(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(54)【発明の名称】ＥＢＶ特異的免疫細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20220616BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220616BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220616BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220616BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220616BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20220616BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20220616BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20220616BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220616BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
C12Q1/02
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/22
A61P11/02
A61P11/04
A61P1/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021562004
(86)(22)【出願日】2020-04-09
(85)【翻訳文提出日】2021-12-13
(86)【国際出願番号】 US2020027456
(87)【国際公開番号】W WO2020214479
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】16/388,776
(32)【優先日】2019-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ルーニー、クリオナ エム．
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ、サンディヤー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ10
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS40
4B063QX10
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BD39
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZA66
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB33
(57)【要約】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団を生成させる／拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激することを含む方法が開示される。そのような方法に従って拡大される、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団、およびその使用もまた開示される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激することを含む方法。
【請求項2】
ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を再刺激することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激することを含む方法。
【請求項4】
ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、およびＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを再刺激することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＰＢＭＣが、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または得ることができる単離された免疫細胞集団。
【請求項11】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む単離された免疫細胞集団。
【請求項12】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む単離された免疫細胞集団。
【請求項13】
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団を含む医薬組成物。
【請求項14】
疾患または障害の処置または防止の方法において使用するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
疾患または障害の処置または防止の方法において使用するための医薬品の製造における、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項16】
随伴する疾患または障害を処置するための、または防止するための方法であって、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項17】
前記疾患または障害が、ＥＢＶ感染に伴う疾患または障害である、請求項１４に記載の使用するための単離された免疫細胞集団または医薬組成物、請求項１５に記載の使用、あるいは請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記疾患または障害がガンである、請求項１４に記載の使用するための単離された免疫細胞集団または医薬組成物、請求項１５に記載の使用、あるいは請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
ＥＢＶ感染に伴う前記疾患または障害がＥＢＶ随伴ガンである、請求項１７に記載の使用するための単離された免疫細胞集団または医薬組成物、使用、あるいは方法。
【請求項20】
前記ガンがＥＢＶ随伴ガンである、請求項１８に記載の使用するための単離された免疫細胞集団または医薬組成物、使用、あるいは方法。
【請求項21】
前記ＥＢＶ随伴ガンが、ＥＢＶ陽性リンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽頭ガンおよびＥＢＶ陽性胃ガンから選択される、請求項１９または請求項２０に記載の使用するための単離された免疫細胞集団または医薬組成物、使用、あるいは方法。
【請求項22】
ＥＢＶに感染した細胞を殺傷するための方法であって、ＥＢＶに感染した細胞を請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項23】
ＥＢＶに感染した細胞を殺傷するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項24】
ガン細胞を殺傷するための方法であって、ガン細胞を請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項25】
ガン細胞を殺傷するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離された免疫細胞集団または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項26】
前記ガン細胞にはＥＢＶが感染している、請求項２４または請求項２５に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、米国特許出願第１６／３８８，７７６号（２０１９年４月１８日出願；その内容および要素はすべての目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）の優先権を主張する。
【技術分野】
【0002】
本開示は、少なくとも分子生物学および細胞生物学、免疫学の分野に関連し、医学的処置および予防の方法にも関連する。
【連邦政府援助による研究または開発に関する言及】
【0003】
本発明は、国立衛生研究所によって認められる助成金番号ＣＡ１２６７５２のもとでの政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
４０％前後のリンパ腫、すべての未分化鼻咽頭ガン（ＮＰＣ）、および約１０％の胃ガンが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のゲノムを保有しており、養子移入されたＥＢＶ特異的Ｔ細胞（ＥＢＶＳＴ）によって標的とされ得るウイルスタンパク質を発現する。
【0005】
免疫抑制状況外で生じるＥＢＶ＋悪性腫瘍は約９０個のＥＢＶタンパク質のうちの１～４個しか発現しておらず、これらの抗原は免疫原性が不十分ではあるが、ＥＢＶＳＴのための標的抗原をもたらしている。
【0006】
ＥＢＶ陽性の悪性腫瘍を処置するためのＥＢＶ特異的Ｔ細胞の使用に関する進行中の臨床試験では、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞がＥＢＶ特異的Ｔ細胞の拡大において用いられ（ＮＣＴ０２５７８６４１）、またはＰＢＭＣをＥＢＶのＩＩ型潜伏期抗原に対応するペプチドにより刺激することが伴う（ＮＣＴ０１５５５８９２）。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、ＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチドが、ＥＢＶ随伴疾患の処置のために有用であるＥＢＶ特異的免疫細胞の集団を生成させる／拡大するために使用することができるという予想外の発見に基づく。
【0008】
ＥＢＶ随伴疾患におけるＥＢＶに感染した細胞がＥＢＶ潜伏抗原の実質的な発現を示すだけであるという事実にもかかわらず、本発明者らは、ＥＢＶ溶解抗原のペプチドを使用して免疫細胞を刺激することによって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団がＥＢＶ感染細胞に対する細胞溶解活性を示すことを本明細書中において明らかにする。そのうえ、ＥＢＶ溶解抗原のペプチドを使用して免疫細胞を刺激することによって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団が、ＥＢＶ潜伏抗原のペプチドを使用して免疫細胞を刺激することによって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団と比較した場合、ＥＢＶ陽性ガンをインビボで処置する類似した能力または改善された能力を示すことが明らかにされる。
【0009】
別の予想外の発見が、ＥＢＶ溶解抗原およびＥＢＶ潜伏抗原の両方を刺激において使用する方法は、拡大された集団におけるＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞の頻度の実質的な低下をもたらさなかったということであった。
【0010】
本発明者らはさらに、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む免疫細胞の集団が、ＥＢＶ随伴疾患を処置するために、ＥＢＶ潜伏抗原のみについて特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団よりも効果的であることを明らかにする。
【0011】
第１の局面において、本開示は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激することを含む方法を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を再刺激することを含む。
【0013】
また、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激することを含む方法が提供される。
【0014】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、およびＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを再刺激することを含む。
【0015】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される。本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0016】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびＢＤＬＦ３から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２、ＢＤＬＦ３およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0017】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0018】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0019】
いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣである。
【0020】
本開示による方法によって得られる、または得ることができる単離された免疫細胞集団もまた提供される。
【0021】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む単離された免疫細胞集団もまた提供される。
【0022】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む単離された免疫細胞集団もまた提供される。
【0023】
本開示による単離された免疫細胞集団を含む医薬組成物もまた提供される。
【0024】
疾患または障害の処置または防止を行うための方法において使用するための本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物もまた提供される。
【0025】
疾患または障害の処置または防止の方法において使用するための医薬品の製造における本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。
【0026】
疾患または障害を処置するための、または防止するための方法であって、本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物を対象に投与することを含む方法もまた提供される。
【0027】
ＥＢＶ感染に伴う疾患または障害の処置または防止の方法において使用するための本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物もまた提供される。
【0028】
ＥＢＶ感染に伴う疾患または障害の処置または防止の方法において使用するための医薬品の製造における本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。
【0029】
ＥＢＶ感染に伴う疾患または障害を処置するための、または防止するための方法であって、本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物を対象に投与することを含む方法もまた提供される。
【0030】
ガンの処置または防止の方法において使用するための本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物もまた提供される。
【0031】
ガンの処置または防止の方法において使用するための医薬品の製造における本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。
【0032】
ガンを処置するための、または防止するための方法であって、本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物を対象に投与することを含む方法もまた提供される。
【0033】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、ＥＢＶ感染に伴う疾患または障害はＥＢＶ随伴ガンである。
【0034】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、ガンはＥＢＶ随伴ガンである。
【0035】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ随伴ガンは、ＥＢＶ陽性リンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽頭ガンおよびＥＢＶ陽性胃ガンから選択される。
【0036】
ＥＢＶに感染した細胞を殺傷するための方法であって、ＥＢＶに感染した細胞を本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物と接触させることを含む方法もまた提供される。本方法はインビトロ方法またはインビボ方法である場合がある。
【0037】
ＥＢＶに感染した細胞を殺傷するための、本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。
【0038】
ガン細胞を殺傷するための方法であって、ガン細胞を本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物と接触させることを含む方法もまた提供される。本方法はインビトロ方法またはインビボ方法である場合がある。
【0039】
ガン細胞を殺傷するための、本開示による単離された免疫細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。
【0040】
いくつかの実施形態において、ガン細胞はＥＢＶに感染している。
【発明の詳細な説明】
【0041】
本開示は、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞はＥＢＶ感染細胞を殺傷することができ、加えて、ＥＢＶ潜伏抗原およびＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む細胞の集団が、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞を含むだけである細胞の集団と比較した場合、ＥＢＶ陽性悪性腫瘍を抑制する改善された能力を示すという予想外の発見に基づく。
【0042】
エプスタイン・バーウイルスの複製
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のウイルス学が、例えば、ＳｔａｎｆｉｅｌｄおよびＬｕｆｔｉｑ、Ｆ１０００Ｒｅｓ．（２０１７）６：３８６、およびＯｄｕｍａｄｅ他、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０１１）２４（１）：１９３－２０９に記載される（これらの両方が全体において参照によってここに組み込まれる）。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のウイルス学が、例えば、ＳｔａｎｆｉｅｌｄおよびＬｕｆｔｉｑ、Ｆ１０００Ｒｅｓ．（２０１７）６：３８６、およびＯｄｕｍａｄｅ他、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０１１）２４（１）：１９３－２０９に記載される（これらの両方が全体において参照によってここに組み込まれる）。
【0043】
ＥＢＶは、ウイルスのタンパク質ＢＭＲＦ２がβ１インテグリンに結合すること、ならびにウイルスのタンパク質ｇＨ／ｇＬがインテグリンのａｖβ６およびａｖβ８と結合することを介して上皮細胞に感染する。ＥＢＶは、ウイルスの糖タンパク質ｇｐ３５０がＣＤ２１および／またはＣＤ３５と相互作用することを介して、その後、ウイルスのｇｐ４２がＭＨＣクラスＩＩと相互作用することによってＢ細胞に感染する。これらの相互作用はウイルスエンベロープの細胞膜との融合を引き起こし、これにより、ウイルスは細胞に入ることができる。細胞内に入ると、ウイルスのカプシドが溶解し、ウイルスのゲノムが核に輸送される。
【0044】
ＥＢＶは、潜伏および溶解の２つの複製様式を有する。
【0045】
潜伏サイクルはビリオンの産生をもたらさず、Ｂ細胞および上皮細胞において生じ得る。ＥＢＶゲノムの環状ＤＮＡがエピソームとして細胞核に存在し、宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼによってコピーされる。潜伏期において、ＥＢＶの遺伝子の一部のみが、異なった様々な一組のウイルスタンパク質およびウイルスＲＮＡを生じさせる潜伏期プログラムとして知られている３つの異なるパターンの１つで発現される。この潜伏サイクルが、例えば、ＡｍｏｎおよびＦａｒｒｅｌｌ、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）１５（３）：１４９－５６に記載される（これは全体が参照によってここに組み込まれる）。
【0046】
ＥＢＮＡ１タンパク質と、非コードＲＮＡのＥＢＥＲとが、潜伏期プログラムＩ～ＩＩＩのそれぞれで発現する。潜伏期プログラムＩＩおよびＩＩＩではさらに、ＥＢＮＡＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂタンパク質の発現が伴い、潜伏期プログラムＩＩＩではさらに、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３ＢおよびＥＢＮＡ３Ｃの発現が伴う。
【0047】
ＥＢＮＡ１は多機能であり、遺伝子調節、染色体外複製、ならびにウイルスプロモーターの正の調節および負の調節を介したＥＢＶエピソームゲノムの維持において役割を果たしている（Ｄｕｅｌｌｍａｎ他、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００９）；９０（Ｐｔ ９）：２２５１－２２５９）。ＥＢＮＡ２は潜伏ウイルスの転写の調節に関与し、ＥＢＶに感染した細胞の不死化に寄与している（ＫｅｍｐｋｅｓおよびＬｉｎｇ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）３９１：３５－５９）。ＥＢＮＡ－ＬＰは生来的Ｂ細胞の形質転換のために要求され、転写因子をウイルス複製のために動員する（Ｓｚｙｍｕｌａ他、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．（２０１８）；１４（２）：ｅ１００６８９０）。ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３ＢおよびＥＢＮＡ３ＣはＲＢＰＪと相互作用して、遺伝子発現に影響を与え、これにより、感染細胞の生存および成長に寄与している（Ｗａｎｇ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２０１６）９０（６）：２９０６－２９１９）。ＬＭＰ１は、Ｂ細胞活性化に関与する遺伝子の発現を調節している（Ｃｈａｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１０（５）：４９０－５０４）。ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂは、活性化されたＢ細胞受容体を模倣することによって正常なＢ細胞シグナル伝達を阻害している（ＰｏｒｔｉｓおよびＬｏｎｇｎｅｃｋｅｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３（５３）：８６１９－８６２８）。様々なＥＢＥＲが宿主細胞タンパク質とのリボ核タンパク質複合体を形成し、細胞形質転換において役割を果たすことが提案されている。
【0048】
潜伏サイクルはＢ細胞では潜伏期プログラムＩ～潜伏期プログラムＩＩＩのいずれかに従って進行することができ、通常の場合、ＩＩＩ→ＩＩ→Ｉと進行する。休止ナイーブＢ細胞に感染すると、ＥＢＶは潜伏期プログラムＩＩＩに入る。潜伏期ＩＩＩ遺伝子の発現により、Ｂ細胞は活性化され、これにより増殖性芽球となる。その後、ＥＢＶは典型的には、発現を、芽球がメモリーＢ細胞に分化することを引き起こす遺伝子のサブセットに制限することによって潜伏期ＩＩに進行する。遺伝子発現のさらなる制限により、ＥＢＶが潜伏期Ｉに入ることが引き起こされる。ＥＢＮＡ１の発現により、ＥＢＶが複製することが、メモリーＢ細胞が分裂するときに可能となる。上皮細胞では、潜伏期ＩＩのみが起こる。
【0049】
一次感染において、ＥＢＶは中咽頭上皮細胞において複製し、潜伏期ＩＩＩ、ＩＩおよびＩ感染をＢリンパ球において確立する。Ｂリンパ球のＥＢＶ潜伏感染が、ウイルス持続性、上皮細胞におけるその後の複製、および唾液内への感染性ウイルスの放出のために必要である。Ｂリンパ球のＥＢＶ潜伏期ＩＩＩ感染および潜伏期ＩＩ感染、口腔上皮細胞の潜伏期ＩＩ感染、ならびにＮＫ細胞またはＴ細胞の潜伏期ＩＩ感染は、一様なＥＢＶゲノムの存在および遺伝子発現によって特徴づけられる様々な悪性腫瘍をもたらすことがある。［２６］
【0050】
Ｂ細胞における潜伏ＥＢＶは、溶解複製に切り替わるために再活性化されることがある。溶解サイクルは感染性ビリオンの産生をもたらし、Ｂ細胞および上皮細胞において起こることがあり、例えば、Ａｒｖｉｎ他、Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００７））の第２５章においてＫｅｎｎｅｙによって総説される（これは全体が参照によってここに組み込まれる）。
【0051】
溶解複製では、ＥＢＶゲノムは線状であることが要求される。潜伏ＥＢＶゲノムはエピソーム状であり、したがって、溶解を引き起こす再活性化のために線状化されなければならない。Ｂ細胞において、溶解複製は通常、潜伏期からの再活性化の後で起こるだけである。
【0052】
最初期溶解遺伝子産物、例えば、ＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１などが、それら自身の発現、および後での溶解サイクル遺伝子の発現を高めるトランス活性化因子として作用する。
【0053】
様々な初期溶解遺伝子産物が様々な役割をウイルス複製において（例えば、ＥＢＶのＤＮＡポリメラーゼ触媒成分であるＢＡＬＦ５；ＤＮＡポリメラーゼ進行性因子ＢＭＲＦ１、ＤＮＡ結合タンパク質ＢＡＬＦ２、ヘリカーゼＢＢＬＦ４、プライマーゼＢＳＬＦ１、およびプライマーゼ関連タンパク質ＢＢＬＦ２／３）、また、デオキシヌクレオチド代謝において果たしている（例えば、チミジンキナーゼＢＸＬＦ１、ｄＵＴＰアーゼＢＯＲＦ２）。他の初期溶解遺伝子産物が転写因子のようにふるまい（例えば、ＢＭＲＦ１、ＢＲＲＦ１）、ＲＮＡの安定性およびプロセシングにおいて役割を有し（例えば、ＢＭＬＦ１）、または免疫回避に関与する（例えば、アポトーシスを阻害するＢＨＲＦ１）。
【0054】
様々な後期溶解遺伝子産物が、ウイルス複製が開始された後で発現するものとして従来より分類されている。それらは一般に、ＥＢＶの結合および融合を媒介する糖タンパク質（例えば、ｇｐ３５０／２２０、ｇｐ８５、ｇｐ４２、ｇｐ２５）だけでなく、ビリオンの構造的成分、例えば、ヌクレオカプシドタンパク質などをコードする。他の後期溶解遺伝子産物が免疫回避において役割を有する；ＢＣＬＦ１はＩＬ－１０のウイルスホモログをコードし、ＢＡＬＦ１は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ２に対して相同性を有するタンパク質をコードする。
【0055】
ＥＢＶ随伴ガンにおけるＥＢＶ抗原の発現
ＥＢＶ陽性ガンにおいて発現するＥＢＶ抗原が、例えば、ＣｒａｄｄｏｃｋおよびＨｅｓｌｏｐ、Ｕｐｄａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００８）Ｍａｒ；３（１）：３３－４１、ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋおよびＲｏｏｎｅｙ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）３９１：４２７－４５４、およびＳｈｉｎｏｚａｋｉ－Ｕｓｈｉｋｕ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）４６（４）：１４２１－３４に記載される。
ＥＢＶ陽性ガンにおいて発現するＥＢＶ抗原が、例えば、ＣｒａｄｄｏｃｋおよびＨｅｓｌｏｐ、Ｕｐｄａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００８）Ｍａｒ；３（１）：３３－４１、ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋおよびＲｏｏｎｅｙ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）３９１：４２７－４５４、およびＳｈｉｎｏｚａｋｉ－Ｕｓｈｉｋｕ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）４６（４）：１４２１－３４に記載される。
【0056】
免疫低下した対象、例えば、ＨＳＣＴまたは実質臓器移植の後の対象、先天性免疫不全またはＨＩＶ感染を有する対象において生じるＥＢＶ随伴リンパ腫は、ＩＩＩ型潜伏期を呈し、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を発現する。ＥＢＶ随伴ＥＢＶ陽性のホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、いくつかのタイプおよびＴ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、いくつかの症例のＢ細胞リンパ腫および鼻咽頭ガンが、ＩＩ型潜伏期を呈し、ＥＢＮＡ１、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を発現する。ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫が、ＥＢＮＡ１およびＢＡＲＦ１を発現するＩ型潜伏期を呈する。ＥＢＶ陽性胃ガンがＩ型またはＩＩ型の潜伏期を呈する。
【0057】
（溶解サイクル抗原ではなく）ＥＢＶ潜伏抗原のみが免疫適格対象におけるＥＢＶ陽性ガン細胞の細胞によって発現されることが以前より考えられている。溶解サイクル遺伝子産物をコードする転写物が近年、胃ガン、鼻咽頭ガンおよびＢ細胞リンパ腫を含めて様々なＥＢＶ陽性悪性腫瘍において検出されている。
【0058】
ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞の集団を、ＥＢＶ陽性ガンを有する患者または健常なドナー対象から生成させることが可能であるかどうか、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞がＥＢＶ感染細胞に対してエフェクター活性を示すであろうかどうか、あるいはＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞の集団が、ＥＢＶ随伴ガンを処置するために有用であるであろうかどうかは未だ明らかにされていない。
【0059】
ＥＢＶ抗原
本開示の様々な局面が、様々なＥＢＶ抗原に対応するペプチドを用いる。
本開示の様々な局面が、様々なＥＢＶ抗原に対応するペプチドを用いる。
【0060】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＲＦ１、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＦＵ、ＥＢＮＡ１－ＦＵＫ、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３およびｇｐ３５０から選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＲＦ１、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＦＵ、ＥＢＮＡ１－ＦＵＫ、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３、ｇｐ３５０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびＢＤＬＦ３から選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２、ＢＤＬＦ３およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0061】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２ＢおよびＢＭＲＦ２から選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＡＬＦ２およびＢＮＬＦ２Ａから選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２ＢおよびＢＭＲＦ２から選択される。ＥＢＶ溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0062】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ溶解抗原が、最初期溶解抗原、初期溶解抗原または後期溶解抗原から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態において、最初期溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１およびＢＭＲＦ１から選択される。最初期溶解抗原は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0064】
いくつかの実施形態において、初期溶解抗原が、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＲＦ１、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＦＵおよびＥＢＮＡ１－ＦＵＫから選択される。初期溶解抗原は、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＲＦ１、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＦＵ、ＥＢＮＡ１－ＦＵＫおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、初期溶解抗原が、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４およびＢＭＲＦ２から選択される。初期溶解抗原は、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、初期溶解抗原が、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２ＢおよびＢＭＲＦ２から選択される。初期溶解抗原は、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0065】
いくつかの実施形態において、後期溶解抗原が、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３およびｇｐ３５０から選択される。後期溶解抗原が、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３、ｇｐ３５０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、後期溶解抗原が、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される。後期溶解抗原が、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５、ＢＤＬＦ３およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、後期溶解抗原がＢＤＬＦ３である。
【0066】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、ＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される。ＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される。ＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２Ａから選択される。ＥＢＶ潜伏抗原は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0067】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ潜伏抗原が、ＩＩＩ型潜伏期抗原、ＩＩ型潜伏期抗原またはＩ型潜伏期抗原から選択される。
【0068】
いくつかの実施形態において、ＩＩＩ型潜伏期抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂ、ＢＡＲＦ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３ＢおよびＥＢＮＡ３Ｃから選択される。ＩＩＩ型潜伏期抗原は、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂ、ＢＡＲＦ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、ＩＩ型潜伏期抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２ＢおよびＢＡＲＦ１から選択される。ＩＩ型潜伏期抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂ、ＢＡＲＦ１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。いくつかの実施形態において、Ｉ型潜伏期抗原が、ＥＢＮＡ１およびＢＡＲＦ１から選択される。Ｉ型潜伏期抗原が、ＥＢＮＡ１、ＢＡＲＦ１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される場合がある。
【0069】
ＥＢＶ抗原が本明細書中で言及される場合、本開示では、所与のＥＢＶ抗原のイソ型、フラグメント、バリアント（変異体を含む）もまた意図される。所与のＥＢＶ抗原についてのアミノ酸配列、例えば、本明細書中で言及されるＥＢＶ抗原についてのアミノ酸配列を、例えば、Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）から検索することができる。Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）、４７（Ｄ１）：Ｄ５０６－Ｄ５１５を参照のこと。
【0070】
参照ＥＢＶ抗原の「イソ型」、「フラグメント」または「バリアント」は場合により、参照ＥＢＶ抗原（例えば、該抗原の参照イソ型）のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するとして、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するとして特徴づけられる場合がある。
【0071】
「フラグメント」は一般には参照タンパク質の一部を示し、（アミノ酸の数による）どのような長さのものであってもよく、だが、場合により、参照タンパク質（すなわち、フラグメントが由来するタンパク質）の長さの少なくとも２０％である場合があり、最大長さが、参照タンパク質の長さの５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のうちの１つである場合がある。「バリアント」は一般には、参照タンパク質のアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失または他の改変を含むアミノ酸配列を有する、しかし、参照タンパク質のアミノ酸配列に対する相当な程度の配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を保持するタンパク質を示す。「イソ型」は一般には、ＥＢＶによって発現される参照タンパク質のバリアントを示す。
【0072】
本明細書中に記載される様々な局面によるいくつかの実施形態において、所与のリストからの「１つまたは複数の」抗原が参照される。「１つまたは複数の」抗原に対する言及は、リストに示される抗原の１つとすべてとの間におけるどれでも意味する。列挙される抗原の数に依存して、「１つまたは複数」に対する言及は、例えば、示された抗原のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個などを意味し得る。
【0073】
ペプチドおよびペプミックス（ｐｅｐｍｉｘ）
本開示の様々な局面では、ＥＢＶ抗原に対応するペプチドが、ＥＢＶ抗原について特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大するための方法において用いられる。
本開示の様々な局面では、ＥＢＶ抗原に対応するペプチドが、ＥＢＶ抗原について特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大するための方法において用いられる。
【0074】
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸モノマーの鎖を示す。ペプチドは典型的には、その領域における長さが約２～５０アミノ酸である。「ポリペプチド」は、２つ以上のペプチドのポリマー鎖である。ポリペプチドは典型的には、長さが約５０超のアミノ酸である。
【0075】
本明細書中で使用される場合、参照抗原「に対応する」ペプチドは参照抗原のアミノ酸配列を含むか、または参照抗原のアミノ酸配列からなる。例えば、ＥＢＮＡ１「に対応する」ペプチドは、ＥＢＮＡ１のアミノ酸配列の内部に見出される（すなわち、ＥＢＮＡ１のアミノ酸配列の部分配列である）アミノ酸の配列を含むか、またはそのようなアミノ酸の配列からなる。
【0076】
本明細書中で用いられるペプチドは典型的には長さが５～３０アミノ酸であり、例えば、５～２５アミノ酸、１０～２０アミノ酸、または１２～１８アミノ酸のうちの１つである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、長さが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のうちの１つである。いくつかの実施形態において、ペプチドは長さが約１５アミノ酸である。
【0077】
「ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、同一でないペプチドを含む集団を示す場合がある。
【0078】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、方法では、１つを超える抗原に対応するペプチドが用いられる。そのような実施形態において、前記抗原のそれぞれに対応する少なくとも１つのペプチドが存在する。例えば、方法において、ＥＢＮＡ１およびＬＭＰ１に対応する様々なペプチドが用いられる場合、該ペプチドは、ＥＢＮＡ１に対応する少なくとも１つのペプチドと、ＬＭＰ１に対応する少なくとも１つのペプチドとを含む。
【0079】
いくつかの実施形態において、方法では、参照抗原の全体または一部に対応する様々なペプチドが用いられる。所与抗原の全体に対応するペプチドはこの抗原のアミノ酸配列の全長にわたる。すなわち、これらのペプチドは一緒になって、所与抗原のアミノ酸配列のアミノ酸のすべてを含有する。
【0080】
所与抗原の一部に対応するペプチドはこの抗原のアミノ酸配列の一部にわたる。ペプチドが抗原のアミノ酸配列の一部にわたるいくつかの実施形態において、ペプチドは一緒になって、例えば、該抗原のアミノ酸配列の１０％超にわたる場合があり、例えば、該抗原のアミノ酸配列の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％超のうちの１つにわたる場合がある。
【0081】
いくつかの実施形態において、方法では、重複したペプチドが用いられる。「重複した」は、アミノ酸が共通しており、より典型的にはアミノ酸の様々な配列が共通している。例示として、第１のペプチドが、ＥＢＮＡ１のアミノ酸配列の１～１５位に対応するアミノ酸配列からなり、第２のペプチドが、ＥＢＮＡ１のアミノ酸配列の５～２０位に対応するアミノ酸配列からなる。第１のペプチドと、第２のペプチドとは、１１アミノ酸によって重複する、ＥＢＮＡ１に対応する重複したペプチドである。
【0082】
いくつかの実施形態において、重複したペプチドは、１～２０、５～２０、８～１５、または１０～１２アミノ酸のうちの１つによって重複する。いくつかの実施形態において、重複したペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸のうちの１つによって重複する。いくつかの実施形態において、重複したペプチドは１１アミノ酸によって重複する。
【0083】
いくつかの実施形態において、方法では、所与の参照抗原の全体または一部に対応する、１～２０アミノ酸によって重複する５～３０アミノ酸の長さを有するペプチドが用いられる。
【0084】
いくつかの実施形態において、方法では、すべての所与の参照抗原に対応する、１１アミノ酸によって重複する１５アミノ酸の長さを有するペプチドが用いられる。そのようなペプチドの混合物は、所与抗原についての「ペプミックスペプチドプール」または「ペプミックス」として本明細書中では示される場合がある。
【0085】
例えば、本明細書中の実施例１において使用される「ＥＢＮＡ１ペプミックス」は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０３２１１－１（ｖ１）に示されるようなＥＢＮＡ１についてのアミノ酸配列の全長に広がる、１１アミノ酸によって重複する１５８個の１５ｍｅｒペプチドのプールを示す。
【0086】
本開示の様々な局面によるいくつかの実施形態において、所与のＥＢＶ抗原「に対応するペプチド」は、この抗原についてのペプミックスである場合がある。
【0087】
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大するための方法
本開示の様々な局面が、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大することに関する。
本開示の様々な局面が、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大することに関する。
【0088】
「ＥＢＶについて特異的な免疫細胞」は、ＥＢＶの抗原のペプチドを（例えば、ＭＨＣ分子によって提示されるときに）認識することができる受容体（好ましくはＴ細胞受容体）を発現する／含む。ＥＢＶ特異的な免疫細胞は、そのような受容体を、そのような抗原受容体をコードする内因性核酸の発現の結果として、またはそのような受容体を発現するように操作されたことの結果として発現する／含む場合がある。
【0089】
免疫細胞は、造血系起源の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球または単球である場合がある。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞もしくは自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、またはそれらの前駆体である場合がある。免疫細胞は、例えば、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζまたはＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ８を発現する場合がある。
【0090】
ウイルス特異的な免疫細胞の集団をインビトロ／エクスビボで生成させる／拡大するための様々な方法が当業者には広く知られている。典型的な培養条件（すなわち、細胞培養培地、添加物、温度、気体雰囲気）、細胞数、培養期間などを、例えば、Ｎｇｏ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１４）３７（４）：１９３－２０３（これはその全体が参照によってここに組み込まれる）を参照することによって決定することができる。
【0091】
好都合には、本開示による細胞の様々な培養が、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気において３７℃で維持される場合がある。本開示による細胞培養の細胞は、当業者によって容易に決定され得るように、どのような密度であれ好適な密度で確立することができ、かつ／または維持することができる。例えば、培養が、１ｍｌの培養物あたり約０．５×１０６～約５×１０６細胞／ｍｌ（例えば、約１×１０６細胞／ｍｌ）の初期密度で確立される場合がある。
【0092】
培養を、どのような容器であれ当該培養の体積のために好適である容器において、例えば、細胞培養プレートのウエル、細胞培養フラスコ、バイオリアクターなどにおいて行うことができる。いくつかの実施形態において、細胞がバイオリアクターにおいて培養され、例えば、ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅおよびＤｕｄｌｅｙ、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１（８）：１４３５－１４３７（これはその全体が参照によってここに組み込まれる）に記載されるバイオリアクターにおいて培養される。いくつかの実施形態において、細胞がＧＲｅｘ細胞培養容器において、例えば、ＧＲｅｘフラスコまたはＧＲｅｘ１００バイオリアクターにおいて培養される。
【0093】
本開示の方法は一般には、免疫細胞の集団（例えば、抗原特異的受容体を有する細胞を含む免疫細胞（例えば、末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ）の不均一な集団）を、適切な共刺激およびシグナル増幅をもたらし、その結果、活性化および拡大を引き起こすようにする条件のもと、ウイルス抗原ペプチド：ＭＨＣ複合体を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養することを含む。Ｔ細胞活性化のプロセスが当業者には広く知られており、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第５版、Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ Ｊｒ、Ｔｒａｖｅｒｓ Ｐ、Ｗａｌｐｏｒｔ Ｍ他、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）、第８章）に詳しく記載される（これはその全体が参照によって組み込まれる）。
【0094】
具体的には、方法は、ＥＢＶ抗原ペプチド：ＭＨＣ複合体について特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞が、ＴＣＲが特異的であるＥＢＶ抗原ペプチド：ＭＨＣ複合体を提示するＡＰＣによって刺激される工程を伴う。ＡＰＣは、ＥＢＶ抗原／ペプチド（１つまたは複数）をコードするウイルスに感染させられるか、またはＥＢＶ抗原／ペプチド（１つまたは複数）を含み／発現し、ＥＢＶ抗原ペプチドをＭＨＣ分子との関係で提示する。刺激はＴ細胞の活性化を引き起こし、細胞分裂（増殖）を促進させ、その結果、ＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞の集団の生成および／または拡大がもたらされる。
【0095】
刺激後に得られる細胞の集団は、刺激前の集団と比較した場合、ＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞が富化される（すなわち、ＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞が刺激後の集団では増大した頻度で存在する）。このようにして、ＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞の集団が、異なる特異性を有する様々なＴ細胞の不均一な集団から拡大される／生成させられる。あるＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞の集団が、刺激およびその結果としての細胞分裂によってただ１個のＴ細胞から生成させられる場合がある。ＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞の既存の集団が、ＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞の集団の細胞の刺激およびその結果としての細胞分裂によって拡大される場合がある。
【0096】
本開示の様々な局面の実施形態において、本明細書中におけるＥＢＶ抗原について特異的な免疫細胞は好ましくはＴ細胞であることが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋かつＣＤ４＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋かつＣＤ８＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））である。免疫細胞は好ましくは、ＥＢＶの抗原のペプチドについて特異的なＴＣＲを発現する／含む。
【0097】
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞が特異的であるウイルス抗原に応答して、またはウイルス／抗原を含む／発現する細胞に応答してＴ細胞のある特定の機能的特性を示す場合がある。いくつかの実施形態において、特性は、エフェクターＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）に関連する機能的特性である。
【0098】
いくつかの実施形態において、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は下記特性の１つまたは複数を示す場合がある：ＥＢＶ、またはＴ細胞が特異的であるＥＢＶ抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性；ＥＢＶ、またはＴ細胞が特異的であるＥＢＶ抗原を含む／発現する細胞に対する応答での増殖、ＩＦＮγ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ－２発現、ＴＮＦα発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュライシン発現および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現。
【0099】
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞が特異的であるＥＢＶ抗原のペプチドを、適切なＭＨＣ分子によって提示されたときには認識することができるＴＣＲを発現する／含む。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である場合がある。
【0100】
本開示の方法は、免疫細胞の集団をＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ抗原について特異的な免疫細胞を刺激することを含む。そのような方法工程は、「刺激」または「刺激工程」として本明細書中では示される場合がある。そのような方法工程は、細胞をインビトロ／エクスビボでの培養において維持することを典型的には要し、「刺激培養」として示される場合がある。
【0101】
いくつかの実施形態において、方法は１つまたは複数のさらなる刺激工程を含む。すなわち、いくつかの実施形態において、方法は、刺激工程によって得られる細胞を再刺激する１つまたは複数のさらなる工程を含む。そのようなさらなる刺激工程は、「再刺激」または「再刺激工程」として本明細書中では示される場合がある。そのような方法工程は、細胞をインビトロ／エクスビボでの培養において維持することを典型的には要し、「再刺激培養」として示される場合がある。
【0102】
ＰＢＭＣを（刺激のために）、または本明細書中に記載される刺激工程によって得られる細胞の集団を（再刺激のために）ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と「接触させる」ことは一般には、該ＰＢＭＣ／細胞集団を、該ペプチド（１つまたは複数）を含む細胞培養培地においてインビトロ／エクスビボで培養することを伴うことが理解されるであろう。同様に、ＰＢＭＣ／細胞集団をＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと「接触させる」ことは一般には、該ＡＰＣと該ＰＢＭＣ／細胞集団とを細胞培養培地においてインビトロ／エクスビボで共培養することを伴うことが理解されるであろう。
【0103】
いくつかの実施形態において、方法は、ＰＢＭＣをＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させることを含む。そのような実施形態において、ＰＢＭＣの集団に含まれるＡＰＣ（例えば、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）は、ＰＢＭＣの集団に含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞のその後の活性化のために、抗原を（例えば、食作用、飲作用によって）内在化し、プロセシングし、ＭＨＣクラスＩ分子（交差提示）および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の表面に提示する。
【0104】
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書中に記載される刺激工程によって得られる細胞の集団をＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させることを含む。そのような実施形態において、細胞の集団に含まれるＡＰＣ（例えば、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）は、細胞の集団に含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞のその後の再刺激のために、抗原を（例えば、食作用、飲作用によって）内在化し、プロセシングし、ＭＨＣクラスＩ分子（交差提示）および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の表面に提示する。
【0105】
いくつかの実施形態において、方法は、ＰＢＭＣをＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書中に記載される刺激工程によって得られる細胞の集団を、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと接触させることを含む。
【0106】
本開示による刺激および再刺激におけるＴ細胞とＡＰＣとの共培養が細胞培養培地において行われる。細胞培養培地は、Ｔ細胞およびＡＰＣがそれらに応じてインビトロ／エクスビボでの培養において維持される細胞培養培地がどのような培地であれ可能である。リンパ球の培養における使用のために好適な培養培地が当業者には広く知られており、これには、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、イスコフ培地などが含まれる。
【0107】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地はＲＰＭＩ－１６４０培地および／またはクリック培地（これはまた、イーグル・ハム・アミノ酸（ＥＨＡＡ）培地として知られている）を含む場合がある。これらの培地の組成は当業者には広く知られている。ＲＰＭＩ－１６４０培地の処方が、例えば、Ｍｏｏｒｅ他、ＪＡＭＡ（１９６７）１９９：５１９－５２４に記載されており、クリック培地の処方が、Ｃｌｉｃｋ他、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７２）３：２６４－２７６に記載されている。ＲＰＭＩ－１６４０培地を、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得ることができ、クリック培地を、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる（カタログ番号Ｃ５５７２）。
【0108】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させられたＰＢＭＣを、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣの存在下、ＲＰＭＩ－１６４０培地とクリック培地とを含む細胞培養培地において培養することを伴う。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させられた本明細書中に記載される刺激工程によって得られる細胞の集団を、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣの存在下、ＲＰＭＩ－１６４０培地とクリック培地とを含む細胞培養培地において培養することを伴う。
【0109】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、（体積比で）２５～６５％のＲＰＭＩ－１６４０培地と、２５～６５％のクリック培地とを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、３０～６０％のＲＰＭＩ－１６４０培地と、３０～６０％のクリック培地とを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、３５～５５％のＲＰＭＩ－１６４０培地と、３５～５５％のクリック培地とを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、４０～５０％のＲＰＭＩ－１６４０培地と、４０～５０％のクリック培地とを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、４５％のＲＰＭＩ－１６４０培地と、４５％のクリック培地とを含む。
【0110】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は１つまたは複数の細胞培養培地添加物を含む場合がある。様々な細胞培養培地添加物が当業者には広く知られており、これらには、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、Ｌ－グルタミン、サイトカイン／増殖因子などが含まれる。
【0111】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、（体積で）５～２０％のＦＢＳ、例えば、７．５～１５％のＦＢＳ、または１０％のＦＢＳを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は０．５～５％のＧｌｕｔａＭａｘを含み、例えば、１％のＧｌｕｔａＭａｘを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は０．５～５％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含み、例えば、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む。
【0112】
本開示の様々な局面では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を生成させる／拡大するための方法において用いられる。
【0113】
本開示によるＡＰＣはプロフェッショナルＡＰＣである場合がある。プロフェッショナルＡＰＣは、抗原をＴ細胞に提示するために専門化されており、そのため、ＭＨＣ－ペプチド複合体をプロセシングし、細胞表面に提示することにおいて効率的であり、高レベルの共刺激性分子を発現する。プロフェッショナルＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、およびＢ細胞が含まれる。非プロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣ－ペプチド複合体をＴ細胞に提示することができる、特にＭＨＣクラスＩ－ペプチド複合体をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することができる他の細胞である。
【0114】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ＡＰＣによって内在化される（例えば、エンドサイトーシス／食作用によって取り込まれる）抗原のＭＨＣクラスＩ上での交差提示を行うことができるＡＰＣである。ＣＤ８＋Ｔ細胞への内在化抗原のＭＨＣクラスＩ上での交差提示が、例えば、Ａｌｌｏａｔｔｉ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１６）、２７２（１）：９７－１０８に記載される（これはその全体が参照によってここに組み込まれる）。交差提示を行うことができるＡＰＣには、例えば、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｂ細胞および類洞内皮細胞が含まれる。
【0115】
本明細書中で説明されるように、いくつかの実施形態において、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を刺激するためのＡＰＣが、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を含む細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団の中に含まれ、そのため、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な細胞のそのような集団が本開示の方法に従って拡大されることになる。そのような実施形態において、ＡＰＣは、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または、どのような細胞タイプであれ、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞に抗原を提示することができる細胞の集団に含まれる他の細胞タイプである場合がある。
【0116】
いくつかの実施形態において、方法では、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）／そのペプチド（１つまたは複数）を発現する／含むように改変されているＡＰＣが用いられる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を、該ペプチド（１つまたは複数）と接触させられたこと、および該ペプチド（１つまたは複数）を内在化したことの結果として提示する場合がある。いくつかの実施形態において、ＡＰＣはそのようなペプチド（１つまたは複数）により「パルス処理」されている場合がある：これは一般には、ＡＰＣを、該ＡＰＣが該ペプチド（１つまたは複数）を内在化するために十分な期間にわたって該ペプチド（１つまたは複数）の存在下においてインビトロで培養することを伴う。
【0117】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を、抗原をコードする核酸からの細胞内における発現の結果として提示する場合がある。ＡＰＣは、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）をコードする核酸を、ＥＢＶに感染したことの結果として含む場合がある（例えば、Ｂ細胞の場合には、例えば、ＬＣＬ）。ＡＰＣは、抗原（１つまたは複数）をコードする核酸が、例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションなどにより細胞に導入されたことの結果として、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）をコードする核酸を含む場合がある。ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）をコードする核酸がプラスミド／ベクターにおいて提供される場合がある。
【0118】
いくつかの実施形態において、本開示の方法において用いられるＡＰＣが、活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、樹状細胞、Ｂ細胞（例えば、ＬＣＬを含む）、および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（例えば、Ｎｅａｌ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ（２０１７）２（１）：６８－７９、および、ＴｕｒｔｌｅおよびＲｉｄｄｅｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．（２０１０）１６（４）：３７４－３８１に記載されるものなど）から選択される。
【0119】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団の生成／拡大のために該ＡＰＣが共培養されることになる細胞の集団に関して自己である。すなわち、いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、該ＡＰＣが共培養されることになる細胞の集団が得られた対象と同じ対象に由来する（または、該ＡＰＣが共培養されることになる細胞の集団が得られた対象と同じ対象から得られる細胞に由来する）。
【0120】
ポリクローナルな活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）をＡＰＣとして使用すること、およびＡＴＣを調製するための様々な方法が、例えば、Ｎｇｏ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１４）３７（４）：１９３－２０３に記載される（これは本明細書中上記において参照によって組み込まれている）。簡単に記載すると、ＡＴＣを、ＰＢＭＣをＩＬ－２の存在下においてアゴニスト抗ＣＤ３抗体およびアゴニスト抗ＣＤ２８抗体により刺激することによってＴ細胞をインビトロで非特異的に活性化することによって生成させることができる。
【0121】
樹状細胞が、例えば、Ｎｇｏ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１４）３７（４）：１９３－２０３に記載されるように、この技術分野では広く知られている方法に従って生成させられる場合がある。樹状細胞が、ＰＢＭＣからのＣＤ１４選択によって得られることがある単球から調製される場合がある。単球は、未成熟な樹状細胞へのその分化を引き起こす細胞培養培地において培養されることがあり、その場合、この細胞培養培地は、例えば、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを含むことがある。未成熟な樹状細胞が、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＰＧＥ２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下での培養によって成熟させられる場合がある。
【0122】
ＬＣＬが、この技術分野において広く知られている方法に従って、例えば、Ｈｕｉ－Ｙｕｅｎ他、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（２０１１）５７：３３２１、および、ＨｕｓｓａｉｎおよびＭｕｌｈｅｒｋａｒ、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄ（２０１２）１（２）：７５－８７（両方がそれらの全体において参照によってここに組み込まれる）に記載されるような方法に従って生成させられる場合がある。簡単に記載すると、ＬＣＬを、ＥＢＶを産生する細胞（例えば、Ｂ９５－８細胞）の濃縮された細胞培養上清を用いてＰＢＭＣをシクロスポリンＡの存在下でインキュベーションすることによって産生させることができる。
【0123】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）には、例えば、共刺激性分子のＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３および４－１ＢＢＬを発現するように操作されるＫ５６２ｃｓ細胞が含まれる（この細胞は、例えば、Ｓｕｈｏｓｋｉ他、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００７）１５（５）：９８１－８に記載される）。
【0124】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、ＥＢＶに感染した細胞ではない。いくつかの実施形態において、ＡＰＣはＥＢＶ感染Ｂ細胞ではない。いくつかの実施形態において、ＡＰＣはＥＢＶ－ＬＣＬではない。
【0125】
いくつかの実施形態において、刺激工程は、ＰＢＭＣをＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、再刺激工程は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、再刺激工程は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＴＣと接触させることを含む。
【0126】
いくつかの実施形態において、方法では、刺激および／または再刺激における共刺激を増強するための作用因がさらに用いられる。そのような作用因には、例えば、共刺激性分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３および／または４－１ＢＢＬ）を発現する細胞、例えば、ＬＣＬまたはＫ５６２ｃｓ細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、共刺激性分子を発現する細胞はＨＬＡ陰性かつＥＢＶ複製不全のＬＣＬであり、これはまた、「ユニバーサルＬＣＬ」または「ｕＬＣＬ」として示される。ｕＬＣＬが、例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２５０３７９号（Ａ１）に記載される。
【0127】
共刺激を増強するための作用因の他の例には、例えば、Ｔ細胞によって発現される共刺激性受容体（例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳなど）について特異的なアゴニスト抗体、およびＴ細胞によって発現される共刺激性受容体を活性化することができる共刺激性分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬなど）が含まれる。そのような作用因は、例えば、ビーズに固定化されて提供される場合がある。
【0128】
いくつかの実施形態において、再刺激工程が、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞をｕＬＣＬの存在下において、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＴＣと接触させることを含む。
【0129】
免疫細胞の集団をＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣと接触させることが、Ｔ細胞の活性化および増殖を促進させるために、１つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる場合がある。いくつかの実施形態において、刺激が、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－２および／またはＩＬ－２１の１つまたは複数の存在下で行われる。これらのサイトカインは培養物に対して外因的に、しかも、培養中の細胞によって産生されるサイトカインに加えて添加されることが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、添加されたサイトカインは、組換え産生されたサイトカインである。
【0130】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させられたＰＢＭＣを、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣの存在下、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－２および／またはＩＬ－２１の１つまたは複数の存在下で培養することを伴う。
【0131】
いくつかの実施形態において、培養は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－２および／またはＩＬ－２１の存在下においてである。いくつかの実施形態において、培養は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－６および／またはＩＬ－１２の存在下においてである。いくつかの実施形態において、培養は、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５の存在下においてである。
【0132】
いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－７の最終濃度が約１０ｎｇ／ｍｌである。
【0133】
いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が約１０ｎｇ／ｍｌである。
【0134】
いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が約１００ｎｇ／ｍｌである。
【0135】
いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－６の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－６の最終濃度が約１００ｎｇ／ｍｌである。
【0136】
いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１２の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つである。いくつかの実施形態において、培養におけるＩＬ－１２の最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌである。
【0137】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、ＩＬ－１５の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）である。
【0138】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、ＩＬ－１５の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）である。
【0139】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、ＩＬ－６の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）であり、ＩＬ－１２の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、ＩＬ－１５の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）である。
【0140】
いくつかの実施形態において、刺激培養におけるＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、刺激培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）である。
【0141】
いくつかの実施形態において、刺激培養におけるＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、刺激培養におけるＩＬ－６の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）であり、刺激培養におけるＩＬ－１２の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、刺激培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）である。
【0142】
いくつかの実施形態において、再刺激培養におけるＩＬ－７の最終濃度が１～１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２～５０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、または７．５～１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）であり、かつ、再刺激培養におけるＩＬ－１５の最終濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、２０～５００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌ、または７５～１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）である。
【0143】
本発明の方法による刺激および再刺激は典型的には、Ｔ細胞とＡＰＣとの共培養を、ＡＰＣが該Ｔ細胞を刺激するために、かつ、該Ｔ細胞が細胞分裂を受けるために十分な期間にわたって行うことを伴う。
【0144】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させられたＰＢＭＣを、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣの存在下、少なくとも１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、または少なくとも７日間のうちの１つの期間にわたって培養することを伴う。いくつかの実施形態において、培養は２４時間～２０日間の期間にわたってであり、例えば、４８時間～１４日間、３日間～１２日間、４～１１日間、あるいは６～１０日間、または７～９日間のうちの１つの期間にわたってである。
【0145】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）と接触させられた本明細書中に記載される刺激工程によって得られる細胞の集団を、またはＥＢＶ抗原（１つまたは複数）に対応するペプチド（１つまたは複数）を提示するＡＰＣの存在下、少なくとも１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、または少なくとも７日間のうちの１つの期間にわたって培養することを伴う。いくつかの実施形態において、培養は２４時間～２０日間の期間にわたってであり、例えば、４８時間～１４日間、３日間～１２日間、４～１１日間、あるいは６～１０日間、または７～９日間のうちの１つの期間にわたってである。
【0146】
刺激および再刺激が、培養中の細胞を、細胞が培養された培地から分離することによって、または培養物を、例えば、細胞培養培地の添加によって希釈することによって終了させられる場合がある。いくつかの実施形態において、方法は、細胞を刺激培養または再刺激培養の終了時に回収する工程を含む。
【0147】
いくつかの実施形態において、本開示による再刺激工程が、細胞培養培地（および本明細書中に記載されるようないずれかの他の添加物）を、再刺激工程のための細胞培養培地、馴化培地（およびいずれかの添加物）の所望の割合／濃度を達成するために適切な量で加えることによって確立される場合がある。
【0148】
所与の刺激工程または再刺激工程の培養期間が終了した時、細胞が回収され、細胞培養上清から分離される場合がある。細胞が遠心分離によって回収される場合があり、細胞培養上清が細胞ペレットから分離される場合がある。その後、細胞ペレットは、例えば、再刺激工程のために、細胞培養培地に再懸濁される場合がある。いくつかの実施形態において、細胞は洗浄工程を回収後に受ける場合がある。洗浄工程は、細胞ペレットを等張性緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）に再懸濁し、細胞を遠心分離によって回収し、上清を捨てることを含む場合がある。
【0149】
ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞の集団を本開示に従って生成させるための、および／または拡大するための方法は典型的には、１回を超える刺激工程を伴う。本開示による方法において行われることがある刺激工程の回数には上限がない。いくつかの実施形態において、方法は、２、３、４または５回を超える刺激工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５回の刺激工程のうちの１つを含む。本開示による方法におけるこれらの刺激工程は互いに異なる場合がある。
【0150】
いくつかの実施形態において、本開示の方法において用いられるＰＢＭＣは、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化される。すなわち、いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは「ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞枯渇化ＰＢＭＣ」であるか、または「ＣＤ４５ＲＡ陰性ＰＢＭＣ」である。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の枯渇化は、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される細胞の集団におけるＮＫ細胞および／または制御性Ｔ細胞の数を減少させることが意図され。
【0151】
いくつかの実施形態において、方法は、ＰＢＭＣから、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を、例えば、本開示による刺激工程に先立って枯渇化する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、本開示による刺激工程によって得られる細胞から、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を、例えば、本開示による再刺激工程に先立って枯渇化する工程を含む。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の枯渇化を、どのような方法であれ好適な方法によって、例えば、ＭＡＣＳなどによって、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃカラムと、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体が被覆された磁性ビーズとを使用するＭＡＣＳによって達成することができる。
【0152】
いくつかの実施形態において、本開示の方法において用いられるＡＰＣを導出するために使用される細胞の集団は、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化される。すなわち、いくつかの実施形態において、ＡＰＣを導出するために使用される細胞の集団は「ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞枯渇化」集団または「ＣＤ４５ＲＡ陰性」集団である。例えば、ＡＴＣがＡＰＣとして用いられる実施形態において、ＡＴＣはＣＤ４５ＲＡ陽性細胞枯渇化ＰＢＭＣの集団に由来する場合があり、またはＣＤ４５ＲＡ陰性ＰＢＭＣの集団に由来する場合がある。
【0153】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＥＢＶ抗原（１つまたは複数）について特異的な免疫細胞を、細胞におけるＩＬ－７媒介シグナル伝達を増大させるために改変することを含む。ＩＬ－７媒介シグナル伝達は、腫瘍特異的Ｔ細胞の生存および抗腫瘍活性を増大させることが示されている：例えば、Ｓｈｕｍ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１７）７（１１）：１２３８－１２４７、および国際公開ＷＯ２０１８／０３８９４５（Ａ１）を参照のこと。
【0154】
方法工程の特定の例示的な実施形態
以下の特定の例示的な方法工程が本開示に関連して特に意図される。
以下の特定の例示的な方法工程が本開示に関連して特に意図される。
【0155】
（Ａ）ＰＢＭＣを、ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックスと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0156】
（Ｂ）ＰＢＭＣを、ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックスと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0157】
（Ｃ）ＰＢＭＣを、ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ１ペプミックスと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0158】
（Ｄ）ＰＢＭＣを、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックスと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0159】
（Ｅ）ＰＢＭＣを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
【0160】
（Ｆ）ＰＢＭＣを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
【0161】
（Ｇ）ＰＢＭＣを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ１ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ１ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
【0162】
（Ｈ）ＰＢＭＣを、
ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激すること。
【0163】
（Ｉ）（Ａ）～（Ｈ）のいずれか１つによる免疫細胞を、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－６および／またはＩＬ－１２の存在下で刺激すること。
【0164】
（Ｊ）（Ａ）～（Ｉ）のいずれか１つによる免疫細胞をＩＬ－７および／またはＩＬ－１５の存在下で刺激すること。
【0165】
（Ｋ）前記ＰＢＭＣはＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化される、（Ａ）～（Ｊ）のいずれか１つによる免疫細胞を刺激すること。
【0166】
（Ｌ）ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックスによりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0167】
（Ｍ）ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックスによりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0168】
（Ｎ）ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１および／またはＢＭＲＦ１ペプミックスによりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0169】
（Ｏ）ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックスによりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激すること。
【0170】
（Ｐ）ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
【0171】
（Ｑ）ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックス、ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＸＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ１ペプミックス、ＢＬＬＦ２ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックスおよび／またはＢＮＬＦ２Ａペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
【0172】
（Ｒ）ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを、
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ１；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
ＢＺＬＦ１ペプミックス、ＢＲＬＦ１ペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ１；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
【0173】
（Ｓ）ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを、
ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
ＢＭＲＦ１ペプミックス、ＢＭＬＦ１ペプミックス、ＢＡＬＦ２ペプミックス、ＢＮＬＦ２Ａペプミックス、ＢＮＬＦ２Ｂペプミックスおよび／またはＢＭＲＦ２ペプミックス；ならびに
ＥＢＮＡ１ペプミックス、ＬＭＰ１ペプミックスおよび／またはＬＭＰ２ペプミックス
によりパルス処理されたＡＰＣとの共培養によって刺激すること。
【0174】
（Ｔ）前記ＡＰＣがＡＴＣである、（Ｌ）～（Ｓ）のいずれか１つによる免疫細胞を刺激すること。
【0175】
（Ｕ）前記ＡＴＣが、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣに由来する、（Ｔ）による免疫細胞を刺激すること。
【0176】
（Ｖ）（Ｌ）～（Ｕ）のいずれか１つによる免疫細胞をｕＬＣＬの存在下で刺激すること。
【0177】
（Ｗ）（Ｌ）～（Ｖ）のいずれか１つによる免疫細胞をＩＬ－７および／またはＩＬ－１５の存在下で刺激すること。
【0178】
（Ｘ）（Ａ）～（Ｋ）のいずれか１つによる免疫細胞を刺激し、続いて、（Ｌ）～（Ｗ）のいずれか１つによる免疫細胞を刺激すること。
【0179】
本開示の方法／本開示の方法によって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団の特性
本開示の方法は場合により、当該方法の特性、および／または当該方法によって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団の特性を参照することによって特徴づけられる場合がある。
本開示の方法は場合により、当該方法の特性、および／または当該方法によって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団の特性を参照することによって特徴づけられる場合がある。
【0180】
いくつかの実施形態において、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される免疫細胞の集団は下記特性の１つまたは複数を有する：
ａ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｂ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含み、かつ、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｃ）ＥＢＶ感染細胞による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｄ）自己ＥＢＶ感染細胞に対する細胞溶解活性；
ｅ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンに対する抗ガン活性；
ｆ）生体内におけるＥＢＶ陽性腫瘍の成長の阻害；および
ｇ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンの転移の低減。
ａ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｂ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含み、かつ、１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｃ）ＥＢＶ感染細胞による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むこと；
ｄ）自己ＥＢＶ感染細胞に対する細胞溶解活性；
ｅ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンに対する抗ガン活性；
ｆ）生体内におけるＥＢＶ陽性腫瘍の成長の阻害；および
ｇ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンの転移の低減。
【0181】
免疫細胞の集団が、ＥＢＶ抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）および／またはＥＢＶ感染細胞（例えば、ＬＣＬ）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞を含むかどうかについて、免疫細胞の集団が、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって評価されることがあり、この場合、ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、例えば、実施例２に記載されるように行われることがある。
【0182】
免疫細胞の集団が、自己ＥＢＶ感染細胞に対する細胞溶解活性について、Ｚａｒｉｔｓｋａｙａ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１）、９（６）：６０１－６１６（これはその全体が参照によってここに組み込まれる）において総説される方法を使用して、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイなどを使用して評価されることがある。分析が、自己ＥＢＶ－ＬＣＬを使用して、例えば、実施例３に記載されるように行われることがある。
【0183】
免疫細胞の集団が、ＥＢＶ陽性ガンに対する抗ガン活性および／またはＥＢＶ陽性腫瘍の腫瘍成長の阻害について、適切なモデルでの分析によってインビボで評価されることがある。適切なモデルおよび分析には、実施例４において用いられるＥＢＶ－ＬＣＬ異種移植モデル法が含まれる。転移を、そのようなモデルにおける動物体内でのガン性細胞の所在を、例えば、実施例４において実施されるようにモニターすることによって評価することができる。
【0184】
いくつかの実施形態において、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される免疫細胞の集団は、ＥＢＶ特異的免疫細胞を生成させる／拡大するための参照方法に従って生成させられる／拡大される免疫細胞の集団と比較した場合、下記のうちの１つまたは複数を有する場合がある：
ｈ）１つまたは複数のＥＢＶ抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
ｊ）より多数の異なるＥＢＶ抗原（すなわち、より広範囲の様々なＥＢＶ抗原）について特異的な細胞を含むこと；
ｋ）ＥＢＶ感染細胞による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
Ｌ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンに対する、より大きい抗ガン活性；
ｍ）生体内におけるＥＢＶ陽性腫瘍の成長のより大きい阻害；
ｎ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンの転移のより大きい低減；
ｏ）生体内におけるより大きい持続性；および
ｐ）免疫細胞の該集団が投与される対象において、１つまたは複数の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＩＦＮγ）の増大した量が産生されることを誘発すること。
ｐ）免疫細胞の該集団が投与される対象において、１つまたは複数の抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）の低下した産生が生じることを誘発すること。
ｈ）１つまたは複数のＥＢＶ抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチド（１つまたは複数）による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
ｊ）より多数の異なるＥＢＶ抗原（すなわち、より広範囲の様々なＥＢＶ抗原）について特異的な細胞を含むこと；
ｋ）ＥＢＶ感染細胞による刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより多い数／割合を含むこと；
Ｌ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンに対する、より大きい抗ガン活性；
ｍ）生体内におけるＥＢＶ陽性腫瘍の成長のより大きい阻害；
ｎ）生体内におけるＥＢＶ陽性ガンの転移のより大きい低減；
ｏ）生体内におけるより大きい持続性；および
ｐ）免疫細胞の該集団が投与される対象において、１つまたは複数の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＩＦＮγ）の増大した量が産生されることを誘発すること。
ｐ）免疫細胞の該集団が投与される対象において、１つまたは複数の抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）の低下した産生が生じることを誘発すること。
【0185】
免疫細胞の所与集団の生体内での生存／持続性を、例えば、細胞が、検出可能なマーカーまたはレポーターにより標識され、その生存が経時的にモニターされる方法を使用して評価することができる。そのような方法では、例えば、細胞をホタルルシフェラーゼにより標識すること、および活性を異なる時点で測定することが含まれる。
【0186】
免疫細胞の所与集団が投与される対象によるサイトカインの産生を、例えば、対象から得られる血液由来サンプル（例えば、全血、血漿、血清）の分析によって評価することができる。サイトカインレベルを、例えば、ＥＬＩＳＡによって、例えば、実施例４において記載されるようなＥＬＩＳＡによって求めることができる。
【0187】
ＥＢＶ特異的免疫細胞を生成させる／拡大するための参照方法として、潜伏期ペプミックス（のみ）を刺激において用いる本明細書中の実施例１に記載されるような方法が挙げられる場合がある。
【0188】
本開示の方法によって生成させられる／拡大される免疫細胞の集団を使用する方法
本明細書中に記載されるように生成させられる／拡大されるＥＢＶ特異的免疫細胞を含む免疫細胞の集団は、治療的および／または予防的な方法における使用が見出される。
本明細書中に記載されるように生成させられる／拡大されるＥＢＶ特異的免疫細胞を含む免疫細胞の集団は、治療的および／または予防的な方法における使用が見出される。
【0189】
疾患／状態を対象において処置する／防止するための方法であって、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を対象に投与することを含む方法が提供される。医学的処置／予防の方法において使用するための、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団もまた提供される。疾患／状態を処置する／防止するための方法において使用するための、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される免疫細胞の集団もまた提供される。疾患／状態を処置する／防止するための方法において使用するための医薬品の製造における、本開示の方法に従って生成させられる／拡大される、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団の使用もまた提供される。
【0190】
特に、疾患／状態を養子細胞移入（ＡＣＴ）によって処置する／防止するための方法における、本開示に従って生成させられる／拡大される、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団の使用が意図される。
【0191】
養子細胞移入は一般には、細胞（例えば、免疫細胞）が、典型的には該細胞が単離される血液サンプルを抜き取ることによって対象から得られるプロセスを示す。細胞はその後、典型的には改変および／または拡大され、その後、同じ対象（自己／自家細胞の養子移入の場合）または異なる対象（同種細胞の養子移入の場合）のどちらかに投与される。処置は典型的には、ある特定の所望の特性を有する細胞の集団を対象に与えること、またはそのような特性を有するそのような細胞の頻度をその対象において増大させることを目的とする。養子移入が、細胞または細胞集団を対象に導入すること、および／または細胞または細胞集団の頻度を対象において増大させることを目指して行われる場合がある。
【0192】
免疫細胞の養子移入が、例えば、ＫａｌｏｓおよびＪｕｎｅ、２０１３、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９（１）：４９－６０、およびＤａｖｉｓ他、２０１５、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２１（６）：４８６－４９１に記載される（これらの両方がそれらの全体において参照によってここに組み込まれる）。当業者は、本開示に従う細胞の養子移入のための適切な試薬および手順を、例えば、Ｄａｉ他、２０１６、Ｊ Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１０８（７）：ｄｊｖ４３９（これはその全体が参照によって組み込まれる）を参照することによって決定することができる。
【0193】
いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；および
（ｂ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記生成させられた／拡大された集団を対象に投与すること
を含む。
（ａ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；および
（ｂ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記生成させられた／拡大された集団を対象に投与すること
を含む。
【0194】
いくつかの実施形態において、上記方法は、
（ａ）免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団を対象から単離する／得ること；
（ｂ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；および
（ｃ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記生成させられた／拡大された集団を対象に投与すること
を含む。
（ａ）免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団を対象から単離する／得ること；
（ｂ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；および
（ｃ）ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記生成させられた／拡大された集団を対象に投与すること
を含む。
【0195】
いくつかの実施形態において、免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）が単離される対象は、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の生成させられた／拡大された集団が投与される同じ対象である（すなわち、養子移入は自己／自家細胞である場合がある）。いくつかの実施形態において、免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）が単離される対象は、ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の生成させられた／拡大された集団が投与される対象とは異なる対象である（すなわち、養子移入は同種細胞である場合がある）。
【0196】
いくつかの実施形態において、上記方法は下記のうちの１つまたは複数を含む場合がある：
血液サンプルを対象から取得すること；
免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を前記血液サンプルから単離すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団を回収する／単離すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団をアジュバント、希釈剤またはキャリアと混合すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団を対象に投与すること。
血液サンプルを対象から取得すること；
免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を前記血液サンプルから単離すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の集団を本開示の方法に従って生成させる／拡大すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団を回収する／単離すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団をアジュバント、希釈剤またはキャリアと混合すること；
ＥＢＶについて特異的な免疫細胞の前記集団を対象に投与すること。
【0197】
上記方法は、疾患／状態の発症／進行を弱めること、疾患／状態の症状の緩和、または疾患／状態の病理における軽減のために効果的である場合がある。上記方法は、疾患／状態の進行を防止するために、例えば、疾患／状態の悪化を防止するために、または疾患／状態の発症速度を遅らせるために効果的である場合がある。いくつかの実施形態において、上記方法は、疾患／状態における改善、例えば、疾患／状態の症状における軽減、または疾患／状態の重篤度／活動度の何らかの他の相関物における低下を引き起こす場合がある。いくつかの実施形態において、上記方法は、より後期段階での疾患／状態の発症（例えば、慢性的段階または転移）を防止する場合がある。
【0198】
本開示に従って生成させられる／拡大される細胞の集団の治療的および予防的な有用性が、ＥＢＶ負荷および／またはＥＢＶに感染した細胞の数／活動度における軽減からの治療的利益または予防的利益を得るであろうかもしれない疾患／状態のどのようなものであれその処置／防止にまで及ぶことが理解されるであろう。
【0199】
例えば、疾患／状態は、ＥＢＶまたはＥＢＶに感染した細胞が病理学的に関わる疾患／状態、例えば、ＥＢＶ感染が、疾患／状態の開始、発症もしくは進行、および／または疾患／状態の１つもしくは複数の症状の重篤度と肯定的に関連する疾患／状態、あるいはＥＢＶ感染が、疾患／状態の開始、発症もしくは進行についての危険因子である疾患／状態である場合がある。
【0200】
処置は、ＥＢＶ負荷を軽減させること、ＥＢＶ陽性細胞の数／割合を減少させること、ＥＢＶ陽性細胞の活動度を低下させること、疾患／状態の症状の開始／進行を遅らせる／防止すること、疾患／状態の症状の重篤度を低下させること、ＥＢＶ陽性細胞の生存／成長を低下させること、対象の生存を増大させることのうちの１つまたは複数を目的とする場合がある。
【0201】
いくつかの実施形態において、本開示に従って処置される／防止されることになる疾患／状態は、ＥＢＶ感染によって特徴づけられる疾患／状態である。
【0202】
いくつかの実施形態において、対象が、ＥＢＶ／ＥＢＶ感染細胞の検出に基づいて、例えば、末梢におけるその検出、または疾患／状態によって影響される器官／組織（例えば、疾患／状態の症状が現れる器官／組織）におけるその検出に基づいて、あるいはＥＢＶ陽性ガン細胞（例えば、腫瘍におけるＥＢＶ陽性細胞）の検出によって、本明細書中に記載される処置のために選択される場合がある。疾患／状態は、どのような組織または器官または器官系においてであれ影響を及ぼす場合がある。いくつかの実施形態において、疾患／状態はいくつかの組織／器官／器官系に影響を及ぼす場合がある。
【0203】
いくつかの実施形態において、対象がＥＢＶに感染している、言い換えれば、ＥＢＶに感染した細胞を含むという判定に基づいて、対象が本開示による治療／予防のために選択される場合がある。
【0204】
ＥＢＶが、例えば、Ｊｈａ他、Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１６）７：１６０２（これはその全体が参照によってここに組み込まれる）において概説されるように、いくつかのガンに関わっている。
【0205】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示に従って処置される／防止されることになる疾患はガンである。
【0206】
ガンは、望まれない細胞増殖（またはどのような疾患であれ望まれない細胞増殖によって現れる疾患）、新生物または腫瘍をどのようなものであれ示す場合がある。ガンは良性または悪性である場合があり、また、原発性または二次性（転移性）である場合がある。新生物または腫瘍は、細胞のどのような成長または増殖であれ細胞の異常な成長または増殖である場合があり、また、どのような組織においてでも所在することがある。ガンは、例えば、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含む、または脳を除く）小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎上皮）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃、気管、子宮、外陰部および／または白血球に由来する組織／細胞のものである場合がある。
【0207】
腫瘍は、神経系または非神経系の腫瘍である場合がある。神経系の腫瘍は、中枢神経系または末梢神経系のどちらにでも起源を有する場合がある：例えば、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣細胞腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、星状膠細胞腫および乏突起神経膠腫。非神経系のガン／腫瘍は、どのような組織であれ他の非神経性の組織に起源を有する場合があり、例には、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、類表皮ガン、前立腺ガン、乳ガン、肺ガン、結腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、胸腺ガン、ＮＳＣＬＣ、血液ガンおよび肉腫が含まれる。
【0208】
いくつかの実施形態において、ガンは、結腸ガン、結腸ガン腫、結腸直腸ガン、鼻咽頭ガン、子宮頸ガン、中咽頭ガン、胃ガン、肝細胞ガン、頭頸部ガン、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）、口腔ガン、喉頭ガン、前立腺ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、膀胱ガン、尿路上皮ガン、黒色腫、進行性黒色腫、腎細胞ガン、卵巣ガンまたは中皮腫からなる群から選択される。
【0209】
いくつかの実施形態において、処置される／防止されることになるガンはＥＢＶ随伴ガンである。「ＥＢＶ随伴」ガンは、ＥＢＶによる感染によって引き起こされる、もしくは悪化するガン、感染が危険因子であるガン、および／または、感染が、開始、発症、進行、重篤度もしくは転移に肯定的に関連するガンである場合がある。
【0210】
本開示に従って処置される／防止されることがあるＥＢＶ随伴ガンには、Ｂ細胞関連のガン、例えば、バーキットリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳリンパ腫）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および免疫不全に伴うＥＢＶ随伴リンパ腫（例えば、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患に伴うＥＢＶ陽性リンパ腫、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳに伴うＥＢＶ陽性リンパ腫、および口腔毛状白板症を含む）など、ならびに上皮細胞に関連づけられるガン、例えば、鼻咽頭ガン（ＮＰＣ）および胃ガン（ＧＣ）などが含まれる。
【0211】
いくつかの実施形態において、ガンは、リンパ腫（例えば、ＥＢＶ陽性リンパ腫）、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ；例えば、ＥＢＶ陽性ＨＮＳＣＣ）、鼻咽頭ガン（ＮＰＣ；例えば、ＥＢＶ陽性ＮＰＣ）、および胃ガン（ＧＣ；例えば、ＥＢＶ陽性ＧＣ）から選択される。
【0212】
ＥＢＶ感染はまた、多発性硬化症および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；例えば、ＡｓｃｈｅｒｉｏおよびＭｕｎｇｅｒ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）；３９０（Ｐｔ １）：３６５－８５を参照のこと）などの様々な自己免疫疾患の発症／進行にも関わっており、ＥＢＶ抗原であるＥＢＮＡ２が、ＳＬＥ、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、１型糖尿病、若年性特発性関節炎およびセリアック病の発症についての危険因子として関わる遺伝子領域と会合することが近年には示されている（Ｈａｒｌｅｙ他、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．（２０１８）５０（５）：６９９－７０７）。
【0213】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示に従って処置される／防止されることになる疾患／状態は、ＳＬＥ、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、１型糖尿病、若年性特発性関節炎およびセリアック病から選択される。
【0214】
本開示に従って生成させられる／拡大される細胞の集団はまた、ＥＢＶ感染とは無関係に疾患／状態の処置／防止における使用が見出される。
【0215】
本明細書中上記で記載されるように、本開示に従って生成させられる／拡大される細胞の集団は、ガンを処置するための方法における使用が見出される。
【0216】
いくつかの実施形態において、ガンはガン抗原を発現する場合がある。「ガン抗原」は、ガンの細胞によって発現される、または過剰発現される抗原である。ガン抗原として、ペプチド／ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、グリカン、糖脂質、脂質またはそれらのフラグメントがどのようなものであれ挙げられる場合がある。ガン抗原の発現がガンに随伴する場合がある。ガン抗原がガン細胞によって異常に発現される場合があり（例えば、ガン抗原が、異常な局在化を伴って発現される）、またはガン細胞によって異常な構造を伴って発現される場合がある。ガン抗原が、免疫応答を誘発することができる場合がある。いくつかの実施形態において、抗原はガン細胞の細胞表面に発現される（すなわち、ガン抗原はガン細胞表面抗原である場合がある）。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗原結合分子が結合する抗原の一部が、ガン細胞の外側表面に露呈される（すなわち、細胞外である）。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、ガンの症状の発症、進行または重篤度にその発現が関連する抗原である。ガン随伴抗原はガンの原因または病理に関連する場合があり、あるいはガンの結果として異常に発現される場合がある。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、例えば、比較可能な非ガン性細胞（例えば、同じ組織／細胞タイプに由来する非ガン性細胞）による発現レベルと比較した場合、ガンの細胞によってその発現が（例えば、ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで）アップレギュレーションされる抗原である。いくつかの実施形態において、ガン抗原はガン性細胞によって優先的に発現されており、比較可能な非ガン性細胞（例えば、同じ組織／細胞タイプに由来する非ガン性細胞）によって発現されない。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、変異したガン遺伝子または変異した腫瘍抑制遺伝子の産物である。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、過剰発現した細胞タンパク質、発ガン性ウイルスによって産生されるガン抗原、腫瘍胎児性抗原、細胞表面分子（例えば、細胞表面のタンパク質または糖タンパク質）の産物である。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、細胞シグナル伝達分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキンまたはリンホカインである。いくつかの実施形態において、ガン抗原は増殖因子またはホルモンである。
【0217】
いくつかの実施形態において、ガンはガン抗原について「陽性」であり、このことは、ガンが、ガン抗原を発現する細胞（例えば、ガン抗原を細胞表面に発現する細胞）を含むことを意味する。ガン抗原陽性ガンはガン抗原を過剰発現する場合がある。ガン抗原の過剰発現を、同等の非ガン性細胞／非腫瘍組織による発現レベルよりも大きいガン抗原の遺伝子発現レベルまたはタンパク質発現レベルを検出することによって明らかにすることができる。ガン抗原の遺伝子／タンパク質発現が、ガンの症状の開始、発症、進行もしくは重症度、および／または転移についての危険因子である場合があり、ならびに／あるいはそれらに肯定的に関連する場合がある。
【0218】
対象
本明細書中に記載される開示の様々な局面による対象は、どのような動物またはヒトでもある場合がある。対象は好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物である場合があり、しかし、より好ましくはヒトである。対象はいずれの性でもある場合がある。対象は患者である場合がある。対象は、処置を必要とする疾患／状態と診断されている場合があり、そのような疾患／状態を有することが疑われる場合があり、またはそのような疾患／状態を発症する／そのような疾患／状態に罹患する危険性がある場合がある。
本明細書中に記載される開示の様々な局面による対象は、どのような動物またはヒトでもある場合がある。対象は好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物である場合があり、しかし、より好ましくはヒトである。対象はいずれの性でもある場合がある。対象は患者である場合がある。対象は、処置を必要とする疾患／状態と診断されている場合があり、そのような疾患／状態を有することが疑われる場合があり、またはそのような疾患／状態を発症する／そのような疾患／状態に罹患する危険性がある場合がある。
【0219】
本開示による実施形態において、対象は好ましくはヒト対象である。いくつかの実施形態において、本明細書中の開示の治療的方法または予防的方法に従って処置されることになる対象は、疾患／状態を有する対象、または疾患／状態を発生する危険性がある対象である。本開示による実施形態において、対象が、そのような疾患／状態のある特定のマーカーについての特徴づけに基づく方法による処置のために選択される場合がある。
【0220】
配列同一性
２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の間におけるパーセント同一性を求めるという目的のための対配列アラインメントおよび多重配列アラインメントを、例えば、公開されているコンピューターソフトウエアを使用して、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａソフトウエア（Ｓｏｄｉｎｇ，Ｊ．、２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１、９５１－９６０）、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ他、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２、２０５－２１７）、Ｋａｌｉｇｎソフトウエア（ＬａｓｓｍａｎｎおよびＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ、２００５、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６（２９８））、およびＭＡＦＦＴソフトウエア（ＫａｔｏｈおよびＳｔａｎｄｌｅｙ、２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、３０（４）７７２－７８０）などを使用して、当業者には知られている様々な方法で達成することができる。そのようなソフトウエアを使用するとき、例えば、ギャップペナルティーおよび伸長ペナルティーについては、初期値設定済みパラメーターが好ましくは使用される。
２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の間におけるパーセント同一性を求めるという目的のための対配列アラインメントおよび多重配列アラインメントを、例えば、公開されているコンピューターソフトウエアを使用して、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａソフトウエア（Ｓｏｄｉｎｇ，Ｊ．、２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１、９５１－９６０）、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ他、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２、２０５－２１７）、Ｋａｌｉｇｎソフトウエア（ＬａｓｓｍａｎｎおよびＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ、２００５、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６（２９８））、およびＭＡＦＦＴソフトウエア（ＫａｔｏｈおよびＳｔａｎｄｌｅｙ、２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、３０（４）７７２－７８０）などを使用して、当業者には知られている様々な方法で達成することができる。そのようなソフトウエアを使用するとき、例えば、ギャップペナルティーおよび伸長ペナルティーについては、初期値設定済みパラメーターが好ましくは使用される。
【0221】
番号付き段落
以下の番号付き段落（ｐａｒａ）は、本開示に関連して意図される特徴および特徴組み合わせのさらなる記述を提供する：
以下の番号付き段落（ｐａｒａ）は、本開示に関連して意図される特徴および特徴組み合わせのさらなる記述を提供する：
【0222】
１．エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞を含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞を刺激することを含む方法。
【0223】
２．ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞を再刺激することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【0224】
３．前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項１に記載の方法。
【0225】
４．前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項１に記載の方法。
【0226】
５．前記ＰＢＭＣが、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣである、請求項１に記載の方法。
【0227】
６．エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを含む免疫細胞の集団を生成させるための、または拡大するための方法であって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、（ｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドと、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、および１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な免疫細胞とを刺激することを含む方法。
【0228】
７．ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを、１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチド、およびＥＢＶ潜伏抗原の全体または一部に対応する１つまたは複数のペプチドを提示するＡＰＣと接触させることによって、ＥＢＶ溶解抗原について特異的な前記免疫細胞と、ＥＢＶ潜伏抗原について特異的な前記免疫細胞とを再刺激することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【0229】
８．前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＧＬＦ５、ＢＨＲＦ１、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＨＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＫＲＦ４、ＢＭＲＦ２、ＢＡＬＦ４、ＢＩＬＦ１、ＢＩＬＦ２、ＢＮＦＲ１、ＢＶＲＦ２、ＢＡＬＦ３、ＢＡＬＦ５およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項６に記載の方法。
【0230】
９．前記１つまたは複数のＥＢＶ溶解抗原が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２およびＢＤＬＦ３から選択される、請求項６に記載の方法。
【0231】
１０．前記１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＢＡＲＦ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される、請求項６に記載の方法。
【0232】
１１．前記１つまたは複数のＥＢＶ潜伏抗原が、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂから選択される、請求項６に記載の方法。
【0233】
１２．前記ＰＢＭＣが、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣである、請求項６に記載の方法。
【0234】
１３．請求項１に記載の方法によって得られる、または得ることができる免疫細胞の単離された集団。
【0235】
１４．疾患または障害を処置するための、または防止するための方法であって、請求項１３に記載の単離された免疫細胞集団を対象に投与することを含む方法。
【0236】
１５．前記疾患または障害がガンである、請求項１４に記載の方法。
【0237】
１６．前記疾患または障害が、ＥＢＶ陽性リンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽頭ガンおよびＥＢＶ陽性胃ガンから選択されるＥＢＶ随伴ガンである、請求項１４に記載の方法。
【0238】
本発明には、記載される様々な局面および好ましい特徴の組み合わせが、そのような組み合わせが明らかに容認できない場合または明確に回避される場合を除いて包含される。
【0239】
本明細書中で使用される節見出しは、構成上の目的だけのためのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されることはない。
【0240】
本発明の様々な局面および実施形態が次に、添付された図面を参照することにより例として説明されるであろう。さらなる局面および実施形態が当業者には明らかであろう。本文において言及されるすべての文書が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【0241】
下記の請求項を含めて本明細書全体を通して、文脈上他の解釈が要求される場合を除き、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（含む）、ならびに“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”（含む）および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）などの変化形は、明記された完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または工程または一群の完全体もしくは工程を包含することを意味すること、しかし、他の完全体または工程または一群の完全体もしくは工程をどのようなものであれ除外することを意味しないことが理解されるであろう。
【0242】
本明細書および添付された請求項において使用される場合、“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”を伴う単数形態は、文脈がそうでないことを明確に示す場合を除き、複数である参照物を包含することに留意しなければならない。範囲が、「約」を伴って１つの特定の値から、および／または「約」を伴って別の特定の値までとして本明細書中では表される場合がある。そのような範囲が表されるとき、別の実施形態では、前記１つの特定の値から、および／または前記他の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表されるときには、前記特定の値は別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【0243】
核酸配列が本明細書中に開示される場合、その逆相補体もまた明確に意図される。
【0244】
本明細書中に記載される様々な方法がインビトロまたはインビボで実施される場合がある。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される様々な方法がインビトロで実施される。用語「インビトロ」は、細胞が培養されている実験を包含することが意図され、これに対して、用語「インビボ」は、無傷の多細胞生物を用いる実験を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0245】
次に、本開示の方法および組成物の原理を例示する様々な実施形態および実験が、添付された図面を参照することにより議論される。
【図1A】４名の異なるＥＢＶ陽性リンパ腫患者から得られるＰＢＭＣから拡大される細胞の集団に含まれる、示されたＥＢＶ抗原について特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。潜伏ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によって生成させられるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２ ＥＢＶＳＴ、ＡＩＩ－ＥＢＶＳＴ）の中での、示された抗原による刺激に対する応答における１００，０００細胞あたりのＳＦＣの数を示す。
【図1B】４名の異なるＥＢＶ陽性リンパ腫患者から得られるＰＢＭＣから拡大される細胞の集団に含まれる、示されたＥＢＶ抗原について特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。溶解ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によって生成させられるＥＢＶＳＴ（それぞれ、溶解ＥＢＶＳＴ、ＡＩＩ－ＥＢＶＳＴ）の中での、示された抗原による刺激に対する応答における１００，０００細胞あたりのＳＦＣの数を示す。
【図2】潜伏ペプミックス、溶解ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によって２名のＥＢＶ陽性リンパ腫患者からのＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）に含まれる、示されたＥＢＶ抗原について特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。棒での細胞総数が示される。
【図3】潜伏ペプミックス、最初期溶解ペプミックス、初期溶解ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によって３名の健常ドナー対象からのＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＩＥ－ＥＢＶＳＴ、Ｅ－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）に含まれる、示されたＥＢＶ抗原について特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。
【図4】潜伏ペプミックス、最初期溶解ペプミックス、初期溶解ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によって３名の健常ドナー対象からのＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＩＥ－ＥＢＶＳＴ、Ｅ－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）によって、細胞溶解活性のインビトロアッセイにおいて溶解される自己ＥＢＶ－ＬＣＬの割合を示す棒グラフ。
【図5】潜伏ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）に含まれる、示されたＥＢＶ抗原またはＬＣＬについて特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。
【図6A】潜伏ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
【図6B】潜伏ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。ホタルルシフェラーゼ発現ＥＢＶ－ＬＣＬのルシフェラーゼ活性によって測定されるような経時的な腫瘍負荷量を示す。
【図6C】ホタルルシフェラーゼ発現ＥＢＶ－ＬＣＬのルシフェラーゼ活性によって測定されるような経時的な腫瘍負荷量を示す。
【図7】潜伏ペプミックス、または潜伏＋溶解ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ）の、自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対する抗ガン活性をＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおいて調べる実験の示された日のマウスにおけるインビボでのホタルルシフェラーゼ発現ＥＢＶ－ＬＣＬの負荷量および所在を示す画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。
【図8A】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。ＥＢＶＳＴの注入に対する示された日における背側面を示す。
【図8B】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。ＥＢＶＳＴの注入に対する示された日における腹側面を示す。
【図8C】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。経時的な総腫瘍負荷量を示す。
【図8D】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）の、ＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおける自己ＥＢＶ－ＬＣＬに対するインビボ抗ガン活性を示すグラフおよび画像。コントロール群はＥＢＶＳＴの代わりにＰＢＳを受けた。経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
【図9A】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）による処置をＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおいて受けるマウスの血清において検出されるサイトカインのレベルを、ＥＢＶ注入後の示された日数において示す箱ひげ図。ＧＭ－ＣＳＦのレベルを示す。＊＊＊Ｐ＝０．０００１。
【図9B】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）による処置をＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおいて受けるマウスの血清において検出されるサイトカインのレベルを、ＥＢＶ注入後の示された日数において示す箱ひげ図。ＩＦＮγのレベルをを示す。＊＊＊Ｐ＝０．０００１。
【図9C】潜伏ペプミックス、溶解（２）ペプミックス、または溶解（２）＋潜伏ペプミックスを使用する刺激によってＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ（それぞれ、Ｔ２－ＥＢＶＳＴ、溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ）による処置をＥＢＶ陽性ガンのマウス異種移植モデルにおいて受けるマウスの血清において検出されるサイトカインのレベルを、ＥＢＶ注入後の示された日数において示す箱ひげ図。ＩＬ－１０のレベルを示す。＊＊＊Ｐ＝０．０００１。
【図10】４名の異なる健常ドナー対象（Ｄ＃１～Ｄ＃４）から得られるＰＢＭＣから潜伏ペプミックスを使用する刺激によって拡大される細胞の集団に含まれる、ＥＢＶ抗原について特異的な１００，０００細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す棒グラフ。ＷＷ＝ＰＢＭＣ全体から拡大され、ＰＢＭＣ全体に由来するＡＴＣを使用して再刺激されるＥＢＶＳＴ；ＷＤ＝ＰＢＭＣ全体から拡大され、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣに由来するＡＴＣを使用して再刺激されるＥＢＶＳＴ；ＤＷ＝ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大され、ＰＢＭＣ全体に由来するＡＴＣを使用して再刺激されるＥＢＶＳＴ；およびＤＤ＝ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大され、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣに由来するＡＴＣを使用して再刺激されるＥＢＶＳＴ。
【図11】フローサイトメトリーによって求められるような、４名の異なる健常ドナー対象（Ｄ＃１～Ｄ＃４）、ＰＢＭＣ全体、またはＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣに由来するＡＴＣでのＣＤ８０およびＨＬＡ－ＤＲの発現を示すヒストグラム。
【実施例】
【0246】
以下の実施例において、本発明者らは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を含む細胞の集団が、様々な異なるＥＢＶ抗原のペプチドによる刺激によってＰＢＭＣ集団から生成させられることを記載する。本発明者らは、拡大された細胞集団を、そのＥＢＶ反応性、ＥＢＶ感染細胞に対するエフェクター活性を示し得るか、およびＥＢＶ陽性ガンに対するインビボにおけるその抗ガン活性について特徴づけする。本発明者らはまた、拡大された集団におけるＥＢＶ反応性細胞の割合、ならびにインビボにおける該細胞の抗ガン活性および持続性を増大させるための方法を詳しく調べている。
【0247】
実施例１：ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の生成
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的なＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法に従って、健常ドナーまたはリンパ腫患者から得られる血液サンプルから単離した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的なＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法に従って、健常ドナーまたはリンパ腫患者から得られる血液サンプルから単離した。
【0248】
ＡＴＣの生成
抗ＣＤ３アゴニスト抗体（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を、０．５ｍｌの１：１０００希釈された１ｍｇ／ｍｌの抗体を加え、３７℃で２～４時間または４℃で一晩インキュベーションすることによって組織培養プレートのウエルに被覆した。１×１０６個のＰＢＭＣ（２ｍｌの細胞培養培地において）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５が補充されるＣＴＬ細胞培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０培地、５０％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａＭａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する）における抗ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニスト抗体被覆プレートでの培養によって刺激した。細胞を５％のＣＯ２雰囲気において３７℃で維持した。翌日、１ｍｌの細胞培養培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有する新鮮なＣＴＬ培地により取り換えた。ＡＴＣを培養で維持し、続いて集め、実験で使用したか、または５～７日の間で凍結保存した。
抗ＣＤ３アゴニスト抗体（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体を、０．５ｍｌの１：１０００希釈された１ｍｇ／ｍｌの抗体を加え、３７℃で２～４時間または４℃で一晩インキュベーションすることによって組織培養プレートのウエルに被覆した。１×１０６個のＰＢＭＣ（２ｍｌの細胞培養培地において）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５が補充されるＣＴＬ細胞培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０培地、５０％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａＭａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する）における抗ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニスト抗体被覆プレートでの培養によって刺激した。細胞を５％のＣＯ２雰囲気において３７℃で維持した。翌日、１ｍｌの細胞培養培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有する新鮮なＣＴＬ培地により取り換えた。ＡＴＣを培養で維持し、続いて集め、実験で使用したか、または５～７日の間で凍結保存した。
【0249】
ユニバーサルＬＣＬ
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの表面発現を欠くＬＣＬ（すなわち、ＨＬＡ陰性ＬＣＬ）を、ＨＬＡクラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする遺伝子をＢ細胞のＥＢＶ形質転換によって調製されるリンパ芽球様細胞株の細胞において標的化ノックアウトすることによって得た。このＨＬＡ陰性細胞を、ＥＢＶ複製のために必要な遺伝子をノックアウトするためにさらに改変した。本方法によって得られる生じた細胞は本明細書中ではユニバーサルＬＣＬ（ｕＬＣＬ）として示される。
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの表面発現を欠くＬＣＬ（すなわち、ＨＬＡ陰性ＬＣＬ）を、ＨＬＡクラスＩ分子およびＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする遺伝子をＢ細胞のＥＢＶ形質転換によって調製されるリンパ芽球様細胞株の細胞において標的化ノックアウトすることによって得た。このＨＬＡ陰性細胞を、ＥＢＶ複製のために必要な遺伝子をノックアウトするためにさらに改変した。本方法によって得られる生じた細胞は本明細書中ではユニバーサルＬＣＬ（ｕＬＣＬ）として示される。
【0250】
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の拡大
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を、５０％のＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ、５０％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａＭａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有し、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１００ｎｇ／ｍｌ）が補充される細胞培養培地において、ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られるペプミックス（関連抗原のアミノ酸配列全体に広がる、１１アミノ酸によって重複する重複した１５ｍｅｒアミノ酸ペプチドライブラリー）の以下の組み合わせの１つにより２×１０６個のＰＢＭＣを９日間にわたって刺激することによって拡大した：
（ｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＥＢＮＡ１）＋ＬＭＰ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＬＭＰ１）＋ＬＭＰ２ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＬＭＰ２）－「潜伏ペプミックス」
（ｉｉ）ＢＺＬＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＺＬＦ１）＋ＢＲＬＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＲＬＦ１）＋ＢＭＲＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＭＲＦ１）＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＊＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＊＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＊＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＊＋ＢＭＲＦ２ペプミックス＊－「溶解ペプミックス」
（ｉｉｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス＋ＬＭＰ１ペプミックス＋ＬＭＰ２ペプミックス＋ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＋ＢＭＲＦ２ペプミックス－「潜伏＋溶解ペプミックス」
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を、５０％のＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ、５０％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａＭａｘ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有し、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１００ｎｇ／ｍｌ）が補充される細胞培養培地において、ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られるペプミックス（関連抗原のアミノ酸配列全体に広がる、１１アミノ酸によって重複する重複した１５ｍｅｒアミノ酸ペプチドライブラリー）の以下の組み合わせの１つにより２×１０６個のＰＢＭＣを９日間にわたって刺激することによって拡大した：
（ｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＥＢＮＡ１）＋ＬＭＰ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＬＭＰ１）＋ＬＭＰ２ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＬＭＰ２）－「潜伏ペプミックス」
（ｉｉ）ＢＺＬＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＺＬＦ１）＋ＢＲＬＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＲＬＦ１）＋ＢＭＲＦ１ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＭＲＦ１）＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＊＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＊＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＊＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＊＋ＢＭＲＦ２ペプミックス＊－「溶解ペプミックス」
（ｉｉｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス＋ＬＭＰ１ペプミックス＋ＬＭＰ２ペプミックス＋ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＋ＢＭＲＦ２ペプミックス－「潜伏＋溶解ペプミックス」
【0251】
ペプミックスの組み合わせ（すなわち、ペプミックス混合物）を１×１０６個のＰＢＭＣあたり１０ｎｇのペプミックス混合物の最終量で刺激において使用した。
＊ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２についてのペプミックスを、Ｇｅｎｅｍｅｄから得られる個々の構成ペプチドを組み合わせることによって調製した。
（ｉｖ）ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス－「最初期溶解ペプミックス」
（ｖ）ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＋ＢＭＲＦ２ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＭＲＦ１）－「初期溶解ペプミックス」
＊ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＮＬＦ２Ａ、ＢＮＬＦ２Ｂ、ＢＭＲＦ２についてのペプミックスを、Ｇｅｎｅｍｅｄから得られる個々の構成ペプチドを組み合わせることによって調製した。
（ｉｖ）ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス－「最初期溶解ペプミックス」
（ｖ）ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ｂペプミックス＋ＢＭＲＦ２ペプミックス（ＪＰＴカタログ番号ＰＭ－ＥＢＶ－ＢＭＲＦ１）－「初期溶解ペプミックス」
【0252】
追加の細胞培養培地を９日の経過にわたって必要に応じて加え、サイトカインを、５、６または７日目に補充した。
【0253】
９日間の培養期間が終了した時、細胞を、放射線照射された、ペプチドパルス処理された自己由来の活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）とのｕＬＣＬの存在下での共培養によって再刺激した。簡単に記載すると、２×１０６個のＡＴＣをペプミックス（１×１０６個のＡＴＣあたり１０ｎｇのペプミックス混合物）とともにＣＴＬ培地において３７℃で３０分間インキュベーションし、続いて３０Ｇｙでの放射線照射に供し、集めた。その後、ペプチドパルス処理ＡＴＣを、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するＣＴＬ培地において、１：１：５のレスポンダー細胞：ペプチドパルス処理ＡＴＣ：放射線照射ｕＬＣＬの比率で、培養中の細胞およびｕＬＣＬ（１００Ｇｙでの放射線照射）と混合した。具体的には、１×１０５個のレスポンダー細胞と、１×１０５個のペプチドパルス処理ＡＴＣと、０．５×１０６個の放射線照射ｕＬＣＬとを２４ウエル組織培養プレートのウエルにおいて２ｍＬのＣＴＬ培地で培養した。
【0254】
細胞を５％のＣＯ２雰囲気において３７℃で維持した。３～４日後、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するさらなる細胞培養培地を必要に応じて加えた。５日目または６日目に、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するさらなる細胞培養培地を必要に応じて加え、６～７日後、拡大されたＥＢＶＳＴを分析のために、または実験での使用のために集めた。
【0255】
実施例および図の全体にわたる実例において：
潜伏ペプミックス（すなわち、上記の（ｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「２型潜伏抗原（Ｔ２）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「溶解ＥＢＶＳＴ」として示される。
潜伏＋溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｉｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「広範囲レパートリー（ＢＲ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
最初期溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｖ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「最初期（ｌＥ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
初期溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｖ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「初期（Ｅ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
潜伏ペプミックス（すなわち、上記の（ｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「２型潜伏抗原（Ｔ２）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「溶解ＥＢＶＳＴ」として示される。
潜伏＋溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｉｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「広範囲レパートリー（ＢＲ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
最初期溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｉｖ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「最初期（ｌＥ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
初期溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｖ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「初期（Ｅ）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
【0256】
実施例２：ＥＢＶ抗原についてのＥＢＶＳＴの特異性の分析
異なるペプミックスを使用してＥＢＶ陽性リンパ腫患者のＰＢＭＣから調製されるＥＢＶＳＴを、該ＥＢＶＳＴは異なるＥＢＶ抗原を認識することができるかを明らかにするためにＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。
異なるペプミックスを使用してＥＢＶ陽性リンパ腫患者のＰＢＭＣから調製されるＥＢＶＳＴを、該ＥＢＶＳＴは異なるＥＢＶ抗原を認識することができるかを明らかにするためにＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。
【0257】
簡単に記載すると、ＥＢＶＳＴを抗ＩＦＮγ捕捉抗体により事前に被覆される９６ウエルプレートにおいて１×１０５細胞／ウエルで置床し、示されたＥＢＶペプチドに対応するペプミックスにより刺激した。１８～２０時間のインキュベーションの後、プレートをＩＦＮγ＋スポットについて発色させ、暗所において室温で一晩乾燥させ、定量化した。それぞれの抗原に対して特異的なＴ細胞の頻度を投入細胞数あたりの特異的スポット形成細胞（ＳＦＣ）として表した。
【0258】
図１Ａおよび図１Ｂは、溶解サイクル抗原について特異的なＴ細胞を溶解サイクル抗原についてのプレミックスだけによる刺激によって生成させることができることを示す。潜伏抗原および溶解抗原についてのペプミックスを組み合わせた場合、どのような抗原であれただ１つの抗原についての特異性は損なわれず、抗原特異的Ｔ細胞の総頻度が、ペプミックスが組み合わされたときには大きくなっていた。
【0259】
ある患者のＴ細胞は、潜伏抗原ペプミックスまたは溶解抗原ペプミックスが単独で使用されるときには不良な特異性を示しており、しかし、潜伏抗原ペプミックスと、溶解抗原ペプミックスとが組み合わせで使用されるときには、良好な特異性を達成することができる（ドナー２を参照のこと）。これは、互いに助け合う活性化Ｔ細胞によるサイトカインの産生の結果であると考えられる。
【0260】
図２は、ＥＢＶ潜伏抗原および溶解抗原に対応するペプミックスによる刺激に応答してＩＦＮγを分泌する細胞の数が、潜伏抗原ペプミックスと溶解抗原ペプミックスとの組み合わせを使用して生成させられるＥＢＶＳＴについては、潜伏抗原ペプミックスだけを使用して、または溶解抗原ペプミックスだけを使用して生成させられるＥＢＶＳＴよりも多いことを示す。ＩＦＮγ産生細胞の数における超加法的な増大が、潜伏抗原ペプミックスと溶解抗原ペプミックスとの組み合わせのときには認められる。
【0261】
さらなる実験において、異なるペプミックスを使用して健常ドナーのＰＢＭＣから調製されるＥＢＶＳＴを上記で記載されるように、該ＥＢＶＳＴは異なるＥＢＶ抗原を認識することができるかを明らかにするためにＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。
【0262】
結果が図３に示されており、結果は、潜伏サイクル抗原、最初期溶解抗原および初期溶解抗原について特異的なＴ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣから拡大することが可能であったことを明らかにする。
【0263】
実施例３：異なるＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＥＢＶＳＴによる細胞殺傷の分析
異なるペプミックスを使用するＰＢＭＣの刺激によって得られるＥＢＶＳＴを、該ＥＢＶＳＴは自己のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を殺傷することができるかについて分析した。
異なるペプミックスを使用するＰＢＭＣの刺激によって得られるＥＢＶＳＴを、該ＥＢＶＳＴは自己のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を殺傷することができるかについて分析した。
【0264】
１０μｌのＣｒ５１を、１０ｎｇのＥＢＶ潜伏＋溶解ペプミックス（実施例１の（ｉｉｉ）を参照のこと）によりパルス処理される１×１０６個の自己ＬＣＬに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＬＣＬをＣＴＬ培地により３回洗浄し、５０，０００細胞／ｍｌにＣＴＬ培地において再懸濁した。ＥＢＶＳＴをＶ字型ウエル９６ウエルプレートのウエルにおける２００μｌのＣＴＬ培地において、２０：１のエフェクター：標的細胞比（１００，０００個のＥＢＶＳＴ＋５，０００個のＬＣＬ）で、対応する自己由来のペプミックスパルス処理ＬＣＬとともに置床した。共培養物を４時間、３７℃で５％のＣＯ２においてインキュベーションした。その後、上清を集め、標的細胞の％特異的溶解を、殺傷された標的細胞によって放出されるＣｒ５１を測定するためにガンマ線カウンターを使用して求めた。
【0265】
結果が図４に示される。異なるペプミックスを使用するＰＢＭＣの刺激によって得られるＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞は、自己由来のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を殺傷することができた。
【0266】
溶解抗原ペプミックスを用いる方法を使用して得られるＥＢＶＳＴの強力なＥＢＶ－ＬＣＬ殺傷能は、ＬＣＬのごく一部のみが溶解サイクルにあること（したがって、標的抗原を発現すること）が予想されるかもしれないので、驚くべきものであった。結果は、食作用、および溶解期における瀕死細胞からの抗原の提示によって説明されるかもしれない。
【0267】
実施例４：異なるＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＥＢＶＳＴについてのインビボ抗ガン活性の分析
本発明者らは、ＥＢＶ陽性ガンを処置するＢＲ－ＥＢＶＳＴおよびＴ２－ＥＢＶＳＴの相対的な能力を、マウス異種移植モデルを使用してインビボで調べた。
本発明者らは、ＥＢＶ陽性ガンを処置するＢＲ－ＥＢＶＳＴおよびＴ２－ＥＢＶＳＴの相対的な能力を、マウス異種移植モデルを使用してインビボで調べた。
【0268】
簡単に記載すると、ＥＢＶ陽性腫瘍を、マトリゲルにおける３．５×１０６個のホタルルシフェラーゼ発現自己ＬＣＬをＮＳＧマウスの脇腹に皮下埋め込みすることによって確立した。８日後、腫瘍が視認できたとき、マウスに、ＰＢＳ（コントロール群）、５×１０６個のＢＲ－ＥＢＶＳＴ、または５×１０６個のＴ２－ＥＢＶＳＴを静脈内注入によって投与した。
【0269】
腫瘍をバイオルミネセンス画像化によって実験期間中を通してモニターした。ルシフェラーゼ活性を、Ｄ－ルシフェリン（１．５ｍｇ／マウス）の腹腔内注射、およびＩＶＩＳ画像化装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用する１０分後でのマウスの画像化によってモニターした。腫瘍体積もまた、カリパスを使用する測定によってモニターした。
【0270】
注入に先立って、ＢＲ－ＥＢＶＳＴおよびＴ２－ＥＢＶＳＴを、異なるＥＢＶ抗原またはＥＢＶ－ＬＣＬによる刺激に応答してＩＦＮγを産生するそれらの能力についてＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。結果が図５に示されており、結果は、ＥＢＶ潜伏抗原およびＥＢＶ溶解抗原に対応するペプチドを使用して拡大される免疫細胞の集団は、ＥＢＶ潜伏抗原およびＥＢＶ溶解抗原の両方に対して反応性の細胞を含み、しかも、ＥＢＶ潜伏抗原のみに対応するペプチドを使用して拡大される免疫細胞の集団と比較した場合、ＥＢＶ－ＬＣＬによる刺激に応答してＩＦＮγを産生する細胞のより大きい割合を含むことを明らかにする。
【0271】
【0272】
図７はまた、ＢＲ－ＥＢＶＳＴ処置マウスが、Ｔ２－ＥＢＶＳＴＳにより処置されるマウスよりも低下した転移を示したことを示す。
【0273】
さらなる実験において、ＥＢＶ陽性腫瘍を上記のような３．５×１０６個のホタルルシフェラーゼ発現自己ＬＣＬの皮下埋め込みによって確立し、８日後、マウスに、ＰＢＳ（コントロール群）、１×１０６個のＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ、１×１０６個の溶解（２）－ＥＢＶＳＴ、または１×１０６個のＴ２－ＥＢＶＳＴを静脈内注入によって投与した。
【0274】
この実験で使用される溶解（２）－ＥＶＢＳＴおよびＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴを実施例１に記載されるように生成させ、ただし、ペプミックスの以下の組み合わせを、ＥＢＶＳＴを拡大するために刺激において使用した：
（ｖｉ）ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＸＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ１ペプミックス＋ＢＬＬＦ２ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス－「溶解（２）－ペプミックス」
（ｖｉｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス＋ＬＭＰ１ペプミックス＋ＬＭＰ２ペプミックス＋ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＸＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ１ペプミックス＋ＢＬＬＦ２ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス－「溶解（２）＋潜伏ペプミックス」
（ｖｉ）ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＸＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ１ペプミックス＋ＢＬＬＦ２ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス－「溶解（２）－ペプミックス」
（ｖｉｉ）ＥＢＮＡ１ペプミックス＋ＬＭＰ１ペプミックス＋ＬＭＰ２ペプミックス＋ＢＺＬＦ１ペプミックス＋ＢＲＬＦ１ペプミックス＋ＢＭＲＦ１ペプミックス＋ＢＭＬＦ１ペプミックス＋ＢＸＬＦ１ペプミックス＋ＢＡＬＦ１ペプミックス＋ＢＬＬＦ２ペプミックス＋ＢＡＬＦ２ペプミックス＋ＢＮＬＦ２Ａペプミックス－「溶解（２）＋潜伏ペプミックス」
【0275】
ＢＭＬＦ１、ＢＸＬＦ１、ＢＡＬＦ１、ＢＬＬＦ２、ＢＡＬＦ２およびＢＮＬＦ２Ａについてのペプミックスを、Ｇｅｎｅｍｅｄから得られる個々の構成ペプチドを組み合わせることによって調製した。ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１およびＢＭＲＦ１についてのペプミックスを実施例１に示されるように、ＪＰＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。
【0276】
溶解ペプミックス（すなわち、上記の（ｖｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「溶解（２）－ＥＢＶＳＴ」として示され、溶解（２）＋潜伏ペプミックス（すなわち、上記の（ｖｉｉ））を用いる方法によって生成させられるＥＢＶＳＴは、「ＢＲ（２）－ＥＢＶＳＴ」として示される。
【0277】
腫瘍を上記で記載されるようにバイオルミネセンス画像化によって実験期間中を通してモニターした。腫瘍体積もまた、カリパスを使用する測定によってモニターした。
【0278】
血漿サンプルもまた、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびＩＬ－１０のレベルを求めるために、ＥＢＶＳＴ投与後の３日目および８日目にマウスから採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【0279】
【0280】
ＥＢＶ潜在抗原＋ＥＢＶ溶解抗原のペプチドを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴは腫瘍成長を強く阻害した（図８Ａ～図８Ｄ）。ＥＢＶ溶解抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴはまた、腫瘍成長を阻害することができ、ＥＢＶ潜伏抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴと類似する程度またはそれよりも大きい程度に腫瘍成長を阻害した。
【0281】
ＥＢＶ潜伏抗原＋ＥＢＶ溶解抗原のペプチドを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスはまた、ＥＢＶ潜伏抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスと比較して、増大したレベルの炎症促進性サイトカインをその血清において有し、一方、ＥＢＶ溶解抗原のペプチドだけを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスは、ＥＢＶ潜伏抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスと比較して、類似したレベルまたは増大したレベルの炎症促進性サイトカインをその血清において示した（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【0282】
対照的に、ＥＢＶ潜伏抗原＋ＥＢＶ溶解抗原のペプチドを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスは、ＥＢＶ潜伏抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスと比較して、低下したレベルのＩＬ－１０をその血清において有し、一方、ＥＢＶ溶解抗原のペプチドだけを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスは、ＥＢＶ潜伏抗原のみを使用する刺激によって拡大されるＥＢＶＳＴにより処置されるマウスと比較して、類似したレベルまたは低下したレベルのＩＬ－１０をその血清において示した（図９Ｃ）。
【0283】
したがって、ＢＲ－ＥＢＶＳＴは、より多くの数の腫瘍細胞を殺傷すること、およびより多くの量の炎症促進性サイトカインを産生することが見出された。どのような理論であれ特定の理論によってとらわれることを望まないが、このことは、生体内での増大したエピトープ拡大を引き起こす腫瘍微小環境における変化、および非ウイルス腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によるさらなる腫瘍細胞殺傷をもたらしているかもしれない。
【0284】
実施例５：結論
要約すると、本発明者らは下記のことを示している：
要約すると、本発明者らは下記のことを示している：
【0285】
溶解ＥＢＶ抗原および潜伏ＥＢＶ抗原について特異的なＴ細胞を含有するＴ細胞の集団を、健常ドナーおよびリンパ腫患者の両方からのＰＢＭＣを溶解ＥＢＶ抗原および潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスにより刺激することによって得ることができる（例えば、図１および図３を参照のこと）；
【0286】
溶解ＥＢＶ抗原および潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することにより、ＥＢＶ抗原反応性のＴ細胞が、溶解ＥＢＶ抗原のみに対応するペプミックス、または潜伏ＥＢＶ抗原のみに対応するペプミックスを使用する刺激よりも多くもたらされる（例えば、図２を参照のこと）；
【0287】
溶解＋潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックス、または最初期溶解抗原に対応するペプミックス、または初期溶解抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団は、潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の細胞集団と類似した能力でＥＢＶ－ＬＣＬを殺傷することができる（例えば、図４を参照のこと）；
【0288】
溶解＋潜在ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団は、潜伏ＥＢＶ抗原のみに対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団と比較した場合、ＥＢＶ感染細胞について反応性の細胞のより大きい割合を含む（例えば、図５を参照のこと）；
【0289】
溶解＋潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団は、潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団と比較した場合、腫瘍成長の改善された制御およびＥＢＶ陽性ガンについての低下した転移を示す（例えば、図６および図７を参照のこと）。
【0290】
溶解ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団は、潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞の集団と比較した場合、ＥＢＶ陽性ガンについての腫瘍成長の類似した抑制または改善された制御を示す（例えば、図８を参照のこと）。
【0291】
溶解＋潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞により処置されるＥＢＶ陽性ガンを有する対象は、潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞により処置される対象と比較した場合、末梢血における上昇したレベルの炎症促進性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ）および低下したレベルの抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）を有する（例えば、図９を参照のこと）。
【0292】
溶解ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞により処置されるＥＢＶ陽性ガンを有する対象は、潜伏ＥＢＶ抗原に対応するペプミックスによりＰＢＭＣを刺激することによって得られるＴ細胞により処置される対象と比較した場合、末梢血における類似したレベルまたは上昇したレベルの炎症促進性サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ）および類似したレベルまたは低下したレベルの抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）を有する（例えば、図９を参照のこと）。
【0293】
実施例６：ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣからのＥＢＶ特異的Ｔ細胞の生成
本発明者らは次に、ＰＢＭＣ集団からＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を枯渇化させることの、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の拡大された集団に対する効果を調べた。
本発明者らは次に、ＰＢＭＣ集団からＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を枯渇化させることの、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の拡大された集団に対する効果を調べた。
【0294】
ＰＢＭＣ集団からのＮＫ細胞の派生は、ＥＢＶＳＴをＮＫ細胞集団から拡大するための方法においては、ＮＫ細胞増殖のＩＬ－１５媒介刺激のために問題となる可能性がある。ＣＤ４５ＲＡは、天然のＴ制御性細胞およびＮＫ細胞でもまた発現されるナイーブＴ細胞マーカーである。したがって、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇化によりＮＫ細胞が出発ＰＢＭＣ集団から除かれるであろうことが推理された。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇化により、抗原特異的Ｔ細胞の派生を阻害し得る制御性Ｔ細胞もまた、とりわけガン患者においては除かれ、かつ、バイスタンダー細胞として成長し、抗原特異的Ｔ細胞を希釈し得るナイーブ細胞もまた除かれる。
【0295】
ＣＤ４５ＲＡ発現細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）カラムおよびＣＤ４５ＲＡコンジュゲート化ビーズを使用してＰＢＭＣから枯渇化した。続いて、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣを、本質的には実施例１で記載されるように、潜伏ペプミックスによる刺激によってＥＢＶ特異的Ｔ細胞を拡大するために使用した。
【0296】
ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣはまた、再刺激において使用されるＡＴＣを産生させるための出発集団として使用した。なお、この場合、ＡＴＣは、本質的には実施例１で記載されるように産生された。
【0297】
以下の実験条件を比較した。
（ｉ）ＰＢＭＣ全体（すなわち、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されないＰＢＭＣ）から拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＰＢＭＣ全体から産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＷＷ」（すなわち、全体＋全体）として示される、
（ｉｉ）ＰＢＭＣ全体から拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＷＤ」（すなわち、全体＋枯渇化）として示される。
（ｉｉｉ）ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＰＢＭＣ全体から産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＤＷ」（すなわち、枯渇化＋全体）として示される。
（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＤＤ」（すなわち、枯渇化＋枯渇化）として示される。
（ｉ）ＰＢＭＣ全体（すなわち、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されないＰＢＭＣ）から拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＰＢＭＣ全体から産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＷＷ」（すなわち、全体＋全体）として示される、
（ｉｉ）ＰＢＭＣ全体から拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＷＤ」（すなわち、全体＋枯渇化）として示される。
（ｉｉｉ）ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＰＢＭＣ全体から産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＤＷ」（すなわち、枯渇化＋全体）として示される。
（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから拡大されるＥＢＶＳＴ＋ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから産生されるＡＴＣを使用する再刺激－これは図１０では「ＤＤ」（すなわち、枯渇化＋枯渇化）として示される。
【0298】
４名の異なる健常ドナー（Ｄ＃１～Ｄ＃４）から得られるＰＢＭＣから上記の（ｉ）～（ｉｖ）に従って調製されるＥＢＶＳＴを、該ＥＢＶＳＴは異なるＥＢＶ抗原を認識することができるかを明らかにするためにＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を本質的には実施例２に記載されるように行った。
【0299】
結果が図１０に示される。それぞれのドナーについて、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣを、ＥＢＶＳＴを拡大するための出発集団として使用すると、ＰＢＭＣ集団全体を使用する方法と比較した場合、ＥＢＶペプミックスによる刺激に応答してＩＦＮγを分泌する拡大集団中の細胞の割合が増大した。同様に、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣを、再刺激において使用されるＡＴＣを生成させるための出発集団として使用すると、ＥＢＶペプミックスによる刺激に応答してＩＦＮγを分泌する拡大集団中の細胞の割合がより大きくなった。
【0300】
本発明者らは、ＰＢＭＣ全体から、またはＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから生成させられるＡＴＣでの共刺激分子ＣＤ８０およびＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）の発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【0301】
結果が図１１に示される。ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が枯渇化されるＰＢＭＣから生成させられるＡＴＣは、ＰＢＭＣ全体から生成させられるＡＴＣと比較した場合、ＣＤ８０およびＨＬＡ－ＤＲの発現がより高く、したがって、抗原提示特性および共刺激特性が改善された。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】