特表 2022-529438 共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-22

(54)【発明の名称】共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/861 20060101AFI20220615BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220615BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220615BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220615BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220615BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220615BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220615BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220615BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220615BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220615BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220615BHJP

【ＦＩ】

C12N15/861 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/10 200Z

C12N7/01

C12N5/10

C12P21/02 C

A61P35/00

A61K35/761

A61K48/00

A61P35/02

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021561028

(86)(22)【出願日】2020-04-16

(85)【翻訳文提出日】2021-12-10

(86)【国際出願番号】 EP2020060727

(87)【国際公開番号】W WO2020212503

(87)【国際公開日】2020-10-22

(31)【優先権主張番号】19169833.1

(32)【優先日】2019-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516167808

【氏名又は名称】タルゴバックス エーエスエー

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クリーク ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】エリクセン ヨン アムンド

(72)【発明者】

【氏名】バーンズ ロバート

(72)【発明者】

【氏名】メラー アン－ソフィー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064DA01

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA52

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本発明は癌の治療法に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、並びに該ベクターを含む細胞及び医薬組成物に関する。本発明はまた、被験体において癌を治療するための薬剤の製造における上記ベクターの使用、及び被験体において癌を治療する方法に関する。さらに、本発明は、細胞内で免疫調節リガンドのＢ７ファミリー及びＡＤＡを産生し、被験体において抗腫瘍効果及び特異的免疫応答の誘導を高める方法、並びに細胞内で導入遺伝子を産生し、被験体において抗腫瘍効果及び特異的免疫応答の生成を高めるための本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格と、Ｅ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Ｄ２４）と、Ｅ３領域において共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及びＡＤＡをコードする核酸配列とを含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項2】

前記共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡがＥ３プロモーターの下に配置されている、請求項１に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項3】

前記共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡがＣＭＶ（Ｃｕｏ）プロモーターの下に配置されている、請求項１に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項4】

前記共刺激リガンドのＢ７ファミリーがＩＣＯＳＬであり、ＡＤＡがＡＤＡ１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項5】

前記共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及び前記ＡＤＡをコードする核酸配列がＩＲＥＳと接続されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項6】

前記共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及び前記ＡＤＡをコードする核酸配列がＰ２Ａと接続されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項7】

天然のＥ１Ａプロモーターを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項8】

キャプシド修飾としてＡｄ５／３キメラ化を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項9】

配列番号１を含む、請求項１、３～５又は７～８のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む細胞。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。

【請求項12】

癌治療用、又は被験体における癌を治療する薬剤の製造用の、請求項１～９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。

【請求項13】

前記癌が、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口の癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌からなる群より選択される、請求項１２に記載のアデノウイルスベクター。

【請求項14】

前記被験体における癌の治療が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内若しくは腹腔内の注射、又は経口投与によって行われる、請求項１２又は１３に記載のアデノウイルスベクター。

【請求項15】

前記注射又は前記投与が治療期間中に数回行われる、又は以前の治療のベクターと比較して異なるファイバーノブのキャプシドを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを使用する、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。

【請求項16】

前記被験体における癌の治療が、被験体へのチェックポイント阻害剤、ベラパミル又は別のカルシウムチャネル遮断薬、オートファジー誘導剤、テモゾロミド、化学療法剤若しくは中和抗体の遮断のための抗ＣＤ２０療法剤、被験体において制御性Ｔ細胞をダウンレギュレートすることができる物質、及び／又はシクロホスファミドの投与を更に含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。

【請求項17】

共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞内で産生する方法であって、
ｉ．請求項１～９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運ぶことと、
ｉｉ．細胞内で前記ベクターの共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現させることと、
を含む、方法。

【請求項18】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを産生するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌の治療法に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、並びに該ベクターを含む細胞及び医薬組成物に関する。本発明はまた、被験体において癌を治療するための薬剤の製造における上記ベクターの使用、及び被験体において癌を治療する方法に関する。さらに、本発明は、細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を産生し、被験体において抗腫瘍効果及び特異的免疫応答の誘導を高める方法、並びに細胞内で導入遺伝子を産生し、被験体において抗腫瘍効果及び特異的免疫応答の生成を高めるための本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

過去２０年間、遺伝子導入技術は徹底的に調べられてきた。癌遺伝子治療の目的は、腫瘍細胞に治療用遺伝子を導入することである。標的細胞に導入されたこれらの治療用遺伝子は、例えば、変異遺伝子を修正し、活性な癌遺伝子を抑制し、又は細胞に対して追加の特性を生じ得る。適切な外因性治療用遺伝子としては、限定されるものではないが、免疫療法遺伝子、血管新生抑制遺伝子、化学保護遺伝子及び「自殺」遺伝子が挙げられ、改変ウイルスベクター、又はエレクトロポレーション、遺伝子銃及び脂質コーテイング若しくはポリマーコーティングを含む非ウイルス法を利用することによってそれらの遺伝子を細胞に導入することができる。

【0003】

最適なウイルスベクターの要件は、特異的な標的細胞を見つけ、標的細胞でウイルスゲノムを発現させる効率的な能力を含む。さらに、最適なベクターは、標的の組織又は細胞内で活性を維持する必要がある。ウイルスベクターのこれら特性は全て過去数十年の間に開発されており、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスのベクターは生物医学で広く研究されてきた。

【0004】

腫瘍浸透及び抗腫瘍効果の局所増幅を更に改善するために、選択的に腫瘍溶解を起こす作用物質、例えば条件付きで複製するアデノウイルスが構築されている。腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌の治療のための有望なツールである。腫瘍細胞は、腫瘍細胞内でのウイルスの複製により腫瘍溶解性アデノウイルスによって死滅し、複製の最終段階では、効果的な腫瘍浸透及び血管再感染のために、周囲の腫瘍組織に数千のビリオンが放出される。腫瘍細胞はウイルスの複製を可能にするが、ウイルスゲノム中の設計変更により正常細胞には害はなく、非腫瘍細胞での複製が妨げられる。

【0005】

複製を介した細胞死滅に加えて、腫瘍溶解性アデノウイルスを、様々な治療用導入遺伝子で武装させる（armed with）こともできる。このアプローチは、従来の遺伝子送達の利点と複製能力のある作用物質の効力を組み合わせたものである。ウイルスを武装させる目的の１つは、ウイルスの複製を可能にする細胞に対して免疫反応を誘導することである。ウイルス複製だけでは、免疫原性はあるが、通常、効果的な抗腫瘍免疫を誘導するには十分ではない。治療免疫の誘導を強化するため、ウイルスは、樹状細胞等の抗原提示細胞への腫瘍抗原の導入、並びにそれらの刺激及び／又は成熟を促進するためのサイトカイン等の刺激タンパク質で武装することができる。免疫療法遺伝子の腫瘍細胞への導入、更にはタンパク質の翻訳は、免疫応答の活性化及び腫瘍細胞の効率的な破壊につながる。この点で最も関連性のある免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｔヘルパー細胞及び細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0006】

アデノウイルスの５０を超える様々な血清型がヒトで発見されている。アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は呼吸器疾患を引き起こすことが知られており、遺伝子治療の分野で研究されている最も一般的な血清型である。最初のＡｄ５ベクターでは、Ｅ１及び／又はＥ３領域が欠失され、ベクターへの外来ＤＮＡの挿入が可能になった。さらに、他の領域の欠失及び更なる変異は、ウイルスベクターに追加の特性を提供し、実際、効率的な抗腫瘍効果を達成するためのアデノウイルスの様々な改変が示唆されている。

【0007】

ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）は、免疫チェックポイントタンパク質であり、活性化Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子であり、細胞間シグナル伝達、免疫応答、及び細胞増殖の調節に重要な役割を果たす（非特許文献１）。

【0008】

免疫調節リガンドのＢ７ファミリーは、誘導性共刺激因子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、プログラム死－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死－２リガンド（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ３、及びＢ７－Ｈ４を含む。ヒトでは、ＩＣＯＳ－Ｌの細胞表面発現は、Ｂ細胞、樹状細胞、単球／マクロファージ、及びＴ細胞で報告されている。代わりに、ＩＣＯＳ－Ｌは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に相同なＴ細胞特異的共刺激分子であるＩＣＯＳに結合する。ＩＣＯＳリガンドは、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン分泌を同時刺激する（非特許文献２）。

【0009】

ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ（アデノシンアミノヒドロラーゼ、すなわちＡＤＡ）としても知られている）は、プリン代謝に関与する酵素である。ＡＤＡは、食品からのアデノシンの分解及び組織内の核酸の代謝回転に必要であり、ＡＤＡの２つのアイソフォームであるＡＤＡ１及びＡＤＡ２を含む。

【0010】

ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ経路は、抗チェックポイント阻害剤の最適な治療効果に必要であり、したがって、この経路は、抗癌療法の有効性を改善するための将来の組合せ戦略の標的として関係があるとされている。ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ経路は、抗ＣＴＬＡ－４の最適な抗腫瘍活性に重要であることが示されている（非特許文献３）。

【0011】

特許文献１は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格と、アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Ｄ２４）と、アデノウイルスＥ３領域のｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの欠失の代わりに、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸配列とを含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを開示している。特許文献２はアデノウイルスに関するものである。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターが必須のＥ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動することで、ウイルス複製及び細胞毒性をＲｂ経路欠損腫瘍細胞及びＤＮＸ－２４０１（以前はＤ２４－ＲＧＤと呼ばれていた）に制限する、条件付きで複製する腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）が挙げられ、これは、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損細胞において選択的に複製し、或る特定のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように設計されたアデノウイルスである。

【0012】

それでも、より効率的で正確な遺伝子導入、並びに遺伝子治療の特異性の向上及び十分な腫瘍殺傷能力が必要とされている。治療用ベクターの安全記録も優れていなければならない。本発明は、新規で独創的な方法でアデノウイルスの腫瘍溶解性及び免疫療法性の両方の特性を利用することにより、これらの上記の特性を有する癌治療手段を提供する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】欧州特許第２３７９５８６号

【特許文献2】国際公開第２０１６１２６６０８号

【0014】

【非特許文献1】Hutloff et al., 1999

【非特許文献2】Khayyamian et al., 2002

【非特許文献3】Fu et al., 2011

【発明の概要】

【0015】

本発明の目的は、アデノウイルスの上記の特性を達成し、したがって、従来の癌治療法の課題を解決するための新規な方法及び手段を提供することである。より具体的には、本発明は、遺伝子治療のための新規な方法及び手段を提供する。

【0016】

アデノシン－アデノシンの誘導体（ＡＴＰ、ＡＤＰ）は、自然界に広く見られ、生化学的プロセスで重要な役割を果たす。複数の免疫抑制機構が、抗腫瘍免疫を妨げる。それらの中でも、細胞外アデノシンの蓄積は、プリン作動性受容体の活性化を通じて免疫監視を回避するために腫瘍によって利用される強力で広範な戦略である。腫瘍では、この経路が乗っ取られて抗腫瘍免疫が妨げられ、癌の進行が促進する（Allard et al., 2016）。アデノシンシグナル伝達は、ほとんどの免疫エフェクター細胞の機能をダウンレギュレートするが、抗腫瘍免疫応答の抑制に関与する免疫細胞の増殖及び活性を高める。アデノシンは、免疫制御からの腫瘍エスケープを促進する。これにより、アデノシン作動性経路を標的とする治療法が癌患者に利益をもたらすと見なすことができる（Muller-Haegele et al., 2014）。

【0017】

アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、プリン代謝に関与する酵素であり、アデノシンを代謝することによって腫瘍の進行を阻害することができる（Kutryb-Zajac et al., 2018, Londono-R et al., 2018）。これは、癌免疫療法用のアデノシン経路の阻害剤の可能性のある用途を示す（Ohta, 2016）。

【0018】

本発明者らは、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーとＡＤＡとの発現の組合せが腫瘍根絶に有益な効果を有するであろうと仮定した。より具体的には、本発明者らは、ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡ１をコードする二重導入遺伝子コンストラクト（ＴＧＸ－１１）が腫瘍溶解性ウイルスの特性（すなわち、癌細胞制限複製のためのＥ１Ａ領域における２４ｂｐの欠失の事実による腫瘍溶解（Kuryk et al., 2016）、またファイバーノブ改変（キメラウイルス５／３ノブ）による指向性の増強（Kuryk et al., 2018））を利用するという仮説を立てた。腫瘍溶解特性に加えて、２つの導入遺伝子の存在により、コンストラクトは、ＩＣＯＳＬとＴ細胞上のその受容体との相互作用によるＴ細胞活性化の増加、及びアデノシンの阻害による（ＡＤＡによる）抑制性腫瘍微小環境の低下により、抗腫瘍効果の増強を示すことができ、腫瘍抗原の交差提示、癌特異的Ｔ細胞のプライミング、及び腫瘍微小環境の調節の強化をもたらす。このコンストラクトは、ウイルスを注入した腫瘍と遠隔腫瘍との両方で、活性化Ｔ細胞の浸潤を改善することができる。また、ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡ１を発現する腫瘍溶解性ウイルスＴＧＸ－１１による免疫調節は、免疫チェックポイント遮断の全身的有効性を駆動するための有効な戦略となり得る。

【0019】

コンストラクトの腫瘍溶解特性を伴って生成された導入遺伝子は、相乗的な抗癌効果及び改善された臨床転帰をもたらすことができる。

【0020】

二重導入遺伝子ウイルスは、両方の導入遺伝子が別々のウイルスによってコードされているが一緒に使用されているモデルと比較して、より効率的なモデルであることがわかった。二重導入遺伝子では、特に臨床研究において、導入遺伝子を別々に発現する複合ウイルスに比べて生産プロセスが簡素化される。

【0021】

本出願は、組換えウイルスベクターの構築、ベクターに関連する方法、並びに腫瘍細胞株及び動物モデルにおけるそれらの使用について記載する。

【0022】

本発明は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格と、アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Ｄ２４）と、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡの導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。さらに、アデノウイルスＥ３領域において欠失された２．７ｋｂｐの代わりにＩＲＥＳが存在する場合がある。

【0023】

本発明は更に、本発明のアデノウイルスベクターを含む細胞に関する。

【0024】

本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。

【0025】

本発明はまた、被験体において癌を治療するための薬剤の製造における本発明のアデノウイルスベクターの使用に関する。

【0026】

本発明はまた、被験体において癌を治療する方法であって、被験体への本発明のベクター又は医薬組成物の投与を含む、方法に関する。

【0027】

さらに、本発明はまた、細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを産生する方法であって、ａ）本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運ぶことと、ｂ）細胞内で上記ベクターの共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現させることとを含む、方法に関する。

【0028】

さらに、本発明はまた、被験体において腫瘍特異的免疫応答を高める方法であって、ａ）本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的の細胞又は組織に運ぶことと、ｂ）細胞内で上記ベクターの共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現することと、ｃ）上記標的の細胞又は組織中の細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞の量を増加させることとを含む、方法に関する。

【0029】

さらに、本発明はまた、細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを産生するための本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。

【0030】

さらに、本発明はまた、被験体において腫瘍特異的免疫応答を高めるための本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。

【0031】

本発明は、癌（幾つかは現在のアプローチに抵抗性である）を治療する手段を提供する。また、治療に適した腫瘍の種類に関する制限は、他の多くの治療と比較してほとんどない。実際、全ての固形腫瘍を、提案される発明で治療することができる。質量がより大きな腫瘍及びより複雑な腫瘍を、本発明を使用することによって治療することができる。治療は、腫瘍内、腔内、静脈内、及びこれらの組合せで行うことができる。このアプローチは、局所注射にもかかわらず全身的な有効性を与えることができる。このアプローチはまた、腫瘍創始細胞（tumor initiating）として提案された細胞（「癌幹細胞」）を根絶することができる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ｐＴＧＸ－０４／ｐＴＧＸ－０５用シャトルプラスミドのシャトルプラスミド構成を示す図である。

【図2】ｐＴＧＸ－１１（ＣＭＶ（ＣｕＯ）－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡ－ＳＶ４０ｐＡ）用シャトルプラスミドのシャトルプラスミド構成を示す図である。

【図3】ＴＧＸ－０４（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＩＣＯＳＬ）、ＴＧＸ－０５（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＡＤＡ）、ＴＧＸ－１１（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＣＭＶ（ＣｕＯ）－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡ－ＳＶ４０ｐＡ）のコスミド構成を示す図である。

【図4】ＴＧＸ－０４（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＩＣＯＳＬ）ウイルスの構造を示す図である。Ｅ３領域に挿入されたＩＣＯＳＬ（機能的発現カセット、場所：２８３７１ｂｐ～２９２７９ｂｐ）。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３０９６７ｂｐ～３２７３０ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－０４）に含まれる。Ｅ１Ａ、Ｅ３及びファイバーの領域における３つの遺伝子改変の配列同一性。

【図5】ＴＧＸ－０５（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＡＤＡ）ウイルスの構造を示す図である。Ｅ３領域に挿入されたＡＤＡ（機能的発現カセット、場所：２８３７１ｂｐ～３０４７６ｂｐ）。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、場所：９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３２１６４ｂｐ～３３９２７ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－０５）に含まれる。Ｅ１Ａ及びファイバーの領域における遺伝子改変の配列同一性；ＡＤＡ ＣＤＳ中のサイレント変異。

【図6】ＴＧＸ－１１（ＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＣＭＶ（ＣｕＯ）－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡ－ＳＶ４０ｐＡ）ウイルスの構造を示す図である。Ｅ３領域に挿入されたＣＭＶプロモーター（２８１７２～２８７０５）及びＣｕＯの制御下でのＩＣＯＳＬ（機能的発現カセット、場所：２８９０４ｂｐ～２９８１２ｂｐ）－ＩＲＥＳ（２９８１３ｂｐ～３０３８４ｂｐ）－ＡＤＡ（機能的発現カセット、場所：３１２０７～３１９５０）－ＳＶ４０ｐＡの発現。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、場所：９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３２８８５ｂｐ～３４６４８ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－１３）に含まれる。Ｅ１Ａ及びファイバーの領域における遺伝子改変の配列同一性；－マルチクローニング部位の２つの欠失である、ＡＤＡ ＣＤＳ中のサイレント変異。

【図7a】感染後７２時間後の１０００ＶＰ／細胞の濃度でのヒト黒色腫細胞株Ａ３７５の生存率に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。未処理細胞の吸光度を１００％として表し、処理された細胞の吸光度を未処理細胞の吸光度のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図7b】感染後７２時間後の１ＶＰ／細胞の濃度でのヒト黒色腫細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－２の生存率に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。未処理細胞の吸光度を１００％として表し、処理された細胞の吸光度を未処理細胞の吸光度のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図7c】感染後７２時間後の１０００ＶＰ／細胞の濃度でのヒト黒色腫細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－２の生存率に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。未処理細胞の吸光度を１００％として表し、処理された細胞の吸光度を未処理細胞の吸光度のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図7d】感染後７２時間後の１０００ＶＰ／細胞の濃度でのヒト黒色腫細胞株Ａ２０５８の生存率に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。未処理細胞の吸光度を１００％として表し、処理された細胞の吸光度を未処理細胞の吸光度のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図8】感染の７２時間後の１０００ＶＰ／細胞の濃度でのヒト細胞株Ａ２０５８の細胞死誘導（アポトーシス）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。アポトーシスの量を、試験した細胞株に対するアネキシンＶ染色によって評定した。結果を未処理細胞のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図9a】感染の７２時間後の０．１ＶＰ／細胞の濃度で処理されたヒト細胞株Ａ３７５の免疫原性細胞死（ＡＴＰ放出の誘導）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ量を評価した。結果を未処理細胞のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図9b】感染の７２時間後の１０ＶＰ／細胞の濃度で処理されたヒト細胞株ＳＫＭＥＬ－２の免疫原性細胞死（ＡＴＰ放出の誘導）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ量を評価した。結果を未処理細胞のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図9c】感染の７２時間後の０．１ＶＰ／細胞の濃度で処理されたヒト細胞株ＳＫＭＥＬ－２８の免疫原性細胞死（ＡＴＰ放出の誘導）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ量を評価した。結果を未処理細胞のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図10】感染の７２時間後の１０００ＶＰ／細胞の濃度で処理されたヒト細胞株Ａ３７５の免疫原性細胞死（カルレティキュリン曝露の誘導）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。細胞の表面のカルレティキュリンを抗カルレティキュリン抗体で染色した。結果をカルレティキュリン陽性細胞のパーセンテージとして表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図11】感染の７２時間後の１０ＶＰ／細胞の濃度で処理されたヒト細胞株Ａ２０５８の免疫原性細胞死（ＨＭＧＢ１放出の誘導）に対する試験された腫瘍溶解性アデノウイルスの効果を示す図である。細胞の表面のカルレティキュリンを抗カルレティキュリン抗体で染色した。結果をｎｇ／ｍｌで表す。結果を平均±ＳＥＭで表す。

【図12a】屠殺時の腫瘍における免疫浸潤表現型を示す図である。ヒトグランザイムＢ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の％；免疫浸潤を屠殺時の腫瘍のフローサイトメトリーによって分析した。１群あたりＮ＝６個～１２個の腫瘍。各群について、個々のデータ及び平均±最小及び最大ウィスカー（whiskers：ひげ）を表示する。Ａｎｏｖａ検定を使用した。

【図12b】屠殺時の腫瘍における免疫浸潤表現型を示す図である。ヒトＰＤ１＋ＣＤ８ Ｔ細胞の％；免疫浸潤を屠殺時の腫瘍のフローサイトメトリーによって分析した。１群あたりＮ＝６個～１２個の腫瘍。個々のデータ及び平均±最小及び最大ウィスカーを表示する。

【図12c】屠殺時の腫瘍における免疫浸潤表現型を示す図である。ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の数／両方の腫瘍ｇ；免疫浸潤を、屠殺時の腫瘍のフローサイトメトリーによって分析した。１群あたりＮ＝６個～１２個の腫瘍。個々のデータ及び平均±最小及び最大ウィスカーを表示する。

【発明を実施するための形態】

【0033】

配列表
配列番号１．腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＣＭＶ（ＣｕＯ）－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡ－ＳＶ４０ｐＡ（ＴＧＸ－１１）をコードする核酸配列。Ｅ３領域に挿入されたＣＭＶプロモーター（２８１７２～２８７０５）及びＣｕＯの制御下でのＩＣＯＳＬ（機能的発現カセット、場所：２８９０４ｂｐ～２９８１２ｂｐ）－ＩＲＥＳ（２９８１３ｂｐ～３０３８４ｂｐ）－ＡＤＡ（機能的発現カセット、場所：３１２０７～３１９５０）－ＳＶ４０ｐＡの発現。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、場所：９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３２８８５ｂｐ～３４６４８ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－１３）に含まれる。Ｅ１Ａ及びファイバーの領域における遺伝子改変の配列同一性；－マルチクローニング部位の２つの欠失である、ＡＤＡ ＣＤＳ中のサイレント変異。
配列番号２．腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＩＣＯＳＬ（ＴＧＸ－０４）をコードする核酸配列。Ｅ３領域に挿入されたＩＣＯＳＬ（機能的発現カセット、場所：２８３７１ｂｐ～２９２７９ｂｐ）。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３０９６７ｂｐ～３２７３０ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－０４）に含まれる。Ｅ１Ａ、Ｅ３及びファイバーの領域における３つの遺伝子改変の配列同一性。
配列番号３．腫瘍溶解性アデノウイルスベクターＡｄＶ５／３－Ｄ２４－ＡＤＡ（ＴＧＸ－０５）をコードする核酸配列。Ｅ３領域に挿入されたＡＤＡ（機能的発現カセット、場所：２８３７１ｂｐ～３０４７６ｂｐ）。このウイルスは、Ｅ１Ａ ＣＲ２に２４ｂｐの欠失を含み（Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）に対する２つの結合部位のうち最も強いものが除去された２４ｂｐの欠失を有するＥ１Ａ保存領域２（ＣＲ２）、場所：９０７ｂｐ～９５１ｂｐ）、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー（場所：３２１６４ｂｐ～３３９２７ｂｐ）を発現する。ヌクレオチド配列は添付物（ＴＧＸ－０５）に含まれる。Ｅ１Ａ及びファイバーの領域における遺伝子改変の配列同一性；ＡＤＡ ＣＤＳ中のサイレント変異。
配列番号４．Ｅ１Ａ中のＲｂタンパク質に対する結合部位。
配列番号５．ＣＲ２－Ｄ２４（コンストラクトＴＧＸ－０４内）。
配列番号６．Ａｄ５／３ファイバー（ＴＧＸ－０４）。
配列番号７．ＩＣＯＳＬ（ＴＧＸ－０４）。
配列番号８．ＣＲ２－Ｄ２４（ＴＧＸ－０５）。
配列番号９．Ａｄ５／３ファイバー（ＴＧＸ－０５）。
配列番号１０．ＡＤＡ（ＴＧＸ－０５）。
配列番号１１．ＣＲ２－Ｄ２４（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１２．Ａｄ５／３ファイバー（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１３．ＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１４．ＣＵＯ（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１５．ＩＣＯＳＬ（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１６．ＩＲＥＳ（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１７．ＡＤＡＲＢ１（ＡＤＡ）（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１８．ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル（ＴＧＸ－１１）。
配列番号１９．プライマー２８８－１７。
配列番号２０．プライマー２８８－４１。
配列番号２１．プライマー２８８－１８。
配列番号２２．プライマー２８８－１９。
配列番号２３．プライマー２８８－２０。
配列番号２４．プライマー２８８－２１。

【0034】

本開示の詳細な説明
本発明の二重導入遺伝子腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２（ＣＲ２）に２４ｂｐの欠失（Ｄ２４）を有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格に基づく。ベクターは、アデノウイルスＥ３領域の欠失された２．７ｋｂｐの代わりに、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列と、ＡＤＡをコードする核酸配列とを含む。本発明の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクター骨格は、特許文献１に開示されるＯＮＣＯＳ－１０２であり、これは、ＧＭ－ＣＳＦ／Ｅ３領域の代わりにＩＲＥＳ又はＰ２Ａ配列に接続された共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡの導入遺伝子を含む。

【0035】

好ましくは、免疫調節リガンドのＢ７ファミリーはＩＣＯＳＬである。ＩＣＯＳＬの代わりに、プログラム死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死２リガンド（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ３、及びＢ７－Ｈ４等の免疫調節リガンドのＢ７ファミリーの他のリガンドも本発明において使用され得る。最も好ましくは、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーは、ヒトＩＣＯＳＬである。

【0036】

アデノシンデアミナーゼはＡＤＡ１又はＡＤＡ２であり得る。好ましくは、ＡＤＡはヒトＡＤＡ１である。

【0037】

実験の結果は、二重導入遺伝子ウイルスの驚くべき優れた効果を示した。ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡ１をコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡ１をコードする）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法よりも、幾つかの異なる細胞型において抗癌優位性を示した（図７ａ～図７ｄ、図８、図９ａ～図９ｃ、図１０、図１１、及び図１２ａ～図１２ｃ）。

【0038】

野生型アデノウイルスゲノムと比較して、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域、特にＥ１Ａ領域においてＣＲ２からの２４塩基対、及びＥ３領域において２．７ｋｂｐを欠く。Ｅ１の２４塩基対の欠失（Ｄ２４）は、Ｒｂ腫瘍抑制因子／細胞周期調節タンパク質の結合に関与するＣＲ２ドメインに影響を及ぼし、したがって、合成（Ｓ）期、すなわちＤＮＡ合成又は複製期の誘導を可能にする。ｐＲｂとＥ１Ａとの相互作用には、Ｅ１Ａタンパク質の保存領域の８つのアミノ酸１２１～１２７が必要であり、これらは本発明では欠失されている。Ｄ２４を有するウイルスは、Ｇ１－Ｓチェックポイントを克服し、この相互作用が不要な細胞、例えばＲｂ－ｐ１６経路に欠陥のある腫瘍細胞で効率的に複製する能力が低下していることが知られている。

【0039】

Ｅ３領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス複製に必須ではないが、Ｅ３タンパク質は、宿主の免疫応答の調節、すなわち自然免疫応答と特異的免疫応答との両方の阻害に重要な役割を果たす。Ｅ３の欠失は、アデノウイルスＥ３Ａ領域からの２．７ｋ塩基対の欠失を指す。得られたアデノウイルスコンストラクトでは、ｇｐ１９ｋ遺伝子及び６．７Ｋ遺伝子と共に２．７ｋｂｐが欠失されている。ｇｐ１９ｋ遺伝子産物は、小胞体において主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ１）分子に結合して隔離し、細胞傷害性Ｔリンパ球による感染細胞の認識を防ぐことが知られている。多くの腫瘍はＭＨＣ１を欠損しているため、ｇｐ１９ｋを欠失すると、ウイルスの腫瘍選択性が高まる（ウイルスは、野生型ウイルスよりも早く正常細胞から除去されるが、腫瘍細胞では違いがない）。６．７Ｋタンパク質は細胞表面に発現し、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体２のダウンレギュレーションに関与する。

【0040】

ＩＲＥＳと略記される内部リボソーム侵入部位は、タンパク質合成のより大きなプロセスの一部として、キャップに依存しない方法で翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。真核生物の翻訳では、開始複合体の組み立てには５’キャップ認識が必要であるため、開始は典型的には、ｍＲＮＡ分子の５’末端で発生する。

【0041】

これらの大きなＩＲＥＳ配列の代わりに、はるかに短い自己切断２Ａペプチドを使用することができる。ウイルス由来のペプチド配列はリボソームスキッピング事象を媒介し、１つのｍＲＮＡから複数の別々のペプチド産物を生成することを可能にする。ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）由来のペプチドは、複数の導入遺伝子の発現を促進する。

【0042】

本発明では、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡの導入遺伝子は、Ｅ３プロモーター又はＣＭＶ（Ｃｕｏ）プロモーターの下で、２．７ｋｂｐの欠失したＥ３領域に配置される。これにより、導入遺伝子の発現が腫瘍細胞に制限され、ウイルスの複製及びそれに続くＥ３プロモーターの活性化が可能になる。Ｅ３プロモーターは、当該技術分野で知られている任意の外因性又は内因性のプロモーター、好ましくは内因性プロモーターであり得る。本発明の好ましい実施形態において、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡをコードする核酸配列は、ウイルスＥ３プロモーターの制御下にある。ＣＭＶ（ＣｕＯ）プロモーターは、ｃｕｍａｔｅオペレーター（ＣｕＯ）のコピーを含む。「通常の」２９３細胞及びその他の細胞株では、ＣｕＯオペレーターは不活性であり、転写はＣＭＶプロモーターから行われる。ＣｙｍＲリプレッサーを発現する２９３－ＣｙｍＲ細胞では、ＣｙｍＲリプレッサーがＣｕＯオペレーターに結合し、それによって導入遺伝子の転写が妨げられる。

【0043】

本発明のベクターはまた、上で言及されるように、ＣＲ２及びＥ３の部分的欠失並びにＩＣＯＳＬ配列及びＡＤＡ配列の挿入以外の改変を含み得る。本発明の好ましい実施形態において、Ａｄ５ベクターの他の全ての領域は野生型である。本発明の別の好ましい実施形態において、Ｅ４領域は野生型である。本発明の好ましい実施形態において、野生型領域は、Ｅ１領域の上流に位置する。「上流」とは、発現方向においてＥ１領域の直前を指す。Ｅ１ Ｂ領域はまた、本発明のベクターにおいて改変され得る。

【0044】

本明細書で使用される場合、キャプシドの「Ａｄ５／３キメラ化」は、ファイバーのノブ部分がＡｄ血清型３に由来し、ファイバーの残りがＡｄ血清型５に由来するキメラ化を指す。

【0045】

発現カセットは、ベクターを利用して、細胞等の標的で導入遺伝子を発現させるために使用される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」という表現は、ｃＤＮＡ又は遺伝子をコードするヌクレオチド配列、及び該ｃＤＮＡ又は遺伝子の発現を制御及び／又は調節するヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクター又はその一部を指す。類似又は異なる発現カセットを、１つのベクター又は幾つかの異なるベクターに挿入することができる。本発明のＡｄ５ベクターは、幾つか又は１つの発現カセットのいずれかを含み得る。しかしながら、１つの発現カセットのみで十分足りる。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの発現カセットを含む。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、１つの発現カセットのみを含む。

【0046】

本発明のアデノウイルスベクターを含む細胞は、真核生物の細胞、細菌細胞、動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞等の任意の細胞であり得る。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞であり得る。例えば、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ ｖｉｖｏでアデノウイルスベクターを産生するために使用され得るか、又は細胞は、アデノウイルスベクターに感染した腫瘍細胞等の標的であり得る。

【0047】

細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡの導入遺伝子を産生する方法において、本発明のベクターを含むビヒクルが細胞に運ばれ、更に共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡの導入遺伝子が発現され、そしてタンパク質が翻訳されてパラクリン様式で分泌される。「ビヒクル」は、本発明のベクターを標的細胞に送達することができる、任意のウイルスベクター、プラスミド、又は粒子等の他のツールであり得る。ベクターを細胞に送達するために、当該技術分野で知られている任意の従来の方法を使用することができる。

【0048】

腫瘍特異的免疫応答は、本発明によって被験体において高められ得る。ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及び／又はナチュラルキラー細胞は、コンストラクトの特性の結果として刺激され、産生され、標的化される。

【0049】

本発明の組換えＡｄ５ベクターは、Ｒｂ経路、具体的にはＲｂ－ｐ１６経路に欠陥がある細胞における複製能力に対して構築されている。これらの欠陥細胞は、動物及びヒトの全ての腫瘍細胞を含む。本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、Ｒｂ経路に欠陥を有する細胞において選択的に複製可能である。本明細書で使用される場合、「Ｒｂ経路の欠陥」は、経路の任意の遺伝子又はタンパク質における変異及び／又はエピジェネティックな変化を指す。これらの欠陥のため、腫瘍細胞はＥ２Ｆを過剰発現し、したがって、効果的な複製に通常必要とされるＥ１Ａ ＣＲ２によるＲｂの結合が不要である。

【0050】

悪性腫瘍と良性腫瘍との両方、並びに原発腫瘍と転移とを含む全ての癌又は腫瘍は、遺伝子治療の標的となり得る。本発明の特定の実施形態において、癌は任意の固形腫瘍である。本発明の好ましい実施形態において、癌は、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌（throat cancer）、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌（trophoblastic cancer）、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、下咽頭癌（Hp cancer）、髄膜癌、口の癌（mouth cancer）、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌からなる群より選択される。

【0051】

本発明の医薬組成物は、本発明のベクターの少なくとも１つのタイプを含む。さらに、組成物は、本発明の少なくとも２つ又は３つの異なるベクターを含み得る。本発明のベクターに加えて、医薬組成物はまた、他のアデノウイルスベクター等の任意の他のベクター、他の治療上有効な作用物質、薬学的に許容可能な担体、緩衝剤、賦形剤、アジュバント、防腐剤、充填剤、安定剤若しくは増粘剤等の任意の他の作用物質、及び／又は対応する製品に通常見られる任意の成分も含み得る。

【0052】

医薬組成物は、投与に適した、固体、半固体、又は液体の形態等の任意の形態であり得る。製剤は、限定されるものではないが、溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、ペレット剤及びカプセル剤からなる群より選択され得る。

【0053】

ベクターの有効用量は、少なくとも治療を必要とする被験体、腫瘍の種類、腫瘍の場所、及び腫瘍の病期に依存する。用量は、例えば、約１０ｅ８ウイルス粒子（ＶＰ）～約１０ｅ１４ＶＰ、好ましくは約５×１０ｅ９ＶＰ～約１０ｅ１３ＶＰ、より好ましくは約８×１０ｅ９ＶＰ～約１０ｅ１２ＶＰで変化し得る。本発明の特定の一実施形態において、用量は、約５×１０ｅ１０ＶＰ～５×１０ｅ１１ＶＰの範囲にある。

【0054】

本発明のベクター又は医薬組成物は、植物、動物及びヒトからなる群より選択される任意の真核生物の被験体に投与することができ、本発明の好ましい実施形態において、被験体はヒト又は動物である。動物を、ペット、家畜及び生産動物からなる群より選択することができる。

【0055】

ベクター又は組成物を被験体に投与するために、任意の従来の方法を使用することができる。投与経路は、組成物の処方又は形態、疾患、腫瘍の場所、患者、併存症及び他の要因に依存する。本発明の好ましい実施形態において、投与は、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内若しくは腹腔内の注射、又は経口投与によって行われる。

【0056】

本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは１回だけの投与で治療効果を有し得る。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、治療期間中に数回投与される。腫瘍溶解性アデノウイルスベクター又は医薬組成物を、例えば、最初の２週間、４週間、毎月、又は治療期間中に１回～１０回投与することができる。本発明の一実施形態において、投与は、最初の２週間、次いで４週間目に、その後毎月３回～７回行われる。本発明の特定の実施形態において、投与は、最初の２週間、次いで４週間目に、その後毎月４回行われる。治療期間の長さは様々な場合があり、例えば、２ヶ月～１２ヶ月以上続く場合がある。

【0057】

本発明の遺伝子治療は単独で有効であるが、アデノウイルス遺伝子治療と従来の治療法等の他の治療法との組合せは、いずれか単独よりも有効であり得る。例えば、併用療法の各作用物質は、腫瘍組織において独立して作用することができ、アデノウイルスベクターは、化学療法若しくは放射線療法に対して細胞を感作することができ、及び／又は化学療法剤は、ウイルス複製のレベルを増強し、若しくは標的細胞の受容体状態に影響を及ぼし得る。併用療法の作用物質を同時に又は連続して投与することができる。

【0058】

本発明の好ましい実施形態において、方法又は使用は、被験体への同時放射線療法の適用を更に含む。本発明の別の好ましい実施形態において、方法又は使用は、被験体への同時化学療法の適用を更に含む。本明細書で使用される場合、「同時」は、本発明の遺伝子治療の前、その後、又はそれと同時に適用された治療法を指す。同時療法の期間は、数分から数週間まで様々な場合がある。好ましくは、同時療法は数時間続く。

【0059】

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」又は「チェックポイント阻害剤」という用語は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を全体的又は部分的に低減、阻害、干渉、又は調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化又は機能を調節する。免疫チェックポイントプロセスの中心は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）及びプログラム死１（ＰＤ－１）の免疫チェックポイント経路である。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１の経路は、免疫応答の種々の段階で機能すると考えられている。ＣＴＬＡ－４は、ナイーブＴ細胞活性化の初期段階で、典型的にはリンパ節において自己反応性Ｔ細胞を停止させる可能性があるため、免疫チェックポイント阻害剤の「リーダー（leader）」と見なされる。ＰＤ－１経路は、主に末梢組織において、免疫応答の後期に先に活性化されたＴ細胞を調節する。

【0060】

免疫チェックポイント経路の阻害により、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；Ｙｅｒｖｏｙ（商標））、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１；Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））、ニボルマブ（抗ＰＤ－１；Ｏｐｄｉｖｏ（商標））の幾つかの新薬が承認された。また、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）等のＰＤ－Ｌ１阻害剤も利用可能である。これらのアンタゴニスト抗体は、癌患者の客観的な臨床応答と関連付けられている。ＣＴＬＡ－４を標的とする抗体は、転移性黒色腫用に既に市販されている（例えば、イピリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ、Bristol-Myers Squibb、BMS）。抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Roche）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ、ＢＭＳ）による抗体療法も進行中である。

【0061】

他の免疫チェックポイント阻害剤としては、可溶性Ｉｇ融合タンパク質であるＩＭＰ３２１等のリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）阻害剤が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、Ｂ７－Ｈ３及びＢ７－Ｈ４の阻害剤等のＢ７阻害剤、特に、抗Ｂ７－Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１が挙げられる。ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害剤も挙げられる。或る特定の実施形態において、ＰＤ－１遮断薬としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。或る特定の他の実施形態において、ＰＤ－１遮断薬としては、抗ＰＤ－１抗体、及びニボルマブ（ＭＤＸ １１０６、ＢＭＳ ９３６５５８、ＯＮＯ ４５３８）、ＰＤ－１にそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２によって結合してＰＤ－１の活性化を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体３０等の同様の結合タンパク質；ランブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＳＣＨ ９００４７５）、ＰＤ－１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＰＤ－１に結合するヒト化抗体ＣＴ－０１１；Ｂ７－ＤＣの融合タンパク質であるＡＭＰ－２２４；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）遮断用のＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５－０１）が挙げられる。或る特定の実施形態において使用することができるＰＤ－Ｌ１阻害剤の更なる例は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブである。

【0062】

好ましくは、抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）が本発明で使用される。また、デュルバルマブ等のＰＤ－Ｌ１阻害剤を抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の好ましいチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１に対するものである。

【0063】

併用療法に適した作用物質としては、限定されるものではないが、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが挙げられる。

【0064】

本発明の好ましい実施形態において、方法又は使用は、被験体へのベラパミル又は別のカルシウムチャネル遮断薬の投与を更に含む。「カルシウムチャネル遮断薬」は、カルシウムチャネルの伝導を妨害する薬物及び天然物質のクラスを指し、ベラパミル、ジヒドロピリジン、ガロパミル、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルスピリレン及びフェンジリンからなる群より選択され得る。

【0065】

本発明の好ましい実施形態において、方法又は使用は、被験体へのオートファジー誘導剤の投与を更に含む。オートファジーとは、リソソーム機構を介した細胞自体の成分の分解を伴う異化プロセスを指す。「オートファジー誘導剤」は、オートファジーを誘導することができる作用物質を指し、限定されるものではないが、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｐ１３Ｋ阻害剤、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、テムシロリムス、シロリムス及びテモゾロミドからなる群より選択され得る。本発明の特定の実施形態において、方法は、被験体へのテモゾロミドの投与を更に含む。テモゾロミドは、経口又は静脈内テモゾロミドのいずれかであり得る。

【0066】

本発明の一実施形態において、方法又は使用は、化学療法若しくは抗ＣＤ２０療法、又は中和抗体を遮断するための他のアプローチの適用を更に含む。「抗ＣＤ２０療法」は、ＣＤ２０陽性細胞を死滅させることができる作用物質を指し、リツキシマブ及び他の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体からなる群より選択され得る。「中和抗体を遮断するためのアプローチ」は、通常は感染に起因する抗ウイルス抗体の生成を阻害することができる作用物質を指し、種々の化学療法剤、免疫調節物質、コルチコイド及び他の薬物からなる群より選択され得る。これらの物質は、限定されるものではないが、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、エトポシド、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ４、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－ガンマ、インターロイキン１０、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体、骨髄破壊及び経口アデノウイルスタンパク質からなる群より選択され得る。

【0067】

本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞のビリオン媒介性腫瘍溶解を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。本発明の好ましい実施形態において、方法又は使用は、被験体において制御性Ｔ細胞をダウンレギュレートすることができる物質の投与を更に含む。「制御性Ｔ細胞をダウンレギュレートすることができる物質」とは、サプレッサーＴ（T-suppressor）細胞又は制御性Ｔ細胞として識別される細胞の数を減らす作用物質を指す。これらの細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ１２７－及びＧＩＴＲ＋の免疫表現型マーカーの１つ又は多くからなることが特定されている。サプレッサーＴ細胞又は制御性Ｔ細胞を減少させるかかる作用物質は、抗ＣＤ２５抗体又は化学療法剤からなる群より選択され得る。

【0068】

本発明の目的は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格と、Ｅ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Ｄ２４）と、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及びＡＤＡをコードする核酸配列とを含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。本発明のより好ましい目的は、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡがＥ３プロモーターの下に配置されている腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。更に別の好ましい実施形態は、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡがＣＭＶ（Ｃｕｏ）プロモーターの下に配置されている腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。更に好ましい目的は、Ｅ３に２．７ｋｂｐの欠失がある腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。さらに、共刺激リガンドのＢ７ファミリーがＩＣＯＳＬであり、ＡＤＡがＡＤＡ１である腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、本発明の好ましい態様である。また、共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及びＡＤＡをコードする核酸配列がＩＲＥＳと接続されている腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、本発明の好ましい態様である。共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバーをコードする核酸配列及びＡＤＡをコードする核酸配列がＰ２Ａと接続されている腫瘍溶解性アデノウイルスベクターもまた、本発明の好ましい態様である。天然のＥ１Ａプロモーターを含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、本発明の更に別の好ましい態様である。本発明の別の目的は、キャプシド修飾としてＡｄ５／３キメラ化を更に含むこの腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。本発明の更に別の目的では、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、配列番号１を含む。

【0069】

本発明の１つの目的は、少なくとも１つの発現カセットを含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターである。本発明の別の目的では、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、Ｒｂ経路に欠陥を有する細胞において選択的に複製することができる。

【0070】

また、アデノウイルスベクターを含む細胞は、本発明の一態様である。

【0071】

本発明の別の態様は、本発明のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物である。癌の治療又は被験体において癌を治療するための薬剤の製造に使用されるアデノウイルスベクターもまた、本発明の一態様である。癌は、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口の癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌からなる群より選択され得る。

【0072】

治療の被験体は、ヒト又は動物であり得る。

【0073】

被験体におけるアデノウイルスベクターによる癌の治療は、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内若しくは腹腔内の注射、又は経口投与によって行われ得る。注射又は投与は、治療期間中に数回行われ得る。また、以前の治療のベクターと比較して異なるファイバーノブのキャプシドを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを使用することができる。被験体における癌の治療は、被験体への同時放射線療法及び／又は同時化学療法の適用を更に含み得る。被験体における癌の治療は、チェックポイント阻害剤、ベラパミル又は別のカルシウムチャネル遮断薬、オートファジー誘導剤、テモゾロミド、化学療法剤若しくは抗ＣＤ２０療法剤、又は中和抗体を遮断するための他のアプローチ、及び／又は被験者において制御性Ｔ細胞をダウンレギュレートすることが可能な物質の投与を更に含み得る。

【0074】

共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞内で産生する方法であって、
ａ．腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運ぶことと、
ｂ．細胞内で上記ベクターの共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現させることと、
を含む、方法は本発明の一態様である。

【0075】

また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞内で共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを産生するための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用は、本発明の一態様である。

【0076】

本発明の更なる目的は、癌の治療を必要とするヒト被験体において癌を治療する方法であって、配列番号１を含む腫瘍溶解性アデノウイルスと希釈剤又は担体とを含む医薬製剤を治療有効量、投与する、方法である。本発明の別の目的は、配列番号２を含む腫瘍溶解性アデノウイルスと配列番号３を含む腫瘍溶解性アデノウイルスとの組合せを含む医薬製剤を治療有効量、投与する方法である。該方法は、腫瘍内注射を介して、有効量の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター又は腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む医薬組成物を被験体に投与することを更に含むことができ、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、本発明によるアデノウイルスを含む。該方法では、有効量の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、５×１０ｅ１０～５×１０ｅ１１のウイルス粒子を含む。それらはまた、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターから共刺激リガンドのＢ７ファミリーのメンバー及びＡＤＡを発現する腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を含む特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する。上記治療方法では、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、治療の最初の２週間で３回～７回投与することができる。

【0077】

上記治療方法では、癌は、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口の癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌からなる群より選択され得る。

【0078】

一実施形態によれば、単数又は複数のアデノウイルスベクター又は医薬組成物の投与は、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内若しくは腹腔内の注射、又は経口投与によって実施され得る。別の実施形態によれば、単数又は複数のアデノウイルスベクター又は医薬組成物を、治療期間中に数回投与することができる。好ましい実施形態によれば、同時放射線療法を被験体に適用することができる。より好ましい実施形態によれば、同時化学療法を被験体に適用することができる。更により好ましい実施形態によれば、ベラパミル又は別のカルシウムチャネル遮断薬を被験体に投与することができる。

【0079】

本発明の１つの好ましい目的は、被験体において制御性Ｔ細胞をダウンレギュレートすることができる物質を投与することを更に含む、単数又は複数のアデノウイルスベクターによる治療方法である。

【0080】

本発明の任意の方法又は使用は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法又は使用のいずれかであり得る。

【0081】

本発明を以下の実施例によって解説するが、これらは決して限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0082】

腫瘍溶解性ウイルスのクローニング
腫瘍溶解性ウイルスを、遺伝子工学ツールを使用して構築した。腫瘍溶解性ベクターの構築は、以下の工程を含んだ。

【0083】

１．シャトルプラスミドの構築：
ＴＧＸ－０４／０５の場合、ベクターＡｄ５／３－ｄ２４－ＧＭＣＳＦのＧＭ－ＣＳＦコード配列と全く同じ位置でＥ３領域に導入遺伝子を挿入した。そのベクターでは、Ｅ３ ６．７Ｋ ＯＲＦ及びｇｐ１９Ｋ ＯＲＦを包含する０．９ｋｂのＢｓｉＷＩ－ＭｆｅＩフラグメントが欠失され、ＧＭ－ＣＳＦコード配列に置き換えられた。このクローニングには、本発明者らは、ＷＴ Ｅ３領域とハイブリッドＡｄ５／３ファイバーとを含むシャトルプラスミドｐＡｄ１１２９－１４を使用した。ＩＣＯＳＬリガンド（ＩＣＯＳＬ）配列、ＡＤＡ（ＡＤＡＲＢ１）配列を、標準的なクローニング方法を使用して、ｐＡｄ１１２９－１４のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間に挿入した（図１）。シャトルプラスミドの同一性を、制限分析及び配列決定によって確認した。

【0084】

ＴＧＸ－１１の場合、ほとんどのその遺伝子で欠失されるＥ３領域の代わりに、ジシストロニックカセットＣＭＶ－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡ－ＳＶ４０ｐＡを挿入した。本発明者らは、Ａｄ５ Ｅ３領域及びハイブリッドＡｄ５／３ファイバー遺伝子を含むシャトルプラスミドｐＡｄ１１２９－２７を使用した。２．７ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントをＥ３領域から欠失させ、マルチクローニング部位に置き換えた。標準的なクローニング方法を使用して、両方のジシストロニックカセットをｐＡｄ１１２９－２７に挿入した（図２）。プラスミドの同一性を、制限分析及び配列決定によって検証した。

【0085】

２．コスミド構築
組換えアデノウイルスの全ゲノムをコスミドで再構成した（図３）。トランスフェクショングレードのコスミドＤＮＡを精製し、制限分析によってそれらの同一性を確認した。

【0086】

３．ウイルスのレスキュー及び特性評価
工程２で得られたコスミドからのアデノウイルスゲノムの切除、及び２９３細胞又は２９３－Ｃｙｍｒ細胞又はＡ５４９細胞へのトランスフェクション。コンストラクトごとに３つのウイルスプラークを採取し、小規模で増幅した。３種類の酵素（Ｈｉｒｔ上清）を使用したゲノムの制限分析により、それらの同一性を検証する。

【0087】

４．ウエスタンブロット
ウイルスからの様々な導入遺伝子の発現は、レポーター細胞株に様々なウイルスクローンを感染させ、感染の２４時間後に細胞を溶解し、ＰＡＧＥによって総タンパク質内容物を分離し、化学発光によって様々な導入遺伝子産物を検出する抗ＩＣＯＳＬ抗体及び抗ＡＤＡ抗体を使用してウエスタンブロッティング（ＷＢ）を実施することにより評定した。これらの実験により、増幅及び精製のためにウイルスクローンを選択することができる。

【0088】

５．小規模増幅
ウイルスクローンの小規模増幅、２つのＣｓＣｌ勾配での精製、等張バッファー（ＧＴＳバッファー：２．５％グリセロール、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に対する透析、低タンパク質結合０．２２μｍフィルターによる濾過、及び紫外線吸収によるウイルス粒子（ＶＰ）濃度の決定（Ａｂｓ２６０－ＳＤＳ法）を実施した。

【0089】

６．配列決定によるウイルスの同一性の確認
精製された組換えアデノウイルスの同一性を、Ｅ１Ａ ＣＤＳにおける２４ｂｐの欠失、Ｅ３領域に挿入されたモノシストロニック又はジシストロニックカセット全体、Ａｄ５／３ハイブリッドファイバー、及びコスミド構築中に互いにライゲーションされたＤＮＡフラグメント間の接合部を含む、これらの組換えウイルスに特異的なウイルスゲノムの領域を配列決定することによって確認した。実験配列をコンティグに組み立て、ウイルスの予想される配列と整列させた。プロテイナーゼＫを使用してＣｓＣｌ精製ウイルス粒子からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、３０μＬのＴＥ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。それらの品質を、分光光度法（Ａｂｓ２６０／２８０／３２０ｎｍ）及びアガロースゲル電気泳動によって評定した。ＴＧＸウイルスのＤＮＡを、ショットガンライブラリの作成及び配列決定のため第三者に送った。ライブラリを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴキット（Illumina, Inc）を使用して生成した。それらをプールし、ｑＰＣＲによって定量し、２×３００ ＭｉＳｅｑの実行（Illumina, Inc）で配列決定した。．ｆａｓｔｑファイルを、プログラム「ＢＷＡ Ａｌｉｇｎｅｒ」を使用して処理した。ソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓ ｖ１１．１．５（Biomatters Ltd）を使用して、．ｂａｍファイルを可視化し、コンセンサス配列を計算した。ソフトウェアＳｎａｐＧｅｎｅ ｖ４．２．６を使用して、コンセンサス配列をウイルスゲノムの予測配列と整列させた。

【0090】

７．ウイルス懸濁液の滴定
ウイルス懸濁液の滴定：ウイルス懸濁液１ｍＬあたりの感染単位の濃度の決定を、ＴＣＩＤ５０アッセイによって行った。

【0091】

ＴＧＸ－０４（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＩＣＯＳＬ）のクローニングの詳細
以下の性質を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの構築、増幅、精製、滴定、及び特性評価を行う：
Ｅ１Ａ ＣＲ２における２４ｂｐの欠失
Ｅ３領域に埋め込まれたＩＣＯＳＬをコードする配列
ハイブリッドＡｄ５／３ファイバー

【0092】

組換えアデノウイルスＴＧＸ０４を、そのゲノム全体をコスミド（ｐＴＧＸ０４）で再構成することによって構築した。次の３つのＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションした。
１．ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３からの２７ｋｂのＰａｃＩ－ＳｐｅＩフラグメント
２．ｐＴＧＸ１０３からの８８３３ｂｐのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント
３．ｐＡｄ５ｄＳｆｉからの８ｋｂのＰａｃＩフラグメント
ここでは、
ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３（ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）
ｐＴＧＸ１０３は、Ｅ３領域のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間に挿入されたＩＣＯＳＬコード配列と共に、ウイルスゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩ配列）を含むプラスミドである。
ｐＡｄ５ｄＳｆｉＩは、Ａｄ５ゲノム全体を含むコスミドである。８ｋｂのＰａｃＩフラグメントは、ｐＴＧＸ０４のコスミド骨格を提供する。

【0093】

ｐＴＧＸ１０３を、ｐＴＧＸ１０１の対応する部位の間にｐＡｄ１１２９－ＩＣＯＳＬからの１０７０ｂｐのＢｓｉＷＩ－ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントを挿入することによって構築した。
ここでは、
ｐＴＧＸ１０１は、Ａｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３ゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント）を含むプラスミドである。
ｐＡｄ１１２９－ＩＣＯＳＬは、Ｅ３領域のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間にＩＣＯＳＬコーディングシーケンサー（coding sequencer）を含むシャトルプラスミドである。

【0094】

ｐＡｄ１１２９－ＩＣＯＳＬを、ｐＡｄ１１２９－１４のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間にＩＣＯＳＬをコードする９６９ｂｐの合成ｄｓＤＮＡを挿入することによって構築した。
ここでは、
ｐＡｄ１１２９－１４は、ＷＴ Ａｄ５ Ｅ３領域及びハイブリッドＡｄ５／３ファイバーを含むシャトルプラスミドである。
ｇＢｌｏｃｋ－ＩＣＯＳＬ（転写バリアント１、９０９ｂｐ、ＮＭ＿０１５２５９．４）

【0095】

ＴＧＸ－０５（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＡＤＡ）のクローニングの詳細
以下の性質を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの構築、増幅、精製、滴定、及び特性評価を行う：
Ｅ１Ａ ＣＲ２における２４ｂｐの欠失
Ｅ３領域に埋め込まれたＡＤＡＲＢ１をコードする配列
ハイブリッドＡｄ５／３ファイバー

【0096】

組換えアデノウイルスＴＧＸ０５を、そのゲノム全体をコスミド（ｐＴＧＸ０５）で再構成することによって構築した。次の３つのＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションした。
１．ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３からの２７ｋｂのＰａｃＩ－ＳｐｅＩフラグメント
２．ｐＴＧＸ１０４からの１００３０ｂｐのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント
３．ｐＡｄ５ｄＳｆｉからの８ｋｂのＰａｃＩフラグメント
ここでは、
ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３（ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）
ｐＴＧＸ１０４は、Ｅ３領域のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間に挿入されたＡＤＡＲＢ１コード配列と共に、ウイルスゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩ配列）を含むプラスミドである。
ｐＡｄ５ｄＳｆｉＩは、Ａｄ５ゲノム全体を含むコスミドである。８ｋｂのＰａｃＩフラグメントは、ｐＴＧＸ０５のコスミド骨格を提供する。

【0097】

ｐＴＧＸ１０４を、ｐＴＧＸ１０１の対応する部位の間にｐＡｄ１１２９－ＡＤＡＲＢ１からの２２６７ｂｐのＢｓｉＷＩ－ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントを挿入することによって構築した。
ここでは、
ｐＴＧＸ１０１は、Ａｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３ゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント）を含むプラスミドである。
ｐＡｄ１１２９－ＡＤＡＲＢ１は、Ｅ３領域のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位との間にＡＤＡＲＢ１コード配列を含むシャトルプラスミドである。

【0098】

ｐＡｄ１１２９－ＡＤＡＲＢ１を、ｐＡｄ１１２９－１４のＢｓｉＷＩ部位とＭｆｅＩ部位の間にＡＤＡＲＢ１をコードする２１６６ｂｐの合成ｄｓＤＮＡを挿入することによって構築した。
ここでは、
ｐＡｄ１１２９－１４は、ＷＴ Ａｄ５ Ｅ３領域及びハイブリッドＡｄ５／３ファイバーを含むシャトルプラスミドである。
ｇＢｌｏｃｋ－ＡＤＡＲＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１１１２．３）

【0099】

ＴＧＸ－１１（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＩＣＯＳＬ－ＡＤＡ）のクローニングの詳細
以下の性質を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの構築、増幅、精製、滴定、及び特性評価を行う：
Ｅ１Ａ ＣＲ２における２４ｂｐの欠失
Ｅ３領域の代わりに（２．７ｋｂのＢｇｌＩＩ欠失）ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡＲＢ１を発現するジシストロニックカセット
ハイブリッドＡｄ５／３ファイバー

【0100】

組換えアデノウイルスＴＧＸ１１を、そのゲノム全体をコスミド（ｐＴＧＸ１１）で再構成することによって構築した。次の３つのＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションした。
１．ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３からの２７ｋｂのＰａｃＩ－ＳｐｅＩフラグメント
２．ｐＴＧＸ１１０ｃからの１０７５１ｂｐのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント
３．ｐＡｄ５ｄＳｆｉからの８ｋｂのＰａｃＩフラグメント
ここでは、
ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＷＴＥ３（ｐＡｄ５／３－ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）
ｐＴＧＸ１１０ｃは、Ｅ３領域の代わりにＣＭＶ－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡＲＢ１カセットが挿入されたウイルスゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩ配列）を含むプラスミドである。
ｐＡｄ５ｄＳｆｉＩは、Ａｄ５ゲノム全体を含むコスミドである。８ｋｂのＰａｃＩフラグメントは、ｐＴＧＸ１１のコスミド骨格を提供する。

【0101】

ｐＴＧＸ１１０ｃを、次の３つのＤＮＡフラグメントを互いにライゲーションすることによって構築した。
１．ｐＴＧＸ１０１からの１３４９ｂｐのＣｓｉＩ－ＲｓｒＩＩフラグメント
２．ｐＴＧＸ１０１からの６４９１ｂｐのＲｓｒＩＩ－ＮｈｅＩフラグメント
３．ｐＴＧＸ１１０ｂからの５４８２ｂｐのＮｈｅＩ－ＣｓｉＩフラグメント
ここでは、
ｐＴＧＸ１０１は、Ａｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３ゲノムの右端（ｐＡｄ５／３．ｄ２４－ＷＴＥ３からのＳｐｅＩ－ＰａｃＩフラグメント）を含むプラスミドである。
ｐＴＧＸ１１０ｂは、Ｅ３領域の代わりに（２．７ｋｂのＢｇｌＩＩ欠失）ＣＭＶ－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡＲＢ１－ＳＶ４０ｐＡシグナルカセットを含むプラスミドである。

【0102】

ＣＭＶ－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡＲＢ１カセットに隣接するＳｐｅＩサイトを破壊するために、ｐＴＧＸ１１０をＳｐｅＩで消化し、粘着末端をクレノウ（Klenow）で埋め、両方のフラグメントを相互に再ライゲーションすることによってｐＴＧＸ１１０ｂを構築した。
ここでは、
ｐＴＧＸ１１０は、Ｅ３領域の代わりに（２．７ｋｂ ＢｇｌＩＩ欠失）ＣＭＶ－ＩＣＯＳＬ－ＩＲＥＳ－ＡＤＡＲＢ１－ＳＶ４０ｐＡシグナルカセットを含むプラスミドである。

【0103】

ｐＴＧＸ１１０を、ｐＡｄ１１２９－ＧｒＢ－ＦのＳａｃＩＩ部位とＡｃｃ６５Ｉ部位との間に次の４つのフラグメントを挿入することによって構築した。
１．テンプレートとしてｐＡｄ１１２９－ＩＣＯＳＬを使用し、プライマー２８８－１７及び２８８－４１を使用してＰＣＲによって増幅された９４５ｂｐのＩＣＯＳＬコード配列
２．テンプレートとしてｐＡｄ１１２９－ＩＲＥＳ－ａｔｔを使用し、プライマー２８８－１８及び２８８－１９を使用してＰＣＲによって増幅された６４５ｂｐのＩＲＥＳ－ａｔｔエレメント
３．ＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ消化によってプラスミドｐＡｄ１１２９－ＡＤＡＲＢ１から単離された２１１２ｂｐのＡＤＡＲＢ１コード配列
４．テンプレートとしてｐＡｄ１１２９－ＧｒＢ－Ｆを使用し、プライマー２８８－２０及び２８８－２１を使用してＰＣＲによって増幅された１７４ｂｐのＳＶ４０ｐＡシグナル。
ここでは、
ｐＡｄ１１２９－ＩＣＯＳＬをＴＧＸ０４の構築のため作製した。
ｐＡｄ１１２９－ＡＤＡＲＢ１をＴＧＸ０５の構築のために作製した。
ｐＡｄ１１２９－ＧｒＢ－ＦをＴＧＸ０１の構築のために作製した。
ｐＡｄ１１２９－ＩＲＥＳ－ａｔｔは、ＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の弱毒化バージョンを含むプラスミドである。

【0104】

プライマー：
288-17: ACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGGCCGCCACCATGCGGCTGGGCAGTCCTGGACTGC
288-41: TCAAACGTGGCCAGTGAGCTCTGTC
288-18: AGCTCACTGGCCACGTTTGACCCCTCTCCCTCCCCCCCCT
288-19: TCTTCATCTTCTATATCCATGTCGACTCTAGAGGATCCCG
288-20: AGTTCTCACTCACGCCCTGAAACTTGTTTATTGCAGCTTA
288-21: TAGTTAAAGGGAATAAGATCGGTACC.

【0105】

細胞株
黒色腫細胞株であるＡ２０５８（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１１４７（商標））、Ａ３７５（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１６１９（商標））及びＳＫ－ＭＥＬ－２（ＡＴＣＣ（商標）ＨＴＢ－６８（商標））、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（ＡＴＣＣ（商標）ＨＴＢ－７２（商標））を１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのため、８０％のコンフルエンスで細胞を分離及び継代培養した。

【0106】

黒色腫マウスモデル－ヒト化異種移植マウスモデル
ウイルスを用いる治療によって生じた免疫調節特性（様々な免疫細胞、ＴＩＬを腫瘍に浸潤させる能力）を、ヒト化黒色腫マウスモデルで評定した。本発明者らは、以前に、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞を用いたＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒｙｎｕｌｌ免疫不全症（ＮＯＧ）に基づくヒト化マウスモデルを開発し、試験した（Kuryk et al., 2018）。ＮＯＧマウスに間葉系幹細胞及び造血幹細胞を移植した。このモデルは、患者の抗腫瘍応答をより厳密に表したものを生成する。このアプローチの強みは、Ｔ細胞及びＢ細胞、樹状細胞、並びにＮＫ細胞を含む複数の造血系統を生成できることである。マウスの両脇腹にＡ２０５８ヒト黒色腫腫瘍細胞を皮下注射し、種々の治療群に無作為化した（ｎ＝８／群）。ウイルスを腫瘍内（局所）投与した。一連の治療（ウイルスの５回の注射）の後、マウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、浸潤した白血球の表現型をフローサイトメトリーによって分析した。

【0107】

データ分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７）を使用して、全てのパラメーターを分析した。統計学的分析を、ＲＭ－一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定又はＴ検定（マン・ホイットニー検定）を使用して実施した。

【0108】

実施例１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）
細胞生存率は、製造元の指示に従い、以下の変更を加えて、ＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Abcam）を使用して評価した。ＭＴＳアッセイキットは、生細胞を高感度で定量するための比色法である。これは、細胞増殖、細胞生存率、及び細胞毒性を評定するために使用することができる。ＭＴＳアッセイは、生存可能な哺乳動物細胞によるＭＴＳテトラゾリウム化合物の還元に基づいており、細胞培養培地に可溶な着色ホルマザン色素を生成する。この変換は、代謝的に活性な細胞のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼ酵素によって行われると考えられている。ホルマザン色素は、４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量される。細胞を９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェル及び５０００細胞／ウェルの濃度で播種した。０．１ウイルス粒子（ＶＰ）、１ＶＰ、１０ＶＰ、１００ＶＰ、及び１０００ＶＰの被験ウイルスと共に、又はウイルス粒子を含まずに細胞をインキュベートした。処理を２００μＬの最終容量で開始した。７２時間後、ＭＴＳアッセイを製造業者のプロトコルに従って実施した。プレートをシェーカーで短時間振盪し、４９０ｎｍで吸光度を測定した。未処理細胞の吸光度値を１００％の生存率に対応するように設定し、処理された細胞の生存率を未処理対照の吸光度値のパーセンテージとして表した。

【0109】

ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、Ａ３７５細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０００ＶＰ／細胞の濃度で投与した場合、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする、未処理細胞の６０．９４％）及びＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする、未処理細胞の６４．７１％）よりも抗癌優位性を示した（それぞれ、未処理細胞の３３．５１％）。重要なことに、二重導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－１１は、ＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法よりも強力な抗癌効果を示した（９４．８８％）（図７ａ）。

【0110】

二重導入遺伝子ベクターはまた、１ＶＰ／細胞及び１０００ＶＰ／細胞の濃度で試験した場合、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞株において、単一の導入遺伝子ベクター（ＴＧＸ－０４及びＴＧＸ－０５）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法に対して、抗癌優位性（ＴＧＸ－１１）を示した（それぞれ１ＶＰ／細胞の場合、未処理細胞の７９．６９％；１１４．２２％；１００．７３％、１２２．８５％、及び１０００ＶＰ／細胞の場合、未処理細胞の４５．８３％；６９．１９％；９１．５６％；１１６．２７％）（図７ｂ及び図７ｃ）。

【0111】

ＴＧＸ－１１の増強された抗癌効果（未処理細胞の５６．２９％）は、単一の導入遺伝子ベクターＴＧＸ－０４及びＴＧＸ－０５、並びにＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法（それぞれ、未処理細胞の６７．７２；７５．５％及び８５．６４％）に対して１０００ＶＰ／細胞の濃度でもＡ２０５８細胞株においても記録された（図７ｄ）。

【0112】

実施例２ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－アポトーシス細胞死
初期及び後期のアポトーシス細胞の評価に焦点を当てた治療効果に関する補足分析も実施した。初期アポトーシスに関連する細胞膜の変化を特定するために、アネキシンＶコンジュゲートによる染色を行った。Ａ２０５８細胞株の場合、細胞を１ウェルあたり１．５×１０^４細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。播種と同じ日に処理を開始し、製造業者の指示に従って死細胞アポトーシスキットを使用し、フローサイトメトリーによって処理の開始から７２時間後にアポトーシス細胞及び壊死細胞の量を測定した。

【0113】

ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、Ａ２０５８細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０００ＶＰ／細胞の濃度で投与された場合、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする、未処理細胞の１２０．７６％）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする、未処理細胞の１５９．１７％）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法（未処理細胞の１６２．７５％）よりも、抗癌優位性（アポトーシス細胞死の誘導）を示した（それぞれ未処理細胞の１７５．４３％）（図８ａ）。

【0114】

実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－免疫原性細胞死（ＩＣＤ）
癌細胞死は免疫原性又は非免疫原性である可能性があることが示されている（Tesniere et al., 2008）。免疫原性細胞死は、細胞表面の構造の変化を伴い、免疫原性因子の放出をもたらす（Kroemer et al., 2013）。続いて、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を引き付けて腫瘍抗原を取り込み、それらを処理し、最後に抗腫瘍免疫応答（特定の抗腫瘍Ｔ細胞）を誘発する（Tesniere et al., 2008）。癌治療の成功は、免疫原性腫瘍細胞死の誘導及び抗腫瘍免疫応答の誘導に依存する（Kepp et al., 2011）。細胞死は、細胞膜外膜上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）等の免疫原性細胞死バイオマーカーの存在と、それに続く高移動度群ボックス１タンパク質（high-mobility group box 1 protein）（ＨＭ－ＧＢ１）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の細胞外放出とによって評価され得る（Kepp et al., 2011、Obeid et al., 2007、Kroemer et al., 2013）。

【0115】

細胞を、Ａ３７５細胞株及びＳＫ－ＭＥＬ－２細胞株の場合は１ウェルあたり２．５×１０^４細胞の密度で、Ａ２０５８細胞株及びＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞株の場合は１ウェルあたり１．５×１０^４細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。ウイルスによる処理を播種の日に開始した。処理開始から７２時間後、処理細胞又は未処理細胞の上清を採取した。カルレティキュリンを、製造業者（Abcam）の指示に従って、抗カルレティキュリン抗体で細胞の表面にて染色した。ＡＴＰ量（上清から）を、供給業者（Abcam）の指示に従ってＡＴＰアッセイキットを使用して評価した。ＨＭＧＢ－１を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（IBL International）によって測定した。

【0116】

ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、Ａ３７５細胞株において０．１ＶＰ／細胞の濃度で投与した場合、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法よりも免疫原性細胞死（ＡＴＰ放出）の増強を示した（図９ａ）。ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞株及びＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞株にそれぞれ１０ＶＰ／細胞及び０．１ＶＰ／細胞の濃度で投与した場合、二重導入遺伝子ウイルスの同様の優位性（ＡＴＰ放出）が観察された（図９ｂ及び図９ｃ）。

【0117】

ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、Ａ３７５細胞において、１０００ＶＰ／細胞の濃度で投与した場合、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする、未処理細胞の４．０８％）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする、未処理細胞の２．１７％）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法（未処理細胞の３．５４％）よりも免疫原性細胞死の増強（カルレティキュリン発現レベル、未処理細胞の５．３１％）を示した（図１０）。

【0118】

ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）は、Ａ２０５８細胞株において、１０ＶＰ／細胞の濃度で投与した場合、単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする、８．５３ｎｇ／ｍｌの未処理細胞）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする、６．５９ｎｇ／ｍｌの未処理細胞）及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５ Ａ２０５８との組合せ療法（４．４ｎｇ／ｍｌの未処理細胞）よりも免疫原性細胞死の増強（ＨＭＧＢ１放出、９．６９ｎｇ／ｍｌの未処理細胞）を示した（図１１）。

【0119】

実施例４ ｉｎ ｖｉｖｏ－ヒト化黒色腫マウスモデル
ＩＣＯＳＬ及びＡＤＡをコードする二重導入遺伝子ウイルス（ＴＧＸ－１１）による治療は、腫瘍塊へのグランザイムＢ ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ－１ ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を増強し、Ａ２０５８ヒト化黒色腫マウスモデルにおける単一導入遺伝子ウイルスＴＧＸ－０４（ＩＣＯＳＬをコードする）、ＴＧＸ－０５（ＡＤＡをコードする）、及びＴＧＸ－０４とＴＧＸ－０５との組合せ療法の効果よりも優れていた（図１２ａ、図１２ｂ、及び図１２ｃ）。

【0120】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図8】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【配列表】

2022529438000001.app

【国際調査報告】