(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-06
(54)【発明の名称】リラグルチドに対する抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20220530BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220530BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220530BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
G01N33/53 D
G01N33/53 N
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021558919
(86)(22)【出願日】2020-03-31
(85)【翻訳文提出日】2021-10-01
(86)【国際出願番号】 EP2020059115
(87)【国際公開番号】W WO2020201280
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】62/827,444
(32)【優先日】2019-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ピーター・エム・テシェール
(72)【発明者】
【氏名】サミュエル・ディー・スティンプル
(72)【発明者】
【氏名】アルネ・スタビィ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルの同定および／または定量化などのための、特定の抗体およびその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、前記フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意選択で調製され、前記抗体が、ａ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、前記結合レベルが、アッセイ（ＩＩＩ）に従って少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイのリラグルチドフィブリルに対する検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルに対する検出限界であって、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界、および／または
ｃ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合のレベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合のレベルであって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記結合のレベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界
を有する、抗体。
【請求項2】
前記フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意選択で調製され、前記抗体が、ａ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、前記結合のレベルが、アッセイ（ＩＩＩ）に従って少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意選択で調製され、前記抗体が、 ｃ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合のレベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合のレベルであって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記結合のレベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界を有する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、７０％を超え、代替的に７５％を超え、代替的に８０％を超え、代替的に８５％を超え、代替的に９０％を超え、代替的に９５％を超える単体量の純度を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、溶液中の１～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度、例えば、１～１０ｐｐｍのフィブリル、代替的に１０～１００ｐｐｍのフィブリル、代替的に１００～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、請求項１～４のいずれかに一項記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、前記ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１１５および１２１、または１、２もしくは３個のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択される、請求項１～５のいずれかに一項記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体の重鎖の可変領域が、ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
ｍ．配列番号１１５、１１６、および１１７、
ｎ．配列番号 １２１、１２２、１２３、
または１、２、３個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体の軽鎖の可変領域が、ｏ．配列番号４０、４１、および４２、
ｐ．配列番号４６、４７、および４８、
ｑ．配列番号５２、５３、および５４、
ｒ．配列番号５８、５９、および６０、
ｓ．配列番号６４、６５、および６６、
ｔ．配列番号７０、７１、および７２、
ｕ．配列番号７６、７７、および７８、
ｖ．配列番号８２、８３、および８４、
ｗ．配列番号８８、８９、および９０、
ｘ．配列番号９４、９５、および９６、
ｙ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｚ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
ａａ．配列番号１１８、１１９、および１２０、
ｂｂ．配列番号１２４、１２５、および１２６、
または１、２、３個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体が、請求項６または７に定義の重鎖の可変領域と、請求項８に定義の軽鎖の可変領域とを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０９、および１１０、または最大２０個、例えば最大１５個または最大１０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
前記抗体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０９および１１０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
前記抗体が、単鎖Ｆｖ断片またはＦｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
リラグルチドフィブリルの特定のための、および／またはリラグルチドフィブリルおよび可溶性を含む混合物からフィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項14】
リラグルチドフィブリルを特定および／または定量化する方法であって、前記方法が、ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をリラグルチドに結合する工程と、
ｂ）任意選択で、リラグルチドフィブリルに結合した抗体を検出する工程と、
ｃ）任意選択で、リラグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意選択で、前記フィブリルの標準の使用によって、定量化する工程と、を含む、方法。
【請求項15】
可溶性および／または単量体リラグルチドを上回ってリラグルチドフィブリルを検出するためのアッセイであって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記抗体が、溶液中の１～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度、例えば、１～１０ｐｐｍのフィブリル、代替的に１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リラグルチドのフィブリルまたはセマグルチドのフィブリルに特異的な抗体、ならびにそのような抗体の使用に関する。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年３月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１９００４２ＷＯ０１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１１１キロバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年３月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１９００４２ＷＯ０１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１１１キロバイトである。
【背景技術】
【0003】
ヒトＧＬＰ－１（７－３７）およびその類似体は、溶液中に様々なタイプの凝集体を形成する傾向があることが知られている。本明細書においてフィブリルと称されるそのような凝集体の特定のタイプは、不可逆的に形成され、液体形態での患者への投与のために、医薬品において最小限に保たれるべきであると考えられる。これまでのところ、そのようなフィブリルをアッセイ（すなわち、同定および／または定量化）するための好ましい方法は、フィブリルに結合すると発光スペクトルを変化させるフルオロフォアであるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）に基づくものであり、例えば、本明細書のアッセイ（Ｖ）を参照されたい。ＴｈＴを介してペプチドフィブリルを検出するアッセイは、多くの場合、最初に試料にストレスを与えてフィブリルの量を増幅させ、検出を可能にすることを伴い、そのようなストレスの適用は望ましくないものであり、時間のかかるものである。ペプチドの可溶性形態を含む混合物においても、より高い感度でそのようなペプチドフィブリルを同定する手段が望まれる。
【発明の概要】
【0004】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルは、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルは、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界は、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される。
【0005】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号１１５および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；配列番号４６、４７、および４８；配列番号５２、５３、および５４；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６４、６５、および６６；配列番号７０、７１、および７２；配列番号７６、７７、および７８；配列番号８２、８３、および８４；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９４、９５、および９６；配列番号１００、１０１、および１０２；配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列１１８、１１９、および１２０；配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および本明細書に定義される軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【0007】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、本発明は、固体表面、例えば、アフィニティ表面を作るクロマトグラフ表面または膜表面に抗体を固定化し、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルおよび可溶性形態の両方を含む混合物をその表面に曝露し、フィブリルまたはその一部の単離をもたらすことによる、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルの除去または低減によるリラグルチドまたはセマグルチドの精製のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】選択された抗体バリアント、Ｅ、Ｍ、およびＮの分析サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストリラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルに特異的に結合する抗体に関する。リラグルチドおよびセマグルチドは、ヒトＧＬＰ－１（７－３７）の類似体であり、溶液の形態で市販されている治療用ペプチドである。リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルは、医薬品において望ましくない。したがって、本発明の抗体は、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルをそれらの可溶性形態と区別することを可能にする。本発明のそのような抗体は、任意にそれらの可溶性形態との混合物中のそのようなフィブリルの同定および／または定量化を可能にすること、ならびにリラグルチドまたはセマグルチドを含む医薬品の十分な品質を確保するための手段を提供することを含む、いくつかの技術的利点を有する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、可溶性リラグルチドの混合物からのリラグルチドフィブリルの単離または部分的単離を可能にする。そのような単離は、固体表面、例えば、クロマトグラフカラム、フィルター、または膜への固定化によって行われてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、任意に非常に過剰なペプチドの可溶性形態の存在下で、極めて低いレベルのペプチドフィブリルを検出するための高感度アッセイを可能にする。いくつかの実施形態では、特定のペプチドであるリラグルチドまたはセマグルチドに関しても、「フィブリル」、「ペプチドフィブリル」という用語は、リラグルチドについて本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って、またはセマグルチドについて本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って得られ得る凝集体のタイプを指し、そのようなフィブリルは、例えば、透過電子顕微鏡法を使用して、細い糸の形状のように見える。
【0012】
本発明者らは驚くべきことに、本発明の抗体が、振盪を伴わないＴｈＴアッセイなどのＴｈＴアッセイ、例えば、本明細書のアッセイ（Ｖ）と比較して、フィブリルを検出するための感度が少なくとも１００倍、およびおそらくさらには少なくとも１０００倍高いことを発見した。
【0013】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される。いくつかの実施形態では、抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される。いくつかの実施形態では、抗体は、可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベルを有する。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。
【0014】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルは、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルは、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界は、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される。
【0015】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる。
【0016】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号１１５および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４９、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号５５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７９、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号８５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１１５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号 配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４３、４４、および４５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４９、５０、および５１；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号５５、５６、および５７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６１、６２、および６３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６７、６８、および６９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７３、７４、および７５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７９、８０、および８１；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号８５、８６、および８７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９１、９２、および９３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９７、９８、および９９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１１５、１１６、および１１７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１２１、１２２、および１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；配列番号４６、４７、および４８；配列番号５２、５３、および５４；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６４、６５、および６６；配列番号７０、７１、および７２；配列番号７６、７７、および７８；配列番号８２、８３、および８４；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９４、９５、および９６；配列番号１００、１０１、および１０２；配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列１１８、１１９、および１２０；配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４６、４７、および４８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号５２、５３、および５４；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号５８、５９、および６０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号６４、６５、および６６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号７０、７１、および７２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号７６、７７、および７８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号８２、８３、および８４；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号８８、８９、および９０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号９４、９５、および９６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１００、１０１、および１０２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１１８、１１９、および１２０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、本明細書に定義される重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも７５％など、少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９２％または少なくとも９３％など、少なくとも９１％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９５％または少なくとも９６％など、少なくとも９４％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％など、少なくとも９７％の配列同一性を有する。
【0019】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、抗体は、単離抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する。
【0021】
いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、８０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、８５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、９０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、９５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体の純度は、本明細書において「サイズ排除クロマトグラフィー」の中に記載される方法、続いて、すべてのピークのＡＵＣ２８０ｎｍの合計と関連するモノマー抗体のピークの２８０ｎｍでの吸光度に基づく曲線下面積（ＡＵＣ２８０ｎｍ）の決定に従って決定される。
【0022】
リラグルチドおよびセマグルチド
リラグルチドおよびセマグルチドは、共有結合部分を含むヒトＧＬＰ－１（７－３７）の類似体である。本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに結合する。「フィブリル」という用語は、リラグルチドに関して本明細書で使用される場合、リラグルチドフィブリルを指し、セマグルチドに関して本明細書で使用される場合、セマグルチドフィブリルを指す。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、セマグルチドフィブリルに結合する。
リラグルチドおよびセマグルチドは、共有結合部分を含むヒトＧＬＰ－１（７－３７）の類似体である。本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに結合する。「フィブリル」という用語は、リラグルチドに関して本明細書で使用される場合、リラグルチドフィブリルを指し、セマグルチドに関して本明細書で使用される場合、セマグルチドフィブリルを指す。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、セマグルチドフィブリルに結合する。
【0023】
リラグルチドは、Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ２６－（Ｎ－イプシロン－（ガンマ－Ｌ－グルタミル（Ｎ－アルファ－ヘキサデカノイル）））－ＧＬＰ－１（７－３７）であり、ＷＯ９８／０８８７１の実施例３７に従って調製され得る。ＷＯ９８／０８８７１の実施例３７は、参照により本明細書に組み込まれる。リラグルチドの構造はまた、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，２００３でも公開されている。リラグルチドの構造はまた、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，２０１０でも公開されている。リラグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に記載されるように調製され得る。可溶性リラグルチドの一例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋによって製造される市販の溶液、例えば、商標Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）である。
【0024】
セマグルチドは、Ｎ－ε２６－［２－（２－［２－（２－［２－（２－［４－（１７－カルボキシヘプタデカノイルアミノ）－４（Ｓ）－カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ－１－（７－３７）ペプチドであり、ＷＯ２００６／０９７５３７の実施例４に従って調製され得る。ＷＯ２００６／０９７５３７の実施例４は、参照により本明細書に組み込まれる。セマグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に記載されるように調製され得る。可溶性セマグルチドの例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋによって製造される市販の溶液、例えば、商標Ｏｚｅｍｐｉｃ（登録商標）である。
【0025】
抗体
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／またはＣＤＲ、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ抗体ナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔ，Ｅｌｖｉｎ Ａ．（１９７６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ：Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＣＤＲアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する（重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３と称され得る。同様に、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３と称され得る）。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、および／またはＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、および／またはＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／またはＣＤＲ、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ抗体ナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔ，Ｅｌｖｉｎ Ａ．（１９７６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ：Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＣＤＲアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する（重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３と称され得る。同様に、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３と称され得る）。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、および／またはＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、および／またはＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域を含む。
【0026】
本発明の抗体は、全抗体および抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖抗体を含む、任意の形式であってもよい。
【0027】
いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインに融合した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）抗体である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む１つのアミノ酸配列からなり、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、Ｆｃドメインをさらに含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、本明細書に記載されるような標準抗体ドメインおよび領域を含む完全長抗体である。完全長抗体（または全抗体）は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。
【0029】
重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保護された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでもよい：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片であり、そのような断片は、従来の組換え技術またはタンパク質工学技術を使用して得られ得る。本発明の抗体断片は、切頭によって、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去によって、作製され得る。また、断片は、１つ以上の内部欠失によって生成され得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のいずれか１つの断片であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つの抗原結合部分、またはそのバリアントであるか、またはこれを含む。例えば、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つのＦａｂ断片、もしくはそのバリアントであり得るか、または本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つに由来する単鎖抗体、もしくはそのバリアントであり得る。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４２：４２Ｓ－４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９８８；８５：５８７９－５８８３を参照されたい）、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１）、およびｄＡｂ（典型的には、ＶＨ）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ－ＮＡＲ；単一ＶＨおよび単一ＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９－５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープが挙げられ、ここで、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基もしくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように一緒に会合または連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２Ｓ：１１２６－１１３６、ＷＯ２００５／０４０２１９、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号および同第２００２／０１６１２０１号に記載または考察されている。
【0031】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは概して、Ｋａｂａｔに従って定義される軽鎖の可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、および重鎖の可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または「超可変ループ」からの残基で構成される（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１－９１７）。典型的には、この領域内のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に記載される方法によって実施される。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２に記載される重鎖の可変領域および／軽鎖の可変領域のナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変領域のフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲの短縮、またはそれらへの挿入に対応する、より少ないか、または追加のアミノ酸を含有し得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定され得る。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内ではないこれらのＶＨまたはＶＬアミノ酸残基を指す。抗体の断片結晶化可能領域（Ｆｃドメイン）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、ならびに補体系の一部のタンパク質と相互作用することができる抗体の領域である。
【0032】
「抗体誘導体」という用語は、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートなど、抗体の任意の修飾形態を指す。
【0033】
「抗原」という用語は、抗体を生成するために使用される分子実体を指し得る。しかしながら、本明細書において、「抗原」という用語は、抗体に結合する、または特異的に結合する標的分子を広く指し、したがって、抗体を生成するために使用される分子実体の断片または模倣体を含む。抗体は、動物またはディスプレイスクリーニング、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイなどの免疫化によるものを含む任意の方法で生成され得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはその断片などの「抗原結合ポリペプチド」とその対応する抗原との間の分子相互作用の文脈において定義される。一般に、「エピトープ」は、抗体が結合する、または特異的に結合する抗原上の区域または領域、すなわち、抗体と物理的に接触している区域または領域を指す。エピトープは、抗体（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）への結合に直接関与する抗原中のアミノ酸残基、および抗体によって効果的に遮断される抗原のアミノ酸残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基（言い換えると、このアミノ酸残基は、抗体の「溶媒排除表面」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。所与の抗原は、多数の異なるエピトープを含んでもよく、それらのエピトープとしては、直鎖ペプチド抗原決定基、天然（成熟）立体配座において互いに近接して位置する１つ以上の非連続アミノ酸からなる立体配座抗原決定基、および炭水化物基などの抗原に共有結合した分子構造の全部または一部のいずれかからなる翻訳後抗原決定基が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0035】
抗体の「結合」、「特異的結合」、および「特異性」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の選択性を説明するために本明細書で使用される。本発明による抗体は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに特異的に結合し得、抗体が他の抗原に対して有意により低い結合レベルを有することを示す。いくつかの実施形態では、有意により低いとは、少なくとも１５倍低い、または少なくとも２０倍低いなど、少なくとも１０倍低い結合レベルである。結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って、または本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定され得る。結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数によって決定されるポリペプチド配列間の関連性の程度を指し、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちのより小さい配列間の完全一致率として決定され得る。ポリペプチドの配列同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３ （１９８８）に記載されるものなどが挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の方法によって容易に計算され得る。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間で最大の一致が得られるように設計されている。配列同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されており、２つの配列間の配列同一性を決定するためのそのような好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記参照）から公開されている。周知のスミス・ウォーターマン・アルゴリズムも、配列同一性を決定するために使用され得る。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適な一致のためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され、「平均対角」は、使用される比較マトリクスの対角の平均であり、「対角」は、特定の比較マトリクスによって各完全アミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値である）、およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの｛分数（１／１０）｝倍である）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリクスが、アルゴリズムと併せて使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ ２５０比較マトリクスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）、ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリクスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９（１９９２）を参照されたい）も、アルゴリズムによって使用される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、次のパラメータを使用して、例えば、アルゴリズムＧＡＰ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３（１９７０）、比較マトリクス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ ６２、ならびにギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０、およびエンドギャップに対するペナルティなし。
【0037】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上のアミノ酸置換または挿入を含む。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換の形態であってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないように、１つのアミノ酸残基を別の残基で置換することを伴い得る。保存的アミノ酸置換は、次のアミノ酸の群内で行われ得る：親水性：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；脂肪族：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；さらに、典型的には、任意の残基がアラニンで置換されてもよい。
【0038】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸が、本発明の抗体への置換または挿入によって導入される。そのような非天然アミノ酸としては、共通アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトラリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、Ｃα－メチルアミノ酸、およびＮα－メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
本発明の抗体のアミノ酸配列バリアントは、本発明の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製され得る。そのようなバリアントとしては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の組み合わせは、最終構築物に到達するように作製され得るが、ただし、最終ポリペプチド産物が所望の特徴を有することを条件とする。バリアント（改変）ポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して調製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ変異誘発に供され得る。そのようなインビトロ変異誘発技術としては、ポリヌクレオチドを好適なベクターにサブクローニングすること、ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ－Ｉ ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「ミューテーター」株に形質転換すること、および形質転換された細菌を好適な数の世代に増殖させることが挙げられる。変異／改変ＤＮＡに由来する産物は、本明細書に記載される技術を使用して容易にスクリーニングされて、それらが受容体結合および／または阻害活性を有するかを決定することができる。アミノ酸配列バリアントの設計において、変異部位の位置および変異の性質は、修飾される特徴に依存する。変異部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸選択で置換し、次いで達成された結果に応じてより多くのラジカル選択で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）配置された部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個々にまたは順次に修飾され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列欠失は、約１～１５個の残基、より好ましくは約１～１０個の残基、および典型的には約１～５個の連続残基に及ぶ。
【0040】
いくつかの実施形態では、分子は、定義された配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、分子は、定義された配列からなる。いくつかの実施形態では、抗体は、単離抗体である。「単離抗体」という用語は、その自然環境中の別の／他の成分から分離および／もしくは回収されている抗体、ならびに／またはその自然環境中の成分の混合物から精製されている抗体を指す。本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、または非ヒト霊長類などの哺乳類種を含む、異なる種由来であってもよい。抗体は、齧歯類抗体、より具体的にはマウス抗体であってもよい。あるいは、抗体は、ニワトリなどの非哺乳類種由来であってもよい。抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
【0041】
本発明の抗体は、組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術などの当該技術分野において既知の方法に従って調製され得る。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）などのソースの文献全体にわたって記載および説明されている。
【0042】
ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を含む単鎖抗体は、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を宿主細胞中のプラスミドに挿入し、続いて、組換え技術、例えば、細菌細胞培養によって、この宿主細胞を使用して抗体を発現することによって調製され得、そのような方法は、当該技術分野において周知である。
【0043】
モノクローナル抗体は、典型的には、骨髄腫細胞を、所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合することによって作製される。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体をコードするトランスジェニック動物（例えば、マウスまたは他の好適な種）から得られ得る。あるいは、組換えモノクローナル抗体は、レパートリークローニングまたはファージディスプレイ／酵母ディスプレイと称される技術を伴って作製され得る。組換え抗体工学は、マウスではなくウイルスまたは酵母を使用して抗体を作製することを伴う。
【0044】
抗体の方法および使用
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定および／または定量化するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性リラグルチドまたは可溶性セマグルチドを含む溶液からリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを部分的に単離することを含む、単離するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。そのような同定および／または定量化は、抗体をフィブリルに結合し、続いて、結合した抗体を検出することによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して行われ得る。ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において既知のように行われ得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡ用の容器（マイクロタイタープレートなど）は、最初に飽和している。飽和は、リゾチームまたはアルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミンなどのタンパク質を伴い得る。いくつかの実施形態では、フィブリルに結合した本発明の抗体は、二次抗体に結合される。本発明の抗体がＦｃドメインを含む場合、二次抗体は、このＦｃドメインに結合し得る。二次抗体上にマーカーが存在する場合、二次抗体の検出および／または定量化が可能であり得、そのようなマーカーは、分光法を介して同定され得るフルオロフォアであり得る。定量化は、本発明の抗体に結合したフィブリルの標準を使用して行われ得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定および／または定量化するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性リラグルチドまたは可溶性セマグルチドを含む溶液からリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを部分的に単離することを含む、単離するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。そのような同定および／または定量化は、抗体をフィブリルに結合し、続いて、結合した抗体を検出することによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して行われ得る。ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において既知のように行われ得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡ用の容器（マイクロタイタープレートなど）は、最初に飽和している。飽和は、リゾチームまたはアルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミンなどのタンパク質を伴い得る。いくつかの実施形態では、フィブリルに結合した本発明の抗体は、二次抗体に結合される。本発明の抗体がＦｃドメインを含む場合、二次抗体は、このＦｃドメインに結合し得る。二次抗体上にマーカーが存在する場合、二次抗体の検出および／または定量化が可能であり得、そのようなマーカーは、分光法を介して同定され得るフルオロフォアであり得る。定量化は、本発明の抗体に結合したフィブリルの標準を使用して行われ得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、検出の最低限界を指し、これは、ある物質の、この物質が存在しない場合と区別され得る最低濃度である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される３の混合物／可溶性特異性比を指す。抗体およびＴｈＴアッセイを使用した検出限界の比較は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って行われ得る。抗体およびＴｈＴアッセイを使用した検出限界の比較は、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って行われ得る。いくつかの実施形態では、抗体に関して本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）またはアッセイ（ＩＶ）などの、ＥＬＩＳＡにおいて当該抗体を使用するアッセイの検出限界を指す。いくつかの実施形態では、抗体に関して本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）などの、ＥＬＩＳＡにおいて当該抗体を使用するアッセイの検出限界を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、２つ組で試験された対照試料の標準偏差の３倍であり、標準偏差は、スチューデントのｔ検定によって決定され得る。
【0046】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。
【0047】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、本明細書に定義される抗体の使用に関する。
【0048】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。いくつかの実施形態では、方法は、ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィブリルは、溶液中にある。いくつかの実施形態では、フィブリルは、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある。いくつかの実施形態では、フィブリルは、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある。
【0050】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）試料中の１つ以上のフィブリルが固体支持体上に固定化される条件下で、固体支持体を試料と接触させることと、（ｂ）抗体が１つ以上の固定化フィブリルに結合して、抗体－フィブリル複合体を形成する条件下で、固体支持体を、本明細書に記載される抗体のいずれか１つまたはその抗原結合断片と接触させることと、（ｃ）抗体－フィブリル複合体を、検出可能な標識を含む第２の抗体と接触させることとを含み、ここで、（ｉ）第２の抗体は、抗体－フィブリル複合体に特異的に結合し、（ｉｉ）検出可能な標識からのシグナルの検出は、試料中の１つ以上のフィブリルの存在を示す。
【0051】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）試料中に存在する場合、フィブリルが抗体に結合し、表面に固定化されて複合体を形成するように、フィブリル特異的抗体を含む固体支持体を試料と接触させることと、（ｂ）複合体を検出することとを含む。
【0052】
平面基板またはビーズの形態のポリマー材料から作製された固体支持体などが挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の固体支持体が、本明細書に記載される方法で使用され得る。例えば、固体支持体は、スライド、マルチウェルプレート、（例えば、９６ウェルプレート）、またはビーズ、例えば、ラテックス、アガロース、セファロース、ストレプトアビジン、トシル活性化、エポキシ、ポリスチレン、アミノビーズ、アミンビーズ、カルボキシルビーズなどであってもよい。ある特定の実施形態では、ビーズは、粒子、例えば、微粒子であってもよい。「ビーズ」および「粒子」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、実質的に球状の固体支持体を指す。「微粒子」および「マイクロビーズ」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、例えば、検出モジュール内のウェルのアレイなど、ウェルのアレイを占有するか、またはそこに定着することが許容されるマイクロビーズまたは微粒子を指す。タンパク質またはペプチドをプレートまたは微粒子などの固体支持体に付着させるために、当該技術分野において既知の様々な技術が使用され得る。例えば、米国特許第５，６２０，８５０号に記載される方法など、反応部分をタンパク質に付加するための幅広い技術が知られている。タンパク質の表面への付着のための方法は、例えば、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２３：１２８（１９９０）にも記載されている。
【0053】
固体支持体は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して、大量の試料と接触させられ得る。本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、試料中に１つ以上のフィブリルが存在する場合に結合相互作用が起こるように、固体支持体を試料中の１つ以上のフィブリルと十分に接近させる任意のタイプの混合作用を指す。接触は、試料をマルチウェルプレートまたは微粒子と混合することを含む、様々な異なる方法で達成され得る。接触は、必要な回数だけ繰り返され得る。インキュベーションは、例えば、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性洗剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）などの、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝液中にあってもよい。例えば、温度および塩濃度などの結合相互作用のための他の条件もまた、経験的に決定されてもよく、または製造業者の指示に基づいてもよい。例えば、接触は、室温（２１℃～２８℃、例えば、２３℃～２５℃）、３７℃、または４℃で行わ得る。本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」および「標識」という用語は、視覚または機器による手段によって検出可能であるシグナルを発生させることができる部分を指す。検出可能な標識は、例えば、色素原、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物などのシグナル発生物質であってもよい。一実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォアなどの蛍光化合物であってもよい。試料中のフィブリルの存在または量は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して決定（例えば、定量化）され得る。そのような方法としては、免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡが挙げられるが、これに限定されない。
【0054】
いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性リラグルチドおよび／またはモノマーリラグルチドを上回ってリラグルチドフィブリルを検出するためのアッセイに関し、本発明による抗体を含み、当該抗体は、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる。
【0055】
いくつかの実施形態では、「１つ（ａ）」は、「１つ以上」を意味する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、参照される値のマイナス１０％からプラス１０％の範囲を意味する。本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。
【0056】
発明を実施するための形態
本発明の非限定的な実施形態は、以下を含む。
１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体。
２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される、抗体。
３．セマグルチドフィブリルに結合する抗体。
４．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される、抗体。
５．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
６．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態１または２に記載の抗体。
７．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
８．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも１０倍など、少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
９．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態３または４に記載の抗体。
１０．当該抗体が、可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態３または４に記載の抗体。
１１．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１２．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
１４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
１７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
１８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
１９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、抗体。
２０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、抗体。
２１．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２２．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
２９．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
３０．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３１．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３２．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３３．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される当該検出限界、を有する、抗体。
３８．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ｃ．可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界、を有し、当該検出限界が、アッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、抗体。
３９．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４０．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１１５、および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
４６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
４７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
４８．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
４９．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５０．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５１．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５２．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５３．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５４．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５６．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５７．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５９．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ｍ．配列番号１１５、１１６、および１１７、
ｎ．配列番号 １２１、１２２、１２３、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａａ．配列番号１１８、１１９、および１２０、
ｂｂ．配列番号１２４、１２５、および１２６、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
６７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
６８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
６９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、実施形態３７～６８のいずれか１つに記載の抗体。
７０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、実施形態３７～６９のいずれか１つに記載の抗体。
７１．当該抗体が、単離抗体である、実施形態３７～７０のいずれか１つに記載の抗体。
７２．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７１のいずれか１つに記載の抗体。
７３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、実施形態３７～７２のいずれか１つに記載の抗体。
７４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７３のいずれか１つに記載の抗体。
７５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７４のいずれか１つに記載の抗体。
７６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７５のいずれか１つに記載の抗体。
７７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７６のいずれか１つに記載の抗体。
７８．当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される、検出限界、および／または
ｃ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルが、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界が、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される、検出限界、を有する、実施形態３７～７７のいずれか１つに記載の抗体。
７９．当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、実施形態３７～７８のいずれか１つに記載の抗体。
８０．当該抗体が、７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～７９のいずれか１つに記載の抗体。
８１．当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～８０のいずれか１つに記載の抗体。
８２．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。
８３．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。００
８４．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８６．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、実施形態８４または８５に記載の方法。
８７．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．当該フィブリルが、溶液中にある、実施形態８４～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、実施形態８４～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、実施形態８４～８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．可溶性リラグルチドおよび／またはモノマーリラグルチドよりもリラグルチドフィブリルを選択的に検出するためのアッセイであって、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を含み、当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、アッセイ。
本発明の非限定的な実施形態は、以下を含む。
１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体。
２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される、抗体。
３．セマグルチドフィブリルに結合する抗体。
４．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される、抗体。
５．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
６．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態１または２に記載の抗体。
７．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
８．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも１０倍など、少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
９．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態３または４に記載の抗体。
１０．当該抗体が、可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態３または４に記載の抗体。
１１．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１２．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
１４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
１７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
１８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
１９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、抗体。
２０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、抗体。
２１．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２２．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
２９．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
３０．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３１．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３２．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３３．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される当該検出限界、を有する、抗体。
３８．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ｃ．可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界、を有し、当該検出限界が、アッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、抗体。
３９．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４０．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１１５、および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
４６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
４７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
４８．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
４９．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５０．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５１．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５２．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５３．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５４．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５６．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５７．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５９．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ｍ．配列番号１１５、１１６、および１１７、
ｎ．配列番号 １２１、１２２、１２３、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａａ．配列番号１１８、１１９、および１２０、
ｂｂ．配列番号１２４、１２５、および１２６、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
６７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
６８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
６９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、実施形態３７～６８のいずれか１つに記載の抗体。
７０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、実施形態３７～６９のいずれか１つに記載の抗体。
７１．当該抗体が、単離抗体である、実施形態３７～７０のいずれか１つに記載の抗体。
７２．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７１のいずれか１つに記載の抗体。
７３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、実施形態３７～７２のいずれか１つに記載の抗体。
７４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７３のいずれか１つに記載の抗体。
７５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７４のいずれか１つに記載の抗体。
７６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７５のいずれか１つに記載の抗体。
７７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７６のいずれか１つに記載の抗体。
７８．当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される、検出限界、および／または
ｃ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルが、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界が、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される、検出限界、を有する、実施形態３７～７７のいずれか１つに記載の抗体。
７９．当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、実施形態３７～７８のいずれか１つに記載の抗体。
８０．当該抗体が、７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～７９のいずれか１つに記載の抗体。
８１．当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～８０のいずれか１つに記載の抗体。
８２．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。
８３．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。００
８４．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８６．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、実施形態８４または８５に記載の方法。
８７．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．当該フィブリルが、溶液中にある、実施形態８４～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、実施形態８４～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、実施形態８４～８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．可溶性リラグルチドおよび／またはモノマーリラグルチドよりもリラグルチドフィブリルを選択的に検出するためのアッセイであって、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を含み、当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、アッセイ。
【実施例】
【0057】
略語リスト
・ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４を調整した、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４の水溶液）
・ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
・ｓｃＦｖ－Ｆｃ：Ｆｃドメインに連結した単鎖可変断片
・ＴｈＴ：チオフラビンＴ
・ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４を調整した、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４の水溶液）
・ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
・ｓｃＦｖ－Ｆｃ：Ｆｃドメインに連結した単鎖可変断片
・ＴｈＴ：チオフラビンＴ
【0058】
材料および方法
選択された抗体バリアントの抗体ライブラリ調製、選別、およびクローニング
抗体を、ライブラリ選別の２つの段階を通して単離した。選別の第１の段階において、４Ｄ５ ｓｃＦｖの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）の多様性によって、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）酵母表面ディスプレイライブラリを生成したｓｃＦｖを、可動性リンカーを介して酵母Ａｇａ２タンパク質のＣ末端に遺伝的に融合し、細胞表面上の抗体ディスプレイを可能にした。酵母ディスプレイ抗体ライブラリを、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１４２０３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に固定化されたリラグルチドフィブリル（および対照としての可溶性リラグルチド）への結合によって選別した。ビーズを調製するために、８×１０７個のビーズを最初に１ｍＬの滅菌ＰＢＳで洗浄（２×）した。可溶性リラグルチド（１００μｇ、薬物組成物緩衝液中６ｍｇ／ｍＬのストックから）を、磁気ビーズを含有するＰＢＳ中に希釈し（最終体積８００μＬ）、一晩ビーズに結合した（撹拌することなく４℃）。フィブリル状リラグルチドでコーティングされたビーズについては、１００μｇのリラグルチドフィブリルを、回転混合しながら室温で一晩、８００μＬのＰＢＳ中のビーズに結合した。翌日、１０ｍＭのグリシンを補充した１ｍＬのＰＢＳでビーズを洗浄（２×）して、ビーズ上の未反応のトルエンスルホニル基をクエンチし、次いで、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳ－Ｂ）を補充した１ｍＬのＰＢＳを使用して洗浄（２×）した後、酵母とインキュベーションした。１％のミルクを補充したＰＢＳ－Ｂ中のリラグルチドフィブリルでコーティングしたビーズに対して、８回の正の選択を実施した。リラグルチドフィブリルに対する立体配座特異的抗体を有する酵母を単離するために、最後の３回の選別は、リラグルチドフィブリルに対する正の選択の前にＰＢＳ－Ｂ中の可溶性リラグルチドでコーティングされたビーズに対して実施した負の選択を組み込んだ。
選択された抗体バリアントの抗体ライブラリ調製、選別、およびクローニング
抗体を、ライブラリ選別の２つの段階を通して単離した。選別の第１の段階において、４Ｄ５ ｓｃＦｖの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）の多様性によって、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）酵母表面ディスプレイライブラリを生成したｓｃＦｖを、可動性リンカーを介して酵母Ａｇａ２タンパク質のＣ末端に遺伝的に融合し、細胞表面上の抗体ディスプレイを可能にした。酵母ディスプレイ抗体ライブラリを、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１４２０３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に固定化されたリラグルチドフィブリル（および対照としての可溶性リラグルチド）への結合によって選別した。ビーズを調製するために、８×１０７個のビーズを最初に１ｍＬの滅菌ＰＢＳで洗浄（２×）した。可溶性リラグルチド（１００μｇ、薬物組成物緩衝液中６ｍｇ／ｍＬのストックから）を、磁気ビーズを含有するＰＢＳ中に希釈し（最終体積８００μＬ）、一晩ビーズに結合した（撹拌することなく４℃）。フィブリル状リラグルチドでコーティングされたビーズについては、１００μｇのリラグルチドフィブリルを、回転混合しながら室温で一晩、８００μＬのＰＢＳ中のビーズに結合した。翌日、１０ｍＭのグリシンを補充した１ｍＬのＰＢＳでビーズを洗浄（２×）して、ビーズ上の未反応のトルエンスルホニル基をクエンチし、次いで、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳ－Ｂ）を補充した１ｍＬのＰＢＳを使用して洗浄（２×）した後、酵母とインキュベーションした。１％のミルクを補充したＰＢＳ－Ｂ中のリラグルチドフィブリルでコーティングしたビーズに対して、８回の正の選択を実施した。リラグルチドフィブリルに対する立体配座特異的抗体を有する酵母を単離するために、最後の３回の選別は、リラグルチドフィブリルに対する正の選択の前にＰＢＳ－Ｂ中の可溶性リラグルチドでコーティングされたビーズに対して実施した負の選択を組み込んだ。
【0059】
ライブラリ選別の第２の段階（親和性成熟）において、選別の第１の段階からの最良のクローンのうちの１つのために、サブライブラリを設計した。第二世代ライブラリは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ３、およびＨＣＤＲ２における部位を多様化した。このライブラリを、リラグルチドフィブリルに対して４回の選択に供した。最初の２回の選別は、固定化されたリラグルチドフィブリルに対する正の選択の前に、可溶性リラグルチド（磁気ビーズ上に固定化された）に対する２つの連続的な負の選択を組み込んだ。負の選択をＰＢＳ－Ｂ中で実施した一方で、正の選択を、１％のミルクを補充したＰＢＳ－Ｂ中で行った。また、グルカゴンフィブリルでコーティングされたビーズに対して、３回目および４回目で３連続の負の選択を実施した。グルカゴンフィブリルでコーティングされたビーズを、すでに記載されているように調製した（Ｓｔｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
【0060】
選択された抗体を、すでに記載されているように、哺乳類発現ベクター抗Ｎｏｔｃｈ１＿Ｅ６－ｐＢＩＯＣＡＭ５にクローニングした（Ｓｔｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。簡潔に述べると、挿入物および骨格プラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製およびライゲーションした。サンガー配列決定によってｓｃＦｖコード断片の挿入を確認した。これらのプラスミドは、抗体のＣ末端上に６ｘＨｉｓタグおよび３ｘＦＬＡＧタグを有する二価ｓｃＦｖ－ヒトＦｃ融合タンパク質を発現する。
【0061】
抗体発現および精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現系（カタログ番号Ａ１４６３５）でタンパク質を発現した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、細胞が１ｍＬ当たり約３～５百万個の生細胞密度に達するまで継代培養および増殖した。プラスミド（３０μｇ）を２５ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３およびプラスミドＤＮＡの複合体を、製造業者のガイダンスに記載されるように調製した。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈し、穏やかなピペット操作を介して混合した。５分間のインキュベーション後、希釈されたトランスフェクション試薬を希釈されたＤＮＡと混合した。トランスフェクション試薬およびＤＮＡの複合体を、室温で２０分間インキュベーションし、Ｅｘｐｉ２９３細胞に添加した。細胞を、振盪しながら３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。製造業者の指示に従って、エンハンサー１および２溶液を（トランスフェクション後）２０時間後に細胞に添加した。３日後、分泌抗体を含有する培地を採取し、３４００×ｇで４５分間遠心分離して、細胞および関連残屑を除去した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現系（カタログ番号Ａ１４６３５）でタンパク質を発現した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、細胞が１ｍＬ当たり約３～５百万個の生細胞密度に達するまで継代培養および増殖した。プラスミド（３０μｇ）を２５ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３およびプラスミドＤＮＡの複合体を、製造業者のガイダンスに記載されるように調製した。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈し、穏やかなピペット操作を介して混合した。５分間のインキュベーション後、希釈されたトランスフェクション試薬を希釈されたＤＮＡと混合した。トランスフェクション試薬およびＤＮＡの複合体を、室温で２０分間インキュベーションし、Ｅｘｐｉ２９３細胞に添加した。細胞を、振盪しながら３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。製造業者の指示に従って、エンハンサー１および２溶液を（トランスフェクション後）２０時間後に細胞に添加した。３日後、分泌抗体を含有する培地を採取し、３４００×ｇで４５分間遠心分離して、細胞および関連残屑を除去した。
【0062】
プロテインＡクロマトグラフィーを使用して抗体を精製した。プロテインＡビーズ（２０３３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ２．５）と２０分間インキュベーションした。次に、ビーズをＰＢＳで洗浄し、次いで０．５ｍＬのビーズを３０ｍＬの浄化培地に添加し、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、プロテインＡビーズを有する培地を１０ｍＬの精製カラム（８９８９８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。真空濾過を介してビーズを収集し、ＰＢＳ（１００ｍＬ）で十分に洗浄した。次いで、タンパク質Ａビーズを、２ｍＬの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で１５分間インキュベーションし、緩衝液（溶出タンパク質を含む）を遠心分離によって収集した。次いで、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（８９８９１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、溶出抗体をＰＢＳに緩衝液交換した。２８０ｎｍでの吸光度測定を介してタンパク質濃度をアッセイした（１６８，４６０～２０５，３６０Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数）。
【0063】
サイズ排除クロマトグラフィー
分析および分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。泳動緩衝液は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのカリウムナトリウム、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１．８ｍＭのリン酸二水素カリウム、および２００ｍＭのアルギニンであった。カラム流速は、０．７５ｍＬ／分であった。抗体試料（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、カラム（ＧＥ ２８９９０９４４、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム、内径１０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に注入（１００μＬ）し、２２０および２８０ｎｍで吸光度シグナルをモニタリングした。分取ＳＥＣについては、ＦＲＣ－１０Ａ画分収集器を使用してモノマー画分を単離した。
分析および分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。泳動緩衝液は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのカリウムナトリウム、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１．８ｍＭのリン酸二水素カリウム、および２００ｍＭのアルギニンであった。カラム流速は、０．７５ｍＬ／分であった。抗体試料（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、カラム（ＧＥ ２８９９０９４４、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム、内径１０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に注入（１００μＬ）し、２２０および２８０ｎｍで吸光度シグナルをモニタリングした。分取ＳＥＣについては、ＦＲＣ－１０Ａ画分収集器を使用してモノマー画分を単離した。
【0064】
アッセイ（Ｉ）：リラグルチドフィブリルの調製
６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドの試験溶液を、薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）中で調製し、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して最終ｐＨを８．１５に調整し、続いて、シリンジ濾過（０．２２μｍのＰＥＳフィルター）した。１ｍＬのリラグルチド溶液のアリコートを、マイクロ遠心管に分配し、単一の３ｍｍガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドの試験溶液を、薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）中で調製し、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して最終ｐＨを８．１５に調整し、続いて、シリンジ濾過（０．２２μｍのＰＥＳフィルター）した。１ｍＬのリラグルチド溶液のアリコートを、マイクロ遠心管に分配し、単一の３ｍｍガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
【0065】
陽性のＴｈＴシグナルを使用して、管からの試験溶液の少量の試料（約７５μＬ）を除去することによって、フィブリル形成をモニタリングし、これを本明細書に記載されるアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）に従って分析した。試料が、本明細書のアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）において新たに調製された試験溶液よりも少なくとも５倍高い蛍光を示した場合、フィブリルを２２１，０００×ｇ（１時間、４℃）で沈殿させた。フィブリル、例えば、ゲル状フィブリルが、管の底部で観察された。上清を管から除去した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）による分析のために上清を保持）。ペレットを、ｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液で１回穏やかに洗浄し（ペレットを乱すことなく）、次いで、元の体積のｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（ＴｈＴ分析のために除去されたいかなる体積も考慮に入れて）、４℃で保存した。フィブリルの濃度を、本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）に従って決定した。この計算が正確であるためには、遠心分離後にフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。
【0066】
アッセイ（ＩＩ）：セマグルチドフィブリルの調製
ｐＨ６．９に調整された（必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して）、任意に５０ｍＭのＮａＣｌを含む６ｍｇ／ｍＬのセマグルチド、および薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）の試験溶液を、マイクロ遠心管に１ｍＬのアリコートで入れ、単一の３ｍｍのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
ｐＨ６．９に調整された（必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して）、任意に５０ｍＭのＮａＣｌを含む６ｍｇ／ｍＬのセマグルチド、および薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）の試験溶液を、マイクロ遠心管に１ｍＬのアリコートで入れ、単一の３ｍｍのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
【0067】
陽性のＴｈＴシグナルを使用して、管からの試験溶液の少量の試料（約７５μＬ）を除去することによって、フィブリル形成をモニタリングし、これを本明細書に記載されるアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）に従って分析した。試料が、アッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）において、ｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液中の新たに調製されたセマグルチドよりも少なくとも５倍高い蛍光を示した場合、フィブリルを２２１，０００×ｇ（１時間、４℃）で沈殿させた。フィブリル、例えば、ゲル状フィブリルが、管の底部で観察された。上清を管から除去した（アッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）による分析のために上清を保持）。ペレットを、ｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液で１回穏やかに洗浄し（ペレットを乱すことなく）、次いで、元の体積のｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（ＴｈＴ分析のために除去されたいかなる体積も考慮に入れて）、４℃で保存した。フィブリルの濃度を、本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）に従って決定した。この計算が正確であるためには、遠心分離後にフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。
【0068】
アッセイ（ＩＩＩ）：抗体特異性比（方法１）
抗体特異性比を以下のように決定した：
１．ＥＬＩＳＡプレート調製（３プレート）：
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
２．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
３．翌日、各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
４．各ウェルに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充した３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートをブロッキングした。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間インキュベーションした。
５．プレートがブロッキングされている間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した。
６．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した
７．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。各抗体を、２つ組（すなわち、１プレート当たり各抗体に対して２ウェル）で試験した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
８．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
９．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１０．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１１．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１２．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１３．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１４．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
抗体特異性比を以下のように決定した：
１．ＥＬＩＳＡプレート調製（３プレート）：
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
２．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
３．翌日、各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
４．各ウェルに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充した３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートをブロッキングした。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間インキュベーションした。
５．プレートがブロッキングされている間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した。
６．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した
７．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。各抗体を、２つ組（すなわち、１プレート当たり各抗体に対して２ウェル）で試験した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
８．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
９．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１０．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１１．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１２．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１３．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１４．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
【0069】
アッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）：抗体特異性比（方法１Ｂ）
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
３．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間、撹拌することなくインキュベーションした。
４．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した（濃度の別段の定めがない限り）。
５．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
６．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
７．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
８．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）を添加することによって、プレートを３回洗浄した。
９．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１０．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１１．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１２．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１３．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
３．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間、撹拌することなくインキュベーションした。
４．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した（濃度の別段の定めがない限り）。
５．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
６．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
７．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
８．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）を添加することによって、プレートを３回洗浄した。
９．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１０．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１１．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１２．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１３．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
【0070】
アッセイ（ＩＶ）：抗体特異性比（方法２）
抗体特異性比を以下のように決定した：
アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
抗体特異性比を以下のように決定した：
アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
【0071】
アッセイの日：
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．１μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した。
４．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
５．上記の（３）からの１００μＬの各試料または対照を、新たに洗浄されたプレートのウェルに分配し、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間撹拌することなくインキュベーションした。
６．上記の３時間のインキュベーション中、試験される約７５μＬの抗体（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質）を２１，０００×ｇで５分間スピンさせて、いかなる粒子状物質も沈殿させた。上清を除去し、この上清のＡ２８０ｎｍを決定して抗体の濃度を計算した。抗体を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｇ／ＬのＢＳＡ中、５ｎＭに段階希釈し、使用するまで氷上で保持した。
７．３時間のインキュベーションの終了時に、プレートのウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
８．１００μＬの５ｎＭ抗体を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
９．上記の１時間のインキュベーション中、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｇ／ＬのＢＳＡ中１：１０００に希釈した。
１０．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１１．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
１２．二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化した。２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１３．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１４．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、１０分間インキュベーションした。
１５．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１６．４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において読み取った。
計算：フィブリルを含むウェル内の各抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルを、可溶性リラグルチドを有し、かつフィブリルがない対照ウェル中の同じ抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルで割った。この比は、混合物／可溶性特異性比である。例えば、所与の抗体が、可溶性リラグルチドとの混合物中０．１μＭのリラグルチドフィブリルについて１．５のシグナル、および可溶性リラグルチド（フィブリルを欠く）について０．０５のシグナルをもたらした場合、混合物／可溶性特異性比は、１．５／０．０５＝３０である。
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．１μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した。
４．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
５．上記の（３）からの１００μＬの各試料または対照を、新たに洗浄されたプレートのウェルに分配し、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間撹拌することなくインキュベーションした。
６．上記の３時間のインキュベーション中、試験される約７５μＬの抗体（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質）を２１，０００×ｇで５分間スピンさせて、いかなる粒子状物質も沈殿させた。上清を除去し、この上清のＡ２８０ｎｍを決定して抗体の濃度を計算した。抗体を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｇ／ＬのＢＳＡ中、５ｎＭに段階希釈し、使用するまで氷上で保持した。
７．３時間のインキュベーションの終了時に、プレートのウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
８．１００μＬの５ｎＭ抗体を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
９．上記の１時間のインキュベーション中、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｇ／ＬのＢＳＡ中１：１０００に希釈した。
１０．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１１．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
１２．二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化した。２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１３．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１４．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、１０分間インキュベーションした。
１５．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１６．４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において読み取った。
計算：フィブリルを含むウェル内の各抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルを、可溶性リラグルチドを有し、かつフィブリルがない対照ウェル中の同じ抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルで割った。この比は、混合物／可溶性特異性比である。例えば、所与の抗体が、可溶性リラグルチドとの混合物中０．１μＭのリラグルチドフィブリルについて１．５のシグナル、および可溶性リラグルチド（フィブリルを欠く）について０．０５のシグナルをもたらした場合、混合物／可溶性特異性比は、１．５／０．０５＝３０である。
【0072】
アッセイ（Ｖ）：ＴｈＴアッセイ
ペプチドの試験溶液を、フィブリル形成直後のフィブリルの存在について分析した。フィブリル形成前のペプチド濃度は、６ｍｇ／ｍＬであった。ペプチドは、リラグルチドまたはセマグルチドであってもよい。リラグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製され得る。セマグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製され得る。試験溶液の７５μＬの試料を、１．３６μＬのＴｈＴ原液（ストック濃度：２２００μＭのＴｈＴ）と混合して、ペプチド／ＴｈＴ混合物中４０μＭの最終ＴｈＴ濃度に到達した。リラグルチドの場合、この混合物中の最終濃度は、１５７１μＭのリラグルチドであった（フィブリル化前に計算）。ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加し、５～１０分後、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。
ペプチドの試験溶液を、フィブリル形成直後のフィブリルの存在について分析した。フィブリル形成前のペプチド濃度は、６ｍｇ／ｍＬであった。ペプチドは、リラグルチドまたはセマグルチドであってもよい。リラグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製され得る。セマグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製され得る。試験溶液の７５μＬの試料を、１．３６μＬのＴｈＴ原液（ストック濃度：２２００μＭのＴｈＴ）と混合して、ペプチド／ＴｈＴ混合物中４０μＭの最終ＴｈＴ濃度に到達した。リラグルチドの場合、この混合物中の最終濃度は、１５７１μＭのリラグルチドであった（フィブリル化前に計算）。ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加し、５～１０分後、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。
【0073】
アッセイ（ＶＩ）：抗体アッセイと比較したＴｈＴアッセイ
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ａ．この時点で、可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液（ステップ３からの）を、オボアルブミンコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ検出前に室温で２時間インキュベーションした。残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＩＶ）（ステップ７以降）に記載されるように実施した。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、４０μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ａ．この時点で、可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液（ステップ３からの）を、オボアルブミンコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ検出前に室温で２時間インキュベーションした。残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＩＶ）（ステップ７以降）に記載されるように実施した。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、４０μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
【0074】
アッセイ（ＶＩ－Ｂ）：抗体アッセイと比較したＴｈＴアッセイ
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．アッセイの日、リラグルチド混合物をＢＳＡコーティングプレートに固定化した。
ａ．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
ｂ．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
ｃ．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ｄ．可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液を、ＢＳＡコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、室温で３時間インキュベーションした。
３．残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＶＩ）について記載されるように、いくつかの修正を加えて実施した。
ａ．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を補充したＰＢＳ中で５０ｎＭに段階希釈した。
ｂ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｃ．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
ｄ．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
ｅ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｆ．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
ｇ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｈ．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
ｉ．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
ｊ．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、０．４μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．アッセイの日、リラグルチド混合物をＢＳＡコーティングプレートに固定化した。
ａ．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
ｂ．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
ｃ．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ｄ．可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液を、ＢＳＡコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、室温で３時間インキュベーションした。
３．残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＶＩ）について記載されるように、いくつかの修正を加えて実施した。
ａ．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を補充したＰＢＳ中で５０ｎＭに段階希釈した。
ｂ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｃ．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
ｄ．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
ｅ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｆ．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
ｇ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｈ．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
ｉ．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
ｊ．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、０．４μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
【0075】
アッセイ（ＶＩＩ）：ＢＣＡアッセイ
リラグルチドをリラグルチドフィブリルの標準として、およびセマグルチドをセマグルチドフィブリルの標準として用いて（ＢＳＡではない）、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）を使用して、フィブリル（例えば、リラグルチドフィブリル）の濃度を決定した。薬物組成物緩衝液からのフェノールが、試料希釈に応じて様々な程度までＢＣＡ試薬と反応するため、定量化のために対照を実験してフェノールから生じるバックグラウンドシグナルを説明した。フィブリル集合中の初期濃度（６ｍｇ／ｍＬ）から上清中のペプチド濃度（超遠心分離後）を引くことによって、本明細書のアッセイ（Ｉ）またはアッセイ（ＩＩ）からの再懸濁されたフィブリル溶液中のフィブリルの濃度を決定した。リラグルチドフィブリルの分析を、以下に記載されるように行った：
１．リラグルチドを、６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５で溶解した。これを、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．標準については、可溶性リラグルチド溶液を（１）からＰＢＳ中に、２０００、１５００、１０００、７５０、５００、２５０、１２５、２５、および０μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、ＰＢＳ中に希釈された同量の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有する（がペプチドを欠く）「ブランク」を調製した。例えば、２０００μｇ／ｍＬの標準を６００μｇ／Ｌ作製するためには、（１）からの２００μＬの溶液および４００μＬのＰＢＳを必要とする。ブランクを作製するために、２００μＬの薬物組成物緩衝液（ペプチドなし）および４００μＬのＰＢＳを混合した。
３．本明細書のアッセイ（Ｉ）から得られた超遠心分離されたフィブリル（薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５中）からの上清を、以下の希釈でＰＢＳ中に希釈した：１：２、１；４、１：８、１：１６、１：３２。同じ希釈でＰＢＳ中に希釈された薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有するこれらの試料について、「ブランク」も調製した。
４．透明（結合なしまたは低結合）の平底９６ウェルプレートの各ウェルに、１０μＬの標準（および対応するブランクを有する別個のウェル）、および１０μＬの希釈された試料（および対応するブランクを有する別個のウェル）を添加した。
５．ＢＣＡ Ｗｏｒｋｉｎｇ試薬を作り、２２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを接着フィルムで覆った。
６．プレートを、紫色の形成が十分になるまで３７℃でインキュベーションした（これは概して、比較的迅速に起こり、ある程度の色は多くの場合、ほぼすぐに一部の試料で目に見える）。
７．５６２ｎｍのプレートリーダーで吸光度を読み取った。
８．標準についての「ブランク」吸光度値を、標準についての値から引いた。ペプチド濃度対吸光度をプロットし、二次多項式をフィッティングすることによって、標準曲線を、得られる（バックグラウンド減算された）吸光度にフィッティングした。
９．上清についての「ブランク」吸光度値を上清希釈についての値から引いた。（８）からの標準曲線を使用して、上清試料のペプチド濃度を決定し、それらの希釈倍率を掛けて、未希釈上清中のリラグルチド濃度を計算した。約２５０～１０００μｇ／ｍＬの範囲の計算濃度を有する試料が好ましい（これは、ＢＣＡアッセイの正確な範囲の中間である）。
１０．フィブリルが６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の濃度で集合したため、上清のペプチド濃度をこれから引いて、再懸濁された試料中のフィブリルの濃度を得た。この計算が正確であるためには、遠心分離後にアッセイ（Ｉ）のフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。
リラグルチドをリラグルチドフィブリルの標準として、およびセマグルチドをセマグルチドフィブリルの標準として用いて（ＢＳＡではない）、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）を使用して、フィブリル（例えば、リラグルチドフィブリル）の濃度を決定した。薬物組成物緩衝液からのフェノールが、試料希釈に応じて様々な程度までＢＣＡ試薬と反応するため、定量化のために対照を実験してフェノールから生じるバックグラウンドシグナルを説明した。フィブリル集合中の初期濃度（６ｍｇ／ｍＬ）から上清中のペプチド濃度（超遠心分離後）を引くことによって、本明細書のアッセイ（Ｉ）またはアッセイ（ＩＩ）からの再懸濁されたフィブリル溶液中のフィブリルの濃度を決定した。リラグルチドフィブリルの分析を、以下に記載されるように行った：
１．リラグルチドを、６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５で溶解した。これを、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．標準については、可溶性リラグルチド溶液を（１）からＰＢＳ中に、２０００、１５００、１０００、７５０、５００、２５０、１２５、２５、および０μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、ＰＢＳ中に希釈された同量の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有する（がペプチドを欠く）「ブランク」を調製した。例えば、２０００μｇ／ｍＬの標準を６００μｇ／Ｌ作製するためには、（１）からの２００μＬの溶液および４００μＬのＰＢＳを必要とする。ブランクを作製するために、２００μＬの薬物組成物緩衝液（ペプチドなし）および４００μＬのＰＢＳを混合した。
３．本明細書のアッセイ（Ｉ）から得られた超遠心分離されたフィブリル（薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５中）からの上清を、以下の希釈でＰＢＳ中に希釈した：１：２、１；４、１：８、１：１６、１：３２。同じ希釈でＰＢＳ中に希釈された薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有するこれらの試料について、「ブランク」も調製した。
４．透明（結合なしまたは低結合）の平底９６ウェルプレートの各ウェルに、１０μＬの標準（および対応するブランクを有する別個のウェル）、および１０μＬの希釈された試料（および対応するブランクを有する別個のウェル）を添加した。
５．ＢＣＡ Ｗｏｒｋｉｎｇ試薬を作り、２２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを接着フィルムで覆った。
６．プレートを、紫色の形成が十分になるまで３７℃でインキュベーションした（これは概して、比較的迅速に起こり、ある程度の色は多くの場合、ほぼすぐに一部の試料で目に見える）。
７．５６２ｎｍのプレートリーダーで吸光度を読み取った。
８．標準についての「ブランク」吸光度値を、標準についての値から引いた。ペプチド濃度対吸光度をプロットし、二次多項式をフィッティングすることによって、標準曲線を、得られる（バックグラウンド減算された）吸光度にフィッティングした。
９．上清についての「ブランク」吸光度値を上清希釈についての値から引いた。（８）からの標準曲線を使用して、上清試料のペプチド濃度を決定し、それらの希釈倍率を掛けて、未希釈上清中のリラグルチド濃度を計算した。約２５０～１０００μｇ／ｍＬの範囲の計算濃度を有する試料が好ましい（これは、ＢＣＡアッセイの正確な範囲の中間である）。
１０．フィブリルが６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の濃度で集合したため、上清のペプチド濃度をこれから引いて、再懸濁された試料中のフィブリルの濃度を得た。この計算が正確であるためには、遠心分離後にアッセイ（Ｉ）のフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。
【0076】
本明細書のアッセイ（Ｉ）への参照が、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に置き換えられるべきであることを除いて、同様の手順がセマグルチドフィブリルに使用されてもよい。
【0077】
結果
［実施例１］［抗体］
表１に列挙されるアミノ酸配列を有する抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を、組換え発現によって調製し、精製した。
［実施例１］［抗体］
表１に列挙されるアミノ酸配列を有する抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を、組換え発現によって調製し、精製した。
【0078】
表１は、各抗体の完全配列を列挙し、太字のテキストは、ＣＤＲの位置（Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の順で示される）を示し、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ抗体ナンバリングスキームに従って定義した。表２は、表１の抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ配列）、重鎖の可変領域（ＶＨ配列）のアミノ酸配列を列挙する。表３は、表１の抗体のＣＤＲを列挙する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表2-1】
【表2-2】
【表3-1】
【表3-2】
【0079】
［実施例２］［抗体のリラグルチドフィブリル特異性］
実施例１の抗体を、バックグラウンドおよび／または可溶性リラグルチドと比較して、リラグルチドフィブリルに結合するそれらの能力について個々に試験した。本明細書に定義されるアッセイ（ＩＩＩ）またはアッセイ（ＩＶ）に従って、試験を行った。結果を表４および５に示す。
実施例１の抗体を、バックグラウンドおよび／または可溶性リラグルチドと比較して、リラグルチドフィブリルに結合するそれらの能力について個々に試験した。本明細書に定義されるアッセイ（ＩＩＩ）またはアッセイ（ＩＶ）に従って、試験を行った。結果を表４および５に示す。
【表4】
【表5】
【0080】
表４および５の結果は、試験された抗体が可溶性リラグルチドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。表４の結果はまた、試験された抗体が、バックグラウンドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。表５の結果は、試験された抗体が、高濃度の可溶性リラグルチドの混合物中で試験された場合、有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することもできることを示す。
【0081】
［実施例３］［ＴｈＴアッセイと比較したリラグルチドフィブリル－抗体の検出感度］
ＴｈＴアッセイを、過剰な可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験して、本発明の抗体との感度の比較を可能にした。本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って実験を行った。結果を表６に示す。
ＴｈＴアッセイを、過剰な可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験して、本発明の抗体との感度の比較を可能にした。本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って実験を行った。結果を表６に示す。
【表6】
【0082】
［実施例４］［リラグルチド抗体の濃度依存性結合分析］
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去によって増強された。これらの変化は、アッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去によって増強された。これらの変化は、アッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
【0083】
実施例１の抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、二段階精製し（９５％超のモノマー）、バックグラウンドおよび／または可溶性リラグルチドと比較して、リラグルチドフィブリルにそれらの結合する能力について個々に試験した。本明細書のアッセイ（（ＩＩＩ－Ｂ）に従って、試験を行った。結果を表７（凝集性リラグルチドおよび可溶性リラグルチドについての未加工の（バックグラウンド減算されていない）抗体結合シグナル）、ならびに表８（抗体のリラグルチドフィブリル特異性（リラグルチドフィブリル／モノマーリラグルチド））に示す。３つの独立した実験を実施し、報告された値は、平均である。
【表7】
【表8】
【0084】
表７および８の結果は、試験された抗体が可溶性リラグルチドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。
【0085】
二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）の異なるバッチにおける抗体凝集体の量を制御することがより容易であるため、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、一段階精製された抗体（５％超の抗体凝集体）を使用した以前のアッセイ（ＩＩＩ）よりもアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）をより再現性のあるものにするという利点を有することも観察された。抗体凝集体がリラグルチドフィブリルへの結合に寄与したため、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した抗体凝集体の除去により、低抗体濃度での抗体感度が低下した。しかしながら、抗体純度の上昇は、より低いバックグラウンドシグナルのため、より高い抗体濃度の使用を可能にし、これは、アッセイ感度の改善を可能にした。
【0086】
［実施例５］［ＴｈＴアッセイと比較したリラグルチドフィブリル－抗体の検出感度］
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去、および抗体濃度の増加（５から５０ｎＭ）によって増強され、アッセイ（ＶＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去、および抗体濃度の増加（５から５０ｎＭ）によって増強され、アッセイ（ＶＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
【0087】
ＴｈＴアッセイを、過剰な可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験して、本発明の抗体Ｍとの感度の比較を可能にした。本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って実験を行った。結果を表９に示す。
【表9】
【0088】
表９の結果は、リラグルチドフィブリルを検出するための本発明の抗体の感度が、ＴｈＴアッセイよりも桁違いに高いことを示す。さらに、本発明の抗体が、シグナルがＴｈＴアッセイで記録されなかったフィブリルの濃度で、リラグルチドフィブリルを検出したこともわかった。
【0089】
二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）の異なるバッチにおける抗体凝集体の量を制御することがより容易であるため、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、一段階精製された抗体（５％超の抗体凝集体）を使用した以前のアッセイ（ＶＩ）よりもアッセイ（ＶＩ－Ｂ）をより再現性のあるものにするという利点を有することも観察された。抗体凝集体がリラグルチドフィブリルへの結合に寄与したため、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した抗体凝集体の除去により、低抗体濃度（例えば、５ｎＭ）での抗体感度が低下した。しかしながら、抗体純度の上昇は、より低いバックグラウンドシグナルのため、より高い抗体濃度（５ｎＭの代わりに５０ｎＭ）の使用を可能にし、これは、アッセイ感度の改善を可能にした。
【0090】
［実施例６］［９５％超のモノマー純度を有する抗体の再現性］
実施例１の抗体Ｍを二段階精製し（９５％超のモノマー）、可溶性リラグルチドと比較した、過剰な可溶性リラグルチドの存在下でリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験した。本明細書のアッセイ（（ＶＩ－Ｂ）に従って、試験を行った。抗体の２つの異なるバッチを試験し、合計４つの独立した実験を実施した。結果を表１０に示す。
実施例１の抗体Ｍを二段階精製し（９５％超のモノマー）、可溶性リラグルチドと比較した、過剰な可溶性リラグルチドの存在下でリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験した。本明細書のアッセイ（（ＶＩ－Ｂ）に従って、試験を行った。抗体の２つの異なるバッチを試験し、合計４つの独立した実験を実施した。結果を表１０に示す。
【表10】
【0091】
表１０の結果は、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、非常に再現性のある結果をもたらすことを示す。
【0092】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】