(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(54)【発明の名称】新型の酵素組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20220616BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20220616BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220616BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20220616BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220616BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220616BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220616BHJP
C12N 9/06 20060101ALI20220616BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220616BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220616BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220616BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220616BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20220616BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220616BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53
C12N15/60 ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/869 Z
C12N15/864 100Z
C12N7/01
C12N5/10
C12N9/06 B
A61P25/00
A61P25/16
A61K35/76
A61K48/00
A61K38/46
A61K35/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021562101
(86)(22)【出願日】2020-04-17
(85)【翻訳文提出日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 CN2020085366
(87)【国際公開番号】W WO2020211843
(87)【国際公開日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】201910322504.8
(32)【優先日】2019-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521456210
【氏名又は名称】ビリーフ・バイオメド・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】チェン，チェン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ジーン
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B050CC05
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4C087ZA02
(57)【要約】
Ｎ末端において６０～１２０個のアミノ酸残基を欠くチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）バリアント、ならびにＮ末端において６０～１２０個のアミノ酸残基を欠くＴＨバリアントおよび芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）を含む医薬組成物を提供する。さらに、該ＴＨバリアントまたは該医薬組成物を含む、ヌクレオチド構築物、ベクタープラスミド、細胞またはウイルス、および神経変性疾患、例えばパーキンソン病を治療するための医薬品の製造における、該ウイルスの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
６０～１２０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含むチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項2】
８０～１００個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む、請求項１に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項3】
８０～９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む、請求項２に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項4】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む、請求項２または３に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項5】
Ｎ末端またはＣ末端に付着したタグタンパク質をさらに含む、請求項４に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項6】
前記タグタンパク質が、ＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである、請求項５に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項7】
配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアントを含む組成物。
【請求項9】
芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素がさらに、Ｎ末端またはＣ末端に付着したタグタンパク質を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記タグタンパク質が、ＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項８～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
請求項１～５のいずれか１項に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードする第１のポリヌクレオチドおよび／または請求項９～１３のいずれか１項に定義される芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をコードする第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項15】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１２もしくは１３に記載されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号１２もしくは１３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項16】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号１４～２１のいずれかに対する少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項17】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項18】
前記プロモータが、ニューロン特異的プロモータを含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項19】
請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項20】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１つのベクター中または異なるベクター中に構築されている、請求項１９に記載のベクター。
【請求項21】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１つのベクター中に構築されており、かつ前記ベクターがさらに、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間に挿入された第３のポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項22】
前記第３のポリヌクレオチドが、自己切断可能配列および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、請求項２１に記載のベクター。
【請求項23】
単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１９～２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項24】
請求項１９～２３のいずれか１項に記載のベクターを含むか、または請求項１９～２３のいずれか１つに記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項25】
請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物を含むか、または請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物から発現される核酸を含むウイルスゲノムを含むウイルス。
【請求項26】
請求項２５に記載のウイルス、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項27】
対象において神経変性疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１～７のいずれか１項に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント、請求項８～１３のいずれか１項に記載の組成物、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物、請求項１９～２３のいずれか１項に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２５に記載のウイルス、または請求項２６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項28】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
前記対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項30】
治療を必要とする対象において神経変性疾患を治療する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント、請求項８～１３のいずれか１項に記載の組成物、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物、請求項１９～２３のいずれか１項に記載のベクター、請求項２５に記載のウイルス、または請求項２６に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項31】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本開示は、チロシンヒドロキシラーゼバリアントおよび芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素を含む医薬組成物に関する。本開示はさらに、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドまたは前記の組成物をコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物、該ヌクレオチド構築物を含むベクター、該ベクターでのトランスフェクションにより調製された細胞、および前記のヌクレオチド構築物を含むウイルスに関する。本開示はさらに、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、ＰＤ）を治療するための医薬品の製造における、ウイルスの使用に関し、該使用は、遺伝子工学技術の分野に属する。
【背景技術】
【0002】
[0002]パーキンソン病（ＰＤ）は、振戦、固縮およびジスキネジアを含む主症状を特徴とする重度神経変性疾患である。ＰＤの病理学的特徴は、脳の黒質（ＳＮ）中のドパミン作動性ニューロンの進行性退化であり、ドパミン作動性ニューロンの神経支配障害およびその線条体中でのドパミン濃度の低下をもたらす。したがって、線条体へのドパミン送達を高め得る薬理学的方法が、ＰＤに対する効果的な治療的介入である。ドパミン補充療法（すなわち、経口レボドパ、Ｌ－ドパ）が、目下、ＰＤに対する主要医薬治療である。このドパミン補充療法はＰＤ患者の生活の質を短期的には著しく改善するものの、その有効性は、経時的に次第に低下する。５年超から１０年まで経過すると、ほぼすべてのＰＤ患者は、最終的に、経口Ｌ－ドパによりほぼ治療不可能な状態へと進行する。
【0003】
[0003]酵素補充療法の目的は、ＳＮ中でのドパミン作動性ニューロンの変性によって引き起こされる、ドパミンの合成および分泌の低下を補償することである。この治療方法の基礎となる機構は、線条体中のＧＡＢＡ作動性ニューロンへの、ドパミン合成に必要な酵素をコードする遺伝子の送達であり、それが、それらのＧＡＢＡ作動性ニューロン中でのドパミンの持続するｄｅ ｎｏｖｏ合成、およびその合成されたドパミンの、線条体への放出をもたらす。この療法は、ジスキネジアを改善し得て、かつ大脳基底核外部でのドパミンのレベル上昇により引き起こされる副作用を制限し得る。しかしながら、ドパミン濃度の上昇は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の活性を負に調節することにより、ＴＨによる異所性ドパミン合成能を限定する。
【0004】
[0004]したがって、ＰＤ治療用のより優れた治療効果を有する酵素補充療法を見出す実質的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【0005】
[0005]一態様では、本開示は、６０～１２０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除くと配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含むチロシンヒドロキシラーゼバリアントを提供する。
【0006】
[0006]特定の実施形態では、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントが、８０～１００個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除くと、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む。
【0007】
[0007]特定の実施形態では、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントが、８０～９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除くと、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む。
【0008】
[0008]特定の実施形態では、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントが、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む。
【0009】
[0009]特定の実施形態では、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントがさらに、Ｎ末端またはＣ末端に付着したタグタンパク質を含む。
【0010】
[0010]特定の実施形態では、該タグタンパク質が、ＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである。
【0011】
[0011]特定の実施形態では、該チロシンヒドロキシラーゼバリアントが、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0012】
[0012]別の態様では、本開示は、前記のチロシンヒドロキシラーゼバリアントを含む組成物を提供する。
【0013】
[0013]特定の実施形態では、該組成物がさらに、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素を含む。
【0014】
[0014]特定の実施形態では、該芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む。
【0015】
[0015]特定の実施形態では、該芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素がさらに、Ｎ末端またはＣ末端に付着したタグタンパク質を含む。
【0016】
[0016]特定の実施形態では、該タグタンパク質が、ＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである。
【0017】
[0017]特定の実施形態では、該芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有する。
【0018】
[0018]別の態様では、本開示は、前記のチロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードする第１のポリヌクレオチドおよび／または前記で定義した芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をコードする第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を提供する。
【0019】
[0019]特定の実施形態では、該第１のポリヌクレオチドが、配列番号１２もしくは１３に記載されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号１２もしくは１３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0020】
[0020]特定の実施形態では、該第２のポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号１４～２１のいずれかに対する少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0021】
[0021]特定の実施形態では、該ポリヌクレオチド構築物がさらに、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む。
【0022】
[0022]特定の実施形態では、該プロモータが、ニューロン特異的プロモータを含む。
【0023】
[0023]別の態様では、本開示は、前記のポリヌクレオチド構築物を含むベクターを提供する。
【0024】
[0024]特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、１つのベクター中または異なるベクター中に構築されている。
【0025】
[0025]特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、１つのベクター中に構築されており、かつ該ベクターがさらに、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入された第３のポリヌクレオチドを含む。
【0026】
[0026]特定の実施形態では、該第３のポリヌクレオチドが、自己切断可能配列および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。
【0027】
[0027]特定の実施形態では、ベクターが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。
【0028】
[0028]特定の実施形態では、ベクターがプラスミドを含む。
【0029】
[0029]別の態様では、本開示は、前記のベクターを含むか、または前記のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0030】
[0030]別の態様では、本開示は、前記のポリヌクレオチド構築物を含むか、または前記のポリヌクレオチド構築物から発現される核酸を含むウイルスゲノムを含むウイルスを提供する。
【0031】
[0031]別の態様では、本開示は、前記のウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0032】
[0032]別の態様では、本開示は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において神経変性疾患を治療するための医薬品の製造における、前記のチロシンヒドロキシラーゼバリアント、前記の組成物、前記のヌクレオチド構築物、前記のベクター、前記の宿主細胞、前記のウイルス、または前記の医薬組成物の使用を提供する。
【0033】
[0033]特定の実施形態では、該神経変性疾患がパーキンソン病である。
【0034】
[0034]特定の実施形態では、該対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである。
【0035】
[0035]別の態様では、本開示は、治療を必要とする対象において神経変性疾患を治療する方法であって、前記のチロシンヒドロキシラーゼバリアント、前記の組成物、前記のヌクレオチド構築物、前記のベクター、前記のウイルスまたは前記の医薬の治療有効量を該対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【0036】
[0036]特定の実施形態では、該神経変性疾患がパーキンソン病である。
【0037】
[0037]特定の実施形態では、該対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである。
【0038】
[0038]本開示はさらに、以下の実施形態を提供する。
【0039】
[0039]実施形態１。配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端において６０～１２０個のアミノ酸残基を欠くチロシンヒドロキシラーゼを含むチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【0040】
[0040]実施形態２。配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端において８０～１００個のアミノ酸残基を欠くチロシンヒドロキシラーゼを含む、実施形態１に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【0041】
[0041]実施形態３。配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端において８０～９０個のアミノ酸残基を欠くチロシンヒドロキシラーゼを含む、実施形態２に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【0042】
[0042]実施形態４。配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対する８０％の配列同一性を有するチロシンヒドロキシラーゼ誘導体を含む、好ましくは場合によりさらに、Ｎ末端またはＣ末端にタグタンパク質を含む、さらに好ましくは該タグタンパク質がＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである、実施形態２または３に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【0043】
[0043]実施形態５。配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、実施形態４に記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント。
【0044】
[0044]実施形態６。実施形態１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つのチロシンヒドロキシラーゼバリアントを含む組成物。
【0045】
[0045]実施形態７。芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をさらに含む、実施形態６に記載の組成物。
【0046】
[0046]実施形態８。該芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む全長芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素または配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素誘導体であり、好ましくは場合によりさらに、Ｎ末端またはＣ末端にタグタンパク質を含む、さらに好ましくは該タグタンパク質がＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇである、実施形態７に記載の組成物。
【0047】
[0047]実施形態９。芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素が、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有する、実施形態８に記載の組成物。
【0048】
[0048]実施形態１０。実施形態１～５のいずれか１つに記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドまたは実施形態６～９のいずれか１つに記載の組成物をコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物。
【0049】
[0049]実施形態１１。チロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１２もしくは１３に記載されるヌクレオチド配列または配列番号１２もしくは１３に対する８０％超の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、および／または芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列または配列番号１４～２１のいずれかに対する８０％超の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、実施形態１０に記載のヌクレオチド構築物。
【0050】
[0050]実施形態１２。実施形態１０または１１に記載のヌクレオチド構築物を含むベクタープラスミド。
【0051】
[0051]実施形態１３。チロシンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドとが、１つのベクタープラスミド中または異なるベクタープラスミド中に構築されている、実施形態１２に記載のベクタープラスミド。
【0052】
[0052]実施形態１４。単純ヘルペスウイルスベクタープラスミド、アデノウイルスベクタープラスミドおよびアデノ随伴ウイルスベクタープラスミドからなる群から選択される、実施形態１２に記載のベクタープラスミド。
【0053】
[0053]実施形態１５。実施形態１２～１４のいずれか１つに記載のベクタープラスミドでのトランスフェクションにより調製された細胞。
【0054】
[0054]実施形態１６。そのゲノムとして、実施形態１０または１１に記載のヌクレオチド構築物を含むウイルス。
【0055】
[0055]実施形態１７。実施形態１６に記載のウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【0056】
[0056]実施形態１８。対象において神経変性疾患を治療するための医薬品の製造における、実施形態１～５のいずれか１つに記載のチロシンヒドロキシラーゼバリアント、実施形態６～９のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態１０または１１に記載のヌクレオチド構築物、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載のベクタープラスミド、実施形態１５に記載の細胞、実施形態１６に記載のウイルスまたは実施形態１７に記載の医薬組成物の使用。
【0057】
[0057]実施形態１９。該神経変性疾患がパーキンソン病である、実施形態１８に記載の使用。
【0058】
[0058]実施形態２０。該対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである、実施形態１８に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】[0059]本開示の特定の実施形態に記載される、ヒトシナプシンプロモータと、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のＨＡタグ付きバリアント、Ｔ２Ａペプチド、およびＭｙｃタグ付きヒト芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）をコードするポリヌクレオチドと、ＷＰＲＥ配列と、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリ（Ａ）シグナルとを含む発現カセットを有する組換えＡＡＶベクターの構築を示す。
【図2】[0060]高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した、２９３細胞株中でのドパミンｄｅ ｎｏｖｏ合成を促進するための、Ｎ末端での欠失を有するＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む一連の酵素組成物の発現に関する統計的定量化グラフを示す。ＧＦＰは、陰性対照を示す。ＷＴは、二酵素組成物（ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）中の全長または野生型のＴＨを示す。Ｉｓｏｂは、ＴＨの別のアイソフォームを示す。４０は、Ｎ末端で４０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。６０は、Ｎ末端で６０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。８０は、Ｎ末端で８０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。９０は、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。１００は、Ｎ末端で１００個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。１２０は、Ｎ末端で１２０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。１５０は、Ｎ末端で１５０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。１６４は、Ｎ末端で１６４個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。１９０は、Ｎ末端で１９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを示す。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｎｓ、有意ではない。*ｐ＜０．０５および****ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。
【図3】[0061]ＰＤ症状の効果的なモデルである片側６－ＯＨＤＡ病変マウスにおける脳切片の黒質／腹側被蓋野（ＳＮ／ＶＴＡ）領域（上図）中および尾状核被殻（ＣＰ）領域（下図）中での抗ＴＨ染色の代表的な免疫細胞染色画像を示す。右側は６－ＯＨＤＡ病変側であり、左側は対照側であった。スケールバー、１ｍｍ。
【図4】[0062]図４ａは、定位手術およびアポモルフィン回転試験のタイムコースの略図を示す。片側６－ＯＨＤＡ病変から２週間後に、対側回転として表される、アポモルフィン誘発性の著しい運動非対称性に関してマウスを選別した。両群とも、１分間当たり正味回転（同側に対する対側）として計算して、統計的に同等の回転頻度を示した。２週間後、選別したマウスに、Ｎ末端での９０個のアミノ酸の欠失を有するヒトＴＨバリアントおよび全長ヒトＡＡＤＣ（ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ）を含む組成物を発現するウイルスベクターを線条体内注入した。ＧＦＰ発現ウイルスを対照として注入した。ウイルス注入から４週間後、治療の機能的利益を評価するためにアポモルフィン誘発回転試験を再び行った。図４ｂは、ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣウイルス注入を伴う群における著しい行動回復を示す。ただし、番号記号は、対照群（ＧＦＰ）と比べたＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣウイルス注入群における、運動非対称性表現型からの著しい回復を示す。アスタリスク記号は、ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ群における、ウイルス注入後の、運動非対称性表現型からの著しい回復を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。＃＃＃ｐ＜０．００１および****ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【0060】
[0063]本開示を、以下、特定の実施形態および実験データによりさらに記載する。明確性を目的に、以下では特定用語を使用するが、それらの用語は、本開示の範囲を定義または限定するとは意図されない。
【0061】
[0064]本明細書で使用する「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。例えば、「ａ」細胞は、単一細胞または複数の細胞を意味し得る。
【0062】
[0065]特に異なる指定がない限り、本明細書で使用する単語「または（ｏｒ）」は、「いずれか一方（ｅｉｔｈｅｒ／ｏｒ）」の排他的な趣旨ではなく「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」の包括的な趣旨で使用する。
【0063】
[0066]特に異なる指定がない限り、本明細書に記載される数値範囲は、その範囲内の各々の数値、および各々の部分範囲を含み得る。
【0064】
[0067]本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および別の参考文献は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
【0065】
[0068]本開示は、チロシンヒドロキシラーゼバリアントを提供する。
【0066】
[0069]一態様では、本開示は、６０～１２０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）バリアントを提供する。言い換えると、本明細書中で提供されるＴＨバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列を有する全長ＴＨのＮ末端欠失バリアントである。ＴＨバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端において６０～１２０個のアミノ酸残基を欠く。
【0067】
[0070]特定の実施形態では、Ｎ末端欠失が、６０～１２０個、７０～１２０個、８０～１２０個、９０～１２０個、１００～１２０個、６０～１１０個、６０～１００個、６０～９０個、７０～１１０個、８０～１００個、または８０～９０個のアミノ酸残基の範囲の長さを有する。特定の実施形態では、Ｎ末端欠失が、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個または１００個のアミノ酸の長さを有する。特定の実施形態では、Ｎ末端欠失が、配列番号１の１番目のアミノ酸残基から始まり、言い換えると、６０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失とは、配列番号１の１番目から６０番目までのアミノ残基の欠失を意味する。
【0068】
[0071]特定の実施形態では、ＴＨのＮ末端欠失バリアントが、ＴＨの生物活性断片である。本明細書で使用する用語「生物活性断片」は、特定タンパク質の完全機能または少なくとも部分的機能を維持し得る、該特定タンパク質のポリペプチド断片に関する。概して、ＴＨの生物活性断片は、ＴＨの少なくとも５０％の生物活性、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の生物活性を有する。
【0069】
[0072]本開示は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨとも呼ばれる）バリアントを提供し、該ＴＨバリアントは、６０～１２０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＴＨである。好ましくは、該ＴＨバリアントが、８０～１００個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＴＨである。さらに好ましくは、該ＴＨバリアントが、８０～９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を除く、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＴＨであり、例えば、配列番号１における８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個または１００個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するヒトＴＨである。
【0070】
[0073]一実施形態では、ＴＨバリアントが、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨである。一実施形態では、ＴＨバリアントが、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【0071】
[0074]本開示はさらに、本明細書中で提供されるＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体を提供し、かつそのような断片、誘導体または類似体は、ＴＨバリアントの生物学的機能または生物活性を実質的に維持する。ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に関する用語「断片」は、その配列の一部を意味する。本明細書中で提供されるポリペプチド（例えば、本明細書中で提供されるＴＨバリアントおよびＡＡＤＣ）に関する用語「誘導体」または「類似体」は、（ｉ）１つ以上の保存的もしくは非保存的なアミノ酸残基置換（好ましくは保存的アミノ酸残基置換）を有するカウンターパートポリペプチド、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を有するカウンターパートポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長させる化合物、例えばポリエチレングリコール）と融合しているもしくは別の化合物に付着しているカウンターパートポリペプチド、または（ｉｖ）追加アミノ酸配列（例えば、リーダー配列、分泌配列、そのポリペプチドの精製に使用する配列、タンパク質構成（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎ）配列または融合タンパク質）とのポリペプチドの融合により形成されたカウンターパートポリペプチドを含むがそれらに限定されない。本明細書に定義される、それらの断片、誘導体および類似体は、当業者には公知の範囲内にある。
【0072】
[0075]一実施形態では、ＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントしてから必要であればギャップを導入して同一アミノ酸（または核酸）数の最大値を達成した後に、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同じである、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基の百分率と定義される。言い換えると、アミノ酸配列（または核酸配列）の配列同一性パーセント（％）は、比較対象である参照配列と比べて同一であるアミノ酸残基（または塩基）の数を、参照配列中のアミノ酸残基（または塩基）の総数で割ることにより計算できる。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基とは見なされない。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを特定する目的でのアライメントは、例えば、一般的に利用可能なツール、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト上で利用可能、S.F. Altschul等、J. Mol. Biol.、215:403～410頁(1990年)；F. Stephen等、Nucleic Acids Res.、25:3389～3402頁(1997年)も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト上で利用可能、D.G. Higgins等、Methods in Enzymology、266:383～402頁(1996年)；M.A. Larkin等、Bioinformatics (Oxford、英国)、23(21):2947～8頁(2007年)も参照）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成可能である。当業者は、ツールが提供するデフォルトパラメータを使用してもよく、またはアライメントに適切であるように、例えば、適切なアルゴリズムを選択することによりパラメータをカスタマイズしてもよい。
【0073】
[0076]特定の実施形態では、本明細書中で提供されるＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0074】
[0077]特定の実施形態では、ＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体が、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列中の１つまたはいくつか（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個）のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により形成される。特定の実施形態では、ＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体が、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質として機能する。ＴＨバリアント、およびその断片、誘導体または類似体は、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の活性を有する。
【0075】
[0078]特定の実施形態では、ＴＨバリアントが、場合によりさらにタグタンパク質を含んでもよい。本明細書で使用する用語「タグタンパク質」および「タンパク質タグ」は交換可能であり、かつ標的タンパク質の発現、検出、追跡または精製を容易にするために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ組換え技術により該標的タンパク質と融合させたポリペプチドまたはタンパク質に関する。タンパク質タグは、Ｈｉｓ６、Ｆｌａｇ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡ、ＧＦＰまたはＭｙｃを含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、該タグタンパク質が、ＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＨＡが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｍｙｃが、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｆｌａｇが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。タグタンパク質は、ＴＨバリアント、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＮ末端またはＣ末端に付着され得る。特定の実施形態では、本明細書中で提供されるＴＨバリアントが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するその断片、誘導体もしくは類似体を含む。
【0076】
[0079]別の態様では、本開示がさらに、前記のＴＨバリアント、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む組成物を提供する。
【0077】
[0080]一実施形態では、該組成物がさらに、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、例えば、全長ＡＡＤＣ、または該全長ＡＡＤＣの断片、誘導体もしくは類似体を含む。一実施形態では、全長ＡＡＤＣが、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。一実施形態では、全長ＡＡＤＣの断片、誘導体または類似体が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有する。一実施形態では、全長ＡＡＤＣの断片、誘導体または類似体が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列中の１つまたは限られた数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個）のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により形成される。当業者は、全長ＡＡＤＣの断片、誘導体および類似体が、全長ＡＡＤＣの生物学的機能または生物活性を実質的に維持することを理解するであろう。一実施形態では、全長ＡＡＤＣの断片、誘導体または類似体が、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質として機能する。全長ＡＡＤＣの断片、誘導体または類似体は、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の活性を有する。
【0078】
[0081]特定の実施形態では、ＡＡＤＣが、場合によりさらに、Ｎ末端またはＣ末端にタグタンパク質を含んでもよく、そのタグタンパク質は、好ましくはＨＡ、ＭｙｃまたはＦｌａｇを含むがそれらに限定されない。該タグタンパク質は、ＡＡＤＣのＮ末端またはＣ末端に付着され得る。特定の一実施形態では、ＡＡＤＣが、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号１０に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0079】
[0082]特定の一実施形態では、ＡＡＤＣが、ＤＤＣ遺伝子またはそのバリアントによってコードされる天然型アイソフォームのいずれかであり得る。異なるＡＡＤＣアイソフォームをコードするいくつかの選択的スプライシング転写バリアントが、当該技術分野で同定された。特に、ＤＤＣ遺伝子は、６つの異なるタンパク質アイソフォームをコードする７つの異なる転写バリアントを産生する。ＤＤＣ遺伝子から転写されるバリアント１および２の両方とも、ＡＡＤＣアイソフォーム１をコードする。好ましい一実施形態では、全長ＡＡＤＣが、ＤＤＣ遺伝子の転写バリアント１または２のコード領域であるポリヌクレオチドによりコードされるＡＡＤＣアイソフォーム１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００７８１．１）である。当業者は、先行技術に基づき、それらすべての天然に存在するアイソフォーム（例えば、配列番号４～９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するＡＡＤＣ）が本開示において適用可能であり、かつ同一または類似の効果を達成し得ることを当然ながら予想できる。
【0080】
[0083]特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物が医薬組成物である。特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物がさらに、薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物が治療用途用である。
【0081】
[0084]特定の実施形態では、本明細書中で提供される組成物が酵素組成物である。本明細書で使用する用語「酵素組成物」は、ＡＡＤＣおよび６０個超かつ１２０個未満のアミノ酸残基（例えば、８０個、９０個または１００個のアミノ酸残基）のＮ末端欠失を有するＴＨバリアントを含む組成物に関する。一実施形態では、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨバリアントのアミノ酸配列が、配列番号２に記載される。ＡＡＤＣは、そのアミノ酸配列が配列番号４に記載される全長ＡＡＤＣであり得る。本開示および先行技術の教示を考慮して、当業者はさらに、本開示で使用される、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨバリアントまたは全長ＡＡＤＣが、それらの変形型も含み、かつそのような変形型は、アミノ酸配列においていくつかの相違を有するにもかかわらず、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨまたは全長ＡＡＤＣの機能と同一または類似の機能を有することを理解するであろう。それらの変形型は、１つ以上（例えば、１～５個）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端での１つ以上（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内）のアミノ酸残基の付加を含むが、それらに限定されない。類似または近い特性を有するアミノ酸残基による置換、例えば、イソロイシンとロイシンとの間での置換は、得られるタンパク質の機能を変化させないということが当業者には周知である。別の例として、１つ以上のアミノ酸を含み、かつ精製または検出のために都合よいタグの、Ｃ末端および／またはＮ末端での追加は、通常、得られるタンパク質の機能に影響を及ぼし得ない。特定の一実施形態では、本開示で使用する「酵素組成物」が、Ｎ末端にＨＡタグが付いた、Ｎ末端において９０個のアミノ酸を欠くＴＨおよびＣ末端にＭｙｃタグを有する全長ＡＡＤＣを含み得る。
【0082】
[0085]ポリヌクレオチド構築物
[0086]別の態様では、本開示がさらに、ＴＨバリアントまたはその断片、誘導体もしくは類似体をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を提供する。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチド構築物がさらに、ＡＡＤＣまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本開示が、前記の医薬組成物または酵素組成物をコードするポリヌクレオチド構築物を提供する。
[0086]別の態様では、本開示がさらに、ＴＨバリアントまたはその断片、誘導体もしくは類似体をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を提供する。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチド構築物がさらに、ＡＡＤＣまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本開示が、前記の医薬組成物または酵素組成物をコードするポリヌクレオチド構築物を提供する。
【0083】
[0087]本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に関する。該ＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。該ＤＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードする配列は、特定のタンパク質またはその縮重バリアントのコード配列と同一であり得る。縮重バリアントは、あるタンパク質をコードするが、遺伝暗号縮重により該タンパク質のコード配列とは異なるポリヌクレオチド配列に関する。
【0084】
[0088]一実施形態では、ＴＨバリアントをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１２もしくは１３に記載されるヌクレオチド配列または配列番号１２もしくは１３に対する少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、および／またはＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列または配列番号１４～２１のいずれかに対する少なくとも８０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１２または１３の縮重バリアントであり、かつ同一ＴＨバリアントをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１の１つの縮重バリアントであり、かつ同一ＡＡＤＣをコードする。
【0085】
[0089]特定の実施形態では、ＴＨバリアントの断片、誘導体または類似体をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１２または１３に対する少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＤＣの断片、誘導体または類似体をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに対する少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0086】
[0090]特定の一実施形態では、ＴＨのポリヌクレオチドが、配列番号１２または１３に記載されるヌクレオチド配列中の１つまたは限られた数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個）のヌクレオチド残基またはコドンの置換、欠失または付加により形成されるバリアントであり、かつ配列番号１２または１３に記載されるポリヌクレオチドとして機能する。該バリアントは、配列番号１２もしくは１３に記載されるポリヌクレオチドに対する少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９９％）の配列同一性、または配列番号１２もしくは１３に記載されるポリヌクレオチドの少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９９％）の生物活性を有する。
【0087】
[0091]特定の一実施形態では、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１４～２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列中の１つまたは限られた数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個）のヌクレオチド残基またはコドンの置換、欠失または付加により形成されるバリアントであり、かつ配列番号１４～２１のいずれかに記載されるポリヌクレオチドとして機能する。該バリアントは、配列番号１４～２１のいずれかに対する少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９９％）の配列同一性、または配列番号１４～２１のいずれかの少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９９％）の生物活性を有する。
【0088】
[0092]特定の一実施形態では、ポリヌクレオチド構築物がさらにプロモータを含む。当業者は、外来遺伝子の発現には適切なプロモータが必要であることを認識し、その適切なプロモータは、種特異的、誘導性、組織特異的、または細胞周期特異的なプロモータを含むがそれらに限定されない。遺伝子発現の精密調節は、通常、ＲＮＡ転写の開始を誘導するプロモータに依存する。該プロモータは、構成的または誘導性のいずれか一方であり得る。該プロモータは、すべての細胞型中で発現されてもよく（例えばＣＭＶ）、または特定の細胞型中で発現されてもよい。中枢神経系（ＣＮＳ）に関して、ニューロン特異的プロモータは、ニューロフィラメント、シナプシンまたはセロトニン受容体を含むが、それらに限定されず、グリア特異的プロモータは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、Ｓ１００またはグルタミン合成酵素を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、本開示のベクタープラスミド中のポリヌクレオチドを転写するためにヒトシナプシンプロモータを使用し、前記のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、特異的にニューロン中で発現する。当業者は、別のニューロン特異的プロモータが、対応する機能を有することを当然ながら予想できる。
【0089】
[0093]ベクター
[0094]別の態様では、本開示は、前記のポリヌクレオチド構築物を含むベクターを提供する。
[0094]別の態様では、本開示は、前記のポリヌクレオチド構築物を含むベクターを提供する。
【0090】
[0095]一実施形態では、ＴＨバリアントがヒトＴＨバリアントであり、ＡＡＤＣがヒトＡＡＤＣである。
【0091】
[0096]一実施形態では、組成物の、ＴＨバリアント（またはその誘導体）をコードするポリヌクレオチドとＡＡＤＣ（またはその誘導体）をコードするポリヌクレオチドとが、１つのベクタープラスミド中または異なるベクタープラスミド中に構築され得る。
【0092】
[0097]特定の一実施形態では、該ベクターが、（５’から３’へと）以下に示す３つの部分を含む：
[0098]１）本明細書中で提供されるＴＨバリアント、またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド、
[0099]２）自己切断可能なペプチドをコードするＴ２Ａ配列、および
[00100]３）本明細書中で提供されるＡＡＤＣバリアント、またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
[0098]１）本明細書中で提供されるＴＨバリアント、またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド、
[0099]２）自己切断可能なペプチドをコードするＴ２Ａ配列、および
[00100]３）本明細書中で提供されるＡＡＤＣバリアント、またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【0093】
[00101]特定の一実施形態では、該ベクターが、（５’から３’へと）以下に示す３つの部分を含む：
[00102]１）９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨをコードするポリヌクレオチド、
[00103]２）自己切断可能なペプチドをコードするＴ２Ａ配列、および
[00104]３）全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチド。
[00102]１）９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨをコードするポリヌクレオチド、
[00103]２）自己切断可能なペプチドをコードするＴ２Ａ配列、および
[00104]３）全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチド。
【0094】
[00105]特定の実施形態では、Ｔ２Ａ配列が、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。
【0095】
[00106]特定の一実施形態では、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨをコードするポリヌクレオチドと全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドとが同一ベクタープラスミド中にある場合に、その２つのポリヌクレオチド間に、自己切断可能なペプチドをコードするＴ２Ａ配列を付加することにより、２つのタンパク質を同期的に発現するモノシストロンを構築する。
【0096】
[00107]別の特定の実施形態では、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨをコードするポリヌクレオチドと全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドとの間に、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を付加する。ＩＲＥＳヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡの停止コドンの下流に存在する場合、リボソームの再進入が起こり得ることにより、第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳が開始する。
【0097】
[00108]特定の一実施形態では、９０個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を有するＴＨをコードするポリヌクレオチドとＡＡＤＣ（例えば、全長、またはその断片、誘導体もしくは類似体）をコードするポリヌクレオチドとが、それぞれ、異なるベクター中に構築されることも可能である。
【0098】
[00109]本明細書で使用する用語「ベクター」は、外来標的遺伝子（例えば、本開示に記載されるポリヌクレオチド）を標的細胞内へと輸送および形質導入するための分子ツールに関する。ベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージのようなバクテリオファージ、および動物ウイルスを含む。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、非ウイルス性ベクター、組換えベクターまたは発現ベクターであり得る。本明細書で使用する用語「発現ベクター」は、標的細胞内へと輸送または形質導入された後に外来標的遺伝子の発現を可能にするベクターに関する。発現ベクターは、標的細胞内において転写の開始を可能にする適切なヌクレオチド配列（すなわち、プロモータ）を提供し得る。本明細書で使用する用語「ウイルスベクター」は、ウイルス配列、例えば、ウイルス末端反復配列を有する発現ベクターに関する。当業者は、遺伝子療法の分野では、ウイルスベクターにより、外来標的遺伝子を標的細胞内へと形質導入して標的細胞内で発現させることが好ましい方法であることを理解するであろう。
【0099】
[00110]一実施形態では、本明細書中で提供されるベクターがプラスミドベクターを含む。
【0100】
[00111]一実施形態では、ベクターがウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群から選択される。一実施形態では、ベクターが、中枢神経系において発現可能である。中枢神経系（ＣＮＳ）での効果的な発現ベクターは、ＨＳＶ、ＡｄまたはＡＡＶを含むが、それらに限定されず、好ましくはＡＡＶを含む。
【0101】
[00112]特定の実施形態では、ベクターが、ＡＡＶベクターを含むか、またはＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、そのゲノムが約４．７キロベース（ｋｂ）のサイズを有する一本鎖ヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは、５’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲが隣接する２つの主遺伝子、つまりｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子ならびにＡＡＶ構造タンパク質（ＶＰ－１、ＶＰ－２およびＶＰ－３）をコードするｃａｐ遺伝子を含有する。本明細書で使用する用語「ＡＡＶベクター」は、少なくとも１つ、または２つのＡＡＶ末端逆位反復配列が隣接する１つ以上の異種配列を含む任意のベクター（例えばプラスミド）を含む。当該技術分野では十分に理解されている用語「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、天然一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５個のヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５個のヌクレオチドは、２つの選択的向きのいずれか一方で存在し得て、異なるＡＡＶゲノム間での、および単一ＡＡＶゲノムの２つの末端間での異種性をもたらす。最も外側の１２５個のヌクレオチドは同じく、いくつかの短い自己相補性領域を含有し、ＩＴＲのその部分内において鎖内塩基対形成を可能にする。
【0102】
[00113]ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来し得て、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知または後に見出される任意の別のＡＡＶを含むがそれらに限定されない。詳細については、例えば、NF BERNARD等、VIROLOGY、第2巻、第69章(第4版、Lippincott-Raven Publishers)；Gao等(2004年)、J. Virol. 78:6381～6388頁を参照。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、R. M. Kotin(1994年)、Human Gene Therapy 5:793～801頁；K. I. Berns「Parvoviridae and their Replication」（Fundamental Virology中）、第2版(B. N. FieldsおよびD. M. Knipe編)を参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３末端反復配列の初期の記載は、X. Xiao(1996年)、「Characterization of adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration」（博士論文）、University of Pittsburgh、Pittsburgh、Pa.（本明細書にその全体が組み込まれている）により提供される。
【0103】
[00114]ＡＡＶ ＩＴＲは、天然ＡＡＶ ＩＴＲであってもよく、またはその代わりに、変更ＩＴＲが、望ましい生物学的機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み等をなおも仲介できる限り、例えば、変異、欠失もしくは挿入によって、天然ＡＡＶ ＩＴＲから変更されていてもよい。ＡＡＶベクター中の、選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、例えば、目的の配列を受容細胞ゲノムから切除およびレスキューすることならびに受容細胞ゲノムへの組込みを可能にするために、意図したとおりに機能する限り、必ずしも同一である、または同一ＡＡＶ血清型由来である必要はない。
【0104】
[00115]特定の実施形態では、本明細書中で提供されるＡＡＶベクターが、ＡＡＶウイルス粒子内へとパッケージングされるために適切なサイズを有する発現カセットを含む。例えば、ＡＡＶベクター中の該発現カセットのサイズは、使用するＡＡＶのゲノムサイズのサイズ限度まで、例えば、５．２ｋｂまでであり得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクター中の該発現カセットが、５．２ｋｂ以下、約５ｋｂ以下、約４．５ｋｂ以下、約４ｋｂ以下、約３．５ｋｂ以下、約３ｋｂ以下、約２．５ｋｂ以下のサイズを有する、例えば、J. Y. Dong等（1996年11月10日）を参照。特定の実施形態では、本明細書中で提供されるＡＡＶベクタープラスミドが、５０００ｂｐ未満（例えば、約４５００ｂｐ）であり、かつＩＴＲ、プロモータ、ＷＰＲＥおよびポリ（Ａ）を含む導入遺伝子発現カセットを含む。該導入遺伝子は、本明細書中で提供されるヌクレオチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターが、組換えであってもよい。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、同一ウイルス起源ではない（例えば、非ＡＡＶウイルス由来、またはＡＡＶの異なる血清型由来、または部分的合成配列もしくは完全合成配列由来の）１つ以上の異種配列を含み得る。特定の実施形態では、本明細書中で提供されるヌクレオチド構築物に、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接する。
【0105】
[00116]ＡＡＶベクターは、当該技術分野で公知の方法を使用して構築可能である。ｒＡＡＶベクター構築の一般的原理は、当該技術分野において公知である。例えば、Carter、1992年、Current Opinion in Biotechnology、3:533～539頁；およびMuzyczka、1992年、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、158:97～129頁を参照。例えば、異種配列を、Ｒｅｐ遺伝子および／またはＣａｐ遺伝子を欠失させたＡＡＶゲノムのＩＴＲ間に直接挿入してもよい。複製およびパッケージングの機能を可能にするためにＩＴＲの十分な部分が残存する限り、ＡＡＶゲノムの別の部分を欠失することも可能である。そのような構築物は、当該技術分野において周知の技術を使用して設計できる。例えば、米国特許第５１７３４１４号明細書および米国特許第５１３９９４１号明細書；国際公開第９２／０１０７０号（1992年1月23日公開）および国際公開第９３／０３７６９号（1993年3月4日公開）；Lebkowski等(1988年)、Molec. Cell. Biol. 8:3988～3996頁；Vincent等(1990年)、Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；B. J. Carter(1992年)、Current Opinion in Biotechnology 3:533～539頁；N. Muzyczka(1992年)、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97～129頁；R. M. Kotin (1994年)、Human Gene Therapy 5:793～801頁；ShellingとSmith(1994年)、Gene Therapy 1:165～169頁；ならびにZhou等(1994年)、J. Exp. Med. 179:1867～1875頁を参照。
【0106】
[00117]その代わりに、ＡＡＶ ＩＴＲを含有するウイルスゲノムまたはＡＡＶベクターから、ＡＡＶ ＩＴＲを切除して、例えば、前記のSambrook等に記載される標準的ライゲーション技術を使用して、異種配列の５’および３’に融合してもよい。ＡＡＶ ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、市販入手可能であり、例えば米国特許第５１３９９４１号に記載されている。
【0107】
[00118]特定の一実施形態では、ドパミンの異所性合成および酵素組成物の発現を、本開示中のＡＡＶベクターにより行う。しかしながら、本開示および先行技術の開示を考慮して、当業者はさらに、本開示で使用するＡＡＶベクターは、その変形形態も含み得ることを理解し、その変形形態は、ＡＡＶベクターの基本機能に影響を及ぼさないＤＮＡ配列変種、またはＡＡＶ血清型の変化を含むが、それらに限定されない。
【0108】
[00119]本明細書で使用する用語「異所性合成」または「ｄｅ ｎｏｖｏ合成」は、いくつかの技術を利用した、元来はその化合物を合成しない細胞、組織または器官中での特定化合物産生の開始に関する。特定の一実施形態では、本開示で使用する酵素組成物が、線条体中の元来はドパミンを合成しない中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）中で機能してもよく、その脳領域でのドパミンの合成および分泌を促進し得て、ＰＤ関連表現型の緩和において重要な役割を果たし得る。
【0109】
[00120]ウイルス粒子
[00121]別の態様では、本開示は、前記のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）でのトランスフェクションにより調製された細胞を提供する。
[00121]別の態様では、本開示は、前記のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）でのトランスフェクションにより調製された細胞を提供する。
【0110】
[00122]本開示は、前記のヌクレオチド構築物を、そのゲノムとして含むウイルス粒子を提供する。
【0111】
[00123]ＡＡＶウイルス粒子は、前記のＡＡＶベクターから産生され得る。ＡＡＶ粒子は、公知の技術を使用して、例えばトランスフェクションにより、本明細書中で提供されるＡＡＶベクターを、別の必要な機構、例えば、ＡＡＶ ｃａｐ／ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミド、およびアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれか一方により供給されるヘルパー遺伝子と共に、適切な宿主細胞内へと導入することにより産生可能である（例えば、本明細書にその全体が組み込まれているM. F. Naso等、BioDrugs、31(4):317～334頁(2017年)を参照）。ＡＡＶベクターは、宿主細胞中で発現可能であり、ウイルス粒子内へとパッケージされ得る。
【0112】
[00124]本明細書中で提供されるＡＡＶウイルス粒子は、ｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、該カプシドタンパク質が、天然であっても組換えであってもよい。いくつかの実施形態では、該カプシドタンパク質が、改変されていてもキメラまたは合成であってもよい。改変カプシドは、挿入、付加、欠失または変異のような改変を含み得る。例えば、改変カプシドは、検出または精製のタグを組み込んでもよい。キメラカプシドは、２つ以上のカプシド配列の部分を含む。合成カプシドは、合成配列または人為的に設計された配列を含む。ＡＡＶのカプシド構造も当該技術分野において公知であり、前記のNF Bernard等においてより詳細に記載される。
【0113】
[00125]いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子またはカプシドタンパク質が、２つ以上のＡＡＶ血清型に由来する。本明細書で使用する、ＡＡＶに関する用語「血清型」は、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に関する。様々なＡＡＶ血清型が、機能的および構造的に、遺伝子レベルでさえも関連することが当該技術分野において公知である（例えば、Blacklow、「Parvoviruses and Human Disease」J. R. Pattison編(1988年)の165～174頁；およびRose、Comprehensive Virology 3:1、1974年を参照）。しかしながら、異なる血清型のＡＡＶウイルス粒子は、異なる組織指向性を有し得て（詳細は、M Nonnenmacher等、Gene Ther.、2012年6月、19(6):649～658頁を参照）、標的組織向けの遺伝子療法に適切であるとして選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子またはカプシドタンパク質が、特異的指向性プロファイルを有し得る。用語「指向性プロファイル」は、１つ以上の標的細胞、標的組織および／または標的器官の形質導入のパターンに関する。例えば、カプシドタンパク質は、脳、肝臓（例えば肝細胞）、眼、筋肉、肺、腎臓、腸、膵臓、唾液腺もしくは滑膜、または任意の別の適切な細胞、組織もしくは器官に特異的な指向性プロファイルを有し得る。
【0114】
[00126]いくつかの実施形態では、ｃａｐ遺伝子またはカプシドタンパク質が、任意の適切なＡＡＶカプシド遺伝子またはタンパク質に由来し、例えば、制限なしに、ＡＡＶカプシド遺伝子またはタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ８４３、ＡＡＶｂｂ２、ＡＡＶｃｙＳ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ６４、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｈｕ４３、ＡＡＶｈｕ４４、ＡＡＶｈｕ４６、ＡＡＶｈｕ１９、ＡＡＶｈｕ２０、ＡＡＶｈｕ２３、ＡＡＶｈｕ２２、ＡＡＶｈｕ２４、ＡＡＶｈｕ２１、ＡＡＶｈｕ２７、ＡＡＶｈｕ２８、ＡＡＶｈｕ２９、ＡＡＶｈｕ６３、ＡＡＶｈｕ６４、ＡＡＶｈｕ１３、ＡＡＶｈｕ５６、ＡＡＶｈｕ５７、ＡＡＶｈｕ４９、ＡＡＶｈｕ５８、ＡＡＶｈｕ３４、ＡＡＶｈｕ４５、ＡＡＶｈｕ４７、ＡＡＶｈｕ５１、ＡＡＶｈｕ５２、ＡＡＶｈｕ Ｔ４１、ＡＡＶｈｕ Ｓ１７、ＡＡＶｈｕ Ｔ８８、ＡＡＶｈｕ Ｔ７１、ＡＡＶｈｕ Ｔ７０、ＡＡＶｈｕ Ｔ４０、ＡＡＶｈｕ Ｔ３２、ＡＡＶｈｕ Ｔ１７、ＡＡＶｈｕ ＬＧ１５、ＡＡＶｈｕ９、ＡＡＶｈｕ１０、ＡＡＶｈｕ１１、ＡＡＶｈｕ５３、ＡＡＶｈｕ５５、ＡＡＶｈｕ５４、ＡＡＶｈｕ７、ＡＡＶｈｕ１８、ＡＡＶｈｕ１５、ＡＡＶｈｕ１６、ＡＡＶｈｕ２５、ＡＡＶｈｕ６０、ＡＡＶｃｈ５、ＡＡＶｈｕ３、ＡＡＶｈｕ１、ＡＡＶｈｕ４、ＡＡＶｈｕ２、ＡＡＶｈｕ６１、ＡＡＶｒｈ６２、ＡＡＶｒｈ４８、ＡＡＶｒｈ５４、ＡＡＶｒｈ５５、ＡＡＶｃｙ２、ＡＡＶｒｈ３５、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｃｙ６、ＡＡＶｃｙ４、ＡＡＶｃｙ３、ＡＡＶｃｙ５、ＡＡＶｒｈ１３、ＡＡＶｒｈ３８、ＡＡＶｈｕ６６、ＡＡＶｈｕ４２、ＡＡＶｈｕ６７、ＡＡＶｈｕ４０、ＡＡＶｈｕ４１、ＡＡＶｒｈ４０、ＡＡＶｒｈ２、ＡＡＶｂｂ１、ＡＡＶｈｕ１７、ＡＡＶｈｕ６、ＡＡＶｒｈ２５、ＡＡＶｐｉ２、ＡＡＶｐｉ３、ＡＡＶｒｈ５７、ＡＡＶｒｈ５０、ＡＡＶｒｈ４９、ＡＡＶｈｕ３９、ＡＡＶｒｈ５８、ＡＡＶｒｈ６１、ＡＡＶｒｈ５２、ＡＡＶｒｈ５３、ＡＡＶｒｈ５１、ＡＡＶｈｕ１４、ＡＡＶｈｕ３１、ＡＡＶｈｕ３２、ＡＡＶｒｈ３４、ＡＡＶｒｈ３３、ＡＡＶｒｈ３２、鳥類ＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５、鳥類ＡＡＶ株ＤＡ－１またはウシＡＡＶに由来する。ＡＡＶ８４３のカプシドは、国際公開第２０１９／２４１３２４号（本明細書にその全体が組み込まれている）に開示される合成カプシドＡＡＶＸＬ３２と同一であり、ＡＡＶ８４３は、例えば、J. Xu等、Int J Clin Exp Med、2019年、12(8):10253～10261頁にも開示される。
【0115】
[00127]ＡＡＶカプシドの遺伝子配列およびタンパク質配列のさらなる例は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに見出され得る、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ ００１３５８、ＮＣ ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、ＡＹ６３１９６５、ＡＹ６３１９６６； ＡＦ０６３４９７、ＡＦ０８５７１６、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、ＡＡＳ９９２６４．１、ＡＹ２４３０２２、ＡＹ２４３０１５、ＡＹ５３０５６０、ＡＹ５３０６００、ＡＹ５３０６１１、ＡＹ５３０６２８、ＡＹ５３０５５３、ＡＹ５３０６０６、ＡＹ５３０５８３、ＡＹ５３０５５５、ＡＹ５３０６０７、ＡＹ５３０５８０、ＡＹ５３０５６９、ＮＣ ００６２６３、ＮＣ ００５８８９、ＮＣ ００１８６２、ＡＹ５３０６０９、ＡＹ５３０５８１、ＡＹ５３０５６３、ＡＹ５３０５９１、ＡＹ５３０５６２、ＡＹ５３０５８４、ＡＹ５３０６２２、ＡＹ５３０６０１、ＡＹ５３０５８６、ＡＹ２４３０２１、ＡＹ５３０５７０、ＡＹ５３０５８９、ＡＹ５３０５９５、ＡＹ５３０５７２、ＡＹ５３０５８８、ＡＹ５３０５７５、ＡＹ５３０５６５、ＡＹ５３０５９０、ＡＹ５３０６０２、ＡＹ５３０５６６、ＡＹ５３０５８７、ＡＹ５３０５８５、ＡＹ５３０５６４、ＡＹ５３０５９２、ＡＹ５３０６２３、ＡＹ５３０５７４、ＡＹ５３０５９３、ＡＹ５３０５６０、ＡＹ５３０５９４、ＡＹ５３０５７３、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０６２４、ＡＹ５３０５６１、ＡＹ２４２９９７、ＡＹ５３０６２５、ＡＹ５３０５６７、ＡＹ５３０５５６、ＡＹ５３０５７８、ＡＹ５３０５６８、ＡＹ５３０６１８、ＡＹ２４３０２０、ＡＹ５３０５７９、ＡＹ５３０６１９、ＡＹ５３０５９６、ＡＹ５３０６１２、ＡＹ２４３０００、ＡＹ５３０５９７、ＡＹ５３０６２０、ＡＹ２４２９９８、ＡＹ５３０５９８、ＡＹ２４２９９９、ＡＹ５３０５９９、ＡＹ２４３０１６、ＮＣ ００１７２９、ＮＣ ００１４０１、ＡＹ２４３０１８、ＮＣ ００１８６３、ＡＹ５３０６０８、ＡＹ２４３０１９、ＮＣ ００１８２９、ＡＹ５３０６１０、ＡＹ２４３０１７、ＡＹ２４３００１、ＡＹ５３０６１３、ＡＹ２４３０１３、ＡＹ２４３００２、ＡＹ５３０６１４、ＡＹ２４３００３、ＡＹ６９５３７８、ＡＹ５３０５５８、ＡＹ５３０６２６、ＡＹ６９５３７６、ＡＹ６９５３７５、ＡＹ５３０６０５、ＡＹ６９５３７４、ＡＹ５３０６０３、ＡＹ５３０６２７、ＡＹ６９５３７３、ＡＹ６９５３７２、ＡＹ５３０６０４、ＡＹ６９５３７１、ＡＹ５３０６００、ＡＹ６９５３７０、ＡＹ５３０５５９、ＡＹ６９５３７７、ＡＹ２４３００７、ＡＹ２４３０２３、ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ ００４８２８、ＡＹ５３０６２９、ＡＹ５３０５７６、ＡＹ２４３０１５、ＡＹ３８８６１７、ＡＹ５３０５７７、ＡＹ５３０５８２、ＡＹ５３０６１５、ＡＹ５３０６２１、ＡＹ５３０６１７、ＡＹ５３０５５７、ＡＹ５３０６１６またはＡＹ５３０５５４を参照。
【0116】
[00128]特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ９由来のカプシドタンパク質を含むため、ＡＡＶ９の血清型を有する。ＡＡＶ９のカプシド遺伝子配列は、当該技術分野において、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから公知である、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ５３０５７９を参照。
【0117】
[00129]特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子が、あるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質および第２の血清型由来のＡＡＶ ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子が、シュードタイプＡＡＶを含む。「シュードタイプ」ＡＡＶは、ある血清型由来のカプシドタンパク質および第２の血清型の、５’～３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含有するＡＡＶに関する。シュードタイプＡＡＶは、カプシドタンパク質が由来する血清型の細胞表面結合特性およびＩＴＲが由来する血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想される。
【0118】
[00130]ＡＡＶのゲノム配列と同様にＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は当該技術分野において公知であり、文献および公開データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに見出され得る。以下の表１は、ＡＡＶゲノムのいくつかの模範配列またはＡＡＶカプシド配列を示し、さらなる例は、NF Bernard等、VIROLOGY、第2巻、第69章(第4版、Lippincott-Raven Publishers)；Gao等、(2004年)J. Virol. 78:6381～6388頁；MF Naso等、BioDrugs.、2017年、31(4):317～334頁に概説される。
【0119】
[00131]
【表1】
【0120】
[00132]医薬組成物
[00133]別の態様では、本開示は、前記のウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
[00133]別の態様では、本開示は、前記のウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0121】
[00134]本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、本開示のウイルス粒子の貯蔵および対象への投与を容易にし得るあらゆる医薬担体に関し、例えば、溶媒、分散媒、被覆材、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等に関する。該薬学的に許容される担体は、任意の適切な成分、例えば、制限なしに、食塩水を含み得る。食塩水の実例は、制限なしに、緩衝食塩水、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ショ糖溶液、塩溶液、およびポリソルベート溶液を含む。
【0122】
[00135]特定の実施形態では、医薬組成物がさらに、添加剤、例えば、制限なしに、安定剤、保存剤、および薬剤の細胞取込みを援助するトランスフェクション促進剤を含んでもよい。適切な安定剤は、制限なしに、グルタミン酸一ナトリウム、グリシン、ＥＤＴＡおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）を含み得る。適切な保存剤は、制限なしに、２－フェノキシエタノール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノール、チメロサールおよび抗生物質を含み得る。適切なトランスフェクション促進剤は、制限なしに、カルシウムイオンを含み得る。
【0123】
[00136]医薬組成物は、当該技術分野において公知の任意の適切な経路を介する投与に適切であり得て、その投与経路は、制限なしに、非経口、経口、経腸、バッカル、経鼻、局所、直腸、経膣、経粘膜、表皮、経皮、真皮、経眼、肺内、心臓内、皮下、実質内、脳室内、または脊髄内の投与経路を含む。
【0124】
[00137]医薬組成物は、各投与経路に適切な製剤または調合の形で、対象に投与可能である。医薬組成物の投与に適切な製剤は、制限なしに、液剤、分散剤、乳剤、散剤、懸濁剤、エアロゾル、スプレー、点鼻剤、リポソームベース製剤、パッチ、植込剤、および座剤を含み得る。
【0125】
[00138]製剤は、都合よく単位剤形で提示されてもよく、かつ薬学の当該技術分野で周知の任意の方法により調製され得る。それらの製剤または組成物を調製する方法は、本開示の外来核酸を、１つ以上の薬学的に許容される担体および場合により１つ以上のアジュバントに供給する工程を含む。そのような製剤を準備する方法は、例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、A. R. Gennaro(編)、Mack Publishing Co.、N.J.、1995年；R. Stribling等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:11277～11281頁(1992年)；T. W. Kim等、The Journal of Gene Medicine、7(6):749～758頁(2005年)；S.F. Jia等、Clinical Cancer Research、9:3462(2003年)；A. Shahiwala等、Recent patents on drug delivery and formulation、1:1～9頁(2007年)；A. Barnes等、Current Opinion in Molecular Therapeutics 2000 2:87～93頁(2000年)に見出され得る。
【0126】
[00139]治療の方法
[00140]別の態様では、本開示は、対象において、前記のＴＨバリアント、医薬組成物、ヌクレオチド構築物、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）、細胞、ウイルス粒子または組成物を使用して（例えば、治療有効量の投与により）神経変性疾患を治療する方法を提供する。
[00140]別の態様では、本開示は、対象において、前記のＴＨバリアント、医薬組成物、ヌクレオチド構築物、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）、細胞、ウイルス粒子または組成物を使用して（例えば、治療有効量の投与により）神経変性疾患を治療する方法を提供する。
【0127】
[00141]特定の実施形態では、本開示は、対象において神経変性疾患を治療する方法であって、本明細書中で提供されるウイルス粒子の治療有効量を該対象に投与する工程を含む方法を提供する。本明細書で使用する、ウイルス粒子に関する用語「治療有効量」は、該対象に送達されるウイルス粒子の量が、該対象において治療利益を生み出すため、例えば、該対象における少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの緩和、鎮静または軽減を提供するために十分であることを意味する。例えば、外来核酸の治療有効量は、治療利益を生み出すために、該対象において、ＴＨバリアント（またはその誘導体）およびＡＡＤＣ（またはその誘導体）の、十分な数の細胞への送達および発現を可能にし得る。該治療利益は、例えば、パーキンソン病を有する対象の運動症状の回復を含み得る。
【0128】
[00142]特定の実施形態では、本明細書中で提供されるウイルス粒子、ベクターまたは組成物の治療利益を、ＰＤ動物モデルにおいて試験し得る。本明細書で使用する用語「ＰＤ動物モデル」は、ＰＤ病理（例えば、脳の黒質領域中のドパミン作動性ニューロンの神経変性）と一致する重大な表現型をシミュレーションできる動物モデルに関する。特定の一実施形態では、本開示で使用するＰＤ動物モデルは、片側黒質／腹側被蓋野（ＳＮ／ＶＴＡ）領域中のドパミン作動性ニューロンが有毒試薬（例えば、６－ヒドロキシドパミン、６－ＯＨＤＡ）によって特異的に殺滅されている、Ｃ５７ＢＬ／６と呼ばれるマウス株である。しかしながら、当業者はさらに、あるＰＤ動物モデルの確立は、ヒトＰＤの治療用の手引きおよび方法を提供することを理解する。したがって、遺伝的関係において進化的にヒトにより近い非ヒト霊長類のＰＤモデルは、理論的に、臨床変換（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の目標を達成する助けとなり得る。該特定の実施形態において使用するマウスモデルは、本開示の酵素組成物がＰＤジスキネジアを改善し得ることの例証を意図するのみで、マウスにのみ効果的であることは意味しない。当業者は、先行技術の理解に基づき、本開示の酵素組成物が、別の種（例えばヒト）のＰＤジスキネジアを改善できることを当然ながら予想できる。
【0129】
[00143]特定の実施形態では、本明細書中で提供されるウイルス粒子を、対象の脳の線条体に投与する。
【0130】
[00144]本明細書で使用する用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物に関する。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ラット、マウス、両生類、および爬虫類に関する。特に指定がない限り、用語「患者」および「対象」は交換可能に使用する。
【0131】
[00145]本明細書で使用する用語「治療」または「治療する方法」は、両方とも療法および予防法に関する。治療を必要とする者は、特定疾患をすでに患う個人またはそのような疾患をやがて患うかもしれない個人を含み得る。
【0132】
[00146]一実施形態では、ＴＨバリアントおよびＡＡＤＣのヌクレオチドを発現させるために、ＴＨバリアントおよびＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を含むウイルス粒子を、対象の脳の線条体に投与し、それが次いで、線条体中でのドパミンの異所性合成を引き起こし、パーキンソン病を有する対象の運動症状をやがて効果的に回復する。
【0133】
[00147]特定の実施形態では、線条体が、尾状核被殻（ＣＰ）領域である。
【0134】
[00148]一実施形態では、本開示は、対象において神経変性疾患を治療するための医薬品の製造における、前記のＴＨバリアント、医薬組成物、ヌクレオチド構築物、ベクタープラスミド、細胞、ウイルスまたは組成物の使用を開示する。
【0135】
[00149]特定の実施形態では、該神経変性疾患がパーキンソン病である。
【0136】
[00150]特定の実施形態では、該対象が、哺乳類、好ましくはヒト、ラットまたはマウスである。
【0137】
[00151]本発明の利点
[00152]本開示の利点は、本開示により提供される治療方法を利用して、ドパミンの異所性合成用の酵素組成物が、細胞により放出されるドパミンの濃度を著しく上昇させ得ることであり、その濃度は、別の酵素組成物よりも著しく高い。さらに、前記の外来遺伝子を送達するためのＡＡＶベクターの使用は、標的酵素組成物をコードするヌクレオチド構築物の、脳の線条体中での効果的な発現をもたらし、それにより、ＰＤの疾患表現型を著しく改善する。それは、遺伝子療法での適用向けの、本開示の発現ベクターとしてのＡＡＶを含む酵素組成物の大きな価値を示唆する。
[00152]本開示の利点は、本開示により提供される治療方法を利用して、ドパミンの異所性合成用の酵素組成物が、細胞により放出されるドパミンの濃度を著しく上昇させ得ることであり、その濃度は、別の酵素組成物よりも著しく高い。さらに、前記の外来遺伝子を送達するためのＡＡＶベクターの使用は、標的酵素組成物をコードするヌクレオチド構築物の、脳の線条体中での効果的な発現をもたらし、それにより、ＰＤの疾患表現型を著しく改善する。それは、遺伝子療法での適用向けの、本開示の発現ベクターとしてのＡＡＶを含む酵素組成物の大きな価値を示唆する。
【0138】
[00153]以下の実施例における実験方法は、特に指定がない限り、従来どおりである。
【0139】
[00154]実施例
[00155]方法および材料
[00156]１．酵素組成物を発現するＡＡＶベクターの構築
[00157]本開示の酵素組成物を発現するポリヌクレオチドとＡＡＶベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ：２６９７２）とを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとを用いて、３７℃で１時間消化して、対応する付着末端を得た。ゲル回収により精製した標的断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩ライゲーションした。形質転換後に培養用に単一細菌コロニーをピッキングし、ベクタープラスミドを抽出し、配列検証に向けてサンガー法シーケンシングの対象とした。
[00155]方法および材料
[00156]１．酵素組成物を発現するＡＡＶベクターの構築
[00157]本開示の酵素組成物を発現するポリヌクレオチドとＡＡＶベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ：２６９７２）とを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとを用いて、３７℃で１時間消化して、対応する付着末端を得た。ゲル回収により精製した標的断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩ライゲーションした。形質転換後に培養用に単一細菌コロニーをピッキングし、ベクタープラスミドを抽出し、配列検証に向けてサンガー法シーケンシングの対象とした。
【0140】
[00158]２．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの２９３細胞株の培養およびトランスフェクション
[00159]２９３細胞株を、ＧｌｕｔａＭＡＸならびに二重抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補足したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２９３細胞の密度が、６ウェルプレートの面積の約８０％に達したら、リポソーム型トランスフェクション（リポフェクタミン３０００試薬）を行った。各ウェル中の２９３細胞を、対応するプラスミド３μｇでトランスフェクトし、続く実験に向けて４８時間にわたり連続的に培養した。
[00159]２９３細胞株を、ＧｌｕｔａＭＡＸならびに二重抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補足したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２９３細胞の密度が、６ウェルプレートの面積の約８０％に達したら、リポソーム型トランスフェクション（リポフェクタミン３０００試薬）を行った。各ウェル中の２９３細胞を、対応するプラスミド３μｇでトランスフェクトし、続く実験に向けて４８時間にわたり連続的に培養した。
【0141】
[00160]３．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
[00161]２９３細胞の培地を吸い取った後、細胞を、温かいＰＢＳで１回洗浄してから、ＰＢＳ（１ｍＬ）中で１時間培養した。ライセートを収穫してから、３，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清をＨＣｌＯ４（０．６Ｍ）と１：１の比率で混合して、ＨＣｌＯ４の最終濃度を０．３Ｍとした。十分に混合したサンプルを、２０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を、ＥＳＡ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩＩ電気化学検出器（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を搭載したＨＰＬＣシステムにアプライした。０．２ｍＬ／分の速度のフロー状態（ｆｌｏｗ ｐｈａｓｅ）で平衡化したＥｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８逆相カラム（３．５μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用してカテコールアミンを分離してから、電気化学検出を行い、特定のピークの積分によりドパミン濃度を計算した。
[00161]２９３細胞の培地を吸い取った後、細胞を、温かいＰＢＳで１回洗浄してから、ＰＢＳ（１ｍＬ）中で１時間培養した。ライセートを収穫してから、３，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清をＨＣｌＯ４（０．６Ｍ）と１：１の比率で混合して、ＨＣｌＯ４の最終濃度を０．３Ｍとした。十分に混合したサンプルを、２０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を、ＥＳＡ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩＩ電気化学検出器（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を搭載したＨＰＬＣシステムにアプライした。０．２ｍＬ／分の速度のフロー状態（ｆｌｏｗ ｐｈａｓｅ）で平衡化したＥｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８逆相カラム（３．５μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用してカテコールアミンを分離してから、電気化学検出を行い、特定のピークの積分によりドパミン濃度を計算した。
【0142】
[00162]４．定位的注入
[00163]Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景の片側黒質／腹側被蓋野領域（ＳＮ／ＶＴＡ）への６－ＯＨＤＡの注入によりＰＤマウスモデルを構築した。片側ＳＮ／ＶＴＡ領域において６－ＯＨＤＡ（８ｍｇ／ｍＬ）５００ｎＬを注入するために、定位的注入を行った。有毒試薬として、６－ＯＨＤＡは、ドパミン作動性ニューロンを特異的に殺滅する。６－ＯＨＤＡを、５０ｎＬ／分の速度でゆっくりと注入し、ＡＰ－３．６、ＭＬ－０．５およびＤＶ－４．３において送達した。
[00163]Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的背景の片側黒質／腹側被蓋野領域（ＳＮ／ＶＴＡ）への６－ＯＨＤＡの注入によりＰＤマウスモデルを構築した。片側ＳＮ／ＶＴＡ領域において６－ＯＨＤＡ（８ｍｇ／ｍＬ）５００ｎＬを注入するために、定位的注入を行った。有毒試薬として、６－ＯＨＤＡは、ドパミン作動性ニューロンを特異的に殺滅する。６－ＯＨＤＡを、５０ｎＬ／分の速度でゆっくりと注入し、ＡＰ－３．６、ＭＬ－０．５およびＤＶ－４．３において送達した。
【0143】
[00164]ＰＤモデルマウスの運動非対称性の救済における本開示の酵素組成物の役割を検証する実験において、本発明者は、標的二酵素組成物を発現するベクタープラスミドを含む、ＡＡＶ血清型９のウイルス粒子（力価：１．９５×１０１３ｖｇ／ｍＬ）を、線条体の尾状核被殻（ＣＰ）内に注入した。ＧＦＰ発現ウイルスベクター（力価：７．７８×１０１２ｖｇ／ｍＬ）を対照として使用した。マウス標準脳アトラスに基づいて、３つの適切な注入部位：（１）ＡＰ０．５、ＭＬ－２．０およびＤＶ－３．６；（２）ＡＰ０．５、ＭＬ－２．０およびＤＶ－３．６；（３）ＡＰ－０．６、ＭＬ－２．７およびＤＶ－３．３を選択した。各部位での注入量は５００ｎＬであり、注入速度は、注入ポンプを使用して５０ｎＬ／分であった。
【0144】
[00165]５．アポモルフィン回転試験
[00166]試験前に、ＰＤマウスモデルの頸部にアポモルフィンを、体重で計った投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で皮下投与した。マウスを、馴化のために直径１０ｃｍのシリンダ内に置いてから、回転試験を行った。結果は、６－ＯＨＤＡ病変と反対側のアポモルフィン誘発回転の１分間当たり正味回転で表し、対側回転と同側回転との間の差異を、６０分間の記録時間で割って計算した。
[00166]試験前に、ＰＤマウスモデルの頸部にアポモルフィンを、体重で計った投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で皮下投与した。マウスを、馴化のために直径１０ｃｍのシリンダ内に置いてから、回転試験を行った。結果は、６－ＯＨＤＡ病変と反対側のアポモルフィン誘発回転の１分間当たり正味回転で表し、対側回転と同側回転との間の差異を、６０分間の記録時間で割って計算した。
【0145】
[00167]６．免疫細胞染色
[00168]マウスを、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡで経心的に灌流した。単離した脳を約１週間、４％ＰＦＡ中で固定してから、続いて、１５％ショ糖溶液および３０％ショ糖溶液で脱水した。解析対象の脳領域（ＳＮ／ＶＴＡおよびＣＰ）を含有する厚さ４０μｍの脳切片を得るために、クリオスタット切片化を使用した。ＰＢＳ中で洗浄後、脳切片を、室温で２時間、ブロックバッファ（ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）中でインキュベートした。次いで、切片を４℃で一晩、一次抗体（抗ＴＨ）とインキュベートしてから、該一次抗体の起源に対応し、かつ発色団（吸収波長４８８ｎｍ）を有する二次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った。全画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０ハイスループット蛍光イメージングシステムを用いて獲得した。
[00168]マウスを、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡで経心的に灌流した。単離した脳を約１週間、４％ＰＦＡ中で固定してから、続いて、１５％ショ糖溶液および３０％ショ糖溶液で脱水した。解析対象の脳領域（ＳＮ／ＶＴＡおよびＣＰ）を含有する厚さ４０μｍの脳切片を得るために、クリオスタット切片化を使用した。ＰＢＳ中で洗浄後、脳切片を、室温で２時間、ブロックバッファ（ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）中でインキュベートした。次いで、切片を４℃で一晩、一次抗体（抗ＴＨ）とインキュベートしてから、該一次抗体の起源に対応し、かつ発色団（吸収波長４８８ｎｍ）を有する二次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った。全画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＶＳ１２０ハイスループット蛍光イメージングシステムを用いて獲得した。
【0146】
[00169]７．実験に関与した配列情報
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0147】
[00170]実施例１。二酵素組成物を発現するＡＡＶベクターの構築
[00171]図１に示すように、Ｎ末端での９０個のアミノ酸の欠失を有するＴＨバリアントおよび全長ＡＡＤＣを含む二酵素組成物を発現する組換えＡＡＶベクターを構築した。下流遺伝子の発現は、シナプシンプロモータによって調節された。該二酵素組成物を発現するポリヌクレオチドは、（５’から３’へと）以下に示す３つの部分を含む。
[00172]１）配列番号１３に記載される、Ｎ末端にＨＡタグが付いた、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨをコードするポリヌクレオチド；
[00173]２）自己切断ペプチドをコードする、配列番号２８に記載されるＴ２Ａヌクレオチド配列；
[00174]３）配列番号２１に記載される、Ｃ末端にＭｙｃタグが付いた全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチド。
[00171]図１に示すように、Ｎ末端での９０個のアミノ酸の欠失を有するＴＨバリアントおよび全長ＡＡＤＣを含む二酵素組成物を発現する組換えＡＡＶベクターを構築した。下流遺伝子の発現は、シナプシンプロモータによって調節された。該二酵素組成物を発現するポリヌクレオチドは、（５’から３’へと）以下に示す３つの部分を含む。
[00172]１）配列番号１３に記載される、Ｎ末端にＨＡタグが付いた、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨをコードするポリヌクレオチド；
[00173]２）自己切断ペプチドをコードする、配列番号２８に記載されるＴ２Ａヌクレオチド配列；
[00174]３）配列番号２１に記載される、Ｃ末端にＭｙｃタグが付いた全長ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチド。
【0148】
[00175]本開示の酵素組成物を発現するポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで消化して、ＡＡＶベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ：２６９７２）にサブクローニングした。
【0149】
[00176]対照として、本発明者は同時に、ＧＦＰ発現を誘導するシナプシンプロモータを有するＡＡＶベクターを構築した。
【0150】
[00177]２９３細胞株において、その各々が、Ｎ末端で特定数のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む一連の組成物間で、ｄｅ ｎｏｖｏドパミン合成能を都合よく比較できるよう、２９３細胞株中での標的配列のより良好な発現を目指して、本発明者は、プロモータとしてのユビキチンを有する一群のベクタープラスミドを同時に構築し、その各々は、全長ＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物、ＴＨの別の異性体および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で４０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の４１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣ（配列番号４）を含む組成物、Ｎ末端で６０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の６１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で８０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の８１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の９１～５２８番目のアミノ酸残基もしくは配列番号２）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で１００個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の１０１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で１２０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の１２１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で１５０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の１５１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、Ｎ末端で１６４個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の１６５～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物、またはＮ末端で１９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨ（すなわち、配列番号１の１９１～５２８番目のアミノ酸残基）および全長ＡＡＤＣを含む組成物を発現する。Ｎ末端アミノ酸欠失を有する一連のＴＨはすべて、Ｎ末端においてＨＡタグと付着させ、かつ全長ＡＡＤＣのＣ末端は、Ｍｙｃタグと付着させた。プロモータとしてユビキチンを有するＧＦＰ発現ウイルスベクターを、対照として構築した。
【0151】
[00178]実施例２。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞株中での酵素組成物の機能検証
[00179]ドパミンｄｅ ｎｏｖｏ合成に関して最も効率よい二酵素組成物を見出すために、本発明者は、前記の、Ｎ末端でのアミノ酸欠失を有するＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む一連の二酵素組成物をコードするベクタープラスミドをそれぞれ、リポソーム（リポフェクタミン３０００試薬）を用いて２９３細胞株内にトランスフェクトした。陰性対照として、ＧＦＰ発現ベクターも２９３細胞株内にトランスフェクトした。培養細胞を、３７℃、５％ＣＯ２中で４８時間インキュベーション後、細胞培養培地をＰＢＳで交換した。ＰＢＳ中での１時間のインキュベーション後、上清ＰＢＳおよび細胞サンプルをそれぞれ収穫した。
[00179]ドパミンｄｅ ｎｏｖｏ合成に関して最も効率よい二酵素組成物を見出すために、本発明者は、前記の、Ｎ末端でのアミノ酸欠失を有するＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む一連の二酵素組成物をコードするベクタープラスミドをそれぞれ、リポソーム（リポフェクタミン３０００試薬）を用いて２９３細胞株内にトランスフェクトした。陰性対照として、ＧＦＰ発現ベクターも２９３細胞株内にトランスフェクトした。培養細胞を、３７℃、５％ＣＯ２中で４８時間インキュベーション後、細胞培養培地をＰＢＳで交換した。ＰＢＳ中での１時間のインキュベーション後、上清ＰＢＳおよび細胞サンプルをそれぞれ収穫した。
【0152】
[00180]前記のＰＢＳサンプル中のドパミン濃度、すなわち２９３細胞によって分泌されたドパミン濃度を検出するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。その結果は、Ｎ末端でのアミノ酸欠失を有するＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む一連の二酵素組成物を発現する２９３細胞から収穫した全サンプル中においてドパミンが検出されたが、ＧＦＰ発現サンプル中では検出されなかったことを示した（図２）。これは、２９３細胞株それ自体は、ドパミンを合成および分泌できないが、機能性のＴＨとＡＡＤＣとを同時に導入すると、細胞がドパミンの合成および分泌を開始することを示唆し、本発明者が設計した様々な二酵素組成物が、正常に機能し得る、すなわち、ドパミンのｄｅ ｎｏｖｏ合成を触媒し得ることを証明する。
【0153】
[00181]この結果はさらに、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（９０）を発現する２９３細胞からのサンプル中でのドパミン濃度は、全長ＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（ＷＴ）、ＴＨの別の異性体および全長ＡＡＤＣを含む組成物（Ｉｓｏｂ）、Ｎ末端で４０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（４０）、Ｎ末端で６０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（６０）、Ｎ末端で１００個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（１００）、Ｎ末端で１２０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（１２０）、Ｎ末端で１５０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（１５０）、Ｎ末端で１６４個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（１６４）、ならびにＮ末端で１９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（１９０）を発現する２９３細胞からのいずれかのサンプルよりも著しく高かったことを示した。しかしながら、Ｎ末端で８０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（８０）を発現する２９３細胞サンプル中でのドパミン濃度と比べた場合、差異は著しくはなかった（図２を参照）。このデータは、ドパミン濃度の上昇が、ＴＨの活性を負に調節することにより、その異所性ドパミン合成能を限定し、かつこのジレンマが、Ｎ末端で特定アミノ酸残基を欠失させた、構成的に活性化させたバージョンのＴＨの使用により解決され得ることを確証した。さらに重要なことに、本発明者は、比較により、Ｎ末端での特定アミノ酸の欠失を有する、構成的に活性化させた最適な型のＴＨ、すなわちＮ末端で８０個または９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨを見出した。本開示により提供される二酵素組成物は、Ｎ末端で８０個または９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物である。この結果は、この二酵素組成物が、Ｎ末端での特定欠失を有するＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む、別の型の組成物よりも優れたｄｅ ｎｏｖｏドパミン合成能を有することを示唆する。要約すると、本開示により提供される二酵素組成物は、最良のｄｅ ｎｏｖｏドパミン合成を果たし得る。Ｎ末端での特定欠失を有するＴＨは、構成的活性化状態にあることが公知であるとは言え、本開示は、構成的に活性化されたＴＨバリアントの最適な型を提供する。
【0154】
[00182]実施例３。ＰＤモデルマウスの構築
[00183]ＰＤモデルを構築するために８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス株を選択した。マウス標準脳アトラスに従って、片側ＳＮ／ＶＴＡ領域に６－ＯＨＤＡ（８ｍｇ／ｍＬ）５００ｎＬの定位的注入を行った。６－ＯＨＤＡは、ドパミン作動性ニューロンを特異的に殺滅する毒性薬剤である。２週間後、マウスの頸部にアポモルフィンを、体重で計った投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で皮下注射し、次いで回転試験を行った。６－ＯＨＤＡ病変と反対側の回転を示した、アポモルフィン誘発性運動非対称性の表現型を有するマウスを、続く実験用に選択した。
[00183]ＰＤモデルを構築するために８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス株を選択した。マウス標準脳アトラスに従って、片側ＳＮ／ＶＴＡ領域に６－ＯＨＤＡ（８ｍｇ／ｍＬ）５００ｎＬの定位的注入を行った。６－ＯＨＤＡは、ドパミン作動性ニューロンを特異的に殺滅する毒性薬剤である。２週間後、マウスの頸部にアポモルフィンを、体重で計った投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で皮下注射し、次いで回転試験を行った。６－ＯＨＤＡ病変と反対側の回転を示した、アポモルフィン誘発性運動非対称性の表現型を有するマウスを、続く実験用に選択した。
【0155】
[00184]運動非対称性を有するマウスからのクリオスタット脳切片の免疫細胞染色アッセイを行った。このアッセイでは、ＴＨ陽性染色シグナルが、ＰＤマウスにおける対照としての、６－ＯＨＤＡ病変と反対側の、ＳＮ／ＶＴＡ領域および線条体ＣＰ領域の両方ともで検出されたが、病変と同側の領域では検出されなかったことが示された（図３を参照）。この結果は、６－ＯＨＤＡが、ＣＰへと投射する、ＳＮ／ＶＴＡ中のドパミン作動性ニューロンに対して効果的な病変を引き起こしたことを示した。
【0156】
[00185]要約すると、続く救済実験用に、ＰＤマウスモデルの構築に成功した。
【0157】
[00186]実施例４。二酵素組成物による、ＰＤマウスモデルの表現型の救済
[00187]ＰＤマウス中でのｉｎ ｖｉｖｏ発現用に、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ）を発現するベクタープラスミドを、ＡＡＶ血清型９のウイルス粒子（力価：１．９５×１０１３ｖｇ／ｍＬ）内にパッケージした。対照として、ＧＦＰ発現プラスミドを、ＡＡＶ粒子（ＧＦＰ、力価：７．７８×１０１２ｖｇ／ｍＬ）内にパッケージした。
[00187]ＰＤマウス中でのｉｎ ｖｉｖｏ発現用に、Ｎ末端で９０個のアミノ酸を欠失させたＴＨおよび全長ＡＡＤＣを含む組成物（ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ）を発現するベクタープラスミドを、ＡＡＶ血清型９のウイルス粒子（力価：１．９５×１０１３ｖｇ／ｍＬ）内にパッケージした。対照として、ＧＦＰ発現プラスミドを、ＡＡＶ粒子（ＧＦＰ、力価：７．７８×１０１２ｖｇ／ｍＬ）内にパッケージした。
【0158】
[00188]図４ａに示すワークフローに従って表現型救済実験を行うために、実施例３において構築に成功したＰＤマウスモデルを使用した。ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣまたはＧＦＰのＡＡＶパッケージングを、定位固定装置を用いて、マウス標準脳アトラスに基づいて選択した３つの適切な割り当てられた注入部位で線条体内注入した。各部位で、ウイルス５００ｎＬを注入した。ウイルス投与から４週間後、用量を体重で計った（１０ｍｇ／ｋｇ）、頸部でのアポモルフィン皮下注射により、アポモルフィン誘発回転試験を行った。救済有効性は、６－ＯＨＤＡ病変と反対側のアポモルフィン誘発回転の１分間当たり正味回転の低下として示され、その正味回転は、対側回転と同側回転との間の差異を、６０分間の記録時間で割って計算した。この結果は、ウイルス投与から４週間後のアポモルフィン誘発運動非対称性試験において、ウイルス注入前の正味回転および対照群（ＧＦＰ）の正味回転と比べた、ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣウイルスベクターを注入したＰＤマウスの対側回転の１分間当たり正味回転の著しい低下を示した（図４ｂ）。まとめると、本開示の特定の二酵素組成物（すなわち、ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて効果的に機能し得て、ＳＮ中のドパミン作動性ニューロンにより神経支配される線条体ＣＰ領域中でのドパミン濃度を高め得ることにより、ＰＤマウスモデルにおけるアポモルフィン誘発運動非対称性を著しく改善することが示された。したがって、本開示により提供される二酵素組成物（ＴＨ９０ｄｅｌ／ＡＡＤＣ）は、ＰＤに対して潜在的な治療効果を有する。
【0159】
[00189]実施形態および／または実施例で使用した酵素組成物はヒト由来であるが、当業者は、ヒトまたはマウスの二酵素組成物が、マウスモデルまたはヒト臨床試験に関して優れた治療効果を有することを当然ながら予想する。なぜなら、本開示の開示に基づくと、ヒトとマウスとの間のＴＨまたはＡＡＤＣのタンパク質ホモロジーは、それぞれ８３％または８９％であるからである。
【0160】
[00190]要約すると、本発明者は、本開示の詳細な記載を説明したが、本開示の範囲は、その記載を越える。当業者は、本開示の範囲が、変形および改変された実施形態を含み、それらの実施形態が本開示の保護範囲内に入ることを理解する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】