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▶ ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージーの特許一覧 ▶ 株式会社生命科学インスティテュートの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-16
(54)【発明の名称】細胞集団を濃縮する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20220609BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560542
(86)(22)【出願日】2020-04-09
(85)【翻訳文提出日】2021-12-06
(86)【国際出願番号】 US2020027375
(87)【国際公開番号】W WO2020210429
(87)【国際公開日】2020-10-15
(31)【優先権主張番号】62/831,491
(32)【優先日】2019-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510144959
【氏名又は名称】ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー
(71)【出願人】
【識別番号】521442626
【氏名又は名称】株式会社生命科学インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ヤング，ワイズ
(72)【発明者】
【氏名】サン，ドンミン
(72)【発明者】
【氏名】タドモリ，イマン
(72)【発明者】
【氏名】レン，ズークゥアン
(72)【発明者】
【氏名】出澤 真理
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BA25
4B065BA30
4B065BB19
4B065CA44
(57)【要約】
本開示は、多系統分化ストレス耐性（ＭＵＳＥ）細胞を含む、望ましい細胞集団を分離するための効率的な方法を記載している。また、ソート、拡張、および再ソートの手順を通じてMUSE細胞を分離および濃縮する方法についても説明する。濃縮された細胞または細胞集団は、癌の治療、様々な組織の修復、および様々な変性疾患または遺伝性疾患の治療に使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、多系統ストレス耐性（ＭＵＳＥ）細胞を濃縮する方法：（ｉ）ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源を提供すること；
（ｉｉ）ＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞を含む第１の細胞集団を、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することによってＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離すること；
（ｉｉｉ）少なくとも前記第１の細胞集団の亜集団を培地中で培養すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を少なくとも１～１０代繰り返すこと；および、
（ｖ）ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、得られた培養細胞から濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団を分離し、それによって濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団の約８０％以上をＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞が構成するようにすること。
【請求項2】
さらに以下を含む、請求項１に記載の方法：ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から第２の細胞集団および第３の細胞集団を分離すること、
ここで、前記第２の細胞集団は、前記第１の細胞集団がＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離される前または後に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を選択することによって分離され、前記第３の細胞集団は、第１の細胞集団および第２の細胞集団がＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離された後に回収される。
【請求項3】
前記培養培地が塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２の細胞集団が、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記第３の細胞集団が、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３４＋内皮前駆細胞、またはＣＤ１３３＋多能性細胞を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源が動物の組織から得られる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記組織が、臍帯血、臍帯、臍帯間質細胞（ウォートンゼリー）、羊膜、胎盤、へその緒の裏打ち、月経血、末梢血、骨髄、皮膚、および脂肪からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記組織が臍帯血である、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源が間葉系細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源が単核細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記動物が哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項12】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の細胞集団を分離することが、ＳＳＥＡ３抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項14】
前記第２の細胞集団を分離することが、ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項15】
前記ＳＳＥＡ３抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記ＳＳＥＡ３抗体がマウスまたはラットのモノクローナルＩｇＧ抗体またはモノクローナルＩｇＭ抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＳＳＥＡ３抗体が磁性粒子に結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項20】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む、同種移植のための細胞治療用組成物。
【請求項21】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象の組織を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１９年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８３１，４９１号に基づく優先権を主張する。前述の出願は、参照により本明細書に援用される。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１９年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８３１，４９１号に基づく優先権を主張する。前述の出願は、参照により本明細書に援用される。
【0002】
［技術分野］
本発明は、一般に、望ましい細胞集団を濃縮するための方法、より具体的には、多系統分化ストレス耐性（ＭＵＳＥ）細胞を含む望ましい細胞集団を濃縮する方法およびその使用に関する。
本発明は、一般に、望ましい細胞集団を濃縮するための方法、より具体的には、多系統分化ストレス耐性（ＭＵＳＥ）細胞を含む望ましい細胞集団を濃縮する方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
多系統分化ストレス耐性（ＭＵＳＥ）細胞は、状態特異的な胚性抗原３（ＳＳＥＡ３）を発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のサブタイプである。ＭＵＳＥ細胞は、インビトロで内胚葉、外胚葉、中胚葉の系統細胞に自発的に分化するか、または３つの系統すべてから細胞型を産生するように誘導され得る。それらは自己複製し得るが、インビトロで奇形腫を形成しない。ＭＵＳＥ細胞は、スフィンゴシン－１を発現する組織に移動して、静脈内投与するとインビトロで損傷組織に統合され、組織の修復に必要な特定の細胞に分化し、動物で６か月以上生存する。ＭＵＳＥ細胞は、例えば、肝臓病、脳卒中、筋肉再生、皮膚再生、悪性神経膠腫、および心筋梗塞などの、多くの動物疾患モデルで組織再生を刺激して、機能を回復させる。動物へインビトロで移植後、腫瘍は報告されていない。ＭＵＳＥ細胞はまた、胚性幹（ＥＳ）および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と比較して、テロメラーゼ活性が低く、細胞周期遺伝子の発現が低い。
【0004】
ＭＵＳＥ細胞は、再生医療において他の幹細胞に比べていくつかの利点がある。第一に、それらは多能性の成体幹細胞であり、それ自体および他の多くの種類の細胞を産生して、多種多様な組織を修復し得る。第二に、ＭＵＳＥ細胞は多くの組織から分離されており、脂肪、骨髄、成人の血液、臍帯血、臍帯などの、自家の、および同種異系の供給源から入手され得る。第三に、ＭＵＳＥ細胞は、ＳＳＥＡ３と、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、およびＣＤ９０などの間葉系マーカーとの組み合わせによって識別され得る。間葉系細胞はプラスチックに付着してよく増殖するため、ウォートンゼリー（ＷＪ）またはコードライニング（ＣＬ）のプラスチックで培養された細胞のほぼ１００％が間葉系マーカーを発現する。プラスチック上で細胞を培養すると、細胞が間葉系集団になるように効果的に精製される。ＭＵＳＥ細胞は、ＳＳＥＡ３の発現のみに基づいて、プラスチック上で増殖した細胞培養物から選別およびカウントされ得ることが見出された。最後に、胚性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの他の多能性細胞とは異なり、ＭＵＳＥ細胞は奇形腫や他の腫瘍を形成しない。培養で増殖させた場合、それらの自己複製速度は非ＭＵＳＥ分化細胞の産生よりも遅いため、ＭＵＳＥ細胞の割合は培養で時間とともに常に低下する。
【0005】
ＳＳＥＡ３＋細胞は、ヤギの皮、ヒトの皮膚線維芽細胞、脂肪組織、および骨髄から培養された間葉系細胞の０．０３％～数％を構成する。ＭＵＳＥ細胞を分離するには、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が一般的に使用されるが、この方法は非効率的で費用がかかる（Ｈｅｎｅｉｄｉ， Ｓ．ら、 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１３． ８（６）： ｐ． ｅ６４７５２）。他のいくつかの方法としては、酵素の使用または細胞へのストレスの適用が挙げられ、他の細胞が死ぬ間生き残るためにＭＵＳＥ細胞のストレス耐性に依存している。これらの方法で精製された間葉系細胞の集団では、１１．６％のみがＭＵＳＥ細胞クラスターを形成し得た（Ｋｕｒｏｄａ， Ｙ．ら，ＰＮＡＳ， ２０１０． １０７（１９）： ｐ． ８６３９－４３； Ｄｅｚａｗａ， Ｍ．， Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ２０１６． ２５（５）： ｐ． ８４９－６１）。
【0006】
したがって、ＭＵＳＥ細胞などの細胞を高純度かつ高収率で得るための効率的な方法が依然として強く求められている。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、いくつかの態様で上記の必要性に対処する。一態様では、本開示は、ＭＵＳＥ細胞を濃縮するための方法を提供する。前記方法は以下を含む：（ｉ）ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源を提供すること；（ｉｉ）ＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞を含む第１の細胞集団を、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することによってＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離すること；（ｉｉｉ）少なくとも前記第１の細胞集団の亜集団を培地中で培養すること；（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を少なくとも１～１０代繰り返すこと；および、（ｖ）ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、得られた培養細胞から濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団を分離し、それによって濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団の約８０％以上をＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞が構成するようにすること。いくつかの実施形態では、前記培養培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、前記方法は、ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から第２の細胞集団および第３の細胞集団を分離することをさらに含み、前記第２の細胞集団は、前記第１の細胞集団がＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離される前または後に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を選択することによって分離され、前記第３の細胞集団は、第１の細胞集団および第２の細胞集団がＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離された後に回収される。いくつかの実施形態では、前記第２の細胞集団は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球を含む。いくつかの実施形態では、前記第３の細胞集団は、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３４＋内皮前駆細胞、またはＣＤ１３３＋多能性細胞を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源は、臍帯血、臍帯、臍帯間質細胞（ウォートンゼリー）、羊膜、胎盤、へその緒の裏打ち、月経血、末梢血、骨髄、皮膚、または脂肪などの動物の組織から得られる。いくつかの実施形態では、前記動物は哺乳動物（例えばヒト）である。いくつかの実施形態では、前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源は、間葉系細胞または単核細胞を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＳＳＥＡ３抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して、前記第１の細胞集団を分離する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して、前記第２の細胞集団を分離する。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記ＳＳＥＡ３抗体または前記ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体は、マウスのモノクローナルＩｇＧ抗体もしくはモノクローナルＩｇＭ抗体、またはラットのモノクローナルＩｇＧ抗体もしくはモノクローナルＩｇＭ抗体などのモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、前記ＳＳＥＡ３抗体または前記ＣＤ４およびＣＤ８抗体は磁性粒子に結合している。
【0012】
本開示の範囲内には、上記の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む医薬組成物もまた含まれる。
【0013】
他の態様では、本開示は上記の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む同種移植のための細胞治療用組成物を提供する。
【0014】
さらに他の態様では、本開示は対象（例えばヒト）の組織を再生する方法を提供する。前記方法は、上記の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞の有効量を対象に投与することを含む。
【0015】
前述の概要は、開示のすべての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、以下の詳細な説明などの他のセクションで説明されている。文書全体は、統一された開示として関連することを意図しており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文、段落、またはこのセクションに一緒に見つからない場合でも、ここで説明する機能のすべての組み合わせが意図されているものと理解する必要がある。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、開示の思想および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特定の例は、開示の特定の実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図3】図３は、ＭＵＳＥ細胞を濃縮するための開示された方法を実施するための装置を示す。前記装置は、それぞれ２つの注ぎ口を備えた２つの容器（容器１および容器２）を含む。注ぎ口Ｂは、他の容器の注ぎ口Ｂにチューブで接続されているため、液体の内容物を容器１から容器２に注ぎ得る。前記容器は、抗体でコーティングされた磁性マイクロビーズに付着した細胞を引き付けるために、各容器を取り囲む磁石（切り欠き）を含み得る。
【図5A】図５Ａおよび図５Ｂ（総称して「図５」）は、コードライニング（ＣＬ）細胞（図５Ａ）およびウォートンゼリー（ＷＪ）細胞（図５Ｂ）におけるＣＤ１０５＋およびＳＳＥＡ３＋／ＣＤ１０５＋の発現レベルを示す。灰色のバーは、ＣＤ１０５＋を発現している細胞の割合を示している。黒いバーは、ＣＤ１０５およびＳＳＥＡ３の両方を発現している細胞の割合を示している。番号は様々なサンプルを示している。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、パッセージ１、２、および３を示す。一元配置分散分析は、ＳＳＥＡ３＋の割合がＣＬグループのＰ０とＰ１との間、およびＷＪグループのＰ０とＰ２との間で急激に低下したことを示している。
【図5B】図５Ａおよび図５Ｂ（総称して「図５」）は、コードライニング（ＣＬ）細胞（図５Ａ）およびウォートンゼリー（ＷＪ）細胞（図５Ｂ）におけるＣＤ１０５＋およびＳＳＥＡ３＋／ＣＤ１０５＋の発現レベルを示す。灰色のバーは、ＣＤ１０５＋を発現している細胞の割合を示している。黒いバーは、ＣＤ１０５およびＳＳＥＡ３の両方を発現している細胞の割合を示している。番号は様々なサンプルを示している。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、パッセージ１、２、および３を示す。一元配置分散分析は、ＳＳＥＡ３＋の割合がＣＬグループのＰ０とＰ１との間、およびＷＪグループのＰ０とＰ２との間で急激に低下したことを示している。
【図6】図６Ａは、ウォートンゼリー細胞の位相差画像（１０倍）を示している。図６Ｂは、コードライニング細胞の位相差画像（１０倍）を示している。組織は破線の円に播種され、そこでＭＳＣが成長し始めた。スケールバーは１００μｍを示す。
【図7A】図７は、ＨＵＣ由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析を示している。サンプルは９６ＷＪＰ２から採取された。ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ａを使用して破片から細胞をゲーティングし、ＦＳＣ－ＨおよびＦＳＣ－Ａを使用してクラスター以外の単一の細胞をゲーティングした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して、死んだ細胞を除去した。結果は、全細胞の９２．９８％が生存しており、１．５５％がＳＳＥＡ３＋であり、９９％以上がＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１６６＋、およびＣＤ２９＋であったことを示している。細胞はＣＤ１４－およびＣＤ４５－であった。
【図7B】図７は、ＨＵＣ由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析を示している。サンプルは９６ＷＪＰ２から採取された。ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ａを使用して破片から細胞をゲーティングし、ＦＳＣ－ＨおよびＦＳＣ－Ａを使用してクラスター以外の単一の細胞をゲーティングした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して、死んだ細胞を除去した。結果は、全細胞の９２．９８％が生存しており、１．５５％がＳＳＥＡ３＋であり、９９％以上がＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１６６＋、およびＣＤ２９＋であったことを示している。細胞はＣＤ１４－およびＣＤ４５－であった。
【図8A】図８は、９６ＷＪＰ２から磁気的に活性化されたセルソーティング（ＭＡＣＳ後）で単離されたＳＳＥＡ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示している。選別直後にサンプルを分析した。全細胞の約８９．８４％が生存していた。分類された集団の９２．３１％はＳＳＥＡ３＋であったが、他の７．２７％は直径によると破片のようであった。９９．５％以上が、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ１６６＋であった。細胞はＣＤ１４－およびＣＤ４５－であった。
【図8B】図８は、９６ＷＪＰ２から磁気的に活性化されたセルソーティング（ＭＡＣＳ後）で単離されたＳＳＥＡ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示している。選別直後にサンプルを分析した。全細胞の約８９．８４％が生存していた。分類された集団の９２．３１％はＳＳＥＡ３＋であったが、他の７．２７％は直径によると破片のようであった。９９．５％以上が、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ１６６＋であった。細胞はＣＤ１４－およびＣＤ４５－であった。
【図9】図９は、次の１０代におけるＭＡＣＳ後のＳＳＥＡ３＋細胞の変化率を示している。９６ＷＪ－Ｐ２－ＭＡＣＳ－Ｐ０は磁気選別の直後であり、全集団の９３．７７％はＳＳＥＡ３＋であったが、ＣＤ１４－であった。他の６．１９％は直径に応じた破片であった。選別された細胞を培養し、次の継代の細胞を４日ごとに収集した。最初の継代では、ＳＳＥＡ３＋の割合は１４．８％に減少したが、ＳＳＥＡ３＋の割合はＰ２からＰ５の間で６２．５％～７５．９％の範囲であった。ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、Ｐ６からＰ９の間で４２．０％～５４．７％に低下した。Ｐ１０においても、培養物には３７．３％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。Ｐ１０の後、細胞は再選別され、８９．４％のＳＳＥＡ３＋培養が達成された。すべての継代で、ＣＤ１０５＋の割合は９９．０％を超えたままであった。
【図10】図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、９６ＣＬ継代１の染色を示す。図１０Ａは、９６ＣＬ継代１のヘキスト染色を示す。図１０Ｂは、９６ＣＬ継代１のＫｉ－６７染色を示している。図１０Ｃは、図１０Ａおよび図１０Ｂのマージされた画像を示す。抗原Ｋｉ－６７は、増殖細胞のマーカーである核タンパク質である。全細胞の約６５％がＫｉ－６７＋であり、集団の増殖が非常に活発であったことを示している。スケールバー＝５０μｍ。
【図11】図１１は、ＭＡＣＳ後１０継代でのＭＵＳＥおよび非ＭＵＳＥ細胞の倍加時間（ＴＤ）を示している。左軸は、ＭＵＳＥ細胞と非ＭＵＳＥ細胞の細胞倍加の時間を示している。右軸はＭＵＳＥ細胞の割合を示している。Ｐ１のＭＵＳＥ細胞のＴＤは４０３時間であり、ほとんど増殖しなかったことを示しているが、非ＭＵＳＥ細胞では１４．４時間であった。Ｐ２からＰ７まで、ＭＵＳＥ細胞のＴＤは２４．９±５．４時間であり、ＭＵＳＥ細胞の数が約１日１回倍増したことを示し、Ｐ８からＰ１１まで、ＴＤは３９．８±５．４時間に増加した。非ＭＵＳＥ細胞に関しては、ＴＤはＰ２からＰ１１まで３１．２±７．８時間で非常に安定していた。そのデータは、Ｐ２からＰ７が数百万のＭＵＳＥ細胞を達成するために再分類するための最良の継代であったことを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【0017】
［発明の詳細な説明］
本開示は、例えば、ヒト臍帯（ＨＵＣ）から単離された間葉系細胞から、効率的かつ安価に多数の健康なＭＵＳＥ細胞を単離および濃縮する方法を記載している。一例では、前記方法は、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用してＳＳＥＡ３＋細胞を単離し、続いて培養で細胞を増殖させ、次に２番目のＭＡＣＳ手順を使用して約８０％以上のＳＳＥＡ３＋細胞を含む高純度の細胞集団を取得する。
本開示は、例えば、ヒト臍帯（ＨＵＣ）から単離された間葉系細胞から、効率的かつ安価に多数の健康なＭＵＳＥ細胞を単離および濃縮する方法を記載している。一例では、前記方法は、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用してＳＳＥＡ３＋細胞を単離し、続いて培養で細胞を増殖させ、次に２番目のＭＡＣＳ手順を使用して約８０％以上のＳＳＥＡ３＋細胞を含む高純度の細胞集団を取得する。
【0018】
開示された方法は、いくつかの局面において有利である。第一に、前記方法は穏和で、細胞に損傷を与えない。前記抗ＳＳＥＡ３抗体でコーティングされたビーズは、細胞表面のＳＳＥＡ３に結合し、細胞を容器の壁に適用された磁石に向かって移動させ、ＳＳＥＡ３を発現していない細胞を通過させる。第二に、前記方法は非常に効率的であり、数十億の細胞を数分で分類し得る。第三に、前記方法は非ＭＵＳＥ細胞を保存し、それらが通過し、分析され、または再度分類させる。これは、ＭＵＳＥ処理と比較するための対照細胞としても使用され得る。第４に、ＭＡＣＳで選別された細胞はＣＤ３４＋細胞の臨床試験で長い間使用されてきたため、前記単離されたＭＵＳＥ細胞には規制上の障壁がほとんど、またはまったくないはずである（Ｒｉｃｈｅｌ， Ｄ．Ｊ．ら， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ２０００． ２５（３）： ｐ． ２４３－９）。最後に、前記方法では、ＳＳＥＡ３＋細胞の純度が比較的高く（例えば、＞８０％ＳＳＥＡ３＋細胞）、ＭＡＣＳを使用した以前に公開された、７７．１％および７１．３％の単離されたＭＵＳＥ細胞が得られた研究（Ｕｃｈｉｄａ， Ｈ．ら， Ｓｔｒｏｋｅ， ２０１７． ４８（２）： ｐ． ４２８－４３５； Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ．ら， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ， ２０１５． ４（２）： ｐ． １４６－５５）よりも優れている。
【0019】
本開示はまた、Ｔリンパ球およびＮＫリンパ球、ＳＳＥＡ３＋ ＭＵＳＥ細胞、ならびにＣＤ３４＋内皮前駆細胞およびＣＤ１３３＋多能性幹細胞を有するＣＤ１４＋単球などの細胞の望ましい集団を開始細胞（例えば、単核細胞）から分離するための効率的な方法を記載する。前記リンパ球は、ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体でコーティングされたマイクロビーズで選択できる。それらは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変して、特定の腫瘍を標的とするＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ－ＮＫ細胞を産生し得る。前記ＭＵＳＥ細胞は、ＳＳＥＡ３抗体でコーティングされたマイクロビーズで選択して、付着培養で増殖させて、多数の多能性ＭＵＳＥ細胞を産生し得る。ＭＵＳＥ細胞は、肝臓、肺、心臓、腎臓、脳、およびその他の組織の修復に使用され得る。残りの細胞は、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３４＋内皮前駆細胞、および／またはＣＤ１３３＋多能性細胞が豊富であり、これらは成長因子を分泌して脊髄および脳を再生するＭ２マクロファージの供給源であると考えられている。これらの３つの細胞集団は、臨床状態およびタイミングに応じて、様々な比率で投与され得る。
【0020】
１．望ましい細胞集団を濃縮する方法
図１Ａは、ＭＵＳＥ細胞を濃縮するための方法を示している。前記方法は以下を含む：（ｉ）１０１において、ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源を提供すること；（ｉｉ）１０３において、ＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞を含む第１の細胞集団を、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することによってＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離すること；（ｉｉｉ）１０５において、少なくとも前記第１の細胞集団の亜集団を培地中で培養すること；および（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を少なくとも１～１０代繰り返すこと（例えば、少なくとも１代、少なくとも２代、少なくとも３代、少なくとも４代、少なくとも５代、少なくとも６代、少なくとも７代、少なくとも８代、少なくとも９代、少なくとも１０代）。１０７において、前記方法は、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、得られた培養細胞から濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団を分離し、それによって濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団の約８０％以上をＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞が構成するようにすること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源は、間葉系細胞または単核細胞を含む。
図１Ａは、ＭＵＳＥ細胞を濃縮するための方法を示している。前記方法は以下を含む：（ｉ）１０１において、ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源を提供すること；（ｉｉ）１０３において、ＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞を含む第１の細胞集団を、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することによってＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離すること；（ｉｉｉ）１０５において、少なくとも前記第１の細胞集団の亜集団を培地中で培養すること；および（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を少なくとも１～１０代繰り返すこと（例えば、少なくとも１代、少なくとも２代、少なくとも３代、少なくとも４代、少なくとも５代、少なくとも６代、少なくとも７代、少なくとも８代、少なくとも９代、少なくとも１０代）。１０７において、前記方法は、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、得られた培養細胞から濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団を分離し、それによって濃縮ＭＵＳＥ細胞の集団の約８０％以上をＳＳＥＡ３＋ＭＵＳＥ細胞が構成するようにすること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源は、間葉系細胞または単核細胞を含む。
【0021】
図１Ｂは、ＭＵＳＥ細胞を濃縮する方法の例を示している。第一に、前記ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源は、例えば、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、ＭＡＣＳ単離の対象となる。第二に、前記単離されたＭＵＳＥ細胞の亜集団は、少なくとも１～１０代培養され得る。次に、得られた培養細胞は、例えば、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、ＭＵＳＥ細胞を濃縮するために２回目のＭＡＣＳ単離に供される。前記濃縮されたＭＵＳＥ細胞は、移植を含む様々な用途に使用され得る。前記濃縮されたＭＵＳＥ細胞の使用は、本開示の後半のセクションでさらに説明される。
【0022】
「培養」という用語は、細胞が増殖し、老化を回避し得る条件下で細胞を維持することを指す。例えば、細胞は、１つ以上の成長因子、すなわち成長因子カクテルを含む培地で培養されていてもよい。
【0023】
「増殖」という用語は、インビトロでの細胞の培養を指す。そのような細胞は、哺乳動物、および、適切な環境、例えば、成長因子を含む培地での培養によって生成される追加の量の細胞から抽出され得る。可能であれば、安定した細胞株を確立して、細胞を継続的に増殖させる。
【0024】
細胞を培養／増殖させるための培地は、細胞の増殖を助けるために使用される基礎培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＧＩＢＣＯ）であり得る。前記培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、前記培地には、約０．１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが含まれ得る（例えば、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ）。いくつかの実施形態では、前記培地は、約１％～約２０％のＦＢＳ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－１、約０．１％～約５％のＰＳＡ、および約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含み得る。いくつかの実施形態では、前記培地は、約１％～約２０％のＦＢＳ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－１、約０．１％～約５％のＰＳＡ、および約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地である。いくつかの実施形態では、前記培地は、約１０％ＦＢＳ、約２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ、約１％ＰＳＡ、および約１ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地である。
【0025】
図２は、望ましい細胞集団を濃縮する方法を示している。前記方法は以下を含む：２０１において、ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源を提供すること；ならびに、（ｉｉ）２０３において、開始細胞から、第１の細胞集団、第２の細胞集団、および第３の細胞集団を分離すること。２０３ａにおいて、ＳＳＥＡ３＋細胞を選択することにより、前記第１の細胞集団が得られる。２０３ｂにおいて、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を選択することにより、前記第２の細胞集団が得られる。２０３ｃにおいて、前記第３の細胞集団は、前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団が、ＭＵＳＥ細胞の細胞源または組織源から分離された後に回収される。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記第２の細胞集団は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球を含む。いくつかの実施形態では、前記第３の細胞集団は、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３４＋内皮前駆細胞、またはＣＤ１３３＋多能性細胞を含む。
【0027】
前記第１の細胞集団の単離および前記第２の細胞集団の単離は、いずれかの順序で実施され得る。一例では、前記第１の細胞集団を単離することは、前記第２の細胞集団を単離する前に実行される。他の例では、前記第１の細胞集団の分離は、前記第２の細胞集団を分離した後に実行される。
【0028】
いくつかの実施形態では、前記第１の細胞集団は、ＳＳＥＡ３抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して分離される。いくつかの実施形態では、前記第２の細胞集団は、ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体を含む免疫親和性ベースの試薬を使用して分離される。
【0029】
いくつかの実施形態では、前記ＳＳＥＡ３抗体または前記ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体は、マウスのモノクローナルＩｇＧ抗体もしくはモノクローナルＩｇＭ抗体、またはラットのモノクローナルＩｇＧ抗体もしくはモノクローナルＩｇＭ抗体などのモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、前記ＳＳＥＡ３抗体または前記ＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体は磁性粒子に結合している。
【0030】
前記ＣＤ４抗体の非限定的な例としては、４Ｂ１２（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＮＢＰ１－１９３７１（ＮＯＶＵＳ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ）、ＭＡＢ３７９１（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、およびＭＴ３１０（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）が挙げられる。
【0031】
前記ＣＤ８抗体の非限定的な例としては、ＹＴＳ１６９．４ラット抗マウスＣＤ８抗体（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、マウス抗ラットＣＤ８抗体（ＮＯＶＵＳ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ）、抗マウスＣＤ８ａ抗体（ＤＩＡＮＯＶＡ）、ヤギ抗ネコＣＤ８ポリクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ）などが挙げられ得る。抗ヒトＣＤ８抗体、すなわち、マウス抗ヒトＣＤ８抗体クローンＲＡＶＢ３（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）、ａｂ４０５５およびａｂ２０３０３５（ＡＢＣＡＭ）、ＹＴＳ１６９．４（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、ＭＡＢ１５０９（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、ならびに３２－Ｍ４（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、も同様に利用可能である。
【0032】
前記ＳＳＥＡ３抗体の非限定的な例としては、ＭＡ１－０２０およびＭＣ－６３１（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＬＳ－Ｃ１７９９３８（ＬＳＢｉｏ）、および１５Ｂ１１（ＩＢＬ）が挙げられ得る。
【0033】
いくつかの実施形態において、単球（ＣＤ１４＋単球など）を分離することは有用である。単球はＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージの前駆体であり、損傷した組織の浄化および修復の促進に重要である。単球はまた、免疫系を活性化するための抗原提示において役割を果たす樹状細胞に分化し得る。ＣＤ１４抗体は、単球の分離によく使用される。ＣＤ１４は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＰＢ）の存在下でリポ多糖（ＬＢＳ）に結合するが、リポテイコ酸などの他の病原体関連分子も認識する。市販のＣＤ１４抗体としては、ＵＣＨＭ－１（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＳＩＧＭＡ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ）、抗ＣＤ１４抗体（ＳＩＮＯ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ）、５Ａ３Ｂ１１Ｂ５ ＣＤ１４抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、４Ｂ４Ｆ１２抗ＣＤ１４抗体（ＡＢＣＡＭ）、クローンＭ５Ｅ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＨＣＤ１４ ＣＤ１４抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ１４抗体（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、ヒトＣＤ１４抗体ＭＡＢ３８３２－１００（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、ＣｌｏｎｅＴuＫ４（ＢＩＯ－ＲＡＤ）など、が挙げられるが、これらに限定されない。
【0034】
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性抗体）、および抗体フラグメントを含む。したがって、本明細書内の文脈のいずれかで使用される「抗体」という用語は、いずれかの特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ）；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（単鎖または関連エンティティ）を含むがこれらに限定されない、生物学的に関連するフラグメントまたはその特異的結合メンバー、を含むがこれらに限定されないことを意味する。当技術分野では、抗体は、ジスルフィド結合またはその抗原結合部分によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を有する糖タンパク質であることが理解される。本明細書で使用される「抗体」の定義には、キメラ抗体、ヒト化抗体、および組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から生成されたヒト抗体、ならびに当業者が利用し得る濃縮技術を使用してライブラリーから選択された抗体、も含まれる。
【0035】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、前記集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に発生し得る突然変異を除いて同一である。「ポリクローナル抗体」という用語は、異なる決定基（「エピトープ」）に対して向けられた異なる抗体を含む調製物を指す。
【0036】
いくつかの実施形態では、開示された方法によって単離および／または濃縮された細胞は、実質的に純粋である。「実質的に純粋な」という用語は、特定の細胞が調製物中の細胞の実質的な部分または大部分（すなわち、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上）を構成することを意味する。一般に、実質的に精製された細胞集団は、調製物中の細胞の少なくとも約７０％、通常は調製物中の細胞の約８０％、特に調製物中の細胞の少なくとも約９０％（例えば、９５％、９７％、９９％、１００％）を構成する。
【0037】
図３は、開示された方法を実施するための装置を示している。前記装置によって、２つの連続したＭＡＣＳソートにより、臍帯血由来単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）などの様々なソースから３つの細胞集団を分離し得る。前記装置は、それぞれ２つの注ぎ口を備えた２つの容器（例えば、容器１および容器２）を含む。注ぎ口Ｂは、別のコンテナの２番目の注ぎ口Ｂにチューブで接続されている。２つの注ぎ口Ｂを接続するチューブを通して、液体内容物を一方の容器から他方の容器に注ぎ得る。前記装置はまた、抗体でコーティングされた磁性マイクロビーズに付着した細胞を引き付けるために、各容器を取り囲む磁石（切り欠き）を含む。前記磁石が存在する場合、前記抗体でコーティングされたマイクロビーズは容器内に保持される。前記細胞懸濁液は注ぎ口Ａから注入され、注ぎ口Ｂから注がれる。残りの細胞懸濁液を、注ぎ口Ｃから注ぎ得る。細胞の別々の集団は、再利用可能な磁石が取り外された後、２つの容器で直接洗浄され、注ぎ口Ａおよび注ぎ口Ｃを介して容器から収集される。一例では、容器１は、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球を選択するためのＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズを含み得て、容器２は、ＳＳＥＡ３＋ ＭＵＳＥ細胞を選択するためのＳＳＥＡ３抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズを含み得る。他の例では、容器１は、ＳＳＥＡ３＋ ＭＵＳＥ細胞を選択するためのＳＳＥＡ３抗体被覆磁気マイクロビーズを含み得て、容器２は、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球を選択するためのＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体被覆磁気マイクロビーズを含み得る。
【0038】
本明細書で使用される場合、「ＭＵＳＥ細胞」という用語は、Ｋｕｒｏｄａら、２０１０およびＷａｋａｏら、２０１１、ならびに、その内容が本明細書においてその全体を参照することにより援用されている米国特許出願第２０１２０２４４１２９号および第２０１１００７０６４７号に記載されている多能性幹細胞を指す。より具体的には、ＭＵＳＥ細胞は、単一の細胞から３つすべての胚葉の特徴を有する細胞を生成し得る特定のタイプの動物（例えば、ヒト）間葉系多能性幹細胞を指す。ＭＵＳＥ細胞はストレス耐性があり；接着培養（線維芽細胞に似ている）における一般的な間葉系細胞と形態学的に区別がつかず；多能性マーカーおよびアルカリホスファターゼ染色に陽性の浮遊培養でＭクラスターを形成し得て；自己複製し得て；増殖活性はそれほど高くなく、免疫不全のマウス精巣で奇形腫を形成することは示されておらず；インビトロおよびインビボの両方で内胚葉、外胚葉、および中胚葉細胞に分化し得て；ＣＤ１０５およびＳＳＥＡ３の両方で陽性である。
【0039】
ＭＵＳＥ細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２などの多能性マーカーも発現し得て、ＮＧ２（血管周囲細胞のマーカー）、ＣＤ３４（内皮前駆細胞および脂肪由来幹細胞のマーカー）、フォンウィルブランド因子（内皮前駆細胞のマーカー）、ＣＤ３１（内皮前駆細胞のマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ、メラノブラストのマーカー）、ＣＤ１４６（血管周囲細胞および脂肪由来幹細胞のマーカー）、ＣＤ２７１（神経堤由来幹細胞のマーカー）、Ｓｏｘ１０（神経堤由来幹細胞のマーカー）、Ｓｎａｉｌ（皮膚由来前駆細胞のマーカー）、Ｓｌｕｇ（皮膚由来前駆細胞のマーカー）、フローサイトメトリー分析またはＲＴ－ＰＣＲによるＴｙｒｐ１（メラノブラストのマーカー）およびＤｃｔ（メラノブラストのマーカー）に対して陰性である。
【0040】
骨髄、線維芽細胞、または脂肪組織からのＭＵＳＥ細胞は、数および成長能力が制限されている。前記細胞は骨髄穿刺液に豊富ではなく、骨髄単核細胞の約１：３，０００のみがＭＵＳＥ細胞である。間葉系細胞培養では、ＭＵＳＥ細胞は線維芽細胞と骨髄間質細胞の数パーセントしか占めていない。分離して懸濁培養すると、ＭＵＳＥ細胞は通常、数週間しか増殖せず、その後増殖を停止するが、付着培養に移行した後、増殖を開始する。したがって、骨髄単核細胞からＣＤ１０５＋／ＳＳＥＡ３＋細胞を単に単離して、続いてそのような単離された細胞を従来の培養することは、実際の使用に十分なＭＵＳＥ細胞を提供しない場合がある。
【0041】
ＭＵＳＥ細胞は浮遊培養では増殖が制限されているが、付着培養ではヘイフリック限界まで増殖し続ける。この制限は、ヒト胎児細胞培養では４０～６０分割である。高齢の成体細胞の培養では、細胞の年齢に応じて、ヘイフリック限界を低くする必要がある。出生後の最年少の細胞源である臍帯血細胞は、より多くの増殖能力を有するはずである。他の体性幹細胞および造血幹細胞と同様である。ＭＵＳＥ細胞は、対称的な細胞分裂によって自らを生成するが、同時に、非対称的な細胞分裂によって非ＭＵＳＥ細胞をランダムに生成する。したがって、最初に精製されたＭＵＳＥ細胞培養物は、培養物中の濃度がＳ字状に低下し、数パーセントのプラトーに達し、その後、この低い濃度を維持する。さらに、本明細書に開示されるように、本発明の方法は、インビトロでＭＵＳＥ細胞の濃度を単離および増加させ得る。
【0042】
開示された方法は、様々な組織からＭＵＳＥ細胞を単離、濃縮、または拡大するために使用され得る。いくつかの実施形態では、前記開始細胞は、臍帯血から得られる。臍帯血は、以下の理由からＭＵＳＥ細胞の魅力的な供給源である。まず、ＨＬＡに適合した臍帯血は、ＭＵＳＥ細胞の豊富で免疫適合性のある供給源である。多くの臍帯血バンクは、移植目的で免疫適合性のＭＵＳＥ幹細胞を提供するためにＨＬＡ適合させ得る数十万の臍帯血ユニットを保管している。第二に、臍帯血細胞は、骨髄、皮膚、または脂肪から得られる成人の間葉系幹細胞の他の供給源よりも大きな増殖の可能性を有している。第三に、臍帯血は骨髄置換に安全に使用されてきた長い歴史があり、腫瘍形成のリスクは低い。
【0043】
開示された方法はまた、臍帯血以外の他の組織からＭＵＳＥ細胞を単離、拡大、または濃縮するために適用可能である。ＭＵＳＥ細胞は、間葉系幹細胞から分離された多能性幹細胞の特別な亜集団である。したがって、間葉系幹細胞を単離するのに適したいずれかの供給源を使用して、開示された方法を実施し得る。そのような供給源の非限定的な例としては、臍帯、臍帯間質細胞（ウォートンゼリー）、羊膜、胎盤、臍帯内層、さらには月経血が挙げられる。他の例としては、骨髄、皮膚、脂肪組織、さらには末梢血が挙げられる。しかしながら、上記で指摘したように、これらのソースはいずれもＭＵＳＥ細胞の数が少なく、臍帯血細胞よりも増殖の可能性が低くなり得る。
【0044】
前記望ましい細胞集団（例えば、ＭＵＳＥ細胞）が単離または濃縮されると、次に、細胞を標準的な技術によって試験して、１つまたは複数の系統特異的マーカーを使用して細胞の分化能を確認し得る。すなわち、適切な培養条件下で、細胞が分化するように誘導され、３つの胚葉のマーカーを発現する細胞を生じさせ得るかどうかを試験し得る。外胚葉細胞の例示的なマーカーとしては、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ、Ｍｕｓａｓｈｉ、ニューロフィラメント、ＭＡＰ－２、およびメラノサイトマーカー（チロシナーゼ、ＭＩＴＦ、ｇｆ１００、ＴＲＰ－１、およびＤＣＴなど）が挙げられ；中胚葉細胞の例示的なマーカーとしては、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｎｋｘ２－５平滑筋アクチン、オステオカルシン、オイルレッド－（＋）脂肪滴、およびデスミンが挙げられ；内胚葉細胞の例示的なマーカーとしては、ＧＡＬＡ－６、α－フェトプロテイン、サイトケラチン－７、およびアルブミンが挙げられる。
【0045】
例えば、単離された／濃縮された細胞は、当技術分野で知られている方法によって、神経膠細胞、骨細胞、および脂肪細胞を形成するように誘導され得る。簡単に説明すると、細胞を通過させてコンフルエンスまで培養し、骨形成培地または脂肪生成培地に移し、適切な時間（例えば、３週間）インキュベートし得る。骨形成の分化の可能性は、カルシウム蓄積の石灰化によって評価され得て、これはフォンコッサ染色によって視覚化され得る。脂肪生成分化を調べるために、細胞内脂肪滴をオイルレッドＯで染色し、顕微鏡で観察し得る。神経分化のために、細胞を神経原性培地で適切な期間（例えば、７日間）インキュベートし、次に血清枯渇およびβ－メルカプトエタノールのインキュベーションに供し得る。分化後、細胞は、ネットワークに配置された拡張神経突起様構造を備えた収縮性細胞体の形態を示す。系統特異的マーカーの免疫細胞化学的染色は、神経分化を確認するためにさらに実施され得る。前記マーカーの例としては、ニューロン固有のクラスＩＩＩβ－チューブリン（Ｔｕｊ－１）、ニューロフィラメント、およびＧＦＡＰが挙げられる。
【0046】
ＩＩ．組成物および治療方法
上記の方法で濃縮された３つの細胞集団は、多くの条件に有益な効果をもたらし、様々な方法で使用され得る。例えば、Ｔ細胞やＮＫ細胞などのリンパ球は、特定の腫瘍抗原に対してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された場合、腫瘍細胞に対して毒性があることが示されている。ＣＤ３４／ＣＤ１３３＋前駆細胞を有する単球は、マクロファージ前駆細胞である。マクロファージは３つの表現型を有する：Ｍ１は炎症誘発性食細胞であり；Ｍ２は抗炎症性の修復食細胞であり；かつ、樹状細胞は死んだ細胞または死にかけている細胞を貪食して、免疫細胞に抗原を提供する。単球は、脊髄に移植されたときに再生を刺激するエフェクター細胞であり得る。ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞は、それぞれ内皮前駆細胞および多能性臍帯血幹細胞である。どちらも単球を刺激してＭ２マクロファージを産生し得る。しかしながら、ＣＤ３４＋細胞は、脈管形成およびおそらく造血に関与するため、興味深いものである。ＣＤ１３３＋細胞は多能性細胞であり、多くの種類の細胞に分化するのに有用であり得る。
上記の方法で濃縮された３つの細胞集団は、多くの条件に有益な効果をもたらし、様々な方法で使用され得る。例えば、Ｔ細胞やＮＫ細胞などのリンパ球は、特定の腫瘍抗原に対してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された場合、腫瘍細胞に対して毒性があることが示されている。ＣＤ３４／ＣＤ１３３＋前駆細胞を有する単球は、マクロファージ前駆細胞である。マクロファージは３つの表現型を有する：Ｍ１は炎症誘発性食細胞であり；Ｍ２は抗炎症性の修復食細胞であり；かつ、樹状細胞は死んだ細胞または死にかけている細胞を貪食して、免疫細胞に抗原を提供する。単球は、脊髄に移植されたときに再生を刺激するエフェクター細胞であり得る。ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞は、それぞれ内皮前駆細胞および多能性臍帯血幹細胞である。どちらも単球を刺激してＭ２マクロファージを産生し得る。しかしながら、ＣＤ３４＋細胞は、脈管形成およびおそらく造血に関与するため、興味深いものである。ＣＤ１３３＋細胞は多能性細胞であり、多くの種類の細胞に分化するのに有用であり得る。
【0047】
ＭＵＳＥ細胞は多能性間葉系幹細胞であり、インビトロ接着培養により３つの胚葉に分化し得る。具体的には、多能性幹細胞は、インビトロ誘導培養により、皮膚、肝臓、神経、筋肉、骨、脂肪などを含む３つの胚葉を代表する細胞に分化し得る。また、それらはインビボで移植する場合、３つの胚葉に特徴的な細胞に分化し、損傷した臓器に静脈注射して生体内に移植する場合、生存して臓器（皮膚、脊髄、肝臓、筋肉など）に分化し得る。
【0048】
それらの多能性と非腫瘍形成性のために、前記細胞または細胞集団は、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの他の幹細胞に関連するヒト胚操作および腫瘍形成リスクの倫理的考慮を回避しながら、様々な変性疾患または遺伝性疾患の治療に使用され得る。さらに、開示された方法は、ＭＵＳＥ細胞などの多数の多能性幹細胞を取得させ得るので、他のタイプの幹細胞に関連するロジスティック上の障害を回避し得る。
【0049】
したがって、本開示はまた、上記の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む医薬組成物を提供する。他の態様では、本開示は、上記の方法によって濃縮されたＭＵＳＥ細胞を含む同種移植のための細胞治療組成物を提供する。前記組成物は、それを必要とする対象にＭＵＳＥ細胞を送達するための適切なビヒクルを含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、ＭＵＳＥ細胞および凍結防止剤を含み得る。
【0050】
前記単離されたＭＵＳＥ細胞は、脊髄損傷、脱髄状態、外傷性脳損傷、脳卒中などの様々な状態を治療して、望ましくない免疫応答（炎症など）を抑制し、心臓、肺、腸、肝臓、膵臓、筋肉、骨髄、および皮膚の障害を治療する。そのために、最初にインビトロで、次にインビボで、次に無傷の免疫不全動物で、最後に脊髄損傷動物および中枢神経系ならびに他の組織損傷の他のモデルで細胞の多能性を試験し得る。
【0051】
したがって、本開示は、様々なタイプの組織、様々な器官などを再生する方法を提供する。その例には、皮膚、脳脊髄、肝臓、および筋肉が含まれる。前記方法は、上記の方法によって濃縮された有効量のＭＵＳＥ細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、上記の方法によって分離された第１の細胞集団の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記ＭＵＳＥ細胞は、負傷または損傷した組織、器官などの近くの領域に直接投与され得て、その結果、ＭＵＳＥ細胞は、組織または器官に入り、関連する組織または器官に固有の細胞に分化する。このようにして、前記ＭＵＳＥ細胞は組織および臓器の再生または再構築に寄与し得る。また、前記ＭＵＳＥ細胞の全身投与は、静脈内投与等により可能である。この場合、ＭＵＳＥ細胞は、損傷した組織または器官にホーミングなどによって方向づけられ、組織または器官に到達して侵入し、次に組織または器官の細胞に分化して、組織または器官の再生および再構築に寄与し得るようにする。
【0052】
再生される器官の例としては、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸、目、脳、免疫系、循環器系、骨、結合組織、筋肉、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房－乳腺、脂肪組織、ならびに、例えば、口、食道、膣、および肛門の粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。また、そこで治療される疾患の例としては、癌、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、真性糖尿病、肝炎、血友病、血液系疾患、ならびに、脊髄損傷、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織病、貧血、感染症、移植片拒絶、虚血、炎症、および皮膚または筋肉の損傷、などの変性または外傷性神経障害が挙げられる。
【0053】
前記細胞は、注入もしくは注射（例えば、静脈内、髄腔内、筋肉内、管腔内、気管内、腹腔内、もしくは皮下）、経口、経皮、または当技術分野で知られている他の方法によって個体に投与され得る。また、局所投与または全身投与が本明細書で実施され得る。局所投与は、例えば、カテーテルを使用して実施され得る。前記用量は、再生する臓器、組織の種類、サイズに応じて適切に決定され得る。投与を、２週間に１回、１週間に１回、またはそれ以上の頻度で行い得るが、疾患または障害の維持段階中に頻度を減らし得る。
【0054】
細胞は、薬学的に許容されるベース材料と共に投与され得る。このようなベース材料は、コラーゲンまたは生分解性物質など、生体適合性の高い物質で作製され得る。それらは、粒子、プレート、チューブ、容器などの形態であり得る。細胞には、それをベース材料に結合させた後に、またはベース材料にその中に細胞を含ませた後に投与し得る。
【0055】
本発明は、ＭＵＳＥ細胞、ＭＵＳＥ細胞から形成された胚様体様細胞クラスター、およびＭＵＳＥ細胞または上記の胚様体様細胞クラスターからの分化によって得られた細胞または組織／器官を含む、細胞移植療法のための材料もしくは細胞移植療法のための組成物、または再生医療用材料もしくは再生医療用組成物を包含する。そのような組成物は、ＭＵＳＥ細胞、ＭＵＳＥ細胞から形成された胚様体様細胞クラスター、またはＭＵＳＥ細胞もしくは上記の胚様体様細胞クラスターからの分化により得られた細胞もしくは組織および／もしくは器官に加えて、薬学的に許容される緩衝液、希釈剤などを含む。
【0056】
異種細胞および自家細胞の両方を使用し得る。前者の場合、ＨＬＡマッチングを、宿主の反応を回避または最小化するために実施する必要がある。後者の場合、自家細胞は対象から濃縮および精製され、後で使用するために保存される。前記細胞は、エクスビボで宿主または移植片Ｔ細胞の存在下で培養され、宿主に再導入され得る。これは、前記宿主が細胞を自己として認識し、Ｔ細胞活性の低下をよりよく提供するという利点を有し得る。
【0057】
用量および投与頻度は、当業者に知られている急性期の少なくとも１つまたはより好ましくは２つ以上の臨床徴候の減少または欠如を伴う、寛解期の維持を確認する臨床徴候に依存するであろう。より一般的には、用量および頻度は、上記の組成物による治療のために企図される病状または障害の病理学的徴候ならびに臨床的および無症状の症状の後退に部分的に依存するであろう。用量および投与計画は、当業者によって理解されるように、投与された年齢、性別、体調、ならびに治療される患者または哺乳動物対象におけるコンジュゲートの恩恵および副作用、ならびに医師の判断に応じて調整され得る。上記のすべての方法において、前記細胞は、１×１０４～１×１０１０／時間で対象に投与され得る。
【0058】
さらに、患者から細胞を採取し、ＭＵＳＥ細胞を分離することで、前記ＭＵＳＥ細胞は様々な診断に利用され得る。例えば、ＭＵＳＥ細胞から患者の遺伝子を収集し、遺伝子情報を取得することで、その情報を反映した正確な診断が可能となる。例えば、対象の細胞と同じ特徴（例えば、遺伝的背景）を有する各組織および／または器官の細胞は、患者の細胞由来のＭＵＳＥ細胞の分化を引き起こすことによって入手され得る。したがって、疾患の診断、病状の解明、薬物の効果または副作用の診断などについては、各対象の特性に応じて適切な診断を行い得る。具体的には、ＭＵＳＥ細胞、ＭＵＳＥ細胞から形成される胚様体様細胞クラスター、ならびにＭＵＳＥ細胞または上記の胚様体様細胞クラスターの分化により得られた細胞または組織および／または器官を診断材料として使用され得る。例えば、本発明は、対象から単離されたＭＵＳＥ細胞を用いて、または対象と同じ遺伝的背景を有する（ＭＵＳＥ細胞からの分化により得られた）組織または器官を用いて、対象の疾患等を診断する方法を包含する。
【0059】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、脊椎動物、およびいくつかの例示的な態様では哺乳動物を指す。そのような哺乳動物としては、マウスおよびラットなどの齧歯目哺乳動物、ならびにウサギなどの兎形目哺乳動物、ネコ（猫）およびイヌ（イヌ）を含む食肉目哺乳動物、ウシ（牛）およびブタ（ブタ）を含む偶蹄目哺乳動物、またはウマ（馬）を含む奇蹄目哺乳動物、霊長目哺乳動物、セボイド目哺乳動物、またはシモイド目哺乳動物（サル）ならびに類人猿（ヒトおよび類人猿）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な態様では、前記哺乳動物はマウスである。より例示的な態様では、前記哺乳動物はヒトである。
【0060】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、骨内、腹腔内、脊髄内、筋肉内、関節内、脳室内、頭蓋内、病変内、気管内、髄腔内、皮下、皮内、経皮、または経粘膜投与を含むがこれらに限定されないいずれかの経路による、ＭＵＳＥ細胞などの細胞の輸送を指す。
【0061】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定の障害の少なくとも１つの症状またはパラメーターの測定可能な改善をもたらす量を指す。上記の細胞の治療有効量は、当技術分野で知られている方法によって決定され得る。障害を治療するための有効量は、当業者に知られている経験的方法によって決定され得る。患者に投与される正確な量は、障害の状態および重症度、ならびに患者の体調によって異なる。いずれかの症状またはパラメータの測定可能な改善は、当業者によって決定されるか、または患者によって医師に報告され得る。上記の障害の症状またはパラメータの臨床的もしくは統計的に有意な減衰もしくは改善は、本発明の範囲内であることが理解されよう。臨床的に有意な減衰または改善は、患者および／または医師に知覚し得ることを意味する。
【0062】
医薬組成物または細胞治療用組成物は、治療有効量の細胞、および場合によっては他の活性剤／化合物を薬学的に許容される担体と混合することによって調製され得る。前記担体は、化合物が投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。前記担体は、投与経路に応じて、様々な形態をとり得る。前記担体は、水および油などの滅菌液体であり得る。水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射可能な溶液の場合、担体として好ましくは使用される。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、第１８版による「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。例えば、前記組成物は、従来の医薬賦形剤と混合すること、および調製方法によって調製され得る。賦形剤は、崩壊剤、溶媒、造粒剤、保湿剤、および結合剤と混合され得る。
【0063】
「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容可能であり、通常、ヒトに投与されたときに望ましくない反応を生じない、そのような組成物の分子実体および他の成分を指す。好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された、または哺乳動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。薬学的に許容される塩、エステル、アミド、およびプロドラッグとは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに患者の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合ったものであり、意図された使用に効果的である、それらの塩（例えば、カルボキシレート塩、アミノ酸付加塩）、エステル、アミド、およびプロドラッグを指す。
【0064】
ＩＩＩ．定義
本開示による組成物および方法の詳細な説明を理解するのを助けるために、開示の様々な態様の明確な開示を容易にするために、いくつかの明確な定義が提供される。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本開示による組成物および方法の詳細な説明を理解するのを助けるために、開示の様々な態様の明確な開示を容易にするために、いくつかの明確な定義が提供される。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0065】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含むことに留意されたい。「挙げられる」、「含む」、「含有する」、または「有する」という用語およびそれらの変形は、特に断りのない限り、その後に記載される項目およびその同等物、ならびに追加の主題を包含することを意味する。
【0066】
「一実施形態では」、「様々な実施形態では」、「いくつかの実施形態では」などの句は、繰り返し使用される。そのような句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、文脈が他の方法で指示しない限り、それらは指し得る。
【0067】
本明細書に開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた、その範囲の上限と下限との間で具体的に開示されることが理解される。記載された値または記載された範囲内の介在値と、その記載された範囲内の他の記載された値または介在する値との間の各小さい範囲は、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、個別に範囲に含まれ得て、または除外され得て、いずれか、または両方の制限がより小さな範囲に含まれる各範囲もまた、記載された範囲で特に除外された制限を条件として、本発明に含まれる。記載された範囲が一方または両方の制限を含む場合、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【0068】
「約」という用語は、一般に、示された数のプラスマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示し、「約１」は０．９～１．１を意味し、「約４」は３．６～４．４を意味する。「約」の他の意味は、四捨五入などの文脈から明らかであり得て、例えば、「約１」は、０．５～１．４を意味し得る。「約」という用語は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態では、４５～５５パーセントまでの変動をもたらし得る。整数範囲の場合、「約」という用語は、列挙された整数よりも大きいおよび／または小さい整数を１つまたは２つ含み得る。本明細書で別段の指示がない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能に関して同等である、記載された範囲に近接する値、例えば、重量パーセントを含むことを意図する。
【0069】
「治療する」または「治療」という用語は、障害、障害の症状、障害に続発する病状、または障害の素因を治癒、軽減、緩和、治療、発症の遅延、予防、または改善することを目的として、障害を有している、または障害を発症する危険性を有する、対象への組成物または剤の投与を指す。
【0070】
本明細書で使用される場合、「それぞれ」という用語は、アイテムのコレクションに関して使用される場合、コレクション内の個々のアイテムを識別することを意図しているが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを参照しているわけではない。明示的な開示または文脈が明らかにそうでないことを指示する場合、例外が発生し得る。
【0071】
本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく照らすことを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる文言も、請求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。
【0072】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で実行される。提供される方法のいずれかに関して、方法のステップは、同時にまたは連続して発生し得る。前記方法のステップが連続して発生する場合、特に明記されていない限り、前記ステップはいずれかの順序で発生し得る。
【0073】
方法がステップの組み合わせを含む場合、本明細書に別段の記載がない限り、ステップのありとあらゆる組み合わせまたはサブコンビネーションは、本開示の範囲内に含まれる。
【0074】
本明細書で引用される各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により援用される。本明細書に開示された刊行物は、本発明の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される発行日は、個別に確認する必要がある実際の発行日とは異なり得る。
【0075】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としていること、ならびにその観点からの様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の思想および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解される。
【実施例】
【0076】
ＩＶ．実施例
実施例１
この例では、後続の例で使用する材料および方法について説明する。
実施例１
この例では、後続の例で使用する材料および方法について説明する。
【0077】
ＨＵＣ ＭＳＣの単離
ＨＵＣを、ＫＨ２ＰＯ４（０．２０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（無水、１．１５ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（０．２０ｇ／Ｌ）、およびＮａＣｌ（８．００ｇ／Ｌ）を含む輸送媒体で満たされたボトルに封入した。ボトルを氷で囲み、４℃に保った。すべてのコードは、ラトガース大学倫理委員会の要件を満たす患者の同意を得て収集された。患者から研究室までの出荷には１日かかった。表Ｉに、この研究で使用した抗体を示す。
ＨＵＣを、ＫＨ２ＰＯ４（０．２０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（無水、１．１５ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（０．２０ｇ／Ｌ）、およびＮａＣｌ（８．００ｇ／Ｌ）を含む輸送媒体で満たされたボトルに封入した。ボトルを氷で囲み、４℃に保った。すべてのコードは、ラトガース大学倫理委員会の要件を満たす患者の同意を得て収集された。患者から研究室までの出荷には１日かかった。表Ｉに、この研究で使用した抗体を示す。
【0078】
ヒト臍帯（ＨＵＣ）ＭＳＣの単離は、次のように説明されているプロトコルに従った。まず、ＨＵＣを１０ｃｍの皿に入れた。次に、ＨＵＣを１ｃｍの小さな断片に切断し、縦方向に切開した。次に、ＨＵＣの動脈および静脈を取り除き、ＨＵＣ組織を洗浄した後、ウォートンゼリーとコードライニング組織とを分離した。組織をコラゲナーゼで処理し、細胞を細胞培養フラスコに播種した。簡単に説明すると、血管を除去した後、メスでウォートンゼリーから間葉組織をこすり落とし、２５０ｘｇで５分間室温において遠心分離し、ペレットを無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、１１３３０－０３２）で洗浄した。次に、細胞を２５０ｘｇで５分間、室温において遠心分離し、次に２ｍｇ／ｍｌの濃度のコラゲナーゼＩ型溶液（ＳＩＧＭＡ、ＳＣＲ１０３）で３７℃において１６時間処理した。次に、細胞を洗浄し、２．５％トリプシン（１０ｘ）ストック溶液（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、１５０９００４６）で３７℃において３０分間撹拌しながら処理した。最後に、細胞を洗浄し、３７℃のインキュベーター内で５％ＣＯ２中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ １０４３７－０２８）を含む細胞培養培地で培養し、皿には細胞継代、名前、および日付に関する情報を表示した。
【0079】
細胞培養および継代
ＷＪ組織またはＣＬ組織からの最初の細胞の播種は継代０（Ｐ０）と名付けられ、その後の継代はＰ１およびＰ２などと名付けられた。最初の３継代におけるＳＳＥＡ３陽性細胞の割合を分析した。培地には、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１０４３７－０２８）、２ｍＭ ＧｌｕｔＭａｘ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０－０６１）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０－１２２）、１ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、１００－１８Ｂ）が含まれており、２５０ｍｌボトルにＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ、１１３３０－０３２）を充填した。細胞が９０％のコンフルエンシーに達したときに（図４）、タンパク質分解酵素ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ、１２６０４－０１３）を使用して、細胞培養皿、ボトル、またはプレートから付着細胞を放出し、追加の皿、ボトル、またはプレートに細胞を再播種することにより継代した。
ＷＪ組織またはＣＬ組織からの最初の細胞の播種は継代０（Ｐ０）と名付けられ、その後の継代はＰ１およびＰ２などと名付けられた。最初の３継代におけるＳＳＥＡ３陽性細胞の割合を分析した。培地には、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１０４３７－０２８）、２ｍＭ ＧｌｕｔＭａｘ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０－０６１）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０－１２２）、１ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、１００－１８Ｂ）が含まれており、２５０ｍｌボトルにＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ、１１３３０－０３２）を充填した。細胞が９０％のコンフルエンシーに達したときに（図４）、タンパク質分解酵素ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ、１２６０４－０１３）を使用して、細胞培養皿、ボトル、またはプレートから付着細胞を放出し、追加の皿、ボトル、またはプレートに細胞を再播種することにより継代した。
【0080】
免疫細胞化学染色
細胞を２×１０４細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに移した。各ウェルの下部は丸いカバースリップ（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、１２５４５８０）を有していた。移し替えおよび適切な接着時間の後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（０．５ｍｌ／ウェル）で固定し、室温（ＲＴ）において１０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（表面マーカーにはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｓｉｇｍａ ２３４７２９を含まないが、Ｋｉ－６７核染色には０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含む）とともに３０分間インキュベートし、非特異的抗体の結合をブロックし、続いて一次抗体と４℃において一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温において３０分間二次抗体とインキュベートした。最後のステップとして、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色液で１０分間インキュベートし、核ＤＮＡを標識した（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、６２２４９）。
細胞を２×１０４細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに移した。各ウェルの下部は丸いカバースリップ（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、１２５４５８０）を有していた。移し替えおよび適切な接着時間の後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（０．５ｍｌ／ウェル）で固定し、室温（ＲＴ）において１０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清（表面マーカーにはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｓｉｇｍａ ２３４７２９を含まないが、Ｋｉ－６７核染色には０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含む）とともに３０分間インキュベートし、非特異的抗体の結合をブロックし、続いて一次抗体と４℃において一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温において３０分間二次抗体とインキュベートした。最後のステップとして、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色液で１０分間インキュベートし、核ＤＮＡを標識した（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、６２２４９）。
【0081】
フローサイトメトリー
細胞（～０．３×１０６細胞）を一次抗体とともに１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内でインキュベートした。ＳＳＥＡ３の場合、一次抗体のインキュベーション時間は４℃において１時間、二次抗体のインキュベーション時間は３０分であった。ミルテニーバイオテクの他の抗体の場合、インキュベーション時間は１０分であった。ロードする前に、２．５μｌの１００μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００９３２３３）を５００μｌの細胞懸濁液に加えて、生存できない可能性のある細胞を標識した。アイソタイプ対照群を対照として使用した。１０個の蛍光チャネルを備えたＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０フローサイトメーター（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）を使用して、細胞数をカウントし、グラフを作成した。
細胞（～０．３×１０６細胞）を一次抗体とともに１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内でインキュベートした。ＳＳＥＡ３の場合、一次抗体のインキュベーション時間は４℃において１時間、二次抗体のインキュベーション時間は３０分であった。ミルテニーバイオテクの他の抗体の場合、インキュベーション時間は１０分であった。ロードする前に、２．５μｌの１００μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００９３２３３）を５００μｌの細胞懸濁液に加えて、生存できない可能性のある細胞を標識した。アイソタイプ対照群を対照として使用した。１０個の蛍光チャネルを備えたＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０フローサイトメーター（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）を使用して、細胞数をカウントし、グラフを作成した。
【0082】
磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）
プラスチックプレート上で増殖したほとんどすべてのヒト間葉系細胞は、ＣＤ１０５を発現する。ＭＡＣＳプロシージャは、ＳＳＥＡ３＋細胞を積極的に選択する。２ｍｌに懸濁した約６×１０６個の細胞をＭａｇｎｅｔｉｃＳｏｒｔｅｒ（ＭＳ）カラム（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００４２２０１）にロードした。ＳＳＥＡ３抗体が最初に追加され、続いて抗ラットカッパマイクロビーズＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００４７４０１が追加された。ＭＡＣＳｑｕａｎｔ １０フローサイトメーターで分析するための溶出画分を収集した。ＭＳカラムには、２ｍｌに懸濁した６×１０６を超える染色細胞をロードするべきではない。ＭＳカラムを１ｍｌの脱気バッファーで３回洗浄した。溶出ステップでは、２ｍｌのバッファーをＭＳカラムにピペットで移した。３分後、プランジャーをしっかりと押して、磁気標識された細胞を得た。この研究で使用された抗体は表Ｉに示されている。
プラスチックプレート上で増殖したほとんどすべてのヒト間葉系細胞は、ＣＤ１０５を発現する。ＭＡＣＳプロシージャは、ＳＳＥＡ３＋細胞を積極的に選択する。２ｍｌに懸濁した約６×１０６個の細胞をＭａｇｎｅｔｉｃＳｏｒｔｅｒ（ＭＳ）カラム（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００４２２０１）にロードした。ＳＳＥＡ３抗体が最初に追加され、続いて抗ラットカッパマイクロビーズＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ、１３００４７４０１が追加された。ＭＡＣＳｑｕａｎｔ １０フローサイトメーターで分析するための溶出画分を収集した。ＭＳカラムには、２ｍｌに懸濁した６×１０６を超える染色細胞をロードするべきではない。ＭＳカラムを１ｍｌの脱気バッファーで３回洗浄した。溶出ステップでは、２ｍｌのバッファーをＭＳカラムにピペットで移した。３分後、プランジャーをしっかりと押して、磁気標識された細胞を得た。この研究で使用された抗体は表Ｉに示されている。
【0083】
倍加時間
細胞倍加時間（ＴＤ）を決定するために、５×１０３細胞／ｃｍ２の密度の細胞をプレーティングし、次のアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｕｂｌｉｎｇ－ｔｉｍｅ．ｃｏｍ）を使用してＴＤを計算した：
ＴＤ＝ｔ×ｌｎ２／（ｌｎＮｔ－ｌｎＮ０）
ここで、Ｎ０は接種された細胞の数、Ｎｔは採取された細胞の数、ｔは時間単位の培養時間である。最初の３代の一部のＴＤを表ＩＶに示す。ＭＵＳＥ細胞および非ＭＵＳＥ細胞のＴＤを、すべてのサンプルでそれぞれ計算した。
細胞倍加時間（ＴＤ）を決定するために、５×１０３細胞／ｃｍ２の密度の細胞をプレーティングし、次のアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｕｂｌｉｎｇ－ｔｉｍｅ．ｃｏｍ）を使用してＴＤを計算した：
ＴＤ＝ｔ×ｌｎ２／（ｌｎＮｔ－ｌｎＮ０）
ここで、Ｎ０は接種された細胞の数、Ｎｔは採取された細胞の数、ｔは時間単位の培養時間である。最初の３代の一部のＴＤを表ＩＶに示す。ＭＵＳＥ細胞および非ＭＵＳＥ細胞のＴＤを、すべてのサンプルでそれぞれ計算した。
【0084】
統計分析
ＳＰＳＳ（ＩＢＭ、Ｒ２３．０．０．０）、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ． ４．８．０（ＳＰ２）、およびＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ＺＥＩＳＳ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ ２）を使用して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してグループ間の差異を評価した。グループ間の比較の事後分析は、最小有意差（ＬＳＤ）検定を使用して実行された。特に記載がない限り、結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。＜０．０５の確率（Ｐ値）は有意であると見なされた。Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ． ４．８．０ ＳＰ２およびＺＥＩＳＳＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（バージョン４．２．０．１２１、Ｚｅｉｓｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を使用して画像を取得した。
ＳＰＳＳ（ＩＢＭ、Ｒ２３．０．０．０）、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ． ４．８．０（ＳＰ２）、およびＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ＺＥＩＳＳ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ ２）を使用して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してグループ間の差異を評価した。グループ間の比較の事後分析は、最小有意差（ＬＳＤ）検定を使用して実行された。特に記載がない限り、結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。＜０．０５の確率（Ｐ値）は有意であると見なされた。Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ． ４．８．０ ＳＰ２およびＺＥＩＳＳＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（バージョン４．２．０．１２１、Ｚｅｉｓｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を使用して画像を取得した。
【0085】
実施例２
ＨＵＣ ＷＪおよびＣＬの両方で、多数のＭＳＣを生成した。表ＩＩは、継代０でのＭＳＣおよびＳＳＥＡ３＋の数を示している。組織１グラムあたりのＭＳＣおよびＳＳＥＡ３＋細胞の濃度は、平均３．７±０．５５×１０４ＷＪ－ＭＳＣ、１．８９±１．６７×１０３ＷＪ－ＳＳＥＡ３＋、３．００±０．８０×１０４ＣＬ－ＭＳＣ、およびグラムあたり２．２４±２．００×１０３ＣＬ－ＳＳＥＡ３＋細胞であった。より重いコードはより多くのＷＪＭＳＣを有していた（Ｒ２＝０．６４、ｐ＝０．０１＜０．０５、図４）。９９ＷＪグループは継代０で異常に高い４２．３７％ＳＳＥＡ＋細胞を有していた。しかし、コード重量はＣＬ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＳＳＥＡ３＋／ＣＬ－ＳＳＥＡ３＋と相関していなかった。ＷＪ－ＭＳＣの数は、ＣＬ－ＭＳＣまたはＷＪ－ＳＳＥＡ３＋とは相関していなかった。ＣＬ－ＭＳＣとＣＬ－ＳＳＥＡ３＋との間においても相関はなかった。
ＨＵＣ ＷＪおよびＣＬの両方で、多数のＭＳＣを生成した。表ＩＩは、継代０でのＭＳＣおよびＳＳＥＡ３＋の数を示している。組織１グラムあたりのＭＳＣおよびＳＳＥＡ３＋細胞の濃度は、平均３．７±０．５５×１０４ＷＪ－ＭＳＣ、１．８９±１．６７×１０３ＷＪ－ＳＳＥＡ３＋、３．００±０．８０×１０４ＣＬ－ＭＳＣ、およびグラムあたり２．２４±２．００×１０３ＣＬ－ＳＳＥＡ３＋細胞であった。より重いコードはより多くのＷＪＭＳＣを有していた（Ｒ２＝０．６４、ｐ＝０．０１＜０．０５、図４）。９９ＷＪグループは継代０で異常に高い４２．３７％ＳＳＥＡ＋細胞を有していた。しかし、コード重量はＣＬ－ＭＳＣ／ＷＪ－ＳＳＥＡ３＋／ＣＬ－ＳＳＥＡ３＋と相関していなかった。ＷＪ－ＭＳＣの数は、ＣＬ－ＭＳＣまたはＷＪ－ＳＳＥＡ３＋とは相関していなかった。ＣＬ－ＭＳＣとＣＬ－ＳＳＥＡ３＋との間においても相関はなかった。
【0086】
ＷＪ細胞とＣＬ細胞とを別々に培養し、複数継代にわたるＳＳＥＡ３＋の割合を比較した（図５を参照）。Ｐ０グループでは、ＷＪとＣＬとの両方の全細胞の９８％以上がＣＤ１０５陽性であり、Ｐ１およびＰ２でさらに高かった。Ｐ０では、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合はＷＪおよびＣＬでそれぞれ４．９７％±４．３０％および５．２６％±５．１４％であった。しかしながら、ＳＳＥＡ３＋の割合は、ＣＬグループのＰ０とＰ１との間、およびＷＪグループのＰ０とＰ２との間で急激に低下した。
【0087】
ＷＪ－ＭＳＣとＣＬ－ＭＳＣとは同様の形態を有していた（図６）。それらは紡錘形または三角形であり、細胞体の中心に大きな楕円形の核および１つまたはいくつかの核小体を有していた。図６Ｂにおいて、組織は示されるように円に播種され、ＭＳＣはそこから成長した。免疫蛍光法で測定したところ、すべての細胞がＣＤ１０５陽性であった。ＳＳＥＡ３＋細胞は、多くの場合、長くて薄い突起を有し、周囲の細胞との接続を試みる。平らな細胞体は不規則な形を示したが、３０μｍ×１００μｍの大きさで、直径２０μｍまでの大きな楕円形の核を有していた。分裂している細胞はより小さく丸い細胞体を有していたが、それらの典型的な膜ＳＳＥＡ３＋染色を維持した。図７において、ＷＪおよびＣＬ由来のＭＳＣは両方とも、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１６６＋、およびＣＤ２９＋であったが、ＣＤ４５－およびＣＤ１４－であった。
【0088】
凍結した９６ＷＪＰ２細胞を培養した結果、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合が３．９１％から２８．２７％に増加した。凍結した９６ＷＪＰ２細胞の他の培養では、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合が２０．６２％になり、この現象が確認された。凍結プロセス（厳しい環境）は、ＭＵＳＥ細胞の割合を高め得る。ＭＡＣＳは、９６ＷＪＰ２～９６ＷＪＰ１０の各継代に対して実行された。
【0089】
ＭＡＣＳを使用して、１００万個のＭＳＣから１．２３±０．３８×１０５個の細胞を選別した（表ＩＩＩ）。ソートされた母集団のうち、９１．４４％±３．２２％がＳＳＥＡ３＋細胞であり、この方法の効率を示している。９６ＷＪＰ３の場合、ソート率は９４．１９％および９５．２４％であり、その他の平均は２８．３１±６．１１％であり、ＳＳＥＡ３＋細胞全体の約２８．３１％がＭＳＣ集団からソートされたことを示している。フローサイトメトリーによるさらなる分析は、選別された集団が選別されていないよりも強いＳＳＥＡ３を発現したことを示した。９６ＷＪＰ８から、ＭＳＣ集団におけるＳＳＥＡ３＋細胞の割合は２８．１０％に低下した。前者の継代はＭＡＣＳで使用することが推奨された。さらなる分析は、選別された細胞がＳＳＥＡ３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋およびＣＤ１６６＋であるが、ＣＤ１４－、ＣＤ４５－であることを示した（図８）。
【0090】
１０代中のＭＡＣＳで選別された９６ＷＪＰ２細胞のＳＳＥＡ３＋細胞の割合もモニターされた（図９を参照）。ＭＡＣＳの直後、細胞の９３．８％がＳＳＥＡ３＋であった。ＭＡＣＳ後の最初の継代では、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は１４．８％に減少したが、ＳＳＥＡ３＋細胞の数はリバウンドし、培養物はＰ２～Ｐ５において６２．４８％～７５．９６％のＳＳＥＡ３＋細胞を維持した。割合はＰ６～Ｐ９において４２．０３％～５４．７３％に低下した。Ｐ１０でも、培養物には３７．３５％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。Ｐ１０の後、細胞を再分類し、８９．４０％ＳＳＥＡ３＋細胞培養を達成した。ＭＡＣＳ－Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｒｅＭＡＣＳは、何百万ものＭＵＳＥ細胞を産生し得る。
【0091】
実施例３
ＨＵＣ ＳＳＥＡ３＋およびＣＤ１０５＋細胞は、Ｔ１１脊髄の１２．５ｍｍの体重減少挫傷を伴う脊髄損傷（ＳＣＩ）の２週間後に、２匹の成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの脊髄に移植された。細胞は、損傷部位の上下の脊髄の後根入口ゾーンに注入された。細胞は移植後４週間生存した。ラットは免疫抑制されていなかった。移植された細胞は、ヒト核に対する抗体（Ｓｔｅｍ １０１＋）で染色されたが、それ以外はネスチン、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＮＦ１５５、およびＩｂａ１に対して陰性であった。脳および脊髄に移植された場合、ヒトＭＵＳＥ細胞は長期間生存し、免疫拒絶されない（Ｕｃｈｉｄａ Ｈら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２０１６； ３４（１）：１６０－１７３； Ｕｃｈｉｄａ Ｈら、Ｓｔｒｏｋｅ． ２０１７； ４８（２）：４２８－４３５）。
ＨＵＣ ＳＳＥＡ３＋およびＣＤ１０５＋細胞は、Ｔ１１脊髄の１２．５ｍｍの体重減少挫傷を伴う脊髄損傷（ＳＣＩ）の２週間後に、２匹の成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの脊髄に移植された。細胞は、損傷部位の上下の脊髄の後根入口ゾーンに注入された。細胞は移植後４週間生存した。ラットは免疫抑制されていなかった。移植された細胞は、ヒト核に対する抗体（Ｓｔｅｍ １０１＋）で染色されたが、それ以外はネスチン、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＮＦ１５５、およびＩｂａ１に対して陰性であった。脳および脊髄に移植された場合、ヒトＭＵＳＥ細胞は長期間生存し、免疫拒絶されない（Ｕｃｈｉｄａ Ｈら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２０１６； ３４（１）：１６０－１７３； Ｕｃｈｉｄａ Ｈら、Ｓｔｒｏｋｅ． ２０１７； ４８（２）：４２８－４３５）。
【0092】
実施例４
本開示に示されているように、ＷＪおよびＣＬからそれぞれ単離された細胞をコラゲナーゼとともに培養し、３代にわたるＳＳＥＡ３＋細胞の割合について定量化した。最初の継代には、ＷＪおよびＣＬからそれぞれ５．０±４．３％および５．３％±５．１％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。しかしながら、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、ＣＬグループのＰ１とＰ２との間、およびＷＪグループのＰ０とＰ２との間で大幅に低下した（ｐ＜０．０５）。磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）は、ＳＳＥＡ３＋細胞を９１．４４±３．２２％まで著しく濃縮した。選別された集団が培養された後、ＳＳＥＡ３＋の割合はＰ２～Ｐ５の間で６２．４８％～７５．９６％の範囲であった。ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、Ｐ６～Ｐ９の間で４２％～５５％に低下した。Ｐ１０においてさえも、培養物には３７％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。Ｐ１０後、細胞を再選別し、８９％ＳＳＥＡ３＋培養物を生成した。
本開示に示されているように、ＷＪおよびＣＬからそれぞれ単離された細胞をコラゲナーゼとともに培養し、３代にわたるＳＳＥＡ３＋細胞の割合について定量化した。最初の継代には、ＷＪおよびＣＬからそれぞれ５．０±４．３％および５．３％±５．１％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。しかしながら、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、ＣＬグループのＰ１とＰ２との間、およびＷＪグループのＰ０とＰ２との間で大幅に低下した（ｐ＜０．０５）。磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）は、ＳＳＥＡ３＋細胞を９１．４４±３．２２％まで著しく濃縮した。選別された集団が培養された後、ＳＳＥＡ３＋の割合はＰ２～Ｐ５の間で６２．４８％～７５．９６％の範囲であった。ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、Ｐ６～Ｐ９の間で４２％～５５％に低下した。Ｐ１０においてさえも、培養物には３７％のＳＳＥＡ３＋細胞が含まれていた。Ｐ１０後、細胞を再選別し、８９％ＳＳＥＡ３＋培養物を生成した。
【0093】
ＳＳＥＡ３＋細胞をＭＡＣＳで濃縮し、続いて培養で増殖させ、次にＳＳＥＡ３＋をＭＡＣＳで再濃縮する手順により、比較的純粋な培養で数百万のＳＳＥＡ３＋細胞を分離し得る。培養するとき、選別されたＳＳＥＡ３＋細胞は胚様体に分化し、挫折したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット脊髄に移植すると４週間生存した。ＳＳＥＡ３＋細胞は、挫傷部位の周りの４つの注射点から損傷領域に移動し、腫瘍を生成しなかった。臍帯は胎児ＭＵＳＥ細胞の優れた供給源であり、開示された方法は、ヒト試験での移植のためにヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と一致させ得るＳＳＥＡ３＋ ＭＵＳＥ細胞の比較的純粋な集団の実用的かつ効率的な単離および拡大を可能にする。
【0094】
結果は、ＷＪ組織およびＣＬ組織の両方で多くのＳＳＥＡ３＋およびＣＤ１０５＋二重陽性培養細胞を示した。ＳＳＥＡ３は多能性細胞表面マーカーである。ＳＳＥＡ３＋およびＣＤ１０５＋細胞はＭＵＳＥ細胞であり得る。しかしながら、ＳＳＥＡ３＋細胞の割合は、２～３代後に急速に減少し、非ＭＵＳＥ（すなわち、ＳＳＥＡ３－）細胞がＳＳＥＡ３＋集団よりも速く分裂したことを示唆している。ＭＳＣの約６５％（ＣＤ１０５＋）はＫｉ－６７陽性であり（図１０を参照）、最近の増殖を示している。
【0095】
非ＭＵＳＥ細胞のＴＤは安定しており、一元配置分散分析では、ＣＬＰ１とＣＬＰ２との間、ＷＪＰ１とＷＪＰ２との間、ＣＬＰ１とＷＪＰ１との間、またはＣＬＰ２とＷＪＰ２との間で有意差は示さなかった。ＳＳＥＡ３＋細胞のほとんどは、それらを刺激する因子なしでＧ０にとどまった。表ＩＶのマイナスの数字は、細胞がまったく分裂していないことを示している。ＭＡＣＳで分類されたＳＳＥＡ３＋細胞集団（図１１）では、ＴＤ時間は平均３０．９±９．２時間であり、ヒト線維芽細胞とほぼ同様であった。ＳＳＥＡ３＋細胞の割合が減少する一方で、ＴＤ時間は継代数が増えるにつれて増加した。図１１から、最初のＭＡＣＳの後、Ｐ２～Ｐ７は、その後の移植実験のために再度分類するのに最適な継代であると思われた。この研究では、ＭＳカラムを使用したＭＡＣＳにより、ＷＪ組織およびＣＬ組織からＳＳＥＡ３＋細胞が効率的に分離された。選別する前は、細胞の５％未満がＳＳＥＡ３＋であった。ＭＡＣＳソーティング後、９１．４４±３．２２％の細胞がＳＳＥＡ３＋であった。標識チェック試薬を使用して、ＳＳＥＡ３抗体が抗ラットカッパマイクロビーズとうまく結合したことを確認した（図１２）。強いＳＳＥＡ３発現（～２８．３１％）を発現するＭＵＳＥ細胞のみが単離された。選別手順に関する２つの特別なガイドラインが提供されている：（１）６００万を超える細胞をカラムにロードしてはならない。また、細胞懸濁液の量は、推奨される０．５ｍｌではなく２ｍｌであった。さもないと、細胞がカラムに付着し得る；かつ（２）溶出ステップでは、１ｍｌではなく２ｍｌのバッファーをピペッティングし、３分待ってからプランジャーを適用する。
【0096】
個々のＳＳＥＡ３＋細胞は典型的な膜染色を示したが、以前の研究ではＳＳＥＡ３染色を伴う細胞クラスターのみが示されていた。２～１２０ミクロンのサイズ範囲内のほとんどのヒト細胞と比較して、ＳＳＥＡ３＋細胞体は２０～８０ミクロンのマクロファージと同様に２５～９０μｍであり、核は約２０μｍであった。一部のＭＵＳＥ細胞は、長さが１１０μｍまでの非常に大きな細胞体を有していた。ＭＵＳＥ細胞は、周囲の細胞に向かって伸びる多くの突起を有するが、非ＭＵＳＥ細胞は有さない。分裂するＳＳＥＡ３＋細胞は、核が～７μｍにある一方、１０μｍの小さくて丸い細胞体を有している。
【0097】
ポリＨＥＭＡコーティングディッシュで培養されたＭＡＣＳで選別されたＳＳＥＡ３＋細胞は、プレーティング後２日目にＳＳＥＡ３＋細胞の小さなクラスターを示した。７日後、多くの大きなクラスターが形成された。これらのクラスターを分離し、非ポリＨＥＭＡコーティングウェルで８時間培養した。細胞クラスターはプレートに付着し、ＳＳＥＡ３で染色された。２つの研究では、ＭＵＳＥ細胞の免疫組織学的染色のためにブロッキング溶液にＴｒｉｔｏｎを追加することを推奨していたが、データは０．３％Ｔｒｉｔｏｎ処理細胞サンプルでＳＳＥＡ３シグナルを示さなかった（Ｔｉａｎ、Ｔ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、２０１７．１９（２）： ｐ．１１６－１２２）。Ｔｒｉｔｏｎは脂質膜を透過する界面活性剤であり、ＳＳＥＡ３が細胞の表面に発現していることを確認した。
【0098】
選別されたＭＵＳＥ細胞は、神経前駆細胞培養培地で培養された：２％Ｂ－２７サプリメント（５０ｘ、ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ １７５０４－０４４）、ＧｌｕｔＭａｘ（ＧＩＢＣＯ ３５０５０－０６１、最終濃度：２ｍＭ）、ｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ １００－１８Ｂ、最終：３０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ ＡＦ－１００－１５、最終：３０ｎｇ／ｍｌ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ １５１４０１２２）、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ ２１１０３０４９）。特定の球を形成する神経前駆細胞への分化を誘導するのに７日かかった。ネスチン、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、およびＮＦ－１５５は陽性であり、これは誘導が成功したことを示し、神経前駆細胞は多能性であった。
【0099】
ラットはＳＳＥＡ３抗体の宿主種であったため、移植細胞のＳＳＥＡ３発現はラットでは測定し得なかった。しかしながら、このパイロット実験は、移植された細胞がヒトの細胞質および核抗原を発現したため、移植されたヒトＭＵＳＥ細胞が移植後の最初の４週間で明らかに免疫拒絶されなかったことを示した。他の研究では、ヒトＭＵＳＥ細胞は移植後も生き残り、マウスでは免疫拒絶されないことが示されている。例えば、マウスの脳内出血モデルでは、移植されたヒトＭＵＳＥは６９日目にＮｅｕＮ（～５７％）およびＭＡＰ－２（～４１．６％）に対して陽性を示した（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｎ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１７．２３５ （２）：ｐ．５６５－５７２．） しかしながら、ＭＵＳＥ細胞が他の細胞型に分化すると、免疫抑制なしでは生き残れない場合がある。
【0100】
ＭＵＳＥ細胞は免疫調節効果を有する（Ｇｉｍｅｎｏら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７． ６（１）：ｐａｇｅｓ１６１－１７３）。 同様の現象が、ＭＨＣプロファイルが変化したラット心筋梗塞モデルにおけるＭＳＣの研究（Ｈｕａｎｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０１０．１２２（２３）： ２４１９－２４２９ページ）で観察された。心筋細胞への分化に関連する同種異系ＭＳＣは失われた。免疫抑制剤は、ＭＵＳＥ細胞の子孫細胞のより長い生存期間に必要となり得る。移動はＳ１Ｐ－Ｓ１ＰＲ２によって導かれると思われ、急性心筋梗塞後の長期にわたる組織修復および機能回復のために、損傷した心臓へのＭＵＳＥ細胞のホーミングを仲介する（Ｙａｍａｄａら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ２０１８、１２２（８）：１０６９－１０８３ページ）
ＨＵＣから成長したＳＳＥＡ３＋細胞およびＣＤ１０５＋細胞は、免疫抑制なしに損傷したラット脊髄に移植した後も生存および移動するという発見は、脳卒中後にラットの脳に移植したときにヒトＭＵＳＥ細胞が長期間生存したという島村の発見と一致している。ＨＵＣ ＳＳＥＡ３／ＣＤ１０５細胞は、ヒト核タンパク質に対する抗体Ｓｔｅｍ１０１（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ、日本）によって同定された。この抗体は、マウス、ラット、または非ヒト霊長類の細胞を認識しない。免疫抑制のない損傷したラット脊髄におけるＳＳＥＡ３＋／ＣＤ１０５＋細胞の生存は、ＨＬＡ－Ｇを発現するヒトＭＵＳＥ細胞の免疫寛容と一致している。
ＨＵＣから成長したＳＳＥＡ３＋細胞およびＣＤ１０５＋細胞は、免疫抑制なしに損傷したラット脊髄に移植した後も生存および移動するという発見は、脳卒中後にラットの脳に移植したときにヒトＭＵＳＥ細胞が長期間生存したという島村の発見と一致している。ＨＵＣ ＳＳＥＡ３／ＣＤ１０５細胞は、ヒト核タンパク質に対する抗体Ｓｔｅｍ１０１（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ、日本）によって同定された。この抗体は、マウス、ラット、または非ヒト霊長類の細胞を認識しない。免疫抑制のない損傷したラット脊髄におけるＳＳＥＡ３＋／ＣＤ１０５＋細胞の生存は、ＨＬＡ－Ｇを発現するヒトＭＵＳＥ細胞の免疫寛容と一致している。
【0101】
本明細書に開示されているすべての機能は、いずれかの組み合わせで組み合わせられ得る。本明細書に開示されている各機能は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替機能に置き換えられ得る。したがって、特に明記しない限り、開示される各機能は、同等または類似の機能の一般的なシリーズの例にすぎない。上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得て、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用法および条件に適合させるために様々な変更および修正を行い得る。したがって、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内にある。
【0102】
【表1-1】
【0103】
【表1-2】
【0104】
【表1-3】
【0105】
【表2】
【0106】
【表3】
【0107】
【表4】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】