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特表2022-528700アミロイドベータの形成を低減させるための組成物および方法ならびにその組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-15
(54)【発明の名称】アミロイドベータの形成を低減させるための組成物および方法ならびにその組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/519 20060101AFI20220608BHJP
A61K 31/53 20060101ALI20220608BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20220608BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20220608BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20220608BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220608BHJP
A61P 9/08 20060101ALN20220608BHJP
【ＦＩ】
A61K31/519
A61K31/53
A61K31/4985
A61K31/522
A61K31/506
A61P25/28
A61P9/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021559500
(86)(22)【出願日】2020-03-24
(85)【翻訳文提出日】2021-10-29
(86)【国際出願番号】 IB2020052771
(87)【国際公開番号】W WO2020201915
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】62/822,975
(32)【優先日】2019-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521438191
【氏名又は名称】アリビオ カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】510327987
【氏名又は名称】エスケイ ケミカルズ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】ジェジュン・チョン
(72)【発明者】
【氏名】ユンピョ・チェ
(72)【発明者】
【氏名】ビョンウ・カン
(72)【発明者】
【氏名】フレッド・キム
(72)【発明者】
【氏名】ミスン・チョン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC42
4C086CB05
4C086CB06
4C086CB07
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA16
4C086ZA39
4C086ZC20
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、アミロイドベータの形成を低減するための方法、およびアミロイドベータの蓄積に関連する疾患を治療するための方法を提供する。本発明は、（１）Ａβオリゴマー／フィブリル形成阻害によるＡβ凝集阻害と、（２）β－アミロイド形成プロセシング阻害により低減されたＢＡＣＥ－１と、（３）細胞外Ａβ単量体の増加、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラーク低減に対する脳血流と、（４）神経細胞死阻害および神経新生、シナプス新生、血管新生促進の活性化に対するＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路と、（５）シナプス可塑性回復の活性化におけるＷｎｔシグナル伝達によるＤＫＫ－１阻害、およびＡＰＰ生成低減およびＡβ蓄積抑制の阻害のためのＡβ産生ポジティブフィードバックループと、（６）可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害の治療のための毒性ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィル内の細胞によるオートファジー活性化と、を提供し、重要な成分を含有する薬物、化合物、組成物である選択された化合物における薬学的に許容される塩、溶媒和物、および水和物、および提供される治療方法を有するこれと、を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルツハイマーを治療するための薬学的組成物であって、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィルからなる群から選択される化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および水和物を含む、薬学的組成物。
【請求項2】
前記化合物が、血管拡張によって脳内の血流を増加させて、細胞外のＡβ単量体、オリゴマー、および／またはＡβフィブリル／プラークの形成および蓄積を抑制する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記化合物が、ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路を活性化して、神経細胞死を低減させ、神経新生、シナプス新生、血管新生を促進する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記化合物が、ＤＫＫ－１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）を抑制して、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化してシナプス可塑性を回復し、Ａβ産生のポジティブフィードバックループを抑制して、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）の形成およびＡβの蓄積を低減させる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記化合物がオートファジーを活性化して、細胞内毒性可溶性Ａβオリゴマーを除去してＡβフィブリル／プラークの形成および蓄積を抑制する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
化合物が、行動機能および認知機能を改善する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
アルツハイマーを治療するための方法であって、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィルからなる群から選択される化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および水和物を含む、薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項8】
前記化合物が、Ａβオリゴマーまたはフィブリルの形成を低減させることによって、Ａβ凝集阻害の形成を阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記化合物が、ＢＡＣＥ－１低減によるβ－アミロイド形成プロセシングを阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記化合物が、血管拡張によってアミロイドベータ単量体、オリゴマー、ならびに／またはアミロイドベータフィブリルおよびプラークの細胞外形成および蓄積を低減させる、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記化合物が、ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路を活性化することによって、神経細胞死を低減し、神経新生、シナプス新生、または血管新生を増強する、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記化合物が、ＤＫＫ－ １阻害によるＷｎｔシグナル伝達活性化によってシナプス可塑性を回復した、請求項７に記載の方法。
【請求項13】
前記化合物が、Ａβ産生のポジティブフィードバックループを阻害してＡＰＰの形成およびＡβ蓄積を阻害することによって、ＤＫＫ－１を抑制する、請求項７に記載の方法。
【請求項14】
前記化合物が、オートファジーを活性化して、細胞内毒性可溶性Ａβオリゴマーを除去してＡβフィブリル／プラークの形成および蓄積を抑制する、請求項７に記載の方法。
【請求項15】
化合物が、行動機能および認知機能を改善する、請求項７に記載の方法。
【請求項16】
前記化合物が、オートファジーを活性化して、細胞内毒性可溶性Ａβオリゴマーを除去してＡβフィブリル／プラークの形成および蓄積を抑制する、請求項７に記載の方法。
【請求項17】
化合物が、行動機能および認知機能を改善する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２４日に出願された米国仮出願第６２／８２２，９７５号からの優先権の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月２４日に出願された米国仮出願第６２／８２２，９７５号からの優先権の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、アミロイドベータ形成を低減するための、およびアミロイドベータの蓄積に関連する疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
認知症とは、様々な遺伝的および環境的危険因子によって引き起こされる多面的な病因を示す後天性脳疾患として、複数の認知障害（またはＭＣＤ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ）に罹患する臨床疾患を指す。認知症を引き起こす疾患の代表は、アルツハイマー病であり、主に高齢者で流行し、全認知症の６０～７０％の原因になっている（非特許文献１参照）。近年の人口の急速な高齢化、アルツハイマー型認知症による高齢者のより進行性の認知症が増加し、認知症の治療の必要性も高まっている。しかしながら、さらなる低成功率の研究開発の困難は、認知症に対する新たな治療薬および治療方法の開発プロセスを遅らせた。２０１４年のＧＢＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈのデータに基づくと、アルツハイマー病治療薬の最終承認の成功率は１％未満であり、臨床第ＩＩ相では７２％、臨床第ＩＩＩ相では９２％、ＮＤＡ申請の９９．６％が失敗し、現在進行中のパイプラインの約８０％は「探索的および／または臨床前段階」の場合のみである。
【0004】
現在のＦＤＡ承認薬の従来のリストには、ＡＣｈＥ（アセチルコリンエステラーゼ）阻害剤およびＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸）受容体アンタゴニストが含まれ、抗酸化剤、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、抗炎症剤、スタチン製剤、またはホルモン製剤などと組み合わせて使用されている。しかしながら、これらの薬物は症状を緩和し、認知障害を遅延および改善するためにのみ使用されているが、認知症の根本的な治療は現時点では存在しない。
【0005】
代表的なＡＣｈＥ阻害剤としては、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（商標））、ガランタミン（Ｒｅｍｉｎｙｌ（商標））、リバスチグミン（ＥＮＡ－７１３、Ｅｘｅｌｏｎ（商標））などが挙げられ、これらの薬物は一時的に神経伝達物質アセチルコリンの濃度を増加させ、対症的な治療を提供する。加えて、これらの薬物は、軽度から中等度のアルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病による認知症、および脳卒中または大脳皮質下虚血性血管疾患を有する患者に処方される（非特許文献２参照）。
【0006】
典型的なＮＭＤＡ受容体アンタゴニストには、興奮毒性を引き起こして、シナプス可塑性を遮断して神経細胞変性を効果的に低減するグルタミン酸輸送系を阻害するメマンチン（Ｅｂｉｘａ（商標））が含まれる。メマンチンは、中等度以上の認知症および比較的低い副作用を伴うＬｅｗｙ小体型認知症に有効であることが確認されたが、より早い状態の疾患では限定的な活性しか示されなかった（非特許文献３参照）。したがって、それは、単剤療法よりも、ＣｈＥ阻害剤とともに、軽度および重度の認知症により使用された。しかしながら、ＡＣｈＥ阻害剤とメナンチンとの組み合わせがＡＣｈＥ単独よりも効果的であるという明確な証拠はこれまでには見出されておらず、追加の研究が必要である（非特許文献４参照）。
【0007】
しかしながら、これらの薬物は認知症およびアルツハイマー病の治療に長期間使用されているにもかかわらず、使用に明確な基準がなく、さらには、最大推奨ヒト用量（ＭＲＨＤ）でも、患者を治療患者の末期に導くために、改善が見られなかったか、疾患の進行が継続していたかのいずれかのみであり、これらの薬物の使用には継続的な懸念があった。しかしながら、現在まで有効性が確認された治療薬がないが、認知症の新しい治療開発の努力を継続する以外に選択肢はない（非特許文献５参照）。
【0008】
これまでに開発された認知症治療のための候補の主な対象としては、以下が挙げられる：（１）Ａβ（アミロイドβ）の産生を阻害するためのＢＡＣＥ－１（β－セクレターゼ１）の阻害剤またはγ－セクレターゼ阻害剤、（２）Ａβ（アミロイドβ）を除去するための抗Ａβモノクローナル抗体、（３）タウ凝集およびリン酸化を阻害するためのタウ凝集阻害剤および（１つのアミノ酸キナーゼ）ＴＡＯＫ阻害剤の阻害剤、（４）ＡｃｈＥおよびＮＭＤＡ受容体などを遮断するためのＡＣｈＥ阻害剤およびＮＭＤＡ受容体拮抗剤。最近、Ａβプラークおよびタウタンパク質を標的とするパイプラインが増加しており、それらの中で、候補の約７０～８０％がＡβ産生またはＡβ除去の抑制を標的としている。加えて、パイプラインのうちの約３０％が、モノクローナル抗体またはペプチドの比率が優勢に高いバイオ医薬品である。しかしながら、Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ（Ｂｉｏｇｅｎ）、Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、およびＧａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ）などの標的化Ａβを標的とする抗Ａβモノクローナル抗体を含む、期待値の高い候補の臨床試験が最近失敗したため、認知症治療の標的としてのＡβの想定が不確実となった。それにもかかわらず、認知症の治療薬の開発の主要な標的はＡβの形成の抑制およびその除去であることが、一般的に受け入れられている。
【0009】
Ａβ標的化薬物開発の課題の１つは、分子量が大きいモノクローナル抗体が細胞膜を貫通することが非常に困難であるため、細胞外アミロイドプラークを除去するだけで効果的であり得、細胞内Ａβオリゴマーを除去するための有効性が限定されているのみであることである。さらに、細胞内Ａβオリゴマーは、細胞外Ａβオリゴマーよりも多くの細胞毒性を引き起こし、神経細胞死のためにより重要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献６参照）。したがって、細胞内Ａβオリゴマーを除去するためのモノクローナル抗体などの巨大分子よりも細胞膜を貫通し得る小分子薬物の開発。
【0010】
当該分野で注目を集めている最近の見解の１つは、認知症治療薬の開発が失敗した方向性の理由が、認知症という臨床障害が多面的な病因の疾患であるために、従来のアプローチである「１つの薬物、１つの標的」パラダイムである可能性があるというものである。この従来のアプローチは、認知症の治療薬の開発の成功を達成することができないことが認められている。現在、上記の課題を克服するために、「１つの薬物、複数の標的／メカニズム」パラダイムに基づく新しい治療薬の開発への関心がますます高まっている。複数の標的／複数のメカニズム活性を用いる１つの化合物などのアプローチは、新しい薬物の発見および開発の新しい概念となる（非特許文献７、８参照）。したがって、認知症治療薬の開発における困難を克服し、開発の成功率を高めるためには、特に認知症の多面的な病因を考慮して、従来の「１つの薬物、１つの標的」パラダイムよりも「１つの薬物、複数の標的／メカニズム」パラダイムに基づく小分子／複合薬理学的薬物の開発が、候補の発見当初からおよび臨床前の段階で必要である（非特許文献９、１０参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９３ Ｍａｙ；３３（５）：４９４－５０１．
【非特許文献2】Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ２００９；５２（４）：４１７－４２５．
【非特許文献3】Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１１ Ａｕｇ；６８（８）：９９１－８
【非特許文献4】Ｂｒａｉｎ Ｎｅｕｒｏｒｅｈａｂｉｌ ２０１５ Ｍａｒ；８（１）：１９－２３．
【非特許文献5】Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６ Ｍａｙ；２３（２）：４８－５６．
【非特許文献6】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００２ Ｍａｙ ３；２７７（１８）：１５６６６－７０．
【非特許文献7】Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓ．（Ｖｉｅｎｎａ）．２０１３ Ｊｕｎ；１２０（６）：８９３－９０２．
【非特許文献8】Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ａｐｒ；８（６）：６９７－７１１．
【非特許文献9】Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１３ Ｊａｎ；６（１）：１０．１５８６／Ｅｃｐ．１２．７４．
【非特許文献10】Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０１６；２２（２１）：３１７１－８１．
【発明の概要】
【0012】
本発明の一実施形態は、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィルから選択される化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物の１つを投与することによって、細胞内毒性可溶性Ａβオリゴマーを除去することによって、Ａβフィブリル／プラークの形成を阻害する方法を提供する。
【0013】
本発明の別の実施形態は、（１）Ａβ凝集の抑制によるＡβオリゴマー／フィブリルの形成の阻害、（２）ＢＡＣＥ－１の低減によるβ－アミロイド形成プロセシングの阻害、（３）脳血流増加（血管拡張）による細胞外Ａβ単量体、オリゴマー、Ａβフィブリル／プラークの形成の低減、（４）ＮＯ（一酸化窒素）／ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）／ＰＫＧ（タンパク質キナーゼＧ）、ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）応答エレメント結合タンパク質）経路の活性化による、神経細胞死の阻害、ならびに神経新生、シナプス新生および／または血管新生の促進、（５）ＤＫＫ－１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）の阻害によるＷｉｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性（シナプス可塑性）の回復、およびＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）の産生の阻害およびＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の低減、ならびに（６）オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラークの形成の阻害、のための方法を提供する。
【0014】
別の実施形態において、本発明は、（１）Ａβ凝集の低減によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害、（２）β－アミロイド形成プロセシング減少ＢＡＣＥ－１の阻害、（３）脳血流の増加による細胞外Ａβ単量体、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラークの低減、（４）ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の抑制、ならびに神経新生、シナプス新生および／または血管新生の促進、（５）ＤＫＫ－１の阻害によるＷｉｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性（シナプス可塑性）の回復、ならびにＡＰＰの産生の阻害およびＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の低減、ならびに（６）オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラークの形成の阻害、のために、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィルから選択される１つの化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および水和物を含む薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】Ｉ．Ａβ凝集の低減によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害 本発明の組成物によるＡβフィブリル凝集の用量依存性阻害が存在することを示すチオフラビンＴアッセイの結果を提示する。
【図2】Ｉ．Ａβ凝集の低減によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害 Ａβオリゴマー凝集の形成が本発明の組成物による処置により低減されたことを示す、ＰＩＣＵＰ（未修飾タンパク質の光誘導架橋）／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析の結果を提示する。
【図3】ＩＩ．ＢＡＣＥ－１低減によるβ－アミロイド形成プロセシングの抑制 ＢＡＣＥ－１ ｍＲＮＡレベルがＡβ１－４２オリゴマーの処置によりレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において増加したことを示すが、増加したＢＡＣＥ－１ ｍＲＮＡレベルが本発明の組成物による処置により濃度依存的に減少したことを示す、ｑＲＴ－ＰＣＲ（定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応）の結果を提示する。
【図4】ＩＩＩ．脳血流の増加による細胞外Ａβ単量体、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラークの低減 過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）による周皮細胞の処置により増加した細胞内カルシウムレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す結果を提示する。
【図5】ＩＶ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の阻害 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるｃＧＭＰの量が、本発明の組成物による処置により濃度依存的に増加したことを示す、環状ＧＭＰ完全ＥＬＩＳＡの結果を提示する。
【図6】ＩＶ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の阻害 レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において増加した、アポトーシス関連タンパク質、カパーゼ－３およびＰＡＲＰ［ポリ（アデノシン二リン酸－リボース）ポリメラーゼ）］の切断カパーゼ－３／カスパーゼ－３および切断ＰＡＲＰおよび切断ＰＡＲＰ／ＰＡＲＰに対する比の低減が、本発明の組成物による処理により減少したことを示すウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図7】ＩＶ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の阻害 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるミトコンドリア膜電位の集中が、本発明の組成物による処置により濃度依存的に増加したことを示す、ＪＣ－１ミトコンドリア膜電位アッセイの結果を提示する。
【図8】ＩＶ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の阻害 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により増加した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎによって染色された死細胞の数が、本発明の組成物による処置により低減したことを示す、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３生細胞解析の結果を提示する。
【図9】Ｖ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路を活性化することによる神経新生、シナプス新生、および血管新生の促進 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣＲＥＢタンパク質のＳｅｒ１３３リン酸化が、本発明の組成物による処置によって濃度依存的に増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図10】Ｖ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路を活性化することによる神経新生、シナプス新生、および血管新生の促進 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＮＧＦ（神経成長因子）およびＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）のタンパク質レベルが、本発明の組成物による処置により濃度依存的に増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図11】Ｖ．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路を活性化することによる神経新生、シナプス新生、および血管新生の促進 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＮＧＦ（神経成長因子）のタンパク質レベルが、本発明の組成物による処置により増加したことを示す、ＮＧＦ免疫細胞化学の結果を提示する。
【図12】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により増加した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＤＫＫ－１ ｍＲＮＡのレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、ｑＲＴ－ＰＣＲの結果を提示する。
【図13】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により増加した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＤＫＫ－１タンパク質のレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、ｑＲＴ－ＰＣＲの結果を提示する。
【図14】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーにより最初に処置された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ３ａ ｍＲＮＡのレベルが、対照群と比較して、本発明の組成物による処置により増加したことを示す、ｑＲＴ－ＰＣＲの結果を提示する。
【図15】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬におけるＷｎｔ１タンパク質のレベルの低減が、本発明の組成物による処置により増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図16】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーにより最初に処置された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン関連因子、ＶＡＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＲ５Ａ２、Ｍｉｔｆ、ＴＣＦ／ＬＥＦ、ＮＦＡＴ、ＣＥＢＰ、ＧＬＩ－１、ＧＢＸ２、およびＡＰ－１の活性が、対照群と比較して、本発明の組成物による処置により２倍超増加したことを示す、Ｗｎｔ／β－カテニンＴＦアレイの結果を提示する。
【図17】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により低減された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン活性が、本発明の組成物による処置により濃度依存的に増加したことを示す、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター遺伝子アッセイ（Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達）の結果を提示する。
【図18】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により低減された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＧＳＫ３βタンパク質のＳｅｒ９リン酸化のレベルが、本発明の組成物による処置により増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図19】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により低減された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＧＳＫ３βタンパク質のＳｅｒ９リン酸化のレベルが、本発明の組成物による処置により増加したことを示す、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３ｂ（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡの結果を提示する。
【図20】ＶＩ．ＤＫＫ－１阻害によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復 アルツハイマー病動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬において増加したタウタンパク質のＳｅｒ９リン酸化のレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図21】ＶＩＩ．ＤＫＫ－１の抑制によるＡβ産生のポジティブフィードバックループの抑制によるＡＰＰ形成およびＡβ蓄積の低減 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により増加した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＰＰおよびＡβ１－４２タンパク質のレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図22】ＶＩＩ．ＤＫＫ－１の抑制によるＡβ産生のポジティブフィードバックループの抑制によるＡＰＰ形成およびＡβ蓄積の低減 Ｈ２Ｏ２の処置により増加した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＰＰおよびＡβ１－４２タンパク質のレベルが、本発明の組成物による処理により減少したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図23】ＶＩＩＩ．オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害 アルツハイマー病動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬において増加したＡβタンパク質のレベルが、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図24】ＶＩＩＩ．オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害 アルツハイマー病動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬におけるＡβプラークの数が、本発明の組成物による処置により減少したことを示す、チオフラビンＳ染色／ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）免疫組織化学の結果を提示する。Ａβプラークの数を、チオフルバインＳ（緑色）により染色されたＡβプラークの数と、ＧＦＡＰによって染色されたアストロサイト（赤色）の共局在化スポット（黄色）の数とをカウントすることによってカウントした。
【図25】ＶＩＩＩ．オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるＡＭＰＫ触媒サブユニットαのＴｈｒ１７２リン酸化のレベルが、本発明の組成物による処置により濃度依存的に増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図26】ＶＩＩＩ．オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害 Ａβ１－４２オリゴマーの処置により減少した、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂタンパク質のレベルが、同時に、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比を増加させるためにオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－１からＬＣ３Ｂ－ＩＩへの変換）を誘導し、また、Ａβ１－４２オリゴマーの処置によって減少したオートファゴソームカーゴタンパク質であるユビキチン結合タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ、セクエストソーム１）の発現も増加させたことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。さらに、３－ＭＡ（３－メチルアデニン）、オートファジー／ＰＩ３Ｋ阻害剤を同時に本発明の組成物の組み合わせで使用し、本発明の組成物により増加したオートファジーフラックスのレベル（ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比）が減少し、本発明の組成物により減少したｐ６２の発現が増加した。さらに、本発明の組成物により減少したＡＰＰおよびＡβ１－４２タンパク質のレベルは、３－ＭＡを本発明の組成物とともに使用した場合に増加し、ウエスタンブロット解析による結果が図２６に示される。
【図27】ＶＩＩＩ．オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラーク形成の阻害 ＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２タンパク質、すなわちオートファジーマーカーのレベルがアルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬において増加し、皮質におけるＡＴＧ５／１２タンパク質レベルが本発明の組成物による治療により増加したことを示す、ウエスタンブロット解析の結果を提示する。
【図28】ＩＸ．認知能力および行動学習能力を改善させる効果 アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における認知機能レベルの改善の評価において、本発明の組成物により処置された群が、トランスジェニックマウス対照と比較して、標的に対する潜時および標的に対する距離の低減、ならびに標的象限における時間およびクロスプラットフォームの数の増加を達成したことを示す、モリス水迷路試験の結果を提示する。
【図29】ＩＸ．認知能力および行動学習能力を改善させる効果 アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における認知能力および行動学習能力の改善の評価において、本発明の組成物で処置された群が、トランスジェニックマウス対照と比較して、潜時の低減を達成したことを示す、受動回避試験の結果を提示する。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の一実施形態は、（１）Ａβ凝集の抑制によるＡβオリゴマー／フィブリルの形成の阻害、（２）ＢＡＣＥ－１の低減によるβ－アミロイド形成プロセシングの阻害、（３）脳血流増加（血管拡張）による細胞外Ａβ単量体、オリゴマー、Ａβフィブリル／プラークの形成の低減、（４）ＮＯ（一酸化窒素）／ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）／ＰＫＧ（タンパク質キナーゼＧ）、ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）応答エレメント結合タンパク質）経路の活性化による、神経細胞死の阻害、ならびに神経新生、シナプス新生および／または血管新生の促進、（５）ＤＫＫ－１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤１）の阻害によるＷｉｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性（シナプス可塑性）の回復、ならびにＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）の産生の阻害およびＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の低減、ならびに（６）ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、および／またはアバナフィルから選択される化合物のうちの１つ、ならびに薬学的に許容されるそれらの塩、溶媒和物、および水和物を投与することによる、オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラークの形成の阻害、のための方法を提供する。
【0017】
別の実施形態において、本発明は、（１）Ａβ凝集の低減によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害、（２）βアミロイド形成プロセシング減少ＢＡＣＥ－１の阻害、（３）脳血流の増加による細胞外Ａβ単量体、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラークの低減、（４）ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による、神経細胞死阻害の抑制、ならびに神経新生、シナプス新生および／または血管新生の促進、（５）ＤＫＫ－１の阻害によるＷｉｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性（シナプス可塑性）の回復、ならびにＡＰＰの産生の阻害およびＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の低減、ならびに（６）オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラークの形成の阻害、のために、ミロデナフィル、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、およびアバナフィルから選択される１つの化合物、ならびに薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、および水和物を含む、薬学的組成物を提供する。
【0018】
本発明は、以前に開発された、または現在開発されている他のアルツハイマー治療薬とは区別される複数のメカニズムを有する。本発明は、（１）Ａβ凝集の低減によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害、（２）βアミロイド形成プロセシング減少ＢＡＣＥ－１の阻害、（３）脳血流の増加による細胞外Ａβ単量体、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラークの低減、（４）ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による、神経細胞死の抑制、ならびに神経新生、シナプス新生および／または血管新生の促進、（５）ＤＫＫ－１の阻害によるＷｉｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性（シナプス可塑性）の回復、ならびにＡＰＰの産生の阻害およびＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の低減、ならびに（６）オートファジーの活性化による細胞内毒性および可溶性Ａβオリゴマーの除去によるＡβフィブリル／プラークの形成の阻害、を提供するために、「１つの薬物、１つの標的」パラダイムに基づく従来の発見戦略より優れている「１つの薬物、複数の標的／メカニズム」戦略を採用することによって、市場における現在の薬物と比較して、アルツハイマー病の治療のために大幅に改善された有効性を提供する。
【0019】
アルツハイマー病の治療メカニズム
１．Ａβ凝集の阻害によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害
孤発性および家族性アルツハイマー型認知症における一般的な病理学的特徴は、細胞外老人性プラークを形成するＡβ蓄積として知られるペプチドである（Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ ２０１８；６４（ｓ１）：Ｓ５６７－Ｓ６１０．）。Ａβは正常人でも産生されるが、体内に蓄積しないほど十分迅速に分解される。一方、アルツハイマー病患者の場合、Ａβは、大量に形成されるだけでなく、組織内で分解されず、蓄積する（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２０１３ Ｎｏｖ ２９；５（６）：６０．）。これらの異常なＡβ蓄積は、神経細胞間のシグナル伝達を妨げる細胞外老人性プラークの形成、また、記憶および学習能力において重要な役割を果たす海馬、および皮質において蓄積を誘導し、細胞炎症および神経細胞損傷を引き起こし、最終的に正常な機能に必要な神経細胞ネットワークを損傷する（ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６ Ａｐｒ；６：４２－４９．）。加えて、蓄積されたＡβ単量体が凝集して、毒性のＡβオリゴマーを形成し、ＲＯＳ（反応性酸素種）およびＲＮＳ（反応性窒素種）の産生を増加させて、アポトーシスを増加させる神経細胞死に関連するシグナルネットワークを活性化させる（Ｍｔ Ｓｉｎａｉ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１０ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；７７（１）：４３－９．）。
１．Ａβ凝集の阻害によるＡβオリゴマー／フィブリル形成の阻害
孤発性および家族性アルツハイマー型認知症における一般的な病理学的特徴は、細胞外老人性プラークを形成するＡβ蓄積として知られるペプチドである（Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ ２０１８；６４（ｓ１）：Ｓ５６７－Ｓ６１０．）。Ａβは正常人でも産生されるが、体内に蓄積しないほど十分迅速に分解される。一方、アルツハイマー病患者の場合、Ａβは、大量に形成されるだけでなく、組織内で分解されず、蓄積する（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２０１３ Ｎｏｖ ２９；５（６）：６０．）。これらの異常なＡβ蓄積は、神経細胞間のシグナル伝達を妨げる細胞外老人性プラークの形成、また、記憶および学習能力において重要な役割を果たす海馬、および皮質において蓄積を誘導し、細胞炎症および神経細胞損傷を引き起こし、最終的に正常な機能に必要な神経細胞ネットワークを損傷する（ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６ Ａｐｒ；６：４２－４９．）。加えて、蓄積されたＡβ単量体が凝集して、毒性のＡβオリゴマーを形成し、ＲＯＳ（反応性酸素種）およびＲＮＳ（反応性窒素種）の産生を増加させて、アポトーシスを増加させる神経細胞死に関連するシグナルネットワークを活性化させる（Ｍｔ Ｓｉｎａｉ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１０ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；７７（１）：４３－９．）。
【0020】
【0021】
したがって、本発明の組成物は、Ａβオリゴマー凝集オリゴマーを阻害して、Ａβオリゴマー／フィブリル形成を阻害する。
【0022】
２．ＢＡＣＥ－１低減によるβ－アミロイド形成プロセシングの抑制
Ａβは、様々な数のアミノ酸を有するＡβを生成するために、様々なセクレターゼ切断ＡＰＰとしてＡＰＰから産生される。これらのうち、アルツハイマー型患者の場合、ＢＡＣＥ－１によって形成される４２または４３アミノ酸とのＡβの比率は急激に増加する。現在、Ａβ１－４２またはＡβ１－４３による神経細胞損傷が、アルツハイマー病の進行における重要な原因の１つであることが知られており、Ａβ２５－３５が、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の毒性断片であることが知られている（Ｊ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２０１１；２０１１：１９８４３０．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３；８（１）：ｅ５３１１７，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ ２０１８；６２（３）：１３４５－１３６７）。特に、最近、ＰＤＥ－５阻害剤であるシルデナフィルが、ＢＡＣＥ－１およびカテプシンＢ発現を抑制して、ＡＰＰのβ－アミロイド形成プロセシングを阻害して、Ａβ１－４２またはＡβ１－４３の産生を低減させることが報告され、ＰＤＥ－５阻害剤が、ＢＡＣＥ－１の発現を抑制して、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の形成を低減させて、アルツハイマー病に対する治療効果を有することが予想された（Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２０１５ Ｊｕｎ；７０（６）：６７５－８５．，Ｊ Ｕｒｏｌ．２０１６ Ａｐｒ；１９５（４ Ｐｔ １）：１１７１．）。
Ａβは、様々な数のアミノ酸を有するＡβを生成するために、様々なセクレターゼ切断ＡＰＰとしてＡＰＰから産生される。これらのうち、アルツハイマー型患者の場合、ＢＡＣＥ－１によって形成される４２または４３アミノ酸とのＡβの比率は急激に増加する。現在、Ａβ１－４２またはＡβ１－４３による神経細胞損傷が、アルツハイマー病の進行における重要な原因の１つであることが知られており、Ａβ２５－３５が、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の毒性断片であることが知られている（Ｊ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２０１１；２０１１：１９８４３０．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３；８（１）：ｅ５３１１７，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ ２０１８；６２（３）：１３４５－１３６７）。特に、最近、ＰＤＥ－５阻害剤であるシルデナフィルが、ＢＡＣＥ－１およびカテプシンＢ発現を抑制して、ＡＰＰのβ－アミロイド形成プロセシングを阻害して、Ａβ１－４２またはＡβ１－４３の産生を低減させることが報告され、ＰＤＥ－５阻害剤が、ＢＡＣＥ－１の発現を抑制して、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の形成を低減させて、アルツハイマー病に対する治療効果を有することが予想された（Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２０１５ Ｊｕｎ；７０（６）：６７５－８５．，Ｊ Ｕｒｏｌ．２０１６ Ａｐｒ；１９５（４ Ｐｔ １）：１１７１．）。
【0023】
本発明の組成物は、β－アミロイド形成プロセシングにおいて重要な役割を果たすＢＡＣＥ－１の発現を抑制した（図３）。
【0024】
したがって、本発明の組成物は、ＡＰＰによるβ－アミロイド形成プロセシングを阻害して、神経細胞に損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の形成を低減させる。
【0025】
３．他の細胞によって増加するＡβ単量体、オリゴマーおよびＡβフィブリル／プラーク脳血流の低減
認知症の発症における最初のステップの１つは、様々な遺伝的および環境的要因による、内皮細胞、周皮細胞、および血管平滑筋細胞を含む脳内の血管を構成する細胞の損傷であり、続いて、Ａβタンパク質または細胞などの神経毒性タンパク質が脳組織に侵入して、脳組織の膨張または様々な変性変化を引き起こすことを可能にする血液脳関門における破壊である。脳においては、脳組織炎症および様々な変性変化を浸潤させる組織化があることが知られている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１８ Ｍａｒ；１４（３）：１３３－１５０．）。
認知症の発症における最初のステップの１つは、様々な遺伝的および環境的要因による、内皮細胞、周皮細胞、および血管平滑筋細胞を含む脳内の血管を構成する細胞の損傷であり、続いて、Ａβタンパク質または細胞などの神経毒性タンパク質が脳組織に侵入して、脳組織の膨張または様々な変性変化を引き起こすことを可能にする血液脳関門における破壊である。脳においては、脳組織炎症および様々な変性変化を浸潤させる組織化があることが知られている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１８ Ｍａｒ；１４（３）：１３３－１５０．）。
【0026】
加えて、アルツハイマー型認知症によりもたらされる認知機能の低下の進行に伴って血液脳関門が崩壊するために、記憶を担う脳領域の脳血流の減少およびその領域の継続的な拡大が報告されている（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ ２０１７ Ｍａｙ；１３（５）：５３１－５４０．）。さらに、最近の研究により、アルツハイマー型認知症患者の脳組織では、ＡβによるＲＯＳの増加が血管周囲細胞の収縮を引き起こし、したがって、脳血流量を低減させるために、周皮細胞におけるカルシウムの濃度を増加させることが示された（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９ Ｊｕｌ １９；３６５（６４５０））。したがって、適切な脳血流は、脳に多くの酸素量および栄養量を提供するだけでなく、二酸化炭素およびＡβ脳、または代謝を通じて自然に生成されるタンパク質廃棄物を含む神経毒を効果的に除去するためにも、維持される必要がある（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７ Ｊｕｌ；１８（７）：４１９－４３４）。
【0027】
ＰＤＥ５阻害剤は、肺高血圧症または勃起不全の治療に使用され、これは、ｃＧＭＰの５’－ＧＭＰへの変換を防止し、最終的に血管の拡張を誘発するために周皮細胞におけるｃＧＭＰの濃度を増加させるためにＰＤＥ５の活性化を阻害することができるためである（Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｐｏｔ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ；１６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ４－７．）。特に、最近の研究において、ＰＤＥ５阻害剤は、アルツハイマー患者を示した（Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２０１８ Ｆｅｂ；３８（２）：１８９－２０３．）。
【0028】
本発明の組成物は、Ｈ２Ｏ２処置により増加した周皮細胞内の細胞内カルシウム濃度を低減させ、カルシウム濃度の増加によって引き起こされる周皮細胞の収縮を阻害することにより、組成物が脳血流の低減を阻害することができることを示す（図４）。
【0029】
したがって、本発明の組成物は、脳血流を増加させ、脳組織内のＡβなどの神経毒の蓄積を減少させるために、周皮細胞の収縮を阻害する。
【0030】
４．ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化による神経細胞死の阻害および神経新生、シナプス新生、血管新生の促進
Ａβ単量体をエンドサイトーシス凝集体によって細胞内にトランスフェクトし、毒性可溶性Ａβオリゴマーを形成した。凝集体は、神経細胞の死に関連する細胞機能の障害を誘発するだけでなく、微小管関連タンパク質であるタウタンパク質の水素リン酸化を増加させて、ＮＦＴ（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ｔａｎｇｌｅ）の形成を促進することもできる。その結果、このプロセスにおけるＲＯＳの増加は、ミトコンドリア損傷を引き起こし、カスパーゼ－３を活性化して神経細胞の死をもたらす。（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７ Ｊｕｌ；８（７）：４９９ －５０９．，Ｎｅｕｒｏｎ．２００８ Ｎｏｖ ２６；６０（４）：５３４－４２． Ｎａｔ，Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１ Ｆｅｂ；１２（２）：６５ －７２．）。
Ａβ単量体をエンドサイトーシス凝集体によって細胞内にトランスフェクトし、毒性可溶性Ａβオリゴマーを形成した。凝集体は、神経細胞の死に関連する細胞機能の障害を誘発するだけでなく、微小管関連タンパク質であるタウタンパク質の水素リン酸化を増加させて、ＮＦＴ（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ｔａｎｇｌｅ）の形成を促進することもできる。その結果、このプロセスにおけるＲＯＳの増加は、ミトコンドリア損傷を引き起こし、カスパーゼ－３を活性化して神経細胞の死をもたらす。（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７ Ｊｕｌ；８（７）：４９９ －５０９．，Ｎｅｕｒｏｎ．２００８ Ｎｏｖ ２６；６０（４）：５３４－４２． Ｎａｔ，Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１ Ｆｅｂ；１２（２）：６５ －７２．）。
【0031】
ＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）は、脳組織の中でも認知機能において重要な役割を果たす大脳皮質および海馬で発現され（Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００３ Ｄｅｃ ２２；４６７（４）：５６６－８０を参照されたい）、特に、ＰＤＥ５発現が、アルツハイマー病患者の脳組織中の大脳皮質において、正常な人と比較して、増加することが報告されている（Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ；４１（４）：４７１－８２．）。さらに、マウスの海馬において、Ａβによって低減された脳認知機能に重要なシナプス可塑性が、ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＣＲＥＢ経路の作用によって回復することが報告されている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００５ Ｊｕｌ ２０；２５（２９）：６８８７－９７．）。
【0032】
ＰＤＥ５阻害剤はまた、神経細胞アポトーシスを阻害することができ、それは、ＰＥＤ５阻害剤がＰＥＤ５活性を阻害して、ｃＧＭＰの５’－ＧＭＰへの変換を防止することができるためであると報告されている。その結果、ｃＧＭＰは脳内に蓄積してＰＫＧを活性化する（Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１０ Ｊｕｎ；４１（２－３）：１２９－３７．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｎｏｖ ２１；３（１１）：８３２－４４．，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；２６１：２６７－７７．）。活性化されたＰＫＧは、毒性可溶性Ａβオリゴマーによって活性化されるカスパーゼ－３を抑制して、神経細胞のアポトーシスを抑制する。（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２０１４ Ｍａｒ；３５（３）：５２０－３１，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ Ｊｕｌ ２２；３２８：６９－７９，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７ Ｍａｒ ８；８：１０６．）。また、遺伝子転写因子であるＣＲＥＢタンパク質のＳｅｒ１３３のリン酸化は、神経新生、シナプス新生、血管新生に関連する因子の発現を増加させるＰＫＧを活性化する（Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２０１３ Ａｕｇｕｓｔ １；２５０：２３０－７，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｎｏｖ；３７（１１）：８６１－８６５．）。
【0033】
本発明の組成物は、ＰＤＥ５の活性化を阻害して、細胞内のｃＧＭＰの量を増加させて、ｃＧＭＰの５’－ＧＭＰへの変換を防止し（図５）、カスパーゼ－３の活性を抑制し（図６）、ミトコンドリア膜電位を回復させて（図７）、Ａβ誘発性神経細胞死を低減する（図８）。
【0034】
本発明の組成物は、ＣＲＥＢタンパク質中のＳｅｒ１３３のリン酸化を増加させることにより、神経新生、シナプス新生、および血管新生に関連する因子の発現を増加させた（図９）。
【0035】
本発明の組成物は、神経細胞の成長、維持、増殖および生存の調節に主に関与するＮＧＦおよびＢＤＮＦの発現を増加させた（図１０および１１）。
【0036】
したがって、本発明は、ＮＯ／ｃＧＭＰ／ＰＫＧ／ＣＲＥＢ経路の活性化によって、認知症患者の脳における神経細胞アポトーシス、神経新生、シナプス新生、および血管新生を刺激する効果を提供する。
【0037】
５．ＤＫＫ－１の抑制によるＷｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復、ならびにＡＰＰの産生の低減およびポジティブフィードバックループの抑制によるＡβ蓄積の阻害
Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、細胞生存を含む多くの細胞プロセスを制御する必須のシグナル伝達経路である。特に、脳内のＷｎｔ／β－カテニン経路は、神経細胞生存および神経細胞シグナル生成のために重要であるだけでなく、シナプス可塑性、血液脳関門の完全性、およびそれらの機能の制御においても不可欠な役割を果たす（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１４；２０１４：３０１５７５．）。現時点で、ＷｎｔアンタゴニストＤＫＫ－１の発現がアルツハイマー患者の脳組織で増加して、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制して、シナプス可塑性を増加させることが知られている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００４ Ｊｕｎ ３０；２４（２６）：６０２１－７．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３ Ｎｏｖ ５；７：１６２）。ＤＫＫ－１の発現が、海馬神経細胞中に蓄積されたＡβによって増加して、シナプス可塑性を低下させることが報告されている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１２ Ｍａｒ ７；３２（１０）：３４９２－８．）。さらに、ＤＫＫ－１は、Ａβ産生のためにポジティブフィードバックループの役割を果たすことが報告されており、これは、従来のようにＡβを標的とする代わりに、Ａβ産生のためのポジティブフィードバックループの必須制御因子であるＤＫＫ－１を阻害して、Ａβ産生を低減してシナプスの損失を低減させることによって、アルツハイマー病の進行を遅延させることが可能であり得るという予想を与える（Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；６（１）：７５－８０．，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１４ Ｏｃｔ １；８４（１）：６３－７７．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１４ Ｎｏｖ ２７；５：ｅ１５４４．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｏｃｔ １０；２６（１９）：２５５１－２５６１．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６ Ｏｃｔ １９；１０：４５９．，Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１８ Ｓｅｐ ２０；８（１）：１７９．）。
Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、細胞生存を含む多くの細胞プロセスを制御する必須のシグナル伝達経路である。特に、脳内のＷｎｔ／β－カテニン経路は、神経細胞生存および神経細胞シグナル生成のために重要であるだけでなく、シナプス可塑性、血液脳関門の完全性、およびそれらの機能の制御においても不可欠な役割を果たす（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１４；２０１４：３０１５７５．）。現時点で、ＷｎｔアンタゴニストＤＫＫ－１の発現がアルツハイマー患者の脳組織で増加して、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制して、シナプス可塑性を増加させることが知られている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００４ Ｊｕｎ ３０；２４（２６）：６０２１－７．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３ Ｎｏｖ ５；７：１６２）。ＤＫＫ－１の発現が、海馬神経細胞中に蓄積されたＡβによって増加して、シナプス可塑性を低下させることが報告されている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１２ Ｍａｒ ７；３２（１０）：３４９２－８．）。さらに、ＤＫＫ－１は、Ａβ産生のためにポジティブフィードバックループの役割を果たすことが報告されており、これは、従来のようにＡβを標的とする代わりに、Ａβ産生のためのポジティブフィードバックループの必須制御因子であるＤＫＫ－１を阻害して、Ａβ産生を低減してシナプスの損失を低減させることによって、アルツハイマー病の進行を遅延させることが可能であり得るという予想を与える（Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；６（１）：７５－８０．，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１４ Ｏｃｔ １；８４（１）：６３－７７．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１４ Ｎｏｖ ２７；５：ｅ１５４４．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｏｃｔ １０；２６（１９）：２５５１－２５６１．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６ Ｏｃｔ １９；１０：４５９．，Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１８ Ｓｅｐ ２０；８（１）：１７９．）。
【0038】
一方、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、およびアルツハイマー病を含むいくつかの変性脳疾患では、高リン酸化によるタウタンパク質の凝集によって形成されるＮＦＴがこの疾患の主な原因であり、これらの障害は、総称して「タウオパチー」と呼ばれる（Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１ Ｏｃｔ ５；４：２４．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ Ｄｅｃ １３；１３：１２７４．）。現在のタウオパチーは、Ｗｎｔ／β－カテニン経路が脳内の様々な病原性メカニズムによって抑制されるために引き起こされることが知られており（Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ．２０１９ Ｄｅｃ ４；１２（１）：１０４．）、特に脳内のＡβの蓄積によるＷｎｔ／β－カテニン経路の抑制は、ＧＳＫ３βタンパク質におけるＳｅｒ９リン酸化を低減させ、かつＴｙｒ ２１６リン酸化を増加させて、ＧＳＫ３βを活性化させ、かつマウス海馬神経細胞におけるタウタンパク質のリン酸化を増強する。その結果、ＮＦＴの形成は、神経細胞の生存、神経細胞の生成、シナプス可塑性、血液脳関門の完全性および機能性を低減させて、タウオパチーの進行を増強する（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．１９９８ Ａｕｇ；３１（４）：３１７－２３．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ．２０１９ Ｊａｎ ２４；１４：２３９－２６１．）。
【0039】
要約すると、脳内のＡβの蓄積によるＤＫＫ－１の発現の増加は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制し、かつＧＳＫ３βを活性化して、ＮＦＴの形成を増加させてシナプス可塑性を低減させるためのＷｎｔアンタゴニストとして機能し、また、Ａβの産生および蓄積を増強して、変性脳障害の進行を促進するための、Ａβの産生のためのポジティブフィードバックループとしても機能する。したがって、ＤＫＫ－１発現阻害を標的とする治療薬は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復、ならびにＡβ産生のためのポジティブフィードバックループの抑制によるＡβの形成および蓄積の低減によって、アルツハイマー病を含む変性脳疾患を阻害することが予想される。
【0040】
本発明の組成物は、ＷｎｔアンタゴニストおよびＡβ産生のポジティブフィードバックループの調節因子であるＤＫＫ－１の発現を低減させた（図１２、１３）。
【0041】
本発明の組成物は、Ｗｎｔ３ａ（図１４）およびＷｎｔ１（図１５）の発現、Ｗｎｔ／β－カテニン関連転写因子（ＶＡＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＲ５Ａ２、Ｍｉｔｆ、ＴＣＦ／ＬＥＦ、ＮＦＡＴ、ＣＥＢＰ、ＧＬＩ－１、ＧＢＸ２、ＡＰ－１）の活性を増加させ（図１６）、Ｗｎｔ／β－カテニンの活性を増加させた（図１７）。
【0042】
本発明の組成物は、ＧＳＫ３βタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させて、ＧＳＫ３β活性の活性を阻害した（図１８、１９）。
【0043】
本発明の組成物は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）で増加するタウタンパク質のＳｅｒ１９９／２０２リン酸化を低減させた（図２０）。
【0044】
本発明の組成物は、Ａβ産生ポジティブフィードバックループを阻害し、その結果、ＡＰＰおよびＡβタンパク質レベルを低減させた（図２１、２２）。
【0045】
したがって、本発明の組成物は、ＤＫＫ－１阻害からのＷｎｔシグナル伝達の活性化によってシナプス可塑性を回復させ、Ａβ産生のためのポジティブフィードバックループを抑制することにより、ＡＰＰの形成およびＡβの蓄積を低減させることが予想される。
【0046】
６．毒性可溶性ＡβオリゴマーおよびＡβプラークの形成を阻害するためのオートファジーの活性化
脳は、人体が消費する全酸素の２０％以上を消費するが、細胞内から必然的に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）を除去するための防御メカニズムが弱いために、酸化ストレスに対して弱い。酸化ストレスによって細胞内に蓄積されたＲＯＳは、小胞体内のタンパク質の酸化を誘導し、タンパク質のフォールディングを阻害し、ミスフォールディングタンパク質を蓄積し、最終的に小胞体ストレスを蓄積させる（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００６ Ｊｕｎ；９７（６）：１６３４－５８．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２００７ Ｄｅｃ；９（１２）：２２７７－９３．）。その結果、小胞体ストレスによって引き起こされる細胞内Ａβ蓄積は、小胞体ストレスならびにエンドソームおよびリソソーム漏出およびミトコンドリア機能障害をさらに増加させて、神経細胞のアポトーシスを増強する（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌ；８９（７）：１０３１－４２．）。さらに、最近のアルツハイマーによる認知症患者を対象とした全ゲノム関連研究では、Ａβの放出または除去に関与する遺伝子の変異（ＳＯＲＬ１、ＢＩＮ１、ＣＤ２ＡＰ、ＰＩＣＡＬＭ）が示され、Ａβの細胞内蓄積がアルツハイマーによる認知症の進行の主な原因であることが確認された（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７ Ｏｃｔ；４０（１０）：５９２－６０２．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７５５－７７３．）。
脳は、人体が消費する全酸素の２０％以上を消費するが、細胞内から必然的に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）を除去するための防御メカニズムが弱いために、酸化ストレスに対して弱い。酸化ストレスによって細胞内に蓄積されたＲＯＳは、小胞体内のタンパク質の酸化を誘導し、タンパク質のフォールディングを阻害し、ミスフォールディングタンパク質を蓄積し、最終的に小胞体ストレスを蓄積させる（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００６ Ｊｕｎ；９７（６）：１６３４－５８．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２００７ Ｄｅｃ；９（１２）：２２７７－９３．）。その結果、小胞体ストレスによって引き起こされる細胞内Ａβ蓄積は、小胞体ストレスならびにエンドソームおよびリソソーム漏出およびミトコンドリア機能障害をさらに増加させて、神経細胞のアポトーシスを増強する（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌ；８９（７）：１０３１－４２．）。さらに、最近のアルツハイマーによる認知症患者を対象とした全ゲノム関連研究では、Ａβの放出または除去に関与する遺伝子の変異（ＳＯＲＬ１、ＢＩＮ１、ＣＤ２ＡＰ、ＰＩＣＡＬＭ）が示され、Ａβの細胞内蓄積がアルツハイマーによる認知症の進行の主な原因であることが確認された（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７ Ｏｃｔ；４０（１０）：５９２－６０２．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７５５－７７３．）。
【0047】
最近、オートファジーが神経変性疾患の主な原因として注目を集めている。オートファジーは、主要な細胞メカニズムのうちの１つであり、オートファジーは、長寿命のタンパク質およびオルガネラを分解するように機能することが知られている（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１３ Ａｕｇｕｓｔ；１９（８）：９８３－９７．）。オートファジーの機能障害は、ミスフォールディングされたタンパク質凝集体の細胞内蓄積を引き起こして、様々な疾患を誘発し、特に、４つの主要な神経変性疾患、すなわち、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症の発症に密接に関連している（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｍａｙ；３８（５）：３８１－９．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｓｅｐ；１７（９）：６６０－６８８．）。特に、アルツハイマー病患者の脳における機能障害性オートファジーは、アルツハイマー病の２つの主要な発症因子、すなわち、Ａβおよびタウタンパク質の凝集を誘発する（Ｊ Ｓｙｓｔ Ｉｎｔｅｇｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７；３（４）：１－６．）。その結果、脳内に蓄積されたＡβおよびタウタンパク質が老人性プラークを形成して、認知能力の責任を負う海馬および皮質の壊死または神経細胞を引き起こし、最終的にアルツハイマー病患者における認知機能の低減を引き起こす（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｏｃｔ １０；１７１（１）：８７－９８．、Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ ３０；１０：０４．）。
【0048】
ＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ）は、インスリン感受性、細胞生存率、増殖およびアポトーシスを含むいくつかの生物学的機能の制御を担当し、それらの中でも、特に、細胞の恒常性を維持するためにｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）タンパク質を阻害することによってオートファジーを活性化することによって制御する（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｆｅｂ；１９（２）：１２１－１３５）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊｕｎ １５；６６（６）：７８９－８００．）。現在、ＡＭＰＫ触媒サブユニットａによるＴｈｒ１７２リン酸化は、オートファジーの活性化のためのシグナル伝達経路の主要な出発点であり（Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６ Ａｐｒｉｌ １；４８：ｅ２２４．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｆｅｂ；１９（２）：１２１－１３５．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１９ Ｊｕｌ；１８（７）：５２７－５５１．）、最近、変性脳疾患においては、活性化されたＡＭＰＫからのオートファジー活性化によるアルツハイマー病の主な発症因子であるＡβおよびタウを含む変性脳疾患に関連するミスフォールディングされたタンパク質凝集体を除去することによって、神経細胞変性が阻害されたことが報告されている（Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８ Ｍａｙ ２２；１２：２５５．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｓｅｐ；１７（９）：６６０－６８８．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．２０１９；６８（１）：３３－３８）。アルツハイマー病患者のうちの３０～４０％が他の病理学的症状との混合病態を有することを考慮すると、活性化されたＡＭＰＫからのオートファジーの活性化によって細胞内に蓄積されたＡβおよびＴａｒ凝集体を含むミスフォールディングされたタンパク質凝集体を除去することは、アルツハイマー病を含む変性脳疾患のための治療薬の今後の開発における新しい標的となる（Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８ Ｍａｙ ２２；１２：２５５．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｓｅｐ；１７（９）：６６０－６８８．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．２０１９；６８（１）：３３－３８．）。
【0049】
本発明の組成物は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬におけるＡβタンパク質レベルを低減させた（図２３）。
【0050】
本発明の組成物は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬および皮質におけるＡβプラーク数を低減させた（図２４）。
【0051】
Ｔｈｒ１７２リン酸化の本発明の組成物ＡＭＰＫ触媒サブユニットαを増加させた（図２５）。
【0052】
本発明の組成物は、オートファジーマーカーＬＣ３Ｂのオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－ＩからＬＣ３Ｂ－ＩＩへの変換）を誘導して、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比を増加させ、オートファゴソームカーゴタンパク質、ユビキチン結合タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ、セクエストソーム１）を低減させた（図２６）。
【0053】
本発明の組成物は、オートファジーマーカー、ＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２の発現、ならびにアルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬における皮質でのＡＴＧ５／１２の発現を増強した（図２６）。
【0054】
したがって、本発明の組成物は、オートファジーマーカーＬＣ３ＢＩＩ／Ｉ比を増加させ、オートファゴソームカーゴタンパク質ユビキチン結合タンパク質ｐ６２を低減させ、ＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２の発現を増加させて、オートファジーカスケードを活性化した。
【0055】
７．認知および行動学習スキル改善のためのアルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）
Ａβ４２の形成および蓄積によって引き起こされる神経変性疾患アルツハイマー病に現れる徐々の記憶低下および行動障害に対する本発明の組成物の効果を試験するために、本発明の組成物を、認知能力および行動学習スキルにおける変化を解析するために、認知能力および行動学習スキルを受動回避試験およびモリス水迷路試験によって試験する前に、４ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間、１３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスに腹腔内注射した。
Ａβ４２の形成および蓄積によって引き起こされる神経変性疾患アルツハイマー病に現れる徐々の記憶低下および行動障害に対する本発明の組成物の効果を試験するために、本発明の組成物を、認知能力および行動学習スキルにおける変化を解析するために、認知能力および行動学習スキルを受動回避試験およびモリス水迷路試験によって試験する前に、４ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間、１３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスに腹腔内注射した。
【0056】
本発明の組成物で処置した群における認知能力および行動学習スキルが、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）におけるトランスジェニックカウス対照群と比較して改善されることが確認された（図２８、２９）。
【実施例】
【0057】
実施例１．ＰＤＥ５（ＩＣ５０、阻害濃度５０）についての本発明の組成物の選択性についての試験
実施例１－１．ＰＤＥ５選択性のための試験方法
本発明の組成物の選択的阻害活性（ＩＣ５０、阻害濃度５０）をＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）に対して試験するために、本試験を、解析機関ＣＲＯであるＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、およびＳｃｏｔｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌによって行った。結果を、ＰＤＥ ＳＰＡ解析キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して測定した。ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓは、ＰＤＥ１（ウシ心臓）、ＰＤＥ２、３、５（ヒト血小板）、ＰＤＥ４（ヒトＵ９３７細胞）、およびＰＤＥ６（ウシ網膜ロッド）を解析し、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌは、ＰＤＥ５、７～１１（組換えヒト酵素）を解析した。試験用試料（各１００μＬ）を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１５ｍＭ、ｐＨ７．５）中のＰＤＥファミリータンパク質（１０μＬ）、［３Ｈ］－ｃＧＭＰ（５Ｃｉ／ｍＬ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の混合物に添加した。反応は、ＰＤＥファミリータンパク質の添加によって開始した。各試料を３０℃の水槽中で３０分間保管し、次いで、ＳＰＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（５０μＬ）を添加して反応を終了した。試験管を２０分間静置し、続いて液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ－ｃａｒｂ １５００、Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。タンパク質活性のＰＤＥファミリーの阻害の程度を決定するために、本発明の組成物および試験用試料をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、次いで、溶液を蒸留水で希釈して、最終ＤＭＳＯ濃度を少なくとも０．２％（ｖ／ｖ）とした。すべての阻害試験を、ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）の加水分解速度が１５％を超えない状態で行った。ＧＭＰの形成量は、時間およびＰＤＥ５ファミリータンパク質に依存して、用量依存的にかつ比例して増加した。
実施例１－１．ＰＤＥ５選択性のための試験方法
本発明の組成物の選択的阻害活性（ＩＣ５０、阻害濃度５０）をＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）に対して試験するために、本試験を、解析機関ＣＲＯであるＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、およびＳｃｏｔｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌによって行った。結果を、ＰＤＥ ＳＰＡ解析キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して測定した。ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓは、ＰＤＥ１（ウシ心臓）、ＰＤＥ２、３、５（ヒト血小板）、ＰＤＥ４（ヒトＵ９３７細胞）、およびＰＤＥ６（ウシ網膜ロッド）を解析し、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌは、ＰＤＥ５、７～１１（組換えヒト酵素）を解析した。試験用試料（各１００μＬ）を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１５ｍＭ、ｐＨ７．５）中のＰＤＥファミリータンパク質（１０μＬ）、［３Ｈ］－ｃＧＭＰ（５Ｃｉ／ｍＬ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の混合物に添加した。反応は、ＰＤＥファミリータンパク質の添加によって開始した。各試料を３０℃の水槽中で３０分間保管し、次いで、ＳＰＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（５０μＬ）を添加して反応を終了した。試験管を２０分間静置し、続いて液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ－ｃａｒｂ １５００、Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。タンパク質活性のＰＤＥファミリーの阻害の程度を決定するために、本発明の組成物および試験用試料をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、次いで、溶液を蒸留水で希釈して、最終ＤＭＳＯ濃度を少なくとも０．２％（ｖ／ｖ）とした。すべての阻害試験を、ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）の加水分解速度が１５％を超えない状態で行った。ＧＭＰの形成量は、時間およびＰＤＥ５ファミリータンパク質に依存して、用量依存的にかつ比例して増加した。
【0058】
実施例１－２．本発明の組成物についてのＰＤＥ５選択性試験の結果
１１種のＰＤＥファミリー（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ ＳｅｒｖｉｃｅｓおよびＳｃｏｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）に対する本発明の組成物の阻害活性に基づいて、ＰＤＥ５に対する本発明の組成物のＩＣ５０は、０．３３８ｎＭ（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）であり、残りの１０種のＰＤＥファミリータンパク質と比較して、３０～３７６，４７１倍高い選択性であった（表１）。
１１種のＰＤＥファミリー（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ ＳｅｒｖｉｃｅｓおよびＳｃｏｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）に対する本発明の組成物の阻害活性に基づいて、ＰＤＥ５に対する本発明の組成物のＩＣ５０は、０．３３８ｎＭ（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）であり、残りの１０種のＰＤＥファミリータンパク質と比較して、３０～３７６，４７１倍高い選択性であった（表１）。
【0059】
【表1】
ｂＳｃｏｔｔｉｓｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；ＰＤＥ５、７～１１（組換えヒト酵素）；ＮＩ＝阻害は観察されなかった。
【0060】
実施例２．本発明の組成物によるＡβ凝集の阻害についての試験－
実施例２－１．Ａβ凝集阻害（Ａβ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）（Ａβ凝集阻害（Ａβ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ））試験法
実施例２－１－１．チオフラビンＴアッセイ
アルツハイマーの主要なバイオマーカーの１つであり、原因となるＡβ１－４２ペプチドを、３７℃で３日間インキュベートすると、Ａβフィブリルおよびオリゴマーが生成される。Ａβフィブリルおよびオリゴマー形成を阻害するための本発明の組成物の活性を試験するために、混合物を３７℃で３日間インキュベートし、続いてＡβ１－４２フィブリルおよびオリゴマーの量を測定する前に、Ａβ１－４２（５０μＭ）を様々な濃度（５、５０、５００μＭ）の本発明の組成物で処置した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、励起４５０ｎｍ／発光４８５におけるチオフラビンＴからの蛍光強度を測定した。チオフラビンＴアッセイは、ペプチド凝集体として形成されたβシートからの蛍光応答を測定し、より多くの凝集体が形成されるため、より高い値を示した。チオフラビンＴアッセイは、Ａβオリゴマーとフィブリルとを区別することができないが、それは、凝集したタンパク質の総量を定量的に示すことができるという利点である。
実施例２－１．Ａβ凝集阻害（Ａβ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）（Ａβ凝集阻害（Ａβ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ））試験法
実施例２－１－１．チオフラビンＴアッセイ
アルツハイマーの主要なバイオマーカーの１つであり、原因となるＡβ１－４２ペプチドを、３７℃で３日間インキュベートすると、Ａβフィブリルおよびオリゴマーが生成される。Ａβフィブリルおよびオリゴマー形成を阻害するための本発明の組成物の活性を試験するために、混合物を３７℃で３日間インキュベートし、続いてＡβ１－４２フィブリルおよびオリゴマーの量を測定する前に、Ａβ１－４２（５０μＭ）を様々な濃度（５、５０、５００μＭ）の本発明の組成物で処置した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、励起４５０ｎｍ／発光４８５におけるチオフラビンＴからの蛍光強度を測定した。チオフラビンＴアッセイは、ペプチド凝集体として形成されたβシートからの蛍光応答を測定し、より多くの凝集体が形成されるため、より高い値を示した。チオフラビンＴアッセイは、Ａβオリゴマーとフィブリルとを区別することができないが、それは、凝集したタンパク質の総量を定量的に示すことができるという利点である。
【0061】
実施例２－１－２．ＰＩＣＵＰ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析
Ａβオリゴマーの産生をＰＩＣＵＰ（未修飾タンパク質の光誘導架橋）解析法により観察した。ＰＩＣＵＰプロセスを使用して、生成されたＡβオリゴマーおよびフィブリル／プラークを固定化し、続いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使用してｘｉｚｅにより分離する。銀染色を使用して、別個のＡβ１－４２ペプチドを観察する。
Ａβオリゴマーの産生をＰＩＣＵＰ（未修飾タンパク質の光誘導架橋）解析法により観察した。ＰＩＣＵＰプロセスを使用して、生成されたＡβオリゴマーおよびフィブリル／プラークを固定化し、続いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使用してｘｉｚｅにより分離する。銀染色を使用して、別個のＡβ１－４２ペプチドを観察する。
【0062】
実施例２－２．本発明の組成物によるＡβ凝集阻害の結果
Ａβ－４２凝集阻害の結果は、本発明の組成物が、未処置の対照群と比較して、チオフラビンＴアッセイに基づいて、用量依存的に結果が議論されたＡβ１－４２凝集形成阻害効果を阻害すること（図１）、およびＰＩＣＵＰ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、本発明が、未処置の対照群と比較して、Ａβ１－４２オリゴマーおよびフィブリル／プラーク形成を阻害すること（図２）も示した。結果を考慮すると、本発明の組成物は、Ａβオリゴマーおよびフィブリル／プラーク形成を阻害することが予想される。
Ａβ－４２凝集阻害の結果は、本発明の組成物が、未処置の対照群と比較して、チオフラビンＴアッセイに基づいて、用量依存的に結果が議論されたＡβ１－４２凝集形成阻害効果を阻害すること（図１）、およびＰＩＣＵＰ／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、本発明が、未処置の対照群と比較して、Ａβ１－４２オリゴマーおよびフィブリル／プラーク形成を阻害すること（図２）も示した。結果を考慮すると、本発明の組成物は、Ａβオリゴマーおよびフィブリル／プラーク形成を阻害することが予想される。
【0063】
実施例３．本発明の組成物によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＢＡＣＥ－１発現変化
実施例３－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例３－１－１．細胞継代培養
ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地、ＤＰＢＳ、およびトリプシン－ＥＤＴＡの混合物を、３７℃の恒温水槽中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、すべての培地を取り除き、ＤＰＢＳ（Ｔ２５：５ｍｌ，Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）で１回すすいだ。すべてのＤＰＢＳを廃棄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍＬ、Ｔ７５：５ｍＬおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２を有するインキュベーター中に、３７℃で４分間放置した。５０ｍｌの円錐管中で、新しい完全培地（Ｔ２５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよび：Ｔ１７５：２０ｍＬ）と細胞を混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清をすべて除去し、新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地１ｍＬを添加して、タッピングまたはピペッティングのいずれかによって細胞を再懸濁させた。細胞および培地を細胞培養フラスコに添加して、混合物を５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーターでインキュベートする前に、Ｔ７５：２０ｍｌおよびＴ１７５：４０ｍｌとした。
実施例３－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例３－１－１．細胞継代培養
ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地、ＤＰＢＳ、およびトリプシン－ＥＤＴＡの混合物を、３７℃の恒温水槽中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、すべての培地を取り除き、ＤＰＢＳ（Ｔ２５：５ｍｌ，Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）で１回すすいだ。すべてのＤＰＢＳを廃棄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍＬ、Ｔ７５：５ｍＬおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２を有するインキュベーター中に、３７℃で４分間放置した。５０ｍｌの円錐管中で、新しい完全培地（Ｔ２５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよび：Ｔ１７５：２０ｍＬ）と細胞を混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清をすべて除去し、新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地１ｍＬを添加して、タッピングまたはピペッティングのいずれかによって細胞を再懸濁させた。細胞および培地を細胞培養フラスコに添加して、混合物を５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーターでインキュベートする前に、Ｔ７５：２０ｍｌおよびＴ１７５：４０ｍｌとした。
【0064】
実施例３－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）およびトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）の混合物を、３７℃の恒温水槽中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、すべての培地を取り除き、ＤＰＢＳ（Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）で１回すすいだ。すべてのＤＰＢＳを廃棄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ７５：５ｍＬおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２を有するインキュベーター中に、３７℃で４分間放置した。５０ｍｌの円錐管中で、新しい完全培地（Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）と細胞とを混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清をすべて除去し、新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地１ｍＬを添加して、タッピングまたはピペッティングのいずれかによって細胞を再懸濁させた。一定量のＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を添加し、４×１０４細胞／ｃｍ２を、コラーゲンＩ型コーティング６ウェルプレートまたはコラーゲンＩ型コーティング６０ｍｍ、１００ｍｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。２４時間後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地［＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１０μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）］で交換した。５日目に、培地を、新しいＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地で再び交換した。８日目に、培地を、新しいＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地で再び交換した。１０日目、分化が完了した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）およびトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）の混合物を、３７℃の恒温水槽中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、すべての培地を取り除き、ＤＰＢＳ（Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）で１回すすいだ。すべてのＤＰＢＳを廃棄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ７５：５ｍＬおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２を有するインキュベーター中に、３７℃で４分間放置した。５０ｍｌの円錐管中で、新しい完全培地（Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）と細胞とを混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清をすべて除去し、新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地１ｍＬを添加して、タッピングまたはピペッティングのいずれかによって細胞を再懸濁させた。一定量のＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を添加し、４×１０４細胞／ｃｍ２を、コラーゲンＩ型コーティング６ウェルプレートまたはコラーゲンＩ型コーティング６０ｍｍ、１００ｍｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。２４時間後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地［＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１０μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）］で交換した。５日目に、培地を、新しいＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地で再び交換した。８日目に、培地を、新しいＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地で再び交換した。１０日目、分化が完了した。
【0065】
実施例３－２．本発明のＡβならびに調製および処置方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を、１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）を有するように調製した。Ａβ溶液を３７℃で３時間静置し、Ａβオリゴマーを形成した。元の細胞培養培地を廃棄し、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液を単独でまたは本発明の組成物（最大濃度４０μＭ）で処置した後、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベーターでインキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、収集した後、以下の実験を続行した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を、１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）を有するように調製した。Ａβ溶液を３７℃で３時間静置し、Ａβオリゴマーを形成した。元の細胞培養培地を廃棄し、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液を単独でまたは本発明の組成物（最大濃度４０μＭ）で処置した後、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベーターでインキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、収集した後、以下の実験を続行した。
【0066】
実施例３－３．ｑＲＴ－ＰＣＲ法
全ＲＮＡを、Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して、調製し、１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）の鋳型として提供し、ＢＡＣＥ－１およびβ－アクチンＰＣＲの次のプライマー：ヒトＢＡＣＥ－１（フォワード５’－ＣＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＧＧＣ－３’、リバース５’－ＣＴＴＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＴＴＧＧ－３’）；ヒトβ－アクチン（フォワード５’－ＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧ－３’）を提供した。ＰＣＲサイクルの条件は以下のとおりであった：変性（９５℃で４５秒）；アニーリング、ヒトＢＡＣＥ－１（６０℃で４５秒）、β－アクチン（５６℃で４５秒）；伸長（７２℃で４５秒）；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。
全ＲＮＡを、Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して、調製し、１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）の鋳型として提供し、ＢＡＣＥ－１およびβ－アクチンＰＣＲの次のプライマー：ヒトＢＡＣＥ－１（フォワード５’－ＣＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＧＧＣ－３’、リバース５’－ＣＴＴＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＴＴＧＧ－３’）；ヒトβ－アクチン（フォワード５’－ＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧ－３’）を提供した。ＰＣＲサイクルの条件は以下のとおりであった：変性（９５℃で４５秒）；アニーリング、ヒトＢＡＣＥ－１（６０℃で４５秒）、β－アクチン（５６℃で４５秒）；伸長（７２℃で４５秒）；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。
【0067】
実施例３－４．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における本発明の組成物によるＢＡＣＥ－１発現の変化の結果
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１－４２で処置することにより増加したＢＡＣＥ－１ ｍＲＮＡの発現を用量依存的に低減させた（図３）。結果を考慮すると、本発明は、ＡＰＰのβ－アミロイド形成プロセシングに大きな役割を果たすＢＡＣＥ－１の発現を抑制することによって、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の形成を抑制することが予想される。
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１－４２で処置することにより増加したＢＡＣＥ－１ ｍＲＮＡの発現を用量依存的に低減させた（図３）。結果を考慮すると、本発明は、ＡＰＰのβ－アミロイド形成プロセシングに大きな役割を果たすＢＡＣＥ－１の発現を抑制することによって、神経細胞損傷を引き起こすＡβ１－４２またはＡβ１－４３の形成を抑制することが予想される。
【0068】
実施例４．本発明の組成物による周皮細胞内のカルシウム濃度の変化
実施例４－１．周皮細胞の培養のための方法
実施例４－１－１．細胞継代培養
いくつかのＴ－７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ＳＰＬ、＃７００７５）を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であるＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４Ｚ０－２１０）を使用して１分間コーティングし、続いて、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４Ｚ０－５００）を含む１５ｍＬの完全古典培地をフラスコに添加した後、混合物をＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で安定化させた。インキュベートした正常ヒト脳周皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＣＢＲＩ４９８Ｐ）をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて０．２５％トリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００４２．０２）３ｍＬを添加し、混合物をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２分間反応させた。血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む７ｍＬの完全古典的培地を添加し、細胞のクラスターを反復ピペッティングによって分離し、上清を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４分）によって除去した。細胞塊を血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む１ｍＬの完全古典培地で均質化した後、細胞を安定化Ｔ－７５ｃｍ２細胞培養フラスコ内で最適なＣＯ２下でインキュベートした。
実施例４－１．周皮細胞の培養のための方法
実施例４－１－１．細胞継代培養
いくつかのＴ－７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ＳＰＬ、＃７００７５）を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であるＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４Ｚ０－２１０）を使用して１分間コーティングし、続いて、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４Ｚ０－５００）を含む１５ｍＬの完全古典培地をフラスコに添加した後、混合物をＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で安定化させた。インキュベートした正常ヒト脳周皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＣＢＲＩ４９８Ｐ）をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて０．２５％トリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００４２．０２）３ｍＬを添加し、混合物をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２分間反応させた。血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む７ｍＬの完全古典的培地を添加し、細胞のクラスターを反復ピペッティングによって分離し、上清を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４分）によって除去した。細胞塊を血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む１ｍＬの完全古典培地で均質化した後、細胞を安定化Ｔ－７５ｃｍ２細胞培養フラスコ内で最適なＣＯ２下でインキュベートした。
【0069】
実施例４－２．Ｈ２Ｏ２での調製および処置の方法、および処置後の細胞内カルシウム濃度の変化の測定
平底９６ウェルプレート（ＳＰＬ、＃３００９６）を、Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ（商標）でコーティングして、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む完全古典培地（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、続いて、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１時間プレートを安定化させた。０．２５％のタイリプシンで処置した正常ヒト脳周皮細胞を、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む完全古典的培地を含有するＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｏｔｒ－Ｃｏａｔｅｄ－９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに添加し、混合物を３７℃のＣＯ２インキュベーターで１６時間インキュベートした（５×１０３細胞／ウェル）。培養細胞の培養培地を除去し、細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１３２ｍＭ ＮａＣｌ、５．９ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１．５ｍＭグルコース、１１．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）で１回洗浄し、９６ウェル含有の周皮細胞に移し、ここで、比率測定細胞内Ｃａ２＋色素、Ｆｕｒａ－２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｆ１２０１）を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で１μＭに希釈した後、室温で３０分間インキュベートした。上清を９６ウェルプレートから除去し、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水およびＨ２Ｏ２で希釈した本発明の組成物を処置した後、蛍光を測定して細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。
平底９６ウェルプレート（ＳＰＬ、＃３００９６）を、Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ（商標）でコーティングして、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む完全古典培地（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、続いて、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１時間プレートを安定化させた。０．２５％のタイリプシンで処置した正常ヒト脳周皮細胞を、血清およびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（商標）を含む完全古典的培地を含有するＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｏｔｒ－Ｃｏａｔｅｄ－９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに添加し、混合物を３７℃のＣＯ２インキュベーターで１６時間インキュベートした（５×１０３細胞／ウェル）。培養細胞の培養培地を除去し、細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１３２ｍＭ ＮａＣｌ、５．９ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１１．５ｍＭグルコース、１１．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）で１回洗浄し、９６ウェル含有の周皮細胞に移し、ここで、比率測定細胞内Ｃａ２＋色素、Ｆｕｒａ－２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｆ１２０１）を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で１μＭに希釈した後、室温で３０分間インキュベートした。上清を９６ウェルプレートから除去し、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水およびＨ２Ｏ２で希釈した本発明の組成物を処置した後、蛍光を測定して細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。
【0070】
実施例４－４．本発明の組成物によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の周皮細胞におけるカルシウム濃度の変化の結果
本発明の組成物は、Ｈ２Ｏ２の処置により増加した血管周囲細胞（周皮細胞）中の細胞内カルシウム濃度を低減させた（図４）。その結果、本発明の組成物は、過剰なＲＯＳ産生による周皮細胞内のカルシウム濃度の増加により引き起こされた周皮細胞の収縮により引き起こされる脳血流の低減を阻害することができると予想される。
本発明の組成物は、Ｈ２Ｏ２の処置により増加した血管周囲細胞（周皮細胞）中の細胞内カルシウム濃度を低減させた（図４）。その結果、本発明の組成物は、過剰なＲＯＳ産生による周皮細胞内のカルシウム濃度の増加により引き起こされた周皮細胞の収縮により引き起こされる脳血流の低減を阻害することができると予想される。
【0071】
実施例５．本発明の組成物によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における細胞内ｃＧＭＰの変化
実施例５－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例５－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞を継代培養した。
実施例５－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例５－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞を継代培養した。
【0072】
実施例５－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞分化を行った。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞分化を行った。
【0073】
実施例５－２．Ａβならびに本発明の調製および処置方法
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実施した。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実施した。
【0074】
実施例５－３．細胞内ｃＧＭＰ測定方法
実験は、環状ＧＭＰ完全ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１３３０５２、米国）のマニュアルに従って行った。細胞培養培地を除去し、細胞を０．１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌで処置した後、室温にて１０分間静置した。細胞を６００ｇの遠心分離により回収し、上清のみを収集した。０．１ＭのＨＣｌが試料に含まれる場合、５０μｌの中和試薬を各ウェルに添加した。マニュアルに従い、各剤１００μｌおよび標準溶液（０、０．８、４ ２０、１００、５００ｐｍｏｌ／ｍｌ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、環状ＧＭＰ完全アルカリホスファターゼ複合体５０μｌも各ウェルに添加した。環状ＧＭＰ完全抗体を５０μｌ添加した後、室温で２時間反応を行った。すべての反応溶液を除去したら、ウェルを４００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄緩衝液を完全に除去した後、環状ＧＭＰ完全アルカリホスファターゼ複合体５μｌを添加した。各ウェルに２００μｌのｐＮｐｐ基質溶液を添加した後、反応を室温で１時間行った。ストップ溶液５０μｌを添加し、４０５ｎｍのプレートリーダーを使用してすぐに吸収値を測定した。結果は、キットのマニュアルを使用して計算した。
実験は、環状ＧＭＰ完全ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１３３０５２、米国）のマニュアルに従って行った。細胞培養培地を除去し、細胞を０．１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌで処置した後、室温にて１０分間静置した。細胞を６００ｇの遠心分離により回収し、上清のみを収集した。０．１ＭのＨＣｌが試料に含まれる場合、５０μｌの中和試薬を各ウェルに添加した。マニュアルに従い、各剤１００μｌおよび標準溶液（０、０．８、４ ２０、１００、５００ｐｍｏｌ／ｍｌ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、環状ＧＭＰ完全アルカリホスファターゼ複合体５０μｌも各ウェルに添加した。環状ＧＭＰ完全抗体を５０μｌ添加した後、室温で２時間反応を行った。すべての反応溶液を除去したら、ウェルを４００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄緩衝液を完全に除去した後、環状ＧＭＰ完全アルカリホスファターゼ複合体５μｌを添加した。各ウェルに２００μｌのｐＮｐｐ基質溶液を添加した後、反応を室温で１時間行った。ストップ溶液５０μｌを添加し、４０５ｎｍのプレートリーダーを使用してすぐに吸収値を測定した。結果は、キットのマニュアルを使用して計算した。
【0075】
実施例５－４ 本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における細胞内ｃＧＭＰの変化の結果
本発明の組成物は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１－４２オリゴマーで処置することにより低減したｃＧＭＰの濃度を濃度依存的に増加させた（図５）。この結果を考慮すると、本発明は、ＰＤＥ５の活性を選択的に抑制して（表１）、ｃＧＭＰの５’－ＧＭＰへの変換を阻害し、細胞内ｃＧＭＰを増加させ、カスパーゼ－３の活性を抑制し（図６）、神経細胞死を阻害する可能性のあるミトコンドリア膜電位を回復させる（図８）ことが予想される。また、本発明により増加した細胞内ｃＧＭＰは、認知機能を改善するために、ＮＧＦおよびＢＤＮＦを含むニューロトロフィン発現を促進するＣＲＥＢ（図９）の活性を増加させる（図１０、１１）。
本発明の組成物は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１－４２オリゴマーで処置することにより低減したｃＧＭＰの濃度を濃度依存的に増加させた（図５）。この結果を考慮すると、本発明は、ＰＤＥ５の活性を選択的に抑制して（表１）、ｃＧＭＰの５’－ＧＭＰへの変換を阻害し、細胞内ｃＧＭＰを増加させ、カスパーゼ－３の活性を抑制し（図６）、神経細胞死を阻害する可能性のあるミトコンドリア膜電位を回復させる（図８）ことが予想される。また、本発明により増加した細胞内ｃＧＭＰは、認知機能を改善するために、ＮＧＦおよびＢＤＮＦを含むニューロトロフィン発現を促進するＣＲＥＢ（図９）の活性を増加させる（図１０、１１）。
【0076】
実施例６．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるアポトーシス調節関連タンパク質の発現の変化
実施例６－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例６－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例６－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例６－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0077】
実施例６－１－２．ＳＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0078】
実施例６－２．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
ヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）と混合して、１０μＭ濃度にした。Ａβ溶液を３７℃で３時間静置させて、Ａβオリゴマーを形成した。培養培地を除去し、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー溶液（１０μＭ）を、本発明の組成物（最大濃度４０μＭ）とともに、またはそれなしで、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７２時間インキュベートした。培地を７２時間後に取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、細胞を収集した。以下の手順で、さらなる実験を実行した。
ヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）と混合して、１０μＭ濃度にした。Ａβ溶液を３７℃で３時間静置させて、Ａβオリゴマーを形成した。培養培地を除去し、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー溶液（１０μＭ）を、本発明の組成物（最大濃度４０μＭ）とともに、またはそれなしで、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７２時間インキュベートした。培地を７２時間後に取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、細胞を収集した。以下の手順で、さらなる実験を実行した。
【0079】
実施例６－５．ウエスタンブロット解析法
タンパク質を抽出するために、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で処置し、均質化し、遠心分離して（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を得た。５％濃縮用ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）および１２％分離ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、ビサクリルアミド、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）を使用した。遠心分離により得られた上清を、４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と３：１の比で混合し、９５℃で１０分間煮沸して、タンパク質を変性させた。混合物を氷浴中で１０分間冷却し、スピンダウンした。タンパク質サイズマーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）および各試料を、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩ Ｄｕａｌ－Ｓｌａｂ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で十分に調製されたスタッキングゲルに添加し、すべてが底部に沈殿するまで１５０ボルトで電気泳動した。ポリビニリジン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜をメタノールで湿らせて活性化し、トランスファー緩衝液（１９０ｍＭグリシン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、０．０５％ＳＤＳ、２０％メタノール）で洗浄した。トランスファー緩衝液で湿らせたＷｈａｔｍａｎ ３Ｍ ＰａｐｅｒをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｏｌｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に積み重ね、２００ｍＡで６０分間電気を流して、膜を堆積させた。堆積後、膜を５％脱脂乳液（ＴＢＳ－Ｔ ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いてプラットフォームシェーカー上で６０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体は、表２に提供される。一次抗体を各々、最適濃度の５％脱脂乳中で希釈し、４℃で１６時間プラットフォームシェーカー上に置いた。一次抗体を回収し、ＴＢＳ－Ｔで３回、各々１０分間洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ）を、５％脱脂乳で１：１０，０００の比で希釈し、続いて、プラットフォームシェーカー上に室温で６０分間置き、ＴＢＳ－Ｔ溶液で１０分間、３回洗浄した。最後に、膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に添加し、膜を画像解析システムを使用して走査する前に色を適切に表現し、タンパク質の量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を使用して計算した。
タンパク質を抽出するために、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で処置し、均質化し、遠心分離して（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を得た。５％濃縮用ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）および１２％分離ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、ビサクリルアミド、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）を使用した。遠心分離により得られた上清を、４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と３：１の比で混合し、９５℃で１０分間煮沸して、タンパク質を変性させた。混合物を氷浴中で１０分間冷却し、スピンダウンした。タンパク質サイズマーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）および各試料を、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩ Ｄｕａｌ－Ｓｌａｂ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で十分に調製されたスタッキングゲルに添加し、すべてが底部に沈殿するまで１５０ボルトで電気泳動した。ポリビニリジン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜をメタノールで湿らせて活性化し、トランスファー緩衝液（１９０ｍＭグリシン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、０．０５％ＳＤＳ、２０％メタノール）で洗浄した。トランスファー緩衝液で湿らせたＷｈａｔｍａｎ ３Ｍ ＰａｐｅｒをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｏｌｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に積み重ね、２００ｍＡで６０分間電気を流して、膜を堆積させた。堆積後、膜を５％脱脂乳液（ＴＢＳ－Ｔ ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いてプラットフォームシェーカー上で６０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体は、表２に提供される。一次抗体を各々、最適濃度の５％脱脂乳中で希釈し、４℃で１６時間プラットフォームシェーカー上に置いた。一次抗体を回収し、ＴＢＳ－Ｔで３回、各々１０分間洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ）を、５％脱脂乳で１：１０，０００の比で希釈し、続いて、プラットフォームシェーカー上に室温で６０分間置き、ＴＢＳ－Ｔ溶液で１０分間、３回洗浄した。最後に、膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に添加し、膜を画像解析システムを使用して走査する前に色を適切に表現し、タンパク質の量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を使用して計算した。
【0080】
【表2】
【0081】
実施例６－６ 本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるアポトーシス調節関連タンパク質の発現の変化
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによりレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を処置することによって増加された切断カパーゼ－３の形成を抑制した。その結果、切断カスパーゼ－３によって切断されたＲＡＲＰの量が低減し、したがって、切断ＰＡＲＰの形成量が低減した（図６）。これらの結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって引き起こされるアポトーシスを抑制して、神経細胞死を低減させ、神経細胞の生存を増加させる。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによりレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を処置することによって増加された切断カパーゼ－３の形成を抑制した。その結果、切断カスパーゼ－３によって切断されたＲＡＲＰの量が低減し、したがって、切断ＰＡＲＰの形成量が低減した（図６）。これらの結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって引き起こされるアポトーシスを抑制して、神経細胞死を低減させ、神経細胞の生存を増加させる。
【0082】
実施例７．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるミトコンドリア膜電位の変化
実施例７－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を培養するための方法
実施例７－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例７－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を培養するための方法
実施例７－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0083】
実施例７－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0084】
実施例７－２．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
【0085】
実施例７－３．ミトコンドリア膜電位を測定するための方法
細胞培養培地を取り除いた後、細胞をＣＰＢＳで１回洗浄した。ＪＣ－１のＪＣ－１溶液－ミトコンドリア膜電位測定キット（Ａｂｃａｍ、米国）を、ＦＢＳを含まない培地と混合し、細胞を混合物で処置した。細胞を５％インキュベーター内に３７℃で１５分間放置した。培地を取り除き、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、清浄培地を添加した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、励起４７５ｎｍ／発光５３０ｎｍでＪＣ－１単量体の、および励起５３５ｎｍ／発光５９０ｎｍでＪＣ－１二量体の蛍光を測定した。
細胞培養培地を取り除いた後、細胞をＣＰＢＳで１回洗浄した。ＪＣ－１のＪＣ－１溶液－ミトコンドリア膜電位測定キット（Ａｂｃａｍ、米国）を、ＦＢＳを含まない培地と混合し、細胞を混合物で処置した。細胞を５％インキュベーター内に３７℃で１５分間放置した。培地を取り除き、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、清浄培地を添加した。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、励起４７５ｎｍ／発光５３０ｎｍでＪＣ－１単量体の、および励起５３５ｎｍ／発光５９０ｎｍでＪＣ－１二量体の蛍光を測定した。
【0086】
実施例７－４．レチノイン酸分化ＳＨ － ＳＹ５Ｙ細胞におけるミトコンドリア膜電位の変化
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の処置により低減したミトコンドリア膜電位を用量依存的に増加させた（図７）。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって形成された過剰なＲＯＳによって引き起こされるミトコンドリア損傷を低減させて、神経細胞生存率を増加させた。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の処置により低減したミトコンドリア膜電位を用量依存的に増加させた（図７）。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって形成された過剰なＲＯＳによって引き起こされるミトコンドリア損傷を低減させて、神経細胞生存率を増加させた。
【0087】
実施例８．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における神経細胞死の抑制による効果による生細胞解析
実施例８－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例８－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例８－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例８－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0088】
実施例８－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を分化させた。
【0089】
実施例８－２．本発明によるＡβの調製および処置
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
【0090】
実施例８－３．ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞解析（Ｓａｔｏｒｉｕｓ、米国）
細胞毒性赤色試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ ＃４６３２）を１：１，０００（ｖ／ｖ）の濃度で添加し、細胞を５％ ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞毒性を解析するために、顕微鏡の最終比をｘ２００に調整し、１．５時間ごとに写真を撮影した。ＩｎｃｕＣｙｔｅが提供するソフトウェアを使用して、画像を１．５ｆｐｓであるように生成し、細胞毒性の解析のために、画像において読み取られた赤色物体の総面積が比較された。実験を３回繰り返し、スチューデントのＴ検定を統計分析に使用した。すべての有意性試験が、Ｐ＜０．０５レベルで実施された。
細胞毒性赤色試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ ＃４６３２）を１：１，０００（ｖ／ｖ）の濃度で添加し、細胞を５％ ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞毒性を解析するために、顕微鏡の最終比をｘ２００に調整し、１．５時間ごとに写真を撮影した。ＩｎｃｕＣｙｔｅが提供するソフトウェアを使用して、画像を１．５ｆｐｓであるように生成し、細胞毒性の解析のために、画像において読み取られた赤色物体の総面積が比較された。実験を３回繰り返し、スチューデントのＴ検定を統計分析に使用した。すべての有意性試験が、Ｐ＜０．０５レベルで実施された。
【0091】
実施例８－４．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における神経細胞死の抑制効果による生細胞解析結果
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において増加された細胞毒性赤色試薬によって染色されるアポトーシス細胞を低減させた（図８）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって誘導される神経細胞死を抑制することによって、神経細胞生存率を増加させることができる。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において増加された細胞毒性赤色試薬によって染色されるアポトーシス細胞を低減させた（図８）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって誘導される神経細胞死を抑制することによって、神経細胞生存率を増加させることができる。
【0092】
実施例９．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣＲＥＢ発現変化
実施例９－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例９－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例９－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例９－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0093】
実施例９－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0094】
実施例９－２．Ａβおよび本発明の調製および処置方法
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
【0095】
実施例９－４．ウエスタンブロット解析法
タンパク質を抽出するために、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）で処置し、均質化し、遠心分離して（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を得た。５％スタッキングゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）および１２％分離ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために使用した。遠心分離により得られた上清および４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を３：１の比で混合し、９５℃で１０分間沸騰させて、タンパク質を変性させた。混合物を氷浴中で冷却し、回転させた。タンパク質サイズマーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）および各試料を、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩ Ｄｕａｌ－Ｓｌａｂ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に設けられたスタッキングゲルウェル内に注入し、すべてが底部に落ち着くまで１５０ボルトで電気泳動した。ポリビニリジン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜をメタノールで湿らせて活性化し、トランスファー緩衝液（１９０ｍＭグリシン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、０．０５％ＳＤＳ、２０％メタノール）で洗浄した。トランスファー緩衝液で湿らせたＷｈａｔｍａｎ ３Ｍ ＰａｐｅｒをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｏｌｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に積み重ね、２００ｍＡで６０分間電気を流して、膜を堆積させた。堆積後、膜を３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液（ＴＢＳ－Ｔ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いてプラットフォームシェーカー上で６０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体が、表３に提供される。一次抗体を各々、最適濃度の５％脱脂乳溶液中で各々に希釈し、４℃で１６時間プラットフォームシェーカーに置いた。一次抗体を回収し、ＴＢＳ－Ｔで３回、各々１０分間洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ）を、５％脱脂乳で１：１０，０００比で希釈し、続いて、プラットフォームシェーカーに室温で６０分間置き、ＴＢＳ－Ｔ溶液で１０分間、３回洗浄した。最後に、膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に加え、膜を画像解析システムを使用して走査する前に色を適切に表現し、タンパク質の量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を使用して計算した。
タンパク質を抽出するために、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）で処置し、均質化し、遠心分離して（１４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を得た。５％スタッキングゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）および１２％分離ゲル（ＤＷ、３０％アクリルアミド：ビサクリルアミド、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、ＴＥＭＥＤ、１０％過硫酸アンモニウム）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために使用した。遠心分離により得られた上清および４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を３：１の比で混合し、９５℃で１０分間沸騰させて、タンパク質を変性させた。混合物を氷浴中で冷却し、回転させた。タンパク質サイズマーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）および各試料を、Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩ Ｄｕａｌ－Ｓｌａｂ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に設けられたスタッキングゲルウェル内に注入し、すべてが底部に落ち着くまで１５０ボルトで電気泳動した。ポリビニリジン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜をメタノールで湿らせて活性化し、トランスファー緩衝液（１９０ｍＭグリシン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、０．０５％ＳＤＳ、２０％メタノール）で洗浄した。トランスファー緩衝液で湿らせたＷｈａｔｍａｎ ３Ｍ ＰａｐｅｒをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｏｌｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に積み重ね、２００ｍＡで６０分間電気を流して、膜を堆積させた。堆積後、膜を３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液（ＴＢＳ－Ｔ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いてプラットフォームシェーカー上で６０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体が、表３に提供される。一次抗体を各々、最適濃度の５％脱脂乳溶液中で各々に希釈し、４℃で１６時間プラットフォームシェーカーに置いた。一次抗体を回収し、ＴＢＳ－Ｔで３回、各々１０分間洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍ）を、５％脱脂乳で１：１０，０００比で希釈し、続いて、プラットフォームシェーカーに室温で６０分間置き、ＴＢＳ－Ｔ溶液で１０分間、３回洗浄した。最後に、膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に加え、膜を画像解析システムを使用して走査する前に色を適切に表現し、タンパク質の量を、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、米国）を使用して計算した。
【0096】
【表3】
【0097】
実施例９－５．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣＲＥＢ発現の変化
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において減少されたＣＲＥＢタンパク質のＳｅｒ１３３リン酸化を濃度依存的に増加させた（図９）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減されたＣＲＥＢタンパク質中のＳｅｒ１３３リン酸化を増加させて、ＣＲＥＢタンパク質活性、細胞転写因子の活性を回復させて、神経新生、シナプス新生、および血管新生に関連する因子の発現を誘導して認知機能を改善することが予想される。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において減少されたＣＲＥＢタンパク質のＳｅｒ１３３リン酸化を濃度依存的に増加させた（図９）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減されたＣＲＥＢタンパク質中のＳｅｒ１３３リン酸化を増加させて、ＣＲＥＢタンパク質活性、細胞転写因子の活性を回復させて、神経新生、シナプス新生、および血管新生に関連する因子の発現を誘導して認知機能を改善することが予想される。
【0098】
実施例１０．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における発現変化のＮＧＦおよびＢＤＮＦ
実施例１０－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１０－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例１０－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１０－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0099】
実施例１０－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫を分化させた。
【0100】
実施例１０－２．Ａβおよび本発明の調製および処置方法
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
【0101】
実施例１０－３．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を行っており、一次抗体および本実験に使用した条件を表４に提供する。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を行っており、一次抗体および本実験に使用した条件を表４に提供する。
【0102】
【表4】
【0103】
実施例１０－４．ＮＧＦ免疫細胞化学（ＩＣＣ）
ＳＨ－ＳＹ５ＹをＣｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ培養スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５４６３０）中でインキュベートし、４．８×１０４細胞／ウェルを７日間、Ａβ１－４２オリゴマー（７２時間）および本発明（２４時間）で処置し、ＮＧＦ免疫染色実験を行った。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で１０分間固定し、氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳ中での０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での細胞透過処理後、細胞を氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）を使用して、固定細胞を３０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体は、表４のウサギ抗ＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５２９１８）である。細胞を、４℃で１６時間、ウサギ抗ＮＧＦ抗体（Ｘ３００希釈）溶液中でインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｘ５００希釈）で、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、核染色のためのＤＡＰＩ染色溶液（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２２８５４９）と１分間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。細胞をベクターシールドマウント培地で処置し、超解像共焦点レーザ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、＃ＬＳＭ８００）を使用して蛍光画像を得た。
ＳＨ－ＳＹ５ＹをＣｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ培養スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５４６３０）中でインキュベートし、４．８×１０４細胞／ウェルを７日間、Ａβ１－４２オリゴマー（７２時間）および本発明（２４時間）で処置し、ＮＧＦ免疫染色実験を行った。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で１０分間固定し、氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳ中での０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での細胞透過処理後、細胞を氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）を使用して、固定細胞を３０分間ブロックした。現在の実験に使用される一次抗体は、表４のウサギ抗ＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５２９１８）である。細胞を、４℃で１６時間、ウサギ抗ＮＧＦ抗体（Ｘ３００希釈）溶液中でインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｘ５００希釈）で、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、核染色のためのＤＡＰＩ染色溶液（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２２８５４９）と１分間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。細胞をベクターシールドマウント培地で処置し、超解像共焦点レーザ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、＃ＬＳＭ８００）を使用して蛍光画像を得た。
【0104】
実施例１０－５．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における発現変化のＮＧＦおよびＢＤＮＦ
本発明によるニューロトロフィンの発現増加の効果を検討したところ、ウエスタンブロット解析では、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において減少したＮＧＦおよびＢＤＮＦの発現を濃度増加依存的に増加させたことを示し（図１０）、免疫細胞化学でも、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＮＧＦの発現を増加させたことを示した（図１１）。これらの結果に基づいて、本発明は、認知機能を改善するために神経細胞の生存および分化を刺激するために神経細胞の生存、発達および機能を誘導するために重要な役割を果たす、ＮＧＦおよびＢＤＮＦを含むニューロトロフィンの発現を増加させることが予想される。
本発明によるニューロトロフィンの発現増加の効果を検討したところ、ウエスタンブロット解析では、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において減少したＮＧＦおよびＢＤＮＦの発現を濃度増加依存的に増加させたことを示し（図１０）、免疫細胞化学でも、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置によってレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＮＧＦの発現を増加させたことを示した（図１１）。これらの結果に基づいて、本発明は、認知機能を改善するために神経細胞の生存および分化を刺激するために神経細胞の生存、発達および機能を誘導するために重要な役割を果たす、ＮＧＦおよびＢＤＮＦを含むニューロトロフィンの発現を増加させることが予想される。
【0105】
実施例１１．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＤＫＫ－１の発現への影響
実施例１１－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１１－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例１１－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１１－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0106】
実施例１１－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させた。
【0107】
実施例１１－２．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１１－２－１．細胞継代培養
ＤＭＥＭ／高グルコース培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン）、ＤＰＢＳ、および０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを、３７℃の恒温浴中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、既存の培地を廃棄し、ＤＰＢＳで１回洗浄した（Ｔ２５：５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）。ＤＰＢＳはすべて廃棄され、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍｌ、Ｔ７５：５ｍｌおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２下、３７℃で２分間インキュベーターに放置した。新しい完全培地（Ｔ２５：４ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍＬ）、細胞を５０ｍＬの円錐管中で混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。すべての上清を除去した後、新鮮なＤＭＥＭ／高グルコースを添加し、細胞をタッピングまたはピペッティングのいずれかによって再懸濁した。細胞および培地を細胞培養フラスコ（Ｔ７５～１５ｍｌおよびＴ１７５～４０ｍｌ）に添加し、５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。
実施例１１－２－１．細胞継代培養
ＤＭＥＭ／高グルコース培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン）、ＤＰＢＳ、および０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを、３７℃の恒温浴中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、既存の培地を廃棄し、ＤＰＢＳで１回洗浄した（Ｔ２５：５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）。ＤＰＢＳはすべて廃棄され、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍｌ、Ｔ７５：５ｍｌおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２下、３７℃で２分間インキュベーターに放置した。新しい完全培地（Ｔ２５：４ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍＬ）、細胞を５０ｍＬの円錐管中で混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。すべての上清を除去した後、新鮮なＤＭＥＭ／高グルコースを添加し、細胞をタッピングまたはピペッティングのいずれかによって再懸濁した。細胞および培地を細胞培養フラスコ（Ｔ７５～１５ｍｌおよびＴ１７５～４０ｍｌ）に添加し、５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。
【0108】
実施例１１－２－２．ＨＴ－２２細胞の神経細胞分化
ＤＭＥＭ／高グルコース培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン）、ＤＰＢＳ、および０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを、３７℃の恒温浴中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、既存の培地を廃棄し、ＤＰＢＳで１回洗浄した（Ｔ２５：５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）。ＤＰＢＳはすべて廃棄され、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍｌ、Ｔ７５：５ｍｌおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２下、３７℃で２分間インキュベーターに放置した。新しい完全培地（Ｔ２５：４ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍＬ）、細胞を５０ｍＬの円錐管中で混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。すべての上清を除去した後、１ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ／高グルコースを添加し、細胞をタッピングまたはピペッティングのいずれかによって再懸濁した。最適量のＤＭＥＭ／高グルコース培地をさらに添加し、２×１０５細胞／ｃｍ２をコラーゲンＩ型コーティング６ウェルプレートに添加した。２４時間後、培地を分化培地［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン］に交換した。２４時間後、培地を新しい分化培地に交換し、Ａβ１－４２オリゴマーおよび本発明で６時間処置した。
ＤＭＥＭ／高グルコース培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン）、ＤＰＢＳ、および０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを、３７℃の恒温浴中で３０分間予熱した。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、既存の培地を廃棄し、ＤＰＢＳで１回洗浄した（Ｔ２５：５ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍｌ）。ＤＰＢＳはすべて廃棄され、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔ２５：２ｍｌ、Ｔ７５：５ｍｌおよびＴ１７５：１０ｍＬ）を添加し、混合物を、５％ＣＯ２下、３７℃で２分間インキュベーターに放置した。新しい完全培地（Ｔ２５：４ｍｌ、Ｔ７５：１０ｍｌおよびＴ１７５：２０ｍＬ）、細胞を５０ｍＬの円錐管中で混合し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。すべての上清を除去した後、１ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ／高グルコースを添加し、細胞をタッピングまたはピペッティングのいずれかによって再懸濁した。最適量のＤＭＥＭ／高グルコース培地をさらに添加し、２×１０５細胞／ｃｍ２をコラーゲンＩ型コーティング６ウェルプレートに添加した。２４時間後、培地を分化培地［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン］に交換した。２４時間後、培地を新しい分化培地に交換し、Ａβ１－４２オリゴマーおよび本発明で６時間処置した。
【0109】
実施例１１－３．Ａβおよび本発明の調製および処置
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を行った。
【0110】
実施例１１－４：ｑＲＴ－ＰＣＲ法
Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）およびヒトＤＫＫおよびβ－アクチンＰＣＲの次のプライマーを使用して、鋳型として提供した：ヒトＤＫＫ１（フォワード５’－ＡＴＴＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣ－３’、リバース５’－ＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＣＣ－３’）、ヒトβ－アクチン（フォワード５’－ＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧ－３’）、マウスＤＫＫ１（フォワード５’－ＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣ－３’、リバース５’－ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣ－３’）、マウスβ－アクチン（フォワード５’－ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧ－３’、リバース５’－ＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３’）。ＰＣＲサイクルの条件は次のとおりである：変性、９５℃で４５秒；アニーリング、５６℃で４５秒；伸張、７２℃で４５秒；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。
Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）およびヒトＤＫＫおよびβ－アクチンＰＣＲの次のプライマーを使用して、鋳型として提供した：ヒトＤＫＫ１（フォワード５’－ＡＴＴＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣ－３’、リバース５’－ＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＣＣ－３’）、ヒトβ－アクチン（フォワード５’－ＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧ－３’）、マウスＤＫＫ１（フォワード５’－ＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣ－３’、リバース５’－ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣ－３’）、マウスβ－アクチン（フォワード５’－ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧ－３’、リバース５’－ＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３’）。ＰＣＲサイクルの条件は次のとおりである：変性、９５℃で４５秒；アニーリング、５６℃で４５秒；伸張、７２℃で４５秒；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。
【0111】
実施例１１－５．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および本実験に使用した条件を表５に提供している。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および本実験に使用した条件を表５に提供している。
【0112】
【表5】
【0113】
実施例１１－６．本発明によるレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＤＫＫ－１発現の変化
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーでの処置により増加したレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるｍＲＮＡ（図１２）およびタンパク質レベル（図１３）におけるＤＫＫ－１の発現を減少させた。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって増加したＤＫＫ－１発現の減少、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復（図１４～２０）、およびＡβ産生のポジティブフィードバックループの抑制によるＡＰＰ形成およびＡβ蓄積の低減（図２１、２２）が予想される。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーでの処置により増加したレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるｍＲＮＡ（図１２）およびタンパク質レベル（図１３）におけるＤＫＫ－１の発現を減少させた。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって増加したＤＫＫ－１発現の減少、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化によるシナプス可塑性の回復（図１４～２０）、およびＡβ産生のポジティブフィードバックループの抑制によるＡＰＰ形成およびＡβ蓄積の低減（図２１、２２）が予想される。
【0114】
実施例１２．本発明による分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ遺伝子発現の変化
実施例１２－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１２－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１２－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１２－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0115】
実施例１２－１－２．ＨＴ－２２細胞の神経細胞分化
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0116】
実施例１２－３．Ａβおよび本発明の調製および処置方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１０μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１０μＭ）溶液（最大濃度５μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１０μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１０μＭ）溶液（最大濃度５μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
【0117】
実施例１２－３：ｑＲＴ－ＰＣＲ法
Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して、１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）および以下のプライマーを使用して、Ｗｎｔおよびβ－アクチンＰＣＲのための鋳型として提供した：マウスＷｎｔ１（フォワード５’－ＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＣ－３’）、マウスＷｎｔ３ａ（フォワード５’－ＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣ－３’、リバース５’－ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣ－３’）、マウスＷｎｔ５ａ（フォワード５’－ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧ－３’、リバース５’－ＧＴＣＣＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＴＴＧ－３’）、マウスＷｎｔ７ａ（フォワード５’－ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣ－３’、リバース５’－ＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣ－３’）、マウスβ－アクチン（フォワード５’－ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧ－３’、リバース５’－ＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３’）。ＰＣＲサイクルの条件は、以下のとおりであった。変性（９５℃で４５秒）；アニーリング、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ（６０℃で４５秒）；Ｗｎｔ７ａ（５７℃で４５秒）；β－アクチン（５６℃で４５秒）；伸長（７２℃で４５秒）；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。
Ｅａｓｙ－Ｂｌｕｅ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して、１μｇのＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＡＲＡ）および以下のプライマーを使用して、Ｗｎｔおよびβ－アクチンＰＣＲのための鋳型として提供した：マウスＷｎｔ１（フォワード５’－ＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧ－３’、リバース５’－ＣＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＣ－３’）、マウスＷｎｔ３ａ（フォワード５’－ＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣ－３’、リバース５’－ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣ－３’）、マウスＷｎｔ５ａ（フォワード５’－ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧ－３’、リバース５’－ＧＴＣＣＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＴＴＧ－３’）、マウスＷｎｔ７ａ（フォワード５’－ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣ－３’、リバース５’－ＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣ－３’）、マウスβ－アクチン（フォワード５’－ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧ－３’、リバース５’－ＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３’）。ＰＣＲサイクルの条件は、以下のとおりであった。変性（９５℃で４５秒）；アニーリング、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ（６０℃で４５秒）；Ｗｎｔ７ａ（５７℃で４５秒）；β－アクチン（５６℃で４５秒）；伸長（７２℃で４５秒）；４０サイクル。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。
【0118】
実施例１２－４．本発明による分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ遺伝子発現変化
本発明は、対照群と比較して、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置時の分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ３ａ遺伝子発現を増加させた（図１４）。結果を考慮すると、本発明は、認知機能に重要なシナプス活性を増加させることが知られているＷｎｔ３ａ発現を増加させ、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化してシナプス可塑性を回復させることが予想される。
本発明は、対照群と比較して、Ａβ１－４２オリゴマーによる処置時の分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ３ａ遺伝子発現を増加させた（図１４）。結果を考慮すると、本発明は、認知機能に重要なシナプス活性を増加させることが知られているＷｎｔ３ａ発現を増加させ、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化してシナプス可塑性を回復させることが予想される。
【0119】
実施例１３．本発明によるアルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）におけるＷｎｔ発現変化
実施例１３－１アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
国際的に広く使用されているアルツハイマーのトランスジェニックマウスモデル５ＸＦＡＤ（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＳＪＬ）を使用した。このモデルの特徴は、アルツハイマー病の進行が、５つの異なる遺伝子変換（ＡＰＰ ＫＭ６７０／６７１ＮＬ（スウェーデン）、ＡＰＰ Ｉ７１６Ｖ（フロリダ）、ＡＰＰ Ｖ７１７Ｉ（ロンドン）、ＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｌ（Ａ＞Ｃ）、ＰＳＥＮ１ Ｌ２８６Ｖ）を介して、他のマウスモデルよりも有意に速いことである。換言すると、このモデルにおいて治療的に有効な任意の組成物が、進行が比較的遅い他のＡＰＰモデルにおいて有効であると予想される。認知機能に関わる皮質および海馬領域の脳組織を使用して、解析を行った。
実施例１３－１アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
国際的に広く使用されているアルツハイマーのトランスジェニックマウスモデル５ＸＦＡＤ（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＳＪＬ）を使用した。このモデルの特徴は、アルツハイマー病の進行が、５つの異なる遺伝子変換（ＡＰＰ ＫＭ６７０／６７１ＮＬ（スウェーデン）、ＡＰＰ Ｉ７１６Ｖ（フロリダ）、ＡＰＰ Ｖ７１７Ｉ（ロンドン）、ＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｌ（Ａ＞Ｃ）、ＰＳＥＮ１ Ｌ２８６Ｖ）を介して、他のマウスモデルよりも有意に速いことである。換言すると、このモデルにおいて治療的に有効な任意の組成物が、進行が比較的遅い他のＡＰＰモデルにおいて有効であると予想される。認知機能に関わる皮質および海馬領域の脳組織を使用して、解析を行った。
【0120】
実施例１３－２．本発明の用量
アルツハイマー病の病態が進行し、認知機能が悪化した活動的な年齢のマウス（６ヶ月、雄）に、腹腔内注射５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日により４週間毎日投与した。
アルツハイマー病の病態が進行し、認知機能が悪化した活動的な年齢のマウス（６ヶ月、雄）に、腹腔内注射５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日により４週間毎日投与した。
【0121】
実施例１３－３．組織の調製
本発明を、腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを用いて動物室で麻酔し、脳を切除してタンパク質発現量を測定し、海馬および大脳皮質を分離し、タンパク質発現の解析まで－８０℃の超低温冷凍庫内に保管した。
本発明を、腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを用いて動物室で麻酔し、脳を切除してタンパク質発現量を測定し、海馬および大脳皮質を分離し、タンパク質発現の解析まで－８０℃の超低温冷凍庫内に保管した。
【0122】
実施例１３－５．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および本実験に使用した条件を表６に示す。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および本実験に使用した条件を表６に示す。
【0123】
【表6】
【0124】
実施例１３－６．本発明によるアルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）におけるＷｎｔ１発現変化
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬における低減されたＷｎｔ１発現を増加させた（図１５）。結果を考慮すると、本発明は、神経細胞間のシナプス新生に重要な機能を提供してシナプス可塑性を回復させる、Ｗｎｔ１の発現を増加させることが予想される。
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬における低減されたＷｎｔ１発現を増加させた（図１５）。結果を考慮すると、本発明は、神経細胞間のシナプス新生に重要な機能を提供してシナプス可塑性を回復させる、Ｗｎｔ１の発現を増加させることが予想される。
【0125】
実施例１４．Ｗｎｔ／β－カテニンＴＦ活性化プロファイリングプレートアレイを用いた、本発明による分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン関連因子に関連する因子の活性化の確認
実施例１４－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１４－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１４－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１４－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0126】
実施例１４－１－２．ＨＴ－２２細胞の神経細胞分化
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0127】
実施例１４－２．本発明によるＡβの調製および処置方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１０μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液（最大濃度５μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中１０μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液（最大濃度５μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
【0128】
実施例１４－３．Ｗｎｔ／β－カテニンＴＦ活性化プロファイリングプレートアレイ法
細胞から核抽出物を抽出し、Ｗｎｔ／β－カテニンＴＦ活性化プロファイリングプレートアレイ（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ、＃ＦＡ－１００７）を、ベンダーが提供する手順に従って実行した。相対発光量を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して測定した。
細胞から核抽出物を抽出し、Ｗｎｔ／β－カテニンＴＦ活性化プロファイリングプレートアレイ（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ、＃ＦＡ－１００７）を、ベンダーが提供する手順に従って実行した。相対発光量を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して測定した。
【0129】
実施例１４－４．転写因子アレイによって測定されたＷｎｔ／β－カテニン関連転写関連因子の活性化
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーで３回以上処置された分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞において、ＶＡＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＲ５Ａ２、Ｍｉｔｆ、ＴＣＦ／ＬＥＦ、ＮＦＡＴ、ＣＥＢＰ、ＧＬＩ－１、ＧＢＸ２、およびＡＰ－１を含むＷｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性を増加させた（図１６）。その結果を考慮すると、本発明は、Ｗｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性を増加させて、Ｗｎｔシグナル伝達活性化を刺激してシナプス可塑性を回復させることが予想される。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーで３回以上処置された分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞において、ＶＡＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＲ５Ａ２、Ｍｉｔｆ、ＴＣＦ／ＬＥＦ、ＮＦＡＴ、ＣＥＢＰ、ＧＬＩ－１、ＧＢＸ２、およびＡＰ－１を含むＷｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性を増加させた（図１６）。その結果を考慮すると、本発明は、Ｗｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性を増加させて、Ｗｎｔシグナル伝達活性化を刺激してシナプス可塑性を回復させることが予想される。
【0130】
実施例１５．ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター遺伝子アッセイを使用した、本発明による分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン活性における変化の測定
実施例１５－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１５－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１５－１．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１５－１－１．細胞継代培養
実施例１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0131】
実施例１５－１－２．ＨＴ－２２細胞の神経細胞分化
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0132】
実施例１５－２－３．ＴＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミドＤＮＡのトランスフェクション
６ウェルプレートにおいて、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２３１１）およびＴＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ－β－ガラクトシダーゼ、ＴＯＰＦＬＡＳＨ）を、２×１０５細胞／ウェル内で分化させたＨＴ－２２細胞に添加し、細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。
６ウェルプレートにおいて、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２３１１）およびＴＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ－β－ガラクトシダーゼ、ＴＯＰＦＬＡＳＨ）を、２×１０５細胞／ウェル内で分化させたＨＴ－２２細胞に添加し、細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。
【0133】
実施例１５－２－３．Ａβおよび本発明の調製および処置のための方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中のヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）の１μＭ溶液を調製した。Ａβ１－４２の溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。２４時間トランスフェクションした後、既存の細胞培地を廃棄し、細胞を、本発明（最大濃度５μＭ）の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液で処理し、５％ＣＯ２下、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順により、さらなる実験を行った。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中のヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）の１μＭ溶液を調製した。Ａβ１－４２の溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。２４時間トランスフェクションした後、既存の細胞培地を廃棄し、細胞を、本発明（最大濃度５μＭ）の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液で処理し、５％ＣＯ２下、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順により、さらなる実験を行った。
【0134】
実施例１５－３．ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター遺伝子アッセイ法
ＨＴ－２２細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、細胞溶解物を溶解緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｉｅｒｃｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｎｉ－Ｔａｂｌｅｔ）を調製し（１００μｌ／ウェル）、タンパク質を定量化した。細胞溶解物の一部を使用して、β－ガラクトシダーゼアッセイを実行し、光吸収を４２０ｎｍで測定した。細胞溶解物の残りの部分を使用して、ルシフェラーゼアッセイを実行して、発光を測定した。得られた発光値を、β－ガラクトシダーゼ活性（４２０ｎｍにおける吸光度）を使用してタンパク質濃度で正規化して、相対ルシフェラーゼ活性値を得た。
ＨＴ－２２細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、細胞溶解物を溶解緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｉｅｒｃｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｎｉ－Ｔａｂｌｅｔ）を調製し（１００μｌ／ウェル）、タンパク質を定量化した。細胞溶解物の一部を使用して、β－ガラクトシダーゼアッセイを実行し、光吸収を４２０ｎｍで測定した。細胞溶解物の残りの部分を使用して、ルシフェラーゼアッセイを実行して、発光を測定した。得られた発光値を、β－ガラクトシダーゼ活性（４２０ｎｍにおける吸光度）を使用してタンパク質濃度で正規化して、相対ルシフェラーゼ活性値を得た。
【0135】
実施例１５－４．ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター遺伝子アッセイにより測定された分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞における本発明によるＷｎｔ／β－カテニン活性の結果
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処理により低減された、分化したＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン活性を濃度依存的に増加させた（図１７）。結果を考慮すると、本発明は、Ｗｎｔ発現（図１４および１５）およびＷｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性（図１６）を増加させて、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を促進してシナプス可塑性を回復することが予想される。
本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによる処理により低減された、分化したＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン活性を濃度依存的に増加させた（図１７）。結果を考慮すると、本発明は、Ｗｎｔ発現（図１４および１５）およびＷｎｔ／β－カテニン関連転写因子の活性（図１６）を増加させて、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を促進してシナプス可塑性を回復することが予想される。
【0136】
実施例１６．本発明による、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞におけるＧＳＫ３β発現の変化
実施例１６－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１６－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１６－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１６－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0137】
実施例１６－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させた。
【0138】
実施例１６－２．ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞株の細胞培養方法
実施例１６－２－１．細胞継代培養
１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１６－２－１．細胞継代培養
１１－２－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0139】
実施例１６－２－２．ＨＴ－２２細胞の神経細胞分化
１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
１１－２－２に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0140】
実施例１６－３．Ａβの調製および本発明による処置のための方法
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実行した。
実施例３－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実行した。
【0141】
実施例１６－４．ウエスタンブロット解析法
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表７に提供している。
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表７に提供している。
【0142】
【表7】
【0143】
実施例１６－５．ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３ｂ（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ
ＨＴ－２２細胞（１．５×１０５細胞／ウェル）を６ウェルプレート（ＳＰＬ、＃３０００６）でインキュベートした。培地をＢ－２７サプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｌ Ｐｌｕｓ Ｍｅｉｄａで変更し、２４時間後、細胞をＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）および本発明（１、２、５μＭ）で６時間処理した。細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９８０３）を各ウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。細胞を氷の上に５分間置き、細胞可溶化物を掻爬して１．５ｍＬに移動させ、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ装置を使用して超音波処理を使用して細胞可溶化物を均質化した。均質化された細胞可溶化物を遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を分析して、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質の量を定量化した。ＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｔｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７３１１Ｃ）に含まれるＧＳＫ－３βマウスｍＡｂコーティングマイクロウェルを、室温で３０分間安定化させ、ＥＬＩＳＡ試料希釈液で希釈した同量のタンパク質（３０μｇ／ウェル）を各マイクロウェルに添加し、混合物を４℃で１６時間反応させた。各マイクロウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）ウサギ検出ｍＡｂおよび抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－結合抗体（製剤化ＥＬＩＳＡ）を使用してＥＬＩＳＡ実験を実施した。ＴＭＢ基質溶液をＥＬＩＳＡ基質として使用して、４５０ｎｍでの吸収を測定し、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）の相対量を決定した。
ＨＴ－２２細胞（１．５×１０５細胞／ウェル）を６ウェルプレート（ＳＰＬ、＃３０００６）でインキュベートした。培地をＢ－２７サプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｌ Ｐｌｕｓ Ｍｅｉｄａで変更し、２４時間後、細胞をＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）および本発明（１、２、５μＭ）で６時間処理した。細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９８０３）を各ウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。細胞を氷の上に５分間置き、細胞可溶化物を掻爬して１．５ｍＬに移動させ、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ装置を使用して超音波処理を使用して細胞可溶化物を均質化した。均質化された細胞可溶化物を遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を分析して、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質の量を定量化した。ＰａｔｈＳｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｔｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７３１１Ｃ）に含まれるＧＳＫ－３βマウスｍＡｂコーティングマイクロウェルを、室温で３０分間安定化させ、ＥＬＩＳＡ試料希釈液で希釈した同量のタンパク質（３０μｇ／ウェル）を各マイクロウェルに添加し、混合物を４℃で１６時間反応させた。各マイクロウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）ウサギ検出ｍＡｂおよび抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－結合抗体（製剤化ＥＬＩＳＡ）を使用してＥＬＩＳＡ実験を実施した。ＴＭＢ基質溶液をＥＬＩＳＡ基質として使用して、４５０ｎｍでの吸収を測定し、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）の相対量を決定した。
【0144】
実施例１６－６．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞および分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞における本発明によるＧＳＫ３β発現変化
ＧＳＫ３βタンパク質のリン酸化に対する本発明の効果を検討すると、ウエスタンブロット解析に示すように、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させ（図１８）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３ｂ（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡは、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減された、分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞中のタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させたことを示す（図１９）。結果を考慮すると、本発明は、ＧＳＫ３を非活性化するタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させ、タウタンパク質のリン酸化を低減してタウ病態を低減することが予想される。
ＧＳＫ３βタンパク質のリン酸化に対する本発明の効果を検討すると、ウエスタンブロット解析に示すように、本発明は、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減された、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させ（図１８）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧＳＫ－３ｂ（Ｓｅｒ９）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡは、本発明が、Ａβ１－４２オリゴマーによって低減された、分化ＨＴ－２２マウス海馬神経細胞中のタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させたことを示す（図１９）。結果を考慮すると、本発明は、ＧＳＫ３を非活性化するタンパク質のＳｅｒ９リン酸化を増加させ、タウタンパク質のリン酸化を低減してタウ病態を低減することが予想される。
【0145】
実施例１７．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－Ｈａｐｐ－Ｃ１０５）における本発明によるタウ発現の変化
実施例１７－１．実験動物
実験のための動物は、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウス（１３ヶ月）であり、アルツハイマーによる認知症は、脳組織においてのみＡＰＰ Ｃターミナル１０５アミノ酸を発現する変異ＡＰＰ遺伝子を過剰発現することによって誘導された。動物を、温度２０±２℃、湿度５０％、０８：００～２０：００の点灯、２０：００～０８：００の消灯として制御した条件で収容した。群は、対照／処置群ではない［非ｔｇ対照、ＮＴＣ（ｎ＝６）、アルツハイマー病群［ｔｇ－対照ＴＣ（ｎ＝６）］、本発明で処置したアルツハイマー病群［ｔｇ－本発明、ＴＭ（ｎ＝６）］として特定され、食物および水は実験中、無制限に供給された。
実施例１７－１．実験動物
実験のための動物は、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウス（１３ヶ月）であり、アルツハイマーによる認知症は、脳組織においてのみＡＰＰ Ｃターミナル１０５アミノ酸を発現する変異ＡＰＰ遺伝子を過剰発現することによって誘導された。動物を、温度２０±２℃、湿度５０％、０８：００～２０：００の点灯、２０：００～０８：００の消灯として制御した条件で収容した。群は、対照／処置群ではない［非ｔｇ対照、ＮＴＣ（ｎ＝６）、アルツハイマー病群［ｔｇ－対照ＴＣ（ｎ＝６）］、本発明で処置したアルツハイマー病群［ｔｇ－本発明、ＴＭ（ｎ＝６）］として特定され、食物および水は実験中、無制限に供給された。
【0146】
実施例１７－２．本発明の投与方法
マウス記憶試験、水運動機能試験における迷路による行動試験、および受動回避試験を含むアルツハイマー病モデルに対する１回限りに基づく試験の後、本発明のヒトの１日用量を、Ｒｅａｇａｎ－Ｓｈａｗ等（２００８）に基づいて、１３ヶ月齢のアルツハイマー病モデルマウスに、腹腔内注射により１日１回４ｍｇ／ｋｇで４週間投与した。対照群（ＮＴＣ）およびアルツハイマー病群（ＴＣ）に、同量の生理食塩水を投与した。
マウス記憶試験、水運動機能試験における迷路による行動試験、および受動回避試験を含むアルツハイマー病モデルに対する１回限りに基づく試験の後、本発明のヒトの１日用量を、Ｒｅａｇａｎ－Ｓｈａｗ等（２００８）に基づいて、１３ヶ月齢のアルツハイマー病モデルマウスに、腹腔内注射により１日１回４ｍｇ／ｋｇで４週間投与した。対照群（ＮＴＣ）およびアルツハイマー病群（ＴＣ）に、同量の生理食塩水を投与した。
【0147】
実施例１７－３．組織調製
本発明を、腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを使用して動物室で麻酔し、脳を切除してタンパク質発現量を測定し、海馬および大脳皮質を分離し、タンパク質発現の解析まで－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。
本発明を、腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを使用して動物室で麻酔し、脳を切除してタンパク質発現量を測定し、海馬および大脳皮質を分離し、タンパク質発現の解析まで－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。
【0148】
実施例１７－４．ウエスタンブロット解析法
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表８に提供している。
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表８に提供している。
【0149】
【表8】
【0150】
実施例１７－５．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－Ｈａｐｐ－Ｃ１０５）における本発明によるタウ発現変化
本発明は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬において増加したタウタンパク質中のＳｅｒ１９９／２０２リン酸化を低減させた（図２０）。この結果を考慮すると、本発明は、タウタンパク質におけるＳｅｒ１９９／２０２のリン酸化を低減してタウタンパク質における凝集を抑制して、ＮＦＴの形成を低減し、かつタウ病態を低減することが予想される。
本発明は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）の海馬において増加したタウタンパク質中のＳｅｒ１９９／２０２リン酸化を低減させた（図２０）。この結果を考慮すると、本発明は、タウタンパク質におけるＳｅｒ１９９／２０２のリン酸化を低減してタウタンパク質における凝集を抑制して、ＮＦＴの形成を低減し、かつタウ病態を低減することが予想される。
【0151】
実施例１８．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＡＰＰ形成およびＡβ蓄積の変化
実施例１８－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１８－１－１．細胞継代培養
実施例５－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
実施例１８－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例１８－１－１．細胞継代培養
実施例５－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を実行した。
【0152】
実施例１８－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例５－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例５－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0153】
実施例１８－２．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
実施例１８－２－１．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
実施例５－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実施した。
実施例１８－２－１．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
実施例５－２に記載の方法を使用して、調製および処置を実施した。
【0154】
実施例１８－２－２．Ｈ２Ｏ２の調製および本発明による処置のための方法
１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％のＦＢＳ＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン）を、２４時間毎に分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に添加し、３回リフレッシュし、本発明を、様々な濃度（１０、２０、４０μＭ）で２４時間添加した。
１００μＭのＨ２Ｏ２を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％のＦＢＳ＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン）を、２４時間毎に分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に添加し、３回リフレッシュし、本発明を、様々な濃度（１０、２０、４０μＭ）で２４時間添加した。
【0155】
実施例１８－３．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表９に提供している。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表９に提供している。
【0156】
【表9】
【0157】
実施例１８－４．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＡＰＰ形成Ａβ蓄積の変化
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡβ１－４２オリゴマー（図２１）およびＨ２Ｏ２（図２２）による処置により増加した、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積を低減させた。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ産生のポジティブフィードバックループを抑制することにより、ＡＰＰ形成およびＡβ蓄積を低減させることが予想される。
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡβ１－４２オリゴマー（図２１）およびＨ２Ｏ２（図２２）による処置により増加した、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積を低減させた。結果を考慮すると、本発明は、Ａβ産生のポジティブフィードバックループを抑制することにより、ＡＰＰ形成およびＡβ蓄積を低減させることが予想される。
【0158】
実施例１９．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－Ｈａｐｐ－Ｃ１０５）における本発明によるＡβ発現の変化
実施例１９－１．実験動物
実施例１７－１に記載されている同種の動物モデルを使用した。
実施例１９－１．実験動物
実施例１７－１に記載されている同種の動物モデルを使用した。
【0159】
実施例１９－２．本発明の投与方法
本発明を、実施例１７－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
本発明を、実施例１７－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
【0160】
実施例１９－３．組織の調製
実施例１７－３に記載の方法を使用して、組織試料を調製し、保管した。
実施例１７－３に記載の方法を使用して、組織試料を調製し、保管した。
【0161】
実施例１９－４．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表１０に提供している。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表１０に提供している。
【0162】
【表10】
【0163】
実施例１９－５．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）におけるＡβ発現変化の結果
本発明は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における海馬におけるＡβの発現を効果的に低減させた（図２３）。この結果に基づき、本発明は、Ａβの形成および蓄積を効果的に抑制することが予想される。
本発明は、アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における海馬におけるＡβの発現を効果的に低減させた（図２３）。この結果に基づき、本発明は、Ａβの形成および蓄積を効果的に抑制することが予想される。
【0164】
実施例２０．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）における本発明によるＡβプラーク変化
実施例２０－１．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
実施例１３－１に記載の動物モデルを使用した。
実施例２０－１．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
実施例１３－１に記載の動物モデルを使用した。
【0165】
実施例２０－２．本発明の組成物の投与
実施例１３－２に記載の方法を使用して、本発明の組成物を投与した。
実施例１３－２に記載の方法を使用して、本発明の組成物を投与した。
【0166】
実施例２０－３．組織試料の調製および固定
本発明を腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを使用して動物室で麻酔した後、胸部を開いて左心室に５０ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を３分間投与し、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を０．１Ｍのリン酸緩衝液に１０分間溶解した固定溶液を灌流した。還流および固定後、脳を切除し、４℃で１２時間４％ＰＦＡ固定溶液に加えて固定した後、３０％スクロース溶液中で５日間組織を沈殿させ、
保管のために凍結マイクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して４０μｍの厚さに連続管状インターセプトによりスライスした。
本発明を腹腔内注射により４週間毎日投与し、動物をＣＯ２ガスを使用して動物室で麻酔した後、胸部を開いて左心室に５０ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を３分間投与し、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を０．１Ｍのリン酸緩衝液に１０分間溶解した固定溶液を灌流した。還流および固定後、脳を切除し、４℃で１２時間４％ＰＦＡ固定溶液に加えて固定した後、３０％スクロース溶液中で５日間組織を沈殿させ、
保管のために凍結マイクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して４０μｍの厚さに連続管状インターセプトによりスライスした。
【0167】
実施例２０－４．チオフラビンＳステインＧおよびＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用したＡβプラーク染色方法
マウス脳組織を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）溶液中に２４時間固定した後、３０％スクロースを使用して組織を脱水し、凍結切片を調製した。一次抗体および条件を、表１１に提供している。１％ＳＤＳを使用した抗原回収をトレイン組織の凍結切片上で実施した後、試料をグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体と４℃で１６時間反応させた。試料を、チオフラビンＳ染色のために５０％エタノール中の５００μＭのチオフラビンＳで７分間処置した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（ＩｇＧ）二次抗体を、ＧＦＡＰ抗体／チオフラビンＳ処置脳組織凍結切片と反応させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を核染色のために使用した。
マウス脳組織を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）溶液中に２４時間固定した後、３０％スクロースを使用して組織を脱水し、凍結切片を調製した。一次抗体および条件を、表１１に提供している。１％ＳＤＳを使用した抗原回収をトレイン組織の凍結切片上で実施した後、試料をグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体と４℃で１６時間反応させた。試料を、チオフラビンＳ染色のために５０％エタノール中の５００μＭのチオフラビンＳで７分間処置した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（ＩｇＧ）二次抗体を、ＧＦＡＰ抗体／チオフラビンＳ処置脳組織凍結切片と反応させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を核染色のために使用した。
【0168】
【表11】
【0169】
実施例２０－５．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）７２６０における本発明によるＡβプラークの変化
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬および大脳皮質中のＡβプラークの数を減少させ（図２４）、これは、チオフラビンＳによって染色されたＡβプラーク（緑色）の数と、ＧＦＡＰで染色されたアストロサイト（赤色）の共局在化スポット（黄色）とをカウントすることによって決定された。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ産生およびＡβ蓄積を抑制して、細胞外Ａβプラーク形成を低減することが予想される。
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬および大脳皮質中のＡβプラークの数を減少させ（図２４）、これは、チオフラビンＳによって染色されたＡβプラーク（緑色）の数と、ＧＦＡＰで染色されたアストロサイト（赤色）の共局在化スポット（黄色）とをカウントすることによって決定された。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβ産生およびＡβ蓄積を抑制して、細胞外Ａβプラーク形成を低減することが予想される。
【0170】
実施例２１．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＡＭＰＫ発現変化
実施例２１－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例２１－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例２１－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例２１－１－１．細胞継代培養
実施例３－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0171】
実施例２１－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例３－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0172】
実施例２１－２．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液（最大濃度１０μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液（最大濃度１０μＭ）で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
【0173】
実施例２１－３．ウエスタンブロット解析法
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体およびその条件を表１２に提供している。
実施例９－４に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体およびその条件を表１２に提供している。
【0174】
【表12】
【0175】
実施例２１－４．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＡＭＰＫ発現変化
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるＡＭＰＫ触媒サブユニットαのＴｈｒ１７２の濃度依存的に増加したリン酸化を、Ａβ１－４２オリゴマー処理によって低減した（図２５）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβによって低減されたＡＭＰＫ触媒サブユニットαにおけるＴｈｒ１７２のリン酸化を増加させて、ＡＭＰＫ活性を回復させて、オートファジーを活性化して、変性脳疾患に関連するミスフォールドプロテイン凝集体を除去し、かつ神経細胞変性を阻害することが予想される。
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるＡＭＰＫ触媒サブユニットαのＴｈｒ１７２の濃度依存的に増加したリン酸化を、Ａβ１－４２オリゴマー処理によって低減した（図２５）。この結果を考慮すると、本発明は、Ａβによって低減されたＡＭＰＫ触媒サブユニットαにおけるＴｈｒ１７２のリン酸化を増加させて、ＡＭＰＫ活性を回復させて、オートファジーを活性化して、変性脳疾患に関連するミスフォールドプロテイン凝集体を除去し、かつ神経細胞変性を阻害することが予想される。
【0176】
実施例２２．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＬＣ３ＢおよびＰ６２を含むオートファジーマーカーの発現における変化
実施例２２－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例２２－１－１．細胞継代培養
実施例２－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
実施例２２－１．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の細胞培養方法
実施例２２－１－１．細胞継代培養
実施例２－１－１に記載の方法を使用して、細胞継代培養を行った。
【0177】
実施例２２－１－２．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫分化
実施例２－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
実施例２－１－２に記載の方法を使用して、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞を分化させた。
【0178】
実施例２２－２．本発明によるＡβの調製および処置のための方法
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明（最大濃度４０μＭ）および３－ＭＡ（３－メチルアデニン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（５ｍＭ）、オートファジー／ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３－キナーゼ）阻害剤の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の１μＭのヒトＡβ１－４２（Ａｂｃａｍ）溶液を調製した。Ａβの溶液を３７℃で３時間放置して、Ａβオリゴマーを形成した。既存の培地を廃棄し、細胞を、本発明（最大濃度４０μＭ）および３－ＭＡ（３－メチルアデニン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（５ｍＭ）、オートファジー／ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３－キナーゼ）阻害剤の有無にかかわらず、新たに調製したＡβ１－４２オリゴマー（１μＭ）溶液で処置し、５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、回収した。以下の手順を使用して、さらなる実験を実行した。
【0179】
実施例２２－３．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表１３に提供している。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体および条件を表１３に提供している。
【0180】
【表13】
【0181】
実施例２２－４．レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞における本発明によるＬＣ３ＢおよびＰ６２を含むオートファジーマーカーの発現の変化
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるＡβ１－４２オリゴマーにより低減されたオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂの発現を増加させ、同時にオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－ＩからＬＣ３Ｂ－ＩＩへの変換）を誘導してＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比を増加させるだけでなく、Ａβ１－４２オリゴマーにより増加したオートファゴソームカーゴタンパク質であるユビキチン結合タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ、セクエストソーム１）の発現を低減させる。また、３－ＭＡ（オートファジー／ＰＩ３Ｋ阻害剤）を本発明とともに使用し、本発明により増加したオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比）を低減させ、本発明により低減したｐ６２の発現を増加させた。さらに、細胞が本発明および３－ＭＡとともに処理される場合、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積が増加した（図２６）。この結果を考慮すると、本発明は、オートファジーを活性化することにより、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積を抑制することが予想される。
本発明は、レチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるＡβ１－４２オリゴマーにより低減されたオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂの発現を増加させ、同時にオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－ＩからＬＣ３Ｂ－ＩＩへの変換）を誘導してＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比を増加させるだけでなく、Ａβ１－４２オリゴマーにより増加したオートファゴソームカーゴタンパク質であるユビキチン結合タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ、セクエストソーム１）の発現を低減させる。また、３－ＭＡ（オートファジー／ＰＩ３Ｋ阻害剤）を本発明とともに使用し、本発明により増加したオートファジーフラックス（ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／Ｉ比）を低減させ、本発明により低減したｐ６２の発現を増加させた。さらに、細胞が本発明および３－ＭＡとともに処理される場合、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積が増加した（図２６）。この結果を考慮すると、本発明は、オートファジーを活性化することにより、ＡＰＰ形成およびＡβ１－４２蓄積を抑制することが予想される。
【0182】
実施例２３．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）における本発明によるＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２を含むオートファジーマーカーの発現の変化
実施例２３－１．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
実施例１３－１に記載の動物モデルを使用した。
実施例２３－１．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）
実施例１３－１に記載の動物モデルを使用した。
【0183】
実施例２３－２．本発明の組成物の投与
組成物を、実施例１３－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
組成物を、実施例１３－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
【0184】
実施例２３－３．組織試料の調製
実施例１３－３に記載の方法を使用して、組織試料を調製し、保管した。
実施例１３－３に記載の方法を使用して、組織試料を調製し、保管した。
【0185】
実施例２３－４．ウエスタンブロット解析法
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体およびその条件を表１４に提供している。
実施例６－５に記載の方法を使用して、ウエスタンブロット解析を実行し、一次抗体およびその条件を表１４に提供している。
【0186】
【表14】
【0187】
実施例２３－５．アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）における本発明によるＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２を含むオートファジーマーカーの発現の変化
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬におけるＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２を含むオートファジーマーカーの発現を増加させ、大脳皮質におけるＡＴＧ５／１２の発現を増加させた（図２７）。結果を考慮すると、本発明は、オートファジーフラックス（ＬＣ３ＢＩＩ／Ｉ比）、オートファジーマーカーを増加させ、ｐ６２を低減させ（図２６）、ＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２の発現を増加させてオートファジーカスケードを活性化することが予想される。
本発明は、アルツハイマー病動物モデル（５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス）の海馬におけるＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２を含むオートファジーマーカーの発現を増加させ、大脳皮質におけるＡＴＧ５／１２の発現を増加させた（図２７）。結果を考慮すると、本発明は、オートファジーフラックス（ＬＣ３ＢＩＩ／Ｉ比）、オートファジーマーカーを増加させ、ｐ６２を低減させ（図２６）、ＡＴＧ７およびＡＴＧ５／１２の発現を増加させてオートファジーカスケードを活性化することが予想される。
【0188】
実施例２４．本発明についてのアルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における認知および行動学習能力の向上の効果
実施例２３－１．実験動物
実施例１７－１に記載の動物モデルを使用した。
実施例２３－１．実験動物
実施例１７－１に記載の動物モデルを使用した。
【0189】
実施例２３－２．本発明の投与方法
組成物を、実施例１７－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
組成物を、実施例１７－２に記載されている同じ方法を使用して投与した。
【0190】
実施例２３－３．認知能力と行動学習能力のための試験方法
実施例２３－３－１．モリス水迷路試験
本発明を、水迷路試験を使用して認知能力の変化を測定する前に、４ｍｇ／ｋｇで１日１回、腹腔内注射により４週間投与した。試験は、２２～２５℃の円形水槽（直径１ｍ×高さ４０ｃｍ）中の水で実施し、標的（標的：直径１２ｃｍ）は水面より約３ｃｍ低く設定された。標的を見えないようにするために乾燥乳力を水に添加し、ＳＭＡＲＴ ３．０ ｐｒｏｔｒａｍ（Ｐａｎｌａｂ）を水槽の上の天井に設置して、実験の前および４週間後に、試験動物の標的到達時間（標的に対する潜時）、遊泳距離（標的に対する距離）および遊泳のパターン（遊泳パターン）を監視した。試験対象は、開始点から開始し、標的で終了するために、最初の５日間、１日に２回訓練された。両方の時点で標的を発見しなかったマウスに、標的の位置を認識させた。各試験は５分ごとに実施し、標的を６日目に除去して１分間試験を実施して、開始点から開始し、その結果を実験データとして使用した。
実施例２３－３－１．モリス水迷路試験
本発明を、水迷路試験を使用して認知能力の変化を測定する前に、４ｍｇ／ｋｇで１日１回、腹腔内注射により４週間投与した。試験は、２２～２５℃の円形水槽（直径１ｍ×高さ４０ｃｍ）中の水で実施し、標的（標的：直径１２ｃｍ）は水面より約３ｃｍ低く設定された。標的を見えないようにするために乾燥乳力を水に添加し、ＳＭＡＲＴ ３．０ ｐｒｏｔｒａｍ（Ｐａｎｌａｂ）を水槽の上の天井に設置して、実験の前および４週間後に、試験動物の標的到達時間（標的に対する潜時）、遊泳距離（標的に対する距離）および遊泳のパターン（遊泳パターン）を監視した。試験対象は、開始点から開始し、標的で終了するために、最初の５日間、１日に２回訓練された。両方の時点で標的を発見しなかったマウスに、標的の位置を認識させた。各試験は５分ごとに実施し、標的を６日目に除去して１分間試験を実施して、開始点から開始し、その結果を実験データとして使用した。
【0191】
実施例２３－３－２．受動回避試験
本発明を、記憶を評価するために受動回避試験を実施する前に、１日１回、４ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によって４週間、投与した。受動回避試験は、白色の明るい部屋（１８×１８×２５ｃｍ）のフロントルームからなり、バックルームは黒色の暗い部屋（１８×１８×２５ｃｍ）であり、暗い部屋の床には丈夫な金属ステンレスがフロントおよびバックルームに設置され、フロントおよびバックルームの壁には、ギロチンタイプで開閉する直径４ｃｍの穴があった。各実験動物は、各ケージ内に１分間隔離され、試験動物が部屋間を自由に移動できるようにギロチンタイプのドアを開けられる間調整して、１０秒間でフロントルームに移動させた。試験動物の４つの足がすべてバックルームにあると、ドアをすばやく閉じ、試験動物がフロントルームからバックルームに移動する時間（初期潜伏時間）を記録し、２秒間通電した（０．５ｍＡ）。５秒後、被験試料動物を居住用ケージに移動させた。７２時間後、最大３００秒までフロントルームからバックルームに移動する時間である、暗闇に入るまでの潜時を測定するために、同じ試験を実施した。
本発明を、記憶を評価するために受動回避試験を実施する前に、１日１回、４ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によって４週間、投与した。受動回避試験は、白色の明るい部屋（１８×１８×２５ｃｍ）のフロントルームからなり、バックルームは黒色の暗い部屋（１８×１８×２５ｃｍ）であり、暗い部屋の床には丈夫な金属ステンレスがフロントおよびバックルームに設置され、フロントおよびバックルームの壁には、ギロチンタイプで開閉する直径４ｃｍの穴があった。各実験動物は、各ケージ内に１分間隔離され、試験動物が部屋間を自由に移動できるようにギロチンタイプのドアを開けられる間調整して、１０秒間でフロントルームに移動させた。試験動物の４つの足がすべてバックルームにあると、ドアをすばやく閉じ、試験動物がフロントルームからバックルームに移動する時間（初期潜伏時間）を記録し、２秒間通電した（０．５ｍＡ）。５秒後、被験試料動物を居住用ケージに移動させた。７２時間後、最大３００秒までフロントルームからバックルームに移動する時間である、暗闇に入るまでの潜時を測定するために、同じ試験を実施した。
【0192】
実施例２３－３－３．データ処理方法
収集したデータは、ＳＰＳＳ ２０．０統計プログラムを使用して統計誤差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）を計算するプロセスであり、種間および群間の変数の検証は、一方向分散解析（一方向ＡＮＯＶＡ）によって実施された。群間に有意差がある場合は、事後検証を、ボンフェローニ法を使用して実施した。そのため、仮定許容値はα＝０．０５として設定されている。
収集したデータは、ＳＰＳＳ ２０．０統計プログラムを使用して統計誤差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）を計算するプロセスであり、種間および群間の変数の検証は、一方向分散解析（一方向ＡＮＯＶＡ）によって実施された。群間に有意差がある場合は、事後検証を、ボンフェローニ法を使用して実施した。そのため、仮定許容値はα＝０．０５として設定されている。
【0193】
実施例２３－４．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における本発明による認知および行動学習スキルの向上
実施例２３－４－１．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における本発明による認知機能改善の結果：水迷路試験（モリス水迷路試験）
Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスについてモリス水迷路試験を実施して、４週間の処置後の本発明の認知機能に対する効果を測定した。第一に、目標に到達する時間を解析により、それが、ＮＴＣ群（Ｐ＝０．００１）よりもＴＣ群で統計的に増加し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に低減したことが示されている。第二に、目標到達までの遊泳距離を解析したところ、それは、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計学的に増加し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計学的に低減した。第三に、象限内の標的からの遊泳時間を解析により、それが、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に低減し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に増加したことが示されている。第四に、標的を通過した回数の解析により、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に減少し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．０３７）で統計的に増加したことが示されている（図２８）。
実施例２３－４－１．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における本発明による認知機能改善の結果：水迷路試験（モリス水迷路試験）
Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスについてモリス水迷路試験を実施して、４週間の処置後の本発明の認知機能に対する効果を測定した。第一に、目標に到達する時間を解析により、それが、ＮＴＣ群（Ｐ＝０．００１）よりもＴＣ群で統計的に増加し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に低減したことが示されている。第二に、目標到達までの遊泳距離を解析したところ、それは、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計学的に増加し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計学的に低減した。第三に、象限内の標的からの遊泳時間を解析により、それが、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に低減し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に増加したことが示されている。第四に、標的を通過した回数の解析により、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に減少し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．０３７）で統計的に増加したことが示されている（図２８）。
【0194】
実施例２３－４－２．アルツハイマー型認知症動物モデル（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）における本発明による活動学習および認知能力の改善の結果：受動回避試験
受動回避試験をＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスを用いて行い、本発明による４週間の処置が活動学習および認知能力に及ぼす影響を評価した（図６Ａおよび６Ｂ）。結果は、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に減少し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００４）で統計的に増加したことが示されている（図２９）。
受動回避試験をＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＮＳＥ－ｈＡＰＰ－Ｃ１０５）Ｋｏｒトランスジェニックマウスを用いて行い、本発明による４週間の処置が活動学習および認知能力に及ぼす影響を評価した（図６Ａおよび６Ｂ）。結果は、ＮＴＣ群よりもＴＣ群（Ｐ＝０．００１）で統計的に減少し、ＴＣ群よりもＴＭ群（Ｐ＝０．００４）で統計的に増加したことが示されている（図２９）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】