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特表2022-528151蛍光タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-08
(54)【発明の名称】蛍光タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220601BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220601BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220601BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220601BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220601BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220601BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220601BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220601BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220601BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20220601BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C07K19/00
C07K14/62
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559462
(86)(22)【出願日】2020-03-18
(85)【翻訳文提出日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 CN2020080036
(87)【国際公開番号】W WO2020187270
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】201910210102.9
(32)【優先日】2019-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521437770
【氏名又は名称】ニンポー クンペン バイオテック カンパニー，リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＩＮＧＢＯ ＫＵＮＰＥＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２８ Ｘｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ，ＺｈｏｎｇｙｉＮｉｎｇｂｏ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｋ，Ｙｕｙａｏ，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１５４００，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ソン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ゼンシャン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，フイリン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ウェイ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA37
4H045EA27
4H045FA74
4H045GA25
(57)【要約】
蛍光タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質およびその用途を提供する。本発明の融合タンパク質は、（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔに示される構造を有し、ここで、（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、融合標的ペプチドのフォールディングおよび発現を促進することができ、融合タンパク質の溶解性を向上させ、かつ融合タンパク質の分子間相互作用を減少させることができる。融合タンパク質中の（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、酵素によって標的ペプチドよりも長さがはるかに短い複数の短いペプチドに切断されることができ、標的ペプチドからの分離が容易になり、標的ペプチドの精製がより便利になる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、式Ｉに示される構造を含み、
（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔ（Ｉ）
式において、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
各Ｐ１は、それぞれ独立して、第１の標的ペプチドであり、
各Ｐ２は、それぞれ独立して、第２の標的ペプチドであり、
各Ｌ１は、それぞれ独立して、なしまたは第１の接続ペプチドであり、
各Ｌ２は、それぞれ独立して、なしまたは第２の接続ペプチドであり、
Ａ１は、なしまたはシグナルペプチドであり、
Ａ２は、なしまたはシグナルペプチドであり、
各Ｘは、独立して、蛍光タンパク質の単一のβ－フォールディングユニットであり、
ｎは、１～８の正の整数であり、
ｓは、０、１、または２であり、
ｔは、０、１、または２であり、および
追加の条件は、ｓとｔとが同時に０ではないことを特徴とする、前記融合タンパク質。
【請求項2】
第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドは、非天然アミノ酸を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記β－フォールディングユニットは、蛍光タンパク質のβ－フォールディングユニットｕ１、ｕ２、ｕ３、ｕ４、ｕ５、ｕ６、ｕ７、ｕ８、ｕ９、ｕ１０およびｕ１１からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９または３０に示されるようなアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記任意の二つのβ－フォールディングユニットの間には、可撓性リンカーＩがあり、かつ前記可撓性リンカーＩには、第３の制限酵素切断部位が含まれることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
単離されたオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、請求項１に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする、前記単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
ベクターであって、前記ベクターは、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記ベクター。
【請求項8】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項７に記載のベクターを含むか、または染色体に請求項６に記載の外因性オリゴヌクレオチドが統合されるか、または請求項１に記載の融合タンパク質を発現することを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項9】
タンパク質を調製する方法であって、前記方法は、
請求項８に記載の宿主細胞を培養することにより、請求項１に記載の融合タンパク質を得る段階（ａ）を含むことを特徴とする、前記タンパク質を調製する方法。
【請求項10】
請求項１に記載の融合タンパク質、または請求項６に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項７に記載のベクター、または請求項８に記載の宿主細胞の使用であって、前記融合タンパク質は、標的ポリペプチドの発現および調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術の分野に関し、具体的には、蛍光タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチドは、生体分子の一種であり、多くの生物医学研究分野で試薬、疾病の治療における治療薬として、病原菌の検出における診断剤およびバイオマーカーとして広く使用される。ペプチドを合成する方法は、通常二つがあり、一つは、化学合成であり、もう一つは、組換え発現である。化学合成は、コルチレリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）とその誘導体であるエクセナチドおよびリラグルチド、エンフビルチド、カルシトニン、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、ジコノチド、セルモレリン、ソマトレリン（ｓｏｍａｔｏｒｅｌｉｎ）、セクレチン、テデュグルチドならびにインスリンを含む、様々な治療性ペプチドを調製するために使用されてきた。当該方法は、ペプチドを形成するためにアミノ酸フラグメントの多段階の縮合が必要であり、同時に面倒な保護、脱保護および精製等の段階も必要である。これまでのところ、５０アミノ酸残基未満のほとんどの市販ペプチドは、このような方法で製造される。製薬業界や生物医学研究におけるペプチドの需要が増加し続けるにつれて、化学合成用のアミノ酸フラグメントの価格も上昇し続けている。従って、ＧＬＰ－１類似体等の日常で使用される治療性ペプチド薬物は、将来的に手頃な価格を維持することは困難である。５０アミノ酸残基未満のペプチドを化学的に合成することは、技術的には可能であるが、より低い収量および合成プロセスに生成される大量の有機廃棄物は、非常に不経済である。現在、５０アミノ酸残基を超えるほとんどのペプチドは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等の細胞宿主で組換え発現される。長年にわたり、融合タンパク質を使用してポリペプチドを発現させる方法は、ずっとより一般的な方法である。しかし、ペプチド発現に使用される現在利用可能な融合タンパク質法は、特に５０アミノ酸残基未満のペプチドを生成する方法について、多くの技術的問題が存在する。例えば、従来技術の融合タンパク質では、分子量が大きく、疎水性が強く、分離が難しく、標的タンパク質の比重が低く、融合比が低く、構造が安定し、切断が困難であり、サンプルイオンカラム、疎水性カラムデッドボリュームが多い。
【0003】
従って、既存の融合タンパク質の限界を克服すると同時に、ＢＯＣ－リジンタンパク質等の非天然アミノ酸タンパク質の収量を増加させる等、挿入された非天然アミノ酸タンパク質の収量を増加させることができる、標的ペプチドを発現させるための新しい融合タンパク質を開発することが非常に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、ＢＯＣ－リジンタンパク質等の非天然アミノ酸タンパク質の収量を増加させるような、挿入された非天然アミノ酸タンパク質の収量を増加させることができる、標的ペプチドを発現させるための新しい融合タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の第１の態様は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、式Ｉに示される構造を含み、
（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔ（Ｉ）
式において、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
各Ｐ１は、それぞれ独立して、第１の標的ペプチドであり、
各Ｐ２は、それぞれ独立して、第２の標的ペプチドであり、
各Ｌ１は、それぞれ独立して、なしまたは第１の接続ペプチドであり、
各Ｌ２は、それぞれ独立して、なしまたは第２の接続ペプチドであり、
Ａ１は、なしまたはシグナルペプチドであり、
Ａ２は、なしまたはシグナルペプチドであり、
各Ｘは、独立して、蛍光タンパク質の単一のβ－フォールディングユニットであり、
ｎは、１～８の正の整数であり、
ｓは、０、１、または２であり、
ｔは、０、１、または２であり、および
追加の条件は、ｓとｔとが同時に０ではない。
（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔ（Ｉ）
式において、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
各Ｐ１は、それぞれ独立して、第１の標的ペプチドであり、
各Ｐ２は、それぞれ独立して、第２の標的ペプチドであり、
各Ｌ１は、それぞれ独立して、なしまたは第１の接続ペプチドであり、
各Ｌ２は、それぞれ独立して、なしまたは第２の接続ペプチドであり、
Ａ１は、なしまたはシグナルペプチドであり、
Ａ２は、なしまたはシグナルペプチドであり、
各Ｘは、独立して、蛍光タンパク質の単一のβ－フォールディングユニットであり、
ｎは、１～８の正の整数であり、
ｓは、０、１、または２であり、
ｔは、０、１、または２であり、および
追加の条件は、ｓとｔとが同時に０ではない。
【0006】
別の好ましい例において、ｓは、０であり、ｔは、１である。
別の好ましい例において、ｓは、１であり、ｔは、０である。
別の好ましい例において、前記ｎは、１～６であり、好ましくは、ｎは、２～４である。
別の好ましい例において、前記Ａ１は、シグナルペプチドであり、Ａ２は、なしである。
別の好ましい例において、ｓは、１であり、ｔは、０である。
別の好ましい例において、前記ｎは、１～６であり、好ましくは、ｎは、２～４である。
別の好ましい例において、前記Ａ１は、シグナルペプチドであり、Ａ２は、なしである。
【0007】
別の好ましい例において、前記β－フォールディングユニットは、蛍光タンパク質のβ－フォールディングユニットｕ１、ｕ２、ｕ３、ｕ４、ｕ５、ｕ６、ｕ７、ｕ８、ｕ９、ｕ１０およびｕ１１からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記各Ｘの長さは、１０～１４ａａである。
別の好ましい例において、各Ｘは、異なる。
別の好ましい例において、前記各Ｘの長さは、１０～１４ａａである。
別の好ましい例において、各Ｘは、異なる。
【0008】
別の好ましい例において、各Ｘは、同じである。
別の好ましい例において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質遺伝子（ＣＦＰ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
別の好ましい例において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質遺伝子（ＣＦＰ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【0009】
別の好ましい例において、前記ＧＦＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記任意の二つのβ－フォールディングユニットの間には、可撓性リンカーＩを有するか、または有さない。
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、タンパク質発現促進要素として機能する。
別の好ましい例において、前記任意の二つのβ－フォールディングユニットの間には、可撓性リンカーＩを有するか、または有さない。
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、タンパク質発現促進要素として機能する。
【0010】
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎの全長Ｌｎは、蛍光タンパク質の全長Ｌ０の３．７～３０％、好ましくは７．５～２０．５％、より好ましくは７．５～１５．５％である。
別の好ましい例において、前記Ｘは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：ｊに示されるアミノ酸配列を有するｕｊからなる群から選択され、
ここで、ｊは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１である。
別の好ましい例において、前記Ｘは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：ｊに示されるアミノ酸配列を有するｕｊからなる群から選択され、
ここで、ｊは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１である。
【0011】
別の好ましい例において、前記Ｘは、次のグループからなる群から選択される。
【表1】
【0012】
別の好ましい例において、前記Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１１に示されるような配列のいずれかにおけるＲ、Ｋ、Ｈの相互置換によって生成されるアミノ酸配列をさらに含み、および／または
前記Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１１に示されるような配列のいずれかにおけるＰ、Ｑの相互置換によって形成されるアミノ酸配列をさらにふくみ、および／または
前記Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１１に示されるような配列のいずれかにおけるＴ、Ｓの相互置換によって形成されるアミノ酸配列をさらに含む。
前記Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１１に示されるような配列のいずれかにおけるＰ、Ｑの相互置換によって形成されるアミノ酸配列をさらにふくみ、および／または
前記Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～１１に示されるような配列のいずれかにおけるＴ、Ｓの相互置換によって形成されるアミノ酸配列をさらに含む。
【0013】
別の好ましい例において、前記Ｘは、
（Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（Ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列と≧８０％の相同性（好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、最も好ましくは≧９７％の相同性）を有し、かつ前記特性を保持するポリペプチド、および
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列に１～５アミノ酸残基を置換、欠失または付加することにより形成され、かつ前記特性を保持する誘導ポリペプチドからなる群から選択される。
（Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（Ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列と≧８０％の相同性（好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、最も好ましくは≧９７％の相同性）を有し、かつ前記特性を保持するポリペプチド、および
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列に１～５アミノ酸残基を置換、欠失または付加することにより形成され、かつ前記特性を保持する誘導ポリペプチドからなる群から選択される。
【0014】
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、ｕ８、ｕ９、ｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ８－ｕ９、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ５－ｕ６－ｕ７、ｕ８－ｕ９－ｕ１０、ｕ９－ｕ１０－ｕ１１、ｕ３－ｕ５－ｕ７、ｕ３－ｕ４－ｕ６、ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ６－ｕ８－ｕ１０、ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ２－ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ３－ｕ４－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ５－ｕ７－ｕ９、ｕ５－ｕ６－ｕ７－ｕ８、ｕ１－ｕ３－ｕ７－ｕ９、ｕ２－ｕ２－ｕ７－ｕ８、ｕ７－ｕ２－ｕ５－ｕ１１、ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ１－Ｉ－ｕ２、ｕ１－Ｉ－ｕ５、ｕ２－Ｉ－ｕ４、ｕ３－Ｉ－ｕ８、ｕ５－Ｉ－ｕ６、またはｕ１０－Ｉ－ｕ１１である。
【0015】
別の好ましい例において、前記Ａ１またはＡ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２（ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶ）に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９または３０に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９または３０に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0016】
別の好ましい例において、第１の接続ペプチドは、第１の制限酵素切断部位（例えば、ＴＥＶ制限酵素切断部位）を含む。
別の好ましい例において、第２の接続ペプチドは、第２の制限酵素切断部位を含む。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、第３の制限酵素切断部位を含む。
別の好ましい例において、第２の接続ペプチドは、第２の制限酵素切断部位を含む。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、第３の制限酵素切断部位を含む。
【0017】
別の好ましい例において、前記第３の制限酵素切断部位は、ＥＫ酵素制限酵素切断部位（配列ＤＤＤＤＫに示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２５）である。
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、ｕ１－ＥＫ－ｕ２、ｕ１－ＥＫ－ｕ５、ｕ２－ＥＫ－ｕ４、ｕ３－ＥＫ－ｕ８、ｕ５－ＥＫ－ｕ６、またはｕ１０－ＥＫ－ｕ１１であり、ここで、ＥＫは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位である。
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、ｕ１－ＥＫ－ｕ２、ｕ１－ＥＫ－ｕ５、ｕ２－ＥＫ－ｕ４、ｕ３－ＥＫ－ｕ８、ｕ５－ＥＫ－ｕ６、またはｕ１０－ＥＫ－ｕ１１であり、ここで、ＥＫは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位である。
【0018】
別の好ましい例において、前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位は、互いに異なる。
別の好ましい例において、前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位のうちの二つまたは三つは、同じである。
別の好ましい例において、Ｐ１およびＰ２のそれぞれに前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位は存在しない。
別の好ましい例において、前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位のうちの二つまたは三つは、同じである。
別の好ましい例において、Ｐ１およびＰ２のそれぞれに前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位は存在しない。
【0019】
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、第１、第２および第３の制限酵素切断部位とは異なる制限酵素切断部位をさらに含む。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、トリプシン制限酵素切断部位を含み、好ましくは、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、少なくとも一つのアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）を含む。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、トリプシン制限酵素切断部位を含み、好ましくは、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、少なくとも一つのアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）を含む。
【0020】
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドのＮ末端のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＬｙｓである。
別の好ましい例において、前記第２の接続ペプチドのＣ末端のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＬｙｓである。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、タバコエッチウイルスプロテアーゼ識別配列を含む。
別の好ましい例において、前記第２の接続ペプチドのＣ末端のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＬｙｓである。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、タバコエッチウイルスプロテアーゼ識別配列を含む。
【0021】
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、発現および／または精製を支援するタグ配列をさらに含む。
別の好ましい例において、前記タグ配列は、ヒスチジンタグ、好ましくは６×ＨＩＳタグである。
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、発現および／または精製を支援するタグ配列をさらに含む。
別の好ましい例において、前記タグ配列は、ヒスチジンタグ、好ましくは６×ＨＩＳタグである。
【0022】
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、ヒトインスリン前駆体タンパク質、インスリンリスプロの前駆体タンパク質、インスリングラルギンの前駆体タンパク質、副甲状腺ホルモン、コルチレリン、カルシトニン、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、グルカゴン様ペプチドとその誘導体であるエクセナチドおよびリラグルチド、ジコノチド、セルモレリン、ソマトレリン（ｓｏｍａｔｏｒｅｌｉｎ）、セクレチン、テデュグルチド、ヒルジン、成長ホルモン、成長因子、成長ホルモン放出因子、コルチコトロピン、放出因子、デセレリン、デスモプレシン、カルシトニン、グルカゴン、ロイプロリド、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、トリプトレリン、血管作用性腸ペプチド、インターフェロン、副甲状腺ホルモン、ＢＨ３ペプチド、アミロイドペプチド、または上記各ペプチドのフラグメント、またはその組み合わせから選択され、好ましくは、上記ポリペプチドであるが、これらに限定されない。
【0023】
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、非天然アミノ酸を含むタンパク質である。
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、長さが１０～２００個のアミノ酸の配列、好ましくは、長さが１０～８０個のアミノ酸の配列を有する。
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、プロインスリンまたはインスリンであり、好ましくはヒトプロインスリンまたはヒトインスリンである。
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、長さが１０～２００個のアミノ酸の配列、好ましくは、長さが１０～８０個のアミノ酸の配列を有する。
別の好ましい例において、前記Ｐ１およびＰ２は、それぞれ独立して、プロインスリンまたはインスリンであり、好ましくはヒトプロインスリンまたはヒトインスリンである。
【0024】
別の好ましい例において、前記インスリンは、長時間作用型または速効型インスリンを含む。
別の好ましい例において、前記プロインスリン２９位のリジンは、アルキニルオキシカルボニルリジン誘導体、ＢＯＣ－リジン（tert―ブトキシカルボニル－Ｌ－リジン）誘導体、脂肪アシル化リジン、またはその組み合わせである。
別の好ましい例において、前記プロインスリン２９位のリジンは、アルキニルオキシカルボニルリジン誘導体、ＢＯＣ－リジン（tert―ブトキシカルボニル－Ｌ－リジン）誘導体、脂肪アシル化リジン、またはその組み合わせである。
【0025】
別の好ましい例において、前記プロインスリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９または２０に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記標的ペプチドＰ２は、前記（Ｘ）ｎのＣ末端に位置（または接続）する。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、消化された後、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドを形成する。
別の好ましい例において、前記標的ペプチドＰ２は、前記（Ｘ）ｎのＣ末端に位置（または接続）する。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、消化された後、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドを形成する。
【0026】
別の好ましい例において、前記第１の標的ペプチドおよび第２の標的ペプチドは、同じであるか、または異なる。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、消化された後、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドを形成し、前記（Ｘ）ｎは、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドの長さＬｐよりもはるかに短い長さＬｘを有する短いペプチドに切断される。
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、消化された後、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドを形成し、前記（Ｘ）ｎは、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドの長さＬｐよりもはるかに短い長さＬｘを有する短いペプチドに切断される。
【0027】
別の好ましい例において、前記各Ｌｘは、１～２５個のアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記長さＬｘと長さＬｐとの比は、１／２～１／１０、好ましくは１／３～１／８である。
別の好ましい例において、前記長さＬｐと長さＬｘとの差は１．３ＫＤより大きい。
別の好ましい例において、前記長さＬｘと長さＬｐとの比は、１／２～１／１０、好ましくは１／３～１／８である。
別の好ましい例において、前記長さＬｐと長さＬｘとの差は１．３ＫＤより大きい。
【0028】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、Ａ１－ｕ８－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ９－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ２－ｕ３－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ４－ｕ５－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ８－ｕ９－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ６－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ４－ｕ７－ｕ１０－Ｌ２－Ｐ２、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０－Ｌ２－Ｐ２、またはＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－Ｌ２－Ｐ２からなる群から選択される構造を有する。
【0029】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0030】
本発明の第２の態様は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質をコードする。
【0031】
本発明の第３の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ベクターは、プラスミドであり、好ましくは、前記ベクターは、ｐＢＡＤ－ＨｉｓＡベクターおよび／またはｐＥｖｏｌ－ｐＢｐＦベクターである。
別の好ましい例において、前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ベクターは、プラスミドであり、好ましくは、前記ベクターは、ｐＢＡＤ－ＨｉｓＡベクターおよび／またはｐＥｖｏｌ－ｐＢｐＦベクターである。
【0032】
本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第３の態様に記載のベクターを含むか、または染色体に本発明の第２の態様に記載の外因性ポリヌクレオチドが統合されるか、または本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質を発現する。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞またはその組み合わせである。
別の好ましい例において、前記宿主細胞のいずれも、前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位に対応するプロテアーゼを含まない。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞またはその組み合わせである。
別の好ましい例において、前記宿主細胞のいずれも、前記第１、第２および第３の制限酵素切断部位に対応するプロテアーゼを含まない。
【0033】
本発明の第５の態様は、タンパク質を調製する方法を提供し、前記方法は、
本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質を得る段階（ａ）を含む。
別の好ましい例において、前記方法は、段階（ａ）で得られた融合タンパク質を精製する段階（ｂ）をさらに含む。
本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質を得る段階（ａ）を含む。
別の好ましい例において、前記方法は、段階（ａ）で得られた融合タンパク質を精製する段階（ｂ）をさらに含む。
【0034】
別の好ましい例において、前記方法は、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質をタンパク質分解消化して、前記融合タンパク質から前記標的ペプチドを放出する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記段階（ｃ）において、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質をプロテアーゼで消化して、消化された生成物を得、および任意選択で
（ｄ）消化生成物から前記標的ペプチドを分離または精製する。
別の好ましい例において、前記精製は、ゲルろ過またはＨＰＬＣによる前記標的ペプチドのさらなる精製を含む。
別の好ましい例において、前記段階（ｃ）において、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質をプロテアーゼで消化して、消化された生成物を得、および任意選択で
（ｄ）消化生成物から前記標的ペプチドを分離または精製する。
別の好ましい例において、前記精製は、ゲルろ過またはＨＰＬＣによる前記標的ペプチドのさらなる精製を含む。
【0035】
本発明の第６の態様は、前記融合タンパク質が標的ペプチドの発現および調製に使用される、本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質、または本発明の第２の態様に記載のポリヌクレオチド、または本発明の第３の態様に記載のベクター、または本発明の第４の態様に記載の宿主細胞の用途を提供する。
【発明の効果】
【0036】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】ジスルフィド結合を正しく形成する成熟インスリンの構造を示す。
【図2】組換えヒトインスリン融合タンパク質発現プラスミドマップを示す。
【図3】組換えヒトインスリン融合タンパク質の模式図を示す。
【図4】ＢＯＣ－リジン構造を示す。
【0038】
【図5】組換え融合タンパク質の発現を示す。レーン１は、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現であり、分子量は、１１．２ｋＤであり、レーン２は、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１融合タンパク質の発現であり、分子量は、８．７ｋＤであり、レーン３は、Ａ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現であり、分子量は、１０．０ｋＤであり、レーン４は、Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現であり、分子量は、１２．２ｋＤであり、レーン５は、Ａ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現であり、分子量は、１２．０ｋＤであり、Ｍは、タンパク質の分子量標準である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の後、標的ペプチドの発現に適した新しい融合タンパク質を初めて得た。本発明の融合タンパク質中の（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、融合標的ペプチドのフォールディングおよび発現を促進することができ、融合タンパク質の収率および溶解性を向上させ、かつ融合タンパク質の分子間相互作用を減少させることにより、融合標的ペプチドを商業的意義を有する高濃度下でフォールディングすることができる。また、前記融合タンパク質中の（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、標的ペプチドの長さよりもはるかに短い長さの複数の短いペプチドに切断することができ、標的ペプチドからの分離をより助長するため、標的ペプチドの精製は、より便利である。これに基づいて、本発明者らは、本発明を完成させた。
【0040】
用語
本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的な方法および実験条件に限定されないことを理解されたく、そのような方法および条件は、変化し得るからである。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明することのみを意図し、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的な方法および実験条件に限定されないことを理解されたく、そのような方法および条件は、変化し得るからである。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明することのみを意図し、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【0041】
別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用されるように、具体的に記載された数値に関して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化できないことを意味する。例えば、本明細書で使用されるように、「約１００」という用語は、９９～１０１の間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
本明細書で使用されるように、具体的に記載された数値に関して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化できないことを意味する。例えば、本明細書で使用されるように、「約１００」という用語は、９９～１０１の間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【0042】
本明細書で使用されるように、「含有」または「包括（含む）」という用語は、開放式、半閉鎖式および閉鎖式であり得る。言い換えれば、前記用語も、「基本的にからなる」、または「からなる」を含む。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されるとおりである。
本明細書で使用されるように、「任意選択」または「任意選択で」という用語は、後述する事件または状況が発生する可能性があるが、発生する必要はないことを意味する。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されるとおりである。
本明細書で使用されるように、「任意選択」または「任意選択で」という用語は、後述する事件または状況が発生する可能性があるが、発生する必要はないことを意味する。
【0043】
本発明に記載の「配列同一性」は、適切な交換、挿入または欠失等の突然変異を有する状況下で最適と比較される場合の二つの核酸または二つのアミノ酸配列の間の同一性程度を指す。本発明中に記載の配列とその同一性を有する配列の間の配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な実施例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％を含む。
【0044】
融合タンパク質
本明細書で使用されるように、「本発明の融合タンパク質」、「組換え融合タンパク質」または「ポリペプチド」は、すべて本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質を指す。
具体的には、本発明の前記融合タンパク質は、式Ｉに示される構造を含み、
（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔ（Ｉ）
式において、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
各Ｐ１は、それぞれ独立して、第１の標的ペプチドであり、
各Ｐ２は、それぞれ独立して、第２の標的ペプチドであり、
各Ｌ１は、それぞれ独立して、なしまたは第１の接続ペプチドであり、
各Ｌ２は、それぞれ独立して、なしまたは第２の接続ペプチドであり、
Ａ１は、なしまたはシグナルペプチドであり、
Ａ２は、なしまたはシグナルペプチドであり、
各Ｘは、独立して、蛍光タンパク質の単一のβ－フォールディングユニットであり、
ｎは、１～８の正の整数であり、
ｓは、０、１、または２であり、
ｔは、０、１、または２であり、および
追加の条件は、ｓとｔとが同時に０ではない。
本明細書で使用されるように、「本発明の融合タンパク質」、「組換え融合タンパク質」または「ポリペプチド」は、すべて本発明の第１の態様に記載の融合タンパク質を指す。
具体的には、本発明の前記融合タンパク質は、式Ｉに示される構造を含み、
（Ｐ１－Ｌ１）ｓ－Ａ１－（Ｘ）ｎ－Ａ２－（Ｌ２－Ｐ２）ｔ（Ｉ）
式において、
「－」は、ペプチド結合または接続ペプチドであり、
各Ｐ１は、それぞれ独立して、第１の標的ペプチドであり、
各Ｐ２は、それぞれ独立して、第２の標的ペプチドであり、
各Ｌ１は、それぞれ独立して、なしまたは第１の接続ペプチドであり、
各Ｌ２は、それぞれ独立して、なしまたは第２の接続ペプチドであり、
Ａ１は、なしまたはシグナルペプチドであり、
Ａ２は、なしまたはシグナルペプチドであり、
各Ｘは、独立して、蛍光タンパク質の単一のβ－フォールディングユニットであり、
ｎは、１～８の正の整数であり、
ｓは、０、１、または２であり、
ｔは、０、１、または２であり、および
追加の条件は、ｓとｔとが同時に０ではない。
【0045】
別の好ましい例において、前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰであり、好ましくは、前記ＧＦＰのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるようなアミノ酸配列（２４１個のＡＡ）を有する。
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＡＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＡＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３）
【0046】
ここで、上記配列において、下線が引かれた部分は、順次に蛍光タンパク質のβ－フォールディングユニットｕ１、ｕ２、ｕ３、ｕ４、ｕ５、ｕ６、ｕ７、ｕ８、ｕ９、ｕ１０およびｕ１１である。
【0047】
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎは、ｕ８、ｕ９、ｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ８－ｕ９、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ５－ｕ６－ｕ７、ｕ８－ｕ９－ｕ１０、ｕ９－ｕ１０－ｕ１１、ｕ３－ｕ５－ｕ７、ｕ３－ｕ４－ｕ６、ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ６－ｕ８－ｕ１０、ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ２－ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ３－ｕ４－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ５－ｕ７－ｕ９、ｕ５－ｕ６－ｕ７－ｕ８、ｕ１－ｕ３－ｕ７－ｕ９、ｕ２－ｕ２－ｕ７－ｕ８、ｕ７－ｕ２－ｕ５－ｕ１１、ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ１－Ｉ－ｕ２、ｕ１－Ｉ－ｕ５、ｕ２－Ｉ－ｕ４、ｕ３－Ｉ－ｕ８、ｕ５－Ｉ－ｕ６、またはｕ１０－Ｉ－ｕ１１である。
【0048】
別の好ましい例において、前記（Ｘ）ｎ中の各Ｘ（ｕｊ）の間には、可撓性リンカーＩを有するか、または有さなく、好ましくは可撓性リンカーＩを有する。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、第３の制限酵素切断部位を含む。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位（ＤＤＤＤＫ）を含む。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、第３の制限酵素切断部位を含む。
別の好ましい例において、前記可撓性リンカーＩは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位（ＤＤＤＤＫ）を含む。
【0049】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、消化された後、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドを形成し、前記（Ｘ）ｎは、第１の標的ペプチドおよび／または第２の標的ペプチドの長さＬｐよりもはるかに短い長さＬｘを有する短いペプチドに切断される。
別の好ましい例において、前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、Ａ１－ｕ８、Ａ１－ｕ９、Ａ１－ｕ２－ｕ３、Ａ１－ｕ４－ｕ５、Ａ１－ｕ８－ｕ９、Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ６、Ａ１－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、またはＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６である。
別の好ましい例において、前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、Ａ１－ｕ８、Ａ１－ｕ９、Ａ１－ｕ２－ｕ３、Ａ１－ｕ４－ｕ５、Ａ１－ｕ８－ｕ９、Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３、Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ６、Ａ１－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、またはＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６である。
【0050】
別の好ましい例において、前記Ａ１－（Ｘ）ｎは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９または３０に示されるようなアミノ酸配列を有する。
Ａ１－ｕ８配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２３）
Ａ１－ｕ９配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７）
Ａ１－ｕ８配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２３）
Ａ１－ｕ９配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７）
【0051】
Ａ１－ｕ２－ｕ３配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２４）
Ａ１－ｕ４－ｕ５配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２４）
Ａ１－ｕ４－ｕ５配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）
【0052】
Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５）
ｕ８－ｕ９配列（Ａ１は、なしである）：
ＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５）
ｕ８－ｕ９配列（Ａ１は、なしである）：
ＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４）
【0053】
Ａ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＤＤＤＤＫＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）
Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２６）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＤＤＤＤＫＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）
Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２６）
【0054】
Ａ１－ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２７）
Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ６配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２８）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２７）
Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ６配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２８）
【0055】
Ａ１－ｕ４－ｕ７－ｕ１０配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２９）
Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３０）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２９）
Ａ１－ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０配列：
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３０）
【0056】
別の好ましい例において、前記第１の接続ペプチドおよび／または第２の接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８（ＥＮＬＹＦＱＧＲ）に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記プロインスリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９または２０に示されるアミノ酸配列を有する。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）
別の好ましい例において、前記プロインスリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９または２０に示されるアミノ酸配列を有する。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）
【0057】
別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＥＮＬＹＦＱＧＲＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＥＮＬＹＦＱＧＲＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１）
【0058】
本明細書で使用されるように、「融合タンパク質」という用語は、上記活性を有する変異形態をさらに含む。これらの変異形態は、１～３個（通常は、１～２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下）のアミノ酸の付加または欠失を含む（これらに限定されない）。例えば、この分野において、性能が近いか、または類似なアミノ酸で置換する場合、通常、タンパク質の機能を変更しない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端で一个または複数のアミノ酸を付加または欠失しても、通常、タンパク質の構造および機能を変化しない。さらに、前記用語は、単量体和多量体の形態の本発明のポリペプチドをさらに含む。当該用語は、線形および非線形のポリペプチド（例えば、環状ペプチド）をさらに含む。
【0059】
本発明は、上記融合タンパク質の活性フラグメント、誘導体および類似体をさらに含む。本明細書で使用されるように、「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の融合タンパク質の機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）一つまたはいくつかの保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、または（ｉｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されたポリペプチド、または（ｉｖ）付加されたアミノ酸配列がこのポリペプチド配列に融合することによって形成されたポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または６Ｈｉｓ等のタグ配列を融合することによって形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示によれば、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内にある。
【0060】
好ましいタイプの活性誘導体とは、本発明のアミノ酸配列と比較して、最大で３個、好ましくは最大で２個、より好ましくは最大で１個のアミノ酸が近いまたは類似な特性を有するアミノ酸に置き換えられてポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的変異体ポリペプチドは、最も好ましくは、表Ａに従って、アミノ酸を置き換えられて生成される。
【表2】
【0061】
本発明は、本発明の融合タンパク質の類似体をさらに提供する。これらの類似体と本発明のポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違い、配列に影響を及ぼさない修飾形態の違い、またはその両方であり得る。類似体は、天然Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸）とは異なる残基を有する類似体、および天然に存在しないまたは合成のアミノ酸（例えば、β、γ－アミノ酸）を有する類似体をさらに含む。本発明のポリペプチドは、上述で例示された代用的なポリペプチドに限定されないことを理解されたい。
【0062】
さらに、本発明の融合タンパク質に対して修飾することもできる。修飾（通常は、一次構造を変更しない）形態は、アセチル化またはカルボキシル化等の、インビボまたはインビトロでのポリペプチドの化学的誘導形態を含む。修飾は、例えば、ポリペプチドの合成および加工中、またはさらなる加工段階中にグリコシル化修飾によって生成されたポリペプチド等のグリコシル化をさらに含む。このような修飾は、ポリペプチドをグリコシル化を実行する酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼ）に曝露することによって達成することができる。修飾形態は、リン酸化されたアミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン）を有する配列をさらに含む。修飾されることによりその抗タンパク質加水分解性能を向上させるか、または溶解性能を最適化されるポリペプチドをさらに含む。
【0063】
「本発明の融合タンパク質をコードポリヌクレオチド」という用語は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、または付加のコード配列および／または非コード配列をさらに含む、ポリヌクレオチドであり得る。
【0064】
本発明は、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは融合タンパク質のフラグメント、類似体および誘導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変異体にさらに関する。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。当技術分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態であり、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得るが、コードする融合タンパク質の機能を実質的に変化させる機能はない。
【0065】
本発明は、上記配列とハイブリダイズし、かつ二つの配列の間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、ストリンジェントな条件（または厳密な条件）下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに特に関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃のようなより低いイオン強度およびより高い温度下でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）ハイブリダイゼーション中に、ハイブリダイズする場合、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２℃等の変性剤を加え、または（３）二つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる。
【0066】
本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、より好ましくは，均一に精製される。
【0067】
本発明のポリヌクレオチドの全長配列は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得られることができる。ＰＣＲ増幅法の場合、本発明に開示される関連ヌクレオチド配列、特に開放式リーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計することができ、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に知られている従来の方法によって調製されたｃＤＮＡライブラリーを関連配列を増幅するためのテンプレートとして使用する。配列が長い場合、常に２回または複数回のＰＣＲ増幅を実行してから、毎回増幅されたフラグメントを正しい順序でつなぎ合わせる必要があることがよくある。
【0068】
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連配列を大量に得ることができる。これは、通常、それをベクターにグローニングし、次に細胞に移し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連配列を単離することによって行われる。
さらに、特にフラグメントの長さが短い場合、人工合成法を使用して、関連配列を合成することもできる。通常、まず複数の小さなフラグメントを合成し、次に接続して非常に長い配列のフラグメント取得する。
さらに、特にフラグメントの長さが短い場合、人工合成法を使用して、関連配列を合成することもできる。通常、まず複数の小さなフラグメントを合成し、次に接続して非常に長い配列のフラグメント取得する。
【0069】
現在、完全に化学合成によって、本発明のタンパク質（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。
ＰＣＲ技術を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを得るために使用される。特に、ライブラリーから全長ｃＤＮＡを取得することが困難な場合、ＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ－ｃＤＮＡ末端休息増幅法）を好ましく使用することができ、ＰＣＲに使用されるプライマーは、本明細書に開示される本発明の配列情報に基づいて、適切に選択されることができ、そして従来の方法によって合成されることができる。ゲル電気泳動のような従来の方法で増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントを分離および生成することができる。
ＰＣＲ技術を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを得るために使用される。特に、ライブラリーから全長ｃＤＮＡを取得することが困難な場合、ＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ－ｃＤＮＡ末端休息増幅法）を好ましく使用することができ、ＰＣＲに使用されるプライマーは、本明細書に開示される本発明の配列情報に基づいて、適切に選択されることができ、そして従来の方法によって合成されることができる。ゲル電気泳動のような従来の方法で増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントを分離および生成することができる。
【0070】
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたは本発明の融合タンパク質コード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞、および組換え技術を介して本発明の前記ポリペプチドを生成する方法にも関する。
従来の組換えＤＮＡ技術を通じて、本発明のポリヌクレオチド配列を使用して、組換え融合タンパク質を発現または精製することができる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたは本発明の融合タンパク質コード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞、および組換え技術を介して本発明の前記ポリペプチドを生成する方法にも関する。
従来の組換えＤＮＡ技術を通じて、本発明のポリヌクレオチド配列を使用して、組換え融合タンパク質を発現または精製することができる。
【0071】
一般的には、
（１）本発明の融合タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド（または変異体）を使用するか、または当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する段階と、
（２）適切な培地で宿主細胞を培養する段階と、
（３）培地または細胞からタンパク質を分離および精製する段階とを含む。
（１）本発明の融合タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド（または変異体）を使用するか、または当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する段階と、
（２）適切な培地で宿主細胞を培養する段階と、
（３）培地または細胞からタンパク質を分離および精製する段階とを含む。
【0072】
本発明において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクターに挿入されることができる。「組換え発現ベクター」という用語は、当技術分野で知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルスまたは他のベクターを指す。宿主体内で複製および安定化できる限り、任意のプラスミドおよびベクターを使用することができる。発現ベクターの重要な特徴は、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御要素を含む。
【0073】
当業者に周知の方法はを使用して、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術等を含む。前記ＤＮＡ配列は、発現ベクター内の適切なプロモーターに効果的に接続して、ｍＲＮＡ合成をガイドすることができる。これらのプロモーターの代表的な例としては、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージＰＬプロモーター、真核プロモーター包括ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲｓおよび原核生物または真核生物の細胞またはウイルスにおける遺伝子発現を抑制できる他のいくつかの既知のプロモーターを含む。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。
【0074】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性等の形質転換宿主細胞を選択するための表現型特性を提供する、一つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを使用して、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞を形質転換することができる。
上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを使用して、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【0075】
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラチフィムリウムの細菌細胞、酵母や植物細胞等の真菌細胞（ジンセン細胞等）がある。
【0076】
本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞で発現される場合、ベクターにエンハンサー配列が挿入されると、転写が増強される。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用因子であり、通常、約１０～３００個の塩基対であり、プロモーターに作用して遺伝子の転写を増強する。引用できる例としては、複製開始点の後側にある１００～２７０個の塩基対のＳＶ４０エンハンサー、複製開始点の後側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサー等を含む。
【0077】
当業者は、適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択する方法を知っている。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、指数関数的成長期の後にＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を取得することができ、ＣａＣｌ２法で処理し、使用される段階は当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、形質転換は、エレクトロポレーション法によって行われる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム包装等のＤＮＡトランスフェクション法を選択することができる。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、指数関数的成長期の後にＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を取得することができ、ＣａＣｌ２法で処理し、使用される段階は当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、形質転換は、エレクトロポレーション法によって行われる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム包装等のＤＮＡトランスフェクション法を選択することができる。
【0078】
得られた形質転換体を従来の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養を実施する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間培養する。
【0079】
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内または細胞膜上で発現され得るか、または細胞外に分泌され得る。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な分離方法で組換えタンパク質を分離および生成することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0080】
インスリンの合成
インスリンは、既知のアミノ酸配列と構造的特徴が明確に定義されたペプチドであり、二つのアミノ酸鎖の合計５１個のアミノ酸残基を有するタンパク質である。当該ホルモンは、Ａ鎖（２１個のアミノ酸）およびＢ鎖（３０個のアミノ酸）の二つの独立したペプチド鎖を含み、二つのアミノ酸鎖には、合計６個のシステイン残基があり、各鎖の二つのシステイン残基は、ジスルフィド結合によって互いに接続される。統計的な観点から、一つのヒトインスリン分子内で形成されたジスルフィド結合には、１５の可能性がある。しかし、これらの１５の可能性のうちの一つだけが生物学的活性を有するヒトインスリンに存在し、そのジスルフィド結合は、１）Ａ６－Ａ１１、２）Ａ７－Ｂ７、３）Ａ２０－Ｂ１９である。プロインスリンは、インスリンの生物学的前駆体であり、Ａ鎖とＢ鎖とをＣペプチドで接続して形成された一本鎖ペプチドである。インスリンの二つのペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって結合される（図１）。
インスリンは、既知のアミノ酸配列と構造的特徴が明確に定義されたペプチドであり、二つのアミノ酸鎖の合計５１個のアミノ酸残基を有するタンパク質である。当該ホルモンは、Ａ鎖（２１個のアミノ酸）およびＢ鎖（３０個のアミノ酸）の二つの独立したペプチド鎖を含み、二つのアミノ酸鎖には、合計６個のシステイン残基があり、各鎖の二つのシステイン残基は、ジスルフィド結合によって互いに接続される。統計的な観点から、一つのヒトインスリン分子内で形成されたジスルフィド結合には、１５の可能性がある。しかし、これらの１５の可能性のうちの一つだけが生物学的活性を有するヒトインスリンに存在し、そのジスルフィド結合は、１）Ａ６－Ａ１１、２）Ａ７－Ｂ７、３）Ａ２０－Ｂ１９である。プロインスリンは、インスリンの生物学的前駆体であり、Ａ鎖とＢ鎖とをＣペプチドで接続して形成された一本鎖ペプチドである。インスリンの二つのペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって結合される（図１）。
【0081】
インスリンは、ブドウ糖等の内因性物質によって刺激された膵島細胞によって分泌されるタンパク質ホルモンである。膵島細胞によって最初に分泌されるのは、８４個のアミノ酸からなる長鎖ポリペプチド－プロインスリンである。プロインスリンは、特定のプロテアーゼ－プロインスリン変換酵素ＰＣ１とＰＣ２およびカルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）の作用により、プロインスリンの中央部分（Ｃ鎖）を切断し、プロインスリンのカルボキシル基部分（Ａ鎖）およびアミノ基部分（Ｂ鎖）は、ジスルフィド結合によって結合してインスリンを形成する。成熟したインスリンは、膵島細胞内の分泌小胞に貯蔵され、亜鉛イオンと協調して六量体を形成する。外部の刺激下で、インスリンは、分泌小胞とともに血液中に放出され、かつその生理学的効果を発揮する。１型糖尿病の患者は、自体の膵島細胞のインスリン生成能力が破壊されたため、自体の血糖調節能力を失う。
【0082】
現在、「鎖の組み合わせ」経路および「プロインスリン」経路の二つの経路は、様々なタイプの商業的組換えヒトインスリンの生産に使用される。「鎖の組み合わせ」経路において、インスリンを構成する二つのペプチド鎖-Ａ鎖およびＢ鎖は、それぞれ生物学的組換えによって、別々に合成され、次にＡ鎖およびＢ鎖を混合してジスルフィド結合を生成して、生物学的活性を有するヒトインスリンを生成する。しかしながら、二つのペプチド鎖を直接混合して生物学的活性を有するヒトインスリンを生成する効率は、比較的に低く、最終的な収率は、わずか約７％である。現在、このような方法は、徐々に第２の経路－「プロインスリン」経路に置き換えられる。「プロインスリン」経路の場合、インスリンＢ鎖、Ｃ鎖およびＡ鎖で構成されるプロインスリンは、最初に大腸菌または酵母内で発現され、精製後にインビトロで再生される。再生されたプロインスリンは、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで加水分解および消化して、天然活性を有するヒトインスリンを得る。「プロインスリン」経路において、トリプシンは、タンパク質中のリジンおよびアルギニンを特異的に識別し、かつリジンおよびアルギニンＣ末端でのペプチド結合を切断する。コンフォメーション上の理由により、プロインスリンの位置Ｂ２２のアルギニンは、トリプシンによって加水分解されない。しかし、トリプシンは、インスリンの位置Ｂ２９のリジンを識別および加水分解することにより、必然的に位置Ｂ３０のスレオニンが除去されるインスリン副産物（ＤｅｓＢ３０－インスリン）が生成される。ＤｅｓＢ３０－インスリンの生成を減らすために、トリプシンの用量および反応時間を厳密に制御する必要がある。それにもかかわらず、一定量のＤｅｓＢ３０－インスリンが生成される。ＤｅｓＢ３０－インスリンとインスリンとの間にはスレオニンの違いが一つしかないため、それらの間の分離は、非常に困難である。大規模な高速液体クロマトグラフィー法は、インスリンを分離するための業界で広く使用されるが、このような方法を使用してインスリンおよびＤｅｓＢ３０－インスリンを分離すると、大量の産業廃棄物が発生し、既存の組換えヒトインスリンの製造コストが高くなる。
【0083】
本発明は、システインリッジが正しく接続されたヒトインスリンを取得するための組換え法を開発し、当該方法は、必要な段階が少ないため、より高い収量のヒトインスリンを得ることができる。
【0084】
化学的方法は、ＤＮＡフラグメントを合成し、当該ＤＮＡフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１のアミノ酸配列からなる２β－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳをコードする。当該ＤＮＡフラグメントをａｒａＢＡＤプロモーターによって調節される細菌発現ベクターにクローニングされる。２β－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳを含む発現ベクターを大腸菌Ｔｏｐ１０菌株に形質転換し、組換え細胞を微量元素を含むＬＢ培地で培養する。封入体から２β－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を回収し、一定の条件下でフォールディングして、フォールディングされた２β－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質で形成されたジスルフィド結合は、正しくフォールディングされたヒトプロインスリン中のジスルフィド結合と同じであり、即ち、形成されたジスルフィド結合は、Ａ６－Ａ１１、Ａ７－Ｂ７およびＡ２０－Ｂ１９である。トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで分離された正しいフォールディング２β－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を消化して、正しくフォールディングされたＢｏｃ－ヒトインスリンを形成する。疎水性クロマトグラフィーによって、Ｂｏｃ－ヒトインスリンを純度９０％に精製する。次に、酸でＢｏｃを脱保護して、正しくフォールディングされたヒトインスリンを形成し、次に、逆相ＨＰＬＣで精製する。Ｎ末端配列分析、分子量測定およびペプチドマッピング法を使用してこのように生成された純粋なヒトインスリンの性質を決定する。
【0085】
従来の技術と比較して、本発明は、主に以下の利点を有する。
１）本発明の融合タンパク質中のタンパク質発現促進要素は、融合タンパク質のフォールディングを促進することができる。
２）本発明のタンパク質発現促進要素は、可溶性融合タンパク質の溶解性を向上させ、かつ融合タンパク質の分子間相互作用を減少させることにより、融合タンパク質が商業的意義を有する高濃度下でフォールディングすることができる。
３）標的ペプチドを調製するプロセスにおいて、臭化シアンの分解、酸化亜硫酸縁の加水分解および関連する生成段階は必要ない。
１）本発明の融合タンパク質中のタンパク質発現促進要素は、融合タンパク質のフォールディングを促進することができる。
２）本発明のタンパク質発現促進要素は、可溶性融合タンパク質の溶解性を向上させ、かつ融合タンパク質の分子間相互作用を減少させることにより、融合タンパク質が商業的意義を有する高濃度下でフォールディングすることができる。
３）標的ペプチドを調製するプロセスにおいて、臭化シアンの分解、酸化亜硫酸縁の加水分解および関連する生成段階は必要ない。
【0086】
４）標的ペプチドを調製するプロセスにおいて、高濃度のチオールまたは疎水性吸着樹脂を使用する必要はない。
５）微生物宿主の細胞内分解から標的ペプチドを保護する。
６）標的タンパク質の比重が高く（融合比が増加する）、融合タンパク質中の（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、プロテアーゼにより小さなフラグメントに消化され、標的タンパク質と比較して、分子量の違いが大きく、分離しやすい。
５）微生物宿主の細胞内分解から標的ペプチドを保護する。
６）標的タンパク質の比重が高く（融合比が増加する）、融合タンパク質中の（Ｘ）ｎまたはＡ１－（Ｘ）ｎは、プロテアーゼにより小さなフラグメントに消化され、標的タンパク質と比較して、分子量の違いが大きく、分離しやすい。
【0087】
７）本発明の融合タンパク質は、標的ペプチドの発現を促進することができ、標的ペプチドの発現レベルおよび収率は、有意に向上される。
８）本発明の融合タンパク質は、非天然アミノ酸を有する標的ペプチドを発現するのに非常に適しており、非天然アミノ酸を有する標的ペプチドのフォールディングを明らかに促進することができる。
８）本発明の融合タンパク質は、非天然アミノ酸を有する標的ペプチドを発現するのに非常に適しており、非天然アミノ酸を有する標的ペプチドのフォールディングを明らかに促進することができる。
【0088】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。
実施例において、標的ペプチドとしてヒトインスリンを例に使用されるが、これらに限定されない。
実施例において、標的ペプチドとしてヒトインスリンを例に使用されるが、これらに限定されない。
【0089】
実施例１．発現ベクターＡ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳの構築
発現構築体Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳは、ヒトインスリンタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記タンパク質は、Ａ１－ｕ４－ｕ５のＣ末端に融合する。Ａ１－ｕ４－ｕ５とインスリンタンパク質ＭｉｎｉＩＮＳとの間の接続ペプチドは、オクタペプチドＧｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇである。当該オクタペプチドは、Ａｒｇのカルボキシル基末端でトリプシンによって加水分解されることができ、Ｇｌｎ－Ｇｌｙの間でＴＥＶプロテアーゼによって加水分解されることもできる。当該オクタペプチドのＤＮＡ配列は、コドン最適化されて、大腸菌で機能性タンパク質の高レベルの発現を実現することができる。
発現構築体Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳは、ヒトインスリンタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記タンパク質は、Ａ１－ｕ４－ｕ５のＣ末端に融合する。Ａ１－ｕ４－ｕ５とインスリンタンパク質ＭｉｎｉＩＮＳとの間の接続ペプチドは、オクタペプチドＧｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇである。当該オクタペプチドは、Ａｒｇのカルボキシル基末端でトリプシンによって加水分解されることができ、Ｇｌｎ－Ｇｌｙの間でＴＥＶプロテアーゼによって加水分解されることもできる。当該オクタペプチドのＤＮＡ配列は、コドン最適化されて、大腸菌で機能性タンパク質の高レベルの発現を実現することができる。
【0090】
使用されるすべての融合組換えタンパク質フラグメントは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ会社によって合成され、かつｐＵＣ５７ベクターにロードされ、制限酵素ＮｃｏIおよびＸｈｏIを使用して、合成ベクター「ｐＵＣ５７－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ」から「Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ」をを切断し、同時に制限酵素ＮｃｏIおよびＸｈｏIを使用して、発現ベクター「ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（ＫａｎａＲ）」を切断し、消化された生成物は、アガロース電気泳動によって分離され、アガロースゲルＤＮＡ回収キットを使用して抽出し、最後にＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して二つのＤＮＡフラグメントを接続する。前記接続生成物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、前記形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％寒天）で一晩培養する。三つの生きたコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬの液体ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）で一晩培養し、少量のプラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出する。次に、抽出されたプラスミドに対してシーケンシングする。最終的に得られたプラスミドは、「ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ」と名付けられ、プラスミドマップおよび融合タンパク質の模式図は、それぞれ図２および図３に示される。
【0091】
実施例２．発現構築体Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１の構築
実施例１の方法のように、ｐＵＣ５７－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１を構築および合成し、同時に制限酵素ＮｃｏIおよびＸｈｏIで発現ベクター「ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（ＫａｎａＲ）」を切断し、消化された生成物は、アガロース電気泳動によって分離され、アガロースゲルＤＮＡ回収キットを使用して抽出し、最後にＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して二つのＤＮＡフラグメントを接続する。前記接続生成物を化学的方法で大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、前記形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％寒天）で一晩培養する。三つの生きたコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬの液体ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）で一晩培養し、少量のプラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出する。次に、前記抽出されたプラスミドをシーケンシングオリゴヌクレオチドプライマー５’－ＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ－３’を使用してシーケンシングして、正しい挿入を確認する。最終的に得られたプラスミドは、「ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１」と名付けられる。
実施例１の方法のように、ｐＵＣ５７－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１を構築および合成し、同時に制限酵素ＮｃｏIおよびＸｈｏIで発現ベクター「ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（ＫａｎａＲ）」を切断し、消化された生成物は、アガロース電気泳動によって分離され、アガロースゲルＤＮＡ回収キットを使用して抽出し、最後にＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して二つのＤＮＡフラグメントを接続する。前記接続生成物を化学的方法で大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、前記形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％寒天）で一晩培養する。三つの生きたコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬの液体ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌの酵母ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）で一晩培養し、少量のプラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出する。次に、前記抽出されたプラスミドをシーケンシングオリゴヌクレオチドプライマー５’－ＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ－３’を使用してシーケンシングして、正しい挿入を確認する。最終的に得られたプラスミドは、「ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＧＬＰ１」と名付けられる。
【0092】
実施例３．Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現、分離および精製
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１のアミノ酸配列を含むＡ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳの融合フラグメントを発現させるためである。シーケンシングにより確認されたプラスミドｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳおよびピロリシンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴ（ここで、ピロリシンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴは、特許出願番号２０１１１０３８８６２４１の実施例１に示されるように、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを発現するために使用される）を一緒に大腸菌株Ｔｏｐ１０に形質転換する。形質転換溶液を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に一晩置く。単一のコロニーを選び、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で一晩培養する。次に、前記一晩培養物を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む１００ｍＬのＴＢ培地（液体ＴＢ培地：１２ｇ／Ｌの酵母ペプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、４％ＫＰＰ、０．３‰消泡剤。ＫＰＰ溶液：２３．１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２５．４ｇ／Ｌの無水Ｋ２ＨＰＯ４）に接種し、ＯＤ６００が２～４になるまで３７℃で培養する。次に、２５％のアラビノース溶液を最終濃度０．２５％になるまでに前記培地に加え、最終濃度が５ｍＭになるまでに０．１Ｍのtert―ブトキシカルボニルリジン（ＢＯＣ－リジン、ＢＯＣの構造は、図４に示されるように）溶液を加えて、前記融合タンパク質の発現を誘導する。前記培養液を１６～２０時間連続培養した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して収集する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１のアミノ酸配列を含むＡ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳの融合フラグメントを発現させるためである。シーケンシングにより確認されたプラスミドｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳおよびピロリシンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴ（ここで、ピロリシンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴは、特許出願番号２０１１１０３８８６２４１の実施例１に示されるように、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを発現するために使用される）を一緒に大腸菌株Ｔｏｐ１０に形質転換する。形質転換溶液を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に一晩置く。単一のコロニーを選び、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で一晩培養する。次に、前記一晩培養物を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む１００ｍＬのＴＢ培地（液体ＴＢ培地：１２ｇ／Ｌの酵母ペプトン、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、４％ＫＰＰ、０．３‰消泡剤。ＫＰＰ溶液：２３．１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２５．４ｇ／Ｌの無水Ｋ２ＨＰＯ４）に接種し、ＯＤ６００が２～４になるまで３７℃で培養する。次に、２５％のアラビノース溶液を最終濃度０．２５％になるまでに前記培地に加え、最終濃度が５ｍＭになるまでに０．１Ｍのtert―ブトキシカルボニルリジン（ＢＯＣ－リジン、ＢＯＣの構造は、図４に示されるように）溶液を加えて、前記融合タンパク質の発現を誘導する。前記培養液を１６～２０時間連続培養した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して収集する。
【0093】
Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質は、不溶性「封入体」の形態で発現される。封入体を放出するために、高圧ホモジナイザーで大腸菌細胞を破壊する。１００００ｇの遠心分離法によって核酸、細胞破片および可溶性タンパク質を除去する。Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を含む封入体を純水で洗浄し、得られた封入体沈殿物をフォールディングの原材料として使用する。当該融合タンパク質の最終的な発現レベルは、１４ｇ／Ｌの発酵ブロスである。融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥマップは、図５に示される。図５から、当該融合タンパク質によって発現される標的タンパク質は、破壊されずに完全に発現されることができ、非天然アミノ酸標的タンパク質を挿入する融合タンパク質も、破壊されずに完全に発現されることができることが分かる。
【0094】
融合タンパク質をリフォールディングするために、ｐＨ１０．５であり、かつ２～１０ｍＭのメルカプトエタノールを含む７．５Ｍの尿素溶液に封入体を溶解して、溶解後の総タンパク質の濃度が１０～２５ｍｇ／ｍＬになるようにする。サンプルを５～１０倍に希釈し、４～８℃、ｐＨが１０．５～１１．７である条件下で、従来のフォールディングを１６～３０時間行う。１８～２５℃下で、ｐＨ値を８．０～９．５に維持し、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで融合タンパク質を１０～２０時間加水分解した後、０．４５Ｍの硫酸アンモニウムを加えて酵素加水分解反応を停止させる。逆相ＨＰＬＣ分析の結果によると、当該酵素加水分解段階の収率が９０％より高いことを示す。トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで消化した後得られたインスリン類似体は、ＢＯＣ－ヒトインスリンと名付けられる。Ｂｏｃ－ヒトインスリンは、上記の条件下で加水分解されることはできない。膜ろ過でサンプルを清澄化し、０．４５ｍＭの硫酸アンモニウムを緩衝液として、疎水性クロマトグラフィーで最初にＢｏｃ－ヒトインスリンを精製し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の純度は、９０％に達する。発酵ブロス１LあたりのＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約２．１ｇである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量５９０７．７Ｄａと一致していることが検出された。疎水性クロマトグラフィーで溶出してサンプルを収集し、塩酸を加えてＢｏｃ－ヒトインスリン脱保護反応を行い、水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを２．８～３．２に制御して反応を停止させ、２段階の高圧逆相クロマトグラフィーを行った後、組換えヒトインスリンの収率は、８５％を超える。発酵ブロス１Lあたりの組換えヒトインスリンの最終的な収量は、約７００ｍｇである。
【0095】
実施例４．ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ発現構築体の構築ならびにＡ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現、分離および精製
実験方法は、実施例１～３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２３）に置き換え、ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる（図５）。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約１．９ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
実験方法は、実施例１～３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２３）に置き換え、ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ８－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる（図５）。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約１．９ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
【0096】
実施例５．ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ発現構築体の構築ならびにＡ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現、分離および精製
実験方法は、実施例１－３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５）に置き換え、ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約２．０ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
実験方法は、実施例１－３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５）に置き換え、ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ３－ｕ５－ｕ７－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約２．０ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
【0097】
実施例６．ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ発現構築体の構築ならびにＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質の発現、分離および精製
実験方法は、実施例１－３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）に置き換え、ここで、ＥＫは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位ＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２５）である。ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約１．９ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
実験方法は、実施例１－３と同じであり、Ａ１－ｕ４－ｕ５－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ中のＡ１－ｕ４－ｕ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）をＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）に置き換え、ここで、ＥＫは、ＥＫ酵素制限酵素切断部位ＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２５）である。ｐＢＡＤ－Ａ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳと名付けられる組換えプラスミドを構築し、上記の方法に従ってＡ１－ｕ５－ＥＫ－ｕ６－ＴＥＶ－Ｒ－ＭｉｎｉＩＮＳ融合タンパク質を発現させる。ＢＯＣ－ヒトインスリンの最終的な収量は、約１．９ｇ／Ｌである。また、得られたＢｏｃ－ヒトインスリンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析した結果、その分子量は、理論分子量と一致していることが分かる。
【0098】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】