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特表2022-527846エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）から選択された分裂組織細胞株のフィトコンプレックス及び抽出物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-06
(54)【発明の名称】エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）から選択された分裂組織細胞株のフィトコンプレックス及び抽出物
(51)【国際特許分類】
A01H 6/14 20180101AFI20220530BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20220530BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220530BHJP
A61K 36/28 20060101ALI20220530BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220530BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220530BHJP
A01H 4/00 20060101ALI20220530BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20220530BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20220530BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220530BHJP
【ＦＩ】
A01H6/14
A61K8/9789
A61Q19/08
A61K36/28
A61P29/00
A61P31/00
A01H4/00
C12N5/04
C12P7/22
A23L33/105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560146
(86)(22)【出願日】2020-03-20
(85)【翻訳文提出日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 IB2020052591
(87)【国際公開番号】W WO2020188535
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】102019000004119
(32)【優先日】2019-03-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521437828
【氏名又は名称】アエスラ ビオテック ソチエタ レスポンサビリタ リミタータ
【氏名又は名称原語表記】ＡＥＴＨＥＲＡ ＢＩＯＴＥＣＨ Ｓ．Ｒ．Ｌ．
【住所又は居所原語表記】Ｖｉａ ｄｅｌｌ’Ｉｎｎｏｖａｚｉｏｎｅ １ ３６０４３ Ｃａｍｉｓａｎｏ Ｖｉｃｅｎｔｉｎｏ（Ｖｉｃｅｎｚａ），Ｉｔａｌｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100159905
【弁理士】
【氏名又は名称】宮垣 丈晴
(74)【代理人】
【識別番号】100142882
【弁理士】
【氏名又は名称】合路 裕介
(74)【代理人】
【識別番号】100158610
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 新吾
(74)【代理人】
【識別番号】100132698
【弁理士】
【氏名又は名称】川分 康博
(74)【代理人】
【識別番号】100159916
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 貴之
(72)【発明者】
【氏名】スガラベッティ，エレナ
(72)【発明者】
【氏名】プレッシ，ジョバンナ
(72)【発明者】
【氏名】グッツォ，フラーヴィア
【テーマコード（参考）】
2B030
4B018
4B064
4B065
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD09
2B030CB02
2B030CD05
2B030CD07
2B030CD10
2B030CD17
4B018MD08
4B018MD66
4B018ME06
4B018MF05
4B018MF06
4B018MF14
4B064AE46
4B064CA11
4B064CC03
4B064CC15
4B064CD04
4B064CD09
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA20
4B065AA88X
4B065AA89X
4B065AC14
4B065BB16
4B065BB35
4B065BC33
4B065BC36
4B065BD02
4B065BD10
4B065BD11
4B065BD14
4B065CA18
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
4C083AA111
4C083AA112
4C083AC122
4C083AC302
4C083AC582
4C083AD132
4C083AD152
4C083CC23
4C083CC38
4C083DD27
4C083EE11
4C088AB26
4C088BA06
4C088MA63
4C088NA14
4C088ZB11
4C088ZB31
(57)【要約】
本発明は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物の組織、好ましくはカルス組織から選択された分裂組織細胞株に関する。本発明はまた、細胞株の誘導体、すなわち細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物にも関する。分裂組織細胞株は、高いポリフェノール含量、とりわけ高いチコリ酸含量を特徴とする。さらに、本発明は、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体の化粧品、機能性食品及び医療用途に関する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）前記単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールを含む前記細胞クローンを選択するステップ
を含むプロセスによって得られるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物に由来する分裂組織細胞株であって、
前記固体及び液体培地が、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含有し、
前記細胞株が、前記細胞株の乾燥質量に対して、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量のポリフェノールを含み、ここで、前記ポリフェノールが、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択される分裂組織細胞株。
【請求項2】
前記固体及び液体培地が、各々、１５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のＮＡＡ、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１に記載の分裂組織細胞株。
【請求項3】
前記液体培地が、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフチレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１又は２に記載の分裂組織細胞株。
【請求項4】
前記固体培地が、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフチレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項5】
前記植物細胞の成長に好適な塩が、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項6】
前記植物細胞の成長に好適な塩が、以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項7】
前記固体及び液体培地が、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する、請求項５に記載の分裂組織細胞株。
【請求項8】
前記固体及び液体培地が、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する、請求項６に記載の分裂組織細胞株。
【請求項9】
前記固体及び液体培地の双方が、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項10】
ミオイノシトールが、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度で存在し；ピリドキシン－ＨＣｌが、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度で存在し；チアミン－ＨＣｌが、５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項９に記載の分裂組織細胞株。
【請求項11】
前記ポリフェノールが、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは３８％～５０％のチコリ酸を含有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項12】
３０～７０％ｗ／ｗ、好ましくは４０～６５％ｗ／ｗの量の多糖を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項13】
５～４０％ｗ／ｗ、好ましくは１０～３０％ｗ／ｗの量のタンパク質を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項14】
３～３０％ｗ／ｗ、好ましくは５～１０％ｗ／ｗの量の脂質を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物。
【請求項16】
乾燥若しくは凍結乾燥された細胞、又は細胞ホモジネート、又は細胞壁及びそれらの構成要素、好ましくは、前記分裂組織細胞株のホモジネートである、請求項１５に記載のフィトコンプレックス。
【請求項17】
前記細胞株の乾燥質量に対して０．５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量のポリフェノールを含む細胞ホモジネートであり、ここで、前記ポリフェノールが、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載のフィトコンプレックス。
【請求項18】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株及び／又は請求項１５～１７のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／又は抽出物を含む組成物。
【請求項19】
総組成物に対して、０．０１重量％～１重量％、好ましくは０．０３重量％～０．５重量％、より好ましくは０．０５重量％～０．２重量％の濃度の前記分裂組織細胞株及び／又は前記フィトコンプレックス及び／又は抽出物を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記フィトコンプレックスが、０．０５～０．２％の濃度のホモジネートである、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項21】
クリーム、ゲルクリーム、ゲル、セラム、オイル、エマルジョン、エマルジョンゲル（エマルゲル）、軟膏、点眼薬、マウスウォッシュ、スプレー、好ましくは鼻腔用スプレー、スティック、丸薬、カプセル、錠剤、粒状粉、ハードシェルカプセル、口腔内崩壊顆粒、サシェ、ロゼンジ、又はリポソームとして製剤化される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項22】
その抗酸化活性により、化粧品として、好ましくは皮膚の老化の徴候及び／又は皮膚中のフリーラジカル増加の予防若しくは軽減若しくは対処、或いはしわの予防又は軽減を目的とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、並びに／又は請求項１８～２１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項23】
炎症若しくは上気道感染症の治療及び／又は予防に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、並びに／又は請求項１８～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項24】
機能性食品としての、請求項１～１４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、並びに／又は請求項１８～２１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項25】
エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物の植物分裂組織細胞の調製及び選択のためのプロセスであって、前記細胞が、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの含量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含み、前記プロセスは、以下：１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）前記単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールを含む前記細胞クローンを選択するステップ
を含み、
ここで、前記固体及び液体培地が、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含有するプロセス。
【請求項26】
前記固体及び液体培地の双方が、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンを含む、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項27】
前記植物細胞の成長に好適な塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する液体増殖培地中で前記株を増殖させた後、前記植物細胞の成長に好適な塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する最終液体培地に前記細胞を移すことによる、前記分裂組織細胞株の増殖相を含む、請求項２５又は２６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高いポリフェノール含量を特徴とするエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物に由来する選択された分裂組織細胞株、並びに前記分裂組織細胞株又はその誘導体の化粧品、機能性食品及び医療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）属の植物は、とりわけ、その周知の免疫刺激活性のために、広く使用されている。
【0003】
ポリフェノール、特に、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン及びカフタル酸は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の典型的な成分である。前記化合物は、フリーラジカルの生成及び脂質過酸化を阻害することができる（Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｍｅｄ．）。エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）のチコリ酸の含量及び他のポリフェノール成分は、制御することが難しい複数の要因：季節、植物齢、栽培地域及び製品の調製に用いられる組織に関係する高い変動性を伴う。
【0004】
さらに、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）の栽培に関係する多くの問題：真菌感染、種子休眠、低い発芽度、長い成熟時間及び抽出物標準化の難しさも存在する。
【0005】
上記の理由から、今日市場で入手可能なＥ．プルプレア（Ｅ．ｐｕｒｐｕｒｅａ）を基材とする製品は、往々にして汚染されているか、又は多くの場合、明記されていない別の植物種で代用されている。
【0006】
標準化された植物誘導体（即ち、再現可能な含量の代謝物を含む）の調製は、多くの問題：異なる植物組織中での代謝物の含量の変動、季節による変動、植物寄生体による汚染、栽培地域に関係する相違、並びに収穫、貯蔵及び抽出中の分子の生物活性の喪失を引き起こす。抽出によって、植物又はその部分から直接得られる植物調製物の植物成分の含量の極端な変動は、その有効性にマイナスの影響を与える。
【0007】
汚染物質のない標準化植物フィトコンプレックスを工業的量で取得するための別の方法は、インビトロ細胞培養物を使用するものである。この技術は、標準化された様式で再現することが可能な含量の活性物質を含む調製物を提供することから、植物抽出物の変動に関係する問題を解決することを可能にする。本発明は、この技術基盤に関連するものであり、標準化され、再現可能な含量の活性物質を含むフィトコンプレックスを取得することができる、選択された分裂組織細胞株を提供する。
【0008】
欧州特許第２３１９９１４号明細書は、高い含量のコーヒー酸を有する、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）属、好ましくはエキナセア・アングスティフォリア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）の植物由来の分裂組織細胞の調製を記載している。
【0009】
本発明は、コーヒー酸以外のポリフェノールを高い含量で含む、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）種に属する植物からの選択された分裂組織細胞株及びその誘導体を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）種に属する植物由来の選択された分裂組織細胞株、好ましくは植物自体から得られるカルス組織由来の細胞株に関する。
【0011】
本発明の第２の態様は、選択された分裂組織細胞株の誘導体、即ち、細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物に関する。
【0012】
選択された分裂組織細胞株及びその誘導体は、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールの高い含量を特徴とする。
【0013】
本発明の第３の態様は、化粧品及び／又は医薬品の観点から許容される賦形剤と混合して、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体を含む組成物に関する。
【0014】
本出願人は、選択された細胞株又はその誘導体が、コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの遺伝子の発現の誘導に活性であり、ｉＮＯＳ（誘導性一酸化窒素シンターゼ）、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ２）、ＩＬ－１β（インターロイキン１β）及びＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）の発現の阻害によって媒介される顕著な抗炎症活性、並びにＲＯＳ（活性酸素種）の阻害、ＭＤＡ（マロンジアルデヒド）の及びＮＯ2－の放出の阻害によって媒介される抗酸化活性を有することを実証している。
【0015】
本発明の別の態様は、コーヒー酸以外のポリフェノールを高い含量で含む、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物分裂組織細胞の調製及び選択のためのプロセスに関する。
【0016】
以下に本発明を詳述し、例として添付の図を参照にしながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】固体培地中に維持される、細胞株（Ｅｐ－２Ｐと称する）を明視野光学顕微鏡で撮影した写真を示す。
【図4A-B】（Ａ）選択されたクローンＥｐ－２及び（Ｂ）選択プロセス前の分裂組織細胞についてダイオードアレイ検出器により３３０ｎｍで得られたＵＶ／ＶＩＳクロマトグラムを示す。
【図5】ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの各成分について、正及び負イオン化モードのクロマトグラフプロフィールで得られたメインピークの同定を示す。
【図6】負イオン化モードで得られたＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのクロマトグラムを３次元で示す。
【図7】ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスによる処理から７２時間後の微小組織におけるコラーゲンＩＩＩ及びＩＶの遺伝子の発現を示す。データは、未処理の対照の値を１と設定し、未処理の対照と比較した増加倍数として表される。
【図8】抗コラーゲンＩＩＩ抗体で処理され、且つＤＡＰＩで染色された微小組織の低温切片：Ａ：陰性対照；Ａ’：Ａに示される部分の拡大画像；Ｂ：アリスチンで処理された微小組織（陽性対照）；Ｂ’：Ｂに示される部分の拡大画像；Ｃ：０．０３％のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）を含有する組成物で処理された微小組織；Ｃ’：Ｃに示される部分の拡大画像を示す。
【図9】表示した処理後の細胞生存率の％を示す。
【図10A-C】ＬＰＳ及び０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）による処理後のＩｋＢ－α（Ａ）、ｉ－ＮＯＳ（Ｂ）及びＣＯＸ－２（Ｃ）の評価のためのウエスタンブロット分析及び関連定量を示す。
【図11A-B】細胞溶解物の上清に対して実施されたＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
【図12】ヒトケラチノサイト中のＲＯＳの生成に対するＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの効果を示す。
【図13A-B】マクロファージ細胞モデルの上清（Ａ）及び細胞溶解物（Ｂ）中の亜硝酸塩及びＭＤＡのレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
本発明に関連して、「分裂組織系列」又は「分裂組織細胞」とは、新しい細胞を生み出すように有糸分裂により分裂する能力を維持することができる植物系列又は細胞を意味する。全ての分裂組織細胞は、別の分裂組織細胞に由来する。分裂組織細胞の機能は、動物の幹細胞の機能と同等である。
本発明に関連して、「分裂組織系列」又は「分裂組織細胞」とは、新しい細胞を生み出すように有糸分裂により分裂する能力を維持することができる植物系列又は細胞を意味する。全ての分裂組織細胞は、別の分裂組織細胞に由来する。分裂組織細胞の機能は、動物の幹細胞の機能と同等である。
【0019】
本発明に関連して、「カルス組織」とは、薄い細胞壁と、二次代謝産物が蓄積した大きな液胞を備える未分化細胞又はほとんど特殊化していない細胞の無秩序な塊を指す。
【0020】
本発明に関連して、別に記載のない限り、「ｗ／ｗ」は、細胞株の乾燥質量に関する重量／重量の量を意味する。
【0021】
本発明の第１態様は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）種に属する植物由来の分裂組織細胞株に関する。
【0022】
一実施形態では、前記分裂組織細胞株は、以下：
１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸及びフェルタル酸からなる群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量のチコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含む細胞クローンを選択するステップ。
１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸及びフェルタル酸からなる群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量のチコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含む細胞クローンを選択するステップ。
【0023】
ステップ１）では、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地中に配置して、未分化カルス組織を取得する。エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の組織は、好ましくはエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の少なくとも１つのシュート又はエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の複数のシュートである。
【0024】
本発明の好ましい実施形態では、固体及び液体培地は、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含む。
【0025】
固体培地は、さらに寒天を含むが、液体培地は、寒天を含有しない。
【0026】
固体及び液体培地は、各々、１５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のナフチル酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0027】
好ましい実施形態では、固体培地は、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0028】
好ましい実施形態では、液体培地は、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0029】
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される。
【0030】
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、好ましくは以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される。
【0031】
固体及び液体培地のいずれも、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
【0032】
一実施形態では、固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される。この化合物の組合せは、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地である。
【0033】
一実施形態では、固体及び液体培地のいずれも、上に挙げた塩に加えて、以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
【0034】
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する。
【0035】
固体及び液体培地は、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
【0036】
固体及び液体培地の双方は、好ましくは各々、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のミオイノシトール；７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のピリドキシン－ＨＣｌ；及び５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のチアミン－ＨＣｌを含有する。
【0037】
ステップ１）の後、カルス組織を好ましくは複数の部分に分割し、これらを、固体培地に連続的に移すことにより安定化させて（ステップ１ａ）、安定化した細胞を取得する。このステップは、安定化ステップと呼ばれる。
【0038】
安定化ステップ１ａ）の後、安定化細胞の部分は、好ましくは、最初の「クローン選択」を経る。クローン選択は、適切な期間、好ましくは５～２０日の培養、より好ましくは１０～１５日の期間にわたって安定化細胞を培養するものである（ステップ１ｂ）。これらの細胞を１５℃～３５℃、好ましくは２４℃～２６℃の温度の暗所でインキュベートする。
【0039】
ステップ２）では、固体培地から安定化細胞の凝集体を取り出すことにより、複数の細胞クローンを単離する。
【0040】
ステップ３）では、細胞クローンを各々、前述した液体培地中に接種する。
【0041】
一実施形態によれば、ステップ４）において、細胞クローンの適切な増殖を達成するような時間、好ましくは１０～１５日の増殖相の後、各クローンのポリフェノール含量を定量する。
【0042】
細胞クローンの選択のステップ５）において、０．５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量のチコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含むエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物細胞株を取得するまで、ステップ１ｂ）に従う２回目のクローン選択を実施するのが好ましい。
【0043】
前述したプロセスで選択した分裂組織細胞株は、より好ましくは、３～１５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３．５～１０％ｗ／ｗの量の、上に挙げたポリフェノールを含む。
【0044】
前記ポリフェノールの混合物は、好ましくはチコリ酸、好ましくはチコリ酸とシナリン、さらに好ましくはチコリ酸、シナリン及びクロロゲン酸、より好ましくはチコリ酸、シナリン、クロロゲン酸、カフタル酸及びフェルタル酸を含む。
【0045】
好ましい実施形態では、前記ポリフェノールは、少なくとも４０％、少なくとも３５％又は少なくとも３０％ｗ／ｗ、好ましくは３８％～５０％ｗ／ｗのチコリ酸を含有する。
【0046】
前記選択された細胞株は、好ましくは、３．５～１０％ｗ／ｗの量のポリフェノールを含み、ポリフェノールは、少なくとも４０％、又は少なくとも３５％又は少なくとも３０％ｗ／ｗ、好ましくは３８％～５０％ｗ／ｗのチコリ酸を含有する。
【0047】
本発明の選択された分裂組織細胞株はまた、３０～７０％ｗ／ｗ、好ましくは４０％～６５％ｗ／ｗの量の多糖をさらに含む。
【0048】
本発明の選択された分裂組織細胞株は、５～４０％ｗ／ｗ、好ましくは１０～３０％ｗ／ｗの量のタンパク質をさらに含む。
【0049】
本発明の選択された分裂組織細胞株は、３～３０％ｗ／ｗ、好ましくは５～１０％ｗ／ｗの量の脂質をさらに含む。
【0050】
好ましい実施形態では、前記選択された分裂組織細胞株は、０．５～２０％のポリフェノールを含むＥｐ－２Ｐ株であり、そのうち３５～４０％がチコリ酸である。
【0051】
本発明の第２の態様は、選択された分裂組織細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物である細胞株の誘導体に関する。
【0052】
フィトコンプレックスとは、乾燥若しくは凍結乾燥された細胞、細胞ホモジネート、又は細胞壁及びそれらの構成要素を意味する。フィトコンプレックスは、好ましくは、細胞ホモジネートである。
【0053】
前記フィトコンプレックスは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して０．５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含む。より好ましくは、フィトコンプレックスは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して３～１５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３．５～１０％ｗ／ｗの量の前述したポリフェノールを含む。
【0054】
前記ポリフェノールの混合物は、好ましくは、チコリ酸、好ましくはチコリ酸とシナリン、さらに好ましくはチコリ酸、シナリン及びクロロゲン酸、より好ましくはチコリ酸、シナリン、クロロゲン酸、カフタル酸及びフェルタル酸を含む。
【0055】
好ましい実施形態では、前記ポリフェノールは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、少なくとも４０％、又は少なくとも３５％若しくは少なくとも３０％ｗ／ｗ、好ましくは３２～４０％ｗ／ｗのチコリ酸を含有する。
【0056】
前記フィトコンプレックスは、好ましくは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、３．５～１０％ｗ／ｗの量のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは、３８～５０％ｗ／ｗのチコリ酸から構成される。
【0057】
フィトコンプレックスはまた、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、３０～７０％ｗ／ｗ、好ましくは４０％～６５％ｗ／ｗの量の多糖をさらに含む。
【0058】
フィトコンプレックスはまた、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、５～４０％ｗ／ｗ、好ましくは１０～３０％ｗ／ｗの量のタンパク質をさらに含む。
【0059】
フィトコンプレックスはまた、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、３～３０％ｗ／ｗ、好ましくは５～１０％ｗ／ｗの量の脂質をさらに含む。
【0060】
好ましい実施形態では、前記フィトコンプレックスは、前記選択された分裂組織細胞株Ｅｐ－２Ｐに由来するものであり、０．５～２０％のポリフェノールを含み、そのうち３５～４０％がチコリ酸である。
【0061】
フィトコンプレックスは、好ましくは選択された分裂組織細胞株Ｅｐ－２Ｐの細胞ホモジネートである。
【0062】
抽出物は、アルコール溶媒中の、例えば、メタノール若しくはエタノール、又は様々な割合：５０：５０若しくは６０：４０若しくは７０：３０の水／エタノール混合物中の細胞株自体又は細胞株のフィトコンプレックスの抽出物を意味する。抽出物は、好ましくは細胞株の細胞ホモジネートの抽出物である。前記抽出物の含量は、フィトコンプレックス又はそれが得られた細胞株の含量と一致し、抽出技術によって変動し得る。
【0063】
本発明の第３の態様は、化粧品、機能性食品及び／又は薬学的観点から許容される少なくとも１つの賦形剤と結合した分裂組織細胞株並びに／又はその誘導体（フィトコンプレックス及び／若しくは抽出物）を含む組成物に関する。
【0064】
一実施形態では、組成物は、０．０１％～３０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０３％～１５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～１０％ｗ／ｗの濃度で細胞株及び／又はその誘導体を含む。前記組成物は、好ましくは、細胞ホモジネートであるフィトコンプレックスを含む。
【0065】
一実施形態では、細胞株及び／又はその誘導体は、賦形剤と混合させる前に、分散させて、本発明の組成物を調製する。例として、好適な分散剤は、グリセリン、プロピレン又はブチレングリコールである。
【0066】
本発明の組成物は、薬学的及び／又は化粧品用途について許容される少なくとも１つの賦形剤を含み、それは、組成物の調製に有用であり、一般に、生物学的に安全且つ無毒性である。
【0067】
前記賦形剤は、皮膚用の少なくとも１つのコンディショニング剤、保湿剤、又は閉塞剤、界面活性剤、安定化剤、保存料又はエモリエント剤である。
【0068】
本発明の組成物は、クリーム、ゲルクリーム、ゲル、セラム、オイル、エマルジョン、エマルジョン－ゲル（エマルゲル）、軟膏、点眼薬、マウスウォッシュ、スプレー、好ましくは鼻腔用スプレー、又はスティック（リップクリームなど）として局所用途のために製剤化される。
【0069】
組成物はまた、好ましくは丸薬、カプセル、錠剤、粒状粉、ハードシェルカプセル、口腔内崩壊顆粒、サシェ又はロゼンジとして、経口投与のために製剤化され得る。
【0070】
一実施形態では、組成物は、そこに含まれる活性成分を急速に、又は投与後に遅延及び／若しくは制御様式で放出するように製剤化され、好ましくはリポソームとして製剤化される。
【0071】
本明細書に含まれる実験データは、前述した細胞株又はその誘導体が、コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの合成を刺激することができ、その結果、皮膚弾力及び緻密度の向上をもたらすことを示している。さらに、前記細胞株又はその誘導体は、炎症性酵素ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２並びにＬＰＳにより刺激されるサイトカインＴＮＦα及びＩＬ－１βの合成の低減に関係する抗炎症活性、さらには酸化ストレス後のＲＯＳの生成の低減に関係する抗酸化活性を有することが実証されている。
【0072】
本発明の別の態様は、細胞株又はその誘導体の化粧品用途に関する。
【0073】
化粧品用途とは、皮膚老化の徴候、皮膚弾力及び緻密度の喪失並びに発赤の予防、軽減及び／又は対処、皮膚の水分補給、抗しわ活性及び抗酸化活性を意味する。
【0074】
本発明の別の態様は、身体のケア及び衛生のための細胞株又はその誘導体の使用に関し；この場合、細胞株又はその誘導体は、好適な賦形剤と一緒に、バスフォーム、シャワージェル、セッケン、シャンプー若しくはヘアコンディショナーとして製剤化される。
【0075】
本発明の別の態様は、薬剤又は栄養補助食品として使用するための、特に、上気道を侵す炎症及び感染症の治療又は予防のための細胞株又はその誘導体に関する。
【0076】
本発明の別の態様は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属に属する植物の植物分裂組織細胞の調製及び選択のためのプロセスに関し、これは、以下：
１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸及びフェルタル酸を含む群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含む細胞クローンを選択するステップ
を含む。
１）エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）属の植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸及びフェルタル酸を含む群から選択されるポリフェノールの含量を定量するステップ；
５）０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．５％～２５％ｗ／ｗの量で、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリフェノールを含む細胞クローンを選択するステップ
を含む。
【0077】
一実施形態では、分裂組織細胞株の調製は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物からの組織、好ましくはシュートを収集するステップ、それを、例えば水で洗浄するステップ、それを小片に細断するステップ、並びに例えば、エタノール、次亜塩素酸ナトリウム及び水銀塩での連続的処理によりそれをプレート上で滅菌するステップを含む。
【0078】
ステップ１）では、収集した組織を固体培地中に配置して、未分化カルス組織を取得する。
【0079】
本発明の好ましい実施形態では、固体及び液体培地は、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含む。
【0080】
固体培地は、さらに寒天を含むが、液体培地は、寒天を含有しない。
【0081】
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１５～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のナフチル酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１ｍｇ／Ｌ～２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0082】
好ましい実施形態では、固体培地は、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0083】
好ましい実施形態では、液体培地は、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
【0084】
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される。
【0085】
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、好ましくは以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及びＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ並びにそれらの組合せから選択される。
【0086】
固体及び液体培地のいずれも、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含み、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される。
【0087】
一実施形態では、固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4から選択される。この塩の組合せは、ガンボーグＢ５培地である。
【0088】
一実施形態では、固体及び液体培地のいずれも、上に挙げた塩に加えて、以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
【0089】
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む。
【0090】
固体及び液体培地は、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
【0091】
固体及び液体培地のいずれも、好ましくは各々、７０～１３０ｍｇ、より好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のミオイノシトール；７０～１３０ｍｇ、より好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のピリドキシン－ＨＣｌ；及び５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のチアミン－ＨＣｌを含有する。
【0092】
ステップ１）の後、カルス組織を好ましくは複数の部分に分割し、これらを、固体培地に連続的に移すことにより安定化させて（ステップ１ａ）、安定化した細胞を取得する。このステップは、安定化ステップと呼ばれる。
【0093】
安定化ステップ１ａ）の後、安定化細胞は、好ましくは、最初の「クローン選択」を経る。クローン選択は、好適な期間、好ましくは５～２０日の培養、より好ましくは１０～１５日の期間にわたって安定化細胞を培養するものである（ステップ１ｂ）。これらの細胞を１５℃～３５℃、好ましくは２４℃～２６℃の温度の暗所でインキュベートする。
【0094】
ステップ２）では、固体培地から安定化細胞の凝集体を取り出すことにより、複数の細胞クローンを単離する。
【0095】
ステップ３）では、細胞クローンを各々、前述した液体培地中に接種する。
【0096】
一実施形態によれば、ステップ４）において、細胞クローンの適切な増殖を達成するような時間、好ましくは１０～１５日の増殖相の後、各クローンのポリフェノール含量を定量する。
【0097】
細胞クローンの選択のステップ５）において、チコリ酸、クロロゲン酸、シナリン、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールの産生が最適であるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物細胞株を取得するまで、ステップ１ｂ）に従う２回目のクローン選択を実施するのが好ましい。
【0098】
次に、選択した細胞株を、フラスコ又はバイオリアクター又は発酵槽内で増殖させて、バイオマスの増加を達成する。バイオマスの増加は、ＥＰと呼ばれる液体増殖培地中の最初の段階で起こる。液体増殖培地ＥＰは、前述したガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）塩、上に挙げたビタミン、スクロース、ＮＡＡ、及びＩＡＡを含有する培地である。
【0099】
液体増殖培地ＥＰは、ガンボーグ塩のうち、ＫＮＯ3を１．５ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ～３ｇ／Ｌの量で含有する。スクロースは、好ましくは、１５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌで含まれる。ＮＡＡは、好ましくは、０．５ｍｇ／Ｌ～１．５ｍｇ／Ｌで含まれる。ＩＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。キネチンは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。
【0100】
液体培地ＥＰで増殖させた細胞は、最終増殖相のために、ガンボーグ塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、及びＩＡＡを含有する最終培地ＥＰ－Ｆ中に移し、これによってポリフェノール含量及びバイオマスの増加を誘導する。
【0101】
最終培地ＥＰ－Ｆは、ガンボーグ塩のうち、ＫＮＯ3を０．５ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌの量で含有する。スクロースは、好ましくは、３０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌで含まれる。ＮＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。ＩＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれ、キネチンは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。
【0102】
好ましい実施形態によれば、ＥＰ増殖培地及び最終ＥＰ－Ｆ培地の双方で、フラスコ、バイオリアクター又は発酵槽中の細胞株の増殖は、暗所の条件下、１５℃～３５℃、典型的には２５℃の温度で、７～３０日、好ましくは１４～２１日にわたって実施する。
【0103】
最終ＥＰ－Ｆ培地での増殖の終わりに、細胞株を濾過した後、細胞を回収して、フィトコンプレックスの形態で次のステップで使用するか、或いはまた、後のアルコール溶媒中の抽出相にそれらを付して、高いポリフェノール含量を特徴とする細胞抽出物を生成することもできる。
【0104】
フィトコンプレックスは、生きた細胞の凍結乾燥又は乾燥によって得ることができ；この場合、フィトコンプレックスは、死滅細胞の凍結乾燥物である。
【0105】
一実施形態では、フラスコ、バイオリアクター又は発酵槽中での増殖の終わりに、細胞を、好ましくは酸性化溶液（例えば、アスコルビン酸及び／若しくはクエン酸及び／若しくは酢酸を含む）中での、例えば、機械的粉砕によりホモジナイズした後、凍結乾燥又は乾燥させる。後者の場合、フィトコンプレックスは、細胞及びその内部構造が崩壊している細胞ホモジネートである。これらの異なるタイプのフィトコンプレックスは、全てが、既述のように高いポリフェノール含量を有することを特徴とする。
【0106】
或いは、好ましくは細胞ホモジネートの形態のフィトコンプレックスは、従来の技法を用いて、アルコール溶媒（例えば、メタノール及び／若しくはエタノール及び／又は水）中での抽出に付す。こうして得られた抽出物は、上に詳述したように、高いポリフェノール含量を特徴とし、前述した通り、化粧品、機能性食品又は医薬組成物の調製のために使用することができる。
【0107】
或いはまた、精製後、生きた細胞をそのまま、本発明の組成物の調製に直接使用することができる。
【0108】
これに続く実験で得られた生物学的データにより、本明細書に記載する使用を目的とする、チコリ酸、シナリン、クロロゲン酸、カフタル酸、フェルタル酸及びそれらの混合物を含む群から選択されるポリフェノールを驚くほど高い含量で含有する前記細胞株及び／又は誘導体の有効性を確認する。
【0109】
前記選択された細胞株の誘導体の予想外の有効性も同様に実証され、この場合、前記誘導体は、活性成分の完全性を損ない得る溶媒又は他の抽出手順に細胞を曝露することなく、全細胞成分を含むホモジネート、又はフィトコンプレックスである。
【実施例】
【0110】
エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の分裂組織細胞株の作製及び選択
文献に記載されている標準的手順を用いて、カルス組織の誘導を達成した。この手順により、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物からの幼組織（シュート）の収集、例えば、水道水によるそれらの洗浄、２～５ｃｍの切片への細断、並びに例えば、順に、７０％エタノール水溶液で約１５秒、２％次亜塩素酸ナトリウム及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で約５分の処理、最後に滅菌蒸留水で少なくとも４回の洗浄によるプレート上での滅菌を実施する。寒天の添加により固体にされ、抗生剤なしで、成長ホルモンを補充した栄養培地を含有するペトリ皿内に、さらに破砕した植物組織の全ての断片（外植片）を載せる。２５℃の暗所で好適な期間のインキュベーション後、未分化カルス組織が形成され；次にこれを、新鮮な培地を含む、より広い表面に移した後、増殖させる。
文献に記載されている標準的手順を用いて、カルス組織の誘導を達成した。この手順により、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の植物からの幼組織（シュート）の収集、例えば、水道水によるそれらの洗浄、２～５ｃｍの切片への細断、並びに例えば、順に、７０％エタノール水溶液で約１５秒、２％次亜塩素酸ナトリウム及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で約５分の処理、最後に滅菌蒸留水で少なくとも４回の洗浄によるプレート上での滅菌を実施する。寒天の添加により固体にされ、抗生剤なしで、成長ホルモンを補充した栄養培地を含有するペトリ皿内に、さらに破砕した植物組織の全ての断片（外植片）を載せる。２５℃の暗所で好適な期間のインキュベーション後、未分化カルス組織が形成され；次にこれを、新鮮な培地を含む、より広い表面に移した後、増殖させる。
【0111】
未分化カルス組織から得られた分裂組織細胞株は、固体培地に何回か移すこと（二次培養）によって、安定化させる。この培地は、２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン並びに０．８～１％の植物用寒天を添加した（ＥＰ培地）、最終ｐＨ６．５の固体ガンボーグＢ５タイプ（２．５ｇ／ＬのＫＮＯ3を含有）から成る。クローン選択後にこの特定の培地中で得られた細胞株は、Ｅｐ－２Ｐと称された。
【0112】
得られた分裂組織細胞が植物種エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）に属することをＤＮＡフィンガープリント分析により確認した。
【0113】
細胞株Ｅｐ－２Ｐを増殖させて、液体培地（寒天を含まないＥＰ培地）に細胞を移すのに十分な量のバイオマスを取得する。液体培地での増殖後、細胞懸濁液をバイオリアクターに移すことができ、これは、さらなる増殖相のための最終生産培地又はＥＰ増殖培地を含有し得る。
【0114】
生産液体培地（ポリフェノール含量を増加するために最適化される）は、４０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ及び０．５ｍｇ／Ｌのキネチンを添加した、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５（１ｇ／ＬのＫＮＯ3を含む）である（ＥＰ－Ｆ培地）。
【0115】
エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の細胞株Ｅｐ－２Ｐの特徴を例として記載する。
【0116】
細胞株の形態的特徴
Ｅｐ－２Ｐと称されるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の選択された細胞株は、固体ＥＰ培地で維持され、白っぽい色合いが混じったベージュ色であり、脆い質感を有する（図１～３）。
Ｅｐ－２Ｐと称されるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の選択された細胞株は、固体ＥＰ培地で維持され、白っぽい色合いが混じったベージュ色であり、脆い質感を有する（図１～３）。
【0117】
ホモジナイゼーション手順
選択され、２５℃（±２）のバイオリアクター内で１４日間増殖させた細胞のバイオマスをホモジナイズする手順は、以下：
ａ）ＥＰ－Ｆ培地中でのＥｐ－２Ｐ細胞培養物の増殖から得られたバイオマスの濾過により、細胞のみを取得し、培地を廃棄するステップ；
ｂ）細胞の２倍量の食塩水（滅菌水中０．９％Ｗ／Ｖ ＮａＣｌ）で細胞を洗浄するステップ；
ｃ）濾過し、洗浄したバイオマスに、１．０％Ｗ／Ｗ（０．５～２％Ｗ／Ｗ）のクエン酸（又はアスコルビン酸若しくはクエン酸とアスコルビン酸の混合物）を添加するステップ；
ｄ）例えば、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ又は細胞及びその内部構造を破砕するのに好適な他の器具を用いて、混合物をホモジナイズするステップ；
ｅ）凍結乾燥又は空気循環乾燥又は回転シリンダー乾燥又は流動層乾燥又は噴霧によりバイオマスを乾燥させるステップ
を含む。
選択され、２５℃（±２）のバイオリアクター内で１４日間増殖させた細胞のバイオマスをホモジナイズする手順は、以下：
ａ）ＥＰ－Ｆ培地中でのＥｐ－２Ｐ細胞培養物の増殖から得られたバイオマスの濾過により、細胞のみを取得し、培地を廃棄するステップ；
ｂ）細胞の２倍量の食塩水（滅菌水中０．９％Ｗ／Ｖ ＮａＣｌ）で細胞を洗浄するステップ；
ｃ）濾過し、洗浄したバイオマスに、１．０％Ｗ／Ｗ（０．５～２％Ｗ／Ｗ）のクエン酸（又はアスコルビン酸若しくはクエン酸とアスコルビン酸の混合物）を添加するステップ；
ｄ）例えば、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ又は細胞及びその内部構造を破砕するのに好適な他の器具を用いて、混合物をホモジナイズするステップ；
ｅ）凍結乾燥又は空気循環乾燥又は回転シリンダー乾燥又は流動層乾燥又は噴霧によりバイオマスを乾燥させるステップ
を含む。
【0118】
記載の手順を用いて、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）と称されるフィトコンプレックスを取得する。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）ホモジネートの内容の明細：
４０～６５％の多糖
０．５～２０％の総ポリフェノール（うち約３８％はチコリ酸である）
１０～３０％のタンパク質
５～１０％の脂質
２～６％の水分
２～１７％の灰
５～３０％のクエン酸
ＥＰ－Ｆ培地中の標準ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）Ａフィトコンプレックスの調製の例は、非限定的な例として提供される。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）ホモジネートの内容の明細：
４０～６５％の多糖
０．５～２０％の総ポリフェノール（うち約３８％はチコリ酸である）
１０～３０％のタンパク質
５～１０％の脂質
２～６％の水分
２～１７％の灰
５～３０％のクエン酸
ＥＰ－Ｆ培地中の標準ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）Ａフィトコンプレックスの調製の例は、非限定的な例として提供される。
【0119】
このようにして得られたフィトコンプレックスをそのまま使用するか、又は０．５～５％ｗ／ｗの範囲の濃度で好適な分散媒中に分散させる。こうして得られた懸濁液は、ＥｃｈｉＰｕｒｅ ＣＲＯ（登録商標）－Ｇと称される。
【0120】
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの調製及び分析
固体ＥＰ培地（２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン並びに０．８％の植物用寒天を添加したガンボーグＢ５）中で培養されたエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の株由来の、既述のように安定化及び選択された分裂組織細胞（Ｅｐ－２Ｐと称する）を、２００ｍｌの液体ＥＰ－Ｆ培地（４０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／Ｌではなく１ｇ／ＬのＫＮＯ3、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ及び０．５ｍｇ／Ｌのキネチンを添加した、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５）を含有する５つの１リットル容量フラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖであった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に置いた。７日のインキュベーション後、５ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルを細胞懸濁液（９５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：３９９２４－５２－２）に添加した。７日のインキュベーション後、植物バイオマス（１リットルの細胞懸濁液）を収集し、孔径５０μｍのナイロンメッシュで濾過し、７００ｍｌの滅菌食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ）で洗浄した。洗浄した細胞（新鮮重量３５０ｇ）に３．５ｇのクエン酸を添加し、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘでホモジナイズした。
固体ＥＰ培地（２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン並びに０．８％の植物用寒天を添加したガンボーグＢ５）中で培養されたエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の株由来の、既述のように安定化及び選択された分裂組織細胞（Ｅｐ－２Ｐと称する）を、２００ｍｌの液体ＥＰ－Ｆ培地（４０ｇ／Ｌのスクロース、２．５ｇ／Ｌではなく１ｇ／ＬのＫＮＯ3、１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ及び０．５ｍｇ／Ｌのキネチンを添加した、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５）を含有する５つの１リットル容量フラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖであった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に置いた。７日のインキュベーション後、５ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルを細胞懸濁液（９５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：３９９２４－５２－２）に添加した。７日のインキュベーション後、植物バイオマス（１リットルの細胞懸濁液）を収集し、孔径５０μｍのナイロンメッシュで濾過し、７００ｍｌの滅菌食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ）で洗浄した。洗浄した細胞（新鮮重量３５０ｇ）に３．５ｇのクエン酸を添加し、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘでホモジナイズした。
【0121】
ホモジナイズした細胞を凍結乾燥した。１リットルの細胞懸濁液から、以下：１．０５ｇのポリフェノール、１３ｇの多糖類、３．７５ｇのタンパク質、２．２ｇの脂質、０．７５ｇの灰及び３．５ｇのクエン酸を含有する２５ｇの凍結乾燥物（ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス）が得られた。
【0122】
表１は、フィトコンプレックスの特性決定を示す。
【表1】
【0123】
以下に記載する方法を用いて、フィトコンプレックスの特性決定を実施した：
ａ）ＵＰＬＣ－ＤＡＤによるＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中のポリフェノールの定量
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの１００ｍｇの粉末を計量して１５ｍＬ試験管に導入し、３０容量のエタノールと水６０：４０（Ｖ／Ｖ）を添加した。懸濁液をボルテックスミキサーで３０秒混合した後、氷浴中で１５分音波処理し；最後に、６℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の終了時に、上清を回収した。１５ｍＬの上清を新しい試験管に移し、ＵＰＬＣシステムにロードするまで、氷中で保存した。サンプルを１：１０（初めに溶媒で１：５、続いて水で１：２）希釈した。希釈したサンプルを０．２２μｍフィルターで濾過した後、ＵＰＬＣシステムにロードした。ポリフェノールの定量に用いるクロマトグラフィーシステムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－Ｃｏｌｕｍｎ ３／Ｐｋ、サイズ２．１×５ｍｍに連結された、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍカラム、サイズ２．１×１００ｍｍである。ＵＰＬＣ－ＤＡＤ分析に用いるプラットフォームは、ＰＤＡ ｅλダイオードアレイ検出器に連結された、溶離液管理モジュール、Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓ、及びオートサンプラー、Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ－ＦＴＮ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓから構成されるＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を含む。Ｅｍｐｏｗｅｒ ３（Ｗａｔｅｒｓ）ソフトウェアを用いて、データを取得し、解析した。使用したクロマトグラフィー法は、以下：溶媒Ａ：水、０．１％ギ酸；溶媒Ｂ：１００％アセトニトリルであった。初期条件は、９９％溶媒Ａであり；さらに、流量は、分析期間全体を通して、０．３５０ｍｌ／分で一定のままである。クロマトグラフィーカラムは、３０℃に温度制御した。表２に示すように、勾配及びイソクラティック相を交互にすることにより、分子の溶離を実施した。
ａ）ＵＰＬＣ－ＤＡＤによるＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中のポリフェノールの定量
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの１００ｍｇの粉末を計量して１５ｍＬ試験管に導入し、３０容量のエタノールと水６０：４０（Ｖ／Ｖ）を添加した。懸濁液をボルテックスミキサーで３０秒混合した後、氷浴中で１５分音波処理し；最後に、６℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の終了時に、上清を回収した。１５ｍＬの上清を新しい試験管に移し、ＵＰＬＣシステムにロードするまで、氷中で保存した。サンプルを１：１０（初めに溶媒で１：５、続いて水で１：２）希釈した。希釈したサンプルを０．２２μｍフィルターで濾過した後、ＵＰＬＣシステムにロードした。ポリフェノールの定量に用いるクロマトグラフィーシステムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－Ｃｏｌｕｍｎ ３／Ｐｋ、サイズ２．１×５ｍｍに連結された、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍカラム、サイズ２．１×１００ｍｍである。ＵＰＬＣ－ＤＡＤ分析に用いるプラットフォームは、ＰＤＡ ｅλダイオードアレイ検出器に連結された、溶離液管理モジュール、Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓ、及びオートサンプラー、Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ－ＦＴＮ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓから構成されるＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を含む。Ｅｍｐｏｗｅｒ ３（Ｗａｔｅｒｓ）ソフトウェアを用いて、データを取得し、解析した。使用したクロマトグラフィー法は、以下：溶媒Ａ：水、０．１％ギ酸；溶媒Ｂ：１００％アセトニトリルであった。初期条件は、９９％溶媒Ａであり；さらに、流量は、分析期間全体を通して、０．３５０ｍｌ／分で一定のままである。クロマトグラフィーカラムは、３０℃に温度制御した。表２に示すように、勾配及びイソクラティック相を交互にすることにより、分子の溶離を実施した。
【表2】
【0124】
ポリフェノールの定量のために、３３０ｎｍの波長に関連するクロマトグラムを使用した。ポリフェノールは、チコリ酸相当量として定量し、チコリ酸は、上記群中で最も代表的な分子である。ポリフェノールは、信頼できるチコリ酸の商業的標準の検量線（ＣＡＳ ６５３７－８０－０；純度≧９５％；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって定量した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアを用いて、データ解析を実施した。ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィールを図４に示す。ＵＰＬＣ分析から、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが、４．２に等しい％のポリフェノール（チコリ酸相当量として表される）を含むことがわかる。フィトコンプレックス中のチコリ酸のパーセンテージは、１．６に等しかった。
ｂ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ解析
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの粉末を、ボルテックス式ミキサーで３０秒攪拌した後、氷の下、１５分間４０Ｈｚの音波処理装置内で、２０容量のメタノール：水９０：１０を用いて抽出し；４℃にて、１８０００ｇで１０分の遠心分離後に抽出物を回収した。分析の前に、３２０ｎｍで０．４～０．６の分光光度的吸光度を取得するように、好適な量の同じ溶媒（メタノール：水９０：１０）でサンプルを希釈した。サンプルを水でさらに希釈し、ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳにより分析した。
ｂ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ解析
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの粉末を、ボルテックス式ミキサーで３０秒攪拌した後、氷の下、１５分間４０Ｈｚの音波処理装置内で、２０容量のメタノール：水９０：１０を用いて抽出し；４℃にて、１８０００ｇで１０分の遠心分離後に抽出物を回収した。分析の前に、３２０ｎｍで０．４～０．６の分光光度的吸光度を取得するように、好適な量の同じ溶媒（メタノール：水９０：１０）でサンプルを希釈した。サンプルを水でさらに希釈し、ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳにより分析した。
【0125】
クロマトグラフ分離を伴う質量分析法のために、ＥＳＩ供給源を備える、Ｅｓｑｕｉｒｅ ６０００ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と「オンライン」で連結されたＨＰＬＣシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ １，オートサンプラーを備える溶媒モジュール（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ））を使用した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ５．２－ＥｓｑｕｉｒｅＣｏｎｔｒｏｌ ５．２プログラムを用いて、クロマトグラフ及び質量データを収集し、以下のパラメータを適用し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ５．２－Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．２ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理した。
流量：２００μｌ／分、２５℃；注入量：１０μｌ。
使用したカラム：７．５×２．１ｍｍガードカラムと連結された、Ａｌｌｔｉｍａ ＨＰ Ｃ１８ ３μｍ １５０×２．１ｍｍ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，Ｄｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。
ＥＳＩ：ネブライザーガスＮ２，圧力５０ｐｓｉ、温度３５０℃、乾燥ガス１０ｌ／分
質量取得：５０～１５００ｍ／ｚの範囲で交流するフルスキャン；真空圧：１．４×１０～５ｍバール。
流量：２００μｌ／分、２５℃；注入量：１０μｌ。
使用したカラム：７．５×２．１ｍｍガードカラムと連結された、Ａｌｌｔｉｍａ ＨＰ Ｃ１８ ３μｍ １５０×２．１ｍｍ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，Ｄｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。
ＥＳＩ：ネブライザーガスＮ２，圧力５０ｐｓｉ、温度３５０℃、乾燥ガス１０ｌ／分
質量取得：５０～１５００ｍ／ｚの範囲で交流するフルスキャン；真空圧：１．４×１０～５ｍバール。
【0126】
タンデム質量分析法の場合：フラグメンテーション振幅：１Ｖ；衝突ガス：ヘリウム。
【0127】
使用したクロマトグラフ分離法は以下の通りであった：
溶離液：
－溶液Ａ：５％ＡＣＮ及び０．５％ギ酸水溶液、溶液Ｂ：１００％ＡＣＮ
溶離の合計時間：４２分
勾配：
－分析の開始：溶離液Ａ１００％；
－勾配１：１０％の溶離液Ｂを２分；
－勾配２：２分時点で、２０％のＢを１０分；
－勾配３：１２分時点で、２５％のＢを２分；
－勾配４：１４分時点で、７０％のＢを７分；
－イソクラティック１：７０％のＢで６分；
－勾配５：２７分時点で、９０％のＢを５分；
－イソクラティック２：１０分間９０％のＢ；
－カラムの最終再平衡化：４２分時点で、０％のＢを１分、６０分時点で分析の終了。
溶離液：
－溶液Ａ：５％ＡＣＮ及び０．５％ギ酸水溶液、溶液Ｂ：１００％ＡＣＮ
溶離の合計時間：４２分
勾配：
－分析の開始：溶離液Ａ１００％；
－勾配１：１０％の溶離液Ｂを２分；
－勾配２：２分時点で、２０％のＢを１０分；
－勾配３：１２分時点で、２５％のＢを２分；
－勾配４：１４分時点で、７０％のＢを７分；
－イソクラティック１：７０％のＢで６分；
－勾配５：２７分時点で、９０％のＢを５分；
－イソクラティック２：１０分間９０％のＢ；
－カラムの最終再平衡化：４２分時点で、０％のＢを１分、６０分時点で分析の終了。
【0128】
Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ５．２－Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．２ソフトウェアプログラム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、クロマトグラム及び質量分析に関するデータを専有のＢｒｕｋｅｒフォーマットから．ｎｅｔｃｄｆフォーマットに変換した。
【0129】
ＭＺｍｉｎｅ－ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２１ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｚｍｉｎｅ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を用いて、クロマトグラフ分析から情報を抽出した。
【0130】
図５は、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の分裂組織細胞のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのクロマトグラムを示す。
【0131】
このプロフィールは、２５分の保持時間でドミナントピークを示す。このピークは、チコリ酸のそれ（商業的標準、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と等しいｍ／ｚ値及びフラグメンテーションプロフィール（ＭＳ／ＭＳ）を有する。
【0132】
図６は、負イオン化モードを用い、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスに対して実施された分析のクロマトグラムを３次元で示す。
ｃ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中の多糖含量の定量分析
分析は、フェノール硫酸法（Ｓｅｇａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ Ｊ Ｅｎｏｌ Ｖｉｔｉｃ．）を改変することによって実施した。この方法は、多糖の酸加水分解を伴い、これにより単糖が放出される。単糖は、フェノールと反応して、黄色を発色し、これは、４９０ｎｍで分光光度計を用いて測定することができる。得られた結果は、５２０ｍｇ／ｇのＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスと同等の量の多糖を示し、これは、５２％に相当する。
ｄ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのタンパク質含量の分析
Ｌｙｎｃｈ，Ｊ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，“Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９），８２（６），１３８９－１３９８に記載されている通り、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法を用い、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスに対して、タンパク態窒素の総含量の測定を実施した。
ｃ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中の多糖含量の定量分析
分析は、フェノール硫酸法（Ｓｅｇａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ Ｊ Ｅｎｏｌ Ｖｉｔｉｃ．）を改変することによって実施した。この方法は、多糖の酸加水分解を伴い、これにより単糖が放出される。単糖は、フェノールと反応して、黄色を発色し、これは、４９０ｎｍで分光光度計を用いて測定することができる。得られた結果は、５２０ｍｇ／ｇのＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスと同等の量の多糖を示し、これは、５２％に相当する。
ｄ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスのタンパク質含量の分析
Ｌｙｎｃｈ，Ｊ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，“Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９），８２（６），１３８９－１３９８に記載されている通り、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法を用い、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスに対して、タンパク態窒素の総含量の測定を実施した。
【0133】
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中のタンパク質含量は、１５％ｗ／ｗであった。
ｅ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの脂質含量の分析
Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｘｈｌｅｔ ｌｉｐｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｇｒａｓａｓ ｙ Ａｃｅｉｔｅｓ（１９９７），４８（４），２２６－２３０に記載されている方法に従って、少なくとも１２時間にわたる、ジクロロメタンでのＳｏｘｈｌｅｔ抽出により、全脂質画分の抽出をＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスに対して実施した。
ｅ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの脂質含量の分析
Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｘｈｌｅｔ ｌｉｐｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｇｒａｓａｓ ｙ Ａｃｅｉｔｅｓ（１９９７），４８（４），２２６－２３０に記載されている方法に従って、少なくとも１２時間にわたる、ジクロロメタンでのＳｏｘｈｌｅｔ抽出により、全脂質画分の抽出をＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスに対して実施した。
【0134】
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中の脂質含量は、８．８％ｗ／ｗに等しかった。
ｆ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中の水分及び灰の分析
４０℃のストーブに材料を１２時間放置することにより、フィトコンプレックスに対して水分の測定を実施した。灰の測定は、一定重量に到達するまで、３００℃のマッフル炉内で材料を処理することにより取得した。
ｆ）ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックス中の水分及び灰の分析
４０℃のストーブに材料を１２時間放置することにより、フィトコンプレックスに対して水分の測定を実施した。灰の測定は、一定重量に到達するまで、３００℃のマッフル炉内で材料を処理することにより取得した。
【0135】
フィトコンプレックスの水分は、３％に等しく、灰は、３％に等しかった。
【0136】
細胞株の選択前後のポリフェノールの比較
エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の分裂組織細胞のカルスを分析して、選択前のそれらのポリフェノール含量、特にそれらのチコリ酸含量を定量した。使用した分析方法は、前述したＵＰＬＣ分析であった。図４から明らかなように、選択された株Ｅｐ－２Ｐ（Ａ）は、初期細胞（Ｂ）のそれより３９倍高い総ポリフェノール含量（チコリ酸相当量として表される）を示す。
エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の分裂組織細胞のカルスを分析して、選択前のそれらのポリフェノール含量、特にそれらのチコリ酸含量を定量した。使用した分析方法は、前述したＵＰＬＣ分析であった。図４から明らかなように、選択された株Ｅｐ－２Ｐ（Ａ）は、初期細胞（Ｂ）のそれより３９倍高い総ポリフェノール含量（チコリ酸相当量として表される）を示す。
【0137】
工業規模でのＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの調製
固体ＥＰ培地中で培養した、Ｅｐ－２Ｐと称されるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の株に由来する、既述のように安定化及び選択した分裂組織細胞を、２００ｍｌの液体ＥＰ培地を含有する１リットル容量の１０のフラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖに等しかった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、８００ｍｌの液体ＥＰ培地を含有する３リットル容量の１０のフラスコに接種した。２００ｍｌの細胞懸濁液を、３リットル容量のフラスコに入った８００ｍｌのＥＰ培地中に移した。こうして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、８０リットルのＥＰ－Ｆ培地を含有するバイオリアクターを接種した。２５℃の暗所でバイオリアクターで７日増殖させた後、５ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルを細胞懸濁液に添加した。
固体ＥＰ培地中で培養した、Ｅｐ－２Ｐと称されるエキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の株に由来する、既述のように安定化及び選択した分裂組織細胞を、２００ｍｌの液体ＥＰ培地を含有する１リットル容量の１０のフラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖに等しかった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、８００ｍｌの液体ＥＰ培地を含有する３リットル容量の１０のフラスコに接種した。２００ｍｌの細胞懸濁液を、３リットル容量のフラスコに入った８００ｍｌのＥＰ培地中に移した。こうして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、８０リットルのＥＰ－Ｆ培地を含有するバイオリアクターを接種した。２５℃の暗所でバイオリアクターで７日増殖させた後、５ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルを細胞懸濁液に添加した。
【0138】
さらに７日のインキュベーション後、植物バイオマス（９０リットルの細胞懸濁液）を収集し、孔径５０μｍのナイロンメッシュで濾過し、５６Ｌの滅菌食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ）で洗浄した。洗浄した細胞（新鮮重量２８Ｋｇ）に２８０ｇのクエン酸を添加し、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘでホモジナイズした。
【0139】
ホモジナイズした細胞を乾燥させた。９０リットルの細胞懸濁液から、２９５０ｇのＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが得られた。
生物学的試験：コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの遺伝子発現の増大
高齢者ドナーからのヒト線維芽細胞の微小組織を用いて、コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの生合成の刺激の評価を実施した。０．０３％及び０．１％濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスを用いて、アッセイをセットアップした。アッセイに用いた濃度は、消費者に使用されることになる化粧品処方中のフィトコンプレックスの最終濃度と同等である。
生物学的試験：コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの遺伝子発現の増大
高齢者ドナーからのヒト線維芽細胞の微小組織を用いて、コラーゲンＩＩＩ及びＩＶの生合成の刺激の評価を実施した。０．０３％及び０．１％濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスを用いて、アッセイをセットアップした。アッセイに用いた濃度は、消費者に使用されることになる化粧品処方中のフィトコンプレックスの最終濃度と同等である。
【0140】
０．０３％及び０．１％のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスを微小組織と接触させて７２時間放置した。皮膚微小組織は、６０歳のドナーから採取した一次皮膚線維芽細胞から調製した。０．２２μｍフィルターで濾過した特定の培地（線維芽細胞培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ））中で７２時間のインキュベーション終了時に、ＰＣＲ及び組織学的分析を実施するために、微小組織を収集した。ＰＣＲ分析は、キットを用いてＲＮＡを抽出することにより実施した。抽出したＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ技術を用いてバイオマーカ遺伝子の発現を試験した。抽出物で処理したサンプルを、未処理のものと比較することにより、遺伝子発現の変動を評価した。図７は、コラーゲンＩＩＩ及びコラーゲンＩＶの遺伝子発現に関する結果を示す。
【0141】
結果は、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが、コラーゲンＩＶの遺伝子発現の増大を誘導するのに対して、コラーゲンＩＩＩの場合、効果はそれほど顕著ではないことを示している。フィトコンプレックスによる処理から７２時間後に調製した微小組織の低温切片を抗コラーゲンＩＩＩ抗体（Ａｂｃａｍ）で処理し、核をＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ ＤＭ ２５００蛍光顕微鏡を用いて、シグナルを観察した。図８では、未処理の微小組織と比較して、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスで処理した微小組織中のコラーゲンＩＩＩの沈着の増加が認められる。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗炎症活性
ＬＰＳによる刺激後のＪ７７４ Ａ１マクロファージ細胞株を用いて、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗炎症活性の評価を実施した。使用した試験は、Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，２０１７に記載されている。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗炎症活性
ＬＰＳによる刺激後のＪ７７４ Ａ１マクロファージ細胞株を用いて、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗炎症活性の評価を実施した。使用した試験は、Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，２０１７に記載されている。
【0142】
ＬＰＳによる刺激後のマクロファージ細胞中のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）の保護効果を評価するために、ＭＴＴ比色分析法を用いて、細胞生存率を評価した。図９は、ＬＰＳと共に、０．５～０．１及び０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）による処理後の細胞生存率データを示す。これらの結果から、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが、有意な保護効果を及ぼすことがわかる。
【0143】
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗炎症活性を評価することを目標として、以下のパラメータ：ＩｋＢ－α、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２をウエスタンブロット分析により評価した。図１０に示す結果から、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、フィトコンプレックスは、酵素ｉＮＯＸ及びＣＯＸ－２の発現を有意に低減すると共に、ＩｋＢ－αの分解を予防することがわかる。
【0144】
炎症性サイトカインＴＮＦα及びＩＬ－１βのレベルをＥＬＩＳＡ分析により評価した。ＬＰＳでの刺激後、炎症性サイトカインの増加を観察した。０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）による処理は、図１１のグラフによって証明される通り、これらのサイトカインのレベルを有意に低減する。
【0145】
全体として、得られた結果は、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが、炎症性酵素ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２並びにサイトカインＴＮＦα及びＩＬ－１βの調節を通して顕著な抗炎症活性を及ぼすことを実証するものである。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗酸化活性
ａ）ヒトケラチノサイト中のＲＯＳの生成の評価
ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡ）プローブを用いて、活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内生成を評価した；このプローブは、細胞内に内在化され、ここで、エステラーゼの存在下、脱アセチル化された後、蛍光化合物中に存在するＲＯＳにより酸化される。ＤＣＦの蛍光の強度をＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＰｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＶＩＣＴＯＲ ＴＭ Ｘ３ ２０３０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ（λｅｃ＝４８５ｎｍ；λｅｍ＝５３５ｎｍ）で読み取ると、細胞自体に存在するＲＯＳの量と比例している。ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗酸化活性を試験するために使用した実験モデルは、細胞株ＨａＣａＴ、即ち、ヒトケラチノサイトの株であった。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗酸化活性
ａ）ヒトケラチノサイト中のＲＯＳの生成の評価
ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡ）プローブを用いて、活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内生成を評価した；このプローブは、細胞内に内在化され、ここで、エステラーゼの存在下、脱アセチル化された後、蛍光化合物中に存在するＲＯＳにより酸化される。ＤＣＦの蛍光の強度をＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＰｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＶＩＣＴＯＲ ＴＭ Ｘ３ ２０３０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ（λｅｃ＝４８５ｎｍ；λｅｍ＝５３５ｎｍ）で読み取ると、細胞自体に存在するＲＯＳの量と比例している。ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの抗酸化活性を試験するために使用した実験モデルは、細胞株ＨａＣａＴ、即ち、ヒトケラチノサイトの株であった。
【0146】
図１２は、０．１％ｗ／ｖの濃度のＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）、並びにその公知の抗酸化作用を考慮して、陽性対照としてのＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）による３時間の処理に関するデータを示す。実験は、基本条件と、２００μＭのＨ2Ｏ2により誘導された酸化ストレスの条件の両方の下で実施した。これらのデータは、両方の条件下で、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスが、活性酸素種を有意に低減したことを明らかにする。
ｂ）Ｊ７７４－Ａ１マクロファージにおける抗酸化活性の評価
ＬＰＳによるストレス後のＪ７７４－Ａ１マクロファージ細胞モデルを用いて、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）の抗酸化活性の評価を実施した。実験の一部は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで処理したマクロファージに対して実施し、別の部は、ＬＰＳ及びＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）０．５ｍｇ／ｍＬで処理したマクロファージを用いて実施した。
ｂ）Ｊ７７４－Ａ１マクロファージにおける抗酸化活性の評価
ＬＰＳによるストレス後のＪ７７４－Ａ１マクロファージ細胞モデルを用いて、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）の抗酸化活性の評価を実施した。実験の一部は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで処理したマクロファージに対して実施し、別の部は、ＬＰＳ及びＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）０．５ｍｇ／ｍＬで処理したマクロファージを用いて実施した。
【0147】
フィトコンプレックスの抗酸化活性を評価するために、培地中に放出された亜硝酸塩及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルを分析した。亜硝酸塩の定量は、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬を用いて実施した。ＬＰＳで処理しなかった細胞は、非常に低いレベルの亜硝酸塩（ＮＯ2－）を放出するのに対し、ＬＰＳで刺激すると、ＮＯ2－のレベルは有意に増加する（図１３）。ＭＤＡは、細胞膜の脂質過酸化の産物の１つであり、酸化ストレスの程度を表す。ＭＤＡの評価は、細胞溶解後のＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）アッセイを用いて実施した。ＭＤＡは、反応環境に添加されたチオバルビツール酸（ＴＢＡ）と化学的に結合する能力を有する。酸性度及び温度の好適な条件下で、酸化基質は、分光光度法により決定することができる色素形成付加物ＴＢＡ－ＭＤＡ－ＴＢＡを形成する。ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）による処理は、酸化ストレスに起因する脂質過酸化を有意に防止する。得られた結果から、ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）は、亜硝酸塩の放出を低減すると共に、脂質過酸化を阻害することによって、抗酸化活性を及ぼすことがわかる。
【0148】
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスの２相及び多重エマルジョン、ゲル並びに皮膚及び毛髪洗浄系への製剤化
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）と称されるＥｐ－２Ｐ株のホモジネートを３％ｗ／ｗの濃度でグリセリンに分散させた（ＩＮＣＩ名：グリセリン、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）カルス溶解物、クエン酸）。分散液を３％で以下に記載する処方に添加した。
ＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）と称されるＥｐ－２Ｐ株のホモジネートを３％ｗ／ｗの濃度でグリセリンに分散させた（ＩＮＣＩ名：グリセリン、エキナセア・プルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）カルス溶解物、クエン酸）。分散液を３％で以下に記載する処方に添加した。
【0149】
エマルジョン及びゲル製剤の場合、水相の成分を混合し、７０℃に加熱する。油相の成分を混合し、７５℃に加熱する。ターボ乳化機の作用下で、２つの相を合わせる。約４０℃に冷却した後、穏やかに攪拌しながらグリセリン中に分散させたＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスを添加する。
【0150】
洗浄系の場合、穏やかに攪拌しながら水と上清を混合する。７０℃に加熱した後、存在すれば、７５℃で油相を添加する。４０℃未満で穏やかに攪拌しながらグリセリン中に分散させたＥｃｈｉＰｕｒｅ－ＰＣ（登録商標）フィトコンプレックスを添加する。
【表3】
【表4】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【国際調査報告】