▶ シージェイ チェイルジェダン コーポレーションの特許一覧
特表2022-529246Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-20
(54)【発明の名称】Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220613BHJP
C12P 13/06 20060101ALI20220613BHJP
C12P 13/12 20060101ALI20220613BHJP
C12P 13/22 20060101ALI20220613BHJP
C12P 13/24 20060101ALI20220613BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P13/06 D
C12P13/12 A
C12P13/12 B
C12P13/22 A
C12P13/24 C
C12P13/06 E
C12P13/06 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560112
(86)(22)【出願日】2020-04-29
(85)【翻訳文提出日】2021-10-11
(86)【国際出願番号】 KR2020005674
(87)【国際公開番号】W WO2020226341
(87)【国際公開日】2020-11-12
(31)【優先権主張番号】10-2019-0054430
(32)【優先日】2019-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508139664
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣＨＥＩＬＪＥＤＡＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】ＣＪ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，３３０，Ｄｏｎｇｈｏ－ｒｏ，Ｊｕｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ Ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】一色国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ヒョ リュン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ソ－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヒョ ミン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ソン クン
(72)【発明者】
【氏名】リ，チン ナム
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヒョン ア
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ソル
(72)【発明者】
【氏名】ホ，ラン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE08
4B064AE09
4B064AE14
4B064AE16
4B064AE26
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA50
4B065AA14X
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA48
(57)【要約】
本発明は、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物、及びその微生物を用いたＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を発現するように改変された、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項2】
前記タンパク質は、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）由来のものである請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項3】
前記微生物は、さらに、ｉ）活性が低下したホスホセリンホスファターゼ、ｉｉ）活性が強化された３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、又はｉｉｉ）活性が低下したホスホセリンホスファターゼ及び活性が強化された３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼを有する請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項4】
前記微生物は、さらに、ｔｒｐオペロンの強化、トリプトファナーゼ（Tryptophanase; TnaA）の不活性化、Ｍｔｒ膜タンパク質（Mtr membrane protein; Mtr）の不活性化、又はそれらの組み合わせにより改変されたものである請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項5】
前記微生物は、さらに、ｈｉｓオペロンが強化されたものである請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項6】
前記微生物は、さらに、ＭｃｂＲ（Transcriptional regulator; mcbR）の不活性化、メチオニンシンターゼ（Methionine synthase; meth）の強化、亜硫酸レダクターゼ［ＮＡＤＰＨ］ヘムタンパク質βコンポーネント（Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI）の強化、又はそれらの組み合わせにより改変されたものである請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項7】
前記微生物は、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属である請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項8】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はエシェリキア・コリである請求項７に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項9】
Ｌ－アミノ酸又はその前駆体は、Ｌ－セリン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、Ｏ－スクシニルホモセリン、Ｏ－アセチルホモセリン、Ｌ－ホモセリン、アセチルセリン、Ｌ－シスタチオニン、Ｌ－ホモシステイン及びＯ－ホスホセリンからなる群から選択されるものである請求項１に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物。
【請求項10】
請求項１～９のいずれかに記載の微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法。
【請求項11】
前記培養した微生物又は培地からＬ－アミノ酸又はその前駆体を回収するステップをさらに含む請求項１０に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法。
【請求項12】
Ｌ－アミノ酸又はその前駆体は、セリン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、Ｌ－システイン、Ｏ－スクシニルホモセリン、Ｏ－アセチルホモセリン、Ｌ－ホモセリン、アセチルセリン、Ｌ－シスタチオニン、Ｌ－ホモシステイン及びＯ－ホスホセリンからなる群から選択されるものである請求項１０に記載のＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法。
【請求項13】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質における、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産増加における使用。
【請求項14】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を発現するように改変された微生物、又は前記タンパク質を含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産用組成物。
【請求項15】
請求項１４に記載の組成物を用いた、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物、及びその微生物を用いたＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料や食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。前記Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、Ｌ－リシンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１）。
【0003】
一方、コリネバクテリウム属菌株（Corynebacterium）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性微生物である。前記アミノ酸を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、コリネバクテリウム属菌株において、アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、アミノ酸の生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献２，３）。また、前記方法以外に、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産における具体的な機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的に高収率でＬ－アミノ酸を生産する方法に関する研究が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】韓国登録特許第１０－０８３８０３８号公報
【特許文献2】韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報
【特許文献3】韓国登録特許第１０－１２０８４８０号公報
【特許文献4】韓国登録特許第１０－１０４８５９３号公報
【特許文献5】韓国登録特許第１０－０６２００９２号公報
【特許文献6】国際公開第２００６／０６５０９５号
【特許文献7】国際公開第２００９／０９６６８９号
【特許文献8】韓国登録特許第１０－１７８３１７０号公報
【特許文献9】韓国登録特許第１０－１６３２６４２号公報
【特許文献10】韓国登録特許第１０－１３８１０４８号公報
【特許文献11】米国特許出願公開第２０１２／０１９００８１号明細書
【特許文献12】韓国公開特許第２０１８－００８９３２９号公報
【特許文献13】韓国登録特許第１０－０９３０２０３号公報
【特許文献14】韓国特許公告第１９９２－０００７４０１号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980
【非特許文献2】Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990
【非特許文献3】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献4】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献5】Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993
【非特許文献6】Methods Enzymol., 183, 63, 1990
【非特許文献7】http://www.ncbi.nlm.nih.gov
【非特許文献8】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【非特許文献9】DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
【非特許文献10】J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20-24, (1999)
【非特許文献11】One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5
【非特許文献12】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, p. 4426-4428
【非特許文献13】ACS Synth. Biol., 2014, 3 (1), pp 21-29
【非特許文献14】Microb Biotechnol. 2014 Jan;7(1):5-25
【非特許文献15】J. Biotechnol. 103:51-65, 2003
【非特許文献16】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【非特許文献17】Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726(1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、Ｌ－アミノ酸を高効率で生産する微生物を開発すべく鋭意研究した結果、異なる由来のタンパク質を導入するとＬ－アミノ酸の生産収率が増加するという事実を確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物を提供することを目的とする。
【0008】
また、本発明は、配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された微生物、又は前記タンパク質を含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産用組成物を提供することを目的とする。
【0009】
さらに、本発明は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からＬ－アミノ酸又はその前駆体を回収するステップとを含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法を提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本発明は、配列番号１もしくはその機能的フラグメントにおける、アミノ酸又はその前駆体生産増加用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0011】
本発明の配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物は、Ｌ－セリン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン及び／又はＯ－ホスホセリンを高効率で生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0013】
なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0014】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【0015】
本発明の目的を達成するための本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物を提供する。
【0016】
配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的フラグメントを含むタンパク質は、Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase）活性を有するタンパク質であってもよい。
【0017】
本発明における「Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase）」とは、主に次の化学反応を触媒する酵素を意味する。
【0018】
【化1】
【0019】
【化2】
【0020】
本発明の目的上、前記Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、ＳｅｒＡであってもよい。また、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。さらに、それに対応する活性を有し、かつ前記タンパク質が含まれるＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物とは異なる由来のタンパク質であればいかなるものでもよい。具体的には、前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質と混用されるが、これらに限定されるものではない。
【0021】
前記タンパク質は、配列番号１及び／又は配列番号１と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性（homology）もしくは同一性（identity）を有するアミノ酸配列であってもよい。また、そのような相同性もしくは同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する補助タンパク質も本発明に含まれることは言うまでもない。
【0022】
それに加えて、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。
【0023】
また、本発明の目的上、前記タンパク質は、前記タンパク質が含まれるＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物とは異なる由来であることを特徴とし、具体的にはアゾトバクター（Azotobacter）属由来、又はアゾトバクター属由来のタンパク質と同じタンパク質であってもよいが、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産を増加させるものであれば特に限定されるものではない。前記アゾトバクター（Azotobacter）属微生物は、より具体的にはアゾトバクター・アギリス（Azotobacter agilis）、アゾトバクター・アルメニアカス（Azotobacter armeniacus）、アゾトバクター・ベイジェリンキイ（Azotobacter beijerinckii）、アゾトバクター・クロオコッカム（Azotobacter chroococcum）、アゾトバクター属ＤＣＵ２６（Azotobacter sp. DCU26）、アゾトバクター属ＦＡ８（Azotobacter sp. FA8）、アゾトバクター・ニグリカンス（Azotobacter nigricans）、アゾトバクター・パスパリ（Azotobacter paspali）、アゾトバクター・サリネストリス（Azotobacter salinestris）、アゾトバクター・トロピカリス（Azotobacter tropicalis）又はアゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）であり、本発明の一例として、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）由来のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0024】
本発明における「機能的フラグメント」とは、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列を意味するものであり、前記タンパク質に相当する活性を有するものであれば、前記タンパク質のアミノ酸配列の一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明に含まれることは言うまでもなく、本発明の目的上、それらも機能的フラグメントといえる。
【0025】
本発明において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はポリペプチド」又は「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本発明に用いられることは言うまでもない。例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0026】
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。
【0027】
本発明の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0028】
本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包括する意味で用いられ、ポリヌクレオチドにおける基本構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形したアナログも含まれる（非特許文献１、２参照）。
【0029】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）由来のＤ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。あるいは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産を増加させる活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。
【0030】
前記ポリヌクレオチドは、例えば配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性もしくは同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、例えば配列番号１又は配列番号１と７０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９５又は配列番号９５のポリヌクレオチド配列と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【0031】
また、コドンの縮退（codon degeneracy）により、配列番号１又は配列番号１と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質又はそれと相同性もしくは同一性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも本発明に含まれることは言うまでもない。さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献３、４）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高い遺伝子同士、７０％以上、８０％以上、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本発明には、実質的に類似したポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
【0032】
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0033】
相同性（homology）及び同一性（identity）とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。
【0034】
相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
【0035】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
【0036】
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献５］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献６）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献７）。また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献３、４）で決定される。
【0037】
本発明における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物に導入されるか、微生物中に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。
【0038】
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物中の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む断片又はベクターが微生物に導入されてその活性が現れることであってもよい。「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
【0039】
本発明における「アミノ酸又はその前駆体」とは、前記タンパク質を用いて生産するアミノ酸又はその前駆体であって、セリン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、Ｌ－シスタチオニン、Ｌ－ホモシステイン、Ｏ－アセチルホモセリン、Ｏ－スクシニルホモセリン、Ｌ－ホモセリン及び／又はＯ－ホスホセリンが含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。本発明において、前記アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、微生物が各種炭素源から代謝過程を経て生産するあらゆるＬ－アミノ酸が含まれ、具体的にはＬ－セリン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン又はＬ－システインであり、前記前駆体は、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-acetylhomoserine sulfhydrylase）によりメチオニンに変換される前駆体（特許文献４）であるＯ－アセチルホモセリンもしくはＯ－スクシニルホモセリン（O-succinylhomoserine）、メチオニンの前駆体であるＬ－ホモセリン（L-homoserine）、Ｌ－ホモシステイン（L-homocysteine）、Ｌ－シスタチオニン（L-cystathionine）、Ｌ－システインの前駆体であるアセチルセリン（acetyl-serine）、及び／又はＯ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS）によりシステインに変換される前駆体であるＯ－ホスホセリンであるが、これらに限定されるものではない。前記アミノ酸又はその前駆体は、より具体的にはＬ－セリン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、Ｏ－ホスホセリン又はＬ－システインであるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
前記Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生合成を強化するために、本発明の配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を用いることができる。例えば、Ｌ－セリン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－ホモシステイン、Ｌ－シスタチオニン、アセチルセリン、Ｏ－アセチルホモセリン、Ｏ－スクシニルホモセリン、Ｌ－ホモセリン及び／又はＯ－ホスホセリンの生合成を強化するために、本発明の配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように微生物を改変することができる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を導入したり、その活性を強化することができる。さらに、特定タンパク質の活性を導入又は強化したり、特定タンパク質の活性を不活性化することにより、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産能を一層向上させることができる。
【0041】
具体的には、前記微生物は、さらに、ｉ）活性が低下したホスホセリンホスファターゼ、ｉｉ）活性が強化された３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、又はｉｉｉ）活性が低下したホスホセリンホスファターゼ及び活性が強化された３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼを含み、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0042】
前記微生物は、さらに、ｔｒｐオペロンの強化、トリプトファナーゼ（Tryptophanase; TnaA）の不活性化、Ｍｔｒ膜タンパク質（Mtr membrane protein; Mtr）の不活性化、又はそれらの組み合わせにより改変されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0043】
具体的には、前記微生物は、さらに、Ｌ－トリプトファン生産に関与するＬ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現を抑制するＴｒｐＲを不活性化することによりｔｒｐオペロンが強化されたものであってもよく、細胞の外部のＬ－トリプトファンを細胞内に流入させる役割を果たすトリプトファナーゼ（Tryptophanase; TnaA）、及び細胞内のＬ－トリプトファンと水分子をインドール（Indole）、ピルビン酸（pyruvate）、アンモニア（ＮＨ3）に分解する役割を果たすＭｔｒ膜タンパク質が不活性化されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0044】
さらに、本発明の目的上、前記微生物は、さらに、ｈｉｓオペロンが強化されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0045】
具体的には、前記微生物は、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒで導入したものであってもよい。前記Ｌ－ヒスチジン生合成ｃｌｕｓｔｅｒは、計４つのオペロン（operon）（ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ，ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ，ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ，ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ）に分離され、前記生合成遺伝子を一度に微生物中に導入するベクターを用いてｈｉｓオペロンを強化するものであるが、これに限定されるものではない。
【0046】
さらに、本発明の目的上、前記微生物は、さらに、ＭｃｂＲ（Transcriptional regulator; mcbR）の不活性化、メチオニンシンターゼ（Methionine synthase; meth）の強化、亜硫酸レダクターゼ［ＮＡＤＰＨ］ヘムタンパク質βコンポーネント（Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI）の強化、又はそれらの組み合わせにより改変されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0047】
具体的には、前記微生物は、さらに、メチオニンシステイン転写調節因子タンパク質であるＭｃｂＲの不活性化、メチオニン合成酵素であるメチオニンシンターゼ（Methionine synthase; Meth）の強化、亜硫酸レダクターゼ［ＮＡＤＰＨ］ヘムタンパク質βコンポーネント（Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component; cysI）の強化、又はそれらの組み合わせにより改変されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0048】
前記特定タンパク質及び／又は遺伝子の活性を導入、強化、不活性化する方法は、微生物が有する特徴に応じて、当該分野で公知の好適な方法により行うことができる。
【0049】
本発明におけるタンパク質の活性の「強化」とは、前記タンパク質の活性が導入されるか、内在性活性に比べて活性が増加することを意味する。前記活性の「導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定ポリペプチドの活性が自然に又は人為的に現れるようにすることを意味する。
【0050】
本発明におけるタンパク質の活性が内在性活性に比べて「増加」するとは、微生物が有するタンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。前記活性の増加は、外来タンパク質の導入により行うこともでき、内在性タンパク質の活性の強化により行うこともできる。前記タンパク質の活性の増加／強化は、遺伝子の発現の増加／強化により達成することができる。
【0051】
具体的には、本発明におけるタンパク質の活性の増加は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記タンパク質の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、又は５）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【0052】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体に挿入されることにより行われる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞に導入されることにより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
【0053】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
【0054】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターが連結されるが、前記強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献５，６）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献７）、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ１、ＳＰＬ７、ＳＰＬ１３プロモーター（特許文献８）、Ｏ２プロモーター（特許文献９）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【0055】
さらに、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行うことができる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。また、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、導入された前記外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化して宿主細胞に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドを発現することにより、タンパク質が産生されてその活性が増加する。
【0056】
最後に、５）前記１）～４）の組み合わせにより強化する改変は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現を増加させる発現調節配列の改変、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの改変の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行うことができる。
【0057】
本発明におけるタンパク質の活性の「低下」とは、タンパク質の活性が内在性活性に比べて減少するか、不活性化することを意味する。
【0058】
このようなタンパク質の活性の低下は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性を除去する場合をはじめとして、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が低い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記染色体上の遺伝子の転写産物に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に特に限定されるものではない。
【0059】
具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部を欠失させる方法は、微生物中の染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われる。例えば、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。また、前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なり、当業者が適宜決定することができ、具体的には１～３００個、より具体的には１～１００個、さらに具体的には１～５０個である。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
【0060】
また、発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より活性が低い核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0061】
また、染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、前記タンパク質の活性がさらに低下するように、遺伝子配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、活性がさらに低下するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
【0062】
本発明における「Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物」とは、培地中の炭素源からＬ－アミノ酸又はその前駆体を野生型又は非改変微生物と比較して過剰量で生産する微生物を意味する。あるいは、前記微生物とは、自然にＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産能を有する微生物、又はＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産能のない親株にＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変されたＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0063】
また、前記「Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が低下又は強化された微生物であって、目的とするＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物である。具体的には、前記微生物は、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物である。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物である。前記コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、これらに限定されるものではない。さらに具体的には、エシェリキア（Escherichia）属微生物はエシェリキア・コリ（Escherichia coli）であり、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（corynebacterium glutamicum）であるが、これらに限定されるものではない。
【0064】
本発明の目的上、前記微生物は、これらのタンパク質をはじめとする、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物であればいかなるものでもよい。
【0065】
本発明における前記「Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産する微生物」は、「Ｌ－アミノ酸又はその前駆体を生産できる微生物」、「Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産能を有する微生物」と混用される。
【0066】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された微生物、又は前記タンパク質を含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産用組成物を提供する。
【0067】
前記Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産用組成物とは、本発明のタンパク質によりＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産する組成物を意味する。前記組成物には、前記タンパク質、その機能的フラグメント、又は前記タンパク質を作動させることのできる構成が全て含まれる。
【0068】
本発明のさらに他の態様は、前記微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法を提供する。
【0069】
前記方法は、前記培地又はその培養物からＬ－アミノ酸又はその前駆体を回収するステップをさらに含んでもよい。
【0070】
前記方法において、前記微生物を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行われる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持する。培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産されたアミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
【0071】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含むが、これらに限定されるものではない。
【0072】
本発明の前記培養ステップで生産されたアミノ酸を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を回収（collect）することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするアミノ酸を回収することができるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。よって、前述したように回収されるアミノ酸は、精製された形態であってもよく、アミノ酸を含有する微生物発酵液であってもよい（非特許文献８）。
【0074】
さらに、本発明の目的上、前記アゾトバクター（Azotobacter）属微生物由来のＤ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼを発現するように改変された微生物は、セリン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン又はＯ－ホスホセリンが含まれるＬ－アミノ酸又はその前駆体の生産量が増加することを特徴とする。これは、野生型コリネバクテリウム属菌株がＬ－アミノ酸又はその前駆体を生産できないか、生産したとしても極微量しか生産できないのに対して、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産量を増加させることができることに意義がある。
【0075】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された微生物、又は前記タンパク質を含む組成物を用いた、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体の生産方法を提供する。
【0076】
配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質を発現するように改変された微生物、及びそれを含む微生物については前述した通りである。
【0077】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１もしくはその機能的フラグメントを含むタンパク質における、Ｌ－アミノ酸又はその前駆体生産増加用途を提供する。
【0078】
配列番号１もしくはその機能的フラグメント、Ｌ－アミノ酸、及びその前駆体については前述した通りである。
【実施例】
【0079】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない内容は、当業者であれば十分に認識、類推できるものであるので、その説明を省略する。
【実施例1】
【0080】
アゾトバクター（Azotobacter）由来の３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, serA(Avn)）過剰発現ベクターの作製
アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）由来のＤ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 以下、「ＳｅｒＡ（Ａｖｎ）」という）を強化した場合にセリン及びＯＰＳ生産能が向上するか否かを確認するために、発現ベクターを作製した。
アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）由来のＤ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 以下、「ＳｅｒＡ（Ａｖｎ）」という）を強化した場合にセリン及びＯＰＳ生産能が向上するか否かを確認するために、発現ベクターを作製した。
【0081】
ＳｅｒＡ（Ａｖｎ）をコードする遺伝子ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）（配列番号１）の発現のために、ｐＣＬ１９２０ベクター（GenBank No. AB236930）を用いた。また、発現プロモーターとしてｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）を用いて、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）の形態のベクターを作製した。
【0082】
対照群としては、セリンに対するフィードバック阻害が解除された大腸菌由来の３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼを含むベクターを作製し、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）と命名した。前記各ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表１に示す。
【0083】
【表1】
【0084】
両ベクターの作製に共通して用いられるＰｔｒｃ ＰＣＲには配列番号２及び３のプライマーを用いた。具体的には、外来ｓｅｒＡ（Ａｖｎ） ＰＣＲには配列番号４及び５のプライマーを用い、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ） ＰＣＲには配列番号６及び７のプライマーを用いた。増幅したＰｔｒｃ及び各遺伝子の断片ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）は、それぞれｓｍａＩの制限酵素で処理したｐＣＬ１９２０ベクターとギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングし、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）とｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）を作製した。
【実施例2】
【0085】
大腸菌野生型菌株にアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株の作製及びセリン生産能の評価
親株として大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０を用いて、実施例１で作製した２種のプラスミドをそれぞれＷ３１１０に導入した菌株を作製し、セリン生産能を評価した。
親株として大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０を用いて、実施例１で作製した２種のプラスミドをそれぞれＷ３１１０に導入した菌株を作製し、セリン生産能を評価した。
【0086】
各菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、その後３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を表２の力価培地２５ｍｌに接種し、次いでこれを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養した。その結果を表３に示す。
【0087】
【表2】
【0088】
【表3】
【0089】
表３に示すように、セリンに対するフィードバック阻害が解除されて活性も強化されたｓｅｒＡを含むＷ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株は、野生型に比べてセリン生産量が６０％も増加した。それに対して、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含むＷ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）は、Ｗ３１１０に比べてセリン生産量が１６０％増加し、Ｗ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）に比べて６２．５％増加することが確認された。
【実施例3】
【0090】
ｓｅｒＢの低下及び外来アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株の作製及びＯＰＳ生産能の評価
大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０において内在性ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase, SerB）の活性が低下したＯ－ホスホセリン（ＯＰＳ）生産微生物、ＫＣＣＭ１１２１２Ｐ（「ＣＡ０７－００１２」と命名した；特許文献１０，１１）を準備した。
大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０において内在性ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase, SerB）の活性が低下したＯ－ホスホセリン（ＯＰＳ）生産微生物、ＫＣＣＭ１１２１２Ｐ（「ＣＡ０７－００１２」と命名した；特許文献１０，１１）を準備した。
【0091】
実施例１で作製した２種のプラスミドをそれぞれ前記ＣＡ０７－００１２に導入した菌株を作製し、ＯＰＳ生産能を評価した。
【0092】
各菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、その後３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を表４の力価培地２５ｍｌに接種し、次いでこれを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養した。その結果を表５に示す。
【0093】
【表4】
【0094】
【表5】
【0095】
表５に示すように、セリンに対するフィードバック阻害が解除されて活性も強化されたｓｅｒＡを含むＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株は、野生型に比べてＯＰＳ生産量が５７％増加した。アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含むＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）は、野生型に比べてＯＰＳ生産量が１０７％増加し、ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）に比べて３２％増加することが確認された。
【実施例4】
【0096】
アゾトバクター（Azotobacter）由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）及び大腸菌由来のｓｅｒＣの同時過剰発現ベクターの作製
大腸菌由来の３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（3-phosphoserine aminotransferase, serC）を過剰発現する菌株にｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合にセリン及びＯＰＳ生産能がさらに向上するか否かを確認するために、ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）とｓｅｒＣをオペロンの形態で発現するｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣの形態のベクターを作製した。
大腸菌由来の３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（3-phosphoserine aminotransferase, serC）を過剰発現する菌株にｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合にセリン及びＯＰＳ生産能がさらに向上するか否かを確認するために、ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）とｓｅｒＣをオペロンの形態で発現するｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣの形態のベクターを作製した。
【0097】
その陽性対照群として、大腸菌由来のｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）とｓｅｒＣを同時に発現する微生物を作製するために、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣベクターを作製した。前記各ベクターを作製するために用いたプライマー配列を表６に示す。
【0098】
【表6】
【0099】
Ｐｔｒｃ＿ｓｅｒＡ（Ａｖｎ） ＰＣＲには、実施例１で作製したｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を鋳型とし、配列番号２及び８のプライマーを用い、Ｐｔｒｃ＿ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ） ＰＣＲには、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）を鋳型とし、配列番号２及び１１のプライマーを用いた。両ベクターの作製に共通して用いられる大腸菌由来の（ＲＢＳ）ｓｅｒＣは、ｗ３１１０ゲノミックＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーを用いたＰＣＲにより得た。
【0100】
増幅したＰｔｒｃ＿ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）及び（ＲＢＳ）ｓｅｒＣの断片と、Ｐｔｒｃ＿ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）及び（ＲＢＳ）ｓｅｒＣの断片は、それぞれｓｍａＩの制限酵素で処理したｐＣＬ１９２０ベクターとギブソンアセンブリ（非特許文献９）方法を用いてクローニングし、ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣとｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣを作製した。
【実施例5】
【0101】
ｓｅｒＣの強化及びアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株の作製及びセリン生産能の評価
ｓｅｒＣを過剰発現する菌株にアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合のセリン生産能を評価するために、実施例４で作製した２種のプラスミドをそれぞれＷ３１１０に導入した。
ｓｅｒＣを過剰発現する菌株にアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合のセリン生産能を評価するために、実施例４で作製した２種のプラスミドをそれぞれＷ３１１０に導入した。
【0102】
各菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、その後３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を表７の力価培地２５ｍｌに接種し、次いでこれを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養した。その結果を表８に示す。
【0103】
【表7】
【0104】
【表8】
【0105】
表８に示すように、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）を含むｗ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ菌株に比べて、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含むｗ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣのＬ－セリン生産量のほうが高いことが確認された。すなわち、Ｌ－セリン生産能が増加した菌株においても、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含む場合にＬ－セリン生産能がさらに増加することが確認された。
【0106】
前記ｗ３１１０／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ菌株をＣＡ０７－４３８３と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月９日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２３８１Ｐとして国際寄託した。
【実施例6】
【0107】
ｓｅｒＢの低下、ｓｅｒＣの強化、及びアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株の作製及びＯＰＳ生産能の評価
ｓｅｒＢの活性が低下してｓｅｒＣを過剰発現する菌株にアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合のセリン生産能を評価するために、実施例４で作製した２種のプラスミドをそれぞれＣＡ０７－００１２に導入した菌株を作製し、ＯＰＳ生産能を評価した。
ｓｅｒＢの活性が低下してｓｅｒＣを過剰発現する菌株にアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した場合のセリン生産能を評価するために、実施例４で作製した２種のプラスミドをそれぞれＣＡ０７－００１２に導入した菌株を作製し、ＯＰＳ生産能を評価した。
【0108】
各菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、その後３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を表９の力価培地２５ｍｌに接種し、次いでこれを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養した。その結果を表１０に示す。
【0109】
【表9】
【0110】
【表10】
【0111】
表１０に示すように、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）を含むＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ菌株に比べて、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含むＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）－（ＲＢＳ）ｓｅｒＣのＯＰＳ生産量のほうが高いことが確認された。すなわち、Ｌ－セリン生産能が増加した菌株においても、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を含む場合にＬ－セリン生産能がさらに増加することが確認された。
【実施例7】
【0112】
アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したエシェリキア属菌株の作製及びトリプトファン生産能の評価
実施例７－１：Ｌ－トリプトファンを生産するエシェリキア属微生物の作製
エシェリキア属Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生型の大腸菌Ｗ３１１０から開発した。Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質を発現するように改変することによりＬ－トリプトファン生産量が画期的に増加するかを確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するように作製した菌株を親株として用いた。具体的には、コリスメート（Chorismate）からのＬ－トリプトファン生産に関与するＬ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現は、ＴｒｐＲにより抑制される。よって、それをコードするｔｒｐＲ遺伝子を除去した。また、Ｌ－トリプトファン生産向上に伴うＴｒｐＥポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＴｒｐＥのＮ末端から２１番目のアミノ酸であるプロリン（Proline）をセリン（Serine）に置換した（非特許文献１０）。
実施例７－１：Ｌ－トリプトファンを生産するエシェリキア属微生物の作製
エシェリキア属Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生型の大腸菌Ｗ３１１０から開発した。Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質を発現するように改変することによりＬ－トリプトファン生産量が画期的に増加するかを確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するように作製した菌株を親株として用いた。具体的には、コリスメート（Chorismate）からのＬ－トリプトファン生産に関与するＬ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現は、ＴｒｐＲにより抑制される。よって、それをコードするｔｒｐＲ遺伝子を除去した。また、Ｌ－トリプトファン生産向上に伴うＴｒｐＥポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＴｒｐＥのＮ末端から２１番目のアミノ酸であるプロリン（Proline）をセリン（Serine）に置換した（非特許文献１０）。
【0113】
Ｍｔｒ膜タンパク質は細胞の外部のＬ－トリプトファンを細胞内に流入させる役割を果たし、ＴｎａＡタンパク質は細胞内のＬ－トリプトファンと水分子をインドール（Indole）、ピルビン酸（pyruvate）、アンモニア（ＮＨ３）に分解する役割を果たす。よって、Ｌ－トリプトファン生産を阻害して分解するｍｔｒ遺伝子とｔｎａＡ遺伝子を除去した。
【0114】
このような遺伝子の除去のために、ラムダレッド組換え（λ-red recombination, 非特許文献１１）方法を用いた。ｍｔｒ遺伝子の除去のために、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号１２と配列番号１３のプライマーを用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体の相同組換えが生じるｍｔｒ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。ｐＫＤ４ベクターのカナマイシン抗生剤マーカーは、ターゲット遺伝子の除去及び抗生剤遺伝子挿入の確認のために用いた。ＦＲＴ部位は、ターゲット遺伝子を除去した後に抗生剤マーカーを除去する役割を果たす。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0115】
【表11】
【0116】
ラムダレッドリコンビナーゼ（ｇａｍ，ｂｅｔ，ｅｘｏ）を発現するｐＫＤ４６ベクターを大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ｐＫＤ４６ベクターの形質転換が確認された大腸菌Ｗ３１１０菌株は、３０℃でＯＤ６００が約０．１になったときに１０ｍＭのＬ－アラビノース（L-arabinose）添加により組換え酵素発現を誘導し、ＯＤ６００が約０．６になったときにコンピテントセルを準備し、その後上記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｍｔｒ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片をエレクトロポレーションにより形質転換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号１４と配列番号１５を用いてコロニーＰＣＲを行い、７８２ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
【0117】
【表12】
【0118】
相同組換えが生じてｍｔｒ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルを準備し、その後ｐＣＰ２０ベクターを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。ｐＣＰ２０ベクターは、ＦＬＰタンパク質を発現し、カナマイシン抗生剤の両側のＦＲＴ部位を認識して染色体上に結合することにより、ＦＲＴ部位間の抗生剤マーカーを除去する。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ampicillin）と２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）を含むＬＢ固体培地で成長したｐＣＰ２０ベクター形質転換菌株を３０℃のＬＢ液体培地で１時間培養し、その後４２℃で１５時間追加培養してＬＢ固体培地に塗抹した。生育したコロニーは、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ampicillin）と２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）を含むＬＢ固体培地、１２．５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地、抗生剤を含まないＬＢ固体培地に培養し、抗生剤を含まないＬＢ固体培地でのみ生育したコロニーを選択した。ゲノムシーケンシングによりｍｔｒ遺伝子の除去を最終確認し、それをＣＡ０４－９３００と命名した。
【0119】
ｔｎａＡ遺伝子の除去のために、上記方法と同様に遺伝子操作を行った。ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号１６と配列番号１７を用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体の相同組換えが生じるｔｎａＡ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0120】
【表13】
【0121】
ｐＫＤ４６ベクターの形質転換を確認し、１０ｍＭのＬ－アラビノース添加により組換え酵素を発現するＣＡ０４－９３００菌株は、エレクトロポレーションにより上記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｔｎａＡ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片を形質転換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号１４と配列番号１８を用いてコロニーＰＣＲを行い、７８７ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
【0122】
相同組換えが生じてｔｎａＡ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルを準備し、その後ｐＣＰ２０ベクターを形質転換し、ＦＬＰタンパク質の発現によりカナマイシン抗生剤マーカーが除去された菌株を作製した。ゲノムシーケンシングによりｔｎａＡ遺伝子の除去を最終確認し、それをＣＡ０４－９３０１と命名した。
【0123】
ｔｒｐＲ遺伝子の除去のために、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０のプライマーを用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体の相同組換えが生じるｔｒｐＲ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0124】
【表14】
【0125】
ｐＫＤ４６ベクターの形質転換を確認し、１０ｍＭのＬ－アラビノース添加により組換え酵素を発現するＣＡ０４－９３０１菌株は、エレクトロポレーションにより上記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｔｒｐＲ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片を形質転換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号１４と配列番号２１のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、８３８ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
【0126】
相同組換えが生じてｔｒｐＲ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルを準備し、その後ｐＣＰ２０ベクターを形質転換し、ＦＬＰタンパク質の発現によりカナマイシン抗生剤マーカーが除去された菌株を作製した。ゲノムシーケンシングによりｔｒｐＲ遺伝子の除去を最終確認し、それをＣＡ０４－９３０７と命名した。
【0127】
前記ＣＡ０４－９３０７菌株において、ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｒｐＥ形質を持たせるために、大腸菌Ｗ３１１０ ｇＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩを含む配列番号２２、配列番号２３を用いて、ＥｃｏＲＩ配列を含むｔｒｐＥ遺伝子断片（１５７５ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0128】
【表15】
【0129】
上記方法で得たｔｒｐＥ遺伝子及びｐＳＧ７６－Ｃプラスミド（非特許文献１２）をそれぞれＥｃｏＲＩ制限酵素で処理してクローニングした。クローニングしたプラスミドを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションにより形質転換し、クロラムフェニコール（chloramphenicol）２５μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートから形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選択してｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥプラスミドを得た。
【0130】
前述したように得たｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥプラスミドを用いて、ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Stratagene, 米国）方法により配列番号２４、配列番号２５のプライマーでｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）を作製した。
【0131】
【表16】
【0132】
ＣＡ０４－９３０７菌株にｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）プラスミドを形質転換してＬＢ－Ｃｍ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ２５ｕｇ／Ｌ）培地で培養し、その後クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選択した。選択した形質転換体は、ｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）プラスミドがゲノム内のｔｒｐＥ部分に１次挿入された菌株である。確保したｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）遺伝子を挿入した菌株に、ｐＳＧ７６－Ｃプラスミド内に存在するＩ－ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩを発現するプラスミドであるｐＡＳｃｅｐ（非特許文献１２）を形質転換し、ＬＢ－Ａｐ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ １００ｕｇ／Ｌ）で生長する菌株を選択した。選択した菌株において、配列番号２２、配列番号２３のプライマーを用いてｔｒｐＥ遺伝子を増幅し、増幅した遺伝子は、シーケンシングによりｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）に交換されたことを確認した。このように作製した菌株をＣＡ０４－４３０３と命名した。
【0133】
実施例７－２：アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したエシェリキア属微生物の作製及びトリプトファン生産能の評価
実施例１で作製したｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターと対照群としてのｐＣＬ１９２０ベクターを実施例１で作製したＣＡ０４－４３０３に導入し、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）菌株を作製した。この２つの菌株ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）のＬ－トリプトファン生産量を確認するために、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン（Spectinomycin）を含むＬＢ液体培地に１２時間培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに初期ＯＤ６００値が０．０１になるように接種し、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
実施例１で作製したｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターと対照群としてのｐＣＬ１９２０ベクターを実施例１で作製したＣＡ０４－４３０３に導入し、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）菌株を作製した。この２つの菌株ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）のＬ－トリプトファン生産量を確認するために、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン（Spectinomycin）を含むＬＢ液体培地に１２時間培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに初期ＯＤ６００値が０．０１になるように接種し、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
【0134】
ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０とＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）における培地中のＬ－トリプトファン生産の結果を表１７に示す。ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０菌株は、１．２ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産し、中間産物として３７ｍｇ／Ｌのインドールが蓄積されたが、前述したようにｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株は、インドールが蓄積されることなく、１．７ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産した。
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース７０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，酵母抽出物２．５ｇ，Ｎａ－ｃｉｔｒａｔｅ ５ｇ，ＮａＣｌ １ｇ，ＣａＣＯ３ ４０ｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース７０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，酵母抽出物２．５ｇ，Ｎａ－ｃｉｔｒａｔｅ ５ｇ，ＮａＣｌ １ｇ，ＣａＣＯ３ ４０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0135】
【表17】
【0136】
これらの結果から分かるように、ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）の導入によりＬ－セリンの供給が円滑になったものと推測され、Ｌ－トリプトファン生合成の最後のステップの中間産物であるインドールが蓄積されず、Ｌ－トリプトファン収率も向上することが確認された。
【0137】
実施例７－３：外来アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したトリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の作製
前述したようなアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子の効果をコリネバクテリウム属トリプトファン生産菌株においても確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム属菌株としてＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（特許文献１２）を用いた。
前述したようなアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子の効果をコリネバクテリウム属トリプトファン生産菌株においても確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム属菌株としてＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（特許文献１２）を用いた。
【0138】
コリネバクテリウム・グルタミカムｓｅｒＡ（以下、ｓｅｒＡ（Ｃｇｌ））遺伝子をアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子に置換し、ｇａｐＡプロモーターにより発現するように菌株を作製した。
【0139】
このような遺伝子操作のために、まず染色体の相同組換え（Homologous recombination）が生じるｓｅｒＡ（Ｃｇｌ）遺伝子のプロモーターの上流（Upstream）領域とｓｅｒＡ（Ｃｇｌ）遺伝子のＯＲＦの下流（Downsteam）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２６と配列番号２７のプライマーを用いて、プロモーターの上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号２８と配列番号２９のプライマーを用いて、下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。また、ｇａｐＡプロモーター部位も、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３０と配列番号３１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【0140】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0141】
アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子部分は、実施例１で作製したｐＣＬ－Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターを鋳型とし、配列番号３２と配列番号３３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【0142】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0143】
染色体の相同組換えが生じるように増幅した上流領域と下流領域、ｇａｐＡプロモーター、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子、及びＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0144】
作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターを、Ｌ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｓｅｒＡ（Ｃｇｌ）遺伝子をｇａｐＡプロモーターにより発現するアゾトバクターｓｅｒＡ遺伝子に置換した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号３４と配列番号３５のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＫＣＣＭ１２２１８Ｐ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）と命名した。
【0145】
本実施例で用いたプライマーの配列を表１８に示す。
【0146】
【表18】
【0147】
実施例７－４：アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株のトリプトファン生産能の評価
実施例７－３で作製したＫＣＣＭ１２２１８Ｐ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）菌株と親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐのトリプトファン生産量を確認するために次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
実施例７－３で作製したＫＣＣＭ１２２１８Ｐ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）菌株と親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐのトリプトファン生産量を確認するために次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0148】
【表19】
【0149】
ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）における培養物中のＬ－トリプトファン生産の結果を表１９に示す。
【0150】
親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐ菌株は、２．５ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産し、中間産物として５９ｍｇ／Ｌのインドールが蓄積されたが、前述したようにｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株は、インドールが蓄積されることなく、３．１ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産した。
【0151】
これらの結果から、Ｌ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株においても、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）の導入によりＬ－セリンの供給が円滑になったものと推測され、よってＬ－トリプトファン生合成の最後のステップの中間産物であるインドールが蓄積されず、Ｌ－トリプトファン収率も向上することが確認された。このように前駆体が向上すると、トリプトファンの生産においてシナジー効果が大きくなることが分かる。
【0152】
前記ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）菌株をＣＭ０５－８９３５と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４１４Ｐとして国際寄託した。
【実施例8】
【0153】
アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の作製及びヒスチジン生産能の評価
実施例８－１：ヒスチジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカムＬ－ヒスチジン生産菌株は、野生型ＡＴＣＣ１３０３２菌株から開発した。Ｌ－ヒスチジン生合成経路の最初の酵素であるＨｉｓＧポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＨｉｓＧのＮ末端から２３３番目と２３５番目のアミノ酸をそれぞれグリシン（Glycine）からヒスチジン（histidine）に、トレオニン（Threonine）からグルタミン（Glutamine）に同時置換した（配列番号８８）（非特許文献１３）。また、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子（ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ－ｈｉｓＮ）をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒに作製して導入した（配列番号８９）。
実施例８－１：ヒスチジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカムＬ－ヒスチジン生産菌株は、野生型ＡＴＣＣ１３０３２菌株から開発した。Ｌ－ヒスチジン生合成経路の最初の酵素であるＨｉｓＧポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＨｉｓＧのＮ末端から２３３番目と２３５番目のアミノ酸をそれぞれグリシン（Glycine）からヒスチジン（histidine）に、トレオニン（Threonine）からグルタミン（Glutamine）に同時置換した（配列番号８８）（非特許文献１３）。また、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子（ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ－ｈｉｓＮ）をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒに作製して導入した（配列番号８９）。
【0154】
このような遺伝子操作のために、まず染色体の相同組換え（Homologous recombination）が生じるｈｉｓＧの２３３番目、２３５番目の変異の上流（Upstream）領域及び下流（Downsteam）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３６と配列番号３７のプライマーを用いて、ｈｉｓＧの２３３番目、２３５番目の変異の上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号３８と配列番号３９のプライマーを用いて、ｈｉｓＧの２３３番目、２３５番目の変異の下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0155】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0156】
増幅したｈｉｓＧの２３３番目、２３５番目の変異の上流領域と下流領域、及びＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺ（特許文献２）は、ギブソンアセンブリ（非特許文献９）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ）と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0157】
作製したｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ）ベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でｈｉｓＧの２３３番目、２３５番目のアミノ酸を、それぞれグリシンからヒスチジンに置換し、トレオニンからグルタミンに置換（配列番号８８）した菌株を得た。遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号４０と配列番号４１を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ１４－００１１と命名した。
【0158】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２０に示す。
【0159】
【表20】
【0160】
また、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒに作製して導入した。具体的には、前記Ｌ－ヒスチジン生合成ｃｌｕｓｔｅｒは、計４つのオペロン（operon）（ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ，ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ，ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ，ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ）に分離されており、前記生合成遺伝子を一度に微生物中に導入するベクターを作製した。
【0161】
また、前記生合成ｃｌｕｓｔｅｒの挿入部位には、γ－アミノ酪酸パーミアーゼをコードするＮＣｇｌ１１０８遺伝子（非特許文献１４）を用いた。
【0162】
このような遺伝子操作のために、まず染色体の相同組換え（Homologous recombination）が生じるＮＣｇｌ１１０８の上流（Upstream）領域及び下流（Downsteam）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４２と配列番号４３のプライマーを用いて、ＮＣｇｌ１１０８の上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号４４と配列番号４５のプライマーを用いて、ＮＣｇｌ１１０８の下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0163】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0164】
増幅したＮＣｇｌ１１０８の上流領域と下流領域、及びＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺ（特許文献２）は、ギブソンアセンブリ（非特許文献９）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－△ＮＣｇｌ１１０８と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0165】
作製したｐＤＺ－△ＮＣｇｌ１１０８ベクターをＣＡ１４－００１１菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でＮＣｇｌ１１０８遺伝子が破砕した菌株を得た。遺伝子が破砕した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号４６と配列番号４７を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ１４－０７３６と命名した。
【0166】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２１に示す。
【0167】
【表21】
【0168】
また、生合成ｃｌｕｓｔｅｒの強化のために、４つのオペロン遺伝子群と置換するプロモーター部分を確保した。改良型ｌｙｓＣプロモーター（以下、ｌｙｓＣＰ１，特許文献１３）部位とｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ部位、ｇａｐＡプロモーター部位とｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ部位、ＳＰＬ１３合成プロモーター（特許文献８）部位とｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ部位、ＣＪ７合成プロモーター（特許文献５，６）部位とｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ部位を得た。具体的には、ＫＣＣＭ１０９１９Ｐ菌株（特許文献１３）の染色体を鋳型とし、配列番号４８と配列番号４９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のための重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い、こうして増幅したＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製し、ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位を得た。コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１４－００１１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５０と配列番号５１のプライマーを用いて、ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ部位の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。配列番号５２と配列番号５３のプライマーを用いて、ｇａｐＡプロモーター部位をＰＣＲにより得て、配列番号５４と配列番号５５のプライマーを用いて、ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ部位の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。また、合成作製したプロモーターＳＰＬ１３を鋳型とし、配列番号５６と配列番号５７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１４－００１１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５８と配列番号５９のプライマーを用いて、ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ部位の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。さらに、合成作製したプロモーターＣＪ７を鋳型とし、配列番号６０と配列番号６１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１４－００１１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６２と配列番号６３のプライマーを用いて、ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ部位の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0169】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２２に示す。
【0170】
【表22】
【0171】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１８０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0172】
増幅したｌｙｓＣＰ１部位とｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ部位、ｇａｐＡプロモーター部位とｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ部位、ＳＰＬ１３合成プロモーター部位とｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ部位、ＣＪ７合成プロモーター部位とｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ部位、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺ－△ＮＣｇｌ１１０８は、ギブソンアセンブリ（非特許文献９）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－△ＮＣｇｌ１１０８：：ｌｙｓＣＰ１＿ｈｉｓＥＧ－ＰｇａｐＡ＿ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦＩ－ＳＰＬ１３＿ＨｉｓＤＣＢ－ＣＪ７＿ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0173】
作製したｐＤＺ－△ＮＣｇｌ１１０８：：ＰｌｙｓＣｍ１＿ｈｉｓＥＧ－ＰｇａｐＡ＿ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦＩ－ＳＰＬ１３＿ＨｉｓＤＣＢ－ＣＪ７＿ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮベクターをＣＡ１４－００１１菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で生合成遺伝子を挿入した菌株を得た。遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号４６と配列番号４７を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ１４－０７３７と命名した。
【0174】
前記ＣＡ１４－０７３７菌株は、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４１１Ｐとして国際寄託した。
【0175】
実施例８－２：外来アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したＨｉｓ生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム微生物菌株の作製
前述したアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子のＬ－ヒスチジン生産能の向上効果を確認するために、ＣＡ１４－０７３７菌株を実施例に用いた。
前述したアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子のＬ－ヒスチジン生産能の向上効果を確認するために、ＣＡ１４－０７３７菌株を実施例に用いた。
【0176】
実施例７－３で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を用いて、ｓｅｒＡ（Ｃｇｌ）遺伝子をアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子に置換し、ｇａｐＡプロモーターにより発現するように菌株を作製した。
【0177】
ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターを、Ｌ－ヒスチジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１４－０７３７菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、ｓｅｒＡ（Ｃｇｌ）遺伝子を強いプロモーターであるｇａｐＡプロモーターにより発現するアゾトバクターｓｅｒＡ遺伝子に置換した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号３４と配列番号３５のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ１４－０７３８と命名した。
【0178】
実施例８－３：アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株のＬ－ヒスチジン生産能の評価
実施例８－１、８－２で作製したＣＡ１４－００１１菌株、ＣＡ１４－０７３６菌株、ＣＡ１４－０７３７菌株、ＣＡ１４－０７３８菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－ヒスチジンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，酵母抽出物３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、チアミン１００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
実施例８－１、８－２で作製したＣＡ１４－００１１菌株、ＣＡ１４－０７３６菌株、ＣＡ１４－０７３７菌株、ＣＡ１４－０７３８菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－ヒスチジンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，酵母抽出物３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、チアミン１００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0179】
【表23】
【0180】
コリネバクテリウム・グルタミカムＬ－ヒスチジン生産菌株の培養物中のＬ－ヒスチジン生産の結果を表２３に示す。
【0181】
ヒスチジン生産能を増加させた親株のＣＡ１４－０７３７菌株は、４．０９ｇ／ＬのＬ－ヒスチジンを生産したが、前記ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入したＣＡ１４－０７３８菌株は、前記ＣＡ１４－０７３７に比べて２０％も増加した５．０７ｇ／ＬのＬ－ヒスチジンを生産した。
【0182】
これらの結果から、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）の導入によりＬ－ヒスチジン生産能が向上することが確認された。前記ＣＡ１４－０７３８菌株は、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４１２Ｐとして国際寄託した。
【実施例9】
【0183】
アゾトバクターｓｅｒＡを導入したメチオニン（Ｍｅｔ）生産菌株の作製及び評価
実施例９－１：ｍｃｂＲ遺伝子の欠損のための組換えベクターの作製
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において公知のメチオニンシステイン転写調節因子タンパク質をコードするｍｃｂＲ（非特許文献１５）を不活性化するベクターを作製した。
実施例９－１：ｍｃｂＲ遺伝子の欠損のための組換えベクターの作製
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において公知のメチオニンシステイン転写調節因子タンパク質をコードするｍｃｂＲ（非特許文献１５）を不活性化するベクターを作製した。
【0184】
具体的には、ｍｃｂＲ遺伝子をコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２の染色体上で欠損させるために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｃｂＲ遺伝子及び周辺配列（配列番号９１）を確保した。
【0185】
ｍｃｂＲ遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６４及び６５、配列番号６６及び６７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【0186】
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献２）と前述したように増幅したｍｃｂＲ遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでＤＮＡ接合酵素を用いて連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＺ－△ｍｃｂＲと命名した。
【0187】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２４に示す。
【0188】
【表24】
【0189】
実施例９－２：ｍｅｔＨとｃｙｓＩを同時に強化する組換えベクターの作製
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において公知のメチオニン合成酵素をコードするｍｅｔＨ（Ｎｃｇｌ１４５０）と、亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＩ（Ｎｃｇｌ２７１８）を同時に強化するためのベクターを作製した。
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において公知のメチオニン合成酵素をコードするｍｅｔＨ（Ｎｃｇｌ１４５０）と、亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＩ（Ｎｃｇｌ２７１８）を同時に強化するためのベクターを作製した。
【0190】
具体的には、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子をコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２の染色体上に追加挿入するために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｅｔＨ遺伝子及び周辺配列（配列番号９２）、ｃｙｓＩ遺伝子及び周辺配列（配列番号９３）を確保した。
【0191】
まず、これらを挿入するために、Ｎｃｇｌ１０２１（Transposase）を除去するためのベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのＮｃｇｌ１０２１及び周辺配列（配列番号９４）を確保した。Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６８及び６９、配列番号７０及び７１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれＤＮＡ断片が得られた。コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献２）と前述したように増幅したＮｃｇｌ１０２１遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｘｂａＩで処理し、次いでギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングし、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１と命名した。
【0192】
次に、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７２及び７３、配列番号７４及び７５のプライマーを用いてＰＣＲを行い、また、ｍｅｔＨ遺伝子の発現を強化するために、Ｐｃｊ７プロモーターを用い、ｃｙｓＩ遺伝子の発現を強化するために、Ｐｓｐｌ１プロモーターを用い、それらを得るために、Ｐｃｊ７は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７６、７７を用いてＰＣＲを行い、Ｐｓｐｌ１は、公知のｓｐｌ１－ＧＦＰ（特許文献８）ベクターＤＮＡを鋳型とし、配列番号７８、７９を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩ遺伝子、Ｐｃｊ７プロモーター及びＰｓｐｌ１プロモーターのＤＮＡ断片が得られた。
【0193】
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１ベクターを制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いで前述したように増幅した４つのＤＮＡ断片を染色体導入用制限酵素ｓｃａＩで処理し、次いでギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングし、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩと命名した。
【0194】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２５に示す。
【0195】
【表25】
【0196】
実施例９－３：Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ生産菌株の開発及びそれを用いたＬ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅの生産
前述したように作製したｐＤＣ－△ｍｃＢＲ、ｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１及びｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献１６）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。前記２次組換えが終了したコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号８０、８１のプライマーを用いたＰＣＲによりｍｃＢＲ遺伝子が欠損した菌株を確認し、また、配列番号８２、８３のプライマーを用いて、Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子が欠損した菌株及びＮｃｇｌ１０２１の位置にＰｃｊ７－ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ遺伝子が正確に挿入されたか否かを確認した。本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩと命名した。
前述したように作製したｐＤＣ－△ｍｃＢＲ、ｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１及びｐＤＺ－△Ｎｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩベクターを染色体上での相同組換えによりＡＴＣＣ１３０３２菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献１６）。その後、スクロースを含む固体培地で２次組換えを行った。前記２次組換えが終了したコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、配列番号８０、８１のプライマーを用いたＰＣＲによりｍｃＢＲ遺伝子が欠損した菌株を確認し、また、配列番号８２、８３のプライマーを用いて、Ｎｃｇｌ１０２１遺伝子が欠損した菌株及びＮｃｇｌ１０２１の位置にＰｃｊ７－ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ遺伝子が正確に挿入されたか否かを確認した。本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩと命名した。
【0197】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２６に示す。
【0198】
【表26】
【0199】
前述したように作製した１３０３２／ΔｍｃｂＲ、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、ＣＪＰ１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株と共に次の方法で培養した。
【0200】
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２と発明菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3 １２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3 １２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0201】
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表２７に示す。
【0202】
【表27】
【0203】
その結果、ｍｃｂＲ単独除去菌株は、対照群菌株に比べてＬ－メチオニン生産能が０．１２ｇ／Ｌ向上することが確認された。また、ｍｃｂＲが欠損せず、ｍｅｔＨ及びｃｙｓＩを過剰発現する菌株は、対照群菌株に比べてＬ－メチオニン生産能が０．１８ｇ／Ｌ向上することが確認された。
【0204】
実施例９－４：アゾトバクター（Azotobacter）由来の３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, serA(Avn)）過剰発現ベクターの作製
アゾトバクター由来の３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 以下、「ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）」という）を強化するとメチオニン生産能が向上するか否かを確認するために、発現ベクターを作製した。
アゾトバクター由来の３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 以下、「ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）」という）を強化するとメチオニン生産能が向上するか否かを確認するために、発現ベクターを作製した。
【0205】
ＳｅｒＡ（Ａｖｎ）をコードする遺伝子ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）（配列番号１）の発現のために、コリネバクテリウム・グルタミカムへの形質転換に使用可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（非特許文献１７又は特許文献１４）を用いた。発現プロモーターとしてｓｐｌ１プロモーター（以下、Ｐｓｐｌ１）を用いて、ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）形態のベクターを作製した。Ｐｓｐｌ１プロモーターＰＣＲには配列番号８４及び８５を用い、外来ｓｅｒＡ（Ａｖｎ） ＰＣＲには配列番号８６及び８７のプライマーを用いた。増幅したＰｓｐｌ１及びｓｅｒＡ（Ａｖｎ）遺伝子断片をＥｃｏＲＶの制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７ベクターとギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングし、ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を作製した。
【0206】
本実施例で用いたプライマーの配列を表２８に示す。
【0207】
【表28】
【0208】
実施例９－５：Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ生産株に大腸菌野生型菌株を用いたアゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入した菌株の作製及びＬ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ生産能の評価
前述したように作製したｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターを１３０３２／ΔｍｃｂＲ及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献１６）。本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））と命名した。
前述したように作製したｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）ベクターを１３０３２／ΔｍｃｂＲ及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換した（非特許文献１６）。本組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））と命名した。
【0209】
前述したように作製した１３０３２／ΔｍｃｂＲ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））菌株のＬ－メチオニン生産能を分析するために、親株である１３０３２／ΔｍｃｂＲ及び１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ菌株と共に次の方法で培養した。
【0210】
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２と発明菌株コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２／ΔｍｃｂＲ、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。特に、ベクターを導入した菌株は、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）をさらに添加して培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3 １２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3 １２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0211】
上記培養方法で培養し、培養液中のＬ－メチオニン濃度を分析した。それを表２９に示す。
【0212】
【表29】
【0213】
その結果、ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ）に形質転換された２種の菌株は、どちらもメチオニン生産能が増加した対照群に比べてメチオニン生産能が増加した。１３０３２／ΔｍｃｂＲ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））は対照群に比べて８３％も増加し、１３０３２／ΔＮｃｇｌ１０２１－Ｐｃｊ７ｍｅｔＨ－Ｐｓｐｌ１ｃｙｓＩ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））は対照群に比べて７８％も増加した。よって、本実施例から、アゾトバクター由来のｓｅｒＡ（Ａｖｎ）を導入すると微生物のＬ－メチオニン生産能の向上効果が得られることが確認された。
【0214】
前記１３０３２／ΔｍｃｂＲ菌株をＣＭ０２－０６１８と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１９年１月４日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４２５Ｐとして国際寄託した。また、前記１３０３２／ΔｍｃｂＲ（ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｓｐｌ１－ｓｅｒＡ（Ａｖｎ））菌株をＣＭ０２－０６９３と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４１３Ｐとして国際寄託した。
【0215】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0216】
【0217】
【0218】
【0219】
【0220】
【0221】
【配列表】
【国際調査報告】