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特表2022-528009新規病理学マーカ及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-07

(54)【発明の名称】新規病理学マーカ及びその使用

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20220531BHJP

C12Q 1/04 20060101ALI20220531BHJP

C12Q 1/686 20180101ALI20220531BHJP

C12M 1/00 20060101ALI20220531BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 D

C12Q1/04

C12Q1/686 Z

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021560611

(86)(22)【出願日】2020-04-08

(85)【翻訳文提出日】2021-12-08

(86)【国際出願番号】 IB2020053360

(87)【国際公開番号】W WO2020208549

(87)【国際公開日】2020-10-15

(31)【優先権主張番号】102019000005700

(32)【優先日】2019-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521444619

【氏名又は名称】メタデクリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カスタニェートジセー、リディア

(72)【発明者】

【氏名】ミンニョーネ、ゲルトルード

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029FA02

4B029FA05

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ53

4B063QR32

4B063QR36

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS25

(57)【要約】

本発明は新規病理学マーカの同定、当該マーカの検出及び定量化による、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の診断用、又はその進行のモニタリング用の新規方法、並びに当該方法の実行を可能とするデバイスに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するための方法であって、
ａ．個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、健常な個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値とを比較する工程、
ｃ．ａで測定される値がｂで測定される値より大きいときに、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法。

【請求項2】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＦＬＤに罹患している患者と健常な患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ０を同定する工程、並びにＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプルの集団におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＳＨに罹患している患者と健常な患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ１を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が、前記値Ｃ０以上であり、かつ前記値Ｃ１より小さいときにＮＡＦＬＤを診断し、又はａで得られる値が前記値Ｃ１以上であるときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法。

【請求項3】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳスコアを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ここで、ＮＡＦＬＤに罹患している患者に由来するサンプルを含む前記集団において、ＮＡＳスコア値が、肝臓細胞における脂肪症の割合、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づき、ＮＡＳ１、ＮＡＳ２、及びＮＡＳ３として前記患者において組織学的に定義され、
健常な患者とＮＡＳスコア１を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ２、
ＮＡＳスコア１を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者とＮＡＳスコア２を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ３、及び
ＮＡＳスコア２を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者とＮＡＳスコア３を有する、ＮＡＳＨに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ４、を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．前記ＮＡＳスコアを、
ａで得られる値が前記カットオフ値Ｃ２以上であり、かつ前記カットオフ値Ｃ３以下であるときにはＮＡＳスコア１、
ａで得られる値が前記値Ｃ２より大きく、かつ前記カットオフ値Ｃ４以下であるときにはＮＡＳスコア２、
ａで得られる値が前記値Ｃ４より大きいときにはＮＡＳスコア３と診断する工程を含む、方法。

【請求項4】

ＮＡＳＨの重症度を診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ここで、ＮＡＳＨに罹患している患者に由来するサンプルを含む前記集団において、病態の重症度が、肝臓細胞における脂肪症の割合、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づき、軽度、中等症、又は重症として前記患者において組織学的に定義され、
健常な患者と軽度ＮＡＳＨに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ５、
軽度ＮＡＳＨに罹患している患者と中等症ＮＡＳＨに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ６、及び
中等症ＮＡＳＨに罹患している患者と重症ＮＡＳＨに罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ７、を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ＮＡＳＨの重症度を、
ａにて得られる値が前記値Ｃ５より大きく、かつ前記値Ｃ６より小さいときには軽度、
ａにて得られる値が前記値Ｃ６より大きく、かつ前記値Ｃ７より小さいときには中等症、
ａにて得られる値が前記値Ｃ７より大きいときには重症、と診断する工程を含む、方法。

【請求項5】

Ｐｌｉｎ２タンパク質の前記濃度値が、ウェスタンブロット、又は細胞蛍光分析、又はＥＬＩＳＡ、又は定量ＰＣＲにより測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

Ｐｌｉｎ２タンパク質の前記濃度値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用する細胞蛍光分析により測定され、前記カットオフが、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、前記値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、２．７ＭＦＩに等しい前記濃度のカットオフ値及び１．０ＭＦＩに等しい前記濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩ以上であり、かつ２．７ＭＦＩ以下であるときにＮＡＦＬＤを診断し、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩより大きいときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法。

【請求項8】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳスコアを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、前記値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、１．０ＭＦＩ、１．４ＭＦＩ及び２．７ＭＦＩに等しい前記濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩのカットオフ値以上であり、かつ１．４ＭＦＩのカットオフ値以下であるときに、ＮＡＳスコア１を診断する工程、ａで得られる値が１．４ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、ＮＡＳスコア２を診断する工程、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、ＮＡＳスコア３を診断する工程を含む、方法。

【請求項9】

ＮＡＳＨの重症度を診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、前記値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、２．７ＭＦＩ、４ＭＦＩ及び６．３ＭＦＩに等しい前記濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が、２．７ＭＦＩの前記カットオフ値より大きく、かつ４ＭＦＩの前記カットオフ値以下であるときには軽度状態のＮＡＳＨ、ａで得られる値が、４ＭＦＩの前記カットオフ値より大きく、かつ６．３ＭＦＩの前記値以下であるときには中等症状態のＮＡＳＨ、及びａで得られる値が、６．３ＭＦＩより大きいときには重症状態のＮＡＳＨと診断する工程を含む、方法。

【請求項10】

前記蛍光色素が、以下の特徴を有する蛍光色素である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。

【表1】

【請求項11】

ｅ．ＮＡＳＨを診断するためのａ時点での血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｆ．肝線維症に罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定し、肝線維症に罹患している患者と健常な患者間の前記濃度値のカットオフ値Ｃ８を同定する工程、
ｇ．ｅ時点で得られる値と、ｆ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が、前記値Ｃ８より大きいときに肝線維症を診断する工程をさらに含む、
請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ｅ．ＮＡＳＨを診断するためのａ時点での血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質のタンパク質濃度値を測定する工程、
ｆ．健常な患者に由来する血液サンプル集団、及び肝線維症に罹患している患者に由来する血液サンプル集団中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の前記濃度値を測定し、ここで、前記病態の重症度が、肝線維症の位置及び拡大に基づき、ステージ１、ステージ２、又はステージ３として組織学的に定義され、
健常な患者とステージ１の肝線維症に罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ９、
ステージ１の肝線維症に罹患している患者とステージ２の肝線維症に罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ１０、及び
ステージ２の肝線維症に罹患している患者とステージ３の肝線維症に罹患している患者間の前記濃度のカットオフ値Ｃ１１、を同定する工程、
ｇ．ｅ時点で得られる値とｆ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が前記値Ｃ９以上であり、かつ前記値Ｃ１０より小さいときにステージ１、
ｅ時点で得られる値が前記値Ｃ１０以上であり、かつ前記値Ｃ１１以下のときにステージ２、
ｅ時点で得られる値が前記値Ｃ１１より大きいときにステージ３、
として肝線維症のステージを診断する工程をさらに含む、
請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の前記濃度値が、ウェスタンブロット、又は細胞蛍光分析、又はＥＬＩＳＡ、又は定量ＰＣＲにより測定される、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の前記濃度値が、好適な蛍光色素で標識された、特異的にＰｎｐｌａ３に結合して他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体、及び特異的にＲａｂ１４に結合して他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用する細胞蛍光分析により測定される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

【請求項16】

ｅ．ＮＡＳＨを診断するためのａ時点での血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程であって、前記値が、好適な蛍光色素で標識された、Ｐｎｐｌａ３に特異的に結合し他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体、及びＲａｂ１４に特異的に結合し他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定され、前記カットオフが平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される工程、
ｇ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、１．２４ＭＦＩ、２．３ＭＦＩ、及び３．１０ＭＦＩに等しい前記濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が１．２４ＭＦＩ以上であり、かつ２．４ＭＦＩより小さいときには軽度のステージ１の肝線維症、ｅ時点で得られる値が２．４ＭＦＩ以上であり、かつ３．１０ＭＦＩより小さいときにはステージ２の肝線維症、ｅ時点で得られる値が３．１０ＭＦＩ以上であるときにはステージ３の肝線維症を診断する工程、
をさらに含む、請求項２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記蛍光色素が、以下の特徴を有する蛍光色素である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

【表2】

【請求項18】

患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
ａ．前記モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにおいて、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応しており、
１つ以上の前記瞬間ｔｎにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、前記治療的処置の有効性を表す、工程を含む、方法。

【請求項19】

患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの進行をモニタリングするための方法であって、
ａ．前記モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにてＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応しており、１つ以上の前記瞬間ｔｎにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善を表し、一方で１つ以上の瞬間ｔｎにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の上昇が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの悪化を表す、工程を含む、方法。

【請求項20】

Ｐｌｉｎ２タンパク質の前記濃度値が、ウェスタンブロット、又は細胞蛍光分析、又はＥＬＩＳＡ、又は定量ＰＣＲにより測定される、請求項１８又は１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

Ｐｌｉｎ２タンパク質の前記濃度値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用する細胞蛍光分析により測定される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記蛍光色素が、以下の特徴を有する蛍光色素である、請求項２１に記載の方法。

【表3】

【請求項23】

前記血液サンプルが、末梢血サンプルである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記白血球細胞が、多形核細胞及び／又は単球細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

分析される個体におけるＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、及び健常な個体の血液サンプル中又は前記サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第２濃度値が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値とを比較する工程、並びに
前記第１値が前記第２値より大きいときに、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項26】

分析される個体におけるＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、並びにタンパク質濃度のうち請求項２に定義されるＣ０の第２値及びＣ１の第３値が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値及び第３値とを比較する工程、並びに
前記第１値が前記値Ｃ０以上であり、かつ前記値Ｃ１より小さいときにＮＡＦＬＤを診断する工程、又は前記血液サンプル中の前記第１値が前記値Ｃ１以上であるときにＮＡＳＨを診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項27】

分析される個体におけるＮＡＳスコアを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、請求項３に定義されるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の第２値Ｃ３、第３値Ｃ４、及び第４値Ｃ５が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と、前記第２値、第３値、第４値とを比較する工程、並びに
前記第１値が前記カットオフ値Ｃ２以上であり、かつ前記カットオフ値Ｃ３以下であるときにＮＡＳスコア１、
前記第１値が前記値Ｃ２より大きく、かつ前記カットオフ値Ｃ４以下であるときにＮＡＳスコア２、
前記第１値が前記値Ｃ４よりも大きいときにＮＡＳスコア３、として前記ＮＡＳスコアを診断する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項28】

分析される個体におけるＮＡＳＨ重症度を診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、請求項４に定義されるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の第２値Ｃ５、第３値Ｃ６、第４値Ｃ７が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と、前記第２値、前記第３値、前記第４値とを比較する工程、並びに
前記第１値が前記値Ｃ５より大きく、かつ前記値Ｃ６より小さいときに軽度、
前記第１値が前記値Ｃ６より大きく、かつ前記値Ｃ７より小さいときに中等症、
前記第１値が前記値Ｃ７よりも大きいときに重症、としてＮＡＳＨの重症度を診断する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項29】

分析される個体における肝線維症を診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第１濃度値、並びに請求項１１に定義されるＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第２濃度値Ｃ８が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値とを比較する工程、及び
前記第１値がＣ８より大きいときに肝線維症を診断する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項30】

分析される個体における肝線維症のステージを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される前記個体の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第１濃度値、請求項１２に定義されるＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度の第２値Ｃ９、第３値Ｃ１０、及び第４値Ｃ１１が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値、前記第３値、前記第４値とを比較する工程、及び
前記第１値が、前記値Ｃ９以上であり、かつ前記値Ｃ１０より小さいときにステージ１、
前記第１値が、前記値Ｃ１０以上であり、かつ前記Ｃ１１以下であるときにステージ２、
前記第１値が前記値Ｃ１１よりも大きいときにステージ３、として線維化スコアのステージを診断する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項31】

患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、瞬間ｔ０において前記患者の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、及びｔ０に続く瞬間での前記患者の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第２濃度値が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値とを比較する工程、及び
前記第２値が前記第１値より小さい場合には、前記治療的処置の有効性を検出する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項32】

患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの進行をモニタリングするためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、瞬間ｔ０において前記患者の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、及びｔ０の次の瞬間での前記患者の血液サンプル中、又は前記血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第２濃度値が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
前記第１値と前記第２値とを比較する工程、及び
前記第２値が前記第１値より小さい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善を検出する工程、
前記第２値が前記第１値より大きい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの悪化を検出する工程、
前記第２値が前記第１値とほぼ等しい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの停滞を検出する工程、を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【請求項33】

患者の血液サンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度の自動測定のためのデバイス（１０）であって、
－前記血液サンプルが採取されることになる個体の皮膚に穴を開けやすい穿刺手段（２）と、
－血液サンプル中の多形核球（ＰＢＭＣ）の単離手段（１４、５、６、１９）であって、結合されている構成成分からの前記多形核球（ＰＢＭＣ）の少なくとも分離手段（１９）を含み、前記多形核球（ＰＢＭＣ）と前記構成成分間の分離に有利であるように構成され、前記分離手段（１９）がろ過膜型又は緩衝液型である、単離手段（１４、５、６、１９）と、
－１つの分光器（１２、１３）の、少なくとも１つの分析チャンバ（１１）、及び前記多形核球（ＰＢＭＣ）の細胞質中のＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の濃度の測定手段（１６、１２、１３）を含む、少なくとも１つの分光器であって、前記測定手段（１６、１２、１３）が、
－前記単離手段（１４、５、６、１９）により単離される多形核球（ＰＢＭＣ）の処理手段（１６）であって、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質が存在するときには、前記タンパク質のための特定の試薬とＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の結合を可能とするように構成され、前記試薬が蛍光色素である、又は１つ以上の所定の波長にて特定の発色を有する、処理手段（１６）、および
－少なくとも１つの分光器（１２、１３）であって、
１つの放射線源（１２）であって、前記試薬が蛍光色素を放出する、又は前記特定の発色を呈するように、前記単離及び処理された多形核球（ＰＢＭＣ）にて、所定の波長で放射線を放出するように構成される、放射線源（１２）と、
放射線源（１２）により照射されるサンプルの画像を取得するための手段（１３）と、
を備える少なくとも１つの分光器（１２、１３）
を含む、少なくとも１つの分光器と、
－前記単離手段（１４、５、６、１９）及び前記測定手段（１６、１２、１３）に接続されたコントロールユニット（７）であって、
所定の動作パラメータに従い、自動モードにより前記単離手段（１４、５、６、１９）及び前記測定手段（１６、１２、１３）の発動を制御及び同期するようにプログラムされ、
前記多形核球（ＰＢＭＣ）の前記細胞質中で測定されるＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の濃度データと、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度の少なくとも１つの参照データとを、自動的に比較する、コントロールユニット（７）とを含む、デバイス。

【請求項34】

Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の前記参照データが同じ患者に関連し、前記血液サンプルが検出された瞬間（ｔｎ）より前の瞬間（ｔ０）において検出されるデータであり、前記コントロールユニット（７）が、
－サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の参照データより小さい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善、
－サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の参照データより大きい場合には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はＮＡＳＨの悪化、
－サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の参照データと等しい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの停滞、を検出するようにさらにプログラムされている、請求項１～３３のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項35】

Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の前記参照データが健常な対象に関連するデータであり、前記コントロールユニット（７）が、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の前記参照データより大きい場合には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又はＮＡＳＨ状態を検出するようにさらにプログラムされている、請求項３３又は３４に記載のデバイス（１０）。

【請求項36】

前記コントロールユニット（７）が全ての前記手段及び前記放射線源（１２）に接続され、所定の動作パラメータに従い、自動モードによりそれらの発動を制御及び同期するようにプログラムされており、
前記血液サンプル中に存在するＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の濃度データを決定するように、画像を得るための前記手段（１３）によって取得される画像を処理し、
前記Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度データと、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の前記参照データとを自動的に比較するようにさらに構成されている、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項37】

血液サンプルからの多形核球（ＰＢＭＣ）の前記単離手段（１４、５、６、１９）が、
－前記血液サンプルと、前記サンプル中に存在する多形核球（ＰＢＭＣ）に結合しやすい構成成分と、必要な場合には抗凝固物質と混合するように構成される、混合手段（１４）と、
－機械的振動及び／又は回転応力を、前記混合手段（１４）により得られた前記混合物に加え、前記混合物をろ過手段（６）へと運搬するように構成される、移動手段（５）と、
－前記ろ過手段（６）であって、前記多形核球（ＰＢＭＣ）に結合される前記構成成分を保持し、前記混合物の残りを溶出させることができるように構成される、前記ろ過手段（６）とを含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項38】

前記移動手段（５）及び前記ろ過手段（６）が統合され、ろ過コンベヤベルトとして実装される、請求項３７に記載のデバイス（１０）。

【請求項39】

前記放射線源（１２）が、３４０ｎｍ～７８０ｎｍの波長にて放射線を放出することができる、請求項３３～３８のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項40】

前記血液サンプルを、前記穿刺手段（２）に流体的に接続された回収チャンバ（３）及び前記回収チャンバ（３）に運搬するための手段（４）をさらに含み、運搬するための前記手段（４）がダイヤフラムポンプ型である、請求項３３～３９のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項41】

前記ダイヤフラムポンプが以下の寸法、すなわち、
－０．６ｍｍに等しい高さ、
－５ｍｍに等しい幅、
－５ｍｍに等しい長さ、を有する、請求項４０に記載のデバイス（１０）。

【請求項42】

前記分光器が以下の寸法、すなわち、
－１５ｍｍ～２５ｍｍ、好ましくは２０．１ｍｍに等しい高さ、
－７ｍｍ～１８ｍｍ、好ましくは１２．５ｍｍに等しい幅、
－５ｍｍ～１５ｍｍ、好ましくは１０．１ｍｍに等しい深さ、を有する、請求項３３～４１のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項43】

請求項２５～３３のうち１つ以上に記載のコンピュータプログラムを実行するように構成された少なくとも１つの処理ユニットをさらに含む、請求項３３～４２のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。

【請求項44】

前記処理ユニットが、前記コントロールユニット（７）に動作可能に接続されている、請求項４３に記載のデバイス（１０）。

【請求項45】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を実行するための、請求項３２～４４のいずれか一項に記載のデバイス（１０）の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は新規病理学マーカの同定、当該マーカの検出及び定量化（定性化）による、非アルコール性脂肪性肝疾患であるＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨの診断用、又はその進行のモニタリング用の新規方法、並びに当該方法の実行を可能とするデバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＡＦＬＤ（Ｎｏｎ－ＡｌｃｏｈｏｌｉｃＦａｔｔｙＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅ）の頭字語によっても表示される非アルコール性脂肪性肝疾患は、大量のアルコール消費がなく、肝障害の二次原因が存在しない場合、肝細胞内部の脂肪の過剰蓄積（脂肪症、５％超の細胞トリグリセリドの蓄積からなる）により特徴付けられる肝臓組織の変性といったスペクトルによって表される。

【0003】

ＮＡＦＬＤは現在、西洋において、成人、並びに驚くことには小児及び十代の若者でも同様に、肝細胞溶解性肝炎インデックスを変性させる主要原因を構成している。

【0004】

Ｂｕｇｉａｎｅｓｉ及びＭａｒｉｅｔｔｉ（ＲｅｃｅｎｔｉＰｒｏｇＭｅｄ２０１６；１０７：３６０－３６８）により２０１６年に報告されたアップデートされたデータは、成人集団中、ＮＡＦＬＤの世界的有病率が２５％である点及びＮＡＦＬＤの個体中、肝生検により診断されるＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝疾患）の世界的な有病率が２０～５０％である点を示している。本明細書にて報告される割合は、例えば、肥満及び／又は２型糖尿病に罹患している患者においてなど、危険性のある患者にて劇的に上昇している。

【0005】

最も印象的な疫学的データは小児集団に関係するものであり、小児では、肥満及びメタボリックシンドロームは世界規模で漸進的に増加しており、現在までのところ欧州でもこれは顕著であり、米国で記録されたデータと類似の推定を有している。２００７年～２０１０年に記録されたデータより、ＮＡＦＬＤの有病率は約７％に等しく、これはその２０年弱前に記録されたデータよりも３倍高い値であることがここから明らかである。

【0006】

単純性脂肪肝が肝硬変への進行に関して無視できるリスクを有する一方、有意な割合（１０～１５％）のＮＡＦＬＤを抱える対象は、肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）といった最も重症である形態を特徴付ける壊死性炎症及び膨化変性の組織学的態様を呈する。これらは線維化、肝硬変、及び肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む関連する合併症へと発展する可能性がある。

【0007】

これは複合的で多因子の病態であり、非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度及び発症は、遺伝的要因と環境的要因の両方によって調整される。これは、メタボリックシンドローム及び２型糖尿病といった病態に関連して頻繁に現れるが、これはまた症候群の発症、関連する発生及び合併症において役割を有している。ＮＡＦＬＤ有病率の増加が食事及び先進国の社会的変化と関連すると仮定すると、この病態は潜在的に有意な臨床的関連を伴うことから、例えば無視できない数の場合においては、この病態は肝硬変及びＨＣＣの原因でもある非アルコール性脂肪性肝疾患へと発展することもあり得るため、肝臓値及び肝臓外（心血管）値において予後に影響する可能性がある合併症の発症を調査し、かつ予測することを可能とする目的で、ハイリスクな対象を早期に及び正確に同定することが可能であることは明らかに重要である。

【0008】

肝臓損傷のほかにも、実際のところ、ＮＡＦＬＤに罹患している個体における罹患率及び死亡率の主要原因は、２型糖尿病及び他のリスク因子の存在に関わらず、一般的集団よりもこうした個体においてより出現する心血管合併症により表される。

【0009】

Ｂｕｇｉａｎｅｓｉ及びＭａｒｉｅｔｔｉが２０１６年にさらに報告したように、ＮＡＳＨ診断は現在、肝生検の実施が条件となっていることから、近年、科学者集団の試みは、スクリーニングプログラム、フォローアップ及び治療の試みに正確に取り組む目的で、大規模で適用可能であり関連する遺伝子多型の肝臓損傷の非侵襲的マーカを検索することに関する。

【0010】

この器官での生検は、深刻な症候群が存在する場合のみに実施され、それが標準的となっていることから、非侵襲診断の方法を同定することにより、通常では肝生検に供されない対象においても、適時診断が可能となる。さらに、非侵襲診断はまた、患者に実施される治療的処置の有効性を経時的にモニタリングすることができる。実際、超音波誘導下での肝生検は病院で実施されなければならない高額試験であり、この費用は２０００米ドル～７０００米ドル以上の範囲であることも考慮されなくてはならない。肝生検後の致命的な漏出性出血による死亡率は、未だに０．１３％～０．３３％の範囲であり、凝血時の変性を有する対象ではさらに高い可能性がある。

【0011】

したがって、肝臓に生検介入する必要なく、正確かつ迅速な診断を可能とし、これにより診断方法が非侵襲性であることから集団における疾患の診断を拡大可能とするＮＡＦＬＤ診断マーカを選抜する必要が、現在大いに感じられている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の著者らは、Ｐｌｉｎ２タンパク質が、循環細胞にて非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の効果的なマーカであることを発見し、驚くべきことに、肝細胞にて測定される当該マーカの発現度は、同じ個体の白血球細胞、特に末梢血の多形核白血球細胞及び単球にて測定される当該マーカの発現度と強固かつ正に相関することを見いだした。さらに、本発明の著者らはまた、血液細胞中及び肝細胞中のＰｌｉｎ２タンパク質の発現度が、ＮＡＦＬＤのＮＡＳスコア及びＮＡＳＨ重症度とも比例し、このため、ＮＡＦＬＤに罹患している患者中のＰｌｉｎ２濃度が高くなるにつれて、ＮＡＳスコアが高くなり、ＮＡＳＨに罹患している患者中のＰｌｉｎ２濃度が高くなるにつれて、疾患の重症度は大きくなる（ＮＡＳスコア及びＮＡＳＨ重症度は、文献に従い、及び本発明の説明中で定義される）ことを発見した。

【0013】

本発明の著者はしたがって、個体の血液サンプル又は当該サンプルから抽出した白血球細胞で実施されるＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断するための方法を考案した。ここでは当該サンプル中のＰｌｉｎ２濃度が、健常な個体から採取された１つ以上の対照サンプルで測定されるものより大きい場合には、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨの診断は確認されると見なされなければならない。

【0014】

Ｐｌｉｎ２発現度の測定は、該疾患の当該発現と重症度とが相関するという理由で、治療の有効性をモニタリングするためにさらに有利に使用され得る。それによって、当該測定で得られる値と、瞬間ｔｎに実施される１つ以上の続く測定にて得られる値とを比較することで、治療有効性のモニタリング開始時である瞬間ｔ０において実施される個体のＰｌｉｎ２血液濃度の測定間を比較することで、当該治療有効性を評価することが可能となる。経時的なＰｌｉｎ２濃度の低下は治療有効性を表すが、この場合、ｎは０より大きい整数であり、当該瞬間は、互いに漸進的に続き（続く又は次）、かつ全てｔ０に続く。経時的な一定の値は疾患の封じ込めを意味し、一方で当該値が経時的に上昇することは、治療無効性を意味する。

【0015】

さらに、上に説明されるようにその後の測定により、例えば、患者の食事及び生活習慣の変化、薬物又は減量手術の変化後といった薬理学的治療がない状態でも、疾患の経過をモニタリングすることが可能となる。

【0016】

したがって、本発明により有利には、肝生検の必要なく、明白かつ明らかな医療上及び経済学的利点を有しながら、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの診断及び／又はモニタリングを実施することが可能となる。さらに、本発明による診断及び／又はモニタリングの簡潔さにより、分析を行うことが可能である個体数を大幅に広げることが可能となり、小児への試験もまた容易に実施することが可能となり、さらには通常肝生検に供されることのない患者の全体集団においても、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに関する健康状態を確認することが可能となる。さらに、本発明による分析により、集団へのスクリーニングを実施することもまた可能となる。

【0017】

さらに、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨに罹患している患者において、心血管損傷の発生頻度が高いことが、他のリスク因子の有無に影響しないと判明していることを考えると、この疾患の早期診断により、当該患者における心血管に関する予防モニタリングが可能となる。

【0018】

本発明の著者らは、上に言及されるように、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度値は、ＮＡＳスコアと相関し、本文献では、生検サンプルにて観察される組織学的パラメータに基づき、軽度、中等症、及び重症と定義されるＮＡＳＨの重症度とも相関することも発見した。したがって、本発明はまた、本発明に定義されるように患者の生物学的サンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質濃度値に基づき、当該病態に罹患している当該患者におけるＮＡＳＨの重症度を定義する方法、コンピュータプログラム及びデバイスに関する。

【0019】

本発明の著者らは、驚くべきことに、同様の生物学的サンプルにおいて、Ｐｎｐｌａ３及びＲａｂ１４タンパク質発現値により肝線維症の存在及びそれらの重症度の診断が可能となることもまた発見した。

【0020】

本発明の方法は、上述の測定すること（測定）及び任意で得られたデータの処理を可能とする簡易なデバイスを用いて実施することもまた可能である。

【0021】

したがって、本発明の目的は、
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するための方法であって、
ａ．個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、健常な個体の血液サンプル及び当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値とを比較する工程、
ｃ．ａで測定される値がｂで測定される値より大きいときに、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＦＬＤに罹患している患者と健常な患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ０を同定する工程及びＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプルの集団におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＳＨに罹患している患者と健常な患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ１を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が、当該値Ｃ０以上であり、かつ当該値Ｃ１より小さいときにＮＡＦＬＤを診断し、又はａにて得られた値が当該値Ｃ１以上であるときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ＮＡＦＬＤに罹患している患者に由来するサンプルを含む当該集団において、ＮＡＳ値は、肝臓細胞における脂肪症の割合（パーセント）、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づきＮＡＳ１、ＮＡＳ２、ＮＡＳ３として当該患者において組織学的に定義され、
健常な患者とＮＡＳ１を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ２、
ＮＡＳ１を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者とＮＡＳ２を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ３、ＮＡＳ２を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者と、ＮＡＳ３を有するＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ４を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ＮＡＳ度を、
ａで得られる値が当該カットオフ値Ｃ２以上であり、かつ当該カットオフ値Ｃ３以下であるときにＮＡＳ１として、
ａで得られる値が当該カットオフ値Ｃ２より大きく、かつ当該カットオフ値Ｃ４以下であるときにＮＡＳ２として、
ａで得られる値が当該カットオフ値Ｃ４より大きいときにＮＡＳ３として診断する工程を含む、方法、
ＮＡＳＨの重症度を診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、この場合、ＮＡＳＨに罹患している患者に由来するサンプルを含む当該集団において、病態の重症度が、肝臓細胞における脂肪症の割合、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づき、軽度、中等症、又は重症として当該患者において組織学的に定義され、
健常な患者と軽度ＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ５、
軽度ＮＡＳＨに罹患している患者と中等症ＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ６、
中等症ＮＡＳＨに罹患している患者と重症ＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ７を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ＮＡＳＨの重症度を、
ａにて得られる値が当該値Ｃ５より大きく、かつ当該値Ｃ６より小さいときには軽度、
ａにて得られる値が当該値Ｃ６より大きく、かつ当該値Ｃ７より小さいときには中等症、
ａにて得られる値が当該値Ｃ７より大きいときには重症と診断する工程を含む、方法、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、２．７ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値及び１．０ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩ以上であり、かつ２．７ＭＦＩ以下であるときにＮＡＦＬＤを診断する工程、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩより大きいときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、１．０ＭＦＩ、１．４ＭＦＩ及び２．７ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩのカットオフ値以上であり、かつ１．４ＭＦＩのカットオフ値以下であるときに、１に等しいＮＡＳを診断する工程、ａで得られる値が１．４ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、２に等しいＮＡＳを診断する工程、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、３に等しいＮＡＳを診断する工程を含む、方法、
ＮＡＳＨの重症度を診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、２．７ＭＦＩ、４ＭＦＩ及び６．３ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が２．７ＭＦＩのカットオフ値より大きく、かつ４ＭＦＩのカットオフ値以下であるときに軽度状態のＮＡＳＨ、ａで得られる値が４ＭＦＩのカットオフ値より大きく、かつ６．３ＭＦＩの値以下であるときに中等症状態のＮＡＳＨ、又はａで得られる値が６．３ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、重症状態のＮＡＳＨであると診断する工程を含み、
当該方法は、ＮＡＳＨを診断するためのａ時点での血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中の、Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質のタンパク質濃度値を測定する工程、健常な患者及び任意では、肝線維症の診断のため、肝線維症のグレードが組織学的に定義されている患者に由来する血液サンプル中のその濃度値に対する比較の工程をさらに含む、方法、
患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
ａ．当該モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにおいて、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出された白血球細胞のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応しており、
１つ以上の当該瞬間におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、当該治療的処置の有効性を表す、工程を含む、方法、
患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの進行をモニタリングするための方法であって、
ａ．当該モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにてＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、この場合、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応している、工程を含み、
１つ以上の当該瞬間におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善を表し、一方で１つ以上の瞬間ｔｎにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の上昇が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの悪化を表しており、
当該方法を実行しやすいコンピュータプログラム、
及び血液サンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質濃度値の自動測定用のデバイスであって、一般には、
－血液サンプルからのＰＢＭＣの単離手段、
－当該ＰＢＭＣの細胞質中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値の測定手段、
－当該単離手段及び当該測定手段に接続されるコントロールユニットであって、
所定の動作パラメータに従い、自動モードによりそれらの発動を制御及び同期し、
当該ＰＢＭＣの細胞質中のＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータと、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の参照データとを自動的に比較するようにプログラムされている、コントロールユニットを含む、デバイスを含む、方法である。

【0022】

用語
本発明の目的のための用語白血球細胞は、文献にて一般に公知である意味を有し、好中球、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）又は好酸球（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｓ）、好塩基球、リンパ球、単球へと細分される顆粒球（又は多形核球）といった、異なる細胞種を含む。
本発明の目的のために、用語Ｐｌｉｎ２は、ヒトタンパク質であるアディポース分化関連タンパク質を表し、ＡＤＦＰ、ＡＤＲＰ又は９ｐ２２．１に位置づけられるヒト遺伝子ＡＤＦＰによりコードされるペリリピン２としても公知である。
ＮＡＦＬＤ非アルコール性脂肪性肝疾患
ＮＡＳＨ非アルコール性脂肪肝炎
Ｐｎｐｌａ３は、ヒトＰｎｐｌａ３タンパク質を指し、これはアジポヌトリン、ＡＤＰＮ、アシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ、Ｃ２２ｏｒｆ２０、ＩＰＬＡ２エプシロン、ＤＪ７９６Ｉ１７．１、ＩＰＬＡ（２）エプシロン、ＩＰＬＡ２－エプシロンとしても公知である。
Ｒａｂ１４は、ヒトＲａｂ１４タンパク質を指し、Ｒａｓ関連タンパク質であるＲａｂ－１４としても公知である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】パネルＡ：単球及び肝細胞中の脂肪滴（薄灰色の点）：大きく、若干強く染色された細胞核が可視化される。パネルＢは、単球及び肝臓中のＰｌｉｎ２のウェスタンブロットを示す。 βアクチンは、単球中で検出されるタンパク質量のうち、どのくらいの量が肝細胞中に検出されるタンパク質量に類似しているかを示す。

【図2】同様の対象の肝臓部分及び単球におけるＯＲＯ染色を報告する。

【図3】単球及び肝臓におけるウェスタンブロットにより、Ｐｌｉｎ２測定の差異（Ｙ軸）及び平均（Ｘ軸）のブランド－アルトマングラフを報告する。２つの点線は、一致限界を示す。２つの測定で得られた値間の差異はＹ軸上にて報告されるが、一方で平均はＹ軸上に存在する。点線は、２つの測定間の９５％の一致境界線（限界）を報告する。グラフは、全ての点が一致限界の内側に存在し、肝臓内及び末梢血細胞内のＰｌｉｎ２発現間の直接相関を実証する。

【図4】本発明による、デバイスの好ましい実施形態の例示的なブロック図である。

【図5】本発明による、デバイスのさらに好ましい実施形態の使用の例示的な図である。

【図6】本発明による、デバイスのさらに好ましい実施形態の使用の例示的な図である。

【図7】平均Ｐｌｉｎ２（ＭＦＩ）レベルとＮＡＳステージとの相関であり、Ｘ軸上の独立変数はＰｌｉｎ２の中間値であるが、一方で従属変数はＮＡＳステージである。

【図8】Ｐｌｉｎ２のＮＡＳＨ正規化重要度である。

【図9】Ｐｎｐｌａ３及びＲａｂ１４の線維化正規化重要度である。

【図10】Ｐｌｉｎ２の線維化正規化重要度である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明の著者らは、驚くべきことにＰｌｉｎ２タンパク質はＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨマーカであり、血液細胞（白血球細胞）中のタンパク質濃度は、肝臓細胞中の当該タンパク質の発現と相関し、その濃度はＮＡＳスコア及びＮＡＳＨ疾患の重症度とも比例することを発見した。本発明の著者は、したがって、肝生検に頼る必要なく血液サンプルを分析することにより、ＮＡＦＬＤ若しくはＮＡＳＨの診断を実施するため、本文献中に定義されるようにＮＡＦＬＤ若しくはＮＡＳＨの重症度を軽度、中等症、若しくは重症といったように診断するため、又はＮＡＦＬＤ若しくはＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするため、又はＮＡＦＬＤ若しくはＮＡＳＨの経時的な経過をもモニタリングするため、Ｐｌｉｎ２タンパク質の濃度の測定を使用することが可能であると発見した。

【0025】

したがって、本発明は、
ａ．個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、健常な個体の血液サンプル及び当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値とを比較する工程、
ｃ．ａで測定される値がｂで測定される値より大きいときに、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するための方法を提供する。

【0026】

一実施形態において、工程ａにて当業者には公知である技術により血液サンプルから白血球細胞を単離する目的で処理され得る、血液サンプルが使用される。

【0027】

したがって、この方法はサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の測定に先行する工程を含み、この血液サンプルは中に含有される白血球細胞を単離するために処置に供される。一実施形態において、この方法は、分析される血液サンプル又はそこから単離される白血球細胞から、多形核細胞（多形核球）及び／又は単球を単離する工程を含み得る。

【0028】

血液サンプルから白血球細胞を単離するための現在の使用に関する文献にて公知である任意のプロトコルが使用され得る。

【0029】

単に例として、多形核細胞は以下のように血液サンプルから単離され得る。すなわち、血液の凝固を防ぐため、ＥＤＴＡ（最終濃度が４ｍＭ）を含有している試験管へと血液を採取する。次いで、１つ以上の非連続的なパーコール成分（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコーティングされた、１５～３０ｎｍの径を有するコロイド性シリカ粒子（水中２３％ｗ／ｗ）からなる）を配置し、試験管中に１５ｍｌの６２％パーコールを入れ、２種類の懸濁液の混合を避けつつ、細いカテーテルを有するシリンジを活用して、その下に１５ｍｌの７５％パーコールを静かに重層化させた。

【0030】

次いで、８～１０ｍＬの血液を上に説明される成分上に重層化させ、試験管を２０℃で全体では２５分間、そのうち２００ｒｐｍで１０分間、次に４００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけた。したがって、密度及び大きさに基づく血液の図形的要素の分離、すなわち、赤血球及び大半の好酸球は試験管の底部に定着し、多形核球は２種類のパーコール懸濁液間の界面にて定着し、リンパ単球は６２％のパーコールと血漿の間に局在化させる。

【0031】

血漿及びリンパ単球を廃棄した後、多形核球含有バンドを、ガラス製パスツールピペットを用いて採取し、これを試験管に集め、２５０ｒｐｍにて、７分間２０℃で遠心分離することによりＨＥＰＥＳ／ＢＳＡで洗浄に供した。存在する可能性がある赤血球を廃棄するため、これにより得られた底部層を迅速な溶解処理に供し、これを３部の低張性溶液へと再懸濁させる。約１５秒撹拌させた後、７部の等張溶液を加えることで培地の等張性を回復させた。

【0032】

２５０ｒｐｍで７分、２０℃でさらに洗浄した後、使用するまで、細胞ペレットを再懸濁させ、公知の量のＨＥＰＥＳ／ＢＳＡへと維持させた。好中球濃度を、電動パーティクルカウンタを用いて又は血球計数器を使用して光学顕微鏡下にて測定した。

【0033】

単に例として、様々な種類の単球は、表面細胞マーカに対し、微生物学的に発現されるモノクローナル抗体のＣＤ－特異的組換えＦａｂ断片の使用といった技術により、血液サンプルから単離され得る。また、市販のキットはこの目的のために利用可能であり、例えばＦＡＢｉａｎ（商標）向けのＩＢＡＧｍｂＨ（商標）ＣＤ１４単離キットなどである。

【0034】

Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の測定は、当業者にとって利用可能な任意の方法に従って行われ得る。単に例として、本明細書に説明される方法において、測定はウェスタンブロット、又は細胞蛍光分析、又はＥＬＩＳＡ、又は免疫蛍光法、又は定量ＰＣＲ、酵素免疫スポットアッセイ、若しくは局在表面プラズモン共鳴繊維チッププローブシステムにより、又は以下に説明される当該測定のために調製されるデバイスを使用することにより実施され得る。上に示される方法の全ては、どのサンプルで実施されるべきか、及びどのタンパク質を定量しなければならないかを知っており、最も適切であると考えるプロトコルを選択し、市場において最も好適な試薬を使用することができるような当業者に公知である。本明細書に従い、サンプル内のＰｌｉｎ２の検出及び定量化を実施するのに必要とされる全ての試薬は公知であり、市場にて入手可能である。したがって、本発明の方法が公知となった場合、当業者による特定の工夫を必要とすることがない。

【0035】

例として、上に列挙される技術を要約し、それぞれの工程に関して当業者により通常使用される工程が示される。

【0036】

ウェスタンブロッティングにより、細胞中のタンパク質発現をモニタリングすることが可能となり、これにより、特定の抗原の存在、その量及びその分子量は３つの手法により決定することができる。すなわち、
１）タンパク質の抽出及び投与量、
２）ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によるタンパク質の分離、
３）ウェスタンブロッティング：ゲルから分離されたタンパク質をニトロセルロース分析（ブロット）上へと移動させ、関心対象のタンパク質（一次抗体）に対して向けられる抗体へと膜を曝露させ、種が一次抗体として使用する抗体に対して向けられる抗体（二次抗体）へと膜を曝露させ、ケミルミネセンス法（ＥＣＬ）と共に膜を発達させる、
４）画像濃度測定分析、である。

【0037】

細胞蛍光分析は、中に含有される特定の細胞又はタンパク質を検出し、同定し、数えることができる実験技術である。

【0038】

細胞蛍光分析技術は、様々な段階を予想している。

【0039】

流体中の細胞サンプルの懸濁
検査前に、分析される細胞に基づき、サンプルを細胞のサブタイプを識別可能である特定の色素で処理する。この色素、蛍光色素は、特定の細胞領域又はマーカ抗原に向けられるモノクローナル抗体に結合する。

【0040】

標識される細胞を含有するサンプルは、細胞蛍光計と呼ばれる機器へと導入される。

【0041】

この機器では、内部に次から次へと一列で細胞が組織化される流れを生成するため、細胞含有流体はフローチャンバへと注ぎ込まれ、次いで非常に狭い穴を通る。この細胞の流れを検出計の前に配置し、そうすることで非常に高い速さで流れ中に存在する各細胞を分析する（１秒あたり数百個～数千個の細胞）。

【0042】

細胞蛍光計は、１つ以上のレーザ、及び各細胞にとって特有のいくつかの特徴を同定可能な複数の検出器を含有する。各レーザは、流れ中に存在する細胞に影響し、その特徴に応じて、細胞のそれぞれに特徴的な散乱を発生させる。この特徴は、物理的（細胞サイズ及び複雑性）であり得、又はレーザインターセプト色素（蛍光色素）により発生した信号によって変化することがあり得る。この情報の組合せにより、サンプル中に存在する各細胞の特性プロファイルが作成される。

【0043】

１つ以上の検出器（又は単独の検出器）により検出される信号は、（光電子増倍管により）増幅され、コンピュータに送信される。ここでは、この信号はデジタル形式に変換され、コンピュータ上に表示、又は印刷される。

【0044】

データはグラフ形式で提供される。

【0045】

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）は非常に高頻度で使用される技術であり、酵素と抗体又は抗原との化学結合に基づくものである。これらの酵素の活性は容易にモニタリング可能であり、この活性によりコンジュゲート複合体濃度を正確に定量することが可能となる。使用される特定の方法によっては、ＥＬＩＳＡは抗原又は抗体を投与するために使用され得る。

【0046】

特定の抗体により認識される抗原（免疫）
システム（吸着剤）表面に吸着される分析物（抗原又は抗体）
（第２の）酵素結合抗体により認識される抗原／抗体、その生成物が染色される反応を起こすことが可能。

【0047】

定量ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、フルオロフォアにより放出される蛍光を測定することで核酸（この場合には、ｍＲＮＡをコードするＰｌｉｎ２タンパク質）を定量するために使用される技術である。この技術は、単一の反応内部で増幅と定量化を関連付ける。リアルタイムＰＣＲ反応において、蛍光はＰＣＲ生成物の蓄積に比例して増加する。当業者は、ＲＴ－ＰＣＲを実行するのに好適なプローブを設計するにあたり、何ら問題ないことが予想される。これは、Ｐｌｉｎ２タンパク質の遺伝子及びＤＮＡコード化が文献にて公知であることが理由である。ＰＢＭＣサンプルでの酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析は、インキュベーション中に生成される調査対象のサイトカインに対し、高親和性を有するモノクローナル抗体を吸着させることにより事前に機能化（コーティング）された９６ウェルプレートにおいて、限定的な期間での細胞インキュベーションに基づく。抗基準タンパク質ビオチン化抗体と、抗ビオチン酵素結合二次抗体の組合せにより、スポットの形成により反応生成物が沈殿（色素蓄積）することから、酵素にとって発色性物質の存在下での定義領域内におけるタンパク質産生の検出が可能となる。当該技術は、細胞溶解後にＰＢＭＣ内容物へと加えることができる。

【0048】

蛍光、ラマン散乱、及び二次高調波発生を含む様々な分光測定の表面感度を向上させるために、表面プラズモンを使用した。ただし、それらの最も単純な形式においては、タンパク質などにおける分子吸収を検出するためにＳＰＲの反射率を使用することができる。技術的には、最小反射角（最大吸収）を測定する。

【0049】

上で定義されるような血液サンプル又は細胞サンプル内のＰｌｉｎ２濃度を定量するのに好適である、文献中で公知である任意の分析技術は、本発明の任意の方法にて使用され得る。

【0050】

さらに、本発明によるデバイスは、上に説明される検出技術のうち１つ以上により、関心対象のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の定量化を実施するように設計され得る。

【0051】

特定の実施形態において、測定は、好適な蛍光色素で標識され、Ｐｌｉｎ２タンパク質に特異的な抗体（又は上に定義されるその誘導体若しくはその断片）、すなわちＰｌｉｎ２タンパク質にのみ結合する抗体をタンパク質マーカとして使用する、細胞蛍光分析により実施されることができる。

【0052】

一実施形態において、蛍光色素は、例えば、以下の特徴を有する蛍光色素のような、市販の細胞蛍光分析装置により検出可能である、任意の１つの蛍光色素であってもよい。

【表1】

【0053】

一実施形態において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができる。これは、以下の技術的特徴を有し、ＦＩＴＣ又はＣｙ２の代替物として一般的に使用されることができる。

【0054】

蛍光強度及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）値の分析は、一般に入手可能である好適なソフトウェアにより計算されることができ、市場で入手可能な細胞蛍光計の使用により評価され得る。

【0055】

したがって、一実施形態に従い、使用される蛍光色素は、上に定義される技術的特徴を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素であり得、ＦＣ５００ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）及びそのデータは、本出願の提出時に当該製品の技術特徴を有する、Ｋａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して分析され得る。

【0056】

当業者は、比較アッセイに関しては、他の蛍光色素及び他のデバイス及びソフトウェアを使用して算出されるＭＦＩに関して表されるカットオフにて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素又は上の表に報告される特徴を有する蛍光色素を使用することで算出し、ＦＣ５００ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）又は類似の技術的特徴を有する細胞蛍光計、及びＫａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用し、本明細書にて提供されるＭＦＩに関して表されるカットオフをどのように適合させるかを、どのような方法であっても理解している。

【0057】

ＭＦＩは、単純な算術平均といった意味である。

【0058】

本発明に従い、細胞蛍光計は好ましくは、上で示される細胞蛍光計の技術的特徴を有し、本出願の出願時に一般に入手可能なものである。

【0059】

上に説明される工程に関する全ての実施形態は、本明細書に提供される方法のいずれかに適用可能である。

【0060】

一実施形態において、本発明は、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＦＬＤに罹患している患者と健常な患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ０を同定する工程及びＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプルの集団におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定し、ＮＡＳＨに罹患している患者と健常な患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ１を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が、当該値Ｃ０以上であり、かつ当該値Ｃ１より小さいときにＮＡＦＬＤを診断し、又はａにて得られた値が当該値Ｃ１以上であるときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法に関する。

【0061】

本発明はまた、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳスコアを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ＮＡＦＬＤに罹患している患者に由来するサンプルを含む当該集団において、ＮＡＳスコア値は、肝臓細胞における脂肪症の割合、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づきＮＡＳ１、ＮＡＳ２、ＮＡＳ３として当該患者において組織学的に定義され、
健常な患者とＮＡＳスコア１を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ２、
ＮＡＳ１を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者とＮＡＳスコア２を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ３、ＮＡＳ２を有するＮＡＦＬＤに罹患している患者と、ＮＡＳスコア３を有するＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ４を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ＮＡＳスコアを、
ａで得られた値が当該カットオフ値Ｃ２以上であり、かつ当該カットオフ値Ｃ３以下であるときにＮＡＳスコア１として、
ａで得られた値が当該カットオフ値Ｃ２より大きく、かつ当該カットオフ値Ｃ４以下であるときにＮＡＳスコア２として、
ａで得られた値が当該カットオフ値Ｃ４より大きいときにＮＡＳスコア３として診断する工程を含む、方法に関する。

【0062】

本発明によるＮＡＳスコアは本文献に定義される通りであり、以下のパラメータに従って通常は割り当てられる。

【表2】

【0063】

本発明はまた、ＮＡＳＨの重症度を診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．ＮＡＳＨに罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ＮＡＳＨに罹患している患者に由来するサンプルを含む当該集団において、病態の重症度は、肝臓細胞における脂肪症の割合、膨化肝細胞の発生、小葉炎症の存在、及び門脈炎症の存在に基づき軽度、中等症、又は重症として当該患者において組織学的に定義され、
健常な患者と軽度のＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ５、
軽度ＮＡＳＨに罹患している患者と中等症ＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ６、
中等症ＮＡＳＨに罹患している患者と、重症ＮＡＳＨに罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ７を同定する工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、ｂ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ＮＡＳＨの重症度を、
ａで得られる値が当該値Ｃ５より大きく、かつ当該値Ｃ６より小さいときに軽度、
ａで得られる値が当該値Ｃ６より大きく、かつ当該値Ｃ７より小さいときに中等症、
ａで得られる値が当該値Ｃ７より大きいときに重症診断する工程を含む、方法に関する。

【0064】

したがって、本明細書に従い、Ｐｌｉｎ２濃度のカットオフ値は、
ＮＡＦＬＤに罹患している患者と健常な患者の間のカットオフＣ０、
ＮＡＳＨに罹患している患者と健常な患者の間のカットオフＣ１、
健常な患者と、ＮＡＳ１を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者の間のカットオフＣ２、
ＮＡＳ１を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者と、ＮＡＳ２を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者の間のカットオフＣ３、
ＮＡＳ２を有する、ＮＡＦＬＤに罹患している患者と、ＮＡＳ３を有する、ＮＡＳＨに罹患している患者の間のカットオフＣ４、
健常な患者と、軽度ＮＡＳＨに罹患している患者の間のカットオフＣ５、
軽度ＮＡＳＨに罹患している患者と、中等症ＮＡＳＨに罹患している患者の間のカットオフＣ６、
中等症ＮＡＳＨに罹患している患者と、重症ＮＡＳＨに罹患している患者の間のカットオフＣ７である。

【0065】

本発明による疾患の重症度の形態の定義は、ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）に従う組織分析に基づき、文献にて一般に使用されるものである（ＫｌｅｉｎｅｒＤＥ，ＢｒｕｎｔＥＭ，ＶａｎＮａｔｔａＭ，ＢｅｈｌｉｎｇＣ，ＣｏｎｔｏｓＭＪ，ＣｕｍｍｉｎｇｓＯＷ，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ２００５；４１：１３１３－１３２１）。これは組織的スコアであり、脂肪症、小葉炎症及び門脈炎症、並びに膨化肝細胞変性（「膨化」）の、肝生検の存在に基づき、世界的な肝臓学会により広範に使用及び確認されている。各構成要素は、グレード１（軽度）、グレード２（中等症）、及びグレード３（重症）であり得る。

【0066】

【表3】

【0067】

事実、本発明の著者らは驚くべきことに、ＮＡＳＨ重症度が知られている患者からの分析される血液サンプルＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値が、当該グレードと相関しており、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の上昇は、病態の重症度に直接的に比例することを発見した。

【0068】

好ましい実施形態においては、上に説明される方法は、Ｐｌｉｎ２タンパク質の発現を評価する細胞蛍光分析技術を使用し、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用することにより実行され、当該カットオフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される。

【0069】

より好ましい実施形態においては、これは、上に説明される蛍光色素、ソフトウェア及びデバイス、又は上に説明される蛍光色素に加え、以下及び特許請求の範囲に定義されるような本発明の主題であるソフトウェア及びデバイスを使用することによる。文献及び本発明による、ＮＡＳＨ壊死性炎症性グレードは、肝細胞脂肪症、膨化及び障害、並びに（小葉内及び門脈）炎症のグレードに基づき、グレード１（軽度）、グレード２（中等症）、及びグレード３（重症）と分類される（上記表）。

【0070】

本発明の著者らは、上に説明される方法に適用可能である特定のカットオフ（以下に定義される蛍光色素、ソフトウェア及びデバイスを有するＭＦＩに関して本明細書では表される）が、コンピュータ処理され得ることを実証した（例部分を参照されたい）。

【0071】

したがって、本発明の目的はまた、
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを診断するための方法であって、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、好適な蛍光色素で標識され、当該値が特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｂ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、２．７ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値及び１．０ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩ以上であり、かつ２．７ＭＦＩ以下であるときにＮＡＦＬＤを診断する工程、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩより大きいときにＮＡＳＨを診断する工程を含む、方法である。

【0072】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している患者のＮＡＳスコアを診断するための方法は、
ａ．血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、１．０ＭＦＩ、１．４ＭＦＩ及び２．７ＭＦＩに等しい当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が１．０ＭＦＩのカットオフ値以上であり、かつ１．４ＭＦＩのカットオフ値以下であるときにＮＡＳスコア１、ａで得られる値が１．４ＭＦＩのカットオフ値より大きいときにＮＡＳスコア２、又はａで得られる値が２．７ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、ＮＡＳスコア３であると診断する工程を含み、
ＮＡＳＨの重症度のための方法は、
ａ．血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、好適な蛍光色素で標識され、当該値が特異的にＰｌｉｎ２に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定される工程、
ｃ．ａ時点で得られる値と、２．７ＭＦＩ、４ＭＦＩ及び６．３ＭＦＩに等しい平均蛍光強度（ＭＦＩ）の点で発現する当該濃度のカットオフ値とを比較する工程、
ｄ．ａで得られる値が２．７ＭＦＩのカットオフ値より大きく、かつ４ＭＦＩのカットオフ値以下であるときに軽度状態のＮＡＳＨ、ａで得られる値が４ＭＦＩのカットオフ値より大きく、かつ６．３ＭＦＩの値以下であるときに中等症状態のＮＡＳＨ、又はａで得られる値が６．３ＭＦＩのカットオフ値より大きいときに、重症状態のＮＡＳＨであると診断する工程を含む。

【0073】

このような方法は、
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素、又は上記表にて報告される特徴を有する蛍光色素を使用し、ＦＣ５００ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）及びＫａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用する一実施形態である。同様に、異なるカットオフであるＣ０～Ｃ７は、Ｐｌｉｎ２タンパク質の検出システム及び定量化システムを使用することにより定義され得る。

【0074】

上で表されるように、著者らはまた、驚くべきことに、ＮＡＳＨを診断するためのａ時点における血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度の評価により、肝線維症が存在するかしないかを、及びその重症度を定義することができることを発見した。

【0075】

本発明において、肝線維症を定義する目的で、繊維化の位置及び拡大に基づき、ステージ１、ゾーン３の類洞周囲線維化；ステージ２、上で言及したステージ１を伴う門脈線維化；ステージ３、ステージ２に加えて架橋線維化；及びステージ４、肝硬変といったステージ決めを行うスコアシステムに基づき、文献（ＫｌｅｉｎｅｒＤＥ，ＢｒｕｎｔＥＭ，ＶａｎＮａｔｔａＭ，ＢｅｈｌｉｎｇＣ，ＣｏｎｔｏｓＭＪ，ＣｕｍｍｉｎｇｓＯＷ，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ２００５；４１：１３１３－１３２１）にて使用されるのと同様の定義を使用する。ＮＡＳＨＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＮｅｔｗｏｒｋ（ＮＡＳＨＣＲＮ）は、ステージ１を続いて３カテゴリに細分している。すなわち、ステージ１Ａ、ゾーン３における軽度の類洞周囲線維化；ステージ１Ｂ、ゾーン３における中等症の門脈周囲線維化；及びステージ１Ｃ、門脈／門脈周囲線維化のみである。ステージ１Ｃの線維化は、小児又は重症肥満患者に時折観察される。

【0076】

【表4】

【0077】

したがって、本発明はまた、上で報告される方法に適用されるさらなる工程を提供する。患者の血液サンプルからＮＡＳＨが診断されると、同じサンプルから、又は当該患者のさらなる血液サンプルから、線維化の有無及びその病理学的ステージを診断することもまた可能である。

【0078】

線維化ステージ診断の工程はまた、本明細書及び特許請求の範囲に定義されるようにＮＡＳＨに罹患している患者の血液サンプル上でも行われることができ、ＮＡＳＨの診断は、本発明において説明され、請求されるものとは異なる方法で実施される。

【0079】

したがって、工程ｅは、本明細書にて説明される実施形態のいずれかにおいて、ＮＡＳＨを有すると診断される患者の血液サンプル中、又はその血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程ｅ’により置き換えられることができ、工程ｇはしたがって、ｅ’時点で得られる値と、ｆ時点で得られるカットオフ値とを比較する、工程ｇ’により置き換えられることができる。

【0080】

したがって、本発明の目的は、ＮＡＳＨのみを診断及び／又はその重症度を診断するための方法のいずれか１つであり、
ｅ．ＮＡＳＨを診断するためのａ時点における血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｆ．肝線維症に罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプル集団中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定し、肝線維症に罹患している患者と健常な患者の間の当該濃度のカットオフ値Ｃ８を同定する工程、
ｇ．ｅ時点で得られる値とｆ時点で得られるカットオフ値とを比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が当該値Ｃ８より大きいときに、肝線維症を診断する工程、をさらに含み、又は工程ｅ’、工程ｆ、工程ｇ’及び工程ｈを含む、肝線維症を診断する方法である。本発明の目的はまた、ＮＡＳＨのみを診断及び／又はその重症度を診断する方法のいずれか１つであり、
ｅ．ＮＡＳＨを診断するためのａ時点での血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｆ．肝線維症に罹患している患者及び健常な患者に由来する血液サンプルの集団中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定し、当該病態の重症度は、肝線維症の位置及び拡大に基づき、ステージ１、ステージ２、又はステージ３と組織的に定義され、
健常な患者とステージ１の肝線維症に罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ９、
ステージ１の肝線維症に罹患している患者とステージ２の肝線維症に罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ１０、
ステージ２の肝線維症に罹患している患者とステージ３の肝線維症に罹患している患者間の当該濃度のカットオフ値Ｃ１１、を同定する工程、
ｇ．ｅ時点で得られた値とｆ時点で得られたカットオフ値とを比較する工程、
ｈ．肝線維症のステージを、
ｅ時点で得られる値が当該値Ｃ９以上であり、かつ当該値Ｃ１０より小さいときにはステージ１、
ｅ時点で得られる値が当該値Ｃ１０以上であり、かつ当該値Ｃ１１以下であるときにはステージ２、
ｅ時点で得られる値が当該値Ｃ１１より大きいときにはステージ３と診断する工程、をさらに含み、又は工程ｅ’、工程ｆ、工程ｇ’及び工程ｈ’を含む肝線維症のステージを診断する方法であり、上記工程ｈのｅ時点に対する全ての参照は、必要な変更と共に、ｅ’時点に対する参照へと変更される。

【0081】

本発明の目的はまた、肝線維症を診断するための方法、及びＮＡＳＨを有すると診断される患者からの血液サンプル又は白血球細胞における、肝線維症のステージを診断するための方法は、上に説明される工程を含み、工程ｅ及び工程ｇは、工程ｅ’及び工程ｇ’により置き換えられる。

【0082】

要約すると、本明細書にて定義されるＰｎｐｌａ３及びＲａｂ１４濃度のカットオフ値は、
肝線維症に罹患している患者と健常な患者間のカットオフＣ８、
健常な患者とステージ１の肝線維症に罹患している患者間のカットオフＣ９、
ステージ１の肝線維症に罹患している患者と、ステージ２の肝線維症に罹患している患者間のカットオフＣ１０、
ステージ１の肝線維症に罹患している患者と、ステージ３の肝線維症に罹患している患者間のカットオフＣ１１である。

【0083】

上で言及したタンパク質の濃度値は、ウェスタンブロット、又は細胞蛍光分析、又はＥＬＩＳＡ、又は定量ＰＣＲにより測定され得る。

【0084】

特定の実施形態において、この濃度値は、好適な蛍光色素で標識され、Ｐｎｐｌａ３に特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体、及びＲａｂ１４に特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用して細胞蛍光分析により測定され、当該カットオフは平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される。

【0085】

上に言及されるように、Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値は、例えば、以下の特徴を有する蛍光色素などのＰｌｉｎ２濃度の値を計算する、説明される全ての実施形態及びデバイスを使用することにより計算され得る。

【表5】

【0086】

したがって、一実施形態に従い、使用される蛍光色素は、上に定義される技術特徴を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素であり得、ＦＣ５００ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）及びそのデータは、本出願の提出時に一般に入手可能である当該製品の技術的特徴を有する、Ｋａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して分析され得る。

【0087】

【0088】

したがって本発明の目的はまた、ＮＡＳＨのみを診断及び／又はその重症度を診断するための方法のうちいずれか１つであり、
ｅ．ａ時点又はＮＡＳＨを診断する時点での血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、ＰＮＰＬＡに特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体、及びＲａｂ１４に特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用する細胞蛍光分析により測定される、工程、
ｇ．ｅ時点で得られる値と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して表される、１．２４ＭＦＩ以上のカットオフ値を比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が１．２４ＭＦＩ以上であるときに、肝線維症を診断する工程、をさらに含み、
並びにＮＡＳＨのみを診断及び／又はその重症度を診断するための方法のうちいずれか１つであり、
ｅ．ａ時点又はＮＡＳＨを診断する時点での血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度値を測定する工程であって、当該値が、好適な蛍光色素で標識され、ＰＮＰＬＡに特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体、及びＲａｂ１４に特異的に結合し、他のタンパク質には結合しないモノクローナル抗体を使用する細胞蛍光分析により測定され、当該カットオフが平均蛍光強度（ＭＦＩ）の点で表される、工程、
ｇ．ａ時点で得られる値と、１．２４ＭＦＩ、２．３ＭＦＩ及び３．１０ＭＦＩに等しい平均蛍光強度（ＭＦＩ）の点で発現される当該濃度のカットオフ値を比較する工程、
ｈ．ｅ時点で得られる値が１．２４ＭＦＩ以上であり、かつ２．４ＭＦＩより小さいときに、軽度であるステージ１の肝線維症、ｅ時点で得られる値が２．４ＭＦＩ以上であり、かつ３．１０ＭＦＩより小さいときに、ステージ２の肝線維症、及びｅ時点で得られた値が３．１０ＭＦＩ以上であるときに、ステージ３の肝線維症を診断する工程をさらに含む。

【0089】

この場合も同様に、本発明の目的はまた、肝線維症を診断するための方法、及びＮＡＳＨを有すると診断される患者からの血液サンプル又は白血球細胞における、肝線維症のステージを診断するための方法は、上に説明される工程を含み、工程ｅ及び工程ｇは、工程ｅ’及び工程ｇ’及び工程ｈ’により置き換えられ、この場合、必要な変更と共に、上の工程ｈのｅ時点に対する参照の全ては、ｅ’時点に対する参照へと変更される。

【0090】

上に報告される値は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素、又は上記表にて報告される特徴を有する蛍光色素を使用し、ＣｙｔｏｆｌｕｏｍｅｔｅｒＦＣ５００（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）及びＫａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用することにより定義される。明らかに、異なる検出システムを使用することにより、他のカットオフ値は割り当てられ得る。

【0091】

当業者は、比較アッセイに関しては、他のデバイス及びソフトウェアを使用して計算されるカットオフにて、ＦＣ５００Ｃｙｔｏｆｌｕｏｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、及びＫａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素又は上記表にて報告される特徴を有する蛍光色素を使用することにより計算される、本明細書にて提供されるＭＦＩの点で表されるカットオフにどのようにして適合するかをどのような方法であっても理解している。

【0092】

さらには、本発明は、患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
ａ．当該モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにおいて、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応しており、
１つ以上の当該瞬間におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、当該治療的処置の有効性を表す、工程を含む、方法を提供する。

【0093】

上に説明されるモニタリング方法の実行において、時間ｔ０はモニタリングが開始する時間であり、これは治療の最初より前の瞬間に対応し得、又はそこからモニタリングが開始する瞬間であり、治療が開始されたときでもあり得る。

【0094】

瞬間ｔｎは、値ｎが増加しながら互いに続く（互いの次の）瞬間であり、瞬間ｔ０に続く瞬間である。

【0095】

したがって、瞬間ｔ０はモニタリングが開始する瞬間であり、血液サンプル中のＰｌｉｎ２の濃度値は、治療有効性の評価が開始する値と見なされる。次いで、濃度の測定は、ｔ０に続き１以後から進行して互いに続く（互いの次）時間で繰り返され、当該時間ｔｎは、ｎが０より大きい整数であり、それによって瞬間ｔ１は瞬間ｔ３に先行する瞬間ｔ２に先行し、これが継続する。

【0096】

ｔ０時点で測定される値に対して、ｔ０に続く時間で分析される患者の血液サンプル中のＰｌｉｎ２濃度の検出可能で有意な低下は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善において、治療的処置の有効性を表している。経時的な一定の値の維持は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを含有する治療的処置の有効性を表し、ｔ０時点で測定される値に対する経時的な値の上昇は、治療的処置の無効を表している。

【0097】

場合によっては、薬理学的治療の実施前に、食事習慣およびライフスタイルの変更が患者に提案される。こうした場合、疾患の進行を経時的にモニタリングし、例えば食事習慣及びライフスタイルの変更が疾患にポジティブに影響しているかどうかを確認することが有用である。

【0098】

考えられる治療有効性の評価の有無に関わらず、どのような方法であっても疾患の経過をモニタリングすることは、治療を行う医師にとって関心対象となり得る。したがって、本発明の目的はまた、患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの経時的な進行をモニタリングするための方法であって、
ａ．当該モニタリングが実施される瞬間ｔ０において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程、
ｂ．１つ以上の瞬間ｔｎにてＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプルにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度値を測定する工程であって、この場合、ｎは０より大きい整数であり、各ｔｎはｔ０後の瞬間に対応している、工程を含み、
１つ以上の当該瞬間におけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度における低下が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善を表し、一方で１つ以上の瞬間ｔｎにおけるＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の上昇が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの悪化を表し、一方で経時的に一定の維持状態にある値が、疾患が停滞している状況を表す、方法である。

【0099】

治療的処置のモニタリングのために本方法の説明時に瞬間ｔ０とｔｎについて説明される事項は、一般にはモニタリングのための方法に適用される。

【0100】

以下に説明される診断方法について全ての実施形態はまた、以下に説明されるモニタリング方法にも適用される。

【0101】

一般には、本明細書に説明される方法の実行時に、血液サンプルを器官などからも採取してもよいが、末梢血の使用が好ましい。

【0102】

特に、本明細書に説明される方法の実行においては、当該末梢血から単離される白血球細胞、さらに詳細には多形核細胞（多形核球）及び／又は単球におけるＰｌｉｎ２、Ｐｎｐｌａ３、Ｒａｂ１４濃度の測定を実施することが好ましい。

【0103】

ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに関して上で示される有効性及び疾患の進行をモニタリングするための同様の方法は、必要な変更と共に、脂肪肝に罹患している患者の血液サンプル中のマーカＰｎｐｌａ３及びＲａｂ１４濃度値として使用される、治療有効性及び脂肪肝の進行のモニタリング時に実施され得る。

【0104】

本発明はさらに、個体から採取した血液サンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質濃度値及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質濃度値及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度値の自動測定用デバイスを提供し、一般には、
血液サンプルからのＰＢＭＣの単離手段、
当該ＰＢＭＣの細胞質中のＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の濃度の測定手段、
得られた測定と、健常な個体から得られた値であり得る比較値、又は事前に得られる、同じ個体の血液サンプルからのＰＢＭＣの細胞質中のＰｌｉｎ２タンパク質及び／若しくはＰｎｐｌａ３タンパク質及び／若しくはＲａｂ１４タンパク質の濃度の１つ以上の値を相関させる手段、を含む。

【0105】

上に言及されるように、本発明によるデバイスは、上に説明される検出技術のうち１つ以上により、個体から採取される血液サンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質の測定を実施するために実行され得る。

【0106】

ＰＢＭＣの単離及び溶解のために選択される技術によっては、上で言及した手段は、様々な変形例に従い実行され、そのうちのいくつかは以下に説明されるであろう。例えば、ＰＢＭＣ又は単球と選択的に結合する構成成分による分離形式の場合には、このデバイスは、
－血液サンプルを受容しやすい回収チャンバ；
－当該回収チャンバ内に含まれる混合手段であって、当該血液サンプルと、当該サンプル中に存在する多形核球（ＰＢＭＣ）に結合しやすい構成成分と、必要な場合には抗凝固物質とを混合させるように構成された、混合手段；
－当該混合手段により得られた混合物に、機械的振動及び回転応力を加え、当該混合物をろ過手段へと運搬するように構成された、移動手段；
－当該ろ過手段であって、当該多形核球（ＰＢＭＣ）に結合され、当該混合物の残りを溶出させることができる当該構成成分を保持するように構成された、ろ過手段、
－結合されている構成成分からの当該多形核球（ＰＢＭＣ）の単離手段であって、当該多形核球（ＰＢＭＣ）と当該構成成分との間の分離に有利であるように構成された、単離手段；
－当該単離手段により単離される多形核球（ＰＢＭＣ）の処理手段であって、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質が存在するときには、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質と、当該タンパク質に特異的な試薬とを結合可能とするように構成され、当該試薬が１つ以上の所定の波長で蛍光性を有する、処理手段；
－少なくとも１つの放射線源であって、例えば光波の形態で、当該試薬が蛍光を放出するように所定の波長にて放射線を放出するように構成された、放射線源；
－照射されたサンプルの画像を取得するための手段；
－コントロールユニット（７）であって、当該全ての手段及び当該放射線源（１２）に接続され、所定の動作パラメータに従い、自動モードによりそれらの発動を制御及び同期するようにプログラムされ、当該コントロールユニットが、当該サンプル中に存在するＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度を定量するために当該画像を処理するようにさらに構成されている、コントロールユニット（７）；を含み得る。

【0107】

当該コントロールユニットは、当該測定される濃度と、健常な対象の血液サンプル上で、及び／又は異なる瞬間に採取された同じ個体の血液サンプル上で実施される測定から得られた、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度の１つ以上の参照データとを比較するようにさらに構成される。

【0108】

一実施形態において、例えばＰｌｉｎ２タンパク質を参照すると、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の当該参照データは健常な対象に関連するデータであり、当該コントロールユニット７は、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータがＰｌｉｎ２タンパク質濃度の当該参照データより大きい場合には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）状態を検出するようにさらにプログラムされている。

【0109】

上に説明されたものと類似する、Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度の程度は、肝線維症状態を検出し、任意でそれらの重症度を評価するために使用され得る。さらなる実施形態に従い、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度の当該参照データは、同じ患者に関連し、当該血液サンプルが検出される瞬間（ｔｎ）の前の瞬間（ｔ０）にて検出されたデータであり、当該コントロールユニット７は、経時的に疾患の経過を検出するようにさらにプログラムされる。

【0110】

例えば、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データより大きい場合には、ＮＡＦＬＤの改善が検出され、
サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データより小さい場合には、ＮＡＦＬＤの悪化が検出され、一方でサンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データに等しい場合には、疾患の停滞が検出される。

【0111】

好ましくは、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータは、２つのデータ間の差異が約０％～約５％であるときには、参照データと等しいと考えられる。

【0112】

デバイスの第１の好ましい実施形態及び第２の好ましい実施形態は、図４及び図５に例として例示される。

【0113】

一実施形態に従い、好ましくは抗凝血薬と既に混合される血液サンプルは、デバイス内の回収チャンバ３へと導入される。好ましくは、デバイス１は、当該血液サンプルが採取されることになる個体の皮膚に穴を開けやすい穿刺手段２を含むことができる。例えば、穿刺手段２は、指先で患者の皮膚に穴を開けるのに好適であり得る。当該穿刺手段は、特に、例えば針といった尖った端部を有する、少なくとも突出した終端要素を含む。穿刺手段２は、デバイス１の外部表面に支持され、使用しない状態では最小限の負担にしかならない構成をとることができるように、構成かつ関節運動することができる。この中で、尖った要素はデバイス１の外部表面に面し、使用構成では、尖った要素はデバイス１の外部表面に対向する方向に面する。好ましい一実施形態において、穿刺手段２は、マイクロメートルといったサイズを有する複数の針を含み、それ以外の場合には「マイクロニードル」と呼ばれる。有用には、マイクロニードルは、患者から血液サンプルを採取するのに好適な尖った要素の母型を形成するように、互いに対して配置され得る。そのように配置されたマイクロメートルサイズにより、血液サンプルの抽出を促進させるように、複数の皮膚の穿刺を実施することが可能となる。

【0114】

本明細書に従うデバイスが、血液サンプルを得るための穿刺手段２を直接含むときには、血液サンプルが得られると、これは上で言及した手段２にて集められ、次いで好適な流体接続手段又は運搬するための手段４によりデバイス１内の回収チャンバ３へと運搬される。このような運搬は、血液サンプルの吸引により生じ得る。特に、吸引は、穿刺手段２にそれぞれの吸引口を有する、運搬するための手段４により実施される。特に、運搬するための手段４は、シリコーン製ダイヤフラムポンプ型、又は真空マイクロポンプ型であってもよい。好ましくは、ダイヤフラムポンプが以下の寸法、すなわち、
－０．６ｍｍに等しい高さ、
－５ｍｍに等しい幅、
－５ｍｍに等しい長さ、を有し得る。

【0115】

したがって、ダイヤフラムポンプは、容易に移動させるには十分小型であり、デバイスはほぼかさばることなく、軽量かつ運びやすい。

【0116】

運搬するための手段４はさらに、回収ダクト又はカニューレ、サンプルを抗凝血薬と接触させることができる、例えばゴム製カテーテルをさらに含むことができる。

【0117】

代替的には、本明細書にて説明されるデバイスにより独立して抽出されるサンプルは、好ましくは抗凝血薬を用いて処理した後に、回収チャンバへと直接注入され得る。

【0118】

代替的な一実施形態において、サンプルは、抗凝血薬と接触させる前に回収チャンバ３へと導入又は運搬される。

【0119】

好ましくは、デバイス１は、血液サンプルから多形核球（ＰＢＭＣ）を単離する手段１４、５、６、１９を含む。

【0120】

本発明による、単離手段１４、５、６、１９は、好ましくは回収チャンバ３へと挿入され、当該血液サンプルと、ＰＢＭＣを単離しやすい構成成分又は構成成分の群とを混合するように構成される混合手段１４を含み得る（「ＰＢＭＣの単離手段」としても本明細書にて定義される）。例えば、当該構成成分の群は、当該サンプル中に存在する、多形核球（ＰＢＭＣ）に結合しやすい構成成分を含むことができ、必要な場合には（すなわち、当該血液サンプルが、抗凝血薬で未だ処理されていないときには）、抗凝固物質を伴うことができる。

【0121】

本明細書に説明されるデバイスの実行においては、当該構成成分は例えば、ＣＤ３＋Ｔ、したがってＰＢＭＣに結合するＰＢＭＣ－特異抗原に対する抗体に上で結合されている好適なマイクロビーズ（例えば、ＰｌｕｒｉＢｅａｄ（登録商標）又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）タイプの技術）により表されてもよい。

【0122】

デバイス１は、それぞれ抗凝血薬、及び多形核細胞（多形核球）に結合することができる構成成分を保持している第１容器ｓ１、及び／又は第２容器ｓ２をさらに含み得る。各容器ｓ１、ｓ２は、それぞれの送達手段１５を好ましくは含む。

【0123】

さらに、単離手段１４、５、６、１９は、以下に説明される移動手段５、及びろ過手段６を含み得る。

【0124】

混合することにより、ＰＢＭＣは上で言及した構成成分に結合する。得られる混合物は、好ましくは回収チャンバ３内部に含まれる専用の移動手段５の作用により生じる、機械的振動及び／又は回転応力に供される。特に、移動手段５は、そのようにして得られる混合物を上に運搬する、少なくとも１つの回転コンベヤベルト及び／又は振動コンベヤベルトにより実装され得る。

【0125】

手段５による混合物の応力、又は混合物の撹拌は、所定の持続時間にわたり操作される。これは、５～２０分間、５～１５分間、例えば約１０分間に相当する時間であり得る。持続時間は、例えば好ましくは同じ移動手段５に接続されるタイマーＴによって測定され得る。続いて混合物は、好ましくは同じ移動手段５によってろ過手段６へと運搬され、さらにより好ましくは、この運搬はコンベヤベルトにより実行される。

【0126】

好ましい変形実施形態に従い、ろ過手段６は、例えばろ過コンベヤベルトの形態にて移動手段５に統合され得る。換言すれば、運搬される混合物が上に配置されるコンベヤベルトの作動面は、ろ過用材料から作製され得る。ろ過手段６は、ＰＢＭＣ結合構成成分を保持し、混合物の残りを溶出させるように構成され、これは事実、上で言及した構成成分に結合されるＰＢＭＣの単離を促す。この目的のために、ろ過手段６（ＰＢＭＣを単離しやすい構成成分の群に属する）は、例えばＰＢＭＣ結合構成成分の通過を防ぎ、代わりに混合物の残りを通過させるための所定の部分の通過口を有する。

【0127】

ろ過手段のカットオフという選択は、ＰＢＭＣ結合構成成分のサイズに応じて、当業者により容易に実行され得る。加えて、ろ過のカットオフは、様々な血液サンプル細胞及び上で言及した構成成分に結合しない構成成分を溶出させ、構成成分－ＰＢＭＣ複合体を保持するように選択されるべきである。一実施形態において、ＰＢＭＣ特異的抗抗原抗体と結合したマイクロビーズを使用するときには、ろ過手段はビーズ径に基づき選択されるカットオフを有するであろう。例えば、約３０μｍの径を有するビーズにとって、ろ過手段は、細胞結合ビーズを保持させ、より小さな径を有するもの全てを溶出させるようなカットオフを有するであろう。市場で既に入手可能である試薬を使用したい場合には、ろ過手段６は、市場で現在入手可能である、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（登録商標）型の技術により実行され得る。

【0128】

有用には、単離手段１４、５、６、１９は、当該多形核球（ＰＢＭＣ）と当該構成成分との間の分離に有利であるように構成されている、結合されている構成成分からの当該多形核球（ＰＢＭＣ）の分離手段１９を含み得る。

【0129】

有利には、分離手段１９は、ろ過膜型又は緩衝液型であり得る。

【0130】

ろ過手段６上に保持される構成成分－ＰＢＭＣ化合物は、ＰＢＭＣのみを単離する手段、又は分離手段１９で処理される。それらの結合する構成成分からのＰＢＭＣの単離又は分離は、例えば、ＰＢＭＣとそれらが結合されている構成成分間の結合を破断に有利となりやすい特定の緩衝液（脱離緩衝液）を使用して実施され得る。したがって、デバイスはそれらが結合されている構成成分からＰＢＭＣを脱離するのに好適な溶液である送達手段を含むことができる。

【0131】

そのように単離されたＰＢＭＣは、例えば、管又はカテーテルを含む回収手段９により分析チャンバ１１へと運搬される。当該分析チャンバ１１は、例えば細胞膜用の溶解緩衝液など、ＰＢＭＣ細胞質を曝露させるための手段を好ましくは含む。変形実施形態に従い、細胞質の曝露は、回収チャンバ３へと直接実施される。

【0132】

代替的には、本明細書にて説明されるものに対し、血液サンプル中のＰＢＭＣ分離を得る目的で、ＰＢＭＣを単離しやすい構成成分の群は、ＰＢＭＣにおいて忌避作用を有し、それによりそれら（Ａｖｉｖａｂｉｏ（登録商標））を単離可能である微小電気機械システム、又は精密濾過パリレン膜を含み得る。当該膜は、最大３６ｍｍ^２のろ過表面、及びわずかなマイクロメートルにまで減少された限界寸法を有する、異なる幾何学形状の孔（例えば、円形、楕円又は矩形）を有する約７％～１５％の多孔度を有することができる。加えて、ＰＢＭＣは、電解ニッケルめっき技術又は紙製若しくはプラスチック材料製シートを介したろ過により、血液サンプル中で分離され得る。

【0133】

ＰＢＭＣを単離した後、これらは、例えば、色素結合検出システム、特に蛍光色素結合検出システムといった、１つ以上の所定の波長にてタンパク質の存在を可視化し、定量化することができる手段により、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度を測定するように処理される。これは、好ましくは分析チャンバ１１へと含まれ、当該特性を呈している又はシグナル伝達している構成成分に、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質への結合を行うように構成される処理手段１６により、得られ得る。一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、細胞質Ｐｌｉｎ２溶解用の緩衝液で処理され、好ましくは、例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８などの例えば蛍光二次抗体といった所定の波長で蛍光する試薬に結合される抗Ｐｌｉｎ２モノクローナル抗体と反応する。こうして、蛍光二次抗体はＰｌｉｎ２に関連付けられる。デバイス１は、抗体を保持する第３容器ｓ３をさらに含み、これは当該抗体のそれぞれの送達手段１５を含む。さらには、デバイス１は、分析チャンバ１１内部に収容される分光器を含む。好ましくは、分光器は１つの放射線源１２、及び画像を取得するための手段１３を備え、この両方は、例えば分析チャンバ１１（又は回収チャンバ３）内部に収容され、単離され処理されるＰＢＭＣの沈着面に面している。供給源１２は、当該沈着面に放射線を放出し、当該放射線は、蛍光色素結合抗体が可視化（又は特定の着色をされると想定）されるように、したがって、目視での検査によりＰｌｉｎ２を選抜することが可能となるように、所定の波長を有する。一実施形態において、放射線源１２は、３４０ｎｍ～７８０ｎｍの波長にて放射線を放出するように構成されている。好ましくは、放射線源は、４８８ｎｍの波長で放射線を放出することができる。供給源１２は、レーザ精密蛍光計又は市場で入手可能な他の類似のデバイスを含み得る。

【0134】

有利には、分光器１１は以下の寸法、すなわち、
－１５ｍｍ～２５ｍｍ、好ましくは２０．１ｍｍに等しい高さ、
－７ｍｍ～１８ｍｍ、好ましくは１２．５ｍｍに等しい幅、
－５ｍｍ～１５ｍｍ、好ましくは１０．１ｍｍに等しい深さ、を有し得る。

【0135】

したがって、分光器１１の負担は妥当なものであり、デバイス１は持ち運びが容易となるであろう。

【0136】

当業者は、文献における簡単な情報に基づき、関心対象の蛍光色素を検出するのに必要とされる波長を知るであろう。加えて、デバイスは様々な波長を放出することができるように製造され、したがって当該デバイスを特定かつ特異的な蛍光色素に結合させることがなく、これにより様々な色素の検出が可能となる。

【0137】

放射線源１２を起動させると、画像を取得するための手段１３は照射されたサンプルの画像を取得するように操作される。ここではＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質が検出可能であり、とりわけ定量化（定性化）することができる。

【0138】

デバイス１は、上に説明される手段及び構成要素の全てに接続され、所定の動作パラメータに従い、自動モードによりそれらの発動を制御及び同期させるようにプログラムされたコントロールユニット７を好ましくは含む。当該動作パラメータは、上に説明される手段／構成要素のそれぞれの起動の持続時間、並びに血液サンプルの圧力及び／又は吸引速度、それらの運搬する（運搬）速度、それぞれの容器ｓ１、ｓ２、ｓ３から送達される、抗凝血薬の量／ＰＢＭＣの単離構成成分の量／蛍光試薬の量／抗Ｐｌｉｎ２抗体の量、及び／又は放射線源の波長を含み得る。加えて、コントロールユニット７は、ユーザがデバイス１の起動を制御し、及び／又は上で言及した動作パラメータを変更／選択することができるように構成される、インタフェース手段８を包含し、又はこれに接続され得る。当該インタフェース手段８は、少なくとも１つのデバイス１の電源ボタンを含み得る。

【0139】

さらに、コントロールユニット７は、Ｐｌｉｎ２及び／又はＰｎｐｌａ３及び／又はＲａｂ１４の存在を同定し、手段１３により取得される画像中のタンパク質を定量化するようにプログラムされた画像処理マイクロプロセッサを含み得る。加えて、マイクロプロセッサは、取得される画像及び当該データの出力中に検出されるＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度を定量化するようにプログラムされ得る。出力データは、例えば、デバイス１自体に包含される有線接続手段又は無線接続手段により、外部の電子デバイス、又は例えばディスプレイを含む上で言及したインタフェース手段８に統合され得るディスプレイ手段へと伝送され得る。

【0140】

本発明のデバイス１であり、特にコントロールユニット７のマイクロプロセッサは、手段１３により取得される画像の分析により得られるＰｌｉｎ２タンパク質濃度の参照データと、健常な対象に関連するＰｌｉｎ２及び／又はＰｎｐｌａ３及び／又はＲａｂ１４であり得るＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度の参照データ（簡略化のため、ここでは参照データとする）とを、自動的に比較するように、さらに好ましくはプログラムされることができる。この場合、デバイスは専用の診断機能を有する。

【0141】

上で言及した参照データはまた、メモリモジュールに保存されることができる。例えば、このメモリモジュールは中央ユニット７中に包含され、マイクロプロセッサに接続されている。この中で、疾患の進行を追跡し続ける、又は治療的処置の有効性を評価する目的で、分析が実施されている同じ患者におけるＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度のデータは保存され、デバイス自体により予め検出される。

【0142】

特に、インタフェース手段は、その中でＰｌｉｎ２及び／又はＰｎｐｌａ３及び／又はＲａｂ１４濃度の値のパターンが示され、時間の関数として検出されるグラフを表示するように構成され得る。

【0143】

さらに、インタフェース手段８は、分析により得られたＰｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３及び／又はＲａｂ１４濃度のデータと、参照データとを比較した結果に従い、所定のカラーコードに従い、視覚信号を自動的に表示するように、及び／又は音響信号を再生するように構成され得る。

【0144】

例えば、Ｐｌｉｎ２タンパク質を参照して、疾患の進行のモニタリングを実施するときに、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データより小さい場合には、ＮＡＦＬＤの改善を検出する。これは緑色の光の点灯に対応し得る。代わりに、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データより大きい場合には、ＮＡＦＬＤの悪化を検出する。これは赤色の光の点灯及び／又は音響アラームの再生に対応し得る。加えて、サンプル分析から得られたＰｌｉｎ２タンパク質濃度のデータが参照データに等しい場合には、疾患の停滞を検出する。これは黄色の光の点灯に対応し得る。

【0145】

診断使用の場合、類似のシステムを使用することが可能である。

【0146】

さらに、同じインタフェース手段８により、異なる参照データを変更及び／又は選択すること、及び／又は光の設定／音響信号の表示設定／自動再生設定を変更することが可能である。

【0147】

好ましくは、デバイス１は、病院又は医療センターに対して割り振られる場所においてもまた、Ｐｌｉｎ２タンパク質及び／又はＰｎｐｌａ３タンパク質及び／又はＲａｂ１４タンパク質濃度の測定を可能とする目的で、運搬されるように実装される。特に、デバイス１は、例えば、充電式電池及び／又は光起電若しくは風力充電デバイスなど、デバイス自体を独立型デバイスとすることを可能とする、それ自体の電力供給手段を含むことができる。

【0148】

考案されたデバイスは、特に穿刺手段２、分光器及びポンプ４のサイズなど、様々な構成要素のサイズに関連する多数の利点を伴う。このようにサイズ決めされた当該構成要素の組合せにより、運搬用デバイス１が軽量であり負担を低減されていることから、容易に持ち運ばれて使用されることが可能となる。

【0149】

説明される事柄に従い、どのような理由で運搬用デバイスが、Ｐｌｉｎ２タンパク質濃度に加え、好適な適用及び当業者の到達できる範囲内である必要な変更を伴いつつ、血清／血漿又はＰＢＭＣ中の他の種類のタンパク質濃度の測定をも可能とするのに適切であると理解され得るかが理解されるであろう。

【0150】

この点については、デバイス１は、他のバイオマーカにこのデバイスを適合させるように構成された、好ましくは「プラグイン」ユニットといった接続ユニットを含み得る。

【0151】

代替的な実施形態によれば、デバイスはそれらの間で離間された複数の分析チャンバ１１を含み得る。各チャンバは、Ｐｌｉｎ２、Ｐｎｐｌａ３及びＲａｂ１４の中から選択される異なるタンパク質の血液サンプル中の濃度を測定するように構成されている。

【0152】

したがってこのデバイスは、異なるタンパク質の濃度を決定することが可能であり、これにより、上にて説明されるように、異なる病態の発生及びそのグレードを決定することが可能であることから様々な目的で使用される。

【0153】

好ましくは、デバイスはコントロールユニット７に動作可能に接続され、血液サンプルを、決定されたタンパク質濃度に基づき選択される正確な分析チャンバ１１へと送るように構成される、選択手段を含み得る。選択手段は、コントロールユニット７により制御されることが可能であり、このコントロールユニット７は、決定されるタンパク質濃度に関する情報を含有する入力データを送信するように構成されている。上で言及した入力データに基づき、選択手段は、血液サンプルをある特定の分析チャンバ１１へと向きを変更して導入する。

【0154】

有利には、このデバイスは、以下に報告される１つ以上の例に従い、コンピュータプログラムを実行するように構成されている少なくとも１つの処理ユニットを含み得る。

【0155】

有用には、処理ユニットはコントロールユニット７に動作可能に接続され得る。このようにして、このデバイスは分析チャンバ１１内で検出されるデータを使用し、以下に説明される１つ以上のコンピュータプログラムを実行することができる。

【0156】

本発明のデバイスは、例えば、意図される使用、及び本明細書にて説明及び請求されるようなものの中で実行したいと希望する方法に従い、以下にて説明されるように、好適なコンピュータプログラムを実装することができる。

【0157】

したがって、本発明の目的は以下に列挙されるコンピュータプログラムである。

【0158】

分析される個体におけるＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される当該個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、並びにタンパク質濃度のうち本明細書に定義されるような第２値Ｃ０及び第３値Ｃ１が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と当該第２値及び第３値を比較する工程、並びに
当該第１値が当該値Ｃ０以上であり、かつ当該値Ｃ１より小さいときにＮＡＦＬＤを診断する工程、又は当該血液サンプル中の当該第１値が当該値Ｃ１以上であるときにＮＡＳＨを診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【0159】

分析される個体におけるＮＡＳスコアを診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される当該個体の血液サンプル又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、並びに本明細書に定義されるようなＰｌｉｎ２タンパク質の濃度の第２値Ｃ３、第３値Ｃ４及び第４値Ｃ５が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と、当該第２値、当該第３値、当該第４値とを比較する工程、並びに
当該第１値が当該カットオフ値Ｃ２以上であり、かつ当該カットオフ値Ｃ３以下であるときにＮＡＳスコア１、
当該第１値が当該値Ｃ２より大きく、かつ当該カットオフ値Ｃ４以下であるときにＮＡＳスコア２、
当該第１値が当該値Ｃ４よりも大きいときにＮＡＳスコア３といったようにＮＡＳスコアを診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【0160】

分析される個体におけるＮＡＳＨ重症度を診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される当該個体の血液サンプル中又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、並びに本明細書に定義されるような当該Ｐｌｉｎ２タンパク質の濃度の第２値Ｃ５、第３値Ｃ６、第４値Ｃ７が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と、当該第２値、第３値、第４値とを比較する工程、並びに
当該第１値が当該値Ｃ５より大きく、かつ当該値Ｃ６より小さいときに軽度、
当該第１値が当該値Ｃ６より大きく、かつ当該値Ｃ７より小さいときに中等症、
当該第１値が当該値Ｃ７よりも大きいときに重症といったようにＮＡＳＨ重症度を診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【0161】

分析される個体における肝線維症を診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される当該個体の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第１濃度値、並びに請求項１１に定義されるように、Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第２濃度値Ｃ８が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と当該第２値とを比較する工程、及び
当該第１値がＣ８より大きいときに肝線維症を診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【0162】

分析される個体における肝線維症のステージを診断するための診断するためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、分析される当該個体の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の第１濃度値、並びに本明細書に定義されるように、Ｐｎｐｌａ３タンパク質及びＲａｂ１４タンパク質の濃度の第２値Ｃ９、第３値Ｃ１０、及び第４値Ｃ１１が提供されたときに、以下の工程、すなわち、
第１値と当該第２値、当該第３値、当該第４値とを比較する工程、及び
当該第１値が、当該値Ｃ９以上であり、かつ当該値Ｃ１０より小さいときにステージ１、
当該第１値が、当該値Ｃ１０以上であり、かつ当該Ｃ１１以下であるときにステージ２、及び
当該第１値が当該値Ｃ１１よりも大きいときにステージ３といったように当該線維症スコアのステージを診断する工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム。

【0163】

代替的には、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳスコア、ＮＡＳＨ、ＮＡＳＨの重症度を診断するための、上に説明されるコンピュータプログラムは、肝線維症及び／又は肝線維症ステージを診断するための、２つの上に説明される指示一覧のうち、１つを含み得る。

【0164】

本発明の目的はまた、患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの治療的処置の有効性をモニタリングするためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、瞬間ｔ０における当該患者の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、及びｔ０の次の瞬間における、当該患者の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第２濃度値を提供するときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と当該第２値を比較する工程、及び
当該第２値が当該第１値より小さい場合には、当該治療的処置の有効性を検出する工程、を含む工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラム、
並びに患者におけるＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの進行をモニタリングするためのコンピュータプログラムであって、電子コンピュータ上にて実施され、瞬間ｔ０において当該患者の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第１濃度値、及びｔ０の次の瞬間における、当該患者の血液サンプル中、又は当該血液サンプルから抽出した白血球細胞のサンプル中のＰｌｉｎ２タンパク質の第２濃度値を提供するときに、以下の工程、すなわち、
当該第１値と当該第２値を比較する工程、及び
当該第２値が当該第１値より小さい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの改善を検出する工程、
当該第２値が当該第１値より大きい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの悪化を検出する工程、
当該第２値が当該第１値とほぼ等しい場合には、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの停滞を検出する工程、を含む工程を実行する指示の一覧を含む、コンピュータプログラムである。

【0165】

本発明の目的は、上に説明及び請求されるいずれかの実施形態中のデバイスであり、これはまた、上に説明される例のうち１つ以上に従い、コンピュータプログラムを実行するように構成されている少なくとも１つの処理ユニットをも含む。

【0166】

有用には、処理ユニットはコントロールユニット７に動作可能に接続され得る。このようにして、このデバイスは分析チャンバ１１内で検出されるデータを使用し、上に説明される１つ以上のコンピュータプログラムを実行することができる。

【0167】

本発明の目的はまた、本発明の目的である方法を実行するために、上に説明される実施形態のうちいずれか１つにおいてデバイスを使用することである。

【0168】

最後に、本発明の目的は、本明細書に説明されるモニタリングが実施される、ＮＡＦＬＤに罹患している患者の処置のための治療方法である。

【0169】

例
方法
ＮＡＦＬＤに罹患している男女１９人の肥満対象（１０人の女性及び９人の男性、その平均年齢は３８．５±１．９歳、及びＢＭＩは３６．７９±４．４３ｋｇ／ｍ^２）を登録し、減量手術を施した。登録時に１２時間夜間絶食した後、ＥＤＴＡを添加した末梢静脈血の採取を実施した。患者は、研究及び外科的介入に対するインフォームドコンセントに署名した。

【0170】

全ての対象に対し、既往歴を集めた。身長測定、体重測定、及び人体測定を含む客観的試験も実施した。体重（ｋｇ）を身長（ｍ^２）で割り、ボディマス指数（ＢＭＩ）を計算した。使用される薬物の詳細な一覧を集めた。

【0171】

除外一覧は、（１）定期的及び／又は過剰なアルコール摂取（女性の場合、１日あたり２０ｇ超のアルコール、男性の場合、１日あたり３０ｇ超のアルコール）、（２）医原性胃腸管疾患又は免疫不全疾患（ＨＩＶ感染症）に続発するＮＡＦＬＤの臨床的エビデンス、（３）Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎を含む非ＮＡＦＬＤ肝疾患、又はヘモクロマトーシス、（４）ウィルソン病、（５）糖原病、（６）α－１アンチトリプシン欠乏、（７）自己免疫性肝炎、（８）胆汁うっ滞製肝疾患、（９）関連する心血管、胃腸管若しくは呼吸器疾患、又は任意のホルモン障害、（１０）非代償性肝疾患の臨床的エビデンス（７点超のチャイルド・ピュー分類）、（１１）麻薬乱用状態にある、（１２）関連する全身性疾患、（１３）妊娠、である。

【0172】

外科手術中に肝生検を得た。

【0173】

全ての対象は、血中インスリン及び糖値（血糖）を測定するため、０分時点、３０分時点、６０分時点、９０分時点、１２０分時点、１５０分時点、及び１８０分時点で回収される、経口糖負荷試験を受けた。ＯＧＴＴからインスリン感受性を計算することが可能な方法であるＯＧＩＳ（経口グルコースインスリン感受性の頭字語）として、インスリン感受性を測定した。ＯＧＩＳは、クランプ法により得られるインスリン感受性指数と類似する指数を得た（ＭａｒｉＡ，ＰａｃｉｎｉＧ，ＢｒａｚｚａｌｅＡＲ，ＡｈｒｅｎＲ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｍｐｌｅｉｎｓｕｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｏｒａｌｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２００５；４８：７４８－７５１）。

【0174】

肝臓組織学
ホルマリン下に置かれた肝生検を６０％イソプロパノールで完全に洗浄し、次いでこれを気化させた。オイルレッドＯ（ＯＲＯ）溶液を１０分間加え、次いでこれを除去し、サンプルを水で４回洗浄した。オイルレッドＯの除去時に、この断片を１００％イソプロパノール中でインキュベートした。単球もまた同じＯＲＯ染色に供した。

【0175】

次いで適切なフィルタを装着したＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡の下でサンプルを観察した。

【0176】

さらに、脂肪症の割合を評価する目的で、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンブロックに含まれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された断片から調製した外科手術中に得られた生検部分を保管用スライドガラス上へと取り付けた。スライドガラスの読取りを、盲目条件下にて、肝臓における解剖病理学者が実施した。

【0177】

Ｂｒｕｎｔ分類（ＢｒｕｎｔＥＭ，ＪａｎｎｅｙＣＧ，ＤｉＢｉｓｃｅｇｌｉｅＡＭ，ｅｔａｌ．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ａｐｒｏｐｏｓａｌｆｏｒｇｒａｄｉｎｇａｎｄｓｔａｇｉｎｇｔｈｅｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｅｓｉｏｎｓ．ＡｍＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９９；９４：２４６７－２４７４）を使用し、組織学的スコアリング及びＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝炎）ステージを評価した。特に、脂肪症を以下のスコア：０、存在せず（１％未満）；１、１～２５％；２、２６～５０％；３、５１％～７５％；及び４、７５％超の小葉中の脂肪で定義した。炎症は以下のスコア：１、軽度（リンパ球が単離（散乱）又は門脈管内部及び小葉における小さな形成へと凝集）；２、中等症（グレード１と同様、大きな門脈及び小葉浸潤は未だなし）；３、重症（グレード２と同様、著しい炎症は未だ見られず）を得た。線維化を、存在しないときには０、小葉中心の細胞周囲に見られるときには１、門脈周囲及び細胞周囲に見られるときには２、架橋線維化では３、及び肝硬変では４としてステージ分類した。

【0178】

単球の単離
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）における標準的な勾配遠心分離により、全血からＰＢＭＣを得た。次いでＰＢＭＣを洗浄し、ＰａｎＭｏｎｏｃｙｔｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔにより単球を単離した。

【0179】

肝細胞の単離
肝生検断片を細かく刻み、ＨＢＳＳ中で洗浄して血液の痕跡を除去した。次いで、ＥＧＴＡ緩衝液（ＨＢＳＳ、０．５ｍＭＥＧＴＡ、０．５％ＢＳＡ）を含有する５０ｍＬの試験管へと移し、３７℃に維持して水浴させながら１０分間１００ｒｐｍで撹拌した。次いでこの組織を消化緩衝液（ＨＢＳＳ、０．０５％コラゲナーゼＩＶ、脂肪酸を含まない０．５％のＢＳＡ、１０ｍＭのＣａＣｌ２）へと入れ、３７℃に維持して水浴させながら１０分間１００ｒｐｍで撹拌した。上清を回収し、１００μｍの細孔フィルタに通してろ過し、細胞懸濁液を４℃にて５分間８０ｒｐｍで遠心分離にかけ、この上清を廃棄した。

【0180】

脂肪滴の染色
単離した単球及び肝細胞を、４％ホルマリンと共に２０分間インキュベートし、ナイルレッド（１００ｎｇ／ｍＬ）で染色した。核をＤＡＰＩで染色した。

【0181】

ＣｒｅｓｔＸ－ＬｉｇｈｔＣｏｎｆｏｃａｌＩｍａｇｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）といったスピニングディスク共焦点顕微鏡で写真を撮影し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ＆ＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で画像を分析した。

【0182】

Ｐｌｉｎ２測定
単球及び肝生検を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液でホモジナイズした。ホモジナートを４℃で３０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。タンパク質含有量を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で測定した。タンパク質溶解物（３０μｇ）を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離させ、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を抗Ｐｌｉｎ２抗体（ＬＳ－ＢＩＯ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）及び抗－βアクチンで一晩インキュベートした。ＣｈｅｍｉｄｏｃＸＲＳＩｍａｇｅシステム及びＩｍａｇｅＬａｂ５．０ソフトウェア（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、定性－定量分析を実施した。全てのデータを、βアクチンレベル（８Ｈ１０Ｄ１０）について正規化した。

【0183】

統計
特段指定しない限り、データを平均±ＳＤとして表す。スピアマンの相関を使用し、２変数の相関度を測定した。ブランド－アルトマンプロットにより、２つの方法間の一致を測定した。ブランドーアルトマンの結果は、２つの方法（単球中及び肝臓中のＰｌｉｎ２レベル）で得られる差異及び平均値を示す。２つの方法間の差異の標準偏差（ＳＤ）は、ＳＤバイアスである。許容範囲は平均バイアス、すなわち２測定方法間の差異の平均は、ＳＤバイアスの±１．９６として測定された。

【0184】

方法の感度及び特異性を、ニューラルネットワーク分析により研究した。ニューラルネットワーク分析のパラメータを以下に報告する：２つの入力層が使用される、すなわち、単球中のＰｌｉｎ２及び対照の年齢である。６ユニット及び双曲線（正接）活性化関数を含有する１つの隠れ層のみ。出力層は従属変数、すなわちＮＡＳレベルである。活性化関数：Ｓｏｆｔｍａｘ、誤差関数：交差エントロピー。

【0185】

ニューラルネットワーク分析は、ＲＯＣ（受信者操作特性）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を提供する。ＲＯＣ曲線は、Ｘ軸上に感度を有し、Ｙ軸上には誤検出数（１－特異度）を有する。１に最も近いＡＵＣは、この試験の最高の予測値である。統計分析を、ＳＰＳＳバージョン１３により実行した。

【0186】

結果
脂肪肝のグレードを、肝生検により、かつ上に定義されるＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）、ＮＡＦＬＤのグレードを定義する組織学的方法で評価し、試験される全ての患者の脂肪症グレード平均は、２．４２±１．１７であり、対象は１～４の脂肪症グレードを呈した。

【0187】

単球中でも異所的な脂肪蓄積が生じることを実証する目的で、ナイルレッドを使用して肝生検及び単球を染色した（図１、パネルＡ）。単球においては、脂質はより大きな滴へと凝集する。

【0188】

単球中のＰｌｉｎ２発現は、肝臓中のＰｌｉｎ２発現と強く正に相関する（Ｒ＝０．８４、Ｐ＜０．０００１）。ウェスタンブロットによるＰｌｉｎ２タンパク質発現の一例を、図１のパネルＢに報告する。

【0189】

図２は、同じ対象の肝臓部分及び単球中のＯＲＯ染色を代わりに報告する。

【0190】

肝臓中のＰｌｉｎ２レベルは、脂肪肝のグレードと良好に相関し（Ｒ＝０．９１、Ｐ＜０．００１）、単球中のＰｌｉｎ２レベルは、脂肪肝のグレードと良好に相関する（Ｒ＝０．８９、Ｐ＜０．００１）。

【0191】

図３は、２つの投与方法、すなわち単球中及び肝臓中のＰｌｉｎ２レベルを比較するブランドーアルトマングラフを報告する。２つの測定で得られた値間の差異はＹ軸上にて報告されるが、一方で平均はＹ軸上に存在する。点線は、２つの測定間の９５％の一致境界線を報告する。グラフは、全ての点が一致境界線内部に存在することを実証するが、これは本発明の方法が有効であることを意味している。

【0192】

または、平均蛍光強度（ＭＦＩ、図４）として表される細胞蛍光分析により単球中で測定されるＰｌｉｎ２レベル、及びウェスタンブロットにより測定されるＰｌｉｎ２レベル間には良好な相関が存在することも見いだされた（Ｒ＝０．９２、Ｐ＜０．０００１）。

【0193】

４８．８８±５．８０（ＳＥＭ）であるＰＢＭＣ中のＰｌｉｎ２レベル（ＭＦＩ）は、４２．９０±５．７７（ＳＥＭ）である単球中のレベルと優れた相関（Ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．０００４）を実証する。

【0194】

非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度とＰｌｉｎ２レベルとの相関の証拠として、肝臓中及び単球中の両方のＰｌｉｎ２レベルは、ＯＧＩＳとして表されるインスリン感受性と非常に良好に逆相関することが見いだされており、単球についての回帰式は、
ＯＧＩＳ＝４４．５９^＊Ｐｌｉｎ２＋４１１．３であり、
０．９１のＲ^２およびＰ＜０．０００１を伴う。

【0195】

ＯＧＩＳは経口グルコースインスリン感受性指数の頭字語であり、測定単位としてｍＬ×分^－１×ｍ^－２を有する。Ｐｌｉｎ２を、β－アクチン基準タンパク質に関連する単位で、ウェスタンブロットにより測定する。

【0196】

患者の分析
ＮＡＳＨが疑われる９１人の対象が肝生検を受けたが、一方で標準的なボディマス指数を有する２１人の対象は待機的胆嚢摘出術を受け、手術中に肝超音波陰性試験（対照）は、肝臓のコア生検を受けた。年齢範囲は１８～６７歳であり、５５％が女性で４５％が男性であった。

【0197】

組織学的試験は、ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）の様々なステージにハイライトした。

【0198】

細胞蛍光分析により分析される循環単球中のＰｌｉｎ２レベルを使用し、ＮＡＳを予測した。

【0199】

対照のうち、一方はＮＡＳ＝０であり、もう他方はＮＡＳ＝１であった。

【0200】

細胞蛍光分析
Ｐｌｉｎ２に対するモノクローナル抗体を、ＬＳ－ＢＩＯ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から得て、フルオロフォア結合された二次モノクローナル抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８をＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から、抗ＣＤ１４－ＥＣＤ抗体をＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ（ＢｒｅａＣＡ）から得た。

【0201】

単球を、抗ＣＤ１４－ＥＣＤ抗体を使用することで同定し、全ての多形核球中の単球集団を同定するのに使用した。以下に報告されるように、標準的な技術により単球を固定及び透過処理した。

【0202】

１部の固体／透過濃縮物を、３部の固定／透過希釈剤と混合させた。細胞ペレット（２×１０６細胞）を、３００μＬの１倍透過処理緩衝液に再懸濁させ、４５分間４℃加温してインキュベートした。これを１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して遠心分離にかけ、細胞を１００μＬの１倍のＰＢＳに再懸濁させた。懸濁液中の細胞を、２つの試験管（それぞれ５０μＬ）へと細分した。
・試験管１：懸濁液中の細胞をＩｇＧ抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（１：２０００）で、２０分間室温にて暗所で染色した。この試験管は陰性対照である。
・試験管２：懸濁液中の細胞を、抗Ｐｌｉｎ２（５０μｌ中１μｌ）で染色し、次いでＩｇＧ抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８及び抗ＣＤ１４－ＥＣＤ抗体（５０μｌ中４μｌ）で、２０分間室温にて暗所で染色した。

【0203】

これを洗浄して遠心分離にかけ、５００μＬの１倍ＰＢＳに再懸濁させた。次いで細胞蛍光分析に進む。

【0204】

したがって、単球を、Ｐｌｉｎ２に対するモノクローナル抗体及び抗Ｐｌｉｎ２抗体に結合しているフルオロフォア結合二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）を使用して、Ｐｌｉｎ２に染色した。

【0205】

細胞蛍光分析に使用する装置はＦＣ５００（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）であり、Ｋａｌｕｚａｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）でデータを分析した。

【0206】

Ｐｌｉｎ２検出を、細胞蛍光計の光ダイオードにより獲得され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して変換される信号を生成する蛍光トレーサにより得る。

【0207】

ＭＦＩは、タンパク質の定量化を可能とする細胞抗原（この場合はＰｌｉｎ２）を認識し、これに結合する抗体の数に比例している（ＭｉｚｒａｈｉＯ．，ＳｈａｌｏｍＥ．Ｉ．，ＢａｎｉｙａｓｈＭ．，ＫｌｉｅｇｅｒＹ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｃｏｎｃｅｒｎｓａｎｄｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈ．ＣｙｔｏｍｅｔｒｙＢＣｌｉｎＣｙｔｏｍ．２０１７）。

【0208】

組織学的には、脂肪症が５％超の肝細胞に影響するときにはＮＡＦＬＤが定義され、代わりにＮＡＳＨは、脂肪症に加えて数には関係なくいずれかのグレードの肝細胞の膨化変性、及び小葉炎症性浸潤の存在に対して定義される。ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）は、脂肪症、肝細胞膨化変性、及び肝組織の小葉炎症性浸潤の組合せから生じる。以下の表から、個々の成分の合計が、最大スコア８を得ることが確認されるであろう。

【0209】

【表6】

（ＫｌｅｉｎｅｒＤ．Ｅ．，ＢｒｕｎｔＥ．Ｍ．，ＶａｎＮａｔｔａＭ．，ＢｅｈｌｉｎｈＣ．，ＣｏｎｔｏｓＭ．Ｊ．，ＣｕｍｍｉｎｇｓＯ．Ｗ．，ＦｅｒｒｅｌｌＬ．Ｄ．，ＬｉｕＹ．－Ｃ．，ＴｏｒｂｅｎｓｏｎＭ．Ｓ．，Ｕｎａｌｐ－ＡｒｉｄａＡ．，ＹｅｈＭ．，ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈＡ．Ｊ．，ＳａｎｙａｌＡ．Ｊ．ｆｏｒｔｈｅＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃＳｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＮｅｔｗｏｒｋ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４１：１３１３－１３２１，２００５．）

【0210】

様々なＮＡＳステージにおけるＰｌｉｎ２（平均蛍光強度［ＭＦＩ］）レベルを以下の表にて報告する：

【表7】

【0211】

以下に報告されるように、平均Ｐｌｉｎ２レベル（ＭＦＩ）とＮＡＳステージとの間の相関は優れている。

【0212】

Ｘ軸上の独立変数はＰｌｉｎ２の平均値であり、一方で従属変数はＮＡＳステージである（図７）。

【0213】

【表8】

【0214】

Ｒ２は、Ｐ＜０．０００１の有意性を伴い非常に高く（０．９８５）、ＮＡＳＨ組織ステージ、すなわちＮＡＳを予測するためのモデルが優れていることを示している。

【0215】

【表9】

【0216】

様々なＮＡＳステージを予測するＰｌｉｎ２の能力は、ニューラルネットワーク分析により研究された。

【0217】

ニューラルネットワーク分析パラメータを以下に報告する。２つの入力層である、単球中のＰｌｉｎ２及び対象年齢を使用した。６ユニット及び双曲線（正接）活性化関数を含有する１つの隠れ層のみ。出力層は従属変数、すなわちＮＡＳレベルである。活性化関数：Ｓｏｆｔｍａｘ、誤差関数：交差エントロピー。

【0218】

【表10】

【0219】

この設計は、以下に報告されるように、その訓練中の場合の６．３％のみ、０．０５秒試験中の場合には１１．３５％が不正確なＮＡＳ値を予測した。

【0220】

【表11】

【0221】

このデータは、受信者操作特性曲線（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）が非常に高く、最小０．９７４～最大１までの範囲であることを実証する。全てのステージは、優れた感度と特異性の点で予測可能である。

【0222】

【表12】

【0223】

モデルにおけるＰｌｉｎ２変数の重要度は以下に報告され、これは６８．３％であるが、正規化するとこれは１００％に達する。一方でモデルにて使用される第２の変数の重要度、すなわち年齢は、３１．７％であり、正規化するとこれは４６．３％である。

【0224】

【表13】

（図８を参照されたい）

【0225】

繰り返しの推測、すなわち多重比較用に調整される多重比較分析は、様々なＮＡＳステージにおける高い有意性の差異を実証する。以下の表を参照されたい。

【0226】

【表14】

【0227】

【表15-1】

【表15-2】

【0228】

まとめると、単球中のＰｌｉｎ２は、ＮＡＳＨ重症度ステージ（すなわち、ＮＡＳスコア）を高度に予測し、これにより生検などの侵襲的試験を末梢血における試験に置き換えることが可能となる。

【0229】

線維化
パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（Ｐｎｐｌａ３）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＳＡＢ１４０１８５１）及びＲａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１４（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＲ０６５６）を、常に単球中にて細胞蛍光分析により、肝臓及び単球単離の組織学的試験により合計１３２人の対象に投与した。

【0230】

以下、ＳＡＦ線維症の各ステージに関する平均値（ＭＦＩ）は、Ｆ０～Ｆ４の範囲である（ＢｅｄｏｓｓａＰ，ＰｏｉｔｏｕＣ，ＶｅｙｒｉｅＮ，ＢｏｕｉｌｌｏｔＪＬ，ＢａｓｄｅｖａｎｔＡ，ＰａｒａｄｉｓＶ，ｅｔａｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌａｌｇｏｒｉｔｈｍａｎｄｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｅｒｌｅｓｉｏｎｓｉｎｍｏｒｂｉｄｌｙｏｂｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２０１２；５６：１７５１－１７５９）。

【0231】

【表16】

【0232】

【表17】

【0233】

次いで、独立変数としてＰｎｐｌａ３単球及びＲａｂ１４単球を使用し、従属変数としてＮＡＳを使用し、共変量（２値変数、はい＝１、いいえ＝０）として糖尿病の有無を使用して、ＲＯＣ曲線のＡＵＣを計算するためにニューラルネットワーク分析を実施した。これらの変数を、ニューラルネットワークの入力層にて使用した。８単位を有する隠れ層は１つのみであり、活性化関数は誇張であった。モデルの出力により線維化グレード（ＳＡＦＦ）が生じ、活性化関数はソフトマックスであり、誤差関数は交差エントロピーであった。

【0234】

【表18】