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特表2022-529631デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための大きい突然変異ホットスポットのＡＡＶベクター媒介欠失
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(54)【発明の名称】デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための大きい突然変異ホットスポットのＡＡＶベクター媒介欠失
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220616BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220616BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220616BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220616BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220616BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220616BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220616BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220616BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220616BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220616BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220616BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220616BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/113 Z
C12Q1/02
A61P21/04
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K38/17
A61K31/7105
A61K35/76
A61K35/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560849
(86)(22)【出願日】2020-04-14
(85)【翻訳文提出日】2021-12-08
(86)【国際出願番号】 US2020028148
(87)【国際公開番号】W WO2020214609
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】62/833,760
(32)【優先日】2019-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】ゲルスバッハ チャールズ エイ
(72)【発明者】
【氏名】ブラクラック カレン
(72)【発明者】
【氏名】ロビンソン－ハム ジャクリーン エヌ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA08
4B063QQ08
4B063QR14
4B063QR35
4B063QS34
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA18
4C084DC22
4C084MA02
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA65
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA94
4C086ZB21
4C087AA01
4C087BB65
4C087BC83
4C087MA02
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA94
4C087ZB21
(57)【要約】
遺伝子編集によるヒトジストロフィン遺伝子の補正のための治療標的および使用方法が、本明細書において開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ジストロフィンのイントロン４４を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、（ｂ）ジストロフィンのイントロン５５を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、
（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質、および
（ｄ）１つまたは複数のＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場
を含む組成物をコードする１種または複数種のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
【請求項2】
単一のベクターを含む、請求項１に記載の系。
【請求項3】
２種以上のベクターを含み、２種以上のベクターが、第１のベクターおよび第２のベクターを含む、請求項１に記載の系。
【請求項4】
（ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、
請求項３に記載の系。
【請求項5】
（ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、第２のｇＲＮＡ分子をコードする、
請求項３に記載の系。
【請求項6】
第１のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、請求項５に記載の系。
【請求項7】
第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、請求項５または６に記載の系。
【請求項8】
Ｃａｓ９タンパク質の発現が、構成的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターによって駆動される、請求項１～７のいずれか１項に記載の系。
【請求項9】
筋肉特異的プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターまたはＳｐｃ５１２プロモーターを含む、請求項８に記載の系。
【請求項10】
単一のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質をコードする、請求項２に記載の系。
【請求項11】
ベクターが、少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の系。
【請求項12】
両方向性プロモーターが、第１のｇＲＮＡ分子および／または第２のｇＲＮＡ分子の発現を駆動する第１のプロモーターと、
Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する第２のプロモーターと
を含む、請求項１１に記載の系。
【請求項13】
第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の系。
【請求項14】
第２のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の系。
【請求項15】
Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質またはＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の系。
【請求項16】
Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の系。
【請求項17】
ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、配列番号４のポリヌクレオチドを含むか、または配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１６に記載の系。
【請求項18】
Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＳａＣａｓ９タンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の系。
【請求項19】
ベクターが、配列番号１～１３および２４から選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の系。
【請求項20】
ベクターが、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の系。
【請求項21】
ベクターが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９および配列番号３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の系。
【請求項22】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の系。
【請求項23】
ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の系。
【請求項24】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３またはＡＡＶｒｈ．７４である、請求項２３に記載の系。
【請求項25】
ベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される遍在性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の系。
【請求項26】
組織特異的プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項２５に記載の系。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか１項に記載の系を含む細胞。
【請求項28】
請求項１～２６のいずれか１項に記載の系を含むキット。
【請求項29】
細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子を補正する方法であって、請求項１～２６のいずれか１項に記載の系を細胞に投与することを含む方法。
【請求項30】
対象における突然変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、請求項１～２６のいずれか１項に記載の系または請求項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
【請求項31】
突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象を処置する方法であって、請求項１～２６のいずれか１項に記載の系または請求項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
【請求項32】
系または細胞が、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与される、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３３，７６０号の優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金Ｒ０１ＡＲ０６９０８５の下で、政府支援によってなされたものである。政府は、本発明において、ある種の権利を有する。
本開示は、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベース系およびウイルス送達系を用いた遺伝子発現変更、ゲノム操作、および遺伝子のゲノム変更の分野に関する。また、本開示は、骨格筋および心筋等の筋肉におけるゲノム操作および遺伝子のゲノム変更の分野にも関する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３３，７６０号の優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金Ｒ０１ＡＲ０６９０８５の下で、政府支援によってなされたものである。政府は、本発明において、ある種の権利を有する。
本開示は、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベース系およびウイルス送達系を用いた遺伝子発現変更、ゲノム操作、および遺伝子のゲノム変更の分野に関する。また、本開示は、骨格筋および心筋等の筋肉におけるゲノム操作および遺伝子のゲノム変更の分野にも関する。
【背景技術】
【0002】
序文
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用され得る。このＤＮＡ開裂によって、２つの可能な修復経路の内の１つをもたらす自然のＤＮＡ修復機構の刺激が行われる。ドナー鋳型がない場合、切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、すなわち、ＤＮＡの小さい挿入または欠失をもたらすエラープローン修復経路によって修復される。この方法は、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊する、欠失させる、または変更するために使用され得る。しかし、ドナー鋳型がヌクレアーゼと共に提供される場合、細胞機構は、ＤＮＡ開裂がある場合に数桁増強される相同的組換えによって切断を修復する。この方法は、標的部位においてＤＮＡ配列の特異的変化を導入するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼが、様々なヒトの幹細胞および細胞系における遺伝子編集のために、およびマウス肝臓における遺伝子編集のために使用されてきた。しかし、これらの技術の実施の主要なハードルは、効果的で、効率的で、かつ成功したゲノム修飾を容易にする方法でインビボにおける特定の組織に送達することである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用され得る。このＤＮＡ開裂によって、２つの可能な修復経路の内の１つをもたらす自然のＤＮＡ修復機構の刺激が行われる。ドナー鋳型がない場合、切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、すなわち、ＤＮＡの小さい挿入または欠失をもたらすエラープローン修復経路によって修復される。この方法は、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊する、欠失させる、または変更するために使用され得る。しかし、ドナー鋳型がヌクレアーゼと共に提供される場合、細胞機構は、ＤＮＡ開裂がある場合に数桁増強される相同的組換えによって切断を修復する。この方法は、標的部位においてＤＮＡ配列の特異的変化を導入するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼが、様々なヒトの幹細胞および細胞系における遺伝子編集のために、およびマウス肝臓における遺伝子編集のために使用されてきた。しかし、これらの技術の実施の主要なハードルは、効果的で、効率的で、かつ成功したゲノム修飾を容易にする方法でインビボにおける特定の組織に送達することである。
【0003】
遺伝性遺伝子疾患は、米国における小児に対して壊滅的な影響を及ぼす。これらの疾患は、現在治療法がなく、症状を緩和する試みによって管理され得るだけである。何十年も、遺伝子治療の分野には、これらの疾患に対する治療法の見込みがあった。しかし、治療遺伝子の細胞および患者への安全でかつ効率的な送達に関する技術的ハードルによって、この手法は限定されてきた。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋肉消耗、歩行運動の喪失、および、典型的には、機能的ジストロフィンの喪失による人生の３０代における死亡によって臨床的に特徴付けられる致死的遺伝子疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子における遺伝性または特発性の突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすほとんどの突然変異は、翻訳リーディングフレームをフレーム外に押し出すエキソンの欠失の結果である。大部分のＤＭＤ突然変異は、リーディングフレームをシフトさせ、かつ完全長転写物の発現を終了させるその７９のエキソンの内の１つまたは複数の欠失（約６８％）である。欠失は、ほとんどの場合、エキソン２～２０（全ての欠失の約１／３）およびエキソン４５～５５（全ての欠失の約２／３）を包含する遺伝子の２つの「ホットスポット」内で生じる。ジストロフィン遺伝子の４５～５５の全領域の自然発生インフレーム欠失があるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）患者は、遅発性の疾患の発症および最小限の骨格筋の病状を示す。
ジストロフィンは、筋細胞の統合性および機能の調節を担うタンパク質複合体の主要な成分である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児期の間に自身を身体的に支持する能力を喪失し、１０代の間に進行性により衰弱し、２０代で死亡する。ＤＭＤに対する現行の実験的な遺伝子治療戦略は、一時的な遺伝子送達ビヒクルの反復投与を必要とするか、またはゲノムＤＮＡ内への外来遺伝子材料の永続的な組み込みに依存する。これらの方法の両方とも、重篤な安全性の懸念がある。さらに、これらの戦略は、大きく、かつ複合したジストロフィン遺伝子配列を送達することができないことによって限定されてきた。ジストロフィン遺伝子に突然変異がある患者を補正し、処置するための、より精密で、かつ効率的な遺伝子編集ツールの必要性が残っている。
ジストロフィンは、筋細胞の統合性および機能の調節を担うタンパク質複合体の主要な成分である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児期の間に自身を身体的に支持する能力を喪失し、１０代の間に進行性により衰弱し、２０代で死亡する。ＤＭＤに対する現行の実験的な遺伝子治療戦略は、一時的な遺伝子送達ビヒクルの反復投与を必要とするか、またはゲノムＤＮＡ内への外来遺伝子材料の永続的な組み込みに依存する。これらの方法の両方とも、重篤な安全性の懸念がある。さらに、これらの戦略は、大きく、かつ複合したジストロフィン遺伝子配列を送達することができないことによって限定されてきた。ジストロフィン遺伝子に突然変異がある患者を補正し、処置するための、より精密で、かつ効率的な遺伝子編集ツールの必要性が残っている。
【発明の概要】
【0004】
態様において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に関する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、（ａ）ジストロフィンのイントロン４４を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、（ｂ）ジストロフィンのイントロン５５を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質、および（ｄ）１つまたは複数のＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場を含む組成物をコードする１種または複数種のベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、系は、単一のベクターを含む。いくつかの実施形態において、系は、２種以上のベクターを含み、種以上のベクターは、第１のベクターおよび第２のベクターを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）第１のベクターは、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、（ａ）第１のベクターは、第１のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターは、第２のｇＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態において、第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターまたはＳｐｃ５１２プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、単一のベクターは、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、両方向性プロモーターは、第１のｇＲＮＡ分子および／または第２のｇＲＮＡ分子の発現を駆動する第１のプロモーターと、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する第２のプロモーターとを含む。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする。いくつかの実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質またはＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ足場は、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場である。いくつかの実施形態において、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場は、配列番号４のポリヌクレオチドを含むか、または配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＳａＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１～１３および２４から選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９および配列番号３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３またはＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかの実施形態において、ベクターは、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される遍在性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは筋肉特異的プロモーターである。
【0005】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載の系を含む細胞に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の系を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子を補正する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の系を細胞に投与することを含んでもよい。
本開示の別の態様は、対象における突然変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の系または細胞を対象に投与することを含んでもよい。系または細胞は、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与されてもよい。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の系を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子を補正する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の系を細胞に投与することを含んでもよい。
本開示の別の態様は、対象における突然変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の系または細胞を対象に投与することを含んでもよい。系または細胞は、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与されてもよい。
【0006】
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の系または細胞を対象に投与することを含んでもよい。系または細胞は、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与されてもよい。
本開示は、以下の詳細な説明および添付の図に鑑みて明らかとなる他の態様および実施形態を提供する。
本開示は、以下の詳細な説明および添付の図に鑑みて明らかとなる他の態様および実施形態を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ジストロフィンにおける欠失を起こしやすい２つのホットスポットを示す。ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤと称されてもよい）は、ヒトにおける最も大きい知られた遺伝子である（２．３Ｍｂｐ）。突然変異の約６８％は、フレームシフトエラーをもたらす大きいエキソン欠失である。
【図2】エキソン４５～エキソン５５の突然変異ホットスポットに関する詳細を示す。全てのＤＭＤ突然変異の約４５％および多くの一般に欠失した単一エキソンは、この領域内に位置する。エキソン４５～５５のインフレーム欠失の患者は、より軽度のジストロフィー表現型を示す。ＡＯＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、この領域内におけるエキソンスキッピングを誘導するために用いられてきた。
【図3】ジストロフィンのエキソン４５～５５の切除を示す。この系は、エキソン５２の欠失があるヒト遺伝子を有するヒト化マウスにおいて試験されている。
【図4】新生仔マウスにおけるジストロフィンのエキソン４５～５５を切除するための系の注射を示す。出生の２日後（Ｐ２）に新生仔マウスに全身的に注射した。処置の８週間後に筋肉を採取した。ＰＣＲバンドは、意図された欠失を示す。
【図5】全身的に処置されたマウスにおけるジストロフィン発現を示す（倍率１０倍、Ｐ２に二重ベクターを注射、処置の８週間後）。
【図6】１ベクター系と比較した従来の２ベクター系を示す。１ベクター系に対する利点としては、単一のベクター上の全ての必要な編集成分を有すること、有効用量を増加させる能力、他のベクター産生を合理化すること（単一治療剤）、筋肉特異的プロモーター（ＣＫ８、Ｓｐｃ５１２、ＭＨＣＫ７）の使用／組み込み、（ガイド配列を変化させることによって）エキソンおよび大きい欠失の組み合わせを標的とする能力を挙げることができる。
【図7】ベクターデザインの比較を示す。オールインワンベクター成分（総パッケージ化ＤＮＡ＜４．８ｋｂは、ＳａＣａｓ９（約３．２ｋｂ）；ミニポリアデニル化シグナル（６０ｂｐ）またはｂＧＨポリアデニル化シグナル（２３２ｂｐ）；構成的ＥＦＳプロモーター（２５２ｂｐ）または筋肉特異的プロモーターを含む）。
【図8】エキソン４５～５５の欠失についてのオールインワンベクターおよびＨＥＫ２９３ｓにおけるインビトロ分析を示す。
【図9A】エキソン４８～５０の欠失を示す、ＤＭＤ患者から単離された不死化筋芽細胞に由来するジストロフィン遺伝子の概略図である。
【図9B】本明細書において詳細に述べられるようにエキソン４５～５５がベクターによって効果的に欠失したことを示す、処置されたＤＭＤ患者に由来するゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの欠失ＰＣＲの結果を示す。
【図9C】未処置筋芽細胞は、ジストロフィンタンパク質を産生しなかったが、トランスフェクト筋芽細胞が、ホットスポット欠失に一致した、陽性対照と比較してより小さいジストロフィンタンパク質を発現したことを示す細胞溶解物のウエスタンブロットである。
【図10】対照遺伝子座を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（上のパネル）またはエキソン４５～５５を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（下のパネル）のいずれかが注射された新生仔ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスに由来する心筋細胞の画像である。注射の８週間後に細胞を採取した。細胞をＤＡＰＩで染色したか、またはジストロフィンについて染色した。倍率１０倍、スケールバー＝２００μｍ。
【図11】オールインワンベクター５の種類の概略図である。
【図12】１０倍の倍率で示されるベクターの注射の８週後におけるＴＡ筋細胞の画像である。
【図13】注射の８週間後におけるＴＡ試料を用いたｑＲＴ－ＰＣＲによって決定される、示されたオールインワンベクターによる処置から生じたＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡのインビボにおける発現を示すグラフである。Ｎ＝３～４。
【図14】インビボにおけるオールインワン（ＡＩＯ）ベクターの安定性を示すグラフである。左のグラフは、注射の８週間後におけるＴＡ試料を用いたｑＰＣＲの結果である。右のグラフは、ＳａＣａｓ９に対するＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果である。両方とも、Ｎ＝３～４。
【発明を実施するための形態】
【0008】
詳細な説明
本明細書に記載されるように、ある種の方法および操作されたｇＲＮＡは、発現を変更するため、ゲノム操作のため、およびＤＭＤなどの遺伝子疾患に関与するジストロフィン遺伝子における突然変異の効果を補正するかまたは低下させるためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベース遺伝子編集系によって有用であることが分かった。開示されたｇＲＮＡは、クリニカルトランスレーションにより適した標的部位に生成された。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードする遺伝子は、全ての他の必要な調節配列が含まれる場合に筋肉への全身性遺伝子送達のために用いられるベクターであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達されるにはあまりに大きい。その代わりに、開示されたｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９より約１ｋｂ小さい黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）による使用のために選択され、スクリーニングされた。ヒトジストロフィン遺伝子配列を標的とする、開示されたｇＲＮＡは、ＤＭＤ患者に由来する細胞における機能的ジストロフィンの発現を回復するためにこの領域のゲノム欠失を引き起こすヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系によって使用され得る。
本明細書に記載されるように、ある種の方法および操作されたｇＲＮＡは、発現を変更するため、ゲノム操作のため、およびＤＭＤなどの遺伝子疾患に関与するジストロフィン遺伝子における突然変異の効果を補正するかまたは低下させるためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９ベース遺伝子編集系によって有用であることが分かった。開示されたｇＲＮＡは、クリニカルトランスレーションにより適した標的部位に生成された。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードする遺伝子は、全ての他の必要な調節配列が含まれる場合に筋肉への全身性遺伝子送達のために用いられるベクターであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達されるにはあまりに大きい。その代わりに、開示されたｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９より約１ｋｂ小さい黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）による使用のために選択され、スクリーニングされた。ヒトジストロフィン遺伝子配列を標的とする、開示されたｇＲＮＡは、ＤＭＤ患者に由来する細胞における機能的ジストロフィンの発現を回復するためにこの領域のゲノム欠失を引き起こすヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系によって使用され得る。
【0009】
ジストロフィン遺伝子を標的とするための遺伝子構築体、組成物、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系および複数のｇＲＮＡを送達するための方法も、本明細書に記載される。本開示の主題は、骨格筋および心筋に遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を送達する方法も提供する。ベクターは、修飾ＡＡＶベクターを含むＡＡＶであり得る。本開示の主題には、有効であり、効率的であり、かつ成功したゲノム修飾を容易にする骨格筋または心筋に活性型のこのクラスの治療薬を送達し、かつ、治療的適用のためにヒトゲノムを書きかえ、基礎科学の適用のためにモデル種を標的とするための手段を提供するための方法が記載される。方法は、ジストロフィンのエキソン４５～５５の切除のために必要な編集成分の内の全ての送達のための単一のＡＡＶベクターの使用に関してもよい。
このセクションと本明細書における全体の開示とにおいて用いられるセクション見出しは、単に構成上の目的のためにだけあるものであって、限定することを意図するものではない。
このセクションと本明細書における全体の開示とにおいて用いられるセクション見出しは、単に構成上の目的のためにだけあるものであって、限定することを意図するものではない。
【0010】
１． 定義
特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語および科学用語は、一般に当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含む本文献が優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が使用され得る。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法および例は、例示的であるのみであって、限定することを意図するものではない。
本明細書において用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびそれらの変種は、追加的な作用または構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語または語であることが意図される。文脈が明確に規定しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含む。本開示は、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書で示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かつ「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も検討する。
特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語および科学用語は、一般に当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含む本文献が優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が使用され得る。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法および例は、例示的であるのみであって、限定することを意図するものではない。
本明細書において用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびそれらの変種は、追加的な作用または構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語または語であることが意図される。文脈が明確に規定しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含む。本開示は、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書で示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かつ「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も検討する。
【0011】
本明細書における数値範囲の列挙について、同じ精度でそれらの間にある各数が明示的に検討される。例えば、６～９の範囲について、６および９に加えて７および８という数が検討され、６．０～７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０という数が明示的に検討される。
本明細書において用いられる場合、「約」または「およそ」という用語は、値が測定されるかまたは決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する、当業者によって決定される特定の値についての許容し得る誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における実施につき、３または３超の標準偏差の範囲内を意味し得る。別の場合、「約」は、与えられた値の最高２０％、好ましくは最高１０％、より好ましくは最高５％、さらに好ましくは最高１％の範囲を意味し得る。ある種の態様において、「約」という用語は、特に明記しない限り、または、文脈から明白でない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、示された参照値のいずれかの方向（超または未満）における２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内にある値の範囲を指す。別の場合、特に生物系または生物プロセスに関して、その用語は、値の大きさの程度の範囲内、好ましくは５倍の範囲内、より好ましくは２倍の範囲内を意味し得る。
本明細書において用いられる場合、「約」または「およそ」という用語は、値が測定されるかまたは決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する、当業者によって決定される特定の値についての許容し得る誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における実施につき、３または３超の標準偏差の範囲内を意味し得る。別の場合、「約」は、与えられた値の最高２０％、好ましくは最高１０％、より好ましくは最高５％、さらに好ましくは最高１％の範囲を意味し得る。ある種の態様において、「約」という用語は、特に明記しない限り、または、文脈から明白でない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、示された参照値のいずれかの方向（超または未満）における２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内にある値の範囲を指す。別の場合、特に生物系または生物プロセスに関して、その用語は、値の大きさの程度の範囲内、好ましくは５倍の範囲内、より好ましくは２倍の範囲内を意味し得る。
【0012】
本明細書において交換可能に用いられる「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のデペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、現在のところ疾患を引き起こすことが知られておらず、したがって、そのウイルスは、非常に軽度の免疫応答を引き起こす。
本明細書において用いられる「結合領域」は、ヌクレアーゼが認識し、結合するヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。
本明細書において交換可能に用いられる「心筋（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ）」または「心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）」は、心臓の壁および組織学的支持構造において見出される一種の不随意横紋筋、すなわち、心筋層を意味する。心筋は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）でできている。心筋細胞は、骨格筋細胞におけるものと同様の横紋を示すが、多核骨格細胞と異なり、固有の核を１つだけ含む。ある種の実施形態において、「心筋状態」は、心筋症、心不全、不整脈および炎症性心疾患など、心筋に関連する状態を指す。
本明細書において用いられる「結合領域」は、ヌクレアーゼが認識し、結合するヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。
本明細書において交換可能に用いられる「心筋（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ）」または「心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）」は、心臓の壁および組織学的支持構造において見出される一種の不随意横紋筋、すなわち、心筋層を意味する。心筋は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）でできている。心筋細胞は、骨格筋細胞におけるものと同様の横紋を示すが、多核骨格細胞と異なり、固有の核を１つだけ含む。ある種の実施形態において、「心筋状態」は、心筋症、心不全、不整脈および炎症性心疾患など、心筋に関連する状態を指す。
【0013】
本明細書において用いられる「コード配列」または「コーディング核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を指向することが可能なプロモーターシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、最適化されるコドンであってもよい。
本明細書において用いられる「相補物」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン－クリック型塩基対（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を意味し得る核酸を意味する。「相補性」は、それらが互いに逆平行にアラインメントされる場合に各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的であるように２つの核酸配列の間において共有される特性を指す。
本明細書において用いられる「相補物」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン－クリック型塩基対（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を意味し得る核酸を意味する。「相補性」は、それらが互いに逆平行にアラインメントされる場合に各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的であるように２つの核酸配列の間において共有される特性を指す。
【0014】
本明細書において用いられる「補正」、「ゲノム編集」および「回復」は、完全長の機能的タンパク質または部分的に完全長の機能的タンパク質の発現が得られるように、短縮されたタンパク質をコードするか、または全くタンパク質をコードしない突然変異遺伝子を変化させることを指す。突然変異遺伝子を補正または回復することは、相同性指向修復（ＨＤＲ）などの修復機序を伴う突然変異がない遺伝子のコピーと、突然変異がある遺伝子の領域を交換すること、または突然変異遺伝子全体を交換することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正または回復することは、次いで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて修復される遺伝子における二本鎖切断を生成することによって、早期停止コドン、異所性スプライスアクセプター部位または異所性スプライスドナー部位を生じさせるフレームシフト突然変異を修復することを含んでもよい。ＮＨＥＪは、適切なリーディングフレームを回復し、早期停止コドンを除去し得る修復の間に少なくとも１つの塩基対を付加するか、または欠失させてもよい。突然変異遺伝子を補正または回復することは、異所性スプライスアクセプター部位または異所性スプライスドナー配列を破壊することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正または回復することは、ＮＨＥＪによって２つのヌクレアーゼ標的部位の間のＤＮＡを除去し、ＤＮＡ切断を修復することによって適切なリーディングフレームを回復するために、同じＤＮＡ鎖における２つのヌクレアーゼの同時作用によって非必須遺伝子セグメントを欠失させることを含んでもよい。
【0015】
「両方向性プロモーター（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、両方向における２つの別々の配列の転写を駆動することが可能な２つ以上のプロモーターを指す。一実施形態において、一方のプロモーターは、５’から３’への転写を駆動し、他方のプロモーターは、３’から５’への転写を駆動する。一実施形態において、両方向性プロモーターは、逆方向に、少なくとも２つの別々の配列、例えばコード配列または非コード配列の発現を駆動し得る二本鎖の転写制御エレメントである。そのようなプロモーター配列は、例えば、２つの個別のプロモーター配列もしくはそれらの少なくともコア配列を含むハイブリッド配列、キメラ配列もしくは融合配列によって、または、他の場合、両方向に転写を開始し得る１つの転写調節配列だけによって、逆方向に２つのプロモーターを含むパッケージング構築体を含む、他方の（相補的）ヌクレオチド配列に連結される一方のヌクレオチド配列など、逆方向に作用する２つの個別のプロモーター配列から構成されてもよい。２つの個別のプロモーター配列が、いくつかの実施形態において、並列してもよいか、またはリンカー配列が第１の配列および第２の配列の間に位置することができる。プロモーター配列は、逆向きに別のプロモーター配列と組み合わせるために逆にされてもよい。両方向性プロモーターの両側に位置する遺伝子は、両方向に転写を駆動する単一の転写制御配列または領域に作動可能に連結され得る。他の実施形態において、両方向性プロモーターは並列しない。例えば、１つのプロモーターは、ヌクレオチド断片の５’末端において転写を駆動してもよく、別のプロモーターは、同じ断片の３’末端から転写を駆動してもよい。別の実施形態において、第１の遺伝子は、レポータまたはターミネータエレメントなどのさらなる調節エレメントの有無にかかわらず、両方向性プロモーターに作動可能に連結され得、第２の遺伝子は、この場合もさらなる調節エレメントの有無にかかわらず、逆方向において、相補的プロモーター配列によって、両方向性プロモーターに作動可能に連結され得る。
【0016】
本明細書において交換可能に用いられる「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」および「修復鋳型」は、関連する遺伝子の少なくとも一部を含む二本鎖ＤＮＡ断片または二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードしてもよい。
本明細書において交換可能に用いられる「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋肉変性を引き起こし、最終的に死亡となる劣性で致死的なＸ連鎖障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性一遺伝子性疾患であり、３５００人の男性の内の１人で起こる。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子におけるナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異を引き起こす遺伝性または特発性の突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン突然変異の大部分は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子における早期翻訳終止を引き起こすエキソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児期の間に自身を身体的に支持する能力を喪失し、１０代の間に進行性により衰弱し、２０代で死亡する。
本明細書において交換可能に用いられる「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋肉変性を引き起こし、最終的に死亡となる劣性で致死的なＸ連鎖障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性一遺伝子性疾患であり、３５００人の男性の内の１人で起こる。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子におけるナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異を引き起こす遺伝性または特発性の突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン突然変異の大部分は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子における早期翻訳終止を引き起こすエキソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児期の間に自身を身体的に支持する能力を喪失し、１０代の間に進行性により衰弱し、２０代で死亡する。
【0017】
本明細書において用いられる「ジストロフィン」は、細胞膜を通して筋線維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスに接続するタンパク質複合体の一部である桿状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋細胞の統合性および機能の調節を担う細胞膜のジストログリカン複合体に対して構造的安定性を提供する。本明細書において交換可能に用いられるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１において２２０万塩基対である。一次転写は、約１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡと共に約２，４００ｋｂを計量する。７９のエキソンは、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。
本明細書において用いられるジストロフィンの「エキソン４５～５５」は、全てのジストロフィン突然変異のおおむね４５％が位置する領域を指す。エキソン４５～５５欠失は、非常に軽度のベッカー型表現型（Ｂｅｃｋｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関連し、無症候性の個体においても認められてきた。エキソン４５～５５のマルチエクソンスキッピングは、全てのＤＭＤ患者のおおむね５０％にとって有益である。
本明細書において用いられるジストロフィンの「エキソン４５～５５」は、全てのジストロフィン突然変異のおおむね４５％が位置する領域を指す。エキソン４５～５５欠失は、非常に軽度のベッカー型表現型（Ｂｅｃｋｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関連し、無症候性の個体においても認められてきた。エキソン４５～５５のマルチエクソンスキッピングは、全てのＤＭＤ患者のおおむね５０％にとって有益である。
【0018】
本明細書において交換可能に用いられる「フレームシフト」または「フレームシフト突然変異」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡにおけるコドンのリーディングフレームにおけるシフトを引き起こす一種の遺伝子突然変異を指す。リーディングフレームにおけるシフトは、ミスセンス突然変異または早期停止コドンなど、タンパク質翻訳におけるアミノ酸配列の変更を生じさせる可能性がある。
本明細書において用いられる「機能的」および「完全機能的」によって、生物学的活性を有するタンパク質が示される。「機能的遺伝子」は、機能的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
本明細書において用いられる「融合タンパク質」は、元来は別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の接合によって作製されるキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳によって、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドが生じる。
本明細書において用いられる「遺伝子構築体」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指向することが可能なプロモーターシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルを含む。本明細書において用いられる場合、「発現形態」という用語は、個体の細胞において存在する場合にコード配列が発現するようにタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結される、必要な調節エレメントを含む遺伝子構築体を指す。
本明細書において用いられる「機能的」および「完全機能的」によって、生物学的活性を有するタンパク質が示される。「機能的遺伝子」は、機能的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
本明細書において用いられる「融合タンパク質」は、元来は別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の接合によって作製されるキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳によって、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドが生じる。
本明細書において用いられる「遺伝子構築体」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指向することが可能なプロモーターシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルを含む。本明細書において用いられる場合、「発現形態」という用語は、個体の細胞において存在する場合にコード配列が発現するようにタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結される、必要な調節エレメントを含む遺伝子構築体を指す。
【0019】
本明細書において用いられる「遺伝子疾患」は、ゲノムにおける１つまたは複数の異常によって、部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患、とりわけ出生から存在する状態を指す。異常は、突然変異、挿入または欠失であってもよい。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼす可能性がある。遺伝子疾患は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性障害、レッシュ－ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、色素性網膜炎、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫およびテイ－サックス病であってもよいが、それらに限定されるものではない。
【0020】
本明細書において交換可能に用いられる「相同性指向修復」または「ＨＤＲ」は、ＤＮＡの相同部分が、ほとんどの場合、細胞周期のＧ２期およびＳ期において核内に存在する場合、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための細胞における機構を指す。ＨＤＲは修復を導くためのドナーＤＮＡ鋳型を使用し、全遺伝子の標的付加を含む、ゲノムに対する特異的配列変化を生じさせるために使用されてもよい。ドナー鋳型がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系と共に提供される場合、細胞機構は、ＤＮＡ開裂がある場合に数桁増強される相同的組換えによって切断を修復する。相同的ＤＮＡ部分がない場合、その代わりに非相同末端結合が生じてもよい。
本明細書において用いられる「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補正または回復することを含んでもよい。ゲノム編集は、突然変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含んでもよい。ゲノム編集は、関連する遺伝子を変化させることによって、疾患を処置するため、または筋肉修復を増強するために用いられてもよい。
本明細書において用いられる「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補正または回復することを含んでもよい。ゲノム編集は、突然変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含んでもよい。ゲノム編集は、関連する遺伝子を変化させることによって、疾患を処置するため、または筋肉修復を増強するために用いられてもよい。
【0021】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書において用いられる「同一」または「同一性」は、配列が、特定の領域上において同じである、特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適にアラインメントし、特定の領域上における２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を特定の領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって算出されてもよい。２つの配列が異なる長さであるか、またはアラインメントによって１つもしくは複数の付着末端が生成され、かつ、比較の特定の領域が単一の配列だけを含む場合、単一配列の残基は、算出の分子でなく、分母に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等であると考えてよい。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行われてもよい。
本明細書において交換可能に用いられる「突然変異遺伝子」または「変異遺伝子」は、検出可能な突然変異を受けている遺伝子を指す。突然変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を及ぼす、遺伝子材料の喪失、獲得または交換などの変化を受けている。本明細書において用いられる「破壊された遺伝子」は、早期停止コドンを引き起こす突然変異がある突然変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比べて短縮される。
本明細書において交換可能に用いられる「突然変異遺伝子」または「変異遺伝子」は、検出可能な突然変異を受けている遺伝子を指す。突然変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を及ぼす、遺伝子材料の喪失、獲得または交換などの変化を受けている。本明細書において用いられる「破壊された遺伝子」は、早期停止コドンを引き起こす突然変異がある突然変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比べて短縮される。
【0022】
本明細書において用いられる「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同鋳型を必要とすることなく切断末端を直接連結することによってＤＮＡにおける二本鎖の切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型非依存性再連結は、ＤＮＡ切断点におけるランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する確率的エラープローン修復プロセスである。この方法は、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊するか、欠失させるか、または変更するために用いられてもよい。ＮＨＥＪは、典型的には、修復を導くためのマイクロホモロジーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を用いる。これらのマイクロホモロジーは、多くの場合、二本鎖切断の末端上の一本鎖オーバーハング内に存在する。オーバーハングが完全に適合している場合、ＮＨＥＪは、通常、正確に切断を修復するが、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復が生じることもあり、ましてやオーバーハングが適合していない場合は、不正確な修復は普通に生じる。
本明細書において用いられる「正常遺伝子」は、遺伝子材料の喪失、獲得または交換などの変化を受けなかった遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。例えば、正常遺伝子は、野生型遺伝子であってもよい。
本明細書において用いられる「正常遺伝子」は、遺伝子材料の喪失、獲得または交換などの変化を受けなかった遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。例えば、正常遺伝子は、野生型遺伝子であってもよい。
【0023】
本明細書において用いられる「ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ」は、Ｃａｓ９分子などのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。
本明細書において用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述によって、相補鎖の配列も明確にされる。したがって、核酸は、示された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体は、所定の核酸と同じ目的のために用いられてもよい。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびそれらの相補物も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよいか、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでもよい。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。
本明細書において用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述によって、相補鎖の配列も明確にされる。したがって、核酸は、示された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体は、所定の核酸と同じ目的のために用いられてもよい。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびそれらの相補物も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよいか、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでもよい。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。
【0024】
本明細書において用いられる「作動可能に連結される」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下における遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置してもよい。プロモーターおよび遺伝子の間の距離は、それが、プロモーターが由来する遺伝子内において制御するそのプロモーターおよび遺伝子の間の距離とほとんど同じであってもよい。当技術分野において知られているように、この距離の変化は、プロモーター機能の喪失なしに収まるものであってもよい。
本明細書において用いられる「部分的に機能的」によって、突然変異遺伝子によってコードされ、かつ、生物学的活性が、機能的タンパク質よりも小さいが、非機能的タンパク質よりも大きいタンパク質が示される。
本明細書において交換可能に用いられる「早期停止コドン」または「アウトオブフレーム停止コドン」は、通常は野生型遺伝子では認められない位置において停止コドンになるＤＮＡの配列におけるナンセンス突然変異を指す。早期停止コドンによって、タンパク質は、短縮されるか、または完全長バージョンのタンパク質と比較してより短くなる。
本明細書において用いられる「部分的に機能的」によって、突然変異遺伝子によってコードされ、かつ、生物学的活性が、機能的タンパク質よりも小さいが、非機能的タンパク質よりも大きいタンパク質が示される。
本明細書において交換可能に用いられる「早期停止コドン」または「アウトオブフレーム停止コドン」は、通常は野生型遺伝子では認められない位置において停止コドンになるＤＮＡの配列におけるナンセンス突然変異を指す。早期停止コドンによって、タンパク質は、短縮されるか、または完全長バージョンのタンパク質と比較してより短くなる。
【0025】
本明細書において用いられる「プロモーター」は、細胞において核酸の発現を付与するか、活性化するか、または増強することが可能な合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するための、かつ／または、同じものの空間的発現および／または時間的発現を変更するための１つまたは複数の特異的転写調節配列を含んでもよい。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対もの位置に位置し得る遠位エンハンサーまたは抑制エレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む原料に由来してもよい。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に調節してもよいか（構成的プロモーター）、あるいは、発現が生じる細胞、組織もしくは器官に関して、発現が生じる発育段階に関して、または生理学的なストレス、病原体、金属イオンもしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、差次的に調節してもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。筋肉特異的プロモーターの例としては、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターおよびＳｐｃ５１２プロモーターを挙げることができる。
【0026】
本明細書において用いられる「骨格筋」は、体性神経系の制御下にあり、腱として知られている膠原繊維の束によって骨に付着する一種の横紋筋を指す。骨格筋は、時には口語体で「筋線維」と呼ばれるミオサイトまたは「筋細胞」として知られている個別の成分から構成される。ミオサイトは、筋形成として知られているプロセスにおいて発育上の筋芽細胞（筋細胞を生じさせる一種の胚前駆細胞）の融合から形成される。これらの長い円柱多核細胞は、筋原線維とも呼ばれている。
本明細書において用いられる「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、加齢、筋肉変性、創傷治癒および筋力低下または筋萎縮など、骨格筋に関連する状態を指す。
本明細書において交換可能に用いられる「対象」および「患者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなど）ならびにヒト）が挙げられるが、それらに限定されるものではない、いずれの脊椎動物も指す。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたはヒト以外であってもよい。対象または患者は、他の形態の処置を受けてもよい。
本明細書において用いられる「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、加齢、筋肉変性、創傷治癒および筋力低下または筋萎縮など、骨格筋に関連する状態を指す。
本明細書において交換可能に用いられる「対象」および「患者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなど）ならびにヒト）が挙げられるが、それらに限定されるものではない、いずれの脊椎動物も指す。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたはヒト以外であってもよい。対象または患者は、他の形態の処置を受けてもよい。
【0027】
本明細書において用いられる「標的遺伝子」は、知られた遺伝子産物または推定遺伝子産物をコードするいずれのヌクレオチド配列も指す。標的遺伝子は、遺伝子疾患に関与する変異遺伝子であってもよい。ある種の実施形態において、標的遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子である。ある種の実施形態において、標的遺伝子は、突然変異ヒトジストロフィン遺伝子である。
本明細書において用いられる「標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が結合し、切断するように設計されている標的遺伝子の領域を指す。
本明細書において用いられる「導入遺伝子」は、ある生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝子材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持してもよいか、または、それは、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常機能を変更してもよい。導入遺伝子の導入には、生物の表現型を変化させる可能性がある。
核酸に関して本明細書において用いられる「変異体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列またはその部分の相補物、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補物と実質的に同一である核酸、または、（ｉｖ）参照される核酸、その相補物、もしくはそれと実質的に同一の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
本明細書において用いられる「標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が結合し、切断するように設計されている標的遺伝子の領域を指す。
本明細書において用いられる「導入遺伝子」は、ある生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝子材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持してもよいか、または、それは、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常機能を変更してもよい。導入遺伝子の導入には、生物の表現型を変化させる可能性がある。
核酸に関して本明細書において用いられる「変異体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列またはその部分の相補物、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補物と実質的に同一である核酸、または、（ｉｖ）参照される核酸、その相補物、もしくはそれと実質的に同一の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【0028】
アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、少なくとも１種の生物学的活性を保持する。変異体は、少なくとも１種の生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、荷電領域の親水性、程度および分布）の異なるアミノ酸と置換することは、典型的には軽微な変化を含むと当技術分野において認識される。これらの軽微な変化は、当技術分野において理解されるように、部分的にアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって同定されてもよい。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５～１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸が置換され得、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当技術分野において知られている。一態様において、疎水性親水性指標が±２であるアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質が生じる置換を示すために用いられてもよい。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性を考慮することによって、そのペプチドの最大局所平均親水性の算出が可能になる。親水性値が互いに±２以内であるアミノ酸によって置換を行ってもよい。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観測値に一致して、生物学的機能と適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさおよび他の特性によって示される、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解される。
【0029】
本明細書において用いられる「ベクター」は、複製開始点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己再生染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
特に本明細書において定義されない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられるいずれの用語およびそれらのいずれの技術も、当技術分野においてよく知られており、一般に用いられるものである。用語の意味および範囲は明瞭であるべきであるが、いかなる潜在的意味不明瞭が生じた場合も、本明細書において提供される定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先する。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数のものを含む。
特に本明細書において定義されない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられるいずれの用語およびそれらのいずれの技術も、当技術分野においてよく知られており、一般に用いられるものである。用語の意味および範囲は明瞭であるべきであるが、いかなる潜在的意味不明瞭が生じた場合も、本明細書において提供される定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先する。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【0030】
２． ジストロフィン遺伝子のゲノム編集のための遺伝子構築体
本明細書において、ジストロフィン遺伝子のゲノム編集、ゲノム変更、および／または遺伝子発現の変更のための遺伝子構築体が提供される。ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子であってもよい。遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。少なくとも１種のｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子配列および／またはアカゲザルジストロフィン遺伝子配列を標的としてもよく、ＳａＣａｓ９適合性標的であってもよい。開示されたｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５を標的とするために、ＳａＣａｓ９を用いる系を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系に含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系に含まれてもよい開示されたｇＲＮＡは、ＤＭＤ患者に由来する細胞における機能的ジストロフィンの発現を回復するために、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５の領域のゲノム欠失を引き起こすことが可能である。
本明細書において、ジストロフィン遺伝子のゲノム編集、ゲノム変更、および／または遺伝子発現の変更のための遺伝子構築体が提供される。ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子であってもよい。遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。少なくとも１種のｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子配列および／またはアカゲザルジストロフィン遺伝子配列を標的としてもよく、ＳａＣａｓ９適合性標的であってもよい。開示されたｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５を標的とするために、ＳａＣａｓ９を用いる系を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系に含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系に含まれてもよい開示されたｇＲＮＡは、ＤＭＤ患者に由来する細胞における機能的ジストロフィンの発現を回復するために、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５の領域のゲノム欠失を引き起こすことが可能である。
【0031】
ａ． ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、細胞膜を通して筋線維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスに接続するタンパク質複合体の一部である桿状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に対して構造的安定性を提供する。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１において２２０万塩基対である。一次転写は、およそ１４ｋｂである成熟ｍＲＮＡと共に約２，４００ｋｂを計量する。７９のエキソンは、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋肉組織は、少量のジストロフィンだけを含むが、その異常発現がないことによって、重度でかつ不治の病徴の発症が生じる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの突然変異によって、罹患した患者において、欠陥ジストロフィンと重度のジストロフィー表現型とが生じる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの突然変異によって、罹患した患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質と非常により軽度のジストロフィー表現型とが生じる。
ジストロフィンは、細胞膜を通して筋線維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスに接続するタンパク質複合体の一部である桿状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に対して構造的安定性を提供する。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１において２２０万塩基対である。一次転写は、およそ１４ｋｂである成熟ｍＲＮＡと共に約２，４００ｋｂを計量する。７９のエキソンは、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋肉組織は、少量のジストロフィンだけを含むが、その異常発現がないことによって、重度でかつ不治の病徴の発症が生じる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの突然変異によって、罹患した患者において、欠陥ジストロフィンと重度のジストロフィー表現型とが生じる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの突然変異によって、罹患した患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質と非常により軽度のジストロフィー表現型とが生じる。
【0032】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子においてナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異を引き起こす遺伝性突然変異または自然突然変異の結果である。自然発生突然変異およびそれらの結果は、ＤＭＤについて比較的よく理解されている。桿状ドメインの中に含まれるエキソン４５～５５の領域（図１、図２）内で生じるインフレーム欠失によって、非常に機能的なジストロフィンタンパク質が産生する可能性があり、多くのキャリアは、無症候性であるか、または軽度の病徴を示す。さらに、理論的には、患者の６０％超が、全体としてこの領域（エキソン４５～５５）を標的とするか、またはジストロフィン遺伝子のこの領域における特異的エキソンを標的とすること（例えば、エキソン５１だけを標的とすること）によって処置され得る。内部欠失しているが機能的なジストロフィンタンパク質を産生するためにｍＲＮＡスプライシングの間に非必須エキソンをスキップすることによって（例えば、エキソン５１のスキップ）ＤＭＤ患者における破壊されたジストロフィンリーディングフレームを回復する努力がなされてきた。内部ジストロフィンエキソンの欠失（例えば、エキソン５１の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持するが、あまり重度でないベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を引き起こす。ＢＭＤ遺伝子型は、欠失がジストロフィン遺伝子内に存在するという点でＤＭＤと同様である。しかし、ＢＭＤにおける欠失は、リーディングフレームを無傷のままにする。したがって、内部に短縮されるが、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質が作製される。ＢＭＤには幅広い表現型があるが、多くの場合、欠失がジストロフィンのエキソン４５～５５の間にある場合、表現型は、ＤＭＤと比較して非常により軽度である。したがって、ＤＭＤ遺伝子型をＢＭＤ遺伝子型に変化させることは、ジストロフィンを補正するための一般的な戦略である。ジストロフィンを補正するための多くの戦略があるが、戦略の多くは、内在性ジストロフィンのリーディングフレームを回復することに依存する。このことによって、疾患遺伝子型は、ＤＭＤからベッカー型筋ジストロフィーへと移行する。多くのＢＭＤ患者は、翻訳上のリーディングフレームを維持する遺伝子内欠失を有するが、それによって、より短いが、大きく機能的なジストロフィンタンパク質が生じる。
【0033】
ある種の実施形態において、リーディングフレームを回復するためのエキソン４５～５５の修飾（例えばＮＨＥＪによるエキソン４５～５５の欠失または切除など）は、欠失突然変異があるＤＭＤ対象を含む対象における表現型ＤＭＤを寛解させる。ジストロフィン遺伝子のエキソン４５～５５は、ジストロフィン遺伝子の４５番目のエキソン、４６番目のエキソン、４７番目のエキソン、４８番目のエキソン、４９番目のエキソン、５０番目のエキソン、５１番目のエキソン、５２番目のエキソン、５３番目のエキソン、５４番目のエキソンおよび５５番目のエキソンを指す。４５番目～５５番目のエキソン領域における突然変異は、ＮＨＥＪベースゲノム編集による永続的な補正に理想的には適している。
【0034】
本開示の遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子において欠失を生成してもよい。ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子であってもよい。ある種の実施形態において、ベクターは、ジストロフィン遺伝子の標的位置をフランクすることによってジストロフィン標的位置を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させる２つのイントロン（第１のイントロンおよび第２のイントロン）において２つの二本鎖切断（第１の二本鎖切断および第２の二本鎖切断）を形成するように構成される。「ジストロフィン標的位置」は、本明細書において記載されるように、ジストロフィンエキソン標的位置またはジストロフィン内部エキソン標的位置であり得る。ジストロフィンエキソン標的位置の欠失は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象のジストロフィン配列を最適化することができる。例えば、それは、コードされたジストロフィンタンパク質の機能または活性を増加させることが可能であり、かつ／または対象の疾患状況の改善をもたらす可能性がある。ある種の実施形態において、ジストロフィンエキソン標的位置の切除は、リーディングフレームを回復する。ジストロフィンエキソン標的位置は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエキソンを含むことができる。ある種の実施形態において、ジストロフィン標的位置は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）のエキソン５１を含む。
【0035】
本開示の遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子のエキソン４５～エキソン５５領域において、非常に効率的な遺伝子編集を媒介することができる。本開示の遺伝子構築体は、ＤＭＤ患者に由来する細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を回復することができる。
エキソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエキソン４５～５５の除去は、全てのＤＭＤ患者のおよそ５０％を処置するために用いられ得る。ジストロフィン突然変異のこのクラスは、ＮＨＥＪベースゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な補正に適している。本明細書に記載される遺伝子構築体は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエキソン４５～エキソン５５の標的修飾のために開発された。本開示の遺伝子構築体は、ヒトＤＭＤ細胞にトランスフェクトされ得、正確なリーディングフレームへの効率的な遺伝子修飾および遺伝子転換を媒介し得る。タンパク質回復は、フレーム回復と両立し得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系処置細胞のバルク集団において検出され得る。
エキソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエキソン４５～５５の除去は、全てのＤＭＤ患者のおよそ５０％を処置するために用いられ得る。ジストロフィン突然変異のこのクラスは、ＮＨＥＪベースゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な補正に適している。本明細書に記載される遺伝子構築体は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエキソン４５～エキソン５５の標的修飾のために開発された。本開示の遺伝子構築体は、ヒトＤＭＤ細胞にトランスフェクトされ得、正確なリーディングフレームへの効率的な遺伝子修飾および遺伝子転換を媒介し得る。タンパク質回復は、フレーム回復と両立し得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系処置細胞のバルク集団において検出され得る。
【0036】
ｂ． ＣＲＩＳＰＲ系
本開示の遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードしてもよい。本明細書において交換可能に用いられる場合、「クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌のおよそ９０％のゲノムにおいて認められる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、獲得免疫の形態を提供する、ファージおよびプラスミドへの侵入に対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸開裂の特異性をプログラム化することが可能な非コードＲＮＡエレメントとの組み合わせを含む。スペーサーと呼ばれる外来性ＤＮＡの短いセグメントは、ＣＲＩＳＰＲリピートの間のゲノムに組み込まれ、過去の曝露の「記憶」の役割を果たす。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（本明細書において交換可能に「ｇＲＮＡ」とも称される）の３’末端と複合体を形成し、タンパク質－ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして知られている、あらかじめ定義された２０ｂｐのＤＮＡ配列との間の相補的塩基対によって、そのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内でコードされる領域、すなわち、プロトスペーサーと、病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを介して、病原体ＤＮＡの相同的遺伝子座に対して指向する。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に対して指向させる個別のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡに、ダイレクトリピート内で転写され、開裂される。発現ｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、新しいゲノム標的に対して指向する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉに類似した様式で、外来遺伝エレメントを認識し、非発現化するために用いられる。
本開示の遺伝子構築体は、ジストロフィン遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードしてもよい。本明細書において交換可能に用いられる場合、「クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌のおよそ９０％のゲノムにおいて認められる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、獲得免疫の形態を提供する、ファージおよびプラスミドへの侵入に対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸開裂の特異性をプログラム化することが可能な非コードＲＮＡエレメントとの組み合わせを含む。スペーサーと呼ばれる外来性ＤＮＡの短いセグメントは、ＣＲＩＳＰＲリピートの間のゲノムに組み込まれ、過去の曝露の「記憶」の役割を果たす。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（本明細書において交換可能に「ｇＲＮＡ」とも称される）の３’末端と複合体を形成し、タンパク質－ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして知られている、あらかじめ定義された２０ｂｐのＤＮＡ配列との間の相補的塩基対によって、そのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内でコードされる領域、すなわち、プロトスペーサーと、病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを介して、病原体ＤＮＡの相同的遺伝子座に対して指向する。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に対して指向させる個別のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡに、ダイレクトリピート内で転写され、開裂される。発現ｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、新しいゲノム標的に対して指向する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉに類似した様式で、外来遺伝エレメントを認識し、非発現化するために用いられる。
【0037】
ＣＲＩＳＰＲ系の３つのクラス（Ｉ型エフェクター系、ＩＩ型エフェクター系およびＩＩＩ型エフェクター系）が知られている。ＩＩ型エフェクター系は、ｄｓＤＮＡを開裂するために単一のエフェクター酵素（Ｃａｓ９）を用いて、４つの逐次的なステップで標的ＤＮＡ二本鎖切断を行う。複合体として作用する複数の互いに異なるエフェクターを必要とするＩ型エフェクター系およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核生物細胞などの代替的文脈で機能することができる。ＩＩ型エフェクター系は、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される長いｐｒｅ－ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質と、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシングに関与するｔｒａｃｒＲＮＡとからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのスペーサーを分離するリピート領域にハイブリダイズすることによって、内在性ＲＮアーゼＩＩＩによるｄｓＲＮＡ開裂を開始する。この開裂の後、Ｃａｓ９による各スペーサー内における第２の開裂事象が生じ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と会合し続ける成熟ｃｒＲＮＡを産生し、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を形成する。
【0038】
Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二重螺旋をほどき、開裂するｃｒＲＮＡに適合する配列を検索する。標的ＤＮＡにおける「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡにおける残りのスペーサー配列との間の相補性の検出の際に標的認識が生じる。正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がプロトスペーサーの３’末端にも存在する場合、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介する。プロトスペーサーの標的化のために、配列の直後に、ＤＮＡ開裂のために必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がある必要がある。異なるＩＩ型系には、異なるＰＡＭの要件がある。化膿レンサ球菌ＣＲＩＳＰＲ系は、５’－ＮＲＧ－３’（式中、ＲはＡまたはＧである）としての、このＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）についてのＰＡＭ配列を有してもよく、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の固有の能力は、２つ以上のｓｇＲＮＡと単一のＣａｓ９タンパク質を共発現することによって複数の互いに異なるゲノム遺伝子座を同時に標的とする直接的能力である。例えば、ＩＩ型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）系は、「Ｎ」が任意のヌクレオチドでもあることが可能な「ＮＧＧ」配列を使用することを天然に好むが、操作された系における「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れる（Ｈｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴの天然ＰＡＭを有するが、非常に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ ＰＡＭを含む様々なＰＡＭにわたって活性を有する（Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８１）。
【0039】
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２６）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば、３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２７）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２８）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。上述の実施形態において、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであってもよい。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更するために操作され得る。
【0040】
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系
化膿レンサ球菌のＩＩ型エフェクター系の操作形態は、ゲノム操作のためのヒト細胞において機能することが示された。この系において、Ｃａｓ９タンパク質は、概してＲＮアーゼＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性をなくすｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合である、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、本明細書においてキメラの単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）としても交換可能に用いられる）によってゲノム標的部位に指向された。遺伝子疾患のゲノム編集および処置に用いるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース操作系が、本明細書において提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース操作系は、遺伝子疾患、加齢、組織再生または創傷治癒に関与する遺伝子を含むいずれの遺伝子も標的とするように設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質と少なくとも１種のｇＲＮＡとを含むことができる。ある種の実施形態において、系は、２つのｇＲＮＡ分子を含む。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、Ｃａｓ９に対して内在性であるものといった異なる活性を有するドメイン、例えばトランス活性化ドメインを含む。
化膿レンサ球菌のＩＩ型エフェクター系の操作形態は、ゲノム操作のためのヒト細胞において機能することが示された。この系において、Ｃａｓ９タンパク質は、概してＲＮアーゼＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性をなくすｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合である、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、本明細書においてキメラの単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）としても交換可能に用いられる）によってゲノム標的部位に指向された。遺伝子疾患のゲノム編集および処置に用いるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース操作系が、本明細書において提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース操作系は、遺伝子疾患、加齢、組織再生または創傷治癒に関与する遺伝子を含むいずれの遺伝子も標的とするように設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質と少なくとも１種のｇＲＮＡとを含むことができる。ある種の実施形態において、系は、２つのｇＲＮＡ分子を含む。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、Ｃａｓ９に対して内在性であるものといった異なる活性を有するドメイン、例えばトランス活性化ドメインを含む。
【0041】
標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）は、細胞の分化もしくは遺伝子の活性化が望まれ得るいずれか他のプロセスに関与し得るか、またはフレームシフト突然変異もしくはナンセンス突然変異などの突然変異を有し得る。標的遺伝子が早期停止コドン、異所性スプライスアクセプター部位または異所性スプライスドナー部位を生じさせる突然変異を有する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、早期停止コドン、異所性スプライスアクセプター部位または異所性スプライスドナー部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識し、結合するように設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベース系は、早期停止コドンのスキップを誘導するか、または破壊されたリーディングフレームを回復するためにスプライスアクセプターおよびスプライスドナーを標的とすることによって正常遺伝子スプライシングを破壊するためにも使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、ゲノムのタンパク質－コード領域への非特異的変化を媒介してもしなくてもよい。
【0042】
（１）Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を開裂し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に関与するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、イネ褐条病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバシラス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバシラス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アリシクリフィラス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバシラス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバシラス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスティス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、黄色球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバシラス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サブドリグラヌラム種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）またはバーミンフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられるが、それらに限定されるものではない、いずれの細菌種または古細菌種に由来してもよい。ある種の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳｐＣａｓ９」とも称される）である。ある種の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳａＣａｓ９」とも称される）である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を開裂し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に関与するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、イネ褐条病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバシラス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバシラス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アリシクリフィラス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバシラス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバシラス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスティス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、黄色球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバシラス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サブドリグラヌラム種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）またはバーミンフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられるが、それらに限定されるものではない、いずれの細菌種または古細菌種に由来してもよい。ある種の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳｐＣａｓ９」とも称される）である。ある種の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（本明細書において「ＳａＣａｓ９」とも称される）である。
【0043】
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質は、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相互作用することが可能であり、ｇＲＮＡ分子と一緒に、標的ドメインと、ある種の実施形態において、ＰＡＭ配列とを含む部位に局在化する。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質の能力は、例えば、当技術分野で知られている形質転換アッセイを用いて決定され得る。
ある種の実施形態において、標的核酸と相互作用し、標的核酸を開裂するＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。ある種の実施形態において、標的核酸の開裂は、ＰＡＭ配列の上流で生じる。異なる細菌種に由来するＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２６）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２７）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）（配列番号２８）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。上述の実施形態において、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであってもよい。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更するために操作され得る。
ある種の実施形態において、標的核酸と相互作用し、標的核酸を開裂するＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。ある種の実施形態において、標的核酸の開裂は、ＰＡＭ配列の上流で生じる。異なる細菌種に由来するＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２６）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２７）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。ある種の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）（配列番号２８）を認識し、その配列から１～１０ｂｐ、例えば３～５ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指向する。上述の実施形態において、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであってもよい。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更するために操作され得る。
【0044】
ある種の実施形態において、ベクターは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２７）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２８）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子をコードする。ある種の実施形態において、少なくとも１種のＣａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子である。ある種の実施形態において、少なくとも１種のＣａｓ９分子は、突然変異黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子である。
追加的にまたは代替的には、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当技術分野で知られている。
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードし、任意に核局在化配列（ＮＬＳ）を含む例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３１～３７で示される。黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードする別の例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３８のヌクレオチド１２９３～４４５１を含む。
追加的にまたは代替的には、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当技術分野で知られている。
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードし、任意に核局在化配列（ＮＬＳ）を含む例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３１～３７で示される。黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードする別の例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３８のヌクレオチド１２９３～４４５１を含む。
【0045】
いくつかの実施形態において、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７のポリヌクレオチド配列を含む。黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号３９で示される。黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号４０で示される。
代替的にまたは追加的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、融合タンパク質を含むことができる。融合タンパク質は、２種の異種ポリペプチドドメインを含み、ここで、第１のポリペプチドドメインはＣａｓタンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性またはデメチラーゼ活性などの活性を有する。融合タンパク質は、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性またはデメチラーゼ活性などの活性を有する第２のポリペプチドドメインに融合するＣａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質を含むことができる。
代替的にまたは追加的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、融合タンパク質を含むことができる。融合タンパク質は、２種の異種ポリペプチドドメインを含み、ここで、第１のポリペプチドドメインはＣａｓタンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性またはデメチラーゼ活性などの活性を有する。融合タンパク質は、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチラーゼ活性またはデメチラーゼ活性などの活性を有する第２のポリペプチドドメインに融合するＣａｓ９タンパク質または突然変異Ｃａｓ９タンパク質を含むことができる。
【0046】
（ａ）転写活性化活性
第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、すなわち、トランス活性化ドメインを有し得る。例えば、ヒト遺伝子などの内在性哺乳動物遺伝子の遺伝子発現は、ｇＲＮＡの組み合わせによってｉＣａｓ９の融合タンパク質およびトランス活性化ドメインを哺乳動物プロモーターに標的とさせることによって達成され得る。トランス活性化ドメインは、ｐ３００タンパク質、ＶＰ１６タンパク質、複数種のＶＰ１６タンパク質、例えばＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメイン、またはＮＦカッパＢ転写アクチベータ活性のｐ６５ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ｐ３００であってもよい。
（ｂ）転写抑制活性
第２のポリペプチドドメインは、転写抑制活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス活性、例えばＫＲＡＢドメイン、ＥＲＦリプレッサドメイン活性、Ｍｘｉｌリプレッサドメイン活性、ＳＩＤ４Ｘリプレッサドメイン活性、Ｍａｄ－ＳＩＤリプレッサドメイン活性またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有し得る。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢであってもよい。
第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、すなわち、トランス活性化ドメインを有し得る。例えば、ヒト遺伝子などの内在性哺乳動物遺伝子の遺伝子発現は、ｇＲＮＡの組み合わせによってｉＣａｓ９の融合タンパク質およびトランス活性化ドメインを哺乳動物プロモーターに標的とさせることによって達成され得る。トランス活性化ドメインは、ｐ３００タンパク質、ＶＰ１６タンパク質、複数種のＶＰ１６タンパク質、例えばＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメイン、またはＮＦカッパＢ転写アクチベータ活性のｐ６５ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ｐ３００であってもよい。
（ｂ）転写抑制活性
第２のポリペプチドドメインは、転写抑制活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス活性、例えばＫＲＡＢドメイン、ＥＲＦリプレッサドメイン活性、Ｍｘｉｌリプレッサドメイン活性、ＳＩＤ４Ｘリプレッサドメイン活性、Ｍａｄ－ＳＩＤリプレッサドメイン活性またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有し得る。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢであってもよい。
【0047】
（ｃ）転写終結因子活性
第２のポリペプチドドメインは、転写終結因子活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、真核生物終結因子１（ＥＲＦ１）活性または真核生物終結因子３（ＥＲＦ３）活性を有し得る。
（ｄ）ヒストン修飾活性
第２のポリペプチドドメインは、ヒストン修飾活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有し得る。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００タンパク質もしくはＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質またはそれらの断片であってもよい。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ｐ３００であってもよい。
第２のポリペプチドドメインは、転写終結因子活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、真核生物終結因子１（ＥＲＦ１）活性または真核生物終結因子３（ＥＲＦ３）活性を有し得る。
（ｄ）ヒストン修飾活性
第２のポリペプチドドメインは、ヒストン修飾活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有し得る。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００タンパク質もしくはＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質またはそれらの断片であってもよい。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ｐ３００であってもよい。
【0048】
（ｅ）ヌクレアーゼ活性
第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性と異なるヌクレアーゼ活性を有し得る。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスフォジエステル結合を開裂することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは、通常、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにさらに分割されるが、酵素の一部は両カテゴリにあってもよい。よく知られたヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。
（ｆ）核酸会合活性
第２のポリペプチドドメインは、核酸会合活性を有することが可能であるか、または、核酸結合タンパク質－ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１種のモチーフを含む独立して折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特異的ＤＮＡ配列（認識配列）を認識することが可能であるか、またはＤＮＡ、すなわち、ヘリックスターンヘリックス領域、ロイシンジッパ領域、ウィングドヘリックス領域、ウィングドヘリックスターンヘリックス領域、ヘリックスループヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、亜鉛フィンガ、ＨＭＧ－ボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される核酸会合領域に対する一般的な親和性を有することが可能である。
第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性と異なるヌクレアーゼ活性を有し得る。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスフォジエステル結合を開裂することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは、通常、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにさらに分割されるが、酵素の一部は両カテゴリにあってもよい。よく知られたヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。
（ｆ）核酸会合活性
第２のポリペプチドドメインは、核酸会合活性を有することが可能であるか、または、核酸結合タンパク質－ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１種のモチーフを含む独立して折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特異的ＤＮＡ配列（認識配列）を認識することが可能であるか、またはＤＮＡ、すなわち、ヘリックスターンヘリックス領域、ロイシンジッパ領域、ウィングドヘリックス領域、ウィングドヘリックスターンヘリックス領域、ヘリックスループヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、亜鉛フィンガ、ＨＭＧ－ボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される核酸会合領域に対する一般的な親和性を有することが可能である。
【0049】
（ｇ）メチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシンまたはアデニンにメチル基をトランスファーすることを含むメチラーゼ活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含んでもよい。
（ｈ）デメチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインは、デメチラーゼ活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質（特にヒストン）および他の分子からメチル（ＣＨ３－）基を除去する酵素を含むことができる。別の場合、第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに転換することができる。第２のポリペプチドは、この反応を触媒することができる。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドは、Ｔｅｔ１であり得る。
第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシンまたはアデニンにメチル基をトランスファーすることを含むメチラーゼ活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含んでもよい。
（ｈ）デメチラーゼ活性
第２のポリペプチドドメインは、デメチラーゼ活性を有し得る。第２のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質（特にヒストン）および他の分子からメチル（ＣＨ３－）基を除去する酵素を含むことができる。別の場合、第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに転換することができる。第２のポリペプチドは、この反応を触媒することができる。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドは、Ｔｅｔ１であり得る。
【0050】
（２）ジストロフィン遺伝子を標的とするｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、例えば、２種のｇＲＮＡ分子を含む。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の標的化を提供する。ｇＲＮＡは、２種の非コードＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的と対合する相補的塩基によって特異性の標的化を付与する２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって、いずれの所望のＤＮＡ配列も標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクター系に関与する天然由来のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣する。例えば４２－ヌクレオチドｃｒＲＮＡおよび７５－ヌクレオチドｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよいこの二本鎖は、標的核酸を開裂するＣａｓ９のためのガイドとして作用する。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書において交換可能に用いられてもよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が標的とする標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、各ｇＲＮＡが異なるＤＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含んでもよい。標的ＤＮＡ配列は、重複してもよい。標的配列またはプロトスペーサーの後に、プロトスペーサーの３’末端においてＰＡＭ配列がある。異なるＩＩ型系には、異なるＰＡＭ要件がある。例えば、化膿レンサ球菌ＩＩ型系は、「Ｎ」がいずれのヌクレオチドでもあることができる「ＮＧＧ」配列を用いる。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、「Ｎ」がいずれのヌクレオチドでもあることができる「ＮＧＧ」であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２７）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２８）であってもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、例えば、２種のｇＲＮＡ分子を含む。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の標的化を提供する。ｇＲＮＡは、２種の非コードＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的と対合する相補的塩基によって特異性の標的化を付与する２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって、いずれの所望のＤＮＡ配列も標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクター系に関与する天然由来のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣する。例えば４２－ヌクレオチドｃｒＲＮＡおよび７５－ヌクレオチドｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよいこの二本鎖は、標的核酸を開裂するＣａｓ９のためのガイドとして作用する。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書において交換可能に用いられてもよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が標的とする標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、各ｇＲＮＡが異なるＤＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含んでもよい。標的ＤＮＡ配列は、重複してもよい。標的配列またはプロトスペーサーの後に、プロトスペーサーの３’末端においてＰＡＭ配列がある。異なるＩＩ型系には、異なるＰＡＭ要件がある。例えば、化膿レンサ球菌ＩＩ型系は、「Ｎ」がいずれのヌクレオチドでもあることができる「ＮＧＧ」配列を用いる。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、「Ｎ」がいずれのヌクレオチドでもあることができる「ＮＧＧ」であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２７）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２８）であってもよい。
【0051】
本開示の遺伝子構築体（例えば、ＡＡＶベクター）によってコードされるｇＲＮＡ分子の数は、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡｓ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１種の異なるｇＲＮＡｓ、少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡまたは少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであり得る。本開示の遺伝子構築体によってコードされるｇＲＮＡ分子の数は、５０種未満のｇＲＮＡ、４５種未満の異なるｇＲＮＡ、４０種未満の異なるｇＲＮＡ、３５種未満の異なるｇＲＮＡ、３０種未満の異なるｇＲＮＡ、２５種未満の異なるｇＲＮＡ、２０種未満の異なるｇＲＮＡ、１９種未満の異なるｇＲＮＡ、１８種未満の異なるｇＲＮＡ、１７種未満の異なるｇＲＮＡ、１６種未満の異なるｇＲＮＡ、１５種未満の異なるｇＲＮＡ、１４種未満の異なるｇＲＮＡ、１３種未満の異なるｇＲＮＡ、１２種未満の異なるｇＲＮＡ、１１種未満の異なるｇＲＮＡ、１０種未満の異なるｇＲＮＡ、９種未満の異なるｇＲＮＡ、８種未満の異なるｇＲＮＡ、７種未満の異なるｇＲＮＡ、６種未満の異なるｇＲＮＡ、５種未満の異なるｇＲＮＡ、４種未満の異なるｇＲＮＡまたは３種未満の異なるｇＲＮＡであり得る。本開示の遺伝子構築体によってコードされるｇＲＮＡの数は、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡ～少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種のｇＲＮＡ～少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、または８種の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡの間であり得る。ある種の実施形態において、遺伝子構築体（例えば、ＡＡＶベクター）は、１種のｇＲＮＡ分子、すなわち、第１のｇＲＮＡ分子、および任意にＣａｓ９分子をコードする。ある種の実施形態において、第１の遺伝子構築体（例えば、第１のＡＡＶベクター）は、１種のｇＲＮＡ分子、すなわち、第１のｇＲＮＡ分子、および任意にＣａｓ９分子をコードし、第２の遺伝子構築体（例えば、第２のＡＡＶベクター）は、１種のｇＲＮＡ分子、すなわち、第２のｇＲＮＡ分子、および任意にＣａｓ９分子をコードする。
【0052】
ｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列である標的ドメイン（標的配列とも称される）を含む。ｇＲＮＡは、標的ドメインまたは相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端において「Ｇ」を含んでもよい。ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対または少なくとも３５塩基対の相補的ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の４０塩基対未満、３５塩基対未満、３０塩基対未満、２５塩基対未満、２０塩基対未満、１９塩基対未満、１８塩基対未満、１７塩基対未満、１６塩基対未満、１５塩基対未満、１４塩基対未満、１３塩基対未満、１２塩基対未満、１１塩基対未満または１０塩基対未満の相補的ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、１９～２５個のヌクレオチドの長さを有する。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、２０個のヌクレオチドの長さである。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、２１個のヌクレオチドの長さである。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、２２個のヌクレオチドの長さである。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的ドメインは、２３個のヌクレオチドの長さである。
【0053】
ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）の領域を標的としてもよい。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエキソン、イントロン、プロモーター領域、エンハンサー領域、転写領域の内の少なくとも１種を標的としてもよい。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４を標的とする。ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５を標的とする。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、各々、エキソン４５～５５が欠失するようにヒトジストロフィン遺伝子のイントロンを標的とする。ｇＲＮＡは、配列番号２に対応するポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補物に結合してもよく、標的としてもよい。ｇＲＮＡは、配列番号２を含むポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補物によってコードされてもよい。ｇＲＮＡの標的配列は、配列番号２のポリヌクレオチドもしくはその断片、例えばその５’短縮物、またはその相補物を含んでもよい。短縮物は、例えば、配列番号２より１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド短くてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチドに結合してもよく、標的としてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチドの５’短縮物に結合してもよく、標的としてもよい。ｇＲＮＡは、配列番号３に対応するポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補物に結合してもよく、標的としてもよい。ｇＲＮＡは、配列番号３を含むポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補物によってコードされてもよい。ｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３のポリヌクレオチドもしくはその断片、例えばその５’短縮物、またはその相補物を含んでもよい。短縮物は、例えば、配列番号３より１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド短くてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチドに結合してもよく、標的としてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチドの５’短縮物に結合してもよく、標的としてもよい。いくつかの実施形態において、配列番号２を含むか、もしくは配列番号２に対応するポリヌクレオチド配列またはその短縮物に結合し、標的とするか、またはコードされるｇＲＮＡは、配列番号３を含むか、もしくは配列番号３に対応するポリヌクレオチド配列またはその短縮物に結合し、標的とするか、またはコードされるｇＲＮＡに対合する。
【0054】
単一ｇＲＮＡまたは多重ｇＲＮＡは、ジストロフィンのエキソン４５～５５における突然変異ホットスポットを標的とすることによってジストロフィンリーディングフレームを回復するように設計され得る。本開示のベクターによる処置の後、インビトロでデュシェンヌ型患者筋細胞においてジストロフィン発現が回復され得る。遺伝子的に補正された患者細胞を免疫不全マウスに移植した後、インビボにおいてヒトジストロフィンが検出された。意義深いことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の固有の多重遺伝子編集能力によって、汎用のまたは患者特異的な遺伝子編集手法によって患者突然変異の最高６２％を補正することが可能なこの突然変異ホットスポット領域の大きな欠失を効率的に生成することが可能になる。いくつかの実施形態において、候補ｇＲＮＡは、調査者によって測定される非特異的活性、特異的活性、およびエキソンからの距離に基づいて評価され、選択される。
【0055】
（３）ｇＲＮＡ足場
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、少なくとも１つのｇＲＮＡ足場を含む。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ活性へのＣａｓ９結合を容易にする。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡ標的配列に続くポリヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ標的配列およびｇＲＮＡ足場は、一緒に１つのポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ足場は、配列番号４のポリヌクレオチド配列またはその相補物を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ足場は、配列番号４のポリヌクレオチド配列またはその相補物によってコードされる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２もしくは配列番号３の配列またはその短縮物を標的とするポリヌクレオチドと、配列番号４のｇＲＮＡ足場に対応するかまたはコードされるポリヌクレオチドとを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、少なくとも１つのｇＲＮＡ足場を含む。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ活性へのＣａｓ９結合を容易にする。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡ標的配列に続くポリヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ標的配列およびｇＲＮＡ足場は、一緒に１つのポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ足場は、配列番号４のポリヌクレオチド配列またはその相補物を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ足場は、配列番号４のポリヌクレオチド配列またはその相補物によってコードされる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２もしくは配列番号３の配列またはその短縮物を標的とするポリヌクレオチドと、配列番号４のｇＲＮＡ足場に対応するかまたはコードされるポリヌクレオチドとを含む。
【0056】
３． ＤＮＡ標的組成物
そのような遺伝子構築体を含むＤＮＡ標的組成物は、本明細書においてさらに開示される。ＤＮＡ標的組成物は、上記のようにジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子（例えば、２種のｇＲＮＡ分子）を含む。少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、標的領域に結合することが可能であり、認識することが可能である。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム転換によってジストロフィンリーディングフレームを回復するように可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択され得る。標的領域は、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位であることも可能であり、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失は、スプライス部位破壊およびエキソン排除によって、スプライシングを破壊し、ジストロフィンリーディングフレームを回復する。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失が、停止コドンを除去するか、または破壊することによって、ジストロフィンリーディングフレームを回復するような、異所性終止コドンでもあり得る。
そのような遺伝子構築体を含むＤＮＡ標的組成物は、本明細書においてさらに開示される。ＤＮＡ標的組成物は、上記のようにジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子（例えば、２種のｇＲＮＡ分子）を含む。少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、標的領域に結合することが可能であり、認識することが可能である。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム転換によってジストロフィンリーディングフレームを回復するように可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択され得る。標的領域は、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位であることも可能であり、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失は、スプライス部位破壊およびエキソン排除によって、スプライシングを破壊し、ジストロフィンリーディングフレームを回復する。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失が、停止コドンを除去するか、または破壊することによって、ジストロフィンリーディングフレームを回復するような、異所性終止コドンでもあり得る。
【0057】
ある種の実施形態において、本開示のＤＮＡ標的組成物は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含む。第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドもしくはその短縮物またはその相補物に結合してもよいか、または標的としてもよい。第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２および配列番号３に対応するポリヌクレオチドもしくはその短縮物またはその相補物を含んでもよい。
本開示のベクターの欠失効率は、欠失の大きさ、すなわち、ベクターによって欠失するセグメントの大きさに関連する可能性がある。ある種の実施形態において、特異的欠失の長さまたは大きさは、標的とする遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）内のＰＡＭ配列間の距離によって決定される。ある種の実施形態において、その長さおよびそれが含む配列（例えば、エキソン５１）に関して定義されるジストロフィン遺伝子のセグメントの特異的欠失は、標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の中の特異的ＰＡＭ配列に隣接してなされた切断の結果である。
本開示のベクターの欠失効率は、欠失の大きさ、すなわち、ベクターによって欠失するセグメントの大きさに関連する可能性がある。ある種の実施形態において、特異的欠失の長さまたは大きさは、標的とする遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）内のＰＡＭ配列間の距離によって決定される。ある種の実施形態において、その長さおよびそれが含む配列（例えば、エキソン５１）に関して定義されるジストロフィン遺伝子のセグメントの特異的欠失は、標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の中の特異的ＰＡＭ配列に隣接してなされた切断の結果である。
【0058】
ある種の実施形態において、欠失の大きさは、約５０～約２，０００塩基対（ｂｐ）、例えば、約５０～約１９９９ｂｐ、約５０～約１９００ｂｐ、約５０～約１８００ｂｐ、約５０～約１７００ｂｐ、約５０～約１６５０ｂｐ、約５０～約１６００ｂｐ、約５０～約１５００ｂｐ、約５０～約１４００ｂｐ、約５０～約１３００ｂｐ、約５０～約１２００ｂｐ、約５０～約１１５０ｂｐ、約５０～約１１００ｂｐ、約５０～約１０００ｂｐ、約５０～約９００ｂｐ、約５０～約８５０ｂｐ、約５０～約８００ｂｐ、約５０～約７５０ｂｐ、約５０～約７００ｂｐ、約５０～約６００ｂｐ、約５０～約５００ｂｐ、約５０～約４００ｂｐ、約５０～約３５０ｂｐ、約５０～約３００ｂｐ、約５０～約２５０ｂｐ、約５０～約２００ｂｐ、約５０～約１５０ｂｐ、約５０～約１００ｂｐ、約１００～約１９９９ｂｐ、約１００～約１９００ｂｐ、約１００～約１８００ｂｐ、約１００～約１７００ｂｐ、約１００～約１６５０ｂｐ、約１００～約１６００ｂｐ、約１００～約１５００ｂｐ、約１００～約１４００ｂｐ、約１００～約１３００ｂｐ、約１００～約１２００ｂｐ、約１００～約１１５０ｂｐ、約１００～約１１００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約９００ｂｐ、約１００～約８５０ｂｐ、約１００～約８００ｂｐ、約１００～約７５０ｂｐ、約１００～約７００ｂｐ、約１００～約６００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約４００ｂｐ、約１００～約３５０ｂｐ、約１００～約３００ｂｐ、約１００～約２５０ｂｐ、約１００～約２００ｂｐ、約１００～約１５０ｂｐ、約２００～約１９９９ｂｐ、約２００～約１９００ｂｐ、約２００～約１８００ｂｐ、約２００～約１７００ｂｐ、約２００～約１６５０ｂｐ、約２００～約１６００ｂｐ、約２００～約１５００ｂｐ、約２００～約１４００ｂｐ、約２００～約１３００ｂｐ、約２００～約１２００ｂｐ、約２００～約１１５０ｂｐ、約２００～約１１００ｂｐ、約２００～約１０００ｂｐ、約２００～約９００ｂｐ、約２００～約８５０ｂｐ、約２００～約８００ｂｐ、約２００～約７５０ｂｐ、約２００～約７００ｂｐ、約２００～約６００ｂｐ、約２００～約２０００ｂｐ、約２００～約４００ｂｐ、約２００～約３５０ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約２００～約２５０ｂｐ、約３００～約１９９９ｂｐ、約３００～約１９００ｂｐ、約３００～約１８００ｂｐ、約３００～約１７００ｂｐ、約３００～約１６５０ｂｐ、約３００～約１６００ｂｐ、約３００～約１５００ｂｐ、約３００～約１４００ｂｐ、約３００～約１３００ｂｐ、約３００～約１２００ｂｐ、約３００～約１１５０ｂｐ、約３００～約１１００ｂｐ、約３００～約１０００ｂｐ、約３００～約９００ｂｐ、約３００～約８５０ｂｐ、約３００～約８００ｂｐ、約３００～約７５０ｂｐ、約３００～約７００ｂｐ、約３００～約６００ｂｐ、約３００～約３０００ｂｐ、約３００～約４００ｂｐ、または約３００～約３５０ｂｐである。ある種の実施形態において、欠失の大きさは、約１１８塩基対、約２３３塩基対、約３２６塩基対、約７６６塩基対、約８０５塩基対または約１６１１塩基対であり得る。
【0059】
４． 筋肉におけるゲノム編集のための組成物
例えば、対象の骨格筋および／または心筋における標的遺伝子など、対象における標的遺伝子をゲノム編集するための遺伝子構築体またはその組成物が、本明細書において開示される。遺伝子構築体は、ベクターであってもよい。ベクターは、修飾ＡＡＶベクターであってもよい。組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。組成物は、活性型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を骨格筋または心筋に送達してもよい。本開示の遺伝子構築体は、遺伝子疾患および／または例えばＤＭＤなどの他の骨格筋状態もしくは心筋状態に関与するジストロフィン遺伝子における突然変異の効果を補正するか、または低下させる際に使用され得る。組成物は、さらにドナーＤＮＡまたは導入遺伝子を含んでもよい。これらの組成物は、ゲノム編集、ゲノム操作や、遺伝子疾患ならびに／または他の骨格筋状態および／もしくは心筋状態に関与する遺伝子における突然変異の効果を補正するか、または低下させる際に使用されてもよい。
例えば、対象の骨格筋および／または心筋における標的遺伝子など、対象における標的遺伝子をゲノム編集するための遺伝子構築体またはその組成物が、本明細書において開示される。遺伝子構築体は、ベクターであってもよい。ベクターは、修飾ＡＡＶベクターであってもよい。組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。組成物は、活性型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を骨格筋または心筋に送達してもよい。本開示の遺伝子構築体は、遺伝子疾患および／または例えばＤＭＤなどの他の骨格筋状態もしくは心筋状態に関与するジストロフィン遺伝子における突然変異の効果を補正するか、または低下させる際に使用され得る。組成物は、さらにドナーＤＮＡまたは導入遺伝子を含んでもよい。これらの組成物は、ゲノム編集、ゲノム操作や、遺伝子疾患ならびに／または他の骨格筋状態および／もしくは心筋状態に関与する遺伝子における突然変異の効果を補正するか、または低下させる際に使用されてもよい。
【0060】
ａ． ジストロフィンを標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系
ジストロフィン遺伝子に足して特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が、本明細書において開示される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９と、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも１種のｇＲＮＡとを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的領域に結合してもよく、認識してもよい。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム転換によってジストロフィンリーディングフレームを回復するように可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択されてもよい。標的領域は、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位であってもよく、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失は、スプライス部位破壊およびエキソン排除によって、スプライシングを破壊し、ジストロフィンリーディングフレームを回復する。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失が、停止コドンを除去するか、または破壊することによって、ジストロフィンリーディングフレームを回復するように、異所性終止コドンであってもよい。標的領域は、ジストロフィン遺伝子のイントロンを含んでもよい。標的領域は、ジストロフィン遺伝子のエキソンを含んでもよい。
ジストロフィン遺伝子に足して特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が、本明細書において開示される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、Ｃａｓ９と、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも１種のｇＲＮＡとを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的領域に結合してもよく、認識してもよい。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム転換によってジストロフィンリーディングフレームを回復するように可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択されてもよい。標的領域は、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位であってもよく、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失は、スプライス部位破壊およびエキソン排除によって、スプライシングを破壊し、ジストロフィンリーディングフレームを回復する。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失が、停止コドンを除去するか、または破壊することによって、ジストロフィンリーディングフレームを回復するように、異所性終止コドンであってもよい。標的領域は、ジストロフィン遺伝子のイントロンを含んでもよい。標的領域は、ジストロフィン遺伝子のエキソンを含んでもよい。
【0061】
ｂ． アデノ随伴ウイルスベクター
組成物は、ウイルス送達系を含んでもよい。ある種の実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス科のデペンドウイルス属に属する小さいウイルスである。ＡＡＶベクターは、各種構築体構成を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を送達するために使用されてもよい。例えば、ＡＡＶベクターは、別々のベクターまたは同じベクター上のＣａｓ９およびｇＲＮＡ発現カセットを送達してもよい。別の場合、黄色ブドウ球菌または髄膜炎菌などの種に由来する小さいＣａｓ９タンパク質が用いられる場合、４．７ｋｂパッケージング限界の中で単一ＡＡＶベクターにおいてＣａｓ９と最高で２種のｇＲＮＡ発現カセットとの両方を組み合わせてもよい。
組成物は、ウイルス送達系を含んでもよい。ある種の実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス科のデペンドウイルス属に属する小さいウイルスである。ＡＡＶベクターは、各種構築体構成を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を送達するために使用されてもよい。例えば、ＡＡＶベクターは、別々のベクターまたは同じベクター上のＣａｓ９およびｇＲＮＡ発現カセットを送達してもよい。別の場合、黄色ブドウ球菌または髄膜炎菌などの種に由来する小さいＣａｓ９タンパク質が用いられる場合、４．７ｋｂパッケージング限界の中で単一ＡＡＶベクターにおいてＣａｓ９と最高で２種のｇＲＮＡ発現カセットとの両方を組み合わせてもよい。
【0062】
ある種の実施形態において、ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶベクターである。修飾ＡＡＶベクターは、増強された心筋組織親和性および骨格筋組織親和性を有してもよい。修飾ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を送達し、発現することが可能であってもよい。例えば、修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであってもよい（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏら（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２３：６３５～６４６）。修飾ＡＡＶベクターは、インビボにおいて骨格筋および心筋にヌクレアーゼを送達してもよい。修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含むいくつかのカプシド型の内の１種または複数種に基づいてもよい。修飾ＡＡＶベクターは、全身送達および局所送達によって骨格筋または心筋を効率的に形質導入するＡＡＶ２／１ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、ＡＡＶ２／９ベクター、ＡＡＶ２．５ベクターおよびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替的筋肉親和性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づいてもよい（Ｓｅｔｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９～１５１）。修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９であってもよい（Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）２８８：２８８１４～２８８２３）。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ７４であってもよい。
【0063】
５． 方法
ａ． 筋肉におけるゲノム編集の方法
対象におけるゲノム編集の方法が、本明細書において開示される。ゲノム編集は、対象の骨格筋および／または心筋におけるものであってもよい。方法は、上記に記載されているゲノム編集のための系または組成物を対象の骨格筋および／または心筋に投与することを含んでもよい。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補正すること、または導入遺伝子を挿入することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正することは、突然変異遺伝子を欠失させること、再配列すること、または置換することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正することは、ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪまたはヌクレアーゼ媒介ＨＤＲを含んでもよい。
ａ． 筋肉におけるゲノム編集の方法
対象におけるゲノム編集の方法が、本明細書において開示される。ゲノム編集は、対象の骨格筋および／または心筋におけるものであってもよい。方法は、上記に記載されているゲノム編集のための系または組成物を対象の骨格筋および／または心筋に投与することを含んでもよい。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補正すること、または導入遺伝子を挿入することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正することは、突然変異遺伝子を欠失させること、再配列すること、または置換することを含んでもよい。突然変異遺伝子を補正することは、ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪまたはヌクレアーゼ媒介ＨＤＲを含んでもよい。
【0064】
ｂ． 突然変異遺伝子を補正し、対象を処置する方法
細胞における突然変異遺伝子（例えば、突然変異ジストロフィン遺伝子、例えば、突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を補正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患に罹患している対象を処置する方法が、本明細書において開示される。方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を細胞または対象に投与することを含むことができる。方法は、上記に記載されている骨格筋および／または心筋におけるゲノム編集のための本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の骨格筋および／または心筋に投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を骨格筋または心筋に送達するための本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物の使用によって、突然変異を含む全遺伝子または領域を置換することができる修復鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡによる完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質の発現が回復されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が標的ＤＮＡ配列に結合することによって標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。このＤＮＡ開裂は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激してもよく、それによって、２種の可能な修復経路、すなわち、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の内の１種がもたらされる。
細胞における突然変異遺伝子（例えば、突然変異ジストロフィン遺伝子、例えば、突然変異ヒトジストロフィン遺伝子）を補正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患に罹患している対象を処置する方法が、本明細書において開示される。方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を細胞または対象に投与することを含むことができる。方法は、上記に記載されている骨格筋および／または心筋におけるゲノム編集のための本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の骨格筋および／または心筋に投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を骨格筋または心筋に送達するための本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物の使用によって、突然変異を含む全遺伝子または領域を置換することができる修復鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡによる完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質の発現が回復されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系が標的ＤＮＡ配列に結合することによって標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。このＤＮＡ開裂は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激してもよく、それによって、２種の可能な修復経路、すなわち、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の内の１種がもたらされる。
【0065】
リーディングフレームを効率的に補正することが可能であり、遺伝子疾患に関与する機能的タンパク質の発現を回復することが可能な修復鋳型がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノム編集が、本明細書において提供される。開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、相同的組換えまたは選択ベース遺伝子補正に適さなくてもよい増殖制限初代細胞系における効率的補正を可能にする相同性指向修復ベース補正手法またはヌクレアーゼ媒介非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベース補正手法を用いることを含んでもよい。この戦略は、フレームシフト、早期停止コドン、異所性スプライスドナー部位または異所性スプライスアクセプター部位の原因となる非必須コード領域における突然変異によって引き起こされる遺伝子疾患の処置のための効率的遺伝子編集方法による活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の迅速でかつ堅牢な構築体を統合する。
【0066】
ｉ）ヌクレアーゼ媒介非相同末端結合
内在性変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型を用いないＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復によるものであってもよい。標的遺伝子ＲＮＡを標的とするトランジェント方法とは対照的に、一過性に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノムにおける標的遺伝子リーディングフレームの補正は、各修飾細胞およびその子孫の全てによる永久に回復された標的遺伝子発現をもたらす可能性がある。ある種の実施形態において、ＮＨＥＪは、ある種の実施形態においてＣａｓ９分子によって惹起されるＮＨＥＪを指し、二本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪである。方法は、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための対象の骨格筋または心筋に本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を投与することを含む。
内在性変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型を用いないＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復によるものであってもよい。標的遺伝子ＲＮＡを標的とするトランジェント方法とは対照的に、一過性に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノムにおける標的遺伝子リーディングフレームの補正は、各修飾細胞およびその子孫の全てによる永久に回復された標的遺伝子発現をもたらす可能性がある。ある種の実施形態において、ＮＨＥＪは、ある種の実施形態においてＣａｓ９分子によって惹起されるＮＨＥＪを指し、二本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪである。方法は、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための対象の骨格筋または心筋に本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を投与することを含む。
【0067】
ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ遺伝子補正は、突然変異標的遺伝子を補正することが可能であり、ＨＤＲ経路よりも優れたいくつかの潜在的利点を提供する。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入突然変異を引き起こす可能性があるドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲとは対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期の全ての期において効率的に働くので、筋線維などのサイクリング細胞および分裂終了細胞の両方において効果的に活用され得る。このことによって、終止コドンのオリゴヌクレオチドベースエキソンスキッピングまたは薬理学的強制リードスルーに代替的な堅牢で永続的な遺伝子回復が提供され、わずか１回の薬物処置が理論的に必要となる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系ならびにメガヌクレアーゼおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む他の操作されたヌクレアーゼを用いたＮＨＥＪベース遺伝子補正は、本明細書に記載されるプラスミドエレクトロポレーション手法に加えて、細胞ベース治療および遺伝子ベース治療のための他の既存のエクスビボプラットフォームおよびインビボプラットフォームと組み合わされてもよい。例えば、ｍＲＮＡベース遺伝子移入によるか、または精製された細胞透過性タンパク質としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の送達は、挿入突然変異のいかなる可能性も回避する、ＤＮＡを含まないゲノム編集手法を可能にすることができる。
【0068】
ｉｉ）相同性指向修復
内在性変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、相同性指向修復を含んでもよい。上記に記載されている方法は、ドナー鋳型を細胞に投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ドナー鋳型は、突然変異ジストロフィン遺伝子または相同性指向修復の後で突然変異ジストロフィン遺伝子の回復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を回復するための完全に機能的なジストロフィン構築体である、ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と称される、小型化されたジストロフィン構築体を含んでもよい。
内在性変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、相同性指向修復を含んでもよい。上記に記載されている方法は、ドナー鋳型を細胞に投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ドナー鋳型は、突然変異ジストロフィン遺伝子または相同性指向修復の後で突然変異ジストロフィン遺伝子の回復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を回復するための完全に機能的なジストロフィン構築体である、ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と称される、小型化されたジストロフィン構築体を含んでもよい。
【0069】
ｉｉｉ）突然変異遺伝子を補正し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて対象を処置する方法
本開示は、突然変異を含む全遺伝子または領域を置換することができる修復鋳型またはドナーＤＮＡによる完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質の発現を回復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノム編集にも指向される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系がｇＲＮＡを用いて標的ＤＮＡ配列に結合することによって標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、それらの高い割合の成功した効率的な遺伝子修飾による高度なゲノム編集の利点を有する。このＤＮＡ開裂は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激してもよく、それによって、２種の可能な修復経路、すなわち、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の内の１種がもたらされる。
本開示は、突然変異を含む全遺伝子または領域を置換することができる修復鋳型またはドナーＤＮＡによる完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質の発現を回復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノム編集にも指向される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、標的ゲノム遺伝子座において部位特異的二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系がｇＲＮＡを用いて標的ＤＮＡ配列に結合することによって標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、それらの高い割合の成功した効率的な遺伝子修飾による高度なゲノム編集の利点を有する。このＤＮＡ開裂は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激してもよく、それによって、２種の可能な修復経路、すなわち、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の内の１種がもたらされる。
【0070】
本開示は、リーディングフレームを効率的に補正することが可能であり、遺伝子疾患に関与する機能的タンパク質の発現を回復することが可能な修復鋳型がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系によるゲノム編集に指向される。開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系および方法は、相同的組換えまたは選択ベース遺伝子補正に適さなくてもよい増殖制限初代細胞系における効率的補正を可能にする相同性指向修復手法またはヌクレアーゼ媒介非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベース補正手法を用いることを含んでもよい。この戦略は、フレームシフト、早期停止コドン、異所性スプライスドナー部位または異所性スプライスアクセプター部位の原因となる非必須コード領域における突然変異によって引き起こされる遺伝子疾患の処置のための効率的遺伝子編集方法による活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の迅速でかつ堅牢な構築体を統合する。
【0071】
本開示は、細胞における突然変異遺伝子を補正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患に罹患している対象を処置する方法を提供する。方法は、上記に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の組成物を細胞または対象に投与することを含んでもよい。方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を投与することを含んでもよく、例えば、ヌクレアーゼ活性を有する第２のドメインを含むＣａｓ９タンパク質もしくはＣａｓ９融合タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質もしくはＣａｓ９融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および／または少なくとも１種のｇＲＮＡを投与することを含んでもよく、ここでｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列は、重複していてもよい。細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、上記に記載されているように、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡまたは少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであってもよい。方法は、相同性指向修復または非相同末端結合を含んでもよい。
【0072】
ｃ． 疾患を処置する方法
本開示は、必要に応じて対象を処置する方法に指向される。方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。ある種の実施形態において、方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含んでもよい。ある種の実施形態において、方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の静脈に投与することを含んでもよい。ある種の実施形態において、対象は、変性もしくは脱力または遺伝子疾患を引き起こす骨格筋状態または心筋状態に罹患している。例えば、対象は、上記に記載されているデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患していてもよい。
本開示は、必要に応じて対象を処置する方法に指向される。方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。ある種の実施形態において、方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含んでもよい。ある種の実施形態において、方法は、上記に記載されている本開示の系もしくは遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物を対象の静脈に投与することを含んでもよい。ある種の実施形態において、対象は、変性もしくは脱力または遺伝子疾患を引き起こす骨格筋状態または心筋状態に罹患している。例えば、対象は、上記に記載されているデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患していてもよい。
【0073】
ｉ）デュシェンヌ型筋ジストロフィー
上記に記載されている方法は、ジストロフィン遺伝子を補正し、前記突然変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能的なタンパク質発現または部分的に機能的なタンパク質発現を回復するために使用されてもよい。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤの効果（例えば、臨床的病徴／臨床的指標）を低下させるための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤを処置するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤを予防するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤのさらなる進行を予防するための方法を提供する。
上記に記載されている方法は、ジストロフィン遺伝子を補正し、前記突然変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能的なタンパク質発現または部分的に機能的なタンパク質発現を回復するために使用されてもよい。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤの効果（例えば、臨床的病徴／臨床的指標）を低下させるための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤを処置するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤを予防するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤのさらなる進行を予防するための方法を提供する。
【0074】
６． 構築体およびプラスミド
上記に記載されている組成物は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする１種または複数種の遺伝子構築体を含んでもよい。プラスミドなどの遺伝子構築体は、Ｃａｓ９タンパク質および／もしくはＣａｓ９融合タンパク質ならびに／またはｇＲＮＡの内の少なくとも１種などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸を含んでもよい。上記に記載されている組成物は、本明細書に開示される、修飾ＡＡＶベクターをコードする遺伝子構築体と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸配列とを含んでもよい。プラスミドなどの遺伝子構築体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸を含んでもよい。上記に記載されている組成物は、本明細書に開示される修飾レンチウイルスベクターをコードする遺伝子構築体を含んでもよい。
上記に記載されている組成物は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする１種または複数種の遺伝子構築体を含んでもよい。プラスミドなどの遺伝子構築体は、Ｃａｓ９タンパク質および／もしくはＣａｓ９融合タンパク質ならびに／またはｇＲＮＡの内の少なくとも１種などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸を含んでもよい。上記に記載されている組成物は、本明細書に開示される、修飾ＡＡＶベクターをコードする遺伝子構築体と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸配列とを含んでもよい。プラスミドなどの遺伝子構築体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸を含んでもよい。上記に記載されている組成物は、本明細書に開示される修飾レンチウイルスベクターをコードする遺伝子構築体を含んでもよい。
【0075】
組換えプラスミドまたは組換えウイルス粒子などの遺伝子構築体は、Ｃａｓ９融合タンパク質および少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子構築体は、Ｃａｓ９融合タンパク質および少なくとも２種の異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子構築体は、Ｃａｓ９融合タンパク質および２種超の異なるｇＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子構築体は、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。遺伝子構築体は、機能的染色体外分子として細胞内に存在してもよい。遺伝子構築体は、セントロメア、テロメアまたはプラスミドもしくはコスミドを含む線状ミニ染色体であってもよい。
【0076】
遺伝子構築体は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルス随伴ウイルスを含む組換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築体は、弱毒化された、生きている微生物または細胞内で生きる組換え微生物ベクターにおける遺伝子材料の一部であってもよい。遺伝子構築体は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含んでもよい。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドンまたはポリアデニル化シグナルであってもよい。
【0077】
ある種の実施形態において、遺伝子構築体はベクターである。ベクターは、少なくとも１種のＣａｓ９分子および少なくとも１種のｇＲＮＡ分子をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであることが可能であり、ベクターは、哺乳動物の細胞において少なくとも１種のＣａｓ９分子および少なくとも１種のｇＲＮＡ分子を発現することが可能である。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、インビボにおける遺伝子治療のために使用され得る。ベクターは、組換えであってもよい。ベクターは、Ｃａｓ９融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系などの融合タンパク質をコードする異種核酸を含んでもよい。ベクターは、プラスミドであってもよい。ベクターは、形質転換された宿主細胞が、Ｃａｓ９融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の発現が生じる条件下で培養され、維持される、Ｃａｓ９融合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするために有用であってもよい。
コード配列は、発現の安定性および高レベルについて最適化されてもよい。いくつかの例において、コドンは、分子内結合により形成されたものなどのＲＮＡの二次構造形成を低下させるために選択される。
コード配列は、発現の安定性および高レベルについて最適化されてもよい。いくつかの例において、コドンは、分子内結合により形成されたものなどのＲＮＡの二次構造形成を低下させるために選択される。
【0078】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする異種核酸を含んでもよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系コード配列の上流にあってもよい開始コドンと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系コード配列の下流にあってもよい停止コドンとをさらに含んでもよい。開始コドンおよび終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系コード配列を有するフレーム内にあってもよい。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系コード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系コード配列に作動可能に連結されるプロモーターは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長鎖末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ即時早期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、例えばヒトＵ６プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってもよい。プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。プロモーターは、天然または合成の筋肉特異的プロモーターまたは皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号および米国特許出願公開第２００４０１９２５９３号に記載されており、それらの内容は、全体が本明細書に組み込まれる。筋肉特異的プロモーターの例としては、Ｓｐｃ５－１２プロモーター（その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１９２５９３号、Ｈａｋｉｍら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４００２、およびＬａｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．（２０１４）２３（１２）：３１８９～３１９９に記載）、ＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００７）１５：３２０～３２９に記載）、ＣＫ８プロモーター（Ｐａｒｋら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ （２０１５）１０（４）：ｅ０１２４９１４に記載）およびＣＫ８ｅプロモーター（Ｍｕｉｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４０２５に記載）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質の発現は、ｔＲＮＡによって駆動される。
【0079】
ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするポリヌクレオチド配列の各々は、各々がプロモーターに作動可能に連結されてもよい。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子に作動可能に連結されるプロモーターは、同じプロモーターであってもよい。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子に作動可能に連結されるプロモーターは、異なるプロモーターであってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターまたは調節可能プロモーターであってもよい。プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。組織特異的プロモーターは、筋肉特異的プロモーターであってもよい。筋肉特異的プロモーターの例としては、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターおよびＳｐｃ５１２プロモーターを挙げることができる。プロモーターは、例えば、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５１２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーターであってもよい。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の下流にあってもよいポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルまたはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に由来するポリアデニル化シグナルであってもよい。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の下流にあってもよいポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルまたはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に由来するポリアデニル化シグナルであってもよい。
【0080】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系の上流におけるエンハンサー、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質コード配列もしくはＣａｓ９融合タンパク質コード配列またはｓｇＲＮＡ、あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を含んでもよい。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必要であってもよい。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶまたはＥＢＶに由来するものであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，９６２，４２８号およびＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は、参照により完全に組み込まれている。ベクターは、染色体外でベクターを維持し、細胞におけるベクターの複数のコピーを生成するために、哺乳動物の複製開始点を含んでもよい。ベクターは、ベクターが投与される哺乳動物細胞またはヒト細胞における遺伝子発現によく適している可能性がある調節配列を含んでもよい。ベクターは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポータ遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含んでもよい。
【0081】
ベクターは、参照により完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む通常の技術および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための発現ベクターまたは発現系であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする核酸配列と少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸配列とを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系をコードする核酸配列を含んでもよい。
７． 医薬組成物
本開示の主題は、上記の遺伝子構築体を含む組成物を提供する。本明細書において詳細に述べられる医薬組成物は、用いられる投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、それらは、無菌で、発熱性物質を含まず、粒子状物質を含まない。等張製剤が、好ましくは用いられる。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
７． 医薬組成物
本開示の主題は、上記の遺伝子構築体を含む組成物を提供する。本明細書において詳細に述べられる医薬組成物は、用いられる投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、それらは、無菌で、発熱性物質を含まず、粒子状物質を含まない。等張製剤が、好ましくは用いられる。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
【0082】
組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含んでもよい。医薬的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤として機能的な分子であってもよい。医薬的に許容し得る賦形剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、小胞、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオンもしくはナノ粒子を含むことができるトランスフェクション促進剤、または他の知られたトランスフェクション促進剤であってもよい。
【0083】
トランスフェクション促進剤は、ポリＬ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリＬ－グルタミン酸塩であり、より好ましくは、ポリＬ－グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための組成物中に存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体ならびに小胞、例えばスクアレンおよびスクアレンを含んでもよく、ヒアルロン酸は、遺伝子構築体と共に投与されて用いられてもよい。いくつかの実施形態において、組成物をコードするＤＮＡベクターは、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、ＤＮＡ－リポソーム混合物としての当技術分野で知られているレシチンリポソームもしくは他のリポソームを含むリポソーム（例えば、国際特許公開第ＷＯ９３２４６４０参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオンまたはナノ粒子、あるいは他の知られたトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリＬ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。
【0084】
８． 送達方法
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはその組成物を細胞に送達する方法が、本明細書において提供される。組成物の送達は、細胞において発現し、細胞の表面に送達される核酸分子としての組成物のトランスフェクションまたはエレクトロポレーションであってもよい。核酸分子のエレクトロポレーションは、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌデバイスまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂデバイスを用いて行われてもよい。ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーション溶液、Ｓｉｇｍａリン酸塩緩衝食塩水製品＃Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含むいくつかの異なる緩衝液が用いられてもよい。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００などのトランスフェクション試薬を含んでもよい。
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはその組成物を細胞に送達する方法が、本明細書において提供される。組成物の送達は、細胞において発現し、細胞の表面に送達される核酸分子としての組成物のトランスフェクションまたはエレクトロポレーションであってもよい。核酸分子のエレクトロポレーションは、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌデバイスまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂデバイスを用いて行われてもよい。ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーション溶液、Ｓｉｇｍａリン酸塩緩衝食塩水製品＃Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含むいくつかの異なる緩衝液が用いられてもよい。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００などのトランスフェクション試薬を含んでもよい。
【0085】
組織への本開示の遺伝子構築体または組成物の送達の際、および哺乳動物の細胞内へのベクターの送達の際、トランスフェクション細胞は、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を発現する。遺伝子構築体または組成物は、遺伝子発現を変更するために、またはゲノムを再操作もしくは変更するために哺乳動物に投与されてもよい。例えば、遺伝子構築体または組成物は、哺乳動物におけるジストロフィン遺伝子を補正するために哺乳動物に投与されてもよい。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラットまたはニワトリであってもよく、好ましくはヒト、ウシ、ブタまたはニワトリであってもよい。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードする遺伝子構築体（例えば、ベクター）は、インビボにおけるエレクトロポレーションベクター、リポソーム媒介ベクター、ナノ粒子促進ベクターおよび／または組換えベクターのある場合、ならびにない場合におけるＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）によって哺乳動物に送達され得る。組換えベクターは、いずれのウイルス様式によっても送達され得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードする遺伝子構築体（例えば、ベクター）は、インビボにおけるエレクトロポレーションベクター、リポソーム媒介ベクター、ナノ粒子促進ベクターおよび／または組換えベクターのある場合、ならびにない場合におけるＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）によって哺乳動物に送達され得る。組換えベクターは、いずれのウイルス様式によっても送達され得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
【0086】
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）を遺伝子的に補正するために細胞内に導入され得る。ある種の実施形態において、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、ＤＭＤ患者に由来する筋芽細胞内に導入される。ある種の実施形態において、遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、ＤＭＤ患者に由来する繊維芽細胞内に導入され、遺伝子的に補正された繊維芽細胞は、補正されたジストロフィンタンパク質が機能的であるかを確認するために、かつ／または対象を処置するために対象の損傷筋肉などの対象内に埋め込まれ得る筋芽細胞への分化を誘導するために、ＭｙｏＤで処置され得る。修飾細胞は、誘導多能性幹細胞などの幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者に由来するヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞であることも可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、誘導多能性幹細胞の神経分化または筋原性分化を引き起こしてもよい。
【0087】
９． 投与経路
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入による、口腔内投与による、胸膜腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、鞘内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって対象に投与されてもよい。ある種の実施形態において、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）または組成物は、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで、対象（例えば、ＤＭＤに罹患している対象）に投与される。獣医学的使用のために、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）または組成物は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容し得る製剤として投与されてもよい。獣医師は、特定の動物のために最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定してもよい。組成物は、従来の注射器、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学法」もしくは超音波によって投与されてもよい。
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入による、口腔内投与による、胸膜腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、鞘内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって対象に投与されてもよい。ある種の実施形態において、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）または組成物は、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで、対象（例えば、ＤＭＤに罹患している対象）に投与される。獣医学的使用のために、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）または組成物は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容し得る製剤として投与されてもよい。獣医師は、特定の動物のために最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定してもよい。組成物は、従来の注射器、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学法」もしくは超音波によって投与されてもよい。
【0088】
本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）または組成物は、インビボにおけるエレクトロポレーションベクター、リポソーム媒介ベクター、ナノ粒子促進ベクター、組換えベクター、例えば、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルス随伴ウイルスのある場合、ならびにない場合におけるＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含むいくつかの技術によって哺乳動物に送達されてもよい。組成物は、骨格筋または心筋に注射されてもよい。例えば、組成物は、前脛骨筋または尾部に注射されてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾静脈注射（全身）、２）筋肉内注射、例えば、成体マウスにおけるＴＡまたは腓腹筋などの筋肉内への局所注射、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注射（全身）によって投与される。
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはその組成物は、１）成体マウス内への尾静脈注射（全身）、２）筋肉内注射、例えば、成体マウスにおけるＴＡまたは腓腹筋などの筋肉内への局所注射、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、または４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注射（全身）によって投与される。
【0089】
１０． 細胞型
これらの送達方法および／または投与経路の内のいずれかは、種々の細胞型で利用され得る。細胞型としては、不死化筋芽細胞、例えば野生型系およびＤＭＤ患者由来系、例えばΔ４８－５０ＤＭＤ細胞系、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８－５０）細胞系、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）細胞系、Ｃ２５Ｃ１４細胞系およびＤＭＤ－７７９６細胞系、始原ＤＭＤ皮膚繊維芽細胞（ｐｒｉｍａｌ ＤＭＤ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、誘導多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者に由来するヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、ならびにＭｙｏＤ形質導入細胞またはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子的に補正された筋原細胞のクローン誘導のために用いられ得る。遺伝子的に補正されたジストロフィン遺伝子を含み、ゲノムのタンパク質コード領域において他のヌクレアーゼ導入突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離し、増殖させるために、細胞をエクスビボで修飾することが可能である。別の場合、非ウイルス遺伝子移入もしくは非統合ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質と細胞透過性モチーフを含むｇＲＮＡとの直接送達によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系の一過性インビボ送達は、外来性ＤＮＡ組み込みのリスクが最小限であるか、またはない、インサイチュにおける非常に特異的な補正を可能にする可能性がある。
これらの送達方法および／または投与経路の内のいずれかは、種々の細胞型で利用され得る。細胞型としては、不死化筋芽細胞、例えば野生型系およびＤＭＤ患者由来系、例えばΔ４８－５０ＤＭＤ細胞系、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８－５０）細胞系、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）細胞系、Ｃ２５Ｃ１４細胞系およびＤＭＤ－７７９６細胞系、始原ＤＭＤ皮膚繊維芽細胞（ｐｒｉｍａｌ ＤＭＤ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、誘導多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者に由来するヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３＋細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、ならびにＭｙｏＤ形質導入細胞またはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子的に補正された筋原細胞のクローン誘導のために用いられ得る。遺伝子的に補正されたジストロフィン遺伝子を含み、ゲノムのタンパク質コード領域において他のヌクレアーゼ導入突然変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離し、増殖させるために、細胞をエクスビボで修飾することが可能である。別の場合、非ウイルス遺伝子移入もしくは非統合ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質と細胞透過性モチーフを含むｇＲＮＡとの直接送達によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系の一過性インビボ送達は、外来性ＤＮＡ組み込みのリスクが最小限であるか、またはない、インサイチュにおける非常に特異的な補正を可能にする可能性がある。
【0090】
１１． キット
突然変異ジストロフィン遺伝子を補正するために用いられてよいキットが、本明細書において提供される。キットは、少なくとも、突然変異ジストロフィン遺伝子を補正するためのｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を使用するための説明書とを含む。骨格筋または心筋におけるジストロフィン遺伝子のゲノム編集のために用いられてもよいキットも、本明細書において提供される。キットは、上記に記載されている、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含んでもよい。
キットに含まれる説明書は、包装材料に貼られてもよいか、または添付文書として含まれてもよい。説明書は、典型的には書かれた材料または印刷材料であるが、それらは、そのようなものに限定されるものではない。そのような説明書を記憶することが可能であり、それらを最終使用者に通知することが可能ないずれの媒体も、本開示によって検討される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本明細書において用いられる場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
突然変異ジストロフィン遺伝子を補正するために用いられてよいキットが、本明細書において提供される。キットは、少なくとも、突然変異ジストロフィン遺伝子を補正するためのｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系を使用するための説明書とを含む。骨格筋または心筋におけるジストロフィン遺伝子のゲノム編集のために用いられてもよいキットも、本明細書において提供される。キットは、上記に記載されている、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含んでもよい。
キットに含まれる説明書は、包装材料に貼られてもよいか、または添付文書として含まれてもよい。説明書は、典型的には書かれた材料または印刷材料であるが、それらは、そのようなものに限定されるものではない。そのような説明書を記憶することが可能であり、それらを最終使用者に通知することが可能ないずれの媒体も、本開示によって検討される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本明細書において用いられる場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
【0091】
突然変異ジストロフィンを補正するための、または骨格筋もしくは心筋におけるジストロフィン遺伝子のゲノム編集のための遺伝子構築体（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の領域に特異的に結合し、開裂する、上記に記載されているｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を含む修飾ＡＡＶベクターを含んでもよい。上記に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子編集系は、突然変異ジストロフィン遺伝子における特定の領域に特異的に結合し、標的とするために、キットに含まれてもよい。キットは、上記に記載されているドナーＤＮＡ、異なるｇＲＮＡまたは導入遺伝子をさらに含んでもよい。
【実施例】
【0092】
１２． 実施例
本明細書において記載される本開示の方法の他の適切な修正および適合が、容易に適用可能でかつ評価可能であり、本開示または本明細書において開示される態様および実施形態の範囲を逸脱することなく適切な均等物を用いてなされてもよいことは、当業者にとって容易に明らかであろう。本開示は、ここで詳細に記載されたが、本開示のいくつかの態様および実施形態を例示することだけを単に意図するものであり、本開示の範囲に限定するものとみなされるべきではない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるであろう。本明細書において参照される全ての雑誌の参考文献、米国特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示によって、以下の非限定的な実施例によって示される複数の実施形態および態様が詳細に述べられる。
本明細書において記載される本開示の方法の他の適切な修正および適合が、容易に適用可能でかつ評価可能であり、本開示または本明細書において開示される態様および実施形態の範囲を逸脱することなく適切な均等物を用いてなされてもよいことは、当業者にとって容易に明らかであろう。本開示は、ここで詳細に記載されたが、本開示のいくつかの態様および実施形態を例示することだけを単に意図するものであり、本開示の範囲に限定するものとみなされるべきではない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるであろう。本明細書において参照される全ての雑誌の参考文献、米国特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示によって、以下の非限定的な実施例によって示される複数の実施形態および態様が詳細に述べられる。
【0093】
（実施例１）
二重ベクター系
ＤＭＤの処置のための従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、典型的には２種以上のベクターを含む（図６、図７）。例えば、あるベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードしてもよく、第２のベクターは、２種のｇＲＮＡをコードしてもよい。別の例として、あるベクターは、Ｃａｓ９タンパク質および第１のｇＲＮＡをコードしてもよく、第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質および第２のｇＲＮＡをコードしてもよい。
複数のベクターを用いてマウスにおけるジストロフィンのエキソン４５～５５を切除する実験の概略図を図３に示し、結果を図４、図５および図１０に示す。新生仔マウスを全身／側頭静脈注射により二重ベクター系で処置した。処置の８週間後に組織を採取した。図４に示されるように、ＰＣＲおよび配列決定によって、突然変異ホットスポットエキソン４５～５５の欠失が確認された。さらなる結果が図１０に示されるが、対照遺伝子座を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（図１０、上のパネル）またはエキソン４５～５５を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（図１０、下のパネル）は、広範囲にわたるジストロフィン発現がエキソン４５～５５の欠失後に心筋において認められたが、模擬ベクター処置マウスでは認められなかったことを示す。
二重ベクター系
ＤＭＤの処置のための従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、典型的には２種以上のベクターを含む（図６、図７）。例えば、あるベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードしてもよく、第２のベクターは、２種のｇＲＮＡをコードしてもよい。別の例として、あるベクターは、Ｃａｓ９タンパク質および第１のｇＲＮＡをコードしてもよく、第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質および第２のｇＲＮＡをコードしてもよい。
複数のベクターを用いてマウスにおけるジストロフィンのエキソン４５～５５を切除する実験の概略図を図３に示し、結果を図４、図５および図１０に示す。新生仔マウスを全身／側頭静脈注射により二重ベクター系で処置した。処置の８週間後に組織を採取した。図４に示されるように、ＰＣＲおよび配列決定によって、突然変異ホットスポットエキソン４５～５５の欠失が確認された。さらなる結果が図１０に示されるが、対照遺伝子座を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（図１０、上のパネル）またはエキソン４５～５５を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ（図１０、下のパネル）は、広範囲にわたるジストロフィン発現がエキソン４５～５５の欠失後に心筋において認められたが、模擬ベクター処置マウスでは認められなかったことを示す。
【0094】
（実施例２）
二重ベクター系についての治療手法の検証
ＤＭＤ患者から単離された不死化筋芽細胞を用いて、実施例１の二重ベクターで機能的ジストロフィン遺伝子を回復するためのＣＲＩＳＰＲベース手法のさらなる検証を行った。不死化筋芽細胞は、アウトオブフレーム突然変異を生じるエキソン４８～５０の欠失を含んだ（図９Ａ）。実施例１におけるＨＥＫ２９３インビトロ実験で用いられる同じＡＡＶプラスミドを患者筋芽細胞にトランスフェクトした。
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの欠失ＰＣＲによって、エキソン４５～５５が効果的に欠失されたことが示されたが、このことは、サンガー配列決定によって確認された（図９Ｂ）。細胞溶解物のウエスタンブロットは、未処置筋芽細胞がジストロフィンタンパク質を産生しなかったが、トランスフェクトされた筋芽細胞が、ホットスポット欠失に一致した、陽性対照と比較してより小さいジストロフィンタンパク質を発現したことを示した（図９Ｃ）。これらの結果によって、ヒト突然変異を編集し、ジストロフィン発現を回復するために二重ベクター構築体を用いることができることのインビトロにおける検証がさらに提供された。
二重ベクター系についての治療手法の検証
ＤＭＤ患者から単離された不死化筋芽細胞を用いて、実施例１の二重ベクターで機能的ジストロフィン遺伝子を回復するためのＣＲＩＳＰＲベース手法のさらなる検証を行った。不死化筋芽細胞は、アウトオブフレーム突然変異を生じるエキソン４８～５０の欠失を含んだ（図９Ａ）。実施例１におけるＨＥＫ２９３インビトロ実験で用いられる同じＡＡＶプラスミドを患者筋芽細胞にトランスフェクトした。
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの欠失ＰＣＲによって、エキソン４５～５５が効果的に欠失されたことが示されたが、このことは、サンガー配列決定によって確認された（図９Ｂ）。細胞溶解物のウエスタンブロットは、未処置筋芽細胞がジストロフィンタンパク質を産生しなかったが、トランスフェクトされた筋芽細胞が、ホットスポット欠失に一致した、陽性対照と比較してより小さいジストロフィンタンパク質を発現したことを示した（図９Ｃ）。これらの結果によって、ヒト突然変異を編集し、ジストロフィン発現を回復するために二重ベクター構築体を用いることができることのインビトロにおける検証がさらに提供された。
【0095】
（実施例３）
オールインワンベクターのための成分
ＤＭＤの処置のために１ベクターＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を開発した（図６、図７）。１ベクター系の利点は、単一ベクターにおける全ての必要な編集成分を有すること、有効用量を増加させる能力、他のベクター産生（単一治療剤）の合理化、筋肉特異的プロモーター（例えば、ＣＫ８、Ｓｐｃ５１２、ＭＨＣＫ７）の使用／組み込み、ならびに（例えば、ガイド配列を変化させることによって）エキソンおよび大きい欠失の組み合わせを標的とする能力を含むことができる。開発されたオールインワンベクターの概略図を図８に示す。本明細書に記載されるオールインワンベクターの一部または全てに含まれる配列を表１に示す。図１２、図１３および図１４は、ｍｄｘマウスにおけるこれらの構築体の試験の結果を示す。オールインワンベクターについて、実施例４～７においてさらに詳細に述べる。
オールインワンベクターのための成分
ＤＭＤの処置のために１ベクターＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を開発した（図６、図７）。１ベクター系の利点は、単一ベクターにおける全ての必要な編集成分を有すること、有効用量を増加させる能力、他のベクター産生（単一治療剤）の合理化、筋肉特異的プロモーター（例えば、ＣＫ８、Ｓｐｃ５１２、ＭＨＣＫ７）の使用／組み込み、ならびに（例えば、ガイド配列を変化させることによって）エキソンおよび大きい欠失の組み合わせを標的とする能力を含むことができる。開発されたオールインワンベクターの概略図を図８に示す。本明細書に記載されるオールインワンベクターの一部または全てに含まれる配列を表１に示す。図１２、図１３および図１４は、ｍｄｘマウスにおけるこれらの構築体の試験の結果を示す。オールインワンベクターについて、実施例４～７においてさらに詳細に述べる。
【0096】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0097】
（実施例４）
オールインワンベクター１（バージョン１および２）
ベクター１の２つのバージョンを生成した。ベクター１は、前方方向における全てのプロモーター（Ｕ６、Ｈ１およびＳａＣａｓ９駆動）を有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター１のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター１のバージョン１についての配列は、配列番号１４である。
ベクター１のバージョン２は、ＣＫ８構成的プロモーターを含んだ。ベクター１のバージョン２についての配列は、配列番号１５である。
オールインワンベクター１（バージョン１および２）
ベクター１の２つのバージョンを生成した。ベクター１は、前方方向における全てのプロモーター（Ｕ６、Ｈ１およびＳａＣａｓ９駆動）を有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター１のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター１のバージョン１についての配列は、配列番号１４である。
ベクター１のバージョン２は、ＣＫ８構成的プロモーターを含んだ。ベクター１のバージョン２についての配列は、配列番号１５である。
【0098】
（実施例５）
オールインワンベクター２（バージョン１～４）
ベクター２の４つのバージョンを生成した。ベクター２は、ＳａＣａｓ９駆動プロモーターから外方に向いた逆方向におけるＵ６プロモーターを有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター２のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン１についての配列は、配列番号１６における通りである。
ベクター２のバージョン２は、ＣＫ８構成的プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン２についての配列は、配列番号１７における通りである。
ベクター２のバージョン３は、Ｓｐｃ５１２プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン３についての配列は、配列番号１８における通りである。
ベクター２のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン４についての配列は、配列番号１９における通りである。
オールインワンベクター２（バージョン１～４）
ベクター２の４つのバージョンを生成した。ベクター２は、ＳａＣａｓ９駆動プロモーターから外方に向いた逆方向におけるＵ６プロモーターを有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター２のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン１についての配列は、配列番号１６における通りである。
ベクター２のバージョン２は、ＣＫ８構成的プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン２についての配列は、配列番号１７における通りである。
ベクター２のバージョン３は、Ｓｐｃ５１２プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン３についての配列は、配列番号１８における通りである。
ベクター２のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター２のバージョン４についての配列は、配列番号１９における通りである。
【0099】
（実施例６）
オールインワンベクター３（バージョン１～４）
ベクター３の４つのバージョンを生成した。ベクター３は、ＳａＣａｓ９駆動プロモーターから外方に向いた逆方向におけるＵ６プロモーターを有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター３のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン１についての配列は、配列番号２０における通りである。
ベクター３のバージョン２は、ＣＫ８プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン２についての配列は、配列番号２１における通りである。
ベクター３のバージョン３は、Ｓｐｃ５１２プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン３についての配列は、配列番号２２における通りである。
ベクター３のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン４についての配列は、配列番号２３における通りである。
オールインワンベクター３（バージョン１～４）
ベクター３の４つのバージョンを生成した。ベクター３は、ＳａＣａｓ９駆動プロモーターから外方に向いた逆方向におけるＵ６プロモーターを有するエキソン４５～５５標的ｇＲＮＡとＳａＣａｓ９に対するミニポリアデニル化シグナルとを含んだ。
ベクター３のバージョン１は、ＥＦＳ構成的プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン１についての配列は、配列番号２０における通りである。
ベクター３のバージョン２は、ＣＫ８プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン２についての配列は、配列番号２１における通りである。
ベクター３のバージョン３は、Ｓｐｃ５１２プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン３についての配列は、配列番号２２における通りである。
ベクター３のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター３のバージョン４についての配列は、配列番号２３における通りである。
【0100】
（実施例７）
オールインワンベクター５（バージョン１～４）
ガイド配置、調節エレメントおよびＰｏｌ－ＩＩＩプロモーターの効果を決定するためにオールインワンベクター設計のパネルをスクリーニングした後、構成的プロモーターおよび筋肉特異的プロモーターで新しい一組のオールインワンベクターを作製した（図１１）。オールインワンベクターのベクター５のバージョンは、ＳＶ４０イントロン（配列番号２４参照）および異なるエレメントの配置を含んだ。
ベクター５のバージョン１は、構成的プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン１についての配列は、配列番号４１における通りである。
ベクター５のバージョン２は、ＣＫ８プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン２についての配列は、配列番号４２における通りである。
ベクター５のバージョン３は、Ｓｐｃ－５１２プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン３についての配列は、配列番号２９における通りである。
ベクター５のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン４についての配列は、配列番号３０における通りである。
オールインワンベクター５（バージョン１～４）
ガイド配置、調節エレメントおよびＰｏｌ－ＩＩＩプロモーターの効果を決定するためにオールインワンベクター設計のパネルをスクリーニングした後、構成的プロモーターおよび筋肉特異的プロモーターで新しい一組のオールインワンベクターを作製した（図１１）。オールインワンベクターのベクター５のバージョンは、ＳＶ４０イントロン（配列番号２４参照）および異なるエレメントの配置を含んだ。
ベクター５のバージョン１は、構成的プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン１についての配列は、配列番号４１における通りである。
ベクター５のバージョン２は、ＣＫ８プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン２についての配列は、配列番号４２における通りである。
ベクター５のバージョン３は、Ｓｐｃ－５１２プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン３についての配列は、配列番号２９における通りである。
ベクター５のバージョン４は、ＭＨＣＫ７プロモーターを含んだ。ベクター５のバージョン４についての配列は、配列番号３０における通りである。
【0101】
具体的な態様の前述の記載によって、他の人が、本開示の一般的概念を逸脱することなく、不当な実験なしで、当業者の技能の範囲内における知識を適用することによって、そのような具体的な態様を各種の適用のために容易に修正しかつ／または適合させることができるという本発明の一般的性質が完全に示されるであろう。ゆえに、そのような適合および修正は、本明細書に示された教示および案内に基づいて、開示された態様の均等物の意味および範囲の中にあることが意図される。本明細書における語法または用語は、記載の目的のためにあるのであって、限定する目的のためにあるのではないことを理解すべきであり、その結果、本明細書の用語または語法は、教示および案内に鑑みて当業者によって解釈されるべきである。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても限定されるべきでないが、以下の請求項およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願および／または他の文献は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれていることが個別に示されているかのように、それらの全体が同程度に全ての目的のために参照により組み込まれている。
完全性の理由のために、本開示の各種態様が、番号がつけられた以下の項において示される。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても限定されるべきでないが、以下の請求項およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願および／または他の文献は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれていることが個別に示されているかのように、それらの全体が同程度に全ての目的のために参照により組み込まれている。
完全性の理由のために、本開示の各種態様が、番号がつけられた以下の項において示される。
【0102】
項１． （ａ）ジストロフィンのイントロン４４を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、（ｂ）ジストロフィンのイントロン５５を標的とする第２のｇＲＮＡ分子、（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質、および（ｄ）１つまたは複数のＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場を含む組成物をコードする１種または複数種のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
項２． 単一のベクターを含む、項１に記載の系。
項３． ２種以上のベクターを含み、２種以上のベクターが、第１のベクターおよび第２のベクターを含む、項１に記載の系。
項４． （ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、項３に記載の系。
項５． （ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、第２のｇＲＮＡ分子をコードする、項３に記載の系。
項６． 第１のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、項５に記載の系。
項７． 第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、項５または６に記載の系。
項２． 単一のベクターを含む、項１に記載の系。
項３． ２種以上のベクターを含み、２種以上のベクターが、第１のベクターおよび第２のベクターを含む、項１に記載の系。
項４． （ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、項３に記載の系。
項５． （ａ）第１のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子をコードし、（ｂ）第２のベクターが、第２のｇＲＮＡ分子をコードする、項３に記載の系。
項６． 第１のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、項５に記載の系。
項７． 第２のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をさらにコードする、項５または６に記載の系。
【0103】
項８． Ｃａｓ９タンパク質の発現が、構成的プロモーターまたは筋肉特異的プロモーターによって駆動される、項１～７のいずれか１項に記載の系。
項９． 筋肉特異的プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターまたはＳｐｃ５１２プロモーターを含む、項８に記載の系。
項１０． 単一のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質をコードする、項２に記載の系。
項１１． ベクターが、少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の系。
項１２． 両方向性プロモーターが、第１のｇＲＮＡ分子および／または第２のｇＲＮＡ分子の発現を駆動する第１のプロモーターと、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する第２のプロモーターとを含む、項１１に記載の系。
項１３． 第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、項１～１２のいずれか１項に記載の系。
項９． 筋肉特異的プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーターまたはＳｐｃ５１２プロモーターを含む、項８に記載の系。
項１０． 単一のベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質をコードする、項２に記載の系。
項１１． ベクターが、少なくとも１種の両方向性プロモーターを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の系。
項１２． 両方向性プロモーターが、第１のｇＲＮＡ分子および／または第２のｇＲＮＡ分子の発現を駆動する第１のプロモーターと、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する第２のプロモーターとを含む、項１１に記載の系。
項１３． 第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、項１～１２のいずれか１項に記載の系。
【0104】
項１４． 第２のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチドまたはその５’短縮物を標的とする、項１～１３のいずれか１項に記載の系。
項１５． Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質またはＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質である、項１～１４のいずれか１項に記載の系。
項１６． Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場である、項１～１５のいずれか１項に記載の系。
項１７． ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、配列番号４のポリヌクレオチドを含むか、または配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされる、項１６に記載の系。
項１８． Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＳａＣａｓ９タンパク質である、項１～１７のいずれか１項に記載の系。
項１９． ベクターが、配列番号１～１３および２４から選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、項１～１８のいずれか１項に記載の系。
項２０． ベクターが、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む、項１～１９のいずれか１項に記載の系。
項２１． ベクターが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９および配列番号３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、項１～２０のいずれか１項に記載の系。
項１５． Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳａＣａｓ９タンパク質またはＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質である、項１～１４のいずれか１項に記載の系。
項１６． Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場である、項１～１５のいずれか１項に記載の系。
項１７． ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ足場が、配列番号４のポリヌクレオチドを含むか、または配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされる、項１６に記載の系。
項１８． Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＳａＣａｓ９タンパク質である、項１～１７のいずれか１項に記載の系。
項１９． ベクターが、配列番号１～１３および２４から選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、項１～１８のいずれか１項に記載の系。
項２０． ベクターが、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む、項１～１９のいずれか１項に記載の系。
項２１． ベクターが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２９および配列番号３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、項１～２０のいずれか１項に記載の系。
【0105】
項２２． ベクターがウイルスベクターである、項１～２１のいずれか１項に記載の系。
項２３． ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項１～２２のいずれか１項に記載の系。
項２４． ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３またはＡＡＶｒｈ．７４である、項２３に記載の系。
項２５． ベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される遍在性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、項１～２４のいずれか１項に記載の系。
項２６． 組織特異的プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、項２５に記載の系。
項２７． 項１～２６のいずれか１項に記載の系を含む細胞。
項２８． 項１～２６のいずれか１項に記載の系を含むキット。
項２９． 細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子を補正する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系を細胞に投与することを含む方法。
項３０． 対象における突然変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系または項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
項３１． 突然変異ジストロフィン遺伝子がある対象を処置する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系または項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
項３２． 系または細胞が、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与される、項３０または３１に記載の方法。
項２３． ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項１～２２のいずれか１項に記載の系。
項２４． ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３またはＡＡＶｒｈ．７４である、項２３に記載の系。
項２５． ベクターが、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される遍在性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含む、項１～２４のいずれか１項に記載の系。
項２６． 組織特異的プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、項２５に記載の系。
項２７． 項１～２６のいずれか１項に記載の系を含む細胞。
項２８． 項１～２６のいずれか１項に記載の系を含むキット。
項２９． 細胞における突然変異ジストロフィン遺伝子を補正する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系を細胞に投与することを含む方法。
項３０． 対象における突然変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系または項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
項３１． 突然変異ジストロフィン遺伝子がある対象を処置する方法であって、項１～２６のいずれか１項に記載の系または項２７に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
項３２． 系または細胞が、筋肉内、静脈内またはそれらの組み合わせで、対象に投与される、項３０または３１に記載の方法。
【0106】
配列
配列番号１、ＡＡＶ ＩＴＲ
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct（配列番号１）
配列番号１、ＡＡＶ ＩＴＲ
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct（配列番号１）
【0107】
配列番号２、ＪＣＲ１４３：ヒトジストロフィンイントロン４４領域を標的とするｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列
acatttcctctctatacaaatg（配列番号２）
配列番号３、ＪＣＲ１２０：ヒトジストロフィンイントロン５５領域を標的とするｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列
atatagtaatgaaattattggcac（配列番号３）
配列番号４、ＳａＣａｓ９ガイドＲＮＡ足場、ｇＲＮＡの足場
tctcgccaacaagttgacgagataaacacggcattttgccttgttttagtagattctgtttccagagtactaaaac（配列番号４）
配列番号５、Ｕ６プロモーター
ggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaatatctttgtgtttacagtcaaattaattccaattatctctctaacagccttgtatcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctc（配列番号５）
acatttcctctctatacaaatg（配列番号２）
配列番号３、ＪＣＲ１２０：ヒトジストロフィンイントロン５５領域を標的とするｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列
atatagtaatgaaattattggcac（配列番号３）
配列番号４、ＳａＣａｓ９ガイドＲＮＡ足場、ｇＲＮＡの足場
tctcgccaacaagttgacgagataaacacggcattttgccttgttttagtagattctgtttccagagtactaaaac（配列番号４）
配列番号５、Ｕ６プロモーター
ggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaatatctttgtgtttacagtcaaattaattccaattatctctctaacagccttgtatcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctc（配列番号５）
【0108】
配列番号６、Ｈ１プロモーター
gaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccac（配列番号６）
配列番号７、ＥＦＳプロモーター
tcgagtggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtgtcgtgaccgcgg（配列番号７）
gaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccac（配列番号６）
配列番号７、ＥＦＳプロモーター
tcgagtggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtgtcgtgaccgcgg（配列番号７）
【0109】
配列番号８、ＣＫ８プロモーター
ctagactagcatgctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgcatgccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccag（配列番号８）
ctagactagcatgctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgcatgccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccag（配列番号８）
【0110】
配列番号９、Ｓｐｃ５１２プロモーター
gagctccaccgcggtggcggccgtccgccttcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctctaaaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatat（配列番号９）
gagctccaccgcggtggcggccgtccgccttcggcaccatcctcacgacacccaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaaggtgggcaggcagcaggtgttggcgctctaaaaataactcccgggagttatttttagagcggaggaatggtggacacccaaatatggcgacggttcctcacccgtcgccatatttgggtgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccacgagctacccggaggagcgggaggcgccaagctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatat（配列番号９）
【0111】
配列番号１０、ＭＨＣＫ７プロモーター
gtttaaacaagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcggcgcgccc（配列番号１０）
gtttaaacaagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcggcgcgccc（配列番号１０）
【0112】
配列番号１１、ＳａＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド
aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc（配列番号１１）
aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc（配列番号１１）
【0113】
配列番号１２、ミニポリアデニル化シグナル
tagcaataaaggatcgtttattttcattggaagcgtgtgttggttttttgatcaggcgcg（配列番号１２）
配列番号１３、ｂＧＨポリアデニル化シグナル
ctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctgggga（配列番号１３）
tagcaataaaggatcgtttattttcattggaagcgtgtgttggttttttgatcaggcgcg（配列番号１２）
配列番号１３、ｂＧＨポリアデニル化シグナル
ctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctgggga（配列番号１３）
【0114】
配列番号１４、ベクター１のバージョン１
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【0115】
配列番号１５、ベクター１のバージョン２
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【0116】
配列番号１６、ベクター２のバージョン１
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【0117】
配列番号１７、ベクター２のバージョン２
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【0118】
配列番号１８、ベクター２のバージョン３
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【0119】
配列番号１９、ベクター２のバージョン４
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【0120】
配列番号２０、ベクター３のバージョン１
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【0121】
配列番号２１、ベクター３のバージョン２
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【0122】
配列番号２２、ベクター３のバージョン３
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【0123】
配列番号２３、ベクター３のバージョン４
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccTCTAGAaaaaatctcgccaacaagttgacgagataaacacggcattttgccttgttttagtagattctgtttccagagtactaaaacacatttcctctctatacaaatgCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCCTCGAGGtttaaacaagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcggcgcgcccaccggtgccaccATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatcctacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttaccCatacgatgttccagattacgcttaaGAATTCctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaGGTACCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGA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cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccTCTAGAaaaaatctcgccaacaagttgacgagataaacacggcattttgccttgttttagtagattctgtttccagagtactaaaacacatttcctctctatacaaatgCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCCTCGAGGtttaaacaagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcggcgcgcccaccggtgccaccATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatcctacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttaccCatacgatgttccagattacgcttaaGAATTCctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaGGTACCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGA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【0124】
配列番号２４、ＳＶ４０イントロンをコードするポリヌクレオチド
tctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttac
tctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttac
【0125】
配列番号２５
NNGRR（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
配列番号２６
NNGRRN（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
配列番号２７
NNGRRT（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
NNGRR（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
配列番号２６
NNGRRN（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
配列番号２７
NNGRRT（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
【0126】
配列番号２８
NNGRRV（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
NNGRRV（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴの内のいずれかであり得る）
【0127】
配列番号２９、ベクター５のバージョン３
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【0128】
配列番号３０、ベクター５のバージョン４
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccTCTAGACTCGAGagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcCCATGGtctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacgccaCCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatccGAATTCtagcaataaaggatcgtttattttcattggaagcgtgtgttggttttttgatcaggcgcgGGTACCAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACacatttcctctctatacaaatgCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCCTCGACTAGTAGAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACGTGCCAATAATTTCATTACTATATCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCA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cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccTCTAGACTCGAGagcttgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacagacagacactcaggagccagccagcCCATGGtctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacgccaCCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatccGAATTCtagcaataaaggatcgtttattttcattggaagcgtgtgttggttttttgatcaggcgcgGGTACCAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACacatttcctctctatacaaatgCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCCTCGACTAGTAGAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACGTGCCAATAATTTCATTACTATATCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCA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【0129】
配列番号３１、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅａｓ）Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
atgaaaagga actacattct ggggctggac atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt
attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac
gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga
aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat
tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg
tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac
gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc
aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa
gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc
aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact
tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc
ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt
ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat
gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag
ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct
aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa
ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa
atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc
tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc
gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc
aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg
ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg
gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg
gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag
accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg
attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc
tccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagagaac
tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct
tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag
accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat
tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg
cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc
acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac
catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag
ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct
atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc
aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac
agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg
attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg
aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag
actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc
aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt
cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac
ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat
gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca
gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg
gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact
taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt
gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag
gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggc ［配列番号３１］
atgaaaagga actacattct ggggctggac atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt
attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac
gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga
aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat
tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg
tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac
gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc
aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa
gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc
aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact
tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc
ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt
ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat
gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag
ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct
aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa
ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa
atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc
tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc
gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc
aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg
ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg
gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg
gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag
accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg
attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc
tccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagagaac
tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct
tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag
accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat
tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg
cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc
acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac
catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag
ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct
atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc
aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac
agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg
attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg
aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag
actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc
aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt
cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac
ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat
gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca
gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg
gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact
taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt
gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag
gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggc ［配列番号３１］
【0130】
配列番号３２、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc
atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac
gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg
cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac
agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg
agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac
gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg
aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa
gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc
aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc
tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc
ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc
cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac
gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag
ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc
aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag
cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag
attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc
agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc
gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc
aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg
ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg
gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc
gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaaccggcag
accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg
atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc
atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac
agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc
tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag
accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac
ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccacca gaggcctgat gaacctgctg
cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc
accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa
ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc
atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc
aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat
agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg
atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg
aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa
accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt
aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc
agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag ccctacagat tcgacgtgta cctggacaat
ggcgtgtaca agttcgtgac cgtgaagaat ctggatgtga tcaaaaaaga aaactactac
gaagtgaata gcaagtgcta tgaggaagct aagaagctga agaagatcag caaccaggcc
gagtttatcg cctccttcta caacaacgat ctgatcaaga tcaacggcga gctgtataga
gtgatcggcg tgaacaacga cctgctgaac cggatcgaag tgaacatgat cgacatcacc
taccgcgagt acctggaaaa catgaacgac aagaggcccc ccaggatcat taagacaatc
gcctccaaga cccagagcat taagaagtac agcacagaca ttctgggcaa cctgtatgaa
gtgaaatcta agaagcaccc tcagatcatc aaaaagggc［配列番号３２］
atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc
atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac
gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg
cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac
agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg
agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac
gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg
aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa
gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc
aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc
tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc
ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc
cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac
gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag
ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc
aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag
cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag
attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc
agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc
gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc
aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg
ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg
gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc
gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaaccggcag
accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg
atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc
atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc
agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac
agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc
tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag
accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac
ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccacca gaggcctgat gaacctgctg
cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc
accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa
ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc
atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc
aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat
agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg
atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc
aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg
aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa
accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt
aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc
agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag ccctacagat tcgacgtgta cctggacaat
ggcgtgtaca agttcgtgac cgtgaagaat ctggatgtga tcaaaaaaga aaactactac
gaagtgaata gcaagtgcta tgaggaagct aagaagctga agaagatcag caaccaggcc
gagtttatcg cctccttcta caacaacgat ctgatcaaga tcaacggcga gctgtataga
gtgatcggcg tgaacaacga cctgctgaac cggatcgaag tgaacatgat cgacatcacc
taccgcgagt acctggaaaa catgaacgac aagaggcccc ccaggatcat taagacaatc
gcctccaaga cccagagcat taagaagtac agcacagaca ttctgggcaa cctgtatgaa
gtgaaatcta agaagcaccc tcagatcatc aaaaagggc［配列番号３２］
【0131】
配列番号３３、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
atgaagcgca actacatcct cggactggac atcggcatta cctccgtggg atacggcatc
atcgattacg aaactaggga tgtgatcgac gctggagtca ggctgttcaa agaggcgaac
gtggagaaca acgaggggcg gcgctcaaag aggggggccc gccggctgaa gcgccgccgc
agacatagaa tccagcgcgt gaagaagctg ctgttcgact acaaccttct gaccgaccac
tccgaacttt ccggcatcaa cccatatgag gctagagtga agggattgtc ccaaaagctg
tccgaggaag agttctccgc cgcgttgctc cacctcgcca agcgcagggg agtgcacaat
gtgaacgaag tggaagaaga taccggaaac gagctgtcca ccaaggagca gatcagccgg
aactccaagg ccctggaaga gaaatacgtg gcggaactgc aactggagcg gctgaagaaa
gacggagaag tgcgcggctc gatcaaccgc ttcaagacct cggactacgt gaaggaggcc
aagcagctcc tgaaagtgca aaaggcctat caccaacttg accagtcctt tatcgatacc
tacatcgatc tgctcgagac tcggcggact tactacgagg gtccagggga gggctcccca
tttggttgga aggatattaa ggagtggtac gaaatgctga tgggacactg cacatacttc
cctgaggagc tgcggagcgt gaaatacgca tacaacgcag acctgtacaa cgcgctgaac
gacctgaaca atctcgtgat cacccgggac gagaacgaaa agctcgagta ttacgaaaag
ttccagatta ttgagaacgt gttcaaacag aagaagaagc cgacactgaa gcagattgcc
aaggaaatcc tcgtgaacga agaggacatc aagggctatc gagtgacctc aacgggaaag
ccggagttca ccaatctgaa ggtctaccac gacatcaaag acattaccgc ccggaaggag
atcattgaga acgcggagct gttggaccag attgcgaaga ttctgaccat ctaccaatcc
tccgaggata ttcaggaaga actcaccaac ctcaacagcg aactgaccca ggaggagata
gagcaaatct ccaacctgaa gggctacacc ggaactcata acctgagcct gaaggccatc
aacttgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgataacc agatcgctat tttcaatcgg
ctgaagctgg tccccaagaa agtggacctc tcacaacaaa aggagatccc tactaccctt
gtggacgatt tcattctgtc ccccgtggtc aagagaagct tcatacagtc aatcaaagtg
atcaatgcca ttatcaagaa atacggtctg cccaacgaca ttatcattga gctcgcccgc
gagaagaact cgaaggacgc ccagaagatg attaacgaaa tgcagaagag gaaccgacag
actaacgaac ggatcgaaga aatcatccgg accaccggga aggaaaacgc gaagtacctg
atcgaaaaga tcaagctcca tgacatgcag gaaggaaagt gtctgtactc gctggaggcc
attccgctgg aggacttgct gaacaaccct tttaactacg aagtggatca tatcattccg
aggagcgtgt cattcgacaa ttccttcaac aacaaggtcc tcgtgaagca ggaggaaaac
tcgaagaagg gaaaccgcac gccgttccag tacctgagca gcagcgactc caagatttcc
tacgaaacct tcaagaagca catcctcaac ctggcaaagg ggaagggtcg catctccaag
accaagaagg aatatctgct ggaagaaaga gacatcaaca gattctccgt gcaaaaggac
ttcatcaacc gcaacctcgt ggatactaga tacgctactc ggggtctgat gaacctcctg
agaagctact ttagagtgaa caatctggac gtgaaggtca agtcgattaa cggaggtttc
acctccttcc tgcggcgcaa gtggaagttc aagaaggaac ggaacaaggg ctacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgacttca tcttcaaaga atggaagaaa
cttgacaagg ctaagaaggt catggaaaac cagatgttcg aagaaaagca ggccgagtct
atgcctgaaa tcgagactga acaggagtac aaggaaatct ttattacgcc acaccagatc
aaacacatca aggatttcaa ggattacaag tactcacatc gcgtggacaa aaagccgaac
agggaactga tcaacgacac cctctactcc acccggaagg atgacaaagg gaataccctc
atcgtcaaca accttaacgg cctgtacgac aaggacaacg ataagctgaa gaagctcatt
aacaagtcgc ccgaaaagtt gctgatgtac caccacgacc ctcagactta ccagaagctc
aagctgatca tggagcagta tggggacgag aaaaacccgt tgtacaagta ctacgaagaa
actgggaatt atctgactaa gtactccaag aaagataacg gccccgtgat taagaagatt
aagtactacg gcaacaagct gaacgcccat ctggacatca ccgatgacta ccctaattcc
cgcaacaagg tcgtcaagct gagcctcaag ccctaccggt ttgatgtgta ccttgacaat
ggagtgtaca agttcgtgac tgtgaagaac cttgacgtga tcaagaagga gaactactac
gaagtcaact ccaagtgcta cgaggaagca aagaagttga agaagatctc gaaccaggcc
gagttcattg cctccttcta taacaacgac ctgattaaga tcaacggcga actgtaccgc
gtcattggcg tgaacaacga tctcctgaac cgcatcgaag tgaacatgat cgacatcact
taccgggaat acctggagaa tatgaacgac aagcgcccgc cccggatcat taagactatc
gcctcaaaga cccagtcgat caagaagtac agcaccgaca tcctgggcaa cctgtacgag
gtcaaatcga agaagcaccc ccagatcatc aagaaggga［配列番号３３］
atgaagcgca actacatcct cggactggac atcggcatta cctccgtggg atacggcatc
atcgattacg aaactaggga tgtgatcgac gctggagtca ggctgttcaa agaggcgaac
gtggagaaca acgaggggcg gcgctcaaag aggggggccc gccggctgaa gcgccgccgc
agacatagaa tccagcgcgt gaagaagctg ctgttcgact acaaccttct gaccgaccac
tccgaacttt ccggcatcaa cccatatgag gctagagtga agggattgtc ccaaaagctg
tccgaggaag agttctccgc cgcgttgctc cacctcgcca agcgcagggg agtgcacaat
gtgaacgaag tggaagaaga taccggaaac gagctgtcca ccaaggagca gatcagccgg
aactccaagg ccctggaaga gaaatacgtg gcggaactgc aactggagcg gctgaagaaa
gacggagaag tgcgcggctc gatcaaccgc ttcaagacct cggactacgt gaaggaggcc
aagcagctcc tgaaagtgca aaaggcctat caccaacttg accagtcctt tatcgatacc
tacatcgatc tgctcgagac tcggcggact tactacgagg gtccagggga gggctcccca
tttggttgga aggatattaa ggagtggtac gaaatgctga tgggacactg cacatacttc
cctgaggagc tgcggagcgt gaaatacgca tacaacgcag acctgtacaa cgcgctgaac
gacctgaaca atctcgtgat cacccgggac gagaacgaaa agctcgagta ttacgaaaag
ttccagatta ttgagaacgt gttcaaacag aagaagaagc cgacactgaa gcagattgcc
aaggaaatcc tcgtgaacga agaggacatc aagggctatc gagtgacctc aacgggaaag
ccggagttca ccaatctgaa ggtctaccac gacatcaaag acattaccgc ccggaaggag
atcattgaga acgcggagct gttggaccag attgcgaaga ttctgaccat ctaccaatcc
tccgaggata ttcaggaaga actcaccaac ctcaacagcg aactgaccca ggaggagata
gagcaaatct ccaacctgaa gggctacacc ggaactcata acctgagcct gaaggccatc
aacttgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgataacc agatcgctat tttcaatcgg
ctgaagctgg tccccaagaa agtggacctc tcacaacaaa aggagatccc tactaccctt
gtggacgatt tcattctgtc ccccgtggtc aagagaagct tcatacagtc aatcaaagtg
atcaatgcca ttatcaagaa atacggtctg cccaacgaca ttatcattga gctcgcccgc
gagaagaact cgaaggacgc ccagaagatg attaacgaaa tgcagaagag gaaccgacag
actaacgaac ggatcgaaga aatcatccgg accaccggga aggaaaacgc gaagtacctg
atcgaaaaga tcaagctcca tgacatgcag gaaggaaagt gtctgtactc gctggaggcc
attccgctgg aggacttgct gaacaaccct tttaactacg aagtggatca tatcattccg
aggagcgtgt cattcgacaa ttccttcaac aacaaggtcc tcgtgaagca ggaggaaaac
tcgaagaagg gaaaccgcac gccgttccag tacctgagca gcagcgactc caagatttcc
tacgaaacct tcaagaagca catcctcaac ctggcaaagg ggaagggtcg catctccaag
accaagaagg aatatctgct ggaagaaaga gacatcaaca gattctccgt gcaaaaggac
ttcatcaacc gcaacctcgt ggatactaga tacgctactc ggggtctgat gaacctcctg
agaagctact ttagagtgaa caatctggac gtgaaggtca agtcgattaa cggaggtttc
acctccttcc tgcggcgcaa gtggaagttc aagaaggaac ggaacaaggg ctacaagcac
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgacttca tcttcaaaga atggaagaaa
cttgacaagg ctaagaaggt catggaaaac cagatgttcg aagaaaagca ggccgagtct
atgcctgaaa tcgagactga acaggagtac aaggaaatct ttattacgcc acaccagatc
aaacacatca aggatttcaa ggattacaag tactcacatc gcgtggacaa aaagccgaac
agggaactga tcaacgacac cctctactcc acccggaagg atgacaaagg gaataccctc
atcgtcaaca accttaacgg cctgtacgac aaggacaacg ataagctgaa gaagctcatt
aacaagtcgc ccgaaaagtt gctgatgtac caccacgacc ctcagactta ccagaagctc
aagctgatca tggagcagta tggggacgag aaaaacccgt tgtacaagta ctacgaagaa
actgggaatt atctgactaa gtactccaag aaagataacg gccccgtgat taagaagatt
aagtactacg gcaacaagct gaacgcccat ctggacatca ccgatgacta ccctaattcc
cgcaacaagg tcgtcaagct gagcctcaag ccctaccggt ttgatgtgta ccttgacaat
ggagtgtaca agttcgtgac tgtgaagaac cttgacgtga tcaagaagga gaactactac
gaagtcaact ccaagtgcta cgaggaagca aagaagttga agaagatctc gaaccaggcc
gagttcattg cctccttcta taacaacgac ctgattaaga tcaacggcga actgtaccgc
gtcattggcg tgaacaacga tctcctgaac cgcatcgaag tgaacatgat cgacatcact
taccgggaat acctggagaa tatgaacgac aagcgcccgc cccggatcat taagactatc
gcctcaaaga cccagtcgat caagaagtac agcaccgaca tcctgggcaa cctgtacgag
gtcaaatcga agaagcaccc ccagatcatc aagaaggga［配列番号３３］
【0132】
配列番号３４、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccagagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaggcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag［配列番号３４］
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccagagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaggcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag［配列番号３４］
【0133】
配列番号３５、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
accggtgcca ccatgtaccc atacgatgtt ccagattacg cttcgccgaa gaaaaagcgc
aaggtcgaag cgtccatgaa aaggaactac attctggggc tggacatcgg gattacaagc
gtggggtatg ggattattga ctatgaaaca agggacgtga tcgacgcagg cgtcagactg
ttcaaggagg ccaacgtgga aaacaatgag ggacggagaa gcaagagggg agccaggcgc
ctgaaacgac ggagaaggca cagaatccag agggtgaaga aactgctgtt cgattacaac
ctgctgaccg accattctga gctgagtgga attaatcctt atgaagccag ggtgaaaggc
ctgagtcaga agctgtcaga ggaagagttt tccgcagctc tgctgcacct ggctaagcgc
cgaggagtgc ataacgtcaa tgaggtggaa gaggacaccg gcaacgagct gtctacaaag
gaacagatct cacgcaatag caaagctctg gaagagaagt atgtcgcaga gctgcagctg
gaacggctga agaaagatgg cgaggtgaga gggtcaatta ataggttcaa gacaagcgac
tacgtcaaag aagccaagca gctgctgaaa gtgcagaagg cttaccacca gctggatcag
agcttcatcg atacttatat cgacctgctg gagactcgga gaacctacta tgagggacca
ggagaaggga gccccttcgg atggaaagac atcaaggaat ggtacgagat gctgatggga
cattgcacct attttccaga agagctgaga agcgtcaagt acgcttataa cgcagatct
tacaacgccc tgaatgacct gaacaacctg gtcatcacca gggatgaaaa cgagaaactg
gaatactatg agaagttcca gatcatcgaa aacgtgttta agcagaagaa aaagcctaca
ctgaaacaga ttgctaagga gatcctggtc aacgaagagg acatcaaggg ctaccgggtg
acaagcactg gaaaaccaga gttcaccaat ctgaaagtgt atcacgatat taaggacatc
acagcacgga aagaaatcat tgagaacgcc gaactgctgg atcagattgc taagatcctg
actatctacc agagctccga ggacatccag gaagagctga ctaacctgaa cagcgagctg
acccaggaag agatcgaaca gattagtaat ctgaaggggt acaccggaac acacaacctg
tccctgaaag ctatcaatct gattctggat gagctgtggc atacaaacga caatcagatt
gcaatcttta accggctgaa gctggtccca aaaaaggtgg acctgagtca gcagaaagag
atcccaacca cactggtgga cgatttcatt ctgtcacccg tggtcaagcg gagcttcatc
cagagcatca aagtgatcaa cgccatcatc aagaagtacg gcctgcccaa tgatatcatt
atcgagctgg ctagggagaa gaacagcaag gacgcacaga agatgatcaa tgagatgcag
aaacgaaacc ggcagaccaa tgaacgcatt gaagagatta tccgaactac cgggaaagag
aacgcaaagt acctgattga aaaaatcaag ctgcacgata tgcaggaggg aaagtgtctg
tattctctgg aggccatccc cctggaggac ctgctgaaca atccattcaa ctacgaggtc
gatcatatta tccccagaag cgtgtccttc gacaattcct ttaacaacaa ggtgctggtc
aagcaggaag agaactctaa aaagggcaat aggactcctt tccagtacct gtctagttca
gattccaaga tctcttacga aacctttaaa aagcacattc tgaatctggc caaaggaaag
ggccgcatca gcaagaccaa aaaggagtac ctgctggaag agcgggacat caacagattc
tccgtccaga aggattttat taaccggaat ctggtggaca caagatacgc tactcgcggc
ctgatgaatc tgctgcgatc ctatttccgg gtgaacaatc tggatgtgaa agtcaagtcc
atcaacggcg ggttcacatc ttttctgagg cgcaaatgga agtttaaaaa ggagcgcaac
aaagggtaca agcaccatgc cgaagatgct ctgattatcg caaatgccga cttcatcttt
aaggagtgga aaaagctgga caaagccaag aaagtgatgg agaaccagat gttcgaagag
aagcaggccg aatctatgcc cgaaatcgag acagaacagg agtacaagga gattttcatc
actcctcacc agatcaagca tatcaaggat ttcaaggact acaagtactc tcaccgggtg
gataaaaagc ccaacagaga gctgatcaat gacaccctgt atagtacaag aaaagacgat
aaggggaata ccctgattgt gaacaatctg aacggactgt acgacaaaga taatgacaag
ctgaaaaagc tgatcaacaa aagtcccgag aagctgctga tgtaccacca tgatcctcag
acatatcaga aactgaagct gattatggag cagtacggcg acgagaagaa cccactgtat
aagtactatg aagagactgg gaactacctg accaagtata gcaaaaagga taatggcccc
gtgatcaaga agatcaagta ctatgggaac aagctgaatg cccatctgga catcacagac
gattacccta acagtcgcaa caaggtggtc aagctgtcac tgaagccata cagattcgat
gtctatctgg acaacggcgt gtataaattt gtgactgtca agaatctgga tgtcatcaaa
aaggagaact actatgaagt gaatagcaag tgctacgaag aggctaaaaa gctgaaaaag
attagcaacc aggcagagtt catcgcctcc ttttacaaca acgacctgat taagatcaat
ggcgaactgt atagggtcat cggggtgaac aatgatctgc tgaaccgcat tgaagtgaat
atgattgaca tcacttaccg agagtatctg gaaaacatga atgataagcg cccccctcga
attatcaaaa caattgcctc taagactcag agtatcaaaa agtactcaac cgacattctg
ggaaacctgt atgaggtgaa gagcaaaaag caccctcaga ttatcaaaaa gggctaagaa ttc［配列番号３５］
accggtgcca ccatgtaccc atacgatgtt ccagattacg cttcgccgaa gaaaaagcgc
aaggtcgaag cgtccatgaa aaggaactac attctggggc tggacatcgg gattacaagc
gtggggtatg ggattattga ctatgaaaca agggacgtga tcgacgcagg cgtcagactg
ttcaaggagg ccaacgtgga aaacaatgag ggacggagaa gcaagagggg agccaggcgc
ctgaaacgac ggagaaggca cagaatccag agggtgaaga aactgctgtt cgattacaac
ctgctgaccg accattctga gctgagtgga attaatcctt atgaagccag ggtgaaaggc
ctgagtcaga agctgtcaga ggaagagttt tccgcagctc tgctgcacct ggctaagcgc
cgaggagtgc ataacgtcaa tgaggtggaa gaggacaccg gcaacgagct gtctacaaag
gaacagatct cacgcaatag caaagctctg gaagagaagt atgtcgcaga gctgcagctg
gaacggctga agaaagatgg cgaggtgaga gggtcaatta ataggttcaa gacaagcgac
tacgtcaaag aagccaagca gctgctgaaa gtgcagaagg cttaccacca gctggatcag
agcttcatcg atacttatat cgacctgctg gagactcgga gaacctacta tgagggacca
ggagaaggga gccccttcgg atggaaagac atcaaggaat ggtacgagat gctgatggga
cattgcacct attttccaga agagctgaga agcgtcaagt acgcttataa cgcagatct
tacaacgccc tgaatgacct gaacaacctg gtcatcacca gggatgaaaa cgagaaactg
gaatactatg agaagttcca gatcatcgaa aacgtgttta agcagaagaa aaagcctaca
ctgaaacaga ttgctaagga gatcctggtc aacgaagagg acatcaaggg ctaccgggtg
acaagcactg gaaaaccaga gttcaccaat ctgaaagtgt atcacgatat taaggacatc
acagcacgga aagaaatcat tgagaacgcc gaactgctgg atcagattgc taagatcctg
actatctacc agagctccga ggacatccag gaagagctga ctaacctgaa cagcgagctg
acccaggaag agatcgaaca gattagtaat ctgaaggggt acaccggaac acacaacctg
tccctgaaag ctatcaatct gattctggat gagctgtggc atacaaacga caatcagatt
gcaatcttta accggctgaa gctggtccca aaaaaggtgg acctgagtca gcagaaagag
atcccaacca cactggtgga cgatttcatt ctgtcacccg tggtcaagcg gagcttcatc
cagagcatca aagtgatcaa cgccatcatc aagaagtacg gcctgcccaa tgatatcatt
atcgagctgg ctagggagaa gaacagcaag gacgcacaga agatgatcaa tgagatgcag
aaacgaaacc ggcagaccaa tgaacgcatt gaagagatta tccgaactac cgggaaagag
aacgcaaagt acctgattga aaaaatcaag ctgcacgata tgcaggaggg aaagtgtctg
tattctctgg aggccatccc cctggaggac ctgctgaaca atccattcaa ctacgaggtc
gatcatatta tccccagaag cgtgtccttc gacaattcct ttaacaacaa ggtgctggtc
aagcaggaag agaactctaa aaagggcaat aggactcctt tccagtacct gtctagttca
gattccaaga tctcttacga aacctttaaa aagcacattc tgaatctggc caaaggaaag
ggccgcatca gcaagaccaa aaaggagtac ctgctggaag agcgggacat caacagattc
tccgtccaga aggattttat taaccggaat ctggtggaca caagatacgc tactcgcggc
ctgatgaatc tgctgcgatc ctatttccgg gtgaacaatc tggatgtgaa agtcaagtcc
atcaacggcg ggttcacatc ttttctgagg cgcaaatgga agtttaaaaa ggagcgcaac
aaagggtaca agcaccatgc cgaagatgct ctgattatcg caaatgccga cttcatcttt
aaggagtgga aaaagctgga caaagccaag aaagtgatgg agaaccagat gttcgaagag
aagcaggccg aatctatgcc cgaaatcgag acagaacagg agtacaagga gattttcatc
actcctcacc agatcaagca tatcaaggat ttcaaggact acaagtactc tcaccgggtg
gataaaaagc ccaacagaga gctgatcaat gacaccctgt atagtacaag aaaagacgat
aaggggaata ccctgattgt gaacaatctg aacggactgt acgacaaaga taatgacaag
ctgaaaaagc tgatcaacaa aagtcccgag aagctgctga tgtaccacca tgatcctcag
acatatcaga aactgaagct gattatggag cagtacggcg acgagaagaa cccactgtat
aagtactatg aagagactgg gaactacctg accaagtata gcaaaaagga taatggcccc
gtgatcaaga agatcaagta ctatgggaac aagctgaatg cccatctgga catcacagac
gattacccta acagtcgcaa caaggtggtc aagctgtcac tgaagccata cagattcgat
gtctatctgg acaacggcgt gtataaattt gtgactgtca agaatctgga tgtcatcaaa
aaggagaact actatgaagt gaatagcaag tgctacgaag aggctaaaaa gctgaaaaag
attagcaacc aggcagagtt catcgcctcc ttttacaaca acgacctgat taagatcaat
ggcgaactgt atagggtcat cggggtgaac aatgatctgc tgaaccgcat tgaagtgaat
atgattgaca tcacttaccg agagtatctg gaaaacatga atgataagcg cccccctcga
attatcaaaa caattgcctc taagactcag agtatcaaaa agtactcaac cgacattctg
ggaaacctgt atgaggtgaa gagcaaaaag caccctcaga ttatcaaaaa gggctaagaa ttc［配列番号３５］
【0134】
配列番号３６、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag［配列番号３６］
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag［配列番号３６］
【0135】
配列番号３７、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９のポリヌクレオチド配列
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aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc［配列番号３７］
【0136】
配列番号３８、ｐＤＯ２４２（インビトロでの仕事のための全てのＪＣＲ８９／９１プロジェクトおよびＪＣＲ１５７／１６０プロジェクトにおいて用いられるＳａＣａｓ９；ＳａＣａｓ９は大文字）
ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacCtttaattctagtactatgcaTgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactaccggtgccaccATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCGCAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACGATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATTATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGTGTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATGCCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAACGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAAGGGCagcggaggcaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatcctacccatacgatgttccagattacgcttaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaggtagcggccgcCCgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac［配列番号３８］
ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacCtttaattctagtactatgcaTgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactaccggtgccaccATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCGCAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACGATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATTATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGTGTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATGCCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAACGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAAGGGCagcggaggcaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatcctacccatacgatgttccagattacgcttaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaggtagcggccgcCCgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac［配列番号３８］
【0137】
配列番号３９、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG［配列番号３９］
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG［配列番号３９］
【0138】
配列番号４０、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９のアミノ酸配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG［配列番号４０］
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG［配列番号４０］
【0139】
配列番号４１、ベクター５のバージョン１
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccTCTAGACTCGAGTCGAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGGCCATGGtctagaggatccggtactcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacgccaCCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatccGAATTCtagcaataaaggatcgtttattttcattggaagcgtgtgttggttttttgatcaggcgcgGGTACCAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACacatttcctctctatacaaatgCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCCTCGACTAGTAGAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAACGTGCCAATAATTTCATTACTATATCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCGGTACCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaa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【0140】
配列番号４２、ベクター５のバージョン２
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】