2022-528057 リラグルチドの精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-08

(54)【発明の名称】リラグルチドの精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/20 20060101AFI20220601BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20220601BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20220601BHJP

   B01J 20/287 20060101ALI20220601BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20220601BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20220601BHJP

   G01N 30/46 20060101ALI20220601BHJP

   C07K 14/605 20060101ALN20220601BHJP

【ＦＩ】

C07K1/20

G01N30/88 J ZNA

G01N30/06 C

B01J20/287

G01N30/26 A

G01N30/34 E

G01N30/46 Z

C07K14/605

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557061

(86)(22)【出願日】2020-03-24

(85)【翻訳文提出日】2021-11-10

(86)【国際出願番号】 SG2020050156

(87)【国際公開番号】W WO2020197492

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/823,147

(32)【優先日】2019-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513105579

【氏名又は名称】サイノファーム タイワン，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】ウー ミン－チー

(72)【発明者】

【氏名】ホアン シン－チョー

(72)【発明者】

【氏名】シャオ ツン－ユイ

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA20

4H045BA18

4H045DA30

4H045EA27

4H045FA33

4H045GA25

(57)【要約】

本発明は、リラグルチドを精製するための改良された方法を提供する。リラグルチドは、２回の連続ＲＰ－ＨＰＬＣ精製と、それに続く塩交換工程によって精製され、ここで、ｐＨは１回目とと２回目の精製工程で一定に保たれる。特に本方法は、試料調製工程でハロゲン化溶媒を利用し、これにより、溶解性が向上し、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製前に、粗リラグルチドの脱炭酸に適した環境が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含むリラグルチドを精製するための方法：
（ａ）粗リラグルチドをハロゲン化溶媒を含む溶液に溶解すること、及び
（ｂ）前記溶液をＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムに供し、精製されたリラグルチドを画分で採取すること。

【請求項2】

工程（ａ）のハロゲン化溶媒が、フッ素化酸、フッ素化アルコール、塩素化溶媒、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記フッ素化アルコールは、２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、２，２，３，３－テトラフルオロ－１－プロパノール、２，２，３，３，３－ペンタフルオロ－１－プロパノール、ペンタフルオロフェノール、ノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、３，３，４，４，４－ペンタフルオロ－１－ブタノール、４，４，５，５，５－ペンタフルオロ－１－ペンタノール、２，２，３，４，４，４－ヘキサフルオロ－１－ブタノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－フェニル－２－プロパノール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記塩素化溶媒が２，２，２－トリクロロエタノールである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

フッ素化酸がトリフルオロ酢酸である、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

工程（ａ）の溶液が、５～３５容量％のフッ素化アルコール及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

工程（ａ）の溶液が、１５～２０容量％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

工程（ａ）の溶液が、２０～３０容量％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｂ）のＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムが、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製と、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を含み、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製がｐＨ値＜７で実施され、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製がｐＨ値＞７で実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製がｐＨ値＜３で実施され、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製がｐＨ値＞約７．５で実施される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製が、トリフルオロ酢酸及び水を含む移動相Ａと、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含む移動相Ｂとを使用する、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記移動相Ａ及び前記移動相Ｂが、それぞれ０．１～１容量％のトリフルオロ酢酸を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

移動相Ｂが５～２５容量％から８０～１００容量％までの線形勾配で溶出される、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製が、アンモニウム塩又はリン酸塩を含む移動相Ｃと、アセトニトリルを含む移動相Ｄとを使用する、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

前記アンモニウム塩が、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記リン酸塩が、第三リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第三リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、第三リン酸アンモニウム、第二リン酸アンモニウム、第一リン酸アンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記移動相Ｃが、水中の５～５０ｍＭの濃度のアンモニウム塩又はリン酸塩を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記移動相Ｃが、約７．５～約９．０又は約７．５～約８．５のｐＨ値を有する、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記移動相Ｄが、０～１０容量％から５０～１００容量％までの線形勾配で溶出される、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

画分中の前記精製されたリラグルチドが、約７．５～約８．５のｐＨ値を有する、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

以下をさらに含む請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法：
（ｃ）工程（ｂ）の画分を、ナトリウム塩、水、及びアセトニトリルを含む移動相Ｅを使用する３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、そして画分を集めて塩交換リラグルチドを得ること。

【請求項22】

前記ナトリウム塩が第二リン酸ナトリウムである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

画分中の前記塩交換リラグルチドが約７．５～約８．０のｐＨ値を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１９年３月２５日に出願された米国仮出願第６２／８２３，１４７号の優先権を主張し、これは、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

コンパクトディスクで提出された「配列表」、表、又はコンピュータープログラムリスト添付書類の参照
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、こうして参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、Sequence_Listing_for_050760_54001_WO_ST25.txtである。このテキストファイルは、４．００ＫＢであり、２０２０年３月１９日に作成され、ｅ－ＰＣＴファイリングを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
リラグルチド（Liraglutide）（商品名Victoza）はヒトＧＬＰ－１の類似体であり、ＧＬＰ－１受容体アゴニストとして作用し、２型糖尿病の成人の血糖コントロールを改善するための食事及び運動療法の補助として示されている。リラグルチドは、配列番号１を有するペプチドを含み、これは、３４位のリジンをアルギニンで置換することにより、天然のヒトＧＬＰ－１と９７％相同であるように操作されている。リラグルチドは更に、前述の操作されたペプチドから、Ｃ－１６脂肪酸（パルミチン酸）をグルタミン酸スペーサーを介して２６位のリジン残基に結合させることにより得られる。すなわち、天然のヒトＧＬＰ－１に基づいて前述の修飾を加えたリラグルチドの構造を以下に示す：

【化1】

【0004】

リラグルチドは、Ｃ₁₇₂Ｈ₂₆₅Ｎ₄₃Ｏ₅₁の分子式、及び３７５１．２ダルトンの分子量を有する。これは、もともとはNovo Nordiskによって開発され、２０１０年１月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって「Victoza」の商品名で承認された。

【0005】

米国特許出願公開第２０１５／００５１３７２Ａ１号は、固相合成粗リラグルチドを精製するための３工程の方法を開示する：試料処理とそれに続く３回のＲＰ－ＨＰＬＣ精製。試料処理では、粗リラグルチドはアセトニトリルと水の混合物（例えば、２０容量％アセトニトリル／８０容量％水）に溶解された。調製した試料を１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、ここで移動相Ａ（ＭＰＡ）は０．１％ＴＦＡ／イソプロパノール／水であり、移動相Ｂ（ＭＰＢ）は０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルであり、固定相はオクチルシラン結合シリカであり、そして勾配は線形勾配であった。次に、１回目の精製で得られた画分を２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、ここで、ＭＰＡは水中の０．０５～０．１５％過塩素酸であり、ＭＰＢは、アセトニトリル中の０．０５～０．１５％過塩素酸であり、固定相はシアのシラン結合シリカであり、そして勾配は線形勾配であった。精製されたリラグルチドは最終的に、脱塩のために３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供され、ここで、ＭＰＡは０．０５％アンモニア水溶液であり、ＭＰＢはアセトニトリルであり、固定相はオクチルシラン結合シリカであり、そして勾配は線形勾配であった。

【0006】

米国特許第９，４２２，３３０Ｂ２号は、酵母の発酵から生成された粗リラグルチドを精製する方法を開示する。米国特許第９，４２２，３３０号の実施例６に記載されているように、粗リラグルチドを水は希釈され、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供され、ここで、固定相はオクタデシル－ジメチルシリルシリカであり、これはまず、ｐＨ７．５の２０ｍＭトリス緩衝液／２０％エタノールの移動相と平衡化させた。カラムを最初に平衡化溶液で洗浄し、線形勾配で溶出し、続いてエタノールとｐＨ５．１の２０ｍＭクエン酸緩衝液を含む移動相でアイソクラティック勾配で溶出した。次に、標的リラグルチドを、エタノール及び２０ｍＭクエン酸緩衝液を含む移動相を用いて、ｐＨ５．１からｐＨ４．０への線形ｐＨ勾配溶出によって溶出した。クロマトグラフィー温度は６０℃に維持した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記の精製方法にもかかわらず、リラグルチドを精製するためのより効率的で改良された方法の開発の必要性がいまだに存在する。本開示は、この必要性に対処し、関連する利点も提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様において、本発明はリラグルチドを精製するための方法を提供する。この方法には以下が含まれる：
（ａ）粗リラグルチドをハロゲン化溶媒を含む溶液に溶解すること、及び
（ｂ）前記溶液をＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムに供し、精製されたリラグルチドを画分で採取すること。

【0009】

第２の態様において、本出願はリラグルチドを精製するための方法を提供する。この方法には以下が含まれる：
（ａ）粗リラグルチドをハロゲン化溶媒を含む溶液に溶解すること、及び
（ｂ）前記溶液をＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムに供し、精製されたリラグルチド画分を採取することであり、ここで、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムは１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製と２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製とを含む、及び
（ｃ）工程（ｂ）の画分を、ナトリウム塩、水、及びアセトニトリルを含む移動相Ｅを使用して３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、そして画分を集めて塩交換リラグルチドを得ること。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１による１回目の精製の溶出クロマトグラム（全体）を示す。

【0011】

【図2】図１の溶出クロマトグラム（ズームイン）を示す。示されている５～１３の画分を一緒にして、次の２回目の精製のための１Ｐ主画分とした。

【0012】

【図3】実施例２又は３による１回目の精製の溶出クロマトグラム（全体）を示す。

【0013】

【図4】図３の溶出クロマトグラム（ズームイン）を示す。示されている１０～１５の画分を一緒にして、次の２回目の精製のための１Ｐ主画分とした。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（発明の詳細な説明）
Ｉ．一般
本発明は、リラグルチドを精製するための改良された方法を提供する。リラグルチドは、２回の連続したＲＰ－ＨＰＬＣ精製と、それに続く塩交換工程によって精製され、ここで、ｐＨは１回目と２回目の精製工程で一定に保たれる。特にこれらの方法は、試料調製工程でハロゲン化溶媒を利用し、これにより、溶解性が向上し、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製前の粗リラグルチドの脱炭酸に適した環境が提供される。表Ａ及びＢは、当技術分野で開示されている方法と比較した本発明の利点又は特徴を要約している。

【化2】

ＴＦＥ：トリフルオロエタノール；ＨＦＩＰ：ヘキサフルオロイソプロパノール；及びＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。

【化3】

【0015】

ＩＩ． 定義
配列番号１は、リラグルチド中の操作されたペプチドのアミの酸配列を指す。この配列は次のように表される：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

【0016】

「約」は、特定の値を含む値の範囲を意味し、当業者は、これを特定の値に合理的に類似していると見なすであろう。いくつかの実施態様において、「約」という用語は、当技術分野で一般的に許容される測定値を使用する標準偏差内を意味する。いくつかの実施態様において、約は特定の値の±１０％に及ぶ範囲を意味する。いくつかの実施態様において、約は特定の値を意味する。

【0017】

「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は、逆相高速／高圧液体クロマトグラフを指す。

【0018】

「アンモニウム塩」は、ＮＲ₄ ⁺のカチオン及びアニオンから構成される化合物のクラスを指し、ここでＲ基は水素又はアルキルであり得る。１つの実施態様において、アンモニウム塩は、ＮＨ₄ ⁺のカチオン及びアニオンから構成される化合物のクラスを指す。本発明において有用なアンモニウム塩には、ギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムが含まれる。

【0019】

「リン酸塩」は、カチオン及びリン酸アニオンから構成される化合物のクラス、例えばリン酸アニオン（ＰＯ₄ ^3-）、リン酸水素アニオン（ＨＰＯ₄ ^2-）、及び第二リン酸アニオン（Ｈ₂ＰＯ₄ ^-）を指す。ＰＯ₄ ^3-の陰イオンを有するリン酸塩はまた、第三リン酸塩を指す。ＨＰＯ₄ ^2-のアニオンを有するリン酸塩はまた、第二リン酸塩を指す。また、Ｈ₂ＰＯ₄ ^-のアニオンを有するリン酸塩はまた、第一リン酸塩を指す。本発明において有用なリン酸塩には、第三リン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＰＯ₄）、第二リン酸ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、第一リン酸二ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）、第三リン酸二カリウム（Ｋ₃ＰＯ₄）、第二リン酸カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）、第一リン酸カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）、第三リン酸アンモニウム（（ＮＨ₄）₃ＰＯ₄）、第二リン酸アンモニウム（（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄）、第一リン酸アンモニウム（（ＮＨ₄）Ｈ₂ＰＯ₄）が含まれる。

【0020】

ＩＩＩ． 方法
第１の態様において本発明は、リラグルチドを精製するための方法を提供する。この方法は以下を含む：
（ａ）粗リラグルチドをハロゲン化溶媒を含む溶液に溶解すること、及び
（ｂ）前記溶液をＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムに供し、精製されたリラグルチドを画分で採取すること。

【0021】

いくつかの実施態様において、工程（ａ）のハロゲン化溶媒は、フッ素化酸、フッ素化アルコール、塩素化溶媒、及びこれらの混合物からなる群から選択される。

【0022】

いくつかの実施態様において、フッ素化アルコールは、２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、２，２，３，３－テトラフルオロ－１－プロパノール、２，２，３，３，３－ペンタフルオロ－１－プロパノール、ペンタフルオロフェノール、ノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、３，３，４，４，４－ペンタフルオロ－１－ブタノール、４，４，５，５，５－ペンタフルオロ－１－ペンタノール、２，２，３，４，４，４－ヘキサフルオロ－１－ブタノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－フェニル－２－プロパノール、及びこれらの混合物からなる群から選択される。

【0023】

いくつかの実施態様において、塩素化溶媒は、２，２，２－トリクロロエタノールである。

【0024】

いくつかの実施態様において、フッ素化酸はトリフルオロ酢酸である。

【0025】

いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、５～３５容量％のフッ素化アルコール及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、１５～２０容量％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、２０～３０容量％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及び０．１～１容量％のフッ素化酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、１５～２０容量％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）及び０．１～１容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、２０～３０容量％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及び０．１～１容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、１５～２０容量％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）及び０．１～０．３容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、２０～３０容量％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及び０．１～０．３容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、約１７容量％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）及び約０．２容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、工程（ａ）の溶液は、約２５容量％の２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）及び約０．２容量％のトリフルオロ酢酸を含む。

【0026】

いくつかの実施態様において、工程（ｂ）のＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムは、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製と、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製を含む。１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＜７で実施され、そして２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＞７で実施される。

【0027】

いくつかの実施態様において、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＜７で実施され、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＞約７で実施される。いくつかの実施態様において、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＜３で実施され、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＞約７で実施される。いくつかの実施態様において、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＜３で実施され、そして２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製はｐＨ値＞約７．５で実施される。

【0028】

いくつかの実施態様において、１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、トリフルオロ酢酸及び水を含む移動相Ａと、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含む移動相Ｂを使用する。

【0029】

いくつかの実施態様において、移動相Ａ及び移動相Ｂは、それぞれ０．１～１容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ａ及び移動相Ｂは、それぞれ０．１～０．５容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ａ及び移動相Ｂは、それぞれ０．１～０．３容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ａ及び移動相Ｂは、それぞれ約０．２容量％のトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ａは、水中の０．２容量％のトリフルオロ酢酸の溶液であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中の約０．２容量％のトリフルオロ酢酸の溶液である。

【0030】

いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、５～２５容量％から８０～１００容量％までの線形勾配で溶出される。いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、５～１５容量％から９０～１００容量％までの線形勾配で溶出される。いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、５～２５容量％から８０～１００容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ａは、水中の０．２％トリフルオロ酢酸の溶液であり、そして移動相Ｂは、アセトニトリル中の約０．２％のトリフルオロ酢酸の溶液である。いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、５～１５容量％から９０～１００容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ａは、水中の０．２％トリフルオロ酢酸の溶液であり、そして移動相Ｂは、アセトニトリル中の約０．２％トリフルオロ酢酸の溶液である。いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、約１０容量％から９５容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ａは、水中の０．２％トリフルオロ酢酸の溶液であり、そして移動相Ｂは、アセトニトリル中の約０．２％トリフルオロ酢酸の溶液である。いくつかの実施態様において、移動相Ｂは、表１の勾配に従って、約１０容量％から９５容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ａは、水中の０．２％トリフルオロ酢酸の溶液であり、そして移動相Ｂは、アセトニトリル中の約０．２％トリフルオロ酢酸の溶液である。

【0031】

いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、アンモニウム塩又はリン酸塩を含む移動相Ｃとアセトニトリルを含む移動相Ｄを使用する。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、アンモニウム塩を含む移動相Ｃとアセトニトリルを含む移動相Ｄを使用する。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、リン酸塩を含む移動相Ｃとアセトニトリルを含む移動相Ｄを使用する。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、移動相Ｃと移動相Ｄを使用し、これらのそれぞれはアンモニウム塩又はリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、移動相Ｃと移動相Ｄを使用し、これらのそれぞれはアンモニウム塩を含む。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、アンモニウム塩の水溶液を含む移動相Ｃと、アンモニウム塩及びアセトニトリルの水溶液を含む移動相Ｄを使用する。いくつかの実施態様において、２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、リン酸塩の水溶液を含む移動相Ｃと、アセトニトリルである移動相Ｄを使用する。

【0032】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、１容量％～１０容量％の量のアセトニトリルをさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、３容量％～７容量％の量のアセトニトリルをさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、約５容量％の量のアセトニトリルをさらに含む。

【0033】

いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、１０容量％～６０容量％の量のアンモニウム塩の水溶液をさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、２０容量％～６０容量％、３０％～６０容量％、４％～６０容量％、又は約５０容量％の量のアンモニウム塩の水溶液をさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、約５０容量％の量のアンモニウム塩の水溶液をさらに含む。

【0034】

いくつかの実施態様において、アンモニウム塩は、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、アンモニウム塩はギ酸アンモニウムである。

【0035】

いくつかの実施態様において、リン酸塩は、第三リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第三リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、第三リン酸アンモニウム、第二リン酸アンモニウム、第一リン酸アンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、リン酸塩は、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、第二リン酸アンモニウム、第一リン酸アンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、リン酸塩は、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、リン酸塩は、第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムとの混合物である。

【0036】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の５～５０ｍＭの濃度のアンモニウム塩又はリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の１０～４０ｍＭの濃度のアンモニウム塩又はリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の１０～３０ｍＭ、１５～２５ｍＭ、又は約２０ｍＭの濃度のアンモニウム塩又はリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の約２０ｍＭの濃度のアンモニウム塩又はリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の約２０ｍＭの濃度のアンモニウム塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭのアンモニウム塩の水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、水中の約２０ｍＭの濃度のリン酸塩を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭのリン酸塩の水溶液を含む。

【0037】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、約７．５～約９．０又は約７．５～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、約７．５～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、約７．９のｐＨ値を有する。

【0038】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、ギ酸アンモニウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭギ酸アンモニウムの水溶液を含み、かつ約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、アセトニトリル及び２０ｍＭギ酸アンモニウムの水溶液を含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、ここで前記水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。

【0039】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含み、かつ約７．９のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、アセトニトリルと、２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含み、かつ約７．９のｐＨ値を有し、ここで、第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムは１２対１の重量比を有し、そして水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。

【0040】

いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、約７．５～約９．０又は約７．５～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、約７．５～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、約８．５のｐＨ値を有する。

【0041】

いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、ギ酸アンモニウムの水溶液をさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液をさらに含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液をさらに含み、かつ約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、ここで、水溶液とアセトニトリルは５０対５０の容量比を有する。

【0042】

いくつかの実施態様において、移動相Ｄはアセトニトリルである。

【0043】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、ここで移動相Ｃ中の前記水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有し、そして移動相Ｄ中の前記水溶液とアセトニトリルは５０対５０の容量比を有する。

【0044】

いくつかの実施態様において、移動相Ｃは、アセトニトリルと、２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含み、かつ約７．９のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄはアセトニトリルであり、ここで、第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムは１２対１の重量比を有し、かつ移動相Ｃ中の前記水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。

【0045】

いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、０～１０容量％から５０～１００容量％までの線形勾配で溶出される。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、０容量％から１００容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ｃは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、ここで前記移動相Ｃ中の水溶液とアセトニトリルは、９５対５の容量比を有し、そして移動相Ｄ中の水溶液とアセトニトリルは、５０対５０の容量比を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、表２の勾配に従って、０容量％から１００容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ｃは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄは、２０ｍＭのギ酸アンモニウムの水溶液とアセトニトリルを含み、かつ約８．５のｐＨ値を有し、ここで、移動相Ｃ中の水溶液とアセトニトリルは、９５対５の容量比を有し、そして移動相Ｄ中の水溶液とアセトニトリルは、５０対５０の容量比を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、５容量％から７０容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ｃは、アセトニトリルと２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウム及び第一リン酸カリウムの水溶液を含み、かつ約７．９のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄはアセトニトリルであり、ここで第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムは１２対１の重量比を有し、そして移動相Ｃ中の水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｄは、表３の勾配に従って５容量％から７０容量％までの線形勾配で溶出され、ここで移動相Ｃは、アセトニトリルと、約２０ｍＭの濃度の第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムの水溶液を含み、かつ約７．９のｐＨ値を有し、そして移動相Ｄはアセトニトリルであり、ここで第二リン酸カリウムと第一リン酸カリウムは１２対１の重量比を有し、そして移動相Ｃ中の水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。

【0046】

いくつかの実施態様において、画分中の精製されたリラグルチドは、約７．５～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、画分中の精製されたリラグルチドは、約８．０～約８．５のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、画分中の精製されたリラグルチドは、約７．５～約８．０のｐＨ値を有する。

【0047】

１回目及び２回目の精製の流速は、ＲＰ－ＨＰＬＣ調製カラムのサイズに依存する。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが５ｃｍ×２２ｃｍ～８ｃｍｘ１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約５０～２００ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが５ｃｍ×２２ｃｍ～８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約１００～１６０ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが５ｃｍ×２２ｃｍの直径と長さを有する場合、約１０４ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約１５２ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが１０ｍｍ×２５０ｍｍの直径と長さを有する場合、４～８ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが１０ｍｍ×２５０ｍｍの直径と長さを有する場合、約４．７ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、２回目の精製の流速は、カラムが５ｃｍ×２２ｃｍ～８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約５０～２００ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、２回目の精製の流速は、カラムが５ｃｍ×２２ｃｍ～８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約１００～１６０ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、２回目の精製の流速は、カラムが８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有する場合、約１５２ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、２回目の精製の流速は、カラムが４．６ｍｍ×１００ｍｍの直径と長さを有する場合、約０．３～０．５ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、２回目の精製の流速は、カラムが４．６ｍｍ×１００ｍｍの直径と長さを有する場合、約０．４ｍＬ／分である。

【0048】

いくつかの実施態様において、工程（ａ）の粗リラグルチドは、固相合成により得られる。

【0049】

いくつかの実施態様において、さらに以下が含まれる：
（ｃ）工程（ｂ）の画分を、ナトリウム塩、水、及びアセトニトリルを含む移動相Ｅを使用する３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、そして画分を集めて塩交換リラグルチドを得る。

【0050】

いくつかの実施態様において、ナトリウム塩は第二リン酸ナトリウムである。

【0051】

いくつかの実施態様において、移動相Ｅは、第二リン酸ナトリウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｅは、２０ｍＭの濃度の第二リン酸ナトリウムの水溶液を含む。いくつかの実施態様において、移動相Ｅは、２０ｍＭの濃度の第二リン酸ナトリウムの水溶液を含み、かつ約８．０のｐＨ値を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｅ（Ｅ１として）は、アセトニトリルと、２０ｍＭの濃度の第二リン酸ナトリウムの水溶液を含み、かつ約８．０のｐＨ値を有し、ここで前記水溶液とアセトニトリルは９５対５の容量比を有する。いくつかの実施態様において、移動相Ｅ（Ｅ２として）は、アセトニトリルと、２０ｍＭの濃度の第二リン酸ナトリウムの水溶液を含み、かつ約８．０のｐＨ値を有し、ここで、前記水溶液とアセトニトリルは５０対５０の容量比を有する。

【0052】

いくつかの実施態様において、工程（ｃ）は、移動相Ｅ１を適用し、続いて移動相Ｅ２を適用することによって実施され、それにより、塩交換リラグルチドが画分で提供される。

【0053】

３回目の精製の流速は、ＲＰ－ＨＰＬＣ調製カラムのサイズに依存する。いくつかの実施態様において、３回目の精製の流速は、カラムが１０ｍｍ×２５０ｍｍの直径と長さを有する場合、４～８ｍＬ／分である。いくつかの実施態様において、１回目の精製の流速は、カラムが１０ｍｍ×２５ｃｍの直径と長さを有する場合、約４．７ｍＬ／分である。

【0054】

いくつかの実施態様において、画分中の塩交換リラグルチドは、約７．５～約８．０のｐＨ値を有する。

【0055】

いくつかの実施態様において、１回目、２回目、及び３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、同じ固定相を有する。

【0056】

第２の態様において、本出願は、リラグルチドを精製するための方法を提供する。この方法は以下を含む：
（ａ）粗リラグルチドをハロゲン化溶媒を含む溶液に溶解すること、及び
（ｂ）前記溶液をＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムに供し、精製されたリラグルチド画分を採取することであり、ここで、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製システムは１回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製と２回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製とを含む、及び
（ｃ）工程（ｂ）の画分を、ナトリウム塩、水、及びアセトニトリルを含む移動相Ｅを使用して３回目のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に供し、そして画分を集めて塩交換リラグルチドを得ること。

【0057】

第２の態様の工程ａ）～（ｃ）の適切な条件は、第１の態様で定義及び説明されたものと同じである。

【0058】

ＩＶ． 実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、決して本発明を限定するものではない。

【0059】

実施例１：
試料の前処理：
粗リラグルチドは、固相合成により４４．６％の純度で得られた。３０ｇの粗リラグルチドを５００ｍＬのトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液（０．２％トリフルオロ酢酸中２５％ＴＦＥ）に溶解した。次に、混合物を室温（ＲＴ）で約２時間撹拌した。

【0060】

１回目の精製：

【0061】

得られた溶液を、８ｃｍ×１２．６ｃｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカを充填したＲＰ－ＨＰＬＣ分取カラムにロードした。ローディング量は２７．１ｇであった。

【0062】

以下の条件で精製サイクルを実施した：
（１）移動相Ａ：水中の０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、
（２）移動相Ｂ：アセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．２％ＴＦＡ、
（３）流速：１５２ｍＬ／分、及び
（４）表１の溶出勾配：

【化4】

【0063】

純度９０．５８％のリラグルチドを含む画分が得られ、２回目の精製に移された。

【0064】

２回目の精製：

【0065】

純度９０．５８％のリラグルチドを含む画分を、３３％アンモニウムでｐＨ値８．５に調整し、ｐＨ値８．５の２０ｍＭギ酸アンモニウムで希釈し、次に、８ｃｍｘ１２．６ｃｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカを充填したＲＰ－ＨＰＬＣカラムにロードした。ローディング量は６．２ｇであった。

【0066】

以下の条件で精製サイクルを実施した：
（１）移動相Ｃ：ｐＨ値８．５に調整し、ＡＣＮで９５／５（Ｖ／Ｖ）の比率に希釈した２０ｍＭギ酸アンモニウム（ＡｍＦ）、
（２）移動相Ｄ：ｐＨ値８．５に調整し、ＡＣＮで５０／５０（Ｖ／Ｖ）の比率に希釈した２０ｍＭギ酸アンモニウム（ＡｍＦ）、
（３）流速：１５２ｍＬ／分；及び
（４）表２の溶出勾配：

【化5】

【0067】

純度９８．４８％でｐＨ値が約８．０～８．５のリラグルチドを含む画分が得られ、３回目の精製（塩交換）に移された。

【0068】

３回目の精製（塩交換）：

【0069】

純度９８．４８％のリラグルチドを含む画分を、１０ｍｍ×２５０ｍｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカを充填したＲＰ－ＨＰＬＣカラムに、４．７ｍＬ／分の流速でロードした。ローディング量は１．１ｇであった。ローディング後、カラムを５％アセトニトリルを含む２０ｍＭ第二リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝８．０）でフラッシュし、次に５０％アセトトリルを含む２０ｍＭ第二リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝８．０）で溶出した。このようにして、約７．５～８．０のｐＨ値を有する塩交換リラグルチドが得られ、次に凍結乾燥され、純度９８．４８％の３．３ｇのリラグルチド濃縮物が得られた。

【0070】

実施例２：
試料の前処理：

【0071】

粗リラグルチドは、固相合成により３３．８％の純度で得られた。１９．５グラムの粗リラグルチドを２３８ｍＬのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶液（０．２％ＴＦＡ溶液中の１７％ＨＦＩＰ）に溶解した。次に、混合物を室温（ＲＴ）で約２時間撹拌した。

【0072】

１回目の精製：

【0073】

得られた溶液を、５ｃｍ×２２ｃｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカが充填されたＲＰ－ＨＰＬＣ分取カラムにロードした。ローディング量は１９．５ｇであった。

【0074】

以下の条件で精製サイクルを実施した：
（１）移動相Ａ：水中の０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、
（２）移動相Ｂ：アセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．２％ＴＦＡ、
（３）流速：１０４ｍＬ／分、及び
（４）表１の溶出勾配：

【化6】

【0075】

純度８９．６５％のリラグルチドを含む画分が得られ、２回目の精製に移された。ローディング量は４．３ｇであった。

【0076】

２回目の精製と３回目の精製（塩交換）：

【0077】

次に、純度８９．６５％のリラグルチドを含む画分を、実施例１と同じ精製条件及び方法を有する２回目の精製と３回目の精製（塩交換）に供した。こうして、約７．５～８．０のｐＨ値を有する塩交換リラグルチドが得られ、次に凍結乾燥されて、純度９７．２３％の３．７ｇのリラグルチド濃縮物が得られた。

【0078】

実施例３：
試料の前処理：

【0079】

粗リラグルチドは、固相合成により３３．８％の純度で得られた。９９０．３ミリグラムの粗リラグルチドを１１．２２ｍＬのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶液（０．２％ＴＦＡ溶液中の１７％ＨＦＩＰ）に溶解した。次に、混合物を室温（ＲＴ）で約２時間撹拌した。

【0080】

１回目の精製：

【0081】

得られた溶液を、１０ｍｍ×２５ｃｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカが充填されたＲＰ－ＨＰＬＣ分取カラムにロードした。ローディング量は０．９９ｇであった。

【0082】

以下の条件で精製サイクルを実施した。
（１）移動相Ａ：水中の０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、
（２）移動相Ｂ：アセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．２％ＴＦＡ、
（３）流速：４．７ｍＬ／分、及び
（４）表１の溶出勾配：

【化7】

【0083】

純度９２．１７％のリラグルチドを含む画分が得られ、２回目の精製に移された。ローディング量は４１．１ミリグラムであった。

【0084】

２回目の精製：

【0085】

純度９２．１７％のリラグルチドを含む画分を移動相Ｃで希釈し、次に、４．６ｍｍ×１００ｍｍの直径と長さを有するＣ８、１０μｍシリカを充填したＲＰ－ＨＰＬＣカラムにロードした。

【0086】

以下の条件で精製サイクルを実施した：
（１）移動相Ｃ：２０ｍＭ第二リン酸カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）／第二リン酸カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）＝１２／１であり、ｐＨ値７．９に調整し、ＡＣＮで９５／５（Ｖ／Ｖ）の比率に希釈された、
（２）移動相Ｄ：ＡＣＮ、
（３）流速：０．４ｍＬ／分、及び
（４）表３の溶出勾配：

【化8】

【0087】

純度９７％及び約７．５～８．０のｐＨ値を有するリラグルチドを含む画分が得られ、３回目の精製（塩交換）に移された。

【0088】

３回目の精製（塩交換）：

【0089】

３回目の精製（塩交換）は、実施例１と同じ精製条件及び方法を有する。こうして、約７．５～８．０のｐＨ値を有する塩交換リラグルチドが得られ、次に凍結乾燥された。

【0090】

前述の発明は、理解を明確にする目的で例示及び例として、ある程度詳細に説明されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び修正が実施され得ることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合、本出願が優勢するものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2022528057000001.app

【国際調査報告】