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特表2022-529424ジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-22
(54)【発明の名称】ジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220615BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220615BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220615BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220615BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220615BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220615BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20220615BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220615BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220615BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220615BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/12 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/55
C12N15/31
C12N15/864 100Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/46
A61K48/00
A61P21/04
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560850
(86)(22)【出願日】2020-04-14
(85)【翻訳文提出日】2021-12-07
(86)【国際出願番号】 US2020028154
(87)【国際公開番号】W WO2020214613
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】62/833,759
(32)【優先日】2019-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100154988
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 真知
(72)【発明者】
【氏名】ガーズバック チャールズ エイ
(72)【発明者】
【氏名】ピッカー オリヴァー エイドリアン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC541
4C084ZC542
(57)【要約】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法が本明細書中に開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および
（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列
を含む組成物をコードしている１個または複数個のベクターを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
【請求項2】
（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および
（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列
を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
【請求項3】
野生型ジストロフィン遺伝子の断片が、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれている、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項4】
ｇＲＮＡが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンと並置されているイントロンを標的とし、エクソンが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項5】
ドナー配列が、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的均等物を含み、エクソンが、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項6】
突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンがジストロフィン遺伝子から突然変異しているもしくは少なくとも部分的に欠失している、または、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンが欠失しており、イントロンが、対応する野生型ジストロフィン遺伝子中で欠失したエクソンがあるはずであろう場所と並置されている、請求項４に記載のシステム。
【請求項7】
エクソンがエクソン５２である、請求項４または５に記載のシステム。
【請求項8】
ｇＲＮＡが、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８、
ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、
ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、
ｄ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいは
ｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列
を含むポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項9】
ｇＲＮＡが、配列番号１９もしくは配列番号２０のポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、またはそれによってコードされている、請求項１～８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項10】
Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項11】
Ｃａｓタンパク質が、配列番号１、２、３、または４のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項12】
２個のｇＲＮＡスペーサーが、配列番号５～８および２５～４５から選択される配列を独立して含む、請求項３～１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項13】
２個のｇＲＮＡスペーサーが同一である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項14】
２個のｇＲＮＡスペーサーが異なる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項15】
２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個が、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む、請求項３～１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項16】
ドナー配列が、配列番号２１または配列番号２２のポリヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項17】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１および３～１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項18】
ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、またはＡＡＶｒｈ．７４ベクターである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
１個または複数個のベクターのうちの１個が、配列番号２３または２４のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項21】
ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比が、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５である、請求項１～２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項22】
野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列またはその機能的均等物をコードしている組換えポリヌクレオチドであって、断片またはその機能的均等物が２個のｇＲＮＡスペーサーによって挟まれている、組換えポリヌクレオチド。
【請求項23】
ドナー配列がジストロフィン遺伝子のエクソンを含み、エクソンが、エクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項24】
組換えポリヌクレオチドが配列番号２３または２４の配列を含む、請求項２２または２３に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項25】
請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項26】
ベクターが組換えポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項27】
請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは請求項２５もしくは２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項28】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または請求項２５もしくは２６に記載のベクターを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
【請求項29】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または請求項２５もしくは２６に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物を含むキット。
【請求項30】
細胞または対象を、請求項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または請求項２５もしくは２６に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物と接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
【請求項31】
ジストロフィン機能が、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項33】
細胞または対象を、請求項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または請求項２５もしくは２６に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物と接触させることを含む、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンによって引き起こされた、破壊されたジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象において、ジストロフィン機能を修復するための方法。
【請求項34】
ジストロフィン機能が、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
欠失または突然変異したエクソンのうちの１つがエクソン５２である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１９年４月１４日に出願の米国仮特許出願第６２／８３３，７５９号の優先権を主張するものである。
連邦支援の研究に関する記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｒ０１ＡＲ０６９０８５号の下で行われた。政府が発明の特定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１９年４月１４日に出願の米国仮特許出願第６２／８３３，７５９号の優先権を主張するものである。
連邦支援の研究に関する記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｒ０１ＡＲ０６９０８５号の下で行われた。政府が発明の特定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
【背景技術】
【0002】
序論
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生男児において約１：５０００で起こる、最も一般的な致死的遺伝性小児疾患である。患者の二十代半ばでの死亡をもたらす進行性の筋力低下は、ジストロフィン遺伝子中の突然変異の結果である。ほとんどの事例において（約６０％）、突然変異は、ジストロフィン遺伝子からの７９個のエクソンのうちの１個または複数個の欠失からなり、リーディングフレームの破壊がもたらされる。以前の治療戦略は、典型的には、ＤＭＤと比較してより緩和な症状に関連しているベッカー型筋ジストロフィーに対応する遺伝子型を反復する、切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現を生じることを目的とする。たとえば、いくつかのグループは、特定のエクソンを欠失させることによってジストロフィンリーディングフレームを修復するために、培養ヒトＤＭＤ細胞およびＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を適応している。しかし、完全な、完全に機能的なジストロフィンタンパク質を修復するための遺伝子編集戦略を開発する必要性が残存する。
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生男児において約１：５０００で起こる、最も一般的な致死的遺伝性小児疾患である。患者の二十代半ばでの死亡をもたらす進行性の筋力低下は、ジストロフィン遺伝子中の突然変異の結果である。ほとんどの事例において（約６０％）、突然変異は、ジストロフィン遺伝子からの７９個のエクソンのうちの１個または複数個の欠失からなり、リーディングフレームの破壊がもたらされる。以前の治療戦略は、典型的には、ＤＭＤと比較してより緩和な症状に関連しているベッカー型筋ジストロフィーに対応する遺伝子型を反復する、切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現を生じることを目的とする。たとえば、いくつかのグループは、特定のエクソンを欠失させることによってジストロフィンリーディングフレームを修復するために、培養ヒトＤＭＤ細胞およびＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を適応している。しかし、完全な、完全に機能的なジストロフィンタンパク質を修復するための遺伝子編集戦略を開発する必要性が残存する。
【発明の概要】
【0003】
一態様では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムに関する。システムは、（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含む組成物をコードしている１個または複数個のベクターを含み得る。さらなる一態様では、システムは、（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含み得る。一部の実施形態では、野生型ジストロフィン遺伝子の断片は、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれている。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンと並置されているイントロンを標的とし、エクソンは、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される。一部の実施形態では、ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的均等物を含み、エクソンは、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される。一部の実施形態では、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンは、ジストロフィン遺伝子もしくはゲノムから突然変異もしくは少なくとも部分的に欠失している、または、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンは欠失しており、イントロンは、対応する野生型ジストロフィン遺伝子中で欠失したエクソンがあるはずであろう場所と並置されている。一部の実施形態では、エクソンはエクソン５２である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８、ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、ｄ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列を含むポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１９もしくは配列番号２０のポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、またはそれによってコードされている。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１、２、３、または４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーは、配列番号５～８および２５～４５から選択される配列を独立して含む。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーは同一である。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーは異なる。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個は、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む。一部の実施形態では、ドナー配列は、配列番号２１または配列番号２２のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、またはＡＡＶｒｈ．７４ベクターである。一部の実施形態では、１個または複数個のベクターのうちの１個は、配列番号２３または２４のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５である。
【0004】
さらなる一態様では、本開示は、野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列またはその機能的均等物をコードしている組換えポリヌクレオチドに関し、断片またはその機能的均等物は２個のｇＲＮＡスペーサーによって挟まれている。一部の実施形態では、ドナー配列はジストロフィン遺伝子のエクソンを含み、エクソンは、エクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは配列番号２３または２４の配列を含む。
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、組換えポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、組換えポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
【0005】
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチドまたは本明細書中に詳述するベクターを含む細胞を提供する。
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、または本明細書中に詳述するベクターを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、または本明細書中に詳述するベクターを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。
【0006】
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、もしくは本明細書中に詳述するベクター、または本明細書中に詳述する組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。方法は、細胞または対象を、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、もしくは本明細書中に詳述するベクター、または本明細書中に詳述する組成物と接触させることを含み得る。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。方法は、細胞または対象を、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、もしくは本明細書中に詳述するベクター、または本明細書中に詳述する組成物と接触させることを含み得る。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
【0007】
本開示の別の態様は、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンによって引き起こされた、破壊されたジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象において、ジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。方法は、細胞または対象を、本明細書中に詳述するシステム、本明細書中に詳述する組換えポリヌクレオチド、もしくは本明細書中に詳述するベクター、または本明細書中に詳述する組成物と接触させることを含み得る。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される。一部の実施形態では、欠失または突然変異したエクソンのうちの１つはエクソン５２である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ジストロフィンタンパク質をコードしているエクソンおよび細胞中の様々な相互作用の模式図である。
【図2】ジストロフィンタンパク質の模式図である。
【図3】ｈＤＭＤ－エクソン５２の上流にあるｈＤＭＤ－イントロン５１を標的とするｇＲＮＡを作製するための戦略を示す図である。
【図4A-4B】図４Ａは、図４Ｂに示すサーベイヤー分析のための、プライマー番号および予想されたバンドサイズを示す。図４Ｂは、ｈＤＭＤ－エクソン５２の上流にあるｈＤＭＤ－イントロン５１を標的とするｇＲＮＡの編集効率を示すゲルの図である。
【図7】ｇＲＮＡ発現プラスミドまたはＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ形質移入の結果を示すゲルである。
【図8A-8B】図８Ａは、ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウス由来の初代筋芽細胞内に電気穿孔した、ＡＡＶプラスミド（ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃａｓ９プラスミドおよびＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－Ｅｘ５２プラスミド）のＨＩＴＩ媒介性組込みを検出するためのネステッドＰＣＲ結果を示すゲルである。図８Ｂは、予想されたＨＩＴＩ媒介性挿入を用いたサンガーシーケンシング結果を示す図である。
【図9】ｉｎ ｖｉｖｏ編集を確認するため、最良のｇＲＮＡ／ドナー配列の組合せを決定するため、およびＡＡＶ－Ｃａｓ９対ＡＡＶ－ドナープラスミドの最良の比を決定するために使用した実験の模式図である。
【図10A-10B】図１０Ａは、標的切断部位の下流の、プライマーを用いたマウスのゲノムＤＮＡ中の標的Ｅｘ５２挿入を示すゲルである。図１０Ｂは、標的切断部位の上流の、プライマーを用いたマウスのゲノムＤＮＡ中の標的Ｅｘ５２挿入を示すゲルである。
【図11】処置したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのｍＲＮＡ中の標的Ｅｘ５２挿入を示すゲルである。
【図12】処置したマウスにおけるタンパク質修復を確認するウエスタンブロット分析を示す図である。
【図13】編集したマウスにおけるＡＡＶ－ＩＴＲゲノム組込みのＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシング定量からの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子／ゲノム編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置する方法を提供する。ＤＭＤは、典型的には、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子中の欠失によって引き起こされる。内部で切断されたジストロフィンタンパク質は部分的に機能的であり続けることができることが示されているため、ＤＭＤを処置するための多くの戦略は、追加のエクソンを除去またはスキップすることによってリーディングフレームを修復することを目的としている。ジストロフィン遺伝子を補正するための、ＡＡＶをベースにした相同性非依存性標的組込み（ＨＩＴＩ）媒介性遺伝子編集治療を本明細書中で詳述する。具体的には、欠損したエクソンの、ジストロフィン遺伝子内への標的挿入を指示するために、本発明者らはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を適応した。治療上関連のある標的として、完全長ヒトジストロフィン遺伝子を保有するマウスにおいてエクソン５２が除去されている、ＤＭＤのヒト化マウスモデル（ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウス）においてＨＩＴＩ媒介性ゲノム編集戦略を最適化した。標的組込みを達成するために、エクソン５２を含めた欠失したゲノム配列を含有するＡＡＶベクターを、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現カセットをコードしているＡＡＶと共に同時送達した。培養細胞中の標的エクソン５２組込みが確認された。ＡＡＶ送達と組み合わせて、欠損したエクソンの標的挿入のためのＨＩＴＩ媒介性戦略は、完全長ジストロフィンを修復する方法、および改善された機能的結果を提供する。
【0010】
１．定義
本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、６～９の範囲では、６および９の数値に加えて７および８が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が明確に企図される。
本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、６～９の範囲では、６および９の数値に加えて７および８が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が明確に企図される。
【0011】
本明細書中で使用する用語「およそ」または「約」とは、当業者によって決定された特定の値について許容される誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。たとえば、「およそ」は、当分野における実施に従って、３以内または３を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「およそ」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物系または生物学的過程に関して、この用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
【0012】
本明細書中で互換性があるように使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」とは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小さなウイルスをいう。ＡＡＶは現在、疾患を引き起こすことは知られておらず、したがって、このウイルスは非常に緩和な免疫応答を引き起こす。
本明細書中で使用する「結合領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムによって認識されてそれと結合する、標的領域内の領域をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体ＤＮＡの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
本明細書中で使用する「結合領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムによって認識されてそれと結合する、標的領域内の領域をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体ＤＮＡの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
【0013】
本明細書中で使用する「コード配列」または「コードしている核酸」とは、タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸を投与する個体または哺乳動物の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルをさらに含むことができる。コード配列はコドン最適化されていてよい。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（たとえばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、２個の核酸配列間で共有される特性をいう。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（たとえばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、２個の核酸配列間で共有される特性をいう。
【0014】
本明細書中で互換性があるように使用される「デュシェンヌ筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」とは、筋変性および最終的には死をもたらす、劣性の致命的なＸ連鎖の障害をいう。ＤＭＤは、３５００人に１人の男性に起こる、一般的な遺伝性の一遺伝子的疾患である。ＤＭＤは、ナンセンスまたはフレームシフトのジストロフィン遺伝子中の突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン突然変異の大多数は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の未熟な翻訳終止を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者、典型的には、小児期中に自身を物理的に支持する能力を失い、ティーンエージ期中に進行的に脆弱になり、その二十代に亡くなる。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
【0015】
本明細書中で使用する「エクソン５２」とは、ジストロフィン遺伝子の５２番目のエクソンをいう。エクソン５２は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソン５２は配列番号２１のポリヌクレオチドを含み得る。エクソン５２は配列番号２２のポリヌクレオチド内に含まれ得る。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードＤＮＡ配列をいう。エンハンサーは、２００ｂｐ～１ｋｂの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの５’上流側もしくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。ＤＮＡルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが１個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードＤＮＡ配列をいう。エンハンサーは、２００ｂｐ～１ｋｂの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの５’上流側もしくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。ＤＮＡルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが１個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
【0016】
本明細書中で使用する「機能的」および「完全に機能的」とは、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能的遺伝子」とは、ｍＲＮＡへと転写される遺伝子をいい、これが機能的タンパク質へと翻訳される。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた２個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた２個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
【0017】
本明細書中で使用する「ゲノム編集」とは、遺伝子を変えることをいう。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補修または修復することを含み得る。ゲノム編集はスプライスアクセプター部位を変更させ得る。ゲノム編集は、目的遺伝子を変えることによって疾患を処置するまたは筋肉修復を増強させるために使用し得る。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の２個以上の配列、たとえば、１個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、２個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列（たとえば、２個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」）を含むことを示す。
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書中で使用する「同一」または「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された残基百分率を有することを意味する。百分率は、２個の配列を最適にアラインメントすること、２個の配列を指定された領域にわたって比較すること、両方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除算すること、および結果を１００で乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。２個の配列が異なる長さのものである、またはアラインメントにより１個または複数個のねじれ型末端が生じ、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合は、単一配列の残基を計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は均等物としてみなし得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行い得る。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の２個以上の配列、たとえば、１個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、２個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列（たとえば、２個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」）を含むことを示す。
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書中で使用する「同一」または「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された残基百分率を有することを意味する。百分率は、２個の配列を最適にアラインメントすること、２個の配列を指定された領域にわたって比較すること、両方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除算すること、および結果を１００で乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。２個の配列が異なる長さのものである、またはアラインメントにより１個または複数個のねじれ型末端が生じ、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合は、単一配列の残基を計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は均等物としてみなし得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行い得る。
【0018】
本明細書中で互換性があるように使用される「突然変異遺伝子」または「突然変異した遺伝子」とは、検出可能な突然変異を受けた遺伝子をいう。突然変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書中で使用する「破壊された遺伝子」とは、未熟なストップコドンの原因となる突然変異を有する突然変異遺伝子をいう。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。たとえば、正常遺伝子は野生型遺伝子であり得る。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。たとえば、正常遺伝子は野生型遺伝子であり得る。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【0019】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または、二本鎖および一本鎖の配列の両方の一部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組合せを含有し得る。核酸は、化学合成方法によってまたは組換え方法によって得られ得る。
「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドンで開始され、ストップコドンで終わる、コドンの区間をいう。複数のエクソンを有する真核生物遺伝子では、イントロンが除去され、その後、転写後にエクソンが一緒に結合されて、タンパク質翻訳のための最終ｍＲＮＡが得られる。オープンリーディングフレームはコドンの連続的な区間であり得る。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、タンパク質の発現のための、スプライシングされたｍＲＮＡにのみ適用され、ゲノムＤＮＡには適用されない。
「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドンで開始され、ストップコドンで終わる、コドンの区間をいう。複数のエクソンを有する真核生物遺伝子では、イントロンが除去され、その後、転写後にエクソンが一緒に結合されて、タンパク質翻訳のための最終ｍＲＮＡが得られる。オープンリーディングフレームはコドンの連続的な区間であり得る。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、タンパク質の発現のための、スプライシングされたｍＲＮＡにのみ適用され、ゲノムＤＮＡには適用されない。
【0020】
本明細書中で使用する「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。
核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的関係に配置されている場合に、「作動可能に連結されている」（または「稼働可能に連結されている」）。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を調節する、またはその変調に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＤＮＡ配列は典型的には連続的であり、作動可能に連結されているアミノ酸配列は、典型的には連続的であり、かつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基まで、またはそれより多く隔てられている場合に機能し、イントロン配列は可変の長さであってよいため、一部のポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されているが連続的ではない場合がある。同様に、一次ポリペプチド配列中で非連続的である特定のアミノ酸配列は、たとえばポリペプチド鎖の折り畳みのおかげで、依然として作動可能に連結されている場合がある。融合ポリペプチドに関して、用語「稼働可能に連結されている」および「作動可能に連結されている」とは、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結されて、そのように連結されていないかのように、同じ機能を行うことをいうことができる。
核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的関係に配置されている場合に、「作動可能に連結されている」（または「稼働可能に連結されている」）。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を調節する、またはその変調に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＤＮＡ配列は典型的には連続的であり、作動可能に連結されているアミノ酸配列は、典型的には連続的であり、かつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基まで、またはそれより多く隔てられている場合に機能し、イントロン配列は可変の長さであってよいため、一部のポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されているが連続的ではない場合がある。同様に、一次ポリペプチド配列中で非連続的である特定のアミノ酸配列は、たとえばポリペプチド鎖の折り畳みのおかげで、依然として作動可能に連結されている場合がある。融合ポリペプチドに関して、用語「稼働可能に連結されている」および「作動可能に連結されている」とは、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結されて、そのように連結されていないかのように、同じ機能を行うことをいうことができる。
【0021】
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、突然変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。
本明細書中で互換性があるように使用される「未熟なストップコドン」または「アウトオブフレームストップコドン」とは、野生型遺伝子中には通常見つからない位置にストップコドンをもたらす、ＤＮＡの配列中のナンセンス突然変異をいう。未熟なストップコドンは、タンパク質の完全長バージョンと比較してタンパク質が切断されるまたは短くなることを引き起こし得る。
本明細書中で互換性があるように使用される「未熟なストップコドン」または「アウトオブフレームストップコドン」とは、野生型遺伝子中には通常見つからない位置にストップコドンをもたらす、ＤＮＡの配列中のナンセンス突然変異をいう。未熟なストップコドンは、タンパク質の完全長バージョンと比較してタンパク質が切断されるまたは短くなることを引き起こし得る。
【0022】
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、または増強させることができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１個または複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
【0023】
たとえば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用する用語「組換え」とは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されている、あるいは、細胞が、そのように改変した細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（天然に存在する）形態内に見つからない遺伝子を発現する、あるいは、そうでなければ正常もしくは異常に発現される、過少発現される、または全く発現されない、ネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞（筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種）の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
本明細書中で使用する「骨格筋状態」とは、筋ジストロフィー、加齢、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または萎縮などの、骨格筋に関連する状態をいう。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞（筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種）の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
本明細書中で使用する「骨格筋状態」とは、筋ジストロフィー、加齢、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または萎縮などの、骨格筋に関連する状態をいう。
【0024】
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」および「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、アルパカ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（たとえば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、ならびにヒト）を含めた、任意の脊椎動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。
「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、本明細書中でそれぞれ互換性があるように使用され、そのような用語が適用される疾患、またはそのような疾患の１種もしくは複数種の症状の進行を逆転、軽減、または阻害することを説明する。処置は、急性または慢性の様式のどちらかで行い得る。この用語はまた、疾患またはそのような疾患に関連する症状の重篤度を、疾患を罹患する前に低下させることもいう。そのような疾患の重篤度の、罹患前の低下とは、抗体または医薬組成物を、投与時に疾患を患っていない対象に投与することをいう。「防止すること」とは、疾患またはそのような疾患に関連する１種もしくは複数種の症状の再発を防止することもいう。「処置」および「治療上」とは、上記定義した「処置すること」のように処置する行為をいう。
「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、本明細書中でそれぞれ互換性があるように使用され、そのような用語が適用される疾患、またはそのような疾患の１種もしくは複数種の症状の進行を逆転、軽減、または阻害することを説明する。処置は、急性または慢性の様式のどちらかで行い得る。この用語はまた、疾患またはそのような疾患に関連する症状の重篤度を、疾患を罹患する前に低下させることもいう。そのような疾患の重篤度の、罹患前の低下とは、抗体または医薬組成物を、投与時に疾患を患っていない対象に投与することをいう。「防止すること」とは、疾患またはそのような疾患に関連する１種もしくは複数種の症状の再発を防止することもいう。「処置」および「治療上」とは、上記定義した「処置すること」のように処置する行為をいう。
【0025】
核酸に関して本明細書中で使用する「変異体」とは、（ｉ）参照したヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照したヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照した核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照した核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一である配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも１種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性（たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも１種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性（たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【0026】
本明細書中で使用する「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。たとえば、ベクターは、Ｃａｓタンパク質もしくは融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、および／あるいは配列番号１９もしくは配列番号２０の少なくとも１個のｇＲＮＡヌクレオチド配列または配列番号１７もしくは配列番号１８を含むヌクレオチド配列を標的とするｇＲＮＡを含む、本明細書中に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムをコードしていてよい。
【0027】
２．ジストロフィンを修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム
ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムを本明細書中で提供する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質と、配列番号１７または配列番号１８に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列番号１９または配列番号２０のポリヌクレオチドを含む、またはそれによってコードされている。融合タンパク質は２個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメイン、または他の酵素機能を有するドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。
ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムを本明細書中で提供する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質と、配列番号１７または配列番号１８に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列番号１９または配列番号２０のポリヌクレオチドを含む、またはそれによってコードされている。融合タンパク質は２個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および塩基編集ドメイン、または他の酵素機能を有するドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。
【0028】
ａ）ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である（図１）。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは約２．２百万個のヌクレオチドを含み、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている（図２）。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である（図１）。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは約２．２百万個のヌクレオチドを含み、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている（図２）。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
【0029】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンスまたはフレームシフトの突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。ＤＭＤは最も一般的な致死的遺伝性小児疾患であり、５，０００人の新生男児中の約１人が罹患する。ＤＭＤは進行性の筋力低下によって特徴づけられており、機能的なジストロフィン遺伝子を欠くことが原因で、しばしば二十代半ばの年齢で対象の死亡をもたらす。ほとんどの突然変異は、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子中の欠失である。天然に存在する突然変異およびその結果は、ＤＭＤについて比較的よく理解されている。桿状ドメイン内に含有されるエクソン４５～５５領域中に起こるインフレーム欠失が、高度に機能的なジストロフィンタンパク質を産生することができ、多くのキャリアは無症候性であるか、緩和な症状を表示することが知られている。ジストロフィンのエクソン４５～５５は突然変異のホットスポットである。さらに、６０％を超える患者が、理論的には、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的化することによって処置し得る。ｍＲＮＡスプライシング中に非必須エクソンをスキップすること（たとえばエクソン４５スキッピング）して、内部欠失であるが機能的なジストロフィンタンパク質を生じさせることによって、ＤＭＤ患者中の破壊されたジストロフィンリーディングフレームを修復する努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（たとえばエクソン４５の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持しており、内部的に切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質を生じることができる。ジストロフィンのエクソン４５～５５の間の欠失は、ＤＭＤと比較してはるかにより緩和な表現型をもたらす。
【0030】
ジストロフィン遺伝子は突然変異ジストロフィン遺伝子であり得る。ジストロフィン遺伝子は野生型ジストロフィン遺伝子であり得る。ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子と機能的に同一である配列を有しいてよく、たとえば、配列は、コドン最適化されているが、それでも依然として野生型ジストロフィンと同じタンパク質をコードしていてよい。突然変異ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子と比較して１個または複数個の突然変異を含み得る。突然変異は、たとえば、ヌクレオチドの欠失、置換、付加、塩基転換、またはその組合せを含み得る。突然変異は、少なくとも１個のイントロンおよび／またはエクソンの全体または一部の欠失を含み得る。突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンは、ジストロフィン遺伝子から突然変異しているまたは少なくとも部分的に欠失していてよい。突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンは完全に欠失していてよい。突然変異ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子中の対応する配列に対応する一部分またはその断片を有し得る。一部の実施形態では、欠失または突然変異したエクソンによって引き起こされた破壊されたジストロフィン遺伝子は、対応する野生型エクソンを付加して戻すことによって、ＤＭＤ患者において修復することができる。一部の実施形態では、欠失または突然変異したエクソン５２によって引き起こされた破壊されたジストロフィンは、野生型エクソン５２を付加して戻すことによって、ＤＭＤ患者において修復することができる。ある特定の実施形態では、リーディングフレームを修復するためにエクソン５２を付加することは、欠失突然変異を有するＤＭＤ対象を含めたＤＭＤ対象において表現型を寛解させる。ある特定の実施形態では、１個または複数個のエクソンを、破壊されたジストロフィン遺伝子内に付加して挿入し得る。１個または複数個のエクソンを付加して挿入して、ジストロフィン中の対応する突然変異または欠失したエクソンを修復し得る。エクソン５２を付加して戻し、挿入することに加えて、１個または複数個のエクソンを破壊されたジストロフィン遺伝子内に付加して挿入し得る。ある特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５２とは、ジストロフィン遺伝子の５２番目のエクソンをいう。エクソン５２は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験において標的とされている。
【0031】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）内への高効率のエクソン５２付加を媒介することができる。本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復することができる。エクソン５２は、ＤＭＤ中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。ジストロフィン転写物へのエクソン５２の付加を使用して、ＤＭＤ患者を処置することができる。本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）を、ヒトＤＭＤ細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変および変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。
【0032】
ｂ）融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含み得る。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および遺伝子／ゲノム編集ドメイン、または他の酵素機能を有するドメインを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＤＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＲＮＡである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含み得る。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および遺伝子／ゲノム編集ドメイン、または他の酵素機能を有するドメインを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＤＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＲＮＡである。
【0033】
ｉ）Ｃａｓタンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムはＣａｓタンパク質を含み得る。Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲをベースにしたシステムの特異性は２個の要因、すなわち標的配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的配列はｇＲＮＡの５’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいＤＮＡ配列で、宿主ＤＮＡ上の塩基対と結合するように設計されている。単にｇＲＮＡの認識配列を交換することによって、Ｃａｓタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は変更したいＤＮＡ上に位置しており、Ｃａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は種特異的であることができる。
Ｃａｓ９タンパク質は核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ座位によってコードされており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与している。Ｃａｓ９分子は、１個または複数個のｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメイン、ある特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子の能力は、たとえば当分野で知られている形質転換アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムはＣａｓタンパク質を含み得る。Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲをベースにしたシステムの特異性は２個の要因、すなわち標的配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的配列はｇＲＮＡの５’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいＤＮＡ配列で、宿主ＤＮＡ上の塩基対と結合するように設計されている。単にｇＲＮＡの認識配列を交換することによって、Ｃａｓタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は変更したいＤＮＡ上に位置しており、Ｃａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は種特異的であることができる。
Ｃａｓ９タンパク質は核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ座位によってコードされており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与している。Ｃａｓ９分子は、１個または複数個のｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメイン、ある特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子の能力は、たとえば当分野で知られている形質転換アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0034】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、触媒的に死んだｄＣａｓ９を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が失活しているように、突然変異していてよい。立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするために、エンドヌクレアーゼ活性を有さない失活したＣａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）を、ｇＲＮＡによって、細菌、酵母、およびヒト細胞中の遺伝子に標的化してよい。ヌクレアーゼ活性を失活させるための、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列を参照とした例示的な突然変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、および／またはＤ９８６Ａが挙げられる。Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み得る。Ｄ１０ＡおよびＨ８４９Ａの突然変異を有する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。ヌクレアーゼ活性を失活させるための、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列を参照とした例示的な突然変異としては、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。
【0035】
Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）などの、任意の細菌または古細菌の種由来であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバシラス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、スッテレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、またはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の細菌属に由来するＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、それだけには限定されないが、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス）Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ユーバクテリウム・ベントリオスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）、ストレプトコッカス・パステリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、スフェロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、アゾルピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、パルビバキュラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、およびカンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）を含めた群から選択される。
【0036】
ある特定の実施形態では、標的核酸と相互作用してそれを切断する、Ｃａｓ９分子または突然変異Ｃａｓ９タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある特定の実施形態では、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。様々な細菌種由来のＣａｓ９分子は、様々な配列モチーフ（たとえばＰＡＭ配列）を認識することができる。ある特定の実施形態では、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＧＧ（配列番号１０）を認識する（たとえばMali 2013を参照）。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１２）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１３）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号１４）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
【0037】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号１０）またはＮＧＡ（配列番号１６）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴ（配列番号１１）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＡＴＴＣＣＴ（配列番号９）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質は黄色ブドウ球菌のＣａｓ９タンパク質であり、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１２）、ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１３）、ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１４）、またはＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡもしくはＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
それに加えてまたはその代わりに、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列（ＮＬＳ）を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
それに加えてまたはその代わりに、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列（ＮＬＳ）を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
【0038】
ｃ）ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムは少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。ｇＲＮＡは、野生型ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。断片は、およそ５～およそ２００、およそ１０～およそ２００、およそ５～およそ３００、またはおよそ１０～およそ３００個のヌクレオチドの長さであり得る。断片は、少なくともおよそ５、少なくともおよそ１０、少なくともおよそ１５、少なくともおよそ２０、少なくともおよそ３０、少なくともおよそ４０、少なくともおよそ５０、または少なくともおよそ１００個のヌクレオチドの長さであり得る。ｇＲＮＡは、突然変異もしくは欠失を含むジストロフィン遺伝子の断片もしくは一部分、またはそれに近位もしくは並置されている配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソンに並置されているイントロンを標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンに並置されているイントロンを標的とし得る。野生型ジストロフィン遺伝子の断片は、本明細書中に詳述するように、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれていてよい。それぞれのｇＲＮＡスペーサーは、配列番号５～８および２５～４５から選択されるアミノ酸配列を含み得る。２個のｇＲＮＡスペーサーは同一であってよい。２個のｇＲＮＡスペーサーは異なっていてよい。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個は、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む。エクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択され得る。一部の実施形態では、エクソンはエクソン５２である。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２個の非コードＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、標的化特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与している天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。たとえば４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得るこの二重鎖は、Ｃａｓ９のガイドとして役割を果たす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システムは少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。ｇＲＮＡは、野生型ジストロフィン遺伝子の断片を標的とし得る。断片は、およそ５～およそ２００、およそ１０～およそ２００、およそ５～およそ３００、またはおよそ１０～およそ３００個のヌクレオチドの長さであり得る。断片は、少なくともおよそ５、少なくともおよそ１０、少なくともおよそ１５、少なくともおよそ２０、少なくともおよそ３０、少なくともおよそ４０、少なくともおよそ５０、または少なくともおよそ１００個のヌクレオチドの長さであり得る。ｇＲＮＡは、突然変異もしくは欠失を含むジストロフィン遺伝子の断片もしくは一部分、またはそれに近位もしくは並置されている配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソンに並置されているイントロンを標的とし得る。ｇＲＮＡは、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンに並置されているイントロンを標的とし得る。野生型ジストロフィン遺伝子の断片は、本明細書中に詳述するように、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれていてよい。それぞれのｇＲＮＡスペーサーは、配列番号５～８および２５～４５から選択されるアミノ酸配列を含み得る。２個のｇＲＮＡスペーサーは同一であってよい。２個のｇＲＮＡスペーサーは異なっていてよい。一部の実施形態では、２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個は、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む。エクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択され得る。一部の実施形態では、エクソンはエクソン５２である。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２個の非コードＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、標的化特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与している天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。たとえば４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得るこの二重鎖は、Ｃａｓ９のガイドとして役割を果たす。
【0039】
一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、標的領域を標的としてそれと結合し得る。一部の実施形態では、１～２０個のｇＲＮＡを、標的遺伝子を変更する、たとえばスプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。たとえば、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、または５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、３０個未満のｇＲＮＡ、２５個未満のｇＲＮＡ、２０個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。
【0040】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、様々な配列および長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡは、配列番号１７もしくは配列番号１８を含む標的配列、または配列番号１７もしくは配列番号１８を含む標的配列の相補的ポリヌクレオチド配列などの、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。ｇＲＮＡは、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、または少なくとも３５塩基対の標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、４０塩基対未満、３５塩基対未満、３０塩基対未満、２５塩基対未満、２０塩基対未満、または１５塩基対未満の標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、または転写された領域のうちの少なくとも１個を標的とし得る。
【0041】
少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８を含む核酸配列と結合し、それを標的とし得る。標的配列は、配列番号１７または配列番号１８のポリヌクレオチド、またはその断片、もしくは５’切断物などのその切断物を含み得る。切断物は、配列番号１７または配列番号１８の配列よりも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のヌクレオチド短くてもよい。ｇＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８に対応するポリヌクレオチド、その相補体、その変異体、またはその断片を含み得る。ｇＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。ゲノム中の標的配列を標的とするｇＲＮＡの一部分は、ｇＲＮＡスペーサーまたはプロトスペーサーと呼び得る。プロトスペーサーは、ゲノム中の標的化配列に相補的であるｇＲＮＡの一部分として定義し得る。プロトスペーサーは、配列番号１７または配列番号１８のポリヌクレオチド、またはその断片、もしくはその切断物、もしくはその相補体を含み得る。ｇＲＮＡはｇＲＮＡ足場を含み得る。ｇＲＮＡ足場は、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとの結合およびエンドヌクレアーゼ活性を促進する。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡが標的とする配列に対応するｇＲＮＡの一部分に続くポリヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ標的化部分とｇＲＮＡ足場は、一緒になって１個のポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化部分とｇＲＮＡ足場は一緒になって、配列番号１９または配列番号２０のポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的化部分とｇＲＮＡ足場は一緒になって、配列番号１９または配列番号２０のポリヌクレオチド配列、またはその相補体によってコードされている。ｇＲＮＡは、配列番号１９のポリヌクレオチド、その相補体、その変異体、もしくはその断片、または配列番号２０、その相補体、その変異体、もしくはその断片によってコードされていてよい。
【0042】
ｄ）ドナー配列
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、少なくとも１個のドナー配列を含み得る。ドナー配列はジストロフィン遺伝子の断片を含み得る。たとえば、ドナー配列は、ジストロフィン遺伝子の１個のエクソンまたはエクソンの任意の組合せをコードしている核酸配列を含み得る。ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的均等物を含み得る。エクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、６１～６６から選択され得る。一部の実施形態では、エクソンはジストロフィン遺伝子のエクソン５２である。ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子の断片またはその機能的均等物を含んでいてよく、断片またはその機能的均等物は、２個のｇＲＮＡスペーサーに挟まれていてよい。ドナー配列は、挿入したいエクソンの周囲または付近のイントロン配列に対応する、少なくとも１個の追加のポリヌクレオチドをさらに含み得る。ドナー配列は、エクソン５２の周囲または付近のイントロン配列に対応する、少なくとも１個の追加のポリヌクレオチドをさらに含み得る。ドナー配列は、配列番号２１または配列番号２２のうちの少なくとも１個の核酸配列、その相補体、その変異体、またはその断片を含み得る。
ｇＲＮＡおよびドナー配列は様々なモル比で存在し得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、少なくとも１：１、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５、少なくとも１：６、少なくとも１：７、少なくとも１：８、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１５、または少なくとも１：２０であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、２０：１未満、１５：１未満、１０：１未満、９：１未満、８：１未満、７：１未満、６：１未満、５：１未満、４：１未満、３：１未満、２：１未満、または１：１未満であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、少なくとも１個のドナー配列を含み得る。ドナー配列はジストロフィン遺伝子の断片を含み得る。たとえば、ドナー配列は、ジストロフィン遺伝子の１個のエクソンまたはエクソンの任意の組合せをコードしている核酸配列を含み得る。ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的均等物を含み得る。エクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、６１～６６から選択され得る。一部の実施形態では、エクソンはジストロフィン遺伝子のエクソン５２である。ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子の断片またはその機能的均等物を含んでいてよく、断片またはその機能的均等物は、２個のｇＲＮＡスペーサーに挟まれていてよい。ドナー配列は、挿入したいエクソンの周囲または付近のイントロン配列に対応する、少なくとも１個の追加のポリヌクレオチドをさらに含み得る。ドナー配列は、エクソン５２の周囲または付近のイントロン配列に対応する、少なくとも１個の追加のポリヌクレオチドをさらに含み得る。ドナー配列は、配列番号２１または配列番号２２のうちの少なくとも１個の核酸配列、その相補体、その変異体、またはその断片を含み得る。
ｇＲＮＡおよびドナー配列は様々なモル比で存在し得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、少なくとも１：１、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５、少なくとも１：６、少なくとも１：７、少なくとも１：８、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１５、または少なくとも１：２０であり得る。ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比は、２０：１未満、１５：１未満、１０：１未満、９：１未満、８：１未満、７：１未満、６：１未満、５：１未満、４：１未満、３：１未満、２：１未満、または１：１未満であり得る。
【0043】
３．ジストロフィン機能を修復するための組成物
ジストロフィン機能を修復するための組成物を本明細書中に開示する。組成物は、１個または複数個のエクソンを付加してジストロフィンのリーディングフレームを修復することによって、ジストロフィン機能を修復し得る。たとえば、付加するエクソンはエクソン５２であり得る。組成物は上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸（たとえば発現コンストラクト）を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達し得る。
ジストロフィン機能を修復するための組成物を本明細書中に開示する。組成物は、１個または複数個のエクソンを付加してジストロフィンのリーディングフレームを修復することによって、ジストロフィン機能を修復し得る。たとえば、付加するエクソンはエクソン５２であり得る。組成物は上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸（たとえば発現コンストラクト）を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達し得る。
【0044】
ａ）コンストラクトおよびプラスミド
上述の組成物またはシステムは、本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
上述の組成物またはシステムは、本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸および／またはｇＲＮＡのうちの少なくとも１個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
【0045】
また、遺伝子コンストラクトは、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、弱毒化した生きた微生物中の遺伝物質の一部または細胞中に生きる組換え微生物ベクターであり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含み得る。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【0046】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムなどのＣａｓタンパク質または融合タンパク質を哺乳動物の細胞中で発現させることができ得る。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムなどのＣａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしている異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸で細胞を形質移入するために有用である場合があり、形質転換させた宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの発現が起こる条件下で培養および維持する。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を減らすように選択される。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を減らすように選択される。
【0047】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている異種核酸を含んでいてよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムのコード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムのコード配列の下流であり得るストップコドンをさらに含んでいてよい。開始および終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムのコード配列とインフレームであり得る。また、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターも含み得る。プロモーターは遍在性プロモーターであり得る。プロモーターは組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的プロモーターは筋肉特異的プロモーターであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、空間および時間における遺伝子／ゲノム編集のダイナミック制御を可能にするために、光誘導性または化学誘導性の制御下であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。また、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。また、プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容がその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。プロモーターは、たとえば、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５１２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーターであり得る。
【0048】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【0049】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムまたはｓｇＲＮＡの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーを含んでいてもよい。
【0050】
ベクターは、参考として完全に組み込まれているSambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)を含めた、ルーチン技法および容易に入手可能な出発物質によってタンパク質を産生させるための発現ベクターまたはシステムであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列と、配列番号１９の核酸配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片、または配列番号２０の核酸配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片、または配列番号１７もしくは配列番号１８の核酸配列を標的とするｇＲＮＡ、その変異体、もしくはその断片を含む、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている核酸配列とを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、２個のベクターは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む第１のベクターおよび少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている核酸配列を含む第２のベクターを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡおよびタンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））によって送達する。たとえば、精製Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＰ複合体を形成することができる。本明細書中に記載する方法は、本明細書中に記載のＤＮＡドナー配列の送達も必要とし得る。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡおよびタンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））によって送達する。たとえば、精製Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＰ複合体を形成することができる。本明細書中に記載する方法は、本明細書中に記載のＤＮＡドナー配列の送達も必要とし得る。
【0051】
ｂ）改変レンチウイルスベクター
エクソン５２を付加または挿入するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、Ｃａｓタンパク質もしくは融合タンパク質コードしている第１のポリヌクレオチド配列および少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第２のポリヌクレオチド配列は少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、３０個未満のｇＲＮＡ、２５個未満のｇＲＮＡ、２０個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、エクソン５２に対応する標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
エクソン５２を付加または挿入するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、Ｃａｓタンパク質もしくは融合タンパク質コードしている第１のポリヌクレオチド配列および少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第２のポリヌクレオチド配列は少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、または少なくとも２０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、３０個未満のｇＲＮＡ、２５個未満のｇＲＮＡ、２０個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、または３個未満のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、エクソン５２に対応する標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
【0052】
ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、ＡＡＶは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質およびｇＲＮＡ発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質および２個までのｇＲＮＡ発現カセットの両方を、単一のＡＡＶベクター中で４．７ｋｂのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
上述の組成物は改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞中において部位特異的ヌクレアーゼを送達および発現させることでき得る。たとえば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１種または複数種に基づき得る。改変ＡＡＶベクターは、全身性および局所的な送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づき得る（Seto et al. Current Gene Therapy (2012) 12:139-151）。コンストラクトは配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含み得る。コンストラクトは配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＡＶは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、ＡＡＶは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質およびｇＲＮＡ発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質および２個までのｇＲＮＡ発現カセットの両方を、単一のＡＡＶベクター中で４．７ｋｂのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
上述の組成物は改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞中において部位特異的ヌクレアーゼを送達および発現させることでき得る。たとえば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１種または複数種に基づき得る。改変ＡＡＶベクターは、全身性および局所的な送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づき得る（Seto et al. Current Gene Therapy (2012) 12:139-151）。コンストラクトは配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含み得る。コンストラクトは配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含み得る。
【0053】
４．突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象においてジストロフィン機能を修復する方法
本明細書中に開示する主題は、ＤＭＤを患っているおよび／または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および／または対象において、ジストロフィン機能（たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修復する方法を提供する。本方法は、上述の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される。
本明細書中に開示する主題は、ＤＭＤを患っているおよび／または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および／または対象において、ジストロフィン機能（たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修復する方法を提供する。本方法は、上述の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される。一部の実施形態では、ジストロフィン機能は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される。
【0054】
本方法は、上述の本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。本方法は、上述のように、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を、骨格筋および／または心筋中におけるゲノム編集のために、対象の骨格筋および／または心筋に投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物の使用は、完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を修復し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、功を奏したかつ効率的な遺伝子改変の率が高いことで、高度なゲノム編集の利点を有する。
【0055】
本方法は、Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質または融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、および／あるいは、配列番号１９を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する少なくとも１個のｇＲＮＡ、その相補体、その変異体、もしくはその断片、または配列番号２０を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する少なくとも１個のｇＲＮＡ、その相補体、その変異体、もしくはその断片、または配列番号１７もしくは配列番号１８の核酸配列を標的とするｇＲＮＡ、その変異体、もしくはその断片を投与することなどの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを標的筋肉に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物の使用は、たとえば、完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を、修復鋳型またはドナーＤＮＡを用いて修復でき、これは、遺伝子全体または突然変異を含有する領域を置き換えることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを使用して、部位特異的な二重鎖切断を標的としたゲノム座位に導入し得る。部位特異的な二重鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムが標的ＤＮＡ配列と結合することによって作られ、それによって標的ＤＮＡの切断が可能となる。このＤＮＡ切断は天然のＤＮＡ修復機構を刺激する場合があり、これは、２個の可能な修復経路、すなわち、たとえば相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１個をもたらし得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを標的筋肉に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物の使用は、たとえば、完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を、修復鋳型またはドナーＤＮＡを用いて修復でき、これは、遺伝子全体または突然変異を含有する領域を置き換えることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを使用して、部位特異的な二重鎖切断を標的としたゲノム座位に導入し得る。部位特異的な二重鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムが標的ＤＮＡ配列と結合することによって作られ、それによって標的ＤＮＡの切断が可能となる。このＤＮＡ切断は天然のＤＮＡ修復機構を刺激する場合があり、これは、２個の可能な修復経路、すなわち、たとえば相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１個をもたらし得る。
【0056】
開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、相同組換え修復またはヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）をベースにした補正手法の使用に関与する場合があり、これは、相同組換えまたは選択をベースにした遺伝子補正を受け入れない場合がある、増殖が制限された初代細胞系において効率的な補正を可能にする。この戦略は、フレームシフト、未熟なストップコドン、異常なスプライスドナー部位、または異常なスプライスアクセプター部位を引き起こす非必須コード領域中の突然変異によって引き起こされた遺伝病を処置するための効率的な遺伝子編集方法を用いた、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの迅速かつ頑強なアセンブリを組み込んでいる。
内在性突然変異遺伝子からのタンパク質発現の修復は、鋳型なしのＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復によるものであり得る。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過的方法とは対照的に、一過的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子リーディングフレームの補正は、それぞれの改変細胞およびそのすべての子孫による永久的に修復された標的遺伝子発現をもたらし得る。ある特定の実施形態では、ＮＨＥＪはヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪであり、ある特定の実施形態では、これは、二本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ分子により開始されるＮＨＥＪをいう。本方法は、骨格筋または心筋中におけるゲノム編集のために、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を、対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。
内在性突然変異遺伝子からのタンパク質発現の修復は、鋳型なしのＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復によるものであり得る。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過的方法とは対照的に、一過的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子リーディングフレームの補正は、それぞれの改変細胞およびそのすべての子孫による永久的に修復された標的遺伝子発現をもたらし得る。ある特定の実施形態では、ＮＨＥＪはヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪであり、ある特定の実施形態では、これは、二本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ分子により開始されるＮＨＥＪをいう。本方法は、骨格筋または心筋中におけるゲノム編集のために、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を、対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。
【0057】
ヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪ遺伝子補正は、突然変異した標的遺伝子を補正し、ＨＤＲ経路を越えるいくつかの潜在的な利点を提供し得る。たとえば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入突然変異を引き起こし得るドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲとは対照的に、ＮＨＥＪは細胞周期のすべての段階において効率的に作動し、したがって、周期中の細胞および筋線維などの分裂終了細胞の両方において有効に活用し得る。これは、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングまたは薬理学的に強制したストップコドンの読み過ごしに対する、頑強な永久的な遺伝子修復の代替方法を提供し、理論的にはわずか１回の薬物処置しか必要としない可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを使用した、ＮＨＥＪをベースにした遺伝子補正、ならびにメガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを含めた他の操作したヌクレアーゼを、本明細書中に記載したプラスミド電気穿孔手法に加えて、細胞および遺伝子をベースにした治療のための他の既存のｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏプラットフォームと組み合わせ得る。たとえば、ｍＲＮＡをベースにした遺伝子移入による、または精製した細胞透過性タンパク質としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの送達は、挿入突然変異のいかなる可能性をも回避するであろう、ＤＮＡを含まないゲノム編集手法を可能にすることができる。
【0058】
近年、相同性非依存性標的組込み（ＨＩＴＩ）のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のＡＡＶ送達の戦略が、ｉｎ ｖｉｖｏでのニューロンのゲノム編集をもたらしている。Suzuki, K., Tsunekawa, Y., Hernandez-Benitez, R., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature 540, 144-149 (2016)を参照されたい。ＤＭＤを補正するための、ＡＡＶをベースにしたＨＩＴＩ媒介性遺伝子編集治療を本明細書中に記載する。そのようなＡＡＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達系を使用して、たとえばＤＭＤのヒト化動物モデルにおける効率的かつ機能的な補正を提供し得る。
【0059】
５．医薬組成物
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ１ｎｇ～およそ１０ｍｇの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているＤＮＡを含み得る。本明細書中に詳述する医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ１ｎｇ～およそ１０ｍｇの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているＤＮＡを含み得る。本明細書中に詳述する医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
【0060】
形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。形質移入促進剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを含有する医薬組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。形質移入促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含んでいてよく、また、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて投与して使用し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているＤＮＡベクターは、脂質、レシチンリポソームもしくは当分野で知られている他のリポソームなどのリポソームをＤＮＡ－リポソーム混合物として（たとえばＷ０９３２４６４０号を参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤などの形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、または脂質である。
【0061】
６．送達方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される１個または複数個の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌもしくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの形質移入試薬を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される１個または複数個の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌもしくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの形質移入試薬を含み得る。
【0062】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムタンパク質をコードしているベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達し得る。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達し得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムタンパク質をコードしているヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている１個または複数個のヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムタンパク質をコードしているヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしている１個または複数個のヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
【0063】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクトまたは組成物を組織に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞内に送達した際、形質移入した細胞はｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を発現する。遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳動物に投与して、遺伝子発現を変更し得る、またはゲノムを再操作もしくは変更し得る。たとえば、遺伝子コンストラクトまたは組成物は、哺乳動物においてジストロフィン機能を修復するために、哺乳動物に投与し得る。哺乳動は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードしている遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードしている遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および／または組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
【0064】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物を細胞内に導入して、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）のジストロフィン機能を遺伝子修復することができる。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の筋芽細胞内に導入する。ある特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞内に導入し、遺伝子補正した繊維芽細胞をＭｙｏＤで処置して筋芽細胞への分化を誘導することができ、補正されたジストロフィンタンパク質が機能的であるかを検証するため、および／または対象を処置するために、これを対象の損傷筋肉などの対象内に移植することができる。改変細胞は、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞などの幹細胞であることもできる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、人工多能性幹細胞の神経性または筋原性の分化を引き起こし得る。
【0065】
７．投与経路
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムおよびその組成物は、たとえば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムおよびその組成物は、たとえば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
【0066】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、たとえば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、筋肉内、静脈内、またはその組合せで対象（たとえばＤＭＤを患っている対象）に投与する。獣医学的使用には、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。
【0067】
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）または組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。組成物は、骨格筋または心筋内に注射し得る。たとえば、組成物は、前脛骨筋または尾部内に注射し得る。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾部静脈注入（全身性）、２）成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、ＴＡもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注入（全身性）によって投与する。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾部静脈注入（全身性）、２）成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、ＴＡもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注入（全身性）によって投与する。
【0068】
８．細胞種
これらの送達方法および／または投与経路のうちの任意のものは、無数の細胞種、たとえば、それだけには限定されないが、野生型およびＤＭＤ患者由来の系統、原始（ｐｒｉｍａｌ）ＤＭＤ真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞などの不死化筋芽細胞を含めた、細胞をベースにしたＤＭＤの治療について現在調査されている細胞種で利用することができる。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたシステムの一過性ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、外因性ＤＮＡの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いｉｎ ｓｉｔｕの補正および／または修復を可能にし得る。
これらの送達方法および／または投与経路のうちの任意のものは、無数の細胞種、たとえば、それだけには限定されないが、野生型およびＤＭＤ患者由来の系統、原始（ｐｒｉｍａｌ）ＤＭＤ真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤもしくはＰａｘ７で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞などの不死化筋芽細胞を含めた、細胞をベースにしたＤＭＤの治療について現在調査されている細胞種で利用することができる。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたシステムの一過性ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、外因性ＤＮＡの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いｉｎ ｓｉｔｕの補正および／または修復を可能にし得る。
【0069】
９．キット
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび／またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、少なくとも、配列番号１９のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含むもしくはそれによってコードされているｇＲＮＡ、または配列番号２０のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含むもしくはそれによってコードされているｇＲＮＡ、または配列番号１７もしくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列を標的とするｇＲＮＡ、その相補体、その変異体、もしくはその断片、ジストロフィン機能を修復するため、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした編集システムを使用するための指示を含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中におけるゲノム編集のための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび／またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、少なくとも、配列番号１９のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含むもしくはそれによってコードされているｇＲＮＡ、または配列番号２０のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含むもしくはそれによってコードされているｇＲＮＡ、または配列番号１７もしくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列を標的とするｇＲＮＡ、その相補体、その変異体、もしくはその断片、ジストロフィン機能を修復するため、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした編集システムを使用するための指示を含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中におけるゲノム編集のための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
【0070】
キット中に含められる指示は、梱包材料に貼り得る、または添付文書として含められ得る。指示は典型的には文書または印刷された物体であるが、これらはそれに限定されない。そのような指示を記憶し、それらを最終使用者に伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、それだけには限定されないが、電子記憶媒体（たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（たとえばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書中で使用する用語「指示」としては、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを挙げ得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のｇＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質または融合タンパク質を含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン５２と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のｇＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質または融合タンパク質を含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン５２と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
【実施例】
【0071】
１０．実施例
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。本開示は、添付の非限定的な例によって例示される複数の態様および実施形態を有する。
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。本開示は、添付の非限定的な例によって例示される複数の態様および実施形態を有する。
【0072】
（実施例１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるｈＤＭＤ－イントロン５１標的のためのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡの設計およびスクリーニング
ＳａＣａｓ９ ｈＤＭＤ－エクソン５２の上流にあるｈＤＭＤ－イントロン５１を標的とするｇＲＮＡを、２１ｂｐのスペーサーを用いて設計し、個々の発現プラスミド内にクローニングした（図３）。２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（３７５ｎｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１２５ｎｇ）で形質移入した。形質移入の３日後にゲノムＤＮＡを抽出した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図４Ａおよび図４Ｂ）。陰性対照（ＮＣ）はｇＲＮＡを含有していなかった。ＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡ中の単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）に関連する過剰なバンドも観察された。これらのバンドは、ＳＮＰの位置に基づいて予想された大きさに対応していた（図５Ａ、図５Ｂ）。試験を１９～２３ｂｐのスペーサーについてｇＲＮＡ０３、ｇＲＮＡ０６、ｇＲＮＡ０７、およびｇＲＮＡ０９で続けた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるｈＤＭＤ－イントロン５１標的のためのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡの設計およびスクリーニング
ＳａＣａｓ９ ｈＤＭＤ－エクソン５２の上流にあるｈＤＭＤ－イントロン５１を標的とするｇＲＮＡを、２１ｂｐのスペーサーを用いて設計し、個々の発現プラスミド内にクローニングした（図３）。２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（３７５ｎｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１２５ｎｇ）で形質移入した。形質移入の３日後にゲノムＤＮＡを抽出した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図４Ａおよび図４Ｂ）。陰性対照（ＮＣ）はｇＲＮＡを含有していなかった。ＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡ中の単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）に関連する過剰なバンドも観察された。これらのバンドは、ＳＮＰの位置に基づいて予想された大きさに対応していた（図５Ａ、図５Ｂ）。試験を１９～２３ｂｐのスペーサーについてｇＲＮＡ０３、ｇＲＮＡ０６、ｇＲＮＡ０７、およびｇＲＮＡ０９で続けた。
【0073】
（実施例２）
ヒト８０３６筋芽細胞中におけるｈＤＭＤ－イントロン５１標的のためのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡの設計およびスクリーニング
ＨＥＫ２９３Ｔ中で試験したｇＲＮＡの編集活性に基づいて、上位のｇＲＮＡを１９～２３ｂｐのスペーサーを用いて再設計し、個々の発現プラスミド内にクローニングした。再設計したｇＲＮＡをヒト８０３６筋芽細胞中でスクリーニングした。６ウェルプレート中のヒト８０３６筋芽細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（１０μｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１０μｇ）で電気穿孔した。ゲノムＤＮＡを電気穿孔の３日後に単離した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図６Ａ、図６Ｂ）。陰性対照（ＮＣ）はｇＲＮＡを含有していなかった。編集効率をタイド分析によっても評価した。ｇＲＮＡ ｇ１２、ｇ１６、およびｇ７を選択してＡＡＶ組込み（ｉｎｔｅｇｒａｉｏｎ）ベクターを作製した。
ヒト８０３６筋芽細胞中におけるｈＤＭＤ－イントロン５１標的のためのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡの設計およびスクリーニング
ＨＥＫ２９３Ｔ中で試験したｇＲＮＡの編集活性に基づいて、上位のｇＲＮＡを１９～２３ｂｐのスペーサーを用いて再設計し、個々の発現プラスミド内にクローニングした。再設計したｇＲＮＡをヒト８０３６筋芽細胞中でスクリーニングした。６ウェルプレート中のヒト８０３６筋芽細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（１０μｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１０μｇ）で電気穿孔した。ゲノムＤＮＡを電気穿孔の３日後に単離した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図６Ａ、図６Ｂ）。陰性対照（ＮＣ）はｇＲＮＡを含有していなかった。編集効率をタイド分析によっても評価した。ｇＲＮＡ ｇ１２、ｇ１６、およびｇ７を選択してＡＡＶ組込み（ｉｎｔｅｇｒａｉｏｎ）ベクターを作製した。
【0074】
（実施例３）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスクリーニング
ヒト８０３６筋芽細胞中で試験したｇＲＮＡの編集活性に基づいて、上位のｇＲＮＡをＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミド内にクローニングした（ｇＲＮＡ ｇ１２、ｇ１６、およびｇ７）。２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（３７５ｎｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１２５ｎｇ）またはＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミド（１２５ｎｇ）で形質移入した。形質移入の３日後にゲノムＤＮＡを抽出した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図７）。個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドの編集活性に基づいて、ｇ７およびｇ１２ドナーを先の実験で使用して、ＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドを作製した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドのＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスクリーニング
ヒト８０３６筋芽細胞中で試験したｇＲＮＡの編集活性に基づいて、上位のｇＲＮＡをＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミド内にクローニングした（ｇＲＮＡ ｇ１２、ｇ１６、およびｇ７）。２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＳａＣａｓ９を発現するプラスミド（３７５ｎｇ）およびＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するプラスミド（１２５ｎｇ）またはＵ６プロモーター下で個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミド（１２５ｎｇ）で形質移入した。形質移入の３日後にゲノムＤＮＡを抽出した。編集効率をサーベイヤー分析によって評価した（図７）。個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドの編集活性に基づいて、ｇ７およびｇ１２ドナーを先の実験で使用して、ＡＡＶ－ＨＩＴＩドナープラスミドを作製した。
【0075】
（実施例４）
ｈＤＭＤ－エクソン５２のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＩＴＩ媒介性組込み
初代筋芽細胞をｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスから単離した。６ウェルプレート中のこれらの細胞を、ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃａｓ９プラスミド（１０μｇ）および個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－Ｅｘ５２ドナープラスミド（１０μｇ）で電気穿孔した。ゲノムＤＮＡを電気穿孔の６日後に抽出した。ネステッドＰＣＲを使用して、ＨＩＴＩ媒介性ｈＤＭＤ－エクソン５２の組込みを検出した（図８Ａ）。ｇＲＮＡ１２－ドナー試料中の四角で囲んだバンドを切り取り、サンガーシーケンシングに送って（図８Ｂ）、標的部位でのｈＤＭＤ－エクソン５２ドナーの組込みが確認された。
ｈＤＭＤ－エクソン５２のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＩＴＩ媒介性組込み
初代筋芽細胞をｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスから単離した。６ウェルプレート中のこれらの細胞を、ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃａｓ９プラスミド（１０μｇ）および個々のｇＲＮＡを発現するＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－Ｅｘ５２ドナープラスミド（１０μｇ）で電気穿孔した。ゲノムＤＮＡを電気穿孔の６日後に抽出した。ネステッドＰＣＲを使用して、ＨＩＴＩ媒介性ｈＤＭＤ－エクソン５２の組込みを検出した（図８Ａ）。ｇＲＮＡ１２－ドナー試料中の四角で囲んだバンドを切り取り、サンガーシーケンシングに送って（図８Ｂ）、標的部位でのｈＤＭＤ－エクソン５２ドナーの組込みが確認された。
【0076】
（実施例５）
ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスモデルにおけるｈＤＭＤ－エクソン５２のｉｎ ｖｉｖｏ ＨＩＴＩ媒介性組込み
図９に、ｉｎ ｖｉｖｏ編集を確認するため、最良のｇＲＮＡ／ドナー配列の組合せを決定するため、およびＡＡＶ－Ｃａｓ９対ＡＡＶ－ドナープラスミドの最良の比を決定するために使用した実験の模式図を示す。雄の６～８週齢のｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスに、前脛骨（ＴＡ）筋中への局所筋肉内注射を介してＡＡＶ－Ｃａｓ９およびＡＡＶ－ＨＩＴＩドナーを注射した。注射の４週間後、ＴＡ筋肉を採取して処理し、ＨＩＴＩ媒介性編集を評価した。ＰＢＳを注射したマウスが陰性対照として役割を果たした、Ｎ＝４匹。
ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスモデルにおけるｈＤＭＤ－エクソン５２のｉｎ ｖｉｖｏ ＨＩＴＩ媒介性組込み
図９に、ｉｎ ｖｉｖｏ編集を確認するため、最良のｇＲＮＡ／ドナー配列の組合せを決定するため、およびＡＡＶ－Ｃａｓ９対ＡＡＶ－ドナープラスミドの最良の比を決定するために使用した実験の模式図を示す。雄の６～８週齢のｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスに、前脛骨（ＴＡ）筋中への局所筋肉内注射を介してＡＡＶ－Ｃａｓ９およびＡＡＶ－ＨＩＴＩドナーを注射した。注射の４週間後、ＴＡ筋肉を採取して処理し、ＨＩＴＩ媒介性編集を評価した。ＰＢＳを注射したマウスが陰性対照として役割を果たした、Ｎ＝４匹。
【0077】
ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのゲノムＤＮＡ中における標的Ｅｘ５２挿入を、標的切断部位の下流のプライマー（図１０Ａ）および標的切断部位の上流のプライマー（図１０Ｂ）を用いて調査した。ゲノムＤＮＡをＴＡ筋肉から抽出した。ＰＣＲ分析により、標的部位でのＥｘ５２挿入の存在が確認された。
処置したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのｍＲＮＡ中における標的Ｅｘ５２挿入を調査した（図１１）。全ＲＮＡをＴＡ筋肉から抽出し、ｃＤＮＡを作製するために使用した。ＰＣＲ分析により、ＲＮＡ転写物中のスプライシングを介したＥｘ５２挿入の存在が確認された。
処置したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのｍＲＮＡ中における標的Ｅｘ５２挿入を調査した（図１１）。全ＲＮＡをＴＡ筋肉から抽出し、ｃＤＮＡを作製するために使用した。ＰＣＲ分析により、ＲＮＡ転写物中のスプライシングを介したＥｘ５２挿入の存在が確認された。
【0078】
（実施例６）
処置したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのジストロフィンタンパク質修復
タンパク質をＴＡ筋肉から抽出し、ウエスタンブロット分析に使用した。ＰＢＳおよび処置したＴＡ筋肉には、２５μｇの全タンパク質をロードした。陽性対照として役割を果たすために、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ＴＡ筋肉由来の３．１２５μｇの全タンパク質をロードした。膜を抗ジストロフィン（クローン２ｃ６、ＭＡＮＤＹＳ１０６）または抗ＧＡＰＤＨ（クローン１４Ｃ１０）で染色した。ウエスタンブロット分析により、処置したマウスにおけるタンパク質修復が確認された（図１２）。
処置したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのジストロフィンタンパク質修復
タンパク質をＴＡ筋肉から抽出し、ウエスタンブロット分析に使用した。ＰＢＳおよび処置したＴＡ筋肉には、２５μｇの全タンパク質をロードした。陽性対照として役割を果たすために、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ＴＡ筋肉由来の３．１２５μｇの全タンパク質をロードした。膜を抗ジストロフィン（クローン２ｃ６、ＭＡＮＤＹＳ１０６）または抗ＧＡＰＤＨ（クローン１４Ｃ１０）で染色した。ウエスタンブロット分析により、処置したマウスにおけるタンパク質修復が確認された（図１２）。
【0079】
（実施例７）
編集したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ－ＩＴＲ配列組込みのディープシーケンシング定量
図１３に、編集したマウスにおけるエクソン５２ゲノム組込みのＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシング定量からの結果を示す。ゲノムＤＮＡをＴＡ筋肉から抽出した。不偏シーケンシング分析のために、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポゾンを使用してゲノムＤＮＡをタグ付けした。標的化配列を濃縮するために、イントロン５１標的部位の上流のゲノム特異的プライマーを使用してＰＣＲを完了し、トランスポゾンによって挿入されたタグ配列に特異的な逆方向プライマー対合させた。第２のＰＣＲを使用して実験バーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を付加した。ＩＴＲの組込みを次世代シーケンシングによって検出した。ボウタイ分析を使用して、ＡＡＶベクターに一致するＩＴＲ配列、およびゲノム特異的プライマーとイントロン５１標的部位との間のゲノムＤＮＡ配列に一致したゲノム特異的配列の存在を検出した。
編集したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ－ＩＴＲ配列組込みのディープシーケンシング定量
図１３に、編集したマウスにおけるエクソン５２ゲノム組込みのＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシング定量からの結果を示す。ゲノムＤＮＡをＴＡ筋肉から抽出した。不偏シーケンシング分析のために、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポゾンを使用してゲノムＤＮＡをタグ付けした。標的化配列を濃縮するために、イントロン５１標的部位の上流のゲノム特異的プライマーを使用してＰＣＲを完了し、トランスポゾンによって挿入されたタグ配列に特異的な逆方向プライマー対合させた。第２のＰＣＲを使用して実験バーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を付加した。ＩＴＲの組込みを次世代シーケンシングによって検出した。ボウタイ分析を使用して、ＡＡＶベクターに一致するＩＴＲ配列、およびゲノム特異的プライマーとイントロン５１標的部位との間のゲノムＤＮＡ配列に一致したゲノム特異的配列の存在を検出した。
【0080】
（実施例８）
編集したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのｍＲＮＡ中のエクソン５２挿入のＰａｃＢｉｏシーケンシング定量
全ＲＮＡをＴＡ筋肉から抽出し、ｃＤＮＡを作製するために使用した（図１４Ａ）。標的化配列を濃縮するために、エクソン４５およびエクソン６９中のプライマーを使用してＰＣＲを完了した。第２のＰＣＲを使用して実験バーコードおよびＰａｃＢｉｏアダプター配列を付加した。エクソン５２挿入をＰａｃＢｉｏシーケンシングによって検出した（図１４Ｂ）。３’－エクソン５１配列と５’－エクソン５３配列との間の１１８ｎｔのリードを定量した。意図した編集の確認のために、これらの配列をエクソン５２ドナーとアラインメントした。エクソン５１とエクソン５３との間の１１８ｂｐを有するシーケンシングのリードがエクソン５２配列と一致した。
編集したｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスのｍＲＮＡ中のエクソン５２挿入のＰａｃＢｉｏシーケンシング定量
全ＲＮＡをＴＡ筋肉から抽出し、ｃＤＮＡを作製するために使用した（図１４Ａ）。標的化配列を濃縮するために、エクソン４５およびエクソン６９中のプライマーを使用してＰＣＲを完了した。第２のＰＣＲを使用して実験バーコードおよびＰａｃＢｉｏアダプター配列を付加した。エクソン５２挿入をＰａｃＢｉｏシーケンシングによって検出した（図１４Ｂ）。３’－エクソン５１配列と５’－エクソン５３配列との間の１１８ｎｔのリードを定量した。意図した編集の確認のために、これらの配列をエクソン５２ドナーとアラインメントした。エクソン５１とエクソン５３との間の１１８ｂｐを有するシーケンシングのリードがエクソン５２配列と一致した。
【0081】
完全性の理由のため、様々な態様を以下の付番した条項中に記載する：
条項１．（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含む組成物をコードしている１個または複数個のベクターを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
条項２．（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
条項３．野生型ジストロフィン遺伝子の断片が、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれている、条項１または２に記載のシステム。
条項４．ｇＲＮＡが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンと並置されているイントロンを標的とし、エクソンが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
条項１．（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含む組成物をコードしている１個または複数個のベクターを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
条項２．（ａ）突然変異ジストロフィン遺伝子の断片を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質または融合タンパク質、および（ｃ）野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集システム。
条項３．野生型ジストロフィン遺伝子の断片が、２個のｇＲＮＡスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列によって挟まれている、条項１または２に記載のシステム。
条項４．ｇＲＮＡが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンと並置されているイントロンを標的とし、エクソンが、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
【0082】
条項５．ドナー配列が、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的均等物を含み、エクソンが、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
条項６．突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンがジストロフィン遺伝子から突然変異しているもしくは少なくとも部分的に欠失している、または、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンが欠失しており、イントロンが、対応する野生型ジストロフィン遺伝子中で欠失したエクソンがあるはずであろう場所と並置されている、条項４に記載のシステム。
条項７．エクソンがエクソン５２である、条項４または５に記載のシステム。
条項８．ｇＲＮＡが、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８、ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、ｄ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列を含むポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
条項６．突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンがジストロフィン遺伝子から突然変異しているもしくは少なくとも部分的に欠失している、または、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソンが欠失しており、イントロンが、対応する野生型ジストロフィン遺伝子中で欠失したエクソンがあるはずであろう場所と並置されている、条項４に記載のシステム。
条項７．エクソンがエクソン５２である、条項４または５に記載のシステム。
条項８．ｇＲＮＡが、ａ）配列番号１７もしくは配列番号１８、ｂ）配列番号１７もしくは配列番号１８の断片、ｃ）配列番号１７もしくは配列番号１８の相補体、またはその断片、ｄ）配列番号１７もしくは配列番号１８と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１７もしくは配列番号１８とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列を含むポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
【0083】
条項９．ｇＲＮＡが、配列番号１９もしくは配列番号２０のポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、またはそれによってコードされている、条項１～８のいずれか１項に記載のシステム。
条項１０．Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
条項１１．Ｃａｓタンパク質が、配列番号１、２、３、または４のアミノ酸配列を含む、条項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
条項１２．２個のｇＲＮＡスペーサーが、配列番号５～８および２５～４５から選択される配列を独立して含む、条項３～１１のいずれか１項に記載のシステム。
条項１３．２個のｇＲＮＡスペーサーが同一である、条項１２に記載のシステム。
条項１４．２個のｇＲＮＡスペーサーが異なる、条項１２に記載のシステム。
条項１５．２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個が、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む、条項３～１４のいずれか１項に記載のシステム。
条項１６．ドナー配列が、配列番号２１または配列番号２２のポリヌクレオチドを含む、条項１～１５のいずれか１項に記載のシステム。
条項１０．Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質または黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
条項１１．Ｃａｓタンパク質が、配列番号１、２、３、または４のアミノ酸配列を含む、条項１～１０のいずれか１項に記載のシステム。
条項１２．２個のｇＲＮＡスペーサーが、配列番号５～８および２５～４５から選択される配列を独立して含む、条項３～１１のいずれか１項に記載のシステム。
条項１３．２個のｇＲＮＡスペーサーが同一である、条項１２に記載のシステム。
条項１４．２個のｇＲＮＡスペーサーが異なる、条項１２に記載のシステム。
条項１５．２個のｇＲＮＡスペーサーのうちの少なくとも１個が、配列番号２５または配列番号２６の配列を含む、条項３～１４のいずれか１項に記載のシステム。
条項１６．ドナー配列が、配列番号２１または配列番号２２のポリヌクレオチドを含む、条項１～１５のいずれか１項に記載のシステム。
【0084】
条項１７．ベクターがウイルスベクターである、条項１および３～１６のいずれか１項に記載のシステム。
条項１８．ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、条項１７に記載のシステム。
条項１９．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、またはＡＡＶｒｈ．７４ベクターである、条項１８に記載のシステム。
条項２０．１個または複数個のベクターのうちの１個が、配列番号２３または２４のポリヌクレオチド配列を含む、条項１８に記載のシステム。
条項２１．ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比が、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５である、条項１～２０のいずれか１項に記載のシステム。
条項２２．野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列またはその機能的均等物をコードしている組換えポリヌクレオチドであって、断片またはその機能的均等物が２個のｇＲＮＡスペーサーによって挟まれている、組換えポリヌクレオチド。
条項１８．ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、条項１７に記載のシステム。
条項１９．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、またはＡＡＶｒｈ．７４ベクターである、条項１８に記載のシステム。
条項２０．１個または複数個のベクターのうちの１個が、配列番号２３または２４のポリヌクレオチド配列を含む、条項１８に記載のシステム。
条項２１．ｇＲＮＡとドナー配列との間のモル比が、１：１、または１：１５、または５：１～１：１０、または１：１～１：５である、条項１～２０のいずれか１項に記載のシステム。
条項２２．野生型ジストロフィン遺伝子の断片を含むドナー配列またはその機能的均等物をコードしている組換えポリヌクレオチドであって、断片またはその機能的均等物が２個のｇＲＮＡスペーサーによって挟まれている、組換えポリヌクレオチド。
【0085】
条項２３．ドナー配列がジストロフィン遺伝子のエクソンを含み、エクソンが、エクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項２２に記載の組換えポリヌクレオチド。
条項２４．組換えポリヌクレオチドが配列番号２３または２４の配列を含む、条項２２または２３に記載の組換えポリヌクレオチド。
条項２５．条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２６．ベクターが組換えポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項２５に記載のベクター。
条項２７．条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは条項２５もしくは２６に記載のベクターを含む細胞。
条項２４．組換えポリヌクレオチドが配列番号２３または２４の配列を含む、条項２２または２３に記載の組換えポリヌクレオチド。
条項２５．条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２６．ベクターが組換えポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項２５に記載のベクター。
条項２７．条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドまたは条項２５もしくは２６に記載のベクターを含む細胞。
【0086】
条項２８．条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクターを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
条項２９．条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物を含むキット。
条項３０．細胞または対象を、条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物と接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３１．ジストロフィン機能が、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される、条項３０に記載の方法。
条項２９．条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物を含むキット。
条項３０．細胞または対象を、条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物と接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３１．ジストロフィン機能が、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５２の挿入によって修復される、条項３０に記載の方法。
【0087】
条項３２．対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項３０または３１に記載の方法。
条項３３．細胞または対象を、条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物と接触させることを含む、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンによって引き起こされた、破壊されたジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象において、ジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３４．ジストロフィン機能が、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される、条項３３に記載の方法。
条項３５．欠失または突然変異したエクソンのうちの１つがエクソン５２である、条項３４に記載の方法。
条項３３．細胞または対象を、条項１～２１のいずれか１項に記載のシステム、条項２２～２４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチド、または条項２５もしくは２６に記載のベクター、または条項２８に記載の組成物と接触させることを含む、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンによって引き起こされた、破壊されたジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象において、ジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３４．ジストロフィン機能が、１個または複数個の欠失または突然変異したエクソンに対応する、ジストロフィン遺伝子の１個または複数個の野生型エクソンを挿入することによって修復される、条項３３に記載の方法。
条項３５．欠失または突然変異したエクソンのうちの１つがエクソン５２である、条項３４に記載の方法。
【0088】
配列
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（配列番号１）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（配列番号１）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【0089】
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（配列番号２）
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
【0090】
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａを有する）（配列番号３）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【0091】
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４９Ａを有する）（配列番号４）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【0092】
ＰＡＭ（配列番号９）
ＡＴＴＣＣＴ
ＰＡＭ（配列番号１０）
ＮＧＧ
ＰＡＭ（配列番号１１）
ＮＮＮＲＲＴ
ＰＡＭ（配列番号１２）
ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１３）
ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１４）
ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１５）
ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｃ、またはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１６）
ＮＧＡ
ＡＴＴＣＣＴ
ＰＡＭ（配列番号１０）
ＮＧＧ
ＰＡＭ（配列番号１１）
ＮＮＮＲＲＴ
ＰＡＭ（配列番号１２）
ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１３）
ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１４）
ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１５）
ＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｃ、またはＧ）
ＰＡＭ（配列番号１６）
ＮＧＡ
【0093】
ｇＲＮＡ７の標的（配列番号１７）
ＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴ
ｇＲＮＡ１２の標的（配列番号１８）
ＴＴＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣ
ｇＲＮＡ７（標的配列および足場を含む）（配列番号１９）
ＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ
ＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴ
ｇＲＮＡ１２の標的（配列番号１８）
ＴＴＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣ
ｇＲＮＡ７（標的配列および足場を含む）（配列番号１９）
ＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ
【0094】
ｇＲＮＡ１２（標的配列および足場を含む）（配列番号２０）
ＴＴＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ
エクソン５２（配列番号２１）
ＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡＴＣＧＡＡ
ＴＴＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ
エクソン５２（配列番号２１）
ＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡＴＣＧＡＡ
【0095】
一部のイントロンを有するエクソン５２（配列番号２２）
GTTAAATTGTTTTCTATAAACCCTTATACAGTAACATCTTTTTTATTTCTAAAAGTGTTTTGGCTGGTCTCACAATTGTACTTTACTTTGTATTATGTAAAAGGAATACACAACGCTGAAGAACCCTGATACTAAGGGATATTTGTTCTTACAGGCAACAATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAAGAACTCATTACCGCTGCCCAAAATTTGAAAAACAAGACCAGCAATCAAGAGGCTAGAACAATCATTACGGATCGAAGTAAGTTTTTTAACAAGCATGGGACACACAAAGCAAGATGCATGACAAGTTTCAATAAAAACTTAAGTTCATATATCCCCCTCACATTTATAAAAATAATGTGAAATAATTGTAAATGATAACAATTGTGCTGAGATTTTCAGTCCATAATGTTACCTTTTAATAAATGAATGTAATTCCATTGAATAGAAGAAATAC
GTTAAATTGTTTTCTATAAACCCTTATACAGTAACATCTTTTTTATTTCTAAAAGTGTTTTGGCTGGTCTCACAATTGTACTTTACTTTGTATTATGTAAAAGGAATACACAACGCTGAAGAACCCTGATACTAAGGGATATTTGTTCTTACAGGCAACAATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAAGAACTCATTACCGCTGCCCAAAATTTGAAAAACAAGACCAGCAATCAAGAGGCTAGAACAATCATTACGGATCGAAGTAAGTTTTTTAACAAGCATGGGACACACAAAGCAAGATGCATGACAAGTTTCAATAAAAACTTAAGTTCATATATCCCCCTCACATTTATAAAAATAATGTGAAATAATTGTAAATGATAACAATTGTGCTGAGATTTTCAGTCCATAATGTTACCTTTTAATAAATGAATGTAATTCCATTGAATAGAAGAAATAC
【0096】
ｇＲＮＡ７のためのＡＡＶ（配列番号２３）
ｇＲＮＡ７を有するエクソン５２ドナー配列のためのＡＡＶゲノム：
ｇＲＮＡ７を有するエクソン５２ドナー配列のためのＡＡＶゲノム：
【化1】
【0097】
ｇＲＮＡ１２のためのＡＡＶ（配列番号２４）
ｇＲＮＡ１２を有するエクソン５２ドナー配列のためのＡＡＶゲノム：
ｇＲＮＡ１２を有するエクソン５２ドナー配列のためのＡＡＶゲノム：
【化2】
【0098】
配列番号２５ ｇＲＮＡ７スペーサー
ＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡ
配列番号２６：ｇＲＮＡ１２スペーサー
ＧＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＡ
ＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡ
配列番号２６：ｇＲＮＡ１２スペーサー
ＧＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＡ
【0099】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【配列表】
【国際調査報告】