▶ エンジーケム ライフサイエンシーズ コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-17
(54)【発明の名称】糖尿病を処置するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/23 20060101AFI20220610BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220610BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220610BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220610BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220610BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220610BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/231 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/232 20060101ALI20220610BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220610BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/48 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/403 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/351 20060101ALI20220610BHJP
A61K 31/64 20060101ALI20220610BHJP
C07D 519/02 20060101ALN20220610BHJP
C07D 401/04 20060101ALN20220610BHJP
C07D 473/08 20060101ALN20220610BHJP
C07D 209/94 20060101ALN20220610BHJP
C07D 487/04 20060101ALN20220610BHJP
C07D 309/30 20060101ALN20220610BHJP
C07D 309/10 20060101ALN20220610BHJP
A23L 33/115 20160101ALN20220610BHJP
C07D 223/06 20060101ALN20220610BHJP
【ＦＩ】
A61K31/23
A61P3/10
A61P3/06
A61P3/04
A61P13/12
A61P9/12
A61P9/10 101
A61K31/231
A61K31/232
A61P43/00 121
A61K38/28
A61K31/48
A61K31/506
A61K31/522
A61K31/403
A61K31/4985
A61K31/366
A61K31/351
A61K31/64
C07D519/02
C07D401/04
C07D473/08
C07D209/94
C07D487/04 145
C07D309/30 R
C07D309/10
A23L33/115
C07D223/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021541605
(86)(22)【出願日】2020-04-16
(85)【翻訳文提出日】2021-09-10
(86)【国際出願番号】 IB2020053627
(87)【国際公開番号】W WO2020212915
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】10-2019-0044514
(32)【優先日】2019-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】62/908,382
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516343099
【氏名又は名称】エンジーケム ライフサイエンシーズ コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＹＣＨＥＭ ＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】ソン，キ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジェ ファ
(72)【発明者】
【氏名】ユン，ソン ヨン
【テーマコード（参考）】
4B018
4C050
4C063
4C072
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB10
4B018MD10
4B018ME03
4C050AA01
4C050BB06
4C050CC08
4C050EE04
4C050FF02
4C050GG01
4C050HH01
4C063AA01
4C063BB02
4C063CC29
4C063DD10
4C063EE01
4C072PP00
4C072UU01
4C084AA02
4C084DB34
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZC35
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA09
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA42
4C086ZA45
4C086ZA70
4C086ZA81
4C086ZC33
4C086ZC35
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206DB48
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA11
4C206MA13
4C206MA14
4C206MA17
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA42
4C206ZA45
4C206ZA70
4C206ZA81
4C206ZC33
4C206ZC35
4C206ZC75
(57)【要約】
糖尿病を処置するための方法および組成物が開示される。該組成物は、糖尿病を処置するための有効成分として式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む。
【化１】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、１４～２２個の炭素分子の脂肪酸残基である。］
【選択図】図１Ａ
【化１】
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象に、有効量の式１の化合物：【化1】
【請求項2】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
式１の化合物が以下の式２の化合物：【化2】
【請求項4】
対象に有効量の式１の化合物：【化3】
【請求項5】
Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
式１の化合物が以下の式２の化合物：【化4】
【請求項7】
対象が、２型糖尿病、糖尿病性脂質異常症、耐糖能異常または耐糖能不適合（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、代謝性アシドーシス、ケトーシス、肥満、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症および腎疾患、高脂血症、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性、高血糖、高コレステロール血症、脂質異常症、またはＸ症候群に罹患していることが特定され；および式１の化合物が、前記特定された対象に投与される、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
対象がヒトである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
（ａ）式１の化合物：【化5】
（ｂ）対象における糖尿病を処置または予防するために前記化合物を使用するための説明書を含む、キット。
【請求項10】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
（ａ）１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチルグリセロール（ＰＬＡＧ）；（ｂ）糖尿病を処置または予防するためにＰＬＡＧを使用するための説明書
を含む、キット。
【請求項12】
治療有効量のＰＬＡＧを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
ＰＬＡＧの使用のための書面による説明書を含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項14】
説明書が製品ラベルである、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項15】
（ａ）対象に、有効量の式１の１つまたは複数の化合物：【化6】
（ｂ）対象に、前記式１の１つまたは複数の化合物とは異なる、有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること
を含む、糖尿病に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するための方法。
【請求項16】
（ａ）対象に、有効量の式１の化合物：【化7】
（ｂ）対象に、前記式１の１つまたは複数の化合物とは異なる、有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること、
を含む、２型糖尿病、糖尿病性脂質異常症、耐糖能異常または耐糖能不適合（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、代謝性アシドーシス、ケトーシス、肥満、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症および腎疾患、高脂血症、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性、高血糖、高コレステロール血症、脂質異常症、またはＸ症候群、に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置する方法。
【請求項17】
前記式１の１つまたは複数の化合物が、前記式１の１つまたは複数の化合物とは異なる前記１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬と組み合わせて投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
式１の化合物が以下の式２の化合物：【化8】
【請求項20】
対象がヒトである、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬が、１つまたは複数のインスリン（例えば、フムリン、ノボリン、ノボログ、フレックスペン、フィアスプ、アピドラ、ヒューマログ、フムリンＮ、ノボリンＮ、トレシーバ、レベミル、ランタス、トウジェオ、ノボログミックス７０／３０、ヒューマログミックス７５／２５、ヒューマログミックス５０／５０、フムリン７０／３０、ノボリン７０／３０、ライゾデグなど）、アミリン模倣薬またはプラムリンチド（例えば、シムリンペン１２０およびシムリンペン６０）、α－グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、およびミグリトール（グリセット））、ビグアニド（例えば、メトホルミン－アログリプチン（カザノ）、メトホルミン－カナグリフロジン（インボカメット）、メトホルミン－ダパグリフロジン（シグデュオＸＲ）、メトホルミン－エンパグリフロジン（シンジャルディ）、メトホルミン－グリピジド、メトホルミン－グリブリド（グルコバンス）、メトホルミン－リナグリプチン（ジェンタドゥエート）、メトホルミン－ピオグリタゾン（アクトプラス）、メトホルミン－レパグリニド（プランディメット）、メトホルミン－ロシグリタゾン（アバンダメット）、メトホルミン－サキサグリプチン（コンビグリーゼＸＲ）、およびメトホルミン－シタグリプチン（ジャヌメット））、ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン（サイクロゼット））、ジペプチジルペップチダーゼ４（ＤＰＰ－４）阻害薬（例えば、アログリプチン（ネシナ）、アログリプチン－メトホルミン（カザノ）、アログリプチン－ピオグリタゾン（オセニ）、リナグリプチン（トラゼンタ）、リナグリプチン－エンパグリフロジン（グリクサンビ）、リナグリプチン－メトホルミン（ジェンタドゥエート）、サキサグリプチン（オングリザ）、サキサグリプチン－メトホルミン（コンビグリーゼＸＲ）、シタグリプチン（ジャヌビア）、シタグリプチン－メトホルミン（ジャヌメットおよびジャヌメットＸＲ）、シタグリプチンおよびシンバスタチン（ジュビシンク））、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト（例えば、アルビグルチド（タンゼアム）、デュラグルチド（トゥルリシティ）、エキセナチド（バイエッタ）、持続放出型エキセナチド（バイデュレオン）、リラグルチド（ビクトザ）、およびセマグルチド（オゼンピック））、メグリチニド（例えば、ナテグリニド（スターリクス）、レパグリニド（プランジン）、およびレパグリニド－メトホルミン（プランディメット））、ナトリウム－グルコース輸送体（ＳＧＬＴ）２阻害薬（例えば、ダパグリフロジン（ファシーガ（Ｆａｒｘｉｇａ））、ダパグリフロジン－メトホルミン（シグデュオＸＲ）、カナグリフロジン（インボカナ）、カナグリフロジン－メトホルミン（インボカメット）、エンパグリフロジン（ジャルディアンス）、エンパグリフロジン－リナグリプチン（グリクサンビ）、エンパグリフロジン－メトホルミン（シンジャルディ）、およびエルツグリフロジン（ステグラトロ））、スルホニル尿素（例えば、グリメピリド（アマリル）、グリメピリド－ピオグリタゾン（デュエタクト）、グリメピリド－ロシグリタゾン（アバンダリル）、グリクラジド、グリピジド（グルコトロール）、グリピジド－メトホルミン（メタグリップ）、グリブリド（ダイアベータ、グリナース、ミクロナース）、グリブリド－メトホルミン（グルコバンス）、クロルプロパミド（ダイアビネース）、トラザミド（トリネース）、およびトルブタミド（オリネース、トルタブ））、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（アバンディア）、ロシグリタゾン－グリメピリド（アバンダリル）、ロシグリタゾン－メトホルミン（アマリルＭ）、ピオグリタゾン（アクトス）、ピオグリタゾン－アログリプチン（オセニ）、ピオグリタゾン－グリメピリド（デュエタクト）、およびピオグリタゾン－メトホルミン（アクトプラスメット、アクトプラスメットＸＲ）、アスピリンなど、ならびに先のいずれかの医薬上許容される塩または酸のうちの１つまたは複数である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
（ａ）１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロール（ＰＬＡＧ）；（ｂ）ＰＬＡＧとは異なる、１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬；および
（ｃ）糖尿病を処置または予防するために前記ＰＬＡＧを使用するための説明書、
を含む、キット。
【請求項23】
ｉ）糖尿病を処置するための式１の化合物【化9】
ｉｉ）１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬、
を含む、組成物。
【請求項24】
式１の化合物が、ＰＬＡＧである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
糖尿病が、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）またはＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）である、請求項２３または２４に記載のキットまたは組成物。
【請求項26】
前記１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬が、１つまたは複数のインスリン（例えば、フムリン、ノボリン、ノボログ、フレックスペン、フィアスプ、アピドラ、ヒューマログ、フムリンＮ、ノボリンＮ、トレシーバ、レベミル、ランタス、トウジェオ、ノボログミックス７０／３０、ヒューマログミックス７５／２５、ヒューマログミックス５０／５０、フムリン７０／３０、ノボリン７０／３０、ライゾデグなど）、アミリン模倣薬またはプラムリンチド（例えば、シムリンペン１２０およびシムリンペン６０）、α－グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、およびミグリトール（グリセット））、ビグアニド（例えば、メトホルミン－アログリプチン（カザノ）、メトホルミン－カナグリフロジン（インボカメット）、メトホルミン－ダパグリフロジン（シグデュオＸＲ）、メトホルミン－エンパグリフロジン（シンジャルディ）、メトホルミン－グリピジド、メトホルミン－グリブリド（グルコバンス）、メトホルミン－リナグリプチン（ジェンタドゥエート）、メトホルミン－ピオグリタゾン（アクトプラス）、メトホルミン－レパグリニド（プランディメット）、メトホルミン－ロシグリタゾン（アバンダメット）、メトホルミン－サキサグリプチン（コンビグリーゼＸＲ）、およびメトホルミン－シタグリプチン（ジャヌメット））、ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン（サイクロゼット））、ジペプチジルペップチダーゼ４（ＤＰＰ－４）阻害薬（例えば、アログリプチン（ネシナ）、アログリプチン－メトホルミン（カザノ）、アログリプチン－ピオグリタゾン（オセニ）、リナグリプチン（トラゼンタ）、リナグリプチン－エンパグリフロジン（グリクサンビ）、リナグリプチン－メトホルミン（ジェンタドゥエート）、サキサグリプチン（オングリザ）、サキサグリプチン－メトホルミン（コンビグリーゼＸＲ）、シタグリプチン（ジャヌビア）、シタグリプチン－メトホルミン（ジャヌメットおよびジャヌメットＸＲ）、シタグリプチンおよびシンバスタチン（ジュビシンク））、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト（例えば、アルビグルチド（タンゼアム）、デュラグルチド（トゥルリシティ）、エキセナチド（バイエッタ）、持続放出型エキセナチド（バイデュレオン）、リラグルチド（ビクトザ）、およびセマグルチド（オゼンピック））、メグリチニド（例えば、ナテグリニド（スターリクス）、レパグリニド（プランジン）、およびレパグリニド－メトホルミン（プランディメット））、ナトリウム－グルコース輸送体（ＳＧＬＴ）２阻害薬（例えば、ダパグリフロジン（ファシーガ（Ｆａｒｘｉｇａ））、ダパグリフロジン－メトホルミン（シグデュオＸＲ）、カナグリフロジン（インボカナ）、カナグリフロジン－メトホルミン（インボカメット）、エンパグリフロジン（ジャルディアンス）、エンパグリフロジン－リナグリプチン（グリクサンビ）、エンパグリフロジン－メトホルミン（シンジャルディ）、およびエルツグリフロジン（ステグラトロ））、スルホニル尿素（例えば、グリメピリド（アマリル）、グリメピリド－ピオグリタゾン（デュエタクト）、グリメピリド－ロシグリタゾン（アバンダリル）、グリクラジド、グリピジド（グルコトロール）、グリピジド－メトホルミン（メタグリップ）、グリブリド（ダイアベータ、グリナース、ミクロナース）、グリブリド－メトホルミン（グルコバンス）、クロルプロパミド（ダイアビネース）、トラザミド（トリネース）、およびトルブタミド（オリネース、トルタブ））、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（アバンディア）、ロシグリタゾン－グリメピリド（アバンダリル）、ロシグリタゾン－メトホルミン（アマリルＭ）、ピオグリタゾン（アクトス）、ピオグリタゾン－アログリプチン（オセニ）、ピオグリタゾン－グリメピリド（デュエタクト）、およびピオグリタゾン－メトホルミン（アクトプラスメット、アクトプラスメットＸＲ）、アスピリンなど、ならびに先のいずれかの医薬上許容される塩または酸のうちの１つまたは複数である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願公開第６２／９０８，３８２号明細書、および２０１９年４月１６日出願の韓国特許出願第１０－２０１９－００４４５１４号公報に対する優先権の利益を主張しており、これらの出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願公開第６２／９０８，３８２号明細書、および２０１９年４月１６日出願の韓国特許出願第１０－２０１９－００４４５１４号公報に対する優先権の利益を主張しており、これらの出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、糖尿病を処置するためのモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物、より詳細には、糖尿病を処置することができるおよび糖尿病の症状を軽減することができる経口投与用のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
真性糖尿病は、インスリン機能の不全によるグルコース、脂質および／またはアミノ酸の代謝の異常に起因する慢性疾患である。糖尿病は、ランゲルハンス島のβ細胞が破壊され、インスリン分泌が不可逆的に低減して高血糖になるＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病：ＩＤＤＭ）と、ランゲルハンス島において、グルコースに対するインスリン応答が低下するかまたはグルコースに対するインスリン抵抗性が上昇し、それにより慢性的な高血糖を結果としてもたらすＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病：ＮＩＤＤＭ）とに大きく分類される。
【0004】
グルコースは、身体の主要なエネルギー源のうちの１つであり、ほとんどの細胞によって使用され、細胞機能において重要な役割を担っている。グルコースが摂取されると、血糖値が上昇して膵ベータ細胞内でインスリンが分泌される。分泌されたインスリンに応答して、血糖が筋肉または脂肪組織へと吸収され、エネルギー源として使用される。しかしながら、血糖値の上昇は、膵ベータ細胞の機能および生存に対して有害な影響を及ぼす。高濃度のグルコースは、ベータ細胞の過剰刺激を誘導し、このことによって、インスリン合成速度がインスリン分泌速度よりも低くなる。結果として、ベータ細胞の最も重要な機能であるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）が適切に機能しない。加えて、高濃度グルコースは、酸化ストレス、小胞体ストレス、またはアポトーシスを誘導するだけでなく、細胞分化も抑制し、したがって、ベータ細胞の生存に負の影響を及ぼす。
【0005】
糖尿病のための新たな療法を有することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む、糖尿病を処置するための組成物および方法が提供される。好ましい方法および組成物では、過剰なグルコース取り込みに起因するベータ細胞の損傷は、膵ベータ細胞におけるグルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）のエンドサイトーシスを促進することによって軽減または緩和することができる。
【0007】
別の態様では、毒性がなく、かつ糖尿病の症状を軽減するモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む、糖尿病を処置するための組成物および方法である。
【0008】
より詳細には、糖尿病を処置するための式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物および方法が提供される。
【0009】
【化1】
【0010】
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基、好ましくは１５～２０個の炭素原子の脂肪酸残基である。
【0011】
一実施形態では、モノアセチルジアシルグリセロールは、以下の式２の化合物である。
【0012】
【化2】
【0013】
式２の化合物は、１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールであり、式１のＲ１およびＲ２がそれぞれパルミトイルおよびリノレオイルである式１の化合物に相当する。式２の化合物は、本開示では「ＰＬＡＧ」または「ＥＣ－１８」と称されることがある。
【0014】
本発明はまた、糖尿病を軽減または予防するための式１または式２のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む健康機能性食品組成物、および該組成物を糖尿病の疑いのある対象に投与することを含む、糖尿病を処置する方法も提供する。
【0015】
ある特定の好ましい態様では、本発明によるモノアセチルジアシルグリセロール化合物（すなわち、式１または式２の化合物）を含有する、糖尿病を処置するための組成物は、グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）のエンドサイトーシスを促進し、それにより、過剰なグルコース取り込みによる膵ベータ細胞損傷を減弱させる。
【0016】
考察したように、式１および式２の化合物は、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病をはじめとする糖尿病に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するために使用することができる。
【0017】
詳細な態様では、式１または２の化合物は、糖尿病前症患者を処置するために使用される。
【0018】
さらなる態様では、式１または２の化合物は、２型糖尿病、糖尿病性脂質異常症、耐糖能異常または耐糖能不適合（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、代謝性アシドーシス、ケトーシス、食欲調節、肥満、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症および腎疾患をはじめとする糖尿病と関係する合併症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症および食後高脂血症をはじめとする高脂血症、動脈硬化、ならびに高血圧、に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するために使用される。
【0019】
なおもさらなる態様では、式１または２の化合物は、インスリン抵抗性、高血糖、高脂血症、高コレステロール血症、脂質異常症、Ｘ症候群またはメタボリックシンドロームに罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するために使用される。
【0020】
詳細な態様では、本明細書に開示される疾患または障害の処置のために対象が特定および選定され、次いで、式１または２の化合物が該特定および選定された対象に投与される。例えば、患者を２型糖尿病に罹患していると特定および選定することができ、２型糖尿病に罹患していると特定された患者に式１または２の化合物を投与し、それにより、２型糖尿病を軽減または処置することができる。
【0021】
ある特定の態様では、本治療方法は、創傷または損傷組織に悩む対象の処置とは関係していない。この態様では、創傷もしくは損傷組織に悩む対象および／または創傷もしくは損傷組織のための処置を求めている対象は、本治療方法から除外される。関連する態様では、組織の修復または再生を包含する処置を求めている対象は、本治療方法から除外される。
【0022】
さらなる態様では、先に明らかにされた式１または２の化合物を含む医薬組成物が提供される。該組成物は、適切には、１つまたは複数の医薬上許容される担体を含むことができる。好ましい実施形態では、該組成物は、本明細書に開示される糖尿病または他の疾患もしくは障害の処置のために製剤されることができるか、またはさもなくば該処置に適合していることができる。好ましい態様では、該組成物は、錠剤またはカプセル剤として経口投与に適合していることができる。
【0023】
なおもさらなる態様では、本明細書に開示される糖尿病または他の疾患もしくは障害を処置または予防するために使用するためのキットが提供される。本発明のキットは、適切には、１）式１または式２の１つまたは複数の化合物と、２）本明細書に開示される糖尿病または他の疾患もしくは障害を処置または予防するために１つまたは複数の化合物を使用するための説明書とを含むことができる。好ましくは、キットは、治療有効量の式１または式２の１つまたは複数の化合物を含む。説明書は、適切には、製品ラベルをはじめとする、記載された形式であることができる。
【0024】
別の態様では、併用療法のための組成物が提供される。該組成物は、
ｉ）糖尿病を処置するための式１の化合物；
［式中、Ｒ１およびＲ２が独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］；および、
ｉｉ）１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬
を含む。
ｉ）糖尿病を処置するための式１の化合物；
【化3】
ｉｉ）１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬
を含む。
【0025】
さらなる態様では、糖尿病に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するための方法が提供される。該方法は、該対象に、有効量の式１の化合物を投与すること：
【化4】
【0026】
［式中、Ｒ１およびＲ２が独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］；および
該対象に有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること、を含む。
該対象に有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること、を含む。
【0027】
別の態様では、２型糖尿病、糖尿病性脂質異常症、耐糖能異常または耐糖能不適合（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、代謝性アシドーシス、ケトーシス、肥満、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症および腎疾患、高脂血症、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性、高血糖、高コレステロール血症、脂質異常症、またはＸ症候群、に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置する方法が提供される。
【0028】
該方法は、該対象に、有効量の式１の化合物：
［式中、Ｒ１およびＲ２が独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］を投与すること；および
該対象に、有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること、
を含む。
【化5】
該対象に、有効量の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬を投与すること、
を含む。
【0029】
ある特定の態様では、式１もしくは２の１つまたは複数の化合物またはＰＬＡＧは、該式１もしくは２の１つまたは複数の化合物またはＰＬＡＧとは異なる１つまたは複数の糖尿病処置薬と組み合わせてまたは協調して対象に投与することができる。
【0030】
別の態様では、（ａ）ＰＬＡＧ；（ｂ）１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬；および（ｃ）糖尿病を処置または予防するためにＰＬＡＧを使用するための説明書を含むキットが提供される。
【0031】
本発明の他の態様を以下に開示する。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有している。本特許または特許出願公開の、カラー図面付きの写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有している。本特許または特許出願公開の、カラー図面付きの写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【発明を実施するための形態】
【0042】
本発明の糖尿病を処置するための組成物は、式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含む。
【0043】
【化6】
【0044】
本発明では、「モノアセチルジアシルグリセロール化合物」という用語は、アセチル基と２個のアシル基とを含有するグリセロール誘導体を意味し、モノアセチルジアシルグリセロール（ＭＡＤＧ）とも称される。
【0045】
式１中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基であり、好ましくは１５～２０個の炭素原子の脂肪酸残基である。該脂肪酸残基は、－ＯＨ基がそのカルボキシル基から除外された脂肪酸における残存部分を意味する。式１中、Ｒ１およびＲ２の非限定的な例としては、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、アラキドノイルなどがある。Ｒ１およびＲ２の好ましい組み合わせとしては、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルなどがある。Ｒ１およびＲ２のより好ましい組み合わせは、パルミトイル／リノレオイルである。光学活性において、式１のモノアセチルジアシルグリセロール誘導体は、（Ｒ）－形態、（Ｓ）－形態またはラセミ混合物であることができ、好ましくはラセミ混合物であることができ、これらの立体異性体を含んでよい。
【0046】
一実施形態では、モノアセチルジアシルグリセロールは、以下の式２の化合物である。
【0047】
【化7】
【0048】
式２の化合物は、１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールであり、式１のＲ１およびＲ２がそれぞれパルミトイルおよびリノレオイルである式１の化合物に相当する。式２の化合物は、本開示では「ＰＬＡＧ」または「ＥＣ－１８」と称されることがある。
【0049】
モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、天然のシカの枝角から分離および抽出することができるか、または公知の有機合成法（韓国特許第１０－０７８９３２３号公報）によって製造することができる。より具体的には、シカの枝角をヘキサンで抽出した後、残渣をクロロホルムで抽出し、クロロホルムを除去してクロロホルム抽出物を得る。この抽出のための溶媒の量は、シカの枝角を浸漬するのにちょうど十分である。一般に、シカの枝角１ｋｇに対して約４～５リットルのヘキサンおよび／またはクロロホルムが使用されるが、これに限定されない。この方法によって取得された抽出物を、さらに、一連のシリカゲルカラムクロマトグラフおよびＴＬＣ法を用いて分画および精製して、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を取得する。抽出のための溶媒は、クロロホルム／メタノール、ヘキサン／酢酸エチル／酢酸から選択されるが、これらに限定されない。
【0050】
モノアセチルジアシルグリセロール化合物の調製のための化学合成方法は、韓国特許第１０－０７８９３２３号公報に示されている。具体的には、該方法は、（ａ）１－Ｒ１－グリセロールの３位に保護基を導入することによって、１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールを調製する工程、（ｂ）１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールの２位にＲ２を導入することによって、１－Ｒ１－２－Ｒ２－３－保護基－グリセロールを調製する工程、（ｃ）１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールの脱保護反応とアセチル化反応とを同時に行うことによって、所望のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を調製する工程を含む。モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、必要な場合、さらに精製してよい。あるいは、モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ホスファチジルコリンの酸分解（アセトリシス）によって調製することができるが、これに限定されない。式１の化合物の立体異性体も本発明の範囲内である。
【0051】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、糖尿病の処置および／または軽減に有効に用いることができる。「糖尿病」という用語は、インスリン機能の不全によるグルコース、脂質および／またはアミノ酸の代謝の異常に起因する慢性疾患である。糖尿病は、ランゲルハンス島のβ細胞が破壊され、インスリン分泌が不可逆的に低減して高血糖になるＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病：ＩＤＤＭ）と、ランゲルハンス島において、グルコースに対するインスリン応答が低下するかまたはグルコースに対するインスリン抵抗性が上昇し、それにより慢性的な高血糖を結果としてもたらすＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病：ＮＩＤＤＭ）とに大きく分類される。本発明によるモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の処置に用いることができる。「処置」という用語は、糖尿病によって引き起こされる症状が改善されるかまたは有益に変化する組成物による何らかの作用を指す。
【0052】
本発明の実施形態によれば、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を投与すると、１）糖尿病による体重減少を正常な状態まで回復させることができ、２）膵臓組織におけるインスリン発現を上昇させることができ（実施例１）、３）膵ベータ細胞の損傷を低減することができることがわかった。これらの事実は、モノアセチルジアシルグリセロール化合物の投与により糖尿病が改善されることを示している。
【0053】
グルコースは、身体の主要なエネルギー源のうちの１つであり、ほとんどの細胞によって使用され、細胞機能において重要な役割を担っている。グルコースが摂取されると、血糖値が上昇して膵ベータ細胞内でインスリンが分泌される。分泌されたインスリンに応答して、血糖が筋肉または脂肪組織へと吸収され、エネルギー源として使用される。しかしながら、血糖値の上昇は、膵ベータ細胞の機能および生存に対して有害な影響を及ぼす。高濃度のグルコースは、ベータ細胞の過剰刺激を誘導し、このことによって、インスリン合成速度がインスリン分泌速度よりも低くなる。結果として、ベータ細胞の最も重要な機能であるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）が適切に機能しない。
【0054】
体細胞は、それ自体ではグルコースを受け取らないが、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）と呼ばれるタンパク質を経てグルコースを受け取る。すなわち、食物を摂取した後、ＧＬＵＴは血液中のグルコースを細胞内へと輸送する。さまざまなグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）のうち、グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）およびグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）は、インスリン刺激によるグルコース取り込みを制御する。ＧＬＵＴ２はインスリン抵抗性と密接に関連している。ＧＬＵＴ２が適切に機能しない場合、膵ベータ細胞におけるインスリンの分泌は正常に起こらない。インスリン分泌の低減は、多くの組織が血糖を適切に吸収するのを妨げ、高い血中グルコース濃度は、最終的にベータ細胞の生存に対して負の影響を生じる。また、高い血中グルコース濃度は、細胞の酸化ストレスおよび小胞体ストレスを誘導する。酸化ストレスはまた、グルコースの自己酸化、糖化生成物の形成、糖尿病患者におけるタンパク質のグリコシル化、および活性酸素種（ＲＯＳ）によっても引き起こされる。膵ベータ細胞は抗酸化酵素を低レベルで発現するので、酸化ストレスによりベータ細胞が破壊され、細胞分化が抑制される。加えて、糖尿病による高い血中グルコース濃度は、炎症細胞の形成を誘導する。これらの炎症細胞はサイトカインを分泌し、ストレスシグナル伝達経路を活性化して、膵ベータ細胞の機能を阻害および破壊する。
【0055】
本発明の実施形態では、さまざまな実験後に対象の膵臓組織を調査した。この調査によれば、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を投与すると、１）糖尿病に起因する体重減少が観察されず、膵臓組織においてインスリン発現が上昇し（実施例１）、２）膵ベータ細胞株ＩＮＳ－１においてアポトーシス関連タンパク質の発現が低下し（実施例３）、３）ＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスが促進され（実施例４）、４）ベータ細胞における高グルコースレベルに起因するＲＯＳの産生が低減し（実施例５）、５）ベータ細胞のグルコース取り込みが調節された（実施例６）。したがって、モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、膵ベータ細胞の過剰なグルコース取り込みを防止し、ＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスを促進し、正常なベータ細胞機能を維持し、それにより、急速なグルコース取り込みによって引き起こされる有害な効果を軽減する。結果として、モノアセチルジアシルグリセロール化合物は糖尿病の処置に有効であることがわかった。
【0056】
ＲＯＳは、正常な酸素代謝によって自然に発生し、細胞シグナル伝達および恒常性において重要な役割を担っている。過剰なグルコースまたは過剰に産生されたフルクトースはタンパク質に結合してＲＯＳを産生し、このことがアポトーシスおよび糖尿病合併症を誘発する。
【0057】
要約すると、過剰なグルコース摂取はＲＯＳ産生および酸化ストレスを誘導するので、これは制御されるべきである。ＰＬＡＧは、ＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスを促進する。したがって、たとえベータ細胞が高グルコースレベルに曝露されたとしても、ＰＬＡＧはグルコースの急速な流入を調節し、高グルコース濃度に起因する膵ベータ細胞の損傷を軽減する。損傷を受けていないベータ細胞は、通常、インスリンを分泌し、血糖は、脂肪および筋肉組織内へと吸収される。したがって、ＰＬＡＧは、糖尿病および高血糖によって引き起こされる膵ベータ細胞の損傷を防ぐことができる。
【0058】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む医薬組成物は、従来の医薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含むことができる。該医薬組成物中のモノアセチルジアシルグリセロールの量は、特に制限されず、幅広く変えることができ、具体的には、組成物の総量に関して、０．０００１～１００重量％、好ましくは０．００１～９０重量％であり、例えば、該モノアセチルジアシルグリセロールは、７０～８０重量％含有されてよい。
【0059】
さらに、一態様では、式１もしくは２の１つまたは複数の治療化合物化合物、またはＰＬＡＧと、１つまたは複数の異なる糖尿病薬または糖尿病処置薬とを組み合わせて患者に投与することができる。
【0060】
本明細書で使用する場合、対象への療法の投与の文脈における「組み合わせて」という用語は、治療上の利益のための１つを超える療法の使用を指す。投与の文脈における「組み合わせて」という用語はまた、少なくとも１つの追加の療法と共に使用されるときの対象への療法の予防上の使用を指すこともできる。「組み合わせて」という用語の使用は、療法（例えば、第１および第２の療法）が対象に投与される順序を制限しない。療法は、糖尿病に罹患したことがある、糖尿病に罹患している、または糖尿病の疑いのある対象への第２の療法の投与の前（例えば、１分前、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）に、該投与と同時に、または該投与に続いて（例えば、１分後、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後に）投与することができる。該療法は、該療法が一緒に作用することができるように、連続してかつある時間間隔内で対象に投与される。詳細な実施形態では、療法は、他の方法で投与された場合よりも高い恩恵をもたらすように、連続してかつある時間間隔内で対象に投与される。いずれの追加の療法も、その他の追加の療法と共に何らかの順序で投与することができる。
【0061】
化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）ならびに１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症および妊娠糖尿病のための１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬の投与。
【0062】
化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）および１つまたは複数の異なる糖尿病薬または糖尿病処置薬は、同時にまたは逐次投与されてもよい。いくつかの実施形態では、糖尿病の処置は、疾患適応症のための確立された療法であり、化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）の添加によるものであり、このような処置は患者に対する治療上の恩恵が向上する。このような向上は、患者ごとの応答の上昇または患者集団における応答の上昇として測定することができる。併用療法はまた、より少量の用量またはより頻度の少ない治療薬の投与での応答性の向上をもたらし、結果としてより良好な許容される処置投与計画が得られる。示されるように、式１もしくは２の１つまたは複数の化合物、またはＰＬＡＧと、糖尿病を処置するための１つまたは複数の異なる薬または糖尿病処置薬との併用療法は、例えば、ｉ）インスリンを投与すること、ｉｉ）膵臓によって分泌されるインスリンの量を上昇させる作用薬を投与すること、ｉｉｉ）インスリンに対する標的器官の感受性を上昇させる作用薬を投与すること、および／またはｉｖ）グルコースが消化管から吸収される速度を低下させる作用薬を投与すること、によって臨床活性を増強することができる。
【0063】
いくつかの態様では、該方法（例えば、糖尿病処置のための併用療法）は、第２の異なる治療薬（例えば、糖尿病薬または糖尿病処置薬）の投与、または糖尿病処置のための第２の療法（例えば、当技術分野において標準的である治療薬または療法）を用いた処置を含むことができる。
【0064】
いくつかの態様では、該方法（例えば、糖尿病処置のための併用療法）は、第２の治療薬（例えば、糖尿病薬または糖尿病処置薬）の投与、または糖尿病（例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症、および妊娠糖尿病）の処置のための第２の療法（例えば、当技術分野において標準的である治療薬または療法）を用いた処置を含むことができる。
【0065】
例示的な治療薬には、１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬がある。「糖尿病薬」または「糖尿病処置薬」または他の類似の用語は、血糖（グルコース）レベルを制御することによって糖尿病（例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症、および妊娠糖尿病）の処置において有用な化合物（薬物）または生物製剤である。一般に、本明細書で言及される「糖尿病薬」または「糖尿病処置薬」は、ＰＬＡＧなどの式１または式２の化合物とは異なる。
【0066】
ＰＬＡＧなどの式１または式２の化合物の投与と組み合わせてまたは該投与と共になど、本明細書中の方法、キットおよび組成物において議論の対象となり得る糖尿病薬または糖尿病処置薬の例としては、１つまたは複数のインスリン（例えば、フムリン、ノボリン、ノボログ、フレックスペン、フィアスプ、アピドラ、ヒューマログ、フムリンＮ、ノボリンＮ、トレシーバ、レベミル、ランタス、トウジェオ、ノボログミックス７０／３０、ヒューマログミックス７５／２５、ヒューマログミックス５０／５０、フムリン７０／３０、ノボリン７０／３０、ライゾデグなど）、アミリン模倣薬またはプラムリンチド（例えば、シムリンペン１２０およびシムリンペン６０）、α－グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、およびミグリトール（グリセット））、ビグアニド（例えば、メトホルミン－アログリプチン（カザノ）、メトホルミン－カナグリフロジン（インボカメット）、メトホルミン－ダパグリフロジン（シグデュオＸＲ）、メトホルミン－エンパグリフロジン（シンジャルディ）、メトホルミン－グリピジド、メトホルミン－グリブリド（グルコバンス）、メトホルミン－リナグリプチン（ジェンタドゥエート）、メトホルミン－ピオグリタゾン（アクトプラス）、メトホルミン－レパグリニド（プランディメット）、メトホルミン－ロシグリタゾン（アバンダメット）、メトホルミン－サキサグリプチン（コンビグリーゼＸＲ）、およびメトホルミン－シタグリプチン（ジャヌメット））、ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン（サイクロゼット））、ジペプチジルペップチダーゼ４（ＤＰＰ－４）阻害薬（例えば、アログリプチン（ネシナ）、アログリプチン－メトホルミン（カザノ）、アログリプチン－ピオグリタゾン（オセニ）、リナグリプチン（トラゼンタ）、リナグリプチン－エンパグリフロジン（グリクサンビ）、リナグリプチン－メトホルミン（ジェンタドゥエート）、サキサグリプチン（オングリザ）、サキサグリプチン－メトホルミン（コンビグリーゼＸＲ）、シタグリプチン（ジャヌビア）、シタグリプチン－メトホルミン（ジャヌメットおよびジャヌメットＸＲ）、シタグリプチンおよびシンバスタチン（ジュビシンク））、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト（例えば、アルビグルチド（タンゼアム）、デュラグルチド（トゥルリシティ）、エキセナチド（バイエッタ）、持続放出型エキセナチド（バイデュレオン）、リラグルチド（ビクトザ）、およびセマグルチド（オゼンピック））、メグリチニド（例えば、ナテグリニド（スターリクス）、レパグリニド（プランジン）、およびレパグリニド－メトホルミン（プランディメット））、ナトリウム－グルコース輸送体（ＳＧＬＴ）２阻害薬（例えば、ダパグリフロジン（ファシーガ（Ｆａｒｘｉｇａ））、ダパグリフロジン－メトホルミン（シグデュオＸＲ）、カナグリフロジン（インボカナ）、カナグリフロジン－メトホルミン（インボカメット）、エンパグリフロジン（ジャルディアンス）、エンパグリフロジン－リナグリプチン（グリクサンビ）、エンパグリフロジン－メトホルミン（シンジャルディ）、およびエルツグリフロジン（ステグラトロ））、スルホニル尿素（例えば、グリメピリド（アマリル）、グリメピリド－ピオグリタゾン（デュエタクト）、グリメピリド－ロシグリタゾン（アバンダリル）、グリクラジド、グリピジド（グルコトロール）、グリピジド－メトホルミン（メタグリップ）、グリブリド（ダイアベータ、グリナース、ミクロナース）、グリブリド－メトホルミン（グルコバンス）、クロルプロパミド（ダイアビネース）、トラザミド（トリネース）、およびトルブタミド（オリネース、トルタブ））、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（アバンディア）、ロシグリタゾン－グリメピリド（アバンダリル）、ロシグリタゾン－メトホルミン（アマリルＭ）、ピオグリタゾン（アクトス）、ピオグリタゾン－アログリプチン（オセニ）、ピオグリタゾン－グリメピリド（デュエタクト）、およびピオグリタゾン－メトホルミン（アクトプラスメット、アクトプラスメットＸＲ）、アスピリンなど、ならびに先のいずれかの医薬上許容される塩または酸）があるが、これらに限定されない。
【0067】
糖尿病薬または糖尿病処置薬の例示的な有効日用量には、現行の臨床で使用されている作用薬について、該作用薬が現に投与されている薬用量がある。一般に、糖尿病薬または糖尿病処置薬一般の適切なまたは例示的な有効な日用量は、０．１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１、０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９μｇ／ｋｇ体重であってよい。
【0068】
あるいは、別個の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬は、１週間あたり約１回、例えば７日ごとに約１回投与してよい。または、別個の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬は適切には、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、または１週間に７回投与されてよい。該１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬の例示的な有効な毎週の用量には、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、または４ｍｇ／ｋｇ体重がある。例えば、該別個の１つまたは複数の糖尿病薬または糖尿病処置薬の有効な毎週の用量は、０．１μｇ／ｋｇ患者の体重～４００μｇ／ｋｇ患者の体重である。
【0069】
本発明の医薬組成物はさらに、糖尿病の治療効果を有する他の有効成分を含んでよい。該医薬組成物は、経口投与または非経口投与のための固形状、液状、ゲル状または懸濁状形態、例えば錠剤、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、硬質または軟質のゼラチンカプセル剤などのカプセル剤、エマルション剤、懸濁剤、シロップ剤、乳化可能な濃縮物、滅菌水溶液剤、非水溶液剤、凍結乾燥製剤などに製剤されてよい。該組成物の製剤化では、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、および界面活性剤などの従来の賦形剤または希釈剤を使用することができる。経口投与用の固形製剤としては、錠剤、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などがあり、該固形製剤は、１つまたは複数の有効成分と、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどの少なくとも１つの賦形剤とを混合することによって調製することができる。賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤もまた使用することができる。経口投与のための液体製剤としては、エマルション剤、懸濁剤、シロップ剤などがあり、水および流動パラフィンなどの従来の希釈剤を含んでよく、または湿潤剤、甘味料、香味料、および防腐剤などのさまざまな賦形剤を含んでよい。非経口投与用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水溶液剤、凍結乾燥製剤、坐剤などがあり、このような液剤のための溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射器による注射のためのエステルがあってよい。坐剤の基剤材料としては、ウィテップゾール、マクロゴール、トゥイーン６１、カカオバター、ラウリンおよびグリセロゼラチンがあってよい。
【0070】
モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、医薬有効量で投与することができる。「医薬有効量」という用語は、医学的処置において所望の結果を達成するのに十分である量を指すために使用される。「医薬有効量」は、対象の区分、年齢、性別、疾患の重症度および種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路、排泄率などによって決定することができる。本発明の組成物は、単独で、または他の治療薬と共に逐次もしくは同時に投与することができる。本発明の組成物は、単回投与または複数回投与することができる。本発明の組成物の好ましい量は、患者の容態および体重、疾患の重症度、薬物の製剤の種類、投与経路ならびに処置期間によって変えることができる。１日あたりのＰＬＡＧなどの式１または式２の化合物の適切な総投与量は、医師によって決定することができ、一般に約０．００１～約５，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０５～１，０００ｍｇ／ｋｇで１日１回であるか、または分割用量で１日に複数回投与することができる。本発明の組成物は、糖尿病の予防または処置を必要とする何らかの対象に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、ヒトだけでなく、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの非ヒト動物（具体的には哺乳動物）にも投与することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明は、式１のモノアセチルジアシルグリセロールを有効成分として含む、糖尿病を予防、軽減または改善するための健康機能性食品組成物を提供する。
【0072】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、対象における糖尿病を改善するための健康機能性食品組成物へと含まれていてよい。モノアセチルジアシルグリセロール化合物および糖尿病疾患は、先に説明した通りである。本発明の化合物が健康機能性食品組成物へと含まれているとき、該健康食品組成物中のモノアセチルジアシルグリセロールの量は、意図した使用に応じて適切に決定することができる。一般に、モノアセチルジアシルグリセロールの量は、食品または飲料に含まれるとき、該健康機能性食品組成物の総量に関して、好ましくは０．０１重量％以上１５重量％未満である。しかしながら、モノアセチルジアシルグリセロールの量は増減してよい。健康管理および衛生の目的のための長期使用の場合、モノアセチルジアシルグリセロールの量は、先の範囲未満とすることができる。安全性の点で問題がないので、モノアセチルジアシルグリセロールは、先の範囲を超える量で使用してよい。本発明の化合物を添加することができる食品は、制限されておらず、さまざまな食品、例えば食肉、ソーセージ、パン、チョコレート、飴、スナック菓子、ピザ、麺類、ガム類、アイスクリームなどの日用品、スープ、飲料、茶、嚥下可能な飲料、アルコール飲料、複合ビタミン類およびいずれの健康機能食品も含まれる。
【0073】
モノアセチルジアシルグリセロールが飲料製品において使用されるとき、該飲料製品は、甘味料、香味料または炭水化物を含んでよい。炭水化物の例としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールがある。飲料組成物中の炭水化物の量は、具体的な制限がなく幅広く変えることができ、該飲料１００ｍｌあたり、好ましくは０．０１～０．０４ｇ、より好ましくは０．０２～０．０３ｇである。甘味料の例としては、タウマチンおよびステビア抽出物などの天然甘味料、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの人工甘味料がある。上記に加えて、本発明の健康機能性食品組成物には、さまざまな栄養素、ビタミン類、電解質、香味料、着色料、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などが含まれてよい。さらに、本発明の健康機能性食品組成物は、天然果汁および果汁飲料、ならびに野菜飲料を調製する上で使用されるような果実類を含んでよい。
【0074】
本発明は、糖尿病疾患の疑いのある個体に該医薬組成物を投与するステップを含む、糖尿病を処置するための方法を提供する。糖尿病の疑いのある対象に該組成物を投与することによって、該糖尿病が効率的に処置される。「糖尿病の疑いのある対象」という用語は、糖尿病に罹患している対象または糖尿病を発症する可能性のある対象を指す。糖尿病疾患は、該糖尿病疾患を処置しまたは予防する必要のある患者に、有効量の該化合物を投与することによって、処置しまたは予防することができる。モノアセチルジアシルグリセロール化合物の種類、およびモノアセチルジアシルグリセロール化合物の用量、ならびに糖尿病疾患については、先に説明した通りである。「投与」という用語は、本発明の医薬組成物を何らかの適切な方法によって、必要とする患者に導入することを意味する。投与経路は、標的組織に到達することができる限り、経口または非経口と、何らかのまたはさまざまな経路であってよく、例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮投与（局所適用など）、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻腔内投与、直腸投与、鼻腔内投与、腹腔内投与などが使用されてよいが、これらに限定されない。
【実施例】
【0075】
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供される。しかしながら、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0076】
糖尿病疾患の処置における１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃグリセロール（ＥＣ－１８またはＰＬＡＧ）の有効性を確認するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性糖尿病モデルを本実験に使用した。
【0077】
実験例：対照群および実験群の準備
マウスを４つの群（対照群、ＳＴＺのみによる処置群、ＰＬＡＧとの共処置群、およびＰＬＡＧによる後処置群）に分けた。１６時間の絶食後、対照群を除く３つの処置群に、クエン酸緩衝液の新たに調製されたＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇＢＷ）を腹腔内注射した（ＢＷは体重を意味する）。ＳＴＺのみの処置のマウスには、追加の処置は行わなかった。
マウスを４つの群（対照群、ＳＴＺのみによる処置群、ＰＬＡＧとの共処置群、およびＰＬＡＧによる後処置群）に分けた。１６時間の絶食後、対照群を除く３つの処置群に、クエン酸緩衝液の新たに調製されたＳＴＺ（２００ｍｇ／ｋｇＢＷ）を腹腔内注射した（ＢＷは体重を意味する）。ＳＴＺのみの処置のマウスには、追加の処置は行わなかった。
【0078】
同日に、ＰＬＡＧとの共処置群マウスは、３日間連続して１日１回、ＰＬＡＧ（２５０ｍｇ／ｋｇ、経口）による処置を開始した。ＰＬＡＧ後処置群には、ＳＴＺ注射の１日後から開始して２日間連続してＰＬＡＧ（２５０ｍｇ／ｋｇ、経口）を投与した。ＰＬＡＧとしては、式２によって表される１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールを使用した。
【0079】
実施例１：血糖および体重変化の測定
眼窩後部叢を介して血液を採取し、本実験中に血糖値をモニタリングした。血糖を、Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋグルコメーター（Ｒｏｃｈｅ、大韓民国ソウル市）を使用して測定した。図１Ａは、１日目の対照群および実験群の血糖を測定するチャートである。
眼窩後部叢を介して血液を採取し、本実験中に血糖値をモニタリングした。血糖を、Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋグルコメーター（Ｒｏｃｈｅ、大韓民国ソウル市）を使用して測定した。図１Ａは、１日目の対照群および実験群の血糖を測定するチャートである。
【0080】
全てのマウスを実験の最終日（４日目）である４日目に屠殺し、血清インスリンを測定した（図１Ｂ）。対照群および実験群の膵臓組織の組織を収集し、さらなる分析のために１０％ホルマリン中で固定した。本実験中、対照群および実験群の体重変化を測定した（図１Ｃ）。
【0081】
図１Ａ～図１Ｃを参照すると、１日目に、ＳＴＺのみで処置した動物において血糖上昇が観察された。しかしながら、ＰＬＡＧ共処置群は、対照群と比較して血糖の有意な上昇がなかった。ＳＴＺのみでの処置群のインスリン分泌は、対照群および他の実験群よりも有意に低い。また、ＳＴＺのみでの処置群は、対照群および他の実験群よりも体重変化が大きい。
【0082】
実施例２：膵島の組織病理学的性質
膵臓組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、４μｍの厚さで切片作製した。免疫組織化学的性質のために、キシレンおよび段階的エタノール系列を使用して切片を脱パラフィンおよび脱水した。染色を、Ｒｅａｌ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＤＡＢキット（Ｄａｋｏ，デンマーク国グロストルプ）を製造元の説明書に従って使用して行い、次いで、光学顕微鏡（オリンパス、日本国東京都）下で観察した（図１Ｄ、４００倍率）。
膵臓組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、４μｍの厚さで切片作製した。免疫組織化学的性質のために、キシレンおよび段階的エタノール系列を使用して切片を脱パラフィンおよび脱水した。染色を、Ｒｅａｌ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＤＡＢキット（Ｄａｋｏ，デンマーク国グロストルプ）を製造元の説明書に従って使用して行い、次いで、光学顕微鏡（オリンパス、日本国東京都）下で観察した（図１Ｄ、４００倍率）。
【0083】
実施例３：細胞死に対するＰＬＡＧの効果
ＳＴＺ誘導性細胞アポトーシスに対するＰＬＡＧの効果を、アネキシンＶおび７－ＡＡＤ色素を用いたフローサイトメトリーを用いて分析した（図２Ａおよび図２Ｂ）。細胞をトリプシン処理によって回収し、ＰＢＳで洗浄した。細胞アポトーシス分析のために、ＩＮＳ－１細胞をアネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス地区）と共に室温で１０分間インキュベートし、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。アネキシンＶ色素および７－ＡＡＤ色素は、細胞死の一種であるアポトーシスを標識する色素である。
ＳＴＺ誘導性細胞アポトーシスに対するＰＬＡＧの効果を、アネキシンＶおび７－ＡＡＤ色素を用いたフローサイトメトリーを用いて分析した（図２Ａおよび図２Ｂ）。細胞をトリプシン処理によって回収し、ＰＢＳで洗浄した。細胞アポトーシス分析のために、ＩＮＳ－１細胞をアネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス地区）と共に室温で１０分間インキュベートし、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。アネキシンＶ色素および７－ＡＡＤ色素は、細胞死の一種であるアポトーシスを標識する色素である。
【0084】
加えて、特別なタンパク質検出試験（ウエスタンブロット法）を行うために、プロテアーゼ阻害薬およびホスファターゼ阻害薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム市）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（ＬＰＳ溶液、韓国大田広域市）によって細胞を溶解した。タンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット市）に転写した。膜を５％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ＧＬＵＴ２（ｂｓ－０３５１ｒ、Ｂｉｏｓｓ、米国マサチューセッツ州ウーバン市）、ＲＡＣ１（０３５８９、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＢＡＸ（ＢＳ１０３０、Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｅｃｈ、米国ミネソタ州セントルイスパーク市）、ＢＣＬ－２（ＢＳ１０３１、Ｂｉｏｗｏｒｌｄ）、シトクロムｃ（＃４２７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンバース町）、カスパーゼ３（＃９６６２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＮａ＋－Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（＃３０１０Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する一次抗体と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ結合二次抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：５，０００希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。タンパク質のバンドを、ＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出し、次いで、フィルム上で可視化した。Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、シトクロムｃ、カスパーゼ３などのアポトーシス関連タンパク質の発現をウエスタンブロット法によって分析し、Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比を棒グラフによって表す（図２Ｃ）。データを平均±標準偏差（対照に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５）として提示する。
【0085】
【0086】
抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ－２は、ＳＴＺによって低下し、ＰＬＡＧによって回復した。逆に、アポトーシス関連タンパク質ＢＡＸ、シトクロムｃ、およびカスパーゼ３の発現はＳＴＺによって上昇し、ＰＬＡＧの添加によって減弱した。
【0087】
実施例４：細胞膜におけるＧＬＵＴ２の発現に対するＰＬＡＧの効果
ＧＬＵＴ２原形質膜局在化に対するＰＬＡＧの効果を調べるために、膜画分におけるＧＬＵＴ２の発現およびＲａｃ１の発現をウエスタンタンパク質ブロット法と同じ様式で検討した（図３Ａ～図３Ｂ）。
ＧＬＵＴ２原形質膜局在化に対するＰＬＡＧの効果を調べるために、膜画分におけるＧＬＵＴ２の発現およびＲａｃ１の発現をウエスタンタンパク質ブロット法と同じ様式で検討した（図３Ａ～図３Ｂ）。
【0088】
加えて、免疫蛍光アッセイによってＧＬＵＴ２の局在化を観察した。細胞を２４ウェルプレート内のカバーガラス上で成長させ、ＳＴＺおよびＰＬＡＧで処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞膜において発現したタンパク質のみを同定するために透過処理を行わなかった。細胞を抗ＧＬＵＴ２抗体（１：５００希釈）と共にインキュベートし、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合二次抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１０００希釈）およびＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。染色された細胞をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国イェーナ市）下で観察した（図３Ｃ）。
【0089】
図３Ａを参照すると、膜発現ＧＬＵＴ２は、ＳＴＺ処理細胞において着実に低下した。ＰＬＡＧ処理した細胞では、ＧＬＵＴ２発現は、１０分まで徐々に低下し、次いで回復し、６０分で対照レベルに戻った。
【0090】
図３Ｂを参照すると、ＲＯＳを産生するＮＡＤＰＨオキシダーゼであるＲＡＣ１の発現は、ＳＴＺ群では膜画分において着実に上昇したが、ＰＬＡＧ処理群では、１５分でわずかに上昇した後に減衰した。図３Ｃを参照すると、ＰＬＡＧ処理した細胞では、ＧＬＵＴ２のインターナリゼーションの加速が観察され、ＧＬＵＴ２は６０分で再び膜において観察された。
【0091】
実施例５：ＲＯＳに対するＰＬＡＧの効果
ＰＬＡＧを投与した後の細胞内ＲＯＳの分析のために、細胞を２μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド市）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。分析を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い（図４Ａおよび図４Ｂ）、活性酸素種（ＲＯＳ）の発現を免疫蛍光アッセイによって観察した（図４Ｃ）。本発明者らはさらに、細胞内ＲＯＳ生成と膵ベータ細胞のアポトーシスとの関係を検討するために、３種類のＲＯＳ阻害薬（アポシニン、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ、ＮＡＣ）で同時処理した細胞における細胞アポトーシスを検討した。発現したアポトーシス関連タンパク質およびアポトーシスの程度を、阻害薬で処理した細胞において観察した（図４Ｄおよび図４Ｅ）。ＲＯＳ阻害薬として、アポシニン（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害薬）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（ミトコンドリアＲＯＳ阻害薬）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、全体的なＲＯＳ阻害薬）を用いた。データを平均±標準偏差（対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５）として提示する。
ＰＬＡＧを投与した後の細胞内ＲＯＳの分析のために、細胞を２μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド市）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。分析を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い（図４Ａおよび図４Ｂ）、活性酸素種（ＲＯＳ）の発現を免疫蛍光アッセイによって観察した（図４Ｃ）。本発明者らはさらに、細胞内ＲＯＳ生成と膵ベータ細胞のアポトーシスとの関係を検討するために、３種類のＲＯＳ阻害薬（アポシニン、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ、ＮＡＣ）で同時処理した細胞における細胞アポトーシスを検討した。発現したアポトーシス関連タンパク質およびアポトーシスの程度を、阻害薬で処理した細胞において観察した（図４Ｄおよび図４Ｅ）。ＲＯＳ阻害薬として、アポシニン（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害薬）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（ミトコンドリアＲＯＳ阻害薬）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、全体的なＲＯＳ阻害薬）を用いた。データを平均±標準偏差（対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５）として提示する。
【0092】
図４Ａを参照すると、細胞内ＲＯＳは、ＳＴＺ処理した細胞において上昇し、ＰＡＧ処理した細胞において用量依存的に低下した。図４Ｂおよび図４Ｃを参照すると、ＲＯＳは、ＳＴＺ処理した細胞において時間依存的な様式で急速に上昇したが、これはＰＬＡＧ処理した細胞においては減衰した。
【0093】
また、図４Ｄおよび図４Ｅを参照すると、発現したアポトーシス関連タンパク質およびＳＴＺ誘導性細胞アポトーシスの有意な低減が、阻害薬で処理した細胞において観察された。これらの結果は、ＳＴＺ処理後のＲＯＳ生成が、膵ベータ細胞アポトーシスに寄与することを示唆している。
【0094】
実施例６：（ベータ細胞のグルコース取り込みに対するＰＬＡＧの効果）
２－［Ｎ－（７－ニトロベンゼン－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＮＢＤＧ、Ｎ１３１９５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をグルコース取り込みアッセイに使用した。グルコース取り込みアッセイを、蛍光色素と結合した２－ＮＢＤＧを使用して行った。細胞内２－ＮＢＤＧを６０分で測定し（図５Ａ）、２－ＮＢＤＧ処理５分後～４８０分後でフローサイトメトリーによって連続的に計算した（図５Ｂ）。血清含有完全培地を除去し、ＩＮＳ－１細胞をＰＢＳ中で洗浄した。細胞を、グルコース非含有培養培地中で、３７℃で１時間培養し、次いで、２－ＮＢＤＧで処理した。細胞内蛍光は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
２－［Ｎ－（７－ニトロベンゼン－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ］－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＮＢＤＧ、Ｎ１３１９５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をグルコース取り込みアッセイに使用した。グルコース取り込みアッセイを、蛍光色素と結合した２－ＮＢＤＧを使用して行った。細胞内２－ＮＢＤＧを６０分で測定し（図５Ａ）、２－ＮＢＤＧ処理５分後～４８０分後でフローサイトメトリーによって連続的に計算した（図５Ｂ）。血清含有完全培地を除去し、ＩＮＳ－１細胞をＰＢＳ中で洗浄した。細胞を、グルコース非含有培養培地中で、３７℃で１時間培養し、次いで、２－ＮＢＤＧで処理した。細胞内蛍光は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
【0095】
細胞内２－ＮＢＤＧ発現はまた、免疫蛍光アッセイを使用しても観察された（図５Ｃ）。データを平均±標準偏差として提示する。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５。
【0096】
図５Ａを参照すると、２－ＮＢＤＧ処理した細胞において蛍光強度を測定したが、６０分でより低い蛍光強度がＰＬＡＧ処理した群において検出された。
【0097】
図５Ｂを参照すると、グルコース取り込みは、２－ＮＢＤＧ単独よりもむしろＰＬＡＧを投与した実験群において減衰した。これらの結果は、ＰＬＡＧがＧＬＵＴ２のインターナリゼーションを加速させ、グルコース流入を制限することを示唆している。
【0098】
図５Ｃを参照すると、２－ＮＢＤＧのみで処理した群では、２－ＮＢＤＧが５分で細胞膜に観察され、細胞質において漸増し、蛍光強度は時間依存的な様式で上昇した。細胞内２－ＮＢＤＧは、ＰＬＡＧ処理した群においてより緩徐に上昇した。これらの結果は、ＰＬＡＧが、ＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスを促進し、同時に正常なベータ細胞機能を維持することを経て、迅速なグルコース取り込みの有害な効果を減弱させることがあることを示唆している。
【0099】
実施例７：ＧＬＵＴ２発現抑制細胞に対するＰＬＡＧの効果
ＧＬＵＴ２発現抑制細胞を調製して、ＳＴＺ処理した細胞におけるＧＬＵＴ２の役割を明らかにした。ＩＮＳ－１細胞にＧＬＵＴ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトして、ＧＬＵＴ２発現がＳＴＺ誘導性細胞アポトーシスおよびＲＯＳ生成に関連しているかどうかを決定した。
ＧＬＵＴ２発現抑制細胞を調製して、ＳＴＺ処理した細胞におけるＧＬＵＴ２の役割を明らかにした。ＩＮＳ－１細胞にＧＬＵＴ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトして、ＧＬＵＴ２発現がＳＴＺ誘導性細胞アポトーシスおよびＲＯＳ生成に関連しているかどうかを決定した。
【0100】
膵ベータ細胞のアポトーシス、細胞内ＲＯＳ生成およびグルコース取り込みを、ＧＬＵＴ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を使用してフローサイトメトリーによって分析した（図６Ａ～６Ｃ）。エンドサイトーシス関連タンパク質、クラスリンまたはカベオリンのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞における（Ｄ）細胞アポトーシスおよび（Ｅ）ＲＯＳ生成に対するＰＬＡＧの効果を解析した（図６Ｄおよび６Ｅ）。データを平均±標準偏差として提示する。対照に対して＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺ群に対して＃＃Ｐ＜０．００５、＃＃＃Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ．：有意性なし。製造元のプロトコルにより、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国ヒルデン町）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。ＧＬＵＴ２、クラスリン、およびカベオリンに対する特異的ｓｉＲＮＡをＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌｏｇｙ（米国テキサス州ダラス市）から得た。
【0101】
細胞アポトーシス（図６Ａ）および細胞内ＲＯＳ生成（図６Ｂ）は、ＳＴＺで処理した細胞では顕著に上昇したが、ＧＬＵＴ２発現抑制細胞では上昇しなかった。グルコース取り込みもまた、ＧＬＵＴ２発現抑制細胞では有意に上昇しなかった（図６Ｃ）。ＰＬＡＧの生物学的活性がＧＬＵＴ２の細胞内輸送に依存しているかどうかを決定するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを使用してエンドサイトーシス関連タンパク質であるクラスリンおよびカベオリンの発現を抑制した（図６Ｄ、図６Ｅ）。ＰＬＡＧは、クラスリンまたはカベオリンを発現抑制した細胞では、アポトーシスまたはＲＯＳ生成に影響を及ぼさなかった。このことは、ＰＬＡＧの作用がＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスと関係することを示唆している。
【0102】
実施例８：ＰＬＡＧおよびＰＬＨの効果の比較（ＰＬＡＧ活性の特異性）
ＰＬＡＧおよびＰＬＨ（１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－ヒドロキシル－ｒａｃ－グリセロール）で処理した後、アポトーシス、細胞内ＲＯＳ生成およびグルコース取り込みをフローサイトメトリーによって分析した（図７Ｂ～７Ｅ）。加えて、膜画分におけるＧＬＵＴ２の発現をウエスタンブロット法によって分析した（図７Ｆ）。データを平均±標準偏差として提示する。対照に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５。Ｎ．Ｓ．：有意性なし。
ＰＬＡＧおよびＰＬＨ（１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－ヒドロキシル－ｒａｃ－グリセロール）で処理した後、アポトーシス、細胞内ＲＯＳ生成およびグルコース取り込みをフローサイトメトリーによって分析した（図７Ｂ～７Ｅ）。加えて、膜画分におけるＧＬＵＴ２の発現をウエスタンブロット法によって分析した（図７Ｆ）。データを平均±標準偏差として提示する。対照に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＳＴＺに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．００５。Ｎ．Ｓ．：有意性なし。
【0103】
図７Ａは、ＰＬＡＧおよびＰＬＨの単純な構造を示す。ＰＬＨは、ＰＬＡＧの構造類似体である。ＰＬＡＧはアセチル基を有するが、ＰＬＨはグリセロールの３位に水酸基を有する。図７Ｂおよび７Ｃを参照すると、ＰＬＡＧは、細胞アポトーシスおよびＲＯＳ生成を低下させる上で、ＰＬＨよりも有効であった。グルコース取り込みアッセイでは、ＰＬＨ処理群は対照群と同様のパターンを示し、ＰＬＨ処理した細胞におけるグルコース取り込みに対する影響はなかった。ＰＬＡＧを投与した実験群では、２－ＮＢＤＧが緩徐に吸収され、ＧＬＵＴ２のエンドサイトーシスが促進された。逆に、ＰＬＨ処理した細胞では、２－ＮＢＤＧ取り込みまたはＧＬＵＴ２インターナリゼーションに変化はなかった（図７Ｄおよび７Ｅ）。これらの結果は、ＧＬＵＴ２エンドサイトーシスを促進する上でのＰＬＡＧの特異性を確固としている。
【0104】
実施例９：高グルコース（ＨＧ）誘導細胞におけるＰＬＡＧの効果）
（ＰＬＡＧはＨＧ誘導性細胞アポトーシスを低減させる（図８））
膵ベータ細胞保護に対するＰＬＡＧの効果を、ＨＧ処理後に調べた。ＨＧ誘導性細胞アポトーシスを、フローサイトメトリーを使用して分析した。ＩＮＳ－１細胞を５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで４８時間処理した。ＩＮＳ－１細胞を高グルコース条件で維持すると、対照細胞と比較して細胞アポトーシスの有意な上昇があった。対照的に、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで処理した細胞では、アポトーシスの速度低下が観察され、用量依存的保護を示した。
（ＰＬＡＧはＨＧ誘導性細胞アポトーシスを低減させる（図８））
膵ベータ細胞保護に対するＰＬＡＧの効果を、ＨＧ処理後に調べた。ＨＧ誘導性細胞アポトーシスを、フローサイトメトリーを使用して分析した。ＩＮＳ－１細胞を５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで４８時間処理した。ＩＮＳ－１細胞を高グルコース条件で維持すると、対照細胞と比較して細胞アポトーシスの有意な上昇があった。対照的に、５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで処理した細胞では、アポトーシスの速度低下が観察され、用量依存的保護を示した。
【0105】
糖毒性誘発膵ベータ細胞損傷に対するＰＬＡＧの保護効果を、ＨＧ処理後にさらに調べた。細胞アポトーシスは、ＨＧ処理細胞において最大３５％上昇し、ＰＬＡＧは、ＨＧ誘導性細胞アポトーシスを用量依存的に低下させた。
【0106】
ＰＬＡＧは、ＨＧ誘導性細胞内ＲＯＳ生成を低減させる（図９）
細胞内ＲＯＳ生成も、ＤＣＦＨ－ＤＡ色素を使用したフローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度の変化を分析することによってＲＯＳ生成を決定した。ＩＮＳ－１細胞を５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで４８時間処理した。３０ｍＭのＨＧで処理したＩＮＳ－１細胞は有意に増強した蛍光強度を示し、ＰＬＡＧ処理はＨＧ誘導性細胞内ＩＲＯＳ生成を用量依存的に低下させた。
細胞内ＲＯＳ生成も、ＤＣＦＨ－ＤＡ色素を使用したフローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度の変化を分析することによってＲＯＳ生成を決定した。ＩＮＳ－１細胞を５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで４８時間処理した。３０ｍＭのＨＧで処理したＩＮＳ－１細胞は有意に増強した蛍光強度を示し、ＰＬＡＧ処理はＨＧ誘導性細胞内ＩＲＯＳ生成を用量依存的に低下させた。
【0107】
ＰＬＡＧは、ＨＧ処理したＩＮＳ－１細胞においてＧＬＵＴ２エンドサイトーシスを促進する（図１０）
ＧＬＵＴ２原形質膜局在化に対するＰＬＡＧの効果を調べるために、膜タンパク質を分画し、ウエスタンブロット法によって分析した。ＩＮＳ－１細胞を１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで表示時間処理した。膜に発現したＧＬＵＴ２は、ＨＧ処理した細胞において着実に上昇した。ＰＬＡＧ処理した細胞では、ＧＬＵＴ２発現は１５分まで漸減し、次いで回復し、６０分で対照レベルに戻った。これらの結果は、ＰＬＡＧが高グルコース条件下でＧＬＵＴ２のインターナリゼーションを促進することを示唆している。
ＧＬＵＴ２原形質膜局在化に対するＰＬＡＧの効果を調べるために、膜タンパク質を分画し、ウエスタンブロット法によって分析した。ＩＮＳ－１細胞を１００μｇ／ｍＬのＰＬＡＧで１時間前処理し、次いで３０ｍＭのＨＧで表示時間処理した。膜に発現したＧＬＵＴ２は、ＨＧ処理した細胞において着実に上昇した。ＰＬＡＧ処理した細胞では、ＧＬＵＴ２発現は１５分まで漸減し、次いで回復し、６０分で対照レベルに戻った。これらの結果は、ＰＬＡＧが高グルコース条件下でＧＬＵＴ２のインターナリゼーションを促進することを示唆している。
【0108】
材料および方法
【0109】
細胞培養
ＩＮＳ－１ラット膵島ベータ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州ロングビーチ市）、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（抗生物質－抗真菌液、Ｗｅｌｇｅｎｅ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ，大韓民国慶尚北道区）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で成長させた。
ＩＮＳ－１ラット膵島ベータ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州ロングビーチ市）、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（抗生物質－抗真菌液、Ｗｅｌｇｅｎｅ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ，大韓民国慶尚北道区）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で成長させた。
【0110】
化学物質および試薬
ＰＬＡＧは、Ｅｎｚｙｃｈｅｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（大韓民国ソウル特別市）から得た。Ｄ－グルコースは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス市）から購入した。ＰＬＡＧをエタノール中に溶解し、最終作業濃度を０．１％（ｖ／ｖ）とした。Ｄ－グルコースを細胞培養培地中に溶解した。
ＰＬＡＧは、Ｅｎｚｙｃｈｅｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（大韓民国ソウル特別市）から得た。Ｄ－グルコースは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス市）から購入した。ＰＬＡＧをエタノール中に溶解し、最終作業濃度を０．１％（ｖ／ｖ）とした。Ｄ－グルコースを細胞培養培地中に溶解した。
【0111】
フローサイトメトリー
細胞をトリプシン処理によって回収し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞アポトーシス分析のために、ＩＮＳ－１細胞をアネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス地区）と共に室温で１０分間インキュベートし、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の分析のために、細胞を２μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド市）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
細胞をトリプシン処理によって回収し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞アポトーシス分析のために、ＩＮＳ－１細胞をアネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス地区）と共に室温で１０分間インキュベートし、７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の分析のために、細胞を２μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド市）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【0112】
ウエスタンブロット法
膜タンパク質分画のために、製造元の説明書に従って、Ｍｅｍ－ＰＥＲ（商標）Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム市）を使用して行った。タンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット市）に転写した。膜をブロッキングし、ＧＬＵＴ２（ｂｓ－０３５１ｒ、米国マサチューセッツ州ウーバン市）およびＮａ＋－Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（＃３０１０Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンバース町）に対する一次抗体と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ結合二次抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニューヨーク州ファーミングデール村）と共に室温で１時間インキュベートした。タンパク質のバンドを、ＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出し、次いで、フィルム上で可視化した。
膜タンパク質分画のために、製造元の説明書に従って、Ｍｅｍ－ＰＥＲ（商標）Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム市）を使用して行った。タンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ダルムシュタット市）に転写した。膜をブロッキングし、ＧＬＵＴ２（ｂｓ－０３５１ｒ、米国マサチューセッツ州ウーバン市）およびＮａ＋－Ｋ＋ＡＴＰアーゼ（＃３０１０Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンバース町）に対する一次抗体と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ結合二次抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニューヨーク州ファーミングデール村）と共に室温で１時間インキュベートした。タンパク質のバンドを、ＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出し、次いで、フィルム上で可視化した。
【0113】
統計解析
データを平均±標準偏差として提示する。平均間の差の統計学的有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙ検定によって検討した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。対照群と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、高グルコール（ＨＧ）群と比較して＃＃Ｐ＜０．００５、＃＃＃Ｐ＜０．００１。
データを平均±標準偏差として提示する。平均間の差の統計学的有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙ検定によって検討した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。対照群と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、高グルコール（ＨＧ）群と比較して＃＃Ｐ＜０．００５、＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】