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特表2022-529380キメラ抗原受容体構築物およびＣＡＲ－Ｔ細胞におけるそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-21
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体構築物およびＣＡＲ－Ｔ細胞におけるそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220614BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220614BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220614BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220614BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20220614BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20220614BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20220614BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220614BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220614BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220614BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220614BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220614BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220614BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220614BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220614BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220614BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220614BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220614BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220614BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/725
C07K16/30
C07K16/08
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N5/0783
A61K31/7088
A61K35/76
A61K48/00
A61P31/12
A61P31/18
A61P35/00
A61K35/17 Z
A61K38/17
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021563033
(86)(22)【出願日】2020-04-24
(85)【翻訳文提出日】2021-12-21
(86)【国際出願番号】 US2020029768
(87)【国際公開番号】W WO2020219843
(87)【国際公開日】2020-10-29
(31)【優先権主張番号】62/839,175
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514299550
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】スー リーシャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB33
4C084ZC55
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZC55
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZC55
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組成物、ならびに、癌および抗ウイルス免疫療法におけるそれらの使用方法に関する。特に、本発明のＣＡＲは、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―タンパク質（ＨＶＥＭ）またはその機能性フラグメントまたは変異体を含む、共刺激シグナル（ＣＳＳ）ドメインを含む。そのようなＨＶＥＭ ＣＳＳを含むＣＡＲは、高いエフェクター機能を示す。
【選択図】 図１Ａ
【選択図】 図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体ドメイン、および、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ）タンパク質を含む共刺激シグナル（ＣＳＳ）ドメインまたはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントもしくは変異体を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項2】
請求項１のＣＡＲであって、ＨＶＥＭ ＣＳＳドメインが配列番号１のアミノ酸配列またはその機能性フラグメントを含む、
ＣＡＲ。
【請求項3】
請求項１または２のＣＡＲであって、前記ＣＳＳドメインは、ＣＤ２８ ＣＳＳドメイン、４－１ＢＢ ＣＳＳドメイン、ＯＸ－４０ ＣＳＳドメイン、ＩＣＯＳ ＣＳＳドメイン、それらと少なくとも９０％同一性を有する任意のＣＳＳドメインの機能性フラグメントまたは変異体、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、
ＣＡＲ。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか一項のＣＡＲであって、前記Ｔ細胞受容体ドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインまたはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体を含む、
ＣＡＲ。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか一項のＣＡＲであって、前記ＣＳＳドメインは、前記ＣＳＳドメインを含まないＣＡＲと比較して、増大した解糖系およびミトコンドリア呼吸と関連する高いエフェクター機能を促進する、
ＣＡＲ。
【請求項6】
請求項５のＣＡＲであって、ＣＡＲ－Ｔ解糖系が少なくとも２５％増大される、
ＣＡＲ。
【請求項7】
請求項５のＣＡＲであって、ミトコンドリア呼吸が少なくとも２５％増大される、
ＣＡＲ。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項のＣＡＲであって、前記抗原結合ドメインは、一価抗体フラグメントを含む、
ＣＡＲ。
【請求項9】
請求項８のＣＡＲであって、前記一価抗体フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントを含む、
ＣＡＲ。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか一項のＣＡＲであって、前記抗原結合ドメインは、ウイルス粒子および／または癌細胞の表面上に存在する抗原を標的化する、
ＣＡＲ。
【請求項11】
請求項１から１０のいずれか一項のＣＡＲであって、前記抗原結合ドメインは、可溶性ＣＤ４タンパク質またはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体を含む、
ＣＡＲ。
【請求項12】
請求項１から１０のいずれか一項のＣＡＲであって、前記抗原結合ドメインは、表面タンパク質ＣＡＩＸを標的化する一価抗体フラグメントを含む、
ＣＡＲ。
【請求項13】
請求項１から１０のいずれか一項のＣＡＲであって、前記抗原結合ドメインは、表面タンパク質ａＤＧ２を標的化する一価抗体フラグメントを含む、
ＣＡＲ。
【請求項14】
請求項１から１３のいずれか一項のＣＡＲをコードする、核酸分子。
【請求項15】
請求項１４の核酸分子であって、配列番号７のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
核酸分子。
【請求項16】
請求項１４または１５の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項17】
請求項１から１３のいずれか一項のＣＡＲを含む、細胞。
【請求項18】
請求項１４または１５の核酸分子および／または請求項１６のベクターを含む、細胞。
【請求項19】
請求項１７または１８の細胞であって、前記細胞は、αβＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、
細胞。
【請求項20】
請求項１から１３のいずれか一項のＣＡＲ、請求項１４または１５の核酸分子、請求項１６のベクター、および／または請求項１７から１９のいずれか一項の細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む、組成物。
【請求項21】
標的に対する免疫応答を、それを必要とする対象において提供する方法であって、前記方法は、前記対象に、有効量の請求項１から１３のいずれか一項のＣＡＲ、請求項１４または１５の核酸分子、請求項１６のベクター、および／または請求項１７から１９のいずれか一項の細胞を投与するステップを含み、
それにより、前記対象において前記標的に対する免疫応答を提供する、
方法。
【請求項22】
標的に対する免疫応答を、それを必要とする対象において提供する方法であって、前記方法は、
癌および／または感染を有する対象由来のＴ細胞を得るステップ；
請求項１４または１５の核酸分子または請求項１６のベクターを用いて前記Ｔ細胞をトランスフェクトするステップ；
前記トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップ；および
前記の、培養された、トランスフェクトされたＴ細胞を前記対象へ投与するステップ、
を含み、
それにより、前記対象において前記標的に対する免疫応答を提供する、
方法。
【請求項23】
請求項２１または２２の方法であって、前記標的は、癌細胞または感染因子である、
方法。
【請求項24】
抗原に対する細胞の反応性を促進する方法であって、前記方法は、請求項１４または１５の核酸分子または請求項１６のベクターを用いて細胞をトランスフェクトして、細胞表面上に抗原結合ドメインを含むトランスフェクトされた細胞を産生するステップを含み、
ここで、前記抗原結合ドメインは前記抗原に特異的に結合し、
それにより、前記抗原に対する前記細胞の反応性を促進する、
方法。
【請求項25】
それを必要とする対象における感染を治療する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１から１１のいずれか一項のＣＡＲ、請求項１４または１５の核酸分子、請求項１６のベクター、および／または、請求項１７から１９のいずれか一項の細胞を投与するステップを含み、
それにより、前記対象における前記感染を治療する、
方法。
【請求項26】
それを必要とする対象における感染を治療する方法であって、前記方法は、
感染を有する対象由来のＴ細胞を得るステップ；
請求項１４または１５の核酸分子または請求項１６のベクターを用いて前記Ｔ細胞をトランスフェクトするステップ；
前記トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップ；および
前記の、培養された、トランスフェクトされたＴ細胞を、感染を有する対象へ投与するステップ、
を含み、
それにより、前記対象における前記感染を治療する、
方法。
【請求項27】
請求項２５または２６の方法であって、前記感染はＨＩＶである、
方法。
【請求項28】
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１から１３のいずれかのＣＡＲ、請求項１４または１５の核酸分子、請求項１６のベクター、および／または、請求項１７から１９のいずれか一項の細胞を投与するステップを含み、
それにより、前記対象における癌を治療する、
方法。
【請求項29】
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記方法は、
癌を有する対象由来のＴ細胞を得るステップ；
請求項１４または１５の核酸分子または請求項１６のベクターを用いて前記Ｔ細胞をトランスフェクトするステップ；
前記トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップ；および
前記の、培養された、トランスフェクトされたＴ細胞を、固形腫瘍を有する対象へ投与するステップ、
を含み、
それにより、前記対象における癌を治療する、
方法。
【請求項30】
請求項２８または２９の方法であって、前記癌が固形腫瘍である、
方法。
【請求項31】
請求項２８から３０のいずれか一項の方法であって、前記癌が、腎臓癌または神経芽細胞腫である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［優先権の陳述］
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年４月２６日に出願された米国仮出願番号６２／８３９，１７５の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年４月２６日に出願された米国仮出願番号６２／８３９，１７５の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。
【0002】
［配列リストの電子出願に関する陳述］
連邦規則法典第３７巻１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列リストであって、２０２０年４月２２日に作成されてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、１０，７０３バイトのサイズの５４７０－８４６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題されたものは、紙のコピーの代わりに提供される。この配列リストは、その開示に関して参照により本明細書中に援用される。
連邦規則法典第３７巻１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列リストであって、２０２０年４月２２日に作成されてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、１０，７０３バイトのサイズの５４７０－８４６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題されたものは、紙のコピーの代わりに提供される。この配列リストは、その開示に関して参照により本明細書中に援用される。
【0003】
［本発明の分野］
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組成物、ならびに、癌および抗病原体免疫療法におけるそれらの使用方法に関する。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組成物、ならびに、癌および抗病原体免疫療法におけるそれらの使用方法に関する。
【0004】
［政府支援］
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ０７７４５４の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ０７７４５４の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【0005】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られ、癌細胞を標的化するために新たな特異性を免疫細胞と組み合わせた改変された受容体である。典型的に、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に融合させる。受容体は、異なる由来からの部分の融合であるためキメラと呼ばれる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、そのような形質転換された細胞を、主に癌療法のために用いる治療を指す。
【0006】
ＣＡＲ－Ｔ細胞デザインの基本的な原理は、抗原結合とＴ細胞活性化機能を組み合わせる組み換え受容体を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞の一般的な前提は、癌細胞のような病変細胞上に見られるマーカーに対して標的化されるＴ細胞を人工的に生産することである。科学者は、ヒトからＴ細胞を取り出し、それらを遺伝学的に変更し、そして、それらを患者内に戻して病変細胞を攻撃することができる。Ｔ細胞が改変されてＣＡＲ－Ｔ細胞になった時点で、それは「生きた薬物（ｌｉｖｉｎｇ ｄｒｕｇ）」として作用する。
【0007】
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞外リガンド認識ドメインと細胞内シグナリング分子の間のリンクを作り、その結果、Ｔ細胞を活性化する。細胞外リガンド認識ドメインは通常、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の安全性の重要な一態様は、癌性腫瘍細胞のみが標的化され、正常細胞は標的化されないことを確実にする方法である。ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性は、標的化される分子の選択によって決定される。
【0008】
例えば、癌の治療では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者自身の血液から採取することができるか（自家）、または、別の健康なドナーから採取することができる（同種間）。これらのＴ細胞は、人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝学的に操作され、それを通して癌抗原へ標的化される。このプロセスはＭＨＣ非依存性であり、したがって、標的化効率は非常に増大される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍表面上に存在する抗原を標的化するようにプログラムされる。腫瘍上の抗原と接触するとＣＡＲ－Ｔ細胞は、シグナルペプチドを介して活性化され、増殖し、細胞傷害性になる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、広範囲の刺激された細胞増殖のようなメカニズムを通して、細胞が他の生細胞に対して毒性である程度（すなわち、細胞毒性）を増大させ、免疫系において細胞から分泌される、生物内の他の細胞に対する効果を有する因子の産生を増大させることにより、癌細胞を破壊する。これらの因子はサイトカインと呼ばれ、インターロイキン、インターフェロンおよび増殖因子を含む。
【0009】
最近では、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、他の癌タイプ（例えば、固形腫瘍）および／または疾患（例えば、慢性ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ））のための治療選択肢として考えられている。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関する可能性のある適用の拡大により、現在のＣＡＲ－Ｔ細胞療法を改善して、次世代のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の薬剤およびそれらの構成要素を生産する必要性が当該分野において続いている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の組成物およびそれを使用する方法を提供し、ここで、共刺激シグナル（ＣＳＳ）は、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ）タンパク質（ＣＤ２７０とも呼ばれる）を含む。ＣＡＲにおけるＣＳＳは、癌（例えば、固形腫瘍）および病原体感染（例えば、慢性ウイルスまたは細菌感染）のような多種多様の疾患において用いられるＣＡＲ－形質導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫活性を調整する場合に重要である。ＨＶＥＭ ＣＳＳを含むＣＡＲは、ＨＶＥＭを含まないＣＳＳドメインを含むＣＡＲと比較して、著しくより高い解糖系およびミトコンドリア呼吸と関連する高いエフェクター機能を示し、同等の割合のセントラルおよびエフェクターメモリーサブセットを誘導した。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエネルギー代謝を再プログラムすることによって、ＨＶＥＭ共刺激を通して改善され得る。
【課題を解決するための手段】
【0011】
したがって、本発明の一態様は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体ドメイン、および、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ）タンパク質を含む共刺激シグナル（ＣＳＳ）ドメインまたはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントもしくは変異体を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【0012】
本発明の別態様は、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子に関する。
【0013】
本発明のさらなる一態様は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【0014】
本発明のさらなる一態様は、本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【0015】
本発明の別態様は、本発明の核酸分子および／または本発明のベクターを含む細胞に関する。
【0016】
本発明のさらなる一態様は、本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または、本発明の細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む、組成物に関する。
【0017】
本発明のさらなる一態様は、それを必要とする対象における標的に対する免疫応答を提供する方法に関し、その方法は、有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または、本発明の細胞を対象に投与するステップを含み、それにより、対象における標的に対する免疫応答を提供する。
【0018】
本発明の別態様は、それを必要とする対象における標的に対する免疫応答を提供する方法に関し、その方法は、癌および／または感染を有する対象由来のＴ細胞を得るステップ、本発明の核酸分子または本発明のベクターを用いてＴ細胞をトランスフェクトするステップ、トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップ、および、培養された、トランスフェクトされたＴ細胞を対象に投与するステップを含み、それにより、対象における標的に対する免疫応答を提供する。
【0019】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A-1H】ＣＡＲの共刺激シグナルは、ヒトＴ細胞株におけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性を決定する。（図１Ａ）ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター構築物の略図。ＣＡＲは、抗原認識ドメインとしてＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に結合し、共刺激シグナル配列が異なる、ヒトＣＤ４（ｓＣＤ４）の細胞外ドメインを含む。（図１Ｂ）形質導入ヒトＴ細胞株におけるＣＡＲ発現の分析のためのゲーティング戦略。ＧＦＰ＋形質導入細胞をゲーティングして（下側パネル）、フローサイトメトリーによって、抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体を用いたＣＡＲ発現の分析に用いた（上側パネル）。それぞれの形質導入細胞の典型的なドットプロットおよびＣＡＲヒストグラムを示す。同様の形質導入効率が、レンチウイルスの形質導入によって達成された（図７Ａおよび７Ｂも参照）。（図１Ｃ）異なるＣＳＳを有するＧＦＰ＋細胞におけるＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す（ｎ＝５）。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図１Ｄ）異なるＣＳＳを有するＣＡＲ形質導入Ｔ細胞株における、ＣＡＲ（５０ｋＤａ、上側パネル）、内因性ＣＤ３ζ（１８ｋＤａ、中央パネル）およびアクチン（４３ｋＤａ、下側パネル）発現レベルを、それぞれ抗－ＣＤ３ζおよび抗－アクチン抗体を用いたウエスタンブロットによって決定した。（図１Ｅ）形質導入（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋）または未形質導入（ＣＤ３＋ＧＦＰ－）Ｔ細胞における、活性化（ＣＤ６９＋）細胞の頻度を、ＧＦＰ（ＣＨＯ－ＧＦＰ）またはＨＩＶ－Ｅｎｖ／ＧＦＰ（ＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）を発現する標的細胞との共培養アッセイによって決定した（図７Ｃも参照）。ＣＤ２８（陰影バー）、４－１ＢＢ（灰色バー）およびＨＶＥＭ（黒色バー）ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養アッセイによる標準偏差と平均を示す（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０５（二元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図１Ｆ）共培養アッセイにおけるＩＬ－２分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。ＣＤ２８（陰影バー）、４－１ＢＢ（灰色バー）およびＨＶＥＭ（黒色バー）ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養アッセイによる標準偏差と平均を示す（ｎ＝５）。＊＊Ｐ＜０．０５（二元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図１Ｇ）活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度（ｙ軸）とＣＡＲ発現レベル（ｘ軸）の間の線形回帰分析。（図１Ｈ）共培養アッセイにおいて抗原によって刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＬ－２分泌（ｙ軸）とＣＡＲ発現レベル（ｘ軸）の間の線形回帰分析。
【図2A-2C】ＨＶＥＭ共刺激は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いＣＡＲ発現を示す。（図２Ａ）異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の細胞表面ＣＡＲ発現の比較。棒グラフは、２人の異なるドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の標準偏差と平均を示す（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図２Ｂ）異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間のＣＡＲ発現の比較。ＧＦＰ＋形質導入一次ヒトＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーによって抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体を用いて分析した。２人の異なるドナー由来のＧＦＰ＋細胞におけるＣＡＲ発現（ｘ軸）の代表的なヒストグラムを示す。各ヒストグラムにおける数字は、ＣＡＲのＭＦＩを示す。（図２Ｃ）異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＣＡＲ（５０ｋＤａ、上側パネル）、内因性ＣＤ３ζ（１８ｋＤａ、中央パネル）およびアクチン（４３ｋＤａ、下側パネル）発現レベルを、それぞれ抗－ＣＤ３ζおよび抗－アクチン抗体を用いたウエスタンブロットによって決定した。
【図3A-3D】ＨＶＥＭ共刺激は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いエフェクター機能を示す。（図３Ａ）異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を、エフェクター：標的比を１０：１、５：１および１：１でＣＨＯ－ＧＦＰ（白丸）またはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ（黒丸）細胞と共培養した。結果は、２人の異なる健康なヒトドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の平均を示す（ｎ＝６）。（図３Ｂ）共培養アッセイのエフェクター：標的比を１０：１でＥＬＩＳＡによって測定した、ＩＬ－２（第１のパネル）、ＴＮＦ－α（第２のパネル）およびＩＦＮ－γ（第３のパネル）分泌を示す（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図３Ｃ）１０：１のエフェクター：標的比での、異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞間の細胞毒性の比較。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図３Ｄ）異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞間の、共培養アッセイにおけるＴＮＦ－α分泌（ｙ軸）とＣＡＲ発現レベル（ｘ軸）の間の線形回帰分析。（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γまたは細胞毒性の線形回帰分析について、図８Ａ－８Ｃも参照）。
【図4A-4E】４－１ＢＢおよびＨＶＥＭの共刺激は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊を回避する。（図４Ａ）異なるＣＳＳを有するＧＦＰ＋形質導入細胞上の、ＰＤ－１（ｘ軸）およびＬＡＧ－３（ｙ軸）の細胞表面発現の代表的なプロットを示す。各プロットにおける数字は、ＣＡＲ－Ｔ細胞における各集団の頻度を示す。（図４Ｂ）棒グラフは、異なるＣＳＳを有する各ＣＡＲ－Ｔ細胞における、疲弊した（ＰＤ－１＋／ＬＡＧ－３＋）集団を示す。２人の異なる健康なヒトドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の標準偏差と平均を示す（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。（図４Ｃ）異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞間の、共培養アッセイにおけるＴＮＦ－α分泌（ｙ軸）と疲弊した（ＰＤ１＋／ＬＡＧ－３＋）ＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度（ｘ軸）の間の線形回帰分析。（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γまたは細胞毒性の線形回帰分析について図９Ａ－９Ｃも参照）。（図４Ｄ）棒グラフは、ＨＶＥＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、１つまたは２つの抑制性受容体を発現する集団の頻度がより低かったことを示す。（図４Ｅ）ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊を回避する。代表的なプロットは、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞上の、ＰＤ－１（ｘ軸）およびＬＡＧ－３（ｙ軸）の細胞表面発現を示す。各プロットにおける数字は、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞における各集団のパーセンテージを示す。
【図5A-5D】共刺激シグナルは、メモリーＴ細胞集団のバランスに影響する。（図５Ａ）異なるＣＳＳを有するＧＦＰ＋細胞上の、ＣＤ４５ＲＯ（ｘ軸）およびＣＣＲ７（ｙ軸）の細胞表面発現の代表的なプロットを示す。各プロットにおける数字は、ＣＡＲ－Ｔ細胞における各集団の頻度を示す。（図５Ｂ）棒グラフは、異なるＣＳＳを有する各ＣＡＲ－Ｔ細胞における、ナイーブ（ＴＮ：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ－）、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＯ＋）および最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ：ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＯ）集団の頻度を要約する。（図５Ｃ）棒グラフは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の、ＴＣＭおよびＴＥＭ頻度（ｙ軸）を示す。（図５Ｄ）棒グラフは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の、ＴＣＭおよびＴＥＭの集団の比（ＴＥＭに対するＴＣＭ）を示す。結果は、２人の異なるドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の平均を示す（ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。
【図6A-6H】ＨＶＥＭ共刺激は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエネルギー代謝を、よりエネルギー的に活性の状態に再プログラムする。（図６Ａ）基礎代謝状態下およびミトコンドリア阻害剤に応答した、異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）。データは、２人の異なる健康なヒトドナー由来の異なる分類がされた細胞を用いて行なわれた２つの実験の要約であり、標準偏差と平均としてプロットされる。（図６Ｂ）基礎ＯＣＲレベルの測定。（図６Ｃ）基礎細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）レベルの決定。（図６Ｄ）（オリゴマイシン添加前の最後の速度測定値）－（オリゴマイシン添加後の最小速度測定値）として定義されるＡＴＰ産生。（図６Ｅ）最大ＯＣＲレベルの測定。（図６Ｆ）予備呼吸の測定。（図６Ｇ）非ミト（Ｎｏｎ－ｍｉｔｏ）呼吸の測定。（図６Ｈ）プロトン漏出の測定。棒グラフは、２人の異なる健康なヒトドナー由来の細胞を用いた２つの別個の実験の標準偏差と平均を示す。＊＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析；ｂｏｎｆｆｅｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔ－ｈｏｃ）。
【図7A-7C】レンチウイルス形質導入によって達成された、同様の形質導入効率。（図７Ａ）ＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の典型的なドットプロット。形質導入効率およびＣＡＲ発現を、ＧＦＰ発現（ｙ軸）および抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体染色（ｘ軸）の後にフローサイトメトリーによって決定した。プロットにおける数字は、各細胞集団の頻度を示す。（図７Ｂ）示されたＣＳＳを有するＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞間の、ＧＦＰ＋形質導入細胞（ｙ軸）の頻度。標準偏差と平均を示す（ｎ＝５）。（図７Ｃ）共培養アッセイにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性化を決定するためのゲーティング戦略。共培養アッセイにおける抗原活性化ＣＡＴ－Ｔ細胞に関する分析戦略。標的細胞（ＨＩＶ ｇｐ１２０＋ＧＦＰ＋ＣＨＯ細胞）を、ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞と共培養した。共培養後のＧＦＰ（ｙ軸）対ＣＤ３（ｘ軸）の代表的なドットプロット（左側パネル）。形質導入細胞を、ＧＦＰ／ＣＤ３発現に基づいて標的細胞から分離して、ＣＤ６９発現の分析に用いた（中央および右側パネル）。代表的なプロットは、標的細胞と共培養した際の、未形質導入（ＣＤ３＋ＧＦＰ－、中央プロット）または形質導入（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋、右側プロット）エフェクター細胞における、活性化された（ＣＤ６９＋）細胞の頻度を示す。各プロットにおける数字は、活性化された細胞集団の頻度を示す。
【図8A-8C】異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞間の、エフェクター機能とＣＡＲ発現レベルの間の線形回帰分析。グラフは、ＩＬ－２分泌（図８Ａ）、ＩＦＮ－γ分泌（図８Ｂ）または細胞毒性（図８Ｃ）（ｙ軸）と、ＣＡＲ発現レベル（ｘ軸）の間の線形回帰分析の結果を示す。結果は、２人の異なる健康なヒトドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の平均を示す（ｎ＝６）。
【図9A-9C】エフェクター機能と、異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の間の線形回帰分析。グラフは、ＩＬ－２分泌（図９Ａ）、ＩＦＮ－γ分泌（図９Ｂ）または細胞毒性（図９Ｃ）（ｙ軸）と、ＣＡＲ発現レベル（ｘ軸）の間の線形回帰分析の結果を示す。結果は、２人の異なる健康なヒトドナー由来の一次ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた２つの別個の実験の平均を示す（ｎ＝６）。
【図10A-10B】ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現による、メモリーＴ細胞サブセットの分析。（図１０Ａ）異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を有するセントラルメモリーＴ細胞の増大。（図１０Ｂ）それぞれＣＤ２８および４－１ＢＢ由来のＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を有するエフェクターメモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞の増大。
【図11A-11C】ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＨＶＥＭに基づくＣＡＲ発現。（図１１Ａ）様々なＣＡＲ発現レンチウイルスベクター構築物の略図。ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインとして腎細胞腫瘍関連の膜貫通タンパク質炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に結合し、共刺激シグナル配列が異なる、抗－ＣＡＩＸ－ｓｃＦＶを含む。（図１１Ｂ）ＣＡＲ－形質導入ヒト細胞の典型的なドットプロット。形質導入効率およびＣＡＲ発現を、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体染色の後にフローサイトメトリーを介して決定した（ｘ軸）。プロットにおける数字は、それぞれの細胞集団の頻度を示す。（図１１Ｃ）示されるように異なるＣＳＳを有する細胞内のＣＡＲにおけるｃ－ｍｙｃの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｙ軸）。
【図12A-12C】ＨＶＥＭ－ＣＡＲは、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いエフェクター機能を示す：腫瘍関連の膜貫通炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を発現する２つのヒト腎癌細胞株と、ＣＡＩＸ発現なしのコントロール腎癌細胞株。（図１２Ａ）形質導入ヒト腎癌細胞株ＡＣＨＮ、Ｋｅｔｒ－３、およびＯＳＲＣにおける、ＣＡＲ発現のゲーティングおよび分析。（図１２Ｂ）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞が腎癌細胞を死滅化するカイネティクスを示すデータ。（図１２Ｃ）ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞が腎癌細胞を死滅化するのを示す要約データ。（図１２Ｄ）ヒト腎癌細胞株Ｋｅｔｒ－３と共培養したアッセイにおける、異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＥＬＩＳＡによって測定したＩＦＮ－γ（左側パネル）およびＩＬ－２（右側パネル）分泌。（図１２Ｅ）ヒト腎癌細胞株ＯＳＲＣ－２と共培養したアッセイにおける、異なるＣＳＳを有するヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＥＬＩＳＡによって測定したＩＦＮ－γ（左側パネル）およびＩＬ－２（右側パネル）分泌。
【図14A-14C】マウスにおいてインビボで効率的な抗－腎臓腫瘍を示すＨＶＥＭ－ＣＡＲ Ｔ細胞。（図１４Ａ）マウスにおける、ヒト腎癌（ＲＣ）処置デザインを示す概略図。（図１４Ｂ）ＮＳＧマウスにおける、１４日目の末梢血中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を示す要約データ。（図１４Ｃ）肺に転移したヒト腎癌細胞を有するＮＳＧマウスのＣＡＲ－Ｔ療法後の全生存。
【図15A-15C】ＨＶＥＭ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボでより良好の拡大を示す。（図１５Ａ）インビトロ形質導入後のＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージ。（図１４Ｂ）１４日目のＮＳＧマウスにおける末梢血中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞。（図１４Ｃ）全マウス血液細胞のパーセンテージとしてのヒトＴ細胞（左側パネル）またはヒトＴ細胞カウント／１００μｌのマウス血液（右側パネル）の要約データ。
【図16】終了時に転移が減少したマウス肺の写真。
【図17】終了時に転移が減少したマウス肺の組織病理学。
【図18】第三世代のＣＡＲの略図。全ての構築物は、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０タンパク質由来の細胞質ドメインとともにＨＶＥＭ共刺激ドメインを含む。最後の３つの構築物において、ｐＲＲＬ－ＶＲＣ０１－ＣＤ８－ＨＶＥＭ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ構築物内のＨＶＥＭおよびＯＸ４０ドメイン間にリンカーを置き、または、ＣＤ３ｚドメイン内のＩＴＡＭ３モチーフをＰＤ－１ ＩＴＩＭに突然変異させた。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明はここで、本発明の好ましい実施態様が示される添付図面を参照して、より詳細に説明される。しかしながら本発明は異なる形で実現され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈すべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全なものとなり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されるものである。
【0022】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、本発明の説明で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみのものであり、本発明を制限することを意図しない。本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、特許、特許文献および他の参考文献は、参考文献が示される文章および／または段落に関連がある教示に関してそれらの全体で参照により援用される。
【0023】
ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って表される。
【0024】
別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法を、遺伝子クローニング、核酸の増幅および検出などに用いてよい。そのような技術は当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照。
【0025】
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。
【0026】
また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられたアイテムの１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせを指し、および包含し、ならびに、選択的に解釈される場合（「または」）は、組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【0027】
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の抗体、化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合、規定の量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0028】
本発明のアミノおよび／またはヌクレオチド配列に適用される用語「から本質的になる」（および文法上の変形）は、挙げられた配列（例えば配列番号）と、挙げられた配列のＮ末端および／またはＣ末端および／または５’および／または３’末端上の合計１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のアミノ酸および／またはヌクレオチドの、両方からなるアミノおよび／またはヌクレオチド配列であって、アミノおよび／またはヌクレオチド配列がその標的に結合する能力が実質的に変更されないようなものを意味する。例えば、合計１０個以下の追加のヌクレオチドは、５’および３’末端の両方の追加のヌクレオチドを足し合わせた合計数を含む。ヌクレオチド配列の結合に適用される用語「実質的に変更」とは、挙げられた配列からなるヌクレオチド配列の結合親和性と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い結合親和性の増大または低減を指す。
【0029】
本発明の範囲において、用語「抗体」は、全長免疫グロブリンおよびそのフラグメントを指す。そのような全長免疫グロブリンは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、べニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）またはヒト抗体であってよい。
【0030】
用語「抗体フラグメント」は、全長免疫グロブリンの部分であって前記免疫グロブリンの標的化特異性を維持するものを含む。抗体フラグメントの全てではないが多くは、全長免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ領域）が少なくとも部分的に欠失している。一部の実施態様では、抗体フラグメントは、全長免疫グロブリンの消化によって生産される。抗体フラグメントは、免疫グロブリン部分または免疫グロブリン鎖を含む合成または組み換え構築物であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．９，ｐ．１１２６－１１３６を参照）。抗体フラグメントの例は、制限されずに、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｖ（ＮＡＲ）または最小認識単位を含む。「単鎖可変フラグメント」または「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、抗体フラグメントの１つのタイプである。ｓｃＦｖは、リンカーによって連結された免疫グロブリンのＶＨおよびＶＬを含む融合タンパク質である。それらはしたがって、全長免疫グロブリン内に存在する定常Ｆｃ領域が欠失しているが、元の免疫グロブリンの特異性を維持する。
【0031】
本明細書において用いられる、抗体のＶＨおよびＶＬにおけるアミノ酸残基位置を同定するためのナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａによって説明される「ＡＨｏ」システムに相当する。免疫グロブリン可変ドメインに関するさらに別のナンバリングスキーム：Ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，ｖｏｌ．３０９，ｐ．６５７－６７０。その文献は、ＡＨｏおよびＫａｂａｔシステム（Ｕ．Ｓ．ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ ＡＮＤ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＶＩＣＥＳ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓによって編集された、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．，１９９１．ｐ．９１－３２４２）の間の換算表をさらに提供する。
【0032】
本明細書において用いられる、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、相互交換可能に用いられ、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびＲＮＡとＤＮＡのキメラを含む。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、または核酸という用語は、鎖長にかかわらずヌクレオチドの鎖を指す。
【0033】
用語「フラグメント」は、参照核酸またはヌクレオチド配列と比較して減少した長さのヌクレオチド配列を意味すると理解され、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる。本発明に係るそのような核酸フラグメントは、適切な場合、より大きなポリヌクレオチド内に含まれて、その一構成となっていてよい。一部の実施態様では、そのようなフラグメントは、本発明に係る核酸またはヌクレオチド配列の、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の長さの連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含むことができ、から本質的になることができ、および／または、からなることができる。
【0034】
本明細書において用いられる用語「同一性」は、２つのタンパク質または核酸の間の配列一致を指す。比較されるタンパク質または核酸配列は、例えばＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ペアワイズアライメント；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで利用可能）のような生物情報学ツールを用いて、最大の同一性を与えるようにアライメントされる。比較される配列内の同じ位置が同じ核酸塩基またはアミノ酸残基で占められている場合、その結果、それぞれの分子は、まさにその位置において同一である。したがって、「パーセント同一性」は、一致する位置の数を、比較される位置の数で割って１００％をかけた関数である。例えば、１０個のうち６個の配列位置が同一であるならば、その結果、同一性は６０％である。２つのタンパク質配列間のパーセント同一性は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅに組み入れられているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１９７０，ｖｏｌ．４８、ｐ．４４３－４５３）を用いて、「ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）」を１０、「ギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）」を０．５、偽（ｆａｌｓｅ）「エンドギャップペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）」、「エンドギャップ開始ペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）」を１０、「エンドギャップ伸張ペナルティ（ｅｎｄ ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）」を０．５で、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて決定することができる。同一の一次アミノ酸または核酸配列を有する２つの分子は、いかなる化学的および／または生物学的な改変にも関係なく同一である。例えば、同一の一次アミノ酸配列を有するがグリコシル化パターンが異なる２つの抗体は、この定義によると同一である。核酸の場合は、例えば、同一の配列を有するが結合構成要素がリン酸の代わりにチオリン酸のように異なる２つの分子は、この定義によると同一である。
【0035】
本明細書において用いられる用語「変異」は、本明細書において開示される親配列の少なくとも１つの所望の活性を維持しながら、１つまたは複数のアミノ酸残基または核酸塩基の付加（挿入を含む）、欠失および／または置換によって親配列と異なるアミノ酸または核酸配列を指す。ＣＡＲの場合、かかる所望の活性は、特異的な標的結合を含んでよい。同様に、変異核酸配列は、１つまたは複数の核酸塩基の付加、欠失および／または置換によって、親配列と比較すると改変され得るが、コードされるＣＡＲは、上述の所望の活性を維持する。変異は、対立遺伝子またはスプライス変異のような天然起源であってよく、または人工的に構築されてよい。
【0036】
また、本明細書において用いられる「１つまたは複数」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを意味する。
【0037】
本明細書において用いられる、本発明によって治療され得る「対象」は、医学的および／または治療的目的のためのヒト対象および獣医学的および薬物スクリーニングおよび開発目的のための動物対象の両方を含む。他の適切な動物対象は、一般に、哺乳類対象、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）などである。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、胎児、新生児、幼児、未成年、成人および老人対象を含む。
【0038】
本明細書において用いられる用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の低減、腫瘍細胞の数の低減、増殖速度の低減、転移数の低減、平均余命の増大、および／または、癌性状態と関連する様々な生理学的症候の寛解によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体が、腫瘍の発生をそもそも遅らせる能力によっても明らかにされ得る。
【0039】
本明細書において用いられる用語「自家」は、後に再導入される同一個体から採取される任意の材料を指すことを意味する。
【0040】
「同種間（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」は、同一種の異なる動物から採取される移植組織を指す。
【0041】
「異種間（Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）」は、異なる種の動物から採取される移植組織を指す。
【0042】
本明細書において用いられる、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」（または単純に「抗体部分」または「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を維持する抗体の、１つまたは複数のフラグメント、部分またはドメインを指す。全長抗体のフラグメントは、抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦ（ａｂ）’フラグメントを含む二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別個の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域のペアが一価分子を形成する単一の連続した鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーによって連結され得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照）。そのような単鎖抗体もまた、用語抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されることが意図される。ダイアボディのような単鎖抗体の他の形態も包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８を参照）。
【0043】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域内の特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原性決定因子を指す。単一の抗原は、１つよりも多いエピトープを有し得る。エピトープは、立体構造的または線状のいずれかであってよい。立体構造的エピトープは、１つ（または複数）の線状ポリペプチド鎖（単数または複数）の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって生産される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって生産されるエピトープである。特定の実施態様では、エピトープは、他の部分、例えば、糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基を抗原上に含んでよい。
【0044】
本明細書において用いられる「抗体重鎖」は、全抗体分子内にそれらの天然起源の立体構造で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の大きな方を指す。
【0045】
本明細書において用いられる「抗体軽鎖」は、全抗体分子内にそれらの天然起源の立体構造で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の小さな方を指し、κおよびλ軽鎖は、２つの主な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【0046】
本明細書において用いられる用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体生産もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を伴い得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として作用することができることを理解している。さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムＤＮＡから得ることができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、「抗原」を、その用語が本明細書において用いられる場合にコードすることを理解している。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解している。本発明は、制限されないが、１つよりも多い遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、および、これらのヌクレオチド配列が様々な組み合わせで並べられて所望の免疫応答を誘発することが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解している。抗原は、合成することができ、または生物学的サンプルから採取することができることが容易に明らかである。そのような生物学的サンプルは、制限されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生物学的流体を含むことができる。
【0047】
本明細書において用いられる「アミノ酸」は、α炭素上に上に遊離カルボキシル基および遊離非置換アミノ基を有する化合物を指し、それが、ペプチド結合によって連結されて本明細書中に記載のペプチド活性剤を形成し得る。アミノ酸は、標準的または非標準的、天然または合成であってよく、例（およびそれらの略称）は、制限されないが以下を含む：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸
Ａｌａ＝Ａ＝アラニン
Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン
Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン
Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン
Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸
Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン
Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ＝バリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎａｌ＝２－ナフチルアラニン
Ｎｖａ＝ルバリン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｔｈｉ＝２－チエニルアラニン
Ｐｃｐ＝４－クロロフェニルアラニン
Ｂｔｈ＝３－ベンゾチエニルアラニン（ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）
Ｂｉｐ＝４，４’－ビフェニルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｎｂ＝α－アミノノルマル酪酸（ａｍｉｎｏｎｏｒｍａｌ ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）
Ｄｉｐ＝２，２－ジフェニルアラニン
Ｔｈｚ＝４－チアゾリルアラニン
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸
Ａｌａ＝Ａ＝アラニン
Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン
Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン
Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン
Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸
Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン
Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ＝バリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎａｌ＝２－ナフチルアラニン
Ｎｖａ＝ルバリン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｔｈｉ＝２－チエニルアラニン
Ｐｃｐ＝４－クロロフェニルアラニン
Ｂｔｈ＝３－ベンゾチエニルアラニン（ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）
Ｂｉｐ＝４，４’－ビフェニルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｎｂ＝α－アミノノルマル酪酸（ａｍｉｎｏｎｏｒｍａｌ ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）
Ｄｉｐ＝２，２－ジフェニルアラニン
Ｔｈｚ＝４－チアゾリルアラニン
【0048】
本明細書において言及される全てのペプチド配列は、通常の慣習に従って書かれ、したがって、Ｎ末アミノ酸が左側でありＣ末アミノ酸が右側である。２つのアミノ酸残基間の短い線（または線はない）は、ペプチド結合を示す。
【0049】
「塩基性アミノ酸」は、ｐＨ６．０で正電荷の任意のアミノ酸を指し、制限されないが、Ｒ、Ｋ、およびＨを含む。「芳香族アミノ酸」は、α炭素に結合した側鎖内に芳香族基を有する任意のアミノ酸を指し、制限されないが、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびＨを含む。
【0050】
本明細書において用いられる用語「検出可能な部分」は、任意の適切な検出可能基、例えば、当技術分野でよく知られており公知技術に従って用いられる、放射標識（例えば３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、グリーン蛍光タンパク質など）などを含む。
【0051】
「免疫応答」は、抗原の存在に対する対象の反応を指し、以下：抗体の作製、免疫の発生、抗原に対する過敏性の発生、および寛容の発生の、少なくとも１つを含んでよい。
【0052】
本明細書において用いられる用語「免疫応答を高める」は、抗原の存在に対する対象の反応が、本発明のＣＡＲの不存在下での抗原の存在に対する対象の反応と比較して、本発明のＣＡＲの存在下で増加および／または増幅されることを含意している。
【0053】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療するステップ（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「～の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」によって、対象の状態の重症度が減少または少なくとも部分的に改善または改変されること、および、少なくとも１つの臨床症候における何らかの軽減、緩和または低減が達成されることが意図される。
【0054】
本明細書において用いられる「効果的な」量は、所望の効果を提供する量である。
【0055】
本明細書において用いられる「治療的に効果的な」量は、なんらかの改善または利益を対象に提供する量である。別の言い方をすると、「治療的に効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候の何らかの軽減、緩和、または低減を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。
【0056】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメイン、および、Ｔ細胞受容体によって仲介されるシグナル伝達経路を真似することが可能なシグナル伝達ドメインからなる人工抗原受容体である。標的分子に対する抗体の単鎖可変領域または天然リガンドが、ＣＡＲの抗原結合ドメインとして用いられている。ＣＡＲの利点は、抗原プロセッシングまたは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって制限される抗原提示を必要とすることなく所定の標的を認識することができ、Ｔ細胞発現ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が広範囲の患者の養子免疫療法のための有用なツールとして役立つ可能性をもたらすことである（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７（１）：１０７（２０１４））。シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζを有する第一世代ＣＡＲを発現するＴ細胞は、しばしばアネルギー性になり、強力な免疫応答を誘発できない（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（２０Ｐｔ１）：６１０６（２００６））。この問題を解決するために、ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の１つおよび２つの共刺激シグナル（ＣＳＳ）ドメインを有する第二および第三世代のＣＡＲが開発された（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７（１）：１０７（２０１４））。モジュール構造を有するこれらのＣＡＲは、抗原刺激の際にＴ細胞受容体によって仲介されるシグナル伝達をうまく真似て、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および活性化をもたらすことが示されている（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２３（１７）：２６２５（２０１４））。
【0057】
ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いたＢ細胞悪性腫瘍に対する養子免疫療法の臨床試験は、有望な結果を示し（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２５（２６）：４０１７（２０１５））、細胞はアメリカ食品医薬品局によって２０１７年に承認され、臨床適用のためのさらなる拡張の可能性が示唆された（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３８（１２）：６８３（２０１５））。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の養子移入は、リンパ性悪性腫瘍に対するものよりも目立たない治療的効果を固形腫瘍に対して示した（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ３：１６００６（２０１６））。ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍浸潤を促進するヘパラナーゼが抗腫瘍効果を増大させることが最近報告されているので（Ｃａｒｕａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（５）：５２４（２０１５））、固形腫瘍に対する治療有効性を改善するためには、腫瘍微小環境を改変することが助けとなり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって仲介される免疫療法の有用性を増大させるためには、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能および特性をさらに改善することも必要であり得る。共刺激は、Ｔ細胞が、効果的なエフェクター機能を示すのに重要なイベントであり、共刺激分子によって仲介される。共刺激分子は、２つの主なファミリー；ＣＤ２８ファミリー（ＣＤ２８およびＩＣＯＳを含む）、および、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）（４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）およびヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ１４）を含む）に分けられる。これまで、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来のＣＳＳドメインが、ＣＡＲを構築するのに一般に用いられてきた。以前の研究では、４－１ＢＢ由来のＣＳＳドメインを有する第二世代ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ほとんどの患者の血液中で６ヶ月よりも長く持続するが、ＣＤ２８由来ＣＳＳドメインを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、３ヶ月後にはほとんど検出不可能になることが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６（３２）：３３９６１（２０１５））。さらに、４－１ＢＢによって仲介される共刺激は、ミトコンドリア生合成およびエネルギー生産のための酸化的代謝を選択的に誘導して、高い分化をもたらし、セントラルメモリーＴ細胞のインビトロでの持続性を増大させた（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４（２）：３８０（２０１６））。さらに、４－１ＢＢによって仲介される共刺激は、トニック（ｔｏｎｉｃ）シグナリングによって誘導されるＴ細胞疲弊を回避する（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（６）：５８１（２０１５））。したがって、ＴＮＦＲＳＦ由来のＣＳＳドメインは、第二世代ＣＡＲの関連におけるＣＤ２８ファミリー由来のものよりも良好に機能すると考えられる。
【0058】
ＴＮＦＲＳＦの別のメンバーであるＨＶＥＭの、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能およびメモリーＴ細胞の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における役割を示唆した報告が蓄積している。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＶＥＭ不足は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および防御免疫メモリーの発生を大いに損なわせることが示されている（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７７９９１（２０１３））。ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＨＶＥＭのリガンドの１つ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現されたＨＶＥＭとの相互作用も、細菌感染に応答して、生存およびメモリー産生（ｍｅｍｏｒｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を促進することが報告された（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７７９９２（２０１３））。さらに、抗－ＨＶＥＭ単鎖抗体を発現する腫瘍細胞は、共培養されたＴ細胞の強力な増殖およびサイトカイン産生を誘導し（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１（２）：２０３（２０１２））、ＨＶＥＭが、Ｔ細胞において強力なＣＳＳとして役立つことを示唆する。しかしながら、ＨＶＥＭが、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、有用な共刺激シグナルとして働くことができるかどうかについては報告されていない。
【0059】
ＣＡＲモジュールにおける効果的なＣＳＳの同定は、固形腫瘍および病原体感染（例えば、慢性ウイルスまたは細菌の感染）のような、多種多様の疾患に対してＣＡＲ－Ｔ細胞療法を適用するための重要な要件の１つである。本発明者らは、ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ由来のＣＳＳドメインと組み合わせて、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ－１）の表面エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を標的とする抗原結合ドメインとして、ＣＤ４の細胞外ドメイン（可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）として知られる）を含む、第二世代ＣＡＲを開発した（図１Ａ）。異なるＣＳＳを有するｓＣＤ４－ＣＡＲを用いて、本発明者らは、ＣＡＲ－形質導入Ｔ細胞機能と、ヒトＴ細胞株および一次ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方から作製されるＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲ発現の間の関連性を観察した。この関連性は、ＣＡＲ内のＣＳＳに依存し、ＨＶＥＭ ＣＳＳが、最も強力なＣＳＳを提供することが示された。表現型および代謝分析によって、ＨＶＥＭ ＣＳＳは、著しくより高い解糖系およびミトコンドリア呼吸とともに、同等の割合のセントラルおよびエフェクターメモリー表現型を誘導することが示された。さらに、ＨＶＥＭ ＣＳＳは、ＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避した。これらの結果は予期されないものであり、驚くべきことに、ＣＡＲ内のＣＳＳが、エネルギー代謝の調整を通してＣＡＲ－Ｔ細胞の活性および特性に影響を与え、ＨＶＥＭが、効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を開発するための有用なＣＳＳであり得るという最初の証拠を提供することが示唆された。
【0060】
したがって、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体ドメイン、および、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ）タンパク質またはその機能性フラグメントを含む共刺激シグナル（ＣＳＳ）ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【0061】
ＣＳＳドメインは、Ｔ細胞受容体ドメインの細胞内シグナルを促進してＴ細胞の活性化および増殖を開始するのに必須である。したがって、そのようなシグナルの促進は、選択されるＣＳＳドメインおよび／またはその組み合わせに依存し得る。例えば、本発明では、ＨＶＥＭタンパク質またはその機能性フラグメントもしくは変異体を含むＣＳＳドメインは、Ｔ細胞の活性化および増殖を促進する。特に、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳは、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳドメインを含まないＣＡＲと比較して、増大した解糖系およびミトコンドリア呼吸と関連する高いエフェクター機能を促進する。
【0062】
一部の実施態様では、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳドメインを含むＣＡＲ－Ｔ細胞は、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳドメインを含まないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、少なくとも約５０％～約１００％、約６０％～約９０％、または約７０％～約８０％（または少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％）、ＣＡＲ－Ｔ解糖系が増大する。一部の実施態様では、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳドメインを含むＣＡＲ－Ｔ細胞は、本発明のＨＶＥＭ ＣＳＳドメインを含まないＣＡＲ－Ｙ細胞と比較して、少なくとも約５０％～約１００％、約６０％～約９０％、または約７０％～約８０％（または少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％）、ミトコンドリア呼吸が増大する。
【0063】
一部の実施態様では、ＨＶＥＭ ＣＳＳドメインは、ＷＶＷＷＦＬＳＧＳＬＶＩＶＩＶＣＳＴＶＧＬＩＩＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴＧＲＳＰＮＨ（配列番号１）のアミノ酸配列、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、ＨＶＥＭ ＣＳＳは、ＬＶＩＶＩＶＣＳＴＶＧＬＩＩＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴ（配列番号２）のアミノ酸を有するＨＶＥＭのフラグメント、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその変異体を含む、から本質的になる、またはからなる。
【0064】
一部の実施態様では、ＣＳＳドメインは、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のさらなるＣＳＳドメイン、その変異体、および／またはフラグメントをさらに含む。非限定的な例は、ＣＤ２８ ＣＳＳドメイン、４－１ＢＢ ＣＳＳドメイン、ＯＸ－４０ ＣＳＳドメイン、ＩＣＯＳドメイン、または、それらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有する、現在知られているかまたは後に同定される任意の他のＣＳＳドメインおよび／またはそれらの機能性フラグメントまたは変異体を、任意の組み合わせで含む。一部の実施態様では、リンカーが、２個以上のドメインの間に存在してよい（例えば３～１２残基のリンカー、例えば、５～８残基のリンカー）。例示的な構築物を図１８に示す。
【0065】
Ｔ細胞受容体ドメインは、Ｔ細胞を部分的に活性化する細胞内シグナルに、受容体リガンド結合のイベントを伝達する、シグナリングドメインである。適切な共刺激シグナルがない場合は、このイベントは有用なＴ細胞活性化および増殖に不十分である。本発明のＴ細胞受容体ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ζ）のＴ細胞受容体ドメインである。一部の実施態様では、本発明のＣＡＲのＴ細胞受容体ドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインまたはＴ細胞受容体由来の関連Ｔ細胞受容体ドメイン、またはそれらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するそれらの機能性フラグメントまたは変異体を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、ＣＤ３ζドメイン内のＩＴＡＭ３モチーフは、ＰＤ－１ ＩＴＩＭに突然変異され得る。関連Ｔ細胞受容体の例は、限定されないが、ＩＴＡＭを含んでいる一次細胞質シグナリング配列、例えば、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９Ｂ、および／またはＣＤ６６ｄを含む。
【0066】
膜貫通ドメインは、全体としてのＣＡＲの安定性に必須である。一部の実施態様では、膜貫通ドメインは、細胞（例えば、Ｔ細胞）の膜全体に広がっている疎水性αヘリックスであってよい。一部の実施態様では、膜貫通ドメインは、任意のＩ型膜貫通タンパク質、例えば、ＣＤ４、ＣＤ２８またはＨＶＥＭ、または、それらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するそれらの機能性フラグメントまたは変異体由来であってよい。一部の実施態様では、膜貫通タンパク質は、ＣＤ２８、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその機能性フラグメントである。
【0067】
抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンド（すなわち抗原）を認識するように選択され得る。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、一価抗体フラグメントを含む。一部の実施態様では、一価抗体フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントを含む。一部の実施態様では、一価抗体フラグメントは、約２５～約３０ｋＤａ（または約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、または３０ｋＤａ）の分子量を有する。一部の実施態様では、一価抗体フラグメントは、フレキシブルリンカーによっていずれかの方向で連結されたＶＨおよびＶＬドメイン（例えば、ＶＬ－リンカー－ＶＨまたはＶＨ－リンカー－ＶＬ）を有する。一部の実施態様では、方向は、ＶＬ－リンカー－ＶＨであり、軽鎖可変領域がポリペプチドのＮ末端であり重鎖可変領域がポリペプチドのＣ末端である。フレキシブルリンカーは典型的に、１０～約２５アミノ酸を含み、例えば、グリシンは柔軟性を与え、および／または、セリンおよび／またはトレオニンは溶解度の改善のためである）。例えば、一部の実施態様では、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号３）またはその変異体が用いられる。３～５回の繰り返しを有する前記モチーフのバリエーションを用いてもよい。さらに適切なリンカーは、例えば、Ａｌｆｔｈａｎ，Ｋ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９５，ｖｏｌ．８，ｎｏ．７，ｐ．７２５－７３１に記載されており、その全体で参照により援用される。
【0068】
本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインによって標的化される病状は、癌および／または病原体感染（例えば、慢性ウイルスまたは細菌感染）であり得る。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、癌細胞および／またはウイルス粒子の表面上に存在する抗原を標的化する。例示的な癌および／または腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載される。他の例示的な癌および腫瘍抗原は、限定されないが以下を含む：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公報番号ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；乳頭腫ウイルス抗原；および／または、以下の癌（例えば、固形腫瘍）と関連することが現在知られているかまたは後に発見される抗原：黒色腫、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、膵癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、および、現在知られているかまたは後に同定される任意の他の癌または悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照）。
【0069】
一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、癌細胞の表面上に存在する抗原を標的化する。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、腎癌細胞の表面上に存在する抗原を標的化する。腎癌細胞は、限定されないが、腎細胞癌、移行上皮癌、ウィルムス腫瘍、腎肉腫および／または転移性腎癌由来の細胞を含む。
【0070】
一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、制限されないが、淡明細胞型（ｃｌｅａｒ ａｌｌ）ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性ＲＣＣ、集合管ＲＣＣ、および／または分類されないＲＣＣから選択される腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞の表面上に存在する抗原を標的化する。一部の実施態様では、腎細胞癌細胞は、制限されないが、Ｋｅｔｒ－３および／またはＯＲＳＣ－２またはＡＣＨＮ腎癌細胞株から選択される。例示的な腎癌抗原は、限定されないが、当技術分野で知られているかまたは将来的に同定される腎癌細胞の表面上に存在する任意の表面タンパク質および／またはポリペプチドを含む。
【0071】
一部の実施態様では、本発明の抗原結合ドメインは、表面タンパク質炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的化する。一部の実施態様では、表面タンパク質炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的化する本発明の抗原結合ドメインは、抗－ＣＡＩＸ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む一価抗体フラグメントまたはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその変異体を含む。
【0072】
一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、神経芽腫細胞の表面上に存在する抗原を標的化する。一部の実施態様では、神経芽腫細胞はＰＤＸ細胞株由来であるが、他の神経芽腫細胞株を用いることもできる。例示的な神経芽細胞腫抗原は、限定されないが、当技術分野で知られているかまたは将来的に同定される神経芽腫細胞の表面上に存在する任意の表面タンパク質および／またはポリペプチドを含む。一部の実施態様では、本発明の抗原結合ドメインは、表面タンパク質ジシアロガングリオシドＧＤ２を標的化する。一部の実施態様では、表面タンパク質ジシアロガングリオシドＧＤ２（ａＧＤ２）を標的化する本発明の抗原結合ドメインは、ａＧＤ２のアミノ酸配列を含む一価抗体フラグメントまたはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその変異体を含む。
【0073】
一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、ウイルス粒子の表面上に存在する抗原を標的化する。ウイルス粒子の例は、限定されないが、インフルエンザウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラッサ熱ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、痘瘡ウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトＴ細胞球向性ウイルス、ピコルナウイルス、ヘパドナ（ｈｅｐａ ＤＮＡ）ウイルス、フラビウイルス、デルタウイルス、カリシウイルス、ポリオウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、ＳＡＲＳ、風疹、ノロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、マラリア、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、および／またはヘリコバクターピロリを含む。
【0074】
例示的なウイルス抗原は、限定されないが、上記に挙げたウイルス粒子の表面上に存在する任意の表面タンパク質および／またはポリペプチドを含む。そのような表面タンパク質および／またはポリペプチドの例は、限定されないがジカエンベロープドメイン－３、ジカエンベロープＮ、ＷＮＶエンベロープ、ＷＮＶ Ｐｒｅ－Ｍ、ＶＺＶ ＯＲＦ９、ＶＺＶ ＯＲＦ２６、ＣｏＶ－ＮＬ６３、ＣｏＶ－２２９Ｅ、風疹Ｅ１、ノロウイルスグループ－１ Ｐ－ドメイン、ノロウイルスグループ－２ Ｐ－ドメイン、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１６ Ｅ６、マラリアＰｆ．ＭＳＰ１、マラリアＰｖ．ＭＳＰ１、ラッサキャプシド、ラッサＧＰ１、Ｈ１Ｎ１北京、Ｈ１Ｎ１カリフォルニア、Ｈ１Ｎ１ニューカレドニア、ＨＴＬＶ－１エンベロープ、ＨＴＬＶ－１ ｇｐ２１、ＨＴＬＶ－１モザイク、ＨＩＶ Ｏ型エンベロープ、ＨＩＶ Ｏ型ｇｐ４１、ＨＩＶ－１エンベロープ、ＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐ１７、ｐ２４、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０ ＣＭ、ＣａｇＡピロリ、Ｏｍｐピロリ、ＨＰ－ＮＡＰ、ＨＡＶ Ｐ２Ｃ、ＨＡＶ Ｐ２Ｃ－Ｐ３Ａ、ＨＡＶ Ｐ２Ｃ－Ｐ３Ｂ、ＨＡＶ Ｐ３Ｃ、ＨＡＶ ＶＰ１、ＨＡＶ ＶＰ１－Ｐ２Ａ（６６９－７８２ａ．ａ）、ＨＡＶ ＶＰ１－Ｐ２Ａ（７２２－８３０ａ．ａ．）、ＨＡＶ ＶＰ３、ＨＡＶ ＶＰ４－ＶＰ２、ＨＳＶ ２ ｇＧ、ＨＳＶ－１ ｇＤ、および／またはＨＳＶ－２ ｇＢを含む。一部の実施態様では、ウイルス粒子はＨＩＶ粒子である。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、制限されないが、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のエンベロープタンパク質ＥＮＶのようなＨＩＶ粒子の表面受容体を標的化する。
【0075】
一部の実施態様では、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１の表面エンベロープタンパク質ＥＮＶを標的化する本発明の抗原結合ドメインは、可溶性ＣＤ４タンパク質またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体を含む。一部の実施態様では、可溶性ＣＤ４タンパク質は、アミノ酸配列：ＭＮＲＧＶＰＦＲＨＬＬＬＶＬＱＬＡＬＬＰＡＡＴＱＧＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬＮＤＡＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶＶＬＡ（配列番号４）を含む、から本質的になる、またはからなるヒト可溶性ＣＤ４タンパク質、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体である。
【0076】
一部の実施態様では、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、スペーサーを用いて連結される。様々な異なるスペーサーを用いることができる。例えば、一部の実施態様では、スペーサーは、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０個未満のアミノ酸を含む短いスペーサーである。一部の実施態様では、スペーサーは、Ｆｃ領域の少なくとも一部、例えば、ＣＨ３ドメインのヒトＦｃ領域のヒンジ部またはその変異体を含むことができる。一部の実施態様では、スペーサーは、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域の全て又は一部、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に入る配列、例えば、ＩｇＧ４ ＦｃヒンジまたはＣＤ８ヒンジ領域を含む。例は、限定されないが、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）、またはＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）を含む。一部の実施態様では、スペーサーは、ＡＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤ（配列番号５）のアミノ酸配列を有するＣＤ８ヒンジ領域を含む、から本質的になる、またはからなる。
【0077】
さらなる実施態様では、本発明のＣＡＲは、当技術分野で知られている検出可能な部分および／またはエフェクター分子（その非限定的な例は、薬物、毒素、小分子、抗体、および／または抗体フラグメントを、単独または任意の組み合わせで含む）をさらに含むことができる。一部の実施態様では、本発明のＣＡＲは、抗－ｃ－ｍｙｃタグを含む。
【0078】
一部の実施態様では、本発明のＣＡＲは、ＭＮＲＧＶＰＦＲＨＬＬＬＶＬＱＬＡＬＬＰＡＡＴＱＧＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬＮＤＲＡＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶＶＬＡＡＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＷＶＷＷＦＬＳＧＳＬＶＩＶＩＶＣＳＴＶＧＬＩＩＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴＧＲＳＰＮＨＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号６）のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有する配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【0079】
本発明はさらに、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を提供し、一部の実施態様では、その核酸分子は、ａｔｇａａｃｃｇｇｇｇａｇｔｃｃｃｔｔｔｔａｇｇｃａｃｔｔｇｃｔｔｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｃａｇｇｇａａａｇａａａｇｔｇｇｔｇｃｔｇｇｇｃａａａａａａｇｇｇｇａｔａｃａｇｔｇｇａａｃｔｇａｃｃｔｇｔａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｇａａｇａａｇａｇｃａｔａｃａａｔｔｃｃａｃｔｇｇａａａａａｃｔｃｃａａｃｃａｇａｔａａａｇａｔｔｃｔｇｇｇａａａｔｃａｇｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔａａｃｔａａａｇｇｔｃｃａｔｃｃａａｇｃｔｇａａｔｇａｔｃｇｃｇｃｔｇａｃｔｃａａｇａａｇａａｇｃｃｔｔｔｇｇｇａｃｃａａｇｇａａａｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇａｔｃａｔｃａａｇａａｔｃｔｔａａｇａｔａｇａａｇａｃｔｃａｇａｔａｃｔｔａｃａｔｃｔｇｔｇａａｇｔｇｇａｇｇａｃｃａｇａａｇｇａｇｇａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔｃｇｇａｔｔｇａｃｔｇｃｃａａｃｔｃｔｇａｃａｃｃｃａｃｃｔｇｃｔｔｃａｇｇｇｇｃａｇａｇｃｃｔｇａｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｇｇａｇａｇｃｃｃｃｃｃｔｇｇｔａｇｔａｇｃｃｃｃｔｃａｇｔｇｃａａｔｇｔａｇｇａｇｔｃｃａａｇｇｇｇｔａａａａａｃａｔａｃａｇｇｇｇｇｇｇａａｇａｃｃｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｇａｔａｇｔｇｇｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｔｇｃａｇａａｃｃａｇａａｇａａｇｇｔｇｇａｇｔｔｃａａａａｔａｇａｃａｔｃｇｔｇｇｔｇｃｔａｇｃｔｇａａｔｔｃｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇａｔｃａｇｃｇａｇｇａｇｇａｃｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａｃａｇｃａｔｃａｔｇｔａｃｔｔｃａｇｃｃａｃｔｔｃｇｔｇｃｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃａａｇｃｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃａｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｃａｇｃｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｃｇｃｃｃｃｇａｇｇｃｃａｇｃｃｇｃｃｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｇｃｃｇｔｇｃａｃａｃｃｃｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｔｃｃｔｇａｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｇｔｇａｔｃｇｔｇａｔｃｇｔｇｔｇｃａｇｃａｃｃｇｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｃａｔｃｔｇｃｇｔｇａａｇｃｇｃｃｇｃａａｇｃｃｃｃｇｃｇｇｃｇａｃｇｔｇｇｔｇａａｇｇｔｇａｔｃｇｔｇａｇｃｇｔｇｃａｇｃｇｃａａｇｃｇｃｃａｇｇａｇｇｃｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｃｃａｃｃｇｔｇａｔｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｃｃｃｃｃｃｇａｃｇｔｇａｃｃａｃｃｇｔｇｇｃｃｇｔｇｇａｇｇａｇａｃｃａｔｃｃｃｃａｇｃｔｔｃａｃｃｇｇｃｃｇｃａｇｃｃｃｃａａｃｃａｃｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｃｃｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｔａｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｃａａｃｇａｇｃｔｇａａｃｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇｔａｃｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａａｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａｇａｔｇｇｇｃｇｇｃａａｇｃｃｃｃｇｃｃｇｃａａｇａａｃｃｃｃｃａｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａｇａｔｇｇｃｃｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｃｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｇｃｔａａ（配列番号７）のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、０７％、９８％、９９％、または９９．５％同一性を有する配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【0080】
本発明の核酸分子を含んでいるベクターが、本明細書においてさらに提供される。ベクターは、限定されないが、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、またはコスミドベクターを含む。本発明のＴリンパ球は、例えば、ＣＡＲがＴリンパ球において生産される条件下でウイルスベクターを用いて形質導入され得る。ベクターの選択は、導入される宿主細胞にしばしば依存する。
【0081】
一部の実施態様では、本発明は、本発明のＣＡＲを含んでいる細胞を提供し、一部の実施態様では、本発明は、本発明の核酸分子および／またはベクターを含んでいる細胞を提供する。本発明の細胞の非限定的な例は、αβＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞、および任意のそれらの組み合わせを含む。
【0082】
一部の実施態様では、本発明は、癌細胞および／またはウイルス粒子の表面上に存在する抗原を認識して結合するＣＡＲを含んでいる細胞傷害性Ｔリンパ球を提供する。例えば、一部の実施態様では、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１の表面エンベロープタンパク質ＥＮＶを認識して結合する、ＣＡＲを含んでいる細胞傷害性Ｔリンパ球である。一部の実施態様では、癌細胞の表面タンパク質、例えば、腎癌細胞の表面タンパク質（すなわち、ＣＡＩＸ）および／または神経芽腫細胞の表面タンパク質（すなわち、ａＧＤ２）を認識して結合する、ＣＡＲを含んでいる細胞傷害性Ｔリンパ球である。細胞傷害性Ｔリンパ球を、それから、ウイルスベクターを用いて形質導入することができ、または、本発明のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含んでいるプラスミドまたは核酸構築物を用いてトランスフェクトすることができ、一部の実施態様では、ヌクレオチド配列は、他のＣＡＲ－Ｔ細胞に関して病院で用いられる任意のレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。
【0083】
特定の実施態様では、本発明は、癌細胞および／またはウイルス粒子の表面上に存在する抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１の表面エンベロープタンパク質ＥＮＶ、ＣＡＩＸおよび／またはｓＧＤ２）に特異的な抗原結合フラグメント、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）、Ｔ細胞受容体ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、および本発明のＨＶＥＭタンパク質を含むＣＳＳドメインまたはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体を含む、ＣＡＲを含むように改変されたＴリンパ球を含む。特定の実施態様では、抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１の表面エンベロープタンパク質ＥＮＶ、ＣＡＩＸおよび／またはｓＧＤ２）のためのモノクローナル抗体フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【0084】
特定の実施態様では、本発明は、癌細胞および／またはウイルス粒子の表面上に存在する抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１の表面エンベロープタンパク質ＥＮＶ、ＣＡＩＸ、ａＧＤ２）に特異的な細胞を提供し、ここで前記細胞は、例えばＣＤ４タンパク質、ＣＡＩＸ、ａＧＤ２および／またはそれらのフラグメント由来の細胞外抗原結合ドメインを、Ｔ細胞受容体ζ鎖由来のＴ細胞受容体ドメイン、および、ＨＶＥＭタンパク質を含むＣＳＳドメインまたはそれと少なくとも９０％同一性を有するその機能性フラグメントまたは変異体に結合することによって生産される、細胞表面上のＣＡＲを有する。
【0085】
本発明のさらなる実施態様では、抗原に対する細胞の反応性を促進するための方法が提供され、その方法は、本発明の核酸分子および／または本発明のベクターを用いて細胞をトランスフェクトして、細胞表面上に抗原結合ドメインを含むトランスフェクトされた細胞を生産するステップを含み、ここで、抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合し、それにより、抗原に対する細胞の反応性を促進する。本明細書において用いられる「反応性」は、抗原の結合の際に細胞が免疫応答を促進する能力を指す。本発明のＣＡＲを用いて改変された細胞は、本発明のＣＡＲを用いない細胞と比較して、免疫応答の増大（例えば、より強い、より速い、および／または、より効果的な免疫応答）を促進し得る。一部の実施態様では、抗原は、癌細胞および／またはウイルス粒子の表面上に存在する。一部の実施態様では、抗原は、ウイルス粒子、例えば、ＨＩＶ粒子上に存在する。一部の実施態様では、抗原は、癌細胞、例えば、固形腫瘍（例えば、腎癌）上に存在する。一部の実施態様では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【0086】
さらなる実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中の、本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の細胞を含む、から本質的になる、またはからなる、組成物（例えば医薬組成物）を提供する。
【0087】
さらなる実施態様では、本発明は、それを必要とする対象における、標的（例えば、癌細胞および／または感染因子）に対する免疫応答を提供する方法を提供する。一部の実施態様では、その方法は、有効量の本発明のＣＡＲおよび／または本発明の核酸分子および／または本発明のベクター、および／または本発明の細胞を、対象に投与するステップを含み、それにより、対象における標的に対する免疫応答を提供する。一部の実施態様では、標的は感染因子であり、本発明のＣＡＲおよび／または本発明の核酸分子および／または本発明のベクター、および／または本発明の細胞の投与は、対象における感染を治療する。一部の実施態様では、標的は癌であり、本発明のＣＡＲおよび／または本発明の核酸分子および／または本発明のベクター、および／または本発明の細胞の投与は、対象における癌を治療する。一部の実施態様では、癌は固形腫瘍を含む。
【0088】
一部の実施態様では、その方法は、本発明のＣＡＲを含む改変されたＴ細胞（すなわちＴリンパ球）を投与するステップを含む。本発明のＣＡＲを含む改変されたＴリンパ球を調製する方法は、当業者によく知られている。例えば、一部の実施態様では、細胞傷害性リンパ球（すなわちＴ細胞）は、標的（例えば癌細胞および／または感染因子）に対する免疫が易感染性である対象および／または標的に対して免疫不全になるリスクがある対象から得ることができる。一部の実施態様では、対象は癌を有する。一部の実施態様では、対象は感染を有する。一部の実施態様では、細胞傷害性リンパ球（すなわちＴ細胞）は、当技術分野でよく知られている技術を用いて末梢血から単離される（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離の後に、望ましくない細胞を除去するためのネガティブ選択を行なう）。
【0089】
細胞傷害性リンパ球は、本発明のＣＡＲをコードする本発明の発現ベクターおよび／または核酸分子を用いてリンパ球の集団をトランスフェクトすることによって、本発明のＣＡＲを発現するように改変され得る。本発明のＣＡＲを発現するリンパ球のトランスフェクトされた集団を調製するのに適切な方法は当業者によく知られており、限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス（ウイルス媒介性ＣＡＲ遺伝子送達システム）、スリーピング・ビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）、および／またはｐｉｇｇｙｂａｃｋ（ピギーバック）（非ウイルス媒介性ＣＡＲ遺伝子送達システムを含むトランスポゾン／トランスポサーゼシステム）を含む。
【0090】
トランスフェクトされたリンパ球は、対象（例えばヒト）に導入される細胞の集団に適切な条件下で培養される。特定の考慮は、ウシ血清のようないかなる動物産物も含まない培養培地の使用を含む。他の考慮は、細菌、菌類、およびマイコプラズマの汚染を避けるための滅菌条件を含む。一部の実施態様では、対象へ投与される前に、培養されたトランスフェクトされたリンパ球は、ペレット化され、洗浄され、薬学的に許容できる担体または希釈剤中に再懸濁されてよい。トランスフェクトされたリンパ球の対象への投与は、標的（例えば、癌細胞および／または感染因子）に対する免疫応答を与え得て、または高め得る。一部の実施態様では、トランスフェクトされたリンパ球の対象への投与は、対象における癌および／または病原体感染を治療し得る。一部の実施態様では、対象はヒトである。一部の実施態様では、治療される病原体感染は、慢性ウイルス感染、例えば、ＨＩＶである。
【0091】
一部の実施態様では、治療される標的は癌である。一部の実施態様では、治療される癌は固形腫瘍を含む。一部の実施態様では、治療される癌は腎癌である。例示的な腎癌は、限定されないが、腎細胞癌、移行上皮癌、ウィルムス腫瘍、腎肉腫および／または転移性腎癌を含む。一部の実施態様では、腎癌は腎細胞癌（ＲＣＣ）である。一部の実施態様では、腎細胞癌は、制限されないが、淡明細胞型ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性ＲＣＣ、集合管ＲＣＣ、および／または分類されないＲＣＣを含む。
【0092】
一部の実施態様では、本発明の方法は、有効量の本発明のＣＡＲおよび／または本発明の核酸分子および／または本発明のベクター、および／または本発明の細胞を、それを必要とする対象に投与して、癌（すなわち、腎癌）を治療するステップを含む。一部の実施態様では、治療は、腫瘍サイズの減少をもたらす。一部の実施態様では、腫瘍サイズ／体積は、未治療の腫瘍と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少する。一部の実施態様では、治療は、対象の生存率の増大をもたらす。一部の実施態様では、生存率は、未治療の対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％増大する。
【0093】
一部の実施態様では、本発明の方法は、有効量の本発明のＣＡＲおよび／または本発明の核酸分子および／または本発明のベクター、および／または本発明の細胞を、それを必要とする対象に投与して、対象内に存在する癌細胞の数を減少させるステップを含む。一部の実施態様では、癌細胞の数は、未治療の対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍減少する。
【0094】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、または希釈剤および／または他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。簡潔に説明すると、本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載の細胞集団を、１つまたは複数の薬学的または生理的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでよい。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、滅菌食塩水などのようなバッファー；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡおよび／またはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または防腐剤を、単独または任意の組み合わせで含んでよい。本発明の医薬組成物は、治療および／または予防する疾患に適切な様式で投与することができる。投与の量および頻度は、対象の状態、ならびに対象の疾患のタイプおよび重症度のような因子によって決定されるが、一部の実施態様では、適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得る。
【0095】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療的量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および、患者（対象）の状態における個々の違いを考慮して、医師によって決定され得る。一部の実施態様では、本発明の細胞を含む医薬組成物は、約１０３～約１０１０細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与することができ、一部の実施態様では、投薬量は、約１０５～約１０８細胞／ｋｇ体重または約１０６～約１０８であってよく、これらの範囲内の全ての整数値（例えば、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９）を含む。
【0096】
本発明の細胞組成物は、これらの投薬量で、複数回（例えば、１時間ごと、１日４回、１日３回、１日２回、毎日、１週間に２回、１週間に３回、毎週、毎月、隔月、半年ごと、毎年など）投与することができる。
【0097】
本発明の細胞は、免疫療法において一般に知られているインフュージョン技術を用いて投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照）。特定の対象のための最適な投薬量および治療レジメンは、疾患の兆候について対象を監視して、それに応じて治療を調整することによって、医学の分野における当業者によって容易に決定され得る。
【0098】
一部の実施態様では、活性化されたＴ細胞を対象に投与して、続いて、血液を再度採取して（ｒｅｄｒａｗ）（またはアフェレーシスを行なう）、本明細書に記載のように、そこからＴ細胞を活性化して、これらの活性化および拡大されたＴ細胞を対象に再注入することが望ましくあり得る。このプロセスは、複数回、例えば、毎週または数週ごとに行なうことができる。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、約１０ｃｃ～約４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。理論によって拘束されずに、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを用いることは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立ち得る。
【0099】
本発明の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注入、経口摂取、輸血、埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）および／または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む任意の様式で行なうことができる。本発明の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注入、および／または腹腔内によって、患者に投与することができる。一部の実施態様では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注入によって対象へ投与することができる。別の実施態様では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注入によって投与することができる。一部の実施態様では、Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節および／または感染部位へ直接注入することができる。
【0100】
本発明の一部の実施態様では、本明細書中に記載の方法またはＴ細胞が治療的レベルに拡大される当技術分野で知られている他の方法を用いて活性化および拡大された細胞は、任意の数の関連のある治療モダリティとともに（例えば、前、同時および／または後に）、対象へ投与され得る。一部の実施態様では、本発明のＣＡＲおよび／または核酸分子、および／または改変されたＴ細胞は、治療される疾患に応じて、他の治療選択肢（例えば、薬物および／または外科的処置）と組み合わせて用いられ得る。
【0101】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、より詳細に以下に説明される。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提供される。しかしながら、決して、本発明の広い範囲を制限すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【0102】
［実施例１：共刺激シグナルは、ヒトＴ細胞株におけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性を決定する。］
ＣＤ４の細胞外ドメイン（アミノ酸１～１４８）に対応するヒトｓＣＤ４分子は、ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１２０の結合を通してＨＩＶ感染細胞を選択的に標的化することが報告された（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５（６１８８）：３６９（１９８８））。ＨＩＶ Ｅｎｖ－標的化ＣＡＲを生産するために、異なるＣＳＳと組み合わせてｓＣＤ４－ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを作製した（図１Ａ）。ＧＦＰ＋形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞におけるＣＡＲ発現を、抗－ｃ－Ｍｙｃタグ抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した（図１Ｂ～１Ｃ）。形質導入率は、形質導入細胞間で明確には異ならなかったが（図７Ａ～７Ｂ）、細胞表面上のｓＣＤ４－ＣＡＲの発現レベルは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で異なることが分かった（図２Ｃ）。異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の内因性ＣＤ３ζおよびアクチンの同様の発現レベルの下で、全細胞溶解物におけるＣＡＲの発現レベルもまた、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で異なっていた（図２Ｃ）。したがって、これらのデータによって、ＣＡＲの発現レベルがＣＳＳに依存性であることが示唆された。
ＣＤ４の細胞外ドメイン（アミノ酸１～１４８）に対応するヒトｓＣＤ４分子は、ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１２０の結合を通してＨＩＶ感染細胞を選択的に標的化することが報告された（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５（６１８８）：３６９（１９８８））。ＨＩＶ Ｅｎｖ－標的化ＣＡＲを生産するために、異なるＣＳＳと組み合わせてｓＣＤ４－ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを作製した（図１Ａ）。ＧＦＰ＋形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞におけるＣＡＲ発現を、抗－ｃ－Ｍｙｃタグ抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した（図１Ｂ～１Ｃ）。形質導入率は、形質導入細胞間で明確には異ならなかったが（図７Ａ～７Ｂ）、細胞表面上のｓＣＤ４－ＣＡＲの発現レベルは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で異なることが分かった（図２Ｃ）。異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の内因性ＣＤ３ζおよびアクチンの同様の発現レベルの下で、全細胞溶解物におけるＣＡＲの発現レベルもまた、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で異なっていた（図２Ｃ）。したがって、これらのデータによって、ＣＡＲの発現レベルがＣＳＳに依存性であることが示唆された。
【0103】
異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ間の機能性活性を決定するために、ＨＩＶ Ｅｎｖを発現している標的細胞を用いて共培養アッセイを実証した。標的細胞（ＣＨＯ－ＧＦＰまたはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）を、ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：２比で２４時間、共培養した。細胞を含んでいる上清を回収して、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡのために遠心分離によって透明に（ｃｌｅａｒ）した。残っている細胞をフローサイトメトリー分析に用いて、抗原依存性刺激の際のＣＤ６９発現を決定した。標的細胞（ＣＤ３－ＧＦＰ＋）を、エフェクター細胞（ＣＤ３＋）から分離することができた（図７Ｃ、左側パネル）。ＧＦＰ－およびＧＦＰ＋エフェクター細胞活性化の両方を、ＣＤ６９上方調節によって決定した（図７Ｃ、中央および右側パネル）。図１Ｅに示されるように、最小の活性化は、ＣＨＯ－ＧＦＰ細胞との共培養に際してＧＦＰ－およびＧＦＰ＋エフェクター細胞の両方において観察された。最小の活性化がＧＦＰ－エフェクター細胞において観察されたが、明らかなエフェクター細胞活性化がＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ細胞との共培養に際して全てのＣＡＲ－Ｔ細胞において見られた。ＩＬ－２分泌も、ＨＩＶ－Ｅｎｖを発現する標的細胞との共培養の際は観察されたが、ＧＦＰのみを発現する標的細胞との共培養では観察されなかった（図１Ｆ～１Ｈ）。これらのデータは、この試験で作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原依存性の様式で活性化されることを示唆した。さらに、エフェクター細胞活性化およびＩＬ－２分泌の両方とも、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で異なることが分かった（図３Ｂ）。ＣＡＲ発現レベルとＣＡＲ－Ｔ細胞活性の間の関係を決定するために、線形回帰分析を行なった。活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞の頻度およびＣＡＲ発現レベルに対するＩＬ－２分泌について、明確な相関がみられた（図３Ｄ）。線形回帰分析によって、この関連性はＣＳＳの由来に依存することが明確に明らかにされた。合わせると、これらのデータによって、ＣＳＳはヒトＴ細胞株におけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性を決定することが示唆された。
【0104】
［実施例２：ＨＶＥＭ共刺激は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いＣＡＲ発現を示す。］
Ｔ細胞株において観察されたＣＳＳの効果がヒトＣＡＲ－Ｔ細胞においても観察されるかどうかを試験するために、一次ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を開発した。ＣＡＲ－形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞をＧＦＰ発現に基づいて分類して、エフェクター機能および特性の分析に用いた。細胞表面上および全細胞溶解物中のＣＡＲの発現レベルは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞において異なっており（図２Ａ～２Ｃ）、ＣＡＲ－形質導入Ｔ細胞株において観察されたのと同様の傾向であった（図１Ｂおよび１Ｄ）。これらのデータからも、ＨＶＥＭ共刺激が、この研究において試験されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いＣＡＲ発現をもたらすことが示唆された。
Ｔ細胞株において観察されたＣＳＳの効果がヒトＣＡＲ－Ｔ細胞においても観察されるかどうかを試験するために、一次ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を開発した。ＣＡＲ－形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞をＧＦＰ発現に基づいて分類して、エフェクター機能および特性の分析に用いた。細胞表面上および全細胞溶解物中のＣＡＲの発現レベルは、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞において異なっており（図２Ａ～２Ｃ）、ＣＡＲ－形質導入Ｔ細胞株において観察されたのと同様の傾向であった（図１Ｂおよび１Ｄ）。これらのデータからも、ＨＶＥＭ共刺激が、この研究において試験されたヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いＣＡＲ発現をもたらすことが示唆された。
【0105】
［実施例３：ＨＶＥＭ共刺激は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において最も高いエフェクター機能を示す。］
ＣＡＲ発現レベルの違いが一次細胞セッティングにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能と相関するかどうか試験するために、標的細胞との共培養の際の、細胞傷害性活性およびサイトカイン分泌を測定した。図３Ａに示されるように、Ｔ細胞は、ＨＩＶ Ｅｎｖを発現する標的細胞に対して、抗原特異的な細胞傷害性活性を示した。これらのデータからも、細胞傷害性活性がＣＳＳに依存性であること、および、ＨＶＥＭ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が、この研究において試験されたＣＡＲ－Ｔ細胞の中で最も高い細胞傷害性活性を示すことが示唆された（図３Ｃ）。同様の傾向が、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのようなサイトカイン分泌においても観察された（図３Ｂ）。興味深いことに、ＣＤ２８共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞においてサイトカイン分泌はほとんど観察されず、このことは、ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の以前の報告結果と同様であった（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（６）：５８１（２０１５））。ＣＡＲ発現レベルとＣＡＲ－Ｔ細胞エフェクター機能の間の関係を決定するために、線形回帰分析を行なった。ヒトＴ細胞株による結果と一致して、ＣＡＲ発現とＣＡＲ－Ｔ細胞エフェクター機能の間の明確な相関が観察された（図３Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）。これらの相関はＣＳＳの由来に依存していた。したがって、これらのデータにより、ＣＡＲにおけるＣＳＳの由来が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性活性を決定することができること、および、ＨＶＥＭ共刺激が、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において、一般に用いられるＣＳＳに対して最も高いエフェクター機能を示すことが示唆された。
ＣＡＲ発現レベルの違いが一次細胞セッティングにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能と相関するかどうか試験するために、標的細胞との共培養の際の、細胞傷害性活性およびサイトカイン分泌を測定した。図３Ａに示されるように、Ｔ細胞は、ＨＩＶ Ｅｎｖを発現する標的細胞に対して、抗原特異的な細胞傷害性活性を示した。これらのデータからも、細胞傷害性活性がＣＳＳに依存性であること、および、ＨＶＥＭ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が、この研究において試験されたＣＡＲ－Ｔ細胞の中で最も高い細胞傷害性活性を示すことが示唆された（図３Ｃ）。同様の傾向が、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのようなサイトカイン分泌においても観察された（図３Ｂ）。興味深いことに、ＣＤ２８共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞においてサイトカイン分泌はほとんど観察されず、このことは、ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の以前の報告結果と同様であった（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（６）：５８１（２０１５））。ＣＡＲ発現レベルとＣＡＲ－Ｔ細胞エフェクター機能の間の関係を決定するために、線形回帰分析を行なった。ヒトＴ細胞株による結果と一致して、ＣＡＲ発現とＣＡＲ－Ｔ細胞エフェクター機能の間の明確な相関が観察された（図３Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）。これらの相関はＣＳＳの由来に依存していた。したがって、これらのデータにより、ＣＡＲにおけるＣＳＳの由来が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性活性を決定することができること、および、ＨＶＥＭ共刺激が、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞において、一般に用いられるＣＳＳに対して最も高いエフェクター機能を示すことが示唆された。
【0106】
［実施例４：ＴＮＦＲＳＦ共刺激は、ＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避する。］
図３Ａ～３Ｄに示されるように、機能性活性は、ＣＡＲにおけるＣＳＳの由来に依存していた。我々および他の研究者らは、ＣＤ２８共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞はエフェクター機能が減少することを示しており、ＣＡＲにおけるＣＳＳがＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊に影響を及ぼすという仮説を我々にもたらした。疲弊したＴ細胞は、低い増殖性およびサイトカイン産生能を有し（高アポトーシス率と関連する）、高レベルの抑制性受容体、例えばＰＤ－１およびＬＡＧ－３を発現する（Ｖｉｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００９；１３８（１）：３０（２００９）；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（６）：４９２（２０１１））。したがって、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊した集団の頻度（ＰＤ－１＋／ＬＡＧ－３＋）を試験した（図４Ａ）。ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は疲弊した集団の増大を示したが、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、疲弊した集団が明らかにより少なかった（図４Ｂおよび４Ｄ）。線形回帰分析は、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の間で、エフェクター機能と疲弊した集団の頻度の間に明らかな相関を示し、ＴＮＦＲＳＦ共刺激がＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避することが示唆された（図４Ｃおよび図９Ａ～９Ｃ）。
図３Ａ～３Ｄに示されるように、機能性活性は、ＣＡＲにおけるＣＳＳの由来に依存していた。我々および他の研究者らは、ＣＤ２８共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞はエフェクター機能が減少することを示しており、ＣＡＲにおけるＣＳＳがＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊に影響を及ぼすという仮説を我々にもたらした。疲弊したＴ細胞は、低い増殖性およびサイトカイン産生能を有し（高アポトーシス率と関連する）、高レベルの抑制性受容体、例えばＰＤ－１およびＬＡＧ－３を発現する（Ｖｉｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００９；１３８（１）：３０（２００９）；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（６）：４９２（２０１１））。したがって、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊した集団の頻度（ＰＤ－１＋／ＬＡＧ－３＋）を試験した（図４Ａ）。ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は疲弊した集団の増大を示したが、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、疲弊した集団が明らかにより少なかった（図４Ｂおよび４Ｄ）。線形回帰分析は、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の間で、エフェクター機能と疲弊した集団の頻度の間に明らかな相関を示し、ＴＮＦＲＳＦ共刺激がＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避することが示唆された（図４Ｃおよび図９Ａ～９Ｃ）。
【0107】
［実施例５：ＣＡＲにおけるＣＳＳは、メモリーＴ細胞サブセットのバランスに影響を及ぼす。］
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるメモリーサブセットの割合が、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの持続性に影響することが示唆されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３０（２）：４９２（２０１６）；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１）：２８（２０１６））。ＣＳＳとメモリー表現型の間の関係を理解するために、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を、メモリーＴ細胞サブセットに関するマーカーとして分析した（Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９（１０）：６０４（２０１３））。結果は、ＣＳＳが、メモリーＴ細胞サブセットの発生に影響することを示した（図５Ａおよび５Ｂ）。最も著しく影響を受けたメモリー集団は、セントラル（ＴＣＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）およびエフェクター（ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）メモリー集団であった（図５Ｃ）。４－１ＢＢ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、有意に増大されたＴＣＭ集団を含んだが、ＣＤ２８ ＣＳＳは、より少ないＴＣＭ集団を誘導した（図５Ｄ）。興味深いことに、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＭおよびＴＥＭ集団の同等の集団を含んでいた（図５Ｄ）。これらのデータによって、ＣＡＲにおけるＣＳＳがメモリーＴ細胞集団のバランスに影響することが示唆された。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるメモリーサブセットの割合が、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの持続性に影響することが示唆されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３０（２）：４９２（２０１６）；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１）：２８（２０１６））。ＣＳＳとメモリー表現型の間の関係を理解するために、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を、メモリーＴ細胞サブセットに関するマーカーとして分析した（Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９（１０）：６０４（２０１３））。結果は、ＣＳＳが、メモリーＴ細胞サブセットの発生に影響することを示した（図５Ａおよび５Ｂ）。最も著しく影響を受けたメモリー集団は、セントラル（ＴＣＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）およびエフェクター（ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）メモリー集団であった（図５Ｃ）。４－１ＢＢ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、有意に増大されたＴＣＭ集団を含んだが、ＣＤ２８ ＣＳＳは、より少ないＴＣＭ集団を誘導した（図５Ｄ）。興味深いことに、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＭおよびＴＥＭ集団の同等の集団を含んでいた（図５Ｄ）。これらのデータによって、ＣＡＲにおけるＣＳＳがメモリーＴ細胞集団のバランスに影響することが示唆された。
【0108】
［実施例６：ＨＶＥＭ共刺激は、ＣＡＲ－Ｔ細胞エネルギー代謝をよりエネルギー的に活性の段階へ再プログラムする。］
最近の報告により、ＣＡＲシグナリングドメインがＴ細胞代謝を再プログラムすることが示唆されたが（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４（２）：３８０（２０１６））、ＨＶＥＭ ＣＳＳが、細胞の代謝の異なる調整をすることができるかどうかは未だに知られていない。異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を基礎条件で測定し、その後に、オリゴマイシン（ＡＴＰシンターゼの阻害剤）、カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；ＡＴＰ生産から酸素消費を脱共役する）、およびロテノンとアンチマイシンＡ（それぞれ、複合体ＩおよびＩＩＩに関する電子伝達鎖の阻害剤）を連続的に添加して、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアの酸素消費機構の相対的寄与を分析した（図６Ａ）。結果は、ミトコンドリア呼吸の指標である基礎ＯＣＲレベルが、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞の間で有意に異なることを示した。ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＯＣＲレベルは、コントロールＴ細胞におけるものよりも低かった。対照的に、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞と比較して、ＯＣＲが高かった（図６Ｂ）。驚くべきことに、解糖系の指標である基礎細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞でのみ有意に増大した。ＡＴＰ生産および最大ＯＣＲレベルは、基礎のＯＣＲレベルの結果と同様の傾向を示した（図６Ｃ～６Ｅ）。さらなる研究は、予備呼吸能（図６Ｆ）、非ミト呼吸（図６Ｇ）、およびプロトン漏出（図６Ｈ）の測定を含んだ。これらのデータから、ＣＤ２８を有するＣＡＲ－Ｔ細胞は低いエネルギー状態を示すが、４－１ＢＢ ＣＳＳは、ＣＡＲ－Ｔ細胞において高いミトコンドリア呼吸を誘導することが示唆された。さらに、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、高い解糖系およびミトコンドリア呼吸を示し、ＨＶＥＭ共刺激がＣＡＲ－Ｔ細胞においてよりエネルギー的に活性の状態を誘導することが示唆された。
最近の報告により、ＣＡＲシグナリングドメインがＴ細胞代謝を再プログラムすることが示唆されたが（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４（２）：３８０（２０１６））、ＨＶＥＭ ＣＳＳが、細胞の代謝の異なる調整をすることができるかどうかは未だに知られていない。異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を基礎条件で測定し、その後に、オリゴマイシン（ＡＴＰシンターゼの阻害剤）、カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；ＡＴＰ生産から酸素消費を脱共役する）、およびロテノンとアンチマイシンＡ（それぞれ、複合体ＩおよびＩＩＩに関する電子伝達鎖の阻害剤）を連続的に添加して、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアの酸素消費機構の相対的寄与を分析した（図６Ａ）。結果は、ミトコンドリア呼吸の指標である基礎ＯＣＲレベルが、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞の間で有意に異なることを示した。ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＯＣＲレベルは、コントロールＴ細胞におけるものよりも低かった。対照的に、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２８ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞およびコントロールＴ細胞と比較して、ＯＣＲが高かった（図６Ｂ）。驚くべきことに、解糖系の指標である基礎細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞でのみ有意に増大した。ＡＴＰ生産および最大ＯＣＲレベルは、基礎のＯＣＲレベルの結果と同様の傾向を示した（図６Ｃ～６Ｅ）。さらなる研究は、予備呼吸能（図６Ｆ）、非ミト呼吸（図６Ｇ）、およびプロトン漏出（図６Ｈ）の測定を含んだ。これらのデータから、ＣＤ２８を有するＣＡＲ－Ｔ細胞は低いエネルギー状態を示すが、４－１ＢＢ ＣＳＳは、ＣＡＲ－Ｔ細胞において高いミトコンドリア呼吸を誘導することが示唆された。さらに、ＨＶＥＭ ＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、高い解糖系およびミトコンドリア呼吸を示し、ＨＶＥＭ共刺激がＣＡＲ－Ｔ細胞においてよりエネルギー的に活性の状態を誘導することが示唆された。
【0109】
［実施例７：実施例１～６による結果の考察。］
シグナリングドメイン内に異なるＣＳＳを有する抗－ＨＩＶ－１ ＣＡＲを、ｓＣＤ４を抗原認識ドメインとして用いて開発した。このシステムを１つのモデルとして用いて、ＣＡＲ内のＣＳＳがヒトＴ細胞株およびヒト一次ＣＤ８＋Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方においてＣＡＲ－Ｔ細胞活性を決定することが示された。エフェクター機能、メモリーサブセットの発生、Ｔ細胞疲弊およびエネルギー代謝の間の相互作用も明らかにされ、ＣＡＲ内のＣＳＳが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能および特性に著しく影響を及ぼすことが示唆された。特に、ＨＶＥＭ共刺激は、エネルギー代謝を再プログラムすることによってＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能を高めた。これらの試験は、ＣＳＳの選択がＣＡＲ－Ｔ細胞の機能および特性の結末に影響し得るという見識、および、ＨＶＥＭが、固形腫瘍だけでなく持続的な感染性疾患に対しても効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を生じさせる有望な候補となり得るという見識を明らかにした。
シグナリングドメイン内に異なるＣＳＳを有する抗－ＨＩＶ－１ ＣＡＲを、ｓＣＤ４を抗原認識ドメインとして用いて開発した。このシステムを１つのモデルとして用いて、ＣＡＲ内のＣＳＳがヒトＴ細胞株およびヒト一次ＣＤ８＋Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方においてＣＡＲ－Ｔ細胞活性を決定することが示された。エフェクター機能、メモリーサブセットの発生、Ｔ細胞疲弊およびエネルギー代謝の間の相互作用も明らかにされ、ＣＡＲ内のＣＳＳが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能および特性に著しく影響を及ぼすことが示唆された。特に、ＨＶＥＭ共刺激は、エネルギー代謝を再プログラムすることによってＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能を高めた。これらの試験は、ＣＳＳの選択がＣＡＲ－Ｔ細胞の機能および特性の結末に影響し得るという見識、および、ＨＶＥＭが、固形腫瘍だけでなく持続的な感染性疾患に対しても効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を生じさせる有望な候補となり得るという見識を明らかにした。
【0110】
これらのデータにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性がＣＡＲ－形質導入Ｔ細胞株およびヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の両方においてＣＡＲ発現と相関することが示唆された。このことは驚くことではなかった。なぜならば、細胞表面上のＣＡＲ密度が特定の範囲において高ければ高いほど、抗原刺激の際にＣＡＲ－Ｔ細胞のより高い活性化が好適に誘導されるからである。驚くべきことに、ＣＡＲ発現レベルおよびＣＡＲ－Ｔ細胞活性もまた、異なるＣＳＳを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間で明らかに異なっていた。全細胞溶解物を用いたウエスタンブロット分析もまた、異なるＣＳＳにおいてＣＡＲ発現の違いを示し、安定性よりむしろ、ＣＡＲ発現レベル自体が、異なるＣＳＳセッティングにおいて異なることが示唆された。ＣＳＳ間のこの違いの１つの説明は、異なるシグナル伝達経路の誘導に起因し得る。ＣＤ２８共刺激は、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路を誘導するが、４－１ＢＢ共刺激は、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８を活性化するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）によって主に仲介される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １０（３）：２４７（２０００）；Ｃａｎｎｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１１）：６１９３（２０００））。さらに、４－１ＢＢおよびＨＶＥＭを含むＴＮＦＲＳＦメンバーはそれぞれ代替のＮＦ－κＢ経路を活性化することが可能である（Ｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２（８）：２８７４（２００５））。シグナル伝達経路におけるこれらの違いが、転写および翻訳の違いを生じさせ（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７（１０）：６０８（２０１７））、Ｔ細胞活性化状態およびＣＡＲ発現レベルにおける違いをもたらす。
【0111】
抗原非依存性のトニックシグナリングは、エクスビボの拡大中に一部のＣＡＲ－Ｔ細胞において誘導され得て、Ｔ細胞の分化および疲弊をもたらす。ＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊は、ＣＤ２８共刺激によって誘導されることが示されているが、４－１ＢＢ共刺激によって回避される（図４Ａおよび４Ｂ）（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（６）：５８１（２０１５））。これらの試験では、ＨＶＥＭ共刺激もまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避し、ＴＮＦＲＳＦ共刺激がＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を回避するのに重要であり得ることを示唆している（図４Ｃおよび図９Ａ～９Ｃ）。最近の報告では、ガンマレトロウイルスＬＴＲプロモーターからの発現増大はＴ細胞アポトーシスを生じさせるが、自己不活性型レンチウイルスベクター内のＥＦ１αプロモーターからのＣＡＲ発現の減少は、この毒性を減衰させることが示されている（Ｇｏｍｅｓ－Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１（１）：１７（２０１７））。ＣＡＲ発現がレンチウイルスベクター内のＥＦ１αプロモーター由来だとしても、ＣＤ２８共刺激はＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊を誘導した。これらのデータは、ＣＡＲ発現レベルだけでなくＣＳＳの由来も、ＣＡＲ－Ｔ細胞疲弊の誘導に影響することを示唆している。この仮説を支持するために、ＰＤ－１／Ｓｈｐ２複合体は、ＣＤ２８に選択的に結合して脱リン酸化し、減少したＴ細胞拡大と疲弊をもたらす（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５（６３３２）：１４２８（２０１７））。したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞のエクスビボでの拡大中のＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞疲弊を誘導するように仕向け得る。
【0112】
以前の知見と一致して、ＣＤ２８共刺激は、エフェクターメモリーサブセットの増大とともに低いエネルギー代謝を示し、一方で、４－１ＢＢ共刺激は、セントラルメモリーサブセットの増大と関連するより高いミトコンドリア呼吸を誘導することが示された。これらのデータは、ＨＶＥＭ共刺激が、同様の頻度のセントラルおよびエフェクターメモリーサブセットの発生と関連する高いミトコンドリア呼吸および解糖系を示すことも示している。これらのデータは、別個の共刺激が、特異的な代謝経路を調節し、メモリーサブセットの発生に影響することを示唆している（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４（２）：３８０（２０１６））。特に、この研究において試験された４－１ＢＢおよびＨＶＥＭを含むＴＮＦＲＳＦ共刺激は、異なるＴＲＡＦを動員し、異なる大きさでＮＦ－κＢ経路を活性化し得て、異なったエネルギー代謝レベル、メモリーサブセットの発生およびエフェクター機能をもたらす。さらに、ＣＡＲ発現レベルは、エネルギー状態とも関連し（図２Ａ～２Ｃおよび図６Ａ～６Ｅ）、異なるシグナル伝達経路が、代謝要求を満たすためのエネルギー代謝レベルに影響を与え得ることが示唆された。例えば、翻訳は、細胞における最もエネルギーを要求するプロセスである（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４８：１０４（２０１８）；Ｔｏｐｉｓｉｒｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７６：３５５（２０１１）；Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２（Ｐｔ１）：１６３（１９９５））。
【0113】
ＨＩＶ－１感染は、抗－レトロウイルス療法（ＡＲＴ）によって制御することができるが、ＡＲＴは潜在的感染細胞を除去することができないので根絶することはできず、ＨＩＶ感染患者は効果的なＡＲＴを一生受けなければならないことを表わしている。根絶の最近の試みは、免疫学的メカニズムによるＡＲＴ中に存続する潜在的感染細胞の死滅化に注目した。これを達成するために、ＨＩＶ特異的な免疫毒素またはＨＩＶ特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞を成功的に開発して、ＨＩＶ感染細胞を死滅化した（Ｄｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１０（１）：ｅ１００３８７２（２０１４）；Ｓａｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４６（１－２）：２６８（２０１３）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９（１３）：６６８５（２０１５）；Ａｌｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０（１５）：６９９９（２０１６）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．９０（２１）：９７１２（２０１６）；Ｌｅｉｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１３（１０）：ｅ１００６６１３（２０１７））。また、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、抗体依存性細胞傷害によってＨＩＶ感染細胞を除去することが示されている（Ｂｒｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０８４４（２０１６））。これらの研究は、ＨＩＶ感染細胞が、標的化された細胞傷害性療法によって除去され得ることを示す。さらに、ＨＩＶ特異的ＣＴＬまたはｂＮＡｂによる、薬理学的に再活性化された潜在的感染細胞の死滅化である「ショックおよび死滅化（ｓｈｏｃｋ ａｎｄ ｋｉｌｌ）」アプローチが提案されている（Ｈａｌｐｅｒ－Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５８（５）：９８９（２０１４））。しかしながら、広域のＣＴＬ応答が、エスケープ突然変異に起因して、潜在的ＨＩＶ－１を取り除く（ｃｌｅａｒ）ために必要とされることが報告されており（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３４）：３８１（２０１５））、保存領域を標的化することは、潜在的ＨＩＶ－１を取り除くのに有益であると考えられることが示唆された。この概念と一致して、最近の報告によって、ＣＤ４に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＲに基づくＣＡＲ－Ｔ細胞またはｂＮＡｂに基づくＣＡＲ－Ｔ細胞よりも効率的に、ＨＩＶを制御することが報告されている。さらに、４－１ＢＢ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボで、ＨＩＶ治療モデルを用いて、ＣＤ２８共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強力であることが、示されている（Ｌｅｉｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１３（１０）：ｅ１００６６１３（２０１７））。本発明では、ＨＶＥＭ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞よりも強力であることが示されており、ＨＶＥＭ共刺激を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＨＩＶ複製を制御するのにより有益であり得ることが示唆された。
【0114】
このデータは、ＣＡＲ内のＣＳＳが、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能および特性を決定することを示した。この試験において示されるように、ＨＶＥＭ共刺激は、一般に用いられるＣＡＲ内のＣＳＳのデザイン、例えばＣＤ２８および４－１ＢＢと比較して優れた特性と関連する高いエフェクター機能を誘導する。このことは、ＨＶＥＭが、優れた機能および特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の開発のための有望な候補であり得ることを示唆している。我々は、将来的なＣＡＲ－Ｔ細胞療法のために、ＣＳＳのパネルをＣＡＲの関連において試験してＣＡＲのデザインを拡張することによって、より強力なＣＳＳを発見し得る。
【0115】
要約すると、これらの結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのＨＶＥＭ共刺激が、広く用いられるＣＤ２８または４－１ＢＢのような共刺激と比較して、より強力なＣＡＲ－Ｔ細胞をデザインするためのＣＳＳを解明することを示す。この研究は、所望の機能および特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を調節および作製するための最初のステップを提供する。
【0116】
［実施例８：実験モデルおよび対象の詳細］
Ａ．対象の詳細
ヒトサンプルの回収
ヒト末梢血サンプルを健康なドナーから採取した。健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、獨協医科大学の科学倫理委員会によって承認されたプロトコルの下でＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）密度勾配によって調製した。インフォームド・コンセントは全対象から得られた。
Ａ．対象の詳細
ヒトサンプルの回収
ヒト末梢血サンプルを健康なドナーから採取した。健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、獨協医科大学の科学倫理委員会によって承認されたプロトコルの下でＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）密度勾配によって調製した。インフォームド・コンセントは全対象から得られた。
【0117】
細胞株
培養培地、ＭＥＭ、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充し、それぞれ短縮してＭ１０、Ｄ１０およびＲ１０と命名した。ＣＨＯ細胞およびそのトランスフェクタントを、非必須アミノ酸で補充されたＭ１０（Ｍ１０－ＮＥＡＡ）中で維持した。２９３ＦＴ細胞をＤ１０中で培養して、ＤＳ Ｐｈａｒｍａを通してＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅから取得したＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｒ１０中で維持した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。
培養培地、ＭＥＭ、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充し、それぞれ短縮してＭ１０、Ｄ１０およびＲ１０と命名した。ＣＨＯ細胞およびそのトランスフェクタントを、非必須アミノ酸で補充されたＭ１０（Ｍ１０－ＮＥＡＡ）中で維持した。２９３ＦＴ細胞をＤ１０中で培養して、ＤＳ Ｐｈａｒｍａを通してＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅから取得したＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｒ１０中で維持した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。
【0118】
一次細胞培養
ＰＢＭＣを、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで補充されたＡＩＭ－Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（完全ＡＩＭ－Ｖ）中で一晩培養して、プラスチック付着性単球を除去した。単球由来ＰＢＭＣを形質導入実験において用いた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。
ＰＢＭＣを、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで補充されたＡＩＭ－Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（完全ＡＩＭ－Ｖ）中で一晩培養して、プラスチック付着性単球を除去した。単球由来ＰＢＭＣを形質導入実験において用いた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。
【0119】
別の方法は、培養培地、ＭＥＭ、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いる方法であり、それらは１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充されており、それぞれ短縮してＭ１０、Ｄ１０およびＲ１０と命名した。ＣＨＯ細胞およびそれらのトランスフェクタントを非必須アミノ酸で補充されたＭ１０（Ｍ１０－ＮＥＡＡ）中で維持した。２９３ＦＴ細胞をＤ１０中で培養して、ＤＳ Ｐｈａｒｍａを通してＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから取得したＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｒ１０中で維持した。健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）密度勾配によって調製して、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで補充されたＡＩＭ－Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（完全ＡＩＭ－Ｖと短縮）中で一晩培養して、プラスチック付着性単球を除去した。単球由来ＰＢＭＣを形質導入実験に用いた。全ての細胞を３７℃にて５％ＣＯ２で増殖させた。
【0120】
Ｂ．方法の詳細
ベクターの構築
複数の制限酵素部位を導入するために、ＤＮＡリンカーを、レンチウイルスベクタープラスミドｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ブラストサイジン（ＢＳＤ）内に導入した。ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｉＷＩ－ＢｓｔＢＩ－ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいるＤＮＡリンカーを、２つのオリゴＤＮＡ Ｌ１およびＬ２を１：１のモル比で７０℃にて１０分間インキュベートして、室温に２時間置くことによって作製した。リンカーＤＮＡを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩによって消化したｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ（ｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ）内に挿入した。
ベクターの構築
複数の制限酵素部位を導入するために、ＤＮＡリンカーを、レンチウイルスベクタープラスミドｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ブラストサイジン（ＢＳＤ）内に導入した。ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｉＷＩ－ＢｓｔＢＩ－ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいるＤＮＡリンカーを、２つのオリゴＤＮＡ Ｌ１およびＬ２を１：１のモル比で７０℃にて１０分間インキュベートして、室温に２時間置くことによって作製した。リンカーＤＮＡを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩによって消化したｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ（ｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ）内に挿入した。
【0121】
ｓＣＤ４（ヒトＣＤ４の１～１４８アミノ酸）ＤＮＡフラグメントを作製するために、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン、東京、日本）によってＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞から抽出した全ＲＮＡを、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡、大阪、日本）によって製造元の説明に従ってｃＤＮＡ合成に用いた。ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位を含んでいるｓＣＤ４ ＤＮＡフラグメントを、ＫＯＤ－ＦＸ（東洋紡）を用いて増幅させた。精製されたＤＮＡフラグメントを、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに７２℃で１０分間インキュベートしてＡテールを付加した。テール付きＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ－Ｔイージー・ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）内にライゲーションした。配列を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて確認した。ｓＣＤ４－ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターを作製するために、ｓＣＤ４ ＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化したものと、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって人工的に合成された異なるＣＳＳ（ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ）を含んでいるＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したものを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＴＫ６４３－ＥＦ１ａ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ内にライゲーションした。
【0122】
ＨＩＶ Ｅｎｖ（ＮＬ４－３株）発現レンチウイルスベクタープラスミドを作製するために、Ｄｒ．Ｎｏｒｉａｋｉ Ｈｏｓｏｙａから提供されたｐＲＥ１１－ＮＬ４３をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化したものを、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＴＫ６４３－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ／ＢＳＤ内にライゲーションした。
【0123】
組み換えレンチウイルスの生産
組み換えレンチウイルスを、以前の説明（Ｃｏｃｋｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１４（２）：２７６（２００６））を少し改変して生産した。簡潔に説明すると、２９３ＦＴ細胞を、コラーゲンでコーティングした１０ｃｍ皿（イワキ、静岡、日本）上で、８０～９０％の密集度で培養した。培養培地を、２５μＭクロロキン（ＳＩＧＭＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を含むＤ１０（抗生物質を含まない）で置換した。ΔＮＲＦがパッキングされたベクターについては、以下のプラスミド量：１５μｇのレンチウイルスベクタープラスミド、１０μｇのΔＮＲＦ、および５μｇのｐＭＤ．Ｇを用いた。プラスミドを、２９３ＦＴ細胞内に、ポリエチレンイミン「ＭＡＸ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）によって、２：１のＤＮＡ：ＰＥＩ比で共トランスフェクトした。上清を、５ｍＭの酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌａｔｅ）（和光、大阪、日本）および１０μＭのフォルスコリン（東京化成工業、東京、日本）を含んでいるＤ１０を用いて置換した。組み換えレンチウイルスを含んでいる培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収して、遠心分離および０．４５μｍ濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）によって透明にした（ｃｌｅａｒｅｄ）。組み換えレンチウイルスを、高速遠心分離によって１８０００ｒｐｍで３時間、Ｈｉｍａｃ ＣＲ２１Ｎ（日立工機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ）、東京、日本）を用いて濃縮させた。
組み換えレンチウイルスを、以前の説明（Ｃｏｃｋｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１４（２）：２７６（２００６））を少し改変して生産した。簡潔に説明すると、２９３ＦＴ細胞を、コラーゲンでコーティングした１０ｃｍ皿（イワキ、静岡、日本）上で、８０～９０％の密集度で培養した。培養培地を、２５μＭクロロキン（ＳＩＧＭＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を含むＤ１０（抗生物質を含まない）で置換した。ΔＮＲＦがパッキングされたベクターについては、以下のプラスミド量：１５μｇのレンチウイルスベクタープラスミド、１０μｇのΔＮＲＦ、および５μｇのｐＭＤ．Ｇを用いた。プラスミドを、２９３ＦＴ細胞内に、ポリエチレンイミン「ＭＡＸ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）によって、２：１のＤＮＡ：ＰＥＩ比で共トランスフェクトした。上清を、５ｍＭの酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌａｔｅ）（和光、大阪、日本）および１０μＭのフォルスコリン（東京化成工業、東京、日本）を含んでいるＤ１０を用いて置換した。組み換えレンチウイルスを含んでいる培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収して、遠心分離および０．４５μｍ濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）によって透明にした（ｃｌｅａｒｅｄ）。組み換えレンチウイルスを、高速遠心分離によって１８０００ｒｐｍで３時間、Ｈｉｍａｃ ＣＲ２１Ｎ（日立工機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ）、東京、日本）を用いて濃縮させた。
【0124】
レンチウイルスベクターによる形質導入
レンチウイルスを含んでいる上清を用いて、ＣＡＲ／ＧＦＰ遺伝子をＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞内に、および、ＨＩＶ Ｅｎｖ遺伝子をＣＨＯ細胞内に、それぞれ形質導入させた。簡潔に説明すると、６ウェルプレート中の、２００万個のＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞または半コンフルエントＣＨＯ細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒａｎｅ）存在下で、未濃縮のレンチウイルスを含んでいる上清１ｍＬに曝した。細胞を５５００ｒｐｍで３時間、２２℃で遠心分離して、ウイルス感染を高めた。上清の除去後、細胞を３７℃にてＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した。培養培地を、１０μｇ／ｍＬのＢＳＤで補充された培地で置換した。その後に、形質導入細胞を、以下のアッセイを行なうまで１０μｇ／ｍＬのＢＳＤを含む培地中で維持した。
レンチウイルスを含んでいる上清を用いて、ＣＡＲ／ＧＦＰ遺伝子をＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞内に、および、ＨＩＶ Ｅｎｖ遺伝子をＣＨＯ細胞内に、それぞれ形質導入させた。簡潔に説明すると、６ウェルプレート中の、２００万個のＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞または半コンフルエントＣＨＯ細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒａｎｅ）存在下で、未濃縮のレンチウイルスを含んでいる上清１ｍＬに曝した。細胞を５５００ｒｐｍで３時間、２２℃で遠心分離して、ウイルス感染を高めた。上清の除去後、細胞を３７℃にてＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養した。培養培地を、１０μｇ／ｍＬのＢＳＤで補充された培地で置換した。その後に、形質導入細胞を、以下のアッセイを行なうまで１０μｇ／ｍＬのＢＳＤを含む培地中で維持した。
【0125】
ヒト一次ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）上の細胞選別によって、抗－ヒトＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰＥおよびＣＤ８ＰＥ／Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて単球由来ＰＢＭＣから単離した（ルーチン的に、９５％よりも高い純度が達成される）。精製されたＣＤ８ Ｔ細胞を、４０Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、エイズ部門、ＮＩＡＩＤを通して、Ｄｒ．Ｍａｕｒｉｃｅ Ｇａｔｅｌｙ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．から取得）で補充された完全ＡＩＭ－Ｖを用いて、３日間、抗－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３：１のビーズ：細胞比で用いて活性化した。抗－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの除去後、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞を、レトロネクチン（ＴＡＫＡＲＡ、滋賀、日本）でコーティングされたプレートを製造元の説明に従って用いて、３日目および４日目に、レンチウイルスベクターで形質導入した。その後、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含んでいる培地（完全ＡＩＭ－Ｖ）を、細胞選別に十分な数の細胞が増殖するまで２～３日ごとに交換した。
【0126】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーにおいて用いた抗体は、別段の指定がない限りＢｉｏｌｅｇｅｎｄから取得した。形質導入されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞上のＣＡＲ発現を、抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）の後に抗－マウスＩｇｓ－ＰＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。共培養アッセイにおけるＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の活性化を、抗－ヒトＣＤ３－ＡＰＣ抗体、ＣＤ６９－ＰＥ抗体およびＧＦＰを用いて分析した（ゲーティング戦略については図７Ａおよび７Ｂを参照）。ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびＴ細胞疲弊を、ビオチン化抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の後にストレプトアビジン－ＰＥ（ＴＯＮＢＯ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗－ヒトＰＤ－１－ＡＰＣ抗体、抗－ヒトＬＡＧ－３－ＰＥ／Ｃｙ７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＧＦＰを用いて分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリー表現型を、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＣＲ７－ＡＰＣおよびＧＦＰを用いて分析した。遠心分離された細胞を、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含んでいるＰＢＳ）中の抗体溶液を用いて再懸濁して、氷上で３０分間インキュベートした。氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて細胞を固定した。染色された細胞を固定化して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
フローサイトメトリーにおいて用いた抗体は、別段の指定がない限りＢｉｏｌｅｇｅｎｄから取得した。形質導入されたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞上のＣＡＲ発現を、抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）の後に抗－マウスＩｇｓ－ＰＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。共培養アッセイにおけるＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の活性化を、抗－ヒトＣＤ３－ＡＰＣ抗体、ＣＤ６９－ＰＥ抗体およびＧＦＰを用いて分析した（ゲーティング戦略については図７Ａおよび７Ｂを参照）。ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびＴ細胞疲弊を、ビオチン化抗－ｃ－ｍｙｃタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の後にストレプトアビジン－ＰＥ（ＴＯＮＢＯ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗－ヒトＰＤ－１－ＡＰＣ抗体、抗－ヒトＬＡＧ－３－ＰＥ／Ｃｙ７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＧＦＰを用いて分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリー表現型を、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＣＲ７－ＡＰＣおよびＧＦＰを用いて分析した。遠心分離された細胞を、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含んでいるＰＢＳ）中の抗体溶液を用いて再懸濁して、氷上で３０分間インキュベートした。氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて細胞を固定した。染色された細胞を固定化して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
【0127】
ウエスタンブロット
５００万個の細胞を、氷冷ＰＢＳで１回洗浄して、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）および１ｍＭ ＰＭＳＦで補充された１５０μｌのＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ ＮＰ－４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させて、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって透明にした（ｃｌｅａｒｅｄ）細胞溶解物（２０μｌ）を、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．１Ｍ ＤＴＴと混合して、９５℃で５分間ボイルした。ボイルしたサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で電気泳動によって分離して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳および０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴＢＳ中）を用いて３０分間、メンブレンをブロックした。ブロックされたメンブレンを、４℃で一晩、ブロッキングバッファー中に希釈された抗－アクチン抗体（Ｉ－１９）または抗－ＣＤ３ζ抗体（Ｆ－３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてインキュベートした。それから、メンブレンを、ブロッキングバッファー中に希釈された抗－ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗－マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした。全ての抗体インキュベーションステップ後に、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで洗浄した。Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）を基質として用いて免疫活性を可視化して、Ｌｉｇｈｔ－Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（ＡＴＴＯ、東京、日本）を用いて検出した。
５００万個の細胞を、氷冷ＰＢＳで１回洗浄して、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）および１ｍＭ ＰＭＳＦで補充された１５０μｌのＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ ＮＰ－４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させて、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離によって透明にした（ｃｌｅａｒｅｄ）細胞溶解物（２０μｌ）を、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．１Ｍ ＤＴＴと混合して、９５℃で５分間ボイルした。ボイルしたサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で電気泳動によって分離して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳および０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴＢＳ中）を用いて３０分間、メンブレンをブロックした。ブロックされたメンブレンを、４℃で一晩、ブロッキングバッファー中に希釈された抗－アクチン抗体（Ｉ－１９）または抗－ＣＤ３ζ抗体（Ｆ－３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてインキュベートした。それから、メンブレンを、ブロッキングバッファー中に希釈された抗－ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗－マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした。全ての抗体インキュベーションステップ後に、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで洗浄した。Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）を基質として用いて免疫活性を可視化して、Ｌｉｇｈｔ－Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（ＡＴＴＯ、東京、日本）を用いて検出した。
【0128】
共培養アッセイ
ＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の活性化およびＩＬ－２分泌を、標的細胞（ＣＨＯ－ＧＦＰまたはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）と共培養することによって決定した。１０万個の標的細胞を、９６ウェル平底プレートの各ウェル内に蒔いた。２０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞を添加して一晩共培養した。翌日、細胞を含んでいる培養上清を回収した。細胞および無細胞上清を、３，０００ｒｐｍで５分間４℃にて、遠心分離によって分離した。上清中へのＩＬ－２分泌を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて製造元の説明に従って測定した。残っている細胞を用いて、ＣＤ６９発現をフローサイトメトリーによって決定した。
ＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の活性化およびＩＬ－２分泌を、標的細胞（ＣＨＯ－ＧＦＰまたはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）と共培養することによって決定した。１０万個の標的細胞を、９６ウェル平底プレートの各ウェル内に蒔いた。２０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞を添加して一晩共培養した。翌日、細胞を含んでいる培養上清を回収した。細胞および無細胞上清を、３，０００ｒｐｍで５分間４℃にて、遠心分離によって分離した。上清中へのＩＬ－２分泌を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて製造元の説明に従って測定した。残っている細胞を用いて、ＣＤ６９発現をフローサイトメトリーによって決定した。
【0129】
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を決定するために、１００００個の標的細胞を９６ウェル平底プレートの各ウェル内に蒔いた。異なる標的：エフェクター比でＣＡＲ－Ｔ細胞を添加して、０．２ｍＬ／ウェルのフェノールレッドを含まないＮＥＡＡ含有Ｒ１０中で共培養した。一晩のインキュベーション後、上清を回収して、３０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて製造元の説明に従ってアッセイした。細胞選別および培養後の純度が不均質である場合は、未形質導入Ｔ細胞を添加して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数とＴ細胞の合計数の両方がＣＡＲ－Ｔ細胞群にわたって一貫して維持されることを確実にした。回収した上清を用いて、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、製造元の説明に従って、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ分泌も決定した。
【0130】
エネルギー代謝の分析
ＣＡＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア機能を、細胞外フラックスアナライザーＸＦｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。細胞培養マイクロプレートの各ウェルを、製造元の説明に従ってＣｅｌｌＴａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした。ミトコンドリア機能をアッセイするために、異なるＣＳＳを有する選別したＣＡＲ－Ｔ細胞を、５．５ｍＭグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムで補充されたＸＦ ＲＰＭＩ培地中に懸濁して、３０万個／ウェルで蒔いた。プレートを２００ｘｇで１分間遠心分離して、３７℃にて非ＣＯ２インキュベーター内で３０～６０分間インキュベートした。インキュベーション中、機器ＸＦｐおよびそのアッセイカートリッジを、製造元の説明に従ってキャリブレーションした。酸素消費速度（ＯＣＲ）を、基礎条件下、および、１μＭのオリゴマイシン、１μＭのＦＣＣＰおよび１μＭのロテノン／アンチマイシンＡ（ＸＦｐ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた処理後に測定した。各条件で４回の測定を行なった。ＡＴＰ生産を、（オリゴマイシン添加前の最後の速度測定値）－（オリゴマイシン添加後の最小速度測定値）として定義した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア機能を、細胞外フラックスアナライザーＸＦｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。細胞培養マイクロプレートの各ウェルを、製造元の説明に従ってＣｅｌｌＴａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした。ミトコンドリア機能をアッセイするために、異なるＣＳＳを有する選別したＣＡＲ－Ｔ細胞を、５．５ｍＭグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムで補充されたＸＦ ＲＰＭＩ培地中に懸濁して、３０万個／ウェルで蒔いた。プレートを２００ｘｇで１分間遠心分離して、３７℃にて非ＣＯ２インキュベーター内で３０～６０分間インキュベートした。インキュベーション中、機器ＸＦｐおよびそのアッセイカートリッジを、製造元の説明に従ってキャリブレーションした。酸素消費速度（ＯＣＲ）を、基礎条件下、および、１μＭのオリゴマイシン、１μＭのＦＣＣＰおよび１μＭのロテノン／アンチマイシンＡ（ＸＦｐ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた処理後に測定した。各条件で４回の測定を行なった。ＡＴＰ生産を、（オリゴマイシン添加前の最後の速度測定値）－（オリゴマイシン添加後の最小速度測定値）として定義した。
【0131】
統計解析
統計解析は以前に説明された（Ｎｕｎｏｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０９（７）：１０３９（２０１４））。ボンフェローニ多重比較検定による一元配置分散分析または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、線形回帰分析を行ない、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＲ２値を計算した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意と考えた。
統計解析は以前に説明された（Ｎｕｎｏｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０９（７）：１０３９（２０１４））。ボンフェローニ多重比較検定による一元配置分散分析または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、線形回帰分析を行ない、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＲ２値を計算した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意と考えた。
【0132】
［実施例９：ヘルペスウイルスエントリーメディエータ―共刺激シグナルドメインを有するキメラ抗原受容体Ｔ細胞は、機能性効能を示す。］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせられた細胞外抗原結合ドメインを含む（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７（２０１４））。ＣＤ３ζをＣＡＲのシグナル伝達ドメインとして有する第一世代のＣＡＲ－形質導入Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞は、しばしばアネルギー性になり、強力な免疫応答を誘発できない（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１２：６１０６（２００６））。第二世代および第三世代のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ内にそれぞれ１つおよび２つの共刺激シグナルドメイン（ＣＳＳＤ）を加えることによって開発された（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７（２０１４））。モジュール構造を有するこれらのＣＡＲ分子は、同起源抗原刺激の際に、Ｔ細胞受容体によって仲介されるシグナル伝達を成功的に模倣して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および活性化をもたらすことが示されている（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２３：２６２５（２０１４））。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせられた細胞外抗原結合ドメインを含む（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７（２０１４））。ＣＤ３ζをＣＡＲのシグナル伝達ドメインとして有する第一世代のＣＡＲ－形質導入Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞は、しばしばアネルギー性になり、強力な免疫応答を誘発できない（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１２：６１０６（２００６））。第二世代および第三世代のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ内にそれぞれ１つおよび２つの共刺激シグナルドメイン（ＣＳＳＤ）を加えることによって開発された（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７（２０１４））。モジュール構造を有するこれらのＣＡＲ分子は、同起源抗原刺激の際に、Ｔ細胞受容体によって仲介されるシグナル伝達を成功的に模倣して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および活性化をもたらすことが示されている（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２３：２６２５（２０１４））。
【0133】
ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍に対する顕著な有効性を示した（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２５：４０１７（２０１５））。可能性を様々な臨床適用へ拡張するためには（Ｍａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：６０５（２０１８））、ＣＡＲ－Ｔ細胞有効性をさらに改善する必要があり得る。共刺激分子に由来するＣＳＳＤによって推測されるシグナリングは、強力なＣＡＲ－Ｔ細胞有効性を示すための重要なイベントであることが知られている（Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７（２０１４））。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能および特性に対するＣＳＳＤの効果は未だに多くが不明である。共刺激分子は２つの主なファミリー；ＣＤ２８およびＩＣＯＳを含むＣＤ２８ファミリー、ならびに、４－１ＢＢおよびヘルペスウイルスエントリーメディエータ―（ＨＶＥＭ）を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に分類することができる。これまでに、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来のＣＳＳＤが、ＣＡＲを構築するために一般に用いられてきた（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３８：６８３（２０１５））。以前の研究によって、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有する第二世代のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ほとんどの患者の血中で６ヶ月よりも長く持続するが、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、３ヶ月後にほとんど検出不可能になることが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６：３３９６１（２０１５））。さらに、４－１ＢＢ共刺激は、セントラルメモリーサブセットへの高い分化を誘導し、インビトロでの持続性が増大した（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４：３８０（２０１６））。４－１ＢＢ共刺激はまた、ミトコンドリア生合成およびエネルギー生産のための酸化的代謝を増大させ、トニックシグナリングによって誘導されるＴ細胞疲弊を回避することも示されている（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１：５８１（２０１５））。したがって、ＴＮＦＲＳＦ由来のＣＳＳＤは、第二世代ＣＡＲ－Ｔ細胞の関連におけるＣＤ２８ファミリー由来のものよりも良好に機能すると考えられる。
【0134】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能およびメモリー発生における、ＴＮＦＲＳＦの別メンバーであるＨＶＥＭの潜在的役割を示唆する報告が蓄積している。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＶＥＭの不足は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および防御免疫学的メモリーの発生を大いに損なわせることが示されている（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７７９９１（２０１３））。ＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＢ－およびＴ－リンパ球アテニュエータ上に発現されたＨＶＥＭ間の相互作用は、細菌感染に応答して、生存および免疫学的メモリーの発生を促進することも報告されている（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７７９９２（２０１３））。さらに、抗－ＨＶＥＭ単鎖抗体を発現する腫瘍細胞は、共培養されたＴ細胞の強力な増殖およびサイトカイン産生を誘導する（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１：２０３（２０１２））。これらの知見は、ＨＶＥＭがＴ細胞において強力な共刺激分子として作用することを示しており、ＨＶＥＭ由来のＣＳＳＤが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の関連においても有用であり得ることを示唆している。
【0135】
［実施例１０：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲは、ヒトＴ細胞株において効率的に発現される。］
ヒトＣＤ４の１～１４８アミノ酸に対応するｓＣＤ４は、ＨＩＶ Ｅｎｖへの結合を通してＨＩＶ感染細胞を選択的に標的化することが報告された（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３６９（１９８８））。ＨＩＶ Ｅｎｖ－標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を生産するために、ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ由来のＣＳＳＤと組み合わせてＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを構築した（図１Ａ）。フローサイトメトリー分析は、異なるレンチウイルスベクターを用いたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の形質導入率が互いに似ていることを示した（図７Ａ～７Ｂ）。他方で、ＧＦＰ＋細胞の細胞表面上のＣＡＲ発現レベルはかなり異なっており（図１Ｂ）、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞上で最も高かった（図１Ｃ）。ウエスタンブロット分析によって、全細胞溶解物において、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲの量は、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲの量よりも多いことも明らかとなった（図１Ｄ）。
ヒトＣＤ４の１～１４８アミノ酸に対応するｓＣＤ４は、ＨＩＶ Ｅｎｖへの結合を通してＨＩＶ感染細胞を選択的に標的化することが報告された（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３６９（１９８８））。ＨＩＶ Ｅｎｖ－標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を生産するために、ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ由来のＣＳＳＤと組み合わせてＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを構築した（図１Ａ）。フローサイトメトリー分析は、異なるレンチウイルスベクターを用いたＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の形質導入率が互いに似ていることを示した（図７Ａ～７Ｂ）。他方で、ＧＦＰ＋細胞の細胞表面上のＣＡＲ発現レベルはかなり異なっており（図１Ｂ）、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞上で最も高かった（図１Ｃ）。ウエスタンブロット分析によって、全細胞溶解物において、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲの量は、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲの量よりも多いことも明らかとなった（図１Ｄ）。
【0136】
［実施例１１：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲを発現するヒトＴ細胞株は、同起源抗原刺激の際に効率的に活性化される。］
異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の機能を試験するために、ＣＤ３－標的細胞（ＣＨＯ－ＧＦＰまたはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）を、ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターを用いて形質導入されたＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞と共培養した（図７Ｃ、左側パネル）。それから、ＧＦＰ－および成功的に形質導入されたＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｔ細胞活性化の指標であるＣＤ６９上方調節について試験した（図７Ｃ、右側パネル）。図１Ｅに示されるように、コントロールＣＨＯ－ＧＦＰ細胞との共培養に際して、ＧＦＰ－またはＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞において有意な活性化は観察されなかった。ＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ細胞を標的細胞として用いた場合、ＧＦＰ－Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞は効率的に活性化されなかったが、ＧＦＰ＋は効率的に活性化された（図１Ｅ）。また、培養上清におけるＩＬ－２の測定は、ＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞によるＩＬ－２分泌が、ＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ細胞との共培養の際は誘導されるが、コントロールＣＨＯ－ＧＦＰ細胞との共培養の際は誘導されないことを示した（図１Ｅ）。これらのデータによって、この研究において構築されたＣＡＲ発現ベクターを用いたヒトＴ細胞形質導入は、同起源抗原刺激の際に特異的に活性化されることが示された。線形回帰分析は、同起源抗原刺激の際の活性化されたＴ細胞のパーセンテージおよびＩＬ－２分泌は、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルと相関することを示した（図１Ｇおよび１Ｈ）。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原依存性Ｔ細胞活性化を誘導する能力は、この研究において用いられる状況において、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を上回った。
異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞の機能を試験するために、ＣＤ３－標的細胞（ＣＨＯ－ＧＦＰまたはＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ）を、ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターを用いて形質導入されたＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞と共培養した（図７Ｃ、左側パネル）。それから、ＧＦＰ－および成功的に形質導入されたＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｔ細胞活性化の指標であるＣＤ６９上方調節について試験した（図７Ｃ、右側パネル）。図１Ｅに示されるように、コントロールＣＨＯ－ＧＦＰ細胞との共培養に際して、ＧＦＰ－またはＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞において有意な活性化は観察されなかった。ＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ細胞を標的細胞として用いた場合、ＧＦＰ－Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞は効率的に活性化されなかったが、ＧＦＰ＋は効率的に活性化された（図１Ｅ）。また、培養上清におけるＩＬ－２の測定は、ＣＡＲ－形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞によるＩＬ－２分泌が、ＣＨＯ－Ｅｎｖ－ＧＦＰ細胞との共培養の際は誘導されるが、コントロールＣＨＯ－ＧＦＰ細胞との共培養の際は誘導されないことを示した（図１Ｅ）。これらのデータによって、この研究において構築されたＣＡＲ発現ベクターを用いたヒトＴ細胞形質導入は、同起源抗原刺激の際に特異的に活性化されることが示された。線形回帰分析は、同起源抗原刺激の際の活性化されたＴ細胞のパーセンテージおよびＩＬ－２分泌は、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルと相関することを示した（図１Ｇおよび１Ｈ）。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原依存性Ｔ細胞活性化を誘導する能力は、この研究において用いられる状況において、ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を上回った。
【0137】
［実施例１２：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するヒト一次Ｔ細胞由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、強力なエフェクター機能を示す。］
異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞をより詳細に比較するために、ヒト一次ＣＤ８＋を、ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで形質導入して、それらのエフェクター機能について分析した。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞における観察と同様に（図１Ｂ～１Ｄ）、細胞表面上および全細胞溶解物中のＣＡＲ発現レベルは、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞について最も高く、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するものについて最も低かった（図２Ｂ～２Ｃ）。異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能も比較した。３つのＣＡＲ－Ｔ細胞の全てが、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現標的細胞に対する抗原特異的な細胞傷害性活性をもたらしたが、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が最も高い活性を示した（図３Ａ）。同様に、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのようなサイトカインの最も高いレベルは、この研究において試験された他のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌された（図３Ｄ）。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞における観察（図１Ｇおよび１Ｈ）と同様に、細胞傷害性活性およびサイトカイン分泌によって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルと相関した（図３Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）。したがって、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は強力であると考えられた。
異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞をより詳細に比較するために、ヒト一次ＣＤ８＋を、ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで形質導入して、それらのエフェクター機能について分析した。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞における観察と同様に（図１Ｂ～１Ｄ）、細胞表面上および全細胞溶解物中のＣＡＲ発現レベルは、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞について最も高く、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するものについて最も低かった（図２Ｂ～２Ｃ）。異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能も比較した。３つのＣＡＲ－Ｔ細胞の全てが、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現標的細胞に対する抗原特異的な細胞傷害性活性をもたらしたが、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が最も高い活性を示した（図３Ａ）。同様に、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのようなサイトカインの最も高いレベルは、この研究において試験された他のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌された（図３Ｄ）。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞における観察（図１Ｇおよび１Ｈ）と同様に、細胞傷害性活性およびサイトカイン分泌によって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルと相関した（図３Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）。したがって、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は強力であると考えられた。
【0138】
［実施例１３：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、セントラルおよびエフェクターメモリーサブセットの両方へ効率的に分化する。］
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるメモリーサブセットの相対的割合は、インビボでのそれらの機能および持続性に影響を及ぼすことが示唆されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３０：４９２（２０１６）；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８（２０１６））。防御免疫に特に重要なメモリーサブセットは、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）Ｔ細胞として知られている（Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：６０４（２０１３））。したがって、メモリーＴ細胞サブセットの割合を、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現によって分析した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。コントロールＴ細胞はＴＥＭサブセットを優位に含んでいたが、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、より大きなパーセンテージのＴＣＭサブセットを示した（図１０Ａ）。異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の比較において、ＣＤ２８および４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、それぞれＴＥＭおよびＴＣＭサブセットを優位に含んでいた（図１０Ｂ）。興味深いことに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、同等のパーセンテージのＴＣＭおよびＴＥＭサブセットを含んでおり（図１０Ｂ）、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、ＴＥＭおよびＴＣＭサブセットの両方を効率的に誘導することが示唆された。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるメモリーサブセットの相対的割合は、インビボでのそれらの機能および持続性に影響を及ぼすことが示唆されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３０：４９２（２０１６）；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８（２０１６））。防御免疫に特に重要なメモリーサブセットは、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）Ｔ細胞として知られている（Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：６０４（２０１３））。したがって、メモリーＴ細胞サブセットの割合を、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現によって分析した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。コントロールＴ細胞はＴＥＭサブセットを優位に含んでいたが、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、より大きなパーセンテージのＴＣＭサブセットを示した（図１０Ａ）。異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞間の比較において、ＣＤ２８および４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、それぞれＴＥＭおよびＴＣＭサブセットを優位に含んでいた（図１０Ｂ）。興味深いことに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、同等のパーセンテージのＴＣＭおよびＴＥＭサブセットを含んでおり（図１０Ｂ）、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、ＴＥＭおよびＴＣＭサブセットの両方を効率的に誘導することが示唆された。
【0139】
［実施例１４：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊を回避する。］
Ｔ細胞の長期の刺激は、増殖の低減、サイトカイン産生レベルの低下、高いアポトーシス率および抑制性受容体、例えば、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）の発現によって特徴付けられる疲弊を引き起こすことが知られている（Ｖｉｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３８：３０（２００９）；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４９２（２０１１））。Ｔ細胞疲弊に対するＣＳＳＤの効果を決定するために、ＰＤ－１＋、ＬＡＧ－３＋およびＰＤ－１＋／ＬＡＧ－３＋疲弊Ｔ細胞集団のパーセンテージを試験した（図４Ｅ）。結果は、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は相対的に大きなパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含むが、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものは、有意により低いパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含むことを示した（図９Ａ～９Ｃ）。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、この研究において試験されたＣＡＲ－Ｔ細胞の中で、最も低いパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含んだ（図９Ａ～９Ｃ）。興味深いことに、ＰＤ－１＋またはＬＡＧ－３＋細胞のパーセンテージは、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものよりも、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞について、それぞれ、より大きく、および、より小さかった。合わせると、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊を回避した。
Ｔ細胞の長期の刺激は、増殖の低減、サイトカイン産生レベルの低下、高いアポトーシス率および抑制性受容体、例えば、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）の発現によって特徴付けられる疲弊を引き起こすことが知られている（Ｖｉｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３８：３０（２００９）；Ｗｈｅｒｒｙ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４９２（２０１１））。Ｔ細胞疲弊に対するＣＳＳＤの効果を決定するために、ＰＤ－１＋、ＬＡＧ－３＋およびＰＤ－１＋／ＬＡＧ－３＋疲弊Ｔ細胞集団のパーセンテージを試験した（図４Ｅ）。結果は、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は相対的に大きなパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含むが、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものは、有意により低いパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含むことを示した（図９Ａ～９Ｃ）。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、この研究において試験されたＣＡＲ－Ｔ細胞の中で、最も低いパーセンテージの疲弊Ｔ細胞を含んだ（図９Ａ～９Ｃ）。興味深いことに、ＰＤ－１＋またはＬＡＧ－３＋細胞のパーセンテージは、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものよりも、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞について、それぞれ、より大きく、および、より小さかった。合わせると、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊を回避した。
【0140】
［実施例１５：ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、再プログラムされたエネルギー代謝を示す。］
Ｔ細胞疲弊は、エネルギー代謝の欠損を伴うことが最近になって示された（Ｆｉｓｉｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２３：３２７（２０１７）；Ｂｅｎｇｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４５：３５８（２０１６））。したがって、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝状態を、基礎条件および試薬の逐次添加後に比較して、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアの酸素消費機構の相対的寄与を分析した（図６Ａ）。ミトコンドリア呼吸および解糖系は、それぞれ、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）によって測定することができる。ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が最も高いレベルの基礎ＯＣＲを示し、その次に４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものが続き、コントロールＴ細胞およびＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するものが最も低いレベルの基礎ＯＣＲを示した（図６Ｂ～６Ｅ）。ＡＴＰ関連呼吸も、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンを添加することによって測定し、最大ＯＣＲレベルを、カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；ＡＴＰ生産から酸素消費を脱共役する）を添加することによって測定した（図６Ａ）。結果は、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＡＴＰ関連呼吸および最大ＯＣＲレベルが、基礎ＯＣＲレベルと同様に上昇することを示した（図６Ｃおよび６Ｄ）。興味深いことに、基礎ＥＣＡＲは、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞についてのみ有意に増大した（図６Ｅ）。これらのデータにより、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は低いエネルギー状態を示すが、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものはより高いミトコンドリア呼吸を誘導することが示された。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、高い解糖系も誘導した。これらの結果は、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、エネルギー代謝の再プログラムを導くことができることを示唆した。
Ｔ細胞疲弊は、エネルギー代謝の欠損を伴うことが最近になって示された（Ｆｉｓｉｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２３：３２７（２０１７）；Ｂｅｎｇｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４５：３５８（２０１６））。したがって、異なるＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の代謝状態を、基礎条件および試薬の逐次添加後に比較して、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアの酸素消費機構の相対的寄与を分析した（図６Ａ）。ミトコンドリア呼吸および解糖系は、それぞれ、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）によって測定することができる。ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞が最も高いレベルの基礎ＯＣＲを示し、その次に４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものが続き、コントロールＴ細胞およびＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するものが最も低いレベルの基礎ＯＣＲを示した（図６Ｂ～６Ｅ）。ＡＴＰ関連呼吸も、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンを添加することによって測定し、最大ＯＣＲレベルを、カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；ＡＴＰ生産から酸素消費を脱共役する）を添加することによって測定した（図６Ａ）。結果は、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＡＴＰ関連呼吸および最大ＯＣＲレベルが、基礎ＯＣＲレベルと同様に上昇することを示した（図６Ｃおよび６Ｄ）。興味深いことに、基礎ＥＣＡＲは、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞についてのみ有意に増大した（図６Ｅ）。これらのデータにより、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は低いエネルギー状態を示すが、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものはより高いミトコンドリア呼吸を誘導することが示された。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、高い解糖系も誘導した。これらの結果は、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、エネルギー代謝の再プログラムを導くことができることを示唆した。
【0141】
［実施例１６：実施例１０～１５の考察］
ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ由来のＣＳＳＤと組み合わせて抗原認識ドメインとしてのｓＣＤ４からなるＣＡＲを発現する、レンチウイルスベクターを開発した。これらのベクターを用いてヒトＴ細胞株および一次Ｔ細胞を形質導入することにより、ＣＡＲ構築物におけるＣＳＳＤが、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルに関する極めて重要な決定因子であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性およびエフェクター機能と相関すると考えられることが示された。また、この研究において、Ｔ細胞疲弊、エネルギー代謝およびメモリーＴ細胞サブセットの誘導も、ＣＡＲ構築物におけるＣＳＳＤによって影響を受けることも示された。この研究において試験したＣＳＳＤのうち、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤは、最も高いレベルのＣＡＲ発現、ＣＡＲ－Ｔ細胞の最も強力なエフェクター機能、疲弊の回避、および、セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞サブセットの両方のバランスの取れた誘導をもたらした（高い解糖系およびミトコンドリア呼吸と関連する）。この研究の結果は、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、特定の状況において効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するのに有用であり得ることを示唆する。
ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＨＶＥＭ由来のＣＳＳＤと組み合わせて抗原認識ドメインとしてのｓＣＤ４からなるＣＡＲを発現する、レンチウイルスベクターを開発した。これらのベクターを用いてヒトＴ細胞株および一次Ｔ細胞を形質導入することにより、ＣＡＲ構築物におけるＣＳＳＤが、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルに関する極めて重要な決定因子であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性およびエフェクター機能と相関すると考えられることが示された。また、この研究において、Ｔ細胞疲弊、エネルギー代謝およびメモリーＴ細胞サブセットの誘導も、ＣＡＲ構築物におけるＣＳＳＤによって影響を受けることも示された。この研究において試験したＣＳＳＤのうち、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤは、最も高いレベルのＣＡＲ発現、ＣＡＲ－Ｔ細胞の最も強力なエフェクター機能、疲弊の回避、および、セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞サブセットの両方のバランスの取れた誘導をもたらした（高い解糖系およびミトコンドリア呼吸と関連する）。この研究の結果は、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、特定の状況において効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するのに有用であり得ることを示唆する。
【0142】
ＣＳＳＤが、細胞表面上のＣＡＲ発現レベルをどのように制御しているのかは、未だ知られていない。全細胞溶解物中のＣＡＲ分子の量は、細胞表面発現のレベルと相関したので、トラフィッキング以外のＣＡＲ合成は、ＣＳＳＤによって影響を受け得る。他の可能性のうち、異なるＣＳＳＤは、異なるシグナル伝達経路を活性化し得て、異なるレベルの遺伝子発現をもたらす。例えば、ＣＤ２８によって仲介される共刺激はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路を誘導するが、４－１ＢＢによって仲介される共刺激は主に、ＴＮＦＲ関連因子を通してＪＮＫおよびｐ３８を活性化する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １０：２４７（２０００）；Ｃａｎｎｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６１９３（２０００））。また、４－１ＢＢおよびＨＶＥＭは、代替のＮＦ－ΚＢ経路を活性化することが可能であることも示されている（Ｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：２８７４（２００５））。シグナル伝達経路におけるこれらの違いは、転写または翻訳レベルでＣＡＲ発現に影響し得る（Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：６０８（２０１７））。
【0143】
エクスビボでの拡大中の抗原非依存性のトニックシグナリングは、ＣＤ２８由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊を生じさせるが、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものは疲弊に対して相対的に不応性であることが示されている（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１：５８１（２０１５））。本研究は、これらの観察を確認しただけでなく、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤがＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊を防ぐことができることも示した。さらに、これらのデータは、ＣＡＲ構築物におけるＣＳＳＤが、抑制性受容体発現に対する異なる効果を通してＴ細胞疲弊の程度に影響し得ることを示唆した（図４Ｄ）。４－１ＢＢおよびＨＶＥＭはＴＮＦＲＳＦ内に分類されるので、ＴＮＦＲＳＦに由来するＣＳＳＤは、ＣＤ２８ファミリーに由来するものとは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞が疲弊を防ぐのを可能にし得る可能性がある。
【0144】
ミトコンドリア動態は、代謝プログラムを通してＴ細胞の結末を制御することが示唆されている（Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６６：６３（２０１６））。さらに、４－１ＢＢによって仲介される共刺激は、セントラルメモリーサブセットの増大とともにミトコンドリア呼吸を高めることが報告されている（Ｋａｗａｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４：３８０（２０１６））。本発明の結果は、これらの以前の研究と矛盾なく、また、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、解糖系およびミトコンドリア呼吸の両方を高めることも示し、相対的に低いレベルのＴ細胞疲弊も示した。また、様々なＴ細胞サブセットは、それらの機能をサポートするために別個の代謝プログラムを必要とすることも示されている（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１０８（２００９）；Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１０３（２００９）；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３２：６７（２０１０））。本発明のデータは、共刺激シグナルが、セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞サブセットへのＣＡＲ－Ｔ細胞の分化に影響を及ぼすこと、および、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤが、効率的かつバランスの取れた分化を誘導することを示唆した。異なる共刺激シグナルは、別個の様式で代謝プログラムが特異的なメモリーＴ細胞サブセットに分化するのに影響する可能性がある。
【0145】
新規の抗－ＨＩＶ薬物の開発および抗－レトロウイルス療法（ＡＲＴ）における進歩は、ＨＩＶ感染患者の予後を劇的に改善した。しかしながら、ＡＲＴは、潜在的感染細胞の持続性に起因して、患者の体からＨＩＶを完全に除去することは成功していない。この目的を達成するために、潜在的感染細胞の薬理学的再活性化およびその後のＨＩＶ特異的ＣＴＬまたは広域中和抗体（ｂＮＡｂ）による免疫療法を組み合わせる、いわゆる「ショックおよび死滅化」アプローチが提案されている（Ｈａｌｐｅｒ－Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５８：９８９（２０１４））。このプロトコルでは、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖの保存領域を標的化するＣＤ４に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞は、エスケープ突然変異を有する抗原を認識することができないＴＣＲに基づくＣＡＲ－Ｔ細胞またはｂＮＡｂに基づくＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有用であり得る。実際に、最近の研究は、ＨＩＶ治療のインビトロおよびインビボのモデルにおいて、４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するＣＡＲ－Ｔ細胞の有望な結果を報告している（Ｌｅｉｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１３：ｅ１００６６１３（２０１７））。本発明の研究の結果は、ＨＶＥＭ由来ＣＳＳＤを有するＣＤ４に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来ＣＳＳＤを有するものよりも強力なエフェクター機能を示した）は、ＨＩＶ感染の「ショックおよび死滅化」治療のための有用なツールでもあり得ることを強く示唆する。
【0146】
要約すると、本発明の結果は、ＣＡＲにおけるＣＳＳＤが、ＣＡＲ－Ｔ細胞のエフェクター機能および特性に関する極めて重要な決定因子であることを示し、ＣＡＲにおけるＣＳＳＤが、より強力なＣＡＲ－Ｔ細胞を設計するのに重要であることを示す。さらに、ＨＶＥＭ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための有望な候補であり得る。
【0147】
［実施例１７：ＣＡＩＸ ＣＡＲ発現試験］
様々なＣＡＲ構築物を、図１１Ａに示されるように抗－ＣＡＩＸ ｓｃＦｖおよび異なるＣＳＳドメインを用いて調製した。４つの構築物によって形質導入されたｃ－ｍｙｃ＋ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＦＡＣＳ検出を図１１Ｂに示す。平均の表面ｃ－ｍｙｃ発現レベル（ＭＦＩ）を図１１Ｃに示す。
様々なＣＡＲ構築物を、図１１Ａに示されるように抗－ＣＡＩＸ ｓｃＦｖおよび異なるＣＳＳドメインを用いて調製した。４つの構築物によって形質導入されたｃ－ｍｙｃ＋ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のＦＡＣＳ検出を図１１Ｂに示す。平均の表面ｃ－ｍｙｃ発現レベル（ＭＦＩ）を図１１Ｃに示す。
【0148】
３つの標的腎臓／腎癌細胞株を用いて、ＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を試験した。ＡＣＨＮは、ＣＡＩＸ発現がないネガティブコントロールである。ＦＡＣＳによって検出した結果、Ｋｅｔｒ－３はＣＡＩＸの発現が高く、ＯＳＲＣ－２はＣＡＩＸの発現が低い（図１２Ａ）。ＣＡＩＸ－ＨＶＥＶ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＩＸ＋標的細胞を、他のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも効率的に死滅化した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。また、ＣＡＩＸ－ＨＶＥＶ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＩＸ＋標的細胞との共培養に応答して、他のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くのＩＬ－２およびＩＦＮ－γを産生した（Ｋｅｔｒ－３（図１２Ｄ）およびＯＳＣＲ－２（図１２Ｅ））。
【0149】
精製されたｃ－ｍｙｃ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞をＳｅａｈｏｒｓｅアッセイによって分析して、それらの代謝活性を測定した。図１３Ａは、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイによる様々なＣＡＲ－Ｔ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す。ＨＶＥＭに基づくＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より高い基礎ＯＣＲ（図１３Ｂ）および最大ＯＣＲ（図１３Ｃ）を示した。
【0150】
［実施例１８：インビボでの腎癌の試験］
実施例１６のＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた腎癌治療の試験を、ＮＰＧマウスにおいて行なった。試験デザインを図１４Ａに示す。マウスに、１×１０６個のＯＳＣＲ－２ヒト腎癌細胞を１日目に静脈内注入した。１×１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を７日目に静脈内注入した。図１４Ｂは、１４日目のマウスの末梢血中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のレベルを示す。マウスの全生存を図１４Ｃに示す。ＨＶＥＭに基づくＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に良好の生存を提供した。
実施例１６のＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた腎癌治療の試験を、ＮＰＧマウスにおいて行なった。試験デザインを図１４Ａに示す。マウスに、１×１０６個のＯＳＣＲ－２ヒト腎癌細胞を１日目に静脈内注入した。１×１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞を７日目に静脈内注入した。図１４Ｂは、１４日目のマウスの末梢血中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のレベルを示す。マウスの全生存を図１４Ｃに示す。ＨＶＥＭに基づくＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に良好の生存を提供した。
【0151】
６匹のマウス／群における肺転移腫瘍を、図１６に示される時点において試験した。ＨＶＥＭ ＣＡＲ－Ｔ群のマウスは、腫瘍注入の９０日後に終了したが、他の群のマウスは、腫瘍注入の５０日後に終了した。白斑は、肺における転移腫瘍を示す。ＨＶＥＭに基づくＣＡＩＸ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に減少した（ｒｅｃｕｅｄ）腫瘍転移を提供した。図１７は、終了時の１匹のマウス／群の代表的なヘマトキシリン／エオシン肺組織病理学を示す。ＨＶＥＭ ＣＡＲ－Ｔ群のみが機能性な肺構造を示し、他の群は全て、肺の構造および機能が失われた重度に浸潤された肺を示した。
【0152】
繰り返しの実験において、ＨＶＥＭ－ＣＡＲ Ｔ拡大の同様の結果が、腫瘍注入の１４日後およびＣＡＲ－Ｔ細胞移行の７日後にインビボで観察された。図１５Ａは、インビトロ形質導入後のＣＡＲ－Ｔ（ｍｙｃ＋）細胞のパーセンテージを示す。図１５Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞移行後７日目のマウス血液中のヒトＣＡＲ－Ｔ細胞のレベルを示す。図１５Ｃは、全マウス血液細胞のパーセンテージ（左）またはヒトＴ細胞カウント／１００μｌマウス血液としての、ヒトＴ細胞の要約データを示す。ＨＶＥＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より良好な拡大をインビボで示した。
【0153】
前述したものは本発明の例示であり、それらを制限するものと解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物は本明細書中に含められる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B-6C】
【図6D-6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A-8C】
【図9A-9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B-C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】