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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-10
(54)【発明の名称】増強型トランスフェクション
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20220603BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220603BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20220603BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220603BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220603BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220603BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220603BHJP
A61P 7/00 20060101ALN20220603BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20220603BHJP
A61P 17/02 20060101ALN20220603BHJP
A61P 19/08 20060101ALN20220603BHJP
A61P 3/10 20060101ALN20220603BHJP
A61P 25/28 20060101ALN20220603BHJP
A61P 25/16 20060101ALN20220603BHJP
A61P 19/02 20060101ALN20220603BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
C12N15/113 Z ZNA
C07K7/00
C07K14/00
A61K48/00
A61K35/12
A61K38/16 200
A61P7/00
A61P43/00 105
A61P17/02
A61P19/08
A61P3/10
A61P25/28
A61P25/16
A61P19/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021556847
(86)(22)【出願日】2020-03-23
(85)【翻訳文提出日】2021-11-19
(86)【国際出願番号】 GB2020050766
(87)【国際公開番号】W WO2020188302
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】1903873.6
(32)【優先日】2019-03-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511093498
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノッティンガム
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ディクソン、ジェイムズ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC32
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA161
4C084ZA511
4C084ZA891
4C084ZA961
4C084ZB211
4C084ZC202
4C084ZC351
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZA51
4C087ZA89
4C087ZA96
4C087ZC33
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA17
4H045EA20
4H045FA20
(57)【要約】
本発明は、細胞に分子をトランスフェクトする方法であって、該細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップ、該細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節するステップ、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供するステップを含む方法、ならびに療法における関連する組成物および使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞に分子をトランスフェクトする方法であって、前記細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップ、ならびに
前記細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節するステップ、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供するステップ、
を含む方法。
【請求項2】
前記細胞内のＰＫＣの活性の調節が、ＰＫＣ活性の活性化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＰＫＣ活性の調節が、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）、インゲノール３－アンゲラート（Ｉ３Ａ）およびブリオスタチンを含む群から選択されるＰＫＣのモジュレーター、もしくはその機能的類似体および誘導体、またはＰＫＣの発現を阻害するよう配置された遺伝子サイレンサーｓｉＲＮＡであるＰＫＣのモジュレーターの添加によって提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＰＫＣ活性の調節が、トランスフェクション開始後約１～約３時間の時点で行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞内のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の調節をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＨＤＡＣ活性の調節が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、パノビノスタット、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ツバスタチンＡ、およびバルプロ酸を含む群から選択されるＨＤＡＣ阻害剤、もしくはその機能的類似体および誘導体、またはＨＤＡＣの発現を阻害するよう配置された遺伝子サイレンサーｓｉＲＮＡであるＨＤＡＣのモジュレーターの添加によって提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＰＫＣ活性のＰＭＡ／ＴＰＡ活性化が、ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタット、ＴＳＡまたはＳＡＨＡのうちの１つ以上と組み合わせて提供される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記トランスフェクションのための分子が、核酸、タンパク質、ペプチドまたはナノ粒子を含むかまたはそれらからなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記核酸が、１つ以上の遺伝子配列および／または１つ以上の調節配列をコードするＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記トランスフェクションのための分子が、転写因子、または転写因子をコードする核酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記トランスフェクションのための分子が、成長因子または成長因子をコードする核酸を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記トランスフェクションのための分子が、トランスフェクション送達分子と会合している、トランスフェクション送達分子と複合体を形成している、トランスフェクション送達分子内に捕捉されている、またはトランスフェクション送達分子に連結されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記トランスフェクション送達分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、非ウイルス性分子、合成ポリマー、およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強型導入物（ＧＥＴ）カーゴ分子、またはそのｐＨ介在性変異体を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
トランスフェクションのための前記細胞または細胞の集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）、精子、卵母細胞、骨格筋細胞、脳細胞、および肺細胞、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ｐＨ応答性ペプチドが、１０～２５個のＫ残基および／またはＬ残基の配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫ（Ｈ５～２０）を含むまたはその配列からなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
組成物であって、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、組成物。
【請求項18】
ＨＤＡＣモジュレーターをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
キットであって、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、キット。
【請求項20】
ＨＤＡＣモジュレーターをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
細胞トランスフェクション効率を高めるための、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドの、場合によりＨＤＡＣモジュレーターと組み合わせた、使用。
【請求項22】
遺伝子療法の方法であって、対象に、（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチド、ならびに
（ｂ）核酸を含む、トランスフェクションのための分子
を投与することを含む、方法。
【請求項23】
対象の処置方法であって、前記対象に、（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチド、ならびに
（ｂ）治療上有効な分子を含む、トランスフェクションのための分子
を投与することを含む、方法。
【請求項24】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって形質転換した細胞を対象に投与することを含む、対象の処置方法。
【請求項25】
トランスフェクションのための分子と組み合わせて薬剤として使用するための、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞トランスフェクションの方法、トランスフェクションのための関連試薬、および該方法の治療上の適用に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子送達は、細胞プロセスの調査および操作、ならびに療法のための有用なツールである。ヒト細胞のエクスビボ遺伝子改変は、該ヒト細胞の治療上の可能性を有意に改善することが示されている。学術研究室および臨床研究室のいずれにおいても最も一般的に利用される核酸送達ビヒクルは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、非常に効率的であることが実証されている。しかしながら、宿主ゲノムへのウイルスベクターの無作為な組込みについての可能性があり、このことは必須の遺伝子発現および細胞プロセスを妨害することができる。安全性の懸念、ウイルス遺伝子送達の高いコストおよび技術の困難性により、非ウイルス遺伝子送達系の開発に注目が集まっている。
【0003】
非ウイルス遺伝子送達は、多くの細胞株において比較的高い効率を有するが、幹細胞および有糸分裂後の細胞は、現行の非ウイルス送達法では非応答性（０～３５％のトランスフェクション効率）であることが公知である。非ウイルス遺伝子送達の不十分なトランスフェクション効率を克服するために開発された１つの方法が、電気穿孔法である。電気穿孔法は、高いトランスフェクションをもたらすが、トランスフェクション後の低い細胞生存率をもたらし、スケーラビリティが懸念される。すべて特殊な設定を必要とする代替方法としては、微量注射、遺伝子銃、ソノポレーション、レーザーおよび細胞変形がある。現在のところ、非ウイルス遺伝子送達を使用したトランスフェクト困難細胞型における高いトランスフェクション効率は、未解決のままである。
【0004】
近年開発された別の送達方法が、Ｄｉｘｏｎら（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公報：国際公開第２０１５０９２４１７号）によって開示されている。生細胞内へのカーゴ分子の導入の方法であって、カーゴと、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合要素（細胞表面上のＧＡＧに結合することができる）と、タンパク質導入ドメインとを含む送達分子が、細胞内へのタンパク質の効率的な導入を提供する、方法が開示される。このアプローチの変法は、特許出願公開番号国際公開第２０１６２０７６３８号（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されており、該公開は、カーゴに結合するためのカーゴまたはカーゴ結合分子と、タンパク質導入ドメインと、細胞の表面上のＧＡＧに結合することができるＧＡＧ結合要素とを含むｐＨ介在性細胞送達ビヒクルであって、該ＧＡＧ結合要素が、酸性環境下でプロトン化され得る１つ以上のヒスチジン残基を含むように改変されたペプチドである、ｐＨ介在性細胞送達ビヒクルを開示する。トランスフェクション方法の進歩にもかかわらず、いくつかの細胞型はトランスフェクションが困難なままである。それゆえ、さらなる改善についての必要性がある。
【0005】
トランスフェクトしにくい細胞のトランスフェクションを改善することを目指して、Ｈｏら（２０１６）は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の化学的阻害が非ウイルストランスフェクションの方法を増強することができることを実証した。このことは、トランスフェクションプロセスを支援するために細胞活性を改変することが可能であることを示唆している。
【0006】
また、先のトランスフェクション方法は、タンパク質およびナノ粒子など、核酸以外の分子を細胞にトランスフェクトすることができることも望ましく、公知である。それゆえ、核酸送達と、さもなければ細胞膜を通過することが困難であろうタンパク質、ペプチドおよびナノ粒子などの他のカーゴの両方を改善することが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の目的は、トランスフェクトするのが困難な細胞を含む、細胞の改善されたトランスフェクション効率を提供することとする。
【0008】
本発明の第１の態様によると、細胞に分子をトランスフェクトする方法であって、
該細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップと、
該細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節し、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供するステップ
を含む方法が提供される。
該細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップと、
該細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節し、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供するステップ
を含む方法が提供される。
【0009】
ｐＨ応答性ペプチドのヒスチジン残基は、エンドソームの酸性環境下でプロトン化されることができる可能性がある。
【0010】
本発明は、驚くべきことに、細胞内のＰＫＣ活性の、場合によりヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）調節を伴う調節が、細胞のトランスフェクション、有利には、現にゴールドスタンダード試薬で効率的にトランスフェクトすることができない細胞型のトランスフェクションを劇的に増強する上で有意な効果を有することを発見している。特に、本明細書中の本発明は、ＨＤＡＣ調節単独についてのトランスフェクション効率の効果が３～１０倍程度で効率を高め、ＰＫＣ調節単独では効率の有意に大きな１０～２０倍の上昇を提供することができ、かつ、ＨＤＡＣ調節およびＰＫＣ調節がまとまって、効率の驚くべき５０～２００倍またはそれより大きな上昇を提供することができることを発見した。
【0011】
ＰＫＣ調節
細胞内のＰＫＣの活性を調節することは、作用因子を細胞に添加して、細胞内のＰＫＣの活性を調節することを含むことができる。
細胞内のＰＫＣの活性を調節することは、作用因子を細胞に添加して、細胞内のＰＫＣの活性を調節することを含むことができる。
【0012】
一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性の調節は、ＰＫＣ活性の阻害を含む。阻害は、活性における完全な（すなわち、１００％の）阻害または低減を含むことができる。別の実施形態では、阻害は、活性の有意なまたは実質的な阻害または低減を含むことができる。細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも５％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも１０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも２０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも５０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも８０％阻害することができる。当業者は、ＰＫＣ阻害の成功またはレベルが、１つ以上のＰＫＣ標的のリン酸化状態を検出することによって判定されることができることを理解するであろう。
【0013】
細胞内のＰＫＣの活性は、ＰＫＣの阻害剤によって阻害することができる。一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性を調節することは、ＰＫＣのモジュレーターを細胞に添加することを含む。ＰＫＣのモジュレーターは、ＰＫＣ阻害剤であってよい。
【0014】
一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性の調節は、ＰＫＣ活性の活性化を含む。活性化は、有意なまたは実質的な活性化または活性の上昇を含むことができる。細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも５％上昇させることができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも１０％上昇させることができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも２０％上昇させることができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも５０％上昇させることができる。別の実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性は、少なくとも８０％上昇させることができる。当業者は、ＰＫＣ活性化の成功またはレベルが、１つ以上のＰＫＣ標的のリン酸化状態を検出することによって判定されることができることを理解するであろう。
【0015】
細胞内のＰＫＣの活性は、ＰＫＣの活性化因子によって上昇させることができる。一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性を調節することは、ＰＫＣのモジュレーターを細胞に添加することを含む。ＰＫＣのモジュレーターは、ＰＫＣ活性化因子であってよい。一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性の調節は、細胞内のＰＫＣの発現を上方調節することを含む。発現を上方調節させることは、ＰＫＣを上方調節させることができる分子を提供することによって達成することができる。分子は、ｓｉＲＮＡなどの核酸であってよい。分子は、ＰＫＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの、過剰発現のための核酸であってよい。
【0016】
ＰＫＣのモジュレーターは、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）、インゲノール３－アンゲラート（Ｉ３Ａ）およびブリオスタチンを含む群から選択することができる。一実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）（１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール１３－アセタート（ＴＰＡ）としても公知）を含む。別の実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、インゲノール３－アンゲラート（Ｉ３Ａ）を含む。別の実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ブリオスタチンを含む。当業者は、このようなモジュレーターの機能的類似体および誘導体もまた代替として使用することができることを認識するであろう。別の実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ＰＫＣアイソフォームの発現を阻害し、それにより、その活性を低減させるための、ｓｉＲＮＡなどの遺伝子サイレンサーであってよい。
【0017】
一実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ビスインドリルマレイミドＩ（さもなくば２－［１－（３－ジメチルアミノプロピル）インドール－３－イル］－３－（インドール－３－イル）マレイミドまたはＧＦＸ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）、カルホスチンＣ、およびＧｏ６９７６（５，６，７，１３－テトラヒドロ－１３－メチル－５－オキソ－１２Ｈ－インドロ［２，３－ａ］ピロロ［３，４－ｃ］カルバゾール－１２－プロパンニトリル）を含む群から選択されるＰＫＣの阻害剤、またはその組み合わせであってよい。
【0018】
一実施形態では、細胞内のＰＫＣの活性の調節は、細胞内のＰＫＣの発現を下方調節することを含む。発現を下方調節させることは、ＰＫＣを下方調節させることができる分子を提供することによって達成することができる。該分子は、ＰＫＣの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡなどの核酸であってよい。当業者は、細胞内のＰＫＣなどの特定のタンパク質を上方調節するおよび下方調節するための技術に精通しているであろう。
【0019】
ＰＫＣのモジュレーターは、活性化などの所望の調節を提供するための有効な濃度および量で提供されることができる。当業者は、異なるＰＫＣ調節薬が、ＰＫＣの有効な調節のために異なる濃度および量を必要とし得ることを認識するであろう。例えば、ＰＫＣモジュレーターの量は、１０ｎｍ～約１０μｍであってよい。別の実施形態では、ＰＫＣモジュレーターの量は、０．１～１００μＭであってよい。別の実施形態では、ＰＫＣモジュレーターの量は、１０ｎｍ～１μＭであってよい。別の実施形態では、ＰＫＣモジュレーターの量は、０．１～１μＭであってよい。
【0020】
例えば、ＰＫＣ活性調節のための作用薬を添加することによるＰＫＣの活性の調節は、トランスフェクションのための分子を細胞に添加することと同時に、またはその後であってよい。理論に拘束されるものではないが、ＰＫＣ調節は、トランスフェクションのための分子のエンドソーム放出にとって重要であることが理解される。それゆえ、ＰＫＣ調節は、細胞内へのエンドソーム放出を増強するのに適した時点であってよい。
【0021】
ＰＫＣ活性の阻害などの調節は一時的であってよい。例えば、調節は、トランスフェクションプロセスを助けるのに十分な時間生じることができる。ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、４時間以内であってよい。ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、トランスフェクションの開始後であってよい。ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、トランスフェクションの開始後３時間までであってよい。一実施形態では、ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、トランスフェクションの開始後約１～約３時間の時点であってよい。別の実施形態では、ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、トランスフェクションの開始後約１２～約２４時間の時点であってよい。別の実施形態では、ＰＫＣ活性の活性化などの調節は、トランスフェクションの開始後約０～約２４時間の時点であってよい。
【0022】
ＨＤＡＣ調節
細胞に分子をトランスフェクトする方法はさらに、細胞内のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の調節を含むことができる。一実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性の調節は、ＨＤＡＣ活性の阻害を含む。細胞内のＨＤＡＣの阻害などの調節は、細胞内のＰＫＣの活性の活性化などの調節と同時であってよい。一実施形態では、ＨＤＡＣは阻害され、ＰＫＣは活性化される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが阻害され、ＰＫＣは阻害される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが活性化され、ＰＫＣは活性化される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが活性化され、ＰＫＣは阻害される。
細胞に分子をトランスフェクトする方法はさらに、細胞内のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の調節を含むことができる。一実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性の調節は、ＨＤＡＣ活性の阻害を含む。細胞内のＨＤＡＣの阻害などの調節は、細胞内のＰＫＣの活性の活性化などの調節と同時であってよい。一実施形態では、ＨＤＡＣは阻害され、ＰＫＣは活性化される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが阻害され、ＰＫＣは阻害される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが活性化され、ＰＫＣは活性化される。別の実施形態では、ＨＤＡＣが活性化され、ＰＫＣは阻害される。
【0023】
有利なことに、より特異的またはより幅広い特異性を有するいくつかのＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）はすべて、複数の細胞株において毒性を伴わずにあるレベルのトランスフェクション促進活性を示した。
【0024】
ＨＤＡＣ阻害は、ＨＤＡＣの活性における完全な（すなわち、１００％の）阻害または低減を含むことができる。別の実施形態では、阻害は、ＨＤＡＣの活性の有意なまたは実質的な阻害または低減を含むことができる。細胞内のＨＤＡＣの活性は、少なくとも５％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性は、少なくとも１０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性は、少なくとも２０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性は、少なくとも５０％阻害することができる。別の実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性は、少なくとも８０％阻害することができる。当業者は、ＨＤＡＣ阻害の成功またはレベルが、ヒストンデアセチラーゼアッセイ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ製のＨｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ、または同等のアッセイおよびそのキット）などのアッセイによって決定されることができることを理解するであろう。
【0025】
ＨＤＡＣの阻害は、ＨＤＡＣ阻害剤の使用を含むことができる。それゆえ、一実施形態では、細胞に分子をトランスフェクトする方法はさらに、分子のトランスフェクションの間または前にＨＤＡＣ阻害剤を添加することを含むことができる。
【0026】
ＨＤＡＣ阻害剤は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、パノビノスタット、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ツバスタチンＡおよびバルプロ酸を含む群から選択することができる。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を含む。別の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、パノビノスタット、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を含む。別の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ツバスタチンＡを含む。別の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸を含む。当業者は、このような阻害剤の機能的類似体および誘導体もまた代替として使用することができることを認識するであろう。別の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣの発現を阻害し、それにより、その活性を低減させるための、ｓｉＲＮＡなどの遺伝子サイレンサーであってよい。
【0027】
一実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性の調節は、例えば、ＨＤＡＣエンハンサーを提供することによってＨＤＡＣ活性を増強することを含む。ＨＤＡＣエンハンサーは、Ｎ－アセチルチオ尿素を含むことができる。追加的または代替的に、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ活性を増強するために阻害されることができる。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡは、阻害されることができる。ＴＳＡ阻害剤は、ＩＳＴＡ１を含むことができる。
【0028】
一実施形態では、細胞内のＨＤＡＣの活性の調節は、細胞内のＨＤＡＣの発現を上方調節することを含む。発現を上方調節させることは、ＨＤＡＣを上方調節させることができる分子を提供することによって達成することができる。分子は、ｓｉＲＮＡなどの核酸であってよい。分子は、ＨＤＡＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの、過剰発現などの発現のための核酸であってよい。ＨＤＡＣ活性を増強するための分子は、ＨＤＡＣをコードするベクターおよび場合により発現を駆動するためのプロモーターを含むことができる。当業者は、細胞内のＨＤＡＣなどの特定のタンパク質を上方調節するおよび下方調節するための技術に精通しているであろう。
【0029】
ＰＫＣおよびＨＤＡＣの阻害の組み合わせは、パノビノスタット、ＴＳＡまたはＳＡＨＡのうちの１つ以上と組み合わせたＰＭＡ／ＴＰＡの使用を含むことができる。
【0030】
トランスフェクトされる細胞がＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらのハイブリッドである実施形態では、ＰＫＣモジュレーターは、ＰＭＡ／ＴＰＡを含むことができる。トランスフェクトされる細胞が２ハイブリッドヒトＴ／Ｂ細胞である実施形態では、ＰＫＣモジュレーターは、ＰＭＡ／ＴＰＡを含むことができる。
【0031】
トランスフェクトされる細胞がマクロファージ細胞である実施形態では、ＰＫＣモジュレーターは、ＰＭＡ／ＴＰＡを含むことができ、これはさらにＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡと一緒に使用することができる。トランスフェクトされる細胞がリンパ芽球化様細胞株細胞（ＬＣＬ）である実施形態では、ＰＫＣモジュレーターは、ＰＭＡ／ＴＰＡを含むことができ、これはさらにＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡと一緒に使用することができる。ＬＣＬ細胞は、リンパ芽球化様ヒトＢ細胞であってよい。
【0032】
ＨＤＡＣのモジュレーターは、ＨＤＡＣ活性の所望の阻害を提供するための有効な濃度および量で提供されることができる。当業者は、異なるＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＤＡＣの有効な阻害のために異なる濃度および量を必要とすることができることを認識するであろう。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤の量は、１０ｎＭ～約１００μＭであってよい。別の実施形態では、ＨＤＡＣモジュレーターの量は、０．１～１００μＭであってよい。別の実施形態では、ＨＤＡＣモジュレーターの量は、０．１～１０μＭであってよい。別の実施形態では、ＨＤＡＣモジュレーターの量は、１～１０μＭであってよい。
【0033】
ＨＤＡＣ阻害は一時的であってよい。例えば、阻害は、トランスフェクションプロセスを助けるのに十分な時間生じることができる。ＨＤＡＣ阻害は、４時間以内であってよい。ＨＤＡＣ阻害は、トランスフェクションの開始後であってよい。ＨＤＡＣ阻害は、トランスフェクションの開始後６時間までであってよい。一実施形態では、ＨＤＡＣの阻害は、トランスフェクションの開始後約１～約６時間の時点であってよい。
【0034】
一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害および阻害などのＰＫＣ調節は、互いに実質的に同時であってよい。
【0035】
トランスフェクションのための分子
トランスフェクションのための分子は、それ自体では細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節することができない可能性がある。トランスフェクションのための分子は、阻害剤または活性化因子など、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）モジュレーターを含むことができないかまたは該モジュレーターからなることができない。
トランスフェクションのための分子は、それ自体では細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節することができない可能性がある。トランスフェクションのための分子は、阻害剤または活性化因子など、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）モジュレーターを含むことができないかまたは該モジュレーターからなることができない。
【0036】
トランスフェクションのための分子は、核酸ベクターなどの核酸を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、オリゴヌクレオチドを含むことができる。トランスフェクションのための分子は、ｓｉＲＮＡ、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらのコンストラクトから選択される群のうちのいずれかを含むことができる。一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、ＤＮＡである。タンパク質またはペプチドについてコードするまたはコードしない、ＤＮＡなどの核酸である。ＤＮＡなどの核酸は、１つ以上の遺伝子配列および／または１つ以上の調節配列を含むことができる。
【0037】
別の実施形態では、トランスフェクションのための分子は、タンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、ペプチドを含むことができる。トランスフェクションのための分子は、生理学的または代謝上関連するタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細胞内タンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、シグナル経路に関与するタンパク質であるシグナルタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細胞の発現または代謝の調節に関与するタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細胞分裂に関与するタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、幹細胞分化などの細胞分化に関与するタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、多能性幹細胞の誘導に必要なタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、心臓細胞分化に関与するタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、タンパク質マーカーなどのマーカーを含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細菌タンパク質または細菌由来のタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、哺乳動物タンパク質または哺乳動物由来のタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、何らかのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。トランスフェクションのための分子は、研究用、診断用または治療用分子を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、シグナル生成のメンバーである転写モジュレーターを含むことができる。トランスフェクションのための分子は、酵素もしくはその基質、プロテアーゼ、酵素活性モジュレーター、パーチュバイマー（ｐｅｒｔｕｒｂｉｍｅｒ）およびペプチドアプタマー、抗体、タンパク質間相互作用のモジュレーター、成長因子、または分化因子を含むことができる。
【0038】
トランスフェクションのための分子は、プレタンパク質であってよい。例えば、細胞内への進入の際または後に開裂するように構成された送達分子内に切除ドメインが提供されることができる。トランスフェクションのための分子は、細胞内で翻訳後修飾されるように配置されたタンパク質であってよい。トランスフェクションのための分子は、細胞内に入ると機能するように配置されることができる。例えば、トランスフェクションのための分子は、細胞内へのトランスフェクションの後まで機能的でなくてよい。
【0039】
トランスフェクションのための分子は、何らかの細胞内分子を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細胞内機能（作用様式）、細胞内受容体、細胞内リガンド、または細胞内基質を有する何らかのタンパク質または分子を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、天然に／通常は細胞内へと内在化したタンパク質または分子を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、細胞表面受容体など、細胞表面に送達または提示することを意図したタンパク質を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、治療用分子、薬物、プロドラッグ、酵素もしくは転写因子などの機能的タンパク質もしくはペプチド、微生物のタンパク質もしくはペプチド、および毒素、またはこれらをコードする核酸を含む群のうちのいずれかから選択することができる。
【0040】
一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、転写因子、または転写因子をコードする核酸を含むことができる。追加的または代替的に、トランスフェクションのための分子は、成長因子または成長因子をコードする核酸を含むことができる。
【0041】
トランスフェクションのための分子は、毒素、ｊｕｎ、ｆｏｓなどのホルモン転写因子、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ－３、ＨＩＦ１ａおよびＲＵＮＴなどの転写因子、ウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリー、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセタートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、β－グルコシダーゼ、ピルバートカルボキシラート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、ジストロフィンｃＤＮＡ配列、Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＲＰＥ６５Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘＢ１、もしくはこれらの断片、ならびに／またはそれらの組み合わせを含む群のうちのいずれかから選択することができる。
【0042】
成長因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、ペルセフィン、アルテミン、成長分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子、インターロイキン、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、肝細胞成長因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ）としても公知のマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン、ニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、抗アポトーシス生存因子、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびＷｎｔ、もしくはこれらの組み合わせ、ならびに／またはこのような成長因子をコードする核酸を含む群から選択される成長因子を含むことができる。
【0043】
トランスフェクトされる核酸は、細胞内の成長因子を上方制御する可能性があるか、または上方制御することができる可能性がある。一実施形態では、トランスフェクトされる核酸は、細胞内のＢＭＰ２および／またはＶＥＧＦの発現を上方制御するか、または上方制御することができる。
【0044】
トランスフェクトされる核酸は、転写因子をコードすることができる。トランスフェクトされる核酸は、ＢＭＰ２および／またはＶＥＧＦをコードすることができる。
【0045】
一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、ウイルス粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質の複合体を含むことができる。ウイルス粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）はさらに、核酸を含むことができる。
【0046】
一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、金属ナノ粒子またはポリマーナノ粒子などのナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は、金属ロッドなどのロッドであってよい。ナノ粒子は、多孔質であってよい。トランスフェクションのための分子は、ナノ構造を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、非小分子を含むことができる。
【0047】
トランスフェクションのための分子は、タンパク質－タンパク質複合体、タンパク質－ｍＲＮＡ、タンパク質－非コードＲＮＡ、タンパク質－脂質およびタンパク質－小分子複合体などの非共有結合性複合体を含むことができる。このような複合体の例は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）およびスプライセオソームである。
【0048】
トランスフェクションのための分子は、少なくとも１ＫＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、少なくとも５ＫＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、少なくとも１０ＫＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、少なくとも２０ＫＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、４００ＫＤａ以下の分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、３００ＫＤａ以下の分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約０．５ＫＤａ～約４００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約１ＫＤａ～約４００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約０．５ＫＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約１ＫＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約２ＫＤａ～約３００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約２０ＫＤａ～約３００ｋＤａの分子量を有することができる。トランスフェクションのための分子は、約２０ＫＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有することができる。
【0049】
トランスフェクションのための分子がアミノ酸を含む場合、トランスフェクションのための分子は、長さが約２０～約３０，０００アミノ酸であってよい。トランスフェクションのための分子は、長さが約２０～約１０，０００アミノ酸であってよい。トランスフェクションのための分子は、長さが約２０～約５，０００アミノ酸であってよい。トランスフェクションのための分子は、長さが約２０～約１０００アミノ酸であってよい。トランスフェクションのための分子は、長さが少なくとも約２０アミノ酸であってよい。トランスフェクションのための分子は、長さが少なくとも約１００アミノ酸であってよい。
【0050】
一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、トランスフェクション送達分子と会合しているか、トランスフェクション送達分子と複合体を形成しているか、トランスフェクション送達分子内に捕捉されているか、またはトランスフェクション送達分子に連結されている。一実施形態では、トランスフェクションのための分子は、トランスフェクション送達分子のカーゴである。トランスフェクションのための分子（すなわち、カーゴ）は、トランスフェクション送達分子にイオン結合するかまたは共有結合するなどの結合することができる可能性がある。トランスフェクションのための分子（すなわち、カーゴ）は、トランスフェクション送達分子に結合するための要素を含むことができる。トランスフェクションのための分子は、ビオチン、または代替的にストレプトアビジンを含むことができる。トランスフェクションのための分子は、ビオチン化されていてよい。トランスフェクションのための分子は、トランスフェクション送達分子上の相補的親和性タグに結合することができる親和性タグを含むことができる。
【0051】
トランスフェクションのための分子は、トランスフェクションのための分子とトランスフェクション送達分子とを含む融合ペプチドであってよい。
【0052】
「トランスフェクションのための分子」および「カーゴ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。
【0053】
トランスフェクション送達分子
トランスフェクション送達分子は、核酸、ペプチド、タンパク質、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、非ウイルス性分子、合成ポリマー、およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強型導入物（ＧＥＴ）カーゴ分子を含む群から選択することができる。一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強型導入物（ＧＥＴ）カーゴ分子（本明細書では「ＧＥＴ系」または「ＧＥＴ分子」と称する）を含む。
トランスフェクション送達分子は、核酸、ペプチド、タンパク質、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、非ウイルス性分子、合成ポリマー、およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強型導入物（ＧＥＴ）カーゴ分子を含む群から選択することができる。一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合増強型導入物（ＧＥＴ）カーゴ分子（本明細書では「ＧＥＴ系」または「ＧＥＴ分子」と称する）を含む。
【0054】
ＧＥＴ系の有利なトランスフェクション効率は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ第２０１５０９２４１７号に詳細に説明されている。ＧＥＴ分子をＰＫＣ修飾剤と一緒に、場合によりさらにＨＤＡＣｉと一緒に使用することにより、リポフェクタミン製品（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）などのゴールドスタンダードのトランスフェクション技術を有意に上回るトランスフェクションレベルが有利に生じる。
【0055】
一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、
・カーゴと、
・グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合要素であって、該細胞の表面上のＧＡＧに結合することができるＧＡＧ結合要素と、
・タンパク質導入ドメインと、
を含む、ＧＡＧ結合増強型導入物（ＧＥＴ）送達分子であってよい。
・カーゴと、
・グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合要素であって、該細胞の表面上のＧＡＧに結合することができるＧＡＧ結合要素と、
・タンパク質導入ドメインと、
を含む、ＧＡＧ結合増強型導入物（ＧＥＴ）送達分子であってよい。
【0056】
別の実施形態では、トランスフェクション送達分子は、
・カーゴに結合するためのカーゴ結合分子であって、場合により該カーゴがカーゴ結合分子に結合したカーゴ結合分子と、
・グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合要素であって、該細胞の表面上のＧＡＧに結合することができるＧＡＧ結合要素と、
・タンパク質導入ドメインと、
を含む、ＧＡＧ結合増強型導入物（ＧＥＴ）送達分子であってよい。
・カーゴに結合するためのカーゴ結合分子であって、場合により該カーゴがカーゴ結合分子に結合したカーゴ結合分子と、
・グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合要素であって、該細胞の表面上のＧＡＧに結合することができるＧＡＧ結合要素と、
・タンパク質導入ドメインと、
を含む、ＧＡＧ結合増強型導入物（ＧＥＴ）送達分子であってよい。
【0057】
ＧＡＧ結合要素は、タンパク質導入ドメインとは異なってよい。ＧＡＧ結合要素は、タンパク質導入ドメインに対して構造および／または配列が異なってよい。ＧＡＧ結合要素は、タンパク質導入ドメインに対して異なる細胞表面分子に特異的であってよい。ＧＡＧ結合要素は、タンパク質導入ドメインよりも細胞表面分子に特異的であってよい。一実施形態では、ＧＡＧ結合要素は、本明細書に説明するタンパク質導入ドメインではない。一実施形態では、タンパク質導入ドメインは、本明細書に説明するように、特異的ＧＡＧ結合要素ではない。当業者は、タンパク質導入ドメインが細胞表面上のＧＡＧに結合していてもしていなくてもよいが、結合することがＧＡＧに特異的ではないかまたは優先的ではないことを理解するであろう。ＧＡＧ結合要素は、タンパク質導入ドメインによるＧＡＧの非特異的結合と比較して、ＧＡＧに優先的に結合することができる。
【0058】
ＧＡＧ結合要素は、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ－ＧＡＧ）結合要素であってよく、細胞の表面上のＨＳ－ＧＡＧに結合することができる。
【0059】
ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳ－ＧＡＧ）は、２つまたは３つのＨＳ鎖が細胞表面または細胞外マトリックスタンパク質に近接して結合しているプロテオグリカンである。ＨＳが様々なタンパク質リガンドに結合し、発達過程、血管新生、血液凝固および腫瘍転移をはじめとする幅広い種々の生物学的活性を調節するのはこの形態である。ヘパラン硫酸は、炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのメンバーであり、構造においてヘパリンと非常に密接に関連している。いずれも、易変性に硫酸化された反復二糖単位からなる。ヘパラン硫酸内で最も一般的な二糖単位は、典型的には二糖単位全体の約５０％を構成するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合したグルクロン酸（ＧｌｃＡ）から構成される。
【0060】
ＧＡＧ結合要素は、ＧＡＧに対して特異的親和性を有することができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ－ＧＡＧに対して特異的親和性を有することができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）またはその変異体を含むことができる。ヘパリン結合ドメイン変異体は、切形型ヘパリン結合ドメインまたは伸長型ヘパリン結合ドメインを含むことができる。ＧＡＧ結合要素は、ＧＡＧに特異的または優先的に結合する何らかのタンパク質、ペプチドまたは分子を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ－ＧＡＧに特異的または優先的に結合する何らかのタンパク質、ペプチドまたは分子を含むことができる。
【0061】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインの少なくとも一部を含むことができる。ヘパリン結合ドメインは、ＨＢ－ＥＧＦのＰ２１を含むことができる。ヘパリン結合ドメインは、Ｐ２１の切形型変異体、伸長型変異体、または機能的変異体を含むことができる。
【0062】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、線維芽細胞成長因子のヘパリン結合ドメインまたはその機能的変異体を含むことができる。
【0063】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＦＧＦ、ＡＴＩＩＩなどのアンチトロンビン、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、Ｓｈｈ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦを含む群またはこれらの変異体のいずれかから選択することができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、またはＰＤＧＦのうちのいずれかを含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、何らかのＦＧＦタンパク質のヘパリン結合硫酸ドメイン（例えば、ドメインＡ、ドメインＢまたはドメインＣ）のうちの１つ以上を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＦＧＦ４を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＦＧＦ１ ＨＢＤ Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ（ＦＧＦ１の第１のＨＢＤドメイン））、ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ）、ＦＧＦ４ ＨＢＤ Ａ（ヘパラン硫酸結合ドメインＡ）、ＦＧＦ１ ＨＢＤ Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｂ（ヘパラン硫酸結合ドメインＢ）、ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ４ ＨＢＤ Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＦＧＦ７ ＨＢＤ Ｂ（ヘパラン硫酸結合ドメインＢ）、ＦＧＦ７ ＨＢＤ Ｃ（ヘパラン硫酸結合ドメインＣ）、ＡＴＩＩＩなどのアンチトロンビン、ＶＥＧＦ、もしくはＰＤＧＦ、またはこれらの変異体を含むことができる。
【0064】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、肝細胞成長因子、インターロイキン、モルフォゲン、ＨＳ－ＧＡＧ結合酵素、Ｗｎｔ／無翅・無翼奇形、エンドスタチン、口蹄疫ウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質、アネキシンＶ、リポタンパク質リパーゼを含む群またはそれらのＨＳ－ＧＡＧ結合断片のうちのいずれかから選択することができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ－ＧＡＧを特異的に結合することができる何らかのタンパク質、ペプチドまたは分子を含むことができる。
【0065】
「変異体」は、機能的変異体を含むと当業者によって理解されてよく、ここで、公知の、報告された、開示されたまたは特許請求された配列とはいくつかの配列差があってよいが、該変異体は依然としてＨＳ－ＧＡＧに結合することができる。保存的アミノ酸置換もまた、「変異体」の意味の範囲内で想定される。
【0066】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、アミノ酸配列ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ（Ｐ２１、配列番号１）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【0067】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、アミノ酸配列ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴ（ＰＤＧＦ、配列番号３）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号３と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【0068】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、アミノ酸配列ＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱ（（ＦＧＦ７、ＨＢＤ Ｂ）配列番号５）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号５と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号５と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【0069】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、アミノ酸配列ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲ（（ＦＧＦ２、ＨＢＤ Ｂ）配列番号７）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号７と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号７と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【0070】
配列同一性は、標準的なＢＬＡＳＴ整列パラメータ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／によって提供）によって決定することができる。
【0071】
ＧＡＧ結合要素は、ＧＡＧ結合抗体、またはその変異体もしくは断片を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ－ＧＡＧ結合抗体、またはその変異体もしくは断片を含むことができる。抗体断片は、抗体可変ドメイン、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＦＡｂ、Ｄａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、重鎖－軽鎖二量体、または一本鎖構造であってよい。抗体変異体は、ＣＤＲ、抗体模倣物、またはＤＡＲＰｉｎを含むタンパク質足場を含むことができる。
【0072】
ＧＡＧまたはＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ナノボディ（軽鎖を欠きかつラクダ科で天然に生じる、重鎖抗体由来の単一ドメイン抗原結合断片）を含むことができる。
【0073】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１と、ＣＤＲ２と、ＣＤＲ３とを含むＶＨＨ断片を含むことができ、この中で、
ＣＤＲ１は、ＧＦＴＶＳＳＮＥまたはＧＦＡＦＳＳＹＡのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＳＧＧＳＴまたはＩＧＴＧＧＤＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＧＲＲＬＫＤまたはＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
ＣＤＲ１は、ＧＦＴＶＳＳＮＥまたはＧＦＡＦＳＳＹＡのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＳＧＧＳＴまたはＩＧＴＧＧＤＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＧＲＲＬＫＤまたはＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
【0074】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１と、ＣＤＲ２と、ＣＤＲ３とを含むＶＨＨ断片を含むことができ、この中で、
ＣＤＲ１は、ＧＦＴＶＳＳＮＥのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＳＧＧＳＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＧＲＲＬＫＤのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
ＣＤＲ１は、ＧＦＴＶＳＳＮＥのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＳＧＧＳＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＧＲＲＬＫＤのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
【0075】
あるいは、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＧＭＲＰＲＬ、ＨＡＰＬＲＮＴＲＴＮＴ、ＧＳＲＳＳＲ、ＧＲＴＶＧＲＮ、ＧＫＶＫＬＰＮ、ＳＧＲＫＧＲＭＲ、ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ、またはＲＲＹＡＬＤＹを含むことができる。
【0076】
単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ１と、ＣＤＲ２と、ＣＤＲ３とを含むＶＨＨ断片を含むことができ、この中で、
ＣＤＲ１は、ＧＦＡＦＳＳＹＡのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＧＴＧＧＤＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
ＣＤＲ１は、ＧＦＡＦＳＳＹＡのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、
ＣＤＲ２は、ＩＧＴＧＧＤＴのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができ、かつ
ＣＤＲ３は、ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱのアミノ酸配列を含むことができるか、または該アミノ酸配列からなることができる。
【0077】
あるいは、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＬＫＱＱＧＩＳ、ＡＭＴＱＫＫＰＲＫＬＳＬ、ＨＡＰＬＲＮＴＲＴＮＴ、ＧＭＲＰＲＬ、ＲＲＹＡＬＤＹ、またはＳＧＲＫＹＦＲＡＲＤＭＮを含むことができる。
【0078】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、（参照により本明細書に組み込まれるＪｅｎｎｉｓｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ（２０００．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０（１１）：４０９９－４１１１）およびＳｍｉｔｓ，ｅｔ ａｌ（２００６．ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４１６，ｐｐ．６１－８７）において説明されるような）抗ＨＳ ｓｃＦｖ抗体ＡＯ４Ｂ０８、ＡＯ４Ｂ０５、ＡＯ４Ｆ１２、ＲＢ４ＣＢ９、ＲＢ４ＣＤ１２、ＲＢ４ＥＡ１２、もしくはＲＢ４ＥＧ１２、またはこれらの断片を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＡＯ４Ｂ０８を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＡＯ４Ｂ０８、ＡＯ４Ｂ０５、ＡＯ４Ｆ１２、ＲＢ４ＣＢ９、ＲＢ４ＣＤ１２、ＲＢ４ＥＡ１２、またはＲＢ４ＥＧ１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＡＯ４Ｂ０８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。
【0079】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、（参照により本明細書に組み込まれるＷｉｊｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ ２５：１７７－１８５）およびＳｍｉｔｓ，ｅｔ ａｌ（２００６．ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４１６，ｐｐ．６１－８７）において説明されるような）ＨＳ３Ａ８、ＬＫＩＶ６９、ＥＷ３Ｄ１０、ＥＷ４Ｇ２、ＮＳ４Ｆ５、ＲＢ４ＥＡ１２、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ３Ａ８、ＬＫＩＶ６９、ＥＷ３Ｄ１０、ＥＷ４Ｇ２、ＮＳ４Ｆ５、ＲＢ４ＥＡ１２、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、ＨＳ４Ｅ４またはＨＳ４Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。
【0080】
ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１５または１７（ＡＯ４Ｂ０８）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、配列番号１１または１３（ＨＳ４Ｃ３）を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、抗体、または抗体断片、重鎖および／もしくは軽鎖を含むことができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素は、抗体、または抗体断片、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖ならびに／もしくはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖を含むことができる。
【0081】
本発明の一実施形態では、タンパク質導入ドメインはＧＡＧではない。別の実施形態では、タンパク質導入ドメインはＧＡＧとは異なる。
【0082】
タンパク質導入ドメインは、親水性または両親媒性であってよい。タンパク質導入ドメインは、親水性アミノ酸残基の大部分を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、アルギニンアミノ酸残基および／またはリジンアミノ酸残基の大部分を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、アミノ酸配列モチーフの反復した周期的な配列を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、ペネトラチン、ＨＩＶ由来ＴＡＴなどのＴＡＴ、ＭＡＰ、またはトランスポータン、ｐＶｅｃ、またはｐｅｐ－１を含むことができる。
【0083】
残基の「大部分」に言及する場合、このことは残基の５０％超を含むことが当業者によって理解されることができる。大部分は、残基の５５％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％であってよい。
【0084】
タンパク質導入ドメインは、以下を含む群のいずれかから選択することができる。
ペネトラチンまたはアンテナペディアＰＴＤ ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、
ＨＩＶトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、
Ｓｙｎｅｍｂｒｙｎ Ｂ（ＳｙｎＢ）１ ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、
ＳｙｎＢ３ ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；
ＰＴＤ－４ ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ；
ＰＴＤ－５ ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；
フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）コート－（３５－４９）ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ、
ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）Ｇａｇ－（７－２５）ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、
ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ）－ＩＩ Ｒｅｘ－（４－１６）
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、
Ｄ－Ｔａｔ ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、
Ｒ９－Ｔａｔ ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ、
トランスポータン ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬキメラ、
微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ、
ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）
ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、
葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、
ヒト３－メチルアデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ）（ＭＰＧ）
ａｃ－ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、
１０ＭＰＧ－核局在化配列（ＮＬＳ）
ａｃ－ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ－ｃｙａ、
Ｐｅｐ－１ ａｃ－ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、および
Ｐｅｐ－２ ａｃ－ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、または
ＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリアルギニン、ＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリリジン、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ．（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、およびＲ８。
ペネトラチンまたはアンテナペディアＰＴＤ ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、
ＨＩＶトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、
Ｓｙｎｅｍｂｒｙｎ Ｂ（ＳｙｎＢ）１ ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、
ＳｙｎＢ３ ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；
ＰＴＤ－４ ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ；
ＰＴＤ－５ ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；
フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）コート－（３５－４９）ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ、
ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）Ｇａｇ－（７－２５）ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、
ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ）－ＩＩ Ｒｅｘ－（４－１６）
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、
Ｄ－Ｔａｔ ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、
Ｒ９－Ｔａｔ ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ、
トランスポータン ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬキメラ、
微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ、
ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）
ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、
葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、
ヒト３－メチルアデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ）（ＭＰＧ）
ａｃ－ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、
１０ＭＰＧ－核局在化配列（ＮＬＳ）
ａｃ－ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ－ｃｙａ、
Ｐｅｐ－１ ａｃ－ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、および
Ｐｅｐ－２ ａｃ－ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ－ｃｙａ、または
ＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリアルギニン、ＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラなどのポリリジン、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ．（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、およびＲ８。
【0085】
タンパク質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはポリリジンを含むことができる。タンパク質導入ドメインは、アルギニンおよびリジンリピート配列を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、連続的なアルギニン残基などのアルギニン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、アルギニン残基から本質的になることができる。タンパク質導入ドメインは、４～２０個のアルギニン残基などのアルギニン反復を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、８個のアルギニン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約６～約１２個のアルギニン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約７～約９個のアルギニン残基を含むことができる。
【0086】
タンパク質導入ドメインは、約４～約１２個のアミノ酸残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約６～約１２個のアミノ酸残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約７～約９個のアミノ酸残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、少なくとも約４個のアミノ酸残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、少なくとも約６個のアミノ酸残基を含むことができる。
【0087】
タンパク質導入ドメインは、連続的なリジン残基などのリジン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、リジン残基から本質的になることができる。タンパク質導入ドメインは、４～２０個のリジン残基などのリジン反復を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、８個のリジン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約４～約１２個のリジン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約６～約１２個のリジン残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約７～約９個のリジン残基を含むことができる。
【0088】
タンパク質導入ドメインは、連続的なＱＲ反復残基など、Ｑ残基およびＲ残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、Ｑ残基およびＲ残基から本質的になることができる。タンパク質導入ドメインは、４～２０個のＯＲ反復残基などのＱＲ反復を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、８個のＱＲ反復残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約６～約１２個のＱＲ反復残基を含むことができる。タンパク質導入ドメインは、約７～約９個のＱＲ反復残基を含むことができる。
【0089】
一実施形態では、カーゴはカーゴ結合分子に結合している。カーゴは、送達分子の製造中、製造後、使用前、または使用中にカーゴ結合分子に結合していてよい。
【0090】
カーゴ結合分子は、カーゴ分子のための担体であってよい。単一のカーゴ結合分子は、複数のカーゴ分子を結合して該分子を担持することができる。カーゴ結合分子は、細胞内への内在化の前にカーゴを保護することができる。カーゴ結合分子は、ビオチン化カーゴ上のビオチンに結合することができる可能性がある。カーゴ結合分子は、核酸系カーゴに結合することができる可能性がある。カーゴ結合分子は、ペプチド系カーゴに結合することができる可能性がある。カーゴ結合分子は、抗体カーゴまたはその断片もしくは模倣物に結合することができる可能性がある。カーゴ結合分子は、金属またはポリマーナノ粒子などのナノ粒子カーゴに結合することができる可能性がある。カーゴ結合分子は、細胞内で機能的に不活性であってよいが、活性のあるカーゴを担持することができるか、または該カーゴに結合することができる。カーゴ結合分子は、化学リンカー分子を含むことができる。カーゴ結合分子は、親和性タグを含むことができる。カーゴ結合分子は、ペプチドまたはタンパク質を含むことができる。カーゴ結合分子は、ｍＳＡ２（ストレプトアビジン２単量体）を含むことができる。カーゴ結合分子は、ＬＫ１５などの核酸相互作用ペプチドを含むことができる。カーゴ結合分子は、ＩｇＧ結合タンパク質などの抗体結合分子を含むことができる。ＩｇＧ結合タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ含有タンパク質ＳｐＡＢを含むことができる。当業者は、分子の何らかの適切な対または群が、カーゴおよびカーゴ結合分子について使用されることができ、ただし、該分子が、該カーゴおよび該カーゴ結合分子との間で十分な結合または親和性を有することを条件とすることを理解するであろう。
【0091】
カーゴとカーゴ結合分子との間の結合または相互作用は、例えば、細胞内環境において可逆的または分解可能であってよい。
【0092】
ＧＡＧ結合要素およびタンパク質導入ドメインは、直接的な化学的共役によって、またはリンカー分子を経て、カーゴおよび／またはカーゴ結合分子に結合することができる。ＧＡＧ結合要素およびタンパク質導入ドメインは、直接的な化学的共役によって、またはリンカー分子を経て、カーゴに結合することができる。ＧＡＧ結合要素およびタンパク質導入ドメインは、直接的な化学的共役によって、またはリンカー分子を経て、カーゴ結合分子に結合することができる。ＧＡＧ結合要素、タンパク質導入ドメインおよびカーゴは、単一の融合分子であってよい（例えば、単一の融合分子は、単一のペプチド分子としてコードされることができおよび転写されることができる）。ＧＡＧ結合要素、タンパク質導入ドメインおよびカーゴ結合分子は、単一の融合分子であってよい（例えば、単一の融合分子は、単一のペプチド分子としてコードされることができおよび転写されることができる）。タンパク質導入ドメインおよびＧＡＧ結合要素は、カーゴ結合分子および／またはカーゴに挟まれていることができる。
【0093】
送達分子は、長さが約１０～約３０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約２０～約３０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約３０～約３０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約４０～約３０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約１０～約１０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約２０～約１０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約４０～約１０，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約１０～約３，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約２０～約３，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約４０～約３，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約１０～約１０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約２０～約１０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約４０～約１０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約４０～約５００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約１０～約５００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約２０～約５００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが約１００～約３，０００アミノ酸であってよい。送達分子は、長さが少なくとも約１００アミノ酸であってよい。
【0094】
送達分子は、単一の融合分子であってよい。カーゴ、ＨＳ－ＧＡＧ結合要素、およびタンパク質導入ドメインは、一緒に融合していることができる。ＨＳ－ＧＡＧ結合要素およびタンパク質導入ドメインは、カーゴを挟んでいることができる。カーゴ、ＨＳ－ＧＡＧ結合要素、およびタンパク質導入ドメインは、１つ以上のリンカー分子によって一緒に連結していることができる。
【0095】
送達分子は、少なくとも１ＫＤａの分子量を有することができる。送達分子は、少なくとも５ＫＤａの分子量を有することができる。送達分子は、少なくとも１０ＫＤａの分子量を有することができる。送達分子は、少なくとも２０ＫＤａの分子量を有することができる。送達分子は、４００ＫＤａ以下の分子量を有することができる。送達分子は、３００ＫＤａ以下の分子量を有することができる。送達分子は、約０．５ＫＤａ～約４００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約１ＫＤａ～約４００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約０．５ＫＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約１ＫＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約２ＫＤａ～約３００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約２０ＫＤａ～約３００ｋＤａの分子量を有することができる。送達分子は、約２０ＫＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有することができる。
【0096】
カーゴは、イオン結合または共有結合など、タンパク質導入ドメインおよび／またはＧＡＧ結合要素に結合することができ得る。
【0097】
一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、送達のための分子（カーゴ）を含む。特に、送達のための分子（すなわち、カーゴ）およびトランスフェクション送達分子は、「トランスフェクション送達分子」と称することができる。
【0098】
細胞／細胞の集団
細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってよい。細胞は、癌性細胞であってよい。細胞は、幹細胞であってよい。細胞は、変異細胞であってよい。細胞は、細胞の集団を含んでよい。細胞の集団は、細胞型の混合集団であってよい。細胞は、ｉＨＭＳＣなどの間葉系幹細胞であってよい。細胞は、胚性幹細胞であってよい。細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）などの多能性幹細胞であってよい。
細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってよい。細胞は、癌性細胞であってよい。細胞は、幹細胞であってよい。細胞は、変異細胞であってよい。細胞は、細胞の集団を含んでよい。細胞の集団は、細胞型の混合集団であってよい。細胞は、ｉＨＭＳＣなどの間葉系幹細胞であってよい。細胞は、胚性幹細胞であってよい。細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）などの多能性幹細胞であってよい。
【0099】
一実施形態では、トランスフェクションのための細胞または細胞の集団は、ＬＣＬまたはＲＡＷ２４６．７などの血球である。一実施形態では、トランスフェクションのための細胞または細胞の集団は、ＢＶ２などのミクログリアである。
【0100】
一実施形態では、トランスフェクションのための細胞または細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）、精子、卵母細胞、骨格筋細胞、脳細胞、および肺細胞、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【0101】
肺細胞は、肺胞細胞を含んでよい。脳細胞は、ニューロンおよび／またはグリア細胞を含んでよい。骨格筋細胞は、筋細胞および／または筋芽細胞を含んでよい。
【0102】
当業者は、トランスフェクトされる細胞の数が、用途、およびトランスフェクションがインビボであるかインビトロであるかに応じて異なってよいことを認識するであろう。一実施形態では、例えばインビトロで、トランスフェクトされる細胞の数は、少なくとも１０００個の細胞、５０００個の細胞、１×１０３個の細胞、５×１０３個の細胞、または８×１０３個の細胞、またはそれを超える細胞を含む。別の実施形態では、例えばインビボで、トランスフェクトされる細胞の数は、少なくとも１０００個の細胞、５０００個の細胞、１×１０３個の細胞、５×１０３個の細胞、８×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、１×１０６個の細胞、１×１０７個の細胞、または１×１０８個の細胞、またはそれを超える細胞を含む。
【0103】
本方法はさらに、例えば、トランスフェクトされる細胞の接触を容易にし、トランスフェクション効率を高めるために、トランスフェクトされる細胞と共に送達分子を遠心分離することを含んでよい。
【0104】
他の方法の詳細
本方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。本方法がインビボで実施される実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象の体内にあってよい。対象は、ヒトなどの哺乳動物であってよい。
本方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。本方法がインビボで実施される実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象の体内にあってよい。対象は、ヒトなどの哺乳動物であってよい。
【0105】
本方法がインビトロで実施される実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象から単離されてよい。細胞は、維持された細胞株、または対象から抽出された維持された細胞培養物であってよい。
【0106】
本方法がインビボで実施される実施形態では、ＰＫＣモジュレーターおよび／またはトランスフェクションのための分子は、対象に投与することができる。ＨＤＡＣ阻害をさらに提供する実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤を対象に投与することができる。ＰＫＣモジュレーターおよび／またはトランスフェクションのための分子は、医薬として許容され得る賦形剤中で提供することができる。ＨＤＡＣ阻害剤は、医薬として許容され得る賦形剤中で提供することができる。投与は、全身、および／またはトランスフェクトされるインサイツの細胞に直接的であってよい。
【0107】
細胞に分子をトランスフェクトする方法は、非ウイルストランスフェクション法であってよい。「非ウイルストランスフェクション法」は、トランスフェクションのための分子がウイルス起源ではない何らかのトランスフェクション法を包含することが当業者によって理解されることができる。
【0108】
有利なことに、非ウイルストランスフェクション法は、ウイルストランスフェクション法と比較して、導入遺伝子発現の持続時間がより短いことを可能にし、いろいろなサイズのＤＮＡを輸送することを可能にし、より安価であり、調製がより容易であり、インビボ免疫応答をほとんどまたは全く生じない。
【0109】
インビトロトランスフェクションは、細胞成長培地、緩衝液または生理塩類溶液中で実施することができる。
【0110】
ｐＨ介在性エンドソーム逸出
一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと組み合わせて送達されるなど使用することができる。
一実施形態では、トランスフェクション送達分子は、約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと組み合わせて送達されるなど使用することができる。
【0111】
ヒスチジンはかなりの緩衝能を呈するので、後期エンドソームまたはリソソームの低いｐＨ値でプロトン化されるであろう。ヒスチジンのイミダゾール環などの非プロトン化残基は、エンドソーム／リソソーム内へとポンプ注入されるときにプロトンを吸収することができ、より多くのプロトンがポンプ注入されるのをもたらし、Ｃｌ－イオンおよび水の流入の上昇につながることを説明する「プロトン－スポンジ」仮説がある。浸透圧膨潤と、プロトン化アミン基間の反発によるカーゴ内での正に帯電した残基の膨潤との組み合わせは、エンドソーム／リソソーム膜の破裂を引き起こし、その後、その内容物が細胞質中へと放出される。
【0112】
後期エンドソームおよびリソソーム中へのプロトン輸送の上昇は、ＡＴＰ駆動性Ｖ－ＡＴＰアーゼによるものである。このポンプはプロトンの持続的な輸送が可能であり、細胞質ゾル中で十分なＡＴＰが利用可能である限り、Ｖ－ＡＴＰアーゼ活性は小胞膜を横切るプロトン勾配を保持することを目的とする。ＧＥＴペプチドはリソソームを緩衝する可能性が高いが、Ｖ－ＡＴＰアーゼポンプは、プロトンの流入を上昇させることによって小胞の大部分を酸性に保つ。プロトンの流入が上昇しても、「プロトンスポンジ」仮説のために、ｐＨの変化は観察されない。
【0113】
一実施形態では、約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを、本明細書に説明するＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子に添加することができる。特に、ｐＨ応答性ペプチドは、本明細書に説明するＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子に結合していることができるか、またはトランスフェクション送達分子と複合体形成することができる。ｐＨ応答性ペプチドは、例えば、融合ペプチドの形態で、本明細書に説明するＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子に共有結合していることができる。
【0114】
別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、トランスフェクション送達分子と共に提供されるアクセサリーペプチドであってよい。一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、エンドソーム小胞内で放出されるナノ粒子内に含有されていてよい。
【0115】
別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、本明細書に説明するＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子のＰＴＤ（タンパク質導入ドメイン／ＣＰＰ）を置き換えることができる。
【0116】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、５～２０個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、５～１２個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、８～２０個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、５～１５個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、８～１５個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、８～１２個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、９～１１個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、１０個のヒスチジン残基と、核酸と相互作用する配列とを含むか、または該残基と該配列とからなる。
【0117】
核酸と相互作用する配列は、核酸を、好ましくは非特異的に、例えば該核酸の電荷を介して待つことができる可能性がある。核酸と相互作用する配列は両親媒性であってよく、それによってエンドソームの逸出機能も有することができる。核酸と相互作用する配列は、長さが５～３０残基であってよい。核酸と相互作用する配列は、長さが２５、３０または４０残基以下であってよい。核酸と相互作用する配列は、複数のＫ残基および／もしくはＬ残基を含むことができるか、または該複数のＫ残基および／もしくはＬ残基からなることができる。核酸と相互作用する配列は、１０～２５個のＫ残基および／もしくはＬ残基を含むことができるか、または該１０～２５個のＫ残基および／もしくはＬ残基からなることができる。核酸と相互作用する配列は、１５個のＫ残基および／もしくはＬ残基を含むことができるか、または該１５個のＫ残基および／もしくはＬ残基からなることができる。Ｋ残基およびＬ残基は交互であることができるか、またはｐＨ応答性ペプチドはＫＬＬおよび／もしくはＫＬＬＬの繰返し単位を含むことができる。核酸と相互作用する配列は、ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫ（配列番号１９）もしくはその変異体を含むことができるか、またはそれらからなることができる。該変異体は、配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有することができる。
【0118】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、配列ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（本明細書では「ＬＫ１５－１０Ｈ」と称される）（配列番号２０）もしくはその変異体を含むかまたは該配列もしくはその変異体からなる。該変異体は、配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有することができる。一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、配列ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫ（Ｈ５～２０）（配列番号２１）を含むまたは該配列からなる。
【0119】
ｐＨ応答性ペプチドがＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子に結合している実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、ＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子のタンパク質導入ドメインを置き換えることができる。ｐＨ応答性ペプチドがＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子に結合している別の実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドは、ＧＡＧペプチドなどのトランスフェクション送達分子のタンパク質導入ドメインに加えて提供することができる。
【0120】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドを有するトランスフェクション送達分子は、次の配列を含むまたは該配列からなる。
ＦＬＨＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２２）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－１０Ｈ）（本明細書では「４４」とも称される）。
ＦＬＨＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２２）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－１０Ｈ）（本明細書では「４４」とも称される）。
【0121】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドを有するトランスフェクション送達分子は、次の配列を含むまたは該配列からなる。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲ （配列番号２３）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－１０Ｈ－８Ｒ）（本明細書では「ＦＬＨＲ」とも称される）。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲ （配列番号２３）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－１０Ｈ－８Ｒ）（本明細書では「ＦＬＨＲ」とも称される）。
【0122】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドを有するトランスフェクション送達分子は、次の配列を含むまたは該配列からなる。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２４）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－８Ｒ－１０Ｈ）（本明細書では「ＦＬＲＨ」とも称される）。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＲＲＲＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２４）（ＦＧＦ２Ｂ－ＬＫ１５－８Ｒ－１０Ｈ）（本明細書では「ＦＬＲＨ」とも称される）。
【0123】
一実施形態では、ｐＨ応答性ペプチドを有するトランスフェクション送達分子は、次の配列を含むまたは該配列からなる。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２５）（ＦＧＦ２Ｂ－８Ｒ－ＬＫ１５－１０Ｈ）（本明細書では「ＦＲＬＨ」とも称される）。
ＴＹＲＳＲＫＹＴＳＷＹＶＡＬＫＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬＬＫＬＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ （配列番号２５）（ＦＧＦ２Ｂ－８Ｒ－ＬＫ１５－１０Ｈ）（本明細書では「ＦＲＬＨ」とも称される）。
【0124】
他の態様
本発明の別の態様によると、組成物であって、
ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、組成物が提供される。
本発明の別の態様によると、組成物であって、
ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、組成物が提供される。
【0125】
好ましくは、ｐＨ応答性ペプチドの５～２０個のヒスチジン残基は、エンドソームの酸性環境下でプロトン化されることができる。
【0126】
該組成物の一実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ＰＫＣ阻害剤であってよい。該組成物は、ＨＤＡＣ阻害剤をさらに含んでよい。該組成物は、医薬として許容され得る組成物であってよい。
【0127】
本発明の別の態様によると、キットであって、
ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、キットが提供される。
ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
トランスフェクションのための分子と、
を含む、キットが提供される。
【0128】
該キットの一実施形態では、ＰＫＣのモジュレーターは、ＰＫＣ阻害剤であってよい。
【0129】
該キットは、ＨＤＡＣ阻害剤をさらに含んでよい。該キットの構成要素は、別々にまたは組成として提供されてよい。
【0130】
該キットは、遠心管と、場合により遠心分離機をさらに備えてよい。
【0131】
トランスフェクションのための分子は、凍結乾燥した形態にあってよい。該キットは、緩衝液などの再構成溶液を追加として備えてよい。
【0132】
本発明の別の態様によると、トランスフェクションのための分子の細胞へのトランスフェクションを増強する方法であって、
該細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップと、
該細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節し、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供して、該細胞内のエンドソーム放出を増強するステップと、
を含む方法が提供される。
該細胞へのトランスフェクションのための分子を添加するステップと、
該細胞内のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節し、および／または、約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドを提供して、該細胞内のエンドソーム放出を増強するステップと、
を含む方法が提供される。
【0133】
ｐＨ応答性ペプチドは、内在化後にエンドソーム内でプロトン化されることができる。
【0134】
トランスフェクションのための分子は、それ自体では細胞内のＰＫＣの活性を調節することができない可能性がある。トランスフェクションのための分子は、阻害剤または活性化因子など、ＰＫＣモジュレーターを含むことができないかまたは該モジュレーターからなることができない。
【0135】
本発明の別の態様によると、細胞トランスフェクション効率を高めるための、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドの使用が提供される。
【0136】
場合により、ＨＤＡＣモジュレーターは、ＰＫＣのモジュレーターと組み合わせて、細胞トランスフェクション効率を高めるために使用することができる。特に、該使用は、ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせることができる。該使用は、ＧＥＴ介在性トランスフェクションによるものであることができる。
【0137】
本発明の方法は、遺伝子療法において使用することができる。
【0138】
本発明の別の態様によると、遺伝子療法の方法であって、対象に、
（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
（ｂ）トランスフェクションのための分子であって、核酸を含む、トランスフェクションのための分子と、
を投与することを含む、遺伝子療法の方法が提供される。
（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
（ｂ）トランスフェクションのための分子であって、核酸を含む、トランスフェクションのための分子と、
を投与することを含む、遺伝子療法の方法が提供される。
【0139】
遺伝子療法の方法は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与をさらに含むことができる。
【0140】
本発明の別の態様によると、対象の処置の方法であって、該対象に、
（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
（ｂ）トランスフェクションのための分子であって、治療上有効な分子を含む、トランスフェクションのための分子と、
を投与することを含む、方法が提供される。
（ａ）ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドと、
（ｂ）トランスフェクションのための分子であって、治療上有効な分子を含む、トランスフェクションのための分子と、
を投与することを含む、方法が提供される。
【0141】
治療上有効な分子は、本明細書に説明するような核酸、タンパク質またはペプチドであってよい。治療上有効な分子は、例えば、本明細書に説明するように、遺伝子配列および／または調節配列をコードする核酸であってよい。
【0142】
本発明の別の態様によると、本明細書の本発明の方法によって形質転換された細胞を対象に投与することを含む、該対象の処置方法が提供される。
【0143】
本明細書の本発明の方法によって形質転換された細胞は、トランスフェクションのための分子を細胞内に含むことができる。
【0144】
本発明の別の態様によると、薬剤としてのトランスフェクションのための分子との併用のための、ＰＫＣのモジュレーターおよび／または約５～約２０個のヒスチジン残基を含むｐＨ応答性ペプチドが提供される。
【0145】
該使用は、遺伝子療法のためであってよい。別の実施形態では、該使用は、疾患の処置または予防のためであってよい。別の実施形態では、該使用は組織の修復または置き換えのためであってよい。該組織は、軟組織または骨組織であってよい。
【0146】
処置または予防は、単一遺伝子疾患の処置または予防のためであってよい。単一遺伝子疾患は、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、多発性嚢胞腎疾患、テイ・サックス病、α１アンチトリプシン欠損症、および原発性毛様体ジスキネジアを含む群のいずれかから選択することができる。
【0147】
処置または予防は、成長因子過剰発現によって処置または予防することができる疾患または容態の処置または予防のためであってよい。処置または予防は、創傷治癒、組織修復、骨修復、糖尿病性潰瘍、神経変性（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）、または骨関節症を含む疾患または容態の処置または予防のためであってよい。
【0148】
定義
「モジュレーター」は、アゴニスト、インバースアゴニスト、またはアンタゴニストを説明すると当業者に理解されることができ、すなわちモジュレーターはその標的の活性を上昇または低下させることができる。
「モジュレーター」は、アゴニスト、インバースアゴニスト、またはアンタゴニストを説明すると当業者に理解されることができ、すなわちモジュレーターはその標的の活性を上昇または低下させることができる。
【0149】
「阻害剤」は、インバースアゴニストまたはアンタゴニストを説明すると当業者によって理解されることができ、すなわち、阻害剤はその標的の活性を低減または停止させる。
【0150】
「一時的阻害」または「一時的活性化」をはじめとする「一時的調節」という用語は、永続的ではない、細胞内の活性の調節であると理解される。例えば、調節薬の離脱または非存在の際に、元の細胞活性が回復することができる。対照的に、永続的な調節は、突然変異による遺伝子のノックアウトなどの遺伝子調節を含むことができる。
【0151】
「トランスフェクション」および「導入」という用語は、本明細書で相互交換可能に使用され得る。該用語は、核酸またはタンパク質などの分子を細胞内へと導入するプロセスを意味すると理解される。
【0152】
細胞に関して「トランスフェクトされた」、「導入された」または「形質転換された」という用語は、細胞がトランスフェクションのための分子を内在化したことを意味すると理解される。トランスフェクションのための分子は、細胞質および／または核内にあってよく、すなわちエンドソーム内に隔離されていなくてよい。成功したトランスフェクションは、レポーター遺伝子発現（ＧＦＰまたは他の蛍光タンパク質およびフローサイトメトリーなど）を介して測定することができる。当業者は、該方法が、毎回、または該方法の実施のために、トランスフェクション率またはトランスフェクション効率の決定を必要としなくてよいことを理解するであろう。「遺伝子療法」という用語は、治療上の利益を提供するために、または容態もしくは疾患を予防するために、遺伝子および／または調節要素などの遺伝材料を対象の１つ以上の細胞内へ導入することであると理解される。
【0153】
当業者は、本発明の一実施形態または一態様の任意の特徴が、適宜、本発明の他の実施形態または態様に適用可能である可能性があることを理解するであろう。
【0154】
以下、本発明の実施形態を、添付の図面に関して、例としてのみ、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0155】
【図1】ＴＰＡ（Ｔ）は、Ｔ２細胞のトランスフェクションを有意に増強する。１μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡのＧＥＴによるトランスフェクションの２４時間後に測定した、２０，０００個のＴ２ハイブリッドヒトＴ／Ｂ細胞に関する実験。Ｔ＝ＴＰＡ（μｍ）、Ｓ＝ＳＡＨＡ（μＭ）。ＴＰＡは、Ｔ２細胞におけるトランスフェクション効率に対する主要な効果として示されている。
【図2】ＳＡＨＡ（Ｓ）は、ＲＡＷ２６４．７細胞のトランスフェクションを有意に増強する。１μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡのＧＥＴによるトランスフェクションの２４時間後に測定した、２０，０００個のＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞に関する実験。Ｔ＝ＴＰＡ（μｍ）、Ｓ＝ＳＡＨＡ（μＭ）。
【図3】ＳＡＨＡ（Ｓ）、およびＴＰＡ（Ｔ）の短時間曝露は、ＬＣＬ細胞のトランスフェクションを有意に増強する。１μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡのＧＥＴによるトランスフェクションの２４時間後に測定した、２０，０００個のＬＣＬリンパ芽球様ヒトＢ細胞に関する実験。Ｔ＝ＴＰＡ（μｍ）、Ｓ＝ＳＡＨＡ（μＭ）。ＴＰＡは、ＬＣＬ細胞におけるトランスフェクションに対して最も効果があることが示されており、ＳＡＨＡによって増強される。これらのモジュレーターを用いないトランスフェクションは事実上存在しない。
【図4】Ｔ２細胞のトランスフェクション。ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡのＧＥＴによるトランスフェクションの２４時間後に測定した、２０，０００個のＴ２ハイブリッドヒトＴ／Ｂ細胞に関する実験。１×＝ＧＥＴを用いた１μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡ。０．２×＝ＧＥＴを用いた０．２μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡ。Ｔ＝ＴＰＡ（μｍ）、Ｓ＝ＳＡＨＡ（μＭ）。
【図5】ＬＣＬ細胞のトランスフェクション。ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡのＧＥＴによるトランスフェクションの２４時間後に測定した、２０，０００個のＬＣＬリンパ芽球様ヒトＢ細胞に関する実験。１×＝ＧＥＴを用いた１μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡ。０．２×＝ＧＥＴを用いた０．２μｇのｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｐＤＮＡ。Ｔ＝ＴＰＡ（μｍ）、Ｓ＝ＳＡＨＡ（μＭ）。
【図6】ラット小脳切片についてのトランスフェクションプロトコルの概略。 出生８日後（Ｐ８）の仔ラットに関する実験。実体顕微鏡を用いて、氷冷調製培地中で脳から小脳を摘出する。厚さ３５０μｍの切片を、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパまたはビブロトームを使用して矢状方向に作製する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ細胞培養インサート（１ウェルあたり０．２５ｍｌおよび上部に５０μｌ）。トランスフェクション物（１００μｌ）を上部ウェル内のスライスに添加することによって、インビトロで３～５日後（Ｄ３～５）にトランスフェクションを開始した。
【図7】同じペプチドに関するエンドソーム逸出系。ｐＣＭＶ－ｇｌｕｃならびに、ペプチド：ｐＤＮＡ電荷比が低下（５：１、４：１、３：１、２：１、１：１）するＦＬＲ、ＦＬＨおよびＦＲＬＨを用いたヒト皮膚線維芽細胞のトランスフェクション。Ｇｌｕｃをトランスフェクションの１日後に測定し、１ｕｇのｐＤＮＡを２×１０５個の細胞の１２ウェルプレート内にトランスフェクトした。バーはＳＤである。Ｎ＝３。
【図8】アクセサリーペプチドに関するエンドソーム逸出系。ｐＣＭＶ－ｇｌｕｃならびに、ＦＬＨおよびＦＲＬＨの比率を高めながら（５：１、４：１、３：１、２：１、１：１のＦＬＲ、アクセサリーペプチドはｐＤＮＡに対して５：１までペプチド電荷を構成する）または高めることなくＦＬＲを用いたヒト皮膚線維芽細胞のトランスフェクション。Ｇｌｕｃをトランスフェクションの１日後に測定し、１ｕｇのｐＤＮＡを２×１０５個の細胞の１２ウェルプレート内にトランスフェクトした。バーはＳＤである。Ｎ＝３。
【図9】ＨＤＡＣｉ活性は、トランスフェクションの初期（マクロピノサイトーシスおよびエンドソーム輸送の間）であり、（転写活性に影響を及ぼす）その後ではない。急速トランスフェクション（５分）によるｐＣＭＶ－ｇｌｕｃおよびＦＬＲ：ＦＬＨ（１：１）を用いたヒト不死化ＭＳＣのトランスフェクション。トランスフェクション物を取り出し、取り込み／トランスフェクションの最初の６時間において１時間、ＳＡＨＡ（１～１００ｕＭ、Ｓ１～１００）に曝露した。Ｇｌｕｃをトランスフェクションの１日後に測定し、１ｕｇのｐＤＮＡを２×１０５個の細胞の１２ウェルプレート内にトランスフェクトした。バーはＳＤである。Ｎ＝３。
【図10】ＨＤＡＣおよびＰＫＣ阻害（阻害剤ＳＡＨＡおよびＧＦ１０９２０３Ｘ、ＧＦＸ）の存在下でのｉＨＭＳＣのトランスフェクション。ＧＦＸ０＝０μＭのＧＦ１０９２０３Ｘ、ＧＦＸ０．１＝０．１μＭのＧＦ１０９２０３Ｘ、ＧＦＸ１＝１μＭのＧＦ１０９２０３Ｘ、Ｓ０＝０μＭのＳＡＨＡ、Ｓ１＝１μＭのＳＡＨＡ、Ｓ１０＝１０μＭのＳＡＨＡ。
【図11】ＨＤＡＣおよびＰＫＣ阻害（阻害剤ＳＡＨＡおよびカルホスチンＣ）の存在下でのＬＣＬのトランスフェクション。ＣＰＣ０＝０μＭのカルホスチンＣ、ＣＰＣ０．１＝０．１μＭのカルホスチンＣ、Ｓ０＝０μＭのＳＡＨＡ、Ｓ１＝１μＭのＳＡＨＡ、Ｓ１０＝１０μＭのＳＡＨＡ。
【0156】
使用する材料
ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現する哺乳動物発現ベクターである。ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎ８０８１－ｐｃｍｖ－ｇｌｕｃ－２－ｃｏｎｔｒｏｌ－ｐｌａｓｍｉｄ＃Ｐｒｏｄｕｃｔ％２０Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手した。
ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現する哺乳動物発現ベクターである。ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎ８０８１－ｐｃｍｖ－ｇｌｕｃ－２－ｃｏｎｔｒｏｌ－ｐｌａｓｍｉｄ＃Ｐｒｏｄｕｃｔ％２０Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手した。
【0157】
ｐＧＭ（ｐＧＭ２０６）は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現するＣｐＧ非含有ＤＮＡベクター版（ｐＧ４－ｈＣＥＦＩ－ｓｏＧｌｕｃ）である（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｉｍｐｅｒｉａｌ．ａｃ．ｕｋ：８０８０／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／１００４４／１／１９１７９／２／Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ＿３２＿１０＿２０１１．ｐｄｆ）。
【0158】
当業者は、トランスフェクション効率を実証するために何らかの適切な対照ベクターを使用することができることを認識するであろう。
トランスフェクション送達分子についての例となる配列
例となるＨＳ－ＧＡＧ結合配列
Ｐ２１アミノ酸配列
（配列番号１）
ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ
Ｐ２１ヌクレオチド配列（メチオン／ＡＴＧ含有）：
（配列番号２）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇ
ＰＤＧＦ（１９４～２１１）アミノ酸配列：
（配列番号３）
Ｇ Ｒ Ｐ Ｒ Ｅ Ｓ Ｇ Ｋ Ｋ Ｒ Ｋ Ｒ Ｋ Ｒ Ｌ Ｋ Ｐ Ｔ
ＰＤＧＦ（１９４～２１１）ヌクレオチド配列：
（配列番号４）
ｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇａａａｇｃｇｇｃａａａａａａｃｇｃａａａｃｇｃａａａｃｇｃｃｔｇａａａｃｃｇａｃｃ
ＦＧＦ７Ｂアミノ酸配列：
（配列番号５）。
Ｔ Ｙ Ａ Ｓ Ａ Ｋ Ｗ Ｔ Ｈ Ｎ Ｇ Ｇ Ｅ Ｍ Ｆ Ｖ Ａ Ｌ Ｎ Ｑ
ＦＧＦ７Ｂヌクレオチド配列：
（配列番号６）
Ａｃｃｔａｔｇｃｇａｇｃｇｃｇａａａｔｇｇａｃｃｃａｔａａｃｇｇｃｇｇｃｇａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａｃｃａｇ
ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｂ（２４７～２６２）アミノ酸配列：
（配列番号７）。
Ｔ Ｙ Ｒ Ｓ Ｒ Ｋ Ｙ Ｔ Ｓ Ｗ Ｙ Ｖ Ａ Ｌ Ｋ Ｒ
ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｂ（２４７～２６２）ヌクレオチド配列：
（配列番号８）
ａｃｃｔａｔｃｇｃａｇｃｃｇｃａａａｔａｔａｃｃａｇｃｔｇｇｔａｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａａｃｇｃ
８Ｒタンパク質導入ドメイン配列をコードするヌクレオチド：
（配列番号９）
ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＡ ＡＧＧ
例となる送達分子ヌクレオチド配列（Ｐ２１－カーゴ－８Ｒ）：
（配列番号１０）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇＮｃｇａａｇａｃｇｃａｇｇａｇａｃｇｔｃｇａａｇｇ
Ｎ＝様々な長さのカーゴ核酸配列（すなわち、ヌクレオチド残基の数は変わることができる）、または別の分子実体。
トランスフェクション送達分子についての例となる配列
例となるＨＳ－ＧＡＧ結合配列
Ｐ２１アミノ酸配列
（配列番号１）
ＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ
Ｐ２１ヌクレオチド配列（メチオン／ＡＴＧ含有）：
（配列番号２）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇ
ＰＤＧＦ（１９４～２１１）アミノ酸配列：
（配列番号３）
Ｇ Ｒ Ｐ Ｒ Ｅ Ｓ Ｇ Ｋ Ｋ Ｒ Ｋ Ｒ Ｋ Ｒ Ｌ Ｋ Ｐ Ｔ
ＰＤＧＦ（１９４～２１１）ヌクレオチド配列：
（配列番号４）
ｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇａａａｇｃｇｇｃａａａａａａｃｇｃａａａｃｇｃａａａｃｇｃｃｔｇａａａｃｃｇａｃｃ
ＦＧＦ７Ｂアミノ酸配列：
（配列番号５）。
Ｔ Ｙ Ａ Ｓ Ａ Ｋ Ｗ Ｔ Ｈ Ｎ Ｇ Ｇ Ｅ Ｍ Ｆ Ｖ Ａ Ｌ Ｎ Ｑ
ＦＧＦ７Ｂヌクレオチド配列：
（配列番号６）
Ａｃｃｔａｔｇｃｇａｇｃｇｃｇａａａｔｇｇａｃｃｃａｔａａｃｇｇｃｇｇｃｇａａａｔｇｔｔｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａｃｃａｇ
ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｂ（２４７～２６２）アミノ酸配列：
（配列番号７）。
Ｔ Ｙ Ｒ Ｓ Ｒ Ｋ Ｙ Ｔ Ｓ Ｗ Ｙ Ｖ Ａ Ｌ Ｋ Ｒ
ＦＧＦ２ ＨＢＤ Ｂ（２４７～２６２）ヌクレオチド配列：
（配列番号８）
ａｃｃｔａｔｃｇｃａｇｃｃｇｃａａａｔａｔａｃｃａｇｃｔｇｇｔａｔｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａａｃｇｃ
８Ｒタンパク質導入ドメイン配列をコードするヌクレオチド：
（配列番号９）
ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＧＡ ＡＧＧ
例となる送達分子ヌクレオチド配列（Ｐ２１－カーゴ－８Ｒ）：
（配列番号１０）
ａａｇｃｇｃａａｇａａｇａａｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｇｃａａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃｃｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃａａｇｔａｔａａｇＮｃｇａａｇａｃｇｃａｇｇａｇａｃｇｔｃｇａａｇｇ
Ｎ＝様々な長さのカーゴ核酸配列（すなわち、ヌクレオチド残基の数は変わることができる）、または別の分子実体。
【0159】
ＳｃＦｖ抗体のナノボディ変異体の各々の２つのバージョンを作製し、１つは、ＳｃＦｖ ｖＨＨドメインと同一の配列を有しており（フレームドメイン１－ＣＤＲ１－フレームドメイン２－ＣＤＲ２－フレームドメイン３－ＣＤＲ３－ＩｇＡヒンジドメイン／フレームドメイン４）、１つは、ＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメインおよびＣＤＲ３ドメインが、一般的なｖＨＨドメイン配列内へと接ぎ木されたものである。いずれのバージョンも同等の活性を有しているので、一般的な抗体にＣＤＲドメインを単に接ぎ木することもまた機能することを証明するために接ぎ木バージョンを作製した。
【0160】
以下は、ＨＳ４Ｃ３、およびＡＯ４ＢＯ８ ＳｃＦｖ ｖＨＨおよび接ぎ木したｖＨＨの配列である。
ＨＳ４Ｃ３ ＳｃＦｖ ｖＨＨ
（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＲＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＲＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＲＡＥＧＴＡＡＹＹＣＧＲＲＬＫＤＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２ ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３ ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３ ＳｃＦｖ ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１２）
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａａｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃａｇｃａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｃｇｃａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃａｇｃａａａａａｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇａａｇｇｃａｃｃｇｃｇｇｃｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＨＳ４Ｃ３を接ぎ木したｖＨＨ
（配列番号１３）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＧＲＲＬＫＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２ ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３ ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３を接ぎ木したｖＨＨヌクレオチド
（配列番号１４）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８ ＳｃＦｖ ｖＨＨ
（配列番号１５）
ＥＤＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＰＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＨＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＭＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＨＭＮＳＬＩＡＥＤＭＡＶＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＡＦＳＳＹＡ
ＣＤＲ２ ＩＧＴＧＧＤＴ
ＣＤＲ３ ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ
ＡＯ４Ｂ０８ ＳｃＦｖ ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１６）
ｇａａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａａａｇｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｔａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｔｔｇｃｇｇａａｇａｔａｔｇｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８を接ぎ木したｖＨＨ
（配列番号１７）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＡＦＳＳＹＡ
ＣＤＲ２ ＩＧＴＧＧＤＴ
ＣＤＲ３ ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ
ＡＯ４Ｂ０８を接ぎ木したｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１８）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＨＳ４Ｃ３ ＳｃＦｖ ｖＨＨ
（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＲＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＲＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＲＡＥＧＴＡＡＹＹＣＧＲＲＬＫＤＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２ ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３ ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３ ＳｃＦｖ ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１２）
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａａｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃａｇｃａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｃｇｃａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃａｇｃａａａａａｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇａａｇｇｃａｃｃｇｃｇｇｃｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＨＳ４Ｃ３を接ぎ木したｖＨＨ
（配列番号１３）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＶＳＳＮＥＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＧＲＲＬＫＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＴＶＳＳＮＥ
ＣＤＲ２ ＩＳＧＧＳＴ
ＣＤＲ３ ＧＲＲＬＫＤ
ＨＳ４Ｃ３を接ぎ木したｖＨＨヌクレオチド
（配列番号１４）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃａａｃｇａａｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇａａａｇａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８ ＳｃＦｖ ｖＨＨ
（配列番号１５）
ＥＤＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＰＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＨＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＭＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＹＬＨＭＮＳＬＩＡＥＤＭＡＶＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＡＦＳＳＹＡ
ＣＤＲ２ ＩＧＴＧＧＤＴ
ＣＤＲ３ ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ
ＡＯ４Ｂ０８ ＳｃＦｖ ｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１６）
ｇａａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｃｔｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａａａｇｃｃｔｇｔａｔｃｔｇｃａｔａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｔｔｇｃｇｇａａｇａｔａｔｇｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
ＡＯ４Ｂ０８を接ぎ木したｖＨＨ
（配列番号１７）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＡＦＳＳＹＡＬＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＷＡＶＡＡＩＧＴＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＴＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
ＣＤＲ１ ＧＦＡＦＳＳＹＡ
ＣＤＲ２ ＩＧＴＧＧＤＴ
ＣＤＲ３ ＳＬＲＭＮＧＷＲＡＨＱ
ＡＯ４Ｂ０８を接ぎ木したｖＨＨヌクレオチド配列
（配列番号１８）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｔｇｃａｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｔｔｔｇｃｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇａａｃｇｃｔｇｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｔａｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｇａａａｇｇｃｃｇｃｔｔｔａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｇａｔａａｃｇｃｇａａａａａｃａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａａｃｃｔｇａａａｃｃｇｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇａｔｔｔａｔｔａｔｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｔｇａａｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｇｃａｔｃａｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｃｃｃｃｇｃｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇｃ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】