特表2022-528439尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法、及びその方法で逆分化した腎前駆細胞を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-10
(54)【発明の名称】尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法、及びその方法で逆分化した腎前駆細胞を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220603BHJP
A61K 35/22 20150101ALI20220603BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220603BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20220603BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220603BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/22
A61P13/12
C12N5/071
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559954
(86)(22)【出願日】2020-04-09
(85)【翻訳文提出日】2021-10-08
(86)【国際出願番号】 KR2020004835
(87)【国際公開番号】W WO2020209636
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】10-2019-0041289
(32)【優先日】2019-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】314000442
【氏名又は名称】高麗大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１４５， Ａｎａｍ－ｒｏ Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０２８４１， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】スン・クォン・ユ
(72)【発明者】
【氏名】イン・ヨン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ・ウェイ・ガオ
(72)【発明者】
【氏名】フィル・ジュン・カン
(72)【発明者】
【氏名】ウォン－ジン・ユン
(72)【発明者】
【氏名】ギュマン・パク
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB12
4B065BB18
4B065BB19
4B065BC46
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB40
4C087BB41
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA81
(57)【要約】
本発明は、尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法及び前記方法で逆分化された腎前駆細胞を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。本発明は、不便と苦痛なしに容易に繰り返して得られる体細胞である尿細胞を用いて個人オーダーメード型逆分化腎前駆細胞の大量生産が可能なので、腎臓損傷の治癒と腎臓の再生分野に拡大可能な難病分野及び細胞治療剤の生産に適用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の段階を含む尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。（ａ）尿から尿細胞を分離して培養する段階と、
（ｂ）前記培養された尿細胞に逆分化因子ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸、ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質をコードする核酸、ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質をコードする核酸、ｉｖ）ｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードする核酸及びｖ）Ｓｌｕｇタンパク質をコードする核酸を導入する段階と、
（ｃ）前記逆分化因子が導入された尿細胞を腎前駆細胞培養培地で培養し、腎前駆細胞に逆分化を誘導する段階と、
（ｄ）前記腎前駆細胞に直接逆分化が誘導された細胞から腎前駆細胞の特性を持つ逆分化腎前駆細胞を選別する段階。
【請求項2】
前記尿細胞は、尿由来体細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項3】
前記（ｂ）段階は、前記逆分化因子が挿入されたウイルスベクターを直接尿細胞に導入させることを特徴とする、請求項１に記載の尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項4】
前記（ｃ）段階の培養培地は、ＦＧＦ９、ＢＭＰ７、ＣＨＩＲ９９０２１及びＹ－２７６３２を含むことを特徴とする、請求項１に記載の尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項5】
ヘパリン、ＬＤＮ－１９３１８９またはＬ－グルタミンをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項6】
マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ゼラチンまたはコラーゲンがコーティングされた培養プレートで培養することを特徴とする、請求項４に記載の尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項7】
請求項１に記載の方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
前記腎細胞損傷疾患は、急性／慢性腎不全（ａｃｕｔｅ／ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎症候群（ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、腎盂腎炎（ｎｅｐｈｒｏｐｙｅｌｉｔｉｓ）、多嚢胞性腎症（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）及び末期腎疾患（ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法及び前記方法で逆分化した腎前駆細胞を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、身体内に特定の条件及び環境が与えられるか、または自体内で必要に応じて程度に応じた無限の自己増殖能力、及び身体内で必要な特定の細胞及び組織への分化能を持っている細胞を指す。幹細胞は、３つに分類され、初期胚から分離した胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、胚期の原始生殖細胞から分離した胚生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）及び成体の骨髄から分離した多能性成体幹／前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＭＡＰＣ細胞）がある。
【0003】
幹細胞は、それぞれ特化した機能を持つ細胞に発達する潜在力を持っているため、各種臓器の機能回復及び組織再生のための細胞治療剤として研究されており、最近では、成形と美容に至るまで、その活用範囲が拡大されている傾向にある。
【0004】
生体内において成体幹細胞の役割は、大きく２つに要約できるが、第一は、幹細胞そのものが私たちの体で損傷した組織と細胞に分化して再び再生させる役割であり、第二は、一生の間持続的に成長因子及びサイトカインなどの治療因子を分泌し、近隣細胞の成長及び再生を助ける役割を果たす。
【0005】
一方、直接逆分化（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）方式は、体細胞を目標とする他のタイプの固有機能を持つ細胞に転換及び生産できる技術である。日本の山中教授の逆分化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）された誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）とは異なり、多能性幹細胞の状態（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔａｔｅ）を経ないため、核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｃ）の安定性、目標とする細胞の均質性、細胞源間の変動性、腫瘍発生のリスク、患者による特異性、時間及び労力の効率性の面で長所がある。しかし、現在行われている直接逆分化方式は、細胞源としてマウス細胞を主に用い、ヒト体細胞において同じように再現される確率が高くなく、ヒト体細胞の中では、よく皮膚細胞（線維芽細胞）を使用するが、この場合、侵襲的方式の細胞源採取方法が必要となり、供与者の痛み、安全性のリスクをもたらすことがあり、利便性が低下する。
【0006】
損傷後の自然再生において、極めて制限的な能力を持つ腎臓で腎前駆細胞の存在の有無は現在までに疑問として残っているが、学界で合意された腎臓再生のメカニズムは、次の通りである。損傷後に生き残った腎細胞が一時的に脱分化して成長でき、損傷組織を代替できる腎前駆細胞の決定的な役割を基盤とする（Ｂｅｎｉｇｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７５（９７２２）：１３１０－７，２０１０；Ｓａｌｌｕｓｔｉｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ ４（１）：３２６－３３，２０１５）。すなわち、この再生過程は、腎前駆細胞から増殖された前駆細胞が損傷した地域に移動し、成長及び分化を介して機能性腎組織として再構成される。また、このような再生過程で幹細胞による自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）、傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）、内分泌（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）の相互作用を介して、腎臓の生理学的細胞転換及び腎臓の各区画の再生に寄与する（Ｂｕｓｓｏｌａｔｉ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．６６（２）：５４５－５５，２００５；Ｓａｇｒｉｎａｔｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７（９）：２４４３－５６，２００６）。
【0007】
前駆細胞を用いた治療アプローチは、炎症反応を減らすのに寄与する。腎臓の損傷後、炎症因子及び関連血管内の作動因子による活性酸素ストレスは、組織再生のさらに他の障壁と考えられる。これは腎臓の損傷を拡大するだけでなく、腎不全患者にとって心血管系の疾患を引き起こすおそれがある。
腎臓の損傷において、体細胞から誘導された腎前駆細胞の生産、及びこれを用いた医薬品素材の開発技術は、効率性及び患者のオーダーメード型、治療効能性の面で腎臓の組織の治療と再生のための高い価値を有しており、新たな市場の開拓とともに新しいバイオ産業のモデルを提示するという面でその意味が大きいと言える（Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ．４（４）：４６２－８０，２０１４；Ｓａｌｌｕｓｔｉｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ ４（１）：３２６－３３，２０１５）。
腎臓の損傷において、体細胞から誘導された腎前駆細胞の生産、及びこれを用いた医薬品素材の開発技術は、効率性及び患者のオーダーメード型、治療効能性の面で腎臓の組織の治療と再生のための高い価値を有しており、新たな市場の開拓とともに新しいバイオ産業のモデルを提示するという面でその意味が大きいと言える（Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ．４（４）：４６２－８０，２０１４；Ｓａｌｌｕｓｔｉｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ ４（１）：３２６－３３，２０１５）。
【0008】
腎前駆細胞の場合、単純細胞代替の役割だけでなく、腎臓再生に重要な役割を果たす治療因子を分泌する役割もあるため、腎臓損傷の予防及び再生治療製剤の開発に腎臓特化した腎前駆細胞を用いるということは、科学的にも治療期待効果においても極めて当然のアプローチ方式である。
そこで、本発明者らは、損傷した腎臓組織の再生または代替のできる腎前駆細胞を製造するために鋭意努力した結果、逆分化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇを導入して過発現させた尿細胞を腎臓の発達過程において重要と考えられる因子が含まれている環境（ｎｉｃｈｅ）で培養することにより、腎前駆細胞と似たような特性を持つ逆分化腎前駆細胞に誘導し、このような逆分化腎前駆細胞を用いて組織の再生効能を確認し、本発明を完成させた。
そこで、本発明者らは、損傷した腎臓組織の再生または代替のできる腎前駆細胞を製造するために鋭意努力した結果、逆分化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇを導入して過発現させた尿細胞を腎臓の発達過程において重要と考えられる因子が含まれている環境（ｎｉｃｈｅ）で培養することにより、腎前駆細胞と似たような特性を持つ逆分化腎前駆細胞に誘導し、このような逆分化腎前駆細胞を用いて組織の再生効能を確認し、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｂｅｎｉｇｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７５（９７２２）：１３１０－７，２０１０
【非特許文献2】Ｓａｌｌｕｓｔｉｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｅｓ Ｏｐｅｎ Ａｃｃｅｓｓ ４（１）：３２６－３３，２０１５
【非特許文献3】Ｂｕｓｓｏｌａｔｉ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．６６（２）：５４５－５５，２００５
【非特許文献4】Ｓａｇｒｉｎａｔｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７（９）：２４４３－５６，２００６
【非特許文献5】Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ．４（４）：４６２－８０，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、腎臓損傷の治癒と腎臓の再生及び腎細胞損傷疾患の治療に適用可能な腎前駆細胞と似たような特性を持つ逆分化腎前駆細胞を誘導するため、尿細胞に逆分化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇを導入した後、腎臓の発達過程において重要と考えられる因子が含まれている環境（ｎｉｃｈｅ）で培養する段階を含む尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記目的を達成するため、本発明は、（ａ）尿から尿細胞を分離して培養する段階と、（ｂ）前記培養された尿細胞に逆分化因子ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸、ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質をコードする核酸、ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質をコードする核酸、ｉｖ）ｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードする核酸、及びｖ）Ｓｌｕｇタンパク質をコードする核酸を導入する段階と、（ｃ）前記逆分化因子が導入された尿細胞を腎前駆細胞培養培地で培養して腎前駆細胞に逆分化を誘導する段階と、（ｄ）前記腎前駆細胞に直接逆分化が誘導された細胞から腎前駆細胞の特性を持つ逆分化腎前駆細胞を選別する段階と、を含む尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法を提供する。
【0012】
本発明は、さらに前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【0013】
本発明は、さらに前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含有する組成物を個体に投与する段階を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療方法を提供する。
【0014】
本発明は、さらに前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含有する組成物を腎細胞損傷疾患の予防または治療に使用する用途を提供する。
【0015】
本発明は、さらに腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬剤の製造のための前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含有する組成物の用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1b】図１ｂは、女性と男性由来の尿細胞にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇ転写因子の組み合わせにより、誘導された細胞のコロニー形成能を比較した結果である（５Ｆ：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇの組み合わせ；５Ｆ－Ｓｌｕｇ：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの組み合わせ）。
【図3】図３は、尿細胞からＯＣＴ４及びＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＳＬＵＧ遺伝子を導入して逆分化腎前駆細胞に誘導した後、胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞を陽性対照群とし、ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介してＳＩＸ２及びＣＩＴＥＤ１、ＷＴ１のような腎前駆細胞マーカー遺伝子を発現するかどうかを誘導時間に応じて確認した結果である。
【図4】図４は、女性または男性由来の尿細胞を用いて逆分化腎前駆細胞を誘導したコロニーを選別した後、拡張培養してＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介してＳＩＸ２及びＣＩＴＥＤ１、ＷＴ１のような腎前駆細胞マーカー遺伝子を発現するかどうかを確認した結果である。
【図5】図５は、尿細胞を用いて逆分化腎前駆細胞を誘導した後、ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介してＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のような多能性マーカー遺伝子の発現有無により、誘導多能性幹細胞のような腫瘍発生リスクからの安定性を確認した結果である。
【図9】図９は、逆分化腎前駆細胞がＳＩＸ２とＣＩＴＥＤ１のような腎前駆細胞マーカー遺伝子が腎前駆細胞の拡張培養培地で長時間発現維持されるかｍＲＮＡレベルの解析とＦＡＣＳ解析を介して確認した結果である。
【図10A】図１０Ａは、総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて全体の遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりもＨ９、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）の発現パターンを示すかどうかを確認した結果である。
【図10B】図１０Ｂは、総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて全体の遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりもＨ９、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）の発現パターンを示すかどうかを確認した結果である。
【図10C】図１０Ｃは、総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて全体の遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりもＨ９、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）の発現パターンを示すかどうかを確認した結果である。
【図10D】図１０Ｄは、総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて全体の遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりもＨ９、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）の発現パターンを示すかどうかを確認した結果である。
【図11】図１１は、総ＲＮＡシーケンスを通じて全体の遺伝子のうち、腎臓の発達に関連した遺伝子発現レベルで逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりもＨ９、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）の発現パターンを示すかどうかを確認した結果である。
【図12】図１２は、総ＲＮＡシーケンスを通じて全体の遺伝子発現レベルで女性または男性の尿細胞から逆分化腎前駆細胞とＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞の間で、腎臓発達に関連したｍＲＮＡ発現の共通性をベンダイアグラムで示した結果である。
【図13】図１３は、総ＲＮＡシーケンスを通じて全体の遺伝子発現のうち、腎臓発達に関連した細部的に分けて各グループの遺伝子発現レベルで尿細胞から誘導された腎前駆細胞と、ＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞の間の類似性を比較した結果である。
【図14】図１４は、逆分化腎前駆細胞の糸球体足細胞（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｐｏｄｏｃｙｔｅ）への分化能を検証するため、糸球体足細胞の遺伝子マーカーであるＮｅｐｈｒｉｎ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ、ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎの発現をＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介して確認した結果である。
【図15】図１５は、逆分化腎前駆細胞の糸球体足細胞への分化能を検証するため、糸球体足細胞の特異的な形態を分化前の形態と顕微鏡で比較し、糸球体足細胞の遺伝子マーカーであるＳｙｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ、ＰＯＸＤＬの発現を免疫染色法を介して確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野において熟練した専門家によって通常理解されるものと同一の意味を持つ。一般的に、本明細書で使用される命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
【0018】
本発明では、尿から尿細胞を分離、培養してＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＳｌｕｇ逆分化因子の組み合わせが導入されたベクターを尿細胞に導入させた。ヘパリン、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｌ－グルタミンが含まれているＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地にＦＧＦ９、ＢＭＰ７、ＣＨＩＲ９９０２１及びＹ－２７６３２を添加して前記逆分化因子が導入された尿細胞を培養することにより、腎前駆細胞への逆分化を誘導した。
【0019】
したがって、本発明は、一側面において、（ａ）尿から尿細胞を分離して培養する段階と、（ｂ）前記培養された尿細胞に逆分化因子ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸、ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質をコードする核酸、ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質をコードする核酸、ｉｖ）ｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードする核酸及びｖ）Ｓｌｕｇタンパク質をコードする核酸を導入する段階と、（ｃ）前記逆分化因子が導入された尿細胞を腎前駆細胞培養培地で培養して腎前駆細胞へ逆分化を誘導する段階と、（ｄ）前記腎前駆細胞に直接逆分化が誘導された細胞から腎前駆細胞の特性を持つ逆分化腎前駆細胞を選別する段階と、を含む尿細胞から腎前駆細胞への直接逆分化を誘導する方法に関する。
【0020】
本発明の用語の「逆分化腎前駆細胞」とは、分化した細胞に逆分化技術を用いて腎幹細胞と類似または同一の多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つ未分化状態の幹細胞を確立する方式で作製された細胞を意味する。誘導腎前駆細胞は、腎前駆細胞と同一または類似の特性を有しているが、具体的には、似たような細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似しており、生体内外で多分化能を持つことができる。したがって、本発明の逆分化腎前駆細胞は、糸球体足細胞（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｐｏｄｏｃｙｔｅ）または尿細管細胞（ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ）などへ分化可能なものであってもよい。
【0021】
本発明において使用される用語の「腎前駆細胞」とは、腎組織構成細胞に分化可能な多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）未分化細胞（幹細胞及び／又は前駆細胞）として、足細胞と尿細管細胞に分化できる未分化細胞も含む。
【0022】
本発明において逆分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）とは、分化された細胞が１つ以上の互いに異なる組織形態に分化する前に「幹細胞」－類似または多能性細胞状態（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔａｔｅ）を得る現象に関する。
【0023】
本発明において用語の「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、細胞が分裂増殖して成長する間に細胞の構造や機能が特殊化される現象を意味する。多能性中葉幹細胞は、系統が限られた前駆細胞（例えば、中胚葉性細胞）に分化した後、他の形態の前駆細胞にさらに分化してもよく、以後、特定の組織において特徴的な役割を果たす末期分化細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞など）に分化されてもよい。
【0024】
本発明の「腎前駆細胞」とは、特定の組織（例えば、腎臓組織）で特徴的な役割を果たす末期分化細胞、すなわち、腎構成細胞にのみ分化しうる。
【0025】
本発明において用語の「尿細胞（Ｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ；ＵＣｓ）」とは、患者の年齢や性別、健康状態に関連なく、低コストで安全かつ簡単に何らかの不便と苦痛なしに、いつでも容易に繰り返し獲得可能で、特別な分離過程なしに尿から得られる体細胞として知られている。
【0026】
本発明において、前記尿細胞は、尿由来体細胞であることを特徴とする。
【0027】
本発明では、尿細胞において逆分化因子であるＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃと同時に転写因子Ｓｌｕｇを発現させる場合、既に分化した細胞タイプの尿細胞が分化能を持つ腎前駆細胞に逆分化（ｄｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する可能性を発見した。
【0028】
本発明の用語の「逆分化因子」とは、２００６年山中（Ｙａｍａｎａｋａ）教授チームによって導入された概念である逆分化（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）から始まった。成体のすべての組織は、正常発達過程を経て、分化されない未分化状態から次第に分化し、各機能が専門化した細胞に変化する。そのうち、受精卵の細胞は、全能性（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有しており、以後、発達段階が進むにつれて胚盤胞になると、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と外側の細胞に区分が可能である。このときの内部細胞塊細胞が胚体細胞と生殖細胞として発生でき、これを多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）と呼ぶ。この胚性幹細胞は、多能性特有の遺伝子発現の様相を示すが、その代表的な例がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８などである。逆分化は、体細胞にこのような特異的な遺伝子発現を誘導し、胚性幹細胞及び成体幹細胞などの未分化細胞と類似した性質に戻す技術と言える。Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃは、それに伴う一連の研究において使用されてきた様々な因子であって、本発明において尿細胞から腎前駆細胞に逆分化させるのに用いた。
【0029】
本発明の「Ｓｌｕｇ」とは、さらに「Ｓｎａｉ２」としても知られており、ＳｌｕｇとＳｎａｉ２は、同じであると理解できる。
【0030】
本発明のＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）は、ヒトとウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌなどの動物由来のすべてのＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）を含み、好ましくは、ヒトＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）である。また、腎前駆細胞への逆分化に使用される本発明のＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質は、その野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質の変異体を含んでもよい。
【0031】
具体的な一実施例において、逆分化に使用されたＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）の遺伝子配列は、Ｃｅｌｌ ２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２に開示されたものを使用した。
【0032】
Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質の変異体とは、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）の天然アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより、異なる配列を有するタンパク質を意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同じ生物学的活性を示す機能的等価物であるか、必要に応じてタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であってもよい。物理、化学的環境に対する構造安定性が増大するか、または生理学的活性が増大した変異体である。
【0033】
前記Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸は、野生型または前記のような変異体の形態のＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸であって、１つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異されてもよく、天然から分離されるか、または化学的合成法を用いて製造してもよい。
【0034】
前記Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、短鎖または二重鎖であってもよく、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であってもよい。
【0035】
１つの好ましい態様において、本発明で尿細胞を腎前駆細胞に逆分化を誘導する逆分化因子は、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が導入されたＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（ｏｒ Ｓｎａｉ２）タンパク質を発現するベクターを含んでもよい。
【0036】
本発明において、前記（ｂ）段階は、前記逆分化因子が挿入されたウイルスベクターを直接尿細胞に導入させることを特徴とする。
【0037】
本発明において用語の「ベクター」とは、適切な宿主細胞から目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【0038】
本発明において用語の「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られている酵素などを使用する。
【0039】
本発明のベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素の他にも膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造されてもよい。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選ぶための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。ベクターは、自己複製するか、または宿主ＤＮＡに統合されてもよい。
【0040】
ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などから由来したベクターを含むが、これに制限されるものではない。本発明の具体的な実施例では、ＭＭＬＶ－ 基盤－ウイルスベクター（Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）としてｐＭＸｓベクターを用いた。
【0041】
本発明においてＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当分野の公知の方法、例えば、ベクター形態のネイキッドＤＮＡで細胞内に伝達するか（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０：Ｗｏｌｆｆｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０３：１２４９－５９，１９９２）、リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、カチオン性ポリマー（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）などを用いて細胞内に伝達してもよい。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどのカチオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、カチオン性リポソームとアニオン性核酸が一定の割合で混合すると、核酸－リポソーム複合体が形成される。
【0042】
さらに他の好ましい様態として、本発明において尿細胞を腎前駆細胞に逆分化を誘導する組成物は、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を含むＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質を発現するウイルスを含んでもよい。
【0043】
本発明において、用語の「ウイルス」とは、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞に形質転換及び感染させて作製したＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）を発現するウイルスを意味する。
【0044】
本発明のＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質を発現するウイルスの製造に使用可能なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどを含み、これに制限されるものではない。好ましくは、レトロウイルスである。
【0045】
本発明の具体的な実施例では、ｐＭＸｓベクターにＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質をコードする核酸配列を挿入して製造したベクター（ｐＭＸｓ－Ｏｃｔ４及びｐＭＸｓ－Ｓｏｘ２、ｐＭＸｓ－Ｋｌｆ４、ｐＭＸｓ－ｃ－Ｍｙｃ、ｐＭＸｓ－Ｓｌｕｇ（またはｐＭＸｓ－Ｓｎａｉ２））をＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）広範囲な哺乳類宿主細胞に感染が可能な高力価ウイルスを生成するパッケージング細胞である２９３ｇｐｇ細胞に形質転換させてＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）タンパク質を発現させるウイルスを製造して尿細胞を感染させた。
【0046】
本発明において、前記段階（a）で尿細胞の培養は、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕＭ）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）含有培地で行われてもよい。
【0047】
本発明で使用される用語の「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上で細胞の成長及び生存を支持できるようにする培地を意味し、尿細胞及び逆分化腎前駆細胞の誘導及び培養に適切な当分野で使用される通常の培地をすべて含む。細胞の種類に応じて培地及び培養条件を選んでもよい。培養に使用される培地は、好ましくは、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｎｉｍｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ；ＣＣＭＭ）で、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、αＭＥＭ（α Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、及びＩＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）などがあるが、これに制限されるものではない。また、前記培地は、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）またはゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）などの抗生剤を含んでもよい。
【0048】
本発明の具体的な実施例において、尿から分離した細胞をＦＢＳ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する基本培地で培養することにより、得ることができ、具体的には、ＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ及びＲＥＧＭ（Ｒｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ社）培地にｂＦＧＦ及びＥＧＦを添加して培養することにより得られる。さらに好ましくは、前記ハイグルコースＤＭＥＭ及びＲＥＧＭ培地は、Ｌ－グルタミン及びペニシリン－ストレプトマイシンをさらに含んでもよい。
【0049】
本発明において、前記段階（ｂ）で逆分化因子を尿細胞に導入する方法は、当業界で通常使用される細胞に核酸分子またはタンパク質を提供する方法を制限なく使用してもよく、好ましくは、逆分化因子を分化された細胞の培養液に投与する方法、または逆分化因子を分化した細胞に直接注入する方法を使用してもよく、このときに使用される逆分化因子は、該当因子の遺伝子を挿入したウイルスベクターで形質感染させたパッケージ細胞から得たウイルス、試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により生産したｍＲＮＡ、または様々な細胞株内で生産されたタンパク質などの形態で使用してもよい。本発明の具体的な実施例において、尿細胞への前記逆分化因子の導入は、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ（またはＳｎａｉ２）をコードするＤＮＡを使用した。
【0050】
前記ＤＮＡを分化した細胞に直接注入する方法は、当業界で公知の任意の方法を選択して使用してもよく、これに制限されるものではないが、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｊｅｃtｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、粒子噴射法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉注入法、インシュレータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾンを用いた方法の中から適宜選択して適用してもよい。具体的には、本発明の実施例において逆分化因子のＤＮＡは、電気穿孔法を用いて尿細胞に導入した。
【0051】
本発明において、前記段階（ｃ）でＯｃｔ４及びＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇタンパク質をコードする核酸が導入された尿細胞を腎前駆細胞に誘導する培地（腎前駆細胞誘導培地）は、ＬＤＮ－１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ９、ＢＭＰ７のうち１つ以上が含有された基本培地で培養することにより、腎前駆細胞への逆分化を誘導し得、本発明の具体的な実施例において、前記培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地にＹ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ９、ＢＭＰ７をすべて添加し、さらにＬＤＮ－１９３１８９、Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加した培地での腎前駆細胞の転換率が最も優れていることを確認した。
【0052】
本発明において、前記（ｃ）段階の培養培地は、ＦＧＦ９、ＢＭＰ７、ＣＨＩＲ９９０２１及びＹ－２７６３２を含むことが好ましく、さらに好ましくは、ヘパリン、ＬＤＮ－１９３１８９またはＬ－グルタミンをさらに含むものであり、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０基本培地に含まれるものであるが、これに限定されるものではない。
【0053】
また、前記培養培地での培養は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ｌａｍｉｎｉｎ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｇｅｌａｔｉｎ及びｃｏｌｌａｇｅｎのうち１つまたは１つ以上のコーティング条件で行われる場合、誘導効率が増加しうる。
【0054】
本発明において前記段階（ｄ）で誘導された腎前駆細胞の選別は、前記段階（ｃ）を行った後、生成された腎前駆細胞コロニーを採取するものであり、前記選別された腎前駆細胞は、腎前駆細胞培地で培養してもよい。
【0055】
前記腎前駆細胞培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地にＦＧＦ９、ＢＭＰ７、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｈｅｐａｒｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅをすべて添加した培地であってもよい。さらに、前記逆分化腎前駆細胞は、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液もしくはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて継代培養してもよい。
【0056】
本発明は、他の観点から、前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含む腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。
【0057】
本発明は、さらに他の観点から、前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を投与する段階を含む腎細胞損傷疾患の予防または治療方法に関する。
【0058】
本発明は、さらに他の観点から、腎細胞損傷疾患の予防または治療方法に使用するための前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞に関する。
【0059】
本発明は、さらに他の観点から、腎細胞損傷疾患の予防または治療方法で使用するための前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を含む薬学的組成物に関する。
【0060】
本発明は、さらに他の観点から、前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞を有効成分として含有する組成物を腎細胞損傷疾患の予防または治療に使用する用途に関する。
【0061】
本発明は、さらに他の観点から、腎細胞損傷疾患の予防または治療用薬剤の製造のための前記方法で逆分化誘導された腎前駆細胞の用途に関する。
【0062】
本発明の逆分化腎前駆細胞は、糸球体足細胞（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｐｏｄｏｃｙｔｅ）または尿細管細胞（ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ）などに分化可能な多分化能を持つ細胞で、損傷または消失した腎細胞を修復でき、前記腎細胞の損傷または消失により発生する疾患を制限なく治療が可能である。
【0063】
具体的には、前記腎細胞の損傷により発生する疾患は、急性／慢性腎不全（ａｃｕｔｅ／ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎症候群（ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、腎盂腎炎（ｎｅｐｈｒｏｐｙｅｌｉｔｉｓ）、多嚢胞性腎症（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、末期腎疾患（ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれてもよい。
【0064】
本発明の前記薬剤学的組成物は、その持続的に効果を増進させるために薬物送達システムをさらに導入してもよい。例えば、高分子水和ゲル、高分子マイセル、エマルジョン、リポソーム、高分子粒子、微細針などの形態の伝達システムに担持されてもよく、このようなシステムを構成している材料としては、天然及び合成ポリマー、無機物を含んでもよい。
【0065】
本発明の薬学組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。具体的には、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されてもよい。本発明において、前記薬学組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形製剤は、少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕＭ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【0066】
本発明一実施例による薬学組成物に含まれた前記製剤の含量は、特にこれに制限されるものではないが、最終の組成物の総重量を基準として０.０００１～５０重量％、より好ましくは、０.０１～１０重量％の含量で含んでもよい。
【0067】
前記本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与されてもよいが、本発明の用語の「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な受恵／リスク比で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する感度、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路及び排出割合治療期間、使用された本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医療分野でよく知られている要素によって決定されてもよい。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次または同時に投与されてもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。
【0068】
本発明の薬学組成物の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、または有効成分として使用される物質の種類などを考慮して当業者が決定してもよい。例えば、本発明の薬学組成物をヒトを含む哺乳動物に一日に１０～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１０～３０ｍｇ／ｋｇで投与してもよく、本発明の組成物の投与頻度は、特にこれに制限されるものではないが、１日に１回～３回投与するか、または容量を分割して数回投与してもよい。
【0069】
本発明の用語の「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により、腎細胞損傷疾患の発症を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【0070】
本発明の用語の「治療」とは、本発明の薬学組成物を投与することにより、腎細胞損傷疾患が好転するか、または有利に変更させるすべての行為を意味する。
【0071】
本発明の用語の「投与」とは、何らかの適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入する行為を意味し、投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を介して投与されてもよい。
【0072】
本発明の薬学組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、どのような一般的な経路を介して投与されてもよい。本発明の薬学組成物は、特にこれに制限されるものではないが、目的に応じて、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、脾内投与、肺内投与、直腸内に投与されてもよい。
【0073】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解されないものは、当業界において通常の知識を持つ者にとって自明であろう。
【実施例】
【0074】
実施例１：尿から尿細胞（Ｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌ）の分離
尿から尿細胞を分離する方法は、１９７２年に英国のＳｕｔｈｅｒｌａｎｄとＢａｉｎが開発した技術を基本としており、具体的には、以下の通りである。
尿から尿細胞を分離する方法は、１９７２年に英国のＳｕｔｈｅｒｌａｎｄとＢａｉｎが開発した技術を基本としており、具体的には、以下の通りである。
【0075】
まず、供与者から提供された尿を１０００ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットを１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤が含まれたＰＢＳ溶液２０ｍｌに希釈した。次に、希釈されたＰＢＳ＋ペレット溶液を１０００ｇで１０分間遠心分離した。再び上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットをゼラチンがコーティングされた１２－ウェル細胞培養プレートにＤＭＥＭ／Ｆ１２を基本として、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳが含まれた基本培地１ｍｌで希釈してシーディングした。以後、３日間基本培地を１ｍｌずつ添加して培養した後、ＤＭＥＭとＲＥＧＭ（Ｒｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ社）を１：１で混合した培地を基本として、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、５％ＦＢＳ、１０１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０ｇ／ｍｌ ＥＧＦが含まれた成長培地に変更して培養した。
【0076】
実施例２：尿細胞に逆分化因子の導入
ｐＭＸｓベクターにＯｃｔ４及びＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ２、Ｏｓｒ１、Ｐａｘ２、Ｅｙａ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入して製造したベクターｐＭＸｓ－Ｏｃｔ４及びｐＭＸｓ－Ｋｌｆ４、ｐＭＸｓ－Ｓｏｘ２、ｐＭＸｓ－ｃＭｙｃ、ｐＭＸｓ－Ｓｌｕｇ、ｐＭＸｓ－Ｓｉｘ１、ｐＭＸｓ－Ｓｉｘ２、ｐＭＸｓ－Ｏｓｒ１、ｐＭＸｓ－Ｐａｘ２、ｐＭＸｓ－Ｅｙａ１をヒト２９３－由来レトロウイルスパッケージング細胞株である２９３ＧＰＧを用いて前記逆分化因子の組み合わせが導入されたベクターを製造した。これらの逆分化因子の組み合わせが導入されたベクターを実施例１から分離、培養した尿由来細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して注入させ、逆分化因子が導入された尿細胞を製造した。
ｐＭＸｓベクターにＯｃｔ４及びＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ２、Ｏｓｒ１、Ｐａｘ２、Ｅｙａ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入して製造したベクターｐＭＸｓ－Ｏｃｔ４及びｐＭＸｓ－Ｋｌｆ４、ｐＭＸｓ－Ｓｏｘ２、ｐＭＸｓ－ｃＭｙｃ、ｐＭＸｓ－Ｓｌｕｇ、ｐＭＸｓ－Ｓｉｘ１、ｐＭＸｓ－Ｓｉｘ２、ｐＭＸｓ－Ｏｓｒ１、ｐＭＸｓ－Ｐａｘ２、ｐＭＸｓ－Ｅｙａ１をヒト２９３－由来レトロウイルスパッケージング細胞株である２９３ＧＰＧを用いて前記逆分化因子の組み合わせが導入されたベクターを製造した。これらの逆分化因子の組み合わせが導入されたベクターを実施例１から分離、培養した尿由来細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して注入させ、逆分化因子が導入された尿細胞を製造した。
【0077】
前記逆分化因子を導入した尿細胞は、ゼラチンがコーティングされた６－ウェル細胞培養プレートにＤＭＥＭとＲＥＧＭを１：１で混合した培地を基本として、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０ｇ／ｍｌ ＥＧＦを含む環境で２日間培養した。
【0078】
実施例３：尿由来の逆分化腎前駆細胞の誘導
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）がコーティングされた細胞培養プレートに前記逆分化因子が導入された尿由来細胞をシーディングした後、１ｕｇ／ｍｌのヘパリン、１２５ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９、０．５％のＬ－グルタミンが含まれたＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地を基本として、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７、１.２５ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１、１０ｕＭのＹ－２７６３２を添加した腎前駆細胞の誘導及び拡張培地で１０－１３日間培養した。誘導完了時に腎前駆細胞コロニーの発生有無を確認できた（図１ａ及び図２）。
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）がコーティングされた細胞培養プレートに前記逆分化因子が導入された尿由来細胞をシーディングした後、１ｕｇ／ｍｌのヘパリン、１２５ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９、０．５％のＬ－グルタミンが含まれたＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地を基本として、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７、１.２５ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１、１０ｕＭのＹ－２７６３２を添加した腎前駆細胞の誘導及び拡張培地で１０－１３日間培養した。誘導完了時に腎前駆細胞コロニーの発生有無を確認できた（図１ａ及び図２）。
【0079】
特に、山中因子の組み合わせ（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ）にＳｌｕｇが追加された組み合わせ（５Ｆ：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｌｕｇ）において自己増殖能とコロニー形成能が優れていることが確認された（図１ｂ）。しかし、５つの因子がすべて導入された場合と比較し、各因子が１つずつ除去された４つの因子の組み合わせから誘導された男性と女性由来の腎前駆細胞は、非常に少ないコロニー形成能を示した（図１ｂ）。また、代表的な腎前駆細胞マーカー遺伝子であるＳＩＸ２ ｍＲＮＡレベルの解析においても、５つの因子がすべて導入された腎前駆細胞は、４つの組み合わせまたは胚性幹細胞から誘導された場合よりもはるかに高い発現度合いを示した（図１ｃ）。
【0080】
誘導された逆分化腎前駆細胞コロニーを採取し、マトリゲルがコーティングされた細胞培養プレートに前記腎前駆細胞の誘導及び拡張培地を入れて培養した。逆分化腎前駆細胞は、以後、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液またはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて継代培養し、以後、次の実施例において、前記逆分化腎前駆細胞の様々な特性を検証した。
【0081】
実施例４：逆分化腎前駆細胞の分子生物学的特性の分析
４－１：腎前駆細胞マーカー遺伝子発現の確認
胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞を陽性対照群とし、ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介して逆分化腎前駆細胞がＳＩＸ２、ＣＩＴＥＤ１、ＷＴ１、ＮＣＡＭ１のような腎前駆細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図３及び図４）。使用されたプライマー配列は、以下の通りである。
４－１：腎前駆細胞マーカー遺伝子発現の確認
胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞を陽性対照群とし、ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介して逆分化腎前駆細胞がＳＩＸ２、ＣＩＴＥＤ１、ＷＴ１、ＮＣＡＭ１のような腎前駆細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図３及び図４）。使用されたプライマー配列は、以下の通りである。
【0082】
SIX2: forward-CTCAAGGCACACTACATCGAG (配列番号 1)
reverse-GTTGTGGCTGTTAGAATTGGA (配列番号 2)
CITED1: forward-CAGCATCACTTCCCGCCAATTT (配列番号 3)
reverse-TTGCGATCTTTCACCGCAAGG (配列番号 4)
WT1: forward-TGTGTGCTTACCCAGGCTGCAA (配列番号 5)
reverse-CCGGGAGAACTTTCGCTGACAA (配列番号 6)
NCAM1: forward-CGATCTCATGGTTTCGGGATGG (配列番号 7)
reverse-TCATCAAACTGCACCTGGGCTG (配列番号 8)
reverse-GTTGTGGCTGTTAGAATTGGA (配列番号 2)
CITED1: forward-CAGCATCACTTCCCGCCAATTT (配列番号 3)
reverse-TTGCGATCTTTCACCGCAAGG (配列番号 4)
WT1: forward-TGTGTGCTTACCCAGGCTGCAA (配列番号 5)
reverse-CCGGGAGAACTTTCGCTGACAA (配列番号 6)
NCAM1: forward-CGATCTCATGGTTTCGGGATGG (配列番号 7)
reverse-TCATCAAACTGCACCTGGGCTG (配列番号 8)
【0083】
４－２：多能性マーカー遺伝子発現の確認
ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のような多能性マーカー遺伝子の発現有無によって、誘導多能性幹細胞のような腫瘍発生のリスクからの安全性を確認した。
ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のような多能性マーカー遺伝子の発現有無によって、誘導多能性幹細胞のような腫瘍発生のリスクからの安全性を確認した。
【0084】
誘導多能性幹細胞を陽性対照群として逆分化腎前駆細胞においてＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のような多能性マーカー遺伝子の発現有無をＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの解析を介して確認した（図５）。使用されたプライマー配列は、以下の通りである。
【0085】
NANOG: forward-ATAGCAATGGTGTGACGCAG (配列番号 9)
reverse-GATTGTTCCAGGATTGGGTG (配列番号 10)
OCT4: forward-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG (配列番号 11)
reverse-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC (配列番号 12)
reverse-GATTGTTCCAGGATTGGGTG (配列番号 10)
OCT4: forward-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG (配列番号 11)
reverse-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC (配列番号 12)
【0086】
４－３：タンパク質レベルで腎前駆細胞マーカー発現の確認
逆分化腎前駆細胞においてＳＩＸ２及びＣＩＴＥＤ１のような腎前駆細胞マーカーのタンパク質レベルの発現を免疫染色法を介して確認した（図６）。抗体は、ＳＩＸ２（１１５６２－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）及びＣＩＴＥＤ１（Ｈ００００４４３５、Ａｂｎｏｖａ）を使用した。
逆分化腎前駆細胞においてＳＩＸ２及びＣＩＴＥＤ１のような腎前駆細胞マーカーのタンパク質レベルの発現を免疫染色法を介して確認した（図６）。抗体は、ＳＩＸ２（１１５６２－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）及びＣＩＴＥＤ１（Ｈ００００４４３５、Ａｂｎｏｖａ）を使用した。
【0087】
また、ウエスタンブロットを通じて女性と男性の尿由来細胞から逆分化腎前駆細胞がＳＩＸ２及びＣＩＴＥＤ１のような腎前駆細胞のマーカータンパク質を発現していることを確認した（図７）。
【0088】
４－４：核型解析及び腎前駆細胞マーカーｍＲＮＡの量的解析
逆分化腎前駆細胞の分子生物学的特性を検証するため、逆分化腎前駆細胞が正常な染色体を時間に応じて保存していることを核型解析を介して確認した（図８）。
逆分化腎前駆細胞の分子生物学的特性を検証するため、逆分化腎前駆細胞が正常な染色体を時間に応じて保存していることを核型解析を介して確認した（図８）。
【0089】
次に、ｍＲＮＡの量的解析を介して逆分化腎前駆細胞がＳＩＸ２のような腎前駆細胞マーカー遺伝子発現を時間経過にも一定量を維持していることをｑＲＴ－ＰＣＲとＦＡＣＳによって確認した（図９）。
【0090】
４－５：腎臓発達に関連した遺伝子発現レベルの確認
総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて腎臓発達に関連した遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の尿由来細胞よりも胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ発現パターンを示すことを確認した（図９）。
総ＲＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて腎臓発達に関連した遺伝子発現レベル（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）で逆分化腎前駆細胞が本来の尿由来細胞よりも胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ発現パターンを示すことを確認した（図９）。
【0091】
また、総ＲＮＡシーケンスを通じて全遺伝子のうち、腎臓発達に関連した遺伝子発現レベルで逆分化腎前駆細胞が本来の女性または男性の尿由来細胞よりも胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ＲＮＡ）発現パターンを示すかどうかを確認し、腎臓発達に関連したｍＲＮＡ発現の共通性をベンダイヤグラム解析により確認した（図１１及び図１２）。
【0092】
さらに、総ＲＮＡシーケンスを通じて全発現遺伝子のうち、腎臓発達に関連した遺伝子を細部的に分け、各グループの遺伝子発現レベルで尿細胞から逆分化腎前駆細胞とＢＧ０１胚性幹細胞から由来した腎前駆細胞の間の類似性を確認した（図１３）。
【0093】
実施例５：逆分化腎前駆細胞の分化能の解析
５－１：糸球体足細胞への分化能の解析
逆分化腎前駆細胞を糸球体足細胞に分化させるため、腎前駆細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳ、１００ｎＭビタミンＤ３と６０ｕＭ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加した糸球体足細胞分化培地に７日間培養して分化を誘導した。その結果、糸球体足細胞マーカー遺伝子であるＮｅｐｈｒｉｎ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ、ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎを発現することを確認した（図１４）。
５－１：糸球体足細胞への分化能の解析
逆分化腎前駆細胞を糸球体足細胞に分化させるため、腎前駆細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳ、１００ｎＭビタミンＤ３と６０ｕＭ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加した糸球体足細胞分化培地に７日間培養して分化を誘導した。その結果、糸球体足細胞マーカー遺伝子であるＮｅｐｈｒｉｎ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ、ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎを発現することを確認した（図１４）。
【0094】
糸球体足細胞マーカー遺伝子の解析のために使用されたＲＴ－ＰＣＲプライマー配列は、以下の通りである。
【0095】
Nephrin: forward-TGGCTCGGACCAAACCAACATT (配列番号 13)
reverse-AGGGCCTCATACCTGATGCAGA (配列番号 14)
Synaptopodocin: forward-CGCTCACCACACCAACTTCTAA (配列番号 15)
reverse-CTAGAAAGTGGCAGGCTCTGTG (配列番号 16)
podocalyxin: forward-CTTGAGACACAGACACAGAG (配列番号 17)
reverse-CCGTATGCCGCACTTATC (配列番号 18)
reverse-AGGGCCTCATACCTGATGCAGA (配列番号 14)
Synaptopodocin: forward-CGCTCACCACACCAACTTCTAA (配列番号 15)
reverse-CTAGAAAGTGGCAGGCTCTGTG (配列番号 16)
podocalyxin: forward-CTTGAGACACAGACACAGAG (配列番号 17)
reverse-CCGTATGCCGCACTTATC (配列番号 18)
【0096】
また、免疫染色法を介してそれぞれＳｙｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ、ＰＯＸＤＬを染色して逆分化腎前駆細胞が糸球体足細胞に分化できることを確認した（図１５）。抗体は、ｎａｐｔｏｐｏｄｏｃｉｎ（ＳＣ－２１５３７、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＰＯＸＤＬ（ＡＦ１６５８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【0097】
５－２：尿細管細胞への分化能の解析
腎前駆細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ、２０ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、１ｎＭ ｔｒｉ－ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅと１００ｎｇ／ｍｌ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｃｏｎｅを添加した尿細管細胞の分化培地で２１日間培養し、尿細管細胞に分化を誘導した。その結果、尿細管細胞のマーカー遺伝子であるＣＤ１３、ＡＱＰ１を発現することを確認した（図１６）。
腎前駆細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ、２０ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、１ｎＭ ｔｒｉ－ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅと１００ｎｇ／ｍｌ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｃｏｎｅを添加した尿細管細胞の分化培地で２１日間培養し、尿細管細胞に分化を誘導した。その結果、尿細管細胞のマーカー遺伝子であるＣＤ１３、ＡＱＰ１を発現することを確認した（図１６）。
【0098】
尿細管細胞マーカー遺伝子の解析のために使用されたＲＴ－ＰＣＲプライマー配列は、以下の通りである。
【0099】
CD13: forward-CCATGAAGGCCGAGTTCAACA (配列番号 19)
reverse-ATGAAGGCCAGCAAGTACGTG (配列番号 20)
AQP1: forward-ATGCCGACGACATCAACTCCAG (配列番号 21)
reverse-TGAGTCGGTGAGCAACTTTGGG (配列番号 22)
reverse-ATGAAGGCCAGCAAGTACGTG (配列番号 20)
AQP1: forward-ATGCCGACGACATCAACTCCAG (配列番号 21)
reverse-TGAGTCGGTGAGCAACTTTGGG (配列番号 22)
【0100】
また、免疫染色法を介してそれぞれＬＴＬ、ＡＱＰ１、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎを染色して逆分化腎前駆細胞が尿細管細胞に分化できることを確認した（図１７）。抗体は、ＬＴＬ（Ｂ－１３２５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、ＡＱＰ１（ＳＣ３２７３７、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（６１０１８１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。
【0101】
５－３：新単位類似組織への分化能の解析
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）、１％Ｌ－グルタミン（Ｌ／Ｇ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９、３０１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７、１.２５ｕＭ ＣＨＩＲ、１２５ｎＭ ＬＤＮ、１０ｕＭ Ｙ２７６３２及び１０ｎｇ／ｍｌヘパリンを添加したＮＰＥＭで腎前駆細胞を１日間培養した後、ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９、３ｕＭ ＣＨＩＲを添加した分化培地で２日間培養し、ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９を添加した分化培地で３日間培養した後、 ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇを添加した培地で７－１４日間培養して新単位類似組織に分化を誘導した。その結果、糸球体足細胞マーカー遺伝子であるＰＯＤＸＬ及び尿細管細胞マーカー遺伝子であるＬＴＬを発現していることを免疫染色法を介して確認した（図１８）。抗体は、ＰＯＤＸＬ（ＡＦ１６５８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＴＬ（Ｂ－１３２５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用した。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）、１％Ｌ－グルタミン（Ｌ／Ｇ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９、３０１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７、１.２５ｕＭ ＣＨＩＲ、１２５ｎＭ ＬＤＮ、１０ｕＭ Ｙ２７６３２及び１０ｎｇ／ｍｌヘパリンを添加したＮＰＥＭで腎前駆細胞を１日間培養した後、ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９、３ｕＭ ＣＨＩＲを添加した分化培地で２日間培養し、ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ９を添加した分化培地で３日間培養した後、 ＡＲＰＭＩ培地に１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ／Ｇを添加した培地で７－１４日間培養して新単位類似組織に分化を誘導した。その結果、糸球体足細胞マーカー遺伝子であるＰＯＤＸＬ及び尿細管細胞マーカー遺伝子であるＬＴＬを発現していることを免疫染色法を介して確認した（図１８）。抗体は、ＰＯＤＸＬ（ＡＦ１６５８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＴＬ（Ｂ－１３２５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用した。
【産業上の利用可能性】
【0102】
本発明は、不便と苦痛なしに容易に繰り返して得られる体細胞である尿細胞を用いて個人オーダーメード型逆分化腎前駆細胞の大量生産が可能なので、腎臓損傷の治癒と腎臓の再生分野に拡大可能な難病分野及び細胞治療剤の生産に適用が可能である。
【0103】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を持つ者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施態様に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】