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特表2022-529506眼の治療のための高密度リポタンパク質ナノ粒子およびＲＮＡテンプレート化リポタンパク質粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-22
(54)【発明の名称】眼の治療のための高密度リポタンパク質ナノ粒子およびＲＮＡテンプレート化リポタンパク質粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20220615BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220615BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220615BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20220615BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220615BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220615BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220615BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220615BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220615BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220615BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220615BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220615BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220615BHJP
C07K 14/775 20060101ALN20220615BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K47/42
A61K47/24
A61K9/14
A61K9/127
A61K9/51
A61K47/69
A61K47/28
A61K47/18
A61P27/02
A61P31/00
A61P29/00
A61P43/00 111
A61P3/10
A61K48/00
C12N15/113 Z ZNA
C07K14/775
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021563014
(86)(22)【出願日】2020-04-24
(85)【翻訳文提出日】2021-12-21
(86)【国際出願番号】 US2020029752
(87)【国際公開番号】W WO2020219833
(87)【国際公開日】2020-10-29
(31)【優先権主張番号】62/839,579
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500041019
【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】タックストン， シー． シャド
(72)【発明者】
【氏名】ラブカー， ロバート エム．
(72)【発明者】
【氏名】マクマホン， ケイリン エム．
(72)【発明者】
【氏名】ペン， ハン
(72)【発明者】
【氏名】カルバート， アンドレア イー．
(72)【発明者】
【氏名】カプラン， ニハル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA29
4C076AA65
4C076AA67
4C076AA95
4C076BB24
4C076BB36
4C076CC29
4C076CC31
4C076CC41
4C076DD49
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE41
4C076FF31
4C076FF43
4C084AA13
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA38
4C084MA43
4C084MA58
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZA33
4C084ZB11
4C084ZB32
4C084ZC02
4C084ZC35
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA38
4C086MA43
4C086MA58
4C086NA12
4C086NA13
4C086ZA33
4C086ZB11
4C086ZB32
4C086ZC02
4C086ZC35
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA55
4H045CA40
4H045EA20
(57)【要約】
ＲＮＡ複合体化ナノ粒子（例えば、ＲＮＡテンプレート化リポタンパク質粒子、ｍｉＲＮＡ－高密度リポタンパク質粒子）を使用して、眼の障害、傷害、および感染症を処置するためのナノ構造体、組成物および方法が、本明細書で開示される。これらのナノ構造体は、局所治療において企図される。本開示は、眼（例えば、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜））の疾患または傷害を処置するための組成物および方法を示す。これらの領域の処置は、有効になるまでに多数の障壁に直面する。例えば、眼は、種々の物理的障壁（例えば、涙膜、脂質層、水性層、粘液層、上皮層、および細胞層（例えば、基質など）、ならびに機械的障壁（例えば、瞬目反射）を含む。よって、本開示は、処置のための組成物を送達するためにこれらの問題を克服し得る新たな組成物を提示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノ構造体であって、前記ナノ構造体は、コア、アポリポタンパク質、前記コアに結合した脂質シェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含み、ここで前記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含み、ここで前記ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、構造体。
【請求項2】
アニオン性ナノ構造体であって、前記ナノ構造体は、カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体およびテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）の凝集物を含み、ここで前記ＴＬＰは、不活性コア、前記不活性コアを取り囲む脂質シェル、および前記不活性コアに対して官能化されたアポリポタンパク質を有する合成ＨＤＬであるアニオン性ＴＬＰを含み、ここで前記ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、カチオン性脂質－核酸複合体およびＴＬＰの前記凝集物は、前記アニオン性ナノ構造体凝集物を形成する、ナノ構造体。
【請求項3】
前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである、請求項１～２のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項4】
コレステロールをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項5】
前記カチオン性脂質－核酸複合体は、前記カチオン性脂質と複合体化した１本鎖ｍｉＲＮＡから構成される、請求項２～４のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項6】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２０５またはｍｉＲ－１４６ａである、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項7】
カチオン性脂質－核酸複合体およびＴＬＰの前記凝集物は、負のζ電位を有する、請求項２～６のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項8】
カチオン性脂質－ＲＮＡの前記凝集物は、カチオン性脂質－センス鎖ＲＮＡおよびカチオン性脂質－アンチセンス鎖ＲＮＡの混合物を含む、請求項５に記載のナノ構造体。
【請求項9】
前記ＲＮＡは、化学的に改変されていない、請求項１～８のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項10】
前記ＲＮＡは、化学的に改変されている、請求項１～８のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項11】
前記リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ－ＰＥ）から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項12】
前記ナノ構造体は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびｍｉＲＮＡの交互の層を含む、請求項２～８のいずれか１項に記載のナノ構造体。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノ構造体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項14】
眼の障害を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の障害を処置する工程、
を包含する方法。
【請求項15】
眼の傷害または眼の感染症を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の傷害または感染症を処置する工程、
を包含する方法。
【請求項16】
前記眼の障害、眼の傷害または眼の感染症は、それぞれ、角膜障害、角膜傷害、または角膜感染症である、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
眼の炎症を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか１項に記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の炎症を処置する工程、
を包含する方法。
【請求項18】
被験体においてＮＦＫＢシグナル伝達を阻害する方法であって、前記方法は、請求項１～２のいずれか１項に記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与する工程であって、ここで前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡであり、ここで前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１４６ａである工程、
を包含する方法。
【請求項19】
前記眼の障害は、糖尿病性角膜症である、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記投与は局所である、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記被験体は、哺乳動物である、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記被験体はヒトである、請求項８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年４月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８３９，５７９号の出願日の利益を主張する。上記で言及した出願の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年４月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８３９，５７９号の出願日の利益を主張する。上記で言及した出願の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【0002】
政府支援
本発明は、Ｒ０１ ＥＹ０１９４６３およびＲ０１ ＣＡ１６７０４１（ともに、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与）の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｒ０１ ＥＹ０１９４６３およびＲ０１ ＣＡ１６７０４１（ともに、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与）の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
眼の障害（眼の疾患）、感染症、および傷害は、処置が困難であり、処置されずに放置されれば、患者に破壊的な影響を有し得る（例えば、取り返しのつかない損傷、失明など）。例えば、糖尿病角膜は、法的失明の原因第１位である。糖尿病を有する患者は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を発生させ得、ＰＤＲを有する人々は、しばしば５年以内に彼らの視力を失う（１型および２型でそれぞれ、４３％および６０％）。これらの患者のうち、７０％までが、角膜に問題がある。このような問題は、例えば、増大した角膜厚；上皮欠損、脆弱性、およびびらん；潰瘍；浮腫；表層性点在角膜症；内皮の変化；ニューロパチー；ならびに創傷修復の遅延および／または不完全として現れ得る。これらの問題をさらに複雑にさせるものは、多くの眼の疾患は、早期に症状がないことであり、このことは、それら（例えば、眼の障害）が一旦診断されれば、非常に効果的な処置の必要性を増大させる。眼の障害、感染症、および傷害に関する従来の処置が頻繁に効果的でなかったことに起因して、改善された治療の必要性が増大しつつある。
眼の障害（眼の疾患）、感染症、および傷害は、処置が困難であり、処置されずに放置されれば、患者に破壊的な影響を有し得る（例えば、取り返しのつかない損傷、失明など）。例えば、糖尿病角膜は、法的失明の原因第１位である。糖尿病を有する患者は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を発生させ得、ＰＤＲを有する人々は、しばしば５年以内に彼らの視力を失う（１型および２型でそれぞれ、４３％および６０％）。これらの患者のうち、７０％までが、角膜に問題がある。このような問題は、例えば、増大した角膜厚；上皮欠損、脆弱性、およびびらん；潰瘍；浮腫；表層性点在角膜症；内皮の変化；ニューロパチー；ならびに創傷修復の遅延および／または不完全として現れ得る。これらの問題をさらに複雑にさせるものは、多くの眼の疾患は、早期に症状がないことであり、このことは、それら（例えば、眼の障害）が一旦診断されれば、非常に効果的な処置の必要性を増大させる。眼の障害、感染症、および傷害に関する従来の処置が頻繁に効果的でなかったことに起因して、改善された治療の必要性が増大しつつある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の要旨
本開示は、眼（例えば、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜））の疾患または傷害を処置するための組成物および方法を示す。これらの領域の処置は、有効になるまでに多数の障壁に直面する。例えば、眼は、種々の物理的障壁（例えば、涙膜、脂質層、水性層、粘液層、上皮層、および細胞層（例えば、基質など）、ならびに機械的障壁（例えば、瞬目反射）を含む。よって、本開示は、処置のための組成物を送達するためにこれらの問題を克服し得る新たな組成物を提示する。
本開示は、眼（例えば、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜））の疾患または傷害を処置するための組成物および方法を示す。これらの領域の処置は、有効になるまでに多数の障壁に直面する。例えば、眼は、種々の物理的障壁（例えば、涙膜、脂質層、水性層、粘液層、上皮層、および細胞層（例えば、基質など）、ならびに機械的障壁（例えば、瞬目反射）を含む。よって、本開示は、処置のための組成物を送達するためにこれらの問題を克服し得る新たな組成物を提示する。
【0005】
本開示は、少なくとも部分的に、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜）の疾患または傷害を処置する（例えば、局所的に）ために、ナノ構造体（例えば、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ－ＮＰ）またはテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）に結合したＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を使用する組成物または方法に基づく。
【0006】
したがって、本開示の１つの局面は、コア、アポリポタンパク質、上記コアに結合した脂質シェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含むナノ構造体を提供し、ここで上記脂質シェルは、リン脂質および上記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む。本開示の別の局面は、コア、アポリポタンパク質、上記コアに結合した脂質シェルを含むテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）を含むナノ構造体を提供し、ここで上記脂質シェルは、リン脂質および上記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体におけるアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（本明細書でａｐｏＡ－Ｉ、Ａ－１、またはＡＩともいわれ得る）である。いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体は、コレステロールをさらに含む。
【0007】
本開示の別の局面は、眼の障害を有する被験体を処置する方法であって、上記方法は、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体のうちの少なくとも１つを、有効量において上記被験体に投与し、それによって、上記眼の障害を処置する工程を包含する方法を提供する。
【0008】
本開示の別の局面は、眼の傷害または眼の感染症を有する被験体を処置する方法であって、上記方法は、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体のうちの少なくとも１つを、有効量において上記被験体に投与し、それによって、上記眼の傷害または感染症を処置する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記眼の障害、眼の傷害、または眼の感染症は、それぞれ、角膜障害、角膜傷害、または角膜感染症である。いくつかの実施形態において、上記眼の障害は、糖尿病性角膜症である。いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体の投与は、局所投与によるものである。
【0009】
本開示のいくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２０５またはｍｉＲ－１４６ａである。
【0010】
アニオン性ナノ構造体が本開示の他の局面において提供される。上記ナノ構造体は、カチオン性脂質－ＲＮＡ複合体およびテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）の凝集物を含み、ここで上記ＴＬＰは、不活性コア、上記不活性コアを取り囲む脂質シェル、および上記不活性コアに対して官能化されたアポリポタンパク質を有する合成ＨＤＬであるアニオン性ＴＬＰを含み、ここで上記ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、カチオン性脂質－核酸複合体およびＴＬＰの上記凝集物は、上記アニオン性ナノ構造体凝集物を形成する。
【0011】
いくつかの実施形態において、上記カチオン性脂質－核酸複合体は、上記カチオン性脂質と複合体化した１本鎖ｍｉＲＮＡから構成される。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２０５またはｍｉＲ－１４６ａである。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質－核酸複合体およびＴＬＰの上記凝集物は、負のζ電位を有する。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質－ＲＮＡの上記凝集物は、カチオン性脂質－センス鎖ＲＮＡおよびカチオン性脂質－アンチセンス鎖ＲＮＡの混合物を含む。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、化学的に改変されていない。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、化学的に改変されている。いくつかの実施形態において、上記リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ－ＰＥ）から選択される。いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびｍｉＲＮＡの交互の層を含む。
【0012】
本開示の別の局面は、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体のうちのいずれか１つ、または本明細書で開示されるナノ構造体の組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。
【0013】
いくつかの局面において、本開示は、眼の炎症を有する被験体を処置する方法であって、上記方法は、本開示のナノ構造体のいずれか１つのナノ構造体を、有効量において上記被験体に投与し、それによって、上記眼の炎症を処置する工程、を包含する方法に関する。
【0014】
いくつかの局面において、本開示は、被験体においてＮＦＫＢシグナル伝達を阻害する方法であって、上記方法は、本開示のナノ構造体のいずれか１つのナノ構造体を、有効量において上記被験体に投与する工程であって、ここで上記ＲＮＡはｍｉＲＮＡであり、ここで上記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１４６ａである工程、を包含する方法に関する。
【0015】
いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、被験体を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、上記被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトである。
【0016】
これらおよび他の局面および実施形態は、本明細書でより詳細に記載される。本開示のいくつかの例示的実施形態の説明は、例証目的で提供されるに過ぎず、限定であることを意味しない。さらなる組成物および方法がまた、本開示によって包含される。
【0017】
上記の要旨は、本明細書で開示される技術の実施形態、利点、特徴、および使用のうちのいくつかを、非限定的な様式で例証することが意味される。本明細書で開示される技術の他の実施形態、利点、特徴および使用は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに示すために含まれ、これら局面は、本明細書で示される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１またはこれより多くを参照することによってよりよく理解され得る。明瞭にする目的で、全ての構成要素が、全ての図面において表示されないこともある。図面で例証されるデータが本開示の局面を決して限定しないことは、理解されるべきである。図面において：
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【図6-1】図６Ａ～６Ｆは、Ａｋｔ鎮静創傷治癒経路の模式図（図６Ａ）、図２Ａの方法によるｍｉＲ－２０５ ＡＩ ＮＰ合成の吸光度の結果（図６Ｂ）、ＳＨＩＰ２タンパク質発現が、ウェスタンブロット分析（図６Ｃ）によって認められ、デンシトメトリー（図６Ｄ）によって定量されるようにｍｉＲ－２０５－ＡＩ粒子で処置した場合に、ヒト角膜上皮細胞において減少されること、ホスホ－Ａｋｔタンパク質発現が、ウェスタンブロット分析によって認められるようにｍｉＲ－２０５－ＡＩ粒子で処置される場合に、ヒト角膜上皮細胞において増大されること（図６Ｅ）、および処置後にｍｉＲ－２０５ ＨＤＬ－ＮＰがＳＨＩＰ２を減少させ、ｐ－Ａｋｔを増大させた（図６Ｆ）ことを示す。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【図11-1】図１１Ａ～Ｇは、無傷の創傷のない角膜に対するＨＤＬ－ＮＰ（図１１Ａ）およびＣｙ３－ＨＤＬ－ＮＰ（図１１Ｂ）処置の蛍光顕微鏡検査法の切片を含み；Ｃｙ３標識ＡＩが、健常マウスの眼に由来する角膜上皮基底細胞（Ｂ）、翼細胞（Ｗ）、表層細胞（Ｓ）およびケラチノサイト（Ｋ）において検出されており（図１１Ｃ：非処置； 図１１Ｄ：Ｃｙ３－Ａｌ ＮＰ）；Ｃｙ３標識ＡＩが、創傷したマウスの眼に由来する角膜上皮基底細胞（Ｂ）、翼細胞（Ｗ）、表層細胞（Ｓ）およびケラチノサイト（Ｋ）において検出されており（図１１Ｅ：非処置； 図１１Ｆ：Ｃｙ３－Ａｌ ＮＰ）；Ｃｙ３標識ＡＩが、創傷後に眼の結膜において検出されている（図１１Ｇ）。
【図11-2】同上。
【図11-3】同上。
【0030】
【図12-1】図１２Ａ～Ｄは、ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰがインビボで生物学的活性を示すこと（図１２Ａ～１２Ｄ）を示すダイアグラムを含む。図１２Ａは、２４時間にわって撮影したこのような画像を含む。図１２Ｂは、経時的な創傷閉鎖の％を示すプロットを含む。食事誘導性肥満（ＤＩＯ）に麻酔をかけ、角膜上皮においてダイアモンド刃を使用して１ｍｍ創傷を作製し、マウスは、３０分ごとに２時間にわたって、ｍｉＲ－２０５－ＡＩまたは混合ｍｉＲ－ＡＩの局所適用を受容した。マウスを、創傷の２４時間後までモニターした（図１２Ｃ～１２Ｄ）。ｍｉＲ－２０５－ＡＩおよびＮＣ－ｍｉＲ－ＡＩはともに、蛍光色素で認められるように、ＰＢＳと比較して、ＤＩＯマウスにおいて角膜創傷治癒を増強する（図１２Ｃ）； ＤＩＯマウスは、通常食事（ＮＤ）のマウスと比較して、角膜創傷治癒を抑制し、粒子にコンジュゲートしたＮＣ－ｍｉＲまたはｍｉＲ－２０５ありまたはなしのＡＩ ＮＰは、ＤＩＯマウスにおいて同程度まで創傷治癒を減少させる（図１２Ｄ）。
【図12-2】同上。
【0031】
【図13-1】図１３Ａ～１３Ｃは、ｍｉＲ－２０５－ＴＬＰがｐ－Ａｋｔを誘導し、ＳＨＩＰ２タンパク質発現を低減させ、Ａｌ ＮＰが角膜上皮細胞においてｐ－Ａｋｔ、ｐＥｐｈＡ２、およびＤＳＧ３を増大させること、ならびにＡｋｔシグナル伝達が、増強された創傷閉鎖に必要とされることを示す。ｈＴＣＥｐｉ、ｈＴＥＲＴ不死化ヒト角膜上皮細胞を、アンチセンス鎖＋センス鎖（２本鎖）もしくは２倍量のｍｉＲ－２０５のアンチセンス鎖（１本鎖）のいずれかをコンジュゲートしたＲＮＡ－ＴＬＰ、または陰性コントロールで処理した。レーンは、左から非処理（ＮＴ）細胞、陰性前駆体トランスフェクションコントロール、およびｍｉＲ－２０５トランスフェクションコントロールを示す（図１３Ａ）。ＡＩ ＮＰは、ＰＥＧ－ＮＰと比較して、ヒト角膜上皮細胞においてホスホ－Ａｋｔ、ホスホ－ＥｐｈＡ２、およびＤＳＧ３を増大させる（図１３Ｂ）。ＡＩ ＮＰで処理したヒト角膜上皮細胞は、ＰＥＧ ＮＰと比較して擦過傷閉鎖を増強したが、これはＰＩ３Ｋ／ＡｋｔインヒビターＬＹ２９４００２によって抑止される（図１３Ｃ）。
【図13-2】同上。
【0032】
【図14-1】図１４Ａ～１４Ｅは、ＲＮＡ－ＴＬＰが創傷された角膜上皮に透過すること；Ａｌ ＮＰが角膜上皮擦過傷の先端においてＦ－アクチンを増大させること；ならびにエフリン－Ａ１の阻害およびＳｒｃの活性化がＡｌ ＮＰ創傷閉鎖に必要とされることを示す。約１ｍｍ直径の角膜剥離創傷を、マウスの角膜に作製した。１μＭ Ｃｙ３－コントロール－ＲＮＡ－ＴＬＰを、３０分ごとに４時間にわたって眼に局所適用した。創傷の２４時間後に、眼を摘出し、ＯＣＴにおいて固定し、切片化した。スライドを、Ｃｙ３（ＲＮＡ－ＴＬＰ－赤）、ケラチン１２（上皮－緑）、およびＤＡＰＩ（核－青）に関して染色した（図１４Ａ）。ＡＩ ＮＰで処理したヒト角膜上皮細胞は、擦過傷の先端においてＦ－アクチンを増大させた（図１４Ｂ：ＰＥＧ－ＮＰ； 図１４Ｃ：ＨＤＬ－ＮＰ）。ＡＩ ＮＰで処理したヒト角膜上皮細胞は、ＰＥＧ ＮＰと比較して、擦過傷閉鎖を増強したが、これはエフリン－Ａ１の過剰発現（図１４Ｄ）またはＳｒｃの阻害剤（ｐｐ２）（図１４Ｅ）によって抑止される。
【図14-2】同上。
【図14-3】同上。
【0033】
【0034】
【図16-1】図１６Ａ～１６Ｇは、ｍｉＲ－１４６ａがＮＦＫＢシグナル伝達経路に対して作用すること（図１６Ａ）；ｍｉＲ－１４６ａ－ＴＬＰがＬＰＳ誘導性ＮＦ－κＢシグナル伝達を阻害すること（図１６Ｂ～１６Ｃ）を示し、Ｊ７７４－Ｄｕａｌマウスマクロファージ細胞を、０．５ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Ｏ１１１：Ｂ４）で１時間前処理し、続いて、４０ｎＭ ｍｉＲ－１４６ａ－ＴＬＰ、Ｃｔｒｌ－ＴＬＰ、またはＴＬＰ単独で、またはリポフェクタミン送達ｍｉＲ－１４６ａもしくはコントロールｍｉＲＮＡで２４時間処理した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅアッセイ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を使用して、ＮＦ－κＢ ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）活性を決定した；ＰＢＳまたはＰＥＧ ＮＰで処置した眼は、傷害７日後に角膜の炎症の除去を有しなかったが、ＡＩ ＮＰは、眼の炎症を有意に低減した（図１６Ｄ～１６Ｅ）； 傷害後にＰＥＧ ＮＰもしくはＡＩ ＮＰで７日間処置した眼の角膜のＨ＆Ｅ染色は、ＰＥＧ ＮＰ処置の眼と比較して、ＡＩ ＮＰ処置の眼において炎症の増強された除去を示す（図１６Ｆ）；傷害３日後に、ＡＩ ＮＰで処置した角膜は、炎症性サイトカイン（ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ｉＮＯＳ、ＭＭＰ９、およびＣＣＬ２）の有意な低減を有した（図１６Ｇ）。
【図16-2】同上。
【図16-3】同上。
【図16-4】同上。
【図16-5】同上。
【図16-6】同上。
【0035】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
発明の詳細な説明
本開示は、ナノ構造体（例えば、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ－ＮＰ）またはテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）に結合したＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））を使用して、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜）の疾患または傷害を（例えば、局所的に）処置する組成物または方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、眼の疾患の予防的処置のために使用される。
本開示は、ナノ構造体（例えば、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ－ＮＰ）またはテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）に結合したＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））を使用して、前眼部（例えば、角膜、角膜輪部、および結膜）の疾患または傷害を（例えば、局所的に）処置する組成物または方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、眼の疾患の予防的処置のために使用される。
【0038】
点眼剤を通じて眼に治療剤を送達することは、角膜に送達された薬物の低量をもたらす眼の障壁（例えば、涙膜および細胞層）、眼からの迅速な除去、およびターンオーバーを含む多くの難題に直面する。前部の表面上皮は、涙膜とともに、外部環境に対して効率的な障壁を提供し、角膜の透明性および剛性の維持に寄与する。このような障壁が、眼の健康状態に必須である一方で、逆説的には、それは、種々の疾患状態（例えば、炎症および感染症）と戦うために必要な薬物の送達を妨げ得る。送達は、瞬目反射（これは、眼の表面からデブリおよび微生物を除去することに加えて、局所適用される薬物も除去し得る）によってさらに悪化される。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）サイレンシング機構の一部である短い（長さ約２２ヌクレオチド）「非コード」または「非メッセンジャー」ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的化および翻訳抑制を通じて遺伝子発現を制御することによって、生物学的ホメオスタシスを調節する。よって、それらは、正常および疾患両方の状況において、広く種々の生物学的プロセスの調節に寄与する。結果的に、ｍｉＲＮＡは、潜在的治療剤として非常に期待できる。この目的を達成するための大きなハードルは、治療用ｍｉＲＮＡを効果的に製剤化しかつ安定な形態で標的細胞の細胞質へと送達することであった。以前のｍｉＲＮＡ関連の眼の処置は、これらの難題に起因して、局所的に送達されていなかった。
【0039】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、天然のインビボＲＮＡ送達ビヒクルである。天然の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、ヒト血清から単離され、ｍｉＲＮＡを含むことが見出され、これらＨＤＬに結合したｍｉＲＮＡは、裸のｍｉＲＮＡと比較して、改善された安定性を有することが見出された。さらに、天然ＨＤＬは、結合したｍｉＲＮＡを、ＨＤＬの高親和性スカベンジャーレセプタータイプＢ－１（ＳＣＡＲＢ１）レセプターを発現する細胞に送達する。ＳＣＡＲＢ１は、角膜上皮細胞上に発現される。
【0040】
ここで、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を眼に、好ましくは、角膜に局所的に送達し得る球状の機能的なＨＤＬ様ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）の使用が、糖尿病マウス角膜における創傷治癒に対して正の効果を有することが見出された。上記ＨＤＬ－ＮＰは、内因性ｍｉＲＮＡ（これは、疾患状態に伴って異なり得る）を送達するのみならず、ｍｉＲＮＡをレシピエント細胞に、機能的遺伝子調節結果を伴って（例えば、発現に影響を及ぼす）送達することもできる。
【0041】
ＨＤＬの特徴にヒントを得て、カチオン性脂質との製剤化の後、ＲＮＡ二重鎖対の１本鎖および１本鎖相補体で自己アセンブリするテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）を、開発した。その得られたＲＮＡテンプレート化リポタンパク質粒子（ＲＮＡ－ＴＬＰ）は、アニオン性であり、ＲＮＡアセンブリおよび機能に関して調整可能である。データから、角膜上皮細胞株において、ｍｉＲＮＡ－２０５（ｍｉＲ－２０５）－ＴＬＰがｍｉＲ－２０５を活発に標的化し、ダウンレギュレートし、ＳＨＩＰ－２を標的化し、リン酸化Ａｋｔ（ｐ－Ａｋｔ）を増大させることが示される。インビボでは、Ｃｙ３発蛍光団で改変された非標的化ＲＮＡ配列とコンジュゲートしたＴＬＰの眼への局所投与は、角膜上皮における、特に、基底細胞およびケラチノサイトにおけるＣｙ３標識ＲＮＡの透過を、縁上皮および基質における取り込みとともに示す。これは、インビトロにおいて標的遺伝子発現を強力に調節し、インビボで角膜上皮に透過する、活発に標的化されたアニオン性送達ビヒクルにＲＮＡの１本鎖相補体を自己アセンブリすることによる、眼への局所的ＲＮＡ送達のモジュール式アプローチである。
【0042】
本明細書で企図されるＲＮＡテンプレート化リポタンパク質粒子（ＲＮＡ－ＴＬＰ）は、生物にヒントを得た合成のリポタンパク質およびカチオン性脂質－ＲＮＡアセンブリの組み合わせである。それらは、制御された自己アセンブリおよびＲＮＡ－ＴＬＰの機能調整可能性という利点を有する。さらに、ＲＮＡ－ＴＬＰ（ＨＤＬ－ＮＰのような）のモジュール式の性質は、治療用ＲＮＡカーゴの容易な交換、活発な細胞標的化、強力な標的遺伝子調節、および眼の投与後のインビボ有効性を可能にする。
【0043】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ－ＴＬＰを合成するプロセスは、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）、２種のリン脂質の混合物、およびコレステロールでの、固体粒子（例えば、５ナノメートル（ｎｍ）直径の金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ））テンプレートの表面官能化を含む。外側のリン脂質およびコレステロールは、核酸と有利に会合する。合成プロセスの間に、ＴＬＰおよびＲＮＡの負電荷に起因してＲＮＡと複合体化することが公知のカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）が、水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のＲＮＡの混合物に添加される。ＰＢＳ中で例えば、ＤＯＴＡＰ－ＲＮＡと混合したＴＬＰは、不可逆的に凝集し、沈殿する。
【0044】
ＲＮＡの眼への送達のために開発された技術はほぼ全て、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーに基づく。これらのビヒクルのカチオン性の性質および合成の特性に最も頻繁に起因して、それらは、高度に毒性である可能性があり、典型的には疾患特異的部位に標的化されない。本発明の組成物は、眼のＲＮＡ治療に対するこれらの障壁のうちの多くを克服する。なぜなら上記ナノ構造体は、それらがアニオン性であり、細胞の表面に位置する特異的レセプターを通じて固有に標的化されるように、製剤化されるからである。
【0045】
多くのＲＮＡ治療は、特異的疾患標的の周辺に設計されるが、本明細書で開示されるナノ構造体は高度にモジュール式であるため、目的の任意の１つまたは多数の標的を組み込むように想定して目的に合わせて作られ得る。
【0046】
既存の技術は、容易に拡大されず、インビボ毒性をもたらし得る未知の生物学的組成を有する。対照的に、本明細書で開示されるナノ構造体は、インビボで固有の毒性を有さないことが示されており、天然のＲＮＡ送達ビヒクルを模倣して、ビヒクル関連の毒性を回避するように製剤化される。
【0047】
ナノ構造体
いくつかの局面において、本開示は、ナノ構造体に関し、上記ナノ構造体は、コア、アポリポタンパク質、上記コアに結合したシェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含み、上記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む。
いくつかの局面において、本開示は、ナノ構造体に関し、上記ナノ構造体は、コア、アポリポタンパク質、上記コアに結合したシェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含み、上記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「ナノ構造体」とは、高密度リポタンパク質様ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）またはテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）であって、核酸と組み合わされ得るものを指す。本開示のナノ構造体は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）と複合体化されると企図される。本明細書で使用される場合、用語「ＨＤＬ－ＮＰ」および「ＨＤＬ様ナノ粒子」は、交換可能に使用される。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、コレステロールを運び、特定の細胞タイプを標的化し、そして多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たす天然の循環するナノ粒子である。結果として、合成ＨＤＬ摸倣物は、有望な治療剤になった。しかし、今日までのアプローチは、最も存在量が豊富なＨＤＬ種であり、特定の臨床上重要である球状ＨＤＬの重要な特徴を再現することができなかった。本明細書で使用される場合、用語「会合した」は、脂質と複合体化しているナノ構造体における脂質を指すために使用される。本明細書で使用される場合、用語「複合体化される」および「結合した」とは、交換可能に使用される。
【0049】
いくつかの局面において、本開示は、テンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）から構成されるナノ構造体に関連し、上記テンプレート化リポタンパク質粒子は、コア、アポリポタンパク質、上記コアに結合したシェルを含み、ここで上記ＴＬＰは、カチオン性脂質を通じてＲＮＡ分子に複合体化される。ＴＬＰは、いくつかの実施形態において、ＲＮＡとともにアニオン性ナノ構造体凝集物を形成する。上記ナノ構造体は、カチオン性脂質－核酸複合体およびテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）の凝集物を含み、ここで上記ＴＬＰは、不活性コア、上記不活性コアを取り囲む脂質シェル、および上記不活性コアに対して官能化されたアポリポタンパク質を有する合成ＨＤＬであるアニオン性ＴＬＰを含み；上記カチオン性脂質－核酸複合体は、カチオン性脂質と複合体化した１本鎖または２本鎖ＲＮＡから構成され、カチオン性脂質－核酸複合体およびＴＬＰの上記凝集物は、負のζ電位を有し、アニオン性ナノ構造体凝集物を形成する。いくつかの実施形態において、二重鎖ＲＮＡの各鎖は、カチオン性脂質に対して別個にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、化学的に改変されていない。他の実施形態において、それは化学的に改変されている。いくつかの実施形態において、上記不活性コアは、金属（例えば、金）である。いくつかの実施形態において、上記リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ－ＰＥ）である。いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＲＮＡの交互の層を含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、上記ナノ構造体は、カチオン性脂質を含む。上記カチオン性脂質は、以下であり得る：例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃ１）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃ１）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）もしくはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、またはこれらの混合物。
【0051】
上記で具体的に記載されるものに加えて、およそ生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有する他のカチオン性脂質も、脂質ナノ粒子中に含まれ得る。このようなカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない： Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）； Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ－Ｎ－トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）； Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）； Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）； １，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）； ３β－（Ｎ－－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＯＰＣ」）。
【0052】
本開示のいくつかの局面において、上記ナノ構造体は、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含み、核酸（例えば、ＲＮＡ）と、約１：１の、約２：１の、約３：１の、約４：１の、約５：１の、約６：１の、約７：１の、約８：１の、約９：１の、約１０：１の、約１１：１の、約１２：１の、約１３：１の、約１４：１の、約１５：１の、約１６：１の、約１７：１の、約１８：１の、約１９：１の、約２０：１の、約２１：１の、約２２：１の、約２３：１の、約２４：１の、約２５：１の、約２６：１の、約２７：１の、約２８：１の、約２９：１の、約３０：１の、約３１：１の、約３２：１の、約３３：１の、約３４：１の、約３５：１の、約３６：１の、約３７：１の、約３８：１の、約３９：１の、約４０：１の、約４１：１の、約４２：１の、約４３：１の、約４４：１の、約４５：１の、約４６：１の、約４７：１の、約４８：１の、約４９：１の、約５０：１の、約６０：１の、約７０：１の、約８０：１の、約９０：１の、または約１００：１のモル比において混合される。いくつかの実施形態において、上記カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）は、核酸（例えば、ＲＮＡ）と、１０：１、２０：１、３０：１または４０：１のモル比で混合される。
【0053】
「両親媒性脂質」とは、脂質物質の疎水性部分が、疎水性相へと配向する一方で、親水性部分が水性相に向かって配向する任意の適切な物質を指す。このような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレイルホスファチジルコリン、モホホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、またはグリコピラノシドリピドＡ（ＧＬＡ）が挙げられる。
【0054】
いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、アポリポタンパク質を含む。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ（例えば、ａｐｏ Ａ－Ｉ、ａｐｏ Ａ－ＩＩ、ａｐｏ Ａ－ＩＶ、およびａｐｏ Ａ－Ｖ）、アポリポタンパク質Ｂ（例えば、ａｐｏ Ｂ４８およびａｐｏ Ｂ１００）、アポリポタンパク質Ｃ（例えば、ａｐｏ Ｃ－Ｉ、ａｐｏ Ｃ－ＩＩ、ａｐｏ Ｃ－ＩＩＩ、およびａｐｏ Ｃ－ＩＶ）、ならびにアポリポタンパク質Ｄ、Ｅ、およびＨであり得る。さらに、本明細書で記載される構造体は、アポリポタンパク質（例えば、上記で記載されるもの）の１またはこれより多くのペプチドアナログを含み得る。当然のことながら、他のタンパク質（例えば、非アポリポタンパク質）がまた、本明細書で記載されるナノ構造体の中に含められ得る。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、ＨＤＬの主要なタンパク質成分であるアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）を含む。本開示のナノ構造体は、ＳＣＡＲＢ１に対して高親和性で結合し得る。本開示のナノ構造体は、低減した毒性を有する。いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
【0055】
本開示のナノ構造体は、疾患、感染症、および傷害の処置のために使用される。本明細書で企図される障害、感染症および傷害としては、角膜傷害、ドライアイ、角膜炎、結膜炎、白内障、緑内障、眼の炎症、ぶどう膜炎、および虹彩炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
上記構造体に結合したオリゴヌクレオチドの表面密度はまた、制御され得る。オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ）は、静電吸着または化学吸着技術（例えば、Ａｕ－ＳＨコンジュゲート化学）のような技術を使用して、ナノ構造体コアに結合され得る。
【0057】
高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ ＮＰ）コア
上記ナノ構造体のコアは、中空またはナノ構造体コアであり得る。上記ナノ構造体のコアは、ナノ構造体コアであろうが中空コアであろうが、任意の適切な形状および／またはサイズを有し得る。例えば、上記コアは、実質的に球状、非球状、長円形、ロッド形、ピラミッド状、立方体様、円盤形、ワイヤ様、または不規則な形状であり得る。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に球状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に非球状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に長円形を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にロッド様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にピラミッド状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に立方体様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に円板様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にワイヤ様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に不規則な形状を含む。コア（例えば、ナノ構造体コアまたは中空コア）は、例えば、約５００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約７５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約４０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または約５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、最大断面寸法（または、ときおり、最小断面寸法）を有し得る。いくつかの場合には、上記コアは、約１：１より大きい、３：１より大きい、または５：１より大きいアスペクト比を有する。本明細書で使用される場合、「アスペクト比」とは、長さおよび幅が互いに対して垂直で測定され、その長さは、最長の直線的に測定される寸法をいう場合の長さ対幅の比に言及する。
上記ナノ構造体のコアは、中空またはナノ構造体コアであり得る。上記ナノ構造体のコアは、ナノ構造体コアであろうが中空コアであろうが、任意の適切な形状および／またはサイズを有し得る。例えば、上記コアは、実質的に球状、非球状、長円形、ロッド形、ピラミッド状、立方体様、円盤形、ワイヤ様、または不規則な形状であり得る。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に球状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に非球状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に長円形を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にロッド様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にピラミッド状の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に立方体様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に円板様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的にワイヤ様の形状を含む。いくつかの実施形態において、上記コアは、実質的に不規則な形状を含む。コア（例えば、ナノ構造体コアまたは中空コア）は、例えば、約５００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約７５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約４０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または約５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、最大断面寸法（または、ときおり、最小断面寸法）を有し得る。いくつかの場合には、上記コアは、約１：１より大きい、３：１より大きい、または５：１より大きいアスペクト比を有する。本明細書で使用される場合、「アスペクト比」とは、長さおよび幅が互いに対して垂直で測定され、その長さは、最長の直線的に測定される寸法をいう場合の長さ対幅の比に言及する。
【0058】
上記コアは、無機材料から形成され得る。上記無機材料としては、例えば、金属（例えば、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、および他の遷移金属）、半導体（例えば、ケイ素、ケイ素化合物および合金、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム、およびリン化インジウム）、または絶縁物質（例えば、ケイ素酸化物のようなセラミック）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、上記コアは、金（Ａｕ）である。上記無機材料は、上記コアに、任意の適切な量、例えば、少なくとも１重量％（すなわち、１ ｗｔ％）、５ ｗｔ％、１０ ｗｔ％、２５ ｗｔ％、５０ ｗｔ％、７５ ｗｔ％、９０ ｗｔ％、または９９ ｗｔ％で存在し得る。１つの実施形態において、上記コアは、１００ ｗｔ％ 無機材料から形成される。上記ナノ構造体コアは、いくつかの場合に、量子ドット、カーボンナノチューブ、カーボンナノワイヤ、またはカーボンナノロッドの形態であり得る。いくつかの場合に、上記ナノ構造体コアは、生物学的起源でない材料を含むか、またはその材料から形成される。いくつかの実施形態において、ナノ構造体は、合成ポリマーおよび／もしくは天然ポリマーのような１またはこれより多くの有機材料を含むか、またはその材料から形成され得る。合成ポリマーの例としては、非分解性ポリマー（例えば、ポリメタクリレート）および分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびこれらのコポリマー）が挙げられる。天然ポリマーの例としては、ヒアルロン酸、キトサン、およびコラーゲンが挙げられる。ある特定の実施形態において、上記構造体、ナノ構造体またはナノ粒子コアは、ポリマー材料を含まない（例えば、それは非ポリマー性である）。
【0059】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される構造体、ナノ構造体、またはナノ粒子は、金コアに対して６０～２５０倍モル過剰の脂質を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される構造体、ナノ構造体、またはナノ粒子は、上記コア（例えば、金コア）に対して、６０～２００倍、６０～１５０倍、６０～１００倍、６０～７５倍、７０～２００倍、７０～１５０倍、７０～１００倍、７０～７５倍、８０～２５０倍、８０～２００倍、８０～１５０倍、８０～１００倍、９０～２５０倍、９０～２００倍、９０～１５０倍、９０～１００倍、１００～２５０倍、１００～２００倍、１００～１５０倍、６２．５倍、１２５倍、１８７．５倍、または２５０倍モル過剰の脂質を有する。
【0060】
高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ ＮＰ）シェル
ＨＤＬ様ナノ粒子（ＨＤＬナノ粒子ともいわれる）は、それらの形状、サイズ、および表面組成（例えば、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ、リン脂質）において天然の球状ＨＤＬを模倣する。本明細書中のナノ構造体はまた、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ）のようなタンパク質を含み得る。本明細書中のナノ構造体はまた、コレステロール豊富であり得る（例えば、コレステロールを含む構造を有し得る）。上記シェルは、内側表面（内葉ともいわれる）および外側表面（外葉ともいわれる）を有し得、その結果、治療剤および／もしくはアポリポタンパク質は、上記外側シェルに吸着され得る、ならびに／または上記シェルの内側表面と外側表面との間に組み込まれ得る。
ＨＤＬ様ナノ粒子（ＨＤＬナノ粒子ともいわれる）は、それらの形状、サイズ、および表面組成（例えば、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ、リン脂質）において天然の球状ＨＤＬを模倣する。本明細書中のナノ構造体はまた、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ）のようなタンパク質を含み得る。本明細書中のナノ構造体はまた、コレステロール豊富であり得る（例えば、コレステロールを含む構造を有し得る）。上記シェルは、内側表面（内葉ともいわれる）および外側表面（外葉ともいわれる）を有し得、その結果、治療剤および／もしくはアポリポタンパク質は、上記外側シェルに吸着され得る、ならびに／または上記シェルの内側表面と外側表面との間に組み込まれ得る。
【0061】
上記方法において使用され得るナノ構造体の例は、本明細書で記載され、ここで記載される。構造体、ナノ構造体、またはナノ粒子（例えば、合成構造体または合成ナノ構造体）は、コアおよび上記コアを取り囲むシェルを有する。上記コアがナノ構造体である実施形態において、上記コアは、１またはこれより多くの構成要素が必要に応じて結合され得る表面を含む。例えば、いくつかの場合に、上記コアは、シェルによって取り囲まれたナノ構造体であり、上記シェルは、内側表面および外側表面を含む。上記シェルは、少なくとも部分的に、互いとおよび／または上記コアの表面と必要に応じて会合し得る、１またはこれより多くの構成要素（例えば、複数の脂質）から形成され得る。例えば、構成要素は、上記コアに共有結合的に結合されるか、物理吸着されるか、化学吸着されるか、あるいはイオン相互作用、疎水性相互作用および／もしくは親水性相互作用、静電相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、またはこれらの組み合わせを通じて上記コアに結合されることによって、上記コアと会合され得る。１つの特定の実施形態において、上記コアは、金ナノ構造体を含み、上記シェルは、金－チオール結合を通じて、上記コアに結合される。
【0062】
多くの治療剤が、代表的には、ナノ構造体のシェルと会合される。例えば、少なくとも２０の治療剤が、１つの構造体あたりに会合され得る。概して少なくとも２０～３０、２０～４０、２０～５０、２５～３０、２５～４０、２５～５０、３０～４０、３０～５０、３５～４０、３５～５０、４０～４５、４０～５０、４５～５０、５０～１００、または３０～１００の治療剤が、１つの構造体あたりに会合され得る。
【0063】
必要に応じて、構成要素は、互いに架橋され得る。シェルの構成要素の架橋は、例えば、上記シェルへの、または上記シェルに対して外側の領域と上記シェルの内側の領域との間での、種の輸送の制御を可能にし得る。例えば、比較的多量の架橋は、ある特定の低分子が上記シェルの中にまたは上記シェルを通過することを可能にし得るが、大分子はそうでないのに対して、比較的少量の架橋または架橋無しでは、より大きな分子が上記シェルの中にまたは上記シェルを通過することが可能であり得る。さらに、上記シェルを形成する構成要素は、単層または多層の形態であり得、これはまた、分子の輸送または隔離を促進することも妨害することもできる。１つの例示的な実施形態において、上記シェルは、本明細書で記載されるように、コレステロールを隔離するおよび／または細胞からのコレステロール流出を制御するように配置された脂質二重層を含む。
【0064】
コアを取り囲むシェルが、上記コアを完全に取り囲む必要はないが、このような実施形態が、考えられ得かつ企図されることは、理解されるべきである。例えば、上記シェルは、コアの表面積のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％を取り囲み得る。いくつかの場合に、上記シェルは、コアを実質的に取り囲む。他の場合には、上記シェルは、コアを完全に取り囲む。上記シェルの構成要素は、上記コアの表面にわたっていくつかの場合には均一に、および他の場合には不均一に分布され得る。例えば、上記シェルは、いくつかの場合には、いかなる材料をも含まない部分（例えば、孔）を含み得る。望ましい場合には、上記シェルは、ある特定の分子および構成要素の、上記シェルの中または外への透過および／または輸送を可能にするように設計され得るが、他の分子および構成要素の上記シェルの中または外への透過および／または輸送を防止し得る。ある特定の分子が上記シェルの中および／または横断して透過および／または輸送される能力は、例えば、上記シェルを形成する構成要素の充填密度ならびに上記シェルを形成する構成要素の化学的および物理的特性に依存し得る。上記シェルは、１つの材料層、またはいくつかの実施形態において複数の材料層を含み得る。
【0065】
さらに、構造体のシェルは、任意の適切な厚みを有し得る。例えば、シェルの厚みは、少なくとも１０Å、少なくとも０．１ｎｍ、少なくとも１ｎｍ、少なくとも２ｎｍ、少なくとも５ｎｍ、少なくとも７ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１５ｎｍ、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ（例えば、上記シェルの最も内側の表面から最も外側の表面まで）であり得る。いくつかの場合に、シェルの厚みは、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１５ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、７ｎｍ未満、５ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、または１ｎｍ未満（例えば、上記シェルの最も内側の表面から最も外側の表面まで）である。このような厚みは、本明細書で記載されるとおりの分子を隔離する前または隔離した後に決定され得る。
【0066】
本明細書で記載される構造体のシェルは、任意の適切な材料（例えば、疎水性材料、親水性材料、および／または両親媒性材料）を含み得る。上記シェルは、１またはこれより多くの無機材料（例えば、上記ナノ構造体コアに関して上記で列挙されるもの）を含み得るが、多くの実施形態において、上記シェルは、有機材料（例えば、脂質またはある特定のポリマー）を含む。上記ナノ粒子の結合親和性は、コレステロールを（例えば、脂質単層または二重層の流動性を調節するために）含めることによってさらに変更され得る。
【0067】
実施形態の１セットにおいて、本明細書で記載される構造体またはその一部（例えば、構造体のシェル）は、１またはこれより多くの天然または合成の脂質または脂質アナログ（すなわち、親油性分子）を含む。１またはこれより多くの脂質および／または脂質アナログは、単一層（例えば、脂質一重層）または多数層（例えば、二重層、脂質二重層）の構造を形成し得る。多数層が形成されるいくつかの場合には、上記天然または合成の脂質または脂質アナログは、（例えば、異なる層間で）互いに組み合わさる（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅ）。天然または合成の脂質または脂質アナログの非限定的な例としては、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質およびポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合から得られる）、ならびにステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合から得られる）が挙げられる。
【0068】
いくつかの実施形態において、上記シェルは、ポリマーを含む。例えば、両親媒性ポリマーが使用され得る。上記ポリマーは、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマーなどであり得、例えば、ここで１つのブロックは疎水性ポリマーであり、別のブロックは親水性ポリマーである。例えば、上記ポリマーは、α－ヒドロキシ酸（例えば、乳酸）およびポリエチレングリコールのコポリマーであり得る。いくつかの場合に、シェルは、疎水性ポリマー（例えば、ある特定のアクリル、アミドおよびイミド、カーボネート、ジエン、エステル、エーテル、フルオロカーボン、オレフィン、スチレン、ビニルアセタール、ビニルおよびビニリデンクロリド、ビニルエステル、ビニルエーテルおよびケトン、ならびにビニルピリジンおよびビニルピロリドンポリマーを含み得るポリマー）を含む。他の場合には、シェルは、親水性ポリマー（例えば、ある特定のアクリル、アミン、エーテル、スチレン、ビニル酸、およびビニルアルコールを含むポリマー）を含む。上記ポリマーは、荷電されていても荷電されていなくてもよい。本明細書で注記されるように、上記シェルの特定の構成要素は、上記構造体の特定の機能性を付与するように選択され得る。
【0069】
ＲＮＡ
天然のＲＮＡ送達ビヒクルの合成模倣物を開発することは、非常に関心がもたれている。特に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、これらがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような内因性ＲＮＡと天然に結合し、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）をヌクレアーゼ分解に対して安定化し、それらを標的細胞に送達して、遺伝子発現を調節することから、魅力的である。ＲＮＡのＨＤＬ媒介性送達は、スカベンジャーレセプタータイプＢ－１（本明細書でＳＣＡＲＢ１および／またはＳＲ－Ｂ１ともいわれる）の標的細胞発現に依存する。スカベンジャーレセプタークラスＢ、タイプＩ（ＳＲ－ＢＩ）は、眼の組織を含む、多くの細胞タイプおよび組織において見出される膜内在性タンパク質である。それは、成熟物（例えば、表面にアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）を有する成熟ＨＤＬ）に関する高親和性レセプターである。ＳＲ－Ｂ１は、高密度リポタンパク質からのコレステリルエステルの取り込みを促進する。さらに、ＳＲ－Ｂ１は、脂溶性ビタミン取り込みにおいて極めて重要である。ＨＤＬに結合することに加えて、ＳＲ－Ｂ１は、広く種々のサイズのアニオン性分子およびリガンドに結合する。
天然のＲＮＡ送達ビヒクルの合成模倣物を開発することは、非常に関心がもたれている。特に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、これらがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような内因性ＲＮＡと天然に結合し、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）をヌクレアーゼ分解に対して安定化し、それらを標的細胞に送達して、遺伝子発現を調節することから、魅力的である。ＲＮＡのＨＤＬ媒介性送達は、スカベンジャーレセプタータイプＢ－１（本明細書でＳＣＡＲＢ１および／またはＳＲ－Ｂ１ともいわれる）の標的細胞発現に依存する。スカベンジャーレセプタークラスＢ、タイプＩ（ＳＲ－ＢＩ）は、眼の組織を含む、多くの細胞タイプおよび組織において見出される膜内在性タンパク質である。それは、成熟物（例えば、表面にアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）を有する成熟ＨＤＬ）に関する高親和性レセプターである。ＳＲ－Ｂ１は、高密度リポタンパク質からのコレステリルエステルの取り込みを促進する。さらに、ＳＲ－Ｂ１は、脂溶性ビタミン取り込みにおいて極めて重要である。ＨＤＬに結合することに加えて、ＳＲ－Ｂ１は、広く種々のサイズのアニオン性分子およびリガンドに結合する。
【0070】
用語「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」とは、本明細書で交換可能に使用され得るように、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の両方に影響を及ぼすことによって、多細胞生物における遺伝子発現の転写後調節に関与する、短い（例えば、長さが約２０～約２４ヌクレオチド）の非コードリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ｍｉＲＮＡは、タンパク質コードまたは非コードのいずれかであり得るキャップされ、ポリアデニル化された一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）の一部として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。その一次転写物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、長さがおよそ７０ヌクレオチドのステム－ループ前駆ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生成し、これは、ＲＮＡｉ経路においてさらに処理される。この経路の一部として、上記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、細胞質Ｄｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ＊）生成物を生成する。上記成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれ、これは、上記ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成（すなわち、部分的相補性）を通じて標的ｍＲＮＡを認識し、最も一般的には、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化を生じる。この機序は、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する上記ｍｉＲＮＡの結合を通じて最も頻繁に認められ、これは、翻訳を（例えば、翻訳のためにリボソームにアクセスすることを遮断することによって）阻害するか、または転写物の分解を直接的に引き起こすかのいずれかによって、遺伝子発現を減少させ得る。その用語（すなわち、ｍｉＲＮＡ）は、対象のｍｉＲＮＡ（例えば、前駆体、一次および／または成熟ｍｉＲＮＡ）のうちの任意の形態に対して本明細書で使用され得る。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１４６ａである。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲ－１４６ａは、配列番号１の配列を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－２０５である。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲ－２０５は、配列番号２の配列を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、単一のナノ構造体は、これに複合体化された２つの異なるタイプのＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）を有し、ここでＲＮＡ分子のタイプは、異なる機能（例えば、抗炎症性、血管新生抑制性）を有する。
【0071】
リン脂質
リン脂質は、疎水性脂肪酸鎖ならびにホスフェート基およびグリセロール分子を有する親水性ヘッドを含む脂質のクラスである。リン脂質は、種々の理由（改善されたバイオアベイラビリティー、低減された毒性および増大された膜透過性が挙げられるが、これらに限定されない）から、局所、経口および非経口薬物のリソソーム、エトソーム、および他のナノ製剤を調製するために広く使用されてきた。天然に存在するリン脂質は、２本の長鎖脂肪酸および塩基に連結されるリン酸ラジカルを含む脂肪様トリグリセリドである。それらは、全ての動物および植物細胞に、特に、脳、心臓、肝臓、卵黄、およびダイズに存在する。天然に存在するリン脂質の中で最も重要なリン脂質は、セファリンおよびレシチンであり、ここでコラミンまたはクオリン（ｑｕｏｌｉｎｅ）は、塩基として存在する。
リン脂質は、疎水性脂肪酸鎖ならびにホスフェート基およびグリセロール分子を有する親水性ヘッドを含む脂質のクラスである。リン脂質は、種々の理由（改善されたバイオアベイラビリティー、低減された毒性および増大された膜透過性が挙げられるが、これらに限定されない）から、局所、経口および非経口薬物のリソソーム、エトソーム、および他のナノ製剤を調製するために広く使用されてきた。天然に存在するリン脂質は、２本の長鎖脂肪酸および塩基に連結されるリン酸ラジカルを含む脂肪様トリグリセリドである。それらは、全ての動物および植物細胞に、特に、脳、心臓、肝臓、卵黄、およびダイズに存在する。天然に存在するリン脂質の中で最も重要なリン脂質は、セファリンおよびレシチンであり、ここでコラミンまたはクオリン（ｑｕｏｌｉｎｅ）は、塩基として存在する。
【0072】
リン脂質の非限定的な例としては、以下が挙げられる： １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β，γ－ジパルミトイル－α－レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、Ｎ－（２，３－ジ（９－（Ｚ）－オクタデセニルオキシ））－プロパ－１－イル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル－オレオイル－ホスファチジルコリン、ジステアロイル－ホスファチジルコリン、ステアロイル－パルミトイル－ホスファチジルコリン、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイル－ホスファチジルセリン、ジオレイル－ホスファチジルコリン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（１６：０ ＰＤＰ ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（１８：１ ＰＤＰ ＰＥ）、およびこれらの組み合わせまたは誘導体。
【0073】
薬学的組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのナノ構造体のうちのいずれか、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物に関する。本明細書で記載される場合、「薬学的組成物」または「薬学的に受容可能な」組成物は、１またはこれより多くの薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、キャリア、添加剤、および／または希釈剤）と一緒に製剤化された、本明細書で記載される構造体（例えば、ナノ構造体）のうちの１またはこれより多くの治療有効量を含む。本明細書で記載される任意の適切な構造体が、図面に関連して記載されるものを含め、このような薬学的組成物において使用され得ることは、理解されるべきである。いくつかの場合に、薬学的組成物における構造体は、無機材料を含むナノ構造体コアおよび上記ナノ構造体コアを実質的に取り囲みかつ結合したシェルを有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で開示されるとおりのナノ構造体のうちのいずれか、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物に関する。本明細書で記載される場合、「薬学的組成物」または「薬学的に受容可能な」組成物は、１またはこれより多くの薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、キャリア、添加剤、および／または希釈剤）と一緒に製剤化された、本明細書で記載される構造体（例えば、ナノ構造体）のうちの１またはこれより多くの治療有効量を含む。本明細書で記載される任意の適切な構造体が、図面に関連して記載されるものを含め、このような薬学的組成物において使用され得ることは、理解されるべきである。いくつかの場合に、薬学的組成物における構造体は、無機材料を含むナノ構造体コアおよび上記ナノ構造体コアを実質的に取り囲みかつ結合したシェルを有する。
【0074】
いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、液体またはゲル形態において製剤化される： 経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁物）、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による（例えば、滅菌液剤または懸濁物として）、または徐放製剤；局所適用（例えば、眼に適用されるクリーム剤、軟膏剤またはスプレーとして）；眼にまたは経皮的に。
【0075】
語句「薬学的に受容可能な」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触した状態での使用に適切であり、合理的な利益／リスク比と釣り合っている、それらの構造、材料、組成物、および／または投与形態に言及するために本明細書で使用される。
【0076】
語句「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書で使用される場合、本発明の化合物を１つの器官または身体の一部から、別の器官または身体の一部へと運ぶかまたは輸送することに関与する、薬学的に受容可能な材料、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または材料を被包する溶媒）を意味する。各キャリアは、製剤の他の成分と適合性であり、かつ患者に対して有害でないという意味において「受容可能」でなければならない。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；粉末化トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル）；アガー；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝化溶液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに薬学的製剤中で使用される他の非毒性適合性物質。
【0077】
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を有する。企図される薬学的に受容可能な賦形剤の非限定的な例としては、水、緩衝化生理食塩水、生理食塩水、水、乳酸化リンゲル液、細胞培養培地、血清、希釈血清、クリーム、ポリマー、およびヒドロゲルが挙げられる。
【0078】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤がまた、組成物中に存在し得る。
【0079】
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる：水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど）；および金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）。
【0080】
本明細書で記載される構造体は、経口投与され得る、非経口投与され得る、皮下投与され得る、および／または静脈内投与され得る。ある特定の実施形態において、構造体および薬学的調製物は、経口投与される。他の実施形態において、上記構造体または薬学的調製物は、静脈内投与される。代替の投与経路としては、舌下投与、筋肉内投与および経皮的投与が挙げられる。代替の投与経路としては、舌下投与、筋肉内投与、および経皮投与が挙げられる。
【0081】
単一投与形態を生成するためにキャリア物質と組み合わされ得る活性成分の量は、処置される宿主、および特定の投与様式に応じて変動する。単一投与形態を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般には、治療効果を生じる化合物の量である。概して、この量は、約１％～約９９％の活性成分、約５％～約７０％、または約１０％～約３０％の範囲に及ぶ。
【0082】
本明細書で記載される構造体の投与のための液体投与形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、分散物、懸濁物、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられ得る。本発明の構造体に加えて、上記液体投与形態は、当該分野で一般に使用される不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒のような）、可溶化剤および乳化剤、例えば、セチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。
【0083】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤のような補助物質を含み得る。
【0084】
懸濁物は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物として、懸濁剤を含み得る。
【0085】
本明細書で記載される構造体の局所または経皮的投与のための投与形態としては、散剤、スプレー、軟膏剤、パスタ剤、フォーム剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル、液剤、パッチ、滴注剤（ｄｒｏｐ）、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝化剤、またはプロペラントと、混合され得る。
【0086】
上記軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤およびゲルは、本発明の構造体に加えて、賦形剤（例えば、動物性および植物性の脂肪）、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物）を含み得る。本明細書で企図される眼用製剤は、眼用軟膏剤、点眼剤、散剤、液剤などを含む。
【0087】
非経口投与に適した本明細書で記載される薬学的組成物は、１またはこれより多くの薬学的に受容可能な無菌の等張性の水性または非水性の液剤、分散物、懸濁物もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射用液剤もしくは分散物に再構成され得る無菌の散剤と組み合わせて、１またはこれより多くの本発明の構造体を含み、上記組成物は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤、上記製剤を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
【0088】
本明細書で記載される薬学的組成物において使用され得る適切な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの任意の適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）、ならびに注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。
【0089】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助物質を含み得る。本発明の構造体上での微生物活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール ソルビン酸など）を含めることによって促進され得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を上記組成物に含めることはまた、望ましいことであり得る。さらに、上記注射用薬学的形態の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【0090】
本明細書で記載される構造体が医薬としてヒトおよび動物に投与される場合、それらは、それ自体で、または例えば、約０．１％～約９９．５％、約０．５％～約９０％などの構造体を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む薬学的組成物として与えられ得る。
【0091】
投与は、処置されるべき状態に依存して、局所的（例えば、特定の領域、生理学的系、組織、器官、または細胞タイプに）または全身的であり得る。例えば、上記組成物は、非経口的注射、移植物、経口、膣、直腸、口内、肺、局所的、鼻、経皮的、外科的な投与、または上記組成物による標的へのアクセスが達成される任意の他の投与方法を通じて、投与され得る。本発明とともに使用され得る非経口的モダリティーの例としては、静脈内、皮内、皮下、腔内、筋肉内、腹腔内、硬膜外、または髄腔内が挙げられる。移植物モダリティーの例としては、任意の移植可能なまたは注射可能な薬物送達システムが挙げられる。経口投与は、患者および投与スケジュールへの利便性のため、処置によっては有用であり得る。
【0092】
選択される投与経路にかかわらず、本明細書で記載される構造体（これは、適切な水和形態において使用され得る）および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に受容可能な投与形態へと製剤化される。
【0093】
本明細書で記載される組成物は、投与量において、例えば、いかなる潜在的に有害な副作用をも回避するかまたは最小化しながら最大量において与えられ得る。上記組成物は、単独で、または他の化合物と組み合わせて、有効量で投与され得る。例えば、がんを処置する場合、組成物は、本明細書で記載される構造体およびがんを処置するために使用され得る他の化合物のカクテルを含み得る。異常な脂質レベルと関連する状態を処置する場合には、組成物は、本明細書で記載される構造体および脂質レベルを低減するために使用され得る他の化合物（例えば、コレステロール降下剤）を含み得る。
【0094】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療有効量」は、患者に投与される場合に、処置されている疾患状態もしくは障害のための処置を提供するか、またはさもなければ所望の効果（例えば、効果的な免疫応答の誘導、疾患の症状の改善）を提供する、本発明のナノ構造体または組成物の量である。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、その化合物、疾患状態およびその重篤度、処置されるべき患者の年齢などに応じて変動する。治療有効量は、知識および本開示を考慮して、当業者によって慣用的に決定され得る。
【0095】
方法
好ましい実施形態において、本開示のナノ構造体は、局所的処置のためのものである。眼の疾患のための現在の局所的治療（例えば、点眼剤、眼用軟膏剤、およびゲル）は、前眼房へのそれらのペイロードのうちの約５％を送達するに過ぎず、角膜上皮には容易に入らない。本開示のナノ構造体（例えば、ＲＮＡ－ＴＬＰ）は、インビボで角膜上皮における細胞によって取り込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体および／または組成物は、局所適用のために製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体および／または組成物は、局所投与される。
好ましい実施形態において、本開示のナノ構造体は、局所的処置のためのものである。眼の疾患のための現在の局所的治療（例えば、点眼剤、眼用軟膏剤、およびゲル）は、前眼房へのそれらのペイロードのうちの約５％を送達するに過ぎず、角膜上皮には容易に入らない。本開示のナノ構造体（例えば、ＲＮＡ－ＴＬＰ）は、インビボで角膜上皮における細胞によって取り込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体および／または組成物は、局所適用のために製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのナノ構造体および／または組成物は、局所投与される。
【0096】
糖尿病に関する眼の治療
いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、糖尿病被験体における眼の障害または眼の疾患（例えば、糖尿病性角膜症）の処置のために使用され得る。糖尿病性角膜症は、糖尿病で起こる眼の合併症である。いくつかの実施形態において、上記眼の障害は、糖尿病性角膜症である。いくつかの実施形態において、上記眼の障害は、糖尿病網膜症である。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、炎症を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、ＮＦＫＢシグナル伝達を阻害するために使用される。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、眼の創傷を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、上記創傷は、角膜上皮に対する損傷を含む。いくつかの実施形態において、上記創傷は、角膜上皮を取り囲む組織に対する損傷を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体は、糖尿病被験体における眼の障害または眼の疾患（例えば、糖尿病性角膜症）の処置のために使用され得る。糖尿病性角膜症は、糖尿病で起こる眼の合併症である。いくつかの実施形態において、上記眼の障害は、糖尿病性角膜症である。いくつかの実施形態において、上記眼の障害は、糖尿病網膜症である。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、炎症を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、ＮＦＫＢシグナル伝達を阻害するために使用される。いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、眼の創傷を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、上記創傷は、角膜上皮に対する損傷を含む。いくつかの実施形態において、上記創傷は、角膜上皮を取り囲む組織に対する損傷を含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、本開示のナノ構造体および組成物は、眼の傷害または眼の感染症を有する被験体を処置するために使用される。いくつかの実施形態において、上記眼の障害、眼の傷害または眼の感染症は、それぞれ、角膜障害、角膜傷害、または角膜感染症である。
【0098】
眼の疾患および傷害は、糖尿病被験体において特に処置が困難である。その治癒プロセスはまた、眼の表面の上皮が損なわれている手術（例えば、硝子体切除術、水晶体摘出）後の糖尿病に関しては非常に困難である。角膜上皮創傷修復のプロセスは、糖尿病被験体において長くなることに加えて、彼らを感染症に攻撃されやすくし、これは、取り返しの付かない損傷を生じ得る。従来の処置方法は頻繁に、これらの問題に対処するにあたって効果がなかった。それらはまた、糖尿病に二次的な角膜治癒の遅れの根本的な病態生物学に対処できない。
【0099】
ナノ構造体の適用
本開示のナノ構造体は、他の局所的な眼の処置と比較して、眼において増大した取り込みを示す。ここでは、ＲＮＡ－ＴＬＰは、インビボで角膜上皮における細胞によって取り込まれることが示される。本開示のＨＤＬ－ＮＰおよびＲＮＡ－ＨＤＬ－ＮＰ（例えば、ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰ）は、眼の創傷（例えば、角膜上皮創傷）を治癒するための正の薬剤である。従って、ＨＤＬ－ＮＰまたはｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰのいずれかを含む局所的処置（例えば、点眼剤、眼用軟膏剤、およびゲル）は、本明細書で企図される。局所的処置は、企図されるように、創傷した角膜（例えば、裂傷を受けた角膜上皮）を処置するために有効である。
本開示のナノ構造体は、他の局所的な眼の処置と比較して、眼において増大した取り込みを示す。ここでは、ＲＮＡ－ＴＬＰは、インビボで角膜上皮における細胞によって取り込まれることが示される。本開示のＨＤＬ－ＮＰおよびＲＮＡ－ＨＤＬ－ＮＰ（例えば、ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰ）は、眼の創傷（例えば、角膜上皮創傷）を治癒するための正の薬剤である。従って、ＨＤＬ－ＮＰまたはｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰのいずれかを含む局所的処置（例えば、点眼剤、眼用軟膏剤、およびゲル）は、本明細書で企図される。局所的処置は、企図されるように、創傷した角膜（例えば、裂傷を受けた角膜上皮）を処置するために有効である。
【0100】
眼、好ましくは角膜上皮の疾患および傷害（例えば、ドライアイ、角膜炎、眼の感染症）から生じる炎症（すなわち、眼の炎症）を処置または防止するにあたって有効である、ＨＤＬ－ＮＰと複合体化された、抗炎症特性を有するＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ－１４６ａ）の使用がまた、本明細書で企図される。有効な抗炎症性ＲＮＡ複合体化ナノ構造体（例えば、ｍｉＲ－ＨＤＬ－ＮＰ）は、ステロイドが有する有害な副作用（例えば、角膜の菲薄化、緑内障の誘導）なしに、ステロイドとして機能する。
【0101】
角膜血管新生（これはしばしば、角膜の摂動後に起こり得る）を防止するにあたって有効である、ＨＤＬ－ＮＰと複合体化した血管新生抑制特性を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ－１８４）がまた企図される。
【0102】
本開示は、創傷治癒特性を示し、従って、現在利用可能でない糖尿病性角膜症のための処置（例えば、創傷治癒）として使用され得るナノ構造体と複合体化したＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を提供する。
【0103】
処置
本明細書で使用される場合、用語「処置する」とは、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の１もしくはこれより多くの症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、それらの発生を遅らせる、それらの進行を阻害する、それらの重篤度を低減する、ならびに／またはそれらの発生率を低減することを指す。例えば、がんを「処置する」は、腫瘍の生存、増殖、および／または拡がりを阻害することを指し得る。処置は、疾患、障害、および／もしくは状態と関連する病理を発生させるリスクを減少させる目的で、上記疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を示さない被験体に、ならびに／または上記疾患、障害、および／もしくは状態の早期の徴候のみを示す被験体に、投与され得る。いくつかの実施形態において、処置は、被験体への本発明の標的化粒子の送達を含む。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」とは、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の１もしくはこれより多くの症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、それらの発生を遅らせる、それらの進行を阻害する、それらの重篤度を低減する、ならびに／またはそれらの発生率を低減することを指す。例えば、がんを「処置する」は、腫瘍の生存、増殖、および／または拡がりを阻害することを指し得る。処置は、疾患、障害、および／もしくは状態と関連する病理を発生させるリスクを減少させる目的で、上記疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を示さない被験体に、ならびに／または上記疾患、障害、および／もしくは状態の早期の徴候のみを示す被験体に、投与され得る。いくつかの実施形態において、処置は、被験体への本発明の標的化粒子の送達を含む。
【0104】
被験体
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）、例えば、疾患または身体の状態（例えば、眼の疾患または障害である疾患または身体の状態のような）に罹りやすい可能性のある哺乳動物を指す。被験体または患者の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはモルモット）が挙げられる。被験体は、ある特定の疾患もしくは身体の状態と診断されたか、またはさもなければ疾患もしくは身体の状態を有することが既知である被験体であり得る。いくつかの実施形態において、被験体は、疾患もしくは身体の状態を発症していると診断され得るか、またはその発症のリスクがあることが既知であり得る。ある特定の実施形態において、被験体は、上記被験体において既知の疾患または身体の状態に基づいて処置のために選択され得る。いくつかの実施形態において、被験体は、上記被験体において疑われる疾患または身体の状態に基づいて処置のために選択され得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、疾患または身体の状態の発症を防止するために投与され得る。しかし、いくつかの実施形態において、既存の疾患または身体の状態の存在が疑われるが、未だ同定されていなくてもよく、本発明の組成物は、上記疾患または身体の状態のさらなる発症を診断または防止するために投与され得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）、例えば、疾患または身体の状態（例えば、眼の疾患または障害である疾患または身体の状態のような）に罹りやすい可能性のある哺乳動物を指す。被験体または患者の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはモルモット）が挙げられる。被験体は、ある特定の疾患もしくは身体の状態と診断されたか、またはさもなければ疾患もしくは身体の状態を有することが既知である被験体であり得る。いくつかの実施形態において、被験体は、疾患もしくは身体の状態を発症していると診断され得るか、またはその発症のリスクがあることが既知であり得る。ある特定の実施形態において、被験体は、上記被験体において既知の疾患または身体の状態に基づいて処置のために選択され得る。いくつかの実施形態において、被験体は、上記被験体において疑われる疾患または身体の状態に基づいて処置のために選択され得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、疾患または身体の状態の発症を防止するために投与され得る。しかし、いくつかの実施形態において、既存の疾患または身体の状態の存在が疑われるが、未だ同定されていなくてもよく、本発明の組成物は、上記疾患または身体の状態のさらなる発症を診断または防止するために投与され得る。
【0105】
さらに作り込むことなく、当業者は、上記の記載に基づいて、その完全な程度まで本発明を利用し得ると考えられる。従って、以下の具体的実施形態は、例証に過ぎないと解釈されるべきであり、本開示の残りをどのようにしても限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で言及される目的または主題に関して参考として援用される。
【実施例】
【0106】
実施例１： 金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）、テンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）、およびＲＮＡ－ＴＬＰの合成
金コアナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）を、標準的プロトコール（Ｐｉｅｌｌａら， ２０１６）を使用して合成する。約３．５ｎｍ Ａｕシードを、このＡｕシードを核化するように過剰のクエン酸ナトリウムおよび微量のタンニン酸中のテトラクロロ金酸によって合成する。テトラクロロ金酸および過剰のクエン酸ナトリウムをさらに添加すると、シード成長アプローチにおいて単分散性の５ｎｍ Ａｕ ＮＰが生じ、７０ｎＭの濃度を生じる。これらの５ｎｍ Ａｕ ＮＰの水性溶液を、ガラスバイアル中で５倍モル過剰の精製ヒトａｐｏＡ－Ｉと混合する。上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ混合物を、６０ｒｐｍの平底シェーカー上で１時間、室温（ＲＴ）においてインキュベートする。次に、クロロホルム（ＣＨＣｌ３， １ｍＭ）またはジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２， １ｍＭ）中に溶解した１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ－ＰＥ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を、上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ溶液に、上記Ａｕ ＮＰに対して２５０倍モル過剰において添加する。その溶液をボルテックスにかけ、続いて、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、またはＣＨＣｌ３（１ｍＭ）またはＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＭ）中に溶解したカルジオリピン（心臓、ウシ）（ＣＬ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）および１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（１８：２ ＰＧ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の１：１溶液を上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ／ＰＤＰ－ＰＥ溶液に、上記Ａｕ ＮＰに対して２５０倍モル過剰において添加し、上記溶液をボルテックスにかける。次に、ＣＨＣｌ３（１ｍＭ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＣＨ２Ｃｌ２に溶解したコレステロールを、上記Ａｕ ＮＰに対して２５倍モル過剰において添加する。上記混合物をボルテックスにかけ、短時間超音波処理（約２分間）すると、溶液は不透明で色が桃色になる。その得られる混合物を、約６５℃へと一定に撹拌しながら徐々に加熱してＣＨＣｌ３を蒸発させるかまたは約４０℃へと一定に撹拌しながら徐々に加熱してＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させてリン脂質を粒子表面上におよび水相へ移す（約２０分間）。上記反応は、その溶液が透明な赤色になると完了である。その得られるＴＬＰを、６０ｒｐｍの平底シェーカー上で一晩ＲＴにおいてインキュベートし、次いで、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ； ＫｒｏｓＦｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｉｉ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， モデル９００－１６１３）を介して精製および濃縮する。ＴＬＰを、使用するまで４℃で貯蔵する。上記ＴＬＰの濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（Ａｇｉｌｅｎｔ ９４５３）を使用して測定する。ここでＡｕ ＮＰはλｍａｘ＝５２０ｎｍの特徴的な吸収を有し、５ｎｍ Ａｕ ＮＰの吸光係数は９．６９６×１０６ Ｍ－１ｃｍ－１である。
金コアナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）を、標準的プロトコール（Ｐｉｅｌｌａら， ２０１６）を使用して合成する。約３．５ｎｍ Ａｕシードを、このＡｕシードを核化するように過剰のクエン酸ナトリウムおよび微量のタンニン酸中のテトラクロロ金酸によって合成する。テトラクロロ金酸および過剰のクエン酸ナトリウムをさらに添加すると、シード成長アプローチにおいて単分散性の５ｎｍ Ａｕ ＮＰが生じ、７０ｎＭの濃度を生じる。これらの５ｎｍ Ａｕ ＮＰの水性溶液を、ガラスバイアル中で５倍モル過剰の精製ヒトａｐｏＡ－Ｉと混合する。上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ混合物を、６０ｒｐｍの平底シェーカー上で１時間、室温（ＲＴ）においてインキュベートする。次に、クロロホルム（ＣＨＣｌ３， １ｍＭ）またはジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２， １ｍＭ）中に溶解した１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ－ＰＥ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を、上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ溶液に、上記Ａｕ ＮＰに対して２５０倍モル過剰において添加する。その溶液をボルテックスにかけ、続いて、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、またはＣＨＣｌ３（１ｍＭ）またはＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＭ）中に溶解したカルジオリピン（心臓、ウシ）（ＣＬ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）および１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（１８：２ ＰＧ； Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の１：１溶液を上記Ａｕ ＮＰ／ａｐｏＡ－Ｉ／ＰＤＰ－ＰＥ溶液に、上記Ａｕ ＮＰに対して２５０倍モル過剰において添加し、上記溶液をボルテックスにかける。次に、ＣＨＣｌ３（１ｍＭ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＣＨ２Ｃｌ２に溶解したコレステロールを、上記Ａｕ ＮＰに対して２５倍モル過剰において添加する。上記混合物をボルテックスにかけ、短時間超音波処理（約２分間）すると、溶液は不透明で色が桃色になる。その得られる混合物を、約６５℃へと一定に撹拌しながら徐々に加熱してＣＨＣｌ３を蒸発させるかまたは約４０℃へと一定に撹拌しながら徐々に加熱してＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させてリン脂質を粒子表面上におよび水相へ移す（約２０分間）。上記反応は、その溶液が透明な赤色になると完了である。その得られるＴＬＰを、６０ｒｐｍの平底シェーカー上で一晩ＲＴにおいてインキュベートし、次いで、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ； ＫｒｏｓＦｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｉｉ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， モデル９００－１６１３）を介して精製および濃縮する。ＴＬＰを、使用するまで４℃で貯蔵する。上記ＴＬＰの濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（Ａｇｉｌｅｎｔ ９４５３）を使用して測定する。ここでＡｕ ＮＰはλｍａｘ＝５２０ｎｍの特徴的な吸収を有し、５ｎｍ Ａｕ ＮＰの吸光係数は９．６９６×１０６ Ｍ－１ｃｍ－１である。
【0107】
例示的なＲＮＡ－ＴＬＰを合成するために、ＲＮＡおよび１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を、先ず混合した。ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－１４６ａ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ－２１０またはコントロール（Ｃｔｒｌ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の個々のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ配列を、ヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁した（最終５００μＭ）。次いで、相補的な対を、各ＲＮＡ配列の２５倍モル過剰（１つのＲＮＡ配列につき最終２．５μＭ）において、ＴＬＰ（１００ｎＭ）への直接付加を可能にする濃度で、ヌクレアーゼ非含有水中で混合した。次いで、ＤＯＴＡＰのエタノール（ＥｔＯＨ）溶液を、上記ＲＮＡに対して４０倍モル過剰において添加した。ＤＯＴＡＰおよびＲＮＡの混合物を、短時間超音波処理し、ボルテックスにかけ（×３）、次いで、ＲＴにおいて１５分間インキュベートし、その後、水中１００ｎＭ ＴＬＰの溶液に添加した。上記ＤＯＴＡＰ－ＲＮＡ混合物を上記ＴＬＰに添加した後、溶媒混合物は、９：１、水：ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）である。この溶液を、６０ｒｐｍの平底シェーカー上で一晩ＲＴにおいてインキュベートした。得られるＲＮＡ－ＴＬＰを、遠心分離（１５，８７０×ｇ、５０分間）を介して精製した。結合していない出発材料を有する上清のうちの大部分を、除去する。得られたペレットを、短時間超音波処理して溶液に戻し、この材料を濃縮ＲＮＡ－ＴＬＰとして１本のチューブの中で合わせた。上記ＲＮＡ－ＴＬＰの濃度を、ＴＬＰに関して記載されるように計算した。ＲＮＡ－ＴＬＰに関しては、λｍａｘ＝２６０ｎｍにおける強い吸収から、ＲＮＡの存在が確認された。上記ＲＮＡ対のうちの一方の鎖のみで合成した粒子に関して、その合成手順を同様に進めた；しかし、上記ＲＮＡの量の２倍を、上記ＴＬＰに添加した（最終５μＭ）。
【0108】
実施例２： ｍｉＲ－２０５ ＨＤＬ－ＮＰは、ＨＣＥＣにおいてＳＨＩＰ２を標的化する
ｍｉＲ－２０５は、上皮細胞において脂質ホスファターゼＳＨＩＰ２を負に調節し、Ａｋｔシグナル伝達の活性化をもたらした。ＳＨＩＰ２は、上皮への細胞移動を制限する。ＳＨＩＰ２を抑制することによって、ｍｉＲ－２０５は、コフィリン活性化を介して上皮移動を促進する。ここでは、１本鎖ｍｉＲ－２０５摸倣物を、ＨＤＬ－ＮＰに複合体化し、ＨＣＥＣを、上記ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰに４８時間曝した。陰性粒子と比較して、ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰは、５０ｎＭにおいてＳＨＩＰ２を減少させ、ｐ－Ａｋｔを増大させた（図６Ｆ）。
ｍｉＲ－２０５は、上皮細胞において脂質ホスファターゼＳＨＩＰ２を負に調節し、Ａｋｔシグナル伝達の活性化をもたらした。ＳＨＩＰ２は、上皮への細胞移動を制限する。ＳＨＩＰ２を抑制することによって、ｍｉＲ－２０５は、コフィリン活性化を介して上皮移動を促進する。ここでは、１本鎖ｍｉＲ－２０５摸倣物を、ＨＤＬ－ＮＰに複合体化し、ＨＣＥＣを、上記ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰに４８時間曝した。陰性粒子と比較して、ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰは、５０ｎＭにおいてＳＨＩＰ２を減少させ、ｐ－Ａｋｔを増大させた（図６Ｆ）。
【0109】
実施例３： ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰは、擦過傷を迅速にシールする。
直線状の擦過傷を、０．３ｍＭ Ｃａ＋２中でコンフルエントになるまで増殖させ、マイトマイシン処理した角膜上皮細胞株（ｈＴＣＥｐｉ）に作製した。細胞を、コントロールまたはｍｉＲ－２０５ ＨＤＬ－ＮＰの１０ｎｍ溶液で処理し、画像化し、Ｎｉｋｏｎ Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎで分析した。ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰ処理したｈＴＣＥｐｉ細胞は、６時間で創傷を完全にシールしたのに対して、コントロールＨＤＬ－ＮＰ処理したｈＴＣＥｐｉ細胞は、１８時間で創傷をシールした（図７および８）。
直線状の擦過傷を、０．３ｍＭ Ｃａ＋２中でコンフルエントになるまで増殖させ、マイトマイシン処理した角膜上皮細胞株（ｈＴＣＥｐｉ）に作製した。細胞を、コントロールまたはｍｉＲ－２０５ ＨＤＬ－ＮＰの１０ｎｍ溶液で処理し、画像化し、Ｎｉｋｏｎ Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎで分析した。ｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰ処理したｈＴＣＥｐｉ細胞は、６時間で創傷を完全にシールしたのに対して、コントロールＨＤＬ－ＮＰ処理したｈＴＣＥｐｉ細胞は、１８時間で創傷をシールした（図７および８）。
【0110】
実施例４： ｍｉＲ－１４６ａ－ＨＤＬ－ＮＰは、ＮＦ－κＢ活性を低減する
ｍｉＲ－１４６ａは、角膜縁上皮（ＬＥＣ）維持において役割を果たすが、角膜上皮最終分化においてはそうではない。それは、糖尿病ＬＥＣにおいてアップレギュレートされ、糖尿病角膜縁上皮および角膜上皮細胞において細胞移動および創傷閉鎖を遅らせる。さらに、それは、ＮＦ－κＢによって調節される炎症促進性シグナル伝達の重要な遺伝子メディエーターであると考えられる。マウスＪ７７４．１マクロファージは、ＮＦ－κＢコンセンサス転写応答エレメントの下流に分泌型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子を有する。
ｍｉＲ－１４６ａは、角膜縁上皮（ＬＥＣ）維持において役割を果たすが、角膜上皮最終分化においてはそうではない。それは、糖尿病ＬＥＣにおいてアップレギュレートされ、糖尿病角膜縁上皮および角膜上皮細胞において細胞移動および創傷閉鎖を遅らせる。さらに、それは、ＮＦ－κＢによって調節される炎症促進性シグナル伝達の重要な遺伝子メディエーターであると考えられる。マウスＪ７７４．１マクロファージは、ＮＦ－κＢコンセンサス転写応答エレメントの下流に分泌型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子を有する。
【0111】
ここでは、ｍｉＲ－１４６ａ摸倣物を、ＨＤＬ－ＮＰに複合体化し、Ｊ７７４．１マウスマクロファージをｍｉＲ－１４６ａ－ＨＤＬ－ＮＰに曝した（４．５時間）。ＬＰＳを追加した後、Ｑｕａｎｔ Ｂ比色アッセイを使用して、分泌型ＡＰに関して、細胞培養培地をサンプリングすることによって、ＮＦ－κＢ活性を定量した。ｍｉＲ１４６ａを有するＨＤＬ－ＮＰは、ＬＰＳ誘導性分泌型ＡＰのシグナルを有意に低減した（図９）。
【0112】
実施例５： ＨＤＬ－ＮＰの局所適用は、摂動されていない眼の表面に透過し得る
ここでは、３μｌのＣｙ－３タグ化ＨＤＬ－ＮＰ（ＰＢＳ中１μＭ）を、無傷の創傷のない角膜に、３０分ごとに４時間にわたって局所適用した。処置後２４時間で眼を採取し、ＯＣＴにおいて包埋し、切片化し、蛍光顕微鏡で見た（図１０および１１Ａ～１１Ｂ）。
ここでは、３μｌのＣｙ－３タグ化ＨＤＬ－ＮＰ（ＰＢＳ中１μＭ）を、無傷の創傷のない角膜に、３０分ごとに４時間にわたって局所適用した。処置後２４時間で眼を採取し、ＯＣＴにおいて包埋し、切片化し、蛍光顕微鏡で見た（図１０および１１Ａ～１１Ｂ）。
【0113】
実施例６： ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰは、インビボで生物学的活性を示す
ｍｉＲ－２０５は、Ａｋｔシグナル伝達を部分的に介する角膜上皮創傷治癒の正の調節因子である。ＨＤＬは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を介して、増殖、移動および「管」形成を促進することによって、内皮細胞治癒に寄与する。ＨＤＬ－ａｐｏＡ－Ｉは、ヒト大動脈内皮細胞におけるアンギオポエチン様４遺伝子を誘導した。これは、Ａｋｔシグナル伝達のインヒビターによって遮断できた。ＨＤＬおよびｍｉＲ－２０５は、同じシグナル伝達経路を活性化することから、臨床評価を介してｍｉＲ－２０５の任意の付加的な効果を検出することは困難である。
ｍｉＲ－２０５は、Ａｋｔシグナル伝達を部分的に介する角膜上皮創傷治癒の正の調節因子である。ＨＤＬは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を介して、増殖、移動および「管」形成を促進することによって、内皮細胞治癒に寄与する。ＨＤＬ－ａｐｏＡ－Ｉは、ヒト大動脈内皮細胞におけるアンギオポエチン様４遺伝子を誘導した。これは、Ａｋｔシグナル伝達のインヒビターによって遮断できた。ＨＤＬおよびｍｉＲ－２０５は、同じシグナル伝達経路を活性化することから、臨床評価を介してｍｉＲ－２０５の任意の付加的な効果を検出することは困難である。
【0114】
ここで、食事誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスに麻酔をかけ、中心角膜上皮の１ｍｍ領域を、回転式ダイアモンド刃で除去した。創傷の直後に、マウス（８）は、１μｌのｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰ溶液（ＰＢＳ中１μモル）または混合ｍｉＲ－ＨＤＬ－ＮＰ溶液を局所的に、３０分ごとに２時間にわたって受容した。治癒の程度を、２％ フルオレセイン染色を使用して臨床的にモニターし、上皮治癒の速度を、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．５）で創傷サイズを測定することによって評価した。ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰは、インビボで生物学的活性を示すことが見出された。スクランブルしたｍｉＲ－ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰはともに、創傷治癒に対して明確な効果を示す（図１２Ａ～１２Ｄ）。
【0115】
結論
合成の機能的ＨＤＬ－ＮＰは、ｍｉＲＮＡを初代ヒト角膜上皮細胞、マクロファージ細胞株および角膜輪部／角膜の無傷の組織に送達できる。スクランブルしたｍｉＲ－ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰはともに、糖尿病マウスの角膜上皮における創傷治癒に対して明確な効果を有する。これらの所見は、正常および病的な状況における角膜表面へのｍｉＲＮＡ送達に基づく革新的な処置レジメンの基礎を提供する。１つのこのような処置選択肢は、生物学的プロセス（例えば、血管新生および炎症）に同時に影響を及ぼすために、２つのｍｉＲＮＡを有する「超」ｍｉＲＮＡ－ＨＤＬ－ＮＰ眼処置（例えば、点眼剤）の開発である。
合成の機能的ＨＤＬ－ＮＰは、ｍｉＲＮＡを初代ヒト角膜上皮細胞、マクロファージ細胞株および角膜輪部／角膜の無傷の組織に送達できる。スクランブルしたｍｉＲ－ＨＤＬ－ＮＰおよびｍｉＲ－２０５－ＨＤＬ－ＮＰはともに、糖尿病マウスの角膜上皮における創傷治癒に対して明確な効果を有する。これらの所見は、正常および病的な状況における角膜表面へのｍｉＲＮＡ送達に基づく革新的な処置レジメンの基礎を提供する。１つのこのような処置選択肢は、生物学的プロセス（例えば、血管新生および炎症）に同時に影響を及ぼすために、２つのｍｉＲＮＡを有する「超」ｍｉＲＮＡ－ＨＤＬ－ＮＰ眼処置（例えば、点眼剤）の開発である。
【0116】
例示的配列
この表は、本明細書によって開示されるとおりのいくつかの例示的配列を示すが、限定ではない。本明細書は、テキストファイルとしてＡＳＣＩＩフォーマットで、本明細書と同時に提出された配列表を含む。この配列表およびその中に含まれる情報の全ては、明示的に本明細書に援用され、提出時の本明細書の一部を構成する。
この表は、本明細書によって開示されるとおりのいくつかの例示的配列を示すが、限定ではない。本明細書は、テキストファイルとしてＡＳＣＩＩフォーマットで、本明細書と同時に提出された配列表を含む。この配列表およびその中に含まれる情報の全ては、明示的に本明細書に援用され、提出時の本明細書の一部を構成する。
【0117】
【表1】
【0118】
他の実施形態
実施形態１． ナノ構造体であって、前記ナノ構造体は、
コア、アポリポタンパク質、前記コアに結合した脂質シェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含み、ここで前記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む、構造体。
実施形態１． ナノ構造体であって、前記ナノ構造体は、
コア、アポリポタンパク質、前記コアに結合した脂質シェルを含む高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を含み、ここで前記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む、構造体。
【0119】
実施形態２． コア、アポリポタンパク質、前記コアに結合したシェルを含むテンプレート化リポタンパク質粒子（ＴＬＰ）を含むナノ構造体であって、ここで前記脂質シェルは、リン脂質および前記リン脂質と会合しているＲＮＡ分子を含む、ナノ構造体。
【0120】
実施形態３． 前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである、実施形態１～２のいずれか１つに記載のナノ構造体。
【0121】
実施形態４． コレステロールをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のナノ構造体。
【0122】
実施形態５． 前記ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のナノ構造体。
【0123】
実施形態６． 前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２０５またはｍｉＲ－１４６ａである、実施形態５に記載のナノ構造体。
【0124】
実施形態７． 実施形態１～６のいずれか１つに記載のナノ構造体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【0125】
実施形態８． 眼の障害を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、
実施形態１～７のいずれか１つに記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の障害を処置する工程、
を包含する方法。
実施形態１～７のいずれか１つに記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の障害を処置する工程、
を包含する方法。
【0126】
実施形態９． 眼の傷害または眼の感染症を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、
実施形態１～７のいずれか１つに記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の傷害または感染症を処置する工程、
を包含する方法。
実施形態１～７のいずれか１つに記載のナノ構造体を、有効量において前記被験体に投与し、それによって、前記眼の傷害または感染症を処置する工程、
を包含する方法。
【0127】
実施形態１０． 前記眼の障害、眼の傷害または眼の感染症は、それぞれ、角膜障害、角膜傷害、または角膜感染症である、実施形態８～９のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
実施形態１１． 前記眼の障害は、糖尿病性角膜症である、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態１２． 前記投与は局所である、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
実施形態１３． 前記被験体は、哺乳動物である、実施形態８～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0131】
実施形態１４． 前記被験体はヒトである、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0132】
本明細書で開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせられ得る。本明細書で開示される各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に役立つ代替の特徴によって置き換えられ得る。従って、別段明示的に述べられなければ、開示される各特徴は、一般的な一連の等価なまたは類似の特徴の例に過ぎない。
【0133】
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用法および条件に適合させるために、本発明に対して種々の変更および改変を行い得る。従って、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
【0134】
均等物
いくつかの本発明の実施形態が、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を果たすならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１もしくはこれより多くを得るために、種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書で記載される発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および構成は例示であることが意味され、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される具体的適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書で記載される具体的な発明の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認し得る。従って、前述の実施形態が、例示によって示されるに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の実施形態が、具体的に記載され、特許請求されるとおり以外の別の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。さらに、２またはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しなければ、本開示の発明の実施形態の発明の範囲内に含まれる。
いくつかの本発明の実施形態が、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を果たすならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１もしくはこれより多くを得るために、種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書で記載される発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および構成は例示であることが意味され、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される具体的適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書で記載される具体的な発明の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認し得る。従って、前述の実施形態が、例示によって示されるに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の実施形態が、具体的に記載され、特許請求されるとおり以外の別の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。さらに、２またはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しなければ、本開示の発明の実施形態の発明の範囲内に含まれる。
【0135】
全ての定義は、本明細書で定義および使用される場合、辞書の定義、参考として援用される文書中の定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先されることは、理解されるべきである。
【0136】
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用され、いくらかの場合には、その文書の全体を包含し得る主題に関して参考として援用される。
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、明らかに逆に示されなければ、「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味することが理解されるべきである。
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、明らかに逆に示されなければ、「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味することが理解されるべきである。
【0137】
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ ｏｒ ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくらかの場合には接続的に示され、他の場合には離節的に示される要素を意味することが理解されるべきである。「および／または」とともに列挙される多数の要素は、同じ様式において、すなわち、そのように結合された要素の「１またはこれより多くの（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」と解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」の文節によって具体的に特製される要素以外に、それらの具体的に特定される要素に関連しようが関連しまいが、必要に応じて存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制限のない文言とともに使用される場合、１つの実施形態では、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）に；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）に；他に言及し得る。
【0138】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有することが理解されるべきである。例えば、リストの中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち、多くの要素または要素のリスト、および必要に応じて、さらなる列挙されない項目のうちの少なくとも１を含むが、１より多くをも含むとして解釈されるものとする。「のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲の中で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のような、逆を明らかに示す用語のみが、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことに言及する。概して、用語「または」は、本明細書で使用される場合、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、」「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」のような排他性の用語が先立つ場合、排他的な代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ ｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｏｔｈ）」）を示すとして解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の中で使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【0139】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、語句「少なくとも１」は、１またはこれより多くの要素のリストに言及して、要素のリストの中の要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストの中の要素の任意の組み合わせを排除しないことを意味することが理解されるべきである。この定義はまた、語句「少なくとも１」が言及する要素のリスト内で具体的に同定される要素以外の要素が、それら具体的に特定される要素に関連しようが関連しまいが、必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａ、Ｂは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂ、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）に；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａおよび少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂ（必要に応じて、他の要素を含む）に；他に言及し得る。
【0140】
明確に逆に示されなければ、１より多くの工程または行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、上記方法の工程または行為の順序は、上記方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことがまた、理解されるべきである。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図16-6】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】