特表 2022-527854 小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための安定な系、前記細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための安定な方法、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための前記系または方法の使用。

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-06

(54)【発明の名称】小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための安定な系、前記細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための安定な方法、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための前記系または方法の使用。

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20220530BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0793

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021560239

(86)(22)【出願日】2020-03-19

(85)【翻訳文提出日】2021-11-15

(86)【国際出願番号】 IB2020052513

(87)【国際公開番号】W WO2020194141

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】102019000004377

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521439970

【氏名又は名称】ウニヴェルシタ・デッリ・ストゥーディ・ディ・ローマ・“ラ・サピエンツァ”

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ’ ＤＥＧＬＩ ＳＴＵＤＩ ＤＩ ＲＯＭＡ ’ＬＡ ＳＡＰＩＥＮＺＡ’

(71)【出願人】

【識別番号】510121547

【氏名又は名称】フォンダツィオーネ・イスティトゥート・イタリアーノ・ディ・テクノロジャ

【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＺＩＯＮＥ ＩＳＴＩＴＵＴＯ ＩＴＡＬＩＡＮＯ ＤＩ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ジャンニーニ，ジュゼッペ

(72)【発明者】

【氏名】コリッキア，ヴァレーリア

(72)【発明者】

【氏名】カパルボ，カルロ

(72)【発明者】

【氏名】ファブレッティ，フランチェスカ

(72)【発明者】

【氏名】ディ ジュリオ，ステファノ

(72)【発明者】

【氏名】ベラルディニッリ，フランチェスカ

(72)【発明者】

【氏名】ペトローニ，マリアラウラ

(72)【発明者】

【氏名】ロンセロ，マリア サウン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BD21

4B065BD39

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、培養支持体、哺乳類ＧＣＰ細胞、および少なくともＳＡＧ（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄのアゴニスト）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含む培養培地、を含む小脳顆粒細胞前駆細胞（顆粒細胞前駆細胞、ＧＣＰ）の培養のためのｉｎ ｖｉｔｒｏの系、およびＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法、および、小脳顆粒の病態生理学の研究のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの生成のための上記培養系または培養方法の使用、または損傷もしくは神経変性に起因する小脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおける使用のための上記培養系もしくは培養方法の使用、に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養培地、
哺乳類の小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）、ならびに
少なくともＳＡＧ（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄのアゴニスト）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含む培養培地、
を含む、ＧＣＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系。

【請求項2】

該哺乳類のＧＣＰ細胞が、げっ歯類の、好ましくは非トランスジェニックマウスの、好ましくは生後７日目（Ｐ７）に採取した脳から得られたＧＣＰ細胞である、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系。

【請求項3】

ＤＭＥＭ－Ｆ１２（すなわち、ダルベッコ改変イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７サプリメント、インスリン、ＮＡＬＣ（すなわち、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、およびヘパリンを含む群より選択された少なくとも１つ以上のその他の成分に加えて、該培養培地が少なくとも１つの抗生物質を含む、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系。

【請求項4】

該培地がＳＡＧ、ＥＧＦ、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（すなわちダルベッコ改変イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７サプリメント、インスリン、ＮＡＬＣ（すなわち、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、ヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、前述の請求項の何れか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系。

【請求項5】

（ａ）哺乳類の小脳からＧＣＰ細胞を単離する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得たＧＣＰ細胞を少なくともＳＡＧおよびＥＧＦを含む培養培地中に置く工程、
（ｃ）ＧＣＰ細胞を富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）する、および／または希釈によって増殖させる工程、
を含む、ＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法

【請求項6】

哺乳類の脳の小脳からＧＣＰ細胞を単離する工程（ａ）が、好ましくはハンクス平衡生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）、グルコース、ＤＮａｓｅおよび少なくとも１種の抗生物質を含む緩衝系において、哺乳類の小脳を破砕することによるものである、請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法。

【請求項7】

工程（ｂ）の培養培地中のＧＣＰ細胞が１０，０００から３０，０００細胞／ｃｍ^２の範囲で希釈されている、好ましくは、１６，０００細胞／ｃｍ^２に希釈されている、請求項５または６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法。

【請求項8】

工程ｃ）におけるＧＣＰ細胞を、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素を含む溶液で定期的に解離させる、請求項５－７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法。

【請求項9】

小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または疾患の研究のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの生成のための、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系および請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法の使用。

【請求項10】

小脳の変性疾患のマウスモデルを参照するＧＣＰ細胞株を作成するための、請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法の使用。

【請求項11】

増殖性または分化性顆粒細胞および非増殖性通常顆粒細胞での比較において、腫瘍性顆粒細胞に対する旧薬および新薬の毒性を比較するための、小脳腫瘍の一次細胞モデルおよびコントロールを提供するための、請求項１に記載の系、または請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法の使用。

【請求項12】

小脳顆粒細胞に作用し得る薬剤または物質のスクリーニング方法における、請求項１に記載の系または請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法の使用。

【請求項13】

損傷または神経変性に起因する脳疾患、好ましくは毛細血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン症候群、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、脊髄小脳変性症、その他の小脳疾患を含む群から選択された脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおいて使用するための、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または請求項５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の技術分野
本発明は、
以下を含む小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系に関する：
培養培地、
哺乳類のＧＣＰ細胞、および
少なくともＳＡＧ（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄのアゴニスト）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含む培養培地；
以下の工程を含むＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法に関する：
（ａ）哺乳類の小脳からＧＣＰ細胞を単離する工程
（ｂ）工程（ａ）で得たＧＣＰ細胞を、少なくともＳＡＧおよびＥＧＦを含む培養培地中に置く工程
（ｃ）ＧＣＰ細胞を富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）する、および／または希釈によって増殖させる工程；および
小脳顆粒細胞の病態生理学の研究のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの生成のための該培養系または培養方法の使用、または損傷もしくは神経変性に起因する小脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおける該培養系または培養方法の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

先行技術
小脳はバランス、姿勢、随意運動の維持のための器官である。この器官は、自身の細胞の形成に重要な２つの脳室帯（Ｇｅｒｍｉｎａｌ ｚｏｎｅ）；脳室帯（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ、ＶＺ）および菱脳唇（Ｒｈｏｍｂｉｃ Ｌｉｐ、ＲＬ）に区切られている。

【0003】

プルキンエ細胞、ゴルジ細胞、および深部核の神経細胞は、脳室帯（ＶＺ）から生成される。

【0004】

小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）は菱脳唇（ＲＬ）から生成される。

【0005】

マウスの発生（胚形成期Ｅ１０前後）およびヒトの発生過程では、ＧＣＰ細胞層は急激な増殖段階に入り、小脳原基表面の接線方向に沿って移動し（Ｅ１５の段階）、および小脳全体を覆う外顆粒層（またはＥＧＬ）と呼ばれる層を形成する。この層は生後最大１０日目まで拡大し、続いてＧＣＰは成熟顆粒細胞への分化を開始し、プルキンエ細胞層を通過しながら移動して内顆粒層（ＩＧＬ）を形成する。

【0006】

この点に関して、ＧＣＰ細胞の増殖、移動および分化過程は小脳の適切な発達および機能に必須であり、およびそれらを制御する分子経路における欠陥は種々の疾患の原因となることに注目すべきである（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｐｌｕｓ．ｇｏｖ／ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ｈｔｍｌを参照）。この点に関して、発達過程の障害（例えば、毛細血管拡張性運動失調症、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群）、神経変性疾患（例えば脊髄小脳変性症）および腫瘍性形質転換（例えば髄芽腫）などが報告されている。

【0007】

ＧＣＰの増殖、移動、分化を促す分子経路については、文献から数え切れないほどの研究が知られているが、これらの経路はまだ完全には解明されていない。

【0008】

これはまた、病態生理学的な特徴を完全に保存しながら、制御経路を研究できる適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ研究モデルが無いことにも起因している。

【0009】

ＧＣＰ細胞の増殖を誘導する基本的な経路の１つは、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）経路であり、その制御の消失は、ヒトおよびマウス両者のモデルにおいて、髄芽腫（しばしばＧＣＰ細胞の絶え間ない増殖に起因する小児がん）の発生に関連するほどである。

【0010】

周知技術では、Ｓｈｈ経路に依存的な髄芽種の細胞モデルがＧＣＰ細胞およびその経路の分子メカニズムの研究モデルとして用いられてきたが、しかしこれらのモデルで用いられてきた通常の細胞培養条件は、実際にはＳｈｈ経路を抑制するために、前述のモデルは、その元となる病理だけでなくＧＣＰ細胞の生理を代表する事にも全く適さないことに留意すべきである。

【0011】

周知技術において広く知られたｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＣＰ細胞研究モデルは、合成Ｓｈｈペプチドまたは化学経路アゴニスト、例えばＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト）によって凝集させられ、およびそれらによって刺激されるマウスのＧＣＰ細胞（Ｐ７マウスから採取）の一過性培養物によって構成される。

【0012】

しかし、これらの培養物は自発的に、数日以内に（典型的には５－６日）に増殖しない顆粒細胞へと分化するため、よって経時的に非常に安定というわけではない。

【0013】

本発明者らによる未発表の研究では、マウスのＧＣＰ細胞（Ｐ７マウスから採取）をＳＡＧで刺激した後に、ニューロスフェアの形態でより長く維持し得る事を示しているが、しかしこの条件であっても長期間安定な細胞培養を保証するものではない。

【0014】

よって、短期間および特に長期間における、ＧＣＰ細胞培養の安定性は当分野における大きな問題である。

【0015】

これによって、ＧＣＰ細胞またはＳｈｈ経路を研究する研究者たちは、実験動物を犠牲にして新しく培養を行わなければならず、実験のばらつきや、研究の時間および費用に影響を与えている。

【0016】

これまで、上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に富んだ無血清培地中のＧＣＰ細胞培養が知られている。これらの培養物は経時的に安定的であるが、ＧＣＰに典型的な生理学的経路（例えばＳｈｈ経路）を発現せず、および分化実験において、それらは神経細胞成分よりもグリア細胞成分の割合が高い混合細胞集団を構成する。

【0017】

ＦＧＦがＳｈｈ経路を阻害する事および小脳顆粒細胞前駆細胞の生育を制限することは実際に知られていた。

【0018】

したがって、このやり方で取得された培養物は遺伝子的／生化学的な発現パターンにおいてＧＣＰ細胞とは著しく異なっており、およびこの系は非神経細胞集団にひどく汚染されている。

【0019】

したがって、これらの培養物は信頼性が低く、および再現性も高くない。

【0020】

よって、前述のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法および研究モデルは、一般的に用いられているとは言え、ＧＣＰ細胞を適切に代表するものではない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

したがって、これまで当分野では、同時に安定であり、信頼性があり、再現性があり、調整が容易であり、およびＧＣＰ細胞の富化または増殖を容易にするだけでなく、非常に長期間にわたる経時的なＧＣＰ細胞の維持を可能にし、および最適な遺伝子および生化学的発現を得ることができる、ＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系または方法は知られていない。

【0022】

したがって、上記の周知技術の欠点の全てを克服したＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系および方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0023】

発明の概要
驚くべきことに、当分野で知られたＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系および／または方法の欠点を全て克服した、ＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系および方法が見出された。

【0024】

特に、本発明のＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系および方法は、単純であり、信頼性があり、容易に再現可能であり、および極めて安定である（経時的に、しかしまた得られるＧＣＰ細胞培養物の遺伝子的／生化学的な発現プロファイルに関しては、新鮮なＧＣＰ細胞培養物のそれと非常に類似しており、およびまたそれらの凍結および解凍の可能性に関しても、それらの特性を変化させない保存方法である）。

【0025】

よって、本発明の第１の目的は、小脳顆粒細胞前駆細胞（ＧＣＰ）の培養のためのｉｎ ｖｉｔｒｏの系であって、以下を含む：
培養培地、
哺乳類ＧＣＰ細胞、および
少なくともＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含む培養培地。

【0026】

本発明の第２の目的は、ＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法であって、以下の工程を含む：
（ａ）哺乳類の小脳からＧＣＰ細胞を単離する工程
（ｂ）工程（ａ）で得た個々のＧＣＰ細胞を少なくともＳＡＧおよびＥＧＦを含む培養培地中に置く工程
（ｃ）ＧＣＰ細胞を富化する、および／または希釈によって増殖させる工程、

【0027】

本発明のその他の目的は、小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または病理の研究のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または培養方法の使用である。

【0028】

本発明のその他の目的は、損傷または神経変性に起因する小脳疾患への遺伝子および細胞療法アプローチにおいて使用するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための培養系または培養方法である。

【0029】

全ての本発明の目的は、特許請求の範囲においてさらによく定義されており、従属項は本発明の好ましい実施形態を記載しており、およびこの記載の不可欠な部分を形成している。

【図面の簡単な説明】

【0030】

図面の簡単な説明

【図1】図１は、本発明の目的であるＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法を図示したものである。

【0031】

【図2】図２は、小脳から分離した細胞をいくつかの因子の存在下で培養することで得られた平均の細胞球を示す。このグラフは、本発明の目的である条件が、培養７日後に高いクローン原性能力を有する事を示す。図中においてＮＳはニューロスフェアを指す。

【0032】

【図3】図３は、異なるニューロスフェア培養物の代表的な位相差顕微鏡画像である。

【0033】

【図4】図４は、ウェスタンブロット法で観察した、異なる培養条件下における、Ｓｈｈ経路の分子バイオマーカーであるＧｌｉ１およびＮ－Ｍｙｃの発現を示す。β－アクチンの発現量によってロード量をノーマライズする。この画像は、ＳＡＧまたはＥＧＦ＋ＳＡＧの存在下で生育したニューロスフェアにおいてのみ経路が活性化される事を示し、後者の条件は本発明の目的である。

【0034】

【図5】図５はリアルタイムＱ－ＰＣＲによるその発現標的の解析を通じて観察されたＳｈｈ経路の発現を示す。値はΔＣＴで示した。図４と同様に、ここでもＥＧＦ＋ＳＡＧの存在下で生育されたニューロスフェアがＳＡＧの存在下で生育されたものと同等のＳｈｈ経路の活性化レベルを示し、凝集生育顆粒細胞前駆細胞の標準培養物（ＳＧＣＰ）に比べてさらに高い活性化レベルを示す事が明らかである。

【0035】

【図6】図６は、本発明の培養系において、ＳＧＣＰ培養と比較して、最も一般的な分化後顆粒細胞マーカー（Ｐａｘ６、Ｃｎｔｎ２、Ｚｉｃ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｚｉｃ３）の発現が低下していることを示す。反対に、顆粒細胞前駆細胞のマーカー（Ａｔｏｈ１）は高い発現量を維持している。リアルタイムＱ－ＰＣＲで得られた遺伝子発現の値をΔＣＴで示した。

【0036】

【図7】図７は、位相差蛍光顕微鏡によって得られる、それぞれ示された適切に分化する条件（１％胎児血清、または１％胎児血清＋ビタミンＡ）下で生育したニューロスフェアにおける、神経細胞の表現型、およびβ３チューブリン神経細胞マーカーの発現の画像を示す。本発明のニューロスフェアは、明らかに神経細胞の表現型を獲得し分化する事ができ、およびＳＡＧの存在下で生育および同じ条件下で分化させたニューロスフェアと同様にβ３チューブリンの発現がポジティブである。

【0037】

【図8】図８は、経時的にＳＡＧまたはＥＧＦ＋ＳＡＧの存在下で生育した培養物から得られたスフェアの平均を示す。グラフから見て取れるように、本発明の目的であるＥＧＦ＋ＳＡＧ条件は、生育数週間後も高いクローン原性能力を維持しており、一方でＳＡＧのみの条件では、徐々に減少する。

【0038】

【図9】図９は、ＳＡＧまたはＥＧＦ＋ＳＡＧ（図８と同様）の存在下で生育した培養物の培養から４週間後の代表的な写真を示す。

【0039】

【図10】図１０は、Ｇｌｉ１およびＮ－Ｍｙｃなどの分子バイオマーカーの発現によって確かめられるように、ＥＧＦ＋ＳＡＧの存在下で６週間生育したニューロスフェアにおいて、Ｓｈｈ経路の活性が持続している事を示す。

【0040】

【図11】図１１は、ＥＧＦ＋ＳＡＧの存在下で生育したニューロスフェアにおいて、ＳＡＧのみの存在下で生育したものに比べて、ネスチンおよびＳＯＸ２の幹細胞マーカーがより高く発現することを示す。リアルタイムＱ－ＰＣＲで得られた値を、ＳＡＧのみの存在下で生育した培養物におけるその値に対する比率として示した。

【発明を実施するための形態】

【0041】

本発明の詳細な説明
本発明の第１の目的は、請求項１に記載のＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系である。

【0042】

本発明において、ＧＣＰ細胞（顆粒細胞前駆細胞）という用語は小脳顆粒細胞前駆細胞を意味する。

【0043】

本発明における「培養培地」という用語は、好ましくは細胞培養に適したポリスチレンフラスコなどの固体培地を意味する。

【0044】

本発明における哺乳類のＧＣＰ細胞とは、通常の哺乳動物（ヒトを含む）、または組み換え哺乳動物（ヒトを除く）の小脳に由来するＧＣＰ細胞であることを意味する。好ましくは本発明における系および方法のＧＣＰ細胞はげっ歯類のＧＣＰ細胞であり、好ましくは非組み換えマウス細胞であり、好ましくは生後７日目（Ｐ７）に採取した脳から得られたものである。本発明における系および方法は好ましくは以下のマウス系統を用いる：ＣＤ１、Ｃ５７ＢＩ／６および１２９。

【0045】

本発明の系および方法におけるＧＣＰ細胞は、ヒトの胚に由来するＧＣＰ細胞ではない。

【0046】

本発明のＧＣＰ細胞は、典型的には基質接着無しで、および典型的にはニューロスフェア（ＮＳとも呼ばれる）として培養される。

【0047】

本発明の培養培地は少なくともＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含む。

【0048】

本発明の培養培地において、ＳＡＧは典型的には１００ｎＭから１μＭの濃度範囲であり、好ましくは２００ｎＭの濃度であって、一方ＥＧＦは典型的には２００ｎＭから１μＭの濃度範囲であり、好ましくは１μＭの濃度である。本発明の培地は、ＳＡＧ以外、およびＥＧＦ以外の成分を含んでいてもよく、および特に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（すなわちダルベッコ改変イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７、インスリン、ＮＡＬＣ（すなわち、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、ヘパリン、および少なくとも１つの抗生物質から選択された少なくとも１つの追加の成分を含んでいてよい。

【0049】

本発明において、抗生物質は典型的にはペニシリンおよび／またはストレプトマイシンを意味する。本発明の好ましい態様では、ここで用いられる培地は、ＳＡＧ、ＥＧＦ、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（すなわちダルベッコ改変イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７サプリメント、インスリン、ＮＡＬＣ（すなわち、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、ヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む。

【0050】

本発明の好ましい態様では、ＤＭＥＭ－Ｆ１２はここで用いられる培養培地の主な成分であり；ここに、典型的には３ｍｇ／ｍｌの濃度のグルコース；典型的には１Ｘの終濃度で用いられるビタミンＡフリーＢ２７サプリメント（５０Ｘの濃度と比較。実際に、このＢ２７はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ社から購入したコード１２５８７０１０のものであり、最終溶液中で５０倍に希釈される）；典型的には５０μｇ／ｍｌの濃度のインスリン；典型的には６０ｇ／ｍｌの濃度のＮＡＬＣ；典型的には２μｇ／ｍｌの濃度のヘパリン；抗生物質に関して、典型的には１００ユニット／ｍｌの濃度のペニシリンおよび典型的には０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシンが添加される。

【0051】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系における哺乳類ＧＣＰ細胞は、拡大させ、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）を駆動させ、または生育および／または増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）させることができ、および典型的にはスフェロイドの形態（ニューロスフェア、ＮＳ）であり、および以下に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法によると、新鮮なＧＣＰ細胞培養物と同様の遺伝子的／生化学的な発現プロファイルを維持しながら、クローン原性アッセイおよび継続的な希釈アッセイから測定可能な、無限の増殖および自己新生状態に維持される。上記のように、この系および方法（以下で説明する）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで取得されたＧＣＰ細胞は、高い寛容性を持って脳に再移植され得る、かつ劣化の兆候を示すことなく容易に凍結および解凍し得るため、その市場性が促進される。

【0052】

本発明の系および方法における哺乳類 ＧＣＰ細胞はニューロスフェアを形成し、その形態またはコンフルエンスの程度を、透過型および／または走査型光顕微鏡で観察し得る。

【0053】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系はまた、Ａｔｈｏ１、Ｇｌｉ１、Ｎ－Ｍｙｃなどの特異的な哺乳類ＧＣＰ細胞マーカーを、ウェスタンブロット法、定量ＲＴ－ＰＣＲ法、および免疫蛍光法によって定性的および定量的にアッセイする事を可能にする。

【0054】

ＧＣＰ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法は、請求項５の対象である。

【0055】

前述の方法において、「ＧＣＰ細胞」は、上記に定義した哺乳類ＧＣＰ細胞を意味する；「培養支持体」および「培養培地」という用語についても同様であり、これらはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系において上記と同じ意味を持つ。

【0056】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法において、哺乳類の小脳からＧＣＰ細胞を単離する工程（ａ）は、哺乳類の小脳を、ハンクス平衡生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）、グルコース、ＤＮａｓｅ、および少なくとも１つの抗生物質を含み得る緩衝液系中で破砕する事を含み得る。

【0057】

「抗生物質」は好ましくは上記の１つ以上の抗生物質を意味する（ペニシリンおよび／またはストレプトマイシン）。

【0058】

好ましくは、ＨＢＳＳ緩衝系において、グルコースは典型的には終濃度５ｍｇ／ｍｌで添加され、ペニシリンは典型的には１００ユニット／ｍｌの濃度で添加され、ストレプトマイシンは典型的には０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加される。上記の溶液中で、血清ピペットを用いて粗いトリチュレーションを行った後、脳を１，３００ｒｐｍ（－１９０ｘｇ）で５分間遠心分離する。こうして得られたペレットを、１．３Ｕ／ｍｌの濃度のＤＮａｓｅを添加した同様の緩衝液系（ＨＢＳＳ、グルコースおよび抗生物質）中に再懸濁し、少なくとも５分間はパスツールピペットを通過させて分離を促進しつつ室温で３０分間置いた。１，３００ｒｐｍ（－１９０ｘｇ）で５分間の２回目の遠心分離の後、得られたＧＣＰ細胞を最終培地に再懸濁し、カウントした。

【0059】

続いて、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法における工程ｂ）において、工程ａ）で得られたＧＣＰ細胞は、培養培地中に置かれ、または播かれ、および培養培地中に典型的には１０，０００から３０，０００細胞／ｃｍ^２の範囲、好ましくは、１６．０００細胞／ｃｍ^２に希釈されている。

【0060】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法における培養培地は、好ましくはＤＭＥＭ－Ｆ１２、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７、インスリン、ＮＡＬＣ、ヘパリン、少なくとも１つの抗生物質、ＳＡＧおよびＥＧＦである。

【0061】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法における工程ｃ）、ＧＣＰ細胞を富化する、および／または希釈によって増殖させる工程、は典型的には３７℃の温度で、５％ＣＯ_２の存在下で行われる。このＧＣＰスフェロイド細胞は無期限に富化および／または増殖し得る。工程ｃ）におけるＧＣＰ細胞はまた、典型的にはタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素（Ａｃｃｕｔａｓｅ^登録商標として市販されている）を含む溶液用いて定期的に解離され、典型的には少なくとも週に２回解離される。Ａｃｃｕｔａｓｅ^登録商標処置に続いて、細胞は典型的には遠心分離され、それらの維持／培養培地に再懸濁され、必要に応じて１：２または１：３希釈で希釈され得る。

【0062】

本発明の１つの目的は、小脳顆粒細胞の病態生理学の研究、好ましくは、小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または病理の研究のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルを生成するために、前述のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための培養系または方法を使用することである。

【0063】

この目的に沿って、該ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または方法は、可能な限り生理に近い状況、しかし細胞の観点からは自律的な（ｃｅｌｌ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）状況で、ＧＣＰの発達、変性、および形質転換をもたらす機構を調査するにあたって再現性のある、および代表的な細胞モデルを、提供／生成するために有用であるだろう。

【0064】

分化後にはまた、この細胞モデルは小脳顆粒細胞の病態生理学的な特徴（シナプスの形成、神経伝達、など）を研究するための有用なツールとなり得る。

【0065】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法はまた、小脳の変性疾患のマウスモデル由来の細胞株を含むＧＣＰ細胞株の作成に適用し得、これらの疾患の研究への価値のある援助をもたらす。

【0066】

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または方法はまた、通常の増殖または分化した顆粒細胞および非増殖性の顆粒細胞と比較して、旧薬および新薬の腫瘍性顆粒細胞に対する毒性を比べるための一次細胞コントロールモデルを提供するのに有用であり、ｉｎ ｖｉｖｏの研究の前にｉｎ ｖｉｔｒｏ処置の望まない効果を推定する事ができる。

【0067】

特に好ましい態様では、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または方法は、小脳顆粒細胞に影響を与える機能不全または疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの生成に用いられ得る。

【0068】

別の特に好ましい態様では、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系または方法はまた、小脳顆粒細胞に対して作用し得る薬剤または物質のスクリーニングのための方法において用いられ得る。

【0069】

本発明の１つの目的は、損傷または神経変性に起因する脳疾患に対する遺伝子療法および細胞療法アプローチにおいて使用するための上記に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための系または方法である。

【0070】

これに関して、損傷または神経変性に起因する小脳疾患は、典型的には、毛細血管拡張性運動失調症、ナイミーヘン症候群、ジュベール症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、脊髄小脳変性症、または小脳のその他の疾患に関する。

【0071】

本発明の培養系および方法は、富化後に、適切な発達期または成体の哺乳類の小脳に再移植し得るＧＣＰ細胞の培養物を調製する事を可能にする。このようなＧＣＰ細胞は、疾患を患う個体由来ＧＣＰの遺伝子的欠損を遺伝子移植または遺伝子編集することによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの修正後、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法を参照したｉｎ ｖｉｔｒｏ富化、およびその後の小脳への再移植において、遺伝子工学的応用を見出す。

【0072】

上記の系およびｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、以下に記載の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明される。

【実施例】

【0073】

実施例１
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための方法
生後７日（Ｐ７）のマウスから外科的に切除した後、小脳をＨＢＳＳ、グルコースおよび抗生物質、およびＤＮａｓｅ（上記に定義した濃度で）を含む緩衝液中で機械的に破砕し、およびこのようにして得られた個々の細胞をカウントし、およびＤＭＥＭ－Ｆ１２、グルコース、ビタミンＡフリーＢ２７、インスリン、ＮＡＬＣ、ヘパリン、抗生物質（上記に定義した濃度）およびＳＡＧ（２００ｎＭ）およびＥＧＦ（１μＭ）から構成された培地に１６０００細胞／ｃｍ_２に希釈して播種した。この培地では、定期的にＡｃｃｕｔａｓｅ^登録商標を用いて定期的にスフェアを分離させ（週に２、３回）、および希釈によって増殖させる（過剰な成長と、栄養不足や低酸素による死を防ぐため）ことで、細胞を無期限に富化および維持し得る。反応条件は上記の通り。本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法を図１に示す。

【0074】

結果
ＧＣＰ細胞では、ＳＡＧがＳｈｈ経路の高い発現を維持し（培養後の異なる時点におけるＧｌｉ１およびＮ－ＭＹＣタンパク質の発現によって観察）、一方でＥＧＦがその無限の増殖力を確保することが観察されている。加えて、幹細胞マーカーの発現の解析は、ＳＡＧに加えてＥＧＦを投与することで、ＳＡＧを添加して凝集または浮遊させたＧＣＰ細胞の一過性培養物における場合よりも、ＧＣＰ細胞においてより高い発現量のＳＯＸ２転写因子およびネスチンタンパク質が有利に誘導され、ＧＣＰ細胞の経時的な安定性維持能力に著しい影響を与えることを示した。本発明者らの結果がＧＣＰ細胞の維持と決定におけるＳＡＧおよびＥＧＦの相乗効果に密接に関連していることに留意すべきである。実際に、ＥＧＦが存在するのみでは、ＧＣＰに典型的なマーカーを発現しない別の種類の細胞集団が単離されることになる（図４）。一方で、ＳＡＧ単独の存在では、図８にも示されるように、培養物の長期の生存は保証されない。本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法を用いて安定化した細胞株において行った分化実験では、大部分の細胞は特異的な神経細胞マーカーであるβ３チューブリンの発現がポジティブであり、本発明者らの培養物がグリア細胞成分ではなく神経細胞成分で強く富化されることが実証された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】