疫チェックポイント阻害剤との配合医薬（pharmaceutical combination）を提供する。
【0002】
好ましい態様では、本発明は、本発明の組み合わせのＥＰ４アンタゴニストの多形に関する。
【背景技術】
【0003】
がんは、世界の公衆衛生に対する大きな脅威であり、依然として世界中の主要な死因である。したがって、近年の治療の進歩にもかかわらず、より有効な治療処置の開発に対する緊急の医学的必要性がある。
【0004】
免疫腫瘍学は、患者の免疫系を利用してがんと戦うことを目的とした革新的な研究分野である。抗がん免疫の抑制を予防するための最も有望なアプローチの１つは、免疫チェックポイントの遮断、すなわちＴ細胞媒介性自己免疫を予防するために進化した分子経路であるが、腫瘍もその利点を利用することができる。腫瘍では、これらのタンパク質の発現が調節解除される。このため、重要な一連の研究は、Ｔ細胞上で発現される抑制性受容体、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）又は腫瘍細胞上で発現されるそれらの対応するリガンド、例えばプログラム細胞死１リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）を遮断する免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に焦点を当ててきた。（Ａｌｓａａｂ，Ｈ．Ｏ．ら Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８、１～１５（２０１７））。
【0005】
抗ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤に焦点を当てた様々な抗がん薬が、現在ＦＤＡによって承認されている。これらには、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４に対するモノクローナル抗体、例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ及びイピリムマブが含まれる。免疫チェックポイント分子の遮断によるがん免疫療法は、複数のがん型にわたって顕著な臨床的有効性を証明しており、さらに免疫チェックポイント免疫療法の臨床試験は、進行性転移性がんでさえ良好な結果を示している。（Ａｌｓａａｂ，Ｈ．Ｏ．ら Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８、１～１５（２０１７））。
【0006】
確かな成功にもかかわらず、おそらくがんは免疫監視から逃れるための他の方法を見出すことができるので、全ての患者が応答性であるわけではない。これらの制限は、臨床医を、免疫監視に対してより有効な新規な抗腫瘍剤又は新規な治療に向かわせた。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、驚くべきことに、ＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせが腫瘍の処置に有効であることを見出した。
【0008】
したがって、本発明は、式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又は薬学的に許容される塩のＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0009】
ＥＰ４アンタゴニストは、一般式に含まれるものとして国際公開第２０１３／００４２９０号パンフレットに最初に記載された。本発明者らは、驚くべきことに、式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のＥＰ４アンタゴニストが、実験部から明らかになるように、チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、腫瘍を有効に処置することができる唯一のものであることを見出した。
【0010】
本発明において、「免疫チェックポイント」の定義が使用される場合、それは、Ｔ細胞活性化を促進又は阻害する免疫細胞又はがん細胞の細胞経路を活性化することができる補助分子として意図される。
【0011】
本発明において、「免疫チェックポイント阻害剤」の定義が使用される場合、それは免疫チェックポイントの機能を阻害する分子として意図される。
【0012】
本発明者らは、驚くべきことに、ＥＰ４アンタゴニスト（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩が、組み合わせを調製するための好ましいものであることを見出した。実験部から明らかなように、得られる（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩は非晶質化合物であった。驚くべきことに、本発明者らは、好ましくは少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に、それ自体でがんを処置することを可能にする、形態Ａと命名される、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの非常に安定な結晶形態を見出した。
【0013】
したがって、別の態様では、本発明は、４．３、５．０、５．８、６．４、７．１、８．３、８．７、１２．８、１５．３、１５．９の角度２θ±０．２°の値にピークを有する粉末ＸＲＤスペクトルを特徴とする、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａに関する。
【0014】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、好ましくは腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａに関する。
【0015】
したがって、配合医薬は、好ましくは、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又は薬学的に許容される塩から選択されるＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0017】
別の態様では、本発明は、腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの結晶形態ＡからなるＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】例１の（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの結晶形態ＡのＤＳＣグラフを報告する図である。
【図2】例１の（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの結晶形態ＡのＩＲスペクトルを報告する図である。
【図3】ＣＴ２６腫瘍モデルにおける、例１の（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの結晶形態Ａ、ならびに例２の比較化合物及び抗ＰＤ－１の抗腫瘍応答を報告する図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０＾６個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。腫瘍を７日目に測定した後、マウスを無作為化し、次いで、指定される治療で処置した。化合物１及び例２の化合物を毎日３０ｍｇ／Ｋｇ経口投与した。抗ＰＤ－１抗体を、移植後８日目に２０ｍｇ／ｋｇ、１３日目、１９日目及び２３日目に１０ｍｇ／ｋｇ注射した。腫瘍体積を１週間に２回測定し、１群当たり１５匹のマウスの平均±ＳＥとして示す。矢印は抗ＰＤ－１注射を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１ Ａｎｏｖａ検定）。
【図4】ＣＴ２６腫瘍モデルにおける化合物、抗ＰＤ－１及び併用療法の抗腫瘍応答を報告する図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０＾６個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。腫瘍を７日目に測定した後、マウスを無作為化し、次いで、指定される治療で処置した。化合物１及び化合物２を毎日３０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。抗ＰＤ－１抗体を、移植後８日目に２０ｍｇ／ｋｇ、１３日目、１９日目及び２２日目に１０ｍｇ／ｋｇ注射した。腫瘍体積を１週間に２回測定し、１群当たり１５匹のマウスの平均±ＳＥとして示す。矢印は抗ＰＤ－１注射を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１ Ａｎｏｖａ検定）。
【図5】化合物１、例２の化合物、抗ＰＤ－１抗体及び併用療法による処置を通した相対的体重変化を報告する図である。マウス体重を１週間に２回測定した。
【図6】化合物１によるＰＧＥ２効果のインビトロ濃度依存的逆転を報告する図である。
【図7】ＬＰＳによって誘導されるエキソビボＴＮＦ－α放出：ＰＧＥ２阻害（ＩＣ５０）と化合物１処置用量との間の線形関係を報告する図である。分析の線形回帰、Ｒ２＝０．９２６８；０に対する傾斜偏差のＰ値＝０．００８６。
【図8】ＬＰＳによって刺激された全血培養物中のＴＮＦ－α放出のエキソビボ阻害を報告する図である。１０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のビヒクル又は化合物１投与後のＰＧＥ２ ０．０３μＭ及び０．１μＭの阻害効果。二元配置ＡＮＯＶＡ分析；＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクル；＊＊＊ｐ＜０．０００５対ビヒクル Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【図9】投与とは異なる時間にサンプリングされ、ＬＰＳによってエキソビボ刺激された全血中のＴＮＦ－α放出のエキソビボ阻害を報告する図である。ビヒクル又は１０ｍｇ／ｋｇ化合物１投与後のＰＧＥ２ ０．０３μＭ及び０．１μＭの阻害効果。二元配置ＡＮＯＶＡ分析；＊＊＊ｐ＜０．０００５対ビヒクル Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【図10】ＰＧＥ２ ＩＣ５０値分布：単回経口投与後（投与２４時間後）の化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）及び化合物２（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を報告する図である。一元配置ＡＮＯＶＡ＊ｐ＜０．００１対ビヒクル Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【図11】ＰＧＥ２ ＩＣ５０値分布：反復経口投与（８日間ｑｄ）後の化合物１ １０ｍｇ／ｋｇの効果を報告する図である。＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル、Ｍａｎｎ Ｗｉｔｈｎｅｙ検定。
【図12】化合物１が、マクロファージに分化し、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌ＋０．０１μＭ ＰＧＥ２で刺激したヒトＴＨＰ－１細胞上のＴＮＦ－α遺伝子発現のＰＧＥ２誘導阻害を用量依存的に逆転させることを報告する図である。結果を、３連で実施された独立した実験のＴＮＦ－α発現の平均パーセンテージ±ＳＤとして表す。（ＬＰＳリポ多糖、ＰＧＥ２プロスタグランジンＥ２）。
【図13】化合物１が、１０μＭ ＰＧＥ２で刺激したヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１上のＲＡＮＫＬ遺伝子発現を阻害したことを報告する図である。結果を、３連で実施された独立した実験のＲＡＮＫ－Ｌ発現の平均パーセンテージ±ＳＤとして表す。Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ多重比較検定による一元配置分散分析により＊Ｐ＜０．０５。ＰＧＥ２プロスタグランジンＥ２。
【図14】化合物１が、ＩＬ－２、Ｉｌ－２１、抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体ならびに０．０３μＭ ＰＧＥ２への曝露によってＴｈ－１７細胞分化に向けて誘導されたヒトＰＢＭＣ細胞においてＴｈ－１７頻度を用量依存的に減少させたことを報告する図である。（Ｔｈ－１７細胞をＣＤ４＋ＣＣＲ６＋ＣＤ４５Ｒｏ－ＩＬ１７Ｆ＋としてゲーティングした）。
【図15】化合物１が、ｒＩＬ２３及びｒＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）への曝露によってＴｒｅｇ分化に向けて誘導され、ＰＧＥ２ ０．０３μＭ±０．１μＭの化合物１で処理されたヒトＰＢＭＣ細胞においてＴｈ－３細胞頻度を減少させたことを報告する図である。グラフでは、平均及び標準偏差を報告する。＊ｐ＜０．０５一元配置Ａｎｏｖａ。（Ｔｈ－３細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｌｏｗ＋ＴＧＦｂ＋としてゲーティングした）
【図16】化合物１が、ｒＩＬ２３及びｒＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）への曝露によってＴｒｅｇ分化に向けて誘導され、ＰＧＥ２ ０．０３μＭ±０．１μＭの化合物１で処理されたヒトＰＢＭＣ細胞においてｉＴｒ３５制御細胞頻度を減少させたことを報告する図である。グラフでは、平均及び標準偏差を報告する。＊ｐ＜０．０５一元配置Ａｎｏｖａ。（ｉＴｒ３５細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＬ３５＋としてゲーティングした）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又はその薬学的に許容される塩のＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0020】
本発明の組み合わせは、ＥＰ４アンタゴニスト（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸の薬学的に許容される塩を含むことができる。塩は、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩からなる群から選択することができる。好ましくは、本発明によると、組み合わせの塩はナトリウム塩である。
【0021】
実験部から明らかなように、得られるベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩は非晶質化合物であった。
【0022】
驚くべきことに、本発明者らは、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される、形態Ａと命名される、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの非常に安定な結晶形態を見出した。
【0023】
したがって、別の態様では、本発明は、４．３、５．０、５．８、６．４、７．１、８．３、８．７、１２．８、１５．３、１５．９の角度２θ±０．２°の値にピークを有する粉末ＸＲＤスペクトルを特徴とする、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａに関する。
【0024】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、好ましくは腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａに関する。
【0025】
したがって、配合医薬は、好ましくは、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の多形形態Ａと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む。
【0026】
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又は薬学的に許容される塩から選択されるＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0027】
別の態様では、本発明は、腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸又は薬学的に許容される塩から選択されるＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0028】
別の態様では、本発明は、腫瘍の処置に使用するための、（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウムの結晶形態ＡからなるＥＰ４アンタゴニストと少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む配合医薬に関する。
【0029】
したがって、本発明はさらに、治療上有効量の本発明の配合医薬を患者に投与するステップを含む、腫瘍を処置する方法に関する。
【0030】
免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死－リガンド１）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチン－３）、ＯＸ－４０及びそのリガンドＯＸ４０Ｌ、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子－３）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー）、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター）、Ａ２ＡＲ（アデノシン受容体Ａ２）、ＳＩＧＬＥＣ７（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン７）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）、ＮＯＸ－２（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤＰＨオキシダーゼアイソフォーム２）、アルギナーゼＩ、ＣＤ２７６（分化抗原群２７６、Ｂ７Ｈ４とも呼ばれる）、ＣＤ２７（分化抗原群２７）及びそのリガンドＣＤ２７（分化抗原群２７）、ＣＤ１６０（分化抗原群１６０）ならびにＣＤ３９（分化抗原群３９）を含むが、これらに限定されない。
【0031】
好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤は、中和抗体、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）、抗ＴＩＭ－３抗体（例えば、ＭＢＧ４５３）又は抗ＬＡＧ－３抗体である。
【0032】
投与前の抗体、例えば本発明で使用される抗ＰＤ－１又は上に列挙される他の免疫チェックポイントのいずれかの抗体抗は、一般に、生理食塩水溶液などの薬学的に許容される物質と混合され、それだけに限らないが、静脈内、皮内、腹腔内又は髄腔内注射を含む任意の適切な方法を使用して投与され得る。
【0033】
治療上「有効量」は、特定のチェックポイント阻害剤（例えば、特定のチェックポイント阻害剤の効力（ＩＣ５０）、有効性（ＥＣ５０）及び生物学的半減期）、腫瘍状態及びその重症度、処置を必要とする患者の素性（例えば、年齢、サイズ及び体重）などの因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定され得る量に対応するＥＰ４アンタゴニスト及び少なくとも１つのチェックポイント阻害剤の量を意図している。同様に、組み合わせに含有される化合物の処置の持続時間及び投与期間（投与の間の期間及び投与のタイミング、例えば、食事前／食事中／食事後）も、処置を必要とするヒトの素性（例えば、体重）、特定の化合物及びその特性（例えば、医薬特性）、腫瘍及びその重症度によって変化するが、それにもかかわらず、当業者によって決定され得る。
【0034】
本発明のＥＰ４アンタゴニスト及び本発明の少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、全身投与と局所投与の両方を含む任意の適切な投与経路によって、互いに独立に投与され得る。
【0035】
全身投与には、経口投与、非経口投与、経皮投与、直腸投与及び吸入による投与が含まれる。
【0036】
本発明のＥＰ４アンタゴニストと本発明の少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは、１回、又はいくつかの用量が所与の期間にわたって様々な時間間隔で投与される投薬レジメンに従って投与され得る。所望の治療効果が達成されるまで、又は所望の治療効果を維持するために無期限に用量を投与することができる。本発明のＥＰ４アンタゴニストと本発明の少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤の適切な投与レジメンは、当業者によって決定され得るこのような化合物の薬物動態学的特性、例えば吸収、分布及び半減期に依存する。本発明の組み合わせは、患者への投与前に医薬組成物に製剤化することもできる。本発明の医薬組成物は、当業者に知られている技術及び方法を使用して調製される。
【0037】
より好ましい態様では、腫瘍は、結腸直腸がん、膀胱がん、副腎がん、乳がん、脳がん、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮頸がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、前立腺がん、腎臓がん、腎がん、肝臓がん、甲状腺がん、膵臓がん、肉腫、線維肉腫を含み得るが、これらに限定されない。
【0038】
さらにより好ましい態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤である。
【0039】
全ての処置方法について、いくつかの実施形態では、使用される抗ＰＤ－１抗体の有効用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ総体重であり、好ましい用量は２ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇである。
【0040】
個々の投与の最適な量及び間隔は、処置される状態の性質及び程度によって決定されることも当業者によって認識されるであろう。
【0041】
ここで、本発明を、実験部を参照してさらに詳述する。
【0042】
実験部
以下の例で使用される試薬は、様々な供給業者から市販されており、さらに精製することなく使用した。溶媒は脱水形態で使用した。無水環境中の反応は乾燥Ｎ２の陽圧下で行った。
以下の例で使用される試薬は、様々な供給業者から市販されており、さらに精製することなく使用した。溶媒は脱水形態で使用した。無水環境中の反応は乾燥Ｎ２の陽圧下で行った。
【0043】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ装置で記録した。化学シフトは、残留溶媒を内部標準として使用してｐｐｍ（δ）で報告する。分裂パターンは以下のように指定する：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｑ、四重項；ｍ、多重項；ｂ、ブロードなシグナル。
【0044】
ポジティブＥＳ（＋）及びネガティブＥＳ（－）イオン化モードで動作するＩｏｎ Ｔｒａｐ Ｔｈｅｒｍｏ ＬＣＱ古典的分光計で質量スペクトル（ＭＳ）を実行した。
【0045】
Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ－ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μＭ、５０×２．１ｍｍ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ－ＳＱＤ装置でＵＰＬＣスペクトルを実施した。
【0046】
Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ ＨＰシリカカートリッジを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ自動フラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｉｓｏｌｅｒａシステム）でフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーを実施した。
【0047】
ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｃ－１８Ａｑカートリッジを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ自動フラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｉｓｏｌｅｒａシステム）で逆相クロマトグラフィーを実施した。
【0048】
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ ＳＣＸカートリッジ（５５μｍ、７０ Ａ）を使用して、いくつかの塩基性化合物の精製を実施した。
【0049】
Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣプレートＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ－２５４を使用して、ＵＶ光、過マンガン酸水溶液、ヨウ素蒸気で可視化して、薄層クロマトグラフィーを行った。
【0050】
以下の略語を本明細書で使用する：ＡｃＯＨ：酢酸；ＤＩＡＤ：ジイソプロピル（Ｅ）－ジアゼン－１，２－ジカルボキシラート；Ｂｏｃ：ｔｅｒブチルオキシカルボニル；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＲＴ：室温；ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム；ＬｉＯＨ：水酸化リチウム；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＮａＨＣＯ３：重炭酸ナトリウム；Ｎａ２ＳＯ４：硫酸ナトリウム；Ｃｓ２ＣＯ３：炭酸セシウム；ＮａＨＭＤＳ：ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド；ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
【0051】
例１：
式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、ナトリウム塩のＥＰアンタゴニストの調製
化合物を、以下のスキーム１のような合成ステップに従って得た：
ａ）出発物質（ＳＭ２）及び適切なカップリング剤を使用した、出発物質（ＳＭ１）の式（Ｉ）の化合物への変換；
ｂ）ＤＣＭ中ＴＦＡのような酸性媒体中での化合物（Ｉ）の脱保護により、化合物（ＩＩ）を得る；
ｃ）適切な塩基の存在下での臭化ベンジルによる環上の窒素のアルキル化により、化合物（ＩＩＩ）を得る；
ｄ）ＮａＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、化合物（ＩＶ）を得る；及び
ｅ）適切な溶媒中でのナトリウム塩の形成及び結晶化。
式（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、ナトリウム塩のＥＰアンタゴニストの調製
化合物を、以下のスキーム１のような合成ステップに従って得た：
【化1】
ａ）出発物質（ＳＭ２）及び適切なカップリング剤を使用した、出発物質（ＳＭ１）の式（Ｉ）の化合物への変換；
ｂ）ＤＣＭ中ＴＦＡのような酸性媒体中での化合物（Ｉ）の脱保護により、化合物（ＩＩ）を得る；
ｃ）適切な塩基の存在下での臭化ベンジルによる環上の窒素のアルキル化により、化合物（ＩＩＩ）を得る；
ｄ）ＮａＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、化合物（ＩＶ）を得る；及び
ｅ）適切な溶媒中でのナトリウム塩の形成及び結晶化。
【0052】
例１ａ）出発物質１（ＳＭ１）の合成
上記スキーム１で報告される出発物質ＳＭ１は、以下のスキーム２で報告される以下のステップによって得た：
ａ）ＭｅＩ及びＣｓ２ＣＯ３のような適切な塩基を使用して、（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－オキソピペリジン－２－カルボン酸（Ｔｈｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９７）１５６７１～１５６８０に従って調製）をメチルエステル（ＩＸ）に変換する
ｂ）トルエン中メチルトリフェニルホスホニウムブロミドを使用したウィッティヒ反応により化合物（Ｘ）を得る
ｃ）ＭｅＯＨ中のＨＣｌのような適切な酸性試薬を使用したピペリジン窒素の脱保護及びその後のＤＣＭ中塩化Ｃｂｚを使用した保護により化合物（ＸＩ）を得る
ｄ）ＴＨＦ、ジヨードメタン及びＴＦＡ中ジエチル亜鉛のような有機金属試薬を使用したシクロプロパンの形成により化合物（ＸＩＩ）を得る
ｅ）ＭｅＯＨ中水素及びパラジウム炭のような還元剤を使用したピペリジン窒素の脱保護及びその後の（ＢＯＣ）２Ｏを使用した保護により、化合物（ＸＩＩＩ）を得る
ｆ）ＴＨＦ／ＭｅＯＨ中ＬｉＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、（ＳＭ１）を得る
上記スキーム１で報告される出発物質ＳＭ１は、以下のスキーム２で報告される以下のステップによって得た：
【化2】
ａ）ＭｅＩ及びＣｓ２ＣＯ３のような適切な塩基を使用して、（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－オキソピペリジン－２－カルボン酸（Ｔｈｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９７）１５６７１～１５６８０に従って調製）をメチルエステル（ＩＸ）に変換する
ｂ）トルエン中メチルトリフェニルホスホニウムブロミドを使用したウィッティヒ反応により化合物（Ｘ）を得る
ｃ）ＭｅＯＨ中のＨＣｌのような適切な酸性試薬を使用したピペリジン窒素の脱保護及びその後のＤＣＭ中塩化Ｃｂｚを使用した保護により化合物（ＸＩ）を得る
ｄ）ＴＨＦ、ジヨードメタン及びＴＦＡ中ジエチル亜鉛のような有機金属試薬を使用したシクロプロパンの形成により化合物（ＸＩＩ）を得る
ｅ）ＭｅＯＨ中水素及びパラジウム炭のような還元剤を使用したピペリジン窒素の脱保護及びその後の（ＢＯＣ）２Ｏを使用した保護により、化合物（ＸＩＩＩ）を得る
ｆ）ＴＨＦ／ＭｅＯＨ中ＬｉＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、（ＳＭ１）を得る
【0053】
－中間体（ＩＸ）１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（Ｒ）－４－オキソピペリジン－１，２－ジカルボキシラートの合成
スキーム２を参照して、中間体（ＩＸ）を調製した。
スキーム２を参照して、中間体（ＩＸ）を調製した。
【0054】
丸底フラスコ中で、（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－オキソピペリジン－２－カルボン酸（１０ｇ；０．０４１ｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、３℃に冷却した。炭酸セシウム（０．６当量）を添加し、次いで、ヨウ化メチル（１．１当量）を滴加し、ＲＴで２時間後、混合物を水（２５０ｍｌ）で希釈し、ＡｃＯＥｔ（３×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（１５０ｍｌ×３）、引き続いてブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、４０℃で濃縮して、標記化合物（９ｇ；８５％）を淡褐色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．２８－４．７５（ｍ，１Ｈ），４．１３－４．０３（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７２－３．５５（ｍ，１Ｈ），２．９２－２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．５０（ｂｒ ｓ，９Ｈ）ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．２８－４．７５（ｍ，１Ｈ），４．１３－４．０３（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７２－３．５５（ｍ，１Ｈ），２．９２－２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．５０（ｂｒ ｓ，９Ｈ）ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５８［Ｍ＋Ｈ］＋
【0055】
－中間体（Ｘ）１－（ｔｅｒｔ－ブチル）２－メチル（Ｒ）－４－メチレンピペリジン－１，２－ジカルボキシラートの合成
スキーム２を参照して、中間体（Ｘ）を調製した。
スキーム２を参照して、中間体（Ｘ）を調製した。
【0056】
メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（１．１当量）を脱水トルエン（４００ｍｌ）に溶解し、３℃に冷却し、次いで、ＮａＨＭＤＳ溶液（１．０５当量）をゆっくり滴下した。窒素雰囲気下３℃で１時間後、脱水トルエン（２００ｍｌ）中の中間体（ＩＸ）（９ｇ、０．０３５ｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。完了後、反応物を氷／水（８００ｍｌ）でクエンチし、２つの層を分離し、有機層を水（３５０ｍｌ）、引き続いてブライン（３５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９５－５～６０－４０で溶出するシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、標記化合物を淡黄色固体（８ｇ；９０％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．１２－４．７６（ｍ，３Ｈ），４．２７－３．９７（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．２３－２．９２（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．６９（ｍ，１Ｈ），２．５７－２．３８（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．４９（ｂｒ ｓ，９Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５６［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．１２－４．７６（ｍ，３Ｈ），４．２７－３．９７（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．２３－２．９２（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．６９（ｍ，１Ｈ），２．５７－２．３８（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．４９（ｂｒ ｓ，９Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５６［Ｍ＋Ｈ］＋
【0057】
－中間体（ＸＩ）１－ベンジル２－メチル（Ｒ）－４－メチレンピペリジン－１，２－ジカルボキシラートの合成
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩ）を調製した。
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩ）を調製した。
【0058】
中間体（Ｘ）（８ｇ；０．０３１ｍｏｌ）を脱水メタノール（１５０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、次いで、３ＭメタノールＨＣｌ溶液３００ｍｌをゆっくり添加した。ＲＴで２時間後、溶媒を蒸発乾固し、残渣をＤＣＭ（２５０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、次いで、トリエチルアミン（２．５当量）及びクロロギ酸ベンジル（１．２当量）をＲＴで１時間後に添加した。完了後、反応物を氷冷水でクエンチし；２つの層を分離し、有機層を水、引き続いてブライン溶液（２５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、４０℃未満で濃縮して残渣を得て、これをヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９５－５～６０－４０で溶出するシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、標記化合物を白色固体（６．７ｇ；７４％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．４５－７．３０（ｍ，５Ｈ），５．２４－４．９３（ｍ，３Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．３１－４．１３（ｍ，１Ｈ），３．８４－３．６２（ｍ，３Ｈ），３．２６－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．７４（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．４３（ｍ，１Ｈ），２．３４－２．１７（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２９０［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．４５－７．３０（ｍ，５Ｈ），５．２４－４．９３（ｍ，３Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．３１－４．１３（ｍ，１Ｈ），３．８４－３．６２（ｍ，３Ｈ），３．２６－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．７４（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．４３（ｍ，１Ｈ），２．３４－２．１７（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２９０［Ｍ＋Ｈ］＋
【0059】
－中間体（ＸＩＩ）６－ベンジル５－メチル（Ｒ）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５，６－ジカルボキシラートの合成
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩＩ）を調製した。
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩＩ）を調製した。
【0060】
ＤＣＭ（１５０ｍｌ）を０℃に冷却し、次いで、ＴＨＦ中ジエチル亜鉛溶液（２．３当量）をゆっくり添加し、３０分間撹拌した。トリフルオロ酢酸（２．０当量）を０℃でゆっくり添加し、６０分間撹拌し、次いで、ジヨードメタン（４．０当量）を添加し、０℃で６０分間撹拌した。脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）中の中間体（ＸＩ）（６ｇ；０．０２ｍｏｌ）を０℃でゆっくり添加し、次いで、２５℃で２０時間撹拌したままにした。反応塊を１０％重炭酸ナトリウム溶液（４００ｍｌ）でクエンチした。固体沈殿を濾別し、層を濾液から分離し、有機層を水（２５０ｍｌ×２）、引き続いてブライン溶液（２５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、４０℃未満で濃縮して残渣を得て、これをヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９５－５～６０－４０で溶出するシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、標記化合物を白色固体（４．７２ｇ；７５％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）ｄ ｐｐｍ ０．０３－０．４７（ｍ，７８Ｈ）０．７６－０．９２（ｍ，１Ｈ）１．２６－１．４８（ｍ，１Ｈ）１．４９－１．７０（ｍ，２Ｈ）１．７５（ｓ，１Ｈ）１．８８－２．０４（ｍ，１Ｈ）２．１９（ｓ，１Ｈ）２．３５－２．４１（ｍ，１Ｈ）３．１７－３．３９（ｍ，１Ｈ）３．６１－３．８３（ｍ，３Ｈ）４．１４（ｍ，Ｊ＝１１．７４Ｈｚ，１Ｈ）４．９６（ｍ，Ｊ＝４．８９Ｈｚ，１Ｈ）５．１２－５．２５（ｍ，２Ｈ）７．１５－７．２８（ｍ，１Ｈ）７．３７（ｍ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，５Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３０４［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）ｄ ｐｐｍ ０．０３－０．４７（ｍ，７８Ｈ）０．７６－０．９２（ｍ，１Ｈ）１．２６－１．４８（ｍ，１Ｈ）１．４９－１．７０（ｍ，２Ｈ）１．７５（ｓ，１Ｈ）１．８８－２．０４（ｍ，１Ｈ）２．１９（ｓ，１Ｈ）２．３５－２．４１（ｍ，１Ｈ）３．１７－３．３９（ｍ，１Ｈ）３．６１－３．８３（ｍ，３Ｈ）４．１４（ｍ，Ｊ＝１１．７４Ｈｚ，１Ｈ）４．９６（ｍ，Ｊ＝４．８９Ｈｚ，１Ｈ）５．１２－５．２５（ｍ，２Ｈ）７．１５－７．２８（ｍ，１Ｈ）７．３７（ｍ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，５Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３０４［Ｍ＋Ｈ］＋
【0061】
－中間体（ＸＩＩＩ）６－（ｔｅｒｔ－ブチル）５－メチル（Ｒ）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５，６－ジカルボキシラートの合成
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩＩＩ）を調製した。
スキーム２を参照して、中間体（ＸＩＩＩ）を調製した。
【0062】
中間体（ＸＩＩ）（４．５ｇ、０．０１５ｍｏｌ）をメタノール（２００ｍｌ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ １０％（４００ｍｇ）を添加し、次いで、懸濁液を３ｂａｒで２時間水素化した。完了後、反応物を、ｃｅｌｉｔｅ床を通して濾過し、メタノール（２００ｍｌ）で洗浄した。溶液を１５０ｍｌに濃縮し、２０℃に冷却し、次いで、ｂｏｃ無水物（１．２当量）をゆっくり添加し、２５ ５℃で１６時間撹拌した。反応完了後、溶媒を蒸発させ、次いで、残渣をヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９５－５～６０－４０で溶出するシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、標記化合物を白色固体（３．６８ｇ；９２％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．０３－４．７１（ｍ，１Ｈ），４．２１－３．９０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．３５－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．２７－２．１３（ｍ，１Ｈ），２．０２－１．８３（ｍ，Ｊ＝４．６，１３．１，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５６－１．３８（ｍ，１０Ｈ），０．９５－０．７２（ｍ，１Ｈ），０．４３－０．２０（ｍ，４Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２７０［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．０３－４．７１（ｍ，１Ｈ），４．２１－３．９０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．３５－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．２７－２．１３（ｍ，１Ｈ），２．０２－１．８３（ｍ，Ｊ＝４．６，１３．１，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５６－１．３８（ｍ，１０Ｈ），０．９５－０．７２（ｍ，１Ｈ），０．４３－０．２０（ｍ，４Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２７０［Ｍ＋Ｈ］＋
【0063】
－出発物質１（ＳＭ１）（Ｒ）－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボン酸の合成
スキーム２を参照して、出発物質（ＳＭ１）を得た。
スキーム２を参照して、出発物質（ＳＭ１）を得た。
【0064】
中間体（ＸＩＩＩ）（３．５ｇ；０．０１３ｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍｌ）及びメタノール（１００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、次いで、水酸化リチウム溶液（水５０ｍｌ中３．０当量）を滴下した。
【0065】
混合物をＲＴで８時間撹拌した。反応物を１０℃に冷却し、酢酸でｐＨ５（５０ｍｌ）にクエンチし、ＭｅＯＨ及びＴＨＦを留去することによって濃縮した。濃縮塊を氷水で希釈し、酢酸エチル（３００ｍｌ×２）で抽出した。合わせた有機層を水（２００ｍｌ）、引き続いてブライン（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、５０℃未満で濃縮した。残渣に石油エーテル（３００ｍｌ）を添加し；固体を濾別し、４０℃で２４時間真空乾燥した。収量３ｇ（９２％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．１１－４．７７（ｍ，１Ｈ），４．１８－３．８８（ｍ，１Ｈ），３．３２－３．０９（ｍ，１Ｈ），２．３２－２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０３－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．６７－１．５５（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｂｒ ｓ，９Ｈ），０．９７－０．７５（ｍ，１Ｈ），０．５２－０．２６（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５６［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝５．１１－４．７７（ｍ，１Ｈ），４．１８－３．８８（ｍ，１Ｈ），３．３２－３．０９（ｍ，１Ｈ），２．３２－２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０３－１．８８（ｍ，１Ｈ），１．６７－１．５５（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｂｒ ｓ，９Ｈ），０．９７－０．７５（ｍ，１Ｈ），０．５２－０．２６（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ２５６［Ｍ＋Ｈ］＋
【0066】
例１ｂ）出発物質２（ＳＭ２）の合成
出発物質２（ＳＭ２）を公知の文献手順（国際公開第２００８１０４０５５号パンフレット、例１、ステップ２）に従って調製した。
出発物質２（ＳＭ２）を公知の文献手順（国際公開第２００８１０４０５５号パンフレット、例１、ステップ２）に従って調製した。
【0067】
例１ｃ）中間体（Ｉ）ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－５－（（１－（４－（メトキシカルボニル）フェニル）シクロプロピル）カルバモイル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－６－カルボキシラートの合成
スキーム１を参照して、中間体（Ｉ）を得た。
スキーム１を参照して、中間体（Ｉ）を得た。
【0068】
出発物質１ １０ｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍｌ）に溶解し、ＨＯＢｔ水和物（１．１当量）及びＥＤＣ－ＨＣｌ（１．１当量）を添加し、混合物を２０℃で３０分間撹拌した。出発物質２（１．０２当量）を添加し、次いで、ＴＥＡ（１．２当量）を添加し；反応物を３０℃で６時間撹拌したままにし、次いで、水（１００ｍｌ）でクエンチした。有機相を５％重炭酸ナトリウム溶液（１００ｍｌ）、１Ｍクエン酸溶液（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）で洗浄した。ＤＣＭを蒸発させ、ｔ－ブチルメチルエーテル（２００ｍｌ）を添加し、次いで、溶媒を再び蒸発させた。ｔ－ブチルメチルエーテル４００ｍｌを添加し、懸濁液を２０℃で１７時間撹拌し、次いで、白色固体を濾過し、冷ｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄した。生成物を真空下５０℃で乾燥させた。収量１４．７ｇ（８８％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．０１－７．９３（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｓ，２Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．２１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．１０－２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１０－１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９７－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．８４－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．８８－０．８１（ｍ，１Ｈ），０．６３－０．４５（ｍ，１Ｈ），０．４５－０．２９（ｍ，２Ｈ），０．２８－０．１８（ｍ，１Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４２９［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．０１－７．９３（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｓ，２Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．２１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．１０－２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１０－１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９７－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．８４－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｂｒ ｓ，４Ｈ），０．８８－０．８１（ｍ，１Ｈ），０．６３－０．４５（ｍ，１Ｈ），０．４５－０．２９（ｍ，２Ｈ），０．２８－０．１８（ｍ，１Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４２９［Ｍ＋Ｈ］＋
【0069】
例１ｄ）：中間体（ＩＩ）メチル（Ｒ）－４－（１－（６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾアートの合成
スキーム１を参照して、中間体（ＩＩ）を得た。
スキーム１を参照して、中間体（ＩＩ）を得た。
【0070】
中間体（Ｉ）（１４ｇ；０．０３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５０ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（１０当量）を添加し、溶液を２０℃で５時間撹拌した。反応混合物を真空下で蒸留し、ＤＣＭ（１００ｍｌ）を添加し、飽和重炭酸ナトリウム溶液を１５～２５℃でゆっくり添加した（３００ｍｌ、有意な発泡）。有機相を水（２００ｍｌ）で洗浄し、減圧下で蒸発させた。ｔ－ブチルメチルエーテル（２００ｍｌ）を添加し、次いで、溶媒を再び蒸発させた。ｔ－ブチルメチルエーテル３００ｍｌを添加し、懸濁液を２０℃で１７時間撹拌し、次いで、白色固体を濾過し、冷ｔ－ブチルメチルエーテルで洗浄した。生成物を真空下５０℃で乾燥させた。収量９．６５ｇ（９０％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．９６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．４６－３．３９（ｍ，１Ｈ），３．１３－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．９２－２．８２（ｍ，１Ｈ），１．８７－１．７０（ｍ，３Ｈ），１．４１－１．２８（ｍ，５Ｈ），１．０１－０．９３（ｍ，１Ｈ），０．４６－０．２４（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３２９［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．９６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．４６－３．３９（ｍ，１Ｈ），３．１３－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．９２－２．８２（ｍ，１Ｈ），１．８７－１．７０（ｍ，３Ｈ），１．４１－１．２８（ｍ，５Ｈ），１．０１－０．９３（ｍ，１Ｈ），０．４６－０．２４（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３２９［Ｍ＋Ｈ］＋
【0071】
例１ｅ）中間体（ＩＩＩ）メチル（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾアートの合成
スキーム１を参照して、中間体（ＩＩＩ）を得た。
スキーム１を参照して、中間体（ＩＩＩ）を得た。
【0072】
中間体（ＩＩ）（９．５ｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで、Ｃｓ２ＣＯ３（２当量）及び４－（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド（１．２当量 ＴＨＦ７５ｍｌに溶解）を添加した。反応混合物を２５℃で８時間撹拌し、次いで、ＤＣＭ ３５０ｍｌ及び水３５０ｍｌを添加した。有機相を水（１５０ｍｌ）及びブライン（２５０ｍｌ）で洗浄し、減圧下で蒸発させた。ｎ－ヘプタン（１５００ｍｌ）を添加し、次いで、溶媒を再び蒸発させた。ｎ－ヘプタン１５０ｍｌを添加し、懸濁液を２０℃で４時間撹拌し、次いで、白色固体を濾過し、ｎ－ヘプタンで洗浄した。生成物を真空下５０℃で乾燥させた。収量１２．９５ｇ（９２％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．９６－７．８９（ｍ，２Ｈ），７．６６－７．６１（ｍ，２Ｈ），７．４７－７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２７－７．２１（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１０．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９３－２．８６（ｍ，１Ｈ），２．３１－２．２２（ｍ，１Ｈ），２．０７－１．９８（ｍ，１Ｈ），１．８８－１．７８（ｍ，１Ｈ），１．４５－１．２７（ｍ，４Ｈ），１．１７－１．０８（ｍ，１Ｈ），１．０１－０．９４（ｍ，１Ｈ），０．５０－０．３６（ｍ，３Ｈ），０．３３－０．２６（ｍ，１Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４８７［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝７．９６－７．８９（ｍ，２Ｈ），７．６６－７．６１（ｍ，２Ｈ），７．４７－７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２７－７．２１（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１０．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９３－２．８６（ｍ，１Ｈ），２．３１－２．２２（ｍ，１Ｈ），２．０７－１．９８（ｍ，１Ｈ），１．８８－１．７８（ｍ，１Ｈ），１．４５－１．２７（ｍ，４Ｈ），１．１７－１．０８（ｍ，１Ｈ），１．０１－０．９４（ｍ，１Ｈ），０．５０－０．３６（ｍ，３Ｈ），０．３３－０．２６（ｍ，１Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４８７［Ｍ＋Ｈ］＋
【0073】
例１ｆ）：中間体（ＩＶ）（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸の合成
スキーム１を参照して、中間体（ＩＶ）、酸の形態のＥＰ４アンタゴニストを得た。
スキーム１を参照して、中間体（ＩＶ）、酸の形態のＥＰ４アンタゴニストを得た。
【0074】
中間体（ＩＩＩ）（１２ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７０ｍｌ）に溶解し、次いで、ＮａＯＨ ２Ｎ（４当量）を添加した。反応物を５℃で５時間撹拌したままにし、次いで、水（２００ｍｌ）を添加し、有機物を蒸発させた。ジクロロメタン２００ｍｌを添加し、混合物のｐＨを酢酸で４．５～５．０に調整し；有機相を水及びブライン（２００ｍｌ×３）で洗浄し、蒸発させて、標記化合物（９．９ｇ；８５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １２．７２（１Ｈ，ｓ），８．７３（１Ｈ，ｓ），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１；１０．３Ｈｚ），２．７３（１Ｈ，ｍ），２．０８（２Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．１０－１．３１（５Ｈ，ｍ），０．８７（１Ｈ，ｍ），０．３２（４Ｈ，ｍ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４７３［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ １２．７２（１Ｈ，ｓ），８．７３（１Ｈ，ｓ），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１；１０．３Ｈｚ），２．７３（１Ｈ，ｍ），２．０８（２Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．１０－１．３１（５Ｈ，ｍ），０．８７（１Ｈ，ｍ），０．３２（４Ｈ，ｍ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４７３［Ｍ＋Ｈ］＋．
【0075】
このようにして得られたＥＰ４アンタゴニストを分析したところ、非晶質固体としての双性イオンであることが分かった。
【0076】
例１ｇ）Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の調製
例１ｆ）の双性イオンから得ることができた唯一の結晶形態は溶媒和物であり、これは熱的ストレス（例えば、溶媒含有量をＩＣＨレベルまで低下させるための加熱）又は機械的ストレスで容易に非晶質形態を生じた。
例１ｆ）の双性イオンから得ることができた唯一の結晶形態は溶媒和物であり、これは熱的ストレス（例えば、溶媒含有量をＩＣＨレベルまで低下させるための加熱）又は機械的ストレスで容易に非晶質形態を生じた。
【0077】
したがって、エチルエーテル中の中間体（ＩＶ）ＨＣｌに添加することによって塩酸塩を調製した。
【0078】
中間体（ＩＶ）の塩酸塩を調査し、スクリーニングから非晶質形態及び２つの結晶形態（無水Ａ及び溶媒和物Ｂ）を特定した。無水形態Ａをさらに調査した。中間体（ＩＶ）塩酸塩形態Ａは、機械的ストレス又は熱的ストレス下で非晶質形態に変換する傾向を示した。化学的安定性は、例１ｆ）の非晶質双性イオンと同程度であった。
【0079】
中間体（ＩＶ）を溶媒に可溶化した後、ＥｔＯＨ中ＮａＯＨを添加することによってナトリウム塩を調製した。様々な溶媒を試験した（ｎ－プロパノール、ｎ－ブタノール；ｉＰｒＯＨ）が、より高い収率及び容易な乾燥のためにｎ－プロパノールを選択した。形態Ａ及びＤと呼ばれる２つの結晶形態が得られた：形態Ａはｎ－プロパノール結晶化から直接得られ、形態Ｄは形態Ａの水和によってのみ得られた。物理的安定性試験中、形態Ｄは機械的ストレス（ミリング）によって、及び乾燥中に非晶質形態に変換されやすいことが分かった。
【0080】
逆に、ナトリウム塩形態Ａは、熱的ストレスによる非晶質化に対してより安定であることが分かったが、高エネルギーでの機械的ストレスによって非晶質化が観察された。形態Ａは最も熱力学的に安定な無水形態であり、形態Ｄは最も安定な水和形態であった。他の形態は、安定性が低いか又は準安定性であった。これらの形態ならびに非晶質形態は、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸イソプロピル、ＴＨＦ、ヘプタンからの固体スラリーによって安定な形態Ａに容易に変換された。
【0081】
（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウム（形態Ａ）（化合物１とも呼ばれる）の合成プロトコルを以下に報告するように確立した。
【0082】
中間体（ＩＶ）（５０ｇ、０．１ｍｏｌ）をｎ－プロパノール（４００ｍｌ）に溶解し、次いで、ＥｔＯＨ（７０ｍｌ）中ＮａＯＨ（１．０２当量）の冷却溶液を添加した。懸濁液を２０～２４℃で１８～２０時間撹拌し、次いで、濾過し、予冷ｎ－プロパノール（１００ｍｌ）で洗浄し、７０℃で２４時間乾燥させた。収量４３ｇ 白色固体（８７％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ８．６８（１Ｈ，ｓ），７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），３．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１；１０．５Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｍ），２．０７（２Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．１６（４Ｈ，ｍ），１．０９（１Ｈ，ｍ），０．８５（１Ｈ，ｍ），０．３０（４Ｈ，ｍ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４７３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ８．６８（１Ｈ，ｓ），７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），３．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１；１０．５Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｍ），２．０７（２Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．１６（４Ｈ，ｍ），１．０９（１Ｈ，ｍ），０．８５（１Ｈ，ｍ），０．３０（４Ｈ，ｍ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４７３［Ｍ＋Ｈ］＋
【0083】
例１ｆ）の双性イオン、塩形態と全てのナトリウム形態の両方について、溶解度、溶解及びバイオアベイラビリティの研究を実施した。塩（特にナトリウム塩の両形態）は、非晶質と比較して改善された溶解特性を示した。ラットとイヌの両方におけるＰＫ実験は、曝露及びバイオアベイラビリティに関して様々な形態の間で有意な差を示さなかったが、ナトリウム塩形態Ａは、安定性及び医薬品製造可能性の特性を考慮して開発のために選択される形態であるように見える。
【0084】
（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸ナトリウム（Ａ形態）（化合物１とも呼ばれる）の特性評価
固体ＮＭＲ
固体ＮＭＲ測定を、それぞれ１Ｈ及び１３Ｃについて４００．２３ＭＨｚ及び１００．６５ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩ ４００装置で行った。１３Ｃ ＣＰＭＡＳスペクトルを室温で１２ｋＨｚの回転速度で記録した。試料体積８０μＬの円筒形４ｍｍ外径ジルコニアロータを使用した。ＣＰＭＡＳ実験では、３ｍｓの接触時間、４．０μｓの１Ｈ ９０°パルス、５～１０秒のリサイクル遅延、及び２０００～４０００の過渡応答でランプ交差分極パルスシーケンスを使用した。７５ＫＨｚの周波数場で二パルス位相変調デカップリングスキームを使用した。
１３Ｃ化学シフト（ｐｐｍ）
δ＝１７７．１；１４４．８；１４３．１；１３６．９；１２９．３；１２４．９；７１．４；６５．５；６１．３；５７．３；５１．２；３９．０；３５．１；２３．２；１８．０；１４．９；１２．６
固体ＮＭＲ
固体ＮＭＲ測定を、それぞれ１Ｈ及び１３Ｃについて４００．２３ＭＨｚ及び１００．６５ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩ ４００装置で行った。１３Ｃ ＣＰＭＡＳスペクトルを室温で１２ｋＨｚの回転速度で記録した。試料体積８０μＬの円筒形４ｍｍ外径ジルコニアロータを使用した。ＣＰＭＡＳ実験では、３ｍｓの接触時間、４．０μｓの１Ｈ ９０°パルス、５～１０秒のリサイクル遅延、及び２０００～４０００の過渡応答でランプ交差分極パルスシーケンスを使用した。７５ＫＨｚの周波数場で二パルス位相変調デカップリングスキームを使用した。
１３Ｃ化学シフト（ｐｐｍ）
δ＝１７７．１；１４４．８；１４３．１；１３６．９；１２９．３；１２４．９；７１．４；６５．５；６１．３；５７．３；５１．２；３９．０；３５．１；２３．２；１８．０；１４．９；１２．６
【0085】
ＸＲＰＤ
ＸＲＰＤ測定を、Ｂｒａｇｇ－Ｂｒｅｎｔａｎｏ幾何学を有し、以下を備えたＸ線粉末回折計ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ｐｅｒｔ Ｐｒｏで実行した：
ａ）検出器Ｘ’Ｃｅｌｅｒａｔｏｒ
ｂ）マルチサンプラー
ｃ）スピナー
ｄ）セラミックＸ線管Ｃｕ ＬＦＦ（λ１＝１．５４０５１Ａ；λ２＝１．５４４３０Ａ）
範囲４～４０°２θ
ＸＲＰＤ測定を、Ｂｒａｇｇ－Ｂｒｅｎｔａｎｏ幾何学を有し、以下を備えたＸ線粉末回折計ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’ｐｅｒｔ Ｐｒｏで実行した：
ａ）検出器Ｘ’Ｃｅｌｅｒａｔｏｒ
ｂ）マルチサンプラー
ｃ）スピナー
ｄ）セラミックＸ線管Ｃｕ ＬＦＦ（λ１＝１．５４０５１Ａ；λ２＝１．５４４３０Ａ）
範囲４～４０°２θ
【表1】
【0086】
ＤＳＣ
サーモグラムは、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＤＳＣ ８０００を使用して取得し、スキャン速度は３０℃から３００℃まで１０℃／分とした。サーモグラムを図１に報告する。
検出されたピーク：Ｔ開始＝２５２．６４℃、ΔＨ＝５６．１１Ｊ／ｇ
サーモグラムは、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＤＳＣ ８０００を使用して取得し、スキャン速度は３０℃から３００℃まで１０℃／分とした。サーモグラムを図１に報告する。
検出されたピーク：Ｔ開始＝２５２．６４℃、ΔＨ＝５６．１１Ｊ／ｇ
【0087】
ＩＲ
ＩＲスペクトルは、ＡＴＲ（減衰全反射）モードによって、４０００～６５０ｃｍ－１の間でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ １００ ＦＴ／ＩＲ機器で記録した。ＩＲスペクトルを図２に報告する。主な吸収周波数を以下の表に報告する：
ＩＲスペクトルは、ＡＴＲ（減衰全反射）モードによって、４０００～６５０ｃｍ－１の間でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ １００ ＦＴ／ＩＲ機器で記録した。ＩＲスペクトルを図２に報告する。主な吸収周波数を以下の表に報告する：
【表2】
【0088】
形態Ａの安定性
様々な湿度値及び温度でのＲ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の形態Ａ（化合物１とも呼ばれる）の安定性を調査した。結果を以下の表に報告する：
様々な湿度値及び温度でのＲ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の形態Ａ（化合物１とも呼ばれる）の安定性を調査した。結果を以下の表に報告する：
【表3】
【0089】
例２：
（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、ナトリウム塩（化合物２とも呼ばれる）の調製
例１のＥＰアンタゴニストを、国際公開第２０１３／００４２９０号パンフレットに開示されている別のＥＰアンタゴニスト、すなわち、（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸と比較した。
（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、ナトリウム塩（化合物２とも呼ばれる）の調製
例１のＥＰアンタゴニストを、国際公開第２０１３／００４２９０号パンフレットに開示されている別のＥＰアンタゴニスト、すなわち、（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸と比較した。
【0090】
化合物を以下のスキーム３のような合成ステップに従って得た：
ａ）出発物質（ＳＭ２）及び適切なカップリング剤を使用して（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－２－カルボン酸を式（Ｖ）の化合物に変換する；
ｂ）ＤＣＭ中ＴＦＡのような酸性媒体中での化合物（Ｖ）の脱保護により、化合物（ＶＩ）を得る；
ｃ）適切な塩基の存在下、臭化ベンジルによる環上の窒素のアルキル化により、化合物（ＶＩＩ）を得る；
ｄ）ＬｉＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、化合物（ＶＩＩＩ）を得る；及び
ｅ）適切な溶媒混合物中ＮａＯＨを使用したナトリウム塩の形成
【化3】
ａ）出発物質（ＳＭ２）及び適切なカップリング剤を使用して（Ｒ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－２－カルボン酸を式（Ｖ）の化合物に変換する；
ｂ）ＤＣＭ中ＴＦＡのような酸性媒体中での化合物（Ｖ）の脱保護により、化合物（ＶＩ）を得る；
ｃ）適切な塩基の存在下、臭化ベンジルによる環上の窒素のアルキル化により、化合物（ＶＩＩ）を得る；
ｄ）ＬｉＯＨのような適切な無機塩基を使用したメチルエステルの加水分解により、化合物（ＶＩＩＩ）を得る；及び
ｅ）適切な溶媒混合物中ＮａＯＨを使用したナトリウム塩の形成
【0091】
－例２ａ：中間体（Ｖ）ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－２－（（１－（４－（メトキシカルボニル）フェニル）シクロプロピル）カルバモイル）ピペリジン－１－カルボキシラートの合成
Ｂｏｃ－Ｄ－ピペコリン酸（５００ｍｇ、２．１８１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１３ｍｌ）に溶解した。Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．６２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４０分間撹拌したままにした。ＳＭ２（２．２６８ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＥＡ（２．９４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌したままにし、次いで、水（２０ｍｌ）を添加した。相を分離し、水層をＤＣＭ（２×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ １００％から７０／３０までで溶出するＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ－ＨＰ Ｓｐｈｅｒｅ－Ｓｉ（１０ｇ）カラムに充填した。収量８１０ｍｇ（９２％）、淡黄色泡。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．００－７．９３（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２７－７．２２（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．８５－４．６７（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．９７－２．６６（ｍ，１Ｈ），２．２９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．７２－１．５９（ｍ，３Ｈ），１．５４－１．２２（ｍ，１５Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４０３［Ｍ＋Ｈ］＋
Ｂｏｃ－Ｄ－ピペコリン酸（５００ｍｇ、２．１８１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１３ｍｌ）に溶解した。Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．６２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４０分間撹拌したままにした。ＳＭ２（２．２６８ｍｍｏｌ）、引き続いてＴＥＡ（２．９４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌したままにし、次いで、水（２０ｍｌ）を添加した。相を分離し、水層をＤＣＭ（２×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ １００％から７０／３０までで溶出するＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ－ＨＰ Ｓｐｈｅｒｅ－Ｓｉ（１０ｇ）カラムに充填した。収量８１０ｍｇ（９２％）、淡黄色泡。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．００－７．９３（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２７－７．２２（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．８５－４．６７（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．９７－２．６６（ｍ，１Ｈ），２．２９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．７２－１．５９（ｍ，３Ｈ），１．５４－１．２２（ｍ，１５Ｈ）．
ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４０３［Ｍ＋Ｈ］＋
【0092】
－例２ｂ）：中間体（ＶＩ）メチル（Ｒ）－４－（１－（ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾアートの合成
スキーム３に従って、中間体（ＶＩ）を得た。
スキーム３に従って、中間体（ＶＩ）を得た。
【0093】
中間体（Ｖ）（８００ｍｇ、１．９８８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（１９．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌したままにした。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ及びＭｅＯＨ中ＮＨ３ １Ｍで溶出するＳＰＥ－ＳＣＸ（５ｇ）カートリッジに充填した。アンモニア画分を蒸発させて、標記化合物（５９０ｍｇ；９８％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．００－７．９２（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２８－７．２４（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．１０－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．８０－２．６９（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．０６－１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８４－１．７４（ｍ，１Ｈ），１．６５－１．５８（ｍ，１Ｈ），１．５４－１．３１（ｍ，７Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３０３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－ｄ）δ＝８．００－７．９２（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．２８－７．２４（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．１０－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．８０－２．６９（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．０６－１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８４－１．７４（ｍ，１Ｈ），１．６５－１．５８（ｍ，１Ｈ），１．５４－１．３１（ｍ，７Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ３０３［Ｍ＋Ｈ］＋
【0094】
－例２ｃ）：中間体（ＶＩＩ）メチル（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾアートの合成
中間体（ＶＩ）（５８５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１２ｍｌ）に溶解した。材料が溶解するまで混合物を撹拌した。炭酸セシウム（３．８７ｍｍｏｌ）、引き続いて４－（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド（２．４２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２４時間撹拌した。ＴＨＦを蒸発させ、残渣をＤＣＭ／ＮａＨＣＯ３飽和溶液（５０ｍｌ）の混合物に溶解した。相を分離し、水層をＤＣＭ（２×１５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、残渣を、シクロヘキサン／酢酸エチル１００％から７０／３０までで溶出するＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ－ＨＰ Ｓｐｈｅｒｅ－Ｓｉ（１０ｇ）カラムに充填した。収量８５０ｍｇ（９５％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．７１（ｓ，１Ｈ），７．８４－７．７８（ｍ，２Ｈ），７．７２－７．６６（ｍ，２Ｈ），７．６３－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．２０（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８７－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．７９－２．７０（ｍ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．０１－１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８６－１．７８（ｍ，１Ｈ），１．７０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５７－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．２３（ｍ，３Ｈ），１．２１－１．１１（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４６１［Ｍ＋Ｈ］＋
中間体（ＶＩ）（５８５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１２ｍｌ）に溶解した。材料が溶解するまで混合物を撹拌した。炭酸セシウム（３．８７ｍｍｏｌ）、引き続いて４－（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド（２．４２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２４時間撹拌した。ＴＨＦを蒸発させ、残渣をＤＣＭ／ＮａＨＣＯ３飽和溶液（５０ｍｌ）の混合物に溶解した。相を分離し、水層をＤＣＭ（２×１５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、残渣を、シクロヘキサン／酢酸エチル１００％から７０／３０までで溶出するＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ－ＨＰ Ｓｐｈｅｒｅ－Ｓｉ（１０ｇ）カラムに充填した。収量８５０ｍｇ（９５％）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．７１（ｓ，１Ｈ），７．８４－７．７８（ｍ，２Ｈ），７．７２－７．６６（ｍ，２Ｈ），７．６３－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．２０（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８７－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．７９－２．７０（ｍ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．０１－１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８６－１．７８（ｍ，１Ｈ），１．７０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５７－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．２３（ｍ，３Ｈ），１．２１－１．１１（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４６１［Ｍ＋Ｈ］＋
【0095】
－例２ｄ）：中間体（ＶＩＩＩ）（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸の合成
水酸化リチウム一水和物（３．３２ｍｍｏｌ）を中間体（ＶＩＩ）（８５０ｍｇ、１．８４６ｍｍｏｌ）の水／ジオキサン中溶液に添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌したままにし、次いで、ＡｃＯＨ １ｍｌを添加し、ジオキサンを蒸発させ、残渣を水（２ＶＣ）及びＭｅＯＨ（３ＶＣ）で溶出するＢｉｏｔａｇｅ Ｃ１８ １０ｇ ＳＰＥ－カラムに充填した。収率９４％（７７２ｍｇ、白色固体）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝１２．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），７．８３－７．７６（ｍ，２Ｈ），７．７２－７．６６（ｍ，２Ｈ），７．６４－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２４－７．１８（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８８－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．７９－２．７２（ｍ，１Ｈ），２．０１－１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８８－１．７７（ｍ，１Ｈ），１．７６－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５７－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２１（ｍ，３Ｈ），１．２１－１．０９（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
水酸化リチウム一水和物（３．３２ｍｍｏｌ）を中間体（ＶＩＩ）（８５０ｍｇ、１．８４６ｍｍｏｌ）の水／ジオキサン中溶液に添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌したままにし、次いで、ＡｃＯＨ １ｍｌを添加し、ジオキサンを蒸発させ、残渣を水（２ＶＣ）及びＭｅＯＨ（３ＶＣ）で溶出するＢｉｏｔａｇｅ Ｃ１８ １０ｇ ＳＰＥ－カラムに充填した。収率９４％（７７２ｍｇ、白色固体）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝１２．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），７．８３－７．７６（ｍ，２Ｈ），７．７２－７．６６（ｍ，２Ｈ），７．６４－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２４－７．１８（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８８－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．７９－２．７２（ｍ，１Ｈ），２．０１－１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８８－１．７７（ｍ，１Ｈ），１．７６－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５７－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２１（ｍ，３Ｈ），１．２１－１．０９（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
【0096】
－例２ｅ）：（Ｒ）－４－（１－（１－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）ピペリジン－２－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸、ナトリウム塩の合成
中間体（ＶＩＩＩ）（４０ｇ、８９．７ｍｍｏｌ）を水／ジオキサンに溶解し、次いで、ＮａＯＨ（９８ｍｍｏｌ）を添加した。１時間撹拌した後、ＴＨＦを蒸発させた。残渣を水（４ＶＣ）からＭｅＯＨ（勾配４ＣＶ）で溶出するＢｉｏｔａｇｅ Ｃ１８ １５０ｇ ＳＰＥ－カラム（８回注入）に充填した。所望の生成物を含有する画分を蒸発させ、得られた固体を真空下、６０℃で３日間乾燥させた。収率９８％（４１ｇ、白色固体）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．６０（ｓ，１Ｈ），７．７５－７．６５（ｍ，Ｊ＝７．８，７．８Ｈｚ，４Ｈ），７．６５－７．５７（ｍ，２Ｈ），７．０５－６．９６（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），２．８４－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．７８－２．７１（ｍ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．０１－１．９１（ｍ，１Ｈ），１．８６－１．７６（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３４－１．２０（ｍ，１Ｈ），１．１９－１．００（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
中間体（ＶＩＩＩ）（４０ｇ、８９．７ｍｍｏｌ）を水／ジオキサンに溶解し、次いで、ＮａＯＨ（９８ｍｍｏｌ）を添加した。１時間撹拌した後、ＴＨＦを蒸発させた。残渣を水（４ＶＣ）からＭｅＯＨ（勾配４ＣＶ）で溶出するＢｉｏｔａｇｅ Ｃ１８ １５０ｇ ＳＰＥ－カラム（８回注入）に充填した。所望の生成物を含有する画分を蒸発させ、得られた固体を真空下、６０℃で３日間乾燥させた。収率９８％（４１ｇ、白色固体）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．６０（ｓ，１Ｈ），７．７５－７．６５（ｍ，Ｊ＝７．８，７．８Ｈｚ，４Ｈ），７．６５－７．５７（ｍ，２Ｈ），７．０５－６．９６（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），２．８４－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．７８－２．７１（ｍ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．０１－１．９１（ｍ，１Ｈ），１．８６－１．７６（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３４－１．２０（ｍ，１Ｈ），１．１９－１．００（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ＋ｍ／ｚ ４４７［Ｍ＋Ｈ］＋
【0097】
例３：
マウス結腸直腸がんの同系モデルにおける化合物１（（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩のＡ形態）及び化合物２と抗マウスｐｄ－１抗体の併用療法の効果。
材料及び方法
４～６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１２時間／１２時間の明／暗サイクルを用いて温度及び湿度が制御された部屋に１ケージ当たり５匹収容した。実験を通して、動物は食物及び水を自由に摂取することができた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを６つの群（各群ｎ＝１５）：ビヒクル、化合物１、化合物２、抗ＰＤ－１、化合物１＋抗ＰＤ－１、化合物２＋抗ＰＤ－１群に無作為に分けた。
マウス結腸直腸がんの同系モデルにおける化合物１（（Ｒ）－４－（１－（６－（４－（トリフルオロメチル）ベンジル）－６－アザスピロ［２．５］オクタン－５－カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩のＡ形態）及び化合物２と抗マウスｐｄ－１抗体の併用療法の効果。
材料及び方法
４～６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１２時間／１２時間の明／暗サイクルを用いて温度及び湿度が制御された部屋に１ケージ当たり５匹収容した。実験を通して、動物は食物及び水を自由に摂取することができた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを６つの群（各群ｎ＝１５）：ビヒクル、化合物１、化合物２、抗ＰＤ－１、化合物１＋抗ＰＤ－１、化合物２＋抗ＰＤ－１群に無作為に分けた。
【0098】
ＣＴ２６細胞をＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で、５％ ＣＯ２のインキュベーターで培養した。接種に必要な細胞数が得られるまで、細胞を１週間に２回継代培養した。
【0099】
移植日（０日目）に、対数増殖期細胞を収穫し、ＰＢＳに希釈し、ＰＢＳ ０．２ｍｌ中１０＾６個の細胞を、２６Ｇシリンジを使用して各マウスの側腹部領域に皮下接種した。
【0100】
接種後７日目に、マウスを、それぞれビヒクル、化合物１、化合物２、抗ＰＤ－１及び併用療法を受ける１５匹の動物の各々の６つの処置群に無作為化した。
【0101】
化合物１及び化合物２を１日１回３０ｍｇ／ｋｇ、７日目～２３日目に繰り返し経口投与し、抗マウスＰＤ－１抗体を移植後８日目に２０ｍｇ／ｋｇの用量ならびに移植後１３日目、１９日目及び２２日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で抗マウスＰＤ－１抗体単独療法群のマウス及び併用療法群のマウスに腹腔内投与した。
【0102】
デジタルキャリパーを使用して、腫瘍サイズ（ｍｍ３）を１週間に２回評価した。長径及び短径に沿った腫瘍長さを測定し、式：体積＝［（長さ）２×幅］／２を使用して腫瘍体積を計算した。
【0103】
結果
化合物１及び例２の化合物と抗マウスＰＤ－１抗体による併用療法の効果を調査するために、マウス結腸直腸がん細胞株の同種移植モデルを使用した。マウスの皮下で増殖させたＣＴ２６がん細胞腫瘍を、単独療法の例１もしくは２の化合物、又は抗マウスＰＤ－１抗体との併用療法の例１もしくは２の化合物で３週間処置した。
化合物１及び例２の化合物と抗マウスＰＤ－１抗体による併用療法の効果を調査するために、マウス結腸直腸がん細胞株の同種移植モデルを使用した。マウスの皮下で増殖させたＣＴ２６がん細胞腫瘍を、単独療法の例１もしくは２の化合物、又は抗マウスＰＤ－１抗体との併用療法の例１もしくは２の化合物で３週間処置した。
【0104】
図３のグラフは、腫瘍細胞接種後の日数に対してプロットされた毎週測定された腫瘍体積を報告している。化合物１による単独療法は、処置の第２週から開始して、がん成長に対する穏やかな阻害効果を有したが、例２の化合物は、腫瘍成長のわずかな障害しか示さなかったことが分かる。文献に報告されているデータによると、がん成長の阻害がごく部分的であったとしても、抗マウスＰＤ－１療法はがん成長を遅延させた。（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｙ．らＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５、１２９～１３６（２０１５））。対照的に、図４に報告されるように、化合物１と抗マウスＰＤ－１抗体の併用処置によって抗腫瘍有効性が有意に増強された。
【0105】
さらに、処置全体を通した動物の体重の評価は、併用療法が動物の健康全般に影響を及ぼさないことを示した（図５）。
【0106】
結論
上に報告される結果は、化合物１及び化合物２が単一治療として与えられた場合に腫瘍成長を阻害することを示した。さらに、化合物１は、組み合わせて使用されると、ＰＤ－１抗体の抗腫瘍効果を有意に増強する。
上に報告される結果は、化合物１及び化合物２が単一治療として与えられた場合に腫瘍成長を阻害することを示した。さらに、化合物１は、組み合わせて使用されると、ＰＤ－１抗体の抗腫瘍効果を有意に増強する。
【0107】
例４
ヒト組換えＥＰ４受容体サブタイプ上の３Ｈ－ＰＧＥ２特異的結合に対する２つのＥＰ４アンタゴニストの効果
方法
ヒト組換えＥＰ４受容体を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株（ヒト胎児由来腎臓２９３）から細胞膜を調製した。細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で１０％ ＦＢＳを含有するＧｌｕｔａｍａｘ Ｉを含むＤＭＥＭ中で接着増殖させた。膜調製のために、細胞を播種した１５０ｃｍ２フラスコから培養培地を吸引した。細胞単層を１０ｍｌの低張溶解緩衝液（ＴＲＩＳ ５ｍＭ＋ＥＤＴＡ ５ｍＭ－ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、細胞を剥離し、同じ緩衝液で機械的に掻き取ることによって溶解した。溶解物を４℃で２２分間、４００００×ｇで遠心分離した。ペレットを使用するまで－８０℃で保存した。
ヒト組換えＥＰ４受容体サブタイプ上の３Ｈ－ＰＧＥ２特異的結合に対する２つのＥＰ４アンタゴニストの効果
方法
ヒト組換えＥＰ４受容体を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株（ヒト胎児由来腎臓２９３）から細胞膜を調製した。細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で１０％ ＦＢＳを含有するＧｌｕｔａｍａｘ Ｉを含むＤＭＥＭ中で接着増殖させた。膜調製のために、細胞を播種した１５０ｃｍ２フラスコから培養培地を吸引した。細胞単層を１０ｍｌの低張溶解緩衝液（ＴＲＩＳ ５ｍＭ＋ＥＤＴＡ ５ｍＭ－ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、細胞を剥離し、同じ緩衝液で機械的に掻き取ることによって溶解した。溶解物を４℃で２２分間、４００００×ｇで遠心分離した。ペレットを使用するまで－８０℃で保存した。
【0108】
［３Ｈ］－プロスタグランジンＥ２（［３Ｈ］－ＰＧＥ２）結合アッセイを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ－ＫＯＨ緩衝液ｐＨ６中で実施した。膜画分からの１０マイクログラムのタンパク質を、１ｎＭの［３Ｈ］－ＰＧＥ２と共に０．１ｍｌの総体積でインキュベートする。全結合又は非特異的結合を決定するために、１％ ＤＭＳＯ又は１μＭ ＰＧＥ２をそれぞれ反応混合物に添加した。特異的結合は、全結合の８５％超を占めた。競合曲線では、希釈剤を試験化合物（少なくとも２桁に及ぶ８つの濃度；２連の点）で置換した。独立した一連の実験において、同じ化合物の競合曲線を、ウシ血清アルブミン０．５％の存在下で実施した。０．３％ポリエチレンイミンに予め浸漬したガラス繊維フィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ ＧＦＢ ９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ）での急速濾過による結合放射性リガンドと遊離放射性リガンドの分離の前に、９６マルチウェルプレート中、室温で９０分間インキュベートを行った。フィルターを氷冷緩衝液ｐＨ７．４（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、ＢＳＡ ０．１％）で洗浄し、３０℃で３０分間乾燥させ、次いで、０．１ｍｌのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を添加した。少なくとも１時間の安定化後、残留［３Ｈ］－ＰＧＥ２結合を固体シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ）によって決定した。競合曲線の結果をＩＣ５０として表し、対応するＫｉをＣｈａｎｇ－Ｐｒｏｕｓｏｆｆ方程式に従って計算した。最後に、Ｋｉ値をｐＫｉ（Ｋｉの負の対数）に変換した。
【0109】
結果
調査中の両化合物は、ヒト組換えＥＰ４受容体に対してナノモル親和性を示した。しかしながら、タンパク質（すなわち、ＢＳＡ）の存在下では、化合物２は、化合物１に関して以下の表に報告されるｐＫｉのより低い値によって示されるように、６倍低い親和性を示した（ＢＳＡの非存在下又は存在下でそれぞれ７．５及び６．７）。
調査中の両化合物は、ヒト組換えＥＰ４受容体に対してナノモル親和性を示した。しかしながら、タンパク質（すなわち、ＢＳＡ）の存在下では、化合物２は、化合物１に関して以下の表に報告されるｐＫｉのより低い値によって示されるように、６倍低い親和性を示した（ＢＳＡの非存在下又は存在下でそれぞれ７．５及び６．７）。
【表4】
【0110】
０．５％ ＢＳＡの非存在下又は存在下におけるヒト組換えＥＰ４受容体に対する化合物１及び化合物２の親和性（ｐＫｉ）。
【0111】
結論
得られた結果は、例２の化合物が、化合物１と比較した場合に、インビトロでタンパク質（例えば、ＢＳＡ）に対してより高い結合能を有し、したがって試験中のＥＰ４Ｒに対するその相互作用に影響を及ぼすことを示唆している。
得られた結果は、例２の化合物が、化合物１と比較した場合に、インビトロでタンパク質（例えば、ＢＳＡ）に対してより高い結合能を有し、したがって試験中のＥＰ４Ｒに対するその相互作用に影響を及ぼすことを示唆している。
【0112】
例５：
リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘導され、プロスタグランジンＥ２（ラット全血培養物）によって調節されるＴＮＦα放出に対する化合物１のインビトロ効果
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘導され、プロスタグランジンＥ２（ラット全血培養物）によって調節されるＴＮＦα放出に対する化合物１のインビトロ効果
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
【0113】
実験当日、動物を誘導チャンバ内で、Ｏ２中２．５～３％イソフルランで麻酔し、腹部大動脈から血液を採取した。０．１～０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するチューブに全血試料を収集した。アリコート（０．５ｍｌ）を一連のチューブに分注し、０．１μｇ／ｍｌのリポ多糖（大腸菌血清型０５５：Ｂ ５；ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（対照試料）又は０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳ＋０．１μＭのＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の混合物を添加した後、試料を５％ ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。選択された刺激剤濃度は、細胞活性化をもたらす以前の滴定アッセイからの最低濃度とした。そうでなければ、サイトカイン産生における適度な変化が隠され得る可能性がある。同様に、免疫細胞が動物から除去されると免疫細胞の機能が影響を受ける可能性があるため、刺激の時間は最適で、可能な限り短くした。刺激の４時間後、サイトカイン放出はほぼ最大となり、１８～２４時間後にプラトーになった。
【0114】
サイトカインの基礎放出を表す試料では、ＬＰＳを同じ体積の無菌ＰＢＳで置換した。ＬＰＳ及びＰＧＥ２を、無菌ＰＢＳ＋ＢＳＡ ０．２％中ストック溶液として調製した。インキュベーションの最後に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、試料を４℃で遠心分離して血漿を得て、その後、これをサイトカイン決定のためのＥＬＩＳＡアッセイまで－８０℃でアリコートで保存した。ラット全血培養物におけるＴＮＦ－α放出のレベルを、ラットＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、フランス）を使用して評価した。参照標準曲線と比較して、試料中のＴＮＦ－αレベルを濃度（ｐｇ／ｍｌ）として表した。
【0115】
結果
インビトロでの化合物１によるＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２の効果の濃度依存的逆転が実証された。ＴＮＦ－α放出の阻害の約８０％を決定する固定ＰＧＥ２濃度に対する化合物１（０．１～３０μＭ）の曲線は、図６に示されるようにＩＣ５０値２．３μＭを計算することを可能にした。
インビトロでの化合物１によるＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２の効果の濃度依存的逆転が実証された。ＴＮＦ－α放出の阻害の約８０％を決定する固定ＰＧＥ２濃度に対する化合物１（０．１～３０μＭ）の曲線は、図６に示されるようにＩＣ５０値２．３μＭを計算することを可能にした。
【0116】
結論
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニスト化合物１の活性をインビトロで実証するのに有用であった。これらの実験で得られた結果は、化合物１が、ＬＰＳで刺激された血球におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２減少を逆転させることを強調している。
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニスト化合物１の活性をインビトロで実証するのに有用であった。これらの実験で得られた結果は、化合物１が、ＬＰＳで刺激された血球におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２減少を逆転させることを強調している。
【0117】
例６
ＬＰＳによって誘導されるエキソビボＴＮＦ－α放出：ＰＧＥ２阻害（ＩＣ ５０ ）と化合物１処置用量との間の線形関係
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
ＬＰＳによって誘導されるエキソビボＴＮＦ－α放出：ＰＧＥ２阻害（ＩＣ ５０ ）と化合物１処置用量との間の線形関係
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
【0118】
エキソビボでのＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の効果の調節を、ビヒクル又は様々な用量の化合物１で経口処置し、投与１時間後に収集した動物由来の全血培養試料を使用して評価した。
【0119】
詳細には、実験当日、動物を誘導チャンバ内で、Ｏ２中２．５～３％イソフルランで麻酔し、腹部大動脈から血液（平均７ｍｌ／ラット）を採取した。０．１～０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するチューブに全血試料を収集した。アリコート（０．５ｍｌ）を一連のチューブに分注し、ＬＰＳ（対照試料）又は０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳ＋様々な濃度のＰＧＥ２の混合物を添加した後、試料を５％ ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。サイトカインの基礎放出を表す試料では、ＬＰＳを同じ体積の無菌ＰＢＳで置換した。ＬＰＳ及びＰＧＥ２を、無菌ＰＢＳ＋ＢＳＡ ０．２％中１００倍ストック溶液として調製した。インキュベーションの最後に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、試料を４℃で１０分間、１５００ｇで遠心分離し、血漿を取り出し、サイトカイン決定のためのＥＬＩＳＡアッセイまで－８０℃でアリコートで保存した。ラット全血培養物におけるＴＮＦ－α放出のレベルを分析するために、ラットＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、フランス）を使用した。参照標準曲線と比較して、試料中のＴＮＦ－αレベルを濃度（ｐｇ／ｍｌ）として表した。
【0120】
各動物について、対照試料に対する様々なＰＧＥ２濃度による阻害％、及び対応するＩＣ５０（又は０～１００％阻害の範囲の半数阻害濃度）を線形回帰分析によって計算した。さらに、各処置群において、平均ＴＮＦ－αレベル及びＰＧＥ２による平均阻害％のいずれかを計算した。ビヒクル群に対する各用量処置の統計学的に有意な効果を決定するために、ＰＧＥ２阻害曲線の各点を考慮して、二元配置ＡＮＯＶＡを実施した。
【0121】
線形回帰分析によって化合物１用量と得られたＰＧＥ２ ＩＣ５０との間の関係を計算するために、各群の平均ＩＣ５０値を、投与された化合物１用量の関数としてプロットした。
【0122】
結果
ＴＮＦ－α放出に対する公知のＰＧＥ２阻害効果に関する化合物１の調節活性を実証する目的で、ＬＰＳで刺激した全血培養物に基づくエキソビボモデルを展開した。特に、アンタゴニストの存在下でのアゴニストＩＣ５０のシフトを計算するために、１０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の５つの異なる用量で経口投与された化合物１のエキソビボ効果をＰＧＥ２阻害曲線に対して評価した。ＬＰＳ ０．１μｇ／ｍｌによって誘導されたＴＮＦ－α産生を、２４時間のエキソビボ刺激後に測定した。１時間の採血を化合物１ ｔｍａｘの代表として選択し、使用した低用量（１０～３０ｍｇ／ｋｇ）は、関節リウマチのラットモデルにおいて以前に測定されたその薬理学的活性に従ったものであった。
ＴＮＦ－α放出に対する公知のＰＧＥ２阻害効果に関する化合物１の調節活性を実証する目的で、ＬＰＳで刺激した全血培養物に基づくエキソビボモデルを展開した。特に、アンタゴニストの存在下でのアゴニストＩＣ５０のシフトを計算するために、１０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の５つの異なる用量で経口投与された化合物１のエキソビボ効果をＰＧＥ２阻害曲線に対して評価した。ＬＰＳ ０．１μｇ／ｍｌによって誘導されたＴＮＦ－α産生を、２４時間のエキソビボ刺激後に測定した。１時間の採血を化合物１ ｔｍａｘの代表として選択し、使用した低用量（１０～３０ｍｇ／ｋｇ）は、関節リウマチのラットモデルにおいて以前に測定されたその薬理学的活性に従ったものであった。
【0123】
ＰＧＥ２はサイトカイン放出を阻害し、ＥＰ４Ｒと相互作用する血液中の化合物１の存在は、この効果の統計学的に有意な反転を決定した。ビヒクルのＰＧＥ２ ＩＣ５０値を計算したところ、化合物１による処置の結果として、この値の３倍～最大９倍の増加が観察された。化合物１の用量とＰＧＥ２ ＩＣ５０値との間の線形関係を図７に示す。
【0124】
化合物１のラットＥＰ４Ｒへの標的結合と一致して、ＬＰＳによって誘導され、ＰＧＥ２によって阻害され、化合物１によって調節されるＴＮＦ－αのエキソビボ放出の分析を、腫瘍微小環境で通常観察される濃度範囲の代表であるので、低ナノモル濃度のＰＧＥ２に関して焦点を当てた。化合物１投与用量に対するＰＧＥ２によって決定されるＴＮＦ－α放出に対する阻害効果をプロットすると、両ＰＧＥ２濃度について全体的な用量依存的反転が観察された。結果を図８に報告する。
【0125】
さらに、図９のグラフで観察され得るように、化合物１の効果のわずかな時間依存的減少が観察され得るが、ＰＧＥ２ ＴＮＦ－α放出阻害の反転は化合物１投与の２４時間後にも依然として明らかであったので、採血分析の時間経過（１～３～２４時間）は、最小有効用量の１０ｍｇ／ｋｇの化合物１によるＥＰ４Ｒの長期結合を強調した。
【0126】
結論
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニスト化合物１の活性を実証するのに有用であった。全体として、これらの結果は、化合物１が血液細胞におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２誘導阻害を逆転させる能力を強く実証している。実際、血液試料を用いたビヒクル（対照）又は化合物１で経口処置した動物によって得て、投与１時間後に収集したエキソビボ実験では、化合物１の存在により、ＰＧＥ２の予想される効果の統計学的に有意な反転が決定された。さらに、ＰＧＥ２ ＴＮＦ－α放出阻害の反転は、化合物１投与の２４時間後でも依然として明らかであった。
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニスト化合物１の活性を実証するのに有用であった。全体として、これらの結果は、化合物１が血液細胞におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２誘導阻害を逆転させる能力を強く実証している。実際、血液試料を用いたビヒクル（対照）又は化合物１で経口処置した動物によって得て、投与１時間後に収集したエキソビボ実験では、化合物１の存在により、ＰＧＥ２の予想される効果の統計学的に有意な反転が決定された。さらに、ＰＧＥ２ ＴＮＦ－α放出阻害の反転は、化合物１投与の２４時間後でも依然として明らかであった。
【0127】
例７
投与２４時間後の、ＬＰＳによって誘導され、ＰＧＥ２によって阻害されるＴＮＦα放出に対する化合物１及び化合物２の単一処置のエキソビボ効果
共に１０ｍｇ／ｋｇで投与されるビヒクル、化合物１又は例２の化合物で経口処置したウィスターハンラット（２７５～３００ｇ ｂ．ｗ．）からの全血培養試料を使用して、エキソビボでのＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２の効果の調節を評価した。投与の２４時間後に血液試料を収集した。
投与２４時間後の、ＬＰＳによって誘導され、ＰＧＥ２によって阻害されるＴＮＦα放出に対する化合物１及び化合物２の単一処置のエキソビボ効果
共に１０ｍｇ／ｋｇで投与されるビヒクル、化合物１又は例２の化合物で経口処置したウィスターハンラット（２７５～３００ｇ ｂ．ｗ．）からの全血培養試料を使用して、エキソビボでのＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２の効果の調節を評価した。投与の２４時間後に血液試料を収集した。
【0128】
動物を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
【0129】
詳細には、実験当日、動物を誘導チャンバ内で、Ｏ２中２．５～３％イソフルランで麻酔し、腹部大動脈から血液を採取した。試料を０．１～０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するチューブに収集し、アリコート（０．５ｍｌ）を一連のチューブに分注し、ＬＰＳ ０．１μｇ／ｍｌ（対照試料）又はＬＰＳ＋様々な濃度のＰＧＥ２の混合物を添加した後、これらを５％ ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。サイトカインの基礎放出を表す試料では、ＬＰＳを同じ体積の無菌ＰＢＳで置換した。ＬＰＳ及びＰＧＥ２を、無菌ＰＢＳ＋ＢＳＡ ０．２％中ストック溶液として調製した。インキュベーションの最後に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、試料を４℃で１０分間、１５００ｇで遠心分離し、血漿を取り出し、サイトカイン決定のためのＥＬＩＳＡアッセイ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｆｒａｎｃｅ）まで－８０℃でアリコートで保存した。
【0130】
結果
対照（ビヒクル）又は処置群で得られたＰＧＥ２ ＩＣ５０値を分析した。投与２４時間後の血液中の化合物１の存在により、ビヒクル処置群に対してＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα放出のＰＧＥ２阻害の統計学的に有意な反転が決定され（図１０）、実際、ＰＧＥ２ ＩＣ５０値の９倍の統計学的に有意なシフトが観察された。対照的に、化合物２の存在下では、ビヒクル処置群に対してＩＣ５０値の中程度の、統計学的に有意でないシフトのみが観察された。両化合物は、サイトカイン放出にそれ自体干渉しなかった。
対照（ビヒクル）又は処置群で得られたＰＧＥ２ ＩＣ５０値を分析した。投与２４時間後の血液中の化合物１の存在により、ビヒクル処置群に対してＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα放出のＰＧＥ２阻害の統計学的に有意な反転が決定され（図１０）、実際、ＰＧＥ２ ＩＣ５０値の９倍の統計学的に有意なシフトが観察された。対照的に、化合物２の存在下では、ビヒクル処置群に対してＩＣ５０値の中程度の、統計学的に有意でないシフトのみが観察された。両化合物は、サイトカイン放出にそれ自体干渉しなかった。
【0131】
結論
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニストの活性を実証するのに有用であった。化合物１は、単回経口投与の２４時間後にＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２阻害効果を元に戻すことができた。対照的に、例２の化合物は、統計学的有意性なしにＰＧＥ２阻害をわずかに減少させただけであった。
ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ－α産生に対するＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４アンタゴニストの活性を実証するのに有用であった。化合物１は、単回経口投与の２４時間後にＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２阻害効果を元に戻すことができた。対照的に、例２の化合物は、統計学的有意性なしにＰＧＥ２阻害をわずかに減少させただけであった。
【0132】
例８
リポ多糖によって誘導され、プロスタグランジンＥ２によって調節されるＴＮＦ－α放出に対する化合物１の反復投与のエキソビボ効果
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
リポ多糖によって誘導され、プロスタグランジンＥ２によって調節されるＴＮＦ－α放出に対する化合物１の反復投与のエキソビボ効果
材料及び方法
雄ウィスターハンラット（２５０～３００ｇ ｂ．ｗ．；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を、２０℃±２℃の範囲内の温度及び５５％±１０の範囲内の相対湿度を維持するように設定された、１２時間／１２時間の明／暗サイクルの温度制御部屋に１ケージ当たり６匹収容した。試験を通して、動物は、標準的な実験室用固形飼料（Ｔｅｋｌａｄげっ歯類飼料２０１８、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ ａｌ Ｎａｔｉｓｏｎｅ、ＵＤ、イタリア）及び飲料水を自由に摂取することができた。動物の管理及び取り扱いは、地方政府のガイドライン及びヨーロッパ共同体の規制に従った。実験手順の認可はイタリア保健省によって付与された。
【0133】
エキソビボでのＴＮＦ－α放出に対するＰＧＥ２の効果の調節を、ビヒクル又は１０ｍｇ／ｋｇの化合物１でｑｄで８日間経口処置し、最後の処置の２４時間後に収集した動物由来の全血培養試料を使用して評価した。
【0134】
詳細には、実験当日、動物を誘導チャンバ内で、Ｏ２中２．５～３％イソフルランで麻酔し、腹部大動脈から血液を採取した。０．１～０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するチューブに全血試料を収集した。アリコート（０．４ｍｌ）を３７℃で１０分間予熱した一連のチューブに分注し、ＬＰＳ（対照）又はＬＰＳ＋様々な濃度のＰＧＥ２の混合物を添加した後、試料を５％ ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。サイトカインの基礎放出を表す試料では、ＬＰＳを同じ体積の無菌ＰＢＳで置換した。ＬＰＳ及びＰＧＥ２を、無菌ＰＢＳ＋ＢＳＡ ０．２％中１００倍ストック溶液として調製した。インキュベーションの最後に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、試料を４℃で１０分間、１５００ｇで遠心分離し、血漿を取り出し、サイトカイン決定のためのＥＬＩＳＡアッセイまで－８０℃でアリコートで保存した。
【0135】
ラット全血培養物におけるＴＮＦ－α放出のレベルを、ラットＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、フランス）を使用して評価した。
【0136】
参照標準曲線と比較して、試料中のＴＮＦ－αレベルを濃度（ｐｇ／ｍｌ）として表した。各動物について、対照試料に対する様々なＰＧＥ２濃度による阻害％、及び対応するＩＣ５０（又は０～１００％阻害の範囲の半数阻害濃度）を線形回帰分析によって計算した。さらに、各処置群において、平均ＴＮＦ－αレベル又はＰＧＥ２による平均阻害％のいずれかを計算した。ＰＧＥ２阻害曲線をグラフで比較し、各群の平均ＩＣ５０値を計算した。
【0137】
結果
ＰＧＥ２の阻害に対するｑｄで８日間経口投与された化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を、最後の処置の２４時間後に評価した。血液中の化合物１の存在により、ＰＧＥ２の阻害効果の統計学的に有意な反転が確認され、実際、ビヒクルのみで処置された対照群のＩＣ５０値は、１０ｍｇ／ｋｇ化合物１処置群のＩＣ５０値より有意に低い。特に、図１１に示されるように、対照のＩＣ５０値に対して化合物１処置群の平均ＩＣ５０値の５倍の統計学的に有意な増加が観察された。
ＰＧＥ２の阻害に対するｑｄで８日間経口投与された化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を、最後の処置の２４時間後に評価した。血液中の化合物１の存在により、ＰＧＥ２の阻害効果の統計学的に有意な反転が確認され、実際、ビヒクルのみで処置された対照群のＩＣ５０値は、１０ｍｇ／ｋｇ化合物１処置群のＩＣ５０値より有意に低い。特に、図１１に示されるように、対照のＩＣ５０値に対して化合物１処置群の平均ＩＣ５０値の５倍の統計学的に有意な増加が観察された。
【0138】
結論
本試験の結果は、化合物１の反復投与処置が、最後の投与の２４時間後でさえ、ラット血液細胞におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２誘導阻害を調節し得ることを実証している。
本試験の結果は、化合物１の反復投与処置が、最後の投与の２４時間後でさえ、ラット血液細胞におけるＴＮＦ－α放出のＰＧＥ２誘導阻害を調節し得ることを実証している。
【0139】
例９
ヒトマクロファージのインビトロ培養物におけるＴＮＦ－α発現
材料及び方法
ＡＴＣＣから得られたヒト単球細胞株ＴＨＰ－１を、提供された説明書に従って増殖させた。ＴＨＰ－１細胞を、４日間、１００ｎＭホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によりマクロファージに分化させた。次いで、マクロファージをリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｎｇ／ｍｌ及びＰＧＥ２ ０．０１μＭで３時間刺激した。全ＲＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用して精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、特異的ＴａｑＭａｎアッセイ（番号Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び内因性対照として１８Ｓ Ｐｒｅ－Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。１８Ｓ増幅値に対する正規化を用いたデータ分析を、遺伝子発現相対定量化のためのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの特定の説明書に従って行った。全ての個々のデータは、各試料に対する少なくとも３つの異なる分析の結果である。
ヒトマクロファージのインビトロ培養物におけるＴＮＦ－α発現
材料及び方法
ＡＴＣＣから得られたヒト単球細胞株ＴＨＰ－１を、提供された説明書に従って増殖させた。ＴＨＰ－１細胞を、４日間、１００ｎＭホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によりマクロファージに分化させた。次いで、マクロファージをリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｎｇ／ｍｌ及びＰＧＥ２ ０．０１μＭで３時間刺激した。全ＲＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用して精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、特異的ＴａｑＭａｎアッセイ（番号Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び内因性対照として１８Ｓ Ｐｒｅ－Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。１８Ｓ増幅値に対する正規化を用いたデータ分析を、遺伝子発現相対定量化のためのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの特定の説明書に従って行った。全ての個々のデータは、各試料に対する少なくとも３つの異なる分析の結果である。
【0140】
結果
ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ－α遺伝子発現のＰＧＥ２誘導阻害に対抗する化合物１の可能性を評価するために、ＴＨＰ－１細胞をマクロファージに分化させ、その後、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌ＋ＰＧＥ２ １０ ｎＭ±０．０１μＭ～１０μＭ濃度範囲の化合物１で３時間処理した。
ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ－α遺伝子発現のＰＧＥ２誘導阻害に対抗する化合物１の可能性を評価するために、ＴＨＰ－１細胞をマクロファージに分化させ、その後、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌ＋ＰＧＥ２ １０ ｎＭ±０．０１μＭ～１０μＭ濃度範囲の化合物１で３時間処理した。
【0141】
図１２のグラフに示されるように、ＬＰＳ＋ＰＧＥ２刺激ヒトマクロファージ（１００％に設定）と比較してＴＮＦ－α遺伝子発現のパーセンテージを報告すると、化合物１はＴＮＦ－α遺伝子発現レベルを増加させ、わずか０．１μＭという低い濃度でＰＧＥ２＋ＬＰＳで処理した細胞に対して２～３倍の増加を達成した。
【0142】
結論
これらのデータは、化合物１がＴＮＦ－α発現レベルを調節し、マクロファージなどのヒト免疫細胞におけるＴＮＦ－α発現のＰＧＥ２誘導阻害を打ち消すという証拠を提供する。
これらのデータは、化合物１がＴＮＦ－α発現レベルを調節し、マクロファージなどのヒト免疫細胞におけるＴＮＦ－α発現のＰＧＥ２誘導阻害を打ち消すという証拠を提供する。
【0143】
例１０：
がん細胞株におけるＲＡＮＫ－Ｌ発現に対する化合物１の効果
材料及び方法
ヒト乳腺腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＴＣＣから得て、提供された説明書に従って増殖させた。
がん細胞株におけるＲＡＮＫ－Ｌ発現に対する化合物１の効果
材料及び方法
ヒト乳腺腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＴＣＣから得て、提供された説明書に従って増殖させた。
【0144】
細胞を１０μＭ ＰＧＥ２±化合物１ １０μＭで２４時間処理した。全ＲＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用して精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、特異的ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｈｓ００２４３５２２＿ｍ１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び内因性対照として１８Ｓ Ｐｒｅ－Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。１８Ｓ増幅値に対する正規化を用いたデータ分析を、遺伝子発現相対定量化のためのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの特定の説明書に従って行った。全ての個々のデータは、各試料に対する少なくとも３つの異なる分析の結果である。
【0145】
結果
化合物１が、がん細胞上のＰＧＥ２によって誘導されるＲＡＮＫ－Ｌ遺伝子発現の増加を元に戻すことができるかどうかを評価するために、ヒト乳がん細胞に基づくモデルを使用した。
化合物１が、がん細胞上のＰＧＥ２によって誘導されるＲＡＮＫ－Ｌ遺伝子発現の増加を元に戻すことができるかどうかを評価するために、ヒト乳がん細胞に基づくモデルを使用した。
【0146】
１０μＭ ＰＧＥ２±化合物１ １０μＭで２４時間処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＲＡＮＫＬ遺伝子発現のレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価した。
【0147】
結果を図１３に報告し、１００％に設定した１０μＭ ＰＧＥ２で刺激した細胞と比較したＲＡＮＫ－Ｌ発現の平均パーセンテージを示す。化合物１は、ＲＡＮＫ－Ｌ遺伝子発現のレベルを著しく低下させた。
【0148】
結論
得られたデータは、ＰＧＥ２効果に対抗する化合物１が、ヒトがん細胞におけるＲＡＮＫ－Ｌ遺伝子発現を低下させるという証拠を提供する。
得られたデータは、ＰＧＥ２効果に対抗する化合物１が、ヒトがん細胞におけるＲＡＮＫ－Ｌ遺伝子発現を低下させるという証拠を提供する。
【0149】
例１１：
ヒトＴｈ－１７細胞分化のエキソビボ減少
材料及び方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用して健康なボランティアから単離し、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＭＣから濃縮した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地中で維持し、１．５ｎｇ／ｍｌの抗体抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８と組み合わせたＩＬ－１２及びＩＬ－２（共に５ｎｇ／ｍｌ）、ならびに０．０３μＭ ＰＧＥ２±０．０１－０．０３－０．１－０．３μ．Ｍの濃度の化合物１で４８時間刺激することによってＴｈ－１７細胞に分化させた。
ヒトＴｈ－１７細胞分化のエキソビボ減少
材料及び方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用して健康なボランティアから単離し、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＭＣから濃縮した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地中で維持し、１．５ｎｇ／ｍｌの抗体抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８と組み合わせたＩＬ－１２及びＩＬ－２（共に５ｎｇ／ｍｌ）、ならびに０．０３μＭ ＰＧＥ２±０．０１－０．０３－０．１－０．３μ．Ｍの濃度の化合物１で４８時間刺激することによってＴｈ－１７細胞に分化させた。
【0150】
インキュベーション時間の最後に、細胞を、ＣＤ４、ＣＣＲ６、ＣＤ４５、ＣＤ２５及びＩＬ－１７（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で染色した。最後に、Ｔｈ－１７細胞の数をフローサイトメトリーによって決定し、イベントを蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定し、専用ソフトウェアで分析した。
【0151】
結果
得られた結果を図１４に報告し、Ｔｈ－１７Ｆ＋細胞の頻度を化合物１の濃度に対してプロットする。化合物１は、ナイーブＴｈ－１７細胞の数の著しい減少を用量依存的に誘導し、０．１μＭを超える濃度で最大効果のプラトーに達した。
得られた結果を図１４に報告し、Ｔｈ－１７Ｆ＋細胞の頻度を化合物１の濃度に対してプロットする。化合物１は、ナイーブＴｈ－１７細胞の数の著しい減少を用量依存的に誘導し、０．１μＭを超える濃度で最大効果のプラトーに達した。
【0152】
結論
得られたデータは、化合物１がＴｈ－１７細胞分化を負に調節するという証拠を提供する。
得られたデータは、化合物１がＴｈ－１７細胞分化を負に調節するという証拠を提供する。
【0153】
例１２：
エキソビボヒトＴ制御性細胞分化
材料及び方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用して健康なボランティアから単離し、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＭＣから濃縮した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地中で維持し、共に１０ｎｇ／ｍｌの濃度の２つのインターロイキン、すなわちｒＩＬ２３及びｒＩＬ－１βを使用してＴｒｅｇ表現型に分化させ、１４４時間のインキュベーション期間にわたって３０ｎＭ濃度のＰＧＥ２で共刺激した。
エキソビボヒトＴ制御性細胞分化
材料及び方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離を使用して健康なボランティアから単離し、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＭＣから濃縮した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地中で維持し、共に１０ｎｇ／ｍｌの濃度の２つのインターロイキン、すなわちｒＩＬ２３及びｒＩＬ－１βを使用してＴｒｅｇ表現型に分化させ、１４４時間のインキュベーション期間にわたって３０ｎＭ濃度のＰＧＥ２で共刺激した。
【0154】
インキュベーション時間の最後に、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＩＬ３５及びＣＲＴＨ２（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で染色した。最後に、Ｔｒｅｇ細胞の数をフローサイトメトリーによって決定し、イベントを蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定し、専用ソフトウェアで分析した。
【0155】
結果
ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、抑制性腫瘍微小環境の維持において重要な役割を果たし、したがってがんの進行に寄与することが分かっている（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｙ．らＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５、１２９～１３６（２０１５））。ＰＧＥ２は、ＦｏｘＰ３細胞分化の周知の誘導因子である（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３８、６３９～６４６（２０１４））。ここに報告されるデータは、ＰＧＥ２によって誘導されるＴｒｅｇのエキソビボ分化を減少させる化合物１の有効性を強調した。実際、０．０３μＭのＰＧＥ２はＦｏｘＰ３陽性細胞の分化を有意に促進したが、図１５に報告されるように、０．１μＭの化合物１はＴｈ－３細胞の分化を有意に減少させた。Ｔｈ－３細胞は、がんにおける活性化及び拡大が最悪の予後と相関するＴ制御性細胞の特定のサブセットである。（Ｄｕｒａｎ－Ａｎｉｏｔｚ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６２，７６１－７７２（２０１３））．さらに、ＰＧＥ２誘導性分化の同様の阻害が、図１６に報告されるように、Ｔｒｅｇ細胞の別の亜集団、すなわちｉＴＲ３５細胞について観察された。
ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、抑制性腫瘍微小環境の維持において重要な役割を果たし、したがってがんの進行に寄与することが分かっている（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｙ．らＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５、１２９～１３６（２０１５））。ＰＧＥ２は、ＦｏｘＰ３細胞分化の周知の誘導因子である（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３８、６３９～６４６（２０１４））。ここに報告されるデータは、ＰＧＥ２によって誘導されるＴｒｅｇのエキソビボ分化を減少させる化合物１の有効性を強調した。実際、０．０３μＭのＰＧＥ２はＦｏｘＰ３陽性細胞の分化を有意に促進したが、図１５に報告されるように、０．１μＭの化合物１はＴｈ－３細胞の分化を有意に減少させた。Ｔｈ－３細胞は、がんにおける活性化及び拡大が最悪の予後と相関するＴ制御性細胞の特定のサブセットである。（Ｄｕｒａｎ－Ａｎｉｏｔｚ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６２，７６１－７７２（２０１３））．さらに、ＰＧＥ２誘導性分化の同様の阻害が、図１６に報告されるように、Ｔｒｅｇ細胞の別の亜集団、すなわちｉＴＲ３５細胞について観察された。
【0156】
ｉＴｒ３５細胞は、強力な免疫抑制因子ＩＬ－３５の産生及び放出を特徴とする。さらに、ｉＴｒ３５細胞は、通常、乳がん及び結腸直腸がんにおいて高レベルで見られ、これらはエフェクターＴ細胞増殖の抑制を介して腫瘍免疫寛容に関与する（Ｈａｏ，Ｓ．らＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３９、１４８８～１４９６（２０１８）；Ｍａ，Ｙ．らＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７、７３００３～７３０１５（２０１６））。
【0157】
結論
得られたデータは、化合物１がＴ制御性細胞分化を負に調節するという証拠を提供し、したがって、示される結果は、がん細胞に対する免疫応答の回復を目指す免疫腫瘍療法におけるこの化合物の適用を強く支持する。
得られたデータは、化合物１がＴ制御性細胞分化を負に調節するという証拠を提供し、したがって、示される結果は、がん細胞に対する免疫応答の回復を目指す免疫腫瘍療法におけるこの化合物の適用を強く支持する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】