特表 2022-529297 グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-20

(54)【発明の名称】グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20220613BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220613BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220613BHJP

   C12P 13/14 20060101ALI20220613BHJP

【ＦＩ】

C12N15/52 Z

C12N9/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P13/14 A

C12P13/14 E

C12P13/14 C

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021562185

(86)(22)【出願日】2021-03-04

(85)【翻訳文提出日】2021-10-19

(86)【国際出願番号】 KR2021002652

(87)【国際公開番号】W WO2021177731

(87)【国際公開日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】10-2020-0027322

(32)【優先日】2020-03-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508139664

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣＨＥＩＬＪＥＤＡＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】ＣＪ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，３３０，Ｄｏｎｇｈｏ－ｒｏ，Ｊｕｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ Ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ス チン

(72)【発明者】

【氏名】リ，イムサン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヘヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ピョン ソ

(72)【発明者】

【氏名】リ，カン ウ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050LL02

4B050LL05

4B064AE19

4B064CA02

4B064CA19

4B064DA10

4B064DA16

4B065AA24X

4B065AA24Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC03

4B065CA17

(57)【要約】

本出願は、活性が強化されたグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いてＬ－グルタミンを製造する方法に関し、新規な前記変異型ポリペプチドを用いると、野生型のグルタミンシンテターゼ活性を有する菌株に比べて、成長速度を遅延させることなくＬ－グルタミンの生産量を増加させることができるので、Ｌ－グルタミンの大量生産に広く活用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチド。

【請求項2】

４０１番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン（Asparagine）、グルタミン酸（Glutamic acid）又はセリン（Serine）に置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。

【請求項3】

４０２番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジン（Histidine）に置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。

【請求項4】

４０４番目の位置に相当するアミノ酸がバリン（Valine）に置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。

【請求項5】

前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、１００％未満の配列相同性を有する、請求項１に記載のグルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチド。

【請求項6】

前記変異型ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物。

【請求項9】

前記微生物はＬ－グルタミン生産能を有する、請求項８に記載の微生物。

【請求項10】

前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項８に記載の微生物。

【請求項11】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１０に記載の微生物。

【請求項12】

配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－グルタミンを生産する方法。

【請求項13】

前記培養した培地又は微生物からＬ－グルタミンを回収又は分離するステップをさらに含む、請求項１２に記載のＬ－グルタミンを生産する方法。

【請求項14】

前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項１２に記載のＬ－グルタミンを生産する方法。

【請求項15】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１４に記載のＬ－グルタミンを生産する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、活性が強化されたグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いてＬ－グルタミンを製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－グルタミンは、消化器疾患治療剤、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品、健康食品などに広く用いられるアミノ酸である。

【0003】

Ｌ－グルタミンの生産のために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）と大腸菌（Escherichia coli）が代表的な微生物として用いられている。Ｌ－グルタミン生合成経路においては、解糖過程（Glycolysis）とＴＣＡ回路（Tricarboxylic acid cycle）により生成されるα－ケトグルタミン酸（α-keto glutamic acid）を前駆体とし、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Glutamate dehydrogenase）によりＬ－グルタミン酸（L-glutamate）が生成され、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）の反応により最終的にＬ－グルタミンが生成される。

【0004】

Ｌ－グルタミンを高濃度で生産するためには、グルタミンシンテターゼの発現を最適化し、活性を強化することが非常に重要である。グルタミンシンテターゼの活性化には２価の金属イオンが必要であり、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン、グルコサミン－６－リン酸、シチジン三リン酸などにより活性が阻害される。また、４０５番目のアミノ酸のアデニリル化により活性が阻害される。先行研究によれば、４０５番目のアミノ酸をチロシンからフェニルアラニンに置換してアデニリル化による阻害を解除する研究が報告されている（特許文献１）。しかし、依然として高効率でＬ－グルタミンを生産する方法の開発が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】欧州特許第１２２９１２１号明細書

【特許文献2】米国特許第７６６２９４３号明細書

【特許文献3】米国特許第１０５８４３３８号明細書

【特許文献4】米国特許第１０２７３４９１号明細書

【特許文献5】韓国公開特許第２００９－００９４４３３号公報

【特許文献6】韓国登録特許第１０－００４８４４０号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277

【非特許文献2】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献3】Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797

【非特許文献4】Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066

【非特許文献5】Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518

【非特許文献6】Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374

【非特許文献7】Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64

【非特許文献8】Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900

【非特許文献9】Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680

【非特許文献10】Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615

【非特許文献11】Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402

【非特許文献12】Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815

【非特許文献13】McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881

【非特許文献14】Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919

【非特許文献15】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16

【非特許文献16】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012

【非特許文献17】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989

【非特許文献18】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York 9.50-9.51, 11.7-11.8

【非特許文献19】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【非特許文献20】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献21】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献22】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献23】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献24】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献25】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【非特許文献26】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【非特許文献27】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)

【非特許文献28】Van der Rest et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 52:541-545, 1999

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

こうした背景の下、本発明者らは、Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物を開発すべく努力した結果、Ｌ－グルタミンの生産を増加させるグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチドを確保し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。

【0009】

本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0010】

本出願は、前記変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。

【0011】

本出願は、本出願の微生物を培地で培養するステップを含む、Ｌ－グルタミンを生産する方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本出願のグルタミンシンテターゼ活性を強化した新規な変異型ポリペプチドを用いると、野生型のグルタミンシンテターゼ活性を有する菌株に比べて、成長速度を遅延させることなくグルタミンの生産量を増加させることができるので、グルタミンの大量生産に広く活用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な説明に本発明出願が限定されるものではない。

【0014】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

【0015】

本出願の一態様は、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）のアミノ酸配列において４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたグルタミンシンテターゼ変異体を提供する。

【0016】

具体的には、本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。

【0017】

本出願における「変異体」、「変異型ポリペプチド」、「変異型タンパク質（酵素）」は混用されてもよい。

【0018】

本出願における「グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）」とは、微生物にＡＴＰが存在する場合に、グルタミン酸とアンモニアをグルタミンに変換する酵素を意味する。例えば、ｇｌｎＡ遺伝子によりコードされるものであってもよいが、これに限定されるものではない。本出願の目的上、グルタミン酸とアンモニアをグルタミンに変換する活性を有するタンパク質であればいかなる由来のものでもよく、任意の有機体（植物や微生物など）に由来する酵素を用いることができるが、これらに限定されるものではない。前記グルタミンシンテターゼは、コリネバクテリウム属微生物由来の酵素又はその変異体であってもよく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）由来の酵素又はその変異体であるが、これらに限定されるものではない。

【0019】

具体的には、前記グルタミンシンテターゼは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％以上、１００％未満の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよいが、グルタミンシンテターゼ活性を有するものであれば、これらに限定されるものではない。より具体的には、本出願のグルタミンシンテターゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性もしくは同一性を有するポリペプチドを含むものである。また、このような相同性もしくは同一性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する補助タンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。

【0020】

本出願における「グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド」又は「グルタミンシンテターゼ変異体」とは、グルタミンシンテターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸に置換されることにより、変化したグルタミンシンテターゼ活性を有するポリペプチドを意味する。具体的には、前記変異型ポリペプチドは、グルタミンシンテターゼ活性を有する様々な配列のポリペプチド上で配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドであってもよい。

【0021】

本出願の「Ｎ番目の位置」には、Ｎ番目の位置、及びＮ番目の位置に相当（Corresponding）するアミノ酸位置が含まれる。具体的には、対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置が含まれる。より具体的には、前記対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列又はそれと９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、配列番号１のアミノ酸配列において４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置には、配列番号１のアミノ酸配列に８０％以上、１００％未満の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列において前記４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸位置が含まれる。

【0022】

前記Ｎ番目の位置に相当するアミノ酸位置、又は対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献１）で行われるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献２）、具体的にはバージョン５．０．０又はそれ以降のバージョンを用いて決定することができる。用いられるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスであってもよい。

【0023】

前記Ｎ番目の位置に相当するアミノ酸位置、又は対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基の確認は、各デフォルトパラメータを用いるＭＵＳＣＬＥ（multiple sequence comparison by log-expectation；バージョン３．５又はそれ以降のバージョン；非特許文献３）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７又はそれ以降のバージョン；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いるＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３又はそれ以降のバージョン；非特許文献９）をはじめとするいくつかのコンピュータプログラムを用いた複数のポリペプチド配列のアライメントにより決定することができるが、これらに限定されるものではない。

【0024】

その他、ポリペプチドが従来の配列ベースの比較でそれらの関係を検出できない場合（非特許文献１０）は、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムが用いられてもよい。配列ベースの検索においては、データベースを検索するためのポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いる検索プログラムにより高感度が得られる。例えば、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索過程により、プロファイルを算出し、遠縁な相同体を検出することができる（非特許文献１１）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて少なくとも１つの表現を有する場合は、はるかに大きな感度が得られる。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（非特許文献１２；非特許文献１３）などのプログラムは、クエリー配列（query sequence）の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへの入力として様々な供給源（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル及び溶媒和ポテンシャル）からの情報を用いる。同様に、非特許文献１４の方法は、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルをアラインメントするために用いられる。これらのアラインメントはポリペプチドに対する相同性、類似性又は同一性モデルを生成するために順次用いられ、これらのモデルはその目的のために開発された様々なツールを用いて正確性の評価が行われる。

【0025】

前記「他のアミノ酸」は、各位置に相当するアミノ酸を除く他のアミノ酸であればいかなるものでもよい。具体的には、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、システイン、チロシン、リシン、アスファルト酸及びグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。

【0026】

「アミノ酸」は、側鎖の性質によって酸性、塩基性、極性（親水性）、非極性（疎水性）の４種類に分けられる。

【0027】

前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、各位置のアミノ酸が非極性アミノ酸であるグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）及びプロリン（Ｐ）、極性アミノ酸であるセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスファルト酸（Ｄ）及びグルタミン（Ｑ）、酸性アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）及びグルタミン酸（Ｅ）、塩基性アミノ酸であるリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に置換されたタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0028】

具体的には、４０１番目の位置に相当するアミノ酸は酸性アミノ酸又は極性アミノ酸に置換されたものであり、４０２番目の位置に相当するアミノ酸は塩基性アミノ酸に置換されたものであり、４０４番目の位置に相当するアミノ酸は非極性アミノ酸に置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。

【0029】

より具体的には、４０１番目の位置に相当するアミノ酸はアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されたものであり、４０２番目の位置に相当するアミノ酸はヒスチジンに置換されたものであり、４０４番目の位置に相当するアミノ酸はバリンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0030】

本出願において、配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドは、配列番号２～６のいずれかの配列であってもよい。

【0031】

具体的には、前記４０１番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号２を含んでもよく、前記４０１番目の位置に相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換された変異型ポリペプチドは配列番号３を含んでもよく、前記４０１番目の位置に相当するアミノ酸がセリンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号４を含んでもよい。

【0032】

また、前記４０２番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号５を含んでもよく、前記４０４番目の位置に相当するアミノ酸がバリンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号６を含んでもよい。

【0033】

前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、１００％未満の配列相同性を有する、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するものであり、また、そのような相同性を有して前記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置のアミノ酸配列以外に、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。

【0034】

本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記タンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、前記アミノ酸配列の前後へのタンパク質の機能を変更しない配列の付加や、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を除外するものではなく、そのような配列の付加や突然変異を有するものも本願に含まれることは言うまでもない。

【0035】

前記変異型ポリペプチドには、特定位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された以外に、少なくとも１つのアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記タンパク質の機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドが含まれる。

【0036】

本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸の置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。

【0037】

また、前述した特定位置のアミノ酸以外の少なくとも１つのアミノ酸が変異した変異型は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の転移（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。

【0038】

また、前記変異型ポリペプチドは、前述した配列番号１の変異及び／又は配列番号１の変異と変異位置以外に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。すなわち、配列番号２～６のいずれかの配列と８０％以上、１００％未満の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号２～６のいずれかの配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。配列番号１の変異は前述した通りであり、その相同性又は同一性は前述した変異以外の位置で相同性又は同一性を有するものであってもよい。

【0039】

本出願の目的上、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、活性が野生型より強化されたものであってもよい。具体的には、配列番号１の野生型に比べて、グルタミンシンテターゼ活性が増加及び強化されたものであってもよい。

【0040】

本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性に比べて増加させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、増加（increase）などと混用されてもよい。ここで活性化、強化、上方調節、過剰発現、増加には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用されてもよい。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「増加」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上することを意味する。

【0041】

前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）の強化により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量、又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。

【0042】

前記ポリペプチドの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであれば、いかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の技術者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１５、１６など）。

【0043】

具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、４）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチド又はそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0044】

より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体内に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。

【0045】

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より強い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0046】

公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献３）、Ｏ２プロモーター（特許文献４）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0047】

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５'ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0048】

前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が増加するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。

【0049】

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が増加する。

【0050】

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。

【0051】

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部位を選択して改変又は修飾することにより行われる。

【0052】

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度、発現量が野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて増加するか、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することにより行われるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

例えば、本出願の変異型ポリペプチドは、野生型に比べてグルタミン生産能が向上することが確認され、グルタミンシンテターゼ活性が強化されることが確認された（表１～３）。

【0054】

本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。前記導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

【0055】

本出願の他の態様は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0056】

配列番号１のアミノ酸配列、グルタミンシンテターゼ及びグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドについては前述した通りである。

【0057】

本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

【0058】

本出願のポリヌクレオチドは、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）活性を有する変異型ポリペプチドをコードする配列であればいかなるものでもよい。例えば、配列番号２～６のアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列であるが、これらに限定されるものではない。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、コドンの縮退（codon degeneracy）により、前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれと相同性もしくは同一性を有するポリペプチド、より具体的には８０％以上、１００％未満の相同性もしくは同一性を有するポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。

【0059】

また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードする配列であればいかなるものでもよい。

【0060】

前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１７、１８参照）に具体的に記載されている。

【0061】

例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

【0062】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

【0063】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

【0064】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１７）。

【0065】

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられてもよい。

【0066】

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は一部分とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドンの縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

【0067】

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１９のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献１）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献２）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献２０）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献２１、２２及び２３）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0068】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献２４に開示されているように、非特許文献２などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献２５に開示されているように、非特許文献２６の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

【0069】

本出願のさらに他の態様は、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本出願のベクターを含む微生物を提供する。

【0070】

本出願のベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0071】

本出願におけるベクターとは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。

【0072】

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0073】

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

【0074】

前記微生物は、Ｌ－グルタミン生産能を有する微生物であってもよい。

【0075】

本出願における「微生物（又は菌株）」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。

【0076】

具体的には、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含む微生物とは、自然にＬ－グルタミン生産能を有する微生物、又はＬ－グルタミン生産能のない親株にＬ－グルタミン生産能が付与された微生物を意味する。

【0077】

本出願における「グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含む微生物」とは、本出願の変異型ポリペプチドが発現するように組換えられた微生物を意味する。

【0078】

例えば、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはそれを含むベクターで形質転換されて前記変異型ポリペプチドを発現する、宿主細胞又は微生物を意味する。

【0079】

本出願における「グルタミン」は、アミノ酸の一種であって、消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品、健康食品などに広く用いられるアミノ酸である。前記グルタミンは、ＡＴＰ存在下でグルタミンシンテターゼによりグルタミン酸及びアンモニアから変換されることにより作製されてもよい。すなわち、本出願においては、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むため、グルタミンシンテターゼの活性が強化されるので、それを含む微生物のグルタミン生産能を向上させることができる。

【0080】

具体的には、本出願における前記グルタミンはＬ－グルタミンであってもよく、本出願において「グルタミン」と「Ｌ－グルタミン」は混用される。

【0081】

本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0082】

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。

【0083】

本出願の目的上、前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列において４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよい。具体的には、配列番号１のＮ末端から４０１番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されるか、４０２番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジンに置換されるか、４０４番目の位置に相当するアミノ酸がバリンに置換されることにより、グルタミンシンテターゼ活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であり、より具体的には、配列番号１のＮ末端から４０１番目の位置のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されるか、４０２番目の位置のアミノ酸がヒスチジンに置換されるか、４０４番目の位置のアミノ酸がバリンに置換されることにより、グルタミンシンテターゼ活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記微生物は、前記４０１番目、４０２番目又は４０５番目の位置に変異を含むと共に、配列番号１の配列と８０％以上、１００％未満の同一性又は相同性を有する変異型ポリペプチドを発現するか、配列番号２～６のいずれかの配列の変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよい。前記微生物は、前記変異位置のアミノ酸が置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むので、グルタミンシンテターゼ活性が強化され、生長を妨げることなくグルタミンの生産量を増加させるものである。

【0084】

本出願において、前記変異型ポリペプチドを含む微生物は、その種類が特に限定されるものではないが、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物である。

【0085】

本出願における「コリネバクテリウム属（The genus of Corynebacterium）微生物」は、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。一具体例として、本出願におけるコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である。

【0086】

本出願の微生物には、前記ポリヌクレオチド又はベクター導入以外にも、様々な公知の方法による、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物が全て含まれる。

【0087】

本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目、４０２番目又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物（又は本出願の微生物）を培地で培養するステップを含む、Ｌ－グルタミンを生産する方法を提供する。

【0088】

また、本出願の一具体例として、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである。

【0089】

本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

【0090】

本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。

【0091】

具体的には、コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、非特許文献２７に開示されている。

【0092】

本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0093】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0094】

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

【0095】

また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入なくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

【0096】

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。

【0097】

本出願の培養により生産されたＬ－グルタミンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。

【0098】

本出願のＬ－グルタミン生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

【0099】

本出願のＬ－グルタミン生産方法は、前述したように培養した培地（培養培地）又は本出願の微生物からＬ－グルタミンを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

【0100】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－グルタミンを回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－グルタミンを回収することができる。

【0101】

また、本出願のＬ－グルタミン生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－グルタミン生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0102】

本出願の方法における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、Ｌ－グルタミンなどについては前述した通りである。

【0103】

本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において４０１番目の位置に相当するアミノ酸、４０２番目の位置に相当するアミノ酸、又は４０４番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドが発現するように微生物を改変することを含む、Ｌ－グルタミン生産能を向上させる方法を提供する。

【0104】

本出願のさらに他の態様は、前記変異型ポリペプチド、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらのうち少なくとも１つを発現する微生物のＬ－グルタミン生産能向上用途を提供する。

【0105】

前記変異型ポリペプチド、他のアミノ酸、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、Ｌ－グルタミンなどについては前述した通りである。

【0106】

本出願のさらに他の態様は、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらのうち少なくとも１つを発現する微生物又はその培養液を含む、Ｌ－グルタミン生産用組成物を提供する。

【0107】

前記変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、Ｌ－グルタミンなどについては前述した通りである。

【0108】

前記Ｌ－グルタミン生産用組成物とは、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドによりＬ－グルタミンを生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、又は前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを作動させる構成を含むものであればいかなるものでもよい。前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるようにベクターに含まれる形態であってもよい。

【0109】

前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然発生（non-naturally occurring）の物質、又は自然発生の物質であるが、これらに限定されるものではない。

【0110】

他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、前記微生物が自然に接触しない物質、又は前記微生物と自然に同時に含まれない物質であるが、これらに限定されるものではない。

【実施例】

【0111】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0112】

ｇｌｎＡ遺伝子ＯＲＦ内変異導入用ベクターライブラリーの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のグルタミンシンテターゼをコードするｇｌｎＡ遺伝子の発現量又はその活性が強化された変異体を見出すために、次の方法でライブラリーを作製した。

【0113】

まず、ｇｌｎＡ（１，４３４ｂｐ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（１，４３４ｂｐ）に１ｋｂ当たり０～４．５個の変異を導入するために、ＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene）を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（ＷＴ）の染色体を鋳型とし、配列番号７及び８からなるプライマーセットを用いてＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行った。具体的には、ＷＴ菌株の染色体（５００ｎｇ）、プライマー７及び８（それぞれ１２５ｎｇ）、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１Υ）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ（４０ｍＭ）、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を含む反応液を用いて、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２５サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行った。

【0114】

ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いて、増幅した遺伝子断片をｐＣＲＩＩベクターに連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択し、プラスミドを得て塩基配列を分析した結果、０．５ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。最終的に約１０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを得てプラスミドを抽出し、これをｐＴＯＰＯ－ｇｌｎＡ（ｍｔ）ライブラリーと命名した。

【実施例2】

【0115】

ｇｌｎＡ欠損株の作製及びｇｌｎＡ変異株のスクリーニング
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２においてｇｌｎＡ遺伝子が欠損した菌株を作製するために、次のようにｇｌｎＡ遺伝子が欠損したベクターｐＤＺ－△ｇｌｎＡを作製した。具体的には、ｇｌｎＡ遺伝子の５’及び３’末端に位置するＤＮＡ断片（それぞれ１０００ｂｐ）がｐＤＺベクター（特許文献５）に連結された形態に作製した。

【0116】

配列番号２９のｇｌｎＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、５’断片及び３’断片に制限酵素ＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号１０及び１１と、それらからそれぞれ１０００ｂｐ離れた位置のプライマー配列番号９及び１２を合成した。

【0117】

コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、５’末端の遺伝子断片は、配列番号９及び１０からなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより作製した。同様に、ｇｌｎＡ遺伝子の３’末端に位置する遺伝子断片は、配列番号１１及び１２を用いて、ＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。

【0118】

一方、制限酵素ＳａｌＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。配列番号１３及び１４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得て、このプラスミドをｐＤＺ－△ｇｌｎＡと命名した。

【0119】

前述したように作製したベクターｐＤＺ－△ｇｌｎＡをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気パルス法（非特許文献２８）で形質転換し、相同染色体組換えによりｇｌｎＡ遺伝子が欠損した菌株を作製した。このようにｇｌｎＡ遺伝子が欠損した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：△ｇｌｎＡと命名した。

【0120】

また、ＡＴＣＣ１３０３２：：△ｇｌｎＡ菌株を対象にｐＴＯＰＯ－ｇｌｎＡ（ｍｔ）ライブラリーを電気パルス法で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含む複合平板培地に塗抹して約１００個のコロニーを確保した。確保した１００株の菌株に対してＬ－グルタミン生産能テストを行った。グルタミン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに得られた１００株の菌株をそれぞれ接種し、その後３２℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。後述するＬ－グルタミン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。

【0121】

コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２及びＡＴＣＣ１３０３２：：△ｇｌｎＡ菌株を対照区として用いた。培養終了後に、細胞を除去した培地の上清中に存在するＬ－グルタミンをＹＳＩ ７１００ Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（YSI Inc.)により測定した。ＡＴＣＣ１３０３２：：△ｇｌｎＡ菌株に比べてＬ－グルタミン生産能を有するだけでなく、ＡＴＣＣ１３０３２よりＬ－グルタミン濃度が高い菌株を選択した。培養液中のグルタミン濃度を表１に示す。選択した種の菌株をＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－１～３と命名した。その他９７種のコロニーは、対照区として用いたＡＴＣＣ１３０３２よりＬ－グルタミン濃度が低かった。

【0122】

【表1】

【0123】

表１に示すように、対照群に比べて、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－１においては、生産能が約４０％向上することが確認され、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－２においては、生産能が約１１％向上することが確認され、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－３においては、生産能が約１８％向上することが確認された。

【実施例3】

【0124】

３種のｇｌｎＡ変異株の塩基配列の確認
３種の選択菌株ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－１～３のｇｌｎＡ遺伝子の塩基配列を確認するために、実施例１の配列番号７及び８のプライマーセットを用いて、染色体内ｇｌｎＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。

【0125】

増幅した遺伝子の塩基配列を分析した結果、３種の菌株のうち、順にＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－１は、配列番号５の１２０１～１２０３番目の塩基配列が従来のＧＡＣからＡＡＣに置換され、Ｎ末端から４０１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がアスパラギンに置換された形態の変異体が発現する菌株であり、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－２は、配列番号５の１２０４～１２０６番目の塩基配列が従来のＡＡＧからＣＡＣに置換され、Ｎ末端から４０２番目のアミノ酸であるリシンがヒスチジンに置換された変異体が発現する菌株であり、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－３は、配列番号５の１２１０～１２１２番目の塩基配列が従来のＣＴＣからＧＴＣに置換され、Ｎ末端から４０４番目のアミノ酸であるロイシンがバリンに置換された変異体が発現する菌株であることが確認された。前記３種の菌株のうち、Ｌ－グルタミン生産量がＡＴＣＣ１３０３２より増加すると共に、生長速度が同等であるＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（ｍｔ）－１菌株を最も優れたグルタミンシンテターゼ活性強化菌株として選択した。

【実施例4】

【0126】

ｇｌｎＡ遺伝子の４０１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸が他のアミノ酸に置換された様々な菌株の作製
実施例３で４０１番目のアミノ酸が酵素活性に重要な位置であることが確認されたので、配列番号１で表されるタンパク質配列の４０１番目のアミノ酸の位置における、野生型が有するアスパラギン酸を除く他のアミノ酸への置換を試みた。

【0127】

実施例３で確認した変異であるＤ４０１Ｎを含む４種の異種塩基置換変異を導入するために、それぞれの組換えベクターを次の方法で作製した。

【0128】

まず、ＷＴ菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｇｌｎＡ遺伝子の１２０１～１２０３番目の位置から前後にそれぞれ約６００ｂｐ離れた位置の５’断片及び３’断片に制限酵素ＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号１５及び１６を合成した。４種の異種塩基置換変異を導入すべく、ｇｌｎＡ遺伝子の１２０１～１２０３番目の塩基配列を置換するための配列番号１７～２６のプライマーを合成した。

【0129】

さらに、周知のｇｌｎＡのアデニリル化解除変異であるＹ４０５Ｆとグルタミン生産能を比較するために、配列番号２７及び２８のプライマーを合成した。

【0130】

具体的には、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）プラスミドは、ｇｌｎＡ遺伝子の５’及び３’末端に位置するＤＮＡ断片（それぞれ６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（特許文献５）に連結された形態に作製した。ＷＴ菌株の染色体を鋳型とし、５’末端の遺伝子断片は、配列番号１５及び１８からなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。同様に、ｇｌｎＡ遺伝子の３’末端に位置する遺伝子断片は、配列番号１７及び１６からなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより作製した。増幅したＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製し、その後ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。

【0131】

一方、制限酵素ＳａｌＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に前記菌株を塗抹した。配列番号１３及び１４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得た。前記プラスミドをｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）と命名した。

【0132】

同様に、配列番号１５及び２０からなるプライマーセット及び配列番号１９及び１６からなるプライマーセットを用いて、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ）を作製し、また、配列番号１５及び２４からなるプライマーセット及び配列番号２３及び１６からなるプライマーセットを用いて、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｓ）を作製した。それだけでなく、配列番号１５及び２８からなるプライマーセット及び配列番号２７及び１６からなるプライマーセットを用いて、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）を作製した。

【0133】

ｇｌｎＡ変異導入によるグルタミン濃度及び生長速度をより明確にするために、グルタミンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に作製した各ベクターを電気パルス法で形質転換し、相同染色体組換えによりｇｌｎＡ遺伝子に異種塩基置換変異が導入された４種の菌株、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ）、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｓ）、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）を作製した。これらのうち、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）をＣＡ１１－４０２１と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)に２０１９年１２月１９日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２６４５Ｐとして寄託した。

【実施例5】

【0134】

ｇｌｎＡ変異株におけるグルタミン生産能の分析
ＡＴＣＣ１３０３２菌株を対照群として用いて、実施例４で作製した４種の菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。

【0135】

まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters 2478）を用いてＬ－グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表２に示す。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３ ５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）

【0136】

【表2】

【0137】

配列番号１の４０１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む菌株において、置換されたアミノ酸がアスパラギン（ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ））、グルタミン酸（ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ））であれば、グルタミン生産能がそれぞれ約４０％、３３％向上することが確認された。これは、ｇｌｎＡのアデニリル化解除変異が導入された菌株ＡＴＣＣ１３０３２：：ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）と比較してもグルタミン生産能が向上する結果であった。

【実施例6】

【0138】

グルタミン生産菌株ベースｇｌｎＡ変異株の作製
従来のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０（特許文献６）菌株を対象に、実施例４と同様に、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ）、ｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）をそれぞれ電気パルス法で形質転換した。ｇｌｎＡ遺伝子に異種塩基置換変異が導入された３種の菌株をそれぞれＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）、ＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ）、ＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）と命名した。

【実施例7】

【0139】

グルタミン生産菌株ベースｇｌｎＡ変異株におけるグルタミン生産能の分析
ＫＦＣＣ－１０６８０菌株を対照群として用いて、３種の選択菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。

【0140】

まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters 2478）を用いてＬ－グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表３に示す。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３ ５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）

【0141】

【表3】

【0142】

配列番号１の４０１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む菌株において、置換されたアミノ酸がアスパラギン（ＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ））、グルタミン酸（ＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｅ））であれば、グルタミン生産能がそれぞれ約２１％、９％向上することが確認された。

【0143】

これは、ｇｌｎＡのアデニリル化解除変異が導入された菌株ＫＦＣＣ－１０６８０：：ｇｌｎＡ（Ｙ４０５Ｆ）と比較してもグルタミン生産能が向上する結果であった。

【0144】

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１２６４５Ｐ
受託日：２０１９年１２月１９日

【0145】

【配列表】

2022529297000001.app

【国際調査報告】