特表 2022-528169 リポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-08

(54)【発明の名称】リポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220601BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220601BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220601BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220601BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220601BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220601BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220601BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220601BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220601BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220601BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220601BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220601BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220601BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220601BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/46

C07K19/00

C12N15/62 Z

C07K16/28

A61P35/00

A61P31/00

A61P43/00 105

A61K39/395 N

A61K39/395 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021559641

(86)(22)【出願日】2020-04-08

(85)【翻訳文提出日】2021-12-03

(86)【国際出願番号】 EP2020059949

(87)【国際公開番号】W WO2020208049

(87)【国際公開日】2020-10-15

(31)【優先権主張番号】19169022.1

(32)【優先日】2019-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】クラウス， クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】フェッラーラ コラー， クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ウマーナ， パブロ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含み、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子、並びにがん又は感染症の処置におけるそれらの使用に関する。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、前記リポカリンムテインの一方が前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方が前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと
を含む、二重特異性抗原結合分子。

【請求項2】

４－１ＢＢに特異的に結合可能な前記リポカリンムテインの各々が、配列番号１の成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈｕＮＧＡＬ）由来である、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項3】

４－１ＢＢに特異的に結合可能な前記リポカリンムテインの各々が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸の１つ以上が下記のように変異している、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子：
（ａ）２０位のＱがＲに置き換えられ、又は
（ｂ）２５位のＮがＹ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｃ）２８位のＨがＱに置き換えられ、又は
（ｄ）３６位のＱがＭに置き換えられ、又は
（ｅ）４０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｆ）４１位のＲがＬ若しくはＫに置き換えられ、又は
（ｇ）４４位のＥがＶ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｈ）４６位のＫがＳに置き換えられ、且つ４７位～４９位のアミノ酸が欠失され、又は
（ｉ）４９位のＩがＨ、Ｎ、Ｖ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｊ）５２位のＭがＳ若しくはＧに置き換えられ、又は
（ｋ）５９位のＫがＮに置き換えられ、又は
（ｌ）６５位のＤがＮに置き換えられ、又は
（ｍ）６８位のＭがＤ、Ｇ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｎ）７０位のＫがＭ、Ｔ、Ａ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｏ）７１位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｐ）７２位のＤがＬに置き換えられ、又は
（ｑ）７７位のＭがＱ、Ｈ、Ｔ、Ｒ若しくはＮに置き換えられ、又は
（ｓ）７９位のＤがＩ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｔ）８０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｕ）８１位のＷがＱ、Ｓ若しくはＭに置き換えられ、又は
（ｖ）８２位のＴがＰに置き換えられ、又は
（ｗ）８３位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｙ）９２位のＦがＬ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｚ）９４位のＬがＦに置き換えられ、又は
（ｚａ）９６位のＫがＦに置き換えられ、又は
（ｚｂ）１００位のＦがＤに置き換えられ、又は
（ｚｃ）１０１位のＰがＬに置き換えられ、又は
（ｚｄ）１０３位のＨがＰに置き換えられ、又は
（ｚｅ）１０６位のＳがＹに置き換えられ、又は
（ｚｆ）１２２位のＦがＹに置き換えられ、又は
（ｚｇ）１２５位のＦがＳに置き換えられ、又は
（ｚｈ）１２７位のＦがＩに置き換えられ、又は
（ｚｉ）１３２位のＥがＷに置き換えられ、又は
（ｚｊ）１３４位のＹがＧに置き換えられる。

【請求項4】

４－１ＢＢに特異的に結合可能な前記リポカリンムテインの各々が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項5】

４－１ＢＢに特異的に結合可能な前記リポカリンムテインの各々が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項6】

前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール修飾を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項7】

前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項8】

前記Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項9】

標的細胞抗原に特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインが、標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項10】

標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項11】

線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項12】

線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）及び配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）及び配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項13】

配列番号３７の第１の重鎖、配列番号３８の第２の重鎖、及び配列番号３９の軽鎖を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項14】

標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項15】

ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１～９又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項16】

ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は
（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）を含む、請求項１～９又は１４若しくは１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項17】

配列番号６４の第１の重鎖、配列番号６５の第２の重鎖、及び配列番号６６の軽鎖を含む、請求項１～９又は１４～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、単離核酸。

【請求項19】

請求項１８に記載の単離核酸を含む、ベクター、特に発現ベクター。

【請求項20】

請求項１８に記載の核酸又は請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項21】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、前記二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。

【請求項22】

前記二重特異性抗原結合分子を前記宿主細胞から回収することを更に含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項24】

追加の治療剤を更に含む、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

医薬として使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項26】

がん又は感染症の処置に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項27】

がん又は感染症を処置するための医薬を製造するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。

【請求項28】

がん又は感染症を有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２１に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。

【請求項29】

がんを有する個体における細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレート又は延長する方法であって、有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、４－１ＢＢに二価結合することができ、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含む標的細胞抗原に一価結合することができる二重特異性抗原結合分子、並びにがん又は感染症の処置におけるそれらの使用に関する。本発明は更に、これらの分子を製造する方法、及びこれらを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、最初に、Ｔ細胞によって活性化されることによって発現される誘導性分子として同定された（Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１９６３－１９６７）。その後の研究は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、肥満細胞、樹状細胞（ＤＣ）、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞等の非造血起源の細胞を含む多くの他の免疫細胞も４－１ＢＢを発現することを実証した（Ｖｉｎａｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，２０１１，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，２８１－２８４）。種々の細胞型において４－１ＢＢの発現は大部分が誘発性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体のトリガリング、及びプロ炎症性サイトカインの同時刺激分子又は受容体を通して誘発されるシグナル伝達等の、様々な刺激性シグナルによる駆動される（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８，３７５５－３７６２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，２７５８－２７６７）。

【0003】

４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は１９９３年に同定された（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３，２６３１－２６４１）。４－１ＢＢＬの発現は、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージ等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で制限されることが示されている。４－１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδＴ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，２０１１，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ８９，２１－２９）。

【0004】

４－１ＢＢ受容体を介した共刺激（例えば、４－１ＢＢＬライゲーションによる）は、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達カスケード（ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋サブセットの両方）を活性化し、Ｔ細胞活性化を強力に増強する（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ５，１１７）。ＴＣＲトリガリングと組み合わせて、アゴニスト４－１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化により誘発される細胞死の感度を低下させる（Ｓｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２４４，１９７－２１７））。この機序は、癌免疫療法における最初の概念実証として更に進歩した。前臨床モデルでは、腫瘍担持マウスにおける４－１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ ３，６８２－６８５。その後、証拠の蓄積により、４－１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異的ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与した場合にのみ抗腫瘍剤としての効力を示すことが示された（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ５，１１７）。

【0005】

ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４－１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Ｌｉ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１０３０－１０３４）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４－１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の不在下で減少又は有意に改善される肝毒性（Ｄｕｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５９，１２２３－１２３３）と関連するＣＤ８^＋Ｔ細胞の流入をもたらした。診療所では、Ｆｃコンピテント４－１ＢＢアゴニスト性Ａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）がグレード４の肝炎を引き起こし、試験の終了につながった（Ｓｉｍｅｏｎｅ ａｎｄ Ａｓｃｉｅｒｔｏ，２０１２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ９，２４１－２４７）。したがって、効果的で安全な４－１ＢＢアゴニストが必要とされている。

【0006】

ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１６６８）は、セプラーゼとしても公知であり、１７０ｋＤａの内在性膜セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．Ｂ２８）である。ＦＡＰは、密接に関連する細胞表面酵素であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６としても知られる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２７４８７）及び他のペプチダーゼと共に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーに属する（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ ２７７，１１２６－１１４４（２０１０））。ＦＡＰは、酵素の触媒ドメインが位置する大きなＣ末端細胞外ドメインを有する２つのＮ－グリコシル化サブユニットを含むホモ二量体である（Ｓｃａｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１，５６５７－５６６１（１９９４））。ＦＡＰは、そのグリコシル化形態において、プロリルジペプチジルペプチダーゼ後活性及びゼラチナーゼ活性の両方を有する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ２４，２７４－２８１（２００２））。ＦＡＰは、多くの一般的ながんにおけるその発現及び正常な組織におけるその限定された発現のため、様々な癌腫の画像化、診断及び治療のための有望な抗原性標的であると考えられてきた。したがって、複数のモノクローナル抗体が、研究目的、診断目的及び治療目的のためにＦＡＰに対して産生された。

【0007】

ヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ２；ＥｒｂＢ２）は、受容体チロシンキナーゼであり、膜貫通受容体の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２は、様々な腫瘍型で過剰発現され、疾患の開始及び進行に関与している。ＨＥＲ２は予後不良に関連する。例えば、ＨＥＲ２の過剰発現は、ヒト乳癌のおよそ３０％に観察され、これらの腫瘍に関連する侵攻性の成長及び臨床転帰不良に関連付けられている（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７－１８２）。

【0008】

ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＣＡＳ １８０２８８－６９－１、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＨＥＲ２（米国特許第５６７７１７１号；米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６１６５４６４号；米国特許第６３３９１４２号；米国特許第６４０７２１３号；米国特許第６６３９０５５号；米国特許第６７１９９７１号；米国特許第６８００７３８号；米国特許第７０７４４０４号；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１ １３２－９；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７－１２；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２）の細胞外ドメインを標的とする。トラスツズマブは、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、抗体依存性細胞傷害性メディエータ、ＡＤＣＣであることが示されている（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１ １６５－７２；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ；３７：２５５－６３；Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２８２５－２８３１；Ｈｏｔａｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９６）［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；３７：４７１；Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ，ｅｔ ａｌ（１９９７）［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｐｒｏｃ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；３８：６０２；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６（４），Ｓｕｐｐｌ １２：６０－７０；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．ａｎｄ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｍａｇａｚｉｎｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｖｏｌ．２：１２７－１３７）。

【0009】

ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）は、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌患者（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７－７４４）の処置に対して１９９８年に承認された。２００６年に、ＦＤＡは、ＨＥＲ２陽性のリンパ節陽性乳癌を有する患者のアジュバント処置のために、ドキソルビシン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルを含有する処置レジメンの一部として、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を承認した。

【0010】

ペルツズマブ（組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４、パージェタ（ＰＥＲＪＥＴＡ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏとしてもまた既知）は、ＨＥＲ２を標的とする別の抗体処置である。ペルツズマブは、Ｈｅｒ二量化阻害剤（ＨＤＩ）であり、他のＨｅｒ受容体との活性ヘテロ二量体又はホモ二量体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４等）を形成するＨＥＲ２の能力を阻害するように機能する。例えば、Ｈａｒａｒｉ ａｎｄ Ｙａｒｄｅｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６１０２－１４（２０００）；Ｙａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：１２７－３７（２００１）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １０：１５８－９（２００３）；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６－６０（２００３）；ａｎｄ Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４４：１７６－７（２００３）；米国特許第７５６０１１１号を参照されたい。パージェタ（登録商標）は、進行期又は後期（転移性）のＨＥＲ２陽性乳癌を有する患者の処置に対して、トラスツズマブ及びドセタキセルと組み合わせて２０１２年に最初に承認された。一方、トラスツズマブとペルツズマブとを用いた併用療法は、ＨＥＲ２陽性、局所進行性、炎症性又は早期の乳癌のネオアジュバント（術前）処置、及び再発リスクの高いＨＥＲ２陽性早期乳癌（ＥＢＣ）のアジュバント（術後）処置にも承認されている。パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）及びハーセプチンの作用機序は、両方ともＨＥＲ２受容体に結合するが異なる場所に結合するので、互いに補完すると考えられている。パージェタとハーセプチンとの組合せは、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な二重遮断を提供し、したがって腫瘍細胞の成長及び生存を妨げると考えられている。

【0011】

ヒトＥｒｂＢ２のドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対する二重特異性二価ＨＥＲ２抗体は、国際公開第２０１２／１４３５２３号に開示されている。ハーセプターグ（Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ）と呼ばれる、抗体ｒｈｕＭａｂ ２Ｃ４及びｈｕ４Ｄ５の最適化されたバリアントを含む二重特異性ＨＥＲ－２抗体は、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されている。乳癌におけるトラスツズマブの治療有効性は十分に実証されているが、耐性のためにトラスツズマブから利益を得ない患者が多く存在する。低レベルのＨＥＲ２を発現する特定の癌における有効な抗ＨＥＲ２療法の欠如、現在の療法に対する耐性、及びＨＥＲ２関連癌の有病率を考慮すると、かかる癌を処置するために新たな治療法が必要である。

【0012】

本発明の二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特にＦＡＰ又はＨＥＲ２等の腫瘍標的に対するそれらの結合、及び４－１ＢＢに対するそれらの結合特異性を特徴とする。４－１ＢＢに特異的に結合可能な抗原結合ドメインはリポカリンムテインに代表される。リポカリンムテイン（アンチカリン）は、天然のヒトリポカリンに由来する非抗体足場であり、小さいサイズ、強固な保持及び顕著な標的特異性（Ｒｏｔｈｅ Ｃ，Ｓｋｅｒｒａ Ａ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１８，３２，２３３－２４３）等の幾つかの利点を提供する。ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に特異的なリポカリンムテインは、国際公開第２０１６／１７７７６２号及び国際公開第２０１８／０８７１０８号に記載されている。ＣＤ１３７に対する結合特異性及びＨＥＲ２／ｎｅｕに対する結合特異性から構成される融合タンパク質は、国際公開第２０１６／１７７８０２号に開示されている。それらのＦｃドメインに基づいて、これらの融合タンパク質は、ＣＤ１３７及びＨＥＲ２への二価結合を有する対称抗体様二量体を形成する。

【0013】

本発明の結合抗原結合分子は、標的細胞抗原への一価結合及び４－１ＢＢへの二価結合を提供することを特徴とする。驚くべきことに、腫瘍標的結合対エフェクター細胞標的結合の比が１：２であると、エフェクター細胞上の４－１ＢＢアゴニストの架橋が改善され、４－１ＢＢ受容体の下流シグナル伝達がより強くなり、したがって有効性が改善されることが見出された。

【発明の概要】

【0014】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0015】

特定の態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの各々が、配列番号１の成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈｕＮＧＡＬ）由来リポカリンムテインである、二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0016】

更なる態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの各々が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸の１つ以上が下記のように変異している、上記で定義した二重特異性抗原結合分子を提供する：
（ａ）２０位のＱがＲに置き換えられ、又は
（ｂ）２５位のＮがＹ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｃ）２８位のＨがＱに置き換えられ、又は
（ｄ）３６位のＱがＭに置き換えられ、又は
（ｅ）４０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｆ）４１位のＲがＬ若しくはＫに置き換えられ、又は
（ｇ）４４位のＥがＶ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｈ）４６位のＫがＳに置き換えられ、且つ４７位～４９位のアミノ酸が欠失され、又は
（ｉ）４９位のＩがＨ、Ｎ、Ｖ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｊ）５２位のＭがＳ若しくはＧに置き換えられ、又は
（ｋ）５９位のＫがＮに置き換えられ、又は
（ｌ）６５位のＤがＮに置き換えられ、又は
（ｍ）６８位のＭがＤ、Ｇ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｎ）７０位のＫがＭ、Ｔ、Ａ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｏ）７１位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｐ）７２位のＤがＬに置き換えられ、又は
（ｑ）７７位のＭがＱ、Ｈ、Ｔ、Ｒ若しくはＮに置き換えられ、又は
（ｓ）７９位のＤがＩ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｔ）８０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｕ）８１位のＷがＱ、Ｓ若しくはＭに置き換えられ、又は
（ｖ）８２位のＴがＰに置き換えられ、又は
（ｗ）８３位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｙ）９２位のＦがＬ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｚ）９４位のＬがＦに置き換えられ、又は
（ｚａ）９６位のＫがＦに置き換えられ、又は
（ｚｂ）１００位のＦがＤに置き換えられ、又は
（ｚｃ）１０１位のＰがＬに置き換えられ、又は
（ｚｄ）１０３位のＨがＰに置き換えられ、又は
（ｚｅ）１０６位のＳがＹに置き換えられ、又は
（ｚｆ）１２２位のＦがＹに置き換えられ、又は
（ｚｇ）１２５位のＦがＳに置き換えられ、又は
（ｚｈ）１２７位のＦがＩに置き換えられ、又は
（ｚｉ）１３２位のＥがＷに置き換えられ、又は
（ｚｊ）１３４位のＹがＧに置き換えられる。

【0017】

一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、４～１０個のアミノ酸が上記で定義されるように変異している。一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。更なる態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの各々は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一態様では、両方のリポカリンムテインが同一のアミノ酸配列を含む。

【0018】

一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より詳しくは、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール修飾を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0019】

別の態様では、本発明は、（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書において前に定義した二重特異性抗原結合分子に関する。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリング）のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃドメインが、Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）、より具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔに従うＥＵナンバリング）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0020】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子であって、一方のリポカリンムテインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、他方のリポカリンムテインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、及び配列番号１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特に、ペプチドリンカーは、配列番号７８、すなわち（Ｇ_４Ｓ）_３のアミノ酸配列を有する。

【0021】

一特定態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0022】

一態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、二重特異性抗原結合分子が提供される。したがって、標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、上記で定義される二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0023】

一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。特に、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。

【0024】

一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）及び配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含むか、又は（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）及び配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。特に、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。

【0025】

一態様では、本発明は、配列番号３７の第１の重鎖と、配列番号３８の第２の重鎖と、配列番号３９の軽鎖とを含む、４－１ＢＢへの二価結合能及びＦＡＰへの一価結合能を有する二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0026】

別の態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、標的細胞抗原がＨＥＲ２である、二重特異性抗原結合分子が提供される。したがって、標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片が、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片である、上記で定義される二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0027】

一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は（ｃ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。

【0028】

一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、を含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）を含む。特定の一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）とを含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）とを含む。

【0029】

一態様では、本発明は、配列番号６４の第１の重鎖と、配列番号６５の第２の重鎖と、配列番号６６の軽鎖とを含む、４－１ＢＢへの二価結合能及びＨＥＲ２への一価結合能を有する二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0030】

本発明の別の態様に従うと、本明細書にて上に定義される二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸が提供される。本発明は更に、ベクター、特に、本発明の単離核酸と、単離核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞とを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、特に、哺乳動物細胞である。

【0031】

別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することを含み、当該宿主細胞から当該二重特異性抗原結合分子を回収することを更に含む方法が提供される。本発明は、本発明の方法により作製した二重特異性抗原結合分子もまた包含する。

【0032】

本発明の二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を更に提供する。別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含み、追加の治療剤、例えば化学療法剤及び／又は癌免疫療法に使用するための他の薬剤を更に含む医薬組成物が提供される。

【0033】

医薬として使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物も本発明に包含される。一態様では、疾患の処置を必要とする個体における疾患の処置において使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物が提供される。一態様では、がん又は感染症の処置において使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。別の態様では、細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレート又は延長する際に使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物が提供される。

【0034】

疾患の処置を必要とする個体における、疾患を処置するための医薬を製造するための、特に、がん又は感染症を処置するための医薬を製造するための、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用、並びに個体における疾患の処置方法であって、当該個体に、治療有効量の、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含む、方法もまた提供される。一態様では、疾患はがん又は感染症である。特定の態様では、疾患は、癌である。癌を有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレート又は延長する方法であって、有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む方法も提供される。上の実施形態のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A-1B】図１Ａ及び１Ｂは、腫瘍抗原（ＴＡ）を標的とする４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つの融合タンパク質を含む二重特異性抗原結合分子を示す。図１Ａにおいて、腫瘍標的抗原（ＴＡ１）及び４－１ＢＢの両方に対して二価であり、２＋２フォーマットとも称する二重特異性抗原結合分子。図１Ｂでは、ＴＡ１に対して一価であり、４－１ＢＢに対して二価であり、１＋２フォーマットとも称する本発明の二重特異性抗原結合分子が示される。両方の抗原結合分子は、ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡフォーマットである。

【図2】図２Ａは、４－１ＢＢ（ＴＡ１はＦＡＰである）に特異的に結合可能な２つの融合タンパク質を含むＦＡＰ標的化二重特異性抗原結合分子の同時結合のためのＳＰＲ実験の設定を示す。図２Ｂ及び２Ｃでは、固定化されたヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰ（分析物２）への二重特異性抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（分析物１）の同時結合が示される。二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（２＋２と称する）の同時結合を図２Ｂに示す。二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（１＋２と称する）のヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰへの同時結合を図２Ｃに示す。

【図3】図３Ａは、ＨＥＲ２標的化二重特異性４－１ＢＢリポカリン（ＴＡ１はＨＥＲ２である）の同時結合のためのＳＰＲ実験の設定を示す。図３Ｂでは、固定されたヒト４－１ＢＢ及びヒトＨＥＲ２（分析物２）への二重特異性抗ＨＥＲ２、２＋２及び１＋２フォーマットの抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（分析物１）の同時結合が示される。

【図4】図４は、ヒトＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞上で発現されるＦＡＰに対するＦＡＰ標的化４－１ＢＢリポカリンの結合を示す。二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜きの下向き三角及び点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）又はその対照の濃度を、ＰＥコンジュゲート化二次検出抗体の蛍光強度の相乗平均（ｇＭＦＩ）に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２（白抜きの下向き三角及び点線）、ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２（黒三角及び線）、ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２（半分黒の円及び線－点線）又はＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ抗体（灰色の星及び線）のようなＦＡＰ結合ドメイン含有コンストラクトのみが、ＦＡＰ発現細胞に効率的に結合する。

【図5】図５は、ヒト４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２へのＦＡＰ標的化４－１ＢＢリポカリンの結合を示す。二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜きの下向き三角及び点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）又はその対照の濃度を、ＰＥコンジュゲート化二次検出抗体の蛍光強度の相乗平均（ｇＭＦＩ）に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。抗４－１ＢＢ（２０Ｈ４．９）×抗－ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１Ｈ２Ｈ（黒円及び線）は、その対照抗４－１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（灰色の星及び線）と同様に４－１ＢＢに結合する。

【図6】Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性を測定することによるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を図６Ａ～６Ｃに示す。二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜き、下向き黒三角及び点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）、又は対照分子二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２と称する、半分黒の六角形、及び線－点線）、又は単一特異性対照の機能性を試験するため、分子を、ＦＡＰ発現細胞株ＷＭ－２６６－４又はＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９の不在下又は存在下で、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２と共に種々の滴定濃度でインキュベートした。全ての分子は、架橋が起こらないため、ＦＡＰ発現細胞の不在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができなかった。ＦＡＰ発現細胞の存在下では、ＦＡＰ及び４－１ＢＢに結合する二重特異性分子のみがレポーター細胞株上のＮＦκＢ活性化をもたらす。ＦＡＰ＋細胞の不在下での結果を図６Ａに、ヒトＦＡＰ発現細胞株ＷＭ－２６６－４の存在下での結果を図６Ｂに、又はヒトＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９の存在下での結果を図６Ｃに示す。

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（図７Ｂ）又は乳腺癌細胞株ＫＰＬ４（図７Ａ）によって細胞表面上に発現されるＨＥＲ２へのＨＥＲ２標的化４－１ＢＢリポカリンの結合を示す。二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、黒色白抜きの下向き三角、点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）又はその対照の濃度を、ＰＥコンジュゲート化二次検出抗体の蛍光強度の相乗平均（ｇＭＦＩ）に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、黒色白抜き下向き三角、点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）又はＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ抗体（灰色の星印及び線）又はＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ（半分黒の六角形、黒点線）のようなＨＥＲ２結合ドメイン含有コンストラクトのみが、ＨＥＲ２発現細胞に効率的に結合する。

【図8】図８は、ヒト４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２へのＨＥＲ２標的化４－１ＢＢリポカリンの結合を示す。二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜き下向き三角及び点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）又はその対照の濃度を、ＰＥコンジュゲート化二次検出抗体の蛍光強度の相乗平均（ｇＭＦＩ）に対してブロットする。ブランク対照（例えば、一次はなく、二次のみの検出抗体）のベースライン値を差し引くことにより、全ての値をベースライン補正する。

【図9】Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性を測定することによるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を図９Ａ～９Ｄに示す。二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜き、下向き白抜き黒三角及び点線）又は二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）、又は対照分子二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２と称する、半分黒の六角形、及び点線）、又は対照の機能性を試験するため、分子を、ＨＥＲ２発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７、ＫＰＬ４又はＳＫ－Ｂｒ３の不在下又は存在下で、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２と共に種々の滴定濃度でインキュベートした。全ての分子は、架橋が起こらなかったため、ＨＥＲ２発現細胞の不在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができなかった。ＨＥＲ２発現細胞の存在下では、ＨＥＲ２及び４－１ＢＢに結合する二重特異性分子のみがレポーター細胞株上のＮＦκＢ活性化をもたらす。図９ＡにＨＥＲ２＋細胞が存在しない場合の結果、図９ＢにＨＥＲ２発現細胞株ＳＫ－Ｂｒ３の存在下での結果、図９ＣのＨＥＲ２発現細胞株ＫＰＬ４の存在下での結果、又は図９ＤにＨＥＲ２発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７の存在下での結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。

【0037】

本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。

【0038】

「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、且つ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと称する。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、足場抗原結合タンパク質、特にリポカリンムテインによって提供されてもよい。

【0039】

本明細書で使用する場合、「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」、又は「標的細胞抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、標的細胞抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。一態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実体（例えば４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテイン）を標的部位、例えば標的細胞抗原を有する特定の種類の腫瘍細胞に向けることができる。標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。さらに、標的細胞抗原に特異的に結合可能な部分は、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質を含む。抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」という用語は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0040】

本明細書中で使用する場合、「標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片」という用語は、標的細胞抗原に特異的に結合するＦａｂ分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合している実体（例えばリポカリンムテイン）を標的部位、例えば標的細胞抗原を有する特定の種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質に向けることができる。

【0041】

本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。

【0042】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる突然変異を含む、可能なバリアント抗体を除き、かかるバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。

【0043】

「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用する場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基（標的）に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は３つの抗原結合部位を含み、２つの抗原結合部位は第１の抗原決定基に特異的であり、１つは第２の抗原決定基に特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。

【0044】

「価数」という用語は、本出願で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、それぞれ、抗原結合分子中の１個の結合部位、２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を示す。

【0045】

本出願内で使用される場合、「抗原に対して一価」という用語は、抗原結合分子内の前記抗原に対する１つの結合部位のみの存在を示す。本出願内で使用される場合、「標的細胞抗原に対して一価」という用語は、抗原結合分子内の当該標的細胞抗原に対する１つの結合部位のみの存在を示す。

【0046】

「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。

【0047】

「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。

【0048】

インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用する場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）_２断片が得られる。

【0049】

「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ_{（ＶＬＶＨ）}とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ_{（ＣＬＣＨ１）}とも呼ばれる。一態様では、「Ｆａｂ断片」という用語は、クロスＦａｂ断片も含む。

【0050】

「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、Ｖ_ＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（Ｖ_ＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群より選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４^＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及び欧州特許出願公開第１６４１８１８号Ａ１を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号Ａ１を参照されたい。一本鎖ドメイン抗体は、一本のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶ_ＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来Ｖ_ＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号、及び米国特許第６８１８４１８号Ｂ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。

【0051】

リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、安定なｂバレル足場（Ｓｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００８，２７５，２６７７－２６８３）に取り付けられた４つのペプチドループから構成される、高い構造的可塑性を有する結合部位を示す、およそ１８～２０ｋＤａの重量の単量体タンパク質である。リポカリンは、したがって、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。これにより、特定の標的抗原に特異的なリポカリンムテインが産生される。「リポカリンムテイン」は、天然に存在する（野生型）リポカリンと比較して、１つ以上のアミノ酸が交換、欠失又は挿入されている変異タンパク質である。リポカリンムテインという用語には、野生型リポカリンの断片又はバリアントも含まれる。本明細書に記載のリポカリンムテインは、１６０～１８０アミノ酸のサイズである。特定の態様では、リポカリンムテインは、その超二次構造によって規定されるポリペプチド、すなわち、一端に４つのループによって対をなして連結され、それによって結合ポケットを規定する８本のβ鎖を含む円筒形βプリーツシート超二次構造領域であって、当該４つのループのうちの少なくとも３つの各々の少なくとも１個のアミノ酸が変異しており、当該リポカリンは検出可能な親和性で４－１ＢＢに結合するのに有効である。

【0052】

一態様では、本明細書に開示されるリポカリンムテインは、ヒト涙液リポカリン（ＴＬＰＣ又はＴｌｃ）由来のムテインであり、涙液プレアルブミン又はフォン・エブネル腺タンパク質とも称する。本明細書で使用する場合、「ヒト涙液リポカリン」又は「Ｔｌｃ」という用語は、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３１０２５（アイソフォーム１）を有する成熟ヒト涙液リポカリンを指す。したがって、このタイプのリポカリンムテインは、配列番号９０のアミノ酸配列に由来する。特に、本明細書に開示されるリポカリンムテインは、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアクセッション番号Ｐ８０１８８を有する成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈｕＮＧＡＬ）由来のムテインである。このタイプのリポカリンムテインは、「ｈｕＮＧＡＬムテイン」と呼ぶすることができ、配列番号１のアミノ酸配列のポリペプチドに由来する。いくつかの態様では、検出可能な親和性で４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、天然のシステイン残基の別のアミノ酸、例えばセリン残基による少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの他の態様では、検出可能な親和性で４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、野生型リポカリンの１個以上のアミノ酸を置換する１個以上の非天然システイン残基を含み得る。更なる特定の態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、システイン残基による天然アミノ酸の少なくとも２個のアミノ酸置換を含み、これにより、１個以上のシステインブリッジを形成する。いくつかの実施形態では、当該システイン架橋は、少なくとも２つのループ領域を接続し得る。関連する態様では、本開示は、４－１ＢＢに結合することによって４－１ＢＢの下流シグナル伝達経路を活性化することができる１つ以上のリポカリンムテインを教示する。

【0053】

参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。

【0054】

本明細書で使用する場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。

【0055】

「特異的結合」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。

【0056】

「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0057】

「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ以上の改変を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。

【0058】

「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えば癌細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施形態では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群より選択される。具体的には、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＨＥＲ２である。

【0059】

プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号９１）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ化したヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号９２に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号９３）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号９４は、Ｈｉｓタグ化されたマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号９５は、Ｈｉｓタグ化されたカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子が国際特許出願公開番号国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載される。

【0060】

「ＦＡＰに特異的に結合可能な」という用語は、抗原結合分子がＦＡＰを標的化する際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるような、十分な親和性でＦＡＰに結合することができる抗原結合分子を指す。抗原結合分子としては、限定されるものではないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、一本鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が挙げられる。一態様では、無関係な非ＦＡＰタンパク質への抗ＦＡＰ抗原結合分子の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、ＦＡＰへの抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特に、ＦＡＰに特異的に結合可能な抗原結合分子は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_ｄ）を有する。特定の態様では、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、異なる種に由来するＦＡＰに結合する。特に、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ及びカニクイザルＦＡＰ、又はヒトＦＡＰ、カニクイザルＦＡＰ及びマウスＦＡＰに結合する。

【0061】

癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号９６）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７－２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する（Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，９（２－３）：１４５－５３，１９８８；Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２（８）：２３２９－２３３３９，１９９２）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、癌性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。健常な組織において、ＣＥＡは一般的に、細胞の先端面にて発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒoｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））、血流にて抗体に接近できなくなる。健常な組織とは対照的に、ＣＥＡは、癌性細胞の全面にわたって発現する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒoｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、癌性細胞内で抗体結合をしやすくなる。さらに、ＣＥＡの発現は、癌性細胞にて増加する。さらに、ＣＥＡの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｊ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，３０（ａ Ｓｕｐｐｌ．８）：３０－６，２００３）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公開されたデータに一致して、組織サンプルにて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌（ＣＲＣ）において約９５％、膵癌において９０％、胃癌において８０％、非小細胞肺癌（ＨＥＲ３と同時発現するＮＳＣＬＣ）において６０％、及び乳癌において４０％であり、小細胞肺癌及びグリア芽腫においては低い発現が確認された。

【0062】

ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から、直接又はリンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡの濃度は、癌診断のための臨床マーカー、及び癌、特に結腸直腸癌の再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｄ Ｍ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ，７：１８３－１８８，１９９２；Ｃｈａｕ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２２：１４２０－１４２９，２００４；Ｆｌａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２（２３）：６９８５－６９８８，２００６）。

【0063】

コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている、「黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号９７）に示されている。原型癌遺伝子ｃ－ＥｒｂＢ－１又は受容体チロシン－プロテインキナーゼＥｒｂＢ－１という名もある、「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＥＧＦＲを意味する。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号９８）に示されている。

【0064】

「ＣＤ１９」という用語は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号９９）に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトＣＤ１９、並びに本明細書に掲載する抗体がそれに結合する限り、細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のヒトＣＤ１９を包含する。ＣＤ１９は、限定されるものではないが、プレＢ細胞、初期発生のＢ細胞｛すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を通した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含む、ヒトＢ細胞の表面上に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上のＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫等の分化Ｂ細胞腫瘍上に発現され得ることを更に示唆する。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の処置における免疫療法の標的である。

【0065】

「ＣＤ２０」とは、膜貫通４ドメインサブファミリーＡメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、又は白血球表面抗原Ｌｅｕ－１６としても知られている、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０を意味し、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号１００）に示されている。「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても公知の骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号１０１）に示されている。

【0066】

「ＨＥＲ２」という用語は、「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」又は「ｃ－Ｅｒｂ－Ｂ２」としても知られ、細胞内でのＨＥＲ２前駆体タンパク質のプロセシングから生じる任意の天然の成熟ＨＥＲ２を指す。この用語には、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来のＨＥＲ２が含まれる。この用語はまた、ＨＥＲ２の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０２に示す。

【0067】

「ＨＥＲ２に特異的に結合可能な」という用語は、抗原結合分子がＨＥＲ２を標的化する際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるような、十分な親和性でＨＥＲ２に結合することができる抗原結合分子を指す。抗原結合分子としては、限定されるものではないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、一本鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が挙げられる。一態様では、無関係な非ＨＥＲ２タンパク質への抗ＨＥＲ２抗原結合分子の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、ＨＥＲ２への抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特に、ＨＥＲ２に特異的に結合可能な抗原結合分子は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_ｄ）を有する。特定の態様では、抗ＨＥＲ２抗原結合分子は、異なる種に由来するＨＥＲ２に結合する。特に、抗ＨＥＲ２抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＨＥＲ２に結合する。

【0068】

「エピトープ」という用語は、抗［［ＰＲＯ］］抗体が結合する相手である、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。エピトープは、隣接するアミノ酸ストレッチ（線状エピトープ）から形成すること、又は非隣接アミノ酸（立体構造エピトープ）、例えば、抗原の折り畳みにより、すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって空間的に近位になる非隣接アミノ酸を含むことができる。線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されているが、コンフォメーションエピトープは、典型的には、変性剤での処理により破壊される。エピトープは、独特の空間的構造で、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は８～１０個アミノ酸を含む。

【0069】

「エピトープ４Ｄ５」又は「４Ｄ５エピトープ」又は「４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接し、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるもの等のルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。或いは、エピトープマッピングを行い、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（ヒトＨＥＲ２（配列番号１０２）を含む、約５５０残基～約６１０残基に由来する領域内の任意の１つ以上の残基）に結合するかどうかを評定することができる。

【0070】

「エピトープ２Ｃ４」又は「２Ｃ４エピトープ」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるもの等のルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。或いは、エピトープマッピングを行い、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４抗体及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎら「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ」５：３１７～３２８頁（２００４年））。

【0071】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。

【0072】

本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）のそれぞれを意味する。
一般に、抗体は、６つのＣＤＲ：ＶＨに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、及びＶＬに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。

【0073】

特に断りのない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。

【0074】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。

【0075】

「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

【0076】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一態様では、ＶＬの場合、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記載されるように、サブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨの場合、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記載されるように、サブグループカッパＩＩＩである。

【0077】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。

【0078】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に更に分けることができる。特定の態様では、抗体はＩｇＧ_１アイソタイプである。特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ_１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ_２アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ_４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ_４アイソタイプのものである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、σ、ε、γ、及びμと呼ばれる。αδεγμ抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。

【0079】

本出願で使用される「ヒト由来の定常領域」又は「ヒト定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域、及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を示す。かかる定常領域は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８も参照されたい）。本明細書で特に明記されない限り、定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

【0080】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。

【0081】

「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。

【0082】

「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよい、又は完全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリシン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリシン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよい、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断りのない場合には、Ｃ末端のグリシン－リシンジペプチドを含まずに本明細書で示される。一実施形態では、本発明の抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端のグリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。一実施形態では、本発明の抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端のグリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸位置２３１のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸位置３４０のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその位置３４１のアミノ酸残基から、おおよその位置４４７のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照されたい）。かかるバリアントＣＨ３ドメインを使用し、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。

【0083】

「野生型Ｆｃドメイン」という用語は、自然界で見出されるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトＦｃドメインとしては、天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及び天然ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、並びにその天然バリアントが挙げられる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号１２２（ＩｇＧ１、白人型アロタイプ）、配列番号１２３（ＩｇＧ１、アフロアメリカンアロタイプ）、配列番号１２４（ＩｇＧ２）、配列番号１２５（ＩｇＧ３）及び配列番号１２６（ＩｇＧ４）に示される。

【0084】

「バリアント（ヒト）Ｆｃドメイン」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」によって「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、バリアントＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば約１～約１０個のアミノ酸変異、一態様では天然Ｆｃ領域中に約１～約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（バリアント）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。

【0085】

「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、米国特許第７，６９５，９３６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作成することができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。ナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１のＥＵインデックスに従う。

【0086】

「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアント及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。かかるバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照されたい）。

【0087】

「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。

【0088】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による連結の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，ｖｅｒｓｉｏｎ １４１を参照されたい）。

【0089】

「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」、又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は現在、２７種類の受容体で構成されている。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーは、細胞外のシステインリッチなドメイン（ＣＲＤ）を介して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらのシュードリピートは、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成された鎖内ジスルフィドによって定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは原型のＴＮＦ－αと相同である。これらの活性形態において、ＴＮＦ受容体の大多数は、血漿膜内で三量体の複合体を形成する。したがって、大部分の受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有している。これらの受容体のいくつかは、リガンド結合の後にカスパーゼ相互作用タンパク質を動員して、カスパーゼ活性化の外因性経路を開始する細胞内死ドメイン（ＤＤ）もまた含有している。死ドメインを欠く、他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化をもたらすことが可能な細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体は、アポトーシスを開始することもできるが、アポトーシスは間接的な機構を介して行う。アポトーシスの制御に加えて、いくつかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞のホメオスタシス及び活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、並びにＴ細胞の同時刺激等の免疫細胞の機能の制御に関与している。いくつかの他のものは、毛嚢の成長及び破骨細胞の成長等の、細胞種に特異的な応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーとしては、以下が挙げられる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンフォトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ－１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ－１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ－２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテゲリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経増殖因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７、糖質コルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ－３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ－１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。

【0090】

腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、最初のＴ細胞の活性化の後で機能し、Ｔ細胞応答を維持する。「同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」、又は「同時刺激性ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを意味し、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生を同時に刺激することができる。この用語は、本明細書で用いる場合、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施形態では、同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０、及びＧＩＴＲからなる群より選択され、これらは全て、Ｔ細胞上で同時刺激効果を有することができる。より具体的には、同時刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、４－１ＢＢである。

【0091】

本明細書で使用する場合、「４－１ＢＢ」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然４－１ＢＢを指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていない４－１ＢＢ、及び細胞におけるプロセシングから生じる４－１ＢＢの任意の形態を包含する。この用語は、４－１ＢＢの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号１０３（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｑ０７０１１）に示され、例示的なマウス４－１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号１０４（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ２０３３４）に示され、例示的な（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａからの）カニクイザル４－１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号１０５（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。

【0092】

「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に１～１０、典型的には１～４、特に２の数であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７７）、（Ｇ_４Ｓ）_３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）_２（配列番号７９）、及び（Ｇ_４Ｓ）_４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８２）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号８３），ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号８４）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号８５）、ＧＧＳＧ（配列番号８６）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号８７）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号８８）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号８９）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７６）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号７８）及び（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号８０）、より詳しくは（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号７８）である。更なるペプチドリンカーは、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１からなる群より選択される。

【0093】

本出願内で使用される場合「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。

【0094】

本明細書で使用する場合、「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、抗体断片及び抗体に由来しないペプチドで構成される一本鎖ポリペプチドを指す。一態様では、融合ポリペプチドは、抗体のＦｃ領域にペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーを介して連結されたリポカリンムテインから構成される。融合は、リポカリンムテインのＮ又はＣ末端アミノ酸を、ペプチドリンカーを介して重鎖のＣ又はＮ末端アミノ酸に直接連結することによって起こり得る。

【0095】

「融合した」、又は「連結された」とは、構成成分（例えば、ポリペプチド及び当該ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により連結されていることを意味する。

【0096】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率であると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。或いは、同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、且つ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。

【0097】

しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），’’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ’’，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）’’Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’’Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６にって認定され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．
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から公的に利用可能である。或いは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。

【0098】

「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られたバリアント（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に作成されてもよい。簡潔には、１つ以上のＣＤＲ残基は、突然変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、かかる変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＣＤＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保守的な改変（例えば、本明細書で提供されるような保守的な置換）は、ＣＤＲにおいて行われてもよい。突然変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する、二重特異性抗原結合分子が挙げられる。

【0099】

ある特定の態様では、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化バリアントを便利に入手することができる。二重特異性抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸等の種々の炭水化物を含んでいてもよく、二分岐オリゴ糖構造の「幹」にあるＧｌｃＮＡｃに接続するフコースを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、特定の改良された特性を有するバリアントを作成するために、二重特異性抗原結合分子中のオリゴ糖修飾が行われてもよい。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）接続するフコースを欠いた炭水化物構造を有する二重特異性抗原結合分子のバリアントが提供される。かかるフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明の二重特異性抗原結合分子の更なるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。かかるバリアントは、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。かかる抗体バリアントは、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載される。

【0100】

特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作されたバリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定的な実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分）に対して抱合させ、免疫抱合体を作成してもよい。特定の実施形態では、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作成されてもよい。

【0101】

特定の態様では、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子は、当該分野で公知であり、容易に利用可能である更なる非タンパク質性部分を含有するように更に修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、さまざまであってもよく、１つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で使用されるか等を含む限定事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。

【0102】

別の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗原結合分子の免疫コンジュゲートを得ることができる。「免疫抱合体」は、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含め、１つ以上の異種分子（複数可）に抱合される抗体である。

【0103】

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。それぞれのヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。かかるＤＮＡベクター（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡベクター（例えば、ｍＲＮＡ）は、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために被験体にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい。）

【0104】

「単離」核酸とは、核酸分子が自然環境の構成要素から分離されたものを指す。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。

【0105】

「二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター内の核酸分子（複数可）を含む、二重特異性抗原結合分子の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。

【0106】

「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

【0107】

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるＤＮＡ分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。

【0108】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、かかる細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する突然変異型の後代が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。

【0109】

ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。

【0110】

ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。

【0111】

「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は被験体は、ヒトである。

【0112】

「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、製剤が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。

【0113】

「薬学的に許容可能な賦形剤」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、被験体にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。

【0114】

「パッケージ添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、かかる治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。

【0115】

本明細書で使用する場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。

【0116】

本明細書で使用する場合、「癌」という用語は、リンパ腫、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵臓癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａｓ）、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａｓ）、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞癌（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、上記の癌のいずれかの難治性バージョンを含む、又は上記の癌の１つ以上の組み合わせ等の増殖性疾患を指す。

【0117】

「ＨＥＲ２陽性」癌は、正常レベルよりも高いＨＥＲ２を有する癌細胞を含む。ＨＥＲ２陽性癌の例としては、ＨＥＲ２陽性乳癌及びＨＥＲ２陽性胃癌が挙げられる。必要に応じて、ＨＥＲ２陽性癌は、２＋若しくは３＋の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）スコア、及び／又は＞２．０のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅率を有する。

【0118】

「早期ステージ乳癌（ＥＢＣ）」又は「早期乳癌」という用語は、本明細書では、乳房又は腋窩リンパ節を越えて広がっていない乳癌を指すために使用される。これには、非浸潤性乳管癌並びにＩ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期及びＩＩＩＡ期の乳癌が含まれる。

【0119】

「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」としての腫瘍又は癌、及びこの分類内の様々なサブステージへの言及は、当該技術分野で公知の全ステージ分類又はローマ数字病期分類法を使用した腫瘍又は癌の分類を示す。癌の実際の病期は癌の種類に依存するが、一般に、０期癌は非浸潤性（ｉｎ ｓｉｔｕ）病変であり、Ｉ期癌は小さな限局性腫瘍であり、ＩＩ期及びＩＩＩ期癌は局所リンパ節の関与を示す局所進行性腫瘍であり、ＩＶ期癌は転移性癌を表す。腫瘍のそれぞれの種類について特異的な病期は、熟練臨床医には既知である。

【0120】

「転移性乳癌」という用語は、癌細胞が元の部位から体内の他の場所の１つ以上の部位に血管又はリンパ管によって伝達されて、乳房以外の１つ以上の器官に１つ以上の二次腫瘍を形成する乳癌の状態を意味する。

【0121】

「進行」癌とは、元の部位又は器官の外に、局所浸潤又は転移のいずれかによって広がった癌である。したがって、「進行した」癌という用語は、局所進行性疾患及び転移性疾患の両方を含む。

【0122】

「再発」癌は、手術等の初期療法への応答後に、初期部位又は遠位部位のいずれかにおいて再成長したものである。「局所的再発」癌は、処置後に以前に処置された癌と同じ場所で再発する癌である。「手術可能な」又は「切除可能な」癌は、原発器官に限定され、手術（切除）に適した癌である。「切除不能な（ｎｏｎ－ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」又は「切除不能な（ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」癌は、手術によって除去（切除）されることができない。

【0123】

本発明の二重特異性抗原結合分子
本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な新規二重特異性抗原結合分子であって、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含み、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、毒性の低下及び免疫性の低下等の特に有利な特性を有する、新規二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0124】

本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＣ末端にそれぞれ融合されている、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含む。二重特異性抗原結合分子の幾何学、特に４－１ＢＢの２つの異なる結合部位と標的細胞抗原との間の距離は、共刺激ＴＮＦ受容体、すなわち４－１ＢＢの最適な腫瘍局在化活性化に重要である（Ｍ．Ｒｏｔｈｅ ａｎｄ Ａ．Ｓｋｅｒｒｒａ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１８，３２，２３３－２４３。ここで、標的細胞抗原に対する抗原結合ドメインが分子中に１つしか存在しない場合、印象的により良好な活性化が得られ得ることも見出された。腫瘍－標的結合対エフェクター細胞－標的結合の１：２のより低い比、例えば標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン対４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの１：２の比は、腫瘍細胞上のより高密度の占有をもたらし、したがってエフェクター細胞上の４－１ＢＢアゴニストの高密度の架橋をもたらし、最終的にはより強い４－１ＢＢ受容体下流シグナル伝達をもたらす。

【0125】

第１の態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン、特に標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0126】

更なる態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン、特にＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含み、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインのそれぞれが、配列番号１の成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈｕＮＧＡＬ）に由来する、二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0127】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの各々が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列を含み、以下のアミノ酸の１つ以上が下記のように変異している、上記で定義した二重特異性抗原結合分子を提供する：
（ａ）２０位のＱがＲに置き換えられ、又は
（ｂ）２５位のＮがＹ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｃ）２８位のＨがＱに置き換えられ、又は
（ｄ）３６位のＱがＭに置き換えられ、又は
（ｅ）４０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｆ）４１位のＲがＬ若しくはＫに置き換えられ、又は
（ｇ）４４位のＥがＶ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｈ）４６位のＫがＳに置き換えられ、且つ４７位～４９位のアミノ酸が欠失され、又は
（ｉ）４９位のＩがＨ、Ｎ、Ｖ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｊ）５２位のＭがＳ若しくはＧに置き換えられ、又は
（ｋ）５９位のＫがＮに置き換えられ、又は
（ｌ）６５位のＤがＮに置き換えられ、又は
（ｍ）６８位のＭがＤ、Ｇ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｎ）７０位のＫがＭ、Ｔ、Ａ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｏ）７１位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｐ）７２位のＤがＬに置き換えられ、又は
（ｑ）７７位のＭがＱ、Ｈ、Ｔ、Ｒ若しくはＮに置き換えられ、又は
（ｓ）７９位のＤがＩ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｔ）８０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｕ）８１位のＷがＱ、Ｓ若しくはＭに置き換えられ、又は
（ｖ）８２位のＴがＰに置き換えられ、又は
（ｗ）８３位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｙ）９２位のＦがＬ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｚ）９４位のＬがＦに置き換えられ、又は
（ｚａ）９６位のＫがＦに置き換えられ、又は
（ｚｂ）１００位のＦがＤに置き換えられ、又は
（ｚｃ）１０１位のＰがＬに置き換えられ、又は
（ｚｄ）１０３位のＨがＰに置き換えられ、又は
（ｚｅ）１０６位のＳがＹに置き換えられ、又は
（ｚｆ）１２２位のＦがＹに置き換えられ、又は
（ｚｇ）１２５位のＦがＳに置き換えられ、又は
（ｚｈ）１２７位のＦがＩに置き換えられ、又は
（ｚｉ）１３２位のＥがＷに置き換えられ、又は
（ｚｊ）１３４位のＹがＧに置き換えられる。

【0128】

一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、４～１０個のアミノ酸が上記で定義されるように変異している。いくつかの態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、以下の１つ以上のアミノ酸変異を含む：
（ｄ）３６位のＱがＭに置き換えられ、又は
（ｅ）４０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｆ）４１位のＲがＬ若しくはＫに置き換えられ、又は
（ｉ）４９位のＩがＨ、Ｎ、Ｖ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｊ）５２位のＭがＳ若しくはＧに置き換えられ、又は
（ｍ）６８位のＭがＤ、Ｇ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｎ）７０位のＫがＭ、Ｔ、Ａ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｐ）７２位のＤがＬに置き換えられ、又は
（ｑ）７７位のＭがＱ、Ｈ、Ｔ、Ｒ若しくはＮに置き換えられ、又は
（ｓ）７９位のＤがＩ若しくはＡに置き換えられ、又は
（ｕ）８１位のＷがＱ、Ｓ若しくはＭに置き換えられ、又は
（ｚａ）９６位のＫがＦに置き換えられ、又は
（ｚｂ）１００位のＦがＤに置き換えられ、又は
（ｚｄ）１０３位のＨがＰに置き換えられ、又は
（ｚｇ）１２５位のＦがＳに置き換えられ、又は
（ｚｈ）１２７位のＦがＩに置き換えられ、又は
（ｚｉ）１３２位のＥがＷに置き換えられ、又は
（ｚｊ）１３４位のＹがＧに置き換えられる。

【0129】

別の態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインは、以下の１つ以上のアミノ酸変異を含む：
（ａ）２０位のＱがＲに置き換えられ、又は
（ｂ）２５位のＮがＹ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｇ）４４位のＥがＶ若しくはＤに置き換えられ、又は
（ｋ）５９位のＫがＮに置き換えられ、又は
（ｏ）７１位のＦがＬに置き換えられ、又は
（ｔ）８０位のＩがＮに置き換えられ、又は
（ｖ）８２位のＴがＰに置き換えられ、又は
（ｙ）９２位のＦがＬ若しくはＳに置き換えられ、又は
（ｚｃ）１０１位のＰがＬに置き換えられ、又は
（ｚｆ）１２２位のＦがＹに置き換えられる。

【0130】

一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。更なる態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインの各々は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一態様では、両方のリポカリンムテインが同一のアミノ酸配列を含む。

【0131】

更なる態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含み、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインのそれぞれが、配列番号９０のヒト涙液リポカリン（Ｔｌｃ）に由来する、二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0132】

一態様では、４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインはそれぞれ、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0133】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子であって、一方のリポカリンムテインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、他方のリポカリンムテインがペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、及び配列番号１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。別の態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特に、ペプチドリンカーは、配列番号７８、すなわち（Ｇ_４Ｓ）_３のアミノ酸配列を有する。

【0134】

更なる態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より詳しくは、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。

【0135】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合した、標的細胞抗原に特異的に結合可能な１つのＦａｂ断片と、４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインとを含み、一方のリポカリンムテインはＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合し、他方はＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合している。したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットをそれぞれ含む２本の同一でないポリペプチド鎖（「重鎖」）と、軽鎖とを含む。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２本の同一でない重鎖のいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。

【0136】

したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、当該修飾は、特にＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。

【0137】

具体的な態様では、当該修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む本明細書で上記の二重特異性抗原結合分子に関し、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分はＩｇＧ分子の２本の重鎖のヘテロ二量体化を可能にする第２の二量体化モジュールを含み、ノブ・イントゥ・ホール技術に従って、第１の二量体化モジュールはノブを含み、第２の二量体化モジュールはホールを含む。

【0138】

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。

【0139】

したがって、特定の態様では、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。

【0140】

突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作成することができる。

【0141】

具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。より詳しくは、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。より詳しくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらす。ジスルフィド架橋は、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0142】

代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾

【0143】

本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。

【0144】

Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかしながら、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。

【0145】

特定の態様では、１つ以上のアミノ酸修飾は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。

【0146】

特定の態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、一方のリポカリンムテインがＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方のリポカリンムテインがＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0147】

一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸突然変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む、本発明による三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ突然変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、かかる突然変異型Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能等のその特性を決定する方法も記載している国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載される。「ＥＵナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１のＥＵインデックスに従うナンバリングを指す。

【0148】

特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む第１のサブユニット及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含む第２のサブユニットを含む。

【0149】

Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃドメインの残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有する抗体も挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0150】

別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下と、エフェクター機能の低下を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。かかるＩｇＧ４ Ｆｃドメインバリアント及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。

【0151】

突然変異型Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。

【0152】

Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なかかる結合アッセイを本明細書に記載する。或いは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。

【0153】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．マウンテンビュー、カリフォルニア州）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州））。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。

【0154】

いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクター機能を有するように操作されるいくつかの実施形態では、当該低減されたエフェクター機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。

【0155】

特定の二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0156】

一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。

【0157】

一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む。

【0158】

一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片であって、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）及び配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む、Ｆａｂ断片が提供される。

【0159】

一態様では、配列番号２７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）を含む、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片が提供される。一態様では、配列番号２７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＦＡＰ）、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＦＡＰ）のアミノ酸配列を含む、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合可能なＦａｂ断片。

【0160】

一態様では、本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子は、配列番号３７の第１の重鎖と、配列番号３８の第２の重鎖と、配列番号３９の軽鎖とを含む。

【0161】

別の態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片と、
（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインであって、リポカリンムテインの一方がＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方がＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されているリポカリンムテインと、を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0162】

一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、
（ａ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む。

【0163】

一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、（ａ）（ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。

【0164】

一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片であって、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は
（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は
（ｃ）配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）及び配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、を含むＨＥＲ２への特異的結合能を有するＦａｂ断片が提供される。

【0165】

一態様では、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）、又は配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片が提供される。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）とを含む。一態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合可能なＦａｂ断片は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_ＨＨＥＲ２）と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_ＬＨＥＲ２）とを含む。

【0166】

一態様では、本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子は、配列番号６４の第１の重鎖と、配列番号６５の第２の重鎖と、配列番号６６の軽鎖とを含む。
ポリヌクレオチド

【0167】

本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードする単離核酸を提供する。

【0168】

本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。

【0169】

いくつかの態様では、単離核酸は、本明細書中に記載される本発明による二重特異性抗原結合分子全体をコードする。特に、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。

【0170】

一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸であって、核酸分子が、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインをコードする配列、（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをコードする配列、並びに（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能なリポカリンムテインをコードする配列を含む、単離核酸に関する。

【0171】

別の態様では、二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合可能なＦａｂ断片、（ｂ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、並びに（ｃ）４－１ＢＢに特異的に結合可能な２つのリポカリンムテインをコードする配列を含み、一方のリポカリンムテインがＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合され、他方のリポカリンムテインがＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0172】

特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。

【0173】

組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。かかるポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルに従い、二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。

【0174】

適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。

【0175】

本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。

【0176】

後での精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にする、又は融合タンパク質の標識を補助するために使用可能な、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの中に、又はその末端に含めることができる。

【0177】

本発明の更なる態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。かかる細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。

【0178】

（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。

【0179】

一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を製造する方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を発現するのに好適な条件下にて、本明細書において提供するように、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む、方法を提供する。

【0180】

本発明の二重特異性抗原結合分子において、構成要素（標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの部分であって、Ｆｃドメインのサブユニット及びリポカリンムテインを含むポリペプチド）は遺伝的に互いに融合していない。ポリペプチドは、その成分が直接又はリンカー配列を介して互いに融合されるように設計される。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。本発明の抗原結合分子の異なる構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書中に提供される配列中に見出される。また、望ましい場合、更なる配列が、開裂部位を組み込み、融合タンパク質の個々の構成要素を分離するために含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。

【0181】

特定の実施形態では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えば、Ｆａｂ断片）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、少なくとも抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）。

【0182】

免疫グロブリンの任意の動物種を本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）に更に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で知られている様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得て、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を呈する。

【0183】

特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原（例えば、Ｆａｂ断片）に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公報国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、高められた結合親和性を有するように操作される。本発明の抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施形態では、かかる競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子により結合されるのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）’’Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，’’ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原に結合するために第１の抗原結合分子と競合する能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む、溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化された抗原に関連する標識の量を測定する。固定化された抗原に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗原結合分子が抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

【0184】

本明細書に記載されるように調製される本発明の二重特異性抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現する二重特異性抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。

【0185】

アッセイ
本明細書において提供する抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。生物学的活性には、例えば、種々の免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を増強する能力が含まれ得る。例えば、それらは免疫調節性サイトカインの分泌を増強する。増強されているか又は増強され得る他の免疫調節サイトカインは、例えばＩＬ２、グランザイムＢ等である。生物学的活性には、カニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞型への結合も含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでかかる生物学的活性を有する抗原結合分子も提供される。

【0186】

１．親和性アッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対する親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るもの等の受容体又は標的タンパク質を使用して、実施例に記載の方法に従って決定することができる。４－１ＢＢに対する親和性を決定するための特定の条件は、国際公開第２０１８／０８７１０８号にも記載されている。標的細胞抗原（ＦＡＰ又はＨＥＲ２）に対する二重特異性抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な計装、及び例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例１．２又は２．２に記載される。一態様によれば、Ｋ_Ｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0187】

２．結合アッセイ及び他のアッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、４－１ＢＢを発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を結合アッセイに使用することができる。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（４－１ＢＢを発現する）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子の４－１ＢＢ発現細胞への結合を実証することができる。

【0188】

更なる態様では、標的細胞抗原を発現する癌細胞株、例えばＦＡＰ又はＨＥＲ２を使用して、抗原結合分子の、標的細胞抗原への結合を実証した。

【0189】

別の態様では、競合アッセイを使用して、それぞれＦＡＰ、ＨＥＲ２又は４－１ＢＢへの結合について特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の態様では、かかる競合する抗原結合分子は、特異的な抗ＦＡＰ抗体、抗ＨＥＲ２抗体又は特異的な４－１ＢＢ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）’’Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，’’ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。

【0190】

３．活性アッセイ
一態様では、ＦＡＰ又はＨＥＲ２及び生物学的活性を有する４－１ＢＢに結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、ＦＡＰ又はＨＥＲ２を発現する癌が細胞における４－１ＢＢを介したアゴニストシグナル伝達が含み得る。アッセイにより、かかるｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を有すると識別される二重特異性抗原結合分子もまた、提供される。

【0191】

特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のかかる生物活性を試験する。本発明の分子の生物学的活性を検出するためのアッセイは、実施例３．３及び４．３に記載されているものである。さらに、（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）細胞溶解、（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）誘発されたアポトーシス動態、又は（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いた）アポトーシスを検出するアッセイが、当該技術分野において周知である。さらに、かかる複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、若しくはγδＴ細胞等の、様々なリンパ球サブセットの生残、増殖、及びリンホカイン分泌におけるこれらの効果を評価することにより、又は表現型を制御する能力、及び樹状細胞、単球／マクロファージ、若しくはＢ細胞等の抗原提示細胞の機能を評定することにより評定することができる。

【0192】

医薬組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に提示されるいずれかの二重特異性抗原結合分子及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び例えば後述する少なくとも１種の追加の治療薬剤を含む。

【0193】

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤に溶解又は分散した、治療有効量の１種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能な」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子、及び必要に応じて追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示に照らして当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0194】

非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の二重特異性抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。或いは、融合タンパク質は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。必要に応じて、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。

【0195】

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。

【0196】

本発明の例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを含む。上述した組成物に加えて、二重特異性抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。かかる長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。それゆえに、例えば融合タンパク質は、好適なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容され得るオイルの乳剤エマルションとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えば、低溶解性の塩等の難溶性誘導体として製剤化してよい。

【0197】

本発明の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。

【0198】

二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第２鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0199】

本明細書に記載の組成物は、処置される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。

【0200】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌である。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。

【0201】

治療方法及び組成物
本明細書で提供される４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子はいずれも、治療方法に使用され得る。

【0202】

治療方法で使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子を、良好な医事に一致する様式で製剤化、用量化、及び投与することができる。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。

【0203】

一態様では、医薬として使用するための、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の処置に使用するための、特にがん又は感染症の処置に使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、処置方法で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、疾患の処置を必要とする個体における、疾患の処置で使用するための、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、疾患を有する個体の処置方法であって、治療有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む方法で使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。

【0204】

特定の態様では、処置される疾患は癌である。本発明による「癌」という用語はまた、癌転移も含む。「転移」とは、その元の部位から身体の別の部分への癌細胞の広がりを意味する。腫瘍転移は、腫瘍細胞又は成分が残存し、転移能を発現し得るので、原発腫瘍の除去後でさえもしばしば起こる。一態様では、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子は、固形腫瘍の処置に使用するためのものである。固形腫瘍の代表例としては、結腸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、肝臓癌、骨癌、卵巣癌、膵臓癌、脳癌、頭頸部癌及びリンパ腫が挙げられる。したがって、固形腫瘍の処置における使用のための本明細書に記載される、４－１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子が提供される。

【0205】

特定の態様では、処置される疾患はＨＥＲ２陽性癌である。ＨＥＲ２陽性癌の例としては、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。したがって、これらの癌の処置に使用するための、本明細書に記載の４－１ＢＢへの二価結合及びＨＥＲ２への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子が提供される。処置が必要な被験体、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。

【0206】

別の態様では、感染症の処置、特にウイルス感染症の処置に使用するための、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子が提供される。「感染症」という用語は、個体から個体に、又は生物から生物に伝播することができ、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患を指す。更なる態様では、自己免疫疾患（例えば、狼瘡疾患等）の処置において使用するための本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、処置される感染症は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、ＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス１型）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）又はＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）のような慢性ウイルス感染である。

【0207】

更なる態様では、本発明は、４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子の、それを必要とする個体における疾患の処置のための医薬の製造又は調製における使用に関する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む疾患の処置方法で使用するためのものである。特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害、特に癌である。したがって、一態様では、本発明は、癌を処置するための医薬の製造又は調製における本発明の二重特異性結合分子の使用に関する。一態様では、固形腫瘍を処置するための医薬の製造又は調製における本発明の二重特異性結合分子の使用が提供される。一態様では、ＨＥＲ２陽性癌を処置するための医薬品の製造又は調製における本発明の二重特異性結合分子の使用が提供される。ＨＥＲ２陽性癌の例としては、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。特定の態様では、処置される癌は、ＨＥＲ２陽性乳癌、特にＨＥＲ２陽性転移性乳癌である。当業者であれば、いくつかの場合、二重特異性抗原結合分子は、硬化を提供し得ないが、部分的な利益しか提供し得ないことを認識し得る。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす二重特異性抗原結合分子の量を、「有効量」、又は「治療有効量」とみなす。

【0208】

特定の態様では、感染症を処置するための医薬品の製造又は調製における本発明の二重特異性結合分子の使用が提供される。一態様では、感染症は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、ＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス１型）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）又はＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）のような慢性ウイルス感染である。

【0209】

更なる態様では、本発明は、個体における疾患の処置方法であって、４－１ＢＢへの二価結合及び本発明の標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子の治療有効量を当該個体に投与することを含む方法を提供する。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物が上記個体に投与される。特定の態様では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の態様では、疾患は癌である。一態様では、処置される疾患は感染症である。特定の態様では、方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、処置される疾患が癌である場合、抗癌剤）を投与することを含む。特定の態様では、方法は、治療有効量の細胞傷害剤又は別の免疫療法を個体に更に投与することを含む。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。

【0210】

疾患の予防又は処置のために、本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な投与量（単独で又は１つ以上の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、抗原結合分子のタイプ、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗原結合分子が予防目的又は治療目的のために投与されるかどうか、以前の又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度、個々の被験体に適切な用量を決定する。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。二重特異性抗原結合分子は、一度に、又は一連の処置にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回又は複数回の個別投与、又は連続点滴にかかわらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、投薬量はまた、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１回又は複数回の用量を患者に投与してもよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の二重特異性抗原結合分子を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

【0211】

本発明の二重特異性抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患症状を処置又は予防するのに使用するため、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はその医薬組成物は、治療有効量で投与される、又は適用される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。全身投与の場合、治療有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ_５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。かかる情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。初期投薬量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。投与量及び感覚を個別に調節して、治療効果を維持するのに十分な、二重特異性抗原結合分子の血漿濃度を提供することができる。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定することができる。局所投与又は選択的取り込みの場合、二重特異性抗原結合分子の有効局所濃度は血漿濃度に関連しないことがある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。

【0212】

本明細書で記載される、二重特異性抗原結合分子の治療に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を決定する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態等の種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい）を考慮して個々の医師が選択することができる。本発明の融合タンパク質で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全等に起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をもっと高レベルにするように調整することも知っているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、処置される状態の重篤度、投与経路等に伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。

【0213】

他の薬剤及び処置
本発明の４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子は、治療において１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。「治療剤」という用語は、かかる処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。かかる更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の態様では、追加の治療剤は、細胞傷害性の化学療法剤又は抗血管新生剤等の別の抗癌剤である。

【0214】

一態様では、本発明の４－１ＢＢへの二価結合及び標的細胞抗原への一価結合が可能な二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与され得る。特に、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より特定的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブである。

【0215】

かかる他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のかかる他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。二重特異性抗原結合分子は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0216】

上記のかかる併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の二重特異性抗原結合分子の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。

【0217】

製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。

【0218】

ラベル又はパッケージ添付文書は、その組成物が、選択した条件を処置するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の４－１ＢＢ三量体含有抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞傷害性の又は別の治療薬を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を処置するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。

【0219】

これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
表Ｂ（配列）：

【0220】

ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。

【実施例】

【0221】

以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。

【0222】

組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２。

【0223】

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。

【0224】

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同体の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。

【0225】

細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。

【0226】

タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０分子量カットオフ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、凍結させ、－２０℃又は－８０℃で保存した。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又は質量分析による、後続のタンパク質分析及び分析による特性決定のために、サンプルの一部を提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

【0227】

ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。

【0228】

分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。

【0229】

実施例１
４－１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価／二価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特性評価
１．１ ４－１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価又は二価結合を有する二重特異性 抗体の作製
４－１ＢＢに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価又は二価を有する二重特異的アゴニスト４－１ＢＢ抗体を、図１Ａ及び１Ｂに記載されるように調製した。ＦＡＰ結合剤（参照によって本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されるようなクローン４Ｂ９、作製及び調製）及び４－１ＢＢ結合剤（国際公開第２０１６／１７７８０２号に記載のアンチカリン、作製及び調製）を使用して、図１Ａ及び図１Ｂに記載される分子を調製し、ＴＡ１はＦＡＰであった。国際特許出願公開番号国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、重鎖のＦｃ定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。

【0230】

ＦＡＰ（４Ｂ９）バインダーをコードする重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとインフレームでサブクローニングした。

【0231】

ＦＡＰへの二価結合を有するコンストラクトを以下のようにクローニングした：各ＶＨ（ＦＡＰ）－Ｆｃ（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリンを含む２つの重鎖及びＶＬ（ＦＡＰ）－Ｃカッパを含む２つの軽鎖。二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡに関するアミノ酸配列を表１に見出すことができる。

【0232】

ＦＡＰへの一価結合を有するコンストラクトを以下のようにクローニングした：ＶＨ（ＦＡＰ）－Ｆｃノブ（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリンを含む１本の重鎖、１本の重鎖Ｆｃホール（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリン、及びＶＬ（ＦＡＰ）－Ｃカッパを含む１本の軽鎖。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含むＦｃノブ重鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール重鎖と、抗ＦＡＰ軽鎖とを組み合わせることにより、２つの４－１ＢＢ結合リポカリンを含むヘテロ二量体の生成が可能になった。二重特異性一価の２＋１抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡに関するアミノ酸配列を表２に見出すことができる。
表１：成熟二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子のアミノ酸配列

表２：成熟二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子のアミノ酸配列

【0233】

ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地と交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、５％ＣＯ_２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充液を伴うＥｘｃｅｌｌ培地を添加した。トランスフェクションの１日後、１２％フィードを添加した。７日後に細胞上清を集め、標準的な方法によって精製した。細胞を、それぞれａ）及びｂ）のコンストラクトについて１：１又は１：１：１の比で対応する発現ベクターでトランスフェクトした。

【0234】

タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出をｐＨ３．０で達成し、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。

【0235】

精製されたコンストラクトのタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ってアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩを使用して、還元剤の存在下、及び不在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集物含有量の決定は、２５ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ－アルギニンモノヒドロクロライド、ｐＨ６．７泳動緩衝液中、２５℃で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ）を使用するＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。

【0236】

表３は、二重特異性ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４－１ＢＢ結合抗原結合分子の収率及び最終モノマー含有量を要約する。
表３：二重特異性４－１ＢＢ結合抗原結合分子の生化学的分析

【0237】

比較のため、配列番号６９及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む２＋２ ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ分子、並びに配列番号７１及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む非標的２＋２ ＤＰ４７×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ対照分子も作製した。
１．２ 表面プラズモン共鳴による、４－１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価又は二価結合を有する二重特異性抗体及び三重特異性抗体の機能的特性評価

【0238】

ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＦＡＰに同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ、フライブルク／ドイツ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。ビオチン化ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。５００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。

【0239】

二重特異性ＦＡＰ標的化抗４－１ＢＢリポカリンを２００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分のフローで９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離を０秒に設定した。ヒトＦＡＰを、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルに３０μＬ／分の流量で第２の分析物として注入した（図２Ａ）。解離を１２０秒間監視した。タンパク質が不動化しなかった参照フローセルで入手した応答を差し引くことで、バルク屈折率の差を補正した。

【0240】

図２Ｂ及び図２Ｃのグラフにおいて認められ得るように、両方の二重特異性ＦＡＰ標的化抗４－１ＢＢリポカリンがヒト４－１ＢＢ及びヒトＦＡＰに同時に結合することができた。

【0241】

実施例２
４－１ＢＢへの二価結合及びＨＥＲ２への一価／二価結合を有する二重特異性抗体の調製、精製及び特性評価
２．１ ４－１ＢＢへの二価結合及びＨＥＲ２への一価又は二価結合を有する二重特異性抗体の作製
４－１ＢＢに対する二価結合及びＨＥＲ２に対する一価又は二価結合を有する二重特異性アゴニスト４－１ＢＢ抗体を、図１Ａ及び１Ｂに記載されるように調製した。ＨＥＲ２結合剤（トラスツズマブに対応する）及び４－１ＢＢ結合剤（国際公開第２０１６／１７７８０２号に記載のリポカリン、生成及び調製）を使用して、図１Ａ及び図１Ｂに記載の分子を調製し、ＴＡ１はＨＥＲ２であった。国際特許出願公開番号国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、重鎖のＦｃ定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。

【0242】

ＦＡＰ（４Ｂ９）バインダーをコードする重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のどちらかとインフレームでサブクローニングした。

【0243】

ＦＡＰへの二価結合を有するコンストラクトを以下のようにクローニングした：各ＶＨ（ＨＥＲ２）－Ｆｃ（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリンを含む２つの重鎖及びＶＬ（ＨＥＲ２）－Ｃカッパを含む２つの軽鎖。二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡに関するアミノ酸配列を表４に見出すことができる。

【0244】

ＦＡＰへの一価結合を有するコンストラクトを以下のようにクローニングした：ＶＨ（ＨＥＲ２）－Ｆｃノブ（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリンを含む１本の重鎖、１本の重鎖Ｆｃホール（ｈｕ ＩｇＧ１）－（Ｇ４Ｓ）３コネクター－４－１ＢＢ結合リポカリン、及びＶＬ（ＨＥＲ２）－Ｃカッパを含む１本の軽鎖。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含むＦｃノブ重鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール重鎖と、抗ＨＥＲ２軽鎖とを組み合わせることにより、２つの４－１ＢＢ結合リポカリンを含むヘテロ二量体の生成が可能になった。二重特異性一価の２＋１抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡに関するアミノ酸配列を表５に見出すことができる。
表４：成熟二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子のアミノ酸配列

表５：成熟二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子のアミノ酸配列

【0245】

実施例１に記載のとおり二重特異性抗体を作製及び精製した。

【0246】

表６は、二重特異性ＨＥＲ２標的化４－１ＢＢ結合抗原結合分子の収率及び最終モノマー含有量を要約する。
表６：二重特異性４－１ＢＢ結合抗原結合分子の生化学的分析

【0247】

比較のため、配列番号７３及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む以前に記載された融合ポリペプチド２＋２ ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）－アンチカリン－４－１ＢＢヒトＩｇＧ４ ＳＰも作製した（国際公開第２０１６／１７７８０２号）。

【0248】

２．２ 表面プラズモン共鳴による、４－１ＢＢへの二価結合及びＨＥＲ２への一価又は二価結合を有する二重特異性抗体及び三重特異性抗体の機能的特性評価
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＨＥＲ２に同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ、フライブルク／ドイツ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。ビオチン化ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。５００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。

【0249】

二重特異性ＨＥＲ２標的化抗４－１ＢＢリポカリンを２００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分のフローで９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離を０秒に設定した。ヒトＦＡＰを、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルに３０μＬ／分の流量で第２の分析物として注入した（図３Ａ）。解離を１２０秒間監視した。タンパク質が不動化しなかった参照フローセルで入手した応答を差し引くことで、バルク屈折率の差を補正した。

【0250】

図３Ｂのグラフに見られるように、両方の二重特異性ＨＥＲ２標的抗４－１ＢＢリポカリンは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＨＥＲ２に同時に結合することができた。

【0251】

実施例３
ＦＡＰ標的化４－１ＢＢリポカリン抗原結合分子の機能的特性評価
３．１ヒトＦＡＰ発現細胞株への結合
細胞表面に発現したヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）ため、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を使用した。マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）に、ＣＭＶプロモーターの元でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドをトランスフェクションすることにより、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９を生成した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔｑａ－ＭＡＸ－Ｉ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０－０３８）、及び１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ－ｐｒ－５）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号：４２３４０－０２５）中で細胞を維持した。結合アッセイのために、２×１０^５のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５ ０８６３ １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞を、異なる滴定濃度（８段階の希釈段階での１：６希釈における開始濃度３００ｎＭ）の二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋２と称する）若しくは二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋２と称する）、又は対照分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて暗所で４°Ｃで１時間インキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＤＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＣａｎｔｏ ｌｌ（ＢＤ）を使用して入手した。データを、ＦｌｏｗＪｏ １０．４．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【0252】

図４に示されるように、二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する）は、両方の分子がＦＡＰに対して二価に結合することから、同様の親和性で、またＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡと同様に結合する。したがって、４－１ＢＢ結合リポカリンのＣ末端融合は、ＦＡＰへの結合に影響しない。二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ４ ＳＰ分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２）は、他のＦＡＰ二価結合分子よりも低いｇＭＦＩを示す。これは、Ｆｃ断片の異なるアイソタイプによって説明することができる。本発明者らはポリクローナル抗ヒトＦｃ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を使用しているため、Ｆｃ部分のエピトープは異なり、結合していない第２の検出断片及びより低いｇＭＦＩをもたらす可能性がある。二重特異性一価の１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２、黒三角及び線）は、二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する）よりも高いｇＭＦＩを示す。これは、ＦＡＰに対するその一価結合によって説明することができ、１つの分子が２つではなく１つのＦＡＰ－モノマーを占有しているだけであるので、細胞表面におけるより高い占有をもたらす。ＦＡＰ（４Ｂ９）は非常に高い親和性を示すことから、この結合アッセイでは結合活性の喪失（例えば、ＥＣ_５０値の増加）を検出することができない。個々の結合曲線のＥＣ_５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれ表７及び表８に列挙する。
表７：図４に示されるようなＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９に対する結合曲線のＥＣ_５０値

表８：図４に示されるＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９に対する結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値

【0253】

３．２ ヒト４－１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２への結合
細胞表面に発現するヒト４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）への結合には、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。１０％（体積／体積）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔｑａ－ＭＡＸ－Ｉ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０－０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（体積／体積）のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１００ｘ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、６００μｇ／ｍＬのＧ－４１８（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２７８９４００１）、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１０８４３５５５００１）、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｉｅｎｃｅ、カタログ番号：Ｈ０８８７－１００ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１－０４２）中で細胞を、懸濁細胞として維持した。結合アッセイのために、２×１０^５のＪｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５ ０８６３ １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞を、異なる滴定濃度（８段階の希釈段階での１：６希釈における開始濃度３００ｎＭ）の二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（２＋２と称する）若しくは二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（１＋２と称する）、又は対照分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて暗所で４°Ｃで１時間インキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＣａｎｔｏｌｌ（ＢＤ）を使用して入手した。データを、ＦｌｏｗＪｏ １０．４．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【0254】

図５に示されているように、全ての抗４－１ＢＢリポカリン二重特異性分子は、ヒト４－１ＢＢ発現トランスジェニックヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２に対して同様の親和性で結合する。ヒト４－１ＢＢへの結合中のＦＡＰ発現細胞への結合（図４）とは異なり、Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ又はＦｃ－ｈｕＩｇＧ４ ＳＰを含有する分子間の結合（ｇＭＦＩ）に差は見られなかった。これは、ＦＡＰと比較して４－１ＢＢの発現レベルが低く、したがってｇＭＦＩ値がはるかに低いことに関連している可能性があり、例えば、このアッセイは差を検出するのに十分な感度を有していない。結合曲線のＥＣ_５０の値及びＡＵＣを、表９及び表１０に列挙する。
表９：図５に示す細胞発現ヒト４－１ＢＢへの結合曲線のＥＣ_５０値の概要

表１０：図５に示されるような、細胞発現ヒト４－１ＢＢに対する結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値のまとめ

【0255】

３．３レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２を発現するヒト４－１ＢＢ及びＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子におけるＮＦ－κＢ活性化
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体のそのリガンド（４－１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介して４－１ＢＢ下流シグナル伝達を誘導し、ＣＤ８ Ｔ細胞の生存及び活性を促進する（Ｌｅｅ ＨＷ，Ｐａｒｋ ＳＪ，Ｃｈｏｉ ＢＫ，Ｋｉｍ ＨＨ，Ｎａｍ ＫＯ，Ｋｗｏｎ ＢＳ．４－１ＢＢ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ－ｘ（Ｌ）ａｎｄ Ｂｆｌ－１．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：４８８２－４８８８）。二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ分子（２＋２と称する）又は二重特異性一価の１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ分子（１＋２と称する）によって媒介されるこのＮＦκＢ活性化をモニターするために、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（ドイツ）から購入した。細胞を上記のとおりに培養した（ヒト４－１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２への結合）。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０^３のＪｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μｌを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定された濃度の二重特異性二価の２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（２＋２と称する）、又は二重特異性一価の１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（１＋２と称する）、又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を加えた。最後に、１０μＬの、アッセイ培地のみ、又は１×１０^４の細胞ＦＡＰ発現細胞、ヒト黒色腫細胞株ＷＭ－２６６－４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６７６）、若しくはＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９（前述の通り）を含有する培地を供給し、プレートを６時間、３７℃及び５％ ＣＯ_２で、細胞インキュベータ内でインキュベートした。６μＬも、新たに解凍したＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルタ収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【0256】

図６Ａに示すように、ＦＡＰ発現細胞の不存在下においては、いずれの分子も、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４－１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、ＮＦκＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。ＷＭ－２６６－４（図６Ｂ、ヒト黒色腫細胞株、中間体ＦＡＰ発現）又はＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９（図６ Ｃ、ヒト－ＦＡＰトランスジェニックマウス線維芽細胞株）のようなＦＡＰ発現細胞の存在下では、二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、白抜き、下向き黒三角及び点線）、又は二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び線）、又は二重特異性の対照分子二重特異性二価２＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ ４ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２と称する、半分黒の六角形及び点線）の架橋は、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦκＢ活性化ルシフェラーゼ活性の強い増加をもたらす。二重特異性一価１＋２抗ＦＡＰ、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＦＡＰ（４Ｂ９）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び直線）は、活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が最も高く、最も良好に機能した。エフェクター細胞標的結合に対する腫瘍標的結合側の１：２のより低い比、例えば、ＦＡＰ結合部分対４－１ＢＢ結合部分の１：２の比は、より高密度の占有をもたらし、したがって、エフェクター細胞上の４－１ＢＢアゴニストの高密度の架橋をもたらし、最終的にはより強い４－１ＢＢ受容体下流シグナル伝達をもたらすようである。活性化曲線のＥＣ_５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、表１１及び表１２に列挙する。
表１１：図６Ｂ及び６Ｃに示される活性化曲線のＥＣ_５０値

表１２：図６Ｂ及び図６Ｃに示す活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値の概要

【0257】

実施例４
ＨＥＲ２標的化４－１ＢＢリポカリン抗原結合分子の機能的特性評価
４．１ ヒトＨＥＲ２発現細胞株への結合
細胞表面発現ＨＥＲ２ヒト胃癌株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８２２）及びヒト乳腺癌細胞株ＫＰＬ４（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）への結合に、これらを使用した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、１０％（体積／体積）ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、ガンマ照射マイコプラズマ不含、熱失活３５分５６℃）及び２ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０－０３８）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１－０４２）中で接着細胞として培養した。ＫＰＬ４細胞を、接着細胞として、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンを供給したＤＭＥＭ培地（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４３００８２）中で培養した。結合アッセイのために、２×１０^５のＮＣＩ－Ｎ８７及びＫＰＬ４を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５ ０８６３ １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞を、異なる滴定濃度（８段階の希釈段階での１：６希釈における開始濃度３００ｎＭ）の二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋２と称する）若しくは二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋２と称する）、又は対照分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて暗所で４°Ｃで１時間インキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＤＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＣａｎｔｏｌｌ（ＢＤ）を使用して入手した。データを、ＦｌｏｗＪｏ １０．４．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【0258】

図７Ａ及び７Ｂに示されるように、二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する）は、両方の分子がＨＥＲ２に対して二価に結合することから、同様の親和性で、またＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡと同様に結合する。したがって、４－１ＢＢ結合リポカリンのＣ末端融合は、ＨＥＲ２への結合に影響しない。二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ４ ＳＰ分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ ２＋２）は、他のＨＥＲ２二価結合分子よりも低いＭＦＩを示す。これは、Ｆｃ断片の異なるアイソタイプによって説明することができる。本発明者らはポリクローナル抗ヒトＦｃ断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を使用しているので、Ｆｃ部分のエピトープは異なり、結合していない第２の検出断片及びより低いｇＭＦＩをもたらし得る。二重特異性一価の１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２、黒三角及び線）は、二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する）よりも高いｇＭＦＩを示す。これは、ＨＥＲ２に対するその一価結合によって説明することができ、１つの分子が２つではなく１つのＨＥＲ２を占有しているだけであるので、細胞表面におけるより高い占有をもたらす。個々の結合曲線のＥＣ_５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれ表１３及び表１４に列挙する。
表１３：図７Ａ及び７Ｂに示されるようなＨＥＲ２発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７及びＫＰＬ４に対する結合曲線のＥＣ_５０値

表１４：図７Ａ及び７Ｂに示されるＨＥＲ２発現発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７及びＫＰＬ４に対する結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値

【0259】

４．２ ヒト４－１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２への結合
細胞表面に発現するヒト４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）への結合には、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。１０％（体積／体積）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット９４１２７３、γ線照射マイコプラズマ非含有、熱不活化）、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０－０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（体積／体積）のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１００ｘ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、６００μｇ／ｍＬのＧ－４１８（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２７８９４００１）、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１０８４３５５５００１）、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｉｅｎｃｅ、カタログ番号：Ｈ０８８７－１００ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１－０４２）中で細胞を、懸濁細胞として維持した。結合アッセイのために、２×１０^５のＪｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを、１：５０００希釈のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号６５ ０８６３ １８）を含有する、１００μＬ／ウェル４℃の冷却ＤＰＢＳ緩衝液で再懸濁した。プレートを３０分間４℃でインキュベートし、２００μＬの、４℃に冷却したＤＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞を、異なる滴定濃度（８段階の希釈段階での１：６希釈における開始濃度３００ｎＭ）の二重特異性二価２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋２と称する）若しくは二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋２と称する）、又は対照分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、続いて暗所で４°Ｃで１時間インキュベートした。２００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで４回洗浄した後、２．５μｇ／ｍＬの、ＰＥ抱合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの、４℃に冷却したＦＡＣＳ緩衝液で、３０分間４℃で細胞を染色した。細胞を、２００μＬの、４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日、又は翌日に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＣａｎｔｏｌｌ（ＢＤ）を使用して入手した。データを、ＦｌｏｗＪｏ １０．４．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【0260】

図８に示されているように、全ての抗４－１ＢＢリポカリン二重特異性分子は、ヒト４－１ＢＢ発現トランスジェニックヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２に対して同様の親和性で結合する。ヒト４－１ＢＢへの結合中のＨＥＲ２発現細胞への結合（図７Ａ及び７Ｂ）とは異なり、Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ又はＦｃ－ｈｕＩｇＧ４ ＳＰを含有する分子間の結合（ｇＭＦＩ）に差は見られなかった。これは、ＨＥＲ２と比較して４－１ＢＢの発現レベルが低く、したがってｇＭＦＩ値がはるかに低いことに関連している可能性があり、例えば、このアッセイは差を検出するのに十分な感度を有していない。結合曲線のＥＣ_５０の値及びＡＵＣを、表１５及び表１６に列挙する。
表１５：図８に示す細胞発現ヒト４－１ＢＢへの結合曲線のＥＣ_５０値のまとめ

表１６：図８に示されるようなＨＥＲ２発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７及びＫＰＬ４に対する結合曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値

【0261】

４．３レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２を発現するヒト４－１ＢＢ及びＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子におけるＮＦ－κＢ活性化
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体のそのリガンド（４－１ＢＢＬ）へのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介して４－１ＢＢ下流シグナル伝達を誘導し、ＣＤ８ Ｔ細胞の生存及び活性を促進する（Ｌｅｅ ＨＷ，Ｐａｒｋ ＳＪ，Ｃｈｏｉ ＢＫ，Ｋｉｍ ＨＨ，Ｎａｍ ＫＯ，Ｋｗｏｎ ＢＳ．４－１ＢＢ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ－ｘ（Ｌ）ａｎｄ Ｂｆｌ－１．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：４８８２－４８８８）。二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋２と称する）又は二重特異性一価の１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋２と称する）によって媒介されるこのＮＦκＢ活性化をモニターするために、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（ドイツ）から購入した。細胞を上記のとおりに培養した（ヒト４－１ＢＢを発現するレポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２への結合）。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（体積／体積）ＦＢＳ及び１％（体積／体積）ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉを補充したアッセイ培地である、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。２×１０^３のＪｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦκＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞を含有する１０μｌを、蓋付きの滅菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３８２６）の各ウェルに移した。滴定された濃度の二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（２＋２と称する）又は二重特異性一価の１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（１＋２と称する）又は対照分子を含有する１０μＬのアッセイ培地を添加した。最後に、単独で、又は１×１０^４個の細胞ＨＥＲ２発現細胞ＫＰＬ４、ＮＣＩ－Ｎ８７（上記のように）若しくはＳＫ－Ｂｒ３（ヒト乳腺癌、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３０）を含有する１０μＬのアッセイ培地を供給し、プレートを細胞インキュベータにおいて３７℃及び５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。６μＬも、新たに解凍したＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに添加し、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（５００ｍｓの積分時間、全波長にてフィルタ収集なし）を用いて速やかに、ルミネセンス発光を測定した。

【0262】

図９Ａ～９Ｄに示すように、ＨＥＲ２発現細胞の不存在下においては（図９Ａ）、いずれの分子も、Ｊｕｒｋａｔ－ｈｕ４－１ＢＢ－ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２レポーター細胞株内で強力なヒト４－１ＢＢ受容体の活性化を誘発することはできず、ＮＦｋＢの活性化、及びそれ故、ルシフェラーゼ発現をもたらした。ＳＫ－Ｂｒ３（図９Ｂ）、ＫＰＬ４（図９Ｃ）及びＮＣＩ－Ｎ８７（図９Ｄ）のようなＨＥＲ２発現細胞の存在下での二重特異性一価の２＋１抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋１と称する、黒三角及び直線）の架橋は、それらの高さ及び／又はＥＣ_５０値が架橋細胞のＨＥＲ２発現の強度と相関する良好な活性化曲線を示す。二重特異性二価の２＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ抗原結合分子（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋２と称する、黒三角及び直線）及びその制御分子ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ４ ＳＰ（半分黒の六角形及び点線）は、両方ともＨＥＲ２に二価に結合し、類似の活性化曲線を誘導し、それにより、両方の分子の活性化は、ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ２＋１（黒三角及び直線）の活性化曲線をはるかに下回る。二重特異性一価１＋２抗ＨＥＲ２、抗４－１ＢＢ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（ＨＥＲ２（ＴＲＡＳ）×４－１ＢＢリポカリンｈｕＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ １＋２と称する、黒三角及び直線）は、活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が最も高く、最も良好に機能した。本発明者らは、エフェクター細胞標的結合に対する腫瘍標的結合側の１：２のより低い比、例えば４－１ＢＢ結合部分に対するＨＥＲ２結合部分の１：２の比が、腫瘍細胞上のより高い占有密度、したがってエフェクター細胞上の４－１ＢＢアゴニストの高密度の架橋をもたらし、最終的にはより強い４－１ＢＢ受容体下流シグナル伝達をもたらすと考えている。活性化曲線のＥＣ_５０値及び曲線下面積（ＡＵＣ）を、表１７及び表１８に列挙する。
表１７：図９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄに示される活性化曲線のＥＣ_５０値のまとめ

表１８：図９Ｂ、図９Ｃ及び図９Ｄに示される活性化曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）値

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】