▶ シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-16
(54)【発明の名称】安定的な標的組み込み
(51)【国際特許分類】
C12N 15/90 20060101AFI20220609BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220609BHJP
【ＦＩ】
C12N15/90 100Z
C12N15/09 110
C12N15/09 ZNA
C12N15/09 100
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021561932
(86)(22)【出願日】2020-04-20
(85)【翻訳文提出日】2021-11-25
(86)【国際出願番号】 US2020028991
(87)【国際公開番号】W WO2020215077
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】62/835,810
(32)【優先日】2019-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】311016949
【氏名又は名称】シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(72)【発明者】
【氏名】バー，スコット
(72)【発明者】
【氏名】ジョンズ，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ラベレット，ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】マスカレナス，ホアキナ
(72)【発明者】
【氏名】ボーグシャルト，トリッサ
(57)【要約】
ゲノムローカスに外因性配列を組み込むための方法であって、該組み込みは安定的であり、および該外因性配列が予測可能かつ確実に機能し得る、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞のゲノムＤＮＡに少なくとも１つの外因性配列を安定的に組み込むための方法であって、ＮＣＢＩの参照配列、ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位に、該少なくとも１つの外因性配列を組み込む事を含む、方法。
【請求項2】
該細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
該少なくとも１つの外因性配列がタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
該タンパク質が治療用タンパク質、組み換えタンパク質、または工業用タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
該ＲＮＡ分子が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはその前駆体である、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
該少なくとも１つの外因性配列がプロモーター調節配列と作動可能に連結している、請求項３－５の何れか１項に記載の方法。
【請求項7】
該外因性配列の発現が安定的であり、予測可能であり、および再現性がある、請求項３－６の何れか１項に記載の方法。
【請求項8】
該少なくとも１つの外因性配列が、ポリヌクレオチド改変酵素の少なくとも１つの認識配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項9】
該少なくとも１つの認識配列が、哺乳類細胞のゲノムに内因性に存在しない核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
該ポリヌクレオチド改変酵素が部位特異的リコンビナーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
該部位特異的リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、ラムダインテグラーゼ、ファイＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、またはＴＰ９０１－１リコンビナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
ゲノムＤＮＡに組み込まれる外因性配列を含む細胞を調製するための方法であって、ａ）細胞に（ｉ）ＮＣＢＩ参照配列、ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）該外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を導入する事：および
ｂ）該外因性配列がゲノム配列の標的部位に組み込まれるような条件下で該細胞を維持する事、
を含む、方法。
【請求項14】
該細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
該ドナーポリヌクレオチド内の該外因性配列が、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列によって挟まれている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
該外因性配列が、相同配列指向性プロセスによってゲノムに組み込まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
該ドナーポリヌクレオチド内の該外因性配列が、少なくとも１つの該標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列によって挟まれている、請求項１３または１４に記載の方法
【請求項18】
該外因性配列が、直接的なライゲーションプロセスによってゲノムに組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項１３－１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項20】
該外因性配列がタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする、請求項１３－１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項21】
該タンパク質が、治療用タンパク質、組み換えタンパク質、または工業用タンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
該ＲＮＡ分子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはその前駆体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
該外因性配列が、プロモーター調節配列と作動可能に連結している、請求項２０－２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項24】
該外因性配列の発現が安定的であり、予測可能であり、および再現性がある、請求項２０－２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項25】
該外因性配列が、ポリヌクレオチド改変酵素の少なくとも１つの認識配列を含む、請求項１３－１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項26】
該少なくとも１つの認識配列が、哺乳類細胞のゲノムに内因性に存在しない核酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
該ポリヌクレオチド改変酵素が、部位特異的リコンビナーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項28】
該部位特異的リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、ラムダインテグラーゼ、ファイＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、またはＴＰ９０１－１リコンビナーゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１９年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／８３５，８１０号の優先権の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
本願は、２０１９年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／８３５，８１０号の優先権の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【0002】
技術分野
本開示は、予測可能かつ確実に外因性配列が機能し得るゲノムローカスへの外因性配列の安定的な組み込みに関する。
本開示は、予測可能かつ確実に外因性配列が機能し得るゲノムローカスへの外因性配列の安定的な組み込みに関する。
【背景技術】
【0003】
背景技術
従来の細胞株工学のアプローチは、宿主細胞のゲノム内にランダムに導入遺伝子を挿入する方法を用いていた。このような工学的アプローチにより、組み換え治療用タンパク質発現のための高生産性細胞株が開発されてきた。しかし、かかる組み換え方法は、不安定な細胞株、および同じ分子の発現における発現量やタンパク質の不均一性が著しく異なるクローン集団の原因となる。これらの問題を回避するために、導入遺伝子の部位特異的な標的組み込みが、組み換え治療用タンパク質の発現には望まれている。
従来の細胞株工学のアプローチは、宿主細胞のゲノム内にランダムに導入遺伝子を挿入する方法を用いていた。このような工学的アプローチにより、組み換え治療用タンパク質発現のための高生産性細胞株が開発されてきた。しかし、かかる組み換え方法は、不安定な細胞株、および同じ分子の発現における発現量やタンパク質の不均一性が著しく異なるクローン集団の原因となる。これらの問題を回避するために、導入遺伝子の部位特異的な標的組み込みが、組み換え治療用タンパク質の発現には望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
部位特異的に標的化された導入遺伝子の組み込みを成功させる鍵は、組み込みの標的となる好適なゲノム上の位置（すなわち「セーフハーバー」）にある。この位置は、導入遺伝子または外因性配列挿入物に寛容（ａｍｅｎａｂｌｅ）でなくてはならず、導入遺伝子の安定発現および予測を可能にせねばならない、かつ細胞の成長および機能に干渉するものであってはならない。ヒト由来細胞株では、ＡＡＶＳ１のローカスに、好適な部位が同定されているが、しかし多くの細胞では、治療用タンパク質の生産のために用いる、実行可能な部位は同定されていない。よって、治療用タンパク質カセットまたはその他の外因性配列の組み込みを成功させるための、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびその他の細胞における、好適なゲノム位置を同定および検証する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
発明の概要
本開示の様々な態様のうち、少なくとも１つの外因性配列を細胞のゲノムＤＮＡへ安定的に組み込むための方法を提供する。この方法は、ＮＣＢＩ参照配列、ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位へ、この少なくとも１つの外因性配列を組み込む事を含む。
本開示の様々な態様のうち、少なくとも１つの外因性配列を細胞のゲノムＤＮＡへ安定的に組み込むための方法を提供する。この方法は、ＮＣＢＩ参照配列、ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位へ、この少なくとも１つの外因性配列を組み込む事を含む。
【0006】
本開示の別の態様としては、ゲノムＤＮＡに組み込まれた外因性配列を含む細胞を調製するための方法を包含する。この方法は、
（ａ）細胞に（ｉ）ＮＣＢＩ参照配列ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を導入する事：および
ｂ）ゲノム配列の標的部位に外因性配列が組み込まれるような条件下で細胞を維持する事、を含む。
（ａ）細胞に（ｉ）ＮＣＢＩ参照配列ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を導入する事：および
ｂ）ゲノム配列の標的部位に外因性配列が組み込まれるような条件下で細胞を維持する事、を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、安定的な組み込みに適した少なくとも１つの所定の標的部位において、ゲノムＤＮＡに組み込まれた少なくとも１つの外因性配列を含む、宿主細胞、好ましくは宿主細胞株を提供する。好適な所定の標的部位は、好ましくはＮＣＢＩ参照配列、ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログからなる群より選択されたゲノム配列内に位置する。
【0008】
本開示の他の態様および反復は、以下でより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
発明の詳細な説明
本開示は外因性配列の安定的な組み込みのためのゲノムローカス、および外因性配列を該ゲノムローカスに組み込むための方法を提供する。外因性配列は、それらが予測可能かつ確実に機能し得るこれらのゲノムローカスへと安定的に組み込まれる。したがって、該ゲノムローカスは「セーフハーバー」と呼ぶことができる。組み込まれた配列は、該ゲノムローカスにとどまり、かついかなる方法でも切除されず、または変更されない。例えば、この組み込まれた配列および隣接する配列は遺伝子サイレンシングまたは位置効果の対象とならない。加えて、組み込まれた外因性配列は、細胞内の遺伝子またはその他の染色体配列の機能に影響を与えない、すなわち全体的または局所的な遺伝子発現を変更せず、細胞の異常または欠損が無く、位置的な突然変異またはその他の副作用が無い、等。さらに、外因性配列がタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする場合、外因性配列の発現は安定的、効率的、一貫した、および予測可能なものである。
本開示は外因性配列の安定的な組み込みのためのゲノムローカス、および外因性配列を該ゲノムローカスに組み込むための方法を提供する。外因性配列は、それらが予測可能かつ確実に機能し得るこれらのゲノムローカスへと安定的に組み込まれる。したがって、該ゲノムローカスは「セーフハーバー」と呼ぶことができる。組み込まれた配列は、該ゲノムローカスにとどまり、かついかなる方法でも切除されず、または変更されない。例えば、この組み込まれた配列および隣接する配列は遺伝子サイレンシングまたは位置効果の対象とならない。加えて、組み込まれた外因性配列は、細胞内の遺伝子またはその他の染色体配列の機能に影響を与えない、すなわち全体的または局所的な遺伝子発現を変更せず、細胞の異常または欠損が無く、位置的な突然変異またはその他の副作用が無い、等。さらに、外因性配列がタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする場合、外因性配列の発現は安定的、効率的、一貫した、および予測可能なものである。
【0017】
（Ｉ）安定的な組み込みのためのゲノムローカス
本開示の１つの態様は、外因性配列を組み込むことができる、および外因性配列が予測可能かつ確実に機能し得る、哺乳類ゲノムローカスを提供する。安定的な組み込みのために適したゲノムローカスは、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＮＷ＿００３６１３９３４．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド９７９）、ＮＷ＿００３６１４１５９．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド３４６６）、ＮＷ＿００３６１３７３２．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド１７２１）、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内に位置する。上記のＲｅｆＳｅｑは、チャイニーズハムスターのゲノムからのコンティグ／スキャフォールドであるが、相同配列はその他の哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、など）のゲノムにも存在しており、これらの哺乳類細胞における安定的な組み込みのために用いることができる。
本開示の１つの態様は、外因性配列を組み込むことができる、および外因性配列が予測可能かつ確実に機能し得る、哺乳類ゲノムローカスを提供する。安定的な組み込みのために適したゲノムローカスは、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＮＷ＿００３６１３９３４．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド９７９）、ＮＷ＿００３６１４１５９．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド３４６６）、ＮＷ＿００３６１３７３２．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０スキャフォールド１７２１）、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内に位置する。上記のＲｅｆＳｅｑは、チャイニーズハムスターのゲノムからのコンティグ／スキャフォールドであるが、相同配列はその他の哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、など）のゲノムにも存在しており、これらの哺乳類細胞における安定的な組み込みのために用いることができる。
【0018】
好ましいローカスは、ＮＷ＿００３６１３９３４．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０ スキャフォールド９７９）のｂｐ１，０９０，０００からｂｐ１，１２７，０００の領域であり、この領域は５’側のトランスファーＲＮＡリジン（Ｔｒｎａｋ）遺伝子、および３’側のペルオキシソームＮＡＤＨピロホスファターゼ酵素（ＮＵＤＴ１２）遺伝子によって挟まれている。他の好ましいローカスは、ＮＷ＿００３６１４１５９．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０ スキャフォールド３４６６）のｂｐ３６５，０００ からｂｐ ３９５，０００の領域であり、この領域は５’側のＲＡＢ６相互作用ｇｏｌｇｉｎ（Ｇｏｒａｂ）遺伝子および３’側のペア中胚葉ホメオボックスタンパク質１（Ｐｒｒｘ１）によって挟まれている。他の好ましいローカスは、ＮＷ＿００３６１３７３２．１（ＣｒｉＧｒｉ＿１．０ スキャフォールド１７２１）のｂｐ１，９３５，０００からｂｐ１，９８５，０００の領域で、この領域は、５’側のアルファ－マンノシダーゼ２（Ｍａｎ２ａ１）遺伝子および３’側の膜貫通タンパク質２３２（Ｔｍｅｍ２３２）遺伝子によって挟まれている。
【0019】
各好ましいローカスのより正確な挿入位置を、参照ゲノムとしてＣＨＯＫ１Ｓ－ＨＺＤｖ１アセンブリ（ＧｅｎＢａｎｋアセンブリアクセッション：ＧＣＡ＿９００１８６０９５．１）を用いて決定した。Ｄ１４５部位は、（スキャフォールド：位置）０：２１２、３５７、１１５における挿入である。ＭＰ７部位は０：２１７、３３６、４３６-２１７、３３６、３４１における挿入である。ＭＰ５８部位は１：２８、５７０、９１８-２８、５７０、９１９における挿入である。
【0020】
ＩＩ．外因性配列の安定的な組み込みのための方法
本開示の別の態様は、１以上の外因性配列を細胞のゲノムＤＮＡへ安定的に組み込むための方法であって、ＮＣＢＩ参照配列ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位に、該少なくとも１つの外因性配列を組み込む事を含む、方法を提供する。この組み込まれた配列は細胞に副作用を及ぼさず、および組み込まれた配列の機能は予測可能であり、一貫しており、かつ再現性がある。
本開示の別の態様は、１以上の外因性配列を細胞のゲノムＤＮＡへ安定的に組み込むための方法であって、ＮＣＢＩ参照配列ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位に、該少なくとも１つの外因性配列を組み込む事を含む、方法を提供する。この組み込まれた配列は細胞に副作用を及ぼさず、および組み込まれた配列の機能は予測可能であり、一貫しており、かつ再現性がある。
【0021】
特に、この方法は、細胞に（ｉ）ＮＣＢＩ参照配列ＮＷ＿００３６１３９３４．１、ＮＷ＿００３６１４１５９．１、ＮＷ＿００３６１３７３２．１、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする標的指向性エンドヌクレアーゼ、および（ｉｉ）少なくとも１つの外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を組み込む事、および該少なくとも１つの外因性配列が細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で細胞を維持する事、を含む。
【0022】
外因性配列
本明細書で使用する場合、「外因性」配列とは、細胞にとって固有ではないヌクレオチド配列、または細胞ゲノム内でその本来の位置とは異なる位置にあるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用する場合、「外因性」配列とは、細胞にとって固有ではないヌクレオチド配列、または細胞ゲノム内でその本来の位置とは異なる位置にあるヌクレオチド配列を指す。
【0023】
いくつかの実施形態では、外因性配列はタンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、組み換えタンパク質、治療用タンパク質、または工業用タンパク質であり得る。好適なタンパク質の非限定的な例には、抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ／ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）因子、血液成分、酵素、栄養補助タンパク質、前述の何れかの機能性フラグメントもしくはバリアント、または前述のタンパク質および／またはその機能性フラグメントもしくはバリアントの何れかを含む融合タンパク質、を含む。
【0024】
その他の実施形態では、外因性配列はＲＮＡ分子、例えばノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードする。ｎｃＲＮＡの非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ－ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、スプライスリーダーＲＮＡ（ＳＬ ＲＮＡ）、テロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）、そのフラグメント、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、外因性配列はｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードし得る。
【0025】
さらなる他の実施形態では、外因性配列は、少なくとも１つのポリヌクレオチド改変酵素の少なくとも１つの認識配列を含む。別の言い方をすれば、外因性配列は、「ランディングパッド」を含み、ここで、ランディングパッドは、後の外因性配列の標的組み込みに用いられ得る。少なくとも１つのポリヌクレオチド改変酵素の認識配列は一般に、細胞ゲノムにおいて内因的に存在していない。細胞内に内因的に存在していない認識配列を選択することで、標的組み込みの割合を増加させ得る、および／または潜在的なオフターゲットな組み込みを減少させ得る。ポリヌクレオチド改変酵素は部位特異的リコンビナーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的リコンビナーゼの非限定的な例には、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、ラムダインテグラーゼ、ファイＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、およびＴＰ９０１－１リコンビナーゼを含み得る。部位特異的なリコンビナーゼは、当技術分野で公知の、特異的な認識配列（または認識部位）を認識する。例えば、ＣｒｅリコンビナーゼはＬｏｘＰ部位を認識し、およびＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴ部位を認識する。意図される標的指向性エンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質、を含む。これらの各標的指向性エンドヌクレアーゼを下記のセクション（ＩＩ）（ｃ）でさらに説明する。
【0026】
複数の認識配列が単一のランディングパッド内に存在していてもよく、ランディングパッドを２以上のポリペプチド改変酵素が逐次的に標的とすることで、２以上の外因性配列を挿入し得る。あるいは、ランディングパッド内に複数の認識配列が存在することで、同一の外因性配列の複数のコピーをランディングパッド内に挿入し得る。２つの外因性配列が、単一のランディングパッドに対する標的とされる場合、このランディングパッドは、第１ポリヌクレオチド改変酵素（第１のＺＦＮペアなど）の第１認識配列、および第２ポリヌクレオチド改変酵素（第２のＺＦＮペアなど）の第２認識配列、を含む。あるいは、または加えて、１以上の認識配列を含む個々のランディングパッドを細胞ゲノム内の複数位置に組み込むことで、組み換えタンパク質発現コンストラクトを含む外因性配列のマルチコピーの組み込みを可能にし得る。発現コンストラクトを含む外因性配列のマルチコピーで形質転換した細胞中では、タンパク質の発現上昇が観察され得る。あるいは、異なる発現カセットを含む複数のユニークな外因性配列が挿入された場合、同一または異なるランディングパッドどちらであっても、複数のタンパク質産物が同時に発現し得る。例えば、外因性ランディングパッドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上の認識配列を含み得る。２以上の認識配列を含む実施形態では、認識配列は、もう一つからユニークである（すなわち、異なるポリヌクレオチド改変酵素に認識される）、同一の反復配列である、または反復およびユニークな配列の組み合わせ、であり得る。
【0027】
当業者であれば、外因性配列が追加の配列を含み得ることを容易に理解するはずである。例えば、タンパク質およびＲＮＡをコードする配列は、目的の細胞内での発現のためにプロモーター調節配列と作動可能に連結し得る。外因性配列がタンパク質をコードする実施形態では、外因性配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）によって認識されるプロモーター配列と作動可能に連結し得る。Ｐｏｌ ＩＩプロモーター調節配列は、構成的であるか、調節される、または組織特異的であり得る。好適な構成的Ｐｏｌ ＩＩプロモーター調節配列には、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）－アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、そのフラグメント、または前述の何れかの組み合わせ。を含むがこれに限定されない。好適な調節されるＰｏｌ ＩＩプロモーター調節配列の例には、非限定的に、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールによって調節されるものが含まれる。組織特異的Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例には、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター調節配列は野生型であり得る、またはより効率的または効果的な発現のために修飾され得る。タンパク質をコードする配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル、など）、および／または転写終結配列と連結し得る。
【0028】
外因性配列がＲＮＡをコードする実施形態では、外因性配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター調節配列と作動可能に連結している。好適なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、哺乳類Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含むが、これに限定されない。ＲＮＡ－コーディング外因性配列はまた、転写終結配列と連結し得る。
【0029】
さらなる実施形態では、外因性配列は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、および／またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）をコードする配列と連結することができ、ＨＰＲＴ、ＤＨＦＲ、および／またはＧＳを増幅可能な選択可能マーカーとして使用してもよい。外因性配列はまた、少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子をコードする配列、および／または蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする配列に連結され得る。抗生物質耐性遺伝子の非限定的な例には、ブラスチジン、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ登録商標）、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１（Ｚｅｏｃｉｎ商標）に対する耐性をコードするものが含まれる。好適な蛍光タンパク質は非限定的に、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または任意のほかの好適な蛍光タンパク質、を含む。
【0030】
いくつかの好ましい実施形態では、ランディングパッドは、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を促進するように構成されている。そのような実施形態では、ランディングパッドは、選択可能マーカーをコードする配列、およびレポータータンパク質をコードする配列、およびポリペプチド改変酵素の第１および第２認識配列、を含む。これらのエレメントは、選択可能なマーカーをコードする配列およびレポータータンパク質をコードする配列が、ポリヌクレオチド改変酵素の第１および第２認識配列の間にあるように構成されている。特に好ましい実施形態では、レポータータンパク質をコードする配列は、ＧＦＰまたはｔｕｒｂｏＧＦＰなどの緑色蛍光タンパク質をコードし、選択可能なマーカーをコードする配列はピューロマイシンをコードし、第１および第２の認識配列は、Ｌｏｘ配列である。好適なＬｏｘ配列には、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ６６およびＬｏｘ６６／７１が含まれる。
【0031】
外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド
本方法は、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチドを細胞に導入する事を含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列は、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列によって挟まれ得る。例えば、外因性配列は上流の配列と下流の配列によって挟まれ得、ここで、上流および下流の配列は、ゲノム配列内の標的部位の両側の配列に対する実質的な配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、上流の配列とは、標的部位のすぐ上流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に下流の配列とは、標的部位のすぐ下流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド内の上流および下流の配列は、標的ゲノム配列とドナーポリヌクレオチド（外因性配列を含む）間の組み換えを促進するように選択される。
本方法は、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチドを細胞に導入する事を含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列は、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列によって挟まれ得る。例えば、外因性配列は上流の配列と下流の配列によって挟まれ得、ここで、上流および下流の配列は、ゲノム配列内の標的部位の両側の配列に対する実質的な配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、上流の配列とは、標的部位のすぐ上流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に下流の配列とは、標的部位のすぐ下流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド内の上流および下流の配列は、標的ゲノム配列とドナーポリヌクレオチド（外因性配列を含む）間の組み換えを促進するように選択される。
【0032】
本明細書で使用する場合、「実質的な配列同一性」という用語は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。よって、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド内の上流および下流の配列は、ゲノム配列内の標的部位に隣接する（すなわち上流または下流の）染色体配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し得る。特定の実施形態では、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド内の上流および下流の配列は、ゲノム配列内の標的部位に隣接する染色体配列と、約９５％または１００％の配列同一性を有する。上流または下流の隣接配列は、約１０ｂｐから約２５００ｂｐを含み得る。１つの実施形態では上流または下流の配列は約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００ｂｐを含み得る。例示的な上流または下流の隣接配列は約２０から約２００ｂｐ、２５から約１００ｂｐ、約４０ｂｐから約６０ｂｐを含み得る。特定の実施形態では、上流または下流の隣接配列は約２００から約５００ｂｐを含み得る。
【0033】
その他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列は、標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列によって挟まれ得る。例えば、外因性配列は、上流の配列および下流の配列によって挟まれ得、ここで上流および下流の配列は標的指向性エンドヌクレアーゼの認識配列を含む、よって、標的指向性エンドヌクレアーゼは、ゲノム配列内の標的部位に二本鎖切断を導入し、およびドナーポリヌクレオチド内にも二本鎖切断を導入し得るため、外因性配列はドナーポリヌクレオチドの残りの部分から放出され、外因性配列は切断されたゲノム配列に直接的にライゲーションされ得るため、よって外因性配列が細胞ゲノムへ組み込まれる。
【0034】
外因性配列を含むドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状であり得る。一般に、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。ドナーポリヌクレオチドはベクターであり得る。好適なベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを含む。好適なプラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそのバリアントを含む。ドナーポリヌクレオチドは、追加の調節配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など）、複製開始点、選択マーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）などを含み得る。追加情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ２００３、または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ、 ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 ２００１に見出すことができる。
【0035】
標的指向性エンドヌクレアーゼ
本方法はまた、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入する事を含む。標的指向性エンドヌクレアーゼはＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはプログラム可能であり、つまりそれが異なるＤＮＡ配列を認識して結合するように設計または操作されることができることを意味する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡとの間の相互作用により媒介される。ゆえに、ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質工学により目的のＤＮＡ配列に結合するようにプログラムされることができる。その他の実施形態において、ＤＮＡ結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡと相互作用するガイドＲＮＡによって媒介される。かかる場合、ＤＮＡ結合ドメインは、好適なガイドＲＮＡを設計することにより、目的のＤＮＡ配列を標的とする事ができる。
本方法はまた、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入する事を含む。標的指向性エンドヌクレアーゼはＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはプログラム可能であり、つまりそれが異なるＤＮＡ配列を認識して結合するように設計または操作されることができることを意味する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡとの間の相互作用により媒介される。ゆえに、ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質工学により目的のＤＮＡ配列に結合するようにプログラムされることができる。その他の実施形態において、ＤＮＡ結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡと相互作用するガイドＲＮＡによって媒介される。かかる場合、ＤＮＡ結合ドメインは、好適なガイドＲＮＡを設計することにより、目的のＤＮＡ配列を標的とする事ができる。
【0036】
好適な標的指向性エンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質、を含む。標的指向性エンドヌクレアーゼは、野生型または天然に存在するＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼドメイン、改変型の天然に存在するＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼドメイン、合成または人工のＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼドメイン、またはその組み合わせ、を含み得る。
【0037】
（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮはＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域、およびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー領域は、約２から７個のジンクフィンガー、例えば約４から６個のジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは３つのヌクレオチドに結合し、およびジンクフィンガーは好適なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。ジンクフィンガー領域は任意のＤＮＡ配列を認識し、かつ結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０－３３８６０；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２－７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８０９－５８１４、を参照。ＤＮＡ配列内の潜在的な標的部位を同定する、およびジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、一般に公開されているウェブベースのツールは当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮはＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域、およびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー領域は、約２から７個のジンクフィンガー、例えば約４から６個のジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは３つのヌクレオチドに結合し、およびジンクフィンガーは好適なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。ジンクフィンガー領域は任意のＤＮＡ配列を認識し、かつ結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０－３３８６０；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２－７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８０９－５８１４、を参照。ＤＮＡ配列内の潜在的な標的部位を同定する、およびジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、一般に公開されているウェブベースのツールは当技術分野で公知である。
【0038】
ＺＦＮはまた、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得られるヌクレアーゼドメインを含む。ヌクレアーゼドメインの由来となり得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。切断ドメインはまた、切断活性のために二量体形成を必要とする酵素またはその一部に由来するものでもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含むため、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされ得る。２つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのそれぞれの認識部位への結合によって、切断単量体が互いに空間的に配向するように配置され、切断単量体が活性酵素二量体を形成することが可能になる（例えば、二量体化することによって）ように、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位は一般に配置される。その結果、認識部位の端近傍は、約５から約１８ヌクレオチドで分離することができる。例えば、端近傍は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドによって分離することができる。
【0039】
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型－Ｓ制限エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ型－Ｓエンドヌクレアーゼは、認識／結合部位から典型的には数塩基対離れている部位でＤＮＡを切断し、そのため分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。これらの酵素は一般に、一時的に結びついて二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を切断するモノマーである。好適なＩＩ型－Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であり得る。ＩＩ型－Ｓヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量化を促進するように改変されることができる。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異させることにより改変されることができる。非限定的な例として、位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８における、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインのアミノ酸残基は、改変の標的である。例えば、１つの改変ＦｏｋＩドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ変異を含み得、およびその他の改変ＦｏｋＩドメインはＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ変異を含み得る。
【0040】
ＺＦＮは、少なくとも1つの核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含み得、これらは下記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｖｉｉ）に記載される。
【0041】
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム
その他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはＲＮＡにガイドされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムであり得、これはＤＮＡに二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。
その他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはＲＮＡにガイドされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムであり得、これはＤＮＡに二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。
【0042】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩ型（すなわちＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥまたはＩＦ）、ＩＩ型（すなわちＩＩＡ、ＩＩＢまたはＩＩＣ）、ＩＩＩ型（すなわちＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）またはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、これらは様々な細菌および古細菌中に存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ システムは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｓｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｓｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、ｏｒ Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｓｐ、に由来し得る。
【0043】
好適なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆタンパク質、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、およびその誘導体またはそのバリアントを含む。具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃｐｆ１タンパク質、またはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であり得る。その他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であり得る。代替的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であり得る。さらにその他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）であり得る。
【0044】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含み、これはガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得、およびＣｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインを含み得る。
【0045】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、少なくとも1つの核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含み得、これらは下記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｖｉｉ）に記載される。
【0046】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムはまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと相互作用し、ゲノム配列内の標的部位にヌクレアーゼを誘導する。標的部位は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している事を除いて配列の制限がない。例えば、Ｃａｓ９用のＰＡＭ配列には、３’－ＮＧＧ、３’－ＮＧＧＮＧ、３’－ＮＮＡＧＡＡＷ、および３’－ＡＣＡＹを含み、およびＣｐｆ１用のＰＡＭ配列には、５’－ＴＴＮ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド、ＷはＡまたはＴのどちらか、およびＹはＣまたはＴのどちらか、と定義される）を含む。各ｇＲＮＡは標的配列に相補的な配列を含む（例えば、Ｃａｓ９のｇＲＮＡはＧＮ１７－２０ＧＧを含み得る）。ｇＲＮＡはまた、ステムループ構造および一本鎖領域を形成するスキャフォールド配列を含む。このスキャフォールド領域は、どのｇＲＮＡにおいても同一であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは単一分子（すなわち、ｓｇＲＮＡ）であり得る。その他の実施形態では、ｇＲＮＡは２つの別々の分子（すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）であり得る。
【0047】
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム。
その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはペアＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＤＮＡの一本鎖のみを切断するように改変されている事を除いて上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムに類似している。したがって、単一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムは二本鎖ＤＮＡに一本鎖切断またはニックを作り出す。あるいは、オフセットｇＲＮＡのペアを含むペアＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム（または二重ニッカーゼシステム）は、一本鎖切断をＤＮＡの反対の鎖にも発生させることで、ＤＮＡの二本鎖切断を生成し得る。
その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはペアＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＤＮＡの一本鎖のみを切断するように改変されている事を除いて上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムに類似している。したがって、単一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムは二本鎖ＤＮＡに一本鎖切断またはニックを作り出す。あるいは、オフセットｇＲＮＡのペアを含むペアＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム（または二重ニッカーゼシステム）は、一本鎖切断をＤＮＡの反対の鎖にも発生させることで、ＤＮＡの二本鎖切断を生成し得る。
【0048】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、１以上の変異および／または欠失によってニッカーゼへと転換され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼはヌクレアーゼドメインのうちの１つに１以上の変異を含み得、ここで該１以上の変異はＲｕｖＣ様ドメイン内のＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａであり得る、または該１以上の変異はＨＮＨ様ドメイン内のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、および／またはＮ８６３Ａで有り得る。
【0049】
（ｉｖ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
代替的な実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり得る。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結した、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する高度に保存された反復配列で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは植物病原菌キサントモナスによって分泌されるタンパク質であり、宿主植物細胞において遺伝子の転写を変化させる（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１３（１２）：１３２２－９）。ＴＡＬＥ反復アレイは目的の任意のＤＮＡ配列を標的とするように、モジュラータンパク質設計を介して操作され得る。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｉ）に記載されているあらゆるヌクレアーゼドメインであり得る。具体的な実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩに由来する（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１）：１７１－１９２）。
代替的な実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり得る。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結した、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する高度に保存された反復配列で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは植物病原菌キサントモナスによって分泌されるタンパク質であり、宿主植物細胞において遺伝子の転写を変化させる（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１３（１２）：１３２２－９）。ＴＡＬＥ反復アレイは目的の任意のＤＮＡ配列を標的とするように、モジュラータンパク質設計を介して操作され得る。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｉ）に記載されているあらゆるヌクレアーゼドメインであり得る。具体的な実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩに由来する（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１）：１７１－１９２）。
【0050】
ＴＡＬＥＮはまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインを含み得、これらは下記セクション（ＩＩ）（ｃ）（ｖｉｉ）に記載される。
【0051】
（ｖ）メガヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼ
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列（すなわち、認識配列が一般に約１２塩基対～約４５塩基対の範囲である）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要求の結果として、認識配列は一般に、所定のあらゆるゲノムにおいて一度しか生じない。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーはゲノムの研究およびゲノム操作のための有用なツールとなっている（Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４（１－２）：２７－３１）。その他の好適なメガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩおよびそれらのバリアントであり得る。メガヌクレアーゼは当技術分野で当業者に公知の技術を用いてその認識配列を改変することによって、特定の染色体配列を標的とし得る。
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列（すなわち、認識配列が一般に約１２塩基対～約４５塩基対の範囲である）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要求の結果として、認識配列は一般に、所定のあらゆるゲノムにおいて一度しか生じない。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーはゲノムの研究およびゲノム操作のための有用なツールとなっている（Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４（１－２）：２７－３１）。その他の好適なメガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩおよびそれらのバリアントであり得る。メガヌクレアーゼは当技術分野で当業者に公知の技術を用いてその認識配列を改変することによって、特定の染色体配列を標的とし得る。
【0052】
代替的な実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはレアカットエンドヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。レアカットエンドヌクレアーゼは部位特異的なエンドヌクレアーゼであり、その認識配列はゲノム内にまれに生じる（好ましくはゲノム内に一度しか生じない）。レアカットエンドヌクレアーゼは、７ヌクレオチドの配列、８ヌクレオチドの配列、またはそれよりも長い認識配列を認識し得る。レアカットエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、およびＳｂｆＩを含む。
【0053】
メガヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインを含み得、これらは下記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｖｉｉ）に記載される。
【0054】
（ｖｉ）ヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインおよびプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。このヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｉ）に記載されているヌクレアーゼドメインのいずれか、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、またはＣｐｆ１のヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカットエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインであり得る。
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインおよびプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。このヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｉ）に記載されているヌクレアーゼドメインのいずれか、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、またはＣｐｆ１のヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカットエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインであり得る。
【0055】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、全てのヌクレアーゼ活性が欠損するように改変された（すなわち、触媒不活性な）標的指向性エンドヌクレアーゼ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ）に由来し得る。あるいは、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、例えばジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥなどのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質であり得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失によって除去された触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。例えば、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、および／またはＮ８６３Ａ変異を含む、触媒不活性な（ＤＥＡＤ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン内に相当する変異を含む触媒不活性な（ＤＥＡＤ）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。さらなる他の実施形態において、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失によって除去された触媒不活性なメガヌクレアーゼであり得、例えば、触媒不活性なメガヌクレアーゼはＣ末端短縮化を含み得る。
【0057】
ヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質はまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインを含み得、これらは下記のセクション（ＩＩ）（ｃ）（ｖｉｉ）に記載される。
【0058】
（ｖｉｉ）任意の追加ドメイン
標的指向性エンドヌクレアーゼは、追加ドメインをさらに含み得る。例えば、標的指向性エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインをさらに含み得る。
標的指向性エンドヌクレアーゼは、追加ドメインをさらに含み得る。例えば、標的指向性エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインをさらに含み得る。
【0059】
特定の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは少なくとも１つのＮＬＳを含み得る。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸のストレッチを含む。核移行シグナルは当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５）。例えば、１つの実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）などの、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列で有り得る。別の実施形態では、ＮＬＳはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）などの双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列で有り得る。
【0060】
その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含み得る。１つの実施形態では、細胞透過性ドメインはＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質に由来する細胞透過性ペプチド配列であり得る。例として、ＴＡＴ細胞透過性配列はＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）であり得る。別の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞透過性ペプチド配列である、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号５）であり得る。さらに別の実施形態では、細胞透過性ドメインはＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号６、またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７）で有り得る。追加の実施形態では、細胞透過性ドメインはＰｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号８）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列であり得る。
【0061】
さらなる他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのマーカードメインを含み得る。マーカードメインの非限定的な例には、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）またはその他の任意の好適な蛍光タンパク質、を含む。その他の実施形態では、マーカードメインは精製タグ、および／またはエピトープタグであり得る。好適なタグには、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリン、を含むが、これに限定されない。
【0062】
１以上の追加ドメインは、標的指向性エンドヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。あるいは、１以上の追加ドメインは、標的指向性エンドヌクレアーゼに直接融合するか、またはリンカーを介して融合し得る。好適なリンカーの例は当技術分野で公知であり、およびリンカーを設計するプログラムは容易に入手できる（Ｃｒａｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，２０００，１３（５）：３０９－３１２）。
【0063】
上記の標的指向性エンドヌクレアーゼは、当技術分野で公知の技術を用いて、真核細胞または細菌細胞において発現される、およびそれらから精製され得る。
【0064】
（ｖｉｉｉ）標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入される。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、直鎖状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡは、目的の真核細胞内で効率的にタンパク質に翻訳されるために、コドン最適化され得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または市販のソースから入手できる。いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、および細胞への導入のために精製され得る。ｍＲＮＡは５’キャッピングおよび／または３’ポリアデニル化され得る。その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、目的の細胞における発現のために、少なくとも１つのプロモーター調節配列と作動可能に連結され得る。さらなる態様では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列と連結され得る。
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入される。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、直鎖状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡは、目的の真核細胞内で効率的にタンパク質に翻訳されるために、コドン最適化され得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または市販のソースから入手できる。いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、および細胞への導入のために精製され得る。ｍＲＮＡは５’キャッピングおよび／または３’ポリアデニル化され得る。その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、目的の細胞における発現のために、少なくとも１つのプロモーター調節配列と作動可能に連結され得る。さらなる態様では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列と連結され得る。
【0065】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡであるコード配列は、目的の真核細胞における発現のために真核生物のプロモーター配列に作動可能に連結され得る。真核生物のプロモーター調節配列は構成的であるか、調節される、または細胞または組織特異的であり得る。好適な真核生物構成的プロモーター調節配列は、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）－アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、そのフラグメント、または前述のいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。好適な真核生物の調節されるプロモーター調節配列の例は、非限定的に、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより調節されるものを含む。組織特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は、野生型であるか、またはより効率的または効果的な発現のために修飾され得る。
【0066】
様々な実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡはＤＮＡコンストラクト内に存在し得る。好適なコンストラクトには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を含む。１つの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡはプラスミドベクター内に存在する。好適なプラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそのバリアントを含む。ベクターは追加の発現調節配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ 配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製開始点などを含み得る。追加情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ２００３、または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ、 ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 ２００１に見出すことができる。
【0067】
標的指向性エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質またはそのバリアントである実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質またはそのバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターは、１以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。一般に、ガイドＲＮＡをコードする配列は、目的の細胞におけるガイドＲＮＡの発現のために、少なくとも１つの転写調節配列と作動可能に連結され得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）に認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。好適なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、哺乳類のＵ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含むが、これに限定されない。
【0068】
細胞への導入
本方法は、（ｉ）標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を細胞に導入することを含む。標的化ヌクレアーゼがタンパク質（すなわち、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ）である実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、（ｉ）精製タンパク質、（ｉｉ）コーディングＲＮＡ、または（ｉｉｉ）コーディングＤＮＡ、として細胞に導入され得る。標的指向性エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムである実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、（ｉ）タンパク質－ガイドＲＮＡ複合体として、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと一緒に、タンパク質として、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと一緒に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ヌクレアーゼをコードするＲＮＡとして、または（ｉｖ）ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両者をコードするＤＮＡとして、細胞に導入され得る。
本方法は、（ｉ）標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を細胞に導入することを含む。標的化ヌクレアーゼがタンパク質（すなわち、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ）である実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、（ｉ）精製タンパク質、（ｉｉ）コーディングＲＮＡ、または（ｉｉｉ）コーディングＤＮＡ、として細胞に導入され得る。標的指向性エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムである実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、（ｉ）タンパク質－ガイドＲＮＡ複合体として、（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと一緒に、タンパク質として、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと一緒に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ヌクレアーゼをコードするＲＮＡとして、または（ｉｖ）ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両者をコードするＤＮＡとして、細胞に導入され得る。
【0069】
標的指向性エンドヌクレアーゼ分子およびドナーポリヌクレオチドは、様々な手段で細胞内に導入することができる。好適な送達手段には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、独自の薬剤で増強された核酸の取り込み、ならびにリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、もしくは人工ビリオンを介した送達を含む。特定の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼ分子およびドナーポリヌクレオチドは、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入される。
【0070】
１以上の標的指向性エンドヌクレアーゼ分子、および１以上のドナーポリヌクレオチドが細胞に導入される実施形態では、これらの分子は同時に、または逐次的に導入され得る。例えば、各標的部位に特異的な標的指向性エンドヌクレアーゼ分子、およびドナーポリヌクレオチドは同時に導入され得る。あるいは、各標的指向性エンドヌクレアーゼ分子およびドナーポリヌクレオチドは逐次的に導入され得る。
【0071】
細胞培養
本方法は、外因性配列がゲノム配列の標的部位に組み込まれるのに適切な条件下で細胞を維持する事をさらに含む。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位に二本鎖切断を導入し、外因性配列は、相同配列指向性プロセスによってゲノム配列に組み込まれる。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位およびドナーポリヌクレオチド内の外因性配列を挟む認識配列に二本鎖切断を導入し、外因性配列は直接的なライゲーションプロセスによってゲノム配列に組み込まれる。
本方法は、外因性配列がゲノム配列の標的部位に組み込まれるのに適切な条件下で細胞を維持する事をさらに含む。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位に二本鎖切断を導入し、外因性配列は、相同配列指向性プロセスによってゲノム配列に組み込まれる。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位およびドナーポリヌクレオチド内の外因性配列を挟む認識配列に二本鎖切断を導入し、外因性配列は直接的なライゲーションプロセスによってゲノム配列に組み込まれる。
【0072】
一般に、細胞は、細胞増殖および／または維持のために適切な条件で維持される。好適な細胞培養条件は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５：５８０９－５８１４、Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ １０４：３０５５－３０６０、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６－６５１、およびＬｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９８－１３０６に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当技術分野で公知であり、細胞の種類に応じて異なり得る事を理解する。どのような場合においても、特定の細胞種に対して最良の技術を決めるために、通常行われる最適化が行われ得る。
【0073】
外因性配列の組み込みは、ＰＣＲ（例えば、ジャンクションＰＣＲ）、ＤＮＡシーケンシング、フローサイトメトリー（例えば、外因性配列が蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含む場合）、選択技術（例えば、外因性配列が抗生物質耐性遺伝子をさらに含む場合）、および当技術分野で公知のその他の方法によって確認され得る。
【0074】
外因性配列は、安定的に細胞のゲノムへ組み込まれる。特に、組み込まれた配列はゲノムローカスに留まり、かついかなる方法でも切除または変更されない。例えば、この組み込まれた配列および／または隣接する配列は遺伝子サイレンシングまたは位置効果の対象とならない。加えて、組み込まれた外因性配列は、細胞内の遺伝子またはその他の染色体配列の機能に影響を与えない、すなわち全体的または局所的な遺伝子発現を変更しない、細胞の異常または欠損が無い、位置的な突然変異の誘発またはその他の副作用が無い、等。組み込まれた配列は予測可能かつ確実に機能する事ができる。例えば、外因性配列がタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする場合、外因性配列の発現は安定的、効率的、一貫した、および予測可能なものである。あるいは、外因性配列がポリヌクレオチド改変酵素の１以上の認識配列を含む場合、外因性配列は目的の配列の後続の組み込みのためのランディングパッドとして使用され得る。
【0075】
（ｆ）細胞の種類。
好適な細胞には哺乳類細胞または哺乳類細胞株を含む。好適な哺乳類細胞の非限定的な例は、以下を含む：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス胚線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚間葉Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、またはヒトＫ５６２細胞。哺乳動物細胞系の広範なリストは、アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）において見いだされてもよい。
好適な細胞には哺乳類細胞または哺乳類細胞株を含む。好適な哺乳類細胞の非限定的な例は、以下を含む：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス胚線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚間葉Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、またはヒトＫ５６２細胞。哺乳動物細胞系の広範なリストは、アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）において見いだされてもよい。
【0076】
様々な実施形態では、細胞株は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）またはその組み合わせを欠損させられ得る。例えば、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴをコードする染色体配列は不活性化され得る。特定の実施形態では、細胞株においてＧＳをコードする全ての染色体配列は不活性化される。
【0077】
例示的な実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。多数のＣＨＯ細胞株が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できる。好適なＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびその派生を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯＺＮ ＧＳ－／－、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｓ、またはＣＨＯ－Ｋ１ＳＶであり得る。
【0078】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ およびＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに帰する意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ およびＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに帰する意味を有する。
【0079】
本開示の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」という冠詞は、１つまたは複数の要素が存在することを意味することが意図されている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図されており、記載された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
【0080】
本明細書で使用される場合、「内因性配列」という用語は、細胞に固有の染色体配列を指す。
【0081】
「外因性配列」という用語は、細胞に固有ではない染色体配列、または異なる染色体位置に移動した染色体配列を指す。
【0082】
「遺伝子改変された」細胞とは、ゲノムが改変された細胞を指し、すなわち、その細胞は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むように操作された少なくとも１つの染色体配列を含む。
【0083】
「ゲノム改変」および「ゲノム編集」という用語は、それによって染色体配列が改変されるように特定の染色体配列が変えられるプロセスを指す。染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むように改変されてもよい。改変された染色体配列は、産物が作られないように不活性化される。あるいは、変更された産物が作られるように、染色体配列は改変され得る。
【0084】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節するすべてのＤＮＡ領域を指す。その結果、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位、およびローカス調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【0085】
「異種」という用語は、目的の細胞または種に固有ではないものを指す。
【0086】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の立体配座のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分で改変されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対特異性を有する、すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対をなす。核酸またはポリヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミダイト結合、またはその組合せによって連結されていてもよい。
【0087】
「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログとは、改変されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または改変されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然に存在するヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の改変の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子を他の原子（例えば、７－デアザプリン）で置換することを含む。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノを含む。
【0088】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。
【0089】
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、改変または編集されるべき染色体またはゲノム配列の一部を定義する核酸配列を指し、結合および切断のための十分な条件が与えられた場合には、標的指向性エンドヌクレアーゼが認識、結合、および切断するように操作された核酸配列を指す。
【0090】
「上流」および「下流」という用語は、固定位置に対する核酸配列内の位置を指す。上流とは、位置に対して５’（すなわち、鎖の５’末端に近い）である領域を表し、下流とは、位置に対して３’（すなわち、鎖の３’末端に近い）である領域を指す。
【0091】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、このような方法で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２またはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアライメントされた配列間の完全一致の数を短い方の配列の長さで割ったものを１００倍したものである。核酸配列に対する近似的なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ およびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ およびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを用いて、アミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例となる実装は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」ユーティリティアプリケーションで提供されている。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、一般に当技術分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０；期待値＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記載＝５０配列、ソート＝ハイスコア、データベース＝冗長性なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウェブサイトに見出すことができる。本明細書に記載の配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８０％から１００％、およびその間の任意の整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０から７５％、好ましくは８０から８２％、より好ましくは８５から９０％、さらにいっそう好ましくは９２％、さらにいっそう好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【0092】
本発明の範囲を逸脱することなく、上記の細胞および方法に様々な変更を加えることができるので、上述した説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、例示的なものとして解釈されることが意図されており、限定的な意味で解釈されるものではない。
【実施例】
【0093】
実施例
以下の実施例は本発明の特定の態様を説明する。
以下の実施例は本発明の特定の態様を説明する。
【0094】
実施例１：ＣＨＯ細胞株における、ランダムに組み込んだ導入遺伝子のゲノムローカスの同定
アプローチ１。ＧＦＰ発現カセットランディングパッドと、それを挟むＬｏｘ部位、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ２２７２を含む、プラスミドＣＬＥ３８５のランダムな組み込み（図１Ａを参照）。ＧＦＰ高発現な単一コピークローンを同定し、評価した。そこで、ランダムに組み込まれたランディングパッドのコンティグアクセッション番号およびコンティグ内の位置を決定するために、組み込みイベントを挟むゲノム配列を、入手可能なＣＨＯデータベースに対してＢｌａｓｔした。
アプローチ１。ＧＦＰ発現カセットランディングパッドと、それを挟むＬｏｘ部位、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ２２７２を含む、プラスミドＣＬＥ３８５のランダムな組み込み（図１Ａを参照）。ＧＦＰ高発現な単一コピークローンを同定し、評価した。そこで、ランダムに組み込まれたランディングパッドのコンティグアクセッション番号およびコンティグ内の位置を決定するために、組み込みイベントを挟むゲノム配列を、入手可能なＣＨＯデータベースに対してＢｌａｓｔした。
【0095】
アプローチ２。モノクローナル抗体発現カセットランディングパッドとそれを挟むＬｏｘ部位、５’のＬｏｘＰおよびＬｏｘＮ、および３’のＬｏｘ２２７２を含むプラスミドＣＬＥ３９９のランダムな組み込み（図１Ｂを参照）。ｍＡｂ高発現単一コピークローンを同定し、評価した。そして、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を、ＧＦＰ発現カセットＣＬＥ４１６を交換するために用い、およびＧＦＰ高発現クローンを同定し、評価した（図１Ｂを参照）。ランダムに組み込まれたランディングパッドのコンティグのアクセッション番号およびコンティグ内の位置を決定するために、組み込みイベントを挟むゲノム配列を、入手可能なＣＨＯデータベースに対してＢｌａｓｔした。
【0096】
この結果を、表１に示す。
【表1】
【0097】
実施例２ ゲノムローカスＤ１４５の評価
ランディングパッドＣＬＥ３８５を持つクローン（クローンＤ１４５）を単離した。このクローンにおいて、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を行った。簡単に説明すると、ランディングパッドＣＬＥ３８５と互換性のあるＬｏｘ部位に挟まれたｍＡｂカセットを含むプラスミドドナー（ＣＬＥ３８９、図１Ａ）を、Ｃｒｅ ｍＲＮＡと一緒に、このクローンにエレクトロポレーション法で導入した。ＲＭＣＥが成功した後では、ＣＬＥ３８５ランディングパッドはＣＬＥ３８９のドナーカセットと交換されているだろう。グルタミン選択の後、得られたプールをフローサイトメトリーで解析し（図２）、Ｄ１４５親クローン、およびＣｒｅ ｍＲＮＡ非添加でドナーのみを用いて生成されたプールと比較した。ドナーのみプールと比較すると、ＲＭＣＥプールの大多数の細胞がＧＦＰ発現からｍＡｂ発現へとシフトしていた。ＰＣＲプライマーを、その増幅イベントが、ｍＡｂ発現カセットがＤ１４５ローカスに特異的かつ正しく挿入された場合にのみ生じるように設計した。増幅は、５プライムおよび３プライムのジャンクションの両方で成功した（図３）。
ランディングパッドＣＬＥ３８５を持つクローン（クローンＤ１４５）を単離した。このクローンにおいて、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を行った。簡単に説明すると、ランディングパッドＣＬＥ３８５と互換性のあるＬｏｘ部位に挟まれたｍＡｂカセットを含むプラスミドドナー（ＣＬＥ３８９、図１Ａ）を、Ｃｒｅ ｍＲＮＡと一緒に、このクローンにエレクトロポレーション法で導入した。ＲＭＣＥが成功した後では、ＣＬＥ３８５ランディングパッドはＣＬＥ３８９のドナーカセットと交換されているだろう。グルタミン選択の後、得られたプールをフローサイトメトリーで解析し（図２）、Ｄ１４５親クローン、およびＣｒｅ ｍＲＮＡ非添加でドナーのみを用いて生成されたプールと比較した。ドナーのみプールと比較すると、ＲＭＣＥプールの大多数の細胞がＧＦＰ発現からｍＡｂ発現へとシフトしていた。ＰＣＲプライマーを、その増幅イベントが、ｍＡｂ発現カセットがＤ１４５ローカスに特異的かつ正しく挿入された場合にのみ生じるように設計した。増幅は、５プライムおよび３プライムのジャンクションの両方で成功した（図３）。
【0098】
実施例３ ＭＰ７ゲノムローカスの評価
ＭＰ７部位は、アプローチ２で同定され、およびＣＬＥ４１６を用いて再標的化し、ＧＦＰランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。そして、このプールを、対応するＬｏｘ部位を含むｍＡｂ発現プラスミドで標的化し、抗体の分泌を試験した。ＭＰ７をＺＦＮおよび新規のランディングパッドで再標的化する試みが進行中である（図４）。
ＭＰ７部位は、アプローチ２で同定され、およびＣＬＥ４１６を用いて再標的化し、ＧＦＰランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。そして、このプールを、対応するＬｏｘ部位を含むｍＡｂ発現プラスミドで標的化し、抗体の分泌を試験した。ＭＰ７をＺＦＮおよび新規のランディングパッドで再標的化する試みが進行中である（図４）。
【0099】
実施例４ ゲノムローカスＭＰ５８の評価
ＭＰ５８部位は、アプローチ２で同定され、およびＣＬＥ４１６を用いて再標的化し、ＧＦＰランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。ＺＮＦはこの部位に新規のランディングパッドを設置する事を目的として設計された（図５）。
ＭＰ５８部位は、アプローチ２で同定され、およびＣＬＥ４１６を用いて再標的化し、ＧＦＰランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。ＺＮＦはこの部位に新規のランディングパッドを設置する事を目的として設計された（図５）。
【0100】
初期培養物および後期培養物において、ＭＰ５８部位から生じたモノクローナル抗体の産生を、標準的な成長および産生能解析によって測定した。簡単に説明すると、５０ｍｌのシェイクチューブ中で、３ｘ１０５細胞／ｍｌの初期播種密度で３０ｍｌの細胞培養を開始し、標準的なフィード条件で定期的に補いながら培養した。細胞培養物を回収し、分泌されたモノクローナル抗体の濃度を分析しながら、成長と生存率を観察した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ、図６）。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】