(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-15
(54)【発明の名称】腎臓を再調整するための方法および装置
(51)【国際特許分類】
A01N 1/02 20060101AFI20220608BHJP
【ＦＩ】
A01N1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560343
(86)(22)【出願日】2020-04-12
(85)【翻訳文提出日】2021-09-28
(86)【国際出願番号】 SE2020050380
(87)【国際公開番号】W WO2020209787
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】1930123-3
(32)【優先日】2019-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521440666
【氏名又は名称】ユージーエルケー サイエンス エービー
【氏名又は名称原語表記】ＵＧＬＫ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ｉｇｅｌｏｓａ ３７３ Ｓ－２２５ ９４ Ｌｕｎｄ （ＳＥ）
(74)【代理人】
【識別番号】100105131
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 満
(74)【代理人】
【識別番号】100105795
【弁理士】
【氏名又は名称】名塚 聡
(72)【発明者】
【氏名】オラウソン，ミカエル
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011AF01
4H011CA01
4H011CB05
4H011CD06
(57)【要約】
例えば、心停止死体から採取された腎臓を回復するための方法および装置ならびに流体であって、腎臓が４時間以上温虚血に曝されている、方法および装置ならびに流体。採取後のバックテーブルで、腎臓にｌｙｓ－プラスミノーゲンを注射し、１５分後にｔ－ＰＡを注射する。アルブミンおよび電解質を含む高張性循環液を加え、前記ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔ－ＰＡと一緒に腎臓を通して循環させ、それによって循環圧を３０～７５分間、例えば５分当たり５ｍｍＨｇのステップで２０ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇに増加させる。次いで、腎臓を従来の基準によって評価する。
【選択図】 図３
【選択図】 図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ドナー、例えば心停止ドナー（ＤＣＤ）から採取した腎臓の回復方法であって、前記ドナーが循環停止してから少なくとも２時間後に前記ドナーから前記腎臓を回収するステップと、
採取後に前記腎臓にｌｙｓ－プラスミノーゲンを提供するステップであって、前記ｌｙｓ－プラスミノーゲンが第１の高張性溶液中に含まれる前記ステップと、
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）をｌｙｓ－プラスミノーゲンの提供と同時に又はその後に提供するステップであって、前記組織プラスミノーゲン活性化因子は第２の高張性溶液中に含まれる前記ステップと、
第１の回復段階で、５～２５℃の低温で、アルブミンと電解質を含む第３の高張性流体を前記腎臓に循環させるステップと、
第２の回復段階で、３０℃～３７℃の間の温度で、赤血球（ＲＢＣ）を含む第４の高張性流体を前記腎臓に循環させるステップと、
従来の基準によって、前記腎臓を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
前記第１の回復段階が、前記第３の高張性流体を前記腎臓を通して循環させるステップを含み、前記第３の高張性流体は５０ｇ／Ｌと１２０ｇ／Ｌとの間の濃度のアルブミンを含み、それによって、循環圧力が、例えば、約２０ｍｍＨｇから９０ｍｍＨｇまで、３０分から７５分間、例えば、５分当たり５ｍｍＨｇのステップで増加されることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２の回復段階が、前記第２の高張性流体を前記腎臓を通して循環させるステップを含み、前記第４の高張性流体は５０ｇ／Ｌと１２０ｇ／Ｌとの間の濃度のアルブミンを含み、それによって、循環圧力が、例えば、約２０ｍｍＨｇから９０ｍｍＨｇまで、３０分から７５分間、例えば、５分当たり５ｍｍＨｇのステップで増加されるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記腎臓を４℃～１６℃の低温で、保存液を３０ｍｍＨｇ未満の圧力で１時間～７時間の間前記腎臓を通して循環させながら保存するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記保存するステップは、前記第２の回復段階の後に、または各前記回復段階の間に実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１および第２の高張性流体の少なくとも一方が、生理学的濃度の電解質およびアルブミンを含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記第１および第２の高張性流体が、５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第１、第２、第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つが、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害薬と、アルガトロバンのような直接的トロンビン阻害薬と、プロテインＣと、プロテインＳと、アブシキシマブなどの血小板阻害薬のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つが、白血球フィルタを通って循環される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つが、サイトカインの吸着のために、サイトソーベンツなどのサイトカイン吸着器と接触される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つが、エンドトキシンの吸着のために、ＬＰＳ吸着器などのエンドトキシン吸着器と接触される、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記ドナーが少なくとも３時間循環停止した後、前記ドナーから前記腎臓を回収するステップを含み、前記少なくとも３時間には、前記ドナーの腹部に導入された冷たい生理食塩水、氷、またはアイススラッシュによる２時間以下の局所冷却が含まれる、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
ドナー、例えば心停止ドナー（ＤＣＤ）から採取した腎臓の回収方法であって、前記ドナーが循環停止してから少なくとも４時間後に、前記ドナーから前記腎臓を回収するステップと、
採取後に前記腎臓にＬｙｓ－プラスミノーゲンを提供するステップであって、前記ｌｙｓ－プラスミノーゲンが、５０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌの間の濃度のアルブミンと、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤とを含む第１の高張性溶液中に含まれる前記ステップと、
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を前記腎臓に、ｌｙｓ－プラスミノーゲンの提供と同時又はその後に提供するステップであって、前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、５０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌの間の濃度のアルブミンと、アンチトロンビンＩＩＩのような凝固阻害剤とを含む第２の高張性溶液中に含まれる前記ステップと、
第１の回復段階において、５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンと、電解質と、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤とを含む第３の高張性流体を、圧力を２０ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇ～９０ｍｍＨｇに上昇させながら、５℃～２５℃の低温で、前記腎臓を通して循環させるステップと、
第２の回復段階において、赤血球（ＲＢＣ）と、５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンと、電解質と、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤とを含む第４の高張性流体を、３０℃～３７℃の温度で、前記腎臓を通して循環させるステップと、
従来の基準によって前記腎臓を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項14】
ドナーから、例えば循環停止ドナー（ＤＣＤ）から採取された腎臓を回復するための装置であって、処置される腎臓を収容するための容器（３１）と、
静脈を開いた前記腎臓の動脈に接続するためのコネクタ（３２）と、
前記腎臓を通して前記容器内に存在する流体を循環させるために、前記容器と前記コネクタ（３２）との間に接続された循環ポンプ（４３）と、
ドレン弁（４２）を介して前記容器に接続されたドレン（４１）と、
前記容器に流体を供給するための流体弁（５５、５６、５７、５８、５９）を介して前記容器（３１）に接続された少なくとも１つのバッグ（５０、５１、５２、５３、５４）と、
前記ポンプ（４３）によって汲み上げられた流体を酸素化するための酸素供給器（４７）と、
前記ポンプによって汲み上げられた前記流体の温度を制御するためのヒータ／クーラ（４８）と、
前記ポンプによって汲み上げられた前記流体中の白血球を除去するための白血球フィルタ（４９）と、
前記容器の前記流体中のエンドトキシンを除去するように配置されたエンドトキシン吸着器（９５）と、
前記容器の前記流体中のサイトカインを除去するように配置されたサイトカイン吸着器（９６）と、
前記容器の前記流体中の白血球を除去するように配置された白血球フィルタ（９８）
を含む、装置。
【請求項15】
ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ｔＰＡ、電解質、および５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンを含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法を実施するための流体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腎臓の採取ならびに腎臓の保存および評価に関する。
【背景技術】
【0002】
移植に利用可能な腎臓の現在のプールは主に、脳死状態で、依然として機械的呼吸にさらされており、心臓がまだ拍動している患者由来の腎臓に限定されている。さらに、生きているドナーからの腎臓が使われる。
【0003】
病院への搬送前または搬送中に心停止により死亡した患者の腎臓は、通常、移植に用いられない。少数の症例では、特に心停止から腎臓採取までの時間が３０～６０分未満など短い場合にはこのような腎臓が使用されている。心停止から採取までの時間が１時間を超えると、腎臓は通常移植に適さない。このような腎臓の第２のプールを用いることができれば、移植に利用できる腎臓の数を１０倍から１００倍に増やすことができるであろう。
【0004】
心停止後、腎臓は温虚血に曝され、その結果、代謝性の毒性最終産物が腎臓に蓄積する。これは、酸素を含む血液による循環の失敗によるものであり、代謝性最終産物の蓄積をもたらす。
【0005】
心停止後早期には、凝固系が活性化され、微小循環にフィブリン血栓が形成され、その結果、例えば患者を蘇生させて生かせる場合には、消失に数時間または数日を要する血栓性イベントが生じる。
【0006】
死が起こると、腸内の微生物バリア機能がうまくいかず、LPSやサイトカイン放出のようなエンドトキシンによる細菌の異常増殖が場合によっては５分以内に起こり始める。したがって、循環停止により死亡したドナーからの腎臓の使用は限界があると考えられ、ほとんどの場合、循環停止がコントロールされている状況で使用される。温虚血が２時間を超える腎臓は、一般的に移植には不適当と考えられている。
【0007】
腎臓が冷却されると、代謝過程は摂氏１度当たり約６％減少する。２８℃では、代謝過程は約５０％に低下し、２２℃では約２５％に低下した。
【0008】
死体は、通常、１時間で最大２℃冷たくなる。したがって、５時間後、身体および腎臓は、約２７℃の温度を有し得る。
【0009】
したがって、当技術分野では、採取後に腎臓を再調整（recondition）する方法が必要とされており、その場合、腎臓の第２のプールをより広範囲に使用することができる。
【0010】
特許公開ＥＰ０６３１７８６Ａ１（要約）は虚血および付随する再潅流傷害の治療を開示し、これは、ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよび類似の物質を含む、プラスミンおよびプラスミン形成タンパク質の投与を伴う。ｌｙｓ－プラスミノーゲンはｇｌｕ－プラスミノーゲンのタンパク質分解切断から得ることができ、虚血状態によって損傷された組織に対して保護効果を有することが見出されている。ｌｙｓ－プラスミノーゲンの投与は再潅流時および再潅流がすでに起こった後に、対象を治療するために使用することができる。ｌｙｓ－プラスミノーゲンはまた、組織プラスミノーゲンアクチベーターなどを使用するものなどの血餅溶解療法と組み合わせて投与され得る。外科的処置に起因する虚血状態およびその後の再潅流傷害は、ｌｙｓ－プラスミノーゲンまたはｌｙｓ－プラスミノーゲンの前駆細胞の効果を有するタンパク質で予防または処置することができることが挙げられる。このようなタンパク質はドナーおよびレシピエントの周囲の臓器および組織と同様に、すでに移植されたドナーの臓器または組織にも有益な影響を及ぼし得る。ｌｙｓ‐プラスミノーゲンまたはｌｙｓ‐プラスミノーゲンの前駆体の効果を有するタンパク質の投与は、長期間の虚血、並びに移植後の再潅流によって引き起こされる生理的ストレスに、臓器および組織が耐えることを可能にする。臓器および組織の損傷は外科的処置が開始される前に、ｌｙｓ－プラスミノーゲンまたはｌｙｓ－プラスミノーゲンの前駆細胞の効果を有するタンパク質を投与することにより、減少または完全に防止することができる。移植の場合、タンパク質は、臓器または組織の除去の前にドナーに投与され得る。ドナーはその臓器または組織の除去の前に、その臓器または組織を供給する動脈中に全身的にまたは局所的に処置され得る。同様に、臓器または組織のレシピエントは移植領域を取り囲む臓器および組織、ならびにレシピエント内に配置される臓器または組織を保護するために、移植前に処置され得る。ｌｙｓ－プラスミノーゲンまたはｌｙｓ－プラスミノーゲンの前駆細胞の効果を有するタンパク質はまた、再潅流中または再潅流後に投与することができる。したがって、この特許公報はまだ循環しているドナーまたはレシピエントの身体へのｌｙｓ－プラスミノーゲンの添加を示唆しており、さもなければ効果はないであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
したがって、本発明の目的は、上述の欠点および不利益のうちの１つまたは複数を単独で、または任意の組合せで軽減、緩和、または排除することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
一態様では、ドナーから、例えば心停止ドナー（ＤＣＤ）から採取された臓器を回復する方法であって、ドナーが循環停止した少なくとも２時間後にドナーから腎臓を回収するステップと、採取後に腎臓にｌｙｓ－プラスミノーゲンを提供するステップであって、ｌｙｓ－プラスミノーゲンが第１の高張性溶液（又は、高膨張性溶液／高腫脹性溶液／hyperoncotic solution）中に含まれるステップと、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）をｌｙｓ－プラスミノーゲンの提供と同時にまたは提供した後に提供するステップであって、組織プラスミノーゲン活性化因子が第２の高張性溶液中に含まれるステップと、第１の回復段階で、５℃～２５℃の間の低温でアルブミンおよび電解質を含む第３の高張性流体を腎臓中に循環させるステップと、第２の回復段階で、３０℃～３７℃の間の温度で赤血球（ＲＢＣ）を含む第４の高張性流体を腎臓中に循環させるステップと、従来の基準によって臓器を評価するステップとを含む方法が提供される。
【0013】
一実施形態では、第１の回復段階が、腎臓中に前記第３の高張性流体を循環させるステップを含むことができ、前記第３の高張流体は５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの間の濃度のアルブミンを含み、それによって、循環圧力は例えば、約２０ｍｍＨｇから９０ｍｍＨｇまで、３０～７５分間、例えば、５分当たり５ｍｍＨｇのステップで増加される。第２の回復段階は、腎臓中に前記第４の高張性流体を循環させるステップを含むことができ、前記第４の高張性流体は５０ｇ／Ｌと１２０ｇ／Ｌとの間の濃度のアルブミンを含み、それによって、循環圧力は例えば、約２０ｍｍＨｇから９０ｍｍＨｇまで、３０分から７５分間、例えば、５分当たり５ｍｍＨｇのステップで増加される。
【0014】
別の実施形態では、本方法が１時間～７時間の間、３０ｍｍＨｇ未満の圧力で腎臓中に保存液を循環させながら、４℃～１６℃の間の低温で腎臓を保存することをさらに含んでもよい。保存ステップは第２の復元ステップの後に、または復元ステップの間に実行されてもよい。
【0015】
さらに別の実施形態では、第１および第２の高張性流体の少なくとも一方が生理学的濃度の電解質およびアルブミンを含み、第１および第２の高張性流体は５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンを含む。
【0016】
さらに他の実施形態では、第１、第２、第３、および第４の高張性流体のうちの前記少なくとも１つは、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤、アルガトロバンなどの直接トロンビン阻害剤、プロテインＣ、プロテインＳ、およびアブシキシマブなどの血小板阻害剤のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。
【0017】
さらに他の実施形態では、第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つは白血球フィルタを通って循環される。さらに、サイトカインの吸着のために、第３および第４の高張性流体の少なくとも一方にサイトソーベンツ（Cytosorbent）などのサイトカイン吸着体を接触させてもよい。さらに、第３および第４の高張性流体のうちの少なくとも１つに、エンドトキシンの吸着のために、ＬＰＳ吸着器などのエンドトキシン吸着器を接触させる。
【0018】
さらに他の実施形態において、本方法は、ドナーが少なくとも３時間循環停止した後にドナーから腎臓を回収するステップをさらに含むことができ、前記少なくとも３時間はドナーの腹部に設置された冷たい生理食塩水、氷、または氷泥（ｉｃｅｓｌｕｓｈ、アイススラッシュ）による２時間以下の局所冷却を含む。
【0019】
さらに別の実施形態では、ドナーから、例えば心停止ドナー（ＤＣＤ）から採取された腎臓を回復する方法であって、ドナーが循環停止した少なくとも４時間後に、該ドナーから該腎臓を回収するステップと、採取後に腎臓にｌｙｓ－プラスミノーゲンを提供するステップであって、前記ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、５０ｇ／Ｌから７０ｇ／Ｌの間の濃度のアルブミンと、アンチトロンビンＩＩＩのような凝固阻害剤とを含む第１の高張性溶液中に含まれるステップと、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）をｌｙｓ－プラスミノーゲンの提供と同時に又はその後に該腎臓に提供するステップであって、該組織プラスミノーゲン活性化因子が、５０ｇ／Ｌから７０ｇ／Ｌの間の濃度のアルブミンと、アンチトロンビンＩＩＩのような凝固阻害剤とを含む第２の高張性溶液中に含まれるステップと、第１の回復段階で、圧力が２０ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇ～９０ｍｍＨｇに上昇する間に、５～２５℃の低温で、５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンと、電解質と、アンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤とを含む第３の高張性液体を、該腎臓中に循環させるステップ、第２の回復段階で、３０～３７℃の温度で、赤血球（ＲＢＣ）、５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミン、および電解質およびアンチトロンビンＩＩＩなどの凝固阻害剤を含む第４の高張性液体を、該腎臓中に循環させるステップと、該腎臓を通常の基準で評価するステップと、を含む方法が提案される。
【0020】
別の態様では、ドナーから、例えば、循環停止ドナー（ＤＣＤ）から採取された腎臓を回復するための装置が提供され、装置は、治療される腎臓を収容するための容器、静脈が開いている腎臓の動脈に接続するためのコネクタ、前記腎臓中で前記容器内に存在する流体を循環させるために前記容器と前記コネクタとの間に接続された循環ポンプ、ドレン弁を介して前記容器に接続されたドレン、前記容器に流体を供給するために流体弁を介して前記容器に接続された少なくとも１つのバッグ、前記ポンプによってポンプ送りされた流体を酸素化するための酸素供給器と、前記ポンプによってポンプ送りされた流体の温度を制御するための加熱器（又は、ヒータ）／冷却器（又は、クーラ）、前記ポンプによってポンプ送りされた流体中の白血球を除去するための白血球フィルタ、前記容器の流体中のエンドトキシンを除去するように配置されたエンドトキシン吸着器、前記容器の流体中のサイトカインを除去するように配置されたサイトカイン吸着器、及び、前記容器の流体中の白血球を除去するように配置された白血球フィルタを含む。
【0021】
さらなる態様では、ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ｔＰＡ、電解質、および５０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミンを含む、請求項１～１１に記載の方法のいずれか１つを実施するための流体が提供される。
【0022】
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、図面を参照しての本発明の実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明のいくつかの実施形態を説明する。これらの実施形態は当業者が本発明を実施できるようにし、最良の形態を開示するために、例示の目的で記載される。しかしながら、そのような実施形態は、本発明の範囲を限定するものではない。さらに、特徴の特定の組み合わせが示され、検討される。しかしながら、異なる特徴の他の組み合わせも本発明の範囲内で可能である。
【0025】
心臓が拍動を停止すると、血液循環は停止する。これは、血液循環を維持しようとする体からのカスケードイベント（又は、一連の事象／cascade of events／cascade events）をもたらす可能性があり、脳ヘルニア後の脳死の場合は自律神経性カテコールアミンストーム（又は、catecholamine storm）と呼ばれ、心血管の安定性を維持しようと体内で大量のアドレナリンとノルアドレナリンが放出される。最終的な結果は脳死と心停止である。脳ヘルニア形成前に心停止が起こると、カテコールアミンストームを伴わずに、凝固系や炎症系に影響を及ぼす他のカスケードイベントが続発する。心停止および循環停止による死亡後のイベントについてはあまり知られていない。
【0026】
心停止および死後、１５～２５分以内に、蒼白（pallor mortis）と呼ばれるプロセスが起こり、皮膚は青白くなる。蒼白は、全身の毛細血管循環の停止に起因する。
【0027】
次いで、死冷（algor mortis）と呼ばれるプロセスが起こり、このとき、体は、周囲温度に一致するまで、その温度を変化させる。周囲温度に応じて、約４時間後、体温は約２７℃～２９℃又はそれ以下であり、約９時間後、体温は約２８℃である。
【0028】
その後、死後の硬直である死後硬直（rigor mortis）と呼ばれるプロセスが起こり、筋肉が硬くなる。死後、呼吸は停止し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生産に使われる酸素源が枯渇する。ＡＴＰは筋肉の弛緩時にアクチン－ミオシン架橋の分離を引き起こすのに必要である。身体は、これらの架橋を破壊することができないので、死後硬直に入る。死後硬直では、ミオシン頭部はアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を介してアクチンタンパク質の活性部位と結合し続け、筋肉はさらに酵素活性が複合体を分解するまで弛緩できない。
【0029】
死後硬直は心停止の約１～４時間後に始まり、約１２時間後にピークに達する。体のすべての筋肉と腎臓を含むすべての臓器に影響を及ぼす。
【0030】
心停止患者を病院から離れた場所で調達する場合、心停止の持続時間や腎臓への影響を評価することは難しい。したがって、遠隔の心停止体は、通常、移植目的には使用されない。本発明はそのような腎臓を回復し、移植前にそのような腎臓を修復し、評価し、保存することを目的とする。
【0031】
腎臓の採取が早ければ早いほど、腎臓の転帰は良好である。
【0032】
しかしながら、本発明の実施形態による回復プロセスは、死亡および循環停止後のより長い時間での良好でない転帰を伴う、死後硬直のピークの前およびピークまでの腎臓を再調整することができる。
【0033】
上記の作用はすべて心停止体内の腎臓に干渉する。
【0034】
心停止は血液の凝固系を活性化し、最終的に毛細血管系に微小血栓（microthrombi）を生成する可能性がある凝固促進状態（procoagulatory state）をもたらす可能性がある。凝固プロセスの活性化および非活性化の両方において、体温の低下が凝固手順にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。
【0035】
生体の循環器系が働いているとき、血液が凝固するかどうかは、凝固促進物質と呼ばれる凝固を促進する物質と、抗凝固物質と呼ばれる凝固を阻害する物質の２つのグループのバランスに依存している。正常な血流では抗凝固剤が優勢であり、その結果、血液は、血管中を循環している間に凝固しない。
【0036】
心停止後に血液が循環を停止すると、凝固系に何が経時的に起こるのかはほとんどわかっていない。いかなる理論にも拘束されないが、循環停止がある場合には、循環停止の原因にも依存して、抗凝固剤はダウンレギュレートされ、凝血原は活性化されると考えられている。このプロセスは、遅い可能性があり、時間の経過に伴う温度の低下にも依存する。
【0037】
血液が化学的に清浄なガラス試験管に収集される場合、血液は通常、６～１０分で凝固し、これは、凝固障害を決定するためにしばしば使用されることが公知である。しかし、ガラス管をシリコーン処理した容器に代替すると、血小板（thrombocytes）が活性化されないため、血液が１時間以上凝固しないことがある。したがって、採取（又は、摘出／harvesting）された腎臓に捕捉された血液は、通常、１時間、またはそれ以上まで凝固しないと考えられる。２～４時間後に、広範な凝固が起こる。
【0038】
心臓からの圧力が止まると、血管の一部、特に毛細血管が狭くなり、これが蒼白を引き起こし得る。さらにしばらくすると、血液中のアルブミンおよび他の腫腸性物質の存在は周囲組織から血管内への水の限外濾過を引き起こし、血管、特に細動脈および細静脈ならびにより大きな血管の拡張を引き起こす。時間が経つにつれて、赤血球は分離され、沈降反応において血管の最下部に沈降する。白血球および血小板を含むバフィーコート（buffy coat）が、赤血球の上に形成される。バフィーコートは、血小板および他のタンパク質の増加した濃度を有する。血管が拡張すると、血小板と相互作用する血管の一部が露出することがあり、約２～４時間後に血小板を活性化する。さらに、血液の循環がないため、血小板は特に血管に傷がある場合、血管の表面で内皮細胞（endothelial cells）とも相互作用し、内皮細胞に付着する可能性がある。このような相互作用は、内皮細胞をさらに損傷し得、そしてまた、最終的に血餅（又は、クロット／血栓／血塊／凝塊／clots）の形成をもたらし得る。このような血餅は、循環を有さない血管の任意の部分において形成され得る。また、温度の低下は、凝固系に様々な方法で影響を及ぼす。通常、より低い温度は化学反応を遅くする。したがって、ある時間、通常は数時間、例えば１～４時間後、血管は、血管の壁に付着する複数のより小さいまたはより大きい血餅を含み得る。これらの血餅は、ドナーから腎臓を入手した後に通常行う腎臓の血管の洗浄（又は、すすぎ／rinsing）によって洗い流すことができない。実際に、血餅が高圧および高フラッシング流によって洗い流されることを試みる場合、血餅が引き剥がされた内皮細胞に損傷をきたし得る。あるいは、これらの血餅は採取後や移植前に腎臓が保存されている間も残る。腎臓が最終的にレシピエントに移植されると、レシピエントの血液に血管が露出し、その結果、損傷を受けた血管領域に新たな血餅が形成される恐れがある。したがって、特に、循環停止後２時間、３時間、４時間、またはそれ以上などのある時間後にドナーから腎臓が調達された場合、できるだけ早く血餅を除去することが重要である。このような血餅は、循環停止後の何時かに生成されるので、この問題は循環停止後長時間（例えば、４時間以上）経ったドナーから採取された腎臓においてより大きい。他方ではこのプロセスは温度が低ければ減速され、これはドナーの身体が採取前により速く冷却される場合、これが凝固プロセスを減少させ得ることを意味する。
【0039】
腎臓は図２に示すように、糸球体毛細血管（glomerular capillaries）と尿細管周囲毛細血管（peritubular capillaries）の２つの直列に接続された毛細血管系を含み、輸出細動脈（efferent arterioles）が２つの毛細血管系の間に配置されている点で特別である。従って、微小血餅（又は、微小凝血塊／microclots）は、両方の毛細管系において形成されていたかもしれない。さらに、毛細血管系の間に同伴される輸出細動脈には、より大きな血餅が形成されている可能性がある。凝固過程は腎臓に影響を及ぼし、２つの毛細血管系とその間に存在する輸出細動脈を遮断するであろう。このため、微小血餅が形成された腎臓から血餅をすすぎ出す（rinse out）ことは困難である。
【0040】
血餅が形成されると、大量のプラスミノーゲンが他の血漿タンパク質と共に血餅中に捕捉される。プラスミノーゲンは活性化されるまでプラスミンになったり、血餅の溶解を引き起こすことはないであろう。生体内では、傷ついた組織や血管内皮が組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）と呼ばれる強力な活性化因子を非常にゆっくりと放出し、これは、その後実質的にプラスミノーゲンをプラスミンに変換し、残った血餅を取り除く。実際、血餅によって血流が遮断された小血管の多くは、生体内でこの機構によって再開通する。従って、プラスミン系の特に重要な機能は何百万もの小さな末梢血管から微小な血餅を除去することであり、これらは最終的に、それらを除去する方法がない場合に閉塞される。
【0041】
血餅中に捕捉されたプラスミノーゲンは通常、ｇｌｕ－プラスミノーゲンであり、これは、ｔＰＡへの暴露でゆっくりとプラスミンに変換される。これは、系のゆっくりとした始動を引き起こす。しかし、しばらくするとｇｌｕ－プラスミノーゲンはｌｙｓ－プラスミノーゲンに変換され、これがはるかに速くプラスミンに変換される。したがって、最初の時間の後に血餅の溶解速度を増加させる正の増幅系が存在し、これは４８時間までであり得る。
【0042】
長い実験の後、本発明者は、虚血（ischemia）の最初の数時間の間の血餅の形成が腎臓に有害であり得ると結論付けた。血小板は血液の非流によって活性化され、形成された血餅は、血餅の近傍の内皮細胞に影響を与え、傷つける恐れがあると考えられる。死後循環がなく、循環停止状態になるため、血餅が内皮細胞に影響を与える時間が長く、これにより損傷を受ける。
【0043】
内因性溶解システムは、ドナー腎臓における微小血餅の溶解のために使用され得る。しかし、血餅溶解は遅い。実際、大量のｔＰＡの添加は、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化速度を増加させない。
【0044】
しかし、ｌｙｓ－プラスミノーゲンの添加およびｔＰＡの添加は血餅の溶解を高め、そしてプロセスをスピードアップすることが見出された。線溶療法後は局所内皮の脆弱性が高いため、血餅の溶解後は局所環境に注意を払い、再血栓症を予防することができる。
【0045】
再調整（recondition）過程を検証するために、４時間以上温虚血に曝露されたブタからの腎臓が実験目的に使用されてきた。６時間、８時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上の間に虚血に曝露された腎臓は、再調整可能であるという証拠がある。さらに、１時間以下の虚血に曝露された腎臓もまた、多少は、このプロセスから利益を得ることができ、したがって、温または冷虚血時間の延長、または年齢、高血圧、糖尿病、低血圧、集中治療室（ＩＣＵ）における時間、無尿、臨床検査値の上昇、バックテーブルでの潅流不良腎臓、または移植のためにドナーを主に受け入れない他の原因等の他の共立要因（cofounding factors）のいずれかによってマージナルであると考えられる脳死ドナー（ＢＤＤ）由来の腎臓を含む。
【0046】
本発明の一実施形態では、延長された及び未知の時間中に温虚血に曝露された腎臓が以下に述べる主なステップを使用することによって回復される。これらのステップは以下にさらに説明するように、以下に示すシーケンス（又は、順序）で正確に実行される必要はない。
【0047】
第１のステップはｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡを、採取直後およびバックテーブルで腎臓の動脈に、連続的に、または組み合わせて注入する、または体外の、ex-vivo潅流装置を通して、連続的に、または組み合わせて注入してもよいことを含んでもよい。ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、生理学的等張（iso-tonic）電解質流体であり、おそらくは高浸透圧剤を含むキャリア流体中に含まれる。約５～２０ｍｌのｌｙｓ－プラスミノーゲンを（５～１００Ｕ／腎臓を使用して）注射し得る。ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、腎臓の血管内に存在する血餅に付着する。約１５分後（または同時に）、約５～２０ｍｌのｔＰＡ（０．５～１０ｍｇ／腎臓を使用）を、同様の方法で動脈に注射し得る。ｔＰＡは生理学的に等張の電解質流体であり、おそらくは高浸透圧剤を含むキャリア流体に含まれてもよい。第１のステップは、室温以上、例えば２０℃～３７℃で提供されてもよい。
【0048】
腎臓はさらに、循環または潅流（perfusion）ステップにさらされてもよく、腎臓は腎臓の動脈にコネクタを挿入し、静脈から出てくる流体を収集するための容器内に腎臓を配置することによって、潅流デバイスに接続される。容器は５００～１５００ｍｌの生理学的等張電解質流体である循環流体を含むことができ、さらに、単独で、または追加の高浸透圧剤と組み合わせて、高浸透圧剤、例えばアルブミン５７ｇ／Ｌを含むことができる。循環流体は１５℃～２４℃（室温）の温度で、腎臓を通して３５分間以上循環され、２０ｍｍＨｇの圧力で開始し、５分間毎に５ｍｍＨｇずつ最大７０ｍｍＨｇまで圧力を繰り返し増加させ、続いて、より低い圧力、例えば３０ｍｍＨｇで３０分間循環される。この間、ｌｙｓ－プラスミノーゲンとｔＰＡはさらに腎臓内を循環し、抵抗性は次第に低下するであろう。腎臓の色を調べ、腎臓が青白い外観を有するときに高圧での処置を中断して圧力を低下させ続けることができる。
【0049】
処置した血餅の再血栓症（又は、再血栓）を予防するために、以下のうちの１つまたはいくつかを、組み合わせてまたは単独で、添加することができる：
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）などのトロンビン阻害剤；アルゴバトラン、または、イノガトラン、メラガトラン（およびそのプロドラッグキシメラガトラン）、ダビガトランまたはヒルジンおよびそれらの誘導体などの任意の他の直接トロンビン阻害剤；
アロステリック阻害剤；
糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬（アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）などの血小板阻害薬；
非可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害薬（アスピリン、トリフルサール）；
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害薬（カングレロール、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン）；
ホスホジエステラーゼ阻害薬（シロスタゾール）；
プロテアーゼ活性化受容体－１（ＰＡＲ－１）拮抗薬（ボラパキサル）；
アデノシン再取り込み阻害薬（ジピラジモール）；
トロンボキサン阻害剤（イフェトロバン、ピコタミドなどのトロンボキサンシンターゼ阻害剤、およびテルトロバンなどのトロンボキサン受容体拮抗剤）；
または他の血小板阻害薬のいずれか。これらは、第１の注入ステップまたは第１の循環ステップまたは他の任意のステップの間に添加され得る。ヘパリンまたは低分子ヘパリンの添加は任意である。
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）などのトロンビン阻害剤；アルゴバトラン、または、イノガトラン、メラガトラン（およびそのプロドラッグキシメラガトラン）、ダビガトランまたはヒルジンおよびそれらの誘導体などの任意の他の直接トロンビン阻害剤；
アロステリック阻害剤；
糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬（アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）などの血小板阻害薬；
非可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害薬（アスピリン、トリフルサール）；
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害薬（カングレロール、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン）；
ホスホジエステラーゼ阻害薬（シロスタゾール）；
プロテアーゼ活性化受容体－１（ＰＡＲ－１）拮抗薬（ボラパキサル）；
アデノシン再取り込み阻害薬（ジピラジモール）；
トロンボキサン阻害剤（イフェトロバン、ピコタミドなどのトロンボキサンシンターゼ阻害剤、およびテルトロバンなどのトロンボキサン受容体拮抗剤）；
または他の血小板阻害薬のいずれか。これらは、第１の注入ステップまたは第１の循環ステップまたは他の任意のステップの間に添加され得る。ヘパリンまたは低分子ヘパリンの添加は任意である。
【0050】
プロセスの第２のステップは、腎臓の血管を通る高張性流体（hyperoncotic liquid）の循環による循環系の潅流および回復（restoration）を含む。高張性（Hyperoncotic）とは血漿中のタンパク質によって引き起こされる圧力として定義されるが、デキストランまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような人工的構築物であり得る。共通の性質は、それが流れる腎臓の周囲組織よりも高いコロイド浸透圧を有するべきであるということである。さらに、流体は低温、例えば、１２℃～２４℃、および低圧、例えば、２０ｍｍＨｇ～３０ｍｍＨｇで、回復段階の１つの段階で潅流されてもよく、より高い温度、例えば、１８℃～３２℃で、潅流圧力がより高く、例えば、２５ｍｍＨｇ～７０ｍｍＨｇまたは９０ｍｍＨｇであってもよい回復段階の別の段階で潅流されてもよい。１つの高張性流体は５０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ、例えば５７ｇ／Ｌまたは７２ｇ／Ｌなど、４０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの高濃度のアルブミンを含むが、同様の特性を有する他の物質、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。高張性流体は、正常な細胞外レベルと比較して、約１０ｍＭ～２５ｍＭの多量のカリウムを含み得る。高張性流体はまた、浸透膜不浸透性剤（グルコン酸塩およびグルコース）を含み得るが、その代わりに、またはそのようなもの（ラクトビオン酸塩、ラフィノース、マンニトール）と組み合わせて、類似の機能を有する他の薬剤を含み得る。常気圧で、酸素（Ｏ２２０％）、二酸化炭素（ＣＯ２６．５％）、および窒素（Ｎ２７３．５％）で構成されたガスに露出することにより、流体を酸化させることができ、この場合、酸素のパーセンテージは血液ガス分析（blood gas analyses）後に、代謝ニーズに応じて変更することができる。高張性流体は腎臓の間質組織から水分を除去し、毛細血管系を回復させる。さらに、代謝プロセス不全（failing metabolic process）からの毒性産物は重炭酸塩のような緩衝系を使用して洗い流され、ｐＨが回復されるが、追加的にまたは代替的に、類似の機能を有する他の薬剤または物質（リン酸塩、ヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣ）を含有してもよい。
【0051】
腎臓は長時間虚血にさらされているので、グリコーゲン貯蔵が消費されてＡＴＰが不足してしまう。したがって、細胞イオンポンプは働かず、細胞内外のＮａ／Ｋバランスが損なわれる。ｐＨが低下し、乳酸塩およびピルビン酸塩が産生され、組織に蓄積される。高張性流体は代謝の基質としてグルコースおよび／またはアデニンを含むが、追加的または代替的に、同様の機能を有する他の薬剤（α－ケトグルタル酸、ヒスチジン、グルタミン酸）を含んでもよい。しかしながら、代謝速度は、このような低温では非常に遅い。
【0052】
循環は低いポンプ圧で行われる。循環中、血管抵抗は連続的に減少し、循環は、血管抵抗が十分に低くなるまで継続され、これは数時間かかる場合もある。
【0053】
プロセスの第３のステップは、微小環境のさらなる回復および腎臓の評価を含む。温度を約３２℃に上昇させ、圧力を３０ｍｍＨｇまたは７０ｍｍＨｇまで上昇させる。洗浄された赤血球（ＲＢＣ）は、３～２０、例えば５～１０、例えば６～８のヘマトクリット（hematocrit）に添加される。酸素化（又は、酸素注入／酸素添加／oxygenation）は、酸素レベルを増加させた酸素供給器によって行われる。正常な状態では、腎臓は尿を産生し始め、クレアチニン濃縮能が機能の目安として測定される。既知量のクレアチニンを、腎臓の濾過能力のマーカーとして溶液に添加することができる。さらに、腎臓を視覚的に検査する。腎臓に（広い）暗い部分がある場合は、腎不全の徴候かもしれない。さらに、腎血管抵抗を評価する。
【0054】
腎臓が移植に適していると考えられる場合、腎臓を直接移植するか、または４～１５℃の低温に冷却し、移植まで保存する。
【0055】
第２のステップと第３のステップとの間に保存期間を配置することもできる。
【0056】
様々なステップは、多くの点で修正することができる。
【0057】
第１のステップは、第２のステップの後に１つまたはいくつかの第１のステップを差し挟むことによって修正することができる。例えば、高張性流体は１時間の間潅流され得、ここで、ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡ、ならびに場合によりＡＴＩＩＩが添加され、そして潅流はさらに１時間継続され得、ここで、ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡ、および場合によりＡＩＩＩが再び添加される、などである。
【0058】
第２のステップは約１時間の第１の期間中に高張性流体を潅流し、次いで、例えばアルブミン濃度を例えば７２ｇ／Ｌから例えば５７ｇ／Ｌに低下させ、流体をさらに１～３時間循環させることによってコロイド浸透圧を低下させることにより、修正することができる。高張性流体は、０．１～１０％の用量のデキストラン４０を単独で、またはアルブミンもしくは任意の他の高張性剤と組み合わせて、さらに含み得る。
【0059】
第３のステップは処置された血餅の再血栓症を予防するために、凝固阻害剤および／または血小板阻害剤を含むことによって修正され得る。第１のステップに関して上述したのと同じ製品を使用することができる。製品は第３のステップの間に腎臓に添加される前にＲＢＣ懸濁液に、ＲＢＣが添加される前に潅流溶液に、または両方の溶液に添加され得る。微小循環系や血管で形成された血餅は粘着性を有し、内皮細胞に付着すると考えられている。血餅が溶解すると、それらは内皮細胞および糖衣に損傷を残す。この損傷は、赤血球の洗浄にもかかわらず残存する、ＲＢＣ懸濁液中の可能性のある血小板および凝固因子を活性化する。このような活性化は、同じ場所での血餅の新たな形成をもたらし得、これは回避されるべきである。アンチトロンビンＩＩＩ、または任意の直接トロンビン阻害剤はトロンビンと反応し、トロンビンを不活性化し、除去する。アブシキシマブ、あるいは他の血小板阻害薬は、血小板がくっついて傷ついた内皮細胞に付着するのを防ぐ。ヘパリンまたは低分子ヘパリンの添加は任意である。
【0060】
第３のステップは、２８～３７℃および３０～９０ｍｍＨｇで実施されるように修正されてもよい。
【0061】
すすぎステップは、ステップ間およびステップ中に行われてもよい。すすぎ液を腎臓に通し、次いで廃棄する。したがって、すすぎ液は腎臓を循環しない
【0062】
腎臓はできるだけ早く採取されているが、一方で循環停止などの原因で腎臓が虚血に曝された時間はわかっていないが、虚血時間は約３時間か４時間以上など２時間を超える。腎臓は図１に示すように、腎臓、大動脈および大静脈を自由にし、腎動脈および腎静脈の上下の大動脈および大静脈を切断することによって採取される。アセンブリをバックテーブル上に置き、大動脈残渣（又は、大動脈残部／aorta residue）および大静脈残渣（又は、大静脈残部／vena cava residue）を目に見える血餅から除去する（又は、開放する）。
【0063】
できるだけ早く、ｌｙｓ－プラスミノーゲン（５～１００Ｕ）を針および注射器によって腎動脈に注入し、それによって、すべてのｌｙｓ－プラスミノーゲンが腎動脈および腎臓に通過することを確実にするために、注射器の前に腎動脈を圧搾する。流体が腎静脈から出れば、腎臓がｌｙｓ－プラスミノーゲンによって潅流されていることを示している。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンは血管内の血餅と相互作用し、血餅や血餅内のフィブリンと結合する。次に、ｔＰＡ注射の時間まで、両腎動脈と同様に腎静脈をクランプする。
【0064】
次に、ｌｙｓ－プラスミノーゲンと同じ方法でｔＰＡを注入する。しかしながら、静脈はわずかな過剰圧力が腎臓の内側に生成されるように、クランプされたままであってもよい。次いで、大動脈は、一端でカニューレ挿入され、他端でクランプされ、系をex-vivo機械潅流のためにセットする。両方の尿管には、尿をモニタリングできるようにカニューレが挿入される。
【0065】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）またはアルゴバトランなどのトロンビン阻害剤を、ｌｙｓ－プラスミノーゲンと一緒に、および／またはｔＰＡと一緒に添加してもよい。
【0066】
ｌｙｓ－プラスミノーゲンの注入容量、約１０ｍｌは、腎臓に通常含まれる血液の容量の約半分に相当し、腎臓（腎臓が１５０ｇの重量を有する場合）（１０～２０ｍｌ／１００ｇの腎臓）あたり約１５～３０ｍｌであることに留意されたい。ｔＰａの体積も約１０ｍｌであり、用量は腎臓あたり０．５ｍｇ～１０ｍｇである。
【0067】
最後に、図３に示すように、腎臓を閉鎖した容器に入れ、腎臓を大動脈残渣に吊り下げ、循環系に接続する。大静脈の下端は流体が腎臓から自由に流出することができるように開放され、一方、流体は容器の循環系によって大動脈に提供される。
【0068】
ときには、腎臓を別々に扱うことがある。これにより、大動脈を縦に２つに分け、図３に示すように、カニューレを分割した大動脈パッチからまだ流出している腎動脈につなぐ。これにより、複数の動脈を１本の動脈として扱うことができ、それぞれの腎臓を別々にモニターできる可能性がある。ヒトでは、腎臓あたり１本以上の動脈が全腎臓の３０％以上に見られる。提案された技術では、これは問題ではない。
【0069】
図３に示すように、腎臓３５の大動脈残渣３３は、容器３１内に配置されたコネクタ３２に接続される。大静脈３４は破線３６で示すように、容器３１の底部３７に流体を放出するように開いている。流体レベル３６は、腎臓の下、または腎臓の上、またはその間にあってもよく、図３に示されているのは、その間の場合である。
【0070】
容器の底部３７は、バルブ４２を介してドレンバッグ４１に接続されている。底部はまた、第１のスイッチ弁４４を介してポンプ４３に接続されている。図３に示される第１の位置において、第１のスイッチ弁４４は、ポンプ４３の入口を、すすぎ流体バッグ４５または容器３１の底部３７のいずれかに接続する。
【0071】
ポンプ４３の出口は、ポンプを通過する流体の温度を制御する加熱／冷却器４８に接続されている。加熱器／冷却器４８の出口は第２のスイッチ弁４６を介して、酸素供給器４７および白血球フィルタ４９に、または、図３に示されるスイッチの第１の位置では、直接コネクタ３２に、そして腎臓に通じる。図示の位置では、流体が周囲の大気（流体中に溶解した酸素）に曝されることによってのみ酸素化される。
【0072】
したがって、容器３７の底部に存在する流体は、第１のスイッチ４４を介してポンプ４３に循環され、さらに加熱／冷却器４８を介して第２のスイッチ４６およびコネクタ３２に循環される。流体はコネクタ３２から大動脈および腎臓に進み、腎臓の血管を通り、さらに腎臓の静脈に進み、最終的に容器の底部に放出される。
【0073】
ポンプ４３はポンプ圧力が例えば２０ｍｍＨｇの所望の値に調整され、流量が腎臓の抵抗に依存するように、圧力制御されたポンプであってもよい。
【0074】
容器３１の底部３７に存在する流体は、図３に示すように、いくつかのバッグ５０、５１、５２、５３および５４を介して供給される。各バッグは、弁５５、５６、５７、５８及び５９を介して容器３１に接続されている。弁を開くことによって、バッグの内容物は、重力によって容器の底部に運ばれる。
【0075】
一実施形態において動作は、以下の通りであってもよい：
【0076】
採取後、腎臓をバックテーブルでｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡに暴露した後、腎臓を容器３１に移動させ、大動脈残渣をコネクタ３２に接続して、腎臓を容器３１内に吊るす。静脈は開いており、流体を容器の底部３７に直接排出することができる。腎臓は、ネットなどの支持体（図示せず）上に載置されてもよく、水平軸に関してその位置の角度が異なってよい。容器内の温度は、所望の開始温度、例えば１８℃～２８℃に設定される。電解質と、場合によっては５７ｇ／Ｌの濃度のアルブミンとを含む循環流体を、対応する弁５５を開くことによって循環流体バッグ５０から容器３１に供給することができる。次に腎臓を潅流し、２０ｍｍＨｇの圧力で５分間にて開始した後、５０ｍｍＨｇから９０ｍｍＨｇの事前に決めたどれかの値まで５分毎に５ｍｍＨｇずつ増量する。次いで、圧力を例えば２０～３０ｍｍＨｇに低下させ、事前に決定された追加の期間にわたって潅流することができる。腎臓の抵抗は減少し、腎臓は正常に薄い色になり、暗い領域は全くないか、あるいはわずかしかない。これは、腎臓の血管内の血餅が溶解され除去されたことを示す。ここで、容器内部の流体は、ドレン弁４２を開くことによってドレン４１に通される。
【0077】
いかなる理論にも拘束されず、腎臓の暗い部分は循環のない領域のしるしであると考えられている。これは血栓や他の理由によるものかもしれない。このような暗い部分で後に循環が起これば、腎臓はこれらの領域を回復させて、組織を機能させる。
【0078】
潅流ステップでは、ドレン弁４２を閉じ、弁５６を開くことによって、１０００ｍｌの潅流流体５１を重力によって容器３１に通す。容器内の流体レベルは１０００ｍｌの流体が容器の底部に蓄積されると、ライン３６の上方に上昇し、弁５６が閉じられる。第１のスイッチ弁４４は図３に示されるその第１の位置にあり、ポンプが起動され、２０ｍｍＨｇの圧力でポンピングされる。ヒータ／クーラ４８は、温度を１２～１８℃に調整する。容器の底部の流体は、数時間、例えば１～４時間、２０～３０ｍｍＨｇの圧力で循環される。潅流ステップの間、腎臓の化学的性質は回復され、毒性産物が除去される。ここで、ポンプを停止し、すすぎを行う。潅流ステップはすすぎステップの後、低体温潅流期間中に、別の組成の潅流溶液で繰り返されてもよく、または、潅流がＲＢＣの有無にかかわらず、別のより高い温度中に継続されてもよい。
【0079】
評価ステップでは、潅流ステップからの同じ溶液を、ドレン弁４２を開いて容器の内容物をドレン４１に排出した後に使用することができ、または上述の２つのすすぎステップの後にドレン弁４２を閉じて、弁５７を開くことによって５００ｍｌの評価流体５２を重力によって容器３１に送った後に使用することができる。５００ｍｌの流体が入ったら、バルブ５７を閉じる。第１のスイッチ弁４４は図３に示されるその第１の位置にあり、ポンプが起動され、２０ｍｍＨｇの圧力でポンピングされる。加熱／冷却器４８は、温度を２８～３２℃に上昇させる。ｐＨおよび環境がチェックされる５～３０分後、５～１０のヘマトクリットが得られるまで弁５８を開くことによってバッグ５３から赤血球懸濁液（ＲＢＣ）を添加し、その後バルブ５８を閉じる。第２のスイッチ弁４６は、流体および赤血球を酸素化するための回路内の酸素供給器４７を含む第２の位置に移動される。腎臓が移植目的に使えると判断されるまで、３０ｍｍＨｇの圧力で１～４時間の間循環が進む。３２～３７°Ｃ、圧力７０～９０ｍｍＨｇで１５分間にわたって腎臓を評価し、腎臓の潅流状態に関して血管抵抗、血流、視覚的外観に注目する。外科医は、腎臓の潅流が良好であるか、中程度または不良であるかを判定し、中程度はいくつかの青色／黒色の斑点、不良はいくつかの大きな暗青色または黒色の領域が潅流されていない。尿産生を測定し、流量をｍｌ／分および１００ｇ腎組織として記録する。ポンプが停止され、ドレン弁４２が開いて、容器の底部の全ての流体をドレン４１に排出する。
【0080】
任意のすすぎステップは、第１のスイッチ弁４４を、ポンプ４３をすすぎ流体バッグ４５に接続するその第２の位置に移動させることによって実行されてもよい。ポンプを作動させ、約２００ｍｌを腎臓に循環させる。腎臓を出て容器の底部に至る流体は、開放弁４２を介してドレン４１にさらに通される。このようにして、全ての赤血球は腎臓からドレンにすすぎ出される。このようなすすぎステップは、数回、および他のステップの間に実施されてもよい。
【0081】
保存ステップでは、ドレン弁４２を閉じ、弁５９を開くことにより５００ｍｌの保存液５４を重力により容器３１に通す。５００ｍｌの流体が入ったら、弁５９を閉じる。第１のスイッチ弁４４は図３に示されるその第１の位置にあり、ポンプが起動され、２０～３０ｍｍＨｇの圧力でポンピングされる。ヒータ／クーラ４８は、温度を１２～１５℃のように６～１８℃に調節する。容器の底部の流体はレシピエントが見つかり、腎臓がレシピエントへの移植のために準備されるまで、数時間、最大４８時間以上、２０～３０ｍｍＨｇの圧力で循環される。ポンプが停止され、ドレン弁４２が開いて、容器の底部の全ての流体をドレン４１に排出する。腎臓はコネクタ３２から取り外される。
【0082】
図３に記載される実施形態で使用される流体は、表Ａに詳述される流体であってもよい。
【0083】
バックテーブル処置の間、ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、表Ａのベース溶液と同一であり得るキャリア流体中に含まれる。
【0084】
一実施形態では、キャリア流体、リンス流体、潅流流体、および保存流体は同じ基本成分を有してもよい。これらの成分としては、ナトリウム含有量１１３ｍＭ～１２９ｍＭ、カリウム含有量５ｍＭ～２５ｍＭ、マグネシウム含有量２．５ｍＭ～５ｍＭ、カルシウム含有量１ｍＭ～５ｍＭが挙げられる。上記の電解質に加えて、以下の物質のうちの１つまたはいくつかが含まれ得る：４０ｇ／Ｌ～７５ｇ／Ｌ、例えば５７ｇ／Ｌまたは７２ｇ／Ｌなどの１０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌの濃度のアルブミン；任意に０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌのデキストラン４０、０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、０ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０）、または０ｇ／Ｌ～３ｇ／ＬのＰＥＧ３５、の単独または組み合わせ。デキストロース５ｍＭおよび重炭酸塩１０～３５ｍＭも任意である。さらに、Ｌ－アルギニン（一酸化窒素（ＮＯ）の前駆体、生理学的ストレス時の血圧の調節）、Ｌ－ロイシン（タンパク質合成）、Ｌ－グルタミン（アミノ酸産生に必要なＬ－アルギニンを合成する）、または他のものなどのアミノ酸を、単独でまたは組み合わせて、通常濃度で添加してもよい（表Ａを参照のこと）。添加され得る他の物質は、Ｉ－イノシトール（膜電位安定剤）、アデニンおよびリボース（アデノシンを作る－ＡＴＰの一部）である。表Ａに記載されているような微量物質（補因子およびビタミン）も添加することができる。ノボラピッド、Ｔ３、Ｔ４、プロゲストロンおよびエストロゲンなど、天然に存在するホルモンを生理的濃度で添加してもよい（表Ａ）。チエナム（Ｔｉｅｎａｍ）のような抗生物質を添加してもよい。表Ａによるこの基本流体は、キャリア流体、すすぎ流体、循環流体、潅流流体および保存流体のうちの少なくとも１つとして使用され得る。
【0085】
【0086】
潅流液は高い膠質浸透圧を有してよく、これは、７０ｇ／Ｌ～１２０ｇ／Ｌ、例えば７２ｇ／Ｌの濃度までのアルブミン、およびおそらく０ｇ／Ｌ～１５０ｇ／Ｌの濃度のデキストラン４０（またはデキストラン７０）などの高張性溶液、または任意の他の公知の高張性流体の添加によって達成される。カリウムは、１７～２２ｍＭ、例えば１８ｍＭなど、１３～２５ｍＭの範囲で、正常血漿よりも高く維持されてもよい。あるいは、カリウム濃度が１ｍＭ～１３ｍＭなどの低濃度であってもよい。カリウムおよびナトリウムレベルは生理学的環境およびｐＨの標準化（normalization）のために、ＲＢＣフェーズの間に変わる。
【0087】
評価流体はさらに、以下を含んでもよい：
アルゴバトラン（またはイノガトラン、メラガトラン（およびそのプロドラッグキシメラガトラン）、ダビガトランもしくはヒルジンおよびそれらの誘導体などの任意の他の直接トロンビン阻害剤、またはアロステリック阻害剤）などの凝固阻害剤；
血小板阻害薬、例えば糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬（アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）、
不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害薬（アスピリン、トリフルサール）、
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害薬（カングレロール、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン）、
ホスホジエステラーゼ阻害薬（シロスタゾール）、
プロテアーゼ活性化受容体－１（ＰＡＲ－１）拮抗薬（ボラパキサル）、
アデノシン再取り込み阻害薬（ジピラジモール）、
トロンボキサン阻害薬（イフェトロバン、ピコタミドなどのトロンボキサンシンターゼ阻害薬、およびテルトロバンなどのトロンボキサン受容体拮抗薬）または
他の血小板阻害薬－を組み合わせてまたは単独で、治療した血栓の再血栓症を予防するために含んでよい。
アルゴバトラン（またはイノガトラン、メラガトラン（およびそのプロドラッグキシメラガトラン）、ダビガトランもしくはヒルジンおよびそれらの誘導体などの任意の他の直接トロンビン阻害剤、またはアロステリック阻害剤）などの凝固阻害剤；
血小板阻害薬、例えば糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬（アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）、
不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害薬（アスピリン、トリフルサール）、
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害薬（カングレロール、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン）、
ホスホジエステラーゼ阻害薬（シロスタゾール）、
プロテアーゼ活性化受容体－１（ＰＡＲ－１）拮抗薬（ボラパキサル）、
アデノシン再取り込み阻害薬（ジピラジモール）、
トロンボキサン阻害薬（イフェトロバン、ピコタミドなどのトロンボキサンシンターゼ阻害薬、およびテルトロバンなどのトロンボキサン受容体拮抗薬）または
他の血小板阻害薬－を組み合わせてまたは単独で、治療した血栓の再血栓症を予防するために含んでよい。
【0088】
ヘパリン、プロテインＣおよびプロテインＳは任意である。
【0089】
ベラパミルを加えてもよい。図４は、別の実施形態を示す。この実施形態は、腎臓を採取するための施設を備えるローカル（又は、地域）の病院で使用されることが意図される。腎臓は、当該ローカルの病院で前処理され、後にレシピエントへの移植を担当する中央病院に搬送される。
【0090】
ローカルの病院では心停止の犠牲者であるドナーが、死亡からの時間が不明であるが、１２時間、１０時間、８時間、６時間または４時間未満に到着する。ドナーが到着するとすぐに、体内の有害な処置、特に代謝および凝固を減速させるために、屠体を冷却することができる。そのような冷却は、身体が例えば約０℃の空気温度を有する、冷蔵されている部屋または区画に置かれるという点で局所的であってよい。冷却の他の方法は、身体の周りまたは腹腔内に氷スラリーを配置することであってもよく、または冷たい流体を腹腔および／または胸腔内に注入してもよい。
【0091】
採取チームがローカルの病院にいる場合、採取は、冷却の有無を問わず、できるだけ早く行うことができる。
【0092】
腎臓を採取する際には、通常の手順が行われ、腎臓は、ひとまとめにして、あるいはそれぞれ別個にしてバックテーブルの上に置かれる。バックテーブルでは、腎動脈にｌｙｓ－プラスミノーゲンを注入する第１のステップを行う。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンは腎臓血管に約１５分以上滞留させ、その間、腎臓動脈または大動脈にコネクタを取り付けることにより、腎臓をさらに準備する。
【0093】
約１５分後、または可能な限り早く、腎臓は図４に示されるように、容器アセンブリ６０に移される。腎臓６１のコネクタ６３は、容器６２の頂部の対応するコネクタ６４に取り付けられ、そこで、腎臓６１は図４に示されるように、容器６１の内側に吊り下げられる。腎臓の静脈は、容器６１の内部に直接開口している。
【0094】
コネクタ６４がまだ開いているとき、シリンジ７５が接続され、約１０ｍｌのｔＰＡ（Ａｌｔｅｐｌａｓ）がコネクタ６４を介して腎臓の動脈に注入される。ｌｙｓ－プラスミノーゲンの添加は代わりに、ｔＰＡの添加の前に、そしてバックテーブルでの添加の代わりに、コネクタ６４に取り付けられたシリンジを介して実施され得ることに留意されたい。さらに代替的に、ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡは、シリンジを介してコネクタ６４に同時に添加され得るか、またはバックテーブルで同時に注入され得る。
【0095】
アルテプラーゼの代わりに、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼおよびテネクテプラーゼなどの別のｔＰＡを使用することができる。
【0096】
その後、コネクタ６４にチューブ６５が接続される。チューブ６５は螺旋形状に配置され、圧力バッグ６６をコネクタ６４に接続する。圧力バッグ６６は、スタンド６７によって、容器６４の上方例えば２７ｃｍの所定の高さ（２０ｍｍＨｇの圧力に対応する）に支持されている。圧力バッグ６６の高さ位置はウォームギアモータ６８によってスタンド６７に沿って調節可能である。チューブ６５の螺旋構成は、チューブ６５を高さ位置に調整する。最初、バッグは空である。
【0097】
循環流体バッグ７６は、電解質およびアルブミンなどの高浸透圧剤を含む循環流体を含む（表Ａ）。バッグ７６内の循環流体は、矢印７７で示すように容器６２に加えられる。約１Ｌの循環流体があり、容器６２の容積は約１．３Ｌであり、これは、容器６２は循環流体でほぼ満たされていることを意味する。循環流体は、１Ｌ／分でＯ２、ＣＯ２とＮ２のガス混合物を用いて、酸素供給器を介して酸化される。操作は室温で行う。循環流体は、系内のｌｙｓ－プラスミノーゲンおよびｔＰＡと一緒に循環する。
【0098】
循環流体の量は１Ｌよりも小さくてもよいが、チューブおよびポンプ（容器を除く）ならびに腎臓の容積よりも大きくなければならない。加えて、容器内に収容されるためには、小さな容積が必要とされる。このような容量は、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、またはそれ以上であり得る。したがって、例えば、１５０ｍｌ～１０００ｍｌの循環流体を使用することができる。
【0099】
ポンプ６９がチューブ７０を介して容器６２に接続され、容器６２から圧力バッグ６６に循環流体をポンプで送る。レベル検出器７１は、容器６２の流体レベルが所定のレベルに達したときにポンプ６９を始動させる。ポンプは例えば、ポンプの回転速度に対応する流量を有する蠕動ポンプである。ポンプが圧力制御されている必要はない。
【0100】
ポンプ６９は１分間に、例えば７５ｍｌ／分の流量で作動され、７５ｍｌの流体が容器６２から圧力バッグ６６に移送される。ポンプ流量は、腎臓の抵抗が十分に低いことを示す、腎臓を通る所望の流量に対応するように選択される。腎臓１００ｇ当たり５０ｍｌ／分の流量で十分であると通常考えられる。成人男性の正常な腎臓は約１５０ｇである。
【0101】
圧力バッグ６６は例えば、容器６２の上方２７ｃｍの高さに配置されているので、循環流体の流れは、２０ｍｍＨｇに相当する２７ｃｍ水柱の前記圧力で腎臓を通過する。腎臓の耐性が大きい場合、２７ｃｍの水柱のこの圧力は例えば７．５ｍｌ／分の腎臓を通る流れを引き起こすことができ、これは、容器６２内の液面が１０分で液面検出器７１の液面に戻ることを意味する。次いで、ポンプ６９が液面検出器７１によって始動され、この手順が繰り返される。
【0102】
圧力バッグ６６は、ウォームギアモータ６８によってより高い位置に移動されてもよい。一実施形態では、ウォームギアモータ６８が圧力バッグの高さを１ｃｍ／分だけ増加させる。圧力が例えば、１０分後に３５ｃｍ水柱に増加すると、腎臓を通る流れは、例えば、１５ｍｌ／分に増加する。これは、ポンプ６９が５分後に再度運転されることを意味する。腎臓を通る流れが７５ｍｌ／分になるように圧力が上昇すると、ポンプ６９は連続的に作動する。これは、腎臓の抵抗性が十分に低いことを示している。ここで、圧力バッグ６６の高さの増加が停止される。
【0103】
圧力バッグの最大高さは、例えば９５ｃｍであり、７０ｍｍＨｇの圧力に対応する。圧力バッグが上部位置にある前に（最大７０分後に）所望の流量（１５０ｇの腎臓に対して７５ｍｌ／分）に達した場合、手順は中断される。所望の流量に達していない場合、７０ｍｍＨｇ（９５ｃｍ水柱）の圧力で操作をさらに３０分間続ける。
【0104】
これまでの操作は、１８℃～２８℃の室温で行われた。
【0105】
容器６２には、容器の大きな下側部分を覆うジャケット７２が設けられている。ここで、ジャケットには、容器６２を約５℃～１８℃、例えば１２℃～１５℃の温度に冷却するための氷スラリーを設けることができる。圧力チャンバーを２５ｃｍに下げ、ポンプを操作して循環液を腎臓に循環させる。ジャケットおよび圧力バッグを有する容器は断熱ボックス（図示せず）内に配置されてもよく、アセンブリは継続する取扱いを担当する主病院に輸送される。腎臓は、この状態で、長時間、４８時間まで、またはそれ以上保存され得る。
【0106】
移植が行われるかもしれない主病院では、腎臓をさらに治療する。同じ容器６２内に留まるか、または、腎臓は図５に示されるように、別の容器８２に移動され得る。容器８２は、腎臓が接続されるコネクタ８４を備える。ポンプ８９はチューブ８７を介して容器８２から腎臓の入口動脈に流体を圧送し、流体は先に説明したように、静脈を介して容器８２に放出される。ポンプ８９は圧力制御され、圧力を所望の値、例えば２０～３０ｍｍＨｇに維持する。ヒータ／クーラ（図示せず）は潅流および保存の間、温度を所望の温度（例えば、１２～３２℃）に維持する。ドレンバッグ８５は、バルブ８６を介して容器８２の底部に接続されている。
【0107】
図５による装置はまた、赤血球懸濁バッグ９１を含む。赤血球懸濁バッグは、並列に配置された３つのポンプ９２、９３、９４を含む循環システムに接続される。サイトカインフィルタ９５はポンプ９２と直列に配置され、エンドトキシンフィルタ９６はポンプ９３と直列に配置され、酸素供給器９７および白血球フィルタ９８はポンプ９４と直列に配置される。赤血球懸濁バッグ９１の後に配置された懸濁弁９９が開かれると、赤血球懸濁液は、ポンプ９２、９３、９４によって、それぞれのフィルタ９５、９６、９８および酸素供給器９７を通って循環される。循環は、室温で約３０分間行うことができる。このようにして、赤血球懸濁液は、エンドトキシン、サイトカインおよび白血球が除去されるように調整される。さらに、赤血球懸濁液は酸素化される。
【0108】
評価溶液はバッグ１０１内に存在し、バルブ１０２を介して容器８２に接続されている。バルブが開くと、バルブ８６を開くことによって先にドレン８５に中身を流し空になった容器８２に、重力によって評価溶液が流れる。評価溶液を約３２℃の温度に加熱する。評価溶液をポンプ８９によって腎臓に循環させ、すると腎臓は３２℃の温度となる。次に、赤血球懸濁液は、図５に示されるように、バルブ９９および別の２つのバルブ１０３および１０４を開くことによって容器に添加される。懸濁液が重力によって容器８２に移送されてしまうと、赤血球懸濁弁９９が閉じられる。
【0109】
ここで、ポンプ９２、９３、９４は、容器８２内にある流体を、開いた弁１０４および１０３を通して、ならびにフィルタ９５、９６、９８を通して、および酸素供給器９７を通して送り出す。このようにして、評価液がエンドトキシン、サイトカインおよび白血球を含まないことが保証される。さらに、赤血球は酸素化される。ここで、例えば、ｐａＯ２、ＰａＣＯ２、ＨＣＯ３、酸素飽和度、Ｈｂ、Ｈｃｔ、乳酸塩、ブドウ糖、ｐＨなどの「血中」パラメータを測定することによって、腎臓を評価することができる。さらに、腎臓を光学的に検査することができる。抵抗値はポンプデータから計算できる。クレアチニンが評価液に添加される場合、クレアチニン濃度を含む尿産生を検査することができる。このようにして、腎臓が移植に適しているかどうかを調べる。
【0110】
そして、容器８２の内容物は、弁８６を開いてドレン８５に移送される。保存液１０５は、バルブ１０６を開くことによって容器８２に導入される。保存液は全ての赤血球を除去するために、２０～３０ｍｍＨｇの圧力および１２～１５℃の低温でポンプ８９によって循環される。さらに、腎臓がその重量を増加させることが起こり（又は、起こると）、保存液は、腎臓に蓄積した過剰な水を除去するためのアルブミンを含む。最長７日間（またはそれ以上）の保存期間の後、腎臓を移植する。
【0111】
さらなる実施形態を図５ａに示す。この装置は、赤血球（ＲＢＣ）懸濁液を洗浄するためのデバイス１１０（全て詳細には示されていない）を含む。バッグ１１１中の洗浄されたＲＢＣは、チューブ１１２およびバルブ１１３を介してコンディショニング容器１１４に移される。容器１１４は、第１のポンプ１１６、酸素供給器１１７、サイトカイン吸着器１１８、白血球フィルタ１１９、第１の弁１２０および第２の弁１２１を含む調整回路１１５を含む。さらに、バルブを備えた第１のコネクタ１２２が第１のバルブ１２０に接続され、バルブを備えた第２のコネクタ１２３が第２のバルブ１２１に接続される。
【0112】
第１および第２の弁１２０、１２１が開いており、コネクタ１２２、１２３の弁が閉じているとき、調整回路は容器１１４内に存在するＲＢＣ懸濁液中の白血球およびサイトカインを除去するために、酸素供給器１１７、白血球フィルタ１１９、およびサイトカイン吸着器１１８を通して容器１１４内の流体を循環させるためのポンプ１１６を作動させることによって、容器１１４内の流体を調整するように作動する。循環が少なくとも３０分間、例えば６０分間以上行われると、ＲＢＣ懸濁液が調整される。
【0113】
図５ａの右側に処理システム１３０が示されている。処理システムは、第１の弁付きコネクタ１２２に接続することができる第３の弁付きコネクタ１３２と、第２の弁付きコネクタ１２３に接続することができる第４の弁付きコネクタ１３３とを有する処理容器１３１を含む。
【0114】
処理容器１３１は、弁を備えたチューブを介して容器１３１に接続された３つの流体バッグ１３４、１３５、１３６を含む。このような弁を開くことによって、対応する流体バッグの流体を処理容器内に移して空にすることができる。廃棄物バッグ１３７が、弁を備えたチューブを介して処理容器の底部に接続されている。弁を開くことによって、容器１３１内の流体を廃棄物バッグ１３７に排出することができる。
【0115】
採取された腎臓１４０（腎臓）には、大動脈残渣または腎動脈（動脈）に接続する腎臓コネクタ１４１が提供される。腎臓コネクタ１４１は、容器内に設けられた容器コネクタ１４２に接続することができる。容器コネクタ１４２は、循環ポンプ１４３および酸素供給器１４４を備える腎臓循環システムに接続される。ポンプ１４３は治療容器内の流体を、その下部から、前記ポンプおよび酸素供給器を介して、前記容器コネクタ１４２および腎臓１４０の動脈に循環させる。腎静脈から放出された流体は、さらなる循環のために容器の内部に放出される。
【0116】
調整システムは処理容器１３１の底部に接続された第２のポンプ１４５を備え、これは処理容器１３１内の流体を、エンドトキシン吸着器１４６および白血球フィルタ１４７を通って処理容器に戻すようにポンピングするためのものである。
【0117】
２つの医療用注入ポンプ１４８、１４９が、腎臓の動脈への流れに医療用薬剤を注入するために配置される。注入ポンプは、シリンジポンプであってもよい。注入される薬剤は、ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ｔＰＡ、ＡＴＩＩＩ、血小板阻害剤、トロンビン阻害剤、凝固阻害剤などであり得る。医療用注入ポンプ１４８、１４９はさらなるシリンジポンプが接続され得るように、交換可能であり得る。
【0118】
処理容器から出て行く流体を加熱／冷却するために、ヒータ／クーラ１５０が配置されている。
【0119】
システムの動作は以下の通りである：
ＲＢＣ懸濁液は、公知の方法に従って洗浄システム１１０で洗浄される。洗浄が整うと、ＲＢＣ懸濁液は、バルブ１１３を開くことにより重力によって調整容器１１４に移される。
ＲＢＣ懸濁液は、公知の方法に従って洗浄システム１１０で洗浄される。洗浄が整うと、ＲＢＣ懸濁液は、バルブ１１３を開くことにより重力によって調整容器１１４に移される。
【0120】
調整容器１１４内の流体はバルブ１２０および１２１を開き、ポンプ１１６を作動させて、ポンプ１１６によって循環され、流体を白血球フィルタ１１９およびサイトカイン吸着器１１８を通して循環させ、それによって残存する白血球およびサイトカインを除去する。
【0121】
その間に、腎臓１４０が採取され、処理容器１３１内に配置され、腎臓コネクタ１４１を介して容器コネクタ１４２に接続される。この操作は、例えば遠隔の病院において、図５ａに示されるシステムの左側部分から離れたところで行われてもよい。
【0122】
処理容器１３１には、必要に応じて流体バッグ１３４、１３５、１３６から処理流体が供給される。使用時には、流体は廃棄弁を開くことによって廃棄物バッグ１３７に排出される。
【0123】
循環第２ポンプ１４５は、白血球及びエンドトキシンを連続的に除去するために、処理容器内の流体を白血球フィルタ１４７及びエンドトキシン吸着器１４６に通すために作動する。
【0124】
循環ポンプ１４３は、上述したように、酸素供給器１４４を介して容器から腎臓の動脈へ、さらに腎静脈を介して腎臓の治療のための容器へと流体を循環させるために作動される。
【0125】
医薬品ポンプ１４８、１４９は、医薬品を添加するために使用することができる。
【0126】
次いで、処置システム１３０は、弁付きコネクタ１２２を弁付きコネクタ１３２に接続し、弁付きコネクタ１２３を弁付きコネクタ１３３に接続し、弁１２３を除く弁を開くことによって、調整システム１１５にドッキングされる。第１の弁１２０は閉鎖され、第２の弁１２１は開放され、すると、ポンプ１１６は、コネクタ１２２、１３２を介して調整容器１１４内の流体を処理容器にポンピングするために作動される。次に、第２バルブ１２１を閉じ、バルブ１２３を開くと、ポンプ１１６は、処理容器１３１内の処理液を酸素供給器１１７、白血球フィルタ１１９、サイトカイン吸着器１１８を通して循環させる。
【0127】
処理は、上記の方法のいずれか１つに従うことができる。
【0128】
図５ｂに示されるように、処理容器１５１は２つの腎臓を別々に処理するように修正されてもよいが、それらはひとまとめにして（en-block）配置されてもよい。２つの腎臓には容器コネクタ１６２、１７２に接続された２つの腎臓コネクタ１６１、１７１が設けられており、これらは図に示すように、循環ポンプ１６３、１７３に接続されている。酸素供給器１６４は図示されるように、２つの循環システムのための共通ラインに接続される。このシステムでは、それぞれの別個の腎臓に、異なる治療のために、医療用注入ポンプ１６８、１６９および１７８、１７９を介して別個の医療薬を提供することができる。
【0129】
実施例１
回収前の手順：３０頭の豚に麻酔をかけ、正常通気（又は、正常換気／normoventilation）を達成させ、その後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止、循環停止が出現した。室温で２時間後、冷生理食塩水を腹腔および胸腔に導入し、その後、一時間、それ以上の処置は行わなかった。
回収前の手順：３０頭の豚に麻酔をかけ、正常通気（又は、正常換気／normoventilation）を達成させ、その後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止、循環停止が出現した。室温で２時間後、冷生理食塩水を腹腔および胸腔に導入し、その後、一時間、それ以上の処置は行わなかった。
【0130】
回収：循環停止３時間後、腎臓の回収のために手術を開始し、平均４５分を要した。
【0131】
バックテーブル手順：腎臓当たり、０．９％生理食塩水で２０ｍｌに希釈した０．５～１％のリドカイン１０ｍｌ中に約５００Ｕのヘパリンを注射した後、腎臓を、ＳＯＬＴＲＡＮ（腎臓還流液、Baxter Healthcare）で、バックテーブル上の腎動脈を通してフラッシュした。
【0132】
処置手順：腎臓をＡ群１１頭、Ｂ群１３頭、Ｃ群６頭ずつ片腎のみ、Ｄ群同じ６頭ずつのもう一方の腎臓の４群に分けた。
【0133】
Ａ群は、２時間の冷蔵で処理され、その後、移植された。
【0134】
Ｂ群は、２時間の冷蔵で処理され、続いて表Ｂに示される組成を有する溶液を使用して３７℃で９０分間再調整され、洗浄されたＲＢＣと混合されて約１５のｈｃｔにされ、続いて移植された。
【0135】
【0136】
Ｃ群は、製造元( Organ Recovery Systems)の指示に従って、Life Port Kidney TransporterおよびＫＰＳ(Kidney Perfusion Solution)を用いて腎臓を回収した直後４時間の間に低体温潅流を行い、続いて移植を行った。
【0137】
Ｄ群は、Ｃ群と同じドナーからの腎臓を、２時間の冷保存で処理し、続いて移植を行った。
【0138】
図６は、再潅流後および移植後９０分の観察後の動脈血流量（ｍｌ／分）の変化を示す。
【0139】
図７は、移植後９０分の平均尿産生をｍｌ／分で示す。Mann-Whitney U検定を用いた結果、再潅流時の流量は再調整Ｂ群の方が良好であり（ｐ＜０，０５）（図６）、再調整Ｂ群は、移植後９０分の尿産生も良好であった（ｐ＜０，０５）（図７）。
【0140】
実施例２
６頭の豚に麻酔を施し、正常換気を達成させた後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止が出現した。室温で２時間後、冷保存溶液（生理食塩水）を腹腔および胸腔に導入した。
６頭の豚に麻酔を施し、正常換気を達成させた後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止が出現した。室温で２時間後、冷保存溶液（生理食塩水）を腹腔および胸腔に導入した。
【0141】
死亡４時間後に腎臓の回収を開始した。
【0142】
腎臓は腎動脈を通して、腎臓当たり、０．９％生理食塩水で２０ｍｌに希釈された０．５～１％リドカイン１０ｍｌの中に約５００Ｕのヘパリンを注入した後、冷リンガー溶液でバックテーブル上にて洗い流した。
【0143】
腎臓を、図３に示すタイプのex-vivo潅流装置に接続し、０．４ｍｇのｔＰＡ(alteplas)および１５０Ｕのアピラーゼ(Sigma Aldrich、プリン作動薬（purinergic drug）－ＣＤ３９／ＣＤ７３）を、腎動脈を通して注入した。使用した溶液の組成を表Ｃに示す。
【0144】
溶液を、温度１５℃および圧力２０ｍｍＨｇで、３０分間、酸素化せずに潅流した。次いで、温度を３２℃に上昇させ、圧力を３０ｍｍＨｇに上昇させ、再調整フェーズで潅流をさらに９０分間続けた。次いで、洗浄した白血球濾過したＲＢＣを添加し、そして評価の間、潅流をさらに９０分間続けた。
【0145】
その後、腎臓を移植した。
【0146】
図８は、再潅流後および９０分後の腎臓の流れを示す。腎臓は微小循環を完全に除去せず（not clear）、腎臓の表面に潅流欠損を示した。線維素溶解薬ならびにプリン作動薬（アピラーゼ－ＣＤ３９／ＣＤ７３）－をex-vivo系に添加しても、血管抵抗および血流は実質的に改善されなかった。
【0147】
【0148】
実施例３
別の実験では、実施例２のプロトコールを繰り返したが、アピラーゼは与えなかった。代わりに、リドカインを潅流溶液に添加した。このアイデアはリドカインが示したＮａ＋Ｋ＋ポンプへの影響により、再調整フェーズ中の安定化効果を探すことであった。溶液の組成を表Ｄに見ることができる。
別の実験では、実施例２のプロトコールを繰り返したが、アピラーゼは与えなかった。代わりに、リドカインを潅流溶液に添加した。このアイデアはリドカインが示したＮａ＋Ｋ＋ポンプへの影響により、再調整フェーズ中の安定化効果を探すことであった。溶液の組成を表Ｄに見ることができる。
【0149】
【0150】
図９は最初の９０分の間の変化しない流れを示し、これは、通常、減少している。さらに、重量変化は浸透圧が３３０ｍｏｓｍであり、カリウムレベルが約５ｍｍｏｌ／Ｌであるという事実にもかかわらず、再調整の異なるフェーズ間で最小であった。実施例２では、腎臓が潅流の開始から再潅流の９０分後に終わるまで、重さが有意に増加した。
【0151】
実施例４
７頭の豚に麻酔を施し、正常換気を達成させ、その後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止が出現した。室温で２時間後、冷保存溶液（生理食塩水）を腹腔および胸腔に導入した。
７頭の豚に麻酔を施し、正常換気を達成させ、その後、人工呼吸器をオフにした。約１５分後に心停止が出現した。室温で２時間後、冷保存溶液（生理食塩水）を腹腔および胸腔に導入した。
【0152】
各豚の両腎臓の回収を死亡の４時間後に開始した。
【0153】
腎臓を、実施例２に記載されるように、腎動脈を通して、腎臓当たり、０．９％生理食塩水で２０ｍｌに希釈された０．５～１％リドカイン１０ｍｌ中約５００Ｕのヘパリンの注射後、冷リンガー溶液で、バックテーブル上にてフラッシュした。使用した溶液の組成を表Ｅに示す。
【0154】
【0155】
腎臓をex－vivoで３０分間、最初は１５℃および２０ｍｍＨｇの圧力で潅流した。次に、まずＯ２（２０％）、ＣＯ２（５，６％）およびＮ２（７４，４％）のガス混合物を使用して、潅流溶液を酸素化した。１時間後、この溶液を表Ｅの組成を有する新しい溶液と交換し、温度を３２℃に上げ、圧力を３０ｍｍＨｇに調節した。洗浄した白血球濾過したＲＢＣを加えて約１０～１５のｈｃｔとし、続いて５時間潅流した。次に潅流系から片方の腎臓を取り出し、レシピエントブタに移植（ｎ＝７）し、８時間まで９０分間観察した。ex－vivo潅流システム中の残りの腎臓を、比較のためにさらに９０分間潅流した。
【0156】
図１０に移植後の腎動脈血流量を示す。腎臓は機能しており、１０時間以上尿を産生していた（ｎ＝３）。１０時間まで続いた動物はほんのわずかであり、これは、流れの増加した広がりを説明する。実験の終了時、ブタはまだ麻酔下にあった。
【0157】
実施例５
別の実験では実施例４（ｎ＝５）と同じプロトコールに従って処理を行ったが、生体外潅流（ex-vivo perfusion）を６時間でなく１１時間継続した。流れは、再潅流で１０４ｍｌ／分、再潅流後１４．５時間で１０９ｍｌ／分であった。このように、潅流時間を延長しても、かなりの流れを生じ、腎臓の輸送時間を可能にし、レシピエントが到着するのを待つことができる。
別の実験では実施例４（ｎ＝５）と同じプロトコールに従って処理を行ったが、生体外潅流（ex-vivo perfusion）を６時間でなく１１時間継続した。流れは、再潅流で１０４ｍｌ／分、再潅流後１４．５時間で１０９ｍｌ／分であった。このように、潅流時間を延長しても、かなりの流れを生じ、腎臓の輸送時間を可能にし、レシピエントが到着するのを待つことができる。
【0158】
【0159】
実施例６
別の実験では、７匹のブタが実施例４と同じプロトコールに従って死亡宣告された。温虚血時間（ＷＩＴ）は４～６時間であった。
別の実験では、７匹のブタが実施例４と同じプロトコールに従って死亡宣告された。温虚血時間（ＷＩＴ）は４～６時間であった。
【0160】
死亡４時間後から、豚１頭あたり両腎臓を回収した。
【0161】
生体外潅流を１５℃で開始した。最初の１時間の間、７２ｇアルブミン／Ｌを使用し（表Ｅによる溶液）、潅流中の圧力は２０ｍｍＨｇであった。３０分後に酸素化を開始した。１時間後、溶液を排出し、温度を３２℃に上昇させ、圧力を３０ｍｍＨｇにし、ＲＢＣを添加した後、８０ｇアルブミン／Ｌの新しい溶液（表Ｆによる溶液）を２時間使用した。
【0162】
図１１に移植後の腎動脈血流量を示す。７つの腎臓はすべて、腎移植後４時間（１１８．７±１５．０ｍｌ／分）および８時間（８５．０±１０．５ｍｌ／分）良好な流れを示し、尿産生を維持した。実験は８時間後に、まだブタが麻酔下にある状態で終了した。観察期間中、血流は減少していたが、腎臓は観察終了時に良好な血流を依然として有していた。倫理的許可により、豚を起床させることはできなかった。
【0163】
【0164】
実施例７
別の実験では、４匹のブタが実施例４と同じプロトコールに従って死亡宣告した。腹部の氷を用いた局所冷却を２時間後に使用し、その結果、体温が、冷却剤として流体を用いた場合は２５℃から２９℃に変化したのに対し、３７℃から約２０℃に変化した。
別の実験では、４匹のブタが実施例４と同じプロトコールに従って死亡宣告した。腹部の氷を用いた局所冷却を２時間後に使用し、その結果、体温が、冷却剤として流体を用いた場合は２５℃から２９℃に変化したのに対し、３７℃から約２０℃に変化した。
【0165】
腎臓を回収したが、それによってＷＩＴ（温阻血時間）は４～５時間の間で変化した。
【0166】
腎臓を、５７ｇアルブミン／Ｌを高張性剤として用いた、表Ｇに記載される溶液の組成物でリンスした。腎臓が白くなるまで、２０ｍｍＨｇ～７０ｍｍＨｇまでの圧力を使用し、５分毎に圧力を５ｍｍＨｇ上昇させ、１８℃の温度を使用して、ex-vivo装置で腎臓をリンスした。十分に潅流された腎臓を得るには、平均２～３リットルの溶液および最大で５０分を要した。
【0167】
同じ溶液を用いて、温度を１２℃に下げ、腎臓を２０ｍｍＨｇで１時間潅流した。次いで、溶液を、表Ｆに見られる、８０ｇアルブミン／Ｌを含む、温度２８℃、および圧力３０ｍｍＨｇの溶液に変えた。ＲＢＣを添加して、最終のｈｃｔを約１０～１５にした。腎臓をこの溶液で２時間潅流した。次いで、温度を３２℃に上昇させ、腎臓をさらに１時間潅流した後、系を排液し、最初に使用した５７ｇアルブミン／Ｌを含む溶液を再び添加した。この溶液を用いて、移植前に、１５℃、および２０ｍｍＨｇの圧力で３０分間潅流を続けた。
【0168】
図１２に移植後の腎動脈流量を示す。回収後の腎臓の注意深い洗浄後に、再潅流後の高い流量を達成することができた。尿産生はレシピエントにおいて長期間維持されたが、長期観察時間後に低下し、これは数リットルの容量でのフラッシュが、内皮活性化によって遅れた結果に負の影響を及ぼし得ることを示す。さらに、４時間（１４５．７±２９．３ｍｌ／分）および８時間（９６．７３±１２．８ｍｌ／分）で、流れは、先の実施例１～５におけるように、腹腔および胸腔に導入された冷保存溶液による局所冷却よりも良好であり、２５℃～２９℃の温度を達成する。実験は、倫理的許可のため、ブタを麻酔下にある状態にしたまま終了した。
【0169】
実施例８
別の実験において、８匹のブタが実施例４に記載されるように死亡宣告されたが、局所冷却はされなかった。
別の実験において、８匹のブタが実施例４に記載されるように死亡宣告されたが、局所冷却はされなかった。
【0170】
死後４時間で腎臓を回収し、２００～５００ｍｌのPerfadexを用いてバックテーブル上で潅流した。いずれも潅流不良～中等度に乏しく、腎のクリアランスも不良であった。
【0171】
その後、腎臓を腎摘出豚に直ちに移植した。再潅流時の平均流量は、１４．１５ｍｌ／分および９０分３６．８ｍｌ／分であった。すべての腎臓は９０分後に青色／黒色を呈し、最後には尿の産生は認められなかった。この実験は対照としての役割を果たし、例えば本発明の実施形態による、いかなる冷却手順および他の処理もなしの場合、４時間のＷＩＴが、先の実験によると、移植設定において不十分な性能をもたらすことを示した。
【0172】
【0173】
実施例９
別の実験では、６匹のブタが上記の技術を用いて死亡宣告された。腹部に挿入した氷スラッシュを使用した局所冷却を２時間後に使用し、その結果、冷却剤として流体を使用した２５～２９℃および氷を使用した２０℃と比較して、体温が３７℃から約１０～１２℃に変化した。
別の実験では、６匹のブタが上記の技術を用いて死亡宣告された。腹部に挿入した氷スラッシュを使用した局所冷却を２時間後に使用し、その結果、冷却剤として流体を使用した２５～２９℃および氷を使用した２０℃と比較して、体温が３７℃から約１０～１２℃に変化した。
【0174】
腎臓は、４～５時間の間で変化するＷＩＴで回収した。
【0175】
バックテーブル上で、回収後、１０Ｕのｌｙｓ－プラスミノーゲンおよび２００ＵのアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）と混合した７２ｇ／Ｌアルブミン溶液（表Ｉ）を含む２０ｍｌの溶液を、静脈をクランプした後、腎動脈を通して各腎臓に注射し、次いで溶液を送達した後、動脈に注射した。
【0176】
腎臓を生体外（ex-vivo）装置に移した。１５分後、腎臓あたり１ｍｇのｔＰＡ（アルテプラス）および１００ＵのＡＴＩＩＩを注射し、７２ｇ／Ｌアルブミン溶液を含む２０ｍｌの溶液（表Ｉ）に希釈した後、５ｍｌの４つの部分に分割した。ｔＰＡを、２０ｍｍＨｇで開始し、毎回５ｍｍＨｇずつ増加させながら、２０℃の温度で５分間隔で腎動脈に注射した。
【0177】
ｔＰＡの注入完了後、腎臓を、７２ｇアルブミン／Ｌを含む溶液で潅流し、圧力を５分毎に５ｍｍＨｇずつ、５０～７０ｍｍＨｇまで、または腎臓が清浄されるまで（どちらか早いほう）上昇させた。次いで、温度を１２℃に下げ、潅流を２０ｍｍＨｇの潅流圧で１時間続けた。
【0178】
５７ｇ／Ｌアルブミンを含む溶液（表Ｈ）でリンスした後、第２の用量のｌｙｓ－プラスミノーゲン、続いてｔＰＡおよびＡＴＩＩＩを与え、５７ｇアルブミン／Ｌの溶液中に希釈し、上記のように動脈を通して連続的に与えた。
【0179】
次いで、潅流を３０分間、圧力２０ｍｍＨｇ、温度１２℃で続けた。ＲＢＣを５～１０のｈｃｔまで添加する前に、温度を２８℃および３０ｍｍＨｇの圧力まで上昇させた。ＲＢＣは外部ポンプによって２時間前処理し、溶液に添加する前に白血球フィルタを通して循環させた。これは、腎臓に接触する前に白血球を減少させるために行った。混合アルブミン溶液（５７ｇアルブミン／Ｌ、表Ｈ）およびＲＢＣを用いた潅流を１時間継続した。次いで、温度を３７℃に上昇させ、圧力を７０～９０ｍｍＨｇにして１時間評価した。赤血球（ＲＢＣ）含有溶液から腎臓をすすぎ、新しい５７ｇ／Ｌアルブミン溶液で満たし、温度を１５℃に下げた後、移植を行った。
【0180】
移植は、腎移植直前に自然腎を摘出した豚に実施した。３匹は麻酔から覚醒させた（新倫理的許可は１０日間の観察を許容する）。１匹の動物を３日目に調査し、腎臓の検査と新たな血液サンプルを採取した。投与された唯一の免疫抑制は再潅流時のステロイドであった。腎臓は良好に見え、血液中のクレアチニンは６１５μｍｏｌ／Ｌであった。４日目に別のブタを調査したところ、腎も良好であり、血中クレアチニンは８８４μｍｏｌ／Ｌであった。５日目に３番目のブタから試料を採取し、合計８日間追跡した。３頭とも移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）の徴候を示し、１例では８日後に尿毒症および死亡に至り、、他の２例では３日目および４日目に尿濃縮能の徴候として血中クレアチニンの上昇および尿中クレアチニンの高値が表れ屠殺された。
【0181】
図１３は、６匹のブタのそれぞれについて、再潅流後および９０分後の動脈血流を示す。ｌｙｓ－プラスミノーゲンとtPAを加えることにより、腎臓は以前よりも良好にみえ、抵抗は減少し、結果として微小循環が改善した。
【0182】
図１４は一部の腎臓が再潅流後に表面に斑点を示し、時には移植後数時間で青色／黒色の潅流不良な腎臓に発達し、凝固系による再血栓症または内皮に対する血小板／赤血球誘導作用のいずれかを示している。
【0183】
実施例１０
さらに３匹の豚において、実施例９のプロトコールが少数の例外を除いて繰り返された。
さらに３匹の豚において、実施例９のプロトコールが少数の例外を除いて繰り返された。
【0184】
回収後、バックテーブル上で、ｌｙｓ－プラスミノーゲンの注入を上記のように行った。１５分後、５７ｇアルブミン／Ｌ（表Ｈ）を含む５００ｍｌの溶液中２ｍｇのｔＰＡ（アルテプラス）を、腎臓を通してフラッシュした後、それらをex-vivo装置に取り出した。
【0185】
ex-vivo装置では、腎臓を、７２ｇ／Ｌアルブミンを含む溶液（表Ｉ）中、２４℃で、圧力を２０ｍｍＨｇから５０ｍｍＨｇと７０ｍｍＨｇとの間まで上昇させながら潅流した。同じ溶液を用いて、潅流を１２℃および２０ｍｍＨｇの圧力で２時間続けた。
【0186】
排水およびすすぎの後、５７ｇアルブミン／Ｌを含む溶液（表Ｈ）を、洗浄したＲＢＣと一緒に添加して、約５～１０のｈｃｔにし、温度を２８℃に変え、圧力を３０ｍｍＨｇにした。新たな用量のｌｙｓ－プラスミノーゲン、ｔＰＡ２ｍｇおよびＡＴＩＩＩ２００Ｕを添加し、温度を３２℃に上昇させ、続いて評価のために７０ｍｍＨｇの圧力で１５分間潅流した。リンスおよび洗浄後、５７ｇ／Ｌアルブミンを含む溶液（表Ｈ）を添加し、温度を１５℃に低下させた。３匹すべての豚を麻酔から離脱させ、観察した。２匹の動物は１０日間生存し、一方は血中クレアチン１６６μｍｏｌ／Ｌ、他方は血中クレアチン１７４μｍｏｌ／Ｌを有し、実験終了時の腎臓は正常に見えた。３匹目の豚は移植腎機能発現遅延で６日目に屠殺され、血中クレアチニンは１２３１μｍｏｌ／Ｌであったが、尿中クレアチニンは２０００μｍｏｌ／Ｌを超え、尿濃縮能が示された。免疫抑制の唯一の手段として、全レシピエントにステロイドを投与した。同種異系拒絶反応の組織学的研究のためにサンプルを採取した。
【0187】
図１５ａは、移植１０日後の正常に見える腎移植を示している。拒絶反応の肉眼的徴候はない。
【0188】
【0189】
図１５ｃは１０日間生存する第２の腎臓の表面を示し、暗点の領域を示し、影響を受けた微小循環を示す。
【0190】
図１５ｄは図１５ｃにおける移植された腎臓の切断面を示し、下部極における影響を受けた循環を伴う暗い領域を示す。データは微小循環の局所的損傷の危険性が残っているかもしれないが、治療が機能および構造の両方を回復することができることを示す
【0191】
実施例１１
１９匹のブタを含むさらなる実験において、サイトカインレベルを３つの群で測定した。サイトカインの吸着剤を全く含まない７２ｇ／Ｌアルブミン溶液（表Ｉ）で潅流された生きたドナー腎臓からなるＡ群（ｎ＝５）では、潅流の開始時、３時間、および３７℃の終わりに試料を採取した。サイトカインの吸着剤を全く含まない５７ｇ／Ｌアルブミン溶液（表Ｈ）で潅流された生きたドナー腎臓からなる群Ｂ（ｎ＝５）では、潅流の開始時、３時間、および３７℃の終わりに試料を採取した。Ｃ群（ｎ＝９）では、ＲＢＣおよび３７℃での潅流の前に、７２ｇ／Ｌのアルブミン溶液で９０分間、５７ｇ／Ｌのアルブミン溶液で９０分間潅流したＤＣＤ腎臓からなり、その間すべてサイトカイン吸着剤（Cytosorb、Cytosorbents）を使用した。分析にはELISAキット(Quantikine ELISAキット、R&D Biosystems)を用いた。検出レベル未満のレベルを０に設定し、次いで、各群内の測定レベルの平均レベルを計算した。
１９匹のブタを含むさらなる実験において、サイトカインレベルを３つの群で測定した。サイトカインの吸着剤を全く含まない７２ｇ／Ｌアルブミン溶液（表Ｉ）で潅流された生きたドナー腎臓からなるＡ群（ｎ＝５）では、潅流の開始時、３時間、および３７℃の終わりに試料を採取した。サイトカインの吸着剤を全く含まない５７ｇ／Ｌアルブミン溶液（表Ｈ）で潅流された生きたドナー腎臓からなる群Ｂ（ｎ＝５）では、潅流の開始時、３時間、および３７℃の終わりに試料を採取した。Ｃ群（ｎ＝９）では、ＲＢＣおよび３７℃での潅流の前に、７２ｇ／Ｌのアルブミン溶液で９０分間、５７ｇ／Ｌのアルブミン溶液で９０分間潅流したＤＣＤ腎臓からなり、その間すべてサイトカイン吸着剤（Cytosorb、Cytosorbents）を使用した。分析にはELISAキット(Quantikine ELISAキット、R&D Biosystems)を用いた。検出レベル未満のレベルを０に設定し、次いで、各群内の測定レベルの平均レベルを計算した。
【0192】
図１６ａは、主に赤血球からのＩＬ－６レベルの変化を示す図である。吸着剤（Ｃ群）は、ＩＬ－６の全ての徴候を効果的に除去した。
【0193】
図１６ｂはＩＬ－８レベルの変化を示す図であり、これも主にＲＢＣからのものであり、７２ｇ／Ｌアルブミン溶液よりも５７ｇ／Ｌからのものではない。吸着剤はＩＬ－８（Ｃ群）を除去した。
【0194】
図１６ｃは、主に赤血球からのＩＬ－１βレベルの変化を示す図である。吸着体は、腎臓自体または添加されたＲＢＣのいずれかから寄与したサイトカインの全ての徴候をやはり除去した。
【0195】
図１６ｄは、主に赤血球からのＴＮＦ－αレベルの変化を示す図である。吸着体は、腎臓自体または添加されたＲＢＣのいずれかから寄与したサイトカインの全ての徴候をやはり除去した。示されていないデータはＩＬ－１０レベルの分析を含み、ここでは、いずれの群においてもいずれのレベルも検出することができなかった。
【0196】
【0197】
実施例１２
別の実験において、ブタは、上記のプロトコールに従って死亡宣告され、２時間後に氷スラッシュで局所冷却し、４時間後に腎臓回収を開始した。
別の実験において、ブタは、上記のプロトコールに従って死亡宣告され、２時間後に氷スラッシュで局所冷却し、４時間後に腎臓回収を開始した。
【0198】
腎臓は４．５～５時間のＷＩＴで回収した。
【0199】
バックテーブルで、腎臓に１０Ｕのｌｙｓ－プラスミノーゲンと２ｍｇのｔＰＡをそれぞれ１５ｍｌ溶液中溶かして注射した。
【0200】
腎臓をex-vivo装置に配置し、潅流した。潅流溶液は５７ｇアルブミン／Ｌの濃度のアルブミンを含む表Ｊに見られる成分を含み、圧力を２０ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇに、５分毎に５ｍｍＨｇずつ増加させた。６００ＵのＡＴＩＩＩを、２ｍｇのアブシキシマブ（血小板阻害剤）と共に潅流フェーズ（２０℃）の間に使用した。
【0201】
排水し、アルブミン５７ｇ／Ｌを有する表Ｊの溶液２５０ｍｌで２回すすいだ後、アルブミン５７ｇ／Ｌを有する表Ｊの溶液を用いて１５℃で２時間、潅流を続けた。
【0202】
次いで、圧力を３０ｍｍＨｇに上昇させ、温度を２８℃に上昇させ、続いて３０分間潅流し、その後、赤血球（ＲＢＣ）を添加した。赤血球（ＲＢＣ）を、２ｍｇのアブシキシマブと共に８００ＵのＡＴＩＩＩで前処理し、白血球フィルタを通して潅流した後、溶液と混合した。腎臓は、パッチまたは影響された循環なしで、処理により完全に除去された。
【0203】
【0204】
腎臓を移植し、２匹の豚を７日間追跡してから屠殺した。１つの腎臓に感染が認められた。両豚とも７日目にクレアチニンが上昇し、血中クレアチニンは１１１５μｍｏｌ／Ｌ、１３０５μｍｏｌ／Ｌ、尿中クレアチニンは１７９０μｍｏｌ／Ｌ、４５３０μｍｏｌ／Ｌであった。これはＤＧＦの徴候と解釈される可能性があるが、尿を濃縮する腎機能が改善したとも解釈できる。
【0205】
図１７は約３００ｍｏｓｍの浸透圧を有する溶液で潅流し、ＡＴＩＩＩおよび血小板阻害剤を添加した後の流れを示す図である。この図は、以前の実験で見られたよりも、再潅流でのより高い初期流れを示す。
【0206】
実施例１３
別の実験では、実施例１２と同様のプロトコールを使用した。
別の実験では、実施例１２と同様のプロトコールを使用した。
【0207】
バックテーブルで、１５Ｕのｌｙｓ‐プラスミノーゲンと３ｍｇのｔＰＡをそれぞれ１５ｍｌ溶液中に溶かして注射した。
【0208】
腎臓をex-vivo装置に配置し、５７ｇアルブミン／Ｌの濃度のアルブミンを有する表Ｊに見られる成分を含む溶液で潅流した。６００ＵのＡＴＩＩＩを、３ｍｇのアブシキシマブと共に潅流フェーズ（２０℃）の間に使用した。２０ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇまで、５分毎に５ｍｍＨｇ、圧を上昇させた。
【0209】
排水し、アルブミン５７ｇ／Ｌを有する表Ｊの溶液２５０ｍｌで２回すすいだ後、アルブミン５７ｇ／Ｌを有する表Ｊの溶液で、１５℃で２時間潅流を続けた。このフェーズの間に、６００ＵのＡＴＩＩＩおよび３ｍｇのアブシキシマブの追加用量を添加した。
【0210】
次いで、圧力を３０ｍｍＨｇに上昇させ、温度を２８℃に上昇させ、続いて３０分間潅流し、その後、赤血球（ＲＢＣ）を添加した。赤血球（ＲＢＣ）は３ｍｇのアブシキシマブと共に８００ＵのＡＴＩＩＩで前処理し、溶液と混合する前に白血球フィルタを通して潅流した。
【0211】
２．５時間の潅流後、３０ｍｍＨｇの圧力での流れは１４７ｍｌ／分から１３８ｍｌ／分に減少し、抵抗は増加した。別の８００ＵのＡＴＩＩＩおよび３ｍｇのアブシキシマブを溶液に添加した。流れおよび抵抗は３０分間停滞したままであり、次いで流れは増加し、抵抗は減少した。
【0212】
実施例１４
６匹のブタを含む別の実験では、以下のプロトコールを使用した。
６匹のブタを含む別の実験では、以下のプロトコールを使用した。
【0213】
まず、ドナーの左腎を働かせたまま、生体ドナーの右腎を摘出し廃棄した。
【0214】
次に、レシピエントの左腎を回収し、ドナーの右腎を摘出した生体ドナーに直接移植した。
【0215】
レシピエントの腹部を閉じ、レシピエントは後の移植を待つ間、依然としてレシピエントの右腎が働いているまま、眠っていた。
【0216】
生体ドナーでは、ドナーに移植したレシピエントの左腎をドナーの血液で再潅流し、尿を産生するまで観察した。ドナーの腹部を閉じた。
【0217】
次いで、ドナーの心停止を、先の実施例と同様にして生じさせた。
【0218】
ドナーに移植されたレシピエントの左腎を、４．５～５時間のＷＩＴ後に回収した。
【0219】
バックテーブルで、動脈および静脈の両方をクランプしたまま、腎臓に２０ＵのＬｙｓ－プラスミノーゲンおよび６００ＵのＡＴＩＩＩを注射した。１５分後、４ｍｇのｔＰａを別の６００ＵＡＴＩＩＩと一緒に注射した。１５分後、腎臓をex-vivo潅流装置に接続した。
【0220】
【0221】
ex-vivo潅流装置において、腎臓を５７ｇアルブミン／Ｌを含む表Ｋの溶液で潅流した。７０ｍｍＨｇの圧で５分間潅流した後、潅流圧を３０ｍｍＨｇに下げ、腎臓を３０分間潅流した。次いで、圧力を２０ｍｍＨｇに下げ、温度を１５℃に下げて、腎臓を２時間潅流した。
【0222】
並行して、洗浄した赤血球（ＲＢＣ）を、室温で１時間、外部白血球フィルタを通して循環させた。循環赤血球（ＲＢＣ）に、１０００ＵＡＴＩＩＩ、３ｍｇアブシキシマブ、および４ｍｇアルガトロバン（直接抗トロンビン阻害剤）を添加した。
【0223】
サイトカインを吸着するCytosorb（登録商標）フィルタおよびエンドトキシンを吸着するAlteco（登録商標）フィルタをＮａＣｌと、表Ｋの溶液で洗浄し、次いで潅流機に取り付けた。
【0224】
潅流溶液の温度を２８℃に上昇させ、圧力を３０分間３０ｍｍＨｇに上昇させた。上記のＲＢＣを溶液に添加し、フィルタを、例えば図５に示すように接続した。環境を２８℃で安定化させた後、温度を３２℃に上げた。腎臓をこの温度で３時間潅流した。
【0225】
次に、１０００ＵのＡＴＩＩＩ、３ｍｇのアブシキシマブおよび８ｍｇのアルガトロバンを溶液に添加した。３２℃で１．５時間潅流した後、１．５ｍｇのアブシキシマブ、４ｍｇのアルガトロバン、および１０００ＵのＡＴＩＩＩを溶液に加えた。次いで、温度を１５℃に下げ、圧力を２０ｍｍＨｇに下げて、腎臓を３０分間潅流した。
【0226】
その後、腎臓を取り出し、レシピエントの腎臓をレシピエントに戻して移植し、残りのレシピエントの生来の腎臓を摘出した。流れと抵抗は図１８からわかる。
【0227】
実施例１５
９匹のブタを含む別の実験では、実施例１４と同じプロトコールを使用した。
９匹のブタを含む別の実験では、実施例１４と同じプロトコールを使用した。
【0228】
ドナーに移植されたレシピエントの左の腎臓を、４．５～５時間のＷＩＴ後に回収した。
【0229】
バックテーブルで、腎臓に、動脈および静脈の両方をクランプしたままで、３０ＵのＬｙｓ－プラスミノーゲンおよび６００ＵのＡＴＩＩＩを注射した。１５分後、６ｍｇのｔＰａを別の６００ＵＡＴＩＩＩと一緒に注射した。もう１５分後、腎臓を潅流機に接続した。
【0230】
ex-vivo潅流装置において、腎臓を５７ｇアルブミン／Ｌを含む表Ｋの溶液で潅流した。７５ｍｍＨｇの圧で５分間潅流した後、潅流圧を２５ｍｍＨｇに下げ、腎臓を３０分間潅流した。圧力を２０ｍｍＨｇに下げ、温度を１５℃に下げ、腎臓を２時間潅流した。
【0231】
並行して、洗浄した赤血球（ＲＢＣ）を、室温で１時間、外部白血球フィルタを通して循環させた。１０００ＵＡＴＩＩＩ、３ｍｇのアブシキシマブおよび４ｍｇのアルガトロバンを循環赤血球に添加した。
【0232】
サイトカインを吸着するCytosorb（登録商標）フィルタおよびエンドトキシンを吸着するAlteco（登録商標）フィルタをＮａＣｌと、表Ｋの溶液で洗浄し、次いで潅流機に取り付けた。
【0233】
潅流溶液の温度を２８℃に上昇させ、圧力を３０分間３０ｍｍＨｇに上昇させた。上記の赤血球（ＲＢＣ）を溶液に添加し、フィルタを接続した。環境を２８℃で安定化させた後、温度を３２℃に上げた。腎臓をこの温度で３時間潅流した。
【0234】
次いで、１０００ＵのＡＴＩＩＩ、３ｍｇのアブシキシマブおよび８ｍｇのアルガトロバンを腎臓に添加した。３２℃で１．５時間潅流後、１．５ｍｇのアブシキシマブ、４ｍｇのアルガトロバン、１０００ＵのＡＴＩＩＩを腎臓に加えた。
【0235】
実施例１６
実験１５と同様に、８匹のブタを含む別の実験では、ブタを先の実施例１４および１５と同じプロトコールに従って処置した。移植後、豚を麻酔から回復させ、最長３ヶ月間追跡調査した。１０日目および３ヵ月目の血漿中のクレアチニン、ならびに同じ時点の尿中のクレアチニンを、図１９～２２に示すようにデータで追跡した。クレアチニンは最初の１週間以内に正常化し、３か月の生存期間中正常に保たれ、透析を必要としなかった。図２３は典型的な腎臓を示し、再調整（リコンディショニング）および移植後３か月調査し、線維症または萎縮の徴候なしに十分に潅流した。図２４では、腎臓が取り除かれ、湾曲部に沿って切断されており、正常な腎実質が示されている。
実験１５と同様に、８匹のブタを含む別の実験では、ブタを先の実施例１４および１５と同じプロトコールに従って処置した。移植後、豚を麻酔から回復させ、最長３ヶ月間追跡調査した。１０日目および３ヵ月目の血漿中のクレアチニン、ならびに同じ時点の尿中のクレアチニンを、図１９～２２に示すようにデータで追跡した。クレアチニンは最初の１週間以内に正常化し、３か月の生存期間中正常に保たれ、透析を必要としなかった。図２３は典型的な腎臓を示し、再調整（リコンディショニング）および移植後３か月調査し、線維症または萎縮の徴候なしに十分に潅流した。図２４では、腎臓が取り除かれ、湾曲部に沿って切断されており、正常な腎実質が示されている。
【0236】
検討
実施例１では、循環死（ＤＣＤ）後４時間を超える温虚血時間（ＷＩＴ）に供されたドナーからの腎臓を再調整（ｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）する基本原理を、最小必須培地（ＭＥＭ）および高張剤としてアルブミンを含む溶液を用いて調査した。常温体外肝灌流は、持続灌流装置LifePort(LP)または低温保存（CS）保存対照よりも有意に良好な血流および尿産生をもたらした。
実施例１では、循環死（ＤＣＤ）後４時間を超える温虚血時間（ＷＩＴ）に供されたドナーからの腎臓を再調整（ｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）する基本原理を、最小必須培地（ＭＥＭ）および高張剤としてアルブミンを含む溶液を用いて調査した。常温体外肝灌流は、持続灌流装置LifePort(LP)または低温保存（CS）保存対照よりも有意に良好な血流および尿産生をもたらした。
【0237】
実施例２では、動脈と潅流液の両方に、ヘパリン、組織からＡＴＰを除去するプリン作動性阻害剤であるアピラーゼ、およびｔＰＡ（アルテプラス）を注入した後に、回収したＤＣＤ腎を広範囲にフラッシュすると、同様に構成された潅流液を用いて、血管抵抗および血流がわずかに改善し、腎臓を完全に除去することができなかった。アピラーゼは、微小循環によってフィブリン凝固物が除去された後に腎臓に運ばれる可能性がある。
【0238】
実施例３ではリドカインを添加したが、これは９０分で血流を改善し、おそらくＮａ＋Ｋ＋ポンプの阻害により安定化された膜機能を示唆する。
【0239】
実施例４ではさらに、３２℃でＲＢＣを用いた潅流時間の延長が可能であること、レシピエントブタに移植後８時間にわたっていくつかの腎臓を観察したこと、次の実施例５では、潅流時間が移植腎において機能が維持されたまま１１時間に延長されたことが注目された。
【0240】
実施例６では、より高いコロイド浸透圧（アルブミン８０ｇ／Ｌ）を有する薬剤が４～６時間のＷＩＴで１１５ｍｌ／分を超える良好な腎流を有する腎臓を産生することが見出された。レシピエントを移植後８時間追跡した。
【0241】
実施例７では、局所冷却を、死後２時間で、冷リンガー溶液から氷に変えた。これにより、冷リンガーを用いた２５℃～２９℃と比較して、中核体温は２０℃に低下した。血流量は移植後４時間、８時間ともに有意に改善した。
【0242】
局所冷却を受けておらず（実施例８を参照のこと）、そしてバックテーブル潅流のみを受けているブタは、再潅流（１４．１５ｍｌ／分）または９０分（３６．８ｍｌ／分）で良好な流れを示さなかった。
【0243】
実施例９および１０では、温度およびコロイド浸透圧を変化させ、通常の氷の代わりに氷スラッシュを導入した。採集前に１０～１２℃までの体温に達することができた。ｌｙｓ－プラスミノーゲンをｔＰＡと併用して腎臓を治療することにより、腎臓はより良好にクリアになり、血管抵抗は大幅に改善した。線維素溶解治療を施した血管の再血栓症を予防するためにＡＴＩＩＩを投与した。アルテプラーゼを使用したが、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼおよびテネクテプラーゼのような任意の線維素溶解薬を使用することができた。この変更は、先の実施例で見られたよりも良好に腎臓を除去した。これらの腎臓のうちいくつかは、移植時に生来の腎臓の腎摘出術が実施された後、機能している腎臓とともに１０日間生存し、ＤＣＤドナー由来の腎臓を死後４時間使用できることが証明された。評価期間中のＲＢＣ処理は、ＩＬ‐６，ＩＬ‐８、ＩＬ－１β，ＴＮＦ‐αなどのサイトカインの放出に寄与する可能性があり、これらは全て、炎症反応や虚血再潅流に関与していることが判明した。特定の吸着剤（Cytosorb）を使用することにより、これらのサイトカインを完全に除去することができた（実施例１１参照）。
【0244】
続く実施例１２および１３において、本発明者らは血小板阻害剤（例えば、アブシキシマブ）が保存溶液およびＲＢＣに、それらが潅流溶液と混合される前に添加されると、非常に良好な流れを生み出したことに注目した。さらに、ＲＢＣによる長期潅流中の血管抵抗の増加の徴候は、ＡＴＩＩＩおよびアブシキシマブを溶液に添加することによって改善することができ、これは、線維素溶解が終了した後に、凝固系および血小板接着の両方による再血栓症を予防することが所望されることを示す。ＡＴＩＩＩの用量は、先の実施例と比較して、これらの実施例において増加した。
【0245】
実施例１４および１５では、アルガトロバン等の直接トロンビン阻害剤を添加することにより、結果がさらに改善され、ＲＢＣフェーズの間の血流の減少および血管抵抗の増加の危険性を回避した。
【0246】
実施例１６では、実施例１４及び１５に従って再調整した腎臓を首尾良く移植し、３ヶ月まで追跡した結果、再調整した腎臓も関連する臨床設定で機能していることが証明された。実施例１４、１５および１６で使用された新規移植モデルは、最初に移植された腎臓が、心臓死が誘導される以前にレシピエントからドナーに移されたという事実のために、同種拒絶機構が排除されるということを意味する。再調整された腎臓がレシピエント豚の唯一の腎機能であったにもかかわらず、豚は透析を必要とせずに生存した。
【0247】
特許請求の範囲において、「含む／有する」という用語は他の要素又はステップの存在を排除するものではなく、更に、個々に列挙されているものの、複数の手段、要素又は方法ステップは例えば単一のユニットによって実施されてもよい。加えて、個々の特徴は異なる請求項又は実施形態に含まれてもよいが、これらは場合によっては有利に組み合わされてもよく、異なる請求項に含まれることは特徴の組み合わせが、実現可能でない及び／又は有利ではないことを意味するものではない。加えて、単数の言及は複数を排除するものではない。用語「１つの（a）」、「１つの（an）」、「第１の（first）」、「第２の（second）」等は複数を排除するものではない。クレーム中の参照符号は、単に明確な例として提供されるにすぎず、いかなる方法によってもクレームの範囲を限定するものと解釈してはならない。
【0248】
本発明は特定の実施形態および実験を参照して上述されたが、本明細書に記載された特定の形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、上記で特定されたもの以外の他の実施形態はこれらの添付の特許請求の範囲内で等しく可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図16d】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【国際調査報告】