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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-16
(54)【発明の名称】免疫増強用マンガン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 33/32 20060101AFI20220609BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/205 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/125 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/21 20060101ALI20220609BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220609BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220609BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220609BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20220609BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220609BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20220609BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220609BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220609BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220609BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220609BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220609BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20220609BHJP
【ＦＩ】
A61K33/32
A61K39/12
A61K39/205
A61K39/245
A61K39/215
A61K39/125
A61K39/145
A61K39/155
A61K39/21
A61P31/04
A61P31/10
A61P31/12
A61P33/00
A61P35/00
A61P37/00
A61P35/02
A61P25/00
A61P29/00
A61P17/06
A61P3/10
A61K39/39
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021561978
(86)(22)【出願日】2020-04-20
(85)【翻訳文提出日】2021-11-22
(86)【国際出願番号】 CN2020085507
(87)【国際公開番号】W WO2020211857
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】201910319344.1
(32)【優先日】2019-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．Ｓｐａｎ
(71)【出願人】
【識別番号】507232478
【氏名又は名称】北京大学
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】蒋 争凡
(72)【発明者】
【氏名】王 晨光
(72)【発明者】
【氏名】張 睿
(72)【発明者】
【氏名】呂 梦澤
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C085AA02
4C085AA38
4C085BA55
4C085BA64
4C085BA65
4C085BA71
4C085BA78
4C085CC08
4C085FF01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA09
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZB07
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZB37
4C086ZC31
(57)【要約】
本発明は、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを含む免疫増強用組成物及びワクチン組成物、その調製方法、並びに免疫増強及び／又はワクチン接種におけるそれらの用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン、及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む免疫増強用組成物。
【請求項2】
免疫アジュバントとして使用される請求項１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項3】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる請求項１又は２に記載の免疫増強用組成物。
【請求項4】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物。
【請求項5】
Ａ）ワクチン免疫原と、Ｂ）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢが同一及び／又は別々の容器に収容されることができる、ワクチン組成物。
【請求項6】
前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、請求項５又は６に記載のワクチン組成物。
【請求項8】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項５～７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
１）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む免疫増強用組成物の製造方法。
【請求項10】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
１）ワクチン免疫原を与えることと、２）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、を含むワクチン組成物の製造方法。
【請求項13】
前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
免疫増強用組成物又はワクチン組成物の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途。
【請求項17】
前記免疫増強用組成物は、免疫アジュバントである、請求項１６に記載の用途。
【請求項18】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、請求項１６又は１７に記載の用途。
【請求項19】
前記新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の用途。
【請求項20】
前記免疫増強は、自然免疫及び／又は適応免疫を改善することである、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の用途。
【請求項21】
前記免疫増強は、Ｉ型インターフェロンの発現を増加させることである、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
【請求項22】
前記免疫増強は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生することである、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
【請求項23】
前記免疫増強は、抗体の産生を促進することである、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
【請求項24】
それを必要とする対象に請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物又は請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法で得られる免疫増強用組成物を投与することを含む免疫増強用方法において、具体的には、前記免疫増強は、例えば、
Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、
Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加すること、
Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、
Ｄ）抗体の産生を促進する、
Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又は
Ｆ）樹状細胞の成熟を促進することである方法。
【請求項25】
前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
さらに、前記対象に別の予防／治療剤を投与することを含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
それを必要とする対象に請求項５～８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を投与し、ここで、成分Ａ及び成分Ｂが異なる容器にある場合には同時又は異なる時点で投与すること、及び／又は、それを必要とする対象に請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物、及び任意に選択してもよいワクチン免疫原を投与することを含む、免疫接種方法。
【請求項34】
前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記免疫接種は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を予防するために使用される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
さらに、前記対象に別の予防剤を投与することを含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本出願は、２０１９年０４月１９日に中国特許庁へ提出された、出願番号が２０１９１０３１９３４４．１である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、免疫増強用２価のマンガンコロイド又は新たに生成した２価のマンガンの沈殿物、及び、例えば、免疫アジュバント、抗ウイルス又は抗腫瘍用として使用できる免疫増強におけるその用途を提供する。
【背景技術】
【0003】
生体は、自然免疫系及び適応免疫系により外来病原体から生体を保護する。自然免疫は、適応免疫を促進する効果がある。生体が病原体に感染すると、最初に自然免疫応答を開始し、パターン認識受容体を介して病原体関連分子パターンを認識し、さまざまなシグナル伝達経路、例えば、ＴＬＲ経路（１）、ＲＬＲ経路（２）、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路（３）、インフラマソームの活性化（４）などを活性化し、これらの経路の活性化は、Ｉ型インターフェロン、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８などを含む多くの下流サイトカインの産生に繋がる。
Ｉ型インターフェロンは、自己分泌及び傍分泌経路を介してＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を活性化し、大量の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導し、ウイルス感染に抵抗する効果を達成することができる（５、６）。同時に、Ｉ型インターフェロンは、抗原提示細胞の成熟を促進することができ（７）、抗原提示細胞は、Ｔ細胞に病原性微生物または腫瘍抗原を提示し、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するとともに、Ｂ細胞の活性化を促進して抗原特異的抗体を産生し、メモリーＢ細胞及び免疫メモリーの産生を促進する。
炎症誘発性サイトカインＩＬ－１βは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に直接作用し、Ｔ細胞の増殖を促進することができ（８）、ＩＬ－１８は、Ｔｈ１免疫応答を効果的に増強することができ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び細胞傷害性を促進することもできる（９）。
Ｉ型インターフェロンは、自己分泌及び傍分泌経路を介してＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を活性化し、大量の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導し、ウイルス感染に抵抗する効果を達成することができる（５、６）。同時に、Ｉ型インターフェロンは、抗原提示細胞の成熟を促進することができ（７）、抗原提示細胞は、Ｔ細胞に病原性微生物または腫瘍抗原を提示し、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するとともに、Ｂ細胞の活性化を促進して抗原特異的抗体を産生し、メモリーＢ細胞及び免疫メモリーの産生を促進する。
炎症誘発性サイトカインＩＬ－１βは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に直接作用し、Ｔ細胞の増殖を促進することができ（８）、ＩＬ－１８は、Ｔｈ１免疫応答を効果的に増強することができ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び細胞傷害性を促進することもできる（９）。
【0004】
現在、ヒトへの使用がＦＤＡによって承認されているアジュバントは、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９、ＡＳ０３、ＡＳ０４の４つがある。アルミニウムアジュバントは、１９２０年以来広く使用されており、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）ワクチン、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）ワクチン、ジフテリア・百日咳・破傷風混合（ＤＴＰ）ワクチン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン、インフルエンザ菌（ＨｉＢ）ワクチンなどに使用されている。アルミニウムアジュバントは、Ｔｈ２応答（抗体産生に基づく体液性免疫）のみを活性化でき、Ｔｈ１応答（主にＣＤ８＋Ｔ細胞に基づく細胞性免疫）を活性化できない（１０）。ＡＳ０４は、ＭＰＬ及びアルミニウム塩を含むアジュバントであり、ＨＰＶワクチン及びＨＢＶワクチンに使用されている。該アジュバントは、ＮＦ－ｋＢを活性化し、炎症誘発性サイトカインを産生させることができ、アルミニウムアジュバントが本来持っていないＴｈ１応答を活性化する能力を持つ。ＭＦ５９は、スクアレンを油相として制作された油中水型アジュバントであり、分解可能なスクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＳｐａｎ ８５を含み、インフルエンザワクチンに使用される。そのメカニズムは、まだ不明であり、それは、体内での半減期で４２時間であり、Ｔｈ１応答及びＴｈ２応答を同時に活性化することができる。ＡＳ０３は、α－トコフェロール、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０を含む水中油型アジュバントであり、インフルエンザワクチンに適用されるが、ＡＳ０３を含むＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスワクチンＰａｎｄｅｍｒｉｘＴＭは、ナルコレプシーを引き起こす可能性がある（１１）。ＡＳ０３は、ＮＦ－ｋＢ経路を活性化することにより炎症誘発性因子の産生を誘導し、免疫細胞を動員し、抗体産生を誘導することができる。
現在、臨床的応用が承認されていないが、実験室で使用できる多くのアジュバントがあり、その多くは良好な効果を有するが、それらの副作用のため、フロイントにおける鉱油の代謝などの臨床応用を制限し、例えば、フロイントアジュバントにおける鉱物油成分の代謝能力が悪く、注射部位に小結節が形成される。サイトカインアジュバント、例えば、インターロイキン－２、インターフェロンもあるが、それらは高価であるという欠点がある。
現在、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路を活性化するリガンドは、ＤＭＸＡＡ（１２）、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（１３）、ｃＧＡＭＰ（１４）、ｃｈｉｔｏｓａｎ（１５）などのアジュバントとして使用できることを証明することが報告されている。
ＣＮ１０７４１２２６０Ａには、２価のマンガンがｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路活性化因子であり、免疫を増強する効果を有し、例えば、免疫アジュバントとして使用できることを開示している。しかしながら、さらなる研究において、発明者は、２価のマンガン自体にまだいくつかの欠陥があることを予期せず発見し、欠陥の少なくとも１つを排除するために改善された解決策が必要である。
現在、臨床的応用が承認されていないが、実験室で使用できる多くのアジュバントがあり、その多くは良好な効果を有するが、それらの副作用のため、フロイントにおける鉱油の代謝などの臨床応用を制限し、例えば、フロイントアジュバントにおける鉱物油成分の代謝能力が悪く、注射部位に小結節が形成される。サイトカインアジュバント、例えば、インターロイキン－２、インターフェロンもあるが、それらは高価であるという欠点がある。
現在、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路を活性化するリガンドは、ＤＭＸＡＡ（１２）、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（１３）、ｃＧＡＭＰ（１４）、ｃｈｉｔｏｓａｎ（１５）などのアジュバントとして使用できることを証明することが報告されている。
ＣＮ１０７４１２２６０Ａには、２価のマンガンがｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路活性化因子であり、免疫を増強する効果を有し、例えば、免疫アジュバントとして使用できることを開示している。しかしながら、さらなる研究において、発明者は、２価のマンガン自体にまだいくつかの欠陥があることを予期せず発見し、欠陥の少なくとも１つを排除するために改善された解決策が必要である。
【発明の概要】
【0005】
発明者らは、２価のマンガンのさらなる免疫増強効果の研究において、２価のマンガン溶液が体内で免疫増強効果を生み出すことができるが、この免疫増強効果は十分に高くないことを見出した。研究過程では、免疫増強効果を向上させるために２価のマンガン溶液の濃度を上げると、マンガンの沈殿が生成しやすく、均一で安定した高濃度の２価のマンガン溶液を得ることができなく、実験の再現性を効果的に保証できないことも分かったのはさらに重要である。このようなマンガンの沈殿は、貯蔵時間が長くなるにつれて徐々に凝集し、成長する。
所望の高濃度の２価のマンガン溶液が達成できない場合には、発明者らは、免疫増強研究を継続するために２価のマンガン沈殿を使用しなければならない。実験的操作の怠慢のために、発明者らは、異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿を不注意に使用した。発明者らは、異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿が異なる免疫増強効果を有し、しかも、新たに生成した沈殿物の免疫増強効果がより長い時期で放置されたマンガン沈殿よりも著しく優れていることを予期せず発見した。発明者らは、さらに２価のマンガン溶液を異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿と比較し、新たに生成したマンガン塩沈殿の免疫増強効果が２価のマンガン溶液よりも著しく優れていることも予想ずに発見した。
異なる２価のマンガン系を試す過程では、発明者らは、２価のマンガン化合物がコロイド溶液を形成できることを予期せず発見した。さらに驚くべきことは、このマンガンコロイドが新たに生成したマンガン沈殿と同等またはそれ以上の免疫増強効果を示すことである。
所望の高濃度の２価のマンガン溶液が達成できない場合には、発明者らは、免疫増強研究を継続するために２価のマンガン沈殿を使用しなければならない。実験的操作の怠慢のために、発明者らは、異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿を不注意に使用した。発明者らは、異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿が異なる免疫増強効果を有し、しかも、新たに生成した沈殿物の免疫増強効果がより長い時期で放置されたマンガン沈殿よりも著しく優れていることを予期せず発見した。発明者らは、さらに２価のマンガン溶液を異なる時期で放置された２価のマンガン沈殿と比較し、新たに生成したマンガン塩沈殿の免疫増強効果が２価のマンガン溶液よりも著しく優れていることも予想ずに発見した。
異なる２価のマンガン系を試す過程では、発明者らは、２価のマンガン化合物がコロイド溶液を形成できることを予期せず発見した。さらに驚くべきことは、このマンガンコロイドが新たに生成したマンガン沈殿と同等またはそれ以上の免疫増強効果を示すことである。
【0006】
発明者らは、これに基づいて本発明を完成させ、以下の技術的態様を提供する。
１つの側面では、本発明は、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む、免疫増強用組成物を提供する。
１つの実施形態では、前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物の形態から選ばれるものである。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
１つの側面では、本発明は、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む、免疫増強用組成物を提供する。
１つの実施形態では、前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物の形態から選ばれるものである。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
【0007】
他の側面では、本発明は、
Ａ）ワクチン免疫原と、
Ｂ）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢは、同一及び／又は別々の容器に収容されることができるワクチン組成物を提供する。
好ましくは、前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する。
Ａ）ワクチン免疫原と、
Ｂ）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢは、同一及び／又は別々の容器に収容されることができるワクチン組成物を提供する。
好ましくは、前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する。
【0008】
他の側面では、本発明は、
１）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、
２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む免疫増強用組成物の製造方法を提供する。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
他の側面では、本発明は、
１）ワクチン免疫原を与えることと、
２）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、を含むワクチン組成物の製造方法を提供する。
好ましくは、前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、上記と同じであり、ここで、説明は繰り返されない。
１）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、
２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む免疫増強用組成物の製造方法を提供する。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる。
好ましくは、前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
他の側面では、本発明は、
１）ワクチン免疫原を与えることと、
２）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、を含むワクチン組成物の製造方法を提供する。
好ましくは、前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、上記と同じであり、ここで、説明は繰り返されない。
【0009】
１つの側面では、本発明は、自然免疫及び／又は適応免疫を改善するための免疫増強用組成物又はワクチン組成物の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。いくつかの実施形態において、前記新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源は、Ｉ型インターフェロンの発現を増加させることにより自然免疫及び／又は適応免疫を改善する。他の幾つかの実施形態において、前記新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生することにより自然免疫及び／又は適応免疫を改善する。更に他の幾つかの実施形態において、前記新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源は、抗体の産生を促進することにより自然免疫及び／又は適応免疫を改善する。
１つの側面では、本発明は、それを必要とする対象に前記免疫増強用組成物を投与することを含む免疫増強用方法を提供する。
具体的には、前記免疫増強は、例えば、Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加させること、Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、Ｄ）抗体の産生を促進すること、Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又はＦ）樹状細胞の成熟を促進することである。
好ましくは、前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
特に、前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される。
１つの側面では、本発明は、それを必要とする対象に前記免疫増強用組成物を投与することを含む免疫増強用方法を提供する。
具体的には、前記免疫増強は、例えば、Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加させること、Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、Ｄ）抗体の産生を促進すること、Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又はＦ）樹状細胞の成熟を促進することである。
好ましくは、前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
特に、前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される。
【0010】
ここで、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
ここで、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
ここで、前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる。
ここで、前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる。
ここで、前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる。
ここで、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
ここで、前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる。
ここで、前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる。
ここで、前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記免疫増強用組成物は、それを必要とする対象に、別の予防／治療剤と共に投与される。
他の側面では、本発明は、
本発明のワクチン組成物をそれを必要とする対象に投与する（ここで、成分Ａ及び成分Ｂは、異なる容器に収容される場合には、同時又は異なる時点で投与されることができる。）こと、及び／又は
本発明の免疫増強用組成物及び任意に選択してもよいワクチン免疫原をそれを必要とする対象に投与すること、を含む免疫接種方法を提供する。
好ましくは、前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
特に、前記免疫接種は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を予防するために使用される。前記疾患は、上記と同じであり、ここで、説明は繰り返しない。
他の側面では、本発明は、
本発明のワクチン組成物をそれを必要とする対象に投与する（ここで、成分Ａ及び成分Ｂは、異なる容器に収容される場合には、同時又は異なる時点で投与されることができる。）こと、及び／又は
本発明の免疫増強用組成物及び任意に選択してもよいワクチン免疫原をそれを必要とする対象に投与すること、を含む免疫接種方法を提供する。
好ましくは、前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
特に、前記免疫接種は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を予防するために使用される。前記疾患は、上記と同じであり、ここで、説明は繰り返しない。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記免疫増強用組成物は、それを必要とする対象に別の予防／治療剤と共に投与される。
他の側面では、Ｉ型インターフェロンを増強するための医薬品の調製における、本発明は、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生するための医薬品の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、抗体の産生を刺激するための医薬品の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、免疫アジュバントとしての、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。いくつかの実施形態において、前記免疫アジュバントは、Ｔ細胞の活性化及び／又は抗体の生成を活性化する。好ましくは、前記免疫アジュバントは、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫、自身免疫性疾患、及びがんから選ばれる疾患を治療するためのワクチン組成物に使用される。
他の側面では、Ｉ型インターフェロンを増強するための医薬品の調製における、本発明は、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生するための医薬品の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、抗体の産生を刺激するための医薬品の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。
他の側面では、本発明は、免疫アジュバントとしての、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途を提供する。いくつかの実施形態において、前記免疫アジュバントは、Ｔ細胞の活性化及び／又は抗体の生成を活性化する。好ましくは、前記免疫アジュバントは、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫、自身免疫性疾患、及びがんから選ばれる疾患を治療するためのワクチン組成物に使用される。
【0013】
他の側面では、本発明は、１つ又は複数の抗原が収容されている第１の容器と、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源が収容されている第２の容器とを含む免疫接種に使用されるキットを提供する。好ましくは、前記第１の容器及び／又は第２の容器には、薬学的に許容される担体も含まれる。特に、前記キットは、本発明の１つ又は複数の目的に使用される。いくつかの実施形態において、抗原は、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、同一の容器に収容されている。
いくつかの実施形態において、本発明で使用される抗原は、ウイルス又は細菌又は寄生物抗原、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス１、２、６及び７型、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、乳頭腫ウイルス、ＥＢウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パピローマウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、結核およびハンセン病を引き起こすマイコバクテリア、肺炎球菌、好気性グラム陰性桿菌、マイコプラズマ、スタフィロコッカス感染、ストレプトコッカス感染、サルモネラ菌、クラミジア、ヘリコバクター・ピロリ菌、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸虫病、及びフィラリア症から選ばれる。
いくつかの実施形態において、本発明において新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源及び／又は抗原は、有効量である。
いくつかの実施形態において、本発明で使用される抗原は、ウイルス又は細菌又は寄生物抗原、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス１、２、６及び７型、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、乳頭腫ウイルス、ＥＢウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パピローマウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、結核およびハンセン病を引き起こすマイコバクテリア、肺炎球菌、好気性グラム陰性桿菌、マイコプラズマ、スタフィロコッカス感染、ストレプトコッカス感染、サルモネラ菌、クラミジア、ヘリコバクター・ピロリ菌、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸虫病、及びフィラリア症から選ばれる。
いくつかの実施形態において、本発明において新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源及び／又は抗原は、有効量である。
【0014】
他の側面では、本発明は、対象におけるＩ型インターフェロン発現を増加させるための方法において、前記対象に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供する。さらに、本発明は、また、インビトロで細胞におけるＩ型インターフェロンの活性を増強させるための方法において、前記細胞に、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供し、好ましくは、前記方法は、非治療目的のためのものである。
他の側面では、本発明は、対象に炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生するための方法において、前記対象に、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供する。さらに、本発明は、また、インビトロで細胞における炎症性サイトカインの切断を誘導して活性型を産生するための方法において、前記細胞に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供し、好ましくは、前記方法は、非治療目的のためのものである。
他の側面では、本発明は、対象における抗体の産生を刺激するための方法において、前記対象に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供する。さらに、本発明は、また、インビトロで細胞における抗体の産生を刺激するための方法において、前記細胞に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供し、好ましくは、前記方法は、非治療目的のためのものである。
他の側面では、本発明は、対象に炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生するための方法において、前記対象に、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供する。さらに、本発明は、また、インビトロで細胞における炎症性サイトカインの切断を誘導して活性型を産生するための方法において、前記細胞に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供し、好ましくは、前記方法は、非治療目的のためのものである。
他の側面では、本発明は、対象における抗体の産生を刺激するための方法において、前記対象に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供する。さらに、本発明は、また、インビトロで細胞における抗体の産生を刺激するための方法において、前記細胞に新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を投与することを含む、方法を提供し、好ましくは、前記方法は、非治療目的のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0015】
以下、本発明に記載された態様及び他の態様について、本発明の詳しい説明及び図面により明確に説明する。本発明を例を挙げて説明するために、図面中の実施形態は、現在、好ましいものであるが、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されないことが理解される。
【図1】図１は、新たに生成した沈殿物マンガン及びコロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）が良いアジュバント効果を持つことを示す。図１Ａは、溶液中の２価のマンガンの異なる状態を示す。図１Ｂは、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）の透過電子顕微鏡の画像を示す。図１Ｃは、免疫化後の抗ＯＶＡ－ＩｇＧ１抗体のレベルを示す。図１Ｄは、ＭｎＣｌ２溶液とコロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）との筋肉注射後の滞留時間の比較を示す。
【図2】図２は、ＭｎＣｌ２溶液が生理食塩水中の他のアニオンと混合された後の異なる存在状態及び性質を示す。しかも、これらの沈殿物又はコロイドがＩ型インターフェロン又は炎症性サイトカインの産生を活性化する能力、アジュバント効果を測定する。図２Ａは、ＭｎＣｌ２溶液と異なる濃度の炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸イオン、リン酸一水素イオン、水酸化物イオンとが異なる状態を形成することを示す。図２Ｂは、異なる状態のマンガンイオンがＩ型インターフェロンを活性化し、炎症性サイトカインＩＬ－１βの産生を誘導し、並びに、アジュバントとしてＯＶＡタンパク質と混合して免疫化して抗体を産生する能力を示す。図２Ｃは、マンガンイオンと異なるアニオンによって形成された生成物にレーザーポインターを照射し、チンダル現象を観察する。
【図3】図３は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）及びアルミニウムアジュバントがそれぞれニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）と混合し、筋肉注射によりマウスを免疫した後１０日目（Ａ）、１７日目（Ｂ）、２４日目（Ｃ）及び３１日目（Ｄ）に産生された抗ＯＶＡ抗体価を示す。
【図4】図４は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）及びコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）アジュバントがそれぞれＯＶＡと混合し、マウスに点鼻投与して免疫化させた肺胞洗浄液（Ａ）、口内洗浄液（Ｂ）、血清ＩｇＡ（Ｃ）及び血清ＩｇＧ１（Ｄ）抗ＯＶＡの抗体価を示す。
【図5】図５は、図１及び図２の方法によりコロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）をアジュバントとしてＯＶＡと混合しマウスに筋肉注射（Ａ）又は点鼻投与（Ｂ）して免疫化させた後、マウスの血清、口内洗浄液、肺胞洗浄液中の抗ＯＶＡ抗体価を１～６か月測定することを示す。
【図6】図６は、ＭｎＣｌ２によるＩ型インターフェロン経路及びインフラマソームの活性化の活性化を示す。図６Ａ－Ｂは、マウス腹腔マクロファージをＭｎＣｌ２で処理したＩ型インターフェロン、下流誘導因子ＩＳＧ５４及びｖｉｐｅｒｉｎの発現レベルを示し、ここで、アルミニウムアジュバントを対照とする。図６Ｃ－Ｄは、ＭｎＣｌ２がインフラマソームの活性化を活性化できることを示し、ここで、アルミニウムアジュバントを対照とする。図６Ｅ－Ｆは、ＭｎＣｌ２によって活性化されるインフラマソームの活性化がＮＬＲＰ３及びＡＳＣに依存していることを示す。
【図9】図９は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）が樹状細胞の成熟、Ｔ細胞の活性化を促進する能力がｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路及びインフラマソーム経路に依存することを示す。図９Ａは、コロイド状マンガン（ＭｎＯＨＰＯ４）が抗原提示細胞ＢＭＤＣの成熟を誘導することを示す。図９Ｂは、コロイド状マンガン（ＭｎＯＨＰＯ４）が抗原ＯＶＡと混合してＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を示す。図９Ｃは、コロイド状マンガン（ＭｎＯＨＰＯ４）をアジュバントとしてマウスに免疫化した後にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を刺激することを示す。
【図10】図１０は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）をアジュバントとして不活化水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）を顕著に増強させることができる免疫保護効果を示す。図１０Ａは、実験手順を示す。図１０Ｂは、不活化ＶＳＶを１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６の用量に希釈してマウスに免疫化し、１４日後のマウスの生存率を観察することを示す。図１０Ｃは、１０－３の用量に希釈されたＶＳＶ不活化ウイルスをマウスに免疫化した後、１４日間のマウスの生存曲線を観察することを示す。図１０Ｄは、ＶＳＶウイルスに感染した４日目にマウスの脳におけるウイルス力価を示す。図１０Ｅ－Ｇは、不活化ＨＳＶ－１ウイルスにコロイド状マンガンを加えても同じ保護効果があることを示す。
【図11】図１１は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）をアジュバントとして不活化インフルエンザウイルスＰＲ８の免疫保護効果を顕著に増強できることを示す。図１１Ａ－Ｂは、不活化インフルエンザウイルスを１、１０－１、１０－２、１０－３の用量に希釈してマウスに点鼻投与して１回免疫化し、７日後にマウスをインフルエンザウイルスに感染させた後の生存率及び体重変化を示す。図１１Ｃ－Ｄは、マウスに点鼻投与して２回免疫した後、インフルエンザウイルスで感染させたマウスの生存率及び体重変化を示す。
【図12】図１２は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）をアジュバントとしてインフルエンザサブユニットＨＡワクチンの免疫保護効果を顕著に増強できるこを示す。図１２Ａは、マウスの筋肉注射後１４日、２１日、２８日でのマウス血清中の抗ＨＡ－ＩｇＧ１抗体の含有量を示す。図１２Ｂは、マウスに点鼻投与して免疫させた後１４日、２１日、２８日でのマウス血清中の抗ＨＡタンパク質ＩｇＡ抗体の含有量を示す。図１２Ｃは、インフルエンザウイルス感染後のマウスの体重変化を示す。図１２Ｄは、感染５日目のマウスの肺組織の病変を示す。
【図13】図１３は、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４をアジュバントとして同種異型インフルエンザウイルス（ＷＳＮ）及び異種インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）に対する不活化インフルエンザウイルス及びサブユニットワクチンの保護効果を増強させることを示す。図１３Ａは、免疫化後のＷＳＮウイルス感染マウスの体重変化を示す。図１３Ｂは、免疫化後のＨ３Ｎ２ウイルス感染マウスの体重変化を示す。
【図14】図１４は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）がｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍及び転移腫瘍の成長を顕著に抑制できることを示す。図１４Ａは、異なる時間にイメージャーで撮影された皮下腫瘍サイズを示す。図１４Ｂは、腫瘍接種後の腫瘍体積の変化を示す。図１４Ｃは、腫瘍接種後のマウスの生存曲線を示す。図１４Ｄは、腫瘍が転移した肺組織が、異なる免疫化方法の２１日後に撮影されたことを示す。図１４Ｅは、図１４Ｄにおける腫瘍細胞数の統計量を示す。
【図15】図１５は、コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４）と化学療法薬であるシクロホスファミド（ＣＴＸ）の併用による皮下腫瘍モデル－黒色腫Ｂ１６－Ｆ１０の治療効果を示す。図１５Ａは、異なる治療方法における１４日後の腫瘍の画像を示す。図１５Ｂは、マウス皮下腫瘍Ｂ１６Ｆ１０の増殖曲線を示す。図１５Ｃは、図１５Ｂのマウスの１４日目の対応する群の腫瘍重量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書で使用される「自然免疫」という用語とは、生体が生殖細胞株列の発達及び進化の過程で形成される自然免疫防御機能、即ち、出生後にすでに保有する非特異的防御機能を指し、非特異的免疫（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）も呼ばれる。自然免疫には、複数種の細胞及び分子、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、補体、サイトカイン（ＩＬ、ＣＳＦ、ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＴＧＦ－β）、ケモカイン（ＣＣケモカイン、例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２等、ＣＸＣケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９など、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカインを含む。）、リゾチームなどが関与する。
本明細書で使用される「適応免疫」という用語とは、獲得免疫又は特異的免疫とも呼ばれ、抗原分子の刺激後に形成される該抗原に対する生体の特異的免疫を指し、細胞性免疫及び体液性免疫が関与する。
本明細書で使用される「アジュバント」という用語とは、特定的抗原を構成しないが、同時投与された抗原に対する免疫応答の強度および持続時間を増強する試薬を指す。
本明細書で使用される「適応免疫」という用語とは、獲得免疫又は特異的免疫とも呼ばれ、抗原分子の刺激後に形成される該抗原に対する生体の特異的免疫を指し、細胞性免疫及び体液性免疫が関与する。
本明細書で使用される「アジュバント」という用語とは、特定的抗原を構成しないが、同時投与された抗原に対する免疫応答の強度および持続時間を増強する試薬を指す。
【0017】
本明細書で使用される「２価のマンガン」又は「２価のマンガン化合物」という用語とは、塩酸塩、炭酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パントテン酸塩、アスコルビン酸塩、水酸化物など、又はそれらの任意の組み合わせである。好ましくは、前記２価のマンガン化合物は、薬学的に許容されるものである。
本明細書で使用される「コロイド状マンガン」という用語とは、マンガンコロイドとも呼ばれ、２価のマンガンがアニオンと形成されたコロイド（ｃｏｌｌｏｉｄ、コロイド溶液も呼ばれる。）の形態で存在する状態を指し、「コロイド」という用語は、当業者によって理解されるような意味を有する。例えば、コロイド粒子の粒子径は、一般的に、約１～１００ｎｍであり、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｍ、又は以上のいずれか２つの間の値であり、例えば、１～２０、５～２０ｎｍ、１０ｎｍである。典型的には、コロイド溶液は、光照射されるとチンダル効果を示す。コロイド粒子の粒度範囲がナノメートルのオーダーであることを考慮すると、本明細書に記載の「コロイド状マンガン」は、その粒度範囲に対応して「ナノマンガン」と呼ぶこともできる。
本明細書で使用される「新たに生成した沈殿物マンガン」という用語とは、２価のマンガン化合物が非沈殿形態（例えば、溶液形態）から沈殿形態に変換された後の短期間の存在状態を指す。前記短期間は、一般的に、１日以下であるか、典型的に、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間を超えなく、例えば、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
本明細書で使用される用語は、例えば、「含む」、「含有」、「含有する」及び「含み」は、限定することを意図するものではない。さらに、特に断りのない限り、「又は」、「或いは」とは、「及び／又は」を意味する。
本明細書で使用される「コロイド状マンガン」という用語とは、マンガンコロイドとも呼ばれ、２価のマンガンがアニオンと形成されたコロイド（ｃｏｌｌｏｉｄ、コロイド溶液も呼ばれる。）の形態で存在する状態を指し、「コロイド」という用語は、当業者によって理解されるような意味を有する。例えば、コロイド粒子の粒子径は、一般的に、約１～１００ｎｍであり、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｍ、又は以上のいずれか２つの間の値であり、例えば、１～２０、５～２０ｎｍ、１０ｎｍである。典型的には、コロイド溶液は、光照射されるとチンダル効果を示す。コロイド粒子の粒度範囲がナノメートルのオーダーであることを考慮すると、本明細書に記載の「コロイド状マンガン」は、その粒度範囲に対応して「ナノマンガン」と呼ぶこともできる。
本明細書で使用される「新たに生成した沈殿物マンガン」という用語とは、２価のマンガン化合物が非沈殿形態（例えば、溶液形態）から沈殿形態に変換された後の短期間の存在状態を指す。前記短期間は、一般的に、１日以下であるか、典型的に、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間を超えなく、例えば、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である。
本明細書で使用される用語は、例えば、「含む」、「含有」、「含有する」及び「含み」は、限定することを意図するものではない。さらに、特に断りのない限り、「又は」、「或いは」とは、「及び／又は」を意味する。
【0018】
本明細書に係る「ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来する」とは、不活化ウイルス、細菌及び／又は寄生虫、上記病原性物質から抽出されたタンパク質及び／又は核酸物質（切断、工学などの処理後の上記物質も含む。）、精製された組換えタンパク質物質、或いは化学的に合成されたペプチド物質である。
また、本明細書で使用されるように、単数形は、それが明確かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数形の指示対象を含むことを理解すべきである。そして、特定の値が言及されている場合、別に記載されない限り、少なくともその値が含まれる。
数値が近似値を表す場合、特定の数値が別の実施形態を形成することを理解すべきである。本明細書に使用されているような「約Ｘ」（ここで、Ｘは、数値である。）とは、挙げられた値±１０％（両端を含む）である。存在する場合には、すべての範囲が包括的で組み合わせ可能である。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、水、緩衝水溶液、等張塩溶液、例えば、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、トリグリセリドなどから選ぶことができる。使用される薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明による組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与用に処方されるかどうかに依存する。本発明による組成物は、添加剤として、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色物質、矯味物質及び／又は芳香物質などを含むことができる。
また、本明細書で使用されるように、単数形は、それが明確かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数形の指示対象を含むことを理解すべきである。そして、特定の値が言及されている場合、別に記載されない限り、少なくともその値が含まれる。
数値が近似値を表す場合、特定の数値が別の実施形態を形成することを理解すべきである。本明細書に使用されているような「約Ｘ」（ここで、Ｘは、数値である。）とは、挙げられた値±１０％（両端を含む）である。存在する場合には、すべての範囲が包括的で組み合わせ可能である。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、水、緩衝水溶液、等張塩溶液、例えば、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、トリグリセリドなどから選ぶことができる。使用される薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明による組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与用に処方されるかどうかに依存する。本発明による組成物は、添加剤として、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色物質、矯味物質及び／又は芳香物質などを含むことができる。
【0019】
本発明による医薬品組成物は、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与などの任意の適切な経路で投与することができる。
本明細書で使用される「投与」という用語とは、薬理学的に使用可能な方法で対象に物質を提供することを意味する。
本明細書で使用される「医薬有效量」、「有效量」とは、それが投与される対象にその利益を示すのに十分な用量を指す。実際に投与される量、投与の速率及び時間は、治療される対象自体の状態および重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量への決定など）は、最終的には一般開業医や他の医師の責任であり、且つそれらに依存して決定し、通常、治療する病気、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医者にに知られている他の要因を考慮する。
本明細書で使用される「対象」という用語とは、ヒトおよび霊長類などの温血哺乳類を含む動物；鳥類；猫、犬、ヒツジ、ヤギ、牛、馬、豚などの愛玩動物または家畜；マウス、ラット、モルモットなどの実験動物；魚；爬虫類；動物園の動物、野生動物などの動物を意味する。
本明細書で使用される「投与」という用語とは、薬理学的に使用可能な方法で対象に物質を提供することを意味する。
本明細書で使用される「医薬有效量」、「有效量」とは、それが投与される対象にその利益を示すのに十分な用量を指す。実際に投与される量、投与の速率及び時間は、治療される対象自体の状態および重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量への決定など）は、最終的には一般開業医や他の医師の責任であり、且つそれらに依存して決定し、通常、治療する病気、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医者にに知られている他の要因を考慮する。
本明細書で使用される「対象」という用語とは、ヒトおよび霊長類などの温血哺乳類を含む動物；鳥類；猫、犬、ヒツジ、ヤギ、牛、馬、豚などの愛玩動物または家畜；マウス、ラット、モルモットなどの実験動物；魚；爬虫類；動物園の動物、野生動物などの動物を意味する。
【0020】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
特に断りのない限り、本方法及び製品に関する実施形態で開示される任意の成分、元素、特性又は手順は、任意の他の方法および製品に適用することができる。
本開示に係る各特許、特許出願、引用された刊行物又は本明細書での説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明では、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、例としてのみ説明されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。以上の討論及びこれらの例では、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その本質および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて様々な使用方法及び条件に適用することができる。
特に断りのない限り、本方法及び製品に関する実施形態で開示される任意の成分、元素、特性又は手順は、任意の他の方法および製品に適用することができる。
本開示に係る各特許、特許出願、引用された刊行物又は本明細書での説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明では、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、例としてのみ説明されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。以上の討論及びこれらの例では、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その本質および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて様々な使用方法及び条件に適用することができる。
【実施例】
【0021】
材料及び方法
抗体及び試薬
抗体の供給源は次のとおりである。抗ＧＡＰＤＨ抗体（ｓｃ－２５７７８）がＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入された。抗クサリヘビ毒素（Ｖｉｐｅｒｉｎ）抗体、抗ＩＳＧ５４抗体、抗Ｃａｓｐ１／ｐ２０抗体、抗ＩＬ１β／ｐ１７抗体、及び抗ＡＳＣ抗体は、いずれも公開されている方法で調製および使用されている（１６）。簡単に言うと、抗原断片のｃＤＮＡをｐＥＴ－２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、組換えタンパク質をＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムで精製した後、マウス又はウサギに注入し、対応する抗原を認識できる抗血清を取得した。
特に明記しない限り、化学品のすべては、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。アルミニウムアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、 Ｔｈｅｒｍｏ、 ７７１６１）、マウスＩＬ－１ｂｅｔａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭＵＬＴＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＥＫ２０１Ｂ２／２）、マウスＩＬ－１８ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭΜＬＴＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＥＫ２１８１）、リポ多糖（Ｓｉｇｍａ、 Ｌ４１３０）、オボアルブミン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、 ＃ｖａｃ－ｐｏｖａ）は、いずれも市販製品である。
抗体及び試薬
抗体の供給源は次のとおりである。抗ＧＡＰＤＨ抗体（ｓｃ－２５７７８）がＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入された。抗クサリヘビ毒素（Ｖｉｐｅｒｉｎ）抗体、抗ＩＳＧ５４抗体、抗Ｃａｓｐ１／ｐ２０抗体、抗ＩＬ１β／ｐ１７抗体、及び抗ＡＳＣ抗体は、いずれも公開されている方法で調製および使用されている（１６）。簡単に言うと、抗原断片のｃＤＮＡをｐＥＴ－２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、組換えタンパク質をＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムで精製した後、マウス又はウサギに注入し、対応する抗原を認識できる抗血清を取得した。
特に明記しない限り、化学品のすべては、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。アルミニウムアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、 Ｔｈｅｒｍｏ、 ７７１６１）、マウスＩＬ－１ｂｅｔａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭＵＬＴＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＥＫ２０１Ｂ２／２）、マウスＩＬ－１８ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭΜＬＴＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＥＫ２１８１）、リポ多糖（Ｓｉｇｍａ、 Ｌ４１３０）、オボアルブミン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、 ＃ｖａｃ－ｐｏｖａ）は、いずれも市販製品である。
【0022】
細胞
Ｌ９２９－ＩＳＲＥ（蒋争凡の実験室から自作した細胞株、ｐＧＬ３ ＩＳＲＥ－ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅプラスミドをＬ９２９細胞に安定的にトランスフェクトしたもの、ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１）、ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１０）、Ｂ１６－ＯＶＡ（ＡＴＣＣ(R) ＣＲＬ－６３２２）及びＢ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ(R) ＣＲＬ－６４７５）細胞は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５μｇ／ｍｌペニシリン及び１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地で培養された。骨髄由来樹状細胞（ｂｏｎｅＭａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、 ＢＭＤＣｓ）は、１０ ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ、１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地で誘導され、３日目に培養液を半分交換し、７日目に実験を行った。腹膜マクロファージは、チオグリコレート（ＢＤ、 Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）注射による誘導の５日後のマウスから取得され、５％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で培養された。
Ｌ９２９－ＩＳＲＥ（蒋争凡の実験室から自作した細胞株、ｐＧＬ３ ＩＳＲＥ－ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅプラスミドをＬ９２９細胞に安定的にトランスフェクトしたもの、ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１）、ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ(R) ＣＣＬ－１０）、Ｂ１６－ＯＶＡ（ＡＴＣＣ(R) ＣＲＬ－６３２２）及びＢ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ(R) ＣＲＬ－６４７５）細胞は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５μｇ／ｍｌペニシリン及び１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地で培養された。骨髄由来樹状細胞（ｂｏｎｅＭａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、 ＢＭＤＣｓ）は、１０ ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ、１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地で誘導され、３日目に培養液を半分交換し、７日目に実験を行った。腹膜マクロファージは、チオグリコレート（ＢＤ、 Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）注射による誘導の５日後のマウスから取得され、５％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で培養された。
【0023】
マウス
Ｔｍｅｍ１７３－／－マウスは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９法により、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（１００ ｎｇ／μｌ）及びｇＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ）細胞質をＣ５７ＢＬ／６Ｊ マウス受精卵に注入して建築された。ｍＭＥＳＳＡＧＥＭＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ（Ａｍｂｉｏｎ、 ａｍ１３４５）によりＣａｓ９ＭＲＮＡ及びシングルガイド（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。Ｎｌｒｐ３－／－、 Ｎｌｒｃ４－／－、 Ｐｙｃａｒｄ－／－、及びＡｉｍ２－／－遺伝子ノックアウトマウスは、Ｖｉｓｈｖａ Ｄｉｘｉｔ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ、 ＵＳＡ）から寄贈された。Ｔｍｅｍ１７３－／－Ｐｙｃａｒｄ－／－ダブルノックアウトマウスは、Ｔｍｅｍ１７３－／－マウスとＰｙｃａｒｄ－／－を交配することにより同定されて取得された。
マウスのすべては、ＮＩＨ実験動物のの管理・使用ガイド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、無菌条件下で北京大学の実験動物センターで飼育された。
Ｔｍｅｍ１７３－／－マウスは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９法により、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（１００ ｎｇ／μｌ）及びｇＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ）細胞質をＣ５７ＢＬ／６Ｊ マウス受精卵に注入して建築された。ｍＭＥＳＳＡＧＥＭＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ（Ａｍｂｉｏｎ、 ａｍ１３４５）によりＣａｓ９ＭＲＮＡ及びシングルガイド（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。Ｎｌｒｐ３－／－、 Ｎｌｒｃ４－／－、 Ｐｙｃａｒｄ－／－、及びＡｉｍ２－／－遺伝子ノックアウトマウスは、Ｖｉｓｈｖａ Ｄｉｘｉｔ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ、 ＵＳＡ）から寄贈された。Ｔｍｅｍ１７３－／－Ｐｙｃａｒｄ－／－ダブルノックアウトマウスは、Ｔｍｅｍ１７３－／－マウスとＰｙｃａｒｄ－／－を交配することにより同定されて取得された。
マウスのすべては、ＮＩＨ実験動物のの管理・使用ガイド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、無菌条件下で北京大学の実験動物センターで飼育された。
【0024】
Ｉ型ＩＦＮ（Ｔｙｐｅ Ｉ－ＩＦＮ）のバイオアッセイ
Ｉ型ＩＦＮの濃度は、公開されている方法（１７）に従って測定された。簡単に言うと、ＩＦＮ－刺激応答エレメント（ＩＦＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＩＳＲＥ）をｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングすることにより、ＩＦＮ感受性ルシフェラーゼベクターを構築し、その後、Ｌ９２９細胞に安定的にトランスフェクトした。Ｌ９２９－ＩＳＲＥ細胞を９６ウェルプレートに接種し、それぞれ細胞培養上清とともにインキュベートした。組換えヒト及びマウスＩＦＮ－β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を標準品として使用した。４時間後、Ｌ９２９－ＩＳＲＥ細胞を溶解し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
Ｉ型ＩＦＮの濃度は、公開されている方法（１７）に従って測定された。簡単に言うと、ＩＦＮ－刺激応答エレメント（ＩＦＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＩＳＲＥ）をｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングすることにより、ＩＦＮ感受性ルシフェラーゼベクターを構築し、その後、Ｌ９２９細胞に安定的にトランスフェクトした。Ｌ９２９－ＩＳＲＥ細胞を９６ウェルプレートに接種し、それぞれ細胞培養上清とともにインキュベートした。組換えヒト及びマウスＩＦＮ－β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を標準品として使用した。４時間後、Ｌ９２９－ＩＳＲＥ細胞を溶解し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【0025】
ウイルス感染
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１、Ｈｏｎｇｂｉｎｇ Ｓｈｕ、 Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから取得、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－１５４４）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、 Ｉｎｄｉａｎａ ｓｔｒａｉｎ、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－１２３８）は、上記と同様の同僚から寄贈された。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＰＲ８株（Ｙｏｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ、 Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－９５）。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＷＳＮ株から取得、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（Ｗｅｎｊｕｎ Ｌｉｕ、 Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから取得、 ＣＡＳ）。Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株、Ｈ３Ｎ２ ｓｕｂｔｙｐｅ Ａ／Ｊｉａｎｇｘｉ／２００５（Ｍｉｎ Ｆａｎｇ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから取得、ＣＡＳ）。ＢＨＫ２１細胞を使用してＨＳＶ－１及びＶＳＶウイルス力価を測定した。ＭＤＣＫ細胞を使用してインフルエンザウイルス力価を測定した。
ウイルスの増幅及び精製：ＨＳＶ－１、ＶＳＶウイルスは、ｖｅｒｏ細胞で増幅された。ＰＲ８、ＷＳＮ、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスは、ニワトリ胚で増幅された。増幅したウイルスをＰＥＧ８０００で精製し、精製されたウイルスを０．２％のホルムアルデヒドにて３７℃で２４時間不活化し、プラーク法によりウイルスが完全に不活化したかどうかを測定し、次に、不活化ウイルスを用いてマウスに免疫した。
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１、Ｈｏｎｇｂｉｎｇ Ｓｈｕ、 Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから取得、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－１５４４）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、 Ｉｎｄｉａｎａ ｓｔｒａｉｎ、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－１２３８）は、上記と同様の同僚から寄贈された。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＰＲ８株（Ｙｏｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ、 Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＡＴＣＣ(R) ＶＲ－９５）。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスＷＳＮ株から取得、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（Ｗｅｎｊｕｎ Ｌｉｕ、 Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから取得、 ＣＡＳ）。Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株、Ｈ３Ｎ２ ｓｕｂｔｙｐｅ Ａ／Ｊｉａｎｇｘｉ／２００５（Ｍｉｎ Ｆａｎｇ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから取得、ＣＡＳ）。ＢＨＫ２１細胞を使用してＨＳＶ－１及びＶＳＶウイルス力価を測定した。ＭＤＣＫ細胞を使用してインフルエンザウイルス力価を測定した。
ウイルスの増幅及び精製：ＨＳＶ－１、ＶＳＶウイルスは、ｖｅｒｏ細胞で増幅された。ＰＲ８、ＷＳＮ、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスは、ニワトリ胚で増幅された。増幅したウイルスをＰＥＧ８０００で精製し、精製されたウイルスを０．２％のホルムアルデヒドにて３７℃で２４時間不活化し、プラーク法によりウイルスが完全に不活化したかどうかを測定し、次に、不活化ウイルスを用いてマウスに免疫した。
【0026】
マウス生存実験：ＨＳＶ－１（１．４ ｘ１０７ ｐｆｕ／マウス）及びＶＳＶ（８ ｘ １０８ ｐｆｕ／マウス）をマウスに８～１２週間静脈内感染させるか、又はＰＲ８（１ ｘ １０５ ｐｆｕ／マウス）、ＷＳＮ（１ ｘ １０６ ｐｆｕ／マウス）、Ｈ３Ｎ２（１ ｘ １０６ ｐｆｕ／マウス）をマウスに８～１２週間経鼻感染させた。
プラークアッセイ：ＢＨＫ２１細胞を感染したマウス臓器からのホモジネート（無血清ＤＭＥＭでの一連の希釈液）とともに２時間インキュベートした。次いで、０．５％メチルセルロースを含有する無血清ＤＭＥＭを培地と交換した。６０時間後、細胞を０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グルタルアルデヒドで固定し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレット（７０％エタノールに溶解）で染色した。プラークを計数し、プラーク形成単位でウイルス力価を計算した。
タンパク質の発現及び精製
インフルエンザウイルスＨＡ１タンパク質精製プラスミドは、清華大学の張永輝実験室から寄贈された（１８）。プラスミドは、ＨＡタンパク質（Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９５６５２９）の１１～３２４番目のアミノ酸を発現し、菌液をＯＤ６００が０．６になるまで振とうすると、０．５ＭＭ ＩＰＴＧを添加して誘導し、３７℃で５時間インキュベートした。細菌を集めた後、封入体をを超音波で集め、変性及び再生を経てＨＡ１タンパク質を得た。さらに、ＨＡ１タンパク質をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。
プラークアッセイ：ＢＨＫ２１細胞を感染したマウス臓器からのホモジネート（無血清ＤＭＥＭでの一連の希釈液）とともに２時間インキュベートした。次いで、０．５％メチルセルロースを含有する無血清ＤＭＥＭを培地と交換した。６０時間後、細胞を０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グルタルアルデヒドで固定し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレット（７０％エタノールに溶解）で染色した。プラークを計数し、プラーク形成単位でウイルス力価を計算した。
タンパク質の発現及び精製
インフルエンザウイルスＨＡ１タンパク質精製プラスミドは、清華大学の張永輝実験室から寄贈された（１８）。プラスミドは、ＨＡタンパク質（Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９５６５２９）の１１～３２４番目のアミノ酸を発現し、菌液をＯＤ６００が０．６になるまで振とうすると、０．５ＭＭ ＩＰＴＧを添加して誘導し、３７℃で５時間インキュベートした。細菌を集めた後、封入体をを超音波で集め、変性及び再生を経てＨＡ１タンパク質を得た。さらに、ＨＡ１タンパク質をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。
【0027】
マウスに免疫するためのオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、 ＯＶＡ）の免疫原としての使用
ＭｎＣｌ２溶液の筋肉注射による免疫化方法は、１００μＬ ＰＢＳに１０μｇＭｎＣｌ２及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合して５分間放置した後、マウスに筋肉注射して免疫させた。ＭｎＣｌ２溶液の点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ ＰＢＳに５μｇＭｎＣｌ２及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合して５分間放置した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４を例として）の筋肉注射による免疫化方法は、１００μＬ生理食塩水に１０μｇ コロイド状マンガン及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに筋肉注射して免疫化させた。コロイド状マンガンの点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ 生理食塩水に５μｇ コロイド状マンガン及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。アルミニウムアジュバントの筋肉注射による免疫化方法は、８０μＬ生理食塩水に１０μｇ／２０μＬのアルミニウムアジュバント及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、乳化機で乳化した後、マウスに筋肉注射して免疫化させた。コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）の点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ 生理食塩水に５μｇ ＣＴＢ及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。
ＥＬＩＳＡ法によるＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、総ＩｇＧ、ＩｇＡ抗体の測定：免疫化されたマウスからの希釈血清を１００μｇ／ｍｌ ＯＶＡが塗布されたＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識抗体マウスＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、 ＃１８－４０１５－８２）、ＩｇＧ２ｃ（ＧｅｎｅＴｅｘ、 ＧＴＸ７７２９７）、ＩｇＧ ｔｏｔａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｇ２１０４０）、ＩｇＡ（ＧｅｎｅＴｅｘ、 ＧＴＸ７７２２３）を使用して、結合した対応する抗体を検出した。 次いで、プレートを基質ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにインキュベートし、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で反応を停止し、次に、吸収波長４５０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
統計分析
ｔ検定を使用してデータを分析した。コックス・マンテル検定を使用して生存曲線を比較した。
ＭｎＣｌ２溶液の筋肉注射による免疫化方法は、１００μＬ ＰＢＳに１０μｇＭｎＣｌ２及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合して５分間放置した後、マウスに筋肉注射して免疫させた。ＭｎＣｌ２溶液の点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ ＰＢＳに５μｇＭｎＣｌ２及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合して５分間放置した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。コロイド状マンガン（Ｍｎ２ＯＨＰＯ４を例として）の筋肉注射による免疫化方法は、１００μＬ生理食塩水に１０μｇ コロイド状マンガン及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに筋肉注射して免疫化させた。コロイド状マンガンの点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ 生理食塩水に５μｇ コロイド状マンガン及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。アルミニウムアジュバントの筋肉注射による免疫化方法は、８０μＬ生理食塩水に１０μｇ／２０μＬのアルミニウムアジュバント及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、乳化機で乳化した後、マウスに筋肉注射して免疫化させた。コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）の点鼻投与による免疫化方法は、２０μＬ 生理食塩水に５μｇ ＣＴＢ及び１０μｇ ＯＶＡタンパク質を加え、均一に混合した後、マウスに点鼻投与して免疫化させた。
ＥＬＩＳＡ法によるＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、総ＩｇＧ、ＩｇＡ抗体の測定：免疫化されたマウスからの希釈血清を１００μｇ／ｍｌ ＯＶＡが塗布されたＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識抗体マウスＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、 ＃１８－４０１５－８２）、ＩｇＧ２ｃ（ＧｅｎｅＴｅｘ、 ＧＴＸ７７２９７）、ＩｇＧ ｔｏｔａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｇ２１０４０）、ＩｇＡ（ＧｅｎｅＴｅｘ、 ＧＴＸ７７２２３）を使用して、結合した対応する抗体を検出した。 次いで、プレートを基質ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにインキュベートし、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で反応を停止し、次に、吸収波長４５０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
統計分析
ｔ検定を使用してデータを分析した。コックス・マンテル検定を使用して生存曲線を比較した。
【0028】
実施例１． 溶液中でのマンガン化合物の状態及びそのアジュバントとしての効果
実験（ａ）ＭｎＣｌ２は、ＰＢＳと反応して沈殿物を生成し、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、次のように調製された。
図１Ａに示すように、実験では、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）が自分で調製され、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）がＧｉｂｃｏから購入された。合計で３つのグループの反応系があり、それぞれ、９００μｌの生理食塩水に１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えるグループ；９００μｌのＰＢＳに１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えるグループ；８５０μｌの生理食塩水に５０μｌ Ｎａ３ＰＯ４を加え、さらに１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えてコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４を調製するグループである。該コロイド状マンガンの分子式は、Ｘ線光電子分光法Ｘ－ｒａｙ ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ）により測定した。ＭｎＣｌ２は、生理食塩水中で沈殿物が生じなく、ＰＢＳで一晩反応させた後、白色の沈殿が生じ、第３の反応で生成されたコロイドが沈殿を生じなかった。第３の反応生成物に光を照射してチンダル現象が発生した。コロイド状マンガンの微細構造を透過型電子顕微鏡で撮影し、図１Ｂに示すように、直径約１０ｎｍ程度の粒子であることを示した。
実験（ｂ）でのＰＢＳ中のマンガン化合物沈殿とコロイド状マンガンのアジュバント効果の比較
マウスを体重に応じてランダムに６つの群に分け、それぞれ、１）ＰＢＳ対照群、２）抗原ＯＶＡ（１０μｇ）、３）ＭｎＣｌ２を生理食塩水で２日反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、４）ＭｎＣｌ２をＰＢＳで５分間反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、５）ＭｎＣｌ２をＰＢＳで２日反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、６）ＭｎＣｌ２を反応させてコロイド状マンガンを３０日生じた群（１０μｇ Ｍｎ２ＯＨＰＯ４＋ＯＶＡ）である。ここで、１０μｇは、いずれもマンガン元素の質量を指す。各群は、実験設計量に従って筋肉注射して免疫化させ、０日目、７日目、１４日目に各々１回免疫化した。２１日目に採血し、血清分離を行い、ＥＬＩＳＡ法でＯＶＡ―ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。図１Ｃに示すように、ＭｎＣｌ２は、ＰＢＳで短時間反応した粒子がアジュバント効果を有するが、長時間反応した後、大きな粒子に凝集する効果が弱まり、コロイド状マンガン（図１にＭｎＪと略記）Ｍｎ２ＯＨＰＯ４は、１か月放置しても効果が良い。これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が優れた安定したアジュバントであることを示した。
実験（ｃ）：ＭｎＣｌ２溶液とコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の注射部位での滞留時間の比較
マウスは、体重に応じてランダムに２つの群に分けられ、それぞれ、ＭｎＣｌ２溶液筋肉注射群（１００μｌの生理食塩水に２０μｇのＭｎＣｌ２を溶解させたもの）、コロイド状マンガン筋肉注射群（１００μｌの生理食塩水に２０μｇのコロイド状マンガンを懸濁させたもの）であり、ここで、２０μｇは、いずれもマンガン元素の質量を指す。注射後の異なる時間に、注射部位での筋肉０．１ ｇを採取し、マイクロ波消化装置で消化した後、ＩＣＰ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｘ ＳＥＲＩＥＳ ＩＩ）でマンガン元素の含有量を測定した。図１Ｄに示すように、コロイド状マンガンは、注射部位により長く滞留することができ、抗体を生成するためのに生体をより持続的に活性化できるが、溶液マンガンは迅速に代謝される。
実験（ａ）ＭｎＣｌ２は、ＰＢＳと反応して沈殿物を生成し、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、次のように調製された。
図１Ａに示すように、実験では、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）が自分で調製され、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）がＧｉｂｃｏから購入された。合計で３つのグループの反応系があり、それぞれ、９００μｌの生理食塩水に１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えるグループ；９００μｌのＰＢＳに１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えるグループ；８５０μｌの生理食塩水に５０μｌ Ｎａ３ＰＯ４を加え、さらに１００μｌのＭｎＣｌ２ （０．２Ｍ）を加えてコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４を調製するグループである。該コロイド状マンガンの分子式は、Ｘ線光電子分光法Ｘ－ｒａｙ ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ）により測定した。ＭｎＣｌ２は、生理食塩水中で沈殿物が生じなく、ＰＢＳで一晩反応させた後、白色の沈殿が生じ、第３の反応で生成されたコロイドが沈殿を生じなかった。第３の反応生成物に光を照射してチンダル現象が発生した。コロイド状マンガンの微細構造を透過型電子顕微鏡で撮影し、図１Ｂに示すように、直径約１０ｎｍ程度の粒子であることを示した。
実験（ｂ）でのＰＢＳ中のマンガン化合物沈殿とコロイド状マンガンのアジュバント効果の比較
マウスを体重に応じてランダムに６つの群に分け、それぞれ、１）ＰＢＳ対照群、２）抗原ＯＶＡ（１０μｇ）、３）ＭｎＣｌ２を生理食塩水で２日反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、４）ＭｎＣｌ２をＰＢＳで５分間反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、５）ＭｎＣｌ２をＰＢＳで２日反応させた群（１０μｇ ＭｎＣｌ２＋ＯＶＡ）、６）ＭｎＣｌ２を反応させてコロイド状マンガンを３０日生じた群（１０μｇ Ｍｎ２ＯＨＰＯ４＋ＯＶＡ）である。ここで、１０μｇは、いずれもマンガン元素の質量を指す。各群は、実験設計量に従って筋肉注射して免疫化させ、０日目、７日目、１４日目に各々１回免疫化した。２１日目に採血し、血清分離を行い、ＥＬＩＳＡ法でＯＶＡ―ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。図１Ｃに示すように、ＭｎＣｌ２は、ＰＢＳで短時間反応した粒子がアジュバント効果を有するが、長時間反応した後、大きな粒子に凝集する効果が弱まり、コロイド状マンガン（図１にＭｎＪと略記）Ｍｎ２ＯＨＰＯ４は、１か月放置しても効果が良い。これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が優れた安定したアジュバントであることを示した。
実験（ｃ）：ＭｎＣｌ２溶液とコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の注射部位での滞留時間の比較
マウスは、体重に応じてランダムに２つの群に分けられ、それぞれ、ＭｎＣｌ２溶液筋肉注射群（１００μｌの生理食塩水に２０μｇのＭｎＣｌ２を溶解させたもの）、コロイド状マンガン筋肉注射群（１００μｌの生理食塩水に２０μｇのコロイド状マンガンを懸濁させたもの）であり、ここで、２０μｇは、いずれもマンガン元素の質量を指す。注射後の異なる時間に、注射部位での筋肉０．１ ｇを採取し、マイクロ波消化装置で消化した後、ＩＣＰ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｘ ＳＥＲＩＥＳ ＩＩ）でマンガン元素の含有量を測定した。図１Ｄに示すように、コロイド状マンガンは、注射部位により長く滞留することができ、抗体を生成するためのに生体をより持続的に活性化できるが、溶液マンガンは迅速に代謝される。
【0029】
実施例２． マンガンイオン（ＩＩ）と他のアニオンの反応による沈殿特性及び細胞応答
実験（ａ）：一定濃度のマンガンイオン（ＩＩ）と異なる濃度のアニオンとの反応
生理食塩水の反応系では、２０ｍＭのＭｎＣｌ２と他の異なる濃度（２．５、５、１０、２０、３０、４０ｍＭ）のナトリウム塩に由来するアニオン（Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＯＨ）を混合した。図２Ａに示すように、２価の遊離マンガンはＣＯ３ ２－と反応して黒色沈殿としてＭｎＣＯ３を生じ、ＨＣＯ３ －と反応して白色沈殿としてＭｎ（ＨＣＯ３）２を生じ、ＰＯ４ ３－と反応して２つの態様の生成物を生じ、低濃度では、白色沈殿物を生じ、高濃度では、淡黄色のコロイド状物質を生じた。測定すると、低濃度で生成したのは、Ｍｎ３（ＰＯ４）２であり、高濃度で生成したのは、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４であり、２価の遊離マンガンは、ＨＰＯ４ ２－と反応して白色のＭｎＨＰＯ４を生成し、ＯＨ－と反応して淡黄色の沈殿としてＭｎ（ＯＨ）２を生成した。
実験（ｂ）：異なるマンガンイオン（ＩＩ）生成物がＩ型インターフェロンを活性化し、炎症性サイトカインを切断してＩＬ－１βを産生する能力及びアジュバント効果の比較
図２Ｂに示すように、左から右の順序で、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに１００μＬの０．２Ｍ ＭｎＣｌ２と９００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＣｌ２）、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（ＨＣＯ３）２）、１００μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＣＯ３）、２０μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３＋２０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ＋８６０μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ２ＯＨＣＯ３）、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（Ｈ２ＰＯ４）２）、１００μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＨＰＯ４）、２６．６μＬの０．５Ｍ Ｎａ３ＰＯ４＋８７３．４μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ３（ＰＯ４）２）、５０μＬの０．５Ｍ Ｎａ３ＰＯ４＋８５０μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ２（ＯＨ）ＰＯ４）、並びに、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（ＯＨ）２）、反応させて図２Ｂに示すコロイド又は固体沈殿物を生成した。沈殿物を生理食塩水で洗浄し、その後の実験に使用した（生理食塩水に沈殿物がないため、ＭｎＣｌ２は洗浄されないため、実験に溶液を使用された。）。等モル量（５００μＭ Ｍｎ２＋を含有）の複数種の生成物（Ｍｎ（Ｈ２ＰＯ４）２生成物がは水に溶けやすく、沈殿が少なく、５００μＭ未満では、他のアニオンはいずれもＭｎ２＋を完全に沈殿させる可能性がある。）を使用して２×１０６ ＴＨＰ１細胞を１８時間刺激し、上清中のＩ型インターフェロンのレベルを測定した。結果は、図２Ｂに示すように、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、Ｉ型インターフェロンの生成を活性化することができ、図２Ｂに示すＰ－ＩＲＦ３は、Ｉ型インターフェロンの発現を調節する主要な転写因子である。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、さらに炎症性サイトカインＩＬ－１βの産生を有意に誘導することもできる。非コロイド状のＭｎ（ＯＨ）２は、Ｉ型インターフェロンの産生を活性化することしかできず、炎症性サイトカインＩＬ－１βの産生を誘導することができない。１回あたり１０μｇの複数種の生成物（１０μｇは、マンガン元素の質量を指す。）を１０μｇのＯＶＡタンパク質とそれぞれ混合してマウスに３回筋肉免疫した後、マウス血清を採取してその抗ＯＶＡ―ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、生体を刺激して抗体を生成する効果が沈殿したマンガン化合物よりもはるかに優れた。抗体試験では、最左端のＭｎＣｌ２は、ＭｎＣｌ２とＰＢＳを５分間反応させた沈殿のアジュバント効果である。他の一晩放置し固体沈殿は、部分的なアジュバント効果もある。最良の効果のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４を選択して後の実験証明を行った。
実験（ｃ）：異なるマンガンイオン（ＩＩ）生成物のチンダル現象の比較
図２Ｃに示すように、反応生成物を生理食塩水に再懸濁させ、次にレーザーポインターで光を照射した。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４のチンダル現象が最も著しいのに対し、ＭｎＨＰＯ４がその直径が１００ ｎｍよりわずかに大きいため、部分的なチンダル現象を示すことを確認できる。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４の直径は、約１０ｎｍであり、コロイドの定義を満たす。
実験（ａ）：一定濃度のマンガンイオン（ＩＩ）と異なる濃度のアニオンとの反応
生理食塩水の反応系では、２０ｍＭのＭｎＣｌ２と他の異なる濃度（２．５、５、１０、２０、３０、４０ｍＭ）のナトリウム塩に由来するアニオン（Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＯＨ）を混合した。図２Ａに示すように、２価の遊離マンガンはＣＯ３ ２－と反応して黒色沈殿としてＭｎＣＯ３を生じ、ＨＣＯ３ －と反応して白色沈殿としてＭｎ（ＨＣＯ３）２を生じ、ＰＯ４ ３－と反応して２つの態様の生成物を生じ、低濃度では、白色沈殿物を生じ、高濃度では、淡黄色のコロイド状物質を生じた。測定すると、低濃度で生成したのは、Ｍｎ３（ＰＯ４）２であり、高濃度で生成したのは、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４であり、２価の遊離マンガンは、ＨＰＯ４ ２－と反応して白色のＭｎＨＰＯ４を生成し、ＯＨ－と反応して淡黄色の沈殿としてＭｎ（ＯＨ）２を生成した。
実験（ｂ）：異なるマンガンイオン（ＩＩ）生成物がＩ型インターフェロンを活性化し、炎症性サイトカインを切断してＩＬ－１βを産生する能力及びアジュバント効果の比較
図２Ｂに示すように、左から右の順序で、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに１００μＬの０．２Ｍ ＭｎＣｌ２と９００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＣｌ２）、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（ＨＣＯ３）２）、１００μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＣＯ３）、２０μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３＋２０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ＋８６０μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ２ＯＨＣＯ３）、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（Ｈ２ＰＯ４）２）、１００μＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（ＭｎＨＰＯ４）、２６．６μＬの０．５Ｍ Ｎａ３ＰＯ４＋８７３．４μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ３（ＰＯ４）２）、５０μＬの０．５Ｍ Ｎａ３ＰＯ４＋８５０μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ２（ＯＨ）ＰＯ４）、並びに、１００μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ＋８００μＬの生理食塩水を加えて一晩放置し（Ｍｎ（ＯＨ）２）、反応させて図２Ｂに示すコロイド又は固体沈殿物を生成した。沈殿物を生理食塩水で洗浄し、その後の実験に使用した（生理食塩水に沈殿物がないため、ＭｎＣｌ２は洗浄されないため、実験に溶液を使用された。）。等モル量（５００μＭ Ｍｎ２＋を含有）の複数種の生成物（Ｍｎ（Ｈ２ＰＯ４）２生成物がは水に溶けやすく、沈殿が少なく、５００μＭ未満では、他のアニオンはいずれもＭｎ２＋を完全に沈殿させる可能性がある。）を使用して２×１０６ ＴＨＰ１細胞を１８時間刺激し、上清中のＩ型インターフェロンのレベルを測定した。結果は、図２Ｂに示すように、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、Ｉ型インターフェロンの生成を活性化することができ、図２Ｂに示すＰ－ＩＲＦ３は、Ｉ型インターフェロンの発現を調節する主要な転写因子である。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、さらに炎症性サイトカインＩＬ－１βの産生を有意に誘導することもできる。非コロイド状のＭｎ（ＯＨ）２は、Ｉ型インターフェロンの産生を活性化することしかできず、炎症性サイトカインＩＬ－１βの産生を誘導することができない。１回あたり１０μｇの複数種の生成物（１０μｇは、マンガン元素の質量を指す。）を１０μｇのＯＶＡタンパク質とそれぞれ混合してマウスに３回筋肉免疫した後、マウス血清を採取してその抗ＯＶＡ―ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４及びＭｎＨＰＯ４は、生体を刺激して抗体を生成する効果が沈殿したマンガン化合物よりもはるかに優れた。抗体試験では、最左端のＭｎＣｌ２は、ＭｎＣｌ２とＰＢＳを５分間反応させた沈殿のアジュバント効果である。他の一晩放置し固体沈殿は、部分的なアジュバント効果もある。最良の効果のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４を選択して後の実験証明を行った。
実験（ｃ）：異なるマンガンイオン（ＩＩ）生成物のチンダル現象の比較
図２Ｃに示すように、反応生成物を生理食塩水に再懸濁させ、次にレーザーポインターで光を照射した。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４のチンダル現象が最も著しいのに対し、ＭｎＨＰＯ４がその直径が１００ ｎｍよりわずかに大きいため、部分的なチンダル現象を示すことを確認できる。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４の直径は、約１０ｎｍであり、コロイドの定義を満たす。
【0030】
実施例３．コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射及び粘膜免疫用アジュバントとしての使用
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射用アジュバントとしての使用
マウスは、体重に応じてランダムに６つの群に分けられ、それぞれ、ＰＢＳ対照群、抗原ＯＶＡ（１０μｇ）、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４群（１０μｇ Ｍｎ２ＯＨＰＯ４＋ＯＶＡ）、低用量アルミニウムアジュバント群（４４０μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）、中用量アルミニウムアジュバント群（８００μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）、及び高用量アルミニウムアジュバント群（１２２０μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）である。各群は、実験設計量に従って筋肉注射して免疫させ、０日目及び１０日目に各々１回免疫した。１０日目、１７日目、２４日目及び３１日目に採血し、血清分離を行い、抗ＯＶＡ－ＩｇＧ１抗体の含有量をＥＬＩＳＡ法により測定した。図３に示すように、１０μｇ／マウスの用量のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、高用量（１２２０μｇ／マウス）のアルミニウムアジュバントよりも効果が強いことが分かった。これは、コロイド状マンガンがアルミニウムアジュバントの１００分の１未満の用量でより良い免疫増強効果を達成できることを示しており、現在広く使用されているアルミニウムアジュバントの副作用を極めて大きく低減させることができる。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の粘膜アジュバントとしての使用
図４に示すように、同量（５μｇ／マウス）のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４及び経典的な粘膜免疫用アジュバントコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）を使用してそれぞれ抗原ＯＶＡ（１０μｇ）と混合し、マウスに点鼻投与して免疫させた。０日目、７日目及び１４日に各々１回免疫し、２１日目に採血し、血清分離を行い、口内洗浄液、肺胞洗浄液を集め、抗ＯＶＡ－ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ１抗体の含有量をＥＬＩＳＡ法で測定した。図４に示すように、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、粘膜アジュバントとしてマウスに免疫させる場合、肺胞洗浄液での抗体の含有量がコレラ毒素Ｂをアジュバントとする場合よりも高くなることが分かった。口内洗浄液及び血清では、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４は、同量のコレラ毒素Ｂの効果に相当した。これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４も優れた粘膜免疫アジュバントであることを示した。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射用アジュバントとしての使用
マウスは、体重に応じてランダムに６つの群に分けられ、それぞれ、ＰＢＳ対照群、抗原ＯＶＡ（１０μｇ）、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４群（１０μｇ Ｍｎ２ＯＨＰＯ４＋ＯＶＡ）、低用量アルミニウムアジュバント群（４４０μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）、中用量アルミニウムアジュバント群（８００μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）、及び高用量アルミニウムアジュバント群（１２２０μｇアルミニウムアジュバント＋ＯＶＡ）である。各群は、実験設計量に従って筋肉注射して免疫させ、０日目及び１０日目に各々１回免疫した。１０日目、１７日目、２４日目及び３１日目に採血し、血清分離を行い、抗ＯＶＡ－ＩｇＧ１抗体の含有量をＥＬＩＳＡ法により測定した。図３に示すように、１０μｇ／マウスの用量のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、高用量（１２２０μｇ／マウス）のアルミニウムアジュバントよりも効果が強いことが分かった。これは、コロイド状マンガンがアルミニウムアジュバントの１００分の１未満の用量でより良い免疫増強効果を達成できることを示しており、現在広く使用されているアルミニウムアジュバントの副作用を極めて大きく低減させることができる。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の粘膜アジュバントとしての使用
図４に示すように、同量（５μｇ／マウス）のコロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４及び経典的な粘膜免疫用アジュバントコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）を使用してそれぞれ抗原ＯＶＡ（１０μｇ）と混合し、マウスに点鼻投与して免疫させた。０日目、７日目及び１４日に各々１回免疫し、２１日目に採血し、血清分離を行い、口内洗浄液、肺胞洗浄液を集め、抗ＯＶＡ－ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ１抗体の含有量をＥＬＩＳＡ法で測定した。図４に示すように、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、粘膜アジュバントとしてマウスに免疫させる場合、肺胞洗浄液での抗体の含有量がコレラ毒素Ｂをアジュバントとする場合よりも高くなることが分かった。口内洗浄液及び血清では、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４は、同量のコレラ毒素Ｂの効果に相当した。これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４も優れた粘膜免疫アジュバントであることを示した。
【0031】
実施例４．コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射及び粘膜免疫用アジュバントとして使用による生体での持続的な特異的抗体の産生の可能性
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射用アジュバントとしての持続効果
実施例３での方法を参照して、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４をアジュバントとしてＯＶＡと混合して、マウスに筋肉注射して免疫させ、免疫後１週間、１か月、３か月、６か月のマウス血清中での抗ＯＶＡ抗体の含有量を測定した。図５Ａに示すように、血清中の抗ＯＶＡ抗体は、６か月目まで、依然として高いレベルで維持し、これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、アジュバントとして持続的な保護効果を生じることができることを示した。マウスの寿命は一般的に２年間であり、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が生体のライフサイクル全体で保護性抗体を産生できると期待された。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の粘膜アジュバントとしての持続的な効果
実施例３での方法を参照し、マウス粘膜免疫後、異なる時点でマウスの血液、肺胞洗浄液、口内洗浄液を集め、抗体の含有量を測定した。図５Ｂに示すように、特異的抗体の濃度は、免疫化後６か月まで、依然として高いレベルで維持し、これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が粘膜免疫に使用される場合にも持続的な保護効果を生み出すことができることを示した。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の筋肉注射用アジュバントとしての持続効果
実施例３での方法を参照して、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４をアジュバントとしてＯＶＡと混合して、マウスに筋肉注射して免疫させ、免疫後１週間、１か月、３か月、６か月のマウス血清中での抗ＯＶＡ抗体の含有量を測定した。図５Ａに示すように、血清中の抗ＯＶＡ抗体は、６か月目まで、依然として高いレベルで維持し、これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は、アジュバントとして持続的な保護効果を生じることができることを示した。マウスの寿命は一般的に２年間であり、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が生体のライフサイクル全体で保護性抗体を産生できると期待された。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４の粘膜アジュバントとしての持続的な効果
実施例３での方法を参照し、マウス粘膜免疫後、異なる時点でマウスの血液、肺胞洗浄液、口内洗浄液を集め、抗体の含有量を測定した。図５Ｂに示すように、特異的抗体の濃度は、免疫化後６か月まで、依然として高いレベルで維持し、これは、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４が粘膜免疫に使用される場合にも持続的な保護効果を生み出すことができることを示した。
【0032】
実施例５． マンガンイオン（ＩＩ）による炎症性サイトカインの産生の賦活化
炎症性サイトカインＩＬ－１βは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に直接作用、Ｔ細胞の増殖を促進することができ（８）、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βは、好中球の浸潤を促進することができ（１９）、炎症性サイトカインＩＬ－１８は、Ｔｈ１の免疫応答を効果的に増強させることができ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び細胞毒性作用を促進することもできる（９）。アルミニウムアジュバントのアジュバント効果は、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し、炎症性サイトカインを放出することにより達成することが報告されているため（２０－２２）、ＭｎＣｌ２／コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とアルミニウムアジュバントの炎症性サイトカインを賦活化する能力を検出して比較した。
ＭｎＣｌ２は、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と同じ炎症性サイトカインを賦活化する能力（図２Ｂを参照）及びメカニズムを持つが、ここで、ＭｎＣｌ２のみを例として使用した。１０、２０、５０、１００μｇ／ｍＬの塩化マンガン又はアルミニウムアジュバントを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたマウス腹腔マクロファージの初代培養物を処理し、インターフェロン誘導遺伝子ＩＳＧ５４及びＶｉｐｅｒｉｎをウェスタンブロッティングで検出し、上清中のＩ型インターフェロンの総含有量（インターフェロンαとインターフェロンβの濃度の合計）をＢｉｏａｓｓａｙで検出した。結果は、図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＭｎＣｌ２のみがＩ型インターフェロンの発現を活性化できるが、アルミニウムアジュバントは活性化できない。同様の濃度の塩化マンガン及びアルミニウムアジュバントでＬＰＳで前処理された腹腔マクロファージを処理し、上清中のｃａｓｐａｓｅ１の切断及びＩＬ－１βの切断（上のバンドは前駆体であり、下のバンドは、活性型のｃａｓｐａｓｅ１及びＩＬ－１βである。）をウェスタンブロッティングで検出し、上清中の炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８の産生をＥＬＩＳＡにより検出した。結果は、図６Ｃ及び６Ｄに示すように、ＭｎＣｌ２は、炎症性サイトカインを賦活化する能力がアルミニウムアジュバントよりも大幅に強くなることが分かった。ＭｎＣｌ２、ＡＴＰ（経典的なＮＬＲＰ３インフラマソーム賦活剤）、ＶａｃＶ（経典的なＡｉｍ２インフラマソーム賦活剤）でＬＰＳで前処理された腹腔マクロファージを処理し、上清中のｃａｓｐａｓｅ１の切断及びＩＬ－１βの切断（上のバンドは、前駆体であり、下のバンドは、活性型のｃａｓｐａｓｅ１及びＩＬ－１βである。）をウェスタンブロッティングで検出し、上清中の炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８の産生をＥＬＩＳＡにより検出した。結果は、図６Ｅ及び６Ｆに示すように、ＮＬＲＰ３ノックアウト細胞では、ＭｎＣｌ２の炎症性サイトカインを活性化する能力が大幅に弱まっているため、ＭｎＣｌ２によって活性化されたのは、主にＮＬＲＰ３インフラマソームである。
炎症性サイトカインＩＬ－１βは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に直接作用、Ｔ細胞の増殖を促進することができ（８）、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βは、好中球の浸潤を促進することができ（１９）、炎症性サイトカインＩＬ－１８は、Ｔｈ１の免疫応答を効果的に増強させることができ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び細胞毒性作用を促進することもできる（９）。アルミニウムアジュバントのアジュバント効果は、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し、炎症性サイトカインを放出することにより達成することが報告されているため（２０－２２）、ＭｎＣｌ２／コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とアルミニウムアジュバントの炎症性サイトカインを賦活化する能力を検出して比較した。
ＭｎＣｌ２は、コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と同じ炎症性サイトカインを賦活化する能力（図２Ｂを参照）及びメカニズムを持つが、ここで、ＭｎＣｌ２のみを例として使用した。１０、２０、５０、１００μｇ／ｍＬの塩化マンガン又はアルミニウムアジュバントを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたマウス腹腔マクロファージの初代培養物を処理し、インターフェロン誘導遺伝子ＩＳＧ５４及びＶｉｐｅｒｉｎをウェスタンブロッティングで検出し、上清中のＩ型インターフェロンの総含有量（インターフェロンαとインターフェロンβの濃度の合計）をＢｉｏａｓｓａｙで検出した。結果は、図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＭｎＣｌ２のみがＩ型インターフェロンの発現を活性化できるが、アルミニウムアジュバントは活性化できない。同様の濃度の塩化マンガン及びアルミニウムアジュバントでＬＰＳで前処理された腹腔マクロファージを処理し、上清中のｃａｓｐａｓｅ１の切断及びＩＬ－１βの切断（上のバンドは前駆体であり、下のバンドは、活性型のｃａｓｐａｓｅ１及びＩＬ－１βである。）をウェスタンブロッティングで検出し、上清中の炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８の産生をＥＬＩＳＡにより検出した。結果は、図６Ｃ及び６Ｄに示すように、ＭｎＣｌ２は、炎症性サイトカインを賦活化する能力がアルミニウムアジュバントよりも大幅に強くなることが分かった。ＭｎＣｌ２、ＡＴＰ（経典的なＮＬＲＰ３インフラマソーム賦活剤）、ＶａｃＶ（経典的なＡｉｍ２インフラマソーム賦活剤）でＬＰＳで前処理された腹腔マクロファージを処理し、上清中のｃａｓｐａｓｅ１の切断及びＩＬ－１βの切断（上のバンドは、前駆体であり、下のバンドは、活性型のｃａｓｐａｓｅ１及びＩＬ－１βである。）をウェスタンブロッティングで検出し、上清中の炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８の産生をＥＬＩＳＡにより検出した。結果は、図６Ｅ及び６Ｆに示すように、ＮＬＲＰ３ノックアウト細胞では、ＭｎＣｌ２の炎症性サイトカインを活性化する能力が大幅に弱まっているため、ＭｎＣｌ２によって活性化されたのは、主にＮＬＲＰ３インフラマソームである。
【0033】
実施例６． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４によるＴ細胞の増殖の促進
ＣＦＳＥ色素で標識された１×１０６ ＯＴ－ＩＩ細胞をマウスに尾静脈内注射し、１日間後にＯＶＡタンパク質で免疫化し、それぞれ、ＰＢＳ対照群、異なる用量のＯＶＡ対照群（１μｇ、２μｇ及び５μｇ）、１０μｇのコロイド状マンガンと１μｇ、２μｇ及び５μｇのＯＶＡタンパク質のそれぞれと混合した混合群、並びに１２２０μｇのアルミニウムアジュバントと１μｇ、２μｇ及び５μｇのＯＶＡタンパク質のそれぞれと混合した混合群であり、ここでいう用量は、いずれも１匹のマウスあたり１回の免疫の用量を指す。マウスの免疫後３日後に、リンパ節を採取し、リンパ節におけるＯＴ－ＩＩ細胞の増殖をフローサイトメトリーで分析した。
図７に示すように、最右端のピークは、最初にマウスの体に注射されたＯＴ－ＩＩ細胞である。細胞が分裂した後、細胞内のＣＦＳＥは、２つの細胞に均等に分配されるため、細胞内のＣＦＳＥの輝度が低減し、左側のＣＦＳＥが低減した細胞はすべて分裂した細胞である。結果は、同量の抗原を使用した場合、コロイド状マンガンは、Ｔ細胞の増殖を促進する能力がアルミニウムアジュバントよりも強く、用量が類似する効果に達するためにアルミニウムアジュバントの１／１００しか必要としないことを示した。
ＣＦＳＥ色素で標識された１×１０６ ＯＴ－ＩＩ細胞をマウスに尾静脈内注射し、１日間後にＯＶＡタンパク質で免疫化し、それぞれ、ＰＢＳ対照群、異なる用量のＯＶＡ対照群（１μｇ、２μｇ及び５μｇ）、１０μｇのコロイド状マンガンと１μｇ、２μｇ及び５μｇのＯＶＡタンパク質のそれぞれと混合した混合群、並びに１２２０μｇのアルミニウムアジュバントと１μｇ、２μｇ及び５μｇのＯＶＡタンパク質のそれぞれと混合した混合群であり、ここでいう用量は、いずれも１匹のマウスあたり１回の免疫の用量を指す。マウスの免疫後３日後に、リンパ節を採取し、リンパ節におけるＯＴ－ＩＩ細胞の増殖をフローサイトメトリーで分析した。
図７に示すように、最右端のピークは、最初にマウスの体に注射されたＯＴ－ＩＩ細胞である。細胞が分裂した後、細胞内のＣＦＳＥは、２つの細胞に均等に分配されるため、細胞内のＣＦＳＥの輝度が低減し、左側のＣＦＳＥが低減した細胞はすべて分裂した細胞である。結果は、同量の抗原を使用した場合、コロイド状マンガンは、Ｔ細胞の増殖を促進する能力がアルミニウムアジュバントよりも強く、用量が類似する効果に達するためにアルミニウムアジュバントの１／１００しか必要としないことを示した。
【0034】
実施例７． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４による抗体の産生の活性化は、ＳＴＩＮＧ経路及びインフラマソーム経路に依存する。
図８に示すように、図８Ａは、１０μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質でＷＴ、Ｐｙｃａｒｄノックアウト（ＡＳＣ欠失）、Ｓｔｉｎｇノックアウト（ＳＴＩＮＧ欠失）、Ｐｙｃａｒｄ及びＳｔｉｎｇダブルノックマウスに３回筋肉注射した後、マウスの血清を採取して血清中の抗ＯＶＡ抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、総ＩｇＧの含有量をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、シングルノックアウトではコロイド状マンガンのアジュバント効果が部分的に失われるだけであるが、ダブルノックアウトではアジュバント効果が有意に低減することを示した。図８Ｂは、５μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質でマウスに３回粘膜免疫した後、血清、肺胞洗浄液、口内洗浄液を採取し、分泌型抗ＯＶＡ－ＩｇＡ抗体の含有量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ダブルノックマウスでは、アジュバント効果が有意に低減することを示した。
図８に示すように、図８Ａは、１０μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質でＷＴ、Ｐｙｃａｒｄノックアウト（ＡＳＣ欠失）、Ｓｔｉｎｇノックアウト（ＳＴＩＮＧ欠失）、Ｐｙｃａｒｄ及びＳｔｉｎｇダブルノックマウスに３回筋肉注射した後、マウスの血清を採取して血清中の抗ＯＶＡ抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、総ＩｇＧの含有量をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、シングルノックアウトではコロイド状マンガンのアジュバント効果が部分的に失われるだけであるが、ダブルノックアウトではアジュバント効果が有意に低減することを示した。図８Ｂは、５μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質でマウスに３回粘膜免疫した後、血清、肺胞洗浄液、口内洗浄液を採取し、分泌型抗ＯＶＡ－ＩｇＡ抗体の含有量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ダブルノックマウスでは、アジュバント効果が有意に低減することを示した。
【0035】
実施例８． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４による樹状細胞の成熟の促進
図９に示すように、図９Ａは、１００、２００、４００μＭのコロイド状マンガンを使用して骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を２０時間処理し、樹状細胞成熟のマーカーであるＣＤ８６タンパク質をフローサイトメトリーで検出した。結果は、野生型マウスでは、濃度が増加するほど、樹状細胞の成熟を促進できることを示した。但し、ダブルノック細胞では、細胞の成熟を促進できない。図９Ｂでは、４つのマウスについて、実施例６での方法を参照して、コロイド状マンガンがＴ細胞の増殖を促進する効率を測定した。結果は、ダブルノックマウスでは、コロイド状マンガンアジュバントがＴ細胞の増殖を促進する能力が有意に低減することを示し、これは樹状細胞の成熟とも一致している。図９Ｃでは、１０μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質が筋肉注射された野生型マウス及びダブルノックマウスを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面におけるＯＶＡテトラマーの含有量（アジュバントで活性化されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を特徴付け）をフローサイトメトリーで分析した。結果は、コロイド状マンガンがＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を活性化でき、且つＳＴＩＮＧ及びＡＳＣの２つの経路に依存することを示した。
図９に示すように、図９Ａは、１００、２００、４００μＭのコロイド状マンガンを使用して骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を２０時間処理し、樹状細胞成熟のマーカーであるＣＤ８６タンパク質をフローサイトメトリーで検出した。結果は、野生型マウスでは、濃度が増加するほど、樹状細胞の成熟を促進できることを示した。但し、ダブルノック細胞では、細胞の成熟を促進できない。図９Ｂでは、４つのマウスについて、実施例６での方法を参照して、コロイド状マンガンがＴ細胞の増殖を促進する効率を測定した。結果は、ダブルノックマウスでは、コロイド状マンガンアジュバントがＴ細胞の増殖を促進する能力が有意に低減することを示し、これは樹状細胞の成熟とも一致している。図９Ｃでは、１０μｇ／匹のコロイド状マンガンと１０μｇ／匹のＯＶＡタンパク質が筋肉注射された野生型マウス及びダブルノックマウスを使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面におけるＯＶＡテトラマーの含有量（アジュバントで活性化されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を特徴付け）をフローサイトメトリーで分析した。結果は、コロイド状マンガンがＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を活性化でき、且つＳＴＩＮＧ及びＡＳＣの２つの経路に依存することを示した。
【0036】
実施例９． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４のアジュバントとして増強不活化水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）の免疫保護を強化する効果
実験（ａ）：不活化ＶＳＶワクチン
実験手順は、図１０Ａに示すように、０日目にワクチンをマウスに筋肉注射し、１０日目にウイルスをマウスに感染させ、１４日目にマウス組織中のウイルス力価を測定し、マウスを観察し、１４日目までの生存曲線を記録した。ＰＥＧで精製されたＶＳＶを不活化してワクチンとし、１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５及び１０－６の希釈率に希釈してマウスに筋肉注射して免疫させた。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、ウイルスの濃度が十分に高い場合には、単独で使用するとマウスを保護するのに十分な免疫効果を生み出すことができ、ウイルスをいくつかの勾配で１０倍希釈した後、マウスに免疫化させ、濃度が１０－３である場合には、マウスの生存率は、僅かに８．３％であり、濃度が１０－４、１０－５、１０－６である場合には、全てのマウスは死亡したが、濃度１０－３の不活化ウイルスにＭｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えてマウスに免疫化させると、マウスの生存率は、７５％に増加した。図１０Ｄに示すように、コロイド状マンガンはアジュバントとして低濃度の免疫原の免疫効果を増強でき、少量の免疫原を使用すれば保護作用を発揮でき、且つマウスの体内での活性ウイルス力価も低下することを示した。
実験（ｂ）：不活化ＨＳＶ－１ワクチン
図１０Ｅ及び１０Ｆに示すように、ＰＥＧで精製されたＨＳＶ－１ウイルスを不活化してワクチンとしてマウスに筋肉注射して免疫化させ、ウイルスの希釈率が１０－１、１０－２である場合には、単独で使用するとマウスを保護するのに十分な免疫効果を生み出すことができるが、ウイルスの希釈率が１０－４に下げる場合には、マウスの生存率は、わずか１６．７％であり、それより低くなると全てのマウスが死亡したが、希釈率１０－４のウイルスにＭｎ２ＯＨＰＯ４コロイドを加えると、マウスの生存率は、１００％に上昇した。さらに、図１０Ｇに示すように、マウスの体内の活性ウイルス力価は低下した。これは、コロイド状マンガンがアジュバントとして不活化されたＨＳＶ－１ウイルスの用量を１／１０に低減させるとともに同様の保護効果を達成できることを示した。
実験（ａ）：不活化ＶＳＶワクチン
実験手順は、図１０Ａに示すように、０日目にワクチンをマウスに筋肉注射し、１０日目にウイルスをマウスに感染させ、１４日目にマウス組織中のウイルス力価を測定し、マウスを観察し、１４日目までの生存曲線を記録した。ＰＥＧで精製されたＶＳＶを不活化してワクチンとし、１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５及び１０－６の希釈率に希釈してマウスに筋肉注射して免疫させた。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、ウイルスの濃度が十分に高い場合には、単独で使用するとマウスを保護するのに十分な免疫効果を生み出すことができ、ウイルスをいくつかの勾配で１０倍希釈した後、マウスに免疫化させ、濃度が１０－３である場合には、マウスの生存率は、僅かに８．３％であり、濃度が１０－４、１０－５、１０－６である場合には、全てのマウスは死亡したが、濃度１０－３の不活化ウイルスにＭｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えてマウスに免疫化させると、マウスの生存率は、７５％に増加した。図１０Ｄに示すように、コロイド状マンガンはアジュバントとして低濃度の免疫原の免疫効果を増強でき、少量の免疫原を使用すれば保護作用を発揮でき、且つマウスの体内での活性ウイルス力価も低下することを示した。
実験（ｂ）：不活化ＨＳＶ－１ワクチン
図１０Ｅ及び１０Ｆに示すように、ＰＥＧで精製されたＨＳＶ－１ウイルスを不活化してワクチンとしてマウスに筋肉注射して免疫化させ、ウイルスの希釈率が１０－１、１０－２である場合には、単独で使用するとマウスを保護するのに十分な免疫効果を生み出すことができるが、ウイルスの希釈率が１０－４に下げる場合には、マウスの生存率は、わずか１６．７％であり、それより低くなると全てのマウスが死亡したが、希釈率１０－４のウイルスにＭｎ２ＯＨＰＯ４コロイドを加えると、マウスの生存率は、１００％に上昇した。さらに、図１０Ｇに示すように、マウスの体内の活性ウイルス力価は低下した。これは、コロイド状マンガンがアジュバントとして不活化されたＨＳＶ－１ウイルスの用量を１／１０に低減させるとともに同様の保護効果を達成できることを示した。
【0037】
実験（ｃ）：不活化ＰＲ８ウイルスワクチンによる１回の粘膜免疫
ＰＥＧで精製されたインフルエンザＰＲ８ウイルスを不活化した後、１、１０－１、１０－２、１０－３の希釈率に希釈し、マウスに１回点鼻投与して免疫させた。７日間後、インフルエンザウイルスをマウスに感染させ、マウスの生存率及び体重変化を記録した。図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、アジュバントを添加しない場合、全ての用量で保護効果がなく、マウスの体重が死亡まで低下したが、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えた後、１０－１の用量に希釈されたウイルスでは、マウスの体重が４日目及び５日目まで低下した後に上昇し、１０日目以降、体重がウイルス感染前のレベルに戻り、病状が良くなることができる。この結果は、コロイド状マンガンがアジュバントとするのは、元々非免疫原性または弱免疫原性である免疫原を対象に１回免疫化した後、保護効果を生み出すことができることを示した。
実験（ｄ）：不活化ＰＲ８ウイルスワクチンによる２回の粘膜免疫
図１１Ｃ及び１１Ｄに示すように、ＰＥＧで精製されたインフルエンザＰＲ８ウイルスを不活化した後、１、１０－１、１０－２、１０－３の希釈率に希釈し、マウスに２回点鼻投与して免疫化させた（０日目及び７日目に免疫化させた）。１４日間後、インフルエンザウイルスをマウスに感染させ、マウスの生存率及び体重変化を記録した。アジュバントを添加しない場合、全ての用量で保護効果はなく、マウスの体重が死亡まで低下したが、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えた後、１０－１の用量に希釈されたウイルスをマウスに２回免疫化させた後、マウスの体重は、ウイルス感染後に１０％減少しただけであるが、すぐに回復した。希釈されないウイルスの免疫化後にマウスの体重は減少せず、感染の症状も見られない。この結果は、表明コロイド状マンガンがアジュバントとして元々免疫効果がないワクチンに加えられた後、２回免疫後有意な予防効果が達成できることを示した。
ＰＥＧで精製されたインフルエンザＰＲ８ウイルスを不活化した後、１、１０－１、１０－２、１０－３の希釈率に希釈し、マウスに１回点鼻投与して免疫させた。７日間後、インフルエンザウイルスをマウスに感染させ、マウスの生存率及び体重変化を記録した。図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、アジュバントを添加しない場合、全ての用量で保護効果がなく、マウスの体重が死亡まで低下したが、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えた後、１０－１の用量に希釈されたウイルスでは、マウスの体重が４日目及び５日目まで低下した後に上昇し、１０日目以降、体重がウイルス感染前のレベルに戻り、病状が良くなることができる。この結果は、コロイド状マンガンがアジュバントとするのは、元々非免疫原性または弱免疫原性である免疫原を対象に１回免疫化した後、保護効果を生み出すことができることを示した。
実験（ｄ）：不活化ＰＲ８ウイルスワクチンによる２回の粘膜免疫
図１１Ｃ及び１１Ｄに示すように、ＰＥＧで精製されたインフルエンザＰＲ８ウイルスを不活化した後、１、１０－１、１０－２、１０－３の希釈率に希釈し、マウスに２回点鼻投与して免疫化させた（０日目及び７日目に免疫化させた）。１４日間後、インフルエンザウイルスをマウスに感染させ、マウスの生存率及び体重変化を記録した。アジュバントを添加しない場合、全ての用量で保護効果はなく、マウスの体重が死亡まで低下したが、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドをアジュバントとして加えた後、１０－１の用量に希釈されたウイルスをマウスに２回免疫化させた後、マウスの体重は、ウイルス感染後に１０％減少しただけであるが、すぐに回復した。希釈されないウイルスの免疫化後にマウスの体重は減少せず、感染の症状も見られない。この結果は、表明コロイド状マンガンがアジュバントとして元々免疫効果がないワクチンに加えられた後、２回免疫後有意な予防効果が達成できることを示した。
【0038】
実施例１０． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４はアジュバントとしてインフルエンザサブユニットワクチンの保護効果を増強させる。
マウスは、ランダムに体重に応じて４つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｔｒｌ）、ＨＡ抗原群（ＨＡ）、ＨＡ抗原／コロイド状マンガン群（ＨＡ＋Ｍｎ）、及びＨＡ抗原／アルミニウムアジュバント群（ＨＡ＋Ａｌ）である。マウスに筋肉注射した後、１４日目、２１日目及び２８日目にマウスの血清中の抗ＨＡ－ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。図１２Ａに示すように、ＨＡタンパク質（５μｇ／マウス）を単独で使用すると、検出可能な特異的抗体を生成していなく、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド（５０μｇ／マウス）をアジュバントとして加えた後、筋肉注射免疫によって産生された抗ＨＡ－ＩｇＧ１抗体量はアルミニウムアジュバント（８００μｇ／匹）の効果よりも大幅に高かった。コロイド状マンガンとＣＴＢとがアジュバントとしてマウスに点鼻投与して免疫化させた効果を比較すると、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド（２０μｇ／マウス）をアジュバントとして加えた後、経鼻免疫によって産生された抗ＨＡ－ＩｇＡ抗体が４週間免疫化した後にＣＴＢ（５μｇ／マウス）をアジュバントとする効果よりも大幅に高かった。図１２Ｃ及び１２Ｄに示すように、コロイド状マンガンをアジュバントとしてマウスに免疫化させた後、マウスは、体重が変化せず、肺に炎症を起こしないが、アルミニウムアジュバントとＣＴＢとをアジュバントとしてマウスに免疫した後、マウスは、体重が僅かに減少した後回復し、肺に少量の炎症があることが分かった。この結果は、コロイド状マンガンがサブユニットワクチンアジュバントとして使用でき、従来のアジュバントよりも安全性がより高く、効果がより良いことを示した。
マウスは、ランダムに体重に応じて４つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｔｒｌ）、ＨＡ抗原群（ＨＡ）、ＨＡ抗原／コロイド状マンガン群（ＨＡ＋Ｍｎ）、及びＨＡ抗原／アルミニウムアジュバント群（ＨＡ＋Ａｌ）である。マウスに筋肉注射した後、１４日目、２１日目及び２８日目にマウスの血清中の抗ＨＡ－ＩｇＧ１抗体の含有量を測定した。図１２Ａに示すように、ＨＡタンパク質（５μｇ／マウス）を単独で使用すると、検出可能な特異的抗体を生成していなく、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド（５０μｇ／マウス）をアジュバントとして加えた後、筋肉注射免疫によって産生された抗ＨＡ－ＩｇＧ１抗体量はアルミニウムアジュバント（８００μｇ／匹）の効果よりも大幅に高かった。コロイド状マンガンとＣＴＢとがアジュバントとしてマウスに点鼻投与して免疫化させた効果を比較すると、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド（２０μｇ／マウス）をアジュバントとして加えた後、経鼻免疫によって産生された抗ＨＡ－ＩｇＡ抗体が４週間免疫化した後にＣＴＢ（５μｇ／マウス）をアジュバントとする効果よりも大幅に高かった。図１２Ｃ及び１２Ｄに示すように、コロイド状マンガンをアジュバントとしてマウスに免疫化させた後、マウスは、体重が変化せず、肺に炎症を起こしないが、アルミニウムアジュバントとＣＴＢとをアジュバントとしてマウスに免疫した後、マウスは、体重が僅かに減少した後回復し、肺に少量の炎症があることが分かった。この結果は、コロイド状マンガンがサブユニットワクチンアジュバントとして使用でき、従来のアジュバントよりも安全性がより高く、効果がより良いことを示した。
【0039】
実施例１１． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４はアジュバントとして同種異型インフルエンザウイルス（ＷＳＮ）及び異種インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）のいずれにも対する不活化インフルエンザウイルス及びサブユニットワクチンの保護効果を増強させる。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と不活化されたＰＲ８ウイルス又はＰＲ８－ＨＡ１タンパク質と混合して作製されたワクチンは、ＷＳＮウイルスの感染を予防することができる。
マウスは、ランダムに体重に応じて５つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、不活化ＰＲ８ウイルス群、不活化ＰＲ８ウイルス＋コロイド状マンガン群（ＰＲ８＋ＭｎＪ）、ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質群（ＨＡ１）、及びＰＲ８－ＨＡ１タンパク質＋コロイド状マンガン群（ＨＡ１＋ＭｎＪ）である。０日目、７日目、１４日目にそれぞれマウスに１回免疫化し、２１日目にＷＳＮウイルスをマウスに感染させ、マウスの体重を１４日間連続して記録した。図１３Ａに示すように、コロイド状マンガンを加えた実験群では、マウスの体重はいずれも減少せず、これは、ウイルスへの保護効果が極めて良いことを示すが、アジュバントを加えない群及び空白対照群では、マウスの体重はいずれも急速に減少した。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と不活化ＰＲ８ウイルス又はＰＲ８－ＨＡ１タンパク質とを混合して作製されたワクチンは、Ｈ３Ｎ２ウイルスの感染を予防することができる。
マウスは、ランダムに体重に応じて５つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、不活化ＰＲ８ウイルス群、不活化ＰＲ８ウイルス＋コロイド状マンガン群（ＰＲ８＋ＭｎＪ）、ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質群（ＨＡ１）及ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質＋コロイド状マンガン群（ＨＡ１＋ＭｎＪ）である。０日目、７日目、１４日目にそれぞれマウスに１回免疫し、２１日目にＨ３Ｎ２ウイルスをマウスに感染させ、マウスの体重を１４日間連続して記録した。図１３Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２ウイルスの毒性は、マウスの死亡に繋がなく、空白対照群及び単独不活化ウイルス群では、マウスの体重は、いずれも８０％に低下した後回復し、単独ＨＡ１群では、９０％に減少した後回復するが、コロイド状マンガンを加えるＨＡ１群では、体重は基本的に減少せず、コロイド状マンガンを加える不活化ウイルス群では、体重は５％減少しただけで、その後回復した。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と不活化されたＰＲ８ウイルス又はＰＲ８－ＨＡ１タンパク質と混合して作製されたワクチンは、ＷＳＮウイルスの感染を予防することができる。
マウスは、ランダムに体重に応じて５つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、不活化ＰＲ８ウイルス群、不活化ＰＲ８ウイルス＋コロイド状マンガン群（ＰＲ８＋ＭｎＪ）、ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質群（ＨＡ１）、及びＰＲ８－ＨＡ１タンパク質＋コロイド状マンガン群（ＨＡ１＋ＭｎＪ）である。０日目、７日目、１４日目にそれぞれマウスに１回免疫化し、２１日目にＷＳＮウイルスをマウスに感染させ、マウスの体重を１４日間連続して記録した。図１３Ａに示すように、コロイド状マンガンを加えた実験群では、マウスの体重はいずれも減少せず、これは、ウイルスへの保護効果が極めて良いことを示すが、アジュバントを加えない群及び空白対照群では、マウスの体重はいずれも急速に減少した。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４と不活化ＰＲ８ウイルス又はＰＲ８－ＨＡ１タンパク質とを混合して作製されたワクチンは、Ｈ３Ｎ２ウイルスの感染を予防することができる。
マウスは、ランダムに体重に応じて５つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、不活化ＰＲ８ウイルス群、不活化ＰＲ８ウイルス＋コロイド状マンガン群（ＰＲ８＋ＭｎＪ）、ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質群（ＨＡ１）及ＰＲ８－ＨＡ１タンパク質＋コロイド状マンガン群（ＨＡ１＋ＭｎＪ）である。０日目、７日目、１４日目にそれぞれマウスに１回免疫し、２１日目にＨ３Ｎ２ウイルスをマウスに感染させ、マウスの体重を１４日間連続して記録した。図１３Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２ウイルスの毒性は、マウスの死亡に繋がなく、空白対照群及び単独不活化ウイルス群では、マウスの体重は、いずれも８０％に低下した後回復し、単独ＨＡ１群では、９０％に減少した後回復するが、コロイド状マンガンを加えるＨＡ１群では、体重は基本的に減少せず、コロイド状マンガンを加える不活化ウイルス群では、体重は５％減少しただけで、その後回復した。
【0040】
実施例１２． コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４は免疫増強剤として生体への抗腫瘍効果を増強させる。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４のワクチンによるｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍の成長の抑制
マウスは、ランダムに体重に応じて４つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、ＯＶＡ対照群、ＯＶＡ／コロイド状マンガン群（ＯＶＡ＋Ｍｎ）、及びＯＶＡ／アルミニウムアジュバント群（ＯＶＡ＋Ａｌ）である。実験計画に従ってマウスに３回免疫した後（７日おきに１回免疫）、黒色腫Ｂ１６－ＯＶＡを皮下接種し、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍モデルを構築した。図１４Ａ～１４Ｃに示すように、予にアルミニウムアジュバントを使用すると、腫瘍の成長を抑制し、マウスの生存率を向上させることができないが；予にコロイド状マンガンを使用すると、腫瘍の成長を顕著に抑制し、マウスの生存率を向上させることができる。図１４Ｂに示すように、腫瘍接種の２１日後、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、１９０６ｍｍ３であり、ＯＶＡ群のマウスの平均腫瘍サイズは、９２５．５ｍｍ３であり、コロイド状マンガンで免疫されたマウスの平均腫瘍サイズは、２２２．９ｍｍ３であり、アルミニウムアジュバント群のマウスの平均腫瘍サイズは、１９４６ｍｍ３である。図１４Ｃに示すように、対照マウスの生存期間は、２６日間であり、コロイド状マンガンで免疫されたマウスの生存期間は、４９日間であり、アルミニウムアジュバントで免疫されたマウスの２７日間の生存期間よりも顕著に延長された。この結果は、コロイド状マンガンが免疫増強剤として生体の抗ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍効果を増強できることを示した。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４ワクチンによる腫瘍移転の抑制
Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド及びアルミニウムアジュバントをそれぞれ抗原ＯＶＡと混合した後、マウスに７日ごとに１回免疫化し、合計で３回免疫化し、生体内の免疫応答を賦活化し；Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を尾静脈内注射し、腫瘍移転モデルを構築した。図１４Ｄに示すように、腫瘍注射の２１日後にマウスを犠牲にし、肺組織を取り出し、空白対照群のマウスの肺が黒色腫で覆われ、ＯＶＡのみで免疫したマウスの肺に一定数の黒色腫が現れるが、ＯＶＡ＋コロイド状マンガンで免疫したマウス肺に腫瘍がほとんどないことを確認した。腫瘍組織を研磨した後、フローサイトメーターで腫瘍細胞の数を統計し、図１４Ｅに示すように、ＯＶＡ＋コロイド状マンガンを免疫したマウスの肺の腫瘍細胞数は、他の２つの群よりも有意に少ないことを示した。この結果は、コロイド状マンガンが免疫増強剤として生体の抗転移腫瘍効果を増強できることを示した。
実験（ａ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４のワクチンによるｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍の成長の抑制
マウスは、ランダムに体重に応じて４つの群に分けられ、それぞれ、空白対照群（ｃｏｎ）、ＯＶＡ対照群、ＯＶＡ／コロイド状マンガン群（ＯＶＡ＋Ｍｎ）、及びＯＶＡ／アルミニウムアジュバント群（ＯＶＡ＋Ａｌ）である。実験計画に従ってマウスに３回免疫した後（７日おきに１回免疫）、黒色腫Ｂ１６－ＯＶＡを皮下接種し、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍モデルを構築した。図１４Ａ～１４Ｃに示すように、予にアルミニウムアジュバントを使用すると、腫瘍の成長を抑制し、マウスの生存率を向上させることができないが；予にコロイド状マンガンを使用すると、腫瘍の成長を顕著に抑制し、マウスの生存率を向上させることができる。図１４Ｂに示すように、腫瘍接種の２１日後、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、１９０６ｍｍ３であり、ＯＶＡ群のマウスの平均腫瘍サイズは、９２５．５ｍｍ３であり、コロイド状マンガンで免疫されたマウスの平均腫瘍サイズは、２２２．９ｍｍ３であり、アルミニウムアジュバント群のマウスの平均腫瘍サイズは、１９４６ｍｍ３である。図１４Ｃに示すように、対照マウスの生存期間は、２６日間であり、コロイド状マンガンで免疫されたマウスの生存期間は、４９日間であり、アルミニウムアジュバントで免疫されたマウスの２７日間の生存期間よりも顕著に延長された。この結果は、コロイド状マンガンが免疫増強剤として生体の抗ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍効果を増強できることを示した。
実験（ｂ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４ワクチンによる腫瘍移転の抑制
Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド及びアルミニウムアジュバントをそれぞれ抗原ＯＶＡと混合した後、マウスに７日ごとに１回免疫化し、合計で３回免疫化し、生体内の免疫応答を賦活化し；Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を尾静脈内注射し、腫瘍移転モデルを構築した。図１４Ｄに示すように、腫瘍注射の２１日後にマウスを犠牲にし、肺組織を取り出し、空白対照群のマウスの肺が黒色腫で覆われ、ＯＶＡのみで免疫したマウスの肺に一定数の黒色腫が現れるが、ＯＶＡ＋コロイド状マンガンで免疫したマウス肺に腫瘍がほとんどないことを確認した。腫瘍組織を研磨した後、フローサイトメーターで腫瘍細胞の数を統計し、図１４Ｅに示すように、ＯＶＡ＋コロイド状マンガンを免疫したマウスの肺の腫瘍細胞数は、他の２つの群よりも有意に少ないことを示した。この結果は、コロイド状マンガンが免疫増強剤として生体の抗転移腫瘍効果を増強できることを示した。
【0041】
実験（ｃ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とシクロホスファミドの併用による抗腫瘍効果
マウスに黒色腫Ｂ１６Ｆ１０を皮下接種した後、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照群（ｃｏｎ）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド群（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＣＴＸ）群（１４０ｍｇ／ｋｇ）、及び併用投与群（ＣＴＸ＋Ｍｎ）である。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、臨床的に広く使用されている抗腫瘍化学療法薬である。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドを筋肉注射し（腫瘍接種後に２日ごとに１回治療）、ＣＴＸを腹腔内投与し（腫瘍接種後の６、９、１２日目に各々１回治療）、対照群で同体積の生理食塩水を投与した。図１５に示すように、コロイド状マンガンとＣＴＸの併用では、腫瘍の成長を有意に抑制できた。腫瘍接種の１４日後、マウスを犠牲にし、解剖して腫瘍を取り出し、その体積を測定し、図１５Ｂに示すように、対照群では、平均腫瘍サイズは、９６０．１ｍｍ３であり、コロイド状マンガンを単独で使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、６５９．５ｍｍ３であり、ＣＴＸを単独で使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、３９３．９ｍｍ３であり、併用によるマウスの腫瘍サイズは、２３８ｍｍ３である。同時に各腫瘍の重量を秤量した結果は、図１５Ｃに示すように、コロイド状マンガンとＣＴＸの併用により腫瘍の成長を抑制した。これは、コロイド状マンガンを免疫増強剤として従来の治療法、例えば、化学療法、併用投与の効果を増強させ、腫瘍の成長に有意な抑制効果を有することを示した。
実験（ｄ）コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とＰＤ－１抗体の併用による抗黒色腫効果
マウスに黒色腫Ｂ１６Ｆ１０を皮下接種した後、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照群（ｃｏｎ）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド群（５ｍｇ／ｋｇ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／匹）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）である。ＰＤ１抗体は、近年、免疫療法で使用される新薬である。ＰＤ１抗体（Ｃｌｏｎｅ ２９ Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）は、腫瘍接種後の３、７、１１日目にそれぞれ１回治療化され、２００μｇの抗体を２００μｌのＰＢＳに溶解させたものを１回腹腔内投与した。図１６Ａ－Ｃに示すように、腫瘍接種の１５日後、マウスを犠牲にし、解剖して腫瘍を取り出して測定し、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、１８４７ｍｍ３であり、コロイド状マンガンの単独使用群のマウスの平均腫瘍サイズは、７９７．３ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体の単独使用群のマウスの平均腫瘍サイズは、６８７．３ｍｍ３であるが、併用治療群のマウスの平均腫瘍サイズは、３４２ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体の単独使用よりも大幅に低かった。腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで分析し、コロイド状マンガンは、ＰＤ１抗体薬の効果を２７．７％から４５．４％まで向上させた。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに治療黒色腫を相乗的に治療できることを示した。
マウスに黒色腫Ｂ１６Ｆ１０を皮下接種した後、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照群（ｃｏｎ）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド群（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＣＴＸ）群（１４０ｍｇ／ｋｇ）、及び併用投与群（ＣＴＸ＋Ｍｎ）である。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、臨床的に広く使用されている抗腫瘍化学療法薬である。Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイドを筋肉注射し（腫瘍接種後に２日ごとに１回治療）、ＣＴＸを腹腔内投与し（腫瘍接種後の６、９、１２日目に各々１回治療）、対照群で同体積の生理食塩水を投与した。図１５に示すように、コロイド状マンガンとＣＴＸの併用では、腫瘍の成長を有意に抑制できた。腫瘍接種の１４日後、マウスを犠牲にし、解剖して腫瘍を取り出し、その体積を測定し、図１５Ｂに示すように、対照群では、平均腫瘍サイズは、９６０．１ｍｍ３であり、コロイド状マンガンを単独で使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、６５９．５ｍｍ３であり、ＣＴＸを単独で使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、３９３．９ｍｍ３であり、併用によるマウスの腫瘍サイズは、２３８ｍｍ３である。同時に各腫瘍の重量を秤量した結果は、図１５Ｃに示すように、コロイド状マンガンとＣＴＸの併用により腫瘍の成長を抑制した。これは、コロイド状マンガンを免疫増強剤として従来の治療法、例えば、化学療法、併用投与の効果を増強させ、腫瘍の成長に有意な抑制効果を有することを示した。
実験（ｄ）コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とＰＤ－１抗体の併用による抗黒色腫効果
マウスに黒色腫Ｂ１６Ｆ１０を皮下接種した後、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照群（ｃｏｎ）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド群（５ｍｇ／ｋｇ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／匹）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）である。ＰＤ１抗体は、近年、免疫療法で使用される新薬である。ＰＤ１抗体（Ｃｌｏｎｅ ２９ Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）は、腫瘍接種後の３、７、１１日目にそれぞれ１回治療化され、２００μｇの抗体を２００μｌのＰＢＳに溶解させたものを１回腹腔内投与した。図１６Ａ－Ｃに示すように、腫瘍接種の１５日後、マウスを犠牲にし、解剖して腫瘍を取り出して測定し、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、１８４７ｍｍ３であり、コロイド状マンガンの単独使用群のマウスの平均腫瘍サイズは、７９７．３ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体の単独使用群のマウスの平均腫瘍サイズは、６８７．３ｍｍ３であるが、併用治療群のマウスの平均腫瘍サイズは、３４２ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体の単独使用よりも大幅に低かった。腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで分析し、コロイド状マンガンは、ＰＤ１抗体薬の効果を２７．７％から４５．４％まで向上させた。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに治療黒色腫を相乗的に治療できることを示した。
【0042】
実験（ｅ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とＰＤ－１抗体との併用による結腸がん腫瘍の効果
マウスに結腸がんＭＣ３８を皮下接種し、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ、２００μｇ／マウス）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド／対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ＋Ｍｎ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／マウス）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）であり、ＰＤ－１の使用は実験（ｄ）と同様にした。腫瘍接種の２０日後、マウスを犠牲にし、解剖し、腫瘍を取り出して測定し、図１７Ｂに示すように、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、３１９．８ｍｍ３であり、マンガンを単独して使用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、１２６．９ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体薬を単独して使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、１４３．１ｍｍ３であり、併用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、６６．７４ｍｍ３である。腫瘍組織切片を作成し、ＤＡＰＩ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫蛍光染色を行うと、図１７Ｄに示すように、ＰＤ１抗体とコロイド状マンガンの併用により治療されたマウスの腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加することを確認した。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに結腸がんを相乗的に治療できることを示した。
マウスに結腸がんＭＣ３８を皮下接種し、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ、２００μｇ／マウス）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド／対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ＋Ｍｎ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／マウス）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）であり、ＰＤ－１の使用は実験（ｄ）と同様にした。腫瘍接種の２０日後、マウスを犠牲にし、解剖し、腫瘍を取り出して測定し、図１７Ｂに示すように、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、３１９．８ｍｍ３であり、マンガンを単独して使用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、１２６．９ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体薬を単独して使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、１４３．１ｍｍ３であり、併用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、６６．７４ｍｍ３である。腫瘍組織切片を作成し、ＤＡＰＩ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫蛍光染色を行うと、図１７Ｄに示すように、ＰＤ１抗体とコロイド状マンガンの併用により治療されたマウスの腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加することを確認した。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに結腸がんを相乗的に治療できることを示した。
【0043】
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１３．Ｓ．Ｍ． Ｂｌａａｕｂｏｅｒ、Ｖ． Ｄ． Ｇａｂｒｉｅｌｌｅ、Ｌ． Ｊｉｎ、ＭＰＹＳ／ＳＴＩＮＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ、ｎｏｔ ｔｙｐｅ Ｉ ＩＦＮ、ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ （３’－５’）－ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９２、４９２－５０２ （２０１４）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ ０１ （１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０１８１２）．
１４．Ｘ． Ｄ． Ｌｉ、Ｊ． Ｗｕ、Ｄ． Ｇａｏ、Ｈ． Ｗａｎｇ、Ｌ． Ｓｕｎ、Ｚ． Ｊ． Ｃｈｅｎ、Ｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃＧＡＳ－ｃＧＡＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１、１３９０－１３９４ （２０１３）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＳｅｐ ２０ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４４０４０）．
１５．Ｅ． Ｃ． Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｌ． Ｊｉｎ、Ａ．Ｍｏｒｉ、Ｎ．Ｍｕｎｏｚ－Ｗｏｌｆ、Ｅ． Ｏｌｅｓｚｙｃｋａ、Ｈ． Ｂ．Ｍｏｒａｎ、Ｓ．Ｍａｎｓｏｕｒｉ、Ｃ． Ｐ．ＭｃＥｎｔｅｅ、Ｅ． Ｌａｍｂｅ、Ｅ．Ｍ． Ａｇｇｅｒ、Ｐ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｃ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｐ． Ｈｅｒｔｚｏｇ、Ｋ． Ａ． Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ａ． Ｇ． Ｂｏｗｉｅ、Ｅ． Ｃ． Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｔｈｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ＤＮＡ Ｓｅｎｓｏｒ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４、５９７－６０８ （２０１６）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｒ １５ （１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１６．０２．００４）．
１６．Ｃ． Ｗａｎｇ、Ｙ． Ｇｕａｎ、Ｍ． Ｌｖ、Ｒ． Ｚｈａｎｇ、Ｚ． Ｇｕｏ、Ｘ． Ｗｅｉ、Ｘ． Ｄｕ、Ｊ． Ｙａｎｇ、Ｔ． Ｌｉ、Ｙ． Ｗａｎ、Ｘ． Ｓｕ、Ｘ． Ｈｕａｎｇ、Ｚ． Ｊｉａｎｇ、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４８、６７５－６８７ ｅ６７７ （２０１８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ １７ （１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１８．０３．０１７）．
１７．Ｚ． Ｊｉａｎｇ、Ｐ． Ｇｅｏｒｇｅｌ、Ｘ． Ｄｕ、Ｌ． Ｓｈａｍｅｌ、Ｓ． Ｓｏｖａｔｈ、Ｓ．Ｍｕｄｄ、Ｍ． Ｈｕｂｅｒ、Ｃ． Ｋａｌｉｓ、Ｓ． Ｋｅｃｋ、Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ、Ｍ． Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ、Ｂ． Ｂｅｕｔｌｅｒ、ＣＤ１４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙＤ８８－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＬＰＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６、５６５－５７０ （２００５）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｎ （１０．１０３８／ｎｉ１２０７）．
１８．Ｙ． Ｘｉａ、Ｙ． Ｘｉｅ、Ｚ． Ｙｕ、Ｈ． Ｘｉａｏ、Ｇ． Ｊｉａｎｇ、Ｘ． Ｚｈｏｕ、Ｙ． Ｙａｎｇ、Ｘ． Ｌｉ、Ｍ． Ｚｈａｏ、Ｌ． Ｌｉ、Ｍ． Ｚｈｅｎｇ、Ｓ． Ｈａｎ、Ｚ． Ｚｏｎｇ、Ｘ．Ｍｅｎｇ、Ｈ． Ｄｅｎｇ、Ｈ． Ｙｅ、Ｙ． Ｆａ、Ｈ． Ｗｕ、Ｅ． Ｏｌｄｆｉｅｌｄ、Ｘ． Ｈｕ、Ｗ． Ｌｉｕ、Ｙ． Ｓｈｉ、Ｙ． Ｚｈａｎｇ、Ｔｈｅ Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｓ ａ Ｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｃｅｌｌ １７５、１０５９－１０７３ ｅ１０２１ （２０１８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＮｏｖ １ （１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０８．０７０）．
１９．Ｅ． Ｏｌｅｓｚｙｃｋａ、Ｈ． Ｂ．Ｍｏｒａｎ、Ｇ． Ａ． Ｔｙｎａｎ、Ｃ． Ｈ． Ｈｅａｒｎｄｅｎ、Ｇ． Ｃｏｕｔｔｓ、Ｍ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｓ．Ｍ． Ａｌｌａｎ、Ｃ． Ｊ． Ｓｃｏｔｔ、Ｅ． Ｃ． Ｌａｖｅｌｌｅ、ＩＬ－１ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＬ－１ｂｅｔａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｌｕｍ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． ＦＥＢＳ Ｊ ２８３、９－２４ （２０１６）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ （１０．１１１１／ｆｅｂｓ．１３５４６）．
２０．Ｓ． Ｃ． Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、Ｏ． Ｒ． Ｃｏｌｅｇｉｏ、Ｗ． Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｆ． Ｓ． Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａ、Ｒ． Ａ． Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５３、１１２２－１１２６ （２００８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｎ １９ （１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６９３９）．
２１．Ｍ． Ｋｏｏｌ、Ｖ． Ｐｅｔｒｉｌｌｉ、Ｔ． Ｄｅ Ｓｍｅｄｔ、Ａ． Ｒｏｌａｚ、Ｈ． Ｈａｍｍａｄ、Ｍ． ｖａｎ Ｎｉｍｗｅｇｅｎ、Ｉ．Ｍ． Ｂｅｒｇｅｎ、Ｒ． Ｃａｓｔｉｌｌｏ、Ｂ． Ｎ． Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ、Ｊ． Ｔｓｃｈｏｐｐ、Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ： Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＬＰ３ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８１、３７５５－３７５９ （２００８）１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８１．６．３７５５）．
２２．Ｈ． Ｌｉ、Ｓ． Ｂ． Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ． Ｐ． Ｙ． Ｔｉｎｇ、Ｆ． Ｒｅ、Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ： Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｌｕｍ ａｎｄ Ａｌｕｍ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ａｒｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＮＬＲＰ３． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８１、１７－２１ （２００８）１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８１．１．１７）．
１、Ｓ． Ａｋｉｒａ、Ｋ． Ｔａｋｅｄａ、Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４、４９９－５１１ （２００４）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ （１０．１０３８／ｎｒｉ１３９１）．
２．Ａ．Ｍ． Ｂｒｕｎｓ、Ｃ．Ｍ． Ｈｏｒｖａｔｈ、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４７、１９４－２０６ （２０１２）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｒ－Ａｐｒ （１０．３１０９／１０４０９２３８．２０１１．６３０９７４）．
３．Ｚ．Ｍａ、Ｂ． Ｄａｍａｎｉａ、Ｔｈｅ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ｍｉｃｒｏｂｅ １９、１５０－１５８ （２０１６）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＦｅｂ １０ （１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１６．０１．０１０）．
４．Ｋ． Ｓｃｈｒｏｄｅｒ、Ｊ． Ｔｓｃｈｏｐｐ、Ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ． Ｃｅｌｌ １４０、８２１－８３２ （２０１０）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｒ １９ （１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０４０）．
５．Ｌ． Ｂ． Ｉｖａｓｈｋｉｖ、Ｌ． Ｔ． Ｄｏｎｌｉｎ、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４、３６－４９ （２０１４）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ （１０．１０３８／ｎｒｉ３５８１）．
６．Ｗ．Ｍ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｍ． Ｄ． Ｃｈｅｖｉｌｌｏｔｔｅ、Ｃ．Ｍ． Ｒｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ： ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｅｂ ｏｆ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２、５１３－５４５ （２０１４）１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｉｍｍｕｎｏｌ－０３２７１３－１２０２３１）．
７．Ｍ． Ｐ． Ｌｏｎｇｈｉ、Ｃ． Ｔｒｕｍｐｆｈｅｌｌｅｒ、Ｊ． Ｉｄｏｙａｇａ、Ｍ． Ｃａｓｋｅｙ、Ｉ．Ｍａｔｏｓ、Ｃ． Ｋｌｕｇｅｒ、Ａ．Ｍ． Ｓａｌａｚａｒ、Ｍ． Ｃｏｌｏｎｎａ、Ｒ．Ｍ． Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ＣＤ４＋ Ｔｈ１ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ ＩＣ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０６、１５８９－１６０２ （２００９）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ ６ （１０．１０８４／ｊｅｍ．２００９０２４７）．
８．Ｓ． Ｚ． Ｂｅｎ－Ｓａｓｓｏｎ、Ｊ． Ｈｕ－Ｌｉ、Ｊ． Ｑｕｉｅｌ、Ｓ． Ｃａｕｃｈｅｔａｕｘ、Ｍ． Ｒａｔｎｅｒ、Ｉ． Ｓｈａｐｉｒａ、Ｃ． Ａ． Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、Ｗ． Ｅ． Ｐａｕｌ、ＩＬ－１ ａｃｔｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｏｎ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｒｉｖｅｎ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０６、７１１９－７１２４ （２００９）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ ２８ （１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０２７４５１０６）．
９．Ｎ． Ｓ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｐ． Ｄｕｅｗｅｌｌ、Ｂ． Ｙａｎｇ、Ｙ． Ｌｉ、Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ、Ｓ． Ｋｏｅｒｎｉｇ、Ｅ． Ｌａｔｚ、Ｅ．Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ、Ａ． Ｂ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｍ． Ｓｃｈｎｕｒｒ、Ａ． Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＬ－１８ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ ａｄｊｕｖａｎｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９２、３２５９－３２６８ （２０１４）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ １ （１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０２０１１）．
１０．Ｐ．Ｍａｒｒａｃｋ、Ａ． Ｓ．ＭｃＫｅｅ、Ｍ． Ｗ．Ｍｕｎｋｓ、Ｔｏｗａｒｄｓ ａｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９、２８７－２９３ （２００９）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ （１０．１０３８／ｎｒｉ２５１０）．
１１．Ｈ． Ｎｏｈｙｎｅｋ、Ｊ． Ｊｏｋｉｎｅｎ、Ｍ． Ｐａｒｔｉｎｅｎ、Ｏ． Ｖａａｒａｌａ、Ｔ． Ｋｉｒｊａｖａｉｎｅｎ、Ｊ． Ｓｕｎｄｍａｎ、Ｓ． Ｌ． Ｈｉｍａｎｅｎ、Ｃ． Ｈｕｂｌｉｎ、Ｉ． Ｊｕｌｋｕｎｅｎ、Ｐ． Ｏｌｓｅｎ、Ｏ． Ｓａａｒｅｎｐａａ－Ｈｅｉｋｋｉｌａ、Ｔ． Ｋｉｌｐｉ、ＡＳ０３ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ＡＨ１Ｎ１ ｖａｃｃｉｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ａｂｒｕｐｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｎａｒｃｏｌｅｐｓｙ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７、ｅ３３５３６ （２０１２）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３５３６）．
１２．Ｃ． Ｋ． Ｔａｎｇ、Ｔ． Ａｏｓｈｉ、Ｎ． Ｊｏｕｎａｉ、Ｊ． Ｉｔｏ、Ｋ． Ｏｈａｔａ、Ｋ． Ｋｏｂｉｙａｍａ、Ｂ． Ｈ． Ｄｅｓｓａｉｌｌｙ、Ｅ． Ｋｕｒｏｄａ、Ｓ． Ａｋｉｒａ、Ｋ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、Ｃ． Ｃｏｂａｎ、Ｋ． Ｊ． Ｉｓｈｉｉ、Ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ ＤＭＸＡＡ ａｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ＩＲＦ３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｙｐｅ－２ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８、ｅ６００３８ （２０１３）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６００３８）．
１３．Ｓ．Ｍ． Ｂｌａａｕｂｏｅｒ、Ｖ． Ｄ． Ｇａｂｒｉｅｌｌｅ、Ｌ． Ｊｉｎ、ＭＰＹＳ／ＳＴＩＮＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ、ｎｏｔ ｔｙｐｅ Ｉ ＩＦＮ、ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ （３’－５’）－ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９２、４９２－５０２ （２０１４）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ ０１ （１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０１８１２）．
１４．Ｘ． Ｄ． Ｌｉ、Ｊ． Ｗｕ、Ｄ． Ｇａｏ、Ｈ． Ｗａｎｇ、Ｌ． Ｓｕｎ、Ｚ． Ｊ． Ｃｈｅｎ、Ｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃＧＡＳ－ｃＧＡＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１、１３９０－１３９４ （２０１３）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＳｅｐ ２０ （１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４４０４０）．
１５．Ｅ． Ｃ． Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｌ． Ｊｉｎ、Ａ．Ｍｏｒｉ、Ｎ．Ｍｕｎｏｚ－Ｗｏｌｆ、Ｅ． Ｏｌｅｓｚｙｃｋａ、Ｈ． Ｂ．Ｍｏｒａｎ、Ｓ．Ｍａｎｓｏｕｒｉ、Ｃ． Ｐ．ＭｃＥｎｔｅｅ、Ｅ． Ｌａｍｂｅ、Ｅ．Ｍ． Ａｇｇｅｒ、Ｐ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｃ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｐ． Ｈｅｒｔｚｏｇ、Ｋ． Ａ． Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ａ． Ｇ． Ｂｏｗｉｅ、Ｅ． Ｃ． Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｔｈｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ＤＮＡ Ｓｅｎｓｏｒ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４、５９７－６０８ （２０１６）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｒ １５ （１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１６．０２．００４）．
１６．Ｃ． Ｗａｎｇ、Ｙ． Ｇｕａｎ、Ｍ． Ｌｖ、Ｒ． Ｚｈａｎｇ、Ｚ． Ｇｕｏ、Ｘ． Ｗｅｉ、Ｘ． Ｄｕ、Ｊ． Ｙａｎｇ、Ｔ． Ｌｉ、Ｙ． Ｗａｎ、Ｘ． Ｓｕ、Ｘ． Ｈｕａｎｇ、Ｚ． Ｊｉａｎｇ、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４８、６７５－６８７ ｅ６７７ （２０１８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ １７ （１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１８．０３．０１７）．
１７．Ｚ． Ｊｉａｎｇ、Ｐ． Ｇｅｏｒｇｅｌ、Ｘ． Ｄｕ、Ｌ． Ｓｈａｍｅｌ、Ｓ． Ｓｏｖａｔｈ、Ｓ．Ｍｕｄｄ、Ｍ． Ｈｕｂｅｒ、Ｃ． Ｋａｌｉｓ、Ｓ． Ｋｅｃｋ、Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ、Ｍ． Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ、Ｂ． Ｂｅｕｔｌｅｒ、ＣＤ１４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙＤ８８－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＬＰＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６、５６５－５７０ （２００５）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｎ （１０．１０３８／ｎｉ１２０７）．
１８．Ｙ． Ｘｉａ、Ｙ． Ｘｉｅ、Ｚ． Ｙｕ、Ｈ． Ｘｉａｏ、Ｇ． Ｊｉａｎｇ、Ｘ． Ｚｈｏｕ、Ｙ． Ｙａｎｇ、Ｘ． Ｌｉ、Ｍ． Ｚｈａｏ、Ｌ． Ｌｉ、Ｍ． Ｚｈｅｎｇ、Ｓ． Ｈａｎ、Ｚ． Ｚｏｎｇ、Ｘ．Ｍｅｎｇ、Ｈ． Ｄｅｎｇ、Ｈ． Ｙｅ、Ｙ． Ｆａ、Ｈ． Ｗｕ、Ｅ． Ｏｌｄｆｉｅｌｄ、Ｘ． Ｈｕ、Ｗ． Ｌｉｕ、Ｙ． Ｓｈｉ、Ｙ． Ｚｈａｎｇ、Ｔｈｅ Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｓ ａ Ｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｃｅｌｌ １７５、１０５９－１０７３ ｅ１０２１ （２０１８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＮｏｖ １ （１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０８．０７０）．
１９．Ｅ． Ｏｌｅｓｚｙｃｋａ、Ｈ． Ｂ．Ｍｏｒａｎ、Ｇ． Ａ． Ｔｙｎａｎ、Ｃ． Ｈ． Ｈｅａｒｎｄｅｎ、Ｇ． Ｃｏｕｔｔｓ、Ｍ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｓ．Ｍ． Ａｌｌａｎ、Ｃ． Ｊ． Ｓｃｏｔｔ、Ｅ． Ｃ． Ｌａｖｅｌｌｅ、ＩＬ－１ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＬ－１ｂｅｔａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｌｕｍ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． ＦＥＢＳ Ｊ ２８３、９－２４ （２０１６）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ （１０．１１１１／ｆｅｂｓ．１３５４６）．
２０．Ｓ． Ｃ． Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、Ｏ． Ｒ． Ｃｏｌｅｇｉｏ、Ｗ． Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｆ． Ｓ． Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａ、Ｒ． Ａ． Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５３、１１２２－１１２６ （２００８）； ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｎ １９ （１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６９３９）．
２１．Ｍ． Ｋｏｏｌ、Ｖ． Ｐｅｔｒｉｌｌｉ、Ｔ． Ｄｅ Ｓｍｅｄｔ、Ａ． Ｒｏｌａｚ、Ｈ． Ｈａｍｍａｄ、Ｍ． ｖａｎ Ｎｉｍｗｅｇｅｎ、Ｉ．Ｍ． Ｂｅｒｇｅｎ、Ｒ． Ｃａｓｔｉｌｌｏ、Ｂ． Ｎ． Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ、Ｊ． Ｔｓｃｈｏｐｐ、Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ： Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＬＰ３ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８１、３７５５－３７５９ （２００８）１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８１．６．３７５５）．
２２．Ｈ． Ｌｉ、Ｓ． Ｂ． Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ． Ｐ． Ｙ． Ｔｉｎｇ、Ｆ． Ｒｅ、Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ： Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｌｕｍ ａｎｄ Ａｌｕｍ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ａｒｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＮＬＲＰ３． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８１、１７－２１ （２００８）１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１８１．１．１７）．
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【手続補正書】
【提出日】2021-11-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン、及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む免疫増強用組成物。
【請求項2】
請求項１に記載の免疫増強用組成物を含む、免疫アジュバント。
【請求項3】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる請求項１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項4】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項１又は３に記載の免疫増強用組成物。
【請求項5】
Ａ）ワクチン免疫原と、Ｂ）請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢが同一及び／又は別々の容器に収容されることができる、ワクチン組成物。
【請求項6】
前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、請求項５又は６に記載のワクチン組成物。
【請求項8】
前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、請求項５～７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
１）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物の製造方法。
【請求項10】
請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物であって、前記免疫増強は、例えば、
Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、
Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加すること、
Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、
Ｄ）抗体の産生を促進する、
Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又は
Ｆ）樹状細胞の成熟を促進することである、免疫増強用組成物。
【請求項11】
前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌による細菌感染、真菌による真菌感染、ウイルスによるウイルス感染、寄生虫による寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される、請求項１、３、４及び１０のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物。
【請求項12】
前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項１１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項13】
前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項１１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項14】
前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、請求項１１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項15】
前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、請求項１１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項16】
前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、請求項１１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項17】
さらに、別の予防／治療剤を含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0042】
実験（ｅ）：コロイド状マンガンＭｎ２ＯＨＰＯ４とＰＤ－１抗体との併用による結腸がん腫瘍の効果
マウスに結腸がんＭＣ３８を皮下接種し、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ、２００μｇ／マウス）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド／対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ＋Ｍｎ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／マウス）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）であり、ＰＤ－１の使用は実験（ｄ）と同様にした。腫瘍接種の２０日後、マウスを犠牲にし、解剖し、腫瘍を取り出して測定し、図１７Ｂに示すように、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、３１９．８ｍｍ３であり、マンガンを単独して使用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、１２６．９ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体薬を単独して使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、１４３．１ｍｍ３であり、併用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、６６．７４ｍｍ３である。腫瘍組織切片を作成し、ＤＡＰＩ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫蛍光染色を行うと、図１７Ｄに示すように、ＰＤ１抗体とコロイド状マンガンの併用により治療されたマウスの腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加することを確認した。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに結腸がんを相乗的に治療できることを示した。
本発明には、次の態様が含まれる。
１． 新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン、及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む免疫増強用組成物。
２． 免疫アジュバントとして使用される項１に記載の免疫増強用組成物。
３． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる項１又は２に記載の免疫増強用組成物。
４． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１～３のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物。
５． Ａ）ワクチン免疫原と、
Ｂ）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢが同一及び／又は別々の容器に収容されることができる、ワクチン組成物。
６． 前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する、項５に記載のワクチン組成物。
７． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項５又は６に記載のワクチン組成物。
８． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項５～７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
９． １）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、
２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む免疫増強用組成物の製造方法。
１０． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項９に記載の方法。
１１． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項９又は１０に記載の方法。
１２． １）ワクチン免疫原を与えることと、
２）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、を含むワクチン組成物の製造方法。
１３． 前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項１２に記載の方法。
１４． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項１２又は１３に記載の方法。
１５． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６． 免疫増強用組成物又はワクチン組成物の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途。
１７． 前記免疫増強用組成物は、免疫アジュバントである、項１６に記載の用途。
１８． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項１６又は１７に記載の用途。
１９． 前記新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１６～１８のいずれか１項に記載の用途。
２０． 前記免疫増強は、自然免疫及び／又は適応免疫を改善することである、項１６～１９のいずれか１項に記載の用途。
２１． 前記免疫増強は、Ｉ型インターフェロンの発現を増加させることである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２２． 前記免疫増強は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生することである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２３． 前記免疫増強は、抗体の産生を促進することである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２４． それを必要とする対象に項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物又は項９～１１のいずれか１項に記載の方法で得られる免疫増強用組成物を投与することを含む免疫増強用方法において、
具体的には、前記免疫増強は、例えば、
Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、
Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加すること、
Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、
Ｄ）抗体の産生を促進する、
Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又は
Ｆ）樹状細胞の成熟を促進することである方法。
２５． 前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４に記載の方法。
２６． 前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される、項２４又は２５に記載の方法。
２７． 前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
２８． 前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
２９． 前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３０． 前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３１． 前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３２． さらに、前記対象に別の予防／治療剤を投与することを含む、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３３． それを必要とする対象に項５～８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を投与し、ここで、成分Ａ及び成分Ｂが異なる容器にある場合には同時又は異なる時点で投与すること、及び／又は、
それを必要とする対象に項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物、及び任意に選択してもよいワクチン免疫原を投与することを含む、免疫接種方法。
３４． 前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３に記載の方法。
３５． 前記免疫接種は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を予防するために使用される、項３３又は３４に記載の方法。
３６． 前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７． 前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３８． 前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３９． 前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
４０． 前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
４１． さらに、前記対象に別の予防剤を投与することを含む、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
マウスに結腸がんＭＣ３８を皮下接種し、ランダムに４つの群に分けられ、それぞれ、対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ、２００μｇ／マウス）、Ｍｎ２ＯＨＰＯ４コロイド／対照抗体群（Ｉｓｏｔｙｐｅ＋Ｍｎ）、ａｎｔｉ－ＰＤ１抗体群（２００μｇ／マウス）、及び併用投与群（ａｎｔｉ－ＰＤ１＋Ｍｎ）であり、ＰＤ－１の使用は実験（ｄ）と同様にした。腫瘍接種の２０日後、マウスを犠牲にし、解剖し、腫瘍を取り出して測定し、図１７Ｂに示すように、対照群のマウスの平均腫瘍サイズは、３１９．８ｍｍ３であり、マンガンを単独して使用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、１２６．９ｍｍ３であり、ＰＤ１抗体薬を単独して使用して治療されたマウスの腫瘍サイズは、１４３．１ｍｍ３であり、併用して治療されたマウスの平均腫瘍サイズは、６６．７４ｍｍ３である。腫瘍組織切片を作成し、ＤＡＰＩ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫蛍光染色を行うと、図１７Ｄに示すように、ＰＤ１抗体とコロイド状マンガンの併用により治療されたマウスの腫瘍に浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が有意に増加することを確認した。これは、コロイド状マンガンがＰＤ１抗体薬とともに結腸がんを相乗的に治療できることを示した。
本発明には、次の態様が含まれる。
１． 新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン、及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を含む免疫増強用組成物。
２． 免疫アジュバントとして使用される項１に記載の免疫増強用組成物。
３． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる項１又は２に記載の免疫増強用組成物。
４． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１～３のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物。
５． Ａ）ワクチン免疫原と、
Ｂ）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源と、を含むワクチン組成物において、
任意選択で、成分Ａ及びＢが同一及び／又は別々の容器に収容されることができる、ワクチン組成物。
６． 前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせに由来する、項５に記載のワクチン組成物。
７． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項５又は６に記載のワクチン組成物。
８． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項５～７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
９． １）新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、
２）任意選択で、新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンに変換させることと、を含む免疫増強用組成物の製造方法。
１０． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項９に記載の方法。
１１． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項９又は１０に記載の方法。
１２． １）ワクチン免疫原を与えることと、
２）新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源を与えることと、を含むワクチン組成物の製造方法。
１３． 前記ワクチン免疫原は、ウイルス、細菌及び／又は寄生虫に由来し、
例えば、前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ及びＨＢＶから選ばれ；
例えば、前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）から選ばれ；
具体的には、例えば、前記ワクチン免疫原は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項１２に記載の方法。
１４． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項１２又は１３に記載の方法。
１５． 前記の新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間は、１日以下であるか、又は２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６． 免疫増強用組成物又はワクチン組成物の調製における、新たに生成した沈殿物マンガン、コロイド状マンガン及び／又は新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンを形成可能な供給源の用途。
１７． 前記免疫増強用組成物は、免疫アジュバントである、項１６に記載の用途。
１８． 前記の新たに生成した沈殿物マンガン及び／又はコロイド状マンガンは、リン酸マンガン、炭酸マンガン、水酸化マンガン、及びそれらの任意の混合物から選ばれる、項１６又は１７に記載の用途。
１９． 前記新たに生成した沈殿物マンガンが非沈殿形態から沈殿形態に変化するまでの時間１日以下であるか、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下であるか、又は６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分間以下である、項１６～１８のいずれか１項に記載の用途。
２０． 前記免疫増強は、自然免疫及び／又は適応免疫を改善することである、項１６～１９のいずれか１項に記載の用途。
２１． 前記免疫増強は、Ｉ型インターフェロンの発現を増加させることである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２２． 前記免疫増強は、炎症性因子の切断を誘導して活性型を産生することである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２３． 前記免疫増強は、抗体の産生を促進することである、項１６～２０のいずれか１項に記載の用途。
２４． それを必要とする対象に項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物又は項９～１１のいずれか１項に記載の方法で得られる免疫増強用組成物を投与することを含む免疫増強用方法において、
具体的には、前記免疫増強は、例えば、
Ａ）自然免疫及び／又は適応免疫を改善すること、
Ｂ）Ｉ型インターフェロンの発現を増加すること、
Ｃ）活性型の炎症性サイトカインの産生を誘導すること、
Ｄ）抗体の産生を促進する、
Ｅ）Ｔ細胞の増殖を促進すること、及び／又は
Ｆ）樹状細胞の成熟を促進することである方法。
２５． 前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４に記載の方法。
２６． 前記免疫増強は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、自己免疫疾患を予防及び／又は治療するために使用される、項２４又は２５に記載の方法。
２７． 前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
２８． 前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
２９． 前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３０． 前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３１． 前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３２． さらに、前記対象に別の予防／治療剤を投与することを含む、項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
３３． それを必要とする対象に項５～８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を投与し、ここで、成分Ａ及び成分Ｂが異なる容器にある場合には同時又は異なる時点で投与すること、及び／又は、
それを必要とする対象に項１～４のいずれか１項に記載の免疫増強用組成物、及び任意に選択してもよいワクチン免疫原を投与することを含む、免疫接種方法。
３４． 前記投与は、筋肉注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、粘膜投与及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３に記載の方法。
３５． 前記免疫接種は、疾患、例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、腫瘍、及び自己免疫疾患を予防するために使用される、項３３又は３４に記載の方法。
３６． 前記ウイルスは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選ばれ、好ましくは、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、パピローマウイルス科、ポックスウイルス科、及びレトロウイルス科から選ばれ、具体的には、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＰＶウイルス、脳炎ウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス）、ムンプスウイルス、風疹ウイルス及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７． 前記細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌から選ばれ、好ましくは、前記細菌は、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ）、破傷風菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ハンセン病菌、結核菌、髄膜炎菌、肺炎球菌及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３８． 前記自身免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
３９． 前記腫瘍は、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、膀胱がん、腎臓がん、結腸がん、胎盤内絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん、子宮がん、及び白血病から選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
４０． 前記寄生虫は、細胞内寄生虫であり、好ましくは、マラリア原虫、トキソプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、フィラリア、及びリーシュマニアから選ばれる、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
４１． さらに、前記対象に別の予防剤を投与することを含む、項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】